PL195243B1 - Kompozycja szczepionki, białko obejmujące białka Tat HIV i Nef HIV-1 albo ich pochodne oraz kwas nukleinowy kodujący to białko i komórka transformowana tym kwasem, sposób wytwarzania tego białka orazbiałka zawierającego białko Tat HIV i/lub Nef HIValbo ich pochodne, polinukleotyd oraz białko Nef-Tat-His lub Nef-zmutowany Tat-His - Google Patents
Kompozycja szczepionki, białko obejmujące białka Tat HIV i Nef HIV-1 albo ich pochodne oraz kwas nukleinowy kodujący to białko i komórka transformowana tym kwasem, sposób wytwarzania tego białka orazbiałka zawierającego białko Tat HIV i/lub Nef HIValbo ich pochodne, polinukleotyd oraz białko Nef-Tat-His lub Nef-zmutowany Tat-HisInfo
- Publication number
- PL195243B1 PL195243B1 PL98339432A PL33943298A PL195243B1 PL 195243 B1 PL195243 B1 PL 195243B1 PL 98339432 A PL98339432 A PL 98339432A PL 33943298 A PL33943298 A PL 33943298A PL 195243 B1 PL195243 B1 PL 195243B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- protein
- tat
- hiv
- nef
- sioo
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 94
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 89
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims description 19
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 19
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 27
- 108010084873 Human Immunodeficiency Virus nef Gene Products Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 claims description 63
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 30
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 30
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 25
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 15
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 14
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 12
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 8
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 claims description 7
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 claims description 7
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 6
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 claims description 6
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 235000006149 Eugenia stipitata Nutrition 0.000 claims 2
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 claims 2
- 241001074363 Zaedyus Species 0.000 claims 2
- 101710134784 Agnoprotein Proteins 0.000 claims 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 claims 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 claims 1
- 102000012000 CXCR4 Receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108010061299 CXCR4 Receptors Proteins 0.000 claims 1
- 101710149934 Protein tas Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 abstract description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 5
- 108010070875 Human Immunodeficiency Virus tat Gene Products Proteins 0.000 abstract description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 67
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 18
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 16
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 9
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 7
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 101710192141 Protein Nef Proteins 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 6
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 6
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 6
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 5
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 5
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 5
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 5
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 3
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 3
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 3
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 108700020134 Human immunodeficiency virus 1 nef Proteins 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000001421 myristyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 108700004028 nef Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150023385 nef gene Proteins 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 2
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 2
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 229940006193 2-mercaptoethanesulfonic acid Drugs 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150061183 AOX1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 235000001815 DL-alpha-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011627 DL-alpha-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 description 1
- 101001015673 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Glycerophosphodiester phosphodiesterase Proteins 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- -1 MnCh Chemical compound 0.000 description 1
- 241001092142 Molina Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100525628 Picea mariana SB62 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 description 1
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241001222774 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Minnesota Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- ZNEWHQLOPFWXOF-UHFFFAOYSA-N coenzyme M Chemical compound OS(=O)(=O)CCS ZNEWHQLOPFWXOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000000459 effect on growth Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006872 enzymatic polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 101150075199 nei gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[[4-[(e)-[4-(4-ethoxyanilino)phenyl]-[4-[ethyl-[(3-sulfonatophenyl)methyl]azaniumylidene]-2-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]methyl]-n-ethyl-3-methylanilino]methyl]benzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C(=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=2C(=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C)C=C1 RWVGQQGBQSJDQV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical class [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
1. Kompozycja szczepionki obejmujaca czynnik aktywny w domieszce z farmaceutycznie do- puszczalna zaróbka, znamienna tym, ze jako czynnik aktywny zawiera bialko obejmujace: a) pelne bialko Tat HIV albo Tat zawierajace C koncowy „ogon" histydynowy albo zmutowane Tat, które bylo poddane delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu, albo zmutowane Tat, jak okreslone w SEK. NR ID. 23, w polaczeniu z (i) bialkowym lub lipoproteinowym partnerem fuzji albo z (ii) pelnym bialkiem Nef HIV albo Nef zawierajacym C koncowy „ogon” histydynowy albo Nef podda- nym delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu; albo b) pelne bialko Nef HIV albo Nef zawierajace C koncowy „ogon” histydynowy albo Nef, które by- lo poddane delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu, w polaczeniu z (i) bialkowym lub lipo- proteinowym partnerem fuzji albo z (ii) pelnym bialkiem Tat HIV albo Tat zawierajacym C koncowy „ogon” histydynowy albo zmutowanym Tat poddanym delecji, addycji lub substytucji jednego amino- kwasu albo zmutowanym Tat, jak okreslone w SEK. NR ID. 23; albo c) pelne bialko Nef HIV albo Nef zawierajace C koncowy „ogon” histydynowy albo Nef, które by- lo poddane delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu, w polaczeniu z pelnym bialkiem Tat HIV albo Tat zawierajacym C koncowy „ogon" histydynowy albo zmutowanym Tat poddanym delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu albo zmutowanym Tat, jak okreslone w SEK NR ID. 23, oraz z bialkowym lub lipoproteinowym partnerem fuzji. PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja szczepionki, białko obejmujące białka Tat HIV i Nef HIV-1 albo ich pochodne oraz kwas nukleinowy kodujący to białko i komórka transformowana tym kwasem, sposób wytwarzania tego białka oraz białka zawierającego białko Tat HIV i/lub Nef HIV albo ich pochodne, polinukleotyd oraz białko Nef-Tat-His lub Nef-zmutowany Tat-His.
HIV-1 jest główną przyczyną zespołu nabytego niedoboru odporności (AIDS), który jest uważany za jeden z głównych problemów zdrowotnych świata. Mimo iż na całym świecie prowadzi się wytężone badania mające na celu otrzymanie szczepionki, wysiłki te jak dotąd nie powiodły się.
Nieotoczkowe białka HIV-1 zostały opisane i obejmują one, przykładowo, białka strukturalne, takie jak produkty genów gag i pol oraz inne białka niestrukturalne, takie jak Rev, Nef, Vif i Tat (Greene i in., New Engl. J. Med., 324, 5, 308 (1991) i Bryant i in., (red. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11,5, 390 i dalej (1992).
Białka Nef i Tat HIV są białkami wczesnymi, tzn. ulegają ekspresji we wczesnym stadium zakażenia i pod nieobecność białek strukturalnych.
Kompozycja szczepionki według wynalazku obejmuje czynnik aktywny w domieszce z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, przy czym czynnik aktywny zawiera białko obejmujące:
a) pełne białko Tat HIV albo Tat zawierające C końcowy „ogon” hissydynowy albo zmutowane Tat, które było poddane delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu, albo zmutowane Tat, jak określone w SEK. NR ID. 23, w połączeniu z (i) białkowym lub lipoproteinowym partnerem fuzji albo z (ii) pełnym białkiem Nef HIV albo Nef zawierającym C końcowy „ogon” histydynowy albo Nef poddanym delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu; albo
b) petoe biaakoNef HIV albo Nee zawieeające C końcowy„ogon” hissydynowy albo Nef, którebyło poddane delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu, w połączeniu z (i) białkowym lub lipoproteinowym partnerem fuzji albo z (ii) pełnym białkiem Tat HIV albo Tat zawierającym C końcowy „ogon histydynowy albo zmutowanym Tat poddanym delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu albo zmutowanym Tat, jak określone w SEK. NR ID. 23; albo
c) petoe białkoNe^IV albo Nee zawieeające C końcowy„ogon” hissydynowy albo Net które było poddane delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu, w połączeniu z pełnym białkiem Tat HIV albo Tat zawierającym C końcowy „ogon” histydynowy albo zmutowanym Tat poddanym delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu albo zmutowanym Tat, jak określone w SEK. NR ID. 23, oraz z białkowym lub lipoproteinowym partnerem fuzji. Korzystnie kompozycja szczepionki według wynalazku obejmuje białko fuzyjne Tat-Nef albo Nef-Tat albo ich pochodne. Również korzystnie w kompozycji szczepionki według wynalazku białko jest białkiem fuzyjnym Nef-Tat lub jego pochodną i jest karboksymetylowane.
Przez określenie „partner fuzji” rozumie się dowolną sekwencję białkową, która nie jest Tat albo Nef.
Korzystnie, partnerem fuzji jest lipoproteina D z Haemophilus influenzae typu B. W szczególności, korzystne jest wykorzystanie części białka D Haemophilus influenzae typu B z końca N, tj. około 100-130 aminokwasów. W rozwiązaniach według wynalazku możliwe jest również wykorzystanie jednej trzeciej z końca N, tj. około pierwsze 100-300 aminokwasów. Pochodna taka jest niniejszym określana jako Lipo D 1/3. W korzystnej postaci wykonania, kompozycja szczepionki według wynalazku zawiera jako składnik czynny białko Tat poddane fuzji z białkiem Nef HIV oraz partnerem fuzji.
Partner fuzji jest przyłączony zwykle do końca N białka Nef albo Tat.
Pochodne stosowane w kompozycji szczepionki według wynalazku obejmują cząsteczki z C-końcowym „ogonem” histydynowym, który może obejmować od 5 do 10 reszt histydynowych. Ogólnie, histydynowy ogon obejmuje reszty oznaczone tu jako His(n). Obecność ogona histydynowego (albo „His”) ułatwia oczyszczanie. Zatem następujące białka mogą być stosowane w kompozycji szczepionki według wynalazku:
Lipo D 1/3 - Nef - His (6)
Lipo D 1/3 - Nef-Tat - His (6)
Prot D 1/3 - Nef - His (6)
Prot D 1/3 - Nef-Tat - His (6)
Nef-Tat - His (6)
Figura 1 przedstawia sekwencję aminokwasową (Id. Sekw. nr 7) i sekwencję DNA (Id. Sekw. nr 6) składnika fuzji takich konstruktów.
PL 195 243 B1
Wytwarzanie szczepionek opisano ogólnie w New Trends and Developments in Vaccines, Voller i in., (wyd.) University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978. Zamykanie w liposomach opisano w Fullerton, patent USA 4235877.
Białka w kompozycji szczepionki według wynalazku korzystnie wzmacnia się adiuwantem. Odpowiednie adiuwanty obejmują sole glinu, takie jak żel wodorotlenku glinu (alum) albo fosforan glinu, ale mogą to być również sole wapnia, żelaza albo cynku, albo nierozpuszczalne zawiesiny acylowanej tyrozyny albo acylowanych cukrów, kationowe albo anionowo derywatyzowane polisacharydy albo polifosfazeny.
Korzystnie w kompozycji według wynalazku adiuwantem jest adiuwant indukujący wybiórczo reakcję TH1. Korzystne adiuwanty obejmują, przykładowo, monofosforylolipid A albo jego pochodne, na przykład 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL). W kompozycji szczepionki według wynalazku można również stosować monofosforylolipid A lub jego pochodne wraz z solami glinu.
Tak więc, w korzystnej postaci wykonania dostarczono kompozycję szczepionki obejmującą białko jak opisano powyżej wzmocnione monofosforylolipidem A albo jego pochodną, zwłaszcza 3D-MPL. Korzystnie, kompozycja szczepionki ponadto obejmuje saponinę, na przykład QS21. Również korzystnie, kompozycja szczepionki według wynalazku zawiera dodatkowo emulsję oleju w wodzie i tokoferol.
Wzmacniany układ może obejmować kombinację monofosforylolipidu A i pochodną saponiny, szczególnie kombinację QS21 i 3D-MPL, jak ujawniona w WO 94/00153, albo mniej reaktogenną kompozycję, w której QS21 zablokowano cholesterolem, jak ujawniono w WO 96/33739. Szczególnie silna kompozycja adiuwanta obejmująca QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji oleju w wodzie opisana jest w WO 95/17210. Korzystnie w kompozycji szczepionki według wynalazku adiuwant obejmuje 3D-MPL, QS21 oraz emulsję olej w wodzie tokoferolu, skwalen i Tween 80.
Korzystnie kompozycja szczepionki według wynalazku obejmuje ponadto gp160 albo jego pochodną gp 120. Są to glikoproteiny otoczkowe HIV.
Wynalazek obejmuje również sposób wytwarzania kompozycji szczepionki według wynalazku, w którym miesza się białka wskazane powyżej z farmaceutycznie dopuszczalnym rozcieńczalnikiem. Korzystnie sposób wytwarzania szczepionki według wynalazku obejmuje ponadto dodanie gp160 HIV lub jego pochodnej gp120. Również korzystnie sposób wynalazku obejmuje dodanie adiuwanta, a w szczególności adiuwanta wywołującego reakcję TH1.
W zakres wynalazku wchodzi również białko obejmujące pełne białko Tat HIV albo Tat zawierające C końcowy „ogon” histydynowy albo zmutowane Tat, które było poddane delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu, albo zmutowane Tat, jak określone w SEK. NR ID. 23, w połączeniu z pełnym białkiem Nef HIV albo Nef zawierającym C końcowy „ogon” histydynowy albo Nef poddanym delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu, w orientacji Nef-Tat lub Tat-Nef.
Białka według wynalazku mogą być wyrażane z ogonem histydynowym obejmującym od 5 do 10, zaś korzystnie 6 reszt histydynowych, który ułatwia oczyszczanie. Opisano już osobną ekspresję Nef (Macreadie i in., 1993, Yeast 9 (6) 565-573) i Tat (Braddock i in., 1989, Cell 58 (2) 269-79) w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae). Jedynie Nef jest białkiem mirystylowany. Niniejszym opisano po raz pierwszy ekspresję Nef i Tat osobno w układzie ekspresyjnym Pichia (konstrukty Nef-His i Tat-His) oraz pomyślną ekspresję konstruktów fuzyjnych Nef-Tat-His. Sekwencje DNA i aminokwasowe reprezentatywnych białek fuzyjnych Nef-His (Id. Sekw. nr 8 i 9), Tat-His (Id. Sekw. nr 10 i 11) oraz Nef-Tat-His (Id. Sekw. nr 12 i 13) przedstawiono na fig. 2.
Określenie „zmutowane” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza cząsteczkę poddaną delecji, addycji albo substytucji jednego albo więcej aminokwasów, przy użyciu dobrze znanych technik kierowanej mutagenezy albo innej konwencjonalnej metody.
Zmutowane Tat przedstawiono na fig. 2 (Id. Sekw. nr 22 i 23), podobnie jak zmutowane Nef-Tat-His (Id. Sekw. nr 24 i 25).
Wynalazek dotyczy również kwasu nukleinowego kodującego białko według wynalazku. Takie sekwencje można wprowadzać do odpowiedniego wektora ekspresyjnego i wyrażać w odpowiednim gospodarzu. Tak więc w zakres wynalazku wchodzi również gospodarz transformowany kwasem nukleinowym według wynalazku. Korzystnie, gospodarzem jest E. coli albo Pichia pastoris.
Sekwencje DNA kodujące białko według wynalazku można syntetyzować stosując standardowe techniki syntezy DNA, takie jak enzymatyczną ligację opisaną przez Roberts i in., Biochemistry, 1985,
PL 195 243 B1
24:5090-5098, syntezę chemiczną, polimeryzację enzymatyczną in vitro albo technologię PCR wykorzystującą, przykładowo termostabilną polimerazę, albo kombinację tych technik.
Enzymatyczną polimeryzację DNA można przeprowadzić in vitro stosując polimerazę DNA, taką jak polimeraza I DNA (fragment Klenowa) w odpowiednim buforze zawierającym trifosforany nukleozydów dATP, dCTP, dGTP i dTTP w temperaturze 10-37°C, zasadniczo w objętości 50 ml albo mniejszej. Ligację enzymatyczną fragmentów DNA można przeprowadzić stosując ligazę DNA, taką jak ligaza DNA T4 w odpowiednim buforze takim jak 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,01 M MgCh, 0,01 M ditiotreitol, 1 mM spermidyna, 1 mM ATP i 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, w temperaturze 4°C do temperatury otoczenia, zasadniczo w objętości 50 ml albo mniejszej. Syntezę chemiczną polimeru albo fragmentów DNA można przeprowadzić konwencjonalnymi reakcjami z fosfotriestrami, fosfitami albo amidynofosforanami, stosując techniki w fazie stałej, takie jak opisane w „Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual” (red. Gassen i Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982) albo w innych publikacjach naukowych, przykładowo M. J. Gait, Matthes, M. Singh, B. S. Sproat, i R. C. Titmas, Nucl. Acids Res. 1982, 10, 6243; B. S. Sproat i W. Bannwarth, Tetrahedron Lett. 1983, 24, 5771; M. D. Matteuci i M. H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 1980, 21, 719; M. D. Matteuci i M. H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 1983, 103, 3185; N. D. Sinha i J. Biernat, J. McMannus i H. Koester, Nucl. Acids Res., 1984, 12, 4539 i H. W. D. Matthes i in. , EMBO J., 1984, 3, 801.
W zakres wynalazku wchodzi również sposób wytwarzania białka według wynalazku obejmujący etap dostarczania gospodarza według wynalazku, wyrażania białka oraz pozyskiwania białka.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania w Pichia pastoris białka znajdującego zastosowanie w kompozycji szczepionki według wynalazku, przy czym sposób ten obejmuje etapy transformowania Pichia pastoris DNA kodującym to białko, wyrażania białka oraz pozyskiwania białka. Korzystnie wyrażane białko jest białkiem fuzyjnym Nef-Tat lub jego pochodną, a sposób obejmuje ponadto etap karboksymetylacji wyrażanego białka.
Sposoby wytwarzania białka według wynalazku można przeprowadzać konwencjonalnymi technikami rekombinacji, takimi jak opisane w Maniatis i in., Molecular Cloning: A Laboroatory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982-1989.
Określenie „transformowanie” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza wprowadzanie obcego DNA do komórki gospodarza. Można to osiągnąć przykładowo, przez transformowanie, transfekcję albo zakażanie odpowiednim plazmidem albo wektorem wirusowym, z użyciem konwencjonalnych technik, jak opisane w Genetic Engineering; red. S. M. Kingsman i A. J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, Anglia, 1988. Określenie „transformowany” albo „transformant” dotyczą tu powstałych komórek gospodarza zawierających i wyrażających obcy interesujący gen.
Tak więc niniejszym opisane zostały również wektory ekspresyjne.
Zdolne do replikacji wektory ekspresyjne można wytworzyć przez cięcie wektora zgodnego z gospodarzem, w celu dostarczenia liniowego segmentu DNA zawierającego kompletny replikon, oraz połączenie w warunkach ligacji liniowego segmentu z jedną albo wieloma cząsteczkami DNA, które wraz z liniowym segmentem kodują pożądany produkt, taki jak polimer DNA kodujący białko według wynalazku, albo jego pochodną.
Tak więc, polimer DNA można wytworzyć albo otrzymać podczas konstruowania pożądanego wektora.
Wybór wektora będzie zdeterminowany częściowo komórką gospodarza, który może być prokariotyczny albo eukariotyczny, ale korzystnie jest E. coli albo drożdżami. Odpowiednie wektory obejmują plazmidy, bakteriofagi, kosmidy i rekombinowane wirusy.
Wytwarzanie zdolnych do replikacji wektorów ekspresyjnych można przeprowadzić konwencjonalnie, przy użyciu odpowiednich enzymów do cięcia restrykcyjnego, polimeryzacji i ligacji DNA, procedurami opisanymi w, przykładowo, Maniatis i in., wyżej.
Rekombinowaną komórkę gospodarza wytwarza się przez transformowanie komórki gospodarza zdolnym do replikacji wektorem w warunkach transformujących. Odpowiednie warunki transformujące są konwencjonalne i opisano je, przykładowo, w Maniatis i in., cytowane wyżej albo „DNA Cloning” tom II, D. M. Glover i in., IRL Press Ltd. 1985.
Wybór warunków transformujących określany jest przez komórkę gospodarza. Tak więc, bakteryjnego gospodarza takiego jak E. coli można traktować roztworem CaCh (Cohen i in., Proc. Natl.
PL 195 243 B1
Acad. Sci. USA 1973, 69, 2110) albo roztworem obejmującym mieszaninę RbCl, MnCh, octanu potasu i gliceryny, a następnie kwasem 3-[N-morfolino]-propanosulfonowym, RbCl i gliceryną. Komórki gospodarza będące komórkami ssaczymi można transformować w hodowli przez koprecypitację wektora DNA wapniem do komórek.
Hodowanie transformowanej komórki gospodarza w warunkach umożliwiających ekspresję polimeru DNA przeprowadza się konwencjonalnie, jak to opisano przykładowo w Maniatis i in., oraz „DNA Cloning” cytowanych wyżej. Tak więc, komórkom dostarcza się substancji odżywczych i hoduje się w temperaturze poniżej 50°C.
Produkt pozyskuje się sposobami konwencjonalnymi zależnie od komórki gospodarza. Tak więc, gdy komórkami gospodarza są bakterie, jak E. coli, albo drożdże, takie jak Pichia, mogą być poddane lizie fizycznej, chemicznej albo enzymatycznej, zaś produkt białkowy izoluje się z powstałego lizatu. Gdy komórką gospodarza jest komórka ssaka, produkt można zasadniczo izolować z pożywki albo z ekstraktów bezkomórkowych. Konwencjonalne techniki izolowania obejmują wybiórczą precypitację, chromatografię adsorpcyjną i chromatografię powinowactwa, w tym kolumnę powinowactwa z przeciwciałem monoklonalnym.
W przypadku białka według wynalazku zawierającego ogon histydynowy, oczyszczanie można łatwo osiągnąć przez zastosowanie kolumny powinowactwa z jonem metalu. Białko dalej oczyszcza się przez poddanie go chromatografii kationowymiennej i/lub chromatografii przez filtrację żelową. Następnie, białko sterylizuje się przez przepuszczenie przez membranę 0,22 mm.
Białka według wynalazku można formułować w postaci szczepionki, zaś reszty histydynowe odcinać enzymatycznie.
Białka opisane niniejszym dostarcza się w postaci czystej w przynajmniej 80%, a korzystniej 90% co zobrazowano przez SDS PAGE. Białka są widoczne jako pojedynczy prążek na SDS PAGE.
Wynalazek dotyczy również białka Nef-Tat-His lub Nef-zmutowany Tat-His o sekwencji aminokwasowej przedstawionej w SEK. NR ID. 13, 17, 21 lub 25 i polinukleotydu o sekwencji DNA przedstawionej w SEK. NR ID. 12, 16, 20 lub 24.
Wynalazek zostanie dalej opisany w odniesieniu do następujących Przykładów.
Przykłady
Ogólnie.
Białka Nef i Tat, dwa regulacyjne białka kodowane przez ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV-1) wytworzono w E. coli i metylotroficznych drożdżach Pichia pastoris.
Do tego konstruktu wybrano gen nef z izolatu Bru/Lai (Cell 40:9-17, 1985), ponieważ jest on najbardziej zbliżony do sekwencji zgodności Nef.
Materiałem wyjściowym dla genu nef Bru/Lai był fragment DNA wielkości 1170 bp, klonowany do ssaczego wektora ekspresyjnego pcDNA3 (pcDNA3/nef).
Gen tat pochodził z klonu BH10. Gen ten otrzymano jako klon cDNA HTLV III zwany pCV1 i opisany w Science 229:69-73, 1985.
1. Ekspresja sekwencji nef i tat HIV-1 w E. coli
Sekwencje kodujące białko Nef jak również fuzję sekwencji nef i tat umieszczono w wektorach plazmidowych: pRIT14586 i pRIT14589 (fig. 1).
Nef i fuzję Nef-Tat wytworzono jako białka fuzyjne z użyciem części białka D jako składnika fuzji. Białko D, jest białkiem wiążącym immunoglobulinę D eksponowanym na powierzchni bakterii Gram-ujemnych Haemiphilus influenzae.
pRIT14586 zawierał, pod kontrolą promotora XPL sekwencję DNA pochodzącą z bakterii Haemophilus influenzae, która kodowała pierwsze 127 aminokwasów białka D (Infect. Immun. 60:1336-1342, 1992), po której bezpośrednio następował region miejsc klonowania plus sekwencja DNA dla jednej glicyny, 6 reszt histydynowych i kodon stop (fig. 1A).
Wektor ten jest przeznaczony do wyrażania poddanego obróbce lipidowanego białka z „ogonem” His (białko fuzyjne LipoD). Białko fuzyjne jest syntetyzowane jako prekursor z 18 resztami aminokwasowymi sekwencji sygnałowej, zaś po obróbce, cysteina w pozycji 19 staje się resztą końca aminowego, która jest modyfikowana przez kowalencyjne związanie kwasu tłuszczowego (fig. 1B).
pRIT14589 jest niemal identyczny z pRIT14586, z takim wyjątkiem, że sekwencja pochodząca z protD rozpoczyna się bezpośrednio po kodonie 19 cysteiny.
Ekspresja z tego wektora daje nielipidowane białko fuzyjne z ogonem His (białko fuzyjne Prot D).
PL 195 243 B1
Wytworzono cztery konstrukty fuzyjne: LipoD-ne/-His, LipoD-nef-faf-His; ProtD-ne/-His i ProtD-nef-tat-His.
Pierwsze dwa konstrukty wytworzono stosując wektor ekspresyjny pRIT14586, zaś dwa ostatnie stosując pRIT14589.
1.1 KonntruowaaierekombinowaaeeoszzzeepECLD-N1,wytwarzająceeob iałkofuuyjneL ipoDNef-His
1.1.1 Oonstruowanie plazmidu ekspresyjnego IipoD-ne/-His pRIT14595
Gen ne/' (izolat Bru/Lai) amplifikowano przez PCR z plazmidu pcDNA3Nef przy użyciu startera 01 i 02.
Starter 01 (Id. Sekw. nr 1):
Ncol
5'ATCGTCCATGGGTGGCAAGTGGT3'
Starter 02 (Id. Sekw/. nr 2) :
Spel
5' CGGCTACTAGTGCAGTTCTTG.AA3 '
Amplifikowany region DNA ne/ rozpoczynał się na nukleotydzie 8357 i kończył się na nukleotydzie 8971 (Cell 40:9-17, 1985).
Miejsce restrykcyjne Ncol (które niesie kodon ATG dla genu nei) wprowadzono na końcu 5' fragmentu PGR, podczas gdy miejsce Spel wprowadzono na końcu 3'.
Otrzymany fragment PCR i plazmid ekspresyjny pRlT14586 poddano trawieniu restrykcyjnemu Ncol i Spel, oczyszczono na żelu agarozowym, poddano ligacji i transformowano do odpowiedniej komórki gospodarza E. coli, szczepu AR58. Szczep ten miał ukryty lizogen λ, pochodzący z N99, który jest ga|C::Tn10, D-^ch^-pg1) A-MCcro-cWA), N+ i c|857.
Powstały plazmid rekombinowany otrzymał, po weryfikacji amplifikowanego regionu nef (patrz, sekcja 1.1.2, niżej) oznaczenie pRlT14595.
1.1.2. Selekcja transformantów szczepu AR58 E. coli przy użyciu pRlT14595
Przy transformacji szczepu AR58 E. coli, rekombinowany plazmid kierował indukowane temperaturą wytwarzanie białka heterologicznego.
Indukowane temperaturą wytwarzanie białka kilku rekombinowanych transformantów lipoD-NefHis analizowano przez SDS-PAGC z barwieniem błękitem Coomassie. Wszystkie analizowane transformanty wykazywały wytwarzanie heterologicznego białka indukowanego temperaturą.
Występowanie rekombinowanego białka fuzyjnego LipoD-Nef-Tat-His oceniono na 10% białka całkowitego.
Jednego z transformantów wybrano i nadano mu numer dostępu CCLD-N1.
Rekombinowany plazmid ponownie izolowano ze szczepu CCLD-N1, zaś sekwencję regionu kodującego ne/-His potwierdzono automatycznym sekwencjonowaniem. Plazmid ten otrzymał oficjalne oznaczenie pRIT14595.
Poddane pełnej obróbce i acylowane rekombinowane białko fuzyjne Lipo D-ne/-His wytworzone w szczepie CCLD-N1 jest zbudowane z:
°0wasów tłuszczowych, °109 aminokwasów białka D (od aminokwasu 19 do aminokwasu 127), °metioniny, wytworzonej przez zastosowanie miejsca klonowania Ncol pRIT14595 (fig. 1), °205 aminokwasów białka Nef (od aminokwasu 2 do aminokwasu 206), °treoniny i seryny wytworzonej przez procedurę klonowania (klonowanie w miejscu Spel w pRLT14595), °jednej glicyny i sześciu histydyn.
PL 195 243 B1
1.2 Konstruowanie rekombinowanego szczepu ECD-N1, wytwarzającego białko fuzyjne Prot D-Nef-His
Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego pRlT14600, kodującego białko fuzyjne Prot D-Nef-His było identyczne z konstruowaniem plazmidu opisanym w Przykładzie 1.1.1 z takim wyjątkiem, że pRIT14589 zastosowano jako plazmid ekspresyjny dla amplifikowanego przez PGR fragmentu nef.
Szczep AR58 E. coli transformowano pRIT146000 i analizowano transformanty jak to opisano w Przykładzie 1.1.2. Wybrane transformanty otrzymały numer dostępu ECD-N1.
1.3. Konstruowanie rekombinowanego szczepu ECLD-NT6, W wytwarzającego białko fuzyjne Lipo D-Nef-Tat-His
1.3.1 Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego lipo D-Nef-Tat-His pRIT14596
Gen tat (izolat BH10) amplifikowano przez PCR z pochodnej plazmidu pCVl przy użyciu starterów 03 i 04. Miejsca restrykcyjne SpeI wprowadzono na obu końcach fragmentu PCR.
Starter 03 (Id. Sekw. nr 3): SpeI
5'ATCGTACTAGTGAGCCAGTAGATC3'
Starter 04 (Id. Sekw. nr 4) : SpeI
5'CGGCTACTAGTTTCCTTCGGGCCT3'
Sekwencję nukleotydową amplifikowanego genu tat pokazano jako klon pCV1 (Science 229:69-73, 1985) i pokrywał on nukleotydy 5414 do 7998.
Otrzymany fragment pCr i plazmid pRIT14595 (wyrażający białko lipoD-Nef-His) trawiono enzymem restrykcyjnym SpeI, oczyszczano na żelu agarozowym, poddawano ligacji i transformowano do kompetentnych komórek AR58. Powstały plazmid rekombinowany otrzymał, po weryfikacji amplifikowanej sekwencji tat przez automatyczne sekwencjonowanie (patrz, sekcja 1.3.2 niżej), oznaczenie pRIT14596.
1.3.2 Selekcja transformantów szczepu AR58 pRIT14596
Transformanty hodowano, indukowano termicznie i analizowano ich białka na żelach barwionych błękitem Coomassie. Poziom wytwarzania białka rekombinowanego oceniono na 1% całkowitego białka. Jeden z rekombinowanych szczepów wybrano i otrzymał on oznaczenie ECLD-NT6.
Rekombinowany plazmid lipoD-nef-tat-His ponownie izolowano ze szczepu ECLD-NT6, sekwencjonowano i otrzymał on oficjalne oznaczenie pRlT14596.
W pełni obrobione i acylowane rekombinowane białko fuzyjne Lipo D-Nef-Tat-His wytworzone w szczepie ECLD-N6 jest zbudowane z:
°Kwasów tłuszczowych, °109 aminokwasów białka D (od aminokwasu 19 do aminokwasu 127), °metioniny, wytworzonej przez zastosowanie miejsca klonowania NcoI pRIT14586, °205 aminokwasów białka Nef (od aminokwasu 2 do aminokwasu 206), °treoniny i seryny wytworzonej przez procedurę klonowania, °85 aminokwasów białka Tat (od aminokwasu 2 do aminokwasu 86), °treoniny i seryny wytworzonej przez procedurę klonowania, °jednej glicyny i sześciu histydyn.
1.4 Konstruowanie rekombinowanego szczepu ECD-NT1 wytwarzającego białko fuzyjne Prot D-Nef-Tat-His
Konstruowanie plazmidu ekspresyjnego pRIT14601, kodującego białko fuzyjne Prot D-Nef-Tat-His przebiegało identycznie z konstruowaniem plazmidu opisanym w Przykładzie 1.3.1, z takim wyjątkiem, że pRIT14600 zastosowano jako plazmid receptorowy dla fragmentu nef amplifikowanego przez PCR.
Szczep AR58 E. coli transformowano pRIT14601 i analizowano transformanty jak to opisano uprzednio. Wybrane transformanty otrzymały oznaczenie ECD-NT1.
PL 195 243 B1
2. Ekspresja sekwencji nef i tat HIV-l w Pichia pastoris
Białko Nef, Tat i fuzję Nef-Tat wyrażono w metylotroficznych drożdżach Pichia pastoris pod kontrolą indukowalnego promotora oksydazy alkoholowej (AOX1).
W celu wyrażenia tych genów H1V-1 zastosowano zmodyfikowaną wersję wektora PHIL-D2 (Invitrogen). Wektor ten modyfikowano w taki sposób, że ekspresja białka heterologicznego rozpoczynała się bezpośrednio po natywnym kodonie ATG genu AOX1 i dawała rekombinowane białko z „ogonem” w postaci jednej glicyny i sześciu reszt histydynowych. Ten wektor PHIL-D2-MOD skonstruowano przez klonowanie łącznika oligonukleotydowego pomiędzy sąsiadującymi miejscami AsuII i EcoRI wektora PHIL-D2 (patrz, fig. 3). Oprócz ogona His, łącznik niósł miejsca restrykcyjne NcoI, Spel i XbaI, pomiędzy które wprowadzono nef, tat i fuzję nef-tat.
2.1 Konstruowanie wektorów integrujących pRIT14597 (kodujący białko Nef-His), pRIT14598 (kodujący białko Tat-His) i pRIT14599 (kodujący fuzję Nef-Tat-His).
Gen nef amplifikowano przez PCR z plazmidu pcDNA3/Nef starterami 01 i 02 (patrz, sekcja
1.1.1, konstruowanie pRIT14595). Otrzymany fragment PCR i wektor PHIL-D2-MOD trawiono restrykcyjnie Ncol i Spel, oczyszczano na żelu agarozowym i poddawano ligacji z wytworzeniem plazmidu integracyjnego pRIT14597 (patrz, fig. 3).
Gen tat amplifikowano przez PCR z pochodnej plazmidu pCV1 starterami 05 i 04 (patrz, sekcja
1.3.1, konstruowanie pRIT14596):
Starter 05 (Id. Sekw. nr 5):
Ncol
5' ATCGTCCATGGAGCCAGTAGATC3'
Miejsce restrykcyjne Ncol wprowadzono na końcu 5' fragmentu PCR, podczas gdy miejsce Spel wprowadzono na końcu 3' startera 04. Otrzymany fragment PCR i wektor PHIL-D2-Mod trawiono restrykcyjnie Ncol i Spel, oczyszczano na żelu agarozowym i poddano ligacji z wytworzeniem plazmidów integracyjnych pRIT14598.
W celu skonstruowania pRIT14599, fragment DNA wielkości 910 bp odpowiadający sekwencji kodującej nef-tat-His poddano ligacji pomiędzy EcoRI stępione (polimerazą T4) z miejsce NcoI wektora PHIL-D2-MOD. Fragment kodujący nef-tat-His otrzymano przez trawienie pRIT14596 na tępo XbaI (polimerazą T4) i NcoI.
2.2 Transformowanie szczepu GS115(his4) Pichia pastoris
W celu otrzymania szczepów Pichia pastoris wyrażających Nef-His, Tat-His i fuzję Nef-Tat-His, szczep GS115 transformowano liniowymi fragmentami NotI niosącymi odpowiednią kasetę ekspresji plus gen HIS4, w celu komplementacji his4 w genomie gospodarza. Transformacja GS115 liniowymi fragmentami NotI ułatwia rekombinację w locus AOXI.
Klony o zintegrowanych wielokrotnych kopiach wyselekcjonowano przez określenie ilościową analizą metodą dot-blot oraz rodzaj integracji, insercję (fenotyp Mut+) albo przeniesienie (fenotyp Muf).
Dla każdej transformacji, wyselekcjonowano jednego transformanta wykazującego wysoki poziom wytwarzania białka rekombinowanego:
Szczep Y1738 (fenotyp Mut+) wytwarzający rekombinowane białko Nef-His, mirystylowane białko o 215 aminokwasach zbudowane z:
°kwasu mirystylowego, “metioniny, wytworzonej przez zastosowanie miejsca klonowania NcoI PHIL-D2-MOD, °205 aminokwasów białka Nef (od aminokwasu 2 do aminokwasu 206), “treoniny i seryny wytworzonej przez procedurę klonowania (klonowanie w miejscu Spel wektora PHIL-D2-MOD, “jednej glicyny i sześciu histydyn.
Szczep Y1739 (fenotyp Mut+) wytwarzający rekombinowane białko Tat-His, białko o 95 aminokwasach zbudowane z:
PL 195 243 B1 “metioniny, wytworzonej przez zastosowanie miejsca klonowania Ncol, °85 aminokwasów białka Tat (od aminokwasu 2 do aminokwasu 86), “treoniny i seryny wytworzonej przez procedurę klonowania, “jednej glicyny i sześciu histydyn.
Szczep Y1737 (fenotyp Mut+) wytwarzający rekombinowane białko Nef-Tat-His, mirystylowane białko o 302 aminokwasach zbudowane z:
“kwasu mirystylowego, “metioniny, wytworzonej przez zastosowanie miejsca klonowania Ncol, “205 aminokwasów białka Nef (od aminokwasu 2 do aminokwasu 206), “treoniny i seryny wytworzonej przez procedurę klonowania, “85 aminokwasów białka Tat (od aminokwasu 2 do aminokwasu 86), “treoniny i seryny wytworzonej przez procedurę klonowania, “jednej glicyny i sześciu histydyn.
3. Ekspresja mutanta Tat HIV-1 w Pichia pastoris
Podobnie jak zmutowane białko fuzyjne Nef-Tat, wyrażono zmutowane białko rekombinowane Tat. Zmutowane białko Tat musi być biologicznie nieczynne, przy zachowaniu immunogennych epitopów.
W tym celu do konstruktów wybrano podwójnie zmutowany gen tat, skonstruowany przez D. Clements (Tulane University).
Gen tat (pochodzący z klonu BH10) niesie mutacje w regionie aktywnym (Lys41®ala) i motywie RGD (Arg78®Lys i Asp80®Glu) (Virology 235:48-64, 1997).
Zmutowany gen tat otrzymano jako fragment cDNA klonowany pomiędzy miejsca EcoRI i Hindlll w plazmidzie ekspresyjnym CMV (pCMVLys41/KGE).
3.1 Konstruowanie wektorów integracyjnych pRIT14912 (kodujący zmutowane Tat-His) i pRIT-kodujący fuzję Nef-zmutowane Tat-His)
Zmutowany gen tat amplifikowano przez PCR z plazmidu pCMVLys41/KGE przy użyciu starterów 05 i 04 (patrz, sekcja 2.1, konstruowanie pRIT14598).
Miejsce restrykcyjne Ncol wprowadzono na końcu 5' fragmentu PCR, podczas gdy miejsce Spel wprowadzono na końcu 3' przy użyciu startera 04. Otrzymany fragment PCR i wektor PHIL-D2-Mod trawiono restrykcyjnie NcoI i Spel, oczyszczano na żelu agarozowym i poddano ligacji z wytworzeniem plazmidów integracyjnych pRIT14912.
W celu skonstruowania pRIT14913, zmutowany gen tat amplifikowano przez PCR z plazmidu pCMVLys41/KGE, przy użyciu starterów 03 i 04 (patrz, sekcja 1.3.1, konstruowanie pRIT14596).
Otrzymany fragment PCR i plazmid pRIT14597 (wyrażający białko Nef-His) trawiono restrykcyjnie Spel, oczyszczano na żelu agarozowym i poddano ligacji w celu wytworzenia plazmidu integracyjnego pRIT14913.
3.2 Transformowanie szczepu GS115 Pichia pastoris
Szczepy Pichia pastoris wyrażające białko zmutowane Tat-His i fuzję Nef-zmutowane Tat-His otrzymano przez zastosowanie strategii integracji i selekcji rekombinowanych szczepów opisane w sekcji 2.2.
Wyselekcjonowano dwa rekombinowane szczepy wytwarzające białko zmutowane Tat-His o 95 ammokwasacki: γ1775 (fenotyp IMuf) i γ1776 (fenotyp IMuf).
Wyselekcjonowano jeden rekombinowany szczep wyrażający fuzję Nef-zmutowane Tat-His o 302 aminokwasach: Y1774 (fenotyp Mut+).
4. Oczyszczanie białka fuzyjnego Nef-Tat-His (Pichia pastoris)
Opracowano schemat oczyszczania ze 146 g rekombinowanych komórek Pichia pastoris (waga na mokro) albo 2 L homogenatu z Dyno-mill OD55. Etapy chromatografii przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Pomiędzy etapami frakcje zawierające Nef-Tat przechowywano przez noc w chłodni (+ 4“C); na czas dłuższy próbki zamrażano w -20“C.
PL 195 243 Β1
146 g komórek Pichia pastoris
Homogeni zac j a
Zniszczenie komórek w Dyno-mill (4-krotnie)
Wirowanie
Osad Dyno-miii
Bufor: 21 50 mM P04, pH 7,0 OD końcowa = 50
Rotor JA10/9500 rpm/30 minut/temperatura poko jowa
Płukanie i 1 godz., 4°C)
Wirowanie
Osad
Rozpuszczanie (przez noc, 4°C)
Redukcj a (4 godz,, temperatura pokojowa, w ciemności)
Bufor: 21 5 0 mM POz, pil 7,5 150 mM NaCl, 0,5% erapigene Rotor JA10/9500 rpm/30 minut/temperatura pokojowa
Bufor: 660 ml 10 raM PO,, pH 7,5 150 mM NaCl, 4,0 M GuECl
0,2 M kwas 2-merkaptoetano sulfonowy, sól sodowa (w postaci proszku)/pK do 7,5 (0,5 m NaOH)
Karboksymetylacj a <0,5 godz. w temperaturze pokojowej, w ciemności)
Chromatografia powinowactwa z unieruchomionym jonem metalu
Agaroza Ni2+-NTA (Qiagen, 30 ml żywicy)
0,25 M jodoacetamid iw postaci proszku)/pH do 7,5 (0,5 M NaOH)
Bufor do równoważenia: 10 mM PO4, pH 7,5, 150 mM NaCl, 4,0 M GuHCl Bufor do płukania:
i) bufor do równoważenia;
10 mM P04, pK 7,5, 150 mM NaCl,
M mocznik;
3) 10 mM P04, pH 7,5, 150 mM NaCl,
M mocznik, 25 mM imidazoi Bufor do elucji: 10 mM P04, pH 7,5, 150 mM NaCl, 6 M mocznik, 0,5 M
Rozcieńczanie
I
Zatężanie
Chromatografia przez filtrację żelową na żywicy Superdex300 XK 16/60 (Pharmacia, 120 ml)
V imidazoi
Do siły jonowej 18 mS/cm2
Bufor do rozcieńczania; 10 mM P04, pH 7,5, GM mocznik
Bufor do płukania:
1) bufor dc równoważenia;
2) 10 mM PO·, pH 7,5, 250 mM NaCl, 6 M mocznik;
Bufor do elucji: 10 mM boran, pH 9,0, 2 M NaCl, 6 M mocznik do 5 mg/ml membrana Omega 10 kDa (Filtron) Bufor do elucji: 10 mM PO4, pH 7,5, 150 mM NaCl, 6 M mocznik ml próbka/wstrzykn.ięcie > 5 wstrzyknięć
Dializa (przez noc, 4°C)
Sterylizacja przez filtrowanie
Bufor: 10 mM PO4, pH 6,S, 150 mM NaCl, 0,5 M arginina4
Millex GV 0,22 pm stosunek: 0,5 M arginina do stężenia białka 1600 pg/ml.
PL 195 243 B1
Czystość
Poziom czystości oszacowano przez SDS-PAGE, jak pokazano na fig. 4, przez barwienie srebrem Daiichi Silver Staining, oraz na fig. 5 przez barwienie błękitem Coomassie G250.
Po etapie Superdex200: >95%
Po dializie i sterylizacji przez filtrację: >95%
Uzysk mg białka Nef-Tat-His otrzymano przez oczyszczenie ze 146 g rekombinowanych komórek Pichia pastoris (= 21 homogenatu z Dyno-mill OD 55).
5. Wytwarzanie szczepionki
Szczepionka wytworzona według wynalazku obejmuje produkt ekspresji rekombinowanego DNA, kodującego antygen według Przykładu 1 albo 2 oraz, jako adiuwant, formulację obejmującą mieszaninę 3 de-O-acylowanego monofosforylolipidu A, 3D-MPL i QS21 w emulsji oleju w wodzie.
3D-MPL: jest chemicznie detoksyfikowaną postacią lipopolisacharydu (LPS) Gram-ujemnej bakterii Salmonella minnesota.
Doświadczenia przeprowadzone przez Smith Kline Beecham Biologicals wykazały, że 3D-MPL połączony z różnymi nośnikami silnie zwiększa reakcje odpornościowe humoralne i komórkowe typu TH1.
QS21: jest saponiną oczyszczoną z ekstraktu kory drzewa Quillaja Saponaria Molina, która wykazuje silną aktywność adiuwantową: aktywuje swoistą dla antygenu limfoproliferację oraz CTL przeciwko niektórym antygenom.
Doświadczenia przeprowadzone przez Smith Kline Beecham Biologicals wykazały synergistyczny efekt kombinacji 3D-MPL i QS21 w indukowaniu reakcji odpornościowej humoralnej i komórkowej typu TH1.
Emulsja olej/woda obejmuje 2 oleje (tokoferol i skwalen) oraz PBS zawierający Tween 80 jako emulgator. Emulsja obejmuje 5% skwalenu, 5% tokoferolu, 0,4% Tween80 i ma średnią wielkość cząstki równą 180 nm (patrz, WO 95/17210).
Doświadczenia przeprowadzone przez Smith Kline Beecham Biologicals potwierdziły, że dodanie tej emulsji O/W do 3D-MPL/QS21 dalej zwiększa ich właściwości immunostymulujące.
Wytwarzanie emulsji olej/woda (2-krotnie stężonej)
Tween 80 rozpuszczono w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) otrzymując roztwór 2% w PBS. W celu dostarczenia 100 ml dwukrotnego koncentratu, emulsję 5 g DL alfa tokoferolu i 5 ml skwalenu wytrząsano w celu dokładnego zmieszania. Dodano 90 ml roztworu PBS/Tween i wymieszano dokładnie. Powstałą emulsję przepuszczono przez strzykawkę, a na koniec mikrofluidyzowano przy pomocy urządzenia Microfluidics M110S. Powstałe kropelki oleju miały wielkość około 180 nm.
Wytwarzane formulacji oleju w wodzie
Antygen wytworzony według Przykładu 1 albo 2 (5 mg) rozcieńczono 10-krotnie zatężonym PBS pH 6,8 i H2O przed dodaniem SB62, 3D-MPL (5 mg , QS21 (5 mg) i 50 mg/ml tiomersalu, jako konserwanta, w odstępach 5 minutowych. Objętość emulsji jest równa 50% objętości całkowitej (50 ml dla dawki 100 ml).
Wszystkie inkubacje przeprowadzono w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem.
6. Immunogenność Tat i Nef-Tat u gryzoni
Zbadano charakterystykę reakcji odpornościowej wywołanej po immunizacji Tat i Nef-Tat. W celu uzyskania informacji dotyczącej profilu izotypu i odporności komórkowej (CMI) przeprowadzono dwa doświadczenia nad immunizacją myszy. W pierwszym doświadczeniu myszy immunizowano dwukrotnie w odstępie dwutygodniowym w poduszeczkę łapy przy użyciu Tat albo Nef-Tat w postaci, odpowiednio, utlenionej albo zredukowanej. Antygeny formułowano w emulsji oleju w wodzie, zawierającej skwalen, Tween 80™ (monooleinian polioksyetylenosorbitolu), QS21,3D-MPL i a-tokoferol, zaś grupa kontrolna otrzymała sam adiuwant. Dwa tygodnie po ostatniej immunizacji pobrano surowice i poddano ELISA swoistemu wobec Tat (z użyciem zredukowanej postaci Tat do pokrycia studzienek) w celu określenia miana przeciwciał i izotypu (fig. 6a). Miana przeciwciał były najwyższe u myszy otrzymujących utlenione Tat. Ogólnie, cząsteczki utlenione wywoływały wyższe miana przeciwciał niż postaci zredukowane, zaś samo Tat wywoływało wyższe miano przeciwciał niż NefTat. Tę ostatnią obserwację potwierdzono w drugim doświadczeniu. Co ciekawe, profil izotypowy przeciwciał swoistych wobec Tat różnił się w zależności od użytego do immunizacji antygenu. Samo Tat wywoływało zrównoważo12
PL 195 243 B1 ny profil LgG1 i LgG2a, podczas gdy NefTat wywoływał znacznie silniejszą przewagę w stronę TH2 (fig. 6b). Ponownie, potwierdzono to w drugim doświadczeniu.
W drugim doświadczeniu na myszach, zwierzęta otrzymywały wyłącznie zredukowaną postać cząsteczek albo sam adiuwant. Oprócz analizy serologicznej (patrz, wyżej), badano reakcje limfoproliferacyjne komórek z węzłów chłonnych. Po ponownej stymulacji tych komórek in vitro przy użyciu Tat albo NefTat, mierzono włączanie 3H-tymidyny po 4-dniowej hodowli. Prezentacja wyników jako wskaźników pobudzenia wskazuje, że u obu grup otrzymujących antygen wywołano silną reakcję odpornościową (patrz, fig. 7).
Podsumowując, badania na myszach wskazują, że Tat, jak również Nef-Tat są silnie immunogennymi kandydatami na antygeny szczepionki. Reakcja odpornościowa skierowana przeciwko dwóm cząsteczkom charakteryzuje się silną reakcją przeciwciał z zawartością przynajmniej 50% IgGl. Ponadto, obserwowano silne reakcje CMI (mierzone limfoproliferacją).
7. Właściwości funkcjonalne białek Tat i Nef-Tat
Cząsteczki Tat i NefTat w postaci utlenionej i zredukowanej były badane pod kątem ich zdolności do wiązania linii ludzkich limfocytów T. Ponadto, badano wpływ na wzrost tych linii. Płytki ELISA pokryte przez noc różnymi stężeniami białek Tat albo NefTat, niespokrewnionym białkiem gD wirusa opryszczki typu II albo samym buforem. Po usunięciu roztