CZ302878B6

CZ302878B6 - Proteinová vakcína

Info

Publication number: CZ302878B6
Application number: CZ20001091A
Authority: CZ
Inventors: Bruck@Claudine; Andre Georges Godart@Stephane; Marchand@Martine
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1997-09-26
Filing date: 1998-09-17
Publication date: 2012-01-04
Also published as: TR200000864T2; ATE338128T1; ES2272012T5; GB9720585D0; DE69835756D1; DK1015596T4; SA98190877B1; KR20010024287A; DE69835756T3; JP2009213492A; SI1015596T1; SI1015596T2; HUP0004896A3; HK1030431A1; CN1188519C; HUP0004896A1; CN1279718A; EP1015596B1; AU1025599A; NO20001508D0

Abstract

Podstatu rešení tvorí proteinová vakcína, která obsahuje exprimovaný, purifikovaný a izolovaný protein ze skupiny: a) úplný protein HIV Tat nebo Tat s C-terminálním histidinovým koncem nebo mutovaný Tat po vypuštení, pridání nebo náhrade jedné z aminokyselin nebo mutovaný Tat se sekvencí SEQ ID NO. 23, spojený s i) fúzním partnerem typu proteinu nebo lipoproteinu nebo ii) úplným proteinem HIV Nef nebo Nef s C-terminálním histidinovým koncem nebo Nef po vypuštení, pridání nebo náhrade jedné z aminokyselin nebo b) úplný izolovaný protein HIV Nef nebo Nef s C-terminálním histidinovým koncem nebo Nef po vypuštení, pridání nebo náhrade jedné z aminokyselin, spojený s i) fúzním partnerem typu proteinu nebo lipoproteinu nebo ii) úplným proteinem HIV Tat nebo Tat s C-terminálním histidinovým koncem nebo mutovaným Tat po vypuštení, pridání nebo náhrade jedné z aminokyselin nebo mutovaným Tat se sekvencí SEQ ID NO. 23, nebo c) úplný izolovaný protein HIV Nef nebo Nef s C-terminálním histidinovým koncem nebo Nef po vypuštení, pridání nebo náhrade jedné z aminokyselin, spojený s úplným proteinem HIV Tat nebo Tat s C-terminálním histidinovým koncem nebo mutovaným Tat po vypuštení, pridání nebo náhrade jedné z aminokyselin nebo mutovaným Tat se sekvencí SEQ ID NO. 23 a proteinem nebo lipoproteinem jako fúzním partnerem, ve smesi s farmaceuticky prijatelnými pomocnými látkami.

Description

Oblast techniky

Vynález popisuje nové konstrukce proteinu HTV a jejich použití v medicíně. Dále se popisují farmaceutické kompozice, které je obsahují a způsoby jejich výroby.

Vynález se dále týká fuzních proteinů, které zahrnují proteiny HIV-1 Tat a a/nebo Nef.

Dosavadní stav techniky

HIV-1 způsobuje syndrom získaného selhání imunity (AIDS), který je jedním z hlavních světo15 vých zdravotních problémů. Ačkoli vědci s celého světa vyvíjí velké úsilí, aby vytvořili vakcínu, jejich snaha zatím nebyla úspěšná.

Jsou popsány proteiny HIV-1, které se nevyskytují v obalu viru, a zahrnují například vnitřní strukturální proteiny, jako jsou produkty genů gag nebo pol a jiné nestrukturální proteiny, jako je

Rev, Nef, Vif a Tat (popisuje se v publikaci Greene et al., New England J. Med., 324, 5, 308 et seq (1991) a Bryan et al., (Ed. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 et seq (1992).

Proteiny HIV Nef a Tat jsou časné proteiny, které se exprimují v časném stádiu infekce a bez přítomnosti strukturních proteinů.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří proteinová vakcína, která obsahuje exprimovaný, purifikovaný a izolova30 ný protein ze skupiny:

a) úplný protein HTV Tat nebo Tat s C-terminálním histidinovým koncem nebo mutovaný Tat po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin nebo mutovaný Tat se sekvencí SEQ ID NO. 23, spojený s

i) fúzním partnerem typu proteinu nebo lipoproteinu nebo ii) úplným proteinem HIV Nef nebo Nef s C-terminálním histidinovým koncem nebo Nef po vypuštění, přidání nebo náhradě, jedné z aminokyselin nebo

b) úplný izolovaný protein HIV Nef nebo Nef s C-terminálním histidinovým koncem nebo Nef po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin, spojený s

i) fúzním partnerem typu proteinu nebo lipoproteinu nebo ii) úplným proteinem HIV Tat nebo Tat s C-terminálním histidinovým koncem nebo mutovaným Tat po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin nebo mutovaným Tat se sekvencí SEQ ID NO. 23, nebo

c) úplný izolovaný protein HIV Nef nebo Nef s C-terminálním histidinovým koncem nebo Nef po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin, spojený s úplným proteinem HIV Tat nebo Tat s C-terminálním histidinovým koncem nebo mutovaným Tat po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin nebo mutovaným Tat se sekvencí SEQ ID NO. 23 a proteinem nebo lipoproteinem jako fúzním partnerem, ve směsi s farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami.

-1 CZ 302878 B6

Vynález poskytuje proteiny s následující strukturou:

Lipo D 1/3	Nef	His(₆)
LipoD 1/3	Nef-Tat	His (₆)
Prot D 1/3	Nef	His(₆)
Prot D 1/3	Nef-Tat Nef-Tat	His (₆) His G)

Na obrázku č. 1 je znázorněna aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO: 7) a sekvence DNA (SEQ ID NO: 6) fúzního partnera takových konstrukcí.

V preferovaném provedení vynálezu se proteiny exprimují s histidinovým koncem, který zahrnuje 5 až 10 a přednostně 6 histidinových konců. To je výhodné při čištění. Oddělená exprese Nef (popisuje se v publikaci Macreadie I. G. Et. al., 1993, Yeast 9 (6) 565 až 573) a Tat (popisuje se v publikaci Braddock M. et al., 1989, Cell 58 (2) 269 až 79) v kvasinkách (Saccharomyces cerevisiae) už byla popsána. Pouze protein Nef je myristilován. Vynález poprvé popisuje oddělenou expresi proteinů Nef a Tat v expresním systému organizmu Pichia (konstrukce Nef-His a Tat-His) a úspěšnou konstrukci fúze Nef-Tat-His. Sekvence DNA a aminokyselinové sekvence Nef-His (SEQ ID NO: 8 a 9), Tat-His (SEQ ID NO: 10a 11) a fúzních proteinů Nef-Tat-His (SEQ ID NO: 12 a 13) jsou uvedeny na obrázku č. 2.

Deriváty podle vynálezu také zahrnují mutované proteiny. Termín „mutovaný“ znamená molekulu, kde dochází k deleci, adici nebo substituci jedné nebo více aminokyselin za použití dobře známých metod pri místně řízené mutagenezi nebo libovolné jiné běžné metodě.

Mutovaný Tat je zobrazen na obrázku č. 2 (SEQ ID NO: 22 a 23) jako je Nef-Tat mutant-His (SEQ ID NO: 24 a 25).

Vynález zahrnuje DNA kódující proteiny podle vynálezu. Takové sekvence se mohou začlenit do vhodného expresního vektoru a mohou se exprimovat ve vhodném hostiteli.

Sekvence DNA kódující proteiny podle vynálezu se mohou syntetizovat za použití standardních metod syntézy DNA, jako je enzymatická ligace, jak se popisuje v publikaci D, M. Roberts et at, Biochemistry 1985, 24, 5090 až 5098, chemická syntéza, enzymatická polymerizace in vitro nebo technologie PCR za použití například polymerázy stabilní vůči teplu nebo kombinace těchto metod.

Enzymatická polymerizace DNA může probíhat in vitro za použití DNA polymerázy, jako je DNA polymeráza 1 (Klenow fragment) ve vhodném pufru, který obsahuje nukleosidtrifosfáty dATP, dCTP, dGTP a dTTP, při teplotě 10 až 37 °C. Objem reakce je 50 μΐ nebo méně. Enzymatická ligace fragmentů DNA může probíhat za použití ligázy DNA, jako je DNA ligáza T4 ve vhodném pufru, jako je 0,05MTris (pH 7,4), 0,01M MgCt, 0,01M dithiothreitol, lmM spermidin, lmM ATP a 0,1 mg/ml hovězí sérový albumin při teplotě 4 °C až při teplotě prostředí. Objem reakce je většinou 50 μΐ nebo méně. Chemická syntéza polymeru nebo fragmentů DNA se provádí běžnými způsoby chemie fosfotriesteru, fosfitu nebo fosforamiditu za použití metody na pevné fázi, jak se popisuje v publikaci Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments, A Laboratory Manual (ed. H. G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982) nebo v jiné vědecké literatuře například M. J, Gait, H. W. D. Matthes, M. Singh, B. S. Sproat a R. C. Titmas, Nucleic Acids Reseach, 1982, 10, 6243, B. S, Sproat and W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771, M. D. Matteucci and Μ. H. Caruthes, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719, M. D. Matteucci and Μ. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185, S. P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661, N. D. Sinha, J. Biemat, J. McMannus and H. Koester, Nucleic Acids Reseach, 1984, 12, 4539 a H. W. D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.

-2CZ 302878 B6

Vynález dále popisuje způsob přípravy proteinu podle vynálezu zahrnující:

i) Přípravu replikovatelného nebo integračního expresivního vektoru, který je schopný v hostitelské buňce exprimovat polymer DNA zahrnující nukleotidovou sekvenci, která kóduje protein nebo jeho derivát.

i i) Transformaci hostitelské buňky uvedeným vektorem.

iii) Kultivaci uvedené transformované buňky za podmínek, které umožňují exprimovat uvedený polymer DNA za vzniku uvedeného proteinu.

iv) Získání uvedeného proteinu.

Tento způsob podle vynálezu se může také uskutečnit běžnými rekombinantními postupy, jak se popisuje v publikaci Maniatis et al., Molecular Cloning-A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982 až 1989.

Termín „transformace“ znamená zavedení cizorodé DNA do hostitelské buňky. Toho je možné dosáhnout například transformací, transfekcí nebo infekcí s vhodným plazmidem nebo virovým vektorem za použití například běžných metod, jak se popisuje v publikaci Genetic Engineering, Eds„ S. M. Kingsman and A. J. Kingsman, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Engtand, 1988. Termín „transformovaný“ nebo „transformant“ se používá pro výslednou hostitelskou buňku obsahující a exprimující cizorodý gen.

Expresivní vektory jsou nové a také tvoří část vynálezu.

Replikovatelné expresní vektory se mohou připravit podle vynálezu štěpením vektoru kompatibilního s hostitelskou buňkou za vzniku lineárního segmentu DNA vykazující intaktní replikon a kombinací uvedeného lineárního segmentu s jednou nebo více molekul DNA, které spolu s uvedeným lineárním segmentem tvoří polymer DNA kódující protein podle vynálezu nebo jeho derivát za podmínek ligace.

Polymer se podle potřeby může připravit nebo předpřipravit během konstrukce vektoru.

Volbu vektoru stanoví z části hostitelská buňka, která může být prokaryontní nebo eukaryontní, ale upřednostňuje se mikroorganizmus E. coli nebo kvasinky. Vhodné vektory zahrnují plazmidy, bakteriofágy, kosmidy a rekombinantní viry.

Příprava replikovatelného expresního vektoru může probíhat běžně s enzymy vhodnými k restrikci, polymerizací a ligací DNA postupem popsaným například v publikaci Maniatis et al., Molecular Cloning-A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982 až 1989.

