CN117618547A - 一种rsv疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗组合物,涉及生物医药工程领域。本发明将表达的融合前F蛋白和本发明的佐剂组合后,制备疫苗组合物,所述疫苗组合物可诱导产生高滴度的中和抗体,以及IL‑2、IFN‑γ等Th1型细胞因子。
Description
技术领域
本申请属于生物医药工程领域,特别涉及一种RSV疫苗组合物及其制备方法和其在免疫治疗及预防领域的应用。
背景技术
呼吸道合胞病毒(RSV)是感染肺和呼吸道的呼吸道病毒,是世界范围内婴儿中严重病毒性下呼吸道疾病的主要原因,且是老年人呼吸疾病的重要原因。RSV F(针对所述病毒的中和抗体的主要靶标)是在病毒包膜上丰富的I类融合糖蛋白。尽管对F蛋白诸多的结构设计已经足以使其呈稳定的融合前构象,发挥改善的免疫原性,但对于重组亚单位疫苗而言,使用佐剂是尤为重要的,其可减少抗原使用量、增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。铝佐剂是目前批准且应用最为广泛的佐剂,但铝佐剂对体液免疫应答具有有限的佐剂作用。发明人发现MPL与PolyI:C或TQL-1055组合制备的脂质体佐剂不仅可以提高体液免疫应答,还能强效刺激Th1型免疫。生物相容性好,且大大降低佐剂的副作用。然而其是否能有效增强机体对RSV抗原的免疫应答,以及采用何种比例配制可在确保安全性的前提下最大化免疫刺激活性,这些问题均无法预测,需要试验验证,也成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的安全性和免疫刺激活性好,具有人体应用前景的RSV疫苗组合物及其制备方法和应用。尤其涉及某些佐剂的发现,所述佐剂能够增加对呼吸道合胞病毒包膜蛋白的免疫应答,特别涉及RSV糖蛋白F,佐剂的存在允许用减少量的抗原制备疫苗,且大大增强了抗原的免疫原性。
本发明的技术方案如下:
本发明一方面提供一种疫苗组合物,其包含RSV抗原性多肽和佐剂;所述佐剂为包含MPL、TQL-1055和PolyI:C中一种或几种的水包油乳剂、脂质体或纳米颗粒。
在一些实施方式中,所述佐剂是包含TQL-1055和/或PolyI:C的脂质体佐剂。
在一些实施方式中,所述佐剂进一步包含MPL。
在本发明提供的一种疫苗组合物中,所述佐剂是包含TQL-1055和MPL的脂质体佐剂。
在一些实施方式中,所述脂质体佐剂包括:
A)由DOPC组成的脂质;
B)胆固醇;以及
C)基本分布于脂质体磷脂双分子层的MPL和TQL-1055,
其中所述由DOPC组成的脂质与胆固醇的重量比为4:1,胆固醇与MPL的重量比为5:1,MPL与TQL-1055的重量比为2:1-2:3。
在一些实施方式中,每人用剂量中所述由DOPC组成的脂质重量为1000μg,胆固醇的重量为250μg,MPL的重量为25~50μg,TQL-1055的重量为25~75μg。
在一些实施方式中,每人用剂量中所述由DOPC组成的脂质重量为1000μg,胆固醇的重量为250μg,MPL的重量为25μg或50μg,PolyI:C的重量为25μg或62.5μg。
在另一些实施方式中,所述脂质体佐剂包括:
A)由DOPC和DOTAP组合的脂质混合物;
B)胆固醇;以及
C)基本分布于脂质体磷脂双分子层的MPL和TQL-1055,
其中DOPC与DOTAP的重量比为9:1或4:1,脂质混合物与胆固醇的重量比为4:1,胆固醇与MPL的重量比为5:1,MPL与TQL-1055的重量比为2:1-2:3。
在一些实施方式中,每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg,胆固醇的重量为250μg,MPL的重量为25~50μg,TQL-1055的重量为25~75μg。
在一些实施方式中,每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg,胆固醇的重量为250μg,MPL的重量为25μg或50μg,TQL-1055的重量为25μg或62.5μg。
DOTAP与中性脂质(例如DOPC)的组合主要优点是二者的组合更稳定,制成的脂质混合物保持无沉淀状态时间可超过2个月,相比于仅使用中性脂质的稳定性增加3-5倍。另外,DOPC与DDA的脂质组合获得的脂质体粒径远大于200nm,对工艺后期的过滤除菌等会有不利影响,而本发明的脂质体颗粒平均粒径普遍较小,有利于后期工艺及免疫增效。
在一些实施方式中,所述TQL-1055和MPL均基本分布于脂质体佐剂的磷脂双分子层。
在本发明提供的另一种疫苗组合物中,所述佐剂是包含PolyI:C和MPL的平均粒径80~100nm的单室或多室脂质体,其中所述MPL与PolyI:C的重量比为2:1-2:120。
在一些实施方式中,所述脂质体佐剂包括:
A)由DOPC组成的脂质;
B)胆固醇;以及
C)MPL和PolyI:C,
其中所述由DOPC组成的脂质与胆固醇的重量比为4:1,胆固醇与MPL的重量比为5:1,MPL与PolyI:C的重量比为2:1-2:60。
在一些实施方式中,每人用剂量中所述由DOPC组成的脂质重量为1000μg,胆固醇的重量为250μg,MPL的重量为25~50μg,PolyI:C的重量为25~1500μg。
在一些实施方式中,每人用剂量中所述由DOPC组成的脂质重量为1000μg,胆固醇的重量为250μg,MPL的重量为25μg或50μg,PolyI:C的重量为25μg、50μg、500μg、1000μg或1500μg。
在另一些实施方式中,所述脂质体佐剂包括:
A)由DOPC和DOTAP组合的脂质混合物;
B)胆固醇;以及
C)MPL和PolyI:C,
其中DOPC与DOTAP的重量比为9:1或19:1,脂质混合物与胆固醇的重量比为4:1,胆固醇与MPL的重量比为5:1,MPL与PolyI:C的重量比为2:1-2:60。
在一些实施方式中,每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg,胆固醇的重量为250μg,MPL的重量为25~50μg,PolyI:C的重量为25~1500μg。
在一些实施方式中,每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg,胆固醇的重量为250μg,MPL的重量为25μg或50μg,PolyI:C的重量为25μg、50μg、500μg、1000μg或1500μg。
DOTAP与中性脂质(例如DOPC)的组合主要优点是二者的组合更稳定,制成的脂质混合物保持无沉淀状态时间可超过2个月,相比于仅使用中性脂质的稳定性增加3-5倍。另外,DOPC与DDA的脂质组合获得的脂质体粒径远大于200nm,对工艺后期的过滤除菌等会有不利影响,而本发明的脂质体颗粒平均粒径普遍较小,有利于后期工艺及免疫增效。
在一些实施方式中,所述MPL基本分布于脂质体佐剂的磷脂双分子层,所述PolyI:C分布于水相中。
在一些实施方式中,所述佐剂是包含TQL-1055、PolyI:C和MPL的脂质体佐剂。
在一些实施方式中,所述TQL-1055和MPL均基本分布于脂质体佐剂的磷脂双分子层,所述PolyI:C分布于水相中。
在一些实施方式中,所述TQL-1055、PolyI:C和MPL的质量比为0.5~5:5~100:1,例如0.5:5:1、0.5:10:1、1.25:20:1、1.5:20:1、1.75:22:1、2:25:1、2.5:30:1、2.5:40:1、3:45:1、3.5:50:1、4:60:1、4.5:70:1、5:80:1、5:90:1、5:100:1。
在一些实施方式中,所述脂质体佐剂还包含药学上可接受的缓冲剂,所述的缓冲剂是选自乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和Tris的缓冲剂。
在一些实施方式中,所述RSV抗原性多肽为选自重组的RSV糖蛋白F,糖蛋白G,基质蛋白(M2)和核蛋白(N)的肽或其免疫原性片段;在一些实施方式中,相比于野生型RSV F蛋白,所述重组的RSV糖蛋白F包含至少一个将其稳定在融合前构象的氨基酸修饰。
所述的氨基酸修饰包括一个或多个氨基酸的取代、缺失或插入。
在一些实施方式中,所述糖蛋白F是不包括跨膜结构域和居间弗林蛋白酶切割位点的重组RSV可溶性F蛋白,且相对于野生型RSV F蛋白的氨基酸序列还包含至少一个氨基酸突变,其中所述氨基酸突变包含工程改造的二硫键突变、空腔填充突变、静电突变和添加额外的接头序列中的一种或几种。
将一个或多个突变引入其中的重组RSV可溶性F蛋白的F1多肽和F2多肽可来自任何本领域已知或将来发现的野生型RSV F蛋白,包括但不限于RSV亚型A和亚型B毒株(包括A2 Ontario和Buenos Aires)或任何其它亚型的F蛋白氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述野生型RSV是亚型A、亚型B、毒株A2、毒株Ontario或毒株Buenos Aires。
重组RSV可溶性F蛋白的F1多肽链可具有与相应野生型RSV F蛋白的全长F1多肽相同的长度;然而,其也可具有缺失,诸如从全长F1多肽的C-末端缺失1最多达60个氨基酸残基。重组RSV可溶性F蛋白的全长F1多肽对应于天然RSV F0前体的氨基酸位置137-574,且包括(从N-末端至C-末端)细胞外区域(残基137-524)、跨膜结构域(残基525-550)和细胞质结构域(残基551-574)。应注意,天然F1多肽序列中氨基酸残基514向前是本文提供的重组RSV可溶性F蛋白的F1多肽中的任选序列,且因此可在重组RSV可溶性F蛋白的F1多肽中不存在。
在一些实施方式中,重组RSV可溶性F蛋白的F1多肽缺少整个细胞质结构域。在其它实施方式中,F1多肽缺少细胞质结构域和一部分或全部跨膜结构域。在一些具体实施方式中,重组RSV可溶性F蛋白包含F1多肽,其中从位置510、511、512、513、514、515、520、525或530至574的氨基酸残基不存在。通常,对于连接至三聚化结构域的重组RSV可溶性F蛋白,氨基酸514至754可不存在。因此,在一些具体实施方式中,氨基酸残基514至574在重组RSV可溶性F蛋白的F1多肽中不存在。在还有其它具体实施方案中,重组RSV可溶性F蛋白的F1多肽包含天然F0多肽序列的氨基酸残基137-513。
另一方面,重组RSV可溶性F蛋白的F1多肽可包括与三聚化结构域的C-末端链接。本文公开的重组RSV可溶性F蛋白的许多序列包括蛋白酶切割位点序列,诸如凝血酶切割位点(LVPRGS);蛋白标签,诸如6×His-标记(HHHHHH)和链霉素标签II(WSHPGFEK);或接头序列(诸如GG和GS),所述序列不是RSV F蛋白的功能、诸如诱导免疫应答所必需。
本领域技术人员将认识到此类序列,并且在适当时理解,这些序列不包括于所公开的重组RSV可溶性F蛋白中。
在一些实施方式中,所述工程改造的二硫键突变包含但不限于S55C和L188C;S155C和S290C;T103C和I148C;以及L142C和N371C。
在一些具体的实施方式中,所述工程改造的二硫键突变是S155C和S290C取代。
