ES2272012T5 - Proteinas de fusion que comprenden las proteinas tat y/o nef del vih-1. - Google Patents

Proteinas de fusion que comprenden las proteinas tat y/o nef del vih-1. Download PDF

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Abstract

Una composición para vacuna que comprende una proteína que comprende (a) una proteína Tat del HIV completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o una Tat mutada que ha experimentado una deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipropoteica o a (ii) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal o a Nef que ha experimentado una deleción, adición o sustitución de un aminoácido; o (b) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, unida a (i) una pareja de fusión proteica o liproproteica o a (ii) una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal o a una Tat mutada que ha experimentado una deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23; o (c) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, unida a una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal o a una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de uno aminoácido, o auna Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23 y una pareja de fusión proteica o lipoproteica, mezclada con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Description

Proteínas de fusión que comprenden las proteínas Tat y/o Nef del VIH-1.
La presente invención se refiere a nuevas construcciones de proteínas del VIH, a su uso en medicina, a composiciones farmacéuticas que las contienen y a procedimientos para su fabricación.
En particular, la invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden las proteínas Tat y/o Nef del VIH-1.
El VIH-1 es la causa principal del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) que se considera uno de los principales problemas de salud del mundo. Aunque se han realizado investigaciones exhaustivas en todo el mundo para producir una vacuna, hasta ahora estos esfuerzos no han tenido éxito.
Se han descrito proteínas del VIH-1 que no son de la cubierta y que incluyen, por ejemplo, proteínas estructurales internas, tales como los productos de los genes gag y pol y otras proteínas no estructurales, tales como Rev, Nef, Vif y Tat (Greene y col., New England J. Med, 324, 5, 308 y siguientes (1991) y Bryant y col. (Ed. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 y siguientes (1992).
Las proteínas Nef y Tat del VIH son proteínas tempranas, es decir, se expresan muy pronto durante la infección y en ausencia de proteínas estructurales.
Según la presente invención, se proporciona una composición de vacuna proteínica que comprende una proteína expresada, recuperada y aislada que comprende
(a) una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipoproteica o a (ii) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o a Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido; o
(b) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipoproteica o a (ii) una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o a una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23; o
(c) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, unida a una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o a una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23, y una pareja de fusión proteica o lipoproteica.
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Por "pareja de fusión" se pretende significar cualquier secuencia proteica que no sea Tat o Nef. Preferiblemente, la pareja de fusión es una proteína D o su derivado unido a lípidos, la lipoproteína D de Haemophilus influenzae de tipo B. En particular, se prefiere que se utilice el tercio N-terminal, es decir, aproximadamente los primeros 100-130 aminoácidos. Esto se representa en este documento como Lipo D 1/3. En una realización preferida de la invención la proteína Nef o un derivado de la misma puede unirse a la proteína Tat o un derivado de ésta. Estas fusiones Nef-Tat pueden unirse también opcionalmente a una pareja de fusión proteica o lipoproteica, como la proteína D.
La pareja de fusión se une normalmente al extremo N-terminal de la proteína Nef o Tat.
Los derivados que abarca la presente invención incluyen moléculas con una cola de histidina en el extremo C-terminal que comprende preferiblemente entre 5-10 restos histidina. Generalmente, una cola de histidina que contiene n restos se representa en este documento como His (n). La presencia de una cola de histidina (o "His") ayuda a la purificación. Más específicamente, la invención proporciona proteínas con la siguiente estructura
1
La Figura 1 proporciona la secuencia de aminoácidos (ID SEC Nº 7) y de ADN (ID SEC Nº 6) de la pareja de fusión para tales construcciones.
En una realización preferida las proteínas se expresan con una cola de histidina que comprende entre 5 y 10, y preferiblemente seis restos histidina. Estos son ventajosos porque ayudan a la purificación. Se ha descrito ya la expresión independiente, en levadura (Saccharomyces cerevisiae), de Nef (Macreadie I.G. y col., 1993, Yeast 9 (6) 565-573) y Tat (Braddock M y col., 1989, Cell 58 (2) 269-79), y sólo la proteína Nef está miristilada. La presente invención proporciona por primera vez la expresión de Nef y Tat de forma independiente en un sistema de expresión de Pichia (construcciones Nef-His y Tat-His) y la expresión eficaz de una construcción de fusión Nef-Tat-His. Las secuencias de ADN y de aminoácidos de las proteínas de fusión representativas Nef-His (c Nº 8 y 9), Tat-His (ID SEC Nº 10 y 11) y de Nef-Tat-His (ID SEC Nº 12 y 13) se muestran en la Figura 2.
Los derivados que abarca la presente invención también incluyen proteínas mutadas. El término "mutada" se usa en este documento para referirse a una molécula que ha experimentado deleción, adición o sustitución de uno o más aminoácidos usando técnicas bien conocidas para mutagénesis dirigida a sitio o cualquier otro procedimiento convencional.
En la Figura 2 se ilustra una Tat mutada (ID SEC Nº 22 y 23) como es Nef-Tat-mutante-His (ID SEC Nº 24 y 25).
Puede sintetizarse una secuencia de ADN que codifique las proteínas de la presente invención usando técnicas convencionales de síntesis de ADN, tal como mediante ligamiento enzimático, como describen D.M. Roberts y col. en Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, mediante síntesis química, mediante polimerización enzimática in vitro o mediante tecnología de PCR utilizando, por ejemplo, una polimerasa termoestable, o mediante una combinación de estas técnicas.