Rekombinantní hostitelské buňky podle vynálezu se připravily transformací hostitelské buňky s replikovatelným expresivním vektorem podle vynálezu za podmínek transformace. Vhodné transformační podmínky jsou popsané v publikaci Maniatis et al., Molecular Cloning-A laboratoiy Manual, Cold Spring Harbor, 1982 až 1989 nebo v publikaci „DNA Cloning“ vol. II, D. M. Glover ed., IRL Press Ltd., 1985.

Volba transformačních podmínek je určena hostitelskou buňkou. Bakteriální hostitel, jako je E. coli se může ošetřit roztokem CaCl₂ (Cohen et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) nebo roztokem obsahujícím směs RbCl, MnCl₂, acetát draselný a glycerol a pak kyselinou 3-[Nmorfolinoj-propansulfonovou, RbCl a glycerolem. Savčí buňky v kultuře se mohou transformovat ko-precipitací vektoru DNA s vápníkem do buněk. Vynález dále popisuje hostitelskou buňku transformovanou replikovatelným expresivním vektorem podle vynálezu.

-3CZ 302878 B6

Kultivace transformované hostitelské buňky za podmínek, které umožňují expresi polymeru DNA, se provádí podle postupu popsaném v publikaci Maniatis et al., Molecular Clon ing-A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982 až 1989 a „DNA Cloning“ vol. ΪΙ, D. M. Glover ed., IRL Press Ltd., 1985. Tak se v buňce přednostně doplní nutrienty a buňky se kultivují při teplotě nižší než 50 °C.

Produkt se získává běžnými metodami v závislosti na hostitelské buňce. V případě, že hostitelskou buňkou je bakterie, taková jako je E. coli nebo kvasinka, jako je Pichia, může se lyžovat io fyzikálně, chemicky nebo enzymaticky a z výsledného lyzátu se izoluje proteinový produkt.

V případě, že hostitelská buňka je savčí, produkt se může v obecném případě izolovat z nutričního média nebo z buněčného volného extraktu. Vhodná metoda izolace proteinu zahrnuje selektivní precipitaci, adsorpční chromatografii a afinitní chromatografii obsahující afinitní chromatografii s monoklonálními protilátkami.

V případě proteinů podle vynálezu, které mají histidinový konec, je čištění možné jednoduše dosáhnout použitím afinitní kolony s kovovými ionty. V preferovaném provedení se protein dále čistí tak, že se podrobí chromatografii s výměnou kationtu a/nebo gelové filtrační chromatografii. Protein se pak sterilizuje průchodem přes membránu s velikostí pórů 0,22 pm.

Protein podle vynálezu se může pak připravit jako vakcína nebo se mohou enzymaticky odštěpit hístidinové zbytky.

Proteiny podle vynálezu se přednostně připravují v alespoň 80% čistotě, více se preferuje čistota 25 90%, jak je možné vidět na SDS PAGE. Je výhodné, aby se protein jevil na SDS PAGE jako jediný pruh.

Vynález dále popisuje farmaceutickou kompozici obsahující protein podle vynálezu ve farmaceuticky přijatelném excipientu.

Příprava vakcíny se v obecném případě popisuje v publikaci New Trends and Developments in

Vaccines, Voliér et al., (eds.), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978. Tvorba kapsulí s lipozómy se popisuje v publikaci Fullerton, Patent US 4 235 877.

Proteiny podle vynálezu se přednostně upravují do vakcinaěního přípravku podle vynálezu.

Vhodné adjuvans zahrnuje sůl hliníku, jako je gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý, ale mohou to být také sole vápníku, železa nebo zinku nebo může jít o nerozpustnou suspenzi acylovaného tyrozinu nebo acylovaných cukrů nebo kationtově nebo aniontově odvozené polysacharidy nebo polyfosfazeny.

Ve formulacích podle vynálezu se preferuje, že kompozice indukuje preferovanou THI odezvu.

Vhodné systémy adjuvans zahrnují například kombinací monofosforyllipidu A nebo jeho derivátu, upřednostňuje se 3- de-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL) spolu se solí hliníku.

Zesílený systém zahrnuje kombinací monofosforyllipidu A a derivátu saponinu, zvláště pak kombinací QS21 a 3D-MPL, jak se popisuje v dokumentu WO 94/00 153, nebo méně reaktivní kompozici, kde QS21 se zhasíná cholesterolem, jak se popisuje v publikaci WO 96/33 739.

Zvláště silné formulace adjuvans zahrnují QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi olej voda, jak se popisuje v dokumentu WO 95/17 210 a stává se preferovanou formulací.

V jednom provedení vynálezu se popisuje vakcína obsahující protein podle vynálezu upravený podle vynálezu adjuvans monofosforyllipidem A nebo jeho derivátem, zvláště 3D-MPL.

Upřednostňuje se, aby vakcína obsahovala saponin, s výhodou QS21.

-4CZ 302878 B6

Je výhodné, aby formulace obsahovala emulzi olej ve vodě a tokoferol. Vynález také popisuje způsob produkce vakcinační formulace, která obsahuje smíšený protein podle vynálezu spolu s farmaceuticky přijatelným excipientem, jako je 3D-MPL.

Vakcína podle vynálezu může dále obsahovat další proteiny HIV, jako je obalový glykoprotein gpl60 nebo jeho derivát gpl20.

Vynález popisuje protein HIV Nef nebo HIV Tat nebo jeho derivát exprimovaný v Pichia pastoio ris.

Příklady provedení vynálezu

Proteiny Nef a Tat jsou dva regulační proteiny kódované lidským virem imunonedostatečnosti (HIV-1), které byly produkovány v mikroorganizmu E. coli a v methylotrofhích kvasinkách Pichia pastoris.

Gen nef z izolátu Bru/Lai (popisuje se v publikaci Cell 40: 9 až 17, 1985) se vybral z těchto konstrukcí, protože tento gen je mezi těmi, které jsou nejvíce příbuzné konvenčnímu Nef.

Počáteční materiál v případě genu nef Bru/Lai byl fragment DNA 1170 bp klonovaný do savčího expresního vektoru pcDNA3 (pcDNA3/rce/).

Gen tat pochází z molekulového klonu BH10. Tento gen byl obdržen, jako cDNA klon HTLV 111, který se nazývá pCV 1 a popisuje se v publikaci Science, 229, 69 až 73, 1985.

1. Exprese sekvencí HIV-1 nef a tat v mikroorganizmu E. coli.

Sekvence kódující protein Nef stejně jako fúze sekvence nef a tat se umístily do plazmidových vektorů: pRIT14586 a pRIT14589 (obrázek č. 1).

Fúze Nef a Nef-Tat vznikla jako fúzní proteiny za použití fúzního partnera, kteiým je část proteinu D. Protein D je vazebný protein imunoglobulinu D, který je exponovaný na povrchu gram negativní bakterie Haemophilus influenzae.

PRIT14586 obsahuje sekvenci DNA pocházející z bakterie Haemophilus influenzae řízenou promotorem XPL. Uvedená sekvence DNA kóduje prvních 127 aminokyselin proteinu D (popisuje se v publikaci Infect. Immun. 60: 1336 až 1342, 1992), po kterém bezprostředně následuje oblast vícenásobného klonovacího místa plus sekvence DNA kódující jeden glycin, 6 histidinových zbytků a terminální kodon. (obrázek č. 1 A).

Tento vektor je označen tak, aby exprimoval zpracovaný lipidovaný fúzní protein s His koncem (fúzní protein LipoD). Fúzní protein se syntetizoval jako prekurzor s dlouhou signální sekvencí s 18 aminokyselinovými zbytky a po zpracování se cystein v poloze 19 v molekule prekurzoru stává aminoterminálním zbytkem, který se pak upravuje kovalentně vázanými mastnými kyselinami (obrázek č. 1B).

PR1T14589 je skoro identický spRIT14586 s výjimkou, že sekvence získaná zprotD začíná bezprostředně po kodonu cysteinu 19.

Exprese z tohoto vektoru vede ke vzniku ne lipido váného fúzního proteinu s koncem His (fúzní protein Prot D).

-5CZ 302878 B6

Připravily se čtyři konstrukce: LipoD-neAHis, LipoD-rt^A-tat-His, ProtD-z;e/-His a ProtD-zítýtaí-His.

První dvě konstrukce se připravily za použití expresního vektoru pRIT 14586, u posledních dvou 5 konstrukcí se použil pRIT14589.

1.1 Konstrukce rekombinantního kmene ECLD-N1 produkující ffizní protein LIPOD-Nef-HIS.

1.1.1 Konstrukce plazmidu pRIT1495 exprimujícího lipoD-we/^HÍs.

io

Gen nej (izolát Bru/Lai) se amplifikoval pomocí PCR z plazmidu pcDNA3/Nef sprimery 01 a 02.

Ncol

Primer 01 {SEQ ID NO: 1): 5 ^# ATCGTCCMG GGT. GGC AAG. TGG. T 3'

Spěl

Primer 02 {SEQ ID NO: 2): 5'CGGCTACTAGTGCAGTTCTTGAA 3'

Amplifikovaná oblast DNA nef začíná v nukleotidu 837 a končí v nukleotidu 8971 (popisuje se v publikaci Cell 40: 9 až 17, 1985).

Restrikční místo rozeznávané restrikčním enzymem Ncol (které nese ATG kodon genu nef) se zavedlo na 5' konec fragmentu PCR, zatímco místo Spěl se zavedlo na 3' konec.

Získal se fragment PCR a expresní plazmid pR!T14586, které se štěpily restrikčními enzymy Ncol a Spěl, čistily se na agarózovém gelu, ligovaly se a transformovaly se do vhodné hostitelské buňky E. coli kmene AR58. Tento kmen je skrytý lysogen λ získaný z N99, který je ga/E::Tnl 0,A-8(chlD-pgl), Δ-Η1 (cro-chlA)N⁺ a cI857.

Výsledný rekombinantní plazmid se získal po ověření amplifikované oblasti nef automatickým sekvenováním (popisuje se v sekci 1.1.2 dále v textu) a označil se pRIT14595.

t. 1.2 Selekce transformantů E. coli kmene AR58 s pRIT 14595

Když se transformuje hostitelský kmen AR58 mikroorganizmu E. coli, rekombinantní plazmid řídí teplem indukovatelnou produkci heterologního proteinu.

Na SDS-PAGE obarvených Coomassie modří se analyzovala produkce proteinu indukovatelná teplem pro několik transformantů rekombinantním lipoD-Nef-His. Všechny analyzované transformanty vykazují teplem indukovatelnou produkci heterologního proteinu. Četnost rekombinantního LipoD-Nef-Tat-His fúzního proteinu se odhadla na 10 % celkového proteinu.

Vybral se jeden z transformantů a přidělilo se mu označení ECLD-N 1.

Rekombinantní plazmid se opět izoloval z kmene ECLD-N 1 a sekvence kódující oblasti ne/^His se potvrdila automatickým sekvenováním. Tento plazmid se oficiálně označil jako pRIT14595.

Plně zpracovaný a acylovaný rekombinantní fúzní protein Lípo D-ne/^His produkovaný kmenem ECLD-N1 se skládá z:

• Mastných kyselin

-6CZ 302878 B6 • 109 aminokyselin proteinu D (začíná u aminokyseliny v poloze 19 a pokračuje k aminokyselině v poloze 127).

· Methioninu, který vznikl použitím klonovacího místa Ncol pRIT14586 (obrázek č. I).

• 205 aminokyselin proteinu Nef (začíná aminokyselinou v poloze 2 a pokračuje k aminokyselině v poloze 206).

io · Threoninu a šeřinu vytvořených postupem klonování (klonování v restrikčním místě Spěl pRIT14586).

• Jeden glycin a šest histidinů.

1.2 Konstrukce rekombinantního kmene NECD-N1 produkujícího fúzní protein PROT D-NefHIS.

Konstrukce expresního plazmidu pRIT 14600 kódujícího fúzní protein Prot D Nef-His byla shodná s plazmidovou konstrukcí popsanou v příkladu 1.1.1 stou výjimkou, že pRIT 14586 se používal jako receptorový plazmid pro fragment nef amplifikovaný PCR.

Kmen AR59 mikroorganizmu E. colí se transformoval pRIT 14600 a transformanti se analyzovaly, jak se popisuje v příkladu 1.1.2, Vybraný transformant se označil jako ECD-N1.

1.3 Konstrukce rekombinantního kmene ECLD-NT6 produkující fúzní protein LÍPO O NefTat-HlS.

1.3.1 Konstrukce plazmidu pRIT14596 exprimujícího D-Nef-Tat-His jo Gen tat (izolát BH10) se amplifíkoval pomocí PCR z derivátu plazmidu pCVl s primery 03 a 04. Restrikční místa Spěl se zavedla na oba konce fragmentu PCR.

Spěl

Primer 03 (SEQ ID NO: 3): 5 *ATCGTACTAGT.GAG.CCA.GTA.GAT .C 3' Spěl

Primer 04 (SEQ ID NO: 4): 5' CGGCTACTAGTTTCCTTCGGGCCT 3'

Nukleotidová sekvence amplifikovaného genu tat se ilustruje v klonu pCVl (Science 229: 69 až 73, 1985) a pokrývá oblast od nukleotidu 5414 až nukleotid 7998.

Získaný fragment PCR a plazmid pRIT 14595 (exprimující protein lipoD-Nef-His) se štěpily restrikčním enzymem Spěl, čistily se na agarózovém gelu, ligovaly se a transformovaly se do kompetentních buněk AR58. Získal se výsledný rekombinantní plazmid a po ověření amplifikované sekvence tat pomocí automatického sekvenování (popisuje se v sekci 1.3.2 dále v textu) získal označení pRIT14596.

1.3.2 Výběr transformantů kmene AR58 nesoucích pRIT14596

Transformanty se kultivovaly a indukovaly se teplem a jejich proteiny se analyzovaly na gelech obarvených Coomassie modří. Stupeň produkce rekombinantního proteinu se odhaduje na l % celkového proteinu. Vybral se jeden rekombinantní kmen a označil se ECLD-NT6.

-7CZ 302878 B6

Z kmene ECLD-NT6 se znovu izoloval rekombinantní plazmid lipoD-zie^-tóZ-His, sekvenoval se a označil se jako pRIT14596.

Plně zpracovaný a acylovaný rekombinantní fúzní protein Lípo D-Nef-Tat-His produkovaný 5 kmenem ECLD-N6 zahrnuje:

• Mastné kyseliny • 109 aminokyselin proteinu D (začíná u aminokyseliny v poloze 19 a pokračuje k aminokyseio line v poloze 127).

• Methionin, který vznikl použitím klonovacího místa Ncol pRIT14586.

• 205 aminokyselin proteinu Nef (začíná aminokyselinou v poloze 2 a pokračuje k aminokyse15 lině v poloze 206).

• Threonin a serin vytvořené postupem klonování • 85 aminokyselin proteinu Tat (začínající aminokyselinou v poloze 2 a pokračující k amino20 kyselině v poloze 86) • Threonin a serin vytvořené postupem klonování • Jeden glycin a šest histidinů.

1.4 Konstrukce rekombinantního kmene ECD-NT1, který produkuje fúzní protein PROT D— Nef-Tat-HIS

Konstrukce expresního plazmidu pRIT14601 kódující fúzní protein Prot D-Nef-Tat-His je shod30 ný s konstrukcí plazmidu popsanou v příkladu 1.3.1 s výjimkou, že pRIT14600 se použil jako receptorový plazmid pro fragment nef amplifikovaný PCR.

Kmen AR58 mikroorganizmu E. coli se transformoval pR!T14601 a transformanty se analyzovaly způsobem popsaným shora v textu. Vybraný transformant se označil ECD-NT1.

2. Exprese sekvencí nef a Zař HIV-1 v Pichiá Pastoři s

Protein Nef, Tat a fúzní protein Nef-Tat se exprimovaly methy lotrofních kvasinkách Pichiá pastoris. Expresi řídí indukovatelný promotor alkoholoxidázy (AOX1).

Za účelem exprese těchto genů HIV-1 se použila upravená verze integračního vektoru PHIL-D2 (INVITROGEN). Tento vektor se modifikoval takovým způsobem, že exprese heterologního proteinu začíná bezprostředně po přirozeném kodónu ATG genu AOX1 a vznikne rekombinantní protein s koncem tvořeným jedním glycinem a šesti histidinovými zbytky. Tento vektor PHIL45 D2-MOD se zkonstruoval klonováním oligonukleotidového linkeru mezi přilehlými oligonukleotidovými místy AsuII a EcoRI vektoru PHIL-D2 (obrázek č. 3).

Vedle konce His tento linker nese restrikční místa Ncol, Spěl a Xbal, mezi které se začlenily nef tat a fúze nef—tat.

2.1 Konstrukce integračních vektorů pR!T14597 (kódující protein Nef-His), pRlT14598 (kódující protein Tat-His) a pRIT 14599 (kódující fúzi Nef-Tat-His).

-8CZ 302878 B6

Gen nef se amplifíkoval pomocí PCR z plazmidů pcDNA3/Nef s primery 01 a 02 (v sekci 1.1.1 se popisuje konstrukce pR!T14595). Získal se fragment PCR a integrační vektor PHIL-D2MOD, které se Štěpily restrikěními enzymy Ncol a Spěl, čistily se na agarózovém gelu a ligovaly se za vzniku integračního plazmidů pRIT14597 (zobrazeno na obrázku č. 3).

Gen tat se amplifíkoval pomocí PCR z derivátu plazmidů pCVl za použití primerů 05 a 04 (konstrukce pRIT14596 se popisuje v sekci 1.3,1):

Ncol

Primer 05 (SEQ ID NO: 5): 5'ATCGTCCATGGAGCCAGTAGATC 3' io

Restrikční místo Ncol se zavedlo na 5' konec fragmentu PCR, zatímco restrikění místo Spěl se zavedlo na 3 konec primerem 04. Získal se fragment PCR a vektor PHÍL-D2-MOD, které se štěpily restrikěními enzymy Ncol a Spěl, čistily se na agarózovém gelu a ligovaly se za vzniku integračního plazmidů pRIT14598.

Aby mohla vzniknout konstrukce pRIT14599 fragment DNA o velikosti 910 bp odpovídající kódující sekvenci «ef-Zař-His se ligoval mezi tupý konec vytvořený restríkčním enzymem EcoRI a ošetřený T4 polymerázou a restrikční místo Ncol vektoru PH1L-D2-MOD. Kódující fragment nef-tat-\A\s se získal použitím restrikčního enzymu Xbal a ošetřil se T4 polymerázou a štěpením pRIT14596 restríkčním enzymem Ncol.

2.2 Transformace Pichia pastořis kmen GS115 (his4)

Za účelem získání kmenu Pichia pastoris, který exprímuje Nef-His, Tat-His a tuzí Nef-Tat-His 25 se kmen GS115 transformoval lineárními fragmenty Notl, které nesou expresní kazety plus gen

HIS4, aby došlo ke komplementaci his4 v hostitelském genomu. Transformace GS115 fragmenty linearizovanými restríkčním enzymem Notl je výhodná pro rekombinací v lokusu AOXI.

Kvantitativní dot blot analýzou se vybraly kopie integračních klonů a stanovil se typ integrace, 30 inzerce (fenotyp Mut⁺) a trans umístění (fenotyp Mut⁵).

Z každé transformace se vybral jeden transformant vykazující vysoký stupeň produkce rekombinantního proteinu:

Kmen Y1738 (fenotyp Muf) produkující rekombinantní protein Nef-His, což je myristilovaný protein obsahující 215 aminokyselin, který zahrnuje:

• Kyselinu myristovou, · Methionin, vzniklý použitím klonovacího restrikčního místa Ncol vektoru PHIL-D2-MOD, • 205 aminokyselin proteinu Nef (začínající aminokyselinou v poloze 2 a pokračující k aminokyselině 206), · Threonin a serin vzniklý klonováním (klonování do restrikčního místa Spěl vektoru PHILD2-MOD) • Jeden glycin a šest histidinů.

Kmen Y1739 (fenotyp Muf) produkující protein Tat-His, obsahující 95 aminokyselin skládající se z:

I

-9CZ 302878 B6 • Methioninu vytvořeného použitím klonovacího místa Ncol • 85 aminokyselin proteinu Tat (začínající aminokyselinou v poloze 2 a pokračující k aminokyselině v poloze 86) • Threoninu a šeřinu zavedených klonováním • Jednoho glycinu a šesti histidinů io Kmen Y1737 (fenotyp Muí) produkující rekombinantní fúzní protein Nef-Tat-His, myristylovaný protein obsahující 302 aminokyselin skládající se z:

• kyseliny myristové · Methioninu vytvořeného použitím klonovacího místa Ncol • 205 aminokyselin proteinu Tat (začínající aminokyselinou v poloze 2 a pokračující k aminokyselině v poloze 206) · Threoninu a šeřinu zavedených klonováním • 85 aminokyselin proteinu Tat (začínající aminokyselinou v poloze 2 a pokračující k aminokyselině v poloze 86) · Threoninu a šeřinu zavedeného postupem klonování • Jednoho glycinu a šesti histidinů

3. Exprese HIV-1 mutantu Tat v Pichia pastoris

Stejně jako mutantní fúzní protein Nef-Tat, se exprimoval mutantní rekombinantní protein Tat. Mutantní protein Tat nemůže být biologicky aktivní, zatímco si uchovává své ímunogenní epitopy35 Pro účely této konstrukce se vybral dvojitý mutantní gen tat konstruovaný D.CIements (Tulané University).

Tento gen tat (pocházející z molekulového klonu BH10) nese mutace v oblasti aktivního místa (Lys41-»Ala) a v motivu RGD (Arg78-»Lys a Asp80->Glu) (popisuje se v publikaci Virology

2 3 5 : 48 až 64, 1997).

Mutantní gen tat se získal jako fragment cDNA subklonovaný mezi restrikčními místy EcoRI a Hindi II v expresivním plazmidu CM V (pCMVLys41/KGE).

3.1 Konstrukce integračních vektorů pRIT14912 (kódující Tat mutant proteinu His) a pRlT14913 (kódující fúzi Nef-Tat mutant-His).

Mutantní gen tat se amplifikoval pomocí PCR z plazmidu pCMVLys41/KGE pomocí primerů 05 a 04 (konstrukce pRIT 14598 se popisuje v sekci 2.1).

Na 5' konec fragmentu PCR se zavedlo restrikční místo Ncol, zatímco restrikční místo Spěl se zavedlo na 3' konec s primerem 04. Získal se fragment PCR a vektor PHIL-D2-MOD, které se štěpily restrikčními enzymy Ncol a Spěl, čistily se na agarózovém gelu a ligovaly se za vzniku integračního plazmidu pRIT14912.

- 10CZ 302878 B6

Za účelem vzniku konstrukce pRIT14913 se mutant tat amplifíkoval pomocí PCR zplazmidu pCMVLys41/KGE s primery 03 a 04 (konstrukce pRIT14596 se popisuje v sekci 1.3.1).

Získal se fragment PCR a plazmid pRIT 14597 (exprimující protein Nef-His), které se štěpily restrikčním enzymem Spěl, čistily se na agarózovém gelu a ligovaly se za vzniku integračního plazmidu pRJT14913.

3.2 Transformace Pichia pastoris kmen GS115

Kmeny Pichia pastoris exprimující Tat mutant-His protein a fúzní protein Nef-Tat mutant-His se získaly aplikací integrační a rekombinantní strategie selekce kmenů (popsaná shora v textu v sekci 2.2).

Vybraly se dva rekombinantní kmeny produkující Tat mutant-His protein obsahující 95 aminokyselin: Y1775 (fenotyp Mut⁺) a Y1776 (fenotyp Mut⁵).

Vybral se jeden rekombinantní kmen exprimující fúzní protein Nef-Tat mutant-His obsahující 302 aminokyselin: Y1774 (fenotyp Muf).

4. Čištění fúzního proteinu Nef-Tat-His (Pichia pastoris)

Vyvinulo se schéma čištění ze 146 g rekombinantních buněk Pichia pastoris (vlhká hmotnost) nebo ze 21 homogenátu (homogenizér Dyno) OD 55. Krok čištění chromatografii se uskutečnil pri teplotě místnosti. Mezi jednotlivými kroky se frakce obsahující Nef-Tat uchovávala přes noc v chladu (4 °C). Pri uchovávání po delší dobu se vzorky mrazí na teplotu -20 °C.

146 g buněk Pichia pastoris i homogenizace

Porušení buněk zařízení Dyno (4 průchody) i

Centrifugace

Pelet prochází zařízení Dyno

Promytí (1H při teplotě 4 °C)

Centrifugace

Pelet

Φ

Rozpuštění

Redukce (4 h při teplotě místnosti ve tmě

Pufr: 21 50mM PO₄ pH 7,0, konečná hodnota OD: 50 rotor JA10/9 500 ot./min./teplota místnosti pufr: 21 lOmM PO₄ pH 7,5-150mM NaCI 0,5% empigen rotor JA10/9 500 ot,/min./teplota místnosti pufr: 660 ml 10 mM PO₄ pH 7,5-150mM NaCl-4,0M GuHCl +0,2M 2-merkaptoethansulfonová kyselina, sodná sůl (přidání prášku)/pH se upravilo na hodnotu 7,5 (roztokem 0,5M NaOH) před inkubací

Karboxymethylace (30 min, teplota místnosti

-11 CZ 302878 B6 ve tmě)

Afinitní chromatografie s imobilizovanými ionty kovů na Ni++-NTA-agaróza (Qiagen-30 ml pryskyřice)

Ředění i

Chromatografie s výměnou Kationtů na SP sefaróze FF (Pharmacia-30 ml pryskyřice)

Zvýšení koncentrace

Gelová filtrační Chromatografie na Superdexu 200XK 16/60 (Pharmacia-120 ml pryskyřice) dialýza (pres noc, pri teplotě 4 °C)

Sterilní filtrace +0,25M jodoacetamid (přidání prášku )/hodnota pH se upravila na 7,5 (roztokem 0,5M NaOH) před inkubací ekvilibrační pufr: lOmM PO₄ pH 7,5-150mM NaCl-4M GuHCl promývací pufr: 1) ekvilibrační pufr

2) lOmM PO₄ pH 7,5-150mM

NaCl-óM močovina

3) lOmM PO₄ pH 7,5-+50mM NaCl-6M močovina-25mM imidazol

Eluční pufr: lOmM PO₄ pH 7,5-150mM NaCl-óM močovina0,5M imidazol ředění na iontovou sílu 18 mS/cm²

Ředicí pufr: lOmM PO₄ pH 7,5-6M močovina ekvilibrační pufr: lOmM PO₄ pH 7,5-150mM NaCl-6M močovina promývací pufr:

1) ekvilibrační pufr

2) lOmM PO4 pH 7,5-250mM

NaCl-6M močovina

Eluční pufr: lOmM borát pH 9,0-2M NaCl-6M močovina na 5mg/ml

Membrána Omega lOKDa (Fíltron) eluční pufr: lOmM PO₄ pH 7,5-150mM NaCl-6M močovina ml vzorku/injekce—>5 injekcí pufr: lOmM PO₄ pH 6,8-150mM NaCl-0,5M arginin*

Millex GV 0,22 pm *poměr: 0,5M arginin pro koncentraci proteinu 1600 pg/ml. 40 Čistota

Stupeň čistoty se odhaduje pomocí SDS-PAGE a je zobrazen na obrázku č. 4. Datchiovým barvením stříbrem a na obrázku č. 5 barvením Coomassie modří G250.

Po kroku se Superdex200 je čistota vyšší než 95 %.

Po dialýze a sterilizaci filtrací je čistota vyšší než 95 %.

- 12CZ 302878 B6

Získaný protein

Ze 146 g buněk Pichia pastoris (=21 homogenátu, zařízení Dyno, OD 50) se získalo 51 mg pro5 teinu Nef-Tat-his.

5. Příprava vakcíny

Vakcína připravená v souladu s vynálezem obsahuje produkt exprese rekombinantní DNA, která io kóduje antigen, jak se popisuje v příkladu 1 nebo 2, ajako adjuvans slouží formulace obsahující směs 3-de-O-acetylovaný monofosforyllipid A 3D-MPL a QS21 v emulzi olej/voda.

3D-MPL: je chemicky detoxifikovaná forma lipopolysacharidu (LPS) gram-negativní bakterie Salmonella minnesota.

Experimenty provedené v instituci Smith Kline Beecham Biologicals ukázaly, že 3D-MPL kombinované s různými vehikuly silně zvyšuje jak humorální, tak buněčnou imunitu typu THL

QS21: je saponin čištěný ze surového extraktu kůry stromu Quilaja Saponaria Molina, které mají 20 silnou aktivitu adjuvans: aktivuje jak antigen-specifickou lymfoproliferaci a CTL vůči několika antigenům.

Experimenty provedené v instituci Smith Kline Beecham Biologicals ukázaly jasně synergický účinek kombinací 3D-MPL a QS21 pri indukci jak humorální tak buněčné imunitní odezvy typu

THL

Emulze olej/voda obsahuje 2 oleje (tokoferol a skvalen) a PBS obsahující jako emulgátor Tween 80. Emulze obsahovala 5 % skvalenu, 5 % tokoferol, 0,4 % Tween 80 a průměrná velikost partikulí je 180 nm (popisuje se v dokumentu WO 95/17 210).

Experimenty provedené v instituci Smith Kline Beecham Biologicals prokázaly, že přidání této emulze k 3D-MPL/QS21 dále zvyšuje jejich imunostimulační vlastnosti.

Příprava emulze olej/voda (2x koncentrováno)

Tween 80 se rozpustil ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosforečnanem (PBS) za vzniku 2% roztoku v PBS. Aby vzniklo 100 ml dvakrát koncentrované emulze, tak se na vortexu promíchalo 5 g DL-alfa-tokoferolu a 5 ml skvalenu. Přidalo se 90 ml roztoku PBS/Tween a vše se promíchalo. Výsledná emulze pak prošla stříkačku a nakonec se mikrofluidizovala použitím mikroflui40 dizačního přístroje Ml 10S. Výsledné olejové kapky mají velikost přibližně 180 nm.

Příprava formulace olej ve vodě.

Antigen připravený v souladu s příkladem 1 nebo 2 (5 pg) se naředil v 1 Okřát koncentrovaném 45 PBS pH 6,8 a vodě a pak se přidávalo v pětiminutových intervalech SB6, 3D-MPL (5 pg), QS21 (5 μg) a 50 μg/mt thiomerzal, který se používá jako konzervační činidlo. Objem emulze odpovídá 50 % celkovému objemu (50 μΐ pro dávku 100 μΐ).

Všechny inkubace se provedly pri teplotě místnosti za stálého míchání.

6. Imunogenicita Tat a Nef-Tat u hlodavců

Provedla se charakterizace imunitní odezvy vyvolané po imunizaci Tat a Nef-Tat. Aby se získaly informace o izotopových profilech a buňkami zprostředkované imunitě (CMI), provedly se dva imunizační experimenty. Při prvním experimentu se myši imunizovaly dvakrát v intervalu dvou

- 13CZ 302878 B6 týdnů do tlapek proteinem Tat nebo Nef-Tat v oxidované nebo redukované formě. Antigeny se připravily v emulzi olej/voda, která obsahuje skvalen, tween 80™ (polyoxyethylensorbitanmonooleát) QS21, 3D-MPL a α-tokoferol a kontrolní skupině zvířat se aplikovalo pouze samotné adjuvans. Dva týdny po poslední imunizaci se získala séra a zkoumala se testem ELISA specifíc5 kým pro Tat (pří potahování se použil redukovaný Tat) za účelem stanovení titrů protilátek a izotopů (obrázek č. 6a). Titry protilátek jsou nejvyšší u myší, kterým se aplikoval oxidovaný Tat. V obecném případě oxidovaná molekula indukuje vyšší titry protilátek ve srovnání s redukovanými formami a samotný Tat vyvolal vyšší titry protilátek ve srovnání s Nef-Tat. Pozdější pozorování se porovnalo v druhém experimentu. Nejzajímavější je, že izotopový profil protilátek speciio fických pro Tat se liší v závislosti na antigenech používaných při imunizaci. Samotný Tat vyvolává rovnovážný profil IgGl a IgG2a, zatímco Nef-Tat vyvolává silnější odezvu T_H2 (zobrazeno na obrázku č. 6b). To se potvrdilo ve druhém experimentu.

Ve druhém experimentu na myších se zvířatům aplikovaly pouze redukované formy molekul is nebo samotného adjuvans. Vedle serologických analýz (popisuje se shora v textu) se hodnotily také lymfoproliferaění odezvy z buněk lymfatických uzlin. Po opětné stimulaci těchto buněk in vitro s Tat nebo Nef-Tat se měřil po čtyřech dnech kultivace začleněný ³H-thymidin. Prezentace výsledků ukazuje, že velmi silné odezvy se indukovaly v obou skupinách myší, kterým se aplikoval antigen (obrázek č. 7).

Závěrem lze říci, že studium myší ukazuje, že Tat stejně jako Nef-Tat je vysoce imunogenní kandidát vakcinačnícb antigenů. Imunitní odezvy proti oběma molekulám se charakterizuje vysokou odezvou protilátek s alespoň 50 % lgG 1. Dále se zjistila silná odezva CMI (měřená lymfoproliferací).

6. Funkční vlastnosti proteinů Tat a Nef-Tat

U molekul Tat a Nef-Tat v oxidované a redukované formě se zkoumala schopnost vázat se na lidské linie T buněk. Dále se posuzoval účinek na růst těchto buněčných linií. Destičky vhodné io po test ELISA se potáhly přes noc různými koncentracemi proteinu Tat a Nef-Tat, irelevantní gD z viru herpes simplex typ II, nebo samotným pufrem, což slouží jako kontrola. Po dvou hodinách inkubace se prohlubně promyly a mikroskopicky se hodnotilo navázání buněk na dno prohlubní.

Buňky se obarvily toluidinovou modří, lyžovaly se SDS a koncentrace toluidinové modře v supematantu se stanovila odečítacím zařízením vhodným pro mikrotitrační destičky pro test

ELISA. Výsledky ukazují, že všechny čtyři proteiny Tat a Nef-Tat v oxidované nebo redukované formě zprostředkovávají navázání buněk na destičky vhodné pro test ELISA (zobrazeno na obrázku č. 8). Irelevantní protein (data nejsou uvedeny) a samotný pufr nezpůsobily fixaci buněk. Tato skutečnost naznačuje, že rekombinantně exprimované proteiny obsahující Tat se specificky vážou na lidské linie T buněk.

Při druhém experimentu buňky HUT-78 se nechaly v přítomnosti proteinů po dobu 16 hodin. Na konec inkubace se buňky značily [³H]-thymidinem a rychlost začlenění se stanovilo jako míra buněčného růstu. Všechny čtyři proteiny, které se účastní v tomto testu inhibovaly růst buněk, jak se odhaduje ze snížení začleněné radioaktivity (obrázek č. 9). Kontrolní měření nezprostředková45 vá tento účinek. Tyto výsledky demonstrují, že rekombinantní proteiny obsahující Tat jsou schopny inhibovat růst lidské buněčné linie buněk T.

Funkční charakterizace proteinů Tat a Nef-Tat ukázala, že tyto proteiny jsou schopny vázat lidskou buněčnou linii T buněk. Dále, takové proteiny jsou schopny inhibovat růst takových buněčných linií.

- 14CZ 302878 B6

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová io (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

ATCGTCCATG .GGT.GGC.A AG.TGG.T 28 (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

CGGCTACTAG TGCAGTTCTT GAA 23 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

₃₅ ATCGTACTAG T.GAG.CCA. GTA.GAT.C 29 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

CGGCTACTAG TTTCCTTCGG GCCT 24

- 15 CZ 302878 B6 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární io (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

ATCGTCCATG GAGCCAGTAG ATC 23 (2) Informace o SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 441 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

atggatccaa aaactttagc cctttcttta TTAGCAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC 60

AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC 120

CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT ACGTTAGAAT CTAAAGCACT TGCTTTTGCA 180

CAACAGGCTG ATTATTTAGA GCAAGATTTA GCAATGACTA AGGATGGTCG TTTAGTGGTT 240

ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTGACT GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT 300

CGTAAAGATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC TTTACCTTAA AAGAAATTCA AAGTTTAGAA 360

ATGAGAGAAA ACTTTGAAAC CATGGCCACG TGTGATCAGA GCTCAACTAG TGGCCACCAT 420

CACCATCACC ATTAATCTAG A 441 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 144 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

Met

Asp

Pro

Lys

Thr

Leu

Ala

Leu

Ser

Leu

Ala

Gly

Val

Leu

1

5

10

15

Ala

Gly

Cys

Ser

His

Ser

Asn

Met

Ala

Asn

Thr

Gin

Met

Lys

20

25

30

Ser

Asp

Lys

Zle

Ala

His

Arg

Gly

Ala

Ser

Gly

Tyr

Leu

Pro

35

40

45

Glu

His

Thr

Leu

Glu

Ser

Lys

Ala

Leu

Ala

Phe

Ala

Gin

Ala

Asp

50

55

60

Tyr

Leu

Glu

Gin

Asp

Leu

Ala

Met

Thr

Lys

Asp

Gly Arg

Leu

Val

65

70

75

80

Ile

His

Asp

His

Phe

Leu

Asp

Gly

Leu

Thr

Asp

Val

Ala

Lys

Phe

85

90

95

- 16CZ 302878 B6

Pro His

Arg

His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr

100

105

110

Leu

Lys

Glu

Ile

Gin

Ser

Leu

Glu

Met Thr

Glu

Asn

Phe

Glu

Thr

Met

1X5

120

125

Ala

Thr

Cys

Asp

Gin

Ser

Thr

Ser Gly

Hia

His

130

135

140

(2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 648 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární io (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

ATGGGTGGCA AGTGGTCAAA AAGTAGTGTG GTTGGATGGC CTACTGTAAG GGAAAGAATG AGACGAGCTG AGCCAGCAGC AGATGGGGTG GGAGCAGCAT CTCGAGACCT GGAAAAACAT GGAGCAATCA CAAGTAGCAA TACAGCAGCT ACCAATGCTG OTGTGCCTG GCTAGAAGCA CAAGAGGAGG AGGAGGTGGG TTTTCCAGTC ACACCTCAGC TACCTTTAAG ACCAATGACT TAGAAGGCAG CTGTAGATCT TAGCCACTTT TTAAAAGAAA AGGGGGGACT GGAAGGGCTA ATTCACTCCC AACGAAGACA AGATATCOT GATCTGTGGA TCTACCACAC ACAAGGCTAC TTCCCTGATT GGCAGAACTA CACACCAGGG CCAGGGGTCA GATATCCACT GACCTTTGGA TGGTGCTACA AGCTAGTACC AGTTGAGCCA GATAAGGTAG AAGAGGCCAA TAAAGGAGAG AACACCAGCT TGTTACACCC TGTGAGCCTG CATGGAATGG ATGACCCTGA GAGAGAAGTG TTAGAGTGGA GGTTTGAGAG CCGCCTAGCA TTTCATCACG TGGCCCGAGA GCTGCATCCG GAGTACTTCA AGAACTGCAC TAGTGGCCAC CATCACCATC ACCATTAA (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 216 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:

120

190

240

300

360

420

4S0

540

600

648

Met 1

Gly Gly Lys

Trp Ser 5

Lys

Ser

Val 10

Val

Gly Trp

Pro

Thr Val 15

Arg

Glu

Arg Met Arg Arg 20

Ala

Glu

Pro 25

Ala

Asp Gly

Val 30

Gly Ala

Ala

Ser

Arg Asp 35

Leu

Glu

Lys

His 40

Gly

Ala

Ile

Thr Ser 45

Ser

Asn Thr

Ala

Ala 50

Thr Asn

Ala

Cys 55

Ala

Trp

Leu

Glu

Ala Gin 60

Glu

Glu Glu

Glu 65

Val

Gly Phe

Pro

Val 70

Thr

Pro

Gin

Val

Pro 75

Leu Arg

Pro

Met Thr 80

Tyr

Lys

Ala Ala

Val 85

Asp

Leu

Ser

His

Phe 90

Leu

Lys Glu

Lys

Gly Gly 95

Leu

Glu

Gly Leu 100

Ile

His

Ser

Gin

Arg 105

Arg

Gin

Asp Ile

Leu 110

Asp Leu

Trp

Ile

Tyr His 115

Thr

Gin

Gly

Tyr 120

Phe

Pro

Asp

Trp Gin 125

Asn

Tyr Thr

- 17CZ 302878 B6

Pro Gly 130

Pro Gly

Val

Arg

Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys

135

140

Leu

Val

Pro

Val

Glu

Pro

Asp

Lys

Val

Glu

Ala

Asn

Lys

Gly

Glu

145

150

155

160

Aan

Thr

Ser

Leu

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Gly

Met

Asp

Pro

165

170

175

Glu

Arg

Glu

Val

Leu

Glu

Trp

Arg

Phe

Asp

Ser

Arg

Leu

Ala

Phe

His

130

185

190

H±3

Val

Ala

Arg

Glu

Leu

His

Pro

Glu

Tyr

Phe

Lys

Asn

Cys

Thr

Ser

195

200

205

Gly

His

210

215

(2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 288 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární io (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

ATGGAGCCAG TAGATCCTAG ACTAGAGCCC TGGAAGCATC CAGGAAGTCA GCCTAAAACT 60

GCTTGTACCA ATTGCTATTG TAAAAAGTGT TGCTTTCATT GCCAAGTTTG TTTCATAACA 120

AAAGCCTTAG GCATCTCCTA TGGCAGGAAG AAGCGGAGAC AGCGACGAAG ACCTCCTCAA 180

GGCAGTCAGA CTCATCAAGT TTCTCTATCA AAGCAACCCA CCTCCCAATC CCGAGGGGAC 240

CCGACAGGCC CGAAGGAAAC TAGTGGCCAC CATCACCATC ACGAZTAA 288 (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 96 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

Met 1

Glu

Pro

Val

Asp 5

Pro

Arg

Leu Glu

Pro 10

Trp

Lys

His

Pro

Gly 15

Ser

Gin

Pro

Lys

Thr 20

Ala

Cys

Thr

Asn Cys 25

Tyr Cys

Lys

Cys 30

Cys

Phe

His

Cys

Gin 35

Val

Cys

Phe

Ile

Thr Lys 40

Ala

Leu

Gly

Ile 45

Ser

Tyr

Gly

Arg

Lys 50

Lys

Arg

Gin

Arg 55

Arg Arg

Pro

Gin 60

Gly

Ser

Gin

Thr

His 65

Gin

val

Ser

Leu

Ser 70

Lys

Gin Pro

Thr

Ser 75

Gin

Ser

Arg

Gly

Asp 80’

Pro

Thr

Gly

Pro

Lys 85

Glu

Thr

Ser Gly

His 90

His

His 95

(2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 909 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina

- 18CZ 302878 B6 (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

atgggtggca agtggtcaaa aagtagtgtg gttggatggc ctactgtaag ggaaagaatg AGACGAGCTG AGCCAGCAGC AGATGGGGTG GGAGCAGCAT CTCGAGACCT GGAAAAACAT GGAGCAATCA CAAGTAGCAA TACAGCAGCT ACCAATGCT5 CTTGTGCCTG GCTAGAAGCA CAAGAGGAGG AGGAGGTGGG TTTTCCAGTC ACACCTCAGG TACCTTTAAG ACCAATGACT TACAAGGCAG CTGTAGATCT TAGCCACTTT TTAAAAGAAA AGGGGGGACT GGAAGGGCTA attcactccc aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac TTCCCTGATT GGCAGAACTA CACACCAGGG CCAGGGGTCA GATATCCACT GACCTTTGGA TGGTGCTAGA AGCTAGTACC AGTTGAGCCA GATAAGGTAG AAGAGGCCAA TAAAGGAGAG AACACCAGCT TGTTACACCC TGTGAGCCTG CATGGAATGG ATGACCCTGA GAGAGAAGTG TTAGAGTGGA GGTTTGACAG CCGCCTAGCA TTTCATCACG TGGCCCGAGA GCTGCATCCG gagtacttca agaactgcac tagtgagcca GTAGATCCTA gactagagcc ctggaagcat CCAGGAAGTC AGCCTAAAAC TGCTTGTACC AATTGCTATT GTAAAAAGTG TTGCTTTCAT TGCCAAGTTT GTTTCATAAC AAAAGCCTTA GGCATCTCCT ATGGCAGGAA GAAGCGGAGA CAGCGACGAA GACCTCCTCA AGGCAGTCAG ACTCATCAAG TTTCTCTATC AAAGCAACCC ACCTCCCAAT CCCGAGGGGA CCCGACAGGC CCGAAGGAAA CTAGTGGCCA CCATCACCAT

CACCATTAA (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: io (A) DÉLKA: 303 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

909

Met 1

Gly

Lys

Trp 5

Ser

Lys

Ser

Val 10

Val

Gly

Trp

Pro

Thr 15

Val

Arg

Glu

Arg

Met 20

Arg

Ala

Glu

Pro 25

Ala

Asp

Gly

Val 30

Gly

Ala

Ser

Arg 35

Asp

Leu

Glu

Lys

His 40

Gly

Ala

Ue

Thr

Ser 45

Ser

Asn

Thr

Ala

Ala 50

Thr

Asn

Ala

Cys 55

Ala

Trp

Leu

Glu

Ala 60'

Gin

Glu

Glu 65

Val

Gly

Phe

Pro

Val 70

Thr

Pro

Gin

Val

Pro 75

Leu

Arg

Pro

Met

Thr 80

Tyr

Lys

Ala

Val 85

Asp

Leu

Ser

His

Phe 90

Leu

Lys

Glu

Lys

Gly Gly 95

Leu

Glu

Gly

Leu 100

Ile

His

Ser

Gin

Arg 105

Arg

Gin

ASP

Ile

Leu 110

Asp

Leu

Trp

Ile

Tyr 115

His

Thr

Gin

Gly

Tyr 120

Phe

Pro

Asp

Trp

Gin 125

Asn

Tyr

Thr

Pro

Gly 130

Pro

Gly

Val

Arg

Tyr 135

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly 140

Trp

Cys

Tyr

Lys

Leu 145

Val

Pro

Val

Glu

Pro 150

Asp

Lys

Val

Glu

Glu 155

Ala

Asn

Lys

Gly

Glu 160

Asn

Thr

Ser

Leu

Leu 165

His

Pro

Val

Ser

Leu 170

HiS

Gly

Met

Asp

Asp 175

Pro

Glu

Arg

Glu

Val 180

Leu

Glu

Trp

Arg

Phe 185

Asp

Ser

Arg

Leu

Ala 190

Phe

His

- 19 CZ 302878 B6

His Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys Thr Ser 195 200 205

Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gin 210 215 220

Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His

225 230 235 240

Cys Gin Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg

245 250 255

Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser Gin Thr His

260 265 270

Gin Val Ser Leu Ser Lys Gin Pro Thr Ser Gin Ser Arg Gly Asp Pro

275 280 285

Thr Gly Pro Lys Glu Thr Ser Gly His His His His His His

290 295 300 (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1029 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární io (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

ATGGAICCAA AAACTTTAGC CCTTTCTTTA TTAGCAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC 60

AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC 120

CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT ACGTTAGAAT CTAAAGCACT TGCTTTTGCA 180

CAACAGGCTG ATTATTTAGA GCAAGATTTA GCAATGACTA AGGATGGTCG TTTAGTGGTT 240

ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTGACT GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT 300

CGTAAAGATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC TTTACCTTAA AAGAAATTCA AAGTTTAGAA 360

ATGACAGAAA ACTTTGAAAC CATGGGTGGC AAGTGGTCAA AAAGTAGTGT GGTTGGATGG 420

CCTACTGTAA GGGAAAGAAT GAGACGAGCT GAGCCAGCAG CAGATGGGGT GGGAGCAGCA 480

TCTCGAGACC TGGAAAAACA TGGAGCAATC ACAAGTAGCA ATACAGCAGC TACCftATGCT S40

GCTTGTGCCT GGCTAGAAGC ACAAGAGGAG GACGAGGTGG GTTTTCCAGT CACACCTCAG 600

GTACCTTTAA GACCAATGAC TTACAAGGCA GCTGTAGATC TTAGCCACTT TTTAAAAGAA 660

AAGGGGGGAC TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAACGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG 720

ATCTACCACA CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TGGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC 780

AGATATCCAC TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA 840

GAAGAGGCCA ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGAATG 900

GATGACCCTG AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC 960

GTGGCCCGAG AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCA CTAGTGGCCA CCATCACCAT 1020

CftCCATTAA 1029 (2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 325 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

-20CZ 302878 B6

Cys Ser Ser His	Ser Ser Asn	Met Ala Asn	Thr Gin	Met	Lys Ser Asp
1	5	10			15
Lys Zle Ile Ile	Ala His Arg Gly Ala Ser	Gly Tyr	Leu	Pro Glu His
20		25			30
Thr Leu Glu Ser	Lys Ala Leu	Ala Phe Ala	Gin Gin	Ala	Asp Tyr Leu
35		40		45
Glu Gin Asp Leu	Ala Met Thr	Lys Asp Gly Arg Leu	Val	Val Ile His
50.	55		60
Asp His Phe Leu	Asp Gly Leu	Thr Asp Val	Ala Lys	Lys	Phe Pro His
65	70		75		80
Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val	Ile Asp	Phe	Thr Leu Lys
	95	90			95
Glu Ile Gin Ser	Leu Glu Met	Thr Glu Asn	Phe Glu	Thr	Met Gly Gly
100		105			110
Lys Trp Ser Lys	Ser Ser Val	Val Gly Trp	Pro Thr	val	Arg Glu Arg
115		120		125
Met Arg Arg Ala	Glu Pro Ala	Ala Asp Gly	Val Gly	Ala	Ala Ser Arg
130	135		140
Asp Leu Glu Lys	His Gly Ala	Ile Thr Ser	Ser Asn	Thr	Ala Ala Thr
145	150		155		160
Asn Ala Ala Cys	Ala Trp Leu	Glu Ala Gin	Glu Glu	Glu	Glu Val Gly
	165	170			175
Phe Pro Val Thr	Pro Gin Val	Pro Leu Arg	Pro Met	Thr	Tyr Lys Ala
ISO		185			190
Ala Val Asp Leu	Ser His Phe	Leu Lys Glu	Lys Gly Gly	Leu Glu Gly
195		200		205
Leu Ile His Ser	Gin Arg Arg	Gin Asp Ile	Leu Asp	Leu	Trp Ile Tyr
210	215		220
His Thr Gin Gly	Tyr Phe Pro	Asp Trp Gin	Asn Tyr	Thr	Pro Gly Pro
225	230		235		240
Gly Val Arg Tyr	Pro Leu Thr	Phe Gly Trp Cys Tyr Lys	Leu Val Pro
	245	250			255
Val Glu Pro Asp Lys Val Glu	Glu Ala Asn	Lys Gly	Glu	Asn Thr Ser
260		265			270
Leu Leu His Pro	Val Ser Leu	His Gly Met	Asp Asp	Pro	Glu Arg Glu
275		280		285
Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp	Ser Arg Leu	Ala Phe	His	His Val Ala
290	295		300
Arg Glu Leu His	Pro Glu Tyr	Phe Lys Asn	Cys Thr	Ser	Gly His His
305	310		315		320
His His His Bis

(2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1290 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoretězcová (D) TOPOLOGIE: lineární io (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

-21 CZ 302878 B6

ATGGATCCAA AAACTTTAGC CCTTTCTTTA TTAGCAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT ACGTTAGAAT CTAAAGCACT TGCGTTTGCA CAACAGGCTG ATTATTTAGA GCAAGATTTA GCAATGACTA AGGATGGTCG TTTAGTGGTT ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTGACT GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT CGTAAAGATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC TTTACCTTAA AAGAAATTCA AAGTTTAGAA ATGACAGAAA ACTTTGAAAC CATGGGTGGC AAGTGGTCAA AAAGTAGTGT GGTTGGATGG CCTACTGTAA GGGAAAGAAT GAGACGAGCT GAGCCAGCAG CAGATGGGGT GGGAGCAGCA TCTCGASACC TGGAAAAACA TGGAGCAATC ACAAGTAGCA AxaCAGCaOC ŤAČCAATGCT GCTTGTGCCT GGCTAGAAGC ACAAGAGGAG GAGGAGGTGG GTTTTCCAGT CACACCTCAG GTACCTTTAA GACCAATGAC TTACAAGGCA GCTGTAGATC TTAGCCACTT TTTAAAAGAA AAGGGGGGAC TGGAAGGGCT AATTCACTCC CAACGAAGAC AAGATATCCT TGATCTGTGG ATCTACCACA CACAAGGCTA CTTCCCTGAT TGGCAGAACT ACACACCAGG GCCAGGGGTC AGATATCCAC TGACCTTTGG ATGGTGCTAC AAGCTAGTAC CAGTTGAGCC AGATAAGGTA GAAGAGGCCA ATAAAGGAGA GAACACCAGC TTGTTACACC CTGTGAGCCT GCATGGAATG

GATGACCCTG AGAGAGAAGT GTTAGAGTGG AGGTTTGACA GCCGCCTAGC ATTTCATCAC gtggcccgag AGCTGCATCC GGAGTACTTC AAGAACTGCA ctagtgagcc AGTAGATCCT AGACTAGAGC CCTGGAAGCA TCCAGGAAGT CAGCCTAAAA CTGCTTGTAC CAATTGCTAT TGTAAAAAGT GTTGCTTTCA TTGCCAAGTT TGTTTCATAA CAAAAGCCTT AGGCATCTCC TATGGCAGGA AGAAGCGGAG ACAGCGACGA AGACCTCCTC AAGGCAGTCA GACTCATCAA GTTTCTCTAT CAAAGCAACC CACCTCCCAA TCCCGAGGGG ACCCGACAGG CCCGAAGGAA ACTAGTGGCC ACCATCACCA TCACCATTAA

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1290 (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 412 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoretězcová (D) TOPOLOGIE: lineární io (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:

Cys Ser	Ser	His Ser Ser Asn Met Ala	Asn Thr Gin	Met	Lys	Ser	Asp
1		5	10			15
Lys 11·	Ile	11· Ala His Arg Gly Ala 20 25	Ser Gly Tyr	Leu	Pro 30	Glu	HiS
Thr Leu	Glu 35	Ser Lys Ala Leu Ala Phe 40	Ala Gin Gin	Ala 45	Asp	Tyr	Leu
Glu Gin 50	Asp	Leu Ala Met Thr Lys Asp 55	Gly Arg Leu 60	Val	Val	Xle	His
Asp His 65	Phe	Leu Asp Gly Leu Thr Asp 70	Val Ala Lys 75	Lys	Phe	Pro	His 80
Arg His	Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr 85	Val Ile Asp 90	Phe	Thr	Leu 95	Lys
Glu 11·	Gin	Ser Leu Glu Met Thr Glu 100 105	Asn Phe Glu	Thr	Met 110	Gly	Gly
Lys Trp	Ser 115	Lys Ser Ser Val Val Gly Trp Pro Thr 120	val 125	Arg	Glu	Arg
Met Arg 130	Arg	Ala Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly 135 140	Ala	Ala	Ser	Arg
Asp Leu 145	Glu	Lys His Gly Ala Xle Thr 150	Ser Ser Asn 155	Thr	Ala	Ala	Thr 160
Asn Ala	Ala	Cys Ala Trp Leu Glu Ala 165	Gin Glu Glu 170	Glu	Glu	Val 175-	Gly
Phe Pro	Val	Thr Pro Gin Val Pro Leu 180 185	Arg Pro Met	Thr	Tyr 190	Lys	Ala
Ala Val	Asp 195	Leu Ser His Phe Leu Lys 200	Glu Lys Gly Gly 205	Leu	Glu	Gly

-22 CZ 302878 B6

Leu Ile His Sec Gin Arg Acg Gin Asp Ile Leu Asp Leu Tep Ile Tyr

210 215 220

His The Gin Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gin Asn Tyr Thr Pro Gly Pro

225 230 235 240

Gly Vel Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu Val Pro

245 250 255

Val Glu Pro Asp Lys Val Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu Asn Thr Ser

260 265 270

Leu Leu His Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro Glu Arg Glu

275 280 285

Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His His Val Ala

290 295 300

Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys Thr Ser Glu Pro Val

305 310 315 320

Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gin Pro Lys Thr

325 330 335

Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys Gin Val

340 345 350

Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg

355 360 365

Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser Gin Thr His Gin Val Ser

370 375 380

Leu Ser Lys Gin Pro Thr Ser Gin Ser Arg Gly Asp Pro Thr Gly Pro 385 390 395 400

Lys Glu Thr Ser Gly His His His His His His

405 4io (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 98 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoretězcová (D) TOPOLOGIE: lineární io (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC 60

ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA 120

CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT 180

CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC 240

CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT 300

CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA ACCATGGGTG GCAAGTGGTC AAAAAGTAGT 360

GTGGTTGGAT GGCCTACTGT AAGGGAAAGA ATGAGACGAG CTGAGCCAGC AGCAGATGGG 420

GTGGGAGCAG CATCTCGAGA CCTGGAAAAA CATGGAGCAA TCACAAGTAG CAATACAGCA 480

GCTACCAATG CTGCTTGTGC CTGGCTAGAA GCACAAGAGG AGGAGGAGGT GGGTTTTCCA 540

GTCACACCTC AGGTACCTTT AAGACCAATG ACTTACAAGG CAGCTGTAGA TCTTAGCCAC 600

TTTTTAAAAG AAAAGGGGGG ACTGGAAGGG CTAATTCACT CCCAACGAAG ACAAGATATC 660

CTTGATCTGT GGATCTACCA CACACAAGGC TACTTCCCTG ATTGGCAGAA CTACACACCA 720

GGGCCAGGGG TCAGATATCC ACTGACCTTT GGATGGTGCT ACAAGCTAGT ACCAGTTGAG 780

CCAGATAAGG TAGAAGAGGC CAATAAAGGA GAGAACACCA GCTTGTTACA CCCTGTGAGC 840

CTGCATGGAA TGGATGACCC TGAGAGAGAA GTGTTAGAGT GGAGGTTTGA CAGCCGCCTA 900

GCATTTCATC ACGTGGCCCG AGAGCTGCAT CCGGAGTACT TCAAGAACTG CACTAGTGGC 960

CACCATCACC ATCACCATTA A 981 (2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 327 aminokyselin

-23CZ 302878 B6 (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoretězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

Met 1	Asp	Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met	Lys
5	10	15
Sex	Asp	Lys Ile Zle 20	Ile Ala His Arg Gly 25	Ala Ser Gly Tyr Leu 30	Pro
Glu	His	Thr Leu Glu 35	Ser Lys Ala Leu Ala 40	Phe Ala Gin Gin Ala 45	Asp
Tyr	Leu 50	Glu Gin Asp	Leu Ala Met Thr Lys 55	Asp Gly Arg Leu Val 60	Val
Ile 65	His	Asp His Phe	Leu Asp Gly Leu Thr 70	Asp Val Ala Lys Lys 75	Phe 80
Pro	His	Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Xle Asp Phe 85 90 95	Thr
Leu	Lys	Glu Ile Gin 100	Ser Leu Glu Met Thr 105	Glu Asn Phe Glu Thr 110	Met
Gly Gly	Lys Trp Ser 115	Lys Ser Ser Val Val 120	Gly Trp Pro Thr Val 125	Arg
Glu	Arg 130	Met Arg Arg	Ala Glu Pro Ala Ala 135	Asp Gly Val Gly Ala 140	Ala
Ser 145	Arg	Asp Leu Glu	Lys His Gly Ala Ile 150	Thr Ser Ser Asn Thr 155	Ala 160
Ala	Thr	Asn Ala Ala 165	Cys Ala Trp Lau Glu Ala Gin Glu Glu Glu 170 175	Glu
Val	Gly	Phe Pro Val 180	Thr Pro Gin Val Pro 183	Leu Arg Pro Met Thr 190	Tyr
I*ys	Ala	Ala Val Asp 195	Leu Ser His Phe Leu 200	Lys Glu Lys Gly Gly 205	Leu
Glu	Gly 210	Leu Ile His	Ser Gin Arg Arg Gin 215	Asp Ile Leu Asp Leu 220	Trp
Ile 225	Tyr	His Thr Gin	Gly Tyr Phe Pro Asp 230	Trp Gin Asn Tyr Thr 235	Pro 240
Gly	Pro	Gly Val Acg Tyr Pro Leu The Pha 243 230	Gly Trp Cys Tyr Lys 255	Leu
Val	Pro	Val Glu Pro 260	Asp Lys Val Glu Glu 265	Ala Asn Lys Gly Glu 270	Asn
Thr	Ser	Leu Leu His 275	Pro Val Ser Leu His 280	Gly Met Asp Asp Pro 285	Glu
Arg	Glu 290	Val Leu Glu	Trp Arg Phe Asp Ser 295	Arg Leu Ala Phe His 300	His
Val 305 His	Ala His	Arg Glu Leu His His His	His Pro Glu Tyr Phe 310 His	Lys Asn Cys Thr Ser 315	Gly 320

325 (2) Informace o SEQ ID NO: 20: io (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1242 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoretězcová (D) TOPOLOGIE: lineami (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 20:

ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC 60

ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA 120

CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT 180

CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC 240

CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTAGCTT AAAAGAAATT 300

CAAAGTTTAG AAATGAGAGA AAACTTTGAA ACCATGGGTG GCAAGTGGTC AAAAAGTAGT 360

GTGGTTGGAT GGCCTACTGT AAGGGAAAGA ATGAGACGAG CTGAGCCAGC AGCAGATGGG 420

GTGGGAGCAG CATCTCGAGA CCTGGAAAAA CAIGGAGCAA TCACAAGTAG CAATACAGCA 480

GCTACCAATG CTGCTTGTGC CTGGCTAGAA GCACAAGAGG AGGAGGAGGT GGGTTTTCCA 540

GTCACACCTC AGGTACCTTT AAGACCAATG ACTTACAAGG CAGCTGTAGA TCTTAGCCAC 600

TTTTTAAAAG AAAAGGGGGG ACTGGAAGGG CTAATTCACT CCCAACGAAG ACAAGATATC 660

CTTGATCTGT GGATCTACCA CACACAAGGC TACTTCCCTG ATTGGCAGAA CTACACACCA 720

GGGCCAGGGG TCAGATATCC ACTGACCTTT GGATGGTGCT ACAAGCTAGT ACCAGTTGAG 780

CCAGATAASG TAGAAGAGGC CAATAAAGGA GAGAACACCA GCTTGTTACA CCCTGTGAGC 840

CTGCATGGAA TGGATGACCC TGAGAGAGAA GTGTTAGAGT GGAGGTTTGA CAGCCGCCTA 900

GCATTTCATC ACGTGGCCCG AGAGCTGCAT CCGGAGTACT TCAAGAACTG CACTAGTGAG 960

CCAGTAGATC CTAGACTAGA GCCCTGGAAG CATCCAGGAA* GTCAGCCTAA AACTGCTTGT 1020

ACCAATTGCT ATTGTAAAAA GTGTTGCTTT CATTGCCAAG TTTGTTTCAT AACAAAAGCC 1080

TTAGGCATCT CCTATGGCAG GAASAAGCGG AGACAGCGAC GAAGACCTCC TCAAGGCAGT 1140

CAGACTCATC AAGTTTCTCT ATCAAAGCAA CCCACCTCCC AATCCCGAGG GGACCCGACA 1200

GGCCCGAAGG AAAGTAGTGG CCACCATCAC CATCACCATT AA 1242 (2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 414 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová io (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 21:

Met Asp Pro Ses Ser His Ser	Ser Asn Met Ala Asn	Thr Gin	Met	Lys
1 5	10		15
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala	His Arg Gly Ala Ser	Gly Tyr	Leu	Pro
20	25	30
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys	Ala Leu Ala Phe Ala	Gin Gin Ala	Asp
35	40	45
Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala	Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu	Val	Val
50 55	60
Ile His Asp His Phe Leu Asp	Gly Leu Thr Asp Val	Ala Lys	Lys	Phe
65 70	75			80
Pro His Arg His Arg Lys Asp	Gly Arg Tyr Tyr Val	Ile Asp	Phe	Thr
85	90		95
Leu Lys Glu Χία Gin Ser Leu	Glu Met Thr Glu Asn	Phe Glu	Thr	Met
100	105	110
Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser	Ser Val Val Gly Trp	Pro Thr	Val	Arg
115	120	125
Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu	Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala	Ala
130 135	140
Ser Arg Asp Leu Glu Lys His	Gly Ala Ile Thr Ser	Ser Asn	Thr	Ala
145 150	155			160
Ala Thr Asn Ala Ala Cys Ala	Trp Leu Glu Ala Gin	Glu Glu	Glu	Glu
165	170		175
Val Gly Phe Pro Val Thr Pro	Gin Val Pro Leu Arg	Pro Met	Thr	Tyr
180	185	190

-25CZ 302878 B6

Lys

Ala

Val

Asp

Leu

Ser

His

Phe

Leu

Lys

Glu

Lys

Gly Gly

Leu

195

200

205

Glu

Gly

Leu

Ile

His

Ser

Gin

Arg

Gin

Asp

Ile

Leu

Asp

Leu

Trp

210

215

220

Ile

Tyr

His

Thr

Gin

Gly Tyr

Phe

Pro

Asp Trp

Gin

Asn

Tyr

Thr

Pro

225

230

235

240

Gly

Pro

Gly

Val

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Phe

Gly

Trp

Cys

Tyr

Lys

Leu

245

250

255

Val

Pro

Val

Glu

Pro

Asp

Lys

Val

Glu

Giu

Ala

Asn

Lys

Gly

Glu

Asn

260

265

270

Thr

Ser

Leu

His

Pro

Val

Ser

Leu

His

Gly

Met

Asp

Pro

Glu

275

280

285

Arg

Glu

Val

Leu

Glu

Trp

Arg

Phe

Asp

Ser

Arg

Leu

Ala

Phe

His

290

295

300·

Val

Ala

Arg

Glu

Leu

His

Pro

Glu

Tyr

Phe

Lys

Asn

Cys

Thr

Ser

Glu

305

310

315

320

Pro

Val

Asp

Pro

Arg

Leu

Glu

Pro

Trp Lys

His

Pro

Gly

Ser

Gin

Pro

325

330

335

Lys

Thr

Ala

Cys

Thr

Asn

Cys

Tyr Cys

Lys

Cys

Phe

Bis

Cys

340

345

350

Gin

Val

Cys

Phe

Ile

Thr

Lys

Ala

Leu

Gly

Ile

Ser

Tyr

Gly

Arg

Lys

355

360

365

Lys

Arg

Gin

Arg Arg Arg

Pro

Gin

Gly

Ser

Gin

Thr

His

Gin

370

375

380

Val

Ser

Leu

Ser

Lys

Gin

Pro

Thr

Ser

Gin

Ser

Arg

Gly

Asp

Pro

Thr

385

390

395

400

Gly

Pro

Lys

Glu

Thr

Ser

Gly

His

405 410 (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 288 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová io (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 22:

ATGGAGCCAG TAGATCCTAG ACTAGAGCCC TGGAAGCATC CAGGAAGTCA GCCTAAAACT 60

GCTTGTACCA ATTGCTATTG TAAAAAGTGT TGCTTTCATT GCCAAGTTTG TTTCATAACA 120

GCTGCCTTAG GCATCTCCTA TGGCAGGAAG AAGCGGAGAC AGCGACGAAG ACCTCCTCAA 180

GGCAGTCAGA CTCATCAAGT TTCTCTATCA AAGCAACCCA CCTCCCAATC CAAAGGGGAG 240

CCGACAGGCC CGAAGGAAAC TAGTGGCCAC CATCACCATC ACCATTAA 288 (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 96 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 23:

-26CZ 302878 B6

Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser 15 10 15

Gin Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe 20 25 30

His Cys Gin Val Cys Phe Ile Thr Ala Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly

40 45

Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser Gin Thr

55 60

His Gin Val Ser Leu Ser Lys Gin Pro Thr Ser Gin Ser Lys Gly Glu

70 75 80

Pro Thr Gly Pro Lys Glu Thr Ser Gly His His His His His His

90 95 (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 909 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoretězcová (D) TOPOLOGIE: lineární io (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 24:

ATGGGTGGCA AGTGGTCAAA AAGTAGTGTG GTTGGATGGC CTAGTGTAAG GGAAAGAATG 60

AGACGAGCTG AGCCAGCAGC AGATGGGGTG GGAGCAGCAT CTCGAGACCT GGAAAAACAT 120

GGAGCAATCA CAAGTAGCAA TACAGCAGCT ACCAATGCTG CTTGTGCCTG GCTAGAAGCA 180

CAAGAGGAGG AGGAGGTGGG TTTTCCAGTC ACACCTCAGG TACCTTTAAG ACCAATGACT 240

TACAAGGCAG CTGTAGATCT TAGCCACTTT TTAAAAGAAA AGGGGGGACT GGAAGGGCTA 300

ATTCACTCCC AACGAAGACA AGATATCCTT GATCTGTGGA TCTACCACAC ACAAGGCTAC 360

TTCCCTGATT GGCAGAACTA CACACCAGGG CCAGGGGTCA GATATCCACT GACCTTTGGA 420

TGGTGCTACA AGCTAGTACC AGTTGAGCCA GATAAGGTAG AAGAGGCCAA TAAAGGAGAG 480

AACACCAGCT TGTTACACCC TGTGAGCCTG CATGGAATGG ATGACCCTGA GAGAGAAGTG S40

TTAGAGTGGA GGTTTGACAG CCGCCTAGCA TTTCATCACG TGGCCCGAGA GCTGCATCCG 600

GAGTACTTCA AGAACTGCAC TAGTGAGCCA GTAGATCCTA GACTAGAGCC CTGGAAGCAT 660

CCAGGAAGTC AGCCTAAAAC TGCTTGTACC AATTGCTATT GTAAAAAGTG TTGCTTTCAT 720

TGCCAAGTTT GTTTCATAAC AGCTGCCTTA GGCAICTCCT ATGGCAGGAA GAAGCGGAGA 780

CAGCGACGAA GACCTCCTCA AGGCAGTCAG ACTCATCAAG TTTCTCTATC AAAGCAACCC 840

ACCTCCCAAT CCAAAGGGGA GCCGACAGGC CCGAAGGAAA CTAGTGGCCA CCATCACCAT 900

CACCATTAA 909 (2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 303 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 25:

-27CZ 302878 B6

Met	Gly	Gly	Lys Trp Ser	Lys Ser Ser Val Val	Gly Trp Pro Thr	Val
1			5	10	15
Arg	Glu	Arg	Met Arg Arg	Ala Glu Pro Ala Ala	Asp Gly Val Gly	Ala
			20	25	30
Ala	Ser	Arg	Asp Leu Glu	Lys His Gly Ala Ile	Thr Ser Ser Asn	Thr
		35		40	45
Ala	Ala	Thr	Asn Ala Ala	Cys Ala Trp Leu Glu	Ala Gin Glu Glu	Glu
	50			55	60
Glu	Val	Gly	Phe Pro Val	Thr Pro Gin Val Pro	Leu Arg Pro Met	Thr
65			70	75		80
Tyr Lys	Ala	Ala Val Asp	Leu Ser His Phe Leu	Lys Glu Lys Gly Gly
			85	90	95
Leu	Glu	Gly	Lau Ile His	Ser Gin Arg Arg Gin Asp Ile Leu Asp	Leu
			100	105	110
Trp	Ile	Tyr	His Thr Gin	Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gin Asn Tyr	Thr
		115		120	125
Pro	Gly	Pro	Gly Val Arg	Tyr Pro Leu Thr Phe	Gly Trp Cys Tyr	Lys
	130			135	140
Leu	Val	Pro	Val Glu Pro	Asp Lys Val Glu Glu	Ala Asn Lys Gly	Glu
145			150	155		160
Asn	Thr	Ser	Leu Leu His	Pro Val Ser Leu His	Gly Met Asp Asp	Pro
			165	170	175
Glu Arg	Glu	Val Leu Glu	Trp Arg Phe Asp Ser	Arg Leu Ala Phe	His
			180	185	190
His	Val	Ala	Arg Glu Leu	His Pro Glu Tyr Phe	Lys Asn Cys Thr	Ser
		195		200	205
Glu	Pro	Val	Asp Pro Arg	Leu Glu Pro Trp Lys	His Pro Gly Ser	Gin
	210			215	220
Pro	Lys	Thr	Ala Cys Thr	Asn Cys Tyr Cys Lys	Lys Cys Cys Phe	His
225			230	235		240
Cys	Gin	Val	Cys Phe Ile	Thr Ala Ala Leu Gly	Ile Ser Tyr Gly Arg
			245	250	255
Lys	Lys	Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser Gin Thr His
			260	265	270
Gin	Val	Ser	Leu Ser Lys Gin Pro Thr Ser Gin Ser Lys Gly Glu Pro
		275		280	285
Thr	Gly	Pro	Lys Glu Thr	Ser Gly His Bis His	His His His
	290			295	300

(2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 57 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE: jednoretězcová (D) TOPOLOGIE: lineární io (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 26:

TTCGAAACCA TGGCCGCGGA CTAGTGGCCA CCATCACCAT CACCATTAAC GGAATTC (2) Informace o SEQ ID NO: 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

-28CZ 302878 B6 (C) DRUH ŘETĚZCE; jednořetězcová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 27:

Thr Ser Gly His His His His His His

Claims

10 PATENTOVÉ NÁROKY

1. Proteinová vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje exprimovaný, puntíkovaný a izolovaný protein ze skupiny:

a) úplný protein HIV Tat nebo Tat s C-terminálním histidinovým koncem nebo mutovaný Tat po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin nebo mutovaný Tat se sekvencí SEQ ID NO. 23, spojený s

20 i) fúzním partnerem typu proteinu nebo lipoproteinu nebo ii) úplným proteinem HIV Nef nebo Nef s C-terminálním histidinovým koncem nebo Nef po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin nebo

25 b) úplný izolovaný protein HIV Nef nebo Nef s C-terminálním histidinovým koncem nebo Nef po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin, spojený s i) fúzním partnerem typu proteinu nebo lipoproteinu nebo

30 ii) úplným proteinem HIV Tat nebo Tat s C-terminálním histidinovým koncem nebo mutovaným Tat po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin nebo mutovaným Tat se sekvencí SEQ ID NO. 23, nebo

c) úplný izolovaný protein HIV Nef nebo Nef s C-terminálním histidinovým koncem nebo Nef

35 po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin, spojený s úplným proteinem HIV Tat nebo Tat s C-terminálním histidinovým koncem nebo mutovaným Tat po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin nebo mutovaným Tat se sekvencí SEQ ID NO. 23 a proteinem nebo lipoproteinem jako fúzním partnerem, ve směsi s farmaceuticky přijatelnými pomocnými látkami.

2. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje fúzní protein Tat-Nef nebo jeho derivát.

3. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje fúzní protein Nef-Tat

45 nebo jeho derivát.

4. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků laž3, vyznačující se tím, že lipoprotein je lipoprotein D Haemophilus influenza B nebo jeho derivát.

50 5. Vakcína podle nároku 4, vyznačující se tím, že fúzní partner obsahuje 100 až

130 aminokyselin, pocházejících z N-konce proteinu D Haemophilus influenza B.

-29CZ 302878 B6

6. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, vy z n ač uj íc í se tím , že protein Tat je fúzován s proteinem HIV Nef a fúzním partnerem.

7. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že protein má

5 histidinový konec.

8. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků Iaž5a7, vyznačující se tím, že proteinem je fúzní protein Nef-Tat, přičemž protein je karboxy methyl ován.

io

9. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků laž8, vyznačující se tím, že navíc obsahuje adjuvans.

10. Vakcína podle nároku 9, vyznačující se tím, že adjuvans vyvolává odpověď TH1.

11. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 9a 10, vyznačující se tím, že adjuvans obsahuje monofosforyllipid A nebo jeho derivát, například 3-de-O-acyl ováný monofosforyllipid A.

20

12. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 9ažll, vyznačující se tím, že dále obsahuje saponinové adjuvans.

13. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 11 nebo 12, vyznačující se tím, že navíc obsahuje emulzi oleje ve vodě a tokoferol.

14. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 9až13, vyznačující se tím, že adjuvans obsahuje polysacharid 3D-MPL, saponin QS21 a emulzi oleje ve vodě s obsahem tokoferolu, skvalenu a polyoxyethylen(80)sorbitanmonooleátu.

30

15. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků lažl4, vyznačující se tím, že dále obsahuje HIV gpl60 nebo jeho derivát gpl20.

16. Protein, zahrnující úplný protein HIV Tat nebo úplný Tat s C-terminálním histidinovým zakončením nebo mutovaný úplný Tat po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin

35 nebo mutovaný Tat se sekvencí SEQ ID NO. 23, spojený s úplným proteinem HIV Nef nebo s úplným Nef s C-terminálním histidinovým zakončením nebo s úplným Nef po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin v orientaci Nef-Tat nebo Tat-Nef.

17. Způsob výroby proteinu, který zahrnuje

a) úplný protein HIV Tat nebo Tat s C-terminálním histidinovým zakončením nebo mutovaný Tat po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin nebo mutovaný Tat se sekvencí SEQ ID NO, 23, spojený s

45 i) fúzním partnerem typu proteinu nebo lipoproteinu nebo ii) úplným proteinem HIV Nef nebo Nef s C-terminálním histidinovým zakončením nebo Nef po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin nebo

50 b) úplný protein HIV Nef nebo Nef s C-terminálním histidinovým zakončením nebo Nef po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin, spojený s i) fúzním partnerem typu proteinu nebo lipoproteinu nebo

-30CZ 302878 B6 i i) úplným proteinem HIV Tat nebo Tat s C-terminálním histidinovým zakončením nebo mutovaným Tat po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin, nebo

c) úplný protein HIV Nef nebo Nef s C-terminálním histidinovým zakončením nebo Nef po

5 vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin, spojený s úplným proteinem HIV Tat nebo Tat s C-terminálním histidinovým zakončením nebo mutovaným Tat po vypuštění, přidání nebo náhradě jedné z aminokyselin nebo mutovaným Tat se sekvencí SEQ ID NO. 23 a proteinem nebo lipoproteinem jako fúzním partnerem, v Pichia pastoris, vyznačující se ío t í m, že se Pichia pastoris transformuje kódovou DNA pro tento protein, protein je exprimován a po expresi se protein izoluje.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že proteinem je fúzní protein NefTat a způsob dále zahrnuje karboxymethylaci exprimovaného proteinu.

19. Způsob výroby vakcíny, vyznačující se tím, že se protein, získaný způsobem podle kteréhokoliv z nároků 17 a 18 smísí s farmaceuticky přijatelným ředidlem.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že se přidá ještě HIV gp 160 nebo

20 jeho derivát gpl20.

21. Způsob podle nároků 19 a 20, vyznačující se tím, že se dále přidává adjuvans, zvláště adjuvans, vyvolávající odpověď TH1.

25 22. Protein Nef-Tat-His nebo Nef-Tat-mutanta-His nebo polynukleotid kódující tento protein, mající aminokyselinovou nebo DNA sekvencí podle SEQ ID NO, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24 nebo 25.