在一些实施方式中,所述空腔填充突变包含但不限于S62I、S190F、T54Y、T219I、G151A、A147L、V164I、V192H、V207L以及V300Y。
在一些具体的实施方式中,所述空腔填充突变是S190F和V207L取代。
在一些实施方式中,所述重组RSV可溶性F蛋白还包含位于其F1域C端的异源三聚化结构域。
几种促进形成可溶蛋白的稳定三聚体的外源多聚化结构域是本领域已知的。一些多聚化结构域的实例包括:(1)GCN4亮氨酸拉链;(2)来自肺表面活性剂蛋白的三聚化基序;(3)胶原;和(4)噬菌体T4 fibritin foldon。
在一些实施方式中,所述异源三聚化结构域选自GCN4、Foldon或Ferritin。
在一些实施方式中,所述三聚化结构域可以经由接头(诸如氨基酸接头,例如序列GG、GS或SAIG)连接至F1多肽。接头也可以是较长接头(例如,包括重复序列GG)。
在一些实施方式中,所述异源三聚化结构域是foldon结构域。
在一些实施方式中,所述重组RSV可溶性F蛋白具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
本发明另一方面提供一种重组核酸,其包含编码所述重组RSV可溶性F蛋白的多核苷酸序列。
本发明还提供一种宿主细胞,其包含所述编码重组RSV可溶性F蛋白的核酸。
本发明还提供一种制备上述任一疫苗组合物的方法,其包括:
(1)培养哺乳动物宿主细胞以表达所述重组RSV可溶性F蛋白;
(2)纯化经步骤(1)表达的重组RSV可溶性F蛋白;
(3)将纯化的重组RSV可溶性F蛋白或其免疫原性片段与佐剂分别独立包装或按比例充分混合。
在一些实施方式中,具体地,本发明提供一种疫苗组合物的制备方法,包括以下步骤:
1)准备RSV抗原性多肽;
2)将MPL、DOPC和胆固醇溶于有机溶剂,通过梯度减压旋蒸获得脂质薄膜;
3)在脂质薄膜中加入磷酸盐水溶液,水浴旋转水化得到悬浮液;
4)特定浓度的悬浮液经均质获得脂质体,并经过滤器过滤得到浓缩脂质体;
5)Poly I:C溶解于生理盐水获得Poly I:C溶液;
6)将浓缩脂质体稀释后和Poly I:C溶液混匀得到佐剂;
7)将骤1)的RSV抗原性多肽与佐剂分别独立包装或按比例混合,制得所述疫苗组合物。
在一些实施方式中,具体地,本发明还提供另一种疫苗组合物的制备方法,包括以下步骤:
1)准备RSV抗原性多肽;
2)将脂质/脂质混合物、胆固醇和MPL,按质量比90~100:20~30:4~5的比例制成混合物,并溶解于体积比为1:1的乙醇/异丙醇混合有机溶剂中,得到类脂的有机溶液备用;
3)称取TQL-1055溶解于DMSO中,并用1~2倍体积的乙醇/异丙醇混合有机溶剂稀释得到TQL-1055浓缩液;
4)将所述类脂的有机溶液、TQL-1055浓缩液以及乙醇/异丙醇混合有机溶剂按体积比充分混合为有机相,缓冲溶液为水相,经微流控装置得到脂质体样品,所述有机相和水相的体积比为1:3~6;
5)去除脂质体样品中的有机溶剂后经1~2次过滤得到最终的脂质体佐剂;
6)将步骤1)的RSV抗原性多肽与脂质体佐剂分别独立包装或按比例混合,制得所述疫苗组合物。
在一些实施方式中,还包括表达载体的构建、纯化蛋白的冻干等额外步骤。
本发明还提供疫苗组合物在制备用于预防或治疗RSV感染的药物中的用途。
本发明还提供一种预防或治疗RSV感染的方法,所述方法包括:向受试者施用有效量的上述任一疫苗组合物。
在一些实施方式中,所述受试者是哺乳动物,如选自新生儿,婴儿,儿童,青少年,孕妇和老年人的人。
相比现有技术,本发明具有如下有益效果:
(1)免疫诱导效力强,在抗原方面,本发明通过对野生型RSV F蛋白进行多种氨基酸的取代、缺失和添加,获得了能够暴露更多中和抗体表位的RSV F蛋白融合前构象,确保了疫苗可引起对RSV亚型A和B的有效中和抗体反应。更特别的,在佐剂方面,相比于目前应用最为广泛的铝佐剂,或铝佐剂与CpG的复合佐剂,本发明使用的佐剂组分之间发挥协同作用,使得免疫诱导效力更强,而且更全面,不仅可以提高体液免疫应答,还能强效刺激Th1型免疫,大大提升了RSV抗原的免疫原性。
(2)稳定性高,在抗原方面,本发明对野生型RSV F蛋白进行的跨膜域缺失、工程改造的二硫键突变、空腔填充突变以及添加三聚化结构域等处理均很大程度增加了蛋白的稳定性,使其维持稳定的融合前构象。更特别的,在佐剂方面,本发明使用的脂质体佐剂比铝佐剂,或铝佐剂与CpG的复合佐剂有更好的滞留性和缓释效果,稳定提升免疫诱导效力。
(3)安全性高,生物相容性好,本发明使用的佐剂,由于使用了中性脂质和胆固醇,使其具有良好的生物相容性。TQL-1055和MPL均基本分布于脂质体佐剂的磷脂双分子层,而PolyI:C分布于水相中,良好的缓释作用能够显著减少接种部位不良反应。
附图说明
以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释,并不限定本发明的范围。
其中:
图1和图2是本发明实施例9中RSV疫苗组合物免疫效果试验的细胞因子检测结果图。
具体实施方式
下面将通过非限制性实施例进一步说明本发明,本领域技术人员公知,在不背离本发明精神的情况下,可以对本发明做出许多修改,这样的修改也落入本发明的范围。下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围,因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案,而非作为限制,本发明的范围已界定在所附的权利要求中。