La polimerización enzimática de ADN puede realizarse in vitro usando una polimerasa de ADN, tal como la ADN polimerasa I (fragmento Klenow) en un tampón apropiado que contenga los nucleósidos trifosfato dATP, dCTP, dGTP y dTTP, según sea necesario, a una temperatura de 10º-37ºC, generalmente en un volumen de 50 \mul o menos. Se puede realizar el ligamiento enzimático de fragmentos de ADN usando una ADN ligasa, tal como la ADN ligasa de T4, en un tampón apropiado, tal como Tris 0,05 M (pH 7,4), MgCl_{2} 0,01 M, ditiotreitol 0,01M, espermidina 1 mM, ATP 1 mM y albúmina de suero bovino a 0,1 mg/ml, desde una temperatura de 4ºC a temperatura ambiente, generalmente en un volumen de 50 ml o menos. La síntesis química del polímero o fragmentos de ADN puede realizarse mediante procedimientos químicos convencionales de fosfotriéster, fosfito o fosforamidito, usando técnicas en fase sólida, tales como aquellas descritas en "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual" (H.G. Gassen y A. Lang editores), Verlag Chemie, Weinheim (1982), o en otras publicaciones científicas, por ejemplo, M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat y R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat y W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci, M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci t M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams y col., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus y H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; y H.W.D. Matthes y col., EMBO Journal, 1984, 3, 801.
La invención también proporciona un procedimiento para preparar una proteína que comprende (a) una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipoproteica o a (ii) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o a Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido; o (b) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipoproteica o a (ii) una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o a una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23; o (c) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, unida a una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o a una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23, y una pareja de fusión proteica o lipoproteica, en Pichia pastoris, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de trasformar Pichia pastoris con ADN que codifica dicha proteína, expresar dicha proteína y recuperar al proteína.
El procedimiento de la invención puede realizarse mediante técnicas convencionales de recombinación, tales como las descritas en Maniatis y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.
El término "transformación" se usa en este documento para significar a la introducción de ADN extraño dentro de una célula hospedadora. Esto se puede conseguir, por ejemplo, mediante transformación, transfección o infección con un vector plasmídico o vírico apropiado usando, por ejemplo, técnicas convencionales como se describe en Genetic Engineering; Editores. S.M. Kingsman y A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, Inglaterra, 1988. El término "transformado" o "transformante" se aplicará de aquí en adelante a la célula hospedadora resultante que contiene y expresa el gen extraño de interés.
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Los vectores de expresión capaces de replicarse pueden prepararse de acuerdo con la invención, escindiendo un vector compatible con la célula hospedadora para proporcionar un segmento de ADN lineal que tenga un replicón intacto y que combine dicho segmento lineal con una o más moléculas de ADN que, junto con dicho segmento lineal, codifique el producto deseado, tal como el polímero de ADN que codifica la proteína de la invención, o un derivado de la misma, en condiciones de ligamiento.
De este modo, el polímero de ADN puede realizarse o formarse durante la construcción del vector, según se desee.
La elección del vector estará determinada, en parte, por la célula hospedadora, que puede ser procariota o eucariota, pero preferiblemente es E. coli o levadura. Los vectores adecuados incluyen plásmidos, bacteriófagos, cósmicos y virus recombinantes.
La preparación del vector de expresión capaz de replicarse puede llevarse a cabo de forma convencional con enzimas apropiadas de restricción, polimerización y ligamiento de ADN, mediante procedimientos descritos en, por ejemplo, Maniatis y col., citado anteriormente.
La célula hospedadora recombinante se prepara, según la invención, transformando una célula hospedadora con un vector de expresión de la invención capaz de replicarse en condiciones de transformación. Las condiciones de transformación adecuadas son las convencionales y se describen en, por ejemplo, Maniatis y col. citado anteriormente, o en "DNA Cloning" Vol. II, D.M. Glover editor, IRL Press Ltd., 1985.
La elección de las condiciones de transformación está determinada por la célula hospedadora. De este modo, puede tratarse un hospedador bacteriano, tal como E. coli, con una solución de CaCl_{2} (Cohen y col., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) o con una solución que comprenda una mezcla de RbC1, MnCl_{2}, acetato potásico y glicerol y luego con ácido 3-[N-morfolino]-propano-sulfónico, RbC1 y glicerol. Las células de mamífero en cultivo pueden transformarse mediante la coprecipitación con calcio del ADN del vector en las células.
El cultivo de la célula hospedadora transformada en condiciones que permiten la expresión del polímero de ADN se lleva a cabo de forma convencional, como se describe, por ejemplo, en Maniatis y col. y en "DNA Cloning" citado anteriormente. De este modo, preferiblemente, se suministran nutrientes a la célula y se cultiva a una temperatura inferior a 50ºC.
El producto se recupera mediante procedimientos convencionales según la célula hospedadora. De este modo, ya sea la célula hospedadora bacteriana, tal como E. coli, o de levadura, tal como Pichia, puede lisarse física, química o enzimáticamente y el producto proteico puede aislarse del lisado resultante. Si la célula hospedadora es de mamífero, el producto generalmente puede aislarse a partir del medio nutriente o a partir de extractos sin células. Las técnicas convencionales de aislamiento de proteínas incluyen la precipitación selectiva, cromatografía de absorción y cromatografía de afinidad, que incluye una columna de afinidad con anticuerpo monoclonal.
