MXPA05013746A

MXPA05013746A - Conjugados de esfingoide-polialquilamina para vacunacion.

Info

Publication number: MXPA05013746A
Application number: MXPA05013746A
Authority: MX
Inventors: Eliezer Kedar
Original assignee: Yissum Res Dev Co
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2004-06-17
Publication date: 2006-06-27
Also published as: EP1638611B1; AU2004246905A1; WO2004110496A1; JP2006527763A; US8673285B2; EP1638610B1; US20060252717A1; JP2006527762A; CA2528402A1; JP4782675B2; US20080112917A1; JP4695075B2; EP1638611A1; WO2004110980A1; US8242089B2; US20070264273A1; BRPI0411505A; AU2004246904B2; AU2004246904A1; JP2006527761A

Abstract

La presente invencion se refiere al uso de un conjugado de esfingoide-polialquilamina como un agente de captura de moleculas biologicamente activas, tal como antigeno. En una modalidad particular, las esfingoide-polialquilaminas se usan para la preparacion de una composicion farmaceutica para modular la respuesta inmunitaria de un sujeto. Otros aspectos de la invencion se refieren a metodos para modular la respuesta inmunitaria de un sujeto para el uso del conjugado, complejos que comprenden, el conjugado de esfingoide-polialquilamina en combinacion con una molecula biologicamente activa capaz de modular una respuesta inmunitaria de un sujeto, composiciones que comprenden el conjugado asi como equipos que hacen uso el conjugado. Un conjugado preferido de acuerdo con la invencion es N-palmitoil-d-eritro-esfingosil-1-carbamol-espermina.

Description

CONJUGADOS DE ESFINGOIDE-POLIALQÜILAMINA PARA VACUNACION Campo de la Invención La presente invención se refiere a vacunación haciendo uso de conjugados de esfingolipidos-polialquilamina para distribución efectiva de materiales biológicamente activos, en particular, moléculas antigénicas .

Antecedentes de la Invención Lo siguiente es una lista de la técnica anterior que se considera que es pertinente para describir el estado de la técnica en el campo de la invención. US 5,334,761: "Cationic lipids" ; US 2001/048939: "Cationic reagents of transfection" ; US 5,659,011: "Agents having high nitrogen content and high cationic charge based on dicyanimide dicyandiamide or guanidine and inorganic ammonium salts" ; US 5,674,908: "Highly packed polycationic ammonium, sulfonium and phosphonium lipids"; US 6,281,371: "Lipopolyamines, and the preparation and use thereof" ; US 6,075,012: "Reagents for intracellular delivery of macromolecules" ; US 5,783,565: "Cationic amphiphiles containing spermine or spermidine cationic group for intracellular delivery of therapeutic molecules" ; Mar Antoniu Ilies & Alexandru T. Balaban, Expert Opin. Ther. Patents . 11 (11) .1729-1752 (2001); Miller AD, Chem. Int. Ed. Eng. REF:168870 37:1768-1785 (1998); Nakanichi T. et al., J. Control Reléase 61:233-240 (1999); Brunel F. et al. Vaccine 17:2192-2193 (1999); Guy B. et al., Vaccine 19:1794-1805 (2001); Lima KM et al. Vaccine 19:3518-3525 (2001). Muchas moléculas biológicas naturales y sus análogos, incluyendo proteínas y polinucleótidos, sustancias extrañas y fármacos, que son capaces de tener influencia en la función celular a nivel sub-celular o molecular se incorporan de manera preferente dentro de la célula a fin de producir su efecto. Para estos agentes, la membrana celular presenta una barrera selectiva que es impermeable a los mismos. La composición compleja de la membrana celular comprende fosfolípidos , glicolípidos , y colesterol, asi como proteínas intrínsecas y extrínsecas, y sus funciones se ven influenciadas por los componentes citoplasmáticos que incluyen iones de Ca++ y otros iones metálicos, aniones, ATP, microfilamentos, microtúbulos, enzimas, y proteínas de unión a Ca++, y también por la glicocálix extracelular (proteoglicanos, glucosa-aminoglicanos ' y glicoproteínas) . Las interacciones entre los componentes celulares citoplásmicos y estructurales y su respuesta a señales externas constituyen los procesos de transporte responsables de la selectividad de la membrana exhibida dentro y entre los tipos celulares . Se ha investigado también la distribución exitosa de agentes no tomados normalmente por las células en las células . La barrera de membrana puede ser superada al asociar agentes en complejos con formulaciones de lípidos que asemejan cercanamente la composición lipídica de las membranas celulares naturales . Estas formulaciones pueden fusionarse con las membranas cellares en el contacto, o lo que es más común, tomadas por pinocitosis, endocitosis y/o fagocitosis. En todos estos procesos, las sustancias asociadas se distribuyen a las células . Los complejos lipidíeos pueden facilitar las transferencias intracelulares también al superar las repulsiones de carga entre la superficie celular, que en la mayoría de los casos está cargada negativamente. Los lípidos de las formulaciones comprenden un lipido antipático, tal como los fosfolípidos de las membranas celulares, y forman varias capas o agregados tal como micelas o vesículas huecas de lípidos (liposomas) , en sistemas acuosos. Los liposomas se pueden usar para atrapar la sustancia que se va a distribuir dentro de los liposomas; en otras aplicaciones, la molécula de fármaco de interés se puede incorporar en la vesícula lipídica como un componente intrínseco de membrana, en lugar de ser atrapado en el interior acuoso hueco, o unido electrostáticamente a la superficie del agregado. Sin embargo, son ya sea zwiteriónicos (neutrales) o están negativamente cargados la mayoría de los fosfolípidos usados.

Un avance en el área de la distribución intracelular fue el descubrimiento que un lípido catiónico, sintético, positivamente cargado, el cloruro de N-[l-(2,3-dioleiloxi) propil] -?,?,?-trimetilamonio (DOTMA), en la forma de liposomas, o pequeñas vesículas, puede interactuar de forma espontánea con el ADN para formar complejos de lípido-ADN que son capaces de adsorberse en las membranas celulares y de ser captados por las células ya sea por fusión o más probablemente por endocitosis adsorptiva, dando por resultado la expresión del transgen [Felgner, P. L. et al . Proc. Nati. Acad. Sci., Patente de los Estados Unidos No. 84:7413-7417 (1987) y Patente de los Estados Unidos No. 4,897,355 to Eppstein, D. et al.] . Otros han usado exitosamente un análogo de DOTMA, el 1, 2-bis (oleoiloxi) -3- (trimetilamonio) ropano (DOTAP) en combinación con un fosfolípido para formar vesículas de formación de complejos con ADN. El reactivo Lipofectina"11 (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD . ) , un agente efectivo para la distribución de polinucleótidos altamente aniónicos en células de cultivo de tejido viviente, comprende liposomas positivamente cargadas compuestas de lípido positivamente cargado DOTMA y un lípido neutral la dioleil-fosfatidil-etanol-amina (DOPE) referido como lípidos auxiliares. Estos liposomas interactúan espontáneamente con ácidos nucleicos negativamente cargados para formar complejos, referidos como lipoplejos. Cuando se usa un exceso de ¦ liposomas positivamente cargados sobre cargas negativas de ADN, la carga neta en los complejos resultantes también es positiva. Los complejos positivamente cargados preparados de esta manera se unen espontáneamente a superficies celulares negativamente cargadas o se introducen en las células ya sea por endocitosis adsorptiva o se fusionan con la membrana del plasma, ambos procesos distribuyen el polinucleótido funcional en, por ejemplo, células de cultivo de tejido. El DOTMA y el DOTAP son buenos ejemplos de lipidos monocatiónicos [lilis et al. 2001, ibid.]. También se ha mostrado que los cationes multivalentes por sí mismos (que incluyen poliaminas, sales inorgánicas y complejos y solventes de deshidratación) facilitan la distribución de macromoléculas en las células . En particular, los cationes multivalentes provocan el colapso de los oligo-poli-aniones (moléculas de ácido nucleico, moléculas de aminoácido y similares) a formas estructurales compactas, y facilitan el empaque de estos polianiones en virus, su incorporación en liposomas, transferencia en células, etc. [Thomas T.J. et al. Biochemistry 38:3821-3830 (1999)]. Los policationes naturales más pequeños capaces de compactar el ADN son las poliaminas, espermidina y espermina. Al unir un ancla hidrófoba a estas moléculas vía un ligador, se ha desarrollado una nueva clase de lectores de transfección, los lipopollmeros policatiónicos . Los lípidos catiónicos y los polímeros catiónicos interactúan electrostáticamente con los grupos aniónicos de ADN (o de cualquier otra macromolécula polianiónica) formando complejos de ADN-lípido (lipoplejos) o complejos de ADN-policatión (poliplejos) . La formación del complejo se asocia con la liberación de contra-iones de los lípidos o polímero, que es la fuerza de impulsión termodinámica para la formación espontánea del lipoplejo y poliplejo. Los lípidos catiónicos se pueden dividir en cuatro clases: (i) lípidos de sales de amonio cuaternario (por ejemplo DOTMA (Lipofectina"11) y DOTAP) y congéneres de fosfonio/arsonio; (ii) lipopoliaminas ; (iii) lípidos catiónicos que tienen porciones tanto de amonio cuaternario como de poliamina y (iv) lípidos de sales de amidinio, guanidinio y sales heterocíclicas .