除非特别说明,本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述,但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述实验方法如无特别说明,均为常规方法或产品说明书所描述的方法,所使用的实验材料如无特别说明,均可容易地从商业公司获取。
术语定义
在本申请中,术语“佐剂”是指在临床上可应用于人体或具有人体应用前景的具有增强免疫反应功能的物质,包括当前已获批准的和将来可能获得批准的各种佐剂,例如但不限于铝佐剂及各种形式的佐剂组合物。
在本申请中,术语“脂质体”是本领域中是众所周知的,并且定义一般类别的囊泡,其包含围绕水性空间的一个或多个脂质双层。因此,脂质体由一个或多个脂质和/或磷脂双层组成,并且可以在其结构中含有其他分子,诸如蛋白或碳水化合物。因为存在脂质相和水相两者,脂质体可以包封或捕获水溶性材料、脂溶性材料和/或两亲性化合物。
脂质体大小可以从30nm至几μm变化,这取决于磷脂组成和用于其制备的方法。本发明的脂质体含有磷脂酰胆碱脂质,或基本上由磷脂酰胆碱脂质和固醇组成。合适地,本发明的脂质体含有DOPC,或基本上由DOPC和固醇组成。
在本申请中,术语“TQL-1055”是一种合理设计的半合成皂苷佐剂QS-21类似物,旨在提高疫苗耐受性并提供与QS-21相同的强免疫应答。TQL-1055是一种半合成分子,其高效合成工艺采用来自皂树(Quillaja saponaria)树叶和树枝的原料,原料供应量比其他皂苷佐剂更为充足。一项临床试验显示,TQL-1055耐受良好、免疫应答强。通常,三萜皂苷类似物,尤其是TQL-1055,是至少90%纯的,诸如至少95%纯的,特别是至少98%纯的,尤其是99%纯的。
在本申请中,术语“抗原”或“免疫原”是指能够激发免疫应答的多肽。合适地,所述免疫原是包含至少一个B或T细胞表位的抗原。激发的免疫应答可以是抗原特异性B细胞应答,其产生中和抗体。激发的免疫应答可以是抗原特异性T细胞应答,其可以是全身性应答和/或局部应答。抗原特异性T细胞应答可以包含CD4+T细胞应答,诸如涉及表达多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD4+T细胞的应答。可替代地或额外地,所述抗原特异性T细胞应答包含CD8+T细胞应答,诸如涉及表达多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD8+T细胞的应答。
本发明所述的脂质体佐剂可以与抗原结合使用,脂质体佐剂也可以与抗原分开施用。
在本申请中,术语“免疫原性片段”是指与相应的抗原或免疫原具有相似生物学活性的片段。
在本申请中,术语“foldon结构域”通常是指在噬菌体T4纤维蛋白的C-末端的残基。在本申请中,foldon结构域可以是噬菌体T4纤维蛋白的C-末端的27个残基或突变体。在本申请中,foldon结构域可以是噬菌体T4纤维蛋白的C-末端的27个残基截短或增加N端或C端1、2、3、4、5、或6个或10个氨基酸得到的截短体或增长体。在本申请中,“突变体”通常是指因含有一个或多个差异(突变)而与参比序列不同的序列。该差异可以是取代、缺失或插入一个或多个氨基酸。
在本申请中,术语“工程改造的二硫键突变”是指野生型RSV F蛋白中一对氨基酸残基突变为一对半胱氨酸残基。引入的半胱氨酸残基对容许在引入的半胱氨酸残基之间形成二硫键,该二硫键用于稳定蛋白的构型或寡聚状态,诸如融合前构型。对于稳定突变体的融合前构型,用于突变为半胱氨酸的残基对应当在融合前构型中非常接近,但在融合后构型中远离。
在一些实施方案中,重组RSV可溶性F蛋白包含仅一个工程改造的二硫化物突变(“单一工程改造的二硫键突变”)。重组RSV可溶性F蛋白也可以包含至少两个工程改造的二硫化物突变,其中工程改造的二硫化物突变的每对半胱氨酸残基在重组RSV可溶性F蛋白呈融合前构型时适当定位(“双重工程改造的二硫化物突变”)。所述重组RSV可溶性F蛋白包含至少一个选自以下的工程改造的二硫化物突变:55C和188C;155C和290C;103C和148C;和142C和371C,诸如S55C和L188C,S155C和S290C,T103C和I148C,或L142C和N371C。
在本申请中,术语“空腔填充突变”是指野生型RSV F蛋白中的氨基酸残基被预期填充成熟RSV F蛋白的内部空腔的氨基酸取代。在一种应用中,此类空腔填充突变有助于稳定重组RSV可溶性F蛋白的融合前构型。RSV F蛋白的融合前构型中的空腔可通过本领域已知的方法来鉴定,诸如通过目视检查呈融合前构型的RSV F的晶体结构,或通过使用计算型蛋白设计软件。
在本申请中,术语“静电突变”是指引入野生型RSV F蛋白中的氨基酸突变,所述氨基酸突变减少蛋白中在折叠结构中彼此靠近的残基之间的离子排斥或增加所述残基之间的离子吸引。由于氢键键合是离子吸引的特殊情形,所以静电突变可增加此类接近残基之间的氢键键合。
在本申请中,术语“疫苗组合物”是指一种组合物,其包含在个体,如人中,能够刺激免疫反应的免疫原性组分。疫苗组合物可以给予个体以提高抗相应病毒的免疫反应,其能够预防或治疗个体的相应病毒感染。所述病毒选自人免疫缺陷型病毒HIV-1、人乳头瘤病毒、水痘带状疱疹病毒、人单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、乙肝病毒、手足口病毒、柯萨奇病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、冠状病毒和新冠病毒SARS-CoV-2。在本发明的一些实施方式中,优选地,所述病毒为呼吸道合胞病毒。相应地,本文所用的术语“疫苗”是指治疗性疫苗(用于疾病的治疗)和预防性疫苗(用于疾病的预防)。
在本申请中,术语“宿主细胞”是指其中可繁殖载体且表达其DNA或RNA的细胞。该细胞可以是原核或真核的。
在本申请中,术语“野生型”蛋白、序列或多肽是指未通过选择性突变人工修饰的天然存在的蛋白、序列或多肽。
在本申请中,术语“可溶性蛋白”是指能够溶解于水性液体中且保持溶解的蛋白。蛋白的溶解度可取决于以下而变化:蛋白在基于水的液体中的浓度、液体的缓冲条件、液体中其它溶质的浓度(例如盐和蛋白浓度)和液体的温度。
在本申请中,术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下,也表示“为”、“由……组成”的含义。
实施例1.重组RSV可溶性F蛋白的设计
本发明的重组RSV可溶性F蛋白是基于SEQ ID NO:1中所述的野生型RSV F蛋白氨基酸序列来设计和制备的,重组RSV可溶性F蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。本发明的重组RSV可溶性F蛋白保留了SEQ ID NO:1中氨基酸1-25所示的信号肽,氨基酸26-109所示的F2多肽,氨基酸110-136所示的pep27,以及氨基酸137-513所示的F1多肽。并经由SAIG接头将foldon三聚化结构域连接至F1多肽的C-末端。还包括凝血酶识别序列、组氨酸标签、链霉素标签(Streptag)II和接头序列。其还包括相对于SEQ ID NO:1中所述的野生型RSVF蛋白氨基酸序列的3个天然存在的取代(P102A、I379V和M447V),两个弗林蛋白酶基序的消除(RARR和RKRR),以及工程改造的二硫键突变(S155C和S290C)和空腔填充突变(S190F和V207L)。信号肽在表达过程期间从F0前体切割。
实施例2.表达质粒构建
通过DNA2.0使实施例1设计的重组RSV可溶性F蛋白的氨基酸序列按照宿主CHO细胞进行密码子优化和合成。F-foldon-6×His-(Streptag)II的引物通过PCR的方法扩增得到片段PCR产物,通过多段重组的方法重组到目的载体pcDNA3.1(+)(BamHI-XhoI酶切载体)中,得到重组表达质粒。反应体系如表1所示。
表1处理好的目的片段与载体连接反应体系
名称 | 体积 |
酶切后载体 | 5μl |
纯化的PCR产物 | 5μl |
无缝组装MIX | 10μl |
总体积 | 20μl |
转化:将浓度约100ng/μl的重组表达质粒吸取1-3μl加入到100μl左右的感受态细胞里,轻轻晃动旋转以混匀,冰上放置3分钟;42℃水浴90s不要摇动;冰浴中放置3分钟左右;每管中加入500-800μl,37℃预温LB培养基,37℃摇床200rpm温和振荡40分钟。
重组表达质粒的验证:(1)制备含相应抗性的琼脂平板;(2)取100μl菌液,平铺在含有相应抗性的琼脂板,用无菌玻璃涂布器轻轻将细菌涂在平板表面,将平板置于37℃培养15分钟;(3)倒置平板于37℃培养12-16小时可出现菌落;(4)平板挑菌,37℃,250r/min摇菌14小时,用菌液进行PCR鉴定,将阳性克隆菌液送测序。
克隆质粒的鉴定:PCR扩增F-foldon-6×His-(Streptag)II片段,鉴定引物序列由公司内部引物部合成。PCR反应采用20μL体系:引物0.5μL,模板菌液2μL,聚合酶缓冲液0.5μL,buffer 3μl,ddH2O 14μL。循环参数为96℃预变性3min;95℃15s,58℃15s,72℃20s,23个循环,72℃终延伸1min。以菌液PCR方法筛选阳性克隆,获得的阳性菌液37℃摇菌提质粒,测序。测序比对正确的质粒,用BamHI-XhoI进行双酶切,获得目标片段。
重组表达质粒抽提:接1%含重组表达质粒的大肠杆菌细胞(Stbl3)于2ml LB培养基,37℃振荡培养过夜。处理细胞后,使用质粒提取试剂盒提取100μg质粒。测序比对正确的质粒,用BamHI-XhoI进行双酶切,获得目标片段。
实施例3.重组RSV可溶性F蛋白的表达和纯化
将编码重组RSV可溶性F蛋白的多核苷酸序列导入宿主CHO细胞中以生成重组RSV可溶性F蛋白。将包含所导入核苷酸序列的瞬时转染的宿主CHO细胞在培养基中,在适合于生长的条件下进行规模培养。典型地,将细胞在新鲜的无血清培养基中,37℃8%CO2,50mm振幅培养箱90rpm进行培养,并每隔2~3天进行一次传代。
使用OPti-PRO SFM培养基制备转染试剂和重组表达质粒复合物(4℃),例如1mlCHO细胞准备40μl OPti-PRO SFM培养基添加0.8μg重组表达质粒混匀放置5min;准备40μlOPti-PRO SFM培养基添加3μl Expi Fectamine CHO试剂混匀放置5min,室温下1~5分钟,然后将溶液缓慢转移至摇瓶摇晃,在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养,8%CO2。转染后18-22小时,添加Enhancer和ExpiCHO Feed,执行标准实验方案。例如1ml细胞添加6μl Enhancer和0.24ml ExpiCHO Feed,将细胞置于50mm振幅培养箱90rpm进行37℃培养,8%CO2。转染后8天收集,进行后续纯化。
使用切向流过滤将澄清的细胞培养物浓缩5~10倍,随后在Ni-IMAC柱上缓冲液交换为适用于捕获的缓冲液。将含有重组可溶性F蛋白的条件化细胞培养基上样至Ni-IMAC柱上。使用浓度递增的咪唑洗脱产物,合并含有产物的级分,然后上样于Strep-Tactin柱上。使用浓度递增的脱硫生物素从Strep-Tactin柱洗脱产物。合并含有产物的级分并透析至最终储存缓冲液中。粗培养上清液和纯化的蛋白用于本文所述的体外和体内测定中。
实施例4.抗原工作液的制备
以经纯化的重组RSV可溶性F蛋白(原始浓度0.12mg/ml)作为抗原母液,取29μl抗原母液与971μl缓冲液(1×PBS缓冲液)混匀,得到抗原工作液。
实施例5.MPL/TQL1055佐剂工作液的制备
本实施例制备了含有6.25μg TQL-1055的脂质体佐剂,具体方法为:
(1)称取282mg DOPC、72mg胆固醇和13.71mg MPL,溶解于7ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)。4mg TQL-1055溶解于100μlDMSO中,加100μl乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1),稀释至20mg/ml,为TQL-1055母液。
(2)0.8ml溶解有DOPC、胆固醇和MPL的有机相,加0.1ml TQL-1055母液,加0.5ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1),混合后为醇相,磷酸盐水溶液(10mM PB,150mM NaCl)为水相,微流体过程在25℃温度下以4ml/min的总流速和醇相:水相=1:3的流速比运行。去除有机溶剂后,使用0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤,检测过滤后的样品粒径为128.6nm,PDI为0.171。
(3)30kD超滤管浓缩过滤后的样品至一定体积,各组分含量为DOPC 1mg/ml,胆固醇0.25mg/ml,MPL 0.05mg/ml,TQL-1055 0.0625mg/ml。
对制备的脂质体佐剂进行分析发现,脂质体包含水相和悬浮在水相中的单层囊泡,每个囊泡包含一个球形的双层脂质膜,MPL和TQL-1055均基本分布在磷脂双分子层内。
实施例6.MPL/PolyI:C佐剂工作液的制备
(1)将4g DOPC、1g胆固醇和200mg MPL溶于20ml异丙醇,通过梯度减压旋蒸获得脂质薄膜。
(2)在脂质薄膜中加入50ml磷酸盐水溶液(50mM PB,包含100mM的NaCl),在25℃水浴中旋转水化得到悬浮液。
(3)获得的悬浮液稀释至特定浓度后进行均质,均质后获得的脂质体以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤,最终获得适当特定的浓缩脂质体。
(4)PolyI:C加一定体积生理盐水溶解,为Poly I:C溶液。
(5)特定浓度的浓缩脂质体,加磷酸盐水溶液(10mM PB,包含150mM NaCl)稀释混匀,加PolyI:C溶液,混匀至0.5ml/剂各组分含量为DOPC 1mg,胆固醇0.25mg,MPL 0.05mg,PolyI:C 1mg,磷酸氢二钠0.15mg,磷酸二氢钾0.54mg,氯化钠4.385mg,即为最终获得的MPL/PolyI:C佐剂工作液。
实施例7.其他佐剂工作液的制备
(1)Al(OH)3佐剂工作液:Al(OH)3(购自Croda Denmark),浓度为1mg/ml。
(2)CpG佐剂工作液:取55μl CpG(浓度为32.42mg/ml)与245μl的154mM NaCl溶液混匀,得到CpG佐剂工作液。
(3)CpG+Al(OH)3佐剂工作液:取60μl Al(OH)3(购自Croda Denmark,浓度2%,铝含量10mg/ml,CAS:21645-51-2),加入至430μl的154mM NaCl溶液中,混匀备用;取110μl CpG加入至上述溶液中;所获溶液在20rpm的摇床上吸附30min,得到CpG+Al(OH)3佐剂工作液。
(4)AS01佐剂工作液:采购获得,0.5ml工作液含50μg MPL、50μg QS-21、1mg DOPC、0.25mg胆固醇、4.835mg氯化钠、0.15mg无水磷酸氢二钠、0.54mg磷酸二氢钾和注射用水。
(5)MPL/Poly I:C-TQL1055佐剂工作液:0.5ml/剂各组分含量为DOPC 1mg,胆固醇0.25mg,MPL 0.05mg,TQL1055 0.05mg,Poly I:C 1mg,磷酸氢二钠0.15mg,磷酸二氢钾0.54mg,氯化钠4.385mg,即为最终获得的MPL/Poly I:C-TQL1055佐剂工作液。
实施例8.RSV疫苗组合物的制备
取300μl实施例4提供的重组RSV可溶性F蛋白抗原工作液,分别与300μl实施例5~7提供的佐剂工作液混匀,得到疫苗组合物A~G。
实施例9.RSV疫苗组合物免疫效果试验
采用BALB/c小鼠(雌性,6~8周,购自北京维通利华实验动物技术有限公司)进行分组免疫,随机分成8组,每组5只。分别于第0周和第3周进行小鼠免疫,8组分别对应疫苗组合物A~G试验组以及不加任何佐剂的PBS对照组,每只每次肌内注射0.1ml,并进行各项指标的观察与测定。
9.1血液样品采集及处理
分别于免疫的第0天、21天和35天进行采血,采血方法为眼后静脉丛采血、每次采血量300~500μl;取血后不抗凝,37℃放置1h、之后4℃放置0.5h,8000rpm下离心10min,收集血清,置于56℃水浴中灭活30min,-20℃保存。
9.2中和抗体水平检测
使用基于细胞病变的微量中和(MN)测定法进行抗RSV的中和抗体检测,具体步骤为:
(1)将待测血清用培养基2倍连续稀释6个梯度,取100μl稀释后血清加入24孔板中,加入等体积RSV A/B病毒液(200pfu)混匀,同时用培养基与毒株等体积混合,作为病毒对照。37℃孵育1h;
(2)用胰蛋白酶处理Hep-2细胞,将100μl处理后的细胞悬液按约5×105/ml接种到有血清+病毒混合物的24孔板中,放入CO2细胞培养箱,培养6-7d(直至病毒对照孔出现80%的细胞病变);
(3)待空斑形成后,4%多聚甲醛固定,0.25%结晶紫染色,空斑计数。以阴性对照为基准,导致50%空斑形成抑制的最大稀释度倍数被确定为该样本的中和抗体效价。
结果显示,疫苗组合物C~G中佐剂的添加对于中和抗体水平提高有一定作用,各组诱导产生的中和抗体水平较为接近。而疫苗组合物A和B均优于其他组,与对照组相比,诱导产生了约10倍的中和抗体水平增长。说明本申请提供的RSV疫苗组合物在抗原结构和佐剂方面均具有竞争性的优势。
9.3 ELISA法检测抗原特异性IgG抗体滴度
(1)于末次免疫后14天(35d)对小鼠采血,用CB包被液(pH 7.4±0.1)将抗原稀释至5μg/ml,在96孔板上每孔加入100μl,2~8℃包被过夜后洗涤2次;
(2)每孔加入150μl封闭液,37℃封闭2.5h;
(3)将免疫后分离得到的血清以适宜倍数作为起始稀释倍数,用样品稀释液2倍梯度稀释7个浓度点,每孔加入100μl血清样品,37℃孵育90min,孵育结束后洗涤3次;
(4)每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(酶标稀释液稀释30000倍),37℃孵育45min,孵育结束后洗涤5次;
(5)每孔加入100μl显色液,37℃避光孵育15min后加入终止液,测定450nm波长处的OD值;
(6)结果判定,根据方法开发参数,样品OD值与空白对照OD均值的比值大于等于2.1所对应的最大血清稀释倍数,即判定为该血清样品的抗原特异性IgG抗体滴度(阴性对照OD均值小于0.05按0.05计)。
结果显示,疫苗组合物C~G中佐剂的添加对于IgG抗体水平提高有一定作用,各组诱导产生的中和抗体水平较为接近。而疫苗组合物A和B均优于其他组,与对照组相比,诱导产生了约100倍的结合抗体水平增长。
9.4细胞因子检测
第二次免疫后14天,取小鼠脾脏分离小鼠脾淋巴细胞,以肽库为刺激物,通过流式细胞术检测CD4+T细胞分泌细胞因子IFN-γ、IL-2的水平。检测结果如表2所示。
表2细胞因子检测结果
小鼠分组 | 疫苗组合物 | IL-2+ | IL-2+IFN-γ+ | IFN-γ+ |
1 | A | 1.20 | 2.20 | 0.96 |
2 | B | 1.12 | 1.79 | 0.88 |
3 | C | 0.30 | - | 0.10 |
4 | D | 0.33 | 0.04 | 0.12 |
5 | E | 0.33 | 0.10 | 0.25 |
6 | F | 0.58 | 0.71 | 0.93 |
7 | G | 0.53 | 0.62 | 0.88 |
8 | 对照组 | 0.06 | - | 0.09 |
注:“—”存在等于0的数值,无法计算几何均值
结果显示,疫苗组合物A和疫苗组合物B明显激发了更高的IFN-γ和IL-2水平,强效刺激了Th1型免疫,在重组RSV可溶性F蛋白具有结构优势的基础上进一步提升了RSV抗原的免疫原性。
实施例10.不同比例的MPL/PolyIC佐剂颗粒尺寸及分布均匀程度
按照实施例6所述的方法制备表3设计的含不同比例MPL和PolyIC的佐剂,利用动态光散射仪(DLS)测量佐剂颗粒尺寸和PDI,分组及测量结果如下表。
表3不同脂质配方的MPL/PolyIC佐剂粒径及PDI
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本发明的无阳离子脂质组的8小组的平均粒径是85.19nm,平均PDI是0.30;9:1阳离子脂质组的8小组的平均粒径是97.79nm,平均PDI是0.378;而19:1阳离子脂质组的8小组的平均粒径是80.33nm,平均PDI是0.242,说明三组的平均粒径均在80-100nm之间,粒径小且均匀,特别是19:1阳离子脂质组,具有易于制备,稳定性、流动性均较好,易于注射等不可替代的优点。
实施例11.MPL/PolyIC佐剂对大鼠体温的影响
在以1/10HD施用各免疫样品对大鼠进行一免和二免的给药日,在给药后各时段检查各免疫样品对大鼠体温的影响,以生理盐水作为空白对照组,AS01佐剂(每人用剂量0.5mL含50μg的MPL,50μg的QS-21,4.385mg氯化钠,1mg的DOPC,0.54mg磷酸二氢钾,0.25mg胆固醇和0.15mg无水磷酸二钠)作为阳性对照组。佐剂组别参照实施例10,使用直肠数字温度计监测各组大鼠的体温并记录(测温探头进入直肠内约10s,等待数值稳定后读数),分组见下表。
表4大鼠一免后不同脂质配方的体温检测结果
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表5大鼠二免后不同脂质配方的体温检测结果
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相对于生理盐水对照组,经历首次免疫和二次免疫后各时段的大鼠体温在无阳离子脂质组、9:1阳离子脂质组和19:1阳离子脂质组的变化幅度很轻微,而AS01组在一免和二免后普遍显著地引起大鼠体温升高,产生不良副反应。对体温的评估表明,无阳离子脂质组中的1-4、1-8;9:1阳离子脂质组中的2-4、2-8和19:1阳离子脂质组中的3-4、3-8都被动物很好地耐受,安全性高。
实施例12.不同比例的MPL/TQL-1055佐剂颗粒尺寸及分布均匀程度
按照实施例5所述的方法制备表6设计的含不同比例MPL和TQL-1055的佐剂,利用动态光散射仪(DLS)测量佐剂颗粒尺寸和PDI,分组及测量结果如下表。
表6不同脂质配方的MPL/TQL-1055佐剂粒径及PDI
综合对脂质体粒径和PDI的考量,无阳离子脂质组中组1和组2的粒径和PDI均在作为脂质体佐剂可接受范围内;DOPC/DOTAP比例为1:1时佐剂粒径过大,因此当脂质体中含有阳离子脂质时,优选9:1和4:1比例关系的DOPC/DOTAP脂质混合物,尤其优选9:1比例关系的DOPC/DOTAP脂质混合物,由此制备的脂质体佐剂粒径小且均匀,稳定性、流动性均较好。
实施例13.MPL/TQL-1055佐剂对大鼠体温的影响
在以1/10HD施用各免疫样品对大鼠进行一免和二免的给药日,在给药后各时段检查各免疫样品对大鼠体温的影响,以生理盐水作为空白对照组,AS01佐剂(每人用剂量0.5mL含50μg的MPL,50μg的QS-21,4.385mg氯化钠,1mg的DOPC,0.54mg磷酸二氢钾,0.25mg胆固醇和0.15mg无水磷酸二钠)作为阳性对照组。佐剂组别参照实施例12,使用直肠数字温度计监测各组大鼠的体温并记录(测温探头进入直肠内约10s,等待数值稳定后读数),分组见下表。
表7大鼠一免测温结果
表8大鼠二免测温结果
相对于生理盐水对照组,经历无阳离子脂质组或1:1阳离子脂质组首次免疫和二次免疫后各时段的大鼠体温变化幅度轻微,而AS01组在一免和二免后普遍显著地引起大鼠体温升高,产生不良副反应。对体温的评估表明,无阳离子脂质组和1:1阳离子脂质组都被动物很好地耐受,安全性高。
本发明提供的疫苗组合物可诱导产生针对RSV病毒的高滴度的中和抗体以及Th1型细胞因子水平,这也提示在病毒入侵时疫苗将提供较好的保护性效果,对RSV候选疫苗的研发具有重要意义。
以上所述的具体实施例,对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明,应理解的是,以上所述仅为本发明的具体实施例而已,并不用于限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种疫苗组合物,包含RSV抗原性多肽和佐剂,所述佐剂为脂质体形式,其包括:
A)由DOPC组成的脂质;
B)胆固醇;以及
C)基本分布于脂质体磷脂双分子层的MPL和TQL-1055,
其中所述由DOPC组成的脂质与胆固醇的重量比为4:1,胆固醇与MPL的重量比为5:1,MPL与TQL-1055的重量比为2:1-2:3。
2.如权利要求1所述的疫苗组合物,其特征在于,每人用剂量中所述由DOPC组成的脂质重量为1000μg,胆固醇的重量为250μg,MPL的重量为25~50μg,TQL-1055的重量为25~75μg。
3.如权利要求2所述的疫苗组合物,其特征在于,每人用剂量中所述由DOPC组成的脂质重量为1000μg,胆固醇的重量为250μg,MPL的重量为25μg或50μg,PolyI:C的重量为25μg或62.5μg。
4.一种疫苗组合物,包含至少一种RSV抗原性多肽和佐剂,所述佐剂为脂质体形式,其包括:
A)由DOPC和DOTAP组合的脂质混合物;
B)胆固醇;以及
C)基本分布于脂质体磷脂双分子层的MPL和TQL-1055,
其中DOPC与DOTAP的重量比为9:1或4:1,脂质混合物与胆固醇的重量比为4:1,胆固醇与MPL的重量比为5:1,MPL与TQL-1055的重量比为2:1-2:3。
5.如权利要求4所述的疫苗组合物,其特征在于,每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg,胆固醇的重量为250μg,MPL的重量为25~50μg,TQL-1055的重量为25~75μg。
6.如权利要求5所述的疫苗组合物,其特征在于,每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg,胆固醇的重量为250μg,MPL的重量为25μg或50μg,TQL-1055的重量为25μg或62.5μg。
7.如权利要求1或4所述的疫苗组合物,其特征在于,所述RSV抗原性多肽为选自重组的RSV糖蛋白F,糖蛋白G,基质蛋白(M2)和核蛋白(N)的肽或其免疫原性片段。
8.如权利要求7所述的疫苗组合物,其特征在于,相比于野生型RSV F蛋白,所述重组的RSV糖蛋白F包含至少一个将其稳定在融合前构象的氨基酸修饰。
9.如权利要求8所述的疫苗组合物,其特征在于,所述野生型RSV选自亚型A和亚型B毒株。
10.权利要求1-9中任一项所述的疫苗组合物的制备方法,包括以下步骤:
1)准备RSV抗原性多肽;
2)将脂质/脂质混合物、胆固醇和MPL,按质量比90~100:20~30:4~5的比例制成混合物,并溶解于体积比为1:1的乙醇/异丙醇混合有机溶剂中,得到类脂的有机溶液备用;
3)称取TQL-1055溶解于DMSO中,并用1~2倍体积的乙醇/异丙醇混合有机溶剂稀释得到TQL-1055浓缩液;
4)将所述类脂的有机溶液、TQL-1055浓缩液以及乙醇/异丙醇混合有机溶剂按体积比充分混合为有机相,缓冲溶液为水相,经微流控装置得到脂质体样品,所述有机相和水相的体积比为1:3~6;
5)去除脂质体样品中的有机溶剂后经1~2次过滤得到最终的脂质体佐剂;
6)将步骤1)的RSV抗原性多肽与脂质体佐剂分别独立包装或按比例混合,制得所述疫苗组合物。
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