Para las proteínas de la presente invención provistas de colas de histidina, la purificación puede lograrse fácilmente mediante el uso de una columna de afinidad con iones metálicos. En una realización preferida, la proteína se purifica adicionalmente sometiéndola a una cromatografía de intercambió catiónico y/o cromatografía de filtración en gel. A continuación, la solución proteica se esteriliza pasándola a través de una membrana de 0,22 \mum.
Entonces, las proteínas de la invención pueden formularse como vacuna, o eliminarse enzimáticamente los restos histidina.
Las proteínas de la presente invención se proporcionan preferiblemente al menos con una pureza del 80%, más preferiblemente del 90%, como se visualiza mediante SDS-PAGE. Preferiblemente las proteínas aparecen como una única banda en la SDS-PAGE.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de la presente invención en un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La preparación de vacunas se describe de forma general en New Trends and Developments in Vaccines, Voller y col. (editores), Universidad Park Press, Baltimore, Maryland, 1978. La encapsulación en liposomas se describe en Fullerton, Patente de EE.UU. 4.235.877.
Las proteínas de la presente invención se preparan en la formulación para vacuna de la invención preferiblemente con coadyuvante. Los coadyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio, tal como el gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio, de hierro o de cinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acetilada o azúcares acetilados, polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente o polifosfacenos
En la formulación de la invención se prefiere que la composición coadyuvante induzca una respuesta preferentemente TH1. Los sistemas de coadyuvante adecuados incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A o un derivado del mismo, preferiblemente monofosforil lípido A 3-de-O-acetilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio.
Un sistema potenciado implica la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, en especial la combinación de QS21 y 3D-MPL, como se describe en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactogénica donde el QS21 se inactiva con colesterol como se describe en el documento WO 96/33739.
Una formulación de coadyuvante especialmente potente que implica a QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210 y es una formulación preferida.
Por consiguiente, en una realización de la presente invención, se proporciona una vacuna que comprende una proteína según la invención preparada con un coadyuvante como un monofosforil lípido A o un derivado del mismo, especialmente 3D-MPL.
Preferiblemente la vacuna comprende adicionalmente una saponina, más preferiblemente QS21.
Preferiblemente la formulación adicional comprende una emulsión de aceite en agua y tocoferol. La presente invención también proporciona un procedimiento para producir una formulación para vacuna que comprende mezclar una proteína de la presente invención junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como 3D-MPL.
La vacuna de la presente invención puede comprender adicionalmente más proteínas del VIH, tal como la glicoproteína de la cubierta gp160 o su derivado gp120.
En otro aspecto, la invención se refiere a una proteína Nef del VIH o Tat del VIH o derivados de las mismas expresadas en Pichia pastoris.
La invención se describirá más detalladamente en referencia a los siguientes ejemplos.
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Ejemplos General
Las proteínas Nef y Tat, dos proteínas reguladoras codificadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1), se produjeron en E. coli y en la levadura metilotrófica Pichia pastoris.
Se seleccionó el gen nef del clon aislado Bru/Lai (Cell 40: 9-17, 1985) para estas construcciones, porque este gen está entre los más relacionados con la proteína Nef de consenso.
El material inicial para el gen nef de Bru/Lai era un fragmento de ADN de 1.170 pb clonado en el vector de expresión de mamífero pcDNA3 (pcDNA3/nef).
El gen tat se origina a partir del clon molecular BH10. Este gen se recibió como un clon de ADNc de HTLV III denominado pCV1 y descrito en Science, 229, pág. 69-73, 1985.
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1. Expresión de las secuencias de nef y tat del VIH-1 en E. coli
Las secuencias que codifican la proteína Nef, así como una fusión de las secuencias nef y tat se colocó en vectores plasmídicos: pRIT14586 y pRIT14589 (véase la Figura 1).
Nef y la fusión Nef-Tat se produjeron como proteínas de fusión usando como pareja de fusión una parte de la proteína D. La proteína D es una proteína de unión a inmunoglobulina D expuesta en la superficie de la bacteria Gram negativa Haemophilus influenzae.
pRIT14586 contiene, bajo el control de un promotor PL de \lambda, una secuencia de ADN derivada de la bacteria Haemophilus influenzae que codifica los primeros 127 aminoácidos de la proteína D (Infect. Immun. 60: 1336-1342, 1992), seguida inmediatamente por una región de un sitio de clonación múltiple más una secuencia de ADN que codifica una glicina, 6 restos histidina y un codón de parada (Figura 1A).
Este vector está diseñado para expresar una proteína de fusión unida a lípidos procesada con una cola de histidina (proteína de fusión LipoD). La proteína de fusión se sintetiza como un precursor con una secuencia señal de 18 restos de aminoácidos de longitud y tras el procesamiento, la cisteína en posición 19 en la molécula precursora se convierte en el resto amino terminal que, a continuación, se modifica uniéndose covalentemente a ácidos grasos (Figura 1B).
pRIT14589 es casi idéntico a pRIT14586, excepto que la secuencia derivada de la prot D comienza inmediatamente después del codón 19 para cisteína.
La expresión de este vector da lugar a una proteína de fusión sin unir a lípidos con cola de His (proteína de fusión Prot D).
Se hicieron cuatro construcciones: LipoD-nef-His, LipoD-nef tat-His, Prot D-nef His y Prot D-nef tat-His.
Las dos primeras construcciones se hicieron usando el vector de expresión pRIT14586 y las dos últimas construcciones usando pRIT14589.
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1.1 Construcción de la cepa recombinante ECLD-N1 que produce la proteína de fusión lipoD-Nef-His 1.1.1 Construcción del plásmido de expresión de lipoD-nef-His, pRIT14595
El gen nef (clon aislado Bru/Lai) se amplificó mediante PCR a partir del plásmido pcDNA3/Nef con los cebadores 01 y 02.
2
La región nefDNA amplificada comienza en el nucleótido 8.357 y termina en el nucleótido 8.971 (Cell, 40:9-17, 1985).
Se introdujo un sitio de restricción NcoI (que lleva el codón ATG del gen nef) en el extremo 5' del fragmento de PCR, mientras que en el extremo 3' se introdujo un sitio SpeI.
El fragmento de PCR obtenido y el plásmido de expresión pRIT14586 se cortaron ambos con las enzimas de restricción NcoI y SpeI, se purificaron en un gel de agarosa, se ligaron y se transformaron en la célula hospedadora E. coli apropiada, la cepa AR58. Esta cepa es un lisógeno \lambda críptico derivado de N99 que es galE::Tn10, \Delta-8 (chlD-pgl), \Delta-H1 (cro-chlA), N^{+} y cI857.
El plásmido recombinante resultante, tras la verificación de la región nef amplificada mediante secuenciación automática (véase la sección 1.1.2 siguiente), recibió la denominación de pRIT14595.
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1.1.2 Selección de los transformantes de la cepa AR58 de E. coli con pRIT14595
Cuando se transforma en la cepa AR58 de E. coli, el plásmido recombinante dirige la producción termoinducible de la proteína heteróloga.
La producción de la proteína termoinducible de varios transformantes lipoD-Nef-His recombinantes se analizó mediante SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie. Todos los transformantes analizados mostraron la producción de la proteína heteróloga termoinducible. La cantidad de la proteína de fusión LipoD-Nef-Tat-His recombinante se estimó en el 10% de la proteína total.
Se seleccionó uno de los transformantes y se le dio el número de acceso del laboratorio ECLD-N1.
Se volvió a aislar el plásmido recombinante a partir de la cepa ECLD-N1 y se confirmó la secuencia de la región codificadora de nef-His mediante secuenciación automática. Este plásmido recibió la designación oficial de pRIT14595.
La proteína de fusión Lipo D-nef-His recombinante completamente procesada y acetilada producida por la cepa ECLD-N1 se compone de:
º Ácidos grasos
º 109 aa de la proteína D (comenzando en el aa 19 y extendiéndose hasta el aa 127).
º Una metionina, creada mediante el uso del sitio de clonación NcoI de pRIT14586 (Figura 1).
º 250 aa de la proteína Nef (comenzando en el aa 2 y extendiéndose hasta el aa 206).
º Una treonina y una serina creadas mediante el procedimiento de clonación (clonando en el sitio SpeI de
pRIT14586).
º Una glicina y seis histidinas.
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1.2 Construcción de la cepa recombinante ECD-N1 que produce la proteína de fusión Prot D-Nef-His
La construcción del plásmido de expresión pRIT14600 que codifica la proteína de fusión Prot D-Nef-His era idéntica a la construcción plasmídica descrita en el ejemplo 1.1.1 excepto porque se usó pRIT14589 como plásmido receptor para el fragmento nef amplificado por PCR.
La cepa AR58 de E. coli se transformó con pRIT14600 y los transformantes se analizaron como se describe en el ejemplo 1.1.2. El transformante seleccionado recibió el número del acceso del laboratorio ECD-N1.
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1.3 Construcción de la cepa recombinante ECLD-NT6 que produce la proteína de fusión lipoD-Nef-Tat-His 1.3.1 Construcción del plásmido de expresión de lipo D-Nef-Tat-His, pRIT14596
El gen tat (clon aislado BH10) se amplificó mediante PCR a partir de un derivado del plásmido pCV1 con los cebadores 03 y 04. Se introdujeron los sitios de restricción SpeI en ambos extremos del fragmento de PCR.
3
La secuencia de nucleótidos del gen tat amplificado se ilustra en el clon pCV1 (Science 229: 69-73, 1985) y se extiende del nucleótido 5.414 al nucleótido 7.998.
El fragmento de PCR obtenido y el plásmido pRIT14595 (que expresa la proteína lipoD-Nef-His) se digirieron ambos con la enzima de restricción SpeI, se purificaron en un gel de agarosa, se ligaron y transformaron en células AR58 competentes. El plásmido recombinante resultante, tras la verificación de la secuencia del tat amplificada mediante secuenciación automática (véase la sección 1.3.2 siguiente), recibió la denominación de pRIT14596.
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1.3.2 Selección de transformantes de la cepa AR58 con pRIT14596
Los transformantes se crecieron, se indujeron por calor y sus proteínas se analizaron mediante geles teñidos con azul de Coomassie. El nivel de producción de la proteína recombinante se estimó en el 1% de la proteína total. Se seleccionó una cepa recombinante que recibió la denominación del laboratorio de ECLD-NT6.
El plásmido recombinante lipoD-nef-tat-His se volvió a aislar a partir de la cepa ECLD-NT6, se secuenció y recibió la denominación oficial de pRIT14596.
La proteína de fusión Lipo D-Nef-Tat-His recombinante completamente procesada y acetilada producida por la cepa ECLD-N6 se compone de:
º Ácidos grasos
º 109 aa de la proteína D (comenzando en el aa 19 y extendiéndose hasta el aa 127).
º Una metionina, creada mediante el uso del sitio de clonación NcoI de pRIT14586.
º 205 aa de la proteína Nef (comenzando en el aa 2 y extendiéndose hasta el aa 206).
º Una treonina y una serina creadas mediante el procedimiento de clonación
º 85 aa de la proteína Tat (comenzando en el aa 2 y extendiéndose hasta el aa 86).
º Una treonina y una serina introducidas mediante el procedimiento de clonación
º Una glicina y seis histidinas.
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1.4 Construcción de la cepa recombinante ECD-NT1 que produce la proteína de fusión Prot D-Nef-Tat-His
La construcción del plásmido de expresión pRIT14601 que codifica la proteína de fusión Prot D-Nef-Tat-His era idéntica a la construcción plasmídica descrita en el ejemplo 1.3.1 excepto porque pRIT14600 se usó como plásmido receptor para el fragmento nef amplificado por PCR.
La cepa AR58 de E. coli se transformó con pRIT14601 y los transformantes se analizaron como se describe previamente. El transformante seleccionado recibió el número de acceso del laboratorio ECD-NT1.
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2. Expresión de las secuencias de nef y tat del VIH-1 en Pichia pastoris
La proteína Nef, la proteína Tat y la fusión Nef-Tat se expresaron en la levadura metilotrófica Pichia pastoris bajo el control del promotor inducible de la alcohol oxidasa (AOX1).
Para expresar estos genes del VIH-1, se usó una versión modificada del vector de integración PHIL-D2 (INVITROGEN). Este vector se modificó de forma que la expresión de la proteína heteróloga se iniciaba inmediatamente después del codón ATG nativo del gen AOX1 y producía una proteína recombinante con una cola de una glicina y seis restos histidina. Este vector PHIL-D2-MOD se construyó clonando un enlazador oligonucleotídico entre los sitios AsuII y EcoRI adyacentes del vector PHIL-D2 (véase la Figura 3). Además de la cola de His, este enlazador lleva los sitios de restricción NcoI, SpeI y XbaI, entre los que se insertaron nef, tat y la fusión nef-tat.
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2.1 Construcción de los vectores de integración pRIT14597 (que codifica la proteína Nef-His), pRIT14598 (que codifica la proteína Tat-His) y pRIT14599 (que codifica la fusión Nef-Tat-His)
El gen nef se amplificó por PCR a partir del plásmido pcDNA3/Nef con los cebadores 01 y 02 (véase la sección 1.1.1 construcción de pRIT14595). El fragmento obtenido por PCR y el vector de integración PHIL-D2-MOD se escindieron con las enzimas NcoI y SpeI, se purificaron en gel de agarosa y se ligaron para crear el plásmido de integración pRIT14597 (véase la Figura 3).
El gen tat se amplificó por PCR a partir de un derivado del plásmido pCV1 con los cebadores 05 y 04 (véase la sección 1.3.1 construcción de pRIT14596):
5
Se introdujo un sitio de restricción NcoI en el extremo 5' del fragmento de PCR mientras que se introdujo un sitio SpeI en el extremo 3' con el cebador 04. El fragmento de PCR obtenido y el vector PHIL-D2-MOD se escindieron ambos con NcoI y SpeI, se purificaron en un gel de agarosa y se ligaron para crear el plásmido de integración pRIT14598.
Para construir pRIT14599, un fragmento de ADN de 910 pb correspondiente a la secuencia codificadora nef-tat-His se ligó entre los sitios de EcoRI romos (polimerasa de T4) y de NcoI del vector PHIL-D2-MOD. El fragmento que codifica nef-tat-His se obtuvo mediante digestiones de XbaI romas (polimerasa de T4) y de NcoI de pRIT14596.
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2.2 Transformación de las cepa GS115(his4) de Pichia pastoris
Para obtener cepas de Pichia pastoris que expresen Nef-His, Tat-His y la fusión Nef-Tat-His, se transformó la cepa GS 115 con fragmentos lineales NotI que llevaban los respectivos casetes de expresión, además del gen HIS4 para complementar la his4 en el genoma hospedador. La transformación de GS 115 con los fragmentos lineales NotI favorece la recombinación en el locus AOX1.
Se seleccionaron clones integrantes multicopia mediante análisis cuantitativo por transferencia en puntos y se determinó el tipo de integración, inserción (fenotipo Mut^{+}) o transición (fenotipo Mut^{5}).
Para cada transformación, se seleccionó un transformante que mostraba un elevado nivel de producción de la proteína recombinante:
La cepa Y1738 (fenotipo Mut^{+}), que produce la proteína Nef-His recombinante, una proteína de 215 aminoácidos miristilada que está compuesta de:
º Ácido mirístico
º Una metionina, creada mediante el uso del sitio de clonación NcoI de PHIL-D2-MOD.
º 205 aa de la proteína Nef (comenzando en el aa 2 y extendiéndose hasta el aa 206).
º Una treonina y una serina creadas mediante el procedimiento de clonación (clonando en el sitio SpeI del vector PHIL-D2-MOD).
º Una glicina y seis histidinas.
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La cepa Y1739 (fenotipo Mut^{+}) que produce la proteína Tat-His recombinante, una proteína de 95 aminoácidos miristilada que está compuesta de:
º Una metionina, creada mediante el uso del sitio de clonación NcoI.
º 85 aa de la proteína Tat (comenzando en el aa 2 y extendiéndose hasta el aa 86).
º Una treonina y una serina creadas mediante el procedimiento de clonación
º Una glicina y seis histidinas.
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La cepa Y1737 (fenotipo Mut^{s}) que produce la proteína de fusión Nef-Tat-His recombinante, una proteína miristilada de 302 aminoácidos que está compuesta de:
º Ácido mirístico
º Una metionina, creada mediante el uso del sitio de clonación NcoI.
º 205 aa de la proteína Nef (comenzando en el aa 2 y extendiéndose hasta el aa 206).
º Una treonina y una serina creadas mediante el procedimiento de clonación
º 85 aa de la proteína Tat (comenzando en el aa 2 y extendiéndose hasta el aa 86).
º Una treonina y una serina creadas mediante el procedimiento de clonación
º Una glicina y seis histidinas.
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3. Expresión de Tat mutante del VIH-1 en Pichia pastoris
Así como se hizo con una proteína de fusión Nef-Tat mutante, también se expresó una proteína Tat recombinante mutante. La proteína Tat mutante debe ser biológicamente inactiva y a la vez mantener sus epítopos inmunogénicos.
Se seleccionó para estas construcciones un gen tat doble mutante, construido por D. Clements (Universidad de Tulane).
Este gen tat (procedente del clon molecular BH10) tiene mutaciones en la región del sitio activo (Lys41\rightarrowAla) y en el motivo RGD (Arg78\rightarrowLys y Asp80\rightarrowGlu) (Virology 235: 48-64, 1997).
El gen tat mutante se recibió como un fragmento de ADNc subclonado entre los sitios EcoRI e HindIII en un plásmido de expresión del CMV (pCMVLys41/KGE).
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3.1 Construcción de los vectores de integración pRIT14912 (que codifica la proteína Tat mutante-His) y pRIT14913 (que codifica la fusión Nef-Tat mutante-His)
El gen tat mutante se amplificó por PCR a partir del plásmido pCMVLys41/KGE con los cebadores 05 y 04 (véase la sección 2.1 construcción de pRIT14598).
Se introdujo un sitio de restricción NcoI en el extremo 5' del fragmento de PCR mientras que en el extremo 3' se introdujo un sitio SpeI con el cebador 04. El fragmento de PCR obtenido y el vector PHIL-D2-MOD se restringieron ambos con NocI y SpeI, se purificaron en un gel de agarosa y se ligaron para crear el plásmido de integración pRIT14912.
Para construir pRIT14193, se amplificó el gen tat mutante por PCR a partir del plásmido pCMVLys41/KGE con los cebadores 03 y 04 (véase la sección 1.3.1 construcción de pRIT14596).
El fragmento de PCR obtenido y el plásmido pRIT14597 (que expresa la proteína Nef-His) se digirieron ambos con la enzima de restricción SpeI, se purificaron en un gel de agarosa y se ligaron para crear el plásmido de integración pRIT14913.
\newpage
3.2 Transformación de la cepa GS115 de Pichia pastoris
Se obtuvieron cepas de Pichia pastoris que expresaban la proteína Tat mutante-His y la fusión Nef-Tat mutante-His, aplicando estrategias de integración y selección de cepas recombinantes descritas previamente en la sección 2.2.
Se seleccionaron dos cepas recombinantes que producían la proteína Tat mutante-His, una proteína de 95 aminoácidos: Y1775 (fenotipo Mut^{+}) e Y1776 (fenotipo Mut^{s}).
Se seleccionó una cepa recombinante que expresaba la proteína de fusión Nef-Tat mutante-His, una proteína de 302 aminoácidos: Y1774 (fenotipo Mut^{+}).
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4. Purificación de la proteína de fusión Nef-Tat-His (Pichia pastoris)
El esquema de purificación se ha desarrollado a partir de 146 g de células de Pichia pastoris recombinantes (peso húmedo) o 2 l de homogeneizado con Dyno-mill de DO 55. Las etapas cromatográficas se realizaron a temperatura ambiente. Entre las etapas, las fracciones positivas para Nef-Tat se mantienen durante toda la noche en la cámara fría (+4ºC); para tiempos más prolongados, las muestras se congelan a -20ºC.
6
7
8 
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Pureza
El nivel de pureza estimado en SDS-PAGE se muestra en la Figura 4 mediante la tinción con plata de Daiichi y en la Figura 5 mediante azul de Coomassie G250.
Tras la etapa de Superdex200: > 95%.
Tras las etapas de diálisis y filtración para esterilización: > 95%.
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Recuperación
Se purifican 51 mg de proteína Nef-Tat-His a partir de los 146 g de células de Pichia pastoris recombinante (= 2 l de homogeneizado con Dyno-mill de DO 55).
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5. Preparación de vacunas
Una vacuna preparada según la invención comprende el producto de expresión de un ADN recombinante que codifica un antígeno como se explica en los ejemplos 1 ó 2, y como coadyuvante, la formulación que comprende una mezcla del monofosforil lípido A-3-de-O-acetilado, 3D-MPL y QS21 en una emulsión de aceite/agua.
3D-MPL: es una forma químicamente detoxificada del lipopolisacárido (LPS) de la bacteria Gram-negativa Salmonella minnesota.
Experimentos realizados en el Smith Kline Beecham Biologicals han demostrado que 3D-MPL, combinado con diversos vehículos, potencia mucho tanto la inmunidad humoral como una inmunidad celular de tipo TH1.
QS21: es una saponina purificada a partir de un extracto bruto de la corteza del árbol Quillaja saponaria Molina que tiene una potente actividad coadyuvante: activa tanto la linfoproliferación específica de antígeno como los LCT frente a varios antígenos. Experimentos realizados en el Smith Kline Beecham Biologicals han demostrado un efecto claramente sinérgico de combinaciones de 3D-MLP y QS21 en la inducción tanto de respuestas humorales como de respuestas celulares de tipo TH1.
\newpage
La emulsión aceite en agua está compuesta de 2 aceites (un tocoferol y un escualeno) y de PBS que contiene Tween 80 como emulsionante. La emulsión comprendía escualeno al 5%, tocoferol al 5%, Tween 80 al 0,4% y tenía un tamaño medio de partícula de 180 nm (véase el documento WO 95/17210).
Experimentos realizados en el Smith Kline Beechman Biologicals han demostrado que la agregación de esta emulsión aceite en agua a 3D-MPL/QS21 aumenta además sus propiedades inmunoestimulantes.
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Preparación de la emulsión aceite en agua (concentrada 2 veces)
El Tween 80 se disuelve en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una solución al 2% en el PBS. Para proporcionar 100 ml de una emulsión concentrada dos veces, se mezclan mediante agitación 5 g de DL-alfa-tocoferol y 5 ml de escualeno. Se añaden 90 ml de solución PBS/Tween y se mezcla bien. A continuación, la emulsión resultante se pasa a través de una jeringa y, finalmente, se microfluidiza usando una máquina para microfluidos M110S. Las gotitas de aceite resultantes tienen un tamaño de aproximadamente 180 nm.
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Preparación de una formulación de aceite en agua
El antígeno preparado según el ejemplo 1 ó 2 (5 \mug) se diluyó en PBS pH 6,8, concentrado 10 veces y H_{2}O antes de la adición posterior de SB62, 3D-MPL (5 \mug), QS21 (5 \mug) y tiomersal a 50 \mug/ml como conservante con un intervalo de 5 min. El volumen de emulsión es igual al 50% del volumen total (50 \mul para una dosis de 100 \mul).
Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente con agitación.
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6. Inmunogenicidad de Tat y Nef-Tat en roedores
Se realizó la caracterización de la respuesta inmune inducida tras la inmunización con Tat y Nef-Tat. Para obtener información de los perfiles de isotipo y de la inmunidad celular (IC) se realizaron dos experimentos de inmunización en ratones. En el primer experimento, los ratones se inmunizaron dos veces con dos semanas de diferencia en las almohadillas plantares con Tat o Nef-Tat en forma oxidada o reducida, respectivamente. Los antígenos se formularon en una emulsión de aceite en agua que comprendía escualeno, tween 80^{TM} (monooleato de sorbitán polioxietileno) QS21, 3D-MPL y \alpha-tocoferol y un grupo control que recibió sólo el coadyuvante. Dos semanas después de la última inmunización, se obtuvieron los sueros y se sometieron a un ELISA específico para Tat (usando Tat reducido para el recubrimiento) para la determinación de los valores e isotipos de los anticuerpos (Figura 6a). Los valores de anticuerpos fueron mayores en los ratones que habían recibido Tat oxidada. En general, las moléculas oxidadas inducían valores de anticuerpos mayores que las formas reducidas y Tat por sí sola inducía valores de anticuerpos mayores de Nef-Tat. La última observación se confirmó en el segundo experimento. Curiosamente, el perfil de isotipo de anticuerpos específicos de Tat difería dependiendo de los antígenos usados para la inmunización. Tat por sí sola provocada un perfil equilibrado de IgG1 e IgG2a, mientras que Nef-Tat inducía un sesgo hacia T_{H2} más fuerte (Figura 6b). Esto se confirmó una vez más en el segundo experimento.
En el segundo experimento con ratones, los animales recibieron sólo las formas reducidas de las moléculas o sólo el coadyuvante. Además del análisis serológico (véase anteriormente), se evaluaron las respuestas linfoproliferativas de células de ganglios linfáticos. Tras la reestimulación de estas células in vitro con Tat o Nef-Tat, se midió la incorporación de ^{3}H-timidina tras 4 días de cultivo. La presentación de los resultados como índices de estimulación indica que se inducían respuestas muy potentes en los dos grupos de ratones que habían recibido el antígeno (Figura 7).
En conclusión, los estudios en ratones indican que Tat, así como Nef-Tat, son antígenos muy inmunogénicos candidatos a vacunas. La respuesta inmune dirigida frente a las dos moléculas se caracteriza por altas respuestas de anticuerpos con al menos el 50% de IgG1. Además, se observaron fuertes respuestas IC (según se midió por linfoproliferación).
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7. Propiedades funcionales de las proteínas Tat y Nef-Tat
Se investigó la capacidad de las moléculas Tat y Nef-Tat en forma oxidada o reducida para unirse a líneas de células T humanas. Además, se evaluó el efecto sobre el crecimiento de estas líneas celulares. Las placas de ELISA se recubrieron durante toda la noche con concentraciones diferentes de las proteínas Tat y Nef-Tat, la gD no relacionada del virus del herpes simple de tipo II o sólo con un tampón control. Tras retirar la solución de recubrimiento, se añadieron a los pocillos células HUT-78. Tras dos horas de incubación, los pocillos se lavaron y se evaluó microscópicamente la unión de las células al fondo de los pocillos. Como medida cuantitativa, las células se tiñeron con azul de toluidina, se lisaron con SDS y se determinó la concentración de azul de toluidina en el sobrenadante con un lector de placas de ELISA. Los resultados indican que las cuatro proteínas, Tat y Nef-Tat en forma oxidada o reducida, se unen a las células de la placa de ELISA (Figura 8). Ni la proteína no relacionada (datos no mostrados) ni el tampón se fijaban a las células. Esto indica que las proteínas que contienen Tat expresadas de forma recombinante se unen específicamente a líneas de células T humanas.
En un segundo experimento, las células HUT-78 se dejaron en contacto con las proteínas durante 16 horas. Al final del periodo de incubación, las células se marcaron con [^{3}H]-timidina y se determinó la tasa de incorporación como medida del crecimiento celular. Las cuatro proteínas incluidas en este estudio inhibían el crecimiento celular a juzgar por la disminución de la incorporación de radiactividad (Figura 9). El control de tampón no mediaba en este efecto. Estos resultados demuestran que las proteínas recombinantes que contienen Tat son capaces de inhibir el crecimiento de una línea de células T humanas.
En resumen, la caracterización funcional de las proteínas Tat y Nef-Tat revela que estas proteínas son capaces de unirse a líneas de células T humanas. Además, las proteínas son capaces de inhibir el crecimiento de estas líneas celulares.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE: SmithKline Beecham Biologicals. S.A.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 27
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: SmithKline Beecham
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Two New Horizons Court
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Brentford
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO:
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Middx, Reino Unido
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: TW8 9EP
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: FastSEQ para Windows, Versión 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD :
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 26-SEP-1997
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Bor, Fiona R.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE:
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 0181 975 2817
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 0181 975 6141
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
100 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
101 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
102 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
103 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
104 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 441 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6
\vskip1.000000\baselineskip
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 144 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 648 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 216 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 288 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10:
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11:
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 909 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 303 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.029 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 325 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
18
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.290 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 16:
20 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 412 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 981 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 18:
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 327 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
24 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.242 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 414 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 21:
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 288 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 22:
27 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 96 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
28 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 909 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 24:
29 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 303 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
105 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
32

Claims (22)

1. Una composición de vacuna proteínica que proteínica que comprende una proteína expresada, recuperada y aislada que comprende
(a) una proteína Tat del HIV completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o una Tat mutada que ha experimentado una deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipoproteica o a (ii) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal o a Nef que ha experimentado una deleción, adición o sustitución de un aminoácido; o
(b) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipoproteica o a (ii) una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal o a una Tat mutada que ha experimentado una deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23; o
(c) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, unida a una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal o a una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de uno aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23 y una pareja de fusión proteica o lipoproteica, mezclada con un excipiente farmacéuticamente aceptable mezclada con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Una composición según la reivindicación 1 que comprende una proteína de fusión Tat-Nef o un derivado de la misma.
3. Una composición según la reivindicación 1 que comprende una proteína de fusión Nef-Tat o un derivado de la misma.
4. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la que la lipoproteína es la proteína D de Haemophilus influenzae de tipo B o un derivado de la misma.
5. Una composición según la reivindicación 4 en la que la pareja de fusión comprende entre 100-130 aminoácidos del extremo N-terminal de la proteína D de Haemophilus influenzae de tipo B.
6. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la proteína Tat se fusiona con una proteína Nef del VIH y una pareja de fusión.
7. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la proteína tiene una cola de histidina.
8. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en la que la proteína es una proteína de fusión Nef-Tat y está carboximetilada.
9. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que adicionalmente comprende un coadyuvante.
10. Una composición según la reivindicación 9, en la que el coadyuvante es un coadyuvante que induce una respuesta TH1.
11. Una composición según la reivindicación 9 ó 10 cuyo coadyuvante comprende el monofosforil lípido A o un derivado del mismo, tal como monofosforil lípido A 3-de-O-acilado.
12. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 que adicionalmente comprende una saponina como coadyuvante.
13. Una composición según la reivindicación 11 o la reivindicación 12 que adicionalmente comprende una emulsión de aceite en agua y tocoferol.
14. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a la reivindicación 13 en la que el coadyuvante comprende 3D-MPL, QS21 y una emulsión de aceite en agua de tocoferol, escualeno y Tween 80^{TM}.
15. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 que además comprende la gp160 del VIH o su derivado gp120.
16. Una proteína que comprende una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal o una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido o una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23, unida a una proteína Nef del VIH completa o a Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal o Nef que ha experimentado una deleción, adición o sustitución de un aminoácido, en orientación Nef-Tat o Tat-Nef.
17. Un procedimiento para preparar una proteína que comprende (a) una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipoproteica o a (ii) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o a Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido; o (b) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, unida a (i) una pareja de fusión proteica o lipoproteica o a (ii) una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o a una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23; o (c) una proteína Nef del VIH completa o Nef con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o Nef que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, unida a una proteína Tat del VIH completa o Tat con una cola de histidina en el extremo C-terminal, o a una Tat mutada que ha experimentado deleción, adición o sustitución de un aminoácido, o a una Tat mutada como se define en la ID SEC Nº 23, y una pareja de fusión proteica o lipoproteica, en Pichia pastoris, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de trasformar Pichia pastoris con ADN que codifica dicha proteína, expresar dicha proteína y recuperar al proteína
18. El procedimiento de la reivindicación 17 en el que la proteína es una proteína de fusión Nef-Tat y el procedimiento además comprende una etapa de carboximetilación realizada en la proteína expresada.
19. Un procedimiento de producción de una vacuna, que comprende mezclar la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 18 con un diluyente farmacéuticamente aceptable.
20. El procedimiento de la reivindicación 19 que además comprende la adición de la gp 160 del VIH o su derivado gp 120.
21. El procedimiento de las reivindicaciones 17 a 20 que además comprende la adición de un coadyuvante, especialmente un coadyuvante que induce una respuesta TH1.
22. Una proteína o polinucleótido Nef-Tat-His o Nef-Tat mutante-His que tiene la secuencia de aminoácidos o de ADN mostrada en las ID SEC Nº 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24 ó 25.
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