CN114939159A - 一种载病毒抗原和佐剂的多级靶向载体的构建及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种载病毒抗原和佐剂的多级靶向载体的构建及应用。是一种利用脂质体，固体脂质纳米粒，纳米乳，聚合物胶束和纳米囊等纳米装载SARS‑CoV‑2等病毒重组蛋白抗原和疫苗佐剂Toll样受体激动剂，利用甘露糖和阳离子肽Par对该纳米载体进行表面修饰，赋予该纳米载体树突状细胞及其内质网的多级靶向。通过调整Man和Par的比例可有效地调控SARS‑CoV‑2等病毒重组蛋白抗原在DC细胞内质网和溶酶体的处理，增强DC细胞对外源性抗原的递呈，促进机体CD8+和CD4+T细胞的启动；同时该纳米载体还可将极低剂量的CpG‑OND佐剂直接递送至DC细胞内质网发挥作用，减轻了由佐剂诱导的潜在的免疫毒性。

Description

一种载病毒抗原和佐剂的多级靶向载体的构建及应用
技术领域
本发明属于药剂学领域，涉及一种载病毒抗原和佐剂的多级靶向载体的构建及应用，通过控制纳米载体精准靶向至DC细胞及其内质网，增强DC细胞对外源性抗原的呈递，积极调控抗原MHC I和MHC II类呈递，增强CD8+T和CD4+T细胞活化水平，增强病毒抗原诱导的细胞和体液免疫，该载体可有效用于新冠等病毒抗原的递送和分步释放，同时利用该靶向策略可有效地将其他如MERS、埃博拉病毒病、登革热病毒和寨卡等病毒抗原蛋白精准递送至DC 细胞内质网。
背景技术
病毒疫苗能够调动并训练机体特异性免疫响应与记忆来，并且其制备可控、易于普及、副作用低，尤其可以对机体形成长期保护效应，是人类对抗病毒的主要防控手段。新冠疫苗的开发已成为全球卫生优先事项。体液免疫与细胞免疫在生物体内相辅相成，两者的协同配合是抗病毒/肿瘤免疫响应有效、持久与安全的关键[J Immunol 172,6265-6271(2004)]。对基于体液免疫的抗病毒疫苗，适当调控细胞免疫的参与度与响应能力是优化其抗病毒免疫效能的重点[New Engl J Med 382,1969-1973(2020)]。单纯的抗体介导的体液免疫不足以对抗严重的病毒感染[Immunity 52,910-941(2020)]，因为抗体难以渗透进入细胞攻击匿藏于细胞内的病毒，而毒性T细胞介导的细胞免疫可以弥补该缺陷。另外，病毒突变导致的抗原性漂移容易引起抗体的亲和力下降，甚至对病毒的中和能力失效[PlosPathogens 9,e1003354 (2013)]。相比之下，细胞免疫对病毒的突变性免疫逃逸更具有耐受性[Adv Virus Res 78, 43-86(2010)]，涉及多个抗原表位或序列的T细胞免疫甚至可进一步降低这种突变逃逸的风险。体液与细胞免疫的协作实现了彼此抗病毒响应的强大。活化的辅助T细胞为初步启动的 B细胞提供共刺激信号，促进B细胞的充分活化、增殖，增加其向浆细胞分化和抗体分泌的潜能，实现体液免疫的增效放大[Annu Rev Immunol 34,317-334(2016)；SciTransl Med 5, 176ra32(2013)]。另一方面，B细胞可以作为抗原呈递细胞(APC)向T细胞呈递抗原并提供共刺激分子，促进T细胞活化，诱导细胞免疫的发生。此外，T、B细胞分泌的因子可以互相促进功能的发挥与长效免疫记忆的建立[NeurosciBiobehavRev 25,29-41(2001)；Cell and Tissue Biology 7,539-544(2013)]。
单一地或不可控地调动抗病毒体液或细胞免疫同样存在安全性风险。过强的抗病毒细胞免疫可能会引起Th2细胞相关的嗜酸性粒细胞浸润[J Virol 85,12201-12215(2011)] 或诱导自免疫疾病[Cell Mol Immunol 16,602-610(2019)]等病理现象发生。而过度依赖中和抗体的使用可能会诱导促炎因子的过度表达，引发免疫因子风暴，或通过抗体依赖的增强作用(antibody-dependent enhancement，ADE)损伤脏器组织[SSRNElectronic J,2020030138 (2020)]。由此可见，增强体液与细胞免疫的协同调动和可控性对抗病毒免疫响应的安全有效性至关重要，可控调节与筛选两者的优化协同将是优质抗病毒疫苗设计的重要方向。
树突状细胞(dendritic cells，DC)是免疫诱导的中心，可激活T细胞和B细胞。与其他细胞类型(如巨噬细胞和B细胞)相比，DC细胞能够通过胞饮作用、内吞作用或吞噬作用截获不同的抗原，是专职的抗原呈递细胞(antigen processing cells，APC)。为了完成它们作为APC的作用，DC细胞表达了大量的细胞外和细胞间受体，这些受体负责它们“感知”环境的能力。当它们在感染/炎症的情况下遇到抗原时，DC会经历一个成熟过程，导致共刺激分子和MHC分子的上调，并增加它们在MHC I和MHC II情况下呈递抗原的能力[Boscardin,10(2019)]。
抗原靶向内质网递送可显著增强细胞免疫应答水平。通过在纳米载体表面修饰或添加靶向引导分子，实现了精准的载体ER靶向分布，该载体进入细胞后呈现非溶酶体的细胞内转运行为，以小窝蛋白介导细胞内吞后，可沿着胞内微管路径转运至核周ER部位[ACSCent Sci 6,174-188(2020)]。这种类似于某些病毒的胞内转运方式，为所包封的活性分子逃避溶酶体捕获，减少降解提供了帮助。ER相关降解系统(ERAD)是真核细胞进行蛋白质量控制的重要机制，通过将ER腔内终末错误折叠蛋白逆转位至胞浆，进行泛素-蛋白酶体介导的降解来缓解细胞的ER应激。在DC中，ERAD同样发挥着促进抗原加工递呈的作用。借助ER靶向载体将外源性蛋白抗原累积至ER部位，进一步利用ERAD机制实现抗原的加工递呈，研究发现该策略显著增加了抗原MHC I类递呈，诱导了机体特异性CD8+T细胞介导的细胞免疫响应，明显增强了疫苗的抗肿瘤效果[Adv Healthc Mater,e2001934(2021)]。该疫苗策略的核心是将DC对外源性抗原处理的方式由诱导体液免疫为主向细胞免疫转变，其程度取决于该载体的ER靶向效率，这可以由载体的靶向修饰分子数量进一步来控制。
当前，抗病毒疫苗的研究重点主要聚焦探究抗病毒体液免疫的作用机制及效果，其设计与应用也主要围绕抗体依赖性的体液免疫，对细胞免疫的考察及调动不足[Microbiol Mol Biol R 80,989-1010(2016)；TransfusApherSci 59,102922(2020)]。目前对细胞免疫的研究主要集中于抗肿瘤领域[J Cell Physiol 234,8509-8521(2019)；AdvExp Med Biol 1224,53-62(2020)]，随着对病毒作用模式的逐步理解，一些与抗病毒细胞免疫的相关研究也有了少量报导。
刺突蛋白之类的亚单位疫苗本身的较低的免疫原性限制了其应用与发展，通常需要佐剂来增强其产生免疫反应的能力。佐剂可根据其性质分为几类，包括基于铝盐的(氢氧化铝和磷酸铝)、基于角鲨烯油乳剂的如MF59和AS0和Toll样受体(TLR)激动剂，包括TLR9激动剂CpG1018和基于TLR4激动剂单磷酰脂质A(MPL)的AS01B(MPL和皂苷QS-21)和AS04(MPL和氢氧化铝)目前针对SARS-CoV的候选疫苗的佐剂，大都为铝基佐剂。相关证据表明，以铝佐剂为主的疫苗容易引发疫苗相关增强型呼吸道疾病[Nature 579,270–273(2020).]。疫苗构建时，佐剂的选择必须格外小心[Sci Rep 10,20085(2020)]。具有CpG基序的合成寡脱氧核苷酸(CpG ODN)是TLR9的激动剂，可模拟细菌DNA中天然存在的CpG基序的活性。 TLR9被激活后，随即从内质网移动到高尔基体和溶酶体，在那里它与信号通路中的主要蛋白质MyD88相互作用。利用精准靶向载体将CpG ODN递送至DC细胞内质网是一种降低佐剂使用剂量，减轻由佐剂诱发的潜在的由Th2和Th17诱导的免疫病理反应。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种载病毒抗原和佐剂的多级靶向载体的构建方法，是一种递送SARS-CoV-2等病毒抗原的多级靶向带电脂质体的构建，具体包括以下3部分内容：
1、磷脂化DC靶向分子DSPE-PEG2000-Man、磷脂化内质网靶向分子DSPE-PEG2000-Par的构建方法：
本发明基于DC细胞高表达甘露糖受体的特点，利用可与其特异性识别的4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷分子作为靶向DC细胞的靶头。利用4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷与DSPE-PEG2000-NH2、DSPE-PEG2000-COOH或DSPE-PEG2000-SH，通过加成反应形成磷脂化的甘露糖靶向分子DSPE-PEG2000-Man。DSPE-PEG2000-Man能够溶液有机试剂乙醇、丙酮、二氯甲烷和三氯甲烷中。具体方法为：将DSPE-PEG2000-NH2、DSPE-PEG2000-COOH或DSPE-PEG2000-SH与4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷按摩尔比为1-5:1的比例溶解在2-10mL四氢呋喃溶液中，避光条件下室温反应2-24小时后，用重结晶的方法或用透析法纯化反应产物，如用截留分子量为3000 的透析袋收集反应物，用纯水透析除去有机溶剂，冻干即得DSPE-PEG2000-Man，磷脂化后的甘露糖靶头具有两亲性，其疏水端为磷脂部分，可以锚定在脂质体纳米载体表面，亲水部分的 Man则裸露在外，可以作为识别DC细胞上的甘露糖受体的靶头，将脂质体纳米载体靶向DC 细胞。
磷脂化内质网靶向分子的构建方法：Pardaxin(Par)是一种抗菌肽，最初是从红海摩西鳎的分泌物中分离出来的含有33个氨基酸残基的小分子多肽，入胞后能够避开线粒体，高尔基体和溶酶体定向至内质网。Par具有较强的亲水性，为了使其更好的锚定在纳米载体表面，我们对其进行了疏水化修饰，通过采用DSPE-PEG2000-NH2与Par上的游离羧基进行酰胺反应形成具有两亲性的DSPE-PEG2000-Par，可提高Par在乙醇，丙酮，二氯甲烷和三氯甲烷等有机溶剂中的溶解度。
具体方法为：精密称取一定量Par多肽，溶解在2-10mL无水四氢呋喃溶剂中，在避光和冰浴下加入(BOC)2O试剂保护Par多肽上的4个游离氨基，避光氮气密封进行反应12h。经(BOC)2O试剂保护后，加入EDC和NHS活化Pardaxin多肽上羧基，n(EDC):n(Pardaxin) ＝5-20:1，(n(NHS)):n(Pardaxin)＝5-20:1)常温下活化反应2个小时。活化结束后，加入DSPE-PEG-NH2，DSPE-PEG2000-NH2和Par多肽摩尔比为1-10:1，磁力搅拌下反应24 小时。反应结束后，用1-5mL 12M HCI搅拌反应2个小时脱去BOC保护，后用3M NaOH调回中性，用截留分子量为8000的透析袋透析除去有机试剂和游离的反应物，冻干即得 DSPE-PEG-Par。
2、多级靶向带电脂质体的构建方法，具体通过以下方式实现：
以蛋黄卵磷脂、胆固醇、磷脂化的甘露糖分子、磷脂化的内质网靶向分子、阳(阴)脂质混溶于乙醇、丙酮、乙腈，二氯甲烷或三氯甲烷溶剂中作为疏水相，将病毒抗原，佐剂混溶于缓冲水溶液中作为亲水化，采用乙醇注入法、逆向蒸发法或薄膜分散法或微流控技术制备得到多室脂质体，再通过探头超声或水浴超声形成单室阳离子脂质体。本发明中的阳(阴) 离子脂质根据需要占脂质总质量的0.5％-30％，磷脂化的甘露糖分子和磷脂化的内质网靶向分子根据需要分别占脂质总质量的0.01％-10％；磷脂化的甘露糖分子与磷脂化的内质网靶向分子的比例，根据需要，其摩尔比不固定，通过调整靶头的配比来有效调整脂质体进入DC细胞内质网的数量。从而分配病毒抗原在内质网和溶酶体的比例，按需调控由抗原诱导的机体细胞和体液免疫。
本发明中的阳离子脂质可以是带正电荷的脂质，如(2,3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、二甲基双十八烷基铵(DDA)、1,2-二甲基-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)、 1,2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)或3β-[N-(N’N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；也可以是可电离脂质，如4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯 (DLin-MC3-DMA,pKa＝6.44)。本发明中的阴离子脂质可以是磷脂酰甘油，磷脂酰丝氨酸或磷脂酸等。
3、多级靶向阳离子脂质体负载抗原及佐剂的方法，具体通过以下方式实现：
本发明中的病毒抗原主要通过静电吸附的方式负载。主要根据抗原蛋白/多肽的等电点来调整Na2HPO4、KH2PO4组成的缓冲液体系，使其与脂质体带相反的电荷，通过静电吸附和亲水腔装载进行抗原负载。所涉及的抗原可以为新型冠状病毒(SARS-COV-2)、中东呼吸综合征 (MERS)病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒的刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)，膜蛋白(Membrane protein，M蛋白)，包膜蛋白(Envelopeprotein， E蛋白)等RNS病毒抗原蛋白。也可以是乙肝病毒、狂犬病毒、水痘病毒、麻风病毒等DNA 病毒的抗原蛋白。
本发明中的佐剂主要通过静电吸附和亲水腔装载的方式进行负载。根据本发明的需要，主要选用Toll样受体(TLR)激动剂为免疫佐剂。具有CpG基序的合成寡脱氧核苷酸(CpG ODN)是TLR9的激动剂，可模拟细菌DNA中天然存在的CpG基序的活性。TLR9被激活后，随即从内质网移动到高尔基体和溶酶体，在那里它与信号通路中的主要蛋白质MyD88相互作用。利用精准靶向载体将CpG ODN递送至DC细胞内质网是一种降低佐剂使用剂量，减轻由佐剂诱发的潜在的由Th2和Th17诱导的免疫病理反应。本发明中的CpG-ODN可以为A类、B类或C 类CpG ODN。其序列如SEQ ID No.1-5所示。
本发明的另一个目的是提供所述多级靶向带电脂质体在制备将抗病毒抗原精准递送至DC细胞内质网的载体中的应用。本发明的应用，主要通过以下方式实现。
1、负载抗原及佐剂的脂质体精准定位至DC细胞内质网
DC是专职的抗原递呈细胞，是激活细胞免疫的主要信使，本发明所述的脂质体具有DC 细胞和细胞内质网多级靶向能力。其中通过将具有磷脂化的内质网趋向肽(DSPE-PEG-Par) 修饰在脂质体表面，被DC细胞识别并摄取后，被小窝蛋白介导内吞，进入细胞后沿着细胞，可沿着胞内微管路径转运至核周内质网部位，在内质网释放抗原及佐剂。这种类似于某些病毒的胞内转运方式，为所包封的活性分子逃避溶酶体捕获，减少降解提供了帮助。
2、负载抗原及佐剂的脂质体介导DC细胞可控的抗原交叉递呈
抗原的胞内转运影响其呈递命运，导致机体免疫响应类型的差异。本发明构建的负载抗原和佐剂的脂质体能有效控制DC细胞对抗原的递呈模式。从而诱导机体实现可控的细胞免疫与体液免疫。主要通过以下机制实现：专职性抗原呈递细胞DC通常借助溶酶体路径，将外源性抗原以MHCⅡ类途径呈递给CD4+T细胞，促进体液免疫的发挥；将内源性抗原以MHCⅠ类途径加工并呈递给CD8+T细胞，诱导CTL主导的细胞免疫应答。当外源性抗原脱离溶酶体时，也可能产生交叉递呈效果，借助MHCⅠ类分子诱导细胞免疫的发生。因此，调控抗原呈递细胞的MHC分子的参与类型和参与程度，是决定外源性抗原疫苗递送后机体免疫应答的T细胞亚群类型及优势免疫响应(体液或细胞免疫)的重要手段。
本发明以含有COVID-19病毒抗原表位的SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)为外源性模型抗原，构建一种S蛋白二级释放与精准DC内质网靶向的脂质体疫苗。S蛋白以静电吸附和包裹方式，分别装载于脂质体的外围与内核，用于外源性抗原的多样化递呈。该疫苗接种后，脂质体表面吸附抗原快速释放，诱导B细胞活化；解除表面抗原的脂质体借助表面暴露的Man靶头和Par多肽，实现抗原在DC细胞ER的特异性递送与释放，诱导CTL依赖性的细胞免疫。通过改变Man和Par内质网靶向肽的修饰度调控外源性抗原的呈递方式，即交叉呈递的比例，影响CD8+T细胞和CD4+T细胞的活化情况，从而分配细胞和体液免疫的诱导程度及比例。本项目可用于筛选抗病毒细胞免疫和体液免疫的最佳组合，为设计优质抗病毒疫苗载体，应对不同病毒感染提供有效的防治指导。
3、靶向脂质体在小鼠体内实现向淋巴结富集
引发针对特定病毒的更强大和持久的免疫反应的一种方法是将病毒抗原和佐剂靶向抗原呈递巨噬细胞和DC细胞。这些细胞通常在外周疫苗接种部位遇到抗原，然后成熟，进入淋巴管并迁移到淋巴结以引发效应淋巴细胞。本发明通过借助抗原呈递细胞的“搭便车”效应实现负载抗原和佐剂的脂质体在淋巴结的富集。即通过小鼠皮下注射脂质体后，其游离在表Man 靶头能够特异性的与抗原呈递细胞(主要为DC细胞)表面的甘露糖受体识别。摄取有脂质体的DC细胞向淋巴结迁移，实现载体在淋巴结的富集。
4、负载抗原及佐剂的脂质体诱导小鼠体内体液及细胞免疫
本发明的有益之处是可以通过改变Man和Par的修饰度调控外源性抗原的呈递方式和优化佐剂的最小有效使用剂量，激活由CD8+T细胞和CD4+T细胞介导的细胞和体液免疫。本发明通过优化负载新冠病毒S蛋白和CpG佐剂的靶向脂质体，将其注射到小鼠皮下，通过检测小鼠血浆中的抗原特异性免疫球蛋白来考察载抗原脂质体诱导的机体体液免疫；并通过对小鼠脾脏和淋巴结内抗原特异性B细胞和T细胞亚型来考察脂质体诱导的机体体液和细胞免疫。本发明可为应对不同病毒感染提供有效的防治指导。
基于以上背景介绍，本发明专利采用生物安全性高、免疫原性弱的脂质作为主要的材料，构建了一种可将SARS-CoV-2等病毒抗原和免疫佐剂精准递送至DC细胞内质网的纳米脂质体的构建与应用。本发明利用甘露糖Man和内质网定位肽Par对脂质体进行表面修饰，赋予该脂质体DC及其内质网的多级靶向。通过调整Man和Par的比例可有效地调控抗原在 DC细胞内质网和溶酶体的处理，增强DC细胞对外源性抗原的递呈，促进机体CD8+和CD4+T 细胞的启动；同时该脂质体还可以将极低剂量的CpG-OND佐剂直接递送至DC细胞内质网发挥作用，减轻了由佐剂诱导的潜在的免疫毒性。
本发明的有益指出为：
(1)本发明提供了一种新的增强机体细胞免疫应答的手段与机制
机体抗原递呈细胞如DC对于外源与内源性抗原的递呈方式有较大区别。对于DC摄取的抗原(外源性)主要经溶酶体的路径转运与处理，以MHC II类方式递呈，用于体液免疫的应答；而DC自身产生的抗原(内源性)往往处理后以MHC I类分子递呈发挥细胞免疫应答。本研究拟将外源性抗原在DC中以一种非溶酶体途径进行转运，并靶向累积至ER部位，利用ERAD 机制处理抗原，并有效从ER递呈抗原表位。这使得DC对外源性抗原如同内源性方式进行处理，并在递呈靶部位累积，高效发挥MHC I类的递呈效果，显著增强机体的细胞免疫应答。
(2)本发明提供了一种新的抗病毒疫苗调控机体细胞与体液免疫应答策略
以重组病毒蛋白、灭活病毒等为代表的传统抗病毒疫苗技术主要以递送外源性抗原为手段。由于抗原递呈细胞针对外源性抗原优先的处理方式，致使机体主要侧重于诱导体液免疫应答，细胞免疫的活化程度不足，这会极大影响随后的抗病毒效果。本项目拟将外源性抗原采用二级释放行为发挥免疫调控作用：一部分抗原接种后快速释放，可用于B细胞的初级活化；另一部分抗原通过控制靶向ER的递送效率，来调控抗原MHC I和II类递呈比例，分别用于诱导活化CD8+T细胞的细胞免疫应答，以及活化CD4+T细胞来促进体液免疫应答的放大，最终实现对机体细胞与体液免疫诱导的有效调控。
(3)本发明提供了一种新的装载病毒蛋白抗原和佐剂的脂质体构建技术
我们拟利用处方中可电离脂质以及pH的调节，实现病毒抗原和佐剂在脂质体内外分步包封，并结合投料比来控制两部分对抗原和佐剂的包封比例；进一步在脂质体表面修饰针对DC 与内质网的靶向分子，利用两者的修饰度控制脂质体内部包封抗原的递送部位与递呈方式，这是最终实现该疫苗有效调控抗病毒细胞与体液免疫应答的基础，这种基于外源性抗原的新型疫苗构建技术，可为抗病毒疫苗载体的发展提供另一有效思路。
附图说明
图1.S+CpG@PM-LIPO的制备与表征。(A-D)不同LIPO疫苗制剂的透射电镜和粒径图， n＝3。标尺，100nm。(E)不同LIPO疫苗制剂的表面电位，n＝3。(F)不同浓度的载体与DC2.4 和BMDCs共孵育后对细胞的毒性，n＝5。(G)装载S蛋白脂质体载体的释放曲线，n＝3。(H) S@PM-LIPO的SDS-PAGE分析。
图2.增强的并且可控制的抗原呈递效应。(A)不同Par比例修饰的载体与BMDCs细胞共孵育后活化指标的表达，n＝6。(B)CD11c+MHC-I+MHC-II+BMDCs的代表性流式图。
图3.S+CpG@PM-LIPO疫苗后，小鼠血清中抗体浓度。(A)给小鼠接种疫苗方式示意图。(B)疫苗期间小鼠的体重变化。(C)小鼠血清中IgM抗体浓度。(D)小鼠血清中IgG抗体浓度。
图4.S+CpG@PM-LIPO疫苗后，小鼠血清中细胞因子和S中和抗体浓度，其中(A)ELISA 法检测第3、5、7周采集的血清中细胞因子IL-12、IL-4、IL-6浓度，(B-C)检测靶向S蛋白的中和抗体，血清中的S特异性中和抗体将靶向S蛋白并阻断其与ACE2(D)的结合，抑制率决定了样本中针对SARS-COV-2的中和抗体水平；阳性结果(抑制率≥20％)表明检测到SARS-COV-2中和抗体(E)，(F)第3、6和8周收集的血清中S特异性抗体滴度。
图5.S+CpG@PM-LIPO疫苗后，小鼠B细胞及T细胞变化。(A-C)骨髓、脾脏和淋巴几中CD19+B细胞和成熟B细胞的流式结果。(D)通过流式分析血液中CD8+T和CD4+T 细胞的百分比。(E-F)脾脏和淋巴结中CD8+T、CD4+T细胞和中央记忆CD8+T(CD8+Tcm)和 CD4+Tcm的百分比。
图6.体外细胞抗原摄取和内质网共定位。(A)与各种DID标记的LIPO(OVA@LIPO、OVA@Par-LIPO、OVA@Man-LIPO和OVA@PM-LIPO)孵育24小时的BMDC的代表性共聚焦图像，(标尺：25μm)。(B)与各种OVA负载的LIPO孵育后，BMDCs摄取的FITC-OVA的平均荧光强度。(C)与各种DID标记的LIPO孵育后，BMDC摄取的DID-LIPO的平均荧光强度。(D)不同LIPO被BMDCs摄取后的内质网共定位图像(标尺：5μm)。(E)OVA@LIPO、OVA@Par-LIPO 和OVA@PM-LIPO内吞后单个BMDC的3D图像。
图7.增强并且可控的BMDCs交叉递呈效应。(A-B)活化的BMDC是的流式代表图。(C)根据流式数据与各种Par修饰的LIPO孵育后MHC-I和MHC-II表达的BMDCs的定量n＝6， (D)不同Par修饰度的OVA脂质体孵育DC后，MHC-I和MHC-II阳性表达的DC细胞量化。
图8.脂质体疫苗在小鼠淋巴结的富集研究。(A-C)皮下注射后不同时间点引流淋巴结中DiR标记的LIPO或游离OVA的小鼠图。(D)72小时后，皮下注射负载DID的LIPO后剖取各种器官(E-F)淋巴结的平均荧光强度。(G)72小时后皮下注射DID标记的LIPO后淋巴结的荧光照片。(H-I)淋巴结的平均荧光强度。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1
可精准靶向DC细胞内质网的负载抗SARS-CoV-2病毒S蛋白及CpG佐剂的脂质体(S+CpG@PM-LIPO)的制备与应用
处方如下：
Figure RE-GDA0003701646100000081
考察本发明制备的脂质体疫苗精准定位至DC细胞内质网的靶向效果及体内外调控细胞-体液免疫的结果，本发明以实例1为例，进行了如下研究。
2019年新冠病毒(COVID-19)对全球人类的健康与生活造成了巨大影响。针对COVID-19的疫苗的研究目前正如火如荼且国民通过疫苗的接种获得了一定的保护。但病毒与宿主细胞相互作用的复杂性、病毒的易突变性以及免疫逃逸能力，目前针对其他多数病毒感染尚无有效的应对策略。无论过去、现在、还是将来，病毒始终会是人类健康的最大威胁之一。构建可精准靶向DC细胞的SARS-CoV-2亚单位脂质体疫苗为其他疫苗的优化开发提供了一定的参考。本发明首次采用薄膜分散法对多级靶向脂质体疫苗进行了构建，并进行了处方考察，调控抗原交叉递呈，疫苗后小鼠细胞-体液免疫响应等研究。
1、负荷抗原及佐剂的脂质体的构建及表征。
DSPE-PEG-NH2和4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷(4-Isothiocyanatophenyl α-D-mannopyranoside)或派大星多肽(Paradaxin，Par)通过偶联反应形成酰胺键合成 DSPE-PEG-Man和DSPE-PEG-Par。然后通过薄膜分散法制备装载有S蛋白(NCBI参考序列： YP_009724390.1)和CpG佐剂(碱基序列：5-ggGGTCAACGTTGAgggggg-3′)的脂质体：将二甲基十八烷基溴化铵(DDA)、蛋黄卵磷脂E80、胆固醇Chol，DSPE-PEG-Par和DSPE-PEG-Man 按一定摩尔比溶于氯仿，减压旋转蒸发法去除氯仿，形成脂质薄膜，加入含10μg S蛋白的 PBS溶液(由Na2HPO4、KH2PO4组成的缓冲液，根据S蛋白等电点调节缓冲液pH为7.5-8.0) 水化薄膜，通过探头超声(功率150w，工作3秒，停歇2秒，共探超5分钟)制备脂质体，进一步加入CpG-OND的PBS溶液(pH为7.0-8.0)孵育30min，过葡聚糖凝胶柱(Sephadex G50)纯化。依据相同原理，制备其他脂质体对照品。根据有无靶向分子修饰分别对其命名为S+CpG@Man-LIPO(只含有Man靶头)、S+CpG@Par-LIPO(只含有Par靶头)、S+CpG@PM-LIPO (含有Man和Par双靶头)和S+CpG@LIPO(无靶向分子修饰)。
透射电镜(transmission electron microscope，TEM)显示LIPO、PM-LIPO和 S+CpG@PM-LIPO的典型磷脂双分子层结构，脂质体的粒径为100-150nm(图1A-D)。S和CpG 的混合物在缓冲液(pH7.4)中带负电(～-9mV)，而PM-LIPO呈正电(～+50mV)。成功装载了S 和CpG后，S+CpG@PM-LIPO的Zeta电位略有降低(图1E)。我们分别用BCA蛋白浓度测定试剂盒和nanodrop测定S+CpG@LIPO和S+CpG@PM-LIPO中的S蛋白和CpG的包封率数，数据显示均两者包封率均在50％以上。且该空白载体在浓度高达0.625mg/mL时，对DC2.4和BMDCs 细胞均没有较大的毒性(图1F)。我们进一步对脂质体的释药行为进行考察，我们发现释放的S蛋白随时间逐渐增加，在最初的8小时，S+CpG@PM-LIPO释放了大约70％的S蛋白，之后药物释放率缓慢降低，到24小时达到相对稳定(图1G)。我们首先对制备好的脂质体进行超滤，除去未包裹的药物，然后采用SDS-PAGE分析验证S蛋白在脂质体中的完整性(图1H)。
2、DC及内质网靶向脂质体介导可控的抗原交叉递呈研究。
我们首先制备了系列脂质体疫苗，用低(0.3％～0.5％)、中(0.9％～1.5％)和高(3％～5％) 等不同质量分数的Par对脂质体进行表面修饰。然后将脂质体与小鼠骨髓来源树突状细胞 (Mouse bone marrow derived dendritic cells，BMDCs)细胞共孵育，首先考察脂质体疫苗上调BMDCs共刺激分子(CD80和CD86)的能力。结果显示用Par修饰的脂质体与未修饰的相比，能显著增加活化的BMDCs的比例。此外我们进一步研究了脂质体对BMDCs交叉递呈能力是否有促进作用，从对MHC I和MHC II表达上调来看，与非靶向LIPO相比，中高比例 Par修饰的LIPO可显着增强MHC-I和MHC-II的表达。低比例的Par虽然不能促进MHC-I的表达，但可以显着增强MHC II的表达。从MHC-I，MHC-II的双阳性结果可以看出，Par可以显着促进BMDCs对外源抗原的呈递和加工(图2A-B)。该结果表明通过调整Par的修饰比例能够有效调节BMDCs对抗原的交叉呈递。
3.负载S蛋白的脂质体诱导小鼠体内体液及细胞免疫的研究
我们对健康的C57小鼠分别在第0天，14天和28天进行了三次疫苗接种(图3A)。在接种期间，小鼠的体重维持在一个正常的变化范围内，表明该疫苗具有较好的生物安全性(图 3B)。IgM是B细胞分泌的一种碱性抗体，是接触抗原时最先反应的第一抗体，我们发现接种第一周后S+CpG@PM-LIPO中的免疫球蛋白M(IgM)浓度高于15ng/mL，与对照组比有了显著的升高。而在第三周，IgM在各组之间没有显着差异(图3C)。B淋巴细胞经抗原刺激后转化为浆细胞，并产生一定量的免疫球蛋白G(IgG)，它是血清中免疫球蛋白的主要成分。接种三次后，LIPO疫苗中的IgG数量显着增加(图3D)。该结果表明LIPO疫苗具有较强的免疫原性，能有效激活机体的体液免疫。我们用ELISA试剂盒在第3周、第5周和第7周测量了血清中IL-12、IL-4和IL-6的浓度。IL-12主要由活化的炎症细胞(单核细胞、巨噬细胞、DC和其他APC)产生。用S+CpG@PM-LIPO疫苗接种后，小鼠中IL-12的水平升高(图4A)。 IL-4由辅助性Th细胞产生，主要作用于B细胞，可增强IgE介导的体液免疫，IL-6可刺激活化的B细胞增殖并分泌抗体。S+CpG@PM-LIPO疫苗诱导比游离S+CpG或S+CpG@LIPO疫苗更高的IL-4和IL-6(图4B-C)。然后我们评估了不同组在不同时间点收集的血清的中和能力。血清中的S特异性中和抗体(S-specific neutralizing antibody，SNA)将S蛋白中和，并阻断其与ACE2的结合(图4D)。图4E显示的抑制率决定了样本中针对SARS-COV-2的中和抗体的水平。阳性结果(抑制率≥20％)表明样本中检测有SARS-COV-2中和抗体。该数据显示，S+CpG@PM-LIPO疫苗诱发的SNA在第6周和第8周抑制率超过40％，接种6周后SNA 滴度显着增加，SNA滴度较高。一直持续到第8周(图4F)。
作为发挥体液免疫的重要细胞，我们接着考察了疫苗后的小鼠骨髓(BM)、脾脏和淋巴结内B细胞的变化情况。流式结果显示，在BM(B细胞成熟的主要部位)中，B细胞总数没有明显变化，但成熟B细胞的比例与其他游离S+CpG或S+CpG@LIPO疫苗相比， S+CpG@PM-LIPO疫苗组显着增加(图5A-C)。成熟后，B细胞迁移至脾脏的红髓和淋巴结的皮质。流式结果显示，经S+CpG@PM-LIPO处理的小鼠淋巴结和脾脏中活化的B细胞显着增加，进一步表明疫苗载体可以有效激活体液小鼠的免疫力(图5A-C)。
从上述免疫因子释放水平可以看出，S+CpG@PM-LIPO也诱导了强烈的T细胞反应，然后我们分析了接种小鼠的血液、脾脏和淋巴结中的不同T细胞群。在加强疫苗接种六周后，我们发现S+CpG@LIPO和S+CpG@PM-LIPO疫苗可诱导血液中更高的CD4+和CD8+T细胞。在S+CpG@PM-LIPO中发现的CD4+和CD8+中央记忆T(CD62L+CD44+Tcm)细胞比脾脏和LN中的游离S+CpG疫苗更多(图5D-F)。
实施例2
可精准靶向DC细胞内质网的负载抗卵清蛋白(OVA)抗原蛋白及CpG佐剂的脂质体(OVA@PM-LIPO)的制备与应用：
处方如下：
Figure RE-GDA0003701646100000111
脂质体制备步骤如下：
将二甲基十八烷基溴化铵(DDA)、蛋黄卵磷脂E80、胆固醇Chol，DSPE-PEG-Par和DSPE-PEG-Man按上述处方量溶于氯仿，减压旋转蒸发法去除氯仿，形成脂质薄膜，加入含10μg OVA蛋白的PBS溶液(pH为6.5-7.0)水化薄膜，通过探头超声(功率150w，工作3秒，停歇2秒，共探超5分钟)制备脂质体，进一步加入CpG-OND的PBS溶液(pH为7.0-8.0) 孵育30min，过葡聚糖凝胶柱(Sephadex G50)纯化。依据相同原理，制备其他脂质体对照品。本发明以实例2为例，进行了如下研究。
1、负载抗原及佐剂的脂质体精准定位至DC内质网及促DC成熟的相关研究。
为了评估PM-LIPO介导的抗原摄取能力和内质网靶向能力，用DID标记负载FITC-OVA的LIPO疫苗载体。荧光图片显示大部分OVA(绿色)被封装到LIPO(红色)中，合并成橙色的荧光信号(图6A)。被赋予靶向功能后，LIPO更容易被BMDCs吞噬。如图6A-C所示，与载体共孵育24小时后，BMDCs摄取的靶向LIPO(OVA@Par-LIPO和OVA@Man-LIPO)与非靶向LIPO(OVA@LIPO)相比明显更多。PM-LIPO疫苗的靶向摄取功能在其他三个永生化细胞系(DC2.4和Raw264.7)也进一步得到验证。由于上述细胞中Man受体的高表达，Man-LIPO和PM-LIPO都表现出强烈的细胞内化。同时，与LIPO组相比，Par-LIPO由于其增强的阳离子穿透效应，在DC2.4和Raw264.7细胞中的内化作用略有增加。然后，在与各种DID标记的LIPO孵育 12小时后，BMDCs的内质网用ER-tracker green标记。二维和三维共聚焦图像显示Par介导的LIPO(OVA@Par-LIPO和OVA@PM-LIPO)显示出与内质网更多的共定位(图6D-E)。结果表明，PM-LIPO可以准确地将抗原递送至DC的ER进行处理。
2、负载抗原及佐剂的脂质体介导可控的抗原交叉递呈研究。
内源性抗原和交叉呈递的外源性抗原经历细胞质泛素-蛋白酶体降解，以MHC-I类和II 类限制性方式呈递，相应的激活CD8+和CD4+T细胞。细胞摄取的增强和抗原在内质网上的特异性定位有助于促进BMDCs的激活。如图7A-B所示，OVA@LIPO发挥了微弱的促进作用，而载有OVA的靶向LIPO，尤其是OVA@PM-LIPO，显着上调了MHC-II和CD80分子的表达。从上述结果和我们之前的研究可以很清楚地知道，通过在内质网位点积累外源性抗原，并进一步利用ERAD机制实现抗原加工和呈递，DC可以显着增加MHC I类抗原呈递，诱导特异性CD8+T 细胞介导的细胞免疫反应，并显着增强疫苗的抗肿瘤/病毒作用。然后我们同样研究了不同比例的Par修饰的OVA@PM-LIPO活化BMDCs的作用。从CD80和CD86共刺激分子的表达来看(图 7C)，用Par修饰的LIPO能够促进更高比例的BMDCs活化。然后我们研究了它们对BMDCs中 MHC-I和MHC II表达的促进作用。与非靶向LIPO相比，中高比例Par修饰的LIPO可显着增强MHC-I和MHC-II的表达。Par的低比例虽然不促进MHC-I的表达，但可以显着增强MHC II 的表达。从MHC-I和MHC-II的双阳性结果可以看出，Par可以显着促进DCs对外源抗原的呈递和加工(图7D)。
3、靶向脂质体在小鼠淋巴结富集的研究
然后，我们研究了LIPO疫苗的体内生物分布。含有FITC-OVA的LIPO用DIR标记并注射到小鼠背部皮肤，然后使用小动物活体荧光成像系统考察了LIPO疫苗在淋巴结的转运情况。如图8A所示，注射0.5h后，小鼠腹股沟淋巴结处显示出非常明显的OVA信号和DIR标记的LIPO号，且两者重叠性较高。与非靶向LIPO相比，PM-LIPO在小鼠腹股沟淋巴结中的荧光信号更强，表明靶向载体在淋巴结的的积累更好。注射48h后，与OVA@LIPO相比，PM-LIPO 在注射部位的OVA抗原和DIR信号较少，但在腹股沟淋巴结处表现出较强的DIR信号，表明PM-LIPO可以快速迁移并停留在淋巴结中(图8B)。此外，我们通过小鼠足垫注射DIR标记的LIPO，发现120h内PM-LIPO在LN中的积累也明显大于LIPO组。图8E-F是OVA和DIR信号的量化，从结果可以看出，与游离的OVA相比，LIPO疫苗能明显延长抗原在淋巴结的滞留时间，并且PM-LIPO显示出了明显的淋巴结靶向性。从单一的淋巴结图片可以看出，LIPO和 OVA的荧光信号在PM-LIPO组中比较一致，并显示出了最强的荧光信号(图8G-I)。
实施例3
DSPE-PEG2000-Par和DSPE-PEG2000-Man摩尔修饰比为3:1的负载SARS-CoV-2病毒刺突蛋白及CpG佐剂脂质体的制备与应用
处方如下：
Figure RE-GDA0003701646100000131
实施例4
DSPE-PEG2000-Par和DSPE-PEG2000-Man摩尔修饰比为1:1的负载SARS-CoV-2病毒刺突蛋白及CpG 佐剂脂质体的制备
处方如下：
Figure RE-GDA0003701646100000132
实施例5
高CpG-OND装载量的负载SARS-CoV-2病毒刺突蛋白多级脂质体的制备
处方如下：
Figure RE-GDA0003701646100000133
Figure RE-GDA0003701646100000141
实施例6
低CpG-OND装载量的负载SARS-CoV-2病毒刺突蛋白多级靶向脂质体的制备
处方如下：
Figure RE-GDA0003701646100000142
实施例7
装载SARS-CoV-2病毒刺突RBD蛋白多级靶向脂质体的制备
处方如下：
Figure RE-GDA0003701646100000143
实施例8
装载寨卡病毒E蛋白多级靶向脂质体的制备
处方如下：
Figure RE-GDA0003701646100000144
Figure RE-GDA0003701646100000151
实施例9
装载MERS病毒S蛋白的多级靶向脂质体的制备
处方如下：
Figure RE-GDA0003701646100000152
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种载病毒抗原和佐剂的多级靶向载体的构建及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 1
ggggtcaacg ttgagggggg 20
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 2
tccagtgggg ggggacgttc ctgatgct 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 3
tccagtgggg ggggacgttc ctgacgtt 28
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 4
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknow)
<400> 5
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25

Claims (7)

1.一种载病毒抗原和佐剂的多级靶向载体的构建方法，其特征在于，通过以下方案实现，
(1)构建磷脂化DC靶向分子DSPE-PEG2000-Man、磷脂化内质网靶向分子DSPE-PEG2000-Par：
利用4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷与DSPE-PEG2000-NH2、DSPE-PEG2000-COOH或DSPE-PEG2000-SH，通过加成反应形成磷脂化的DC靶向分子DSPE-PEG2000-Man，DSPE-PEG2000-NH2、DSPE-PEG2000-COOH或DSPE-PEG2000-SH与4-异硫氢酸苯基-Α-D-甘露糖苷按摩尔比为1-5:1；
(2)构建多级靶向阳离子脂质体
将蛋黄卵磷脂、胆固醇、磷脂化的甘露糖分子、磷脂化的内质网靶向分子、阳离子脂质混溶于乙醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷或三氯甲烷溶剂中作为混合膜材，将病毒抗原，佐剂混溶于缓冲双蒸水溶液中作为水化液，采用乙醇注入法、逆向蒸发法或薄膜分散法或微流控技术制备得到多室脂质体，再通过探头超声或水浴超声形成单室阳离子脂质体；其中阳脂质占脂质总质量的0.5％-30％，磷脂化的甘露糖分子和磷脂化的内质网靶向分子分别占脂质总质量的0.01％-10％；
(3)负载病毒抗原和佐剂的多级靶向载体构建
病毒抗原通过静电吸附的方式负载，根据抗原蛋白/多肽的等电点调整由不同比例的Na2HPO4、KH2PO4组成的缓冲液体系，使其与脂质体带相反的电荷，一部分通过静电吸附进行抗原装载，另一部分通过脂质体的亲水腔进行装载，CpG-ODN佐剂以同样的静电吸附和脂质体亲水腔装载的方式进行负载。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的阳离子脂质是带正电荷的脂质或可电离脂质，带正电荷的脂质选用(2,3-二油酰基-丙基)三甲基氯化铵、二甲基双十八烷基铵、1,2-二甲基-3-三甲基铵-丙烷、1,2-硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷或3β-[N-(N’N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇，可电离脂质选用4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中抗原为RNS病毒的抗原蛋白或DNA病毒的抗原蛋白，RNS病毒的抗原蛋白选自SARS-COV-2新型冠状病毒、中东呼吸综合征病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒的刺突蛋白，核衣壳蛋白，膜蛋白，包膜蛋白；DNA病毒的抗原蛋白选自乙肝病毒、狂犬病毒、水痘病毒、麻风病毒。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中佐剂为Toll样受体激动剂，选自具有CpG基序的合成寡脱氧核苷酸。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，其中的CpG-ODN为A类、B类或C类CpG-ODN，其序列分别如SEQ ID No.1-5所示。
6.权利要求1所述多级靶向带电脂质体在制备将抗病毒抗原精准递送至DC细胞内质网的载体中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用通过以下方式实现：
(1)负载抗原及佐剂的脂质体精准定位至DC细胞内质网；
(2)负载抗原及佐剂的脂质体介导DC细胞可控的抗原交叉递呈；
(3)靶向脂质体在小鼠体内实现向淋巴结富集；
(4)负载抗原及佐剂的脂质体诱导小鼠体内体液及细胞免疫。
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CN116178571A (zh) * 2023-02-21 2023-05-30 南开大学 一种内质网靶向人工蛋白、重组酿酒酵母、内质网靶向囊泡、免疫佐剂和疫苗
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