Breve Descripción de la Invención De acuerdo a uno de sus aspectos, la presente invención se refiere al uso de un conjugado de esfingoide-polialquilamina para la preparación de una composición farmacéutica para modular la respuesta inmunitaria de un suj eto . De acuerdo a una modalidad preferida, el conjugado de esfingoide-polialquilamina comprende una estructura de esfingoide que tiene, vía un enlace de carbamoilo al menos una cadena de polialquilamina . El término conjugado de esfingoide-polialquilamina como se usa en la presente denota conjugación química (enlace) entre una base esfingoide (referida también en la presente por el término "estructura esfingoide") y al menos una cadena de polialquilamina. La conjugación entre la base esfingoide y al menos una cadena de polialquilamina es vía un enlace de carbamoilo, como se detalla adicionalmente más adelante en la presente. La base/estructura esfingoide, como se usa en la presente, incluye, aminas alif ticas de cadena larga, que contienen dos o más grupos hidroxilo, la cadena alifática puede estar saturada o insaturada. Un ejemplo de una base esfingoide insaturada es aquella que contiene un trans-doble enlace distintivo en la posición 4. El término modulación como se usa en la presente denota cualquier efecto regulador o bioquímico medible exhibido por el material biológicamente activo distribuido por el conjugado, en una respuesta inmunitaria del su eto, que incluye respuesta celular y/o respuesta humoral. La modulación incluye inhibición, o, por otra parte, estimulación o mejora de cualquiera o ambos tipos de respuestas cuando se administra el conjugado de esfingoide-polialquilamina al sujeto en combinación con una sustancia biológicamente activa. La modulación se refiere de manera 8 preferente a estimulación o mejora por un factor de dos o más, con relación a aquella producida por la molécula activa biológica administrada sin el conjugado. La invención también se refiere a la modulación de una respuesta inmunitaria en casos cuando el material biológicamente activo administrado en el conjugado sea sustancialmente inefectivo en la producción de esta respuesta. Aún además, modulación se refiere a inhibición o supresión de la respuesta inhibitoria de un sujeto, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias así como para el tratamiento de alergia. De esta manera, el término molécula biológicamente activa como se usa en la presente denota cualquier sustancia que, cuando se administre en combinación con el conjugado de esfingoide-polialquilamina tenga un efecto en el sistema inmunitario de un sujeto. El material biológicamente activo es de manera preferente una proteína antigénica, péptido antigénico, polipéptido antigénico o carbohidrato antigénico. De acuerdo a otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para modular la respuesta inmunitaria de un sujeto, el método comprende proporcionar al sujeto con un conjugado de esfingoide-polialquilamina conjuntamente con una molécula biológicamente activa, el conjugado de esfingoide-polialquilamina comprende una estructura esfingoide que tiene, vía un enlace de carbamoilo, al menos una cadena de polialquilamina. De acuerdo con aún otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para modular la respuesta inmunitaria de un sujeto, la composición comprende: (i) al menos un conjugado de esfingoide-polialquilamina; y (ii) al menos una molécula de biológicamente activa asociada con el conjugado. De acuerdo con aún otra modalidad, la invención proporciona un complejo que comprende: (i) un conjugado de esfingoide-polialquilamina y (ii) un material biológicamente activo capaz de modular una respuesta inmunitaria de un sujeto . Finalmente, la invención se refiere al uso de un conjugado de esfingoide-polialquilamina como se define, como un agente de captura de moléculas biológicamente activas (por ejemplo, moléculas antigénicas) . En este contexto, el conjugado de esfingoide-polialquilamina puede formar parte de un equipo para capturar moléculas biológicamente activas, de manera preferente moléculas antigénicas y/o inmunoestimulantes y/o inmunosupresores , y el equipo que comprende, además del conjugado, instrucciones para el uso del mismo para la captura de las moléculas biológicamente activas. El conjugado en el equipo puede estar en una forma seca, caso en el cual, el equipo también puede incluir un fluido adecuado con el cual se mezcle el conjugado antes del 10 uso para formar una suspensión o emulsión o solución, o puede estar ya en una forma fluida (suspensión, emulsión, solución, etc . ) . El equipo puede tener numerosas aplicaciones . Por ejemplo, el equipo se puede usar para investigar la función de diferentes moléculas inmunomoduladoras en modulación de respuestas inmunitarias , para aislamiento de moléculas biológicas activas, e identificación de las mismas. Aquellos expertos en la técnica conocerán como hacer uso de este agente de captura también para propósitos de investigación. El término agente de captura como se usa en la presente se refiere al conjugado que es capaz de asociarse con moléculas biológicamente activas, éstas últimas que tienen una carga negativa, un dipolo negativo o una carga negativa local (un área dentro de la molécula que tiene una carga negativa neta) , por virtud de la estructura policatiónica del conjugado. La captura comprende per se interacción electrostática entre la molécula que se va a capturar, que tiene la cadena negativa, dipolo negativa o carga negativa local y el conjugado positivamente cargado de la invención. El conjugado de la invención también se puede usar como un vehículo de distribución, que tiene, al capturar a este, moléculas biológicamente activas a un sitio objetivo y en una célula objetivo. 11 Breve Descripción de las Figuras A fin de entender la invención y ver como se puede llevar a cabo en la práctica, se describirán ahora algunas modalidades, a manera de ejemplos no limitantes únicamente, con referencia a las figuras anexas, en las cuales: Las Figuras 1A-1D muestran varias posibles estructuras químicas, compuestos catiónicos "señales", "ramificados" o "cíclicos", tipo lípido (LLC) que se abarcan bajo la definición general de conjugado de esfingoide-polialquilamina de la fórmula (I) , en donde la Figura 1A muestra una estructura esfingoide (ceramida) enlazada a una cadena individual de polialquilamina, la Figura IB y la Figura 1C muestran la misma estructura esfingoide enlazada a dos cadenas de polialquilamina, la Figura ID muestra nuevamente la misma estructura, sin embargo, en la cual una cadena individual de polialquilamina se enlaza vía las dos porciones de hidroxilo para formar un conjugado cíclico de polialquil mina. Las Figuras 2A-2F muestran la bio-distribución y la farmacocinética de varias formulaciones lipídicas fluorescentemente marcadas en el Gl-M- , pulmones -?- o vaso con no recuperado la Figura 2A muestra la distribución de DMPC : DMPG vacío (relación molar 9:1); la Figura 2B muestra distribución de DMPC : DMPG : HN; la Figura 2C muestra distribución de DOTAP : colesterol vacío; la Figura 2D 12 muestra distribución de DOTAP : colesterol : HN; la Figura 2E muestra distribución de CCS : colesterol vacío; y finalmente, la Figura 2F muestra distribución de CCS-colesterol :H . Las Figuras 3A-3D muestran la bio-distribución de varias formulaciones de montaje de lípido cargada con 15I-HN en el Gl-i-, pulmones -?- o vaso -0- con -x- no recuperado, y en particular, la Figura 3A muestra la bio-distribución de 125I-NH libre; la Figura 3B muestra el montaje de lípido cargado con 125I-HN compuesto de DOTAP: colesterol; la Figura 3C muestra montaje de lípido cargado con 125I-HN compuesto de DMPC:DMPG y la Figura 3D muestra montaje del lípido cargado con 125I-HN compuesto de CCS : colesterol .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere al uso de conjugados de esfingoide-polialquilamina como agentes de captura para transportar moléculas biológicamente activas que son activas en la modulación de la respuesta inmunitaria de un sujeto. Los conjugados de esfingoide-polialquilamina son compuestos catiónicos tipo lípido (LLC) , que se puede sintetizar de la siguiente manera. Las bases de cadena larga N-sustituidas , en particular, los esfingoides N-sustituidos o bases esfingoides se acoplan conjuntamente con diferentes polialquilaminas o sus derivados, para formar una entidad de 13 polialquilamina-esfingoide, que se usa como está, o se alquila adicionalmente . La protonación a un pH adecuado o la alquilación de la entidad de polialquilamina-esfingoide formada confiere a los compuestos tipo lípido una carga positiva deseada para la interacción con moléculas biológicas, biológicamente activas, que se van a distribuir en células objetivo y con células seleccionadas como objetivo. Los conjugados de esfingoide-polialquilamina se pueden asociar de forma eficiente con las moléculas biológicamente activas en virtud de interacciones electrostáticas entre el carácter aniónico de las moléculas biológicamente activas y las porciones de polialquilamina del conjugado para formar complejos (lipoplejo) . De manera alternativa, los conjugados de esfingoide-polialquilamina pueden formar montajes cargados con las moléculas biológicamente activas . El conjugado de esfingoide-polialquilamina puede estar en la forma de moléculas individuales tipo lípido o en la forma de un montaje. Un ejemplo de un montaje adecuado incluye la formación de micelas o vesículas, y en particular, liposoraas . Otros ejemplos de montajes incluyen la formación de micelas, fases invertidas, fases cúbicas y similares. Evidentemente, el conjugado de esfingoide-polialquilamina puede estar en la forma combinada de vesícula/micela o cualquier otra combinación de montajes. 14 El montaje de lipido como se usa en la presente denota una colección organizada de moléculas de lípido que forman Inter alia, micelas y liposomas . Los montajes de lípido son de manera preferente montajes estables de lípido. El montaje estable de lípido como se usa en la presente denota un montaje que es química y físicamente estable bajo condiciones de almacenamiento (4°C, en medio fisiológico) durante al menos un mes. Cuando los montajes están en la forma de vesículas (por ejemplo, liposomas) , la moléculas biológicamente activas se puede encapsular dentro de la vesxcula, parte de su vicapa de lípido o adsorber a la superficie de la vesícula (o cualquier combinación de estas tres opciones) . Cuando los montajes son micelas, las moléculas biológicamente activas se pueden insertar en los anfifilos que forman las micelas y/o asociar con éstas electrostáticamente, de manera estable. De esta manera, como se usa en la presente, los términos "encapsulado en", "contenido en", "cargado sobre", o "asociado con" indica una unión física entre el conjugado y la molécula biológicamente activa. La unión física puede ser ya sea con tensión o atropamiento de la molécula dentro de los montajes (por ejemplo (vesículas, micelas u otros montajes) formados del conjugado; enlace no covalente de la molécula biológicamente a la superficie de los montajes, o incrustación de la molécula biológicamente entre los 15 conjugados de esfIngoide-polialquilamina que forman estos montajes. Se debe señalar que debido a la carga positiva o de polo positivo del conjugado de esfingoide-polialquilamina bajo condiciones fisiológicas, la asociación preferida entre el conjugado y el material biológicamente activo es por interacción electrostática, de dipolo o interacciones ácido-base . A pesar de lo anterior, la invención no se limita por el tipo particular de asociación formada entre el conjugado de esfingoide-polialquilamina y la molécula biológicamente activa. De esta manera, asociación significa cualquier interacción entre el conjugado o el montaje formado de lo mismo y el material biológicamente activo que es capaz de lograr un efecto terapéutico deseado. La molécula biológicamente activa y el conjugado se pueden asociar por cualquier método conocido en la técnica. Esto incluye, de manera enunciativa y sin limitación, pos- o co-liofilización del conjugado con la molécula biológicamente activa, o al mezclar solo el conjugado preformado de esfingoide-polialquilamina con la molécula biológica. El método para la co-liofilización se describe, inter alia en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,156,337 y 6,066,331, en tanto que los métodos para el post-encapsulación se describen, inter alia, en la O03/000227, todas incorporadas en la presente como referencia. 16 De esta manera, de acuerdo a un primero de sus aspectos, la invención se refiere al uso de un conjugado de esfingoide-polialquílamina para la preparación de una composición farmacéutica para modular la respuesta inmunitaria de un sujeto, en donde el conjugado de esfingoide-polialquilamina comprende una estructura esfingoide que tiene, vía un enlace de carbamoilo, al menos una, y de manera preferente una o dos, cadena de polialquilamina . Como se indica anteriormente, el conjugado de esfingoide-polialquilamina incluye un enlace entre una estructura esfingoide y al menos una cadena de polialquilamina, el enlace es vía enlaces de carbamoilo correspondientes. De manera más preferente, el conjugado de esfingoide-polialquilamina tiene la fórmula general (I) : en donde Ri representa un hidrógeno, alquilo lineal o ramificado, arilo, alquilamina o un grupo -C(0)R5; R2 y Rs representan, independientemente, un grupo C10- C24 alquilo, alquenilo o polienilo lineal o ramificado; R3 y R4 son independientemente un grupo -C(0)~NRsR7, 17 R6 y R7 que son los mismos o diferentes para R3 y R4 y representan, independientemente, un hidrógeno, o una polialquilamina lineal o ramificada, saturada o insaturada, en donde una o más unidades de amina en la polialquilamina pueden ser un amonio cuaternario; o R3 es un hidrógeno; 1 R3 y R forman conjuntamente con los átomos de oxígeno a los cuales se unen un anillo heterocíclico que comprende -C (0) -NR9- [R8-NR9] m-C (O) - , R8 representa un Ci-4 alquilo saturado o insaturado y R9 representa un hidrógeno o una polialquilamina de la fórmula - [R8-NR9] n/ en donde el R9 o cada unidad de alquilamina R8NR9 pueden ser los mismos o diferentes en la polialquilamina; y n y m son independientemente un número entero de 1 a 10, de manera preferente 3 a 6; W representa un grupo seleccionado de -CH=CH-, -CH2-CH(0H)- o -CH2-CH2. Los ejemplos no limitantes de los esfingoides o bases esfingoides que se pueden usar de acuerdo a una modalidad más específica de la invención, incluyen, esfingosinas , dihidroesfingosinas , fitoesfingosinas , deshidrofitoesfingosinas y derivados de los mismos. Los ejemplos no limitantes de estos derivados son derivados de acilo, tal como ceramida (N-acilesfingosina) , dihidroceramidas, fitoceramidas y dihidrofitoceramidas, 18 respectivamente, asi como ceraminas (N-alquilesfingosina) y los derivados correspondientes (por ejemplo, dihidroceramina, fitoceramina, etc.). Los esfingoides o fases esfingoides N-sustituidas de manera adecuada poseen grupos hxdroxilo libres que se activan y reaccionan de manera subsiguiente con las polialquilaminas para formar la entidad de polialquilamina-esfingoide. Los ejemplos no limitantes de agentes de activación son ?,?' -disuccinimidilcarbonato, derivados de di-o tri-fosfeno o imidazol. La reacción de estos agentes de activación con los esfingoides o las bases esfingoides produce un succinimidiloxicarbonilo, cloroformiato, o carbamato de imidazol, respectivamente, en uno o ambos hidroxilos . La reacción de los esfingoides activados con las polialquilaminas puede producir conjugados ramificados, rectos (no ramificados) o cíclicos como se muestra en la Figura 1. De acuerdo a una modalidad preferida, la estructura esfingoide es un ceramida enlazada a una (Figura 1A) o dos (Figura IB o 1C) cadenas de polialquilamina, o enlazadas vía las , dos porciones de hidroxilo para formar una porción cíclica de polialquilamina (Figura ID) . Los conjugados formados de esfingoide-polialquilamina se pueden hacer reaccionar adicionalmente con agentes de metilación a fin de formar aminas cuaternarias . Los compuestos resultantes están positivamente cargados a un diferente grado dependiendo de la relación entre las aminas cuaternarias, primarias y/o secundarias dentro de los conjugados formados. Como tal, el conjugado de esfingoide-polialquilamina existe como sal de hidrógeno cuaternizado que incluye, de manera enunciativa y sin limitación, cloruro de amonio cuaternario, yoduro de amonio cuaternario, cloruro de amonio cuaternario, un bromuro de amonio cuaternario, oxianión de amonio cuaternario y una combinación de los mismos . El conjugado de esfingoide-polialquilamina se usa de manera preferente en combinación con una molécula biológicamente activa. El material biológicamente activo es cualquier molécula que cuando se administra con el conjugado de esfingoide-polialquilamina tiene un efecto en el sistema inmunitario de un sujeto, de acuerdo con una modalidad, un efecto estimulador o mej orador. El efecto es de manera preferente por un factor de dos o más correlación al efecto, si lo hay, de la molécula biológicamente activa, cuando se proporciona a un sujeto sin el conjugado. De acuerdo a una modalidad, el material biológicamente activo es una proteína, polipéptido, péptido o carbohidrato. De manera específica, la molécula biológicamente activa puede ser un inmunomodulador, que incluye proteína antigénica o péptido antigénico, inmunoestimulantes y/o inmunosupresores . Las proteínas antigénicas y péptidos, inmunoestimulantes e inmunosupresores son bien conocidos en la técnica. De manera preferente, la protelna o péptido biológicamente activo o carbohidrato, tiene un pH fisiológico ya sea en un momento de dipolo negativo neto, carga negativa neta o contiene al menos una región que tiene una carga negativa neta, negativamente cargada. De acuerdo aún a otra modalidad, el material biológicamente activo es una molécula de ácido nucleico, tal como oligodesoxinucleótidos (ODN) . Una relación en peso preferida entre el conjugado de esfingoide-polialquilamina y el material biológicamente activo es una relación en peso de 1000:1 a 1:1. El conjugado de esfingoide-polialquilamina también se puede combinar con otras sustancias activas conocidas como que se usan en combinación con moléculas antigénicas . Estas sustancias incluyen, por ejemplo, agentes inmunoestimulantes (también conocidos por el término "inmunoestimulantes" o "adyuvantes"). Esto incluye cualquier sustancia que cuando se adiciona a una vacuna mejoran la respuesta inmunitaria de modo que se necesite menos vacuna para producir una mayor respuesta. El agente inmunoestimulador se puede proporcionar conjuntamente con el conjugado/material biológicamente activo, o dentro de un intervalo de tiempo específico (por ejemplo, varias horas o días antes o después de la administración del conjugado/molécula biológicamente activa) . Los agentes inmunoestimuladores preferidos incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, citosinas, tal como interleucinas (IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18) , interferones (IFN alfa, beta, gamma) , oligodesoxinucleótidos (ODN) , toxinas (por ejemplo, toxina de cólera (CT) , enterotoxina B estafilococal (SEB) ) , enterotoxina de E. Coli de marca térmica (HLT) así como cualquier otro adyuvante conocido que se use en la técnica para mejorar o estimular la respuesta inmunitaria a una molécula antigénica. Los montajes pueden incluir el conjugado de esfingoide-polialquilamina (no metilado o metilado) como el único ingrediente tipo lípido, o se combina con otras sustancias lipídicas auxiliares. Estas sustancias lipídicas auxiliares pueden incluir lípidos no catiónicos tal como DOPE, DOPC, DMPC, colesterol, ácido oleico u otros a diferentes relaciones molares al compuesto tipo lípido. El colesterol es una sustancia adicional preferida para la aplicación in vivo en tanto que DOPE puede ser un lípido auxiliar preferido para aplicaciones in vitro. En esta modalidad particular, la relación molar de colesterol a lípido catiónico está dentro del intervalo de 0.01-1.0 y de manera preferente 0.1-0.4. Los montajes también incluyen mejoradores o intensificadores (como se conoce en la técnica, tal como 22 CaCl2 Y polialquilaminas solubles . Otros componentes que se pueden incluir en el montaje de lípido, y que se conoce que se usan en estructuras similares, son estabilizadores estéricos. Un ejemplo de un estabilizador estérico comúnmente usado es la familia de los lipopollmeros , por ejemplo, lípidos derivados de polietilenglicol (conjugado de PEG-lípido) . Esta familia de compuestos se conoce inter alia que incrementan (se extienden) el tiempo en circulación de los lípidos . De acuerdo a una modalidad, los liposomas formados se pueden formar como vesículas heterogéneas y heterolamelares no dimensionadas (UHV) que tienen un diámetro de aproximadamente 50-5000 nm. Las UHV formadas, se pueden reducir de tamaño y convertir a vesículas unilamelares (más homogéneas) grandes (LUV) que tienen un diámetro de aproximadamente 50-100 nm por procesamiento adicional. La estructura y dimensiones de la vesícula, por ejemplo, su forma y tamaño pueden tener implicaciones importantes en la eficiencia como vehículos para la distribución de las entidades biológicas activas al objetivo, es decir, estas determinan sus propiedades de distribución. Un grupo preferido de cadenas de polialquilamina que forman parte del conjugado de esfingoide-polialquilamina se han definido estructuralmente anteriormente en la presente en unión con la fórmula (I) . De acuerdo a esta modalidad, 23 las cadenas de polialquilamina, que pueden ser las mismas o diferentes en el conjugado de la fórmula (I) , se seleccionan de espermina, espermidina, un análogo de polialquilamina o una combinación de los mismos . El término análogo de polialquilamina se usa para denotar cualquier cadena de polialquilamina, y de acuerdo a una modalidad denota una polialquilamina que comprende de 1 a 10 grupos amina, de manera preferente de 3 a 6 y de manera más preferente de 3 o 4 grupos amina. Cada alquilamina dentro de la cadena de polialquilamina puede ser la misma o diferente y puede ser una amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria. La porción de alquilo, que puede ser la misma o diferente dentro de la cadena de polialquilamina, es de manera preferente una unidad de repetición alifática de Ci-C6. Algunos ejemplos no limitantes de polialquilamina incluyen espermidina, N- (2-aminoetil) -1 , 3-propano-diamina, 3,3'-iminobispropilamina, y derivados de bis (etilo) de espermina, polietilenimina . El conjugado de esfingoide-polialquilamina más preferido de acuerdo a la invención es N-palmitoil-D-eritro-esfingosil-carbamoil-espermina (CCS) . Este conjugado incluye una ceramida enlazada vía un enlace de carbamoilo a espermina. El conjugado de esfingoide-polialquilamina de acuerdo a la invención se usa de manera preferente para la preparación de una vacuna.

De acuerdo a una modalidad, el conjugado de esfingoide-polialquilamina, y de manera preferente el CCS, se usa para la preparación de una vacuna de influenza. En esta modalidad particular, el material biológicamente activo se deriva del virus de influenza o un análogo biológicamente activo de una molécula derivada del virus de influenza. Estos análogos incluyen cualquier sustancia que incluya un fragmento antigénico derivado de influenza que produzca una respuesta inmunitaria. Un material antigénico derivado de influenza específico son las moléculas de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) , la combinación se refiere como HN. La presente invención también se refiere a un método para modular la respuesta inmunitaria de un sujeto, el método comprende tratar al sujeto con el conjugado de esfingoide-polialquilamina junto con un material biológicamente activo. El tratamiento combinado incluye administración del conjugado de esfingoide-polialquilamina y el material biológicamente activo ya sea de forma conjunta, o dentro de un intervalo de tiempo predefinido, tal como varias horas o varios días (opcionalmente en combinación con un inmunoestimulante) . Sin embargo, de acuerdo a una modalidad preferida, el conjugado y el material biológicamente activo se mezclan conjuntamente antes de la administración al sujeto. 25 La administración del conjugado de esfingoide-polialquilamina junto con el material biológicamente activo se refiere a otro aspecto de la invención. Por consiguiente, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador fisiológicamente aceptable y una cantidad efectiva de un conjugado de esfingoide-polialquilamina junto con el material biológicamente activo. La composición farmacéutica comprende opcionalmente un inmunoestimulante . El conjugado de esfingoide-polialquilamina en combinación con el material biológicamente activo se puede administrar y dosificar de acuerdo con la buena práctica médica, tomando en cuenta la condición clínica del paciente individual, el sitio y método de administración, la programación de la administración, edad, sexo, peso corporal y otros factores del paciente conocidos por los practicantes médicos . La "cantidad efectiva" para propósitos en la presente denota una cantidad que es efectiva para modular (mejorar o estimular, como se define anteriormente) la respuesta inmunitaria de un sujeto con relación al efecto obtenido cuando el material biológicamente activo se proporciona al sujeto sin el conjugado de esfingoide-polialquilamina. De manera preferente, la cantidades efectiva para lograr inmunización efectiva de un sujeto contra una enfermedad o trastorno específico. No obstante de lo anterior, la cantidad puede ser efectiva para lograr supresión o inhibición de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, para el propósito de tratar alergia o respuestas autoinmunitarias . La composición de la invención que comprende el conjugado de esfingoide-polialquilamina asociado con el material biológicamente activo se puede administrar de varias maneras. Los ejemplos no limitantes de rutas de administración incluyen administración oral, subcutánea (s.c), parenteral que incluye intravenosa (i.v.), intra-arterial (i.a.), intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p.), intrarrectal (i.r.) e intranasal (i.n.), así como técnicas de infusión al ojo, de forma intraocular. De manera preferente, los modos de administración son las administraciones intranasales o . intramusculares . El portador fisiológicamente aceptable de acuerdo a la invención se refiere en general a sustancias sólidas o líquidas, no tóxicas, inertes que no reaccionan de manera preferente con el material biológicamente activo o con el conjugado y que se requieren para la distribución efectiva del conjugado con la molécula biológicamente activa. Los ejemplos no limitantes del portador fisiológicamente aceptable incluyen agua, solución salina, dextrosa al 5% (glucosa), sacarosa al 10%, etc., ya sea sola o con cantidades menores (hasta 10%) de un alcohol, tal como etanol .

De manera preferente, la composición de la invención es una formulación líquida, que incluye suspensiones, soluciones acuosas o en la forma de un aerosol, todas las cuales se conocen por aquellos expertos en la técnica. Las formulaciones en aerosol se pueden colocar en propulsores aceptables presurizados , tal como propano, nitrógeno y similares. También se puede formar como productos farmacéuticos para preparaciones no presurizadas , tal como en portadores adecuados para nebulizador o atomizador .

Descripción de Ejemplos Específicos Influenza Caracterización de liposomas catiónicos cargados con antígeno de H Se probó la eficiencia de la encapsulación de HN (una preparación comercial de hemaglutinina y neuraminidasa derivada de virus de influenza) cargada en varias formulaciones liposomales ca iónicas, a diferentes relaciones p/p de lípido/proteína (3/1-300/1) , y con o sin colesterol (Col) . La Tabla 1 muestra los resultados de este experimento, usando los lípidos catiónicos DOTAP y CCS . 28 Tabal 1 El efecto de la relación de lípido (DOTAP, CCS) /proteína y colesterol (Col) en la eficiencia de encapsulacion relación p/p relación molar % encapsulacion relación p/p relación molar % encapsulacion DOTAP/HN DOTAP/Col HN CCS/HN CCS/Col HN. 300/1 1/1 93 300/1 1/0 73 100/1 1/1 90 100/1 1/0 64 50/1 1/1 90 30/1 1/0 38 30/1 1/1 88 10/1 1/0 1 10/1 1/1 79 3/1 1/1 35 100/1 1/0 90 300/1 3/2 71 100/1 1/1 92 100/1 3/2 64 100/1 2/1 89 30/1 3/2 41 100/1 4/1 · 80 10/1 3/2 0 Se usó una vacuna monovalente para DOTAP y una vacuna trivalente para CCS. El porcentaje de la carga para DOTAP fue 75-90% usando una relación de p/p de lípido/proteína de 50/1 a 300/1, con y sin Col. La relación p/p lípido/proteína de 30/1 a 300/1, se logró aproximadamente 90% de carga de antígeno, disminuyendo a 79% y 35% a relaciones de 10/1 y 3/1 p/p, respectivamente. La adición de Col a la formulación no afectó a la carga en las relaciones molares de DOTAP/Col de 1/1 y 2/1, con ligeramente menor encapsulamiento (80%) a una relación de 4/1. Para CCS, con o sin Col, la eficiencia de carga fue menor (64-73% a relación de p/p de 100/1-300/1) . La asociación de HN con los liposomas en el mezclado simple del antígeno soluble con liposomas vacíos preformados también se determinó. En estos casos, se asoció 40-60% del antígeno con los liposomas usando una relación p/p de lípido/proteina de 100/ a 300/1, a pesar de la formulación. Este hallazgo, indica de forma colectiva alta eficiencia de carga (> 60%) usando un procedimiento simple y rápido (5 minutos) en todas las formulaciones. Adicionalmente, aún los liposomas preformados en suspensión acuosa fueron capaces de asociarse efectivamente con los antígenos superficiales del virus de influenza. La inmunogenicidad de las varias relaciones p/p de lí ido/antígeno (con o sin la adición de colesterol) también se evaluó. En un primer experimento, se determinaron varios niveles de anticuerpos de HI, IgGl e IgG2a después de la vacunación i.n. de ratones BALB/c (2 meses de edad) jóvenes con liposomas neutrales, aniónicos o catiónicos cargados con HN (Tabla 2A) . El antígeno de HN fue una vacuna de subunidad monovalente derivada de la cepa A/New Caledonia (HIN1) en el mismo experimento, también se probaron los niveles pulmonares y nasales de los anticuerpos HI, IgGl, IgG2a e gA y los niveles de INFy producidos por células de vaso, (Tablas 2B y 2C) .

Tabla 2A Niveles de sueros de anticuerpo Hl, igGl, y IgG2a Grupo Suero Vacuna » . <n=5> . Hl (media + SD) IgGl IgG2a 1 PBS 0 0 0 2 F-HN 0 55 0 3 Lip (D PC)-HN (Neutral) 3+7 (0) 150 0 4 Lip (DMPC/DMPG)-HN 6+13 (20) 500 0 (Amónico) 5 Lip (DC-Chol:DOPE)-HN 18±7 (0) 0 0 6 Lip (DSTAP:Col)-HN 28+29 (40) 20 0 7 Lip (DDAB: C.ol)-HN 136±32 (100) 100 0 8 Lip (DOTAP: ColVHN 576±128 (100) 15000 730 9 Lip (DMTAP: Col)-HN 672+212 (100) 30000 470 10 Lip (CCS: Col)-HN 2368+1805 (100) 30000 9000 11 F-HN+CT (l g) 1664+572 (100) 55000 7000 F-HN, antigeno libre; Col, colesterol; CT, toxina de cólera.

Los grupos 5-10 son liposoraas catiónicos. En el paréntesis, % de ceroconversión-% de ratones con título de Hl = 40. En particular, se hizo una comparación entre montajes neutrales (DMPC) , aniónicos (DMPC/DMPG, relación molar 9/1} y catiónicos (6 formulaciones) (Lip) que encapsulan los antlgenos de HN para inducir respuestas locales y sistémicas después de dos administraciones i.n. Para todas las formulaciones, la relación p/p de lípido/HN fue de 300/1, y la relación molar de lípido catiónico fue lipido catiónico/Col o lípido catiónico/DOPE fue 1/1. El antígeno libre (F-HN) y el F-HN co-administrado con toxina de cólera (CT, 1 /¿g) como un adyuvante se probaron en paralelo. Las vacunas se dan en los días 0 y 7, 3 g/dosis (10 µ? por 31 fosa nasal) , y se determinaron las respuestas a las 4 - 6 semanas después de la segunda dosis de vacuna .

Tabla 2B Niveles de lavado pulmonar y nasal de anticuerpos IgGl, IgG2a e IgA Grupo Vacuna Pulmón Nasal IgGl IgG2a IgA ½G1 IgG2a IgA 1 PBS 0 0 0 0 0 0 2 F-HN 0 0 ' 0 0 . 0 0 3 Lip (DMPC)-HN (Neutral) 30 0 0 0 0 0 4 Lip (DMPC/DMPG)-HN 40 0 0 0 0 0 (Amónico) 5 Lip (DC-Col:DOPE)-HN 0 0 0 0 0 0 6 Lip (DSTAP:Col>HN 0 20 0 0 80 0 7 Lip (DDAB: Col)-HN 0 80 30 0 30 0 8 Lip (DOTAP: Col)-H 730 1050 170 40 180 30 9 Lip (DMTAP: C.oD-HN 470 3000 30 15 80 70 10 Lip (CCS: Col>HN 9000 30000 1900 15000 30 300 11 F-HN+CT (lugj 7000 10000 1800 40 120 30 Tabla 2C Niveles de INFy de bazo (pg/ml ) 2 F-HN 1400 3 Lip (DMPC)-HN (Neutral) 4200 4 Lip (DMPC/DMPG)-HN (Anionico) 4000 5 Lip (DC-Col:DOPE)-HN 4900 6 Lip (DSTAP:Col)-HN 2300 7 Lip (DDAB: Col)-HN 3100 8 Lip (DOTAP: Col)-HN 8000 9 Lip (DMTAP: C.ol)-HN 7800 10 Lip (CCS: Col)-HN 10200 11 F-HN+CT (1µ§) 5200 32 Como se muestra en las Tabla 2A-2C, el antígeno libre, así como el Lip-HN neutral y aniónico fueron virtualmente vacunas mucósicas inefectivas. En contraste, el Lip-HN catiónico, particularmente aquellos designados DOTAP-HN, DMTAP-HN y CCS-HN provocaron una respuesta humoral sistémica y mucosal fuerte, con altos niveles de anticuerpos IgGl, IgG2a e IgA, específicamente una respuesta Thl+Th2 mezclada. No se detectaron anticuerpos IgE. Las vacunas liposomales catiónicas que comprenden DOTAP-HN, DMTAP-HN y CCS-HN también indujeron altos niveles de ???? (pero no IL-4) en células de bazo estimuladas con antígeno. Las respuestas producidas por CCS-HN fueron aún más fuertes que aquellas inducidas por F-HN con adyuvante de CT. En base a estos hallazgos, se usaron adicionalmente solo las formulaciones liposomales catiónicas: DOTAP-HN, DMTAP-HN y CCS-HN. ^ En un segundo experimento, el efecto de la relación de lípido/HN en la inmunogenicidad de liposomas catiónicos cargados con HN y de liposomas preformados mezclados simplemente con el antígeno soluble, se determinó. Los datos mostrados en las Tablas 3A-3C indican que las tres formulaciones indujeron una fuerte respuesta sistémica (sérica) y local (pulmonar) , y que la disminución de la relación p/p de lípido/NH por debajo de 100/1 redujo notablemente la respuesta. 33 Tabla 3A Niveles de suero de anticuerpo HI, igGl, IgG2a e igA Vacuna (n— 5) relación p/p Hi Lípido/HN suero IgG2a : ' ¾A 1 F-HN 0 0 0 0 2 Lip (DOTAP)-HN 300/1 496+295 (100) 15000 450 0 3 100/1 196+119 (100) 5000 280 0 4 30/1 36+50 (80) 1000 200 0 5 10/1 28+18 (60) 600 30 0 6 3/1 0 20 0 0 7 Lip (DMTAP)-HN 300/1 388±260 (100) 2500 250 0 8 100/1 208±107 (100) 2200 600 0 9 50/1 130+118 (80) 850 150 0 10 30/1 48+71 (40) 450 0 0 11 10/1 24±35 (40) 120 0 0 12 Lip (CCS)-HN 300/1 560+480 (100) 2000 1800 200 13 100/1 752+504 (100) 6500 6000 0 14 50/1 272+156 (100) 1900 700 0 15 30/1 112+125 (80) 650 400 0 16 10/1 52+68 (40) 275 440 0 17 F-HN+CT (ljig) - 896+350 (100) 30000 8000 120 18 F-HN+Lip (DOTA?) 300/1 864+446 (100) 5000 1500 0 19 F-HN+Lip (DMTAP) 300/1 320+226 (100) 1900 400 0 20 F-HN+Lip (CCS) 300/1 704±525 (100) 30000 5000 500 En los grupos 18-20 se mezclaron liposomas preformados con el antígeno soluble. 34 Tabla 3B Niveles pulmonares de HI, IgGl, IgG2a e IgA Vacuna (n=5) relación p/p " Hi Lipido/HN suero 1 • IgGl IgG2a ISA F-H 0 0 0 0 Lip (DOTAP)-HN 300/1 40 600 85 30 100/1 40 500 20 0 30/1 30 250 35 0 10/1 20 250 0 0 3/1 10 20 0 0 Lip (DMTAP)-HN 300/1 0 5500 200 1200 100/1 0 7000 350 0 50/1 0 4500 250 0 30/1 0 1500 110 0 10/1 0 500 0 0 Lip (CCS)-HN 300/1 80 12500 3000 20000 100/1 80 7000 5500 65000 50/1 40 5500 900 20000 30/1 0 1500 200 0 10/1 0 500 200 0 F-HN+CT (1µ ) - 80 45000 2250 3000 F-HN+Lip (DOTAP) 300/1 0 6000 500 1200 F-HN+Lip (DMTAP) 300/1 0 3750 225 1500 F-HN+Lip (CCS) 300/1 80 35000 3000 80000 35 Tabla 3C Niveles de INFy de bazo (pg/ml) :. Vacuna relación p/p Í yi(ipg/inl) Lípido/HN bazo 1 F-HN 7430 2 Lip (DOTAP)-HN 300/1 9780 3 100/1 42220 4 30/1 20440 5 10/1 20400 6 3/1 27780 7 Lip (DMTAP)-HN 300/1 No realizado 8 100/1 9 50/1 10 30/1 11 io/i 12 Lip (CCS)-HN 300/1 13 100/1 14 50/1 15 30/1 16 10/1 17 F-HN+CT (^g) - 18 F-HN+Lip (DOTAP) 300/1 19 F-HN+Lip (DMTAP) 300/1 20 F-HN-í-Lip (CCS) 300/1 La superioridad de la vacuna Lip CCS-HN con respecto a otras formulaciones de vacuna se dio nuevamente como se refleja por los altos niveles de los anticuerpos IgG2a e IgA de suero y pulmón (grupos 12-16) . De forma interesante, el mezclado simple del antigeno soluble con liposomas preformados generó vacunas muy potentes (grupos 18-20) que son iguales a 36 los liposomas que encapsulan el antígeno. Esto sugiere que el encapsulamiento real del antígeno no puede ser necesario para la capacidad de adyuvante de los montajes catiónicos/liposomas. En un experimento adicional, se probó el efecto de colesterol en la inmunogenicidad de los liposomas cargados con HN . Las Tablas 4A-4C muestran los resultados de este experimento, indicando que la adición de Col redujo ligeramente la respuesta de HI sistémica a DOTAP-HN a relaciones molares de 2/1 y 4/1 (grupos 4,5), pero no a una relación molar de l/l (grupo 3), y mejoró moderadamente la respuesta total a DMTAP-HN a todas las relaciones (grupos 7-9) y la respuesta local (pulmonar) CCS-HN a una relación de 1/1 (grupo 11) . 37 Tabla 4A Niveles séricos de anticuerpos HI, IgGl, IgG2a e IgA No.; Vacuna relación p/p HI 0=5) lípido cat Col suero IgGl IgG2 ¾ á A- ¦ 1 F-HN - 0 0 0 0 2 Lip (DOTAP)-HN 1/0 320+0 (100) 15000 450 0 3 Lip (DOTAP:Col)- 1/1 496+295 (100) 15000 450 0 HN 4 2/1 168+216 (100) 7000 800 0 5 4/1 195+111 (100) 15000 250 0 6 Lip (DMTAP)-H 1/0 320±188 (100) 20000 290 0 7 Lip (DMTAP:Col)- 1/1 672+419 (100) 30000 300 0 HN 8 2/1 576+368 (100) 25000 650 0 9 4/1 608+382 (100) 30000 600 0 10 Lip (CCS)-HN 1/0 2560+1568 30000 7000 10 (100) 0 11 Lip (CCS:C.ol)-HN 1/1 2368+1805(100) 30000 9000 10 n 12 F-HN+CT (?µß) _ 1664+572 (100) 55000 7000 20 Tabla 4B Niveles pulmonares de anticuerpos HI, IgGl, IgG2a e IgA Nó.."'ÍNo: ' Vacuna relación p/p HI (n=5) lípido cat/Col suero ¾G1 IgG2a 1 F-HN - 0 0 0 0 2. Lip (DOTAP)-HN 1/0 40 900 85 25 3 Lip (DOTAP:Col)- 1/1 40 600 80 30 HN 4 2/1 40 680 180 22 5 4/1 60 720 50 60 6 Lip (DMTAP)-HN 1/0 60 1000 40 0 7 Lip (DMTAPrCol)- 1/1 120 3000 30 15 HN 8 2/1 160 2500 160 200 9 4/1 80 4000 100 150 10 Lip (CCS)-HN 1/0 640 30000 1500 9000 11 Lip (CCS:Col)-HN 3/2 1280 30000 1900 15000 12 F-HN+CT (1µ¾) - 20 10000 1800 1000 38 TABLA 4C Niveles en bazo de INFy (pg/ml) TÍO. No; Vacuna 1 F-HN - 7430 2 Lip (DOTAP)-HN 1/0 7480 3 Lip (DOTAP:C.ol)-HN 1/1 9780 4 2/1 12870 5 4/1 9330 6 Lip DMTAP)-HN 1/0 8520 7 Lip (DMTAP:Col)-HN 1/1 10900 S 2/1 8560 9 4/1 7490 10 Lip (CCS)-HN 1/0 15550 11 Lip (CCS:Col)-HN 3/2 13780 12 F-HN+CT (1µ«) - 11110 La inmunogenicidad de la vacuna de CCS-HN también se evaluó en ratones C57BL/6 (18 meses)' envejecidos después de la administración intramuscular (una vez en el día 0) intranasal (dos veces, días 0 y 7) de 1 y 2 g, respectivamente, de la vacuna de sub-unidad (H ) (derivada de virus A/Panamá [H3N2] ) . Los montajes lipidíeos se compusieron de CCS/colesterol (relación molar 3:2) y -la relación p/p lípido/HN fue 200:1. Como lo opuesto a actividad cero de la vacuna comercial, la vacuna de CCS-HN provocó altos niveles de anticuerpos séricos de HI e IgG2a (probado a 4 semanas después de la vacunación) y anticuerpo IgG2a e IgA pulmonares (probados a 6 semanas después de la vacunación) como se puede ver en las Tablas 5A y 5B (los datos muestran títulos medios) .

Tabla 5A Niveles de suero de HI, IgGl, IgG2a e IgA en ratones envejecidos 2 F-HN i.m. xl 0 15 0 3 F-HN i.n. x2 0 0 0 4 Lip (CCS)-HN i.n. x2 80 130 350 Tabla 5B Niveles pulmonares de IgGl, IgG2a e IgA en ratones envej ecidos 3 F-HN i.n. x2 0 0 0 4 CCS-HN Ln. x2 0 180 840 Además, se probó la inducción de respuestas celulares por varias formulaciones de vacuna. En particular, se inmunizaron ratones jóvenes i.n. con varias formulaciones liposomales catiónicas y las respuestas celulares de esplenocitos, citotoxicidad, proliferación y producción de IFNy, se midieron 6 semanas después de la vacunación. En el experimento, los resultados del cual se muestran en la Tabla 6 , se hizo una comparación entre liposomas cargados con HN (grupos 3-10) y antígeno libre (F-HN) dado solo (grupo 2) o mezclado con liposomas vacíos preformados (grupos 11-13) . 40 También se determinó la inmunogenecidad de Lip (DMTAP) -HN y Lip (CCS) -HN a relaciones p/p de lipido/HN variables (30/1-300/1) .

Tabla 6 Inducción de respuestas celulares por liposomas catiónicos administrados i .n. . No. Vacuna Relación p/p % citotoxicidad Proliferación IFNy Lípido/HN péptido Ácpm (pgml) P815 + P815] " : ( media) 1 PBS - 6 4 7010 1900 2 F-HN - 8 5 7700 4500 3 Lip (DMTAP)-HN 300/1 16 13 10960 3500 4 100/1 9 9 12870 5850 · 5 50/1 3 2 17670 3400 6 30/1 3 2 17920 3050 7 Lip (CCS)-HN 300/1 4 2 20370 8000 8 100/1 21 7 24870 8250 9 50/1 6 3 20980 10650 10 30/1 8 5 11510 3500 11 F-HN + Lip (DOTAP) 300/1 17 4 19390 3400 12 F-HN + Lip (DMTAP) 300/1 17 7 11850 5700 13 F-HN + Lip (CCS) 300/1 16 8 19270 4100 Se obtuvo la citotoxicidad preferencial contra células objetivo especificas (P815 tratadas con impulso con el péptido de influenza) sólo con CCS-HN a una relación p/p de lípido/HN de 100/1 (grupo 8) y con los tres liposomas preformados (DOTAP, DMTAP y CCS) co-administrados con antígeno libre . La respuesta proliferativa máxima se observó con DMTA -HN a relaciones p/p de lípido/HN de 50/1 y 30/1 y con CCS-HN a relaciones 300/1, 100/1 y 50/1. Las respuestas proliferativa y citotóxica producidas por las formulaciones 41 liposomales más eficaces fueron 2-3 veces mayores que aquellas inducidas por el antígeno libre. Estos hallazgos sugieren que en comparación con la respuesta humoral (Tabla 3) , donde se obtuvieron los niveles más altos de todos los tipos de anticuerpos medidos a relaciones p/p de lípido/H de 100/1-300/1, pueden ser óptimas relaciones menores p/p (por ejemplo, 30/1-100/1) para las respuestas celulares. Además, en tanto que DMTAP-HN produce una fuerte respuesta humoral, esta formulación es un pobre inductor de actividad citotóxica, en comparación con CCS-HN. De forma interesante, la vacunación con mezclas de antígeno libre con liposomas catiónicos preformados (las tres formulaciones) en suspensión provocó buenas respuestas celulares que son similares en magnitud a aquellas inducidas por el antígeno encapsulado. De esta manera, el mezclado simple de antígeno libre con liposomas catiónicos preformados puede ser suficiente para inducir tanto una fuerte respuesta humoral (Tablas 3A-3C) como células (Tabla G) . En un experimento aún adicional, los resultados de los cuales se muestran en las Tablas 7A-7C, se hizo una comparación entre 1 dosis i.m., 1 o 2 dosis i.n. y 2 dosis orales de un liposoma catiónico cargado con HN monovalente que comprende DOTAP, DMTAP o CCS con respecto a la inmunogenicidad e inducción de inmunidad protectora a estímulo con virus vivo. En este experimento, la relación p/p 42 de lípido/HN fue de 300/1 y la relación de lípido catiónico/Col fue 1/1 para sistemas DOTAP y DMTAP y 3/2 para el sistema CCS . De las tres rutas,, la administración i.n. genera dos veces la respuesta humoral y celular más fuerte e inmunidad protectora. De las 3 formulaciones, CCS induce la respuesta más alta, particularmente con respecto a los anticuerpos IgG2a e IgA. Tabla 7A Niveles séricos de HI, IgGl, IgG2a e IgA No. Vacuna Ruta Suero (?=?¾ HI IgGl ¿ IgG2a IRA ¦ - 1 PBS 0 0 0 0 2 F-HN i.m. x 1 60±37 (70) 1000 40 0 3 oral x 2 0 0 0 0 4 i.n. x 1 0 0 0 0 5 i.n. x 2 0 55 0 0 6 Lip (DOTAP/Chol)- i.m. x 1 424±141 (100) 21000 5500 0 HN 7 oral x 2 0 0 0 0 8 i.n. x 1 40+28 (50) 450 80 0 9 i.n. x 2 409±172 (100) 25000 1300 60 10 Lip (DMTAP/Chol)- i.m. x 1 768±211 (100) 24000 8000 0 HN 11 oral x 2 0 0 0 0 12 i.n. x 1 10±10 (0) 300 60 · 0 13 i.n. x 2 532+763(100) 10500 380 50 14 Lip (CCS/Chol)-HN i.m. x 1 864+1100 (100) 25000 10000 0 15 oral x 2 0 0 16 i.n. x 1 34+50 (20) 1000 30 0 17 i.n. x 2 2289±1576 25000 20000 400 (100) 18 F-HN+CT (lng) i.n. x 2 756+650 (100) 21000 15000 20 43 Tabla 7B cuerpos de pulmón JVo. Vacuna - Ruta Pulmón (n=5) . . ; IgGl IgG2a . 1 PBS 0 0 0 0 2 F-HN i.m. x 1 0 80 0 0 3 oral x 2 0 0 0 0 4 i.n. x 1 0 0 0 0 5 i.n. x 2 0 70 20 0 6 Lip (DOTAP/Col)- i.m. x 1 40 900 500 0 HN 7 oral x 2 0 0 0 0 8 i.n. x 1 0 50 20 0 9 i.n. x 2 120 10000 1000 350 10 Lip (DM AP/Col)- i.m. x 1 20 900 150 0 HN 11 oral x 2 0 0 0 0 12 i.n. x 1 0 35 20 0 13 i.n. x 2 ¦ 240 20000 700 2200 14 Lip (CCS/Col)-HN i.m. x 1 60 3500 900 0 15 oral x 2 0 0 0 0 16 i.n. x 1 0 120 0 35 17 i.n. x 2 360 30000 5000 20000 18 F-HN+CT (^g) i.n. x 2 240 22000 2500 1800 44 Tabla 7C Respuesta celular e inmunidad protectora Jícc.' Vacuna Ruta Bazo Título Acpm Virus TFN. , Pujmón (media ) : (pg/nfl « 10) . - 1 PBS 1641 0 7 2 F-HN i.m. x 1 1909 0 4 3 oral x 2 2253 0 ND 4 i.n. x 1 669 0 ND 5 i.n. x 2 2813 0 5 6 Lip (DOTAP/C.ol)- i.m. x 1 3452 3300 0 HN 7 oral x 2 0 1150 ND 8 i.n. x 1 482 1900 ND 9 i.n. x 2 8391 3200 0 10 Lip (DMTAP/Col)- i.m. x 1 5632 0 1 HN 11 oral x 2 553 0 ND 12 i.n. x 1 1277 0 ND 13 i.n. x 2 7331 3150 0 14 Lip (CCS/C.ol)-HN i.m. x 1 6196 5750 0 15 oral x 2 476 550 MD 16 i.n. x 1 1705 6250 ND 17 i.n. x 2 4912 15500 0 18 F-HN+CT (l]ig) i.n. x 2 1933 5650 0 En el experimento descrito en las Tablas 8-10, se probó una vacuna trivalente comercial y se hizo una compararon entre una dosis individual de vacuna basada en CCS (usando 2 o 4 de antígeno [HN] de cada cepa viral) y dos dosis de vacunas (2 ^g/cepa/dosis) , dados a 3, 7 o 14 días de intervalo entre las administraciones. Los montajes de lipidos se compusieron de CCS/Col (colesterol) a una relación molar 3/2, y la relación p/p de lipido/HN fue de 100/1 para todas 45 las formulaciones. Como controles, la vacuna comercial trivalente normal (H ) se administró ya sea sola o combinada con 1 µ<3 de toxina de cólera (CT) , usada como un adyuvante mucosal. Se probaron lavados nasales, homogenados de pulmón y sueros 5-6 después de la primera dosis de vacuna para anticuerpos de HI (Tabla 8) así como para anticuerpos IgGl, IgG2a, IgA e IgE específicos del antígeno (Tabla 9) . Además, se estimularon 5 ratones de los grupos seleccionados i.n. con virus vivo (usando el virus X-127 recombinante, adaptado de ratón) y se valoró la protección al cuantificar el título de virus de pulmón 4 días después (Tabla 10) . Como lo opuesto a pobre o ninguna inmunogenicidad de la vacuna flu comercial (HN) (grupos 2-6) , la vacuna de CCS/Col-flu indujo altos títulos de todos los tipos de anticuerpos probados (excepto para IgE que estuvo sin detectar) , especialmente contra las dos cepas de virus A (grupos -11; Tablas 8,9) para el régimen de dos dosis, un intervalo de 1 semana parece ser el óptimo (gr. 10) . Para el régimen de dosis individual, 4 g de antígeno, pero no 2 g (gr. 8 vs . gr. 7), indujo altos títulos de los anticuerpos séricos HI, IgGl e IgG2a y los anticuerpos IgGl de pulmón. Sin embargo, en comparación con el régimen de 2 dosis, el régimen de 1 dosis no produjo anticuerpos IgG2a e IgA de pulmón ni anticuerpos nasales (Tabla 9) . En el ensayo de protección (Tabla 10) , la vacuna de CCS-flu administrada i.n. ya sea una vez (4 /¿g) o dos veces (2 /¿g/dosis) dio protección completa contra infección viral (reducción 6 log en título de virus de pulmón) en tanto que la vacuna normal redujo título de virus por sólo 0.5-1 log. De esta manera, aunque el régimen de dosis individual con la vacuna CCS-flu es inferior al régimen de dos dosis para ciertos isotipos de anticuerpo, los dos regímenes proporcionan un grado similar de protección. En este experimento, también se comparó CCS solo a CCS/Col como el portador de vacuna, y no se encontró diferencia en la inmunogenicidad entre las dos formulaciones (datos no mostrados) . Otra modificación en la formulación fue la reducción del tamaño de los montajes de lípido de CCS/Col (diámetro 0.05-5 µtt?) por extrusión (diámetro = 0.02 µp?) . Los títulos de anticuerpo inducidos por la vacuna extruida fueron 50-80% menores que aquellos producidos por la vacuna no extruida (datos no mostrados) . De esta manera, los montajes de lípido de CCS no dimensionados, con o sin colesterol, son altamente eficientes como un portador de vacuna para vacuna flu trivalente .

Tabla 8 Respuesta de anticuerpos de inhibición de hemaglutinación (Hl) después de vacunación intranasal con vacuna trivalente de influenza, libre y en montajes de lipido de CCS, administrada una o dos veces a varios intervalos de tiempo a ratones BALB/C jóvenes (2 meses) No.' Titulo Hl Medio1* ·* Vacuna1 (9-5); Días Á/Panámá B/YaManás Dosificación Caledbiüa suero pulmón suero pulmón suero pulmón 1 Ninguno (PBS) x2 0,7 0 0 0 0 0 0 2 F-HN 2 µ .?1 0 0 0 0 0 0 0 3 4 |ig xl 0 0 0 0 0 0 0 4 2 g x2 0, 3 0 0 0 0 0 0 5 2 g x2 0, 7 0 0 0 0 0 0 6 2 µg ?. 0, 14 0 0 0 0 0 0 7 Lip (CCS/Col)-HN 2 µg xl 0 0 0 0 0 0 0 10 8 4 µ 1 0 336 (100) 40 328 (100) 40 52 (80) 0 9 2 x% 3. 0, 3 544 (100) 80 408 (100) 40 52 (80) 0 10 2 µß 2 0, 7 544 (100) 80 544 (100) 120 88 (100) 0 11 2 | ig x2 0, 14 480 (100) 60 368 (100) 40 80 (80) 0 12 F~HN + CT (1 ß) 2 µß ?2 0, 7 608 (100) 80 664 (100) 120 84 (80) 0 aSe inmunizaron ratones con preparación de vacuna de suburílda'd trlvalénte FluvIrinMR 2003/2004 que consiste de tipo A New caledonla/20/99 (H1 1 ), tipo A/Moscow/10/99 (H3N2) y tipo B/Hong Kong/330/2001 , ya sea libre (F-HN) o Incorporado en CCS/Col (relación molar 3/2) en montajes de lipido (0.6 mg para grupos 7, 9, 10, 11 ; 1.2 mg para grupo 8). britulo Hl sérico se determinó en ratones individuales 35 dias después de la primera dosis de vacuna. Titulo Hl de pulmón (mezclado) se probó en el día 42. En paréntesis, % de ratones con título Hl = 40.0 denota titulo Hl < 20. 15 Tabla 9 Respuesta de anticuerpos lgG1, lgG2a e IgA específicos a antigeno, de suero, pulmón y nasales después de vacunación intranasal con vacuna de influenza trivalente, libre y en montajes de Ifpido de CCS, administrada una 3 4 µgxl 0 320 90 1500 0 0 0 0 0 4 2µd?2 0,3 0 0 0 0 0 0 0 0 5 2 µ ?2 0,7 0 0 0 0 0 0 0 0 6 2 g 2 0, 14 40 0 0 0 0 0 0 0 oo 7 Lip 2µg l 0 300 0 600 0 0 0 0 0 (CCS/Col)-HN 10 8 4µgxl 0 1200 4500 13000 0 0 0 0 0 ? ? 9 2µg 2 0,3 1500 10000 15000 2500 3500 0 10 0 ? ? 10 2µg 2 0,7 1500 12000 14000 2500 9000 200 30 100 ? ? 11 2µgx2 0, 14 1300 5500 12000 1800 3000 50 0 0 12 F-HN+CT (1 ) 2 µ¾?2 0,7 21000 15000 20000 2500 2000 250 30 45 'Ver Tabla 8 para detalles experimentales. Las muestras se mezclan y prueban por ELISA contra 15 las 3 cepas virales (HN mezclado) 42 días después de la primera dosis de vacuna.0 denota título < 10.

Tabla 10 Protección de ratones BALB/c jóvenes contra estimulación viral después de vacunación intranasal con vacuna de influenza trivalente, libre y en montajes de lípido de CCS No. - Vacuna a n=5) Días Dosificación Título Virus Pulmón (log 10)b 1 Ninguno - 6 2 . F-HN 4 µg xl 0 5.5 3 F-HN 2 µg x2 0, 7 5 4 Lip (CCS/Col)-HN 4 µd xl 0 0 5 Lip (CCS/Col)-HN 2 µ§ x2 0, 7 0 6 F-Ett^g + CT (1 µß) x2 0, 7 0 a Ver Tabla 8 para detalles experimentales. En grupos 4, 5, la relación de lípido/HN fue de 100/1. b Los ratones se infectaron intranasalmente 42 días después de la primera dosis de vacuna, usando aproximadamente 106 dosis infecciosa de huevo, 50% (EID 50) de virus X-127 recombinante adaptado a ratón (A/Bei ing/262/95 [HIN] x X31 [A/Hong Kong/1/68 x A/PR/8/34). Se recolectaron los pulmones cuatro 4 después, se homogeneizaron, se diluyeron en serie y se inyectaron en el saco alantoico de huevos de pollo fertilizados de lOd. Después de 48 h a 37°C y 16 h a 4°C, se removió 0.1 mL de fluido alantoico y se verificó para presencia viral por hemaglutinación. En el experimento descrito en las Tablas 11 y 12, la vacuna flu trivalente se formuló con los montajes de lípido CCS/Col usando cantidades variables de los antígenos 50 HN y el lipido. En este experimento, las vacunas se prepararon con: (a) cantidades variables del antlgeno (0.25 -2 g por cepa viral) y del lipido (0.075-0.6 mg) , manteniendo constante la relación p/p de lípido/HN a 100/1; (b) cantidades graduadas del antígeno (0.25-2 µg) y una cantidad constante de lipido (0.6 mg) variando de este modo la relación p/p de lípido/HN desde 100/1 a 800/1. Como se puede ver en la Tabla 11 (título HI) y Tabla 12 (títulos de isotipo) , las vacunas preparadas a una relación p/p de lípido/HN de 100/1 usando 2 o 1 jig de antígeno de cada cepa y 0.6 o 0.3 mg de lipido, respectivamente, produjeron niveles altos y similares de anticuerpos contra las 3 cepas virales (grupos 2, 3) . A menos dosis de antígeno (0.5, 0.25 µg/c a) y de lipido (0.15, 0.075 mg) , la respuesta disminuyó notablemente (grupos 4, 5), particularmente la respuesta mucosal (pulmón, nasal) (Tabla 12) . Cuando se usó una dosis constante de lipido (0.6 mg) , se obtuvieron niveles altos de anticuerpos aún con las dos dosis menores de antígeno (0.25, 0.5 g/cepa) (grupos 6-8). De esta manera, la cantidad de lipido CCS es crítica, y con la dosis apropiada de lipido, se puede reducir la dosis de antígeno 4-8 veces (desde 1-2 µg a 0.25-0.5 g) .

Tabla 11 Efecto de la dosis de antlgeno y dosis de llpido en la inducción de anticuerpos de Hl después de vacunación intranasal con vacuna de influenza trivalente formulada con montajes de Ifpido de CCS, administrada dos veces (en intervalo de 1 semana) a ratones BALB/c jóvenes (2 mo.) No. Vacuna " (¿,=5) - H Llpido Título Hl Medio (% seroconversión) Relación p/p (µe) (mg) Lipido/HN ^A Ne^.^aledoói ; .': AZPanama B Yámanashi Suero Pulmón Suero Pulmón Suero Pulmón 1 F-HN 2 - - 0 0 0 0 0 0 2 Lip (CCS/Chol)-HN 2 0.6 ¦ 100/1 544 (100) 80 544 (100) 120 88 (100) 0 3 1 0.3 100/1 320 (100) 80 544 (100) 160 40 (100) 0 4 0.5 0.15 100/1 416(100) 20 448 (100) 40 32 (100) 0 5 0.25 0.075 100/1 180 (100) 0 100 (100) 20 0 0 6 1 0.6 200/1 672 (100) 80 736 (100) 160 104 (100) 0 7 0.5 0.6 400/1 560 (100) 80 608 (100 160 104 (100) 0 10 8 0.25 0.6 800/1 512 (100) 80 512 (100) 120 48 (100) 0 a Ver Tabla} 8 para detalles experimentales 15 Tabla 12 Efecto de la dosis de antígeno y dosis de lipido en la Inducción de anticuerpos lgG1 , lgG2a e IgA específicos de antigeno, de suero, pulmón y nasal después de vacunación intranasal con vacuna de influenza trivalente formulada con montajes de lipido de CCS, administrada dos veces (a intervalo de 1 semana) a ratones BALB/c jóvenes 5 Vacuna a " HN . Lipido Relación Título Medio de Anticuerpos ? ¦ (n=5) p/p Suero Homogenado pulmonar Lavado nasal Lipido/ HN IgGÍ IgG2a ¦ ¦ 'M91 IgGI IgA ' á .*, 1 F-HN 2 - - 0 0 0 0 0 0 0 0 2 Lip (CCS/Col)-HN 2 0.6 100/1 15000 12000 14000 2500 9000 200 30 100 3 1 0.3 100/1 14000 2500 10000 1000 8000 100 0 80 4 0.5 0.15 100/1 15000 1300 8000 1500 4000 0 0 0 5 0.25 0.075 100/1 12000 400 3500 400 2500 0 0 0 6 1 0.6 200/1 20000 15000 12000 2500 8000 200 15 80 7 0.5 0.6 400/1 15000 14000 15000 5000 15000 150 35 100 8 0.25 0.6 800/1 15000 9000 21000 2500 13000 250 25 90 Ver Tablas 8, 9 para detalles experimentales 15 53 En un experimento adicional, la vacuna flu de sub-unidad, ya sea libre (HN) o asociada con los montajes de lípido de CCS/Col (Lip HN) , se probó para su capacidad para inducir a anticuerpos de HI de reacción en forma cruzada con las varias sub-cepas de influenza A y B que no se incluyeron en la vacuna. Los datos mostrados en la Tabla 13 indican que la vacunación intranasal (i.n.) e intramuscular (i.m.), administrada una o dos veces, con ya sea una vacuna de influenza basada en CCS, monovalente o trivalente, produjo altos títulos séricos de anticuerpos de HI dirigidos contra las cepas inmunizantes, así como anticuerpos de HI que reaccionan de forma cruzada con varias cepas de A/H1N1, A/H3N2 y B que estuvieron en circulación en los años 1986-1999 y no se incluyeron en la vacuna. Se encontró título de HI ligeramente menor después de una dosis individual de vacuna i.n. (gr. 6 vs . gr. 7) . Los títulos de HI de homogenado de pulmón (gr. 4, 8) fueron menores que los títulos correspondientes de suero. De esta manera, la vacunación parenteral o intranasal con la vacuna basada en CCS puede dar protección contra un amplio espectro de cepas virales A y B. Estas variantes antigénicas pueden emerger durante una epidemia/pandemia de flu como resultado de tendencia antigénica. En contraste, la vacuna comercial normal administrada i.n. (gr. 1, 5) fue totalmente inefectiva en inducir anticuerpos contra cepas tanto homologas como heterólogas.

Tabla 13 Inducción de anticuerpos de Hl de reactividad cruzada contra cepas después de vacunación intranasal o intramuscular de ratones BALB/c jóvenes con vacuna de influenza monovalente y trivalente basada en CCS No. Vacuna' Cepas Muestra Titulo Hl Medio contra: a Sueros mezclados y homogenado pulmonar obtenidos 5 semanas después de vacunación se probaron para anticuerpos de Hl. Para detalles experimentales, ver Tabla 8. Los montajes de llpido (Lip) se compusieron de CCS/Col (relación molar 3/2) y la relación p/p del lfpldo/HN fueron de 300/1 en grupos 2-4 y 100/1 en grupos 6-3. Excepto para grupos 3 y 6, las dos dosis de vacunas se separaron 1 semana. En negritas, los títulos de anticuerpo contra las cepas inmunizantes. 0 denota titulo Hl < 10 15 55 Biodistribución de liposomas aniónicos y catiónicos cargados con HN de administrados de forma intranasal En un experimento de bio-distribución, se administraron intranasalmente (200 /xg de lípido, 200 /¿g de antígeno por ratón) en ratones BALB/c, 3 formulaciones de monta e de lípido; C PC/DMPG (aniónico) , DOTAP/Col (catiónico) y CCS/Col (catiónico) ya sea vacio o cargado con antígenos HN de influenza. El lípido marcado fluorescentemente entonces se trazó en los homogenados de los varios tejidos durante un periodo de 24 h (a 1, 5 y 24 horas pos-administración) . Como se puede ver en la siguiente Tabla 14 y en las Figuras 2A-2F, después de 1 y 5 horas hubo 75-100% de recuperación del lípido administrado de las tres formulaciones probadas. Sin embargo, esta recuperación cayó de manera significativa a 24 horas en todas las formulaciones excepto para la formulación de CCS . La formulación de CCS que contiene los antígenos de HN exhibió la retención más larga (> 24 h) en los 3 órganos objetivo (nariz, pulmón, tracto GI) en tanto que no hubo acumulación de lípido en el cerebro y no hubo acumulación significativa en los otros órganos probados (hígado, ríñones, corazón, bazo) . 56 Tabla 14 Recuperación a las 1, 5 y 24 horas de montaje de lípido, fluorescentemente marcados administrados intranasalmente Cuando se usó HN marcado con 125I, su bio-distribución se asemejó a aquella de lípido fluorescente (datos no mostrados) . Esta larga retención de los componentes de la vacuna de CCS en el tracto respiratorio y de GI puede explicar, en parte, su inmunogenicidad superior con respecto a las otras formulaciones liposomales . Esto se exhibe en el siguiente estudio en el cual se trazó el componente de antígeno de la vacuna. Se marcaron proteínas de HN con 125I y se administraron intranasalmente ya sea libres, o asociadas con una de las formulaciones de lípido usadas en los experimentos de bio-distribución fluorescente. Se determinó la radioactividad de los varios tejidos a l, 5 y 24 horas pos-implante . La Tabla 15 enseña que la recuperación del antígeno fue alta en este experimento también. Como se puede ver en las Figuras 3A-3D, el patrón de bio-distribución del HN 57 marcado con 125I es similar a aquel del lípido (Figura 2A-2F) , estableciendo además que: (a) existe en realidad una asociación in vivo entre las proteínas de HN y los montajes del lípido, y (b) la retención prolongada en la nariz del antígeno cuando se asocia con los montajes de lípido catiónico puede ser debido a los montajes de lípido catiónico y no a la propiedad inherente de las proteínas de HN, puesto que no hay retención de HN cuando se administra la proteína por sí misma en forma soluble. También este experimento puede enseñar que no hay acumulación de proteína de HN en el cerebro cuando se administra sola o asociada con montajes de lípido (una cuestión principal de seguridad con vacunación intranasal) .

Puesto que el método de trazado radioactivo es mucho más sensible que el método fluorescente, este resultado se basa ¾ de manera más segura. 58 Tabla 15 Recuperación de HN marcada con 125I administrada intranasalmente ya sea sola o asociada con montaje de lípido a l, 5 y 24 horas En un intento de probar si la proteína y el lípido se retienen y/o depuran por cinética similar o diferente en los varios tejidos, se realizó otro análisis de los datos, donde se determinó la relación entre % de retención de antígeno (de la dosis total administrada) y el % de retención de lípido en los varios tejidos en varios puntos de tiempo. Cuando la relación es constante y es igual o aproximadamente 1, significa que ambos componentes se retuvieron de manera similar en el mismo órgano, en tanto que cuando esta relación es ya sea mayor o menor que 1, sugiere que la cinética de depuración de cada componente fue diferente y un componente se depuró más rápidamente que otro. Como se puede ver en la Tabla 16 a continuación, la única relación que permaneció constante con el tiempo fue 59 aquella de CCS/Col-HN en la nariz (relación = aproximadamente 0.45). Esto sugiere que: (a) la alta retención del antígeno en la nariz con CCS y DOTAP está en correlación con el nivel de asociación y debido a la unión de estas formulaciones a la mucosa nasal, en contraste a DMPC/DMPG; y (b) en tanto que los otros componentes de la formulación se disocian en el cuerpo y se depuran a velocidades diferentes, la formulación basada en CCS-H fue estable, especialmente en la nariz, y esto puede contribuir a la inmunogenicidad mejorada de vista con las vacunas basadas en CCS.

Tabla 16 Retención de lipido y antigeno de HN después de administración l.n. 5 10 Los valores muestran por ciento de retención de lipido total a proteína de HN administrada 61 Estudio de seguridad preliminar de la vacuna flu intranasal La toxicidad (local, sistémica) es una cuestión principal tanto con vacunas i.m. e i.n. y por lo tanto se estudió un estudio piloto de toxicidad. Las formulaciones del lípido catiónico (basadas en DMTAP, DOTAP, CCS) cargadas con los antigenos de influenza hemaglutinxna + neuraminidasa (HN) se administraron i.n. (dos veces, con separación de 1 semana) a ratones (n = 4/grupo) , y se realizó 72 horas más tarde la cuenta sanguínea (total, diferencial) , química sanguínea y examen histológico (nariz, secciones de pulmón) . Los ratones no mostraron signos evidentes de alguna toxicidad. Las cuentas sanguíneas y químicas sanguíneas estuvieron dentro del intervalo normal, y como se esperó, la respuesta inflamatoria mínima-moderada se dio de la nariz y los pulmones de ratones tratados con las formulaciones catiónicas . Una respuesta inflamatoria similar, aunque menos pronunciada, también se observó en algunos ratones tratados con solución salina sola o con el antígeno no encapsulado.

Actividad inmunomoduladora de vacuna CCS-flu en ratones En estos experimentos, se inyectaron ratones i.p. con varias formulaciones liposomales (compuestas de DMPC, DMPC/DMPG, DOTAP/Col, CCS/Col) , 0.5-1 mg de lípido, con o sin los antígenos de HN. Los ratones ya sea no se trataron o se inyectaron i.p. con tioglicolato (TG, para incrementar la 62 producción de macrófago) 2 días antes de la inyección de las formulaciones liposomales. Se recolectaron células peritoneales 24-48 h después de la administración de los liposomas y se usaron como tales o después de 4 de adsorción a 37°C en cajas de plástico y la remoción de células no adherentes . En otros experimentos , se recolectaron células peritoneales de ratones tratados con TG y se incubaron con las formulaciones liposomales durante 24-48 h. Las células se probaron por citometría de flujo por la expresión de MHC II y las moléculas co-estimuladoras CD40 y B7. Los sobrenadantes se probaron para las citocinas, interferón-? (IFNy) factor de necrosis tumoral alfa (TNF o¡) interleucina 12 (IL-12) y para óxido nítrico (NO) . Todas las formulaciones catiónicas (CCS/Col, DOTAP/Col, DMTAP/Col) favorecieron la expresión de B7 y CD40 más que las otras formulaciones (C PC [neutral] , cMPC/D PG [aniónicas] ) e indujeron mayores niveles de IFNy e IL-12. En algunos casos, la formulación de CCS/Col fue más efectiva que las otras formulaciones catiónicas. No se indujeron niveles significativos de TNF OÍ y NO por ninguna de · las formulaciones. La expresión mejorada de moléculas co-estimuladoras en células que presentan el antígeno y la inducción de IL-12 e IFN-? por las formulaciones catiónicas puede explicar, en parte, la mayor actividad adyuvante de estas formulaciones. Estos hallazgos combinados con la 63 retención prolongada de la vacuna CCS-flu en el tracto respiratorio (Figura 2C y 2F y Figura 3A-3D) después de administración intranasal puede explicar por qué CCS es este portador adyuvante de vacuna mucosal eficiente .

Virus de Hepatitis A (HAV) Además de la influenza, el potencial inmunomejorador de montajes de lípido de CCS también se probó para vacuna de HAV administrada por rutas intranasal (i.n.) e intra-rectal (i.r.). Se administró vacuna de HAV (Aventis Pasteur) , 10 EU (aproximadamente 1.5 /¿g de proteína) dos veces en un intervalo de 2 semanas y la respuesta se probó por, la técnica ELISPOT 3 semanas después de la segunda dosis de vacuna. CpG-ODN usado como un adyuvante mucosal, se dio a 10 ^g/dosis. Los montajes de HAV-lípido de CCS se prepararon como se describe anteriormente para la vacuna de influenza (Tabla 1) . Los datos presentados en la Tabla 17 muestran que en tanto que la vacuna de HAV comercial falló en inducir una respuesta de IgA en ambos tejidos (lámina propia, parches de Peyer) probados, y por ambas rutas de administración (i.n., i.r.), la vacuna formulada con ya sea CCS o CpG-ODN generó una respuesta significativa en la mayoría de los casos. La combinación de los montajes de HAV lípido de CCS y CpG-ODN dio por resultado una respuesta sinergista en todos los 64 casos. De esta manera, los montajes de lípido de CCS solos, y particularmente en combinación con CpG-ODN, también son efectivos como un portador/adyuvante para la vacunación mucosal contra HAV.

Tabla 17 Inducción de anticuerpos IgA después de vacunación intranasal (i.n.) o intra-rectal (i.r.) de ratones BALB/c con vacuna de virus de hepatitis A (HAV) , sola y en combinación con montajes de lipido de CCS y/o CpG-ODN Vacuna Media no. de IgA AFC/10- células en: .' ' ¦'.¾-:· Ln. "··" ¦ : i.rf"" .'."' HAV solo 0 0 ¦ 0 0 HAV-CCS 12 27 0 1 HAV + CpG-ODN 16 22 0 14 HAV-CCS + CpG-ODN 139 68 . 28 23 AFC- células formadoras de anticuerpos C . Botulinum En un experimento adicional, se inmunizaron ratones i.n. con una dosis de 0.4 µg de un toxoide comercial de C. botulinum (como un modelo para el agente de bioterror, Uruguay, libre de alum) y se probaron los títulos de anticuerpos por ELISA 4 semanas después de la segunda dosis de vacuna.

Los resultados de un experimento con toxoide de C. 65 botulinum se resumen en la Tabla 18, que muestra la superioridad de la formulación de CCS-toxoide con respecto a la vacuna normal después de la implantación i.n., particularmente con respecto a los niveles de IgA en el intestino delgado y heces. Estos Ab se espera que neutralicen la toxina en la exposición oral. Los ratones inmunizados i.n. con la vacuna sola no producen igA.

Tabla 18 Inducción de anticuerpos IgGl, lgG2a e IgA en ratones BALB/c vacunados intranasalmente (dos veces, 1 semana de separación) con toxoide de Clostridium botulinum (CBT) libre o asociado a CCS Vacuna a Titulo Medio de Anticuerpos Suero Intestino Delgado Heces lsGl-:¾' IsGSa .' ' ¾G1 ¡ IsG2a ISA Ig CBT 0 0 1000 180 0 0 CCS-CBT 400 24 1600 0 1800 •1800 Materiales Química Síntesis de N-palmitoil-D-eritro-esfingosil-l-carbamoil-espermina CCS) (i) Se disolvió N-palmitoilesfingosina (1.61 g, 3 mmol) en THF seco (100 mL) con calentamiento. La solución clara . se llevó a temperatura ambiente y se adicionó carbonato de ?,?' -disuccinimidilo (1.92 g, 7.5 mmol). Se adicionó DMAP (0.81 g, 7.5 mmol con agitación y la reacción se agitó adicionalmente durante 16 horas. El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo se recristalizó a partir de n-heptano produciendo 1.3 g (68 %) de carbonato de disuccinimidilceramidilo como polvo blanco, p.f. 73-76°C. (ii) Se disolvieron Espermina (0.5 g, 2.5 mmol) y carbonato de disuccinimidilceramidilo (0.39 g, 0.5 mmol) en diclorometano seco con agitación y luego se trató con cantidad catalítica de 4-dimetilamino-piridina (DMAP) . La solución se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas, el solvente se evaporó y el residuo se trató con agua, se filtró y se secó in vacuo, dando 0.4 g (82 %) del material crudo que se purificó adicionalmente por cromatografía en columna en gel de sílice, usando eluyente de Butanol: AcOH:H20 60:20:20. (iii) Para obtener una amina cuaternaria dentro del compuesto, el producto del paso (ii) se puede metilar con DMS ó CH3I. La estructura de CCS se confirmó por espectrometría de M l1 y 13C (datos no mostrados) . La descripción detallada del análisis se describe en la solicitud de patente Internacional co-pendiente No. .

Otros procedimientos de síntesis De manera similar al procedimiento anterior, se pueden aplicar los siguientes procedimientos : 67 Síntesis de conjugado de ceramida monosustituida lineal-espermina como se representa en la Figura 1A Se hace reaccionar un equivalente de una ceramida con 2.5 equivalentes de carbonato de disuccinimidilo en la presencia de DMAP para obtener el derivado de l,3-di-0-succinimidilo correspondiente. El derivado de disuccinimidilo obtenido de este modo se hace reaccionar con un equivalente de espermina a temperatura ambiente usando cantidad catalítica de DMAP para obtener el conjugado de ceramida 3-monosustituida-espermina de la Figura IB.

Síntesis de conjugado de ceramida disustituida lineal-espermina como se representa en la Figura IB Se hace reaccionar un equivalente de derivado de 1, 3-di-O-succinimidil-esfingoide preparado como se describe anteriormente con 2.5 equivalentes de espermina a 80° en la presencia de cantidades catalíticas de DMAP. El CCS 1,3-disustituido se obtiene de este modo.

Síntesis de conjugado de ceramida disustituida lineal espermina ramificada como se representa en la Figura 1C. Se hace reaccionar un equivalente de derivado de 1, 3-di-O-suscinimidil-ceramida preparado como se describe anteriormente con 2.5 equivalentes de espermina di-protegida 68 de alfa-omega a 80° en la presencia de cantidades catalíticas de DMAP. La protección se remueve y se obtiene el conjugado de ceramida di-sustituida 1, 3-"ramificada" -espermina.

Síntesis de conjugado de ceramida di-sustituida lineal espermina cíclica como se representa en la Figura ID Se hace reaccionar un equivalente de derivado de 1, 3-di-0-succinimidil-ceramida preparado como se describe anteriormente con 0.75 equivalentes de espermina a 80°C en la presencia de cantidades catalíticas de DMAP.

Antígenos de influenza Se proporcionó de forma generosa por Drs . Gluck y Zurbriggen, Berna Biotech, Bern, Suiza una preparación de antígeno de sub-unidad monovalente derivado de la sepa de influenza A/New Caledonia/20/99-like (H1N1) . Esta preparación (designada en la presente HN) comprendió 80-90 % de heraagglutenina, 5-10 % en peso de neuraminidasa y cantidades trasa de proteínas MI. Se obtuvo de Evans Vaccines Ltd., Liverpool, RU una vacuna de sub-unidad trivalente comercial (Fluvirun*) para la estación 2003/2004 que contiene HN derivado de A/New Caledonia/20/99 (H1N1) , A/Panama/2007/99 (H3N2) y B/Shangdong/7/97. Esta vacuna se concentró aprox x8 (concentrador Eppendorf 5301, Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) antes de la encapsulación. Se usó un virus inactivado .completo en algunos experimentos para la estimulación in vitro.

Lípidos Los fosfolípidos (PL) , dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC) , dimiristoil-fosfatidilglicerol (DMPG) , y dioleoil-fosfatodiletanolamina (DOPE) son de Lipoid GmbH, Ludwigshafen, alemania. Además de los liposomas de DMPC (neutral) y de DMPC/DMPG (relación molar 9/1, aniónico) , se prepararon 6 formulaciones de liposoma catiónicos/montajes de lípidos. Los lipidos monocatiónicos, dimetilaminoetano-carbamoil-colesterol (DC-Col) , 1, 2-diestearoil-3-trimetilamonio-propano (sal de cloruro) (DSTAP) , dioleoil-3-trimetilamoni-propano (sal de cloruro) (DOTAP) , y dimiristoil-3-trimetilamonio-propano (sal de cloruro) (DMTAP) son de Avanti Polar Lipids (Alabaste, AL, EUA) . El lípido monocatiónico, bromuro de dimetildiocadecilamonio (DDAB) y colesterol (Col) son de Sigma. El nuevo esfingolípido policatiónico de patente N-palmitoil-D-eritro-esfingosil-carbamoil-espermina (sal de acetato) (ceramida-carbamoil-espermina, CCS) es de Biolab. Ltd., Jerusalén, Israel. Donde se indica, los lípidos auxiliares de (DOPE, Col.) se usaron a una relación de lípido/auxiliar de 1/1 a 4/1 relación molar. 70 Ratones Se ' usaron ratones BALB/c hembras libres de patógenos específicos (SPF) de 6 a 8 semanas de edad, y ratones C57/BL/6, de 18 meses de edad (5-10 por grupo) . Los animales se mantuvieron bajo condiciones SPF.

Métodos Encapsulación de antígeno de influenza en liposomas/monta es de lipido Se encapsularon antígenos de H (ver anteriormente) en vesículas grandes (diámetro medio de 0.1 - 5 µp?) heterogéneos (sin tamaño) . Se usó el siguiente procedimiento por rutina para la preparación de todas las formulaciones de vacuna. Se disolvieron los lípidos (10-30 mg) en 1 mi de butanol-terciario, luego se esterilizó por filtración (GF92, Glasforser, Vorfilter no. 421051, Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania) . La solución estéril de lipido se congeló a -70°C, luego se liofilizó durante 24 h a sequedad completa. Los lípidos secados se pueden almacenar a 4°C durante >2 años sin degradación significativa (<5 %) de lípidos o pérdida de la capacidad de "encapsulación" . En la necesidad, se hidrató el polvo de lipido con la solución de antígeno (en PBS, pH 7.2) a una relación p/p de lipido : antígeno (proteína) de 3/1 a 800/1. La solución de antígeno se adicionó gradualmente en incrementos de 20-50 µ? y se sometió a vórtice vigorosamente 71 después de cada adición, hasta un volumen final de 0.5-1 mi. En algunos experimentos, los llpidos secos se hidrataron con PBS y se mezclaron los montajes de lípido "vacio" preformados con la solución de antígeno. La mezcla se sometió a vórtice durante 1-2 minutos y se usó como esta en el espacio de 30-60 minutos . Para determinar la eficiencia de "encapsulación" , se usaron dos procedimientos, dependiendo de la formulación, dando por resultado una separación =80 % entre el antígeno libre y el antígeno asociado a lípido. Para todas las formulaciones de vacuna, excepto CCS, se usó la siguiente técnica de separación. Los montajes de lípido (1-30 mg de lípido) que contienen el antígeno HN (50-100 µg de proteína) se dispersaron en 0.5 mi de PBS y se cargaron cuidadosamente sobre 0.5 mi de D20 (99.9 %, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA) . La muestra se centrifugó entonces durante 1 hora a 30°C a 45,000 rpm. El HN no encapsulado, libre precipita en tanto que el HN montado (liposomal) y en los montajes libres de proteína/liposomas permanecen en el sobrenadante. El sobrenadante completo se recolectó y se disolvieron los montajes/liposomas al adicionar 0.2 mi de Triton-X-100 al 10 % tanto al sobrenadante como a las fracciones de sedimento. Se determinó la concentración de proteína en ambas fracciones por la técnica de Lowry modificada. Para la formulación de CCS, el CCS-HN se suspendió en 0.5 mi de PBS-D20 (1 vol de 72 PBS X10 + 9 vol D20) luego se mezcló con 0.5 mi de PBS . La mezcla entonces se centrifugó durante 10 min a 20°C a 10,000 rpm. El antígeno CCS +/- precipita en tanto que el HN libre permanece en el sobrenadante. Se llevaron a cabo la disolución de lípido y la determinación de proteína en ambas fracciones como se describe anteriormente. En ambas técnicas de separación, la recuperación total de los antígenos de HN fue >95 %.

Inmunización Se administraron vacunas libres (F-NH) y montadas/liposomales (Lip-HN) de 0.25-4 µg de antígeno/cepa/dosis y 0.075-1.2 mg de lípido / dosis, ya sea una vez intramuscularmente (i.m., en 30 µ?) , una vez o dos veces intranasalmente (i.n., en 5-50 µ? por fosa nasal) separados por 3, 7 ó 14 días, o dos veces oralmente (en 50 µ?) separados por 1 semana. En todos los casos, los ratones se anestesiaron ligeramente con 0.15 mi de hidrato cloral al 4 % en PBS dado intraperitonealmente . Para la vacunación oral, los ratones se trataron oralmente con 0.5 mi de una solución antiácida (8 partes de solución salina balanceada de Hanks + 2 partes de bicarbonato de sodio al 7.5 %) 30 minutos antes de la vacunación. Se usó toxina de cólera (CT, Sigma, EUA) , 1 µg/dosis, en todos los experimentos como un adyuvante mucosal normal para comparación. En los dos experimentos, se 73 usó como un adyuvante CpG-ODN (ODN 1018, generosamente proporcionado por Dr. E. Raz, University of California, San Diego, CA, EUA) , libre y liposomal, 10 µg/dosis.

Valoración de respuestas humorales Se probaron los lavados séricos, los homogenados pulmonares y los lavados nasales, de forma individual o mezclada, 4-6 semanas después de la vacunación, iniciando a una dilución de muestra 1/10 ó 1/20. Los anticuerpos que inhiben la Hemagglutinación se determinaron por ensayo normal de inhibición de hemaglutinación (HI) iniciando una dilución de muestra de 1/10. Se definieron ratones con título de HI =40 (considerado un título protector en humanos) como seroconvertidos . Se midieron los niveles de IgGl, IgG2a, IgA e IgE específicos de antxgeno por ELISA. La dilusión más alta de muestra que produce absorbancia de 0.2 OD por arriba del control (antígeno + normal de ratón, OD <0.1) se consideró el título del anticuerpo de ELISA. Valoración de respuestas celulares Se probaron los esplenocitos obtenidos a las 5-6 semanas después de la vacunación para la respuesta proliferativa, producción de IFNy e IL-4, y la actividad citotóxica, después de la estimulación in vitro con el antígeno. Se llevaron a cabo cultivos a 37°C en medio RPMI 1640 ó DMEM enriquecido complementado con 5 % (para 74 proliferación, citocinas) ó 10 % (para citotoxicidad) de suero de becerro fetal (FCS) , con (para citotoxicidad) o sin 5 x 10"SM de 2-mercaptoetanol . Se realizaron cultivos celulares como sigue: (i) Proliferación: se incubaron 0.5 x 106 células por cavidad en placas de 96 cavidades en forma de U, en triplicado, con o sin el antígeno (0.5-5 g por cavidad), en un volumen final de 0.2 mi. Después de 72-96 , los cultivos se sometieron a impulsos con 1 µa de 3H-timidina durante 16 horas . Los resultados se expresan en ??t?? = (cuentas promedio por minuto de células cultivadas con antígeno) - (cuentas promedio por minuto de células cultivadas sin antígeno). (ii) Citocinas: 2.5 x 106 a 5 x 10e células por cavidad se incubaron en placas de 24 cavidades, en duplicado, con o sin el antígeno (5-10 g por cavidad) , en un volumen final de 1 mi . Se recolectaron sobrenadantes después de 48-72 h y se probaron por ELISA para IFNy bovino e IL-4 usando Opt EIA Set (Pharmingen, EUA) . (iii) Citotoxicidad: esplenocitos de respuesta (2.5 x 106) se incubaron como en (ii) durante 7 días junto con un número igual de esplenocitos BALB/c estimulantes que se han infectado con virus de influenza X/127(H1N1) (ver más adelante) . Para la infección, los esplenocitos se incubaron, con agitación ocasional, durante^ 3 h a 37°C en el medio RPMI 1640 (sin FCS) con 150 unidades de hemaglutinación/l x 106 esplenocitos del virus, seguido por lavado. De manera subsiguiente, las células efectoras cebadas se reestimularon durante 5 días con esplenocitos irradiados, infectados (3,000 rad) a una relación de células efectoras/estimuladoras de 1/4 en la presencia de 10 IU/ml de rhIL-2. Se midió la citotoxicidad usando el ensayo de liberación de 51Cr 4 h normal a una relación de células efectora/obj etivo de 100/1.

Las células objetivo marcadas, usadas, fueron P815 sin modificar y P815 con impulsos durante 90 minutos a 37°C, con el péptido HA2 189-199 (lYSTVASSLVL, 20 µg/lxl05 células) .

Determinación de inmunidad protectora Se anestesiaron ratones y se administraron 25 µ? de suspensión de virus vivo por fosa nasal, aproximadamente 107 EID 50 (dosis infecciosa de huevo 50 %) , usando el virus recombinante X-127 (A/Beijing/262/95 (H1N1) x X-31 (A/Hong Kong/l/168 x A/PR/8/34) , que es infecciosa a ratones y de reactividad cruzada con A/New Caledonia. Los pulmones se removieron en el día 4, se lavaron 3 veces en PBS frío, y se homogenizaron en PBS (1.5 mi por pulmones por ratón, referido como dilución 1/10) . Los homogenados de cada grupo se mezclaron y centrifugaron a 2000 rpm durante 30 min a 4°C y los sobrenadantes se recolectaron. Las diluciones seriales de 10 veces se realizaron y se inyectaron 0.2 mi de cada dilución, en duplicado, en el saco alantoico de huevos de pollo con embrión de 11 días. Después de 48 horas a 37°C y 16 76 horas a 4°C, se removieron 0.1 mi de fluido alantoico y se verificó para la presencia viral por hemaglutinación (30 min a temperatura ambiente) con eritrocitos de pollo (0.5 % en peso, 0.1 mi). El título de virus de pulmón se determinó como la dilución más alta del virus que produce homogenado del pulmón en el fluido alantoico (hemaglutinación positiva) .

Biodistribución y farmacocinética de varias formulaciones de lípido marcadas fluorescentemente y antígeno H marcado radioactivamente . Se vacunaron ratones una vez con formulaciones de montaje de lípido marcadas con lissamina-rodamina ya sea vacías o asociadas con vacuna de influencia de subunidad trivalente (HN) en un volumen de 20 µ?. Después de 1, 5 ó 24 horas, los ratones se sacrificaron y se removieron varios órganos. Los órganos se almacenaron a -20° durante la noche, y la siguiente mañana se homogenizaron en amortiguador de lisis. Se transfirieron 0.2 mi de homogenado subsiguiente a tubos eppendorf, se adicionaron 0.8 mL de isopropanol, y se giraron durante 15 minutos para liberar la sonda fluorescente en el sobrenadante. Se cargaron 50 µ? del sobrenadante en una placa negra 384 y se leyó la fluorescencia (Em: 545, Ex: 596) . En un ensayo adicional, se dializaron 450 µg de vacuna HN trivalente (en 5 mL) contra DDW (para remover la sal) y luego se concentraron X1000 a 5 µ?,. La proteína se diluyó entonces en amortiguador de borato 0.1 M (pH 8.5) a una solución concentrada de 450 µ en 15 µ?*. La proteína se marcó entonces con 125I usando el reactivo Bolton Hunter de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se les proporcionó a los ratones el HN marcado con 125i (2 µg) y a las 1, 5 y 24 horas,- los ratones se sacrificaron, y se removieron varios órganos (ver Figura 3) en frascos y se leyó en un ?-contador calibrado para 125I. La invención se definirá ahora por las reivindicaciones anexas, los contenidos de la cual se deben leer como que se incluyen dentro de la descripción de la especificación. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims

78 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Uso de un conjugado de esfingoide-polialquilamina para la preparación de una composición farmacéutica para modular la respuesta inmunitaria de un suj eto . 2. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el conjugado de esfingoide-polialquilamina comprende una estructura esfingoide que tiene, vía al menos un enlace de carbamoilo, al menos una cabina de polialquilamina. 3. Uso de conformidad con la reivindicación 1 o 2 , en donde la modulación incluye estimulación o mejora de la respuesta inmunitaria. 4. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 , en combinación con una molécula biológicamente activa, 5. Uso de conformidad con la reivindicación 4, en donde la molécula biológicamente activa tiene, a un pH fisiológico, un momento de dipolo negativo neto o una carga negativa neta o contiene al menos una región que tiene una carga negativa neta. 6. Uso de conformidad con la reivindicación 4 o 5 , 79 en donde la molécula biológicamente activa es una molécula de aminoácido inmunomoduladora, una molécula de ácido nucleico o un compuesto de bajo peso molecular. 7. Uso de conformidad con la reivindicación 6, en donde la molécula biológicamente activa es una proteína antigénica, péptido antigénico, polipéptido antigénico, carbohidrato o un inmunoestimulante . 8. Uso de conformidad con la reivindicación 6 , en donde la molécula de ácido nucleico es un oligodesoxinucleótido (ODN) . 9. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1. a 8, en combinación con un agente inmunoestimulador. 10. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el conjugado de esfingoide-polialquilamina forma montajes de liquido. 11. Uso de conformidad con la reivindicación 10, en donde el conjugado de esfingoide-polialquilamina forma vesículas, micelas o mezclas de los mismos. 12. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el esfingoide se selecciona de ceramida, dihidroceramida, fitoceramida, dihidrofitoceramida, ceramina, dihidroceramina, fitoceramina, dihidrofitoceramina . 13. Uso de conformidad con la reivindicación 12, en 80 donde el esfingoide es una ceramida. 14. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 , en donde la polialquilamina se selecciona de espermina, espermidina, un análogo de polialquilamina o una combinación del los mismos . 15. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, en donde el conjugado de esfingoide-polialquilamina se co-liofiliza con la molécula biológicamente activa, o el material biológicamente activo se mezcla con montajes preformados de conjugado de esfingoide-polialquilamina. 16. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el conjugado de esfingoide-polialquilamina es N-palmitoil-D-eritro-esfingosil-carbamoil-espermina (CCS) . 17. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para la preparación de una vacuna. 18. Uso de conformidad con la reivindicación 17, para la preparación de vacuna de influenza. 19. Uso de conformidad con la reivindicación 18, en donde el material biológicamente activo se deriva de virus de influenza o un análogo de una molécula derivada de virus de influenza . 20. Uso de conformidad con la reivindicación 19, en donde el material biológicamente activo es una combinación de 81 hemaglutinina y neuraminidaza H . 21. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la preparación de vacunación intranasal o intramuscular. 22. Uso de N-palmitoil-D-eritro-esfingosil-carbamoil-espermina (CCS) para la preparación de una composición farmacéutica para mejorar o estimular una respuesta inmunitaria de un sujeto a virus de influenza. 23. Composición farmacéutica para modular la respuesta inmunitaria de un sujeto, la composición está caracterizada porque comprende: (i) al menos un conjugado de esfingoide-polialquilamina; (ii) al menos una molécula biológicamente activa. 24. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque el conjugado de esfingoide-polialquilamina comprende una estructura esfingoide que tiene, vía un enlace de carbamoilo, al menos una cadena de polialquilamina . 25. La composición de conformidad con la reivindicación 23 o 24, caracterizada porque comprende al menos un portador fisiológicamente aceptable. 26. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, caracterizada porque la modulación incluye estimulación o mejora de la respuesta inmunitaria. 82 27. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, caracterizada porque la molécula biológicamente activa tiene a un pH fisiológico, un momento de dipolo negativo neto una carga negativa neta o contiene al menos una región que tiene una carga negativa. 28. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizada porque la molécula biológicamente activa es un imuno-modulador seleccionado de una molécula de aminoácido, una molécula de ácido nucleico, o una molécula de bajo peso molecular. 29. La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la molécula biológicamente activa se selecciona de proteína antigénica, péptido antigénico, polipéptido antigénico o un carbohidrato. 30. La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico es oligodesoxinucleótido (ODN) . 31. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 30, caracterizada porque comprende un agente inmunoestimulador. 32. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 31, caracterizada porque el conjugado de esfingoide-polialquilamina forma montajes de lípido . 33. La composición de conformidad con la 83 reivindicación 32, caracterizada porque el conjugado de esfingoide-polialquilamina forma vesículas o micelas o combinaciones de los mismos . 34. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 33, caracterizada porque la estructura esfingoide se selecciona de ceramida, dihidroceramida, fitoceramida, dihidrofitoceramida, ceramina, dihidroceramina, fitoceramina, dihidrofitoceramina. 35. La composición de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque el esfingoide es ceramida . 36. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35, caracterizada porque la polialquilamina se selecciona de espermina, espermidina o un análogo de polialquilamina de espermina, o espermidina. 37. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 36, caracterizada porque conjugado de esfingoide-polialquilamina es N-palmitoil-D-eritro-esfingosil-carbamoil-espermina (CCS) . 38. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 37, caracterizada porque es para la vacunación de un sujeto contra virus de influenza. 39. La composición de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la molécula biológicamente activa se deriva de virus de influenza o es un 84 análogo de una molécula derivada de virus de influenza. 40. La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la molécula biológicamente activa es una combinación de emaglutinina y neuraminidasa (NH) . 41. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 40, caracterizada porque está en una forma de dosis adecuada para administración intranasal o intramuscular . 42. Una vacuna caracterizada porque comprende N-palmitoil-D-eritro-esfingosil-carbamoil-espermina (CCS) en combinación con hemaglutinina y neuraminidasa. 43. Un complejo caracterizado porque comprende: (i) un conjugado de esfingoide-polialquilamina y (ii) una molécula biológicamente activa capaz de modular una respuesta inmunitaria de un sujeto. 44. El complejo de conformidad con la reivindicación 43 , caracterizado porque el esfingoide está enlazado, vía un enlace de carbamoilo, a al menos una cadena de polialquilamina. 45. El complejo de conformidad con la reivindicación 43 o 44, caracterizado porque la molécula biológicamente activa tiene un pH fisiológico, un momento de dipolo negativo neto o una carga negativa neta o contiene al menos una región que tiene una carga negativa neta. 85 46. El complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 45, caracterizado porque la molécula biológicamente activa es un inmuno-modulador seleccionado de una molécula de aminoácido, una molécula de ácido nucleico, o una molécula de bajo peso molecular. 47. El complejo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la molécula biológicamente activa se selecciona de una proteína antigénica, péptido antigénico, polipéptido antigénico o un carbohidrato. 48. El complejo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico es un oligodesoxinucleótido (ODN) . 49. El complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 48, caracterizado porque el conjugado de esfingoide-polialquilamina forma montajes de lípido . 50. El complejo de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el conjugado de esfingoide-polialquilamina forma vesículas o micelas o combinaciones de los mismos. 51. El complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 50, caracterizado porque el esfingoide se selecciona de ceramida, dihidroceramida, fitoceramida, dihidrofitoceramida, ceramina, dihidroceramina, 86 fitoceramina, dihidrofitoceramina. 52. El complejo de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque el esfingoide es ceramida . 53. El complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 51, caracterizado porque la polialquilamina se selecciona de espermina, espermidina o un análogo de poliamina de espermina o espermidina. 54. El complejo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 53, caracterizado porque el conjugado de esfingoide-polialquilamina es N-palmitoil-D-eritro-esfingosil-carbamoil-espermina (CCS) . 55. Un equipo para capturar una molécula biológicamente activa, el equipo está caracterizado porque comprende un conjugado de esfingoide-polialquilamina como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, e instrucciones para el uso del conjugado como un agente de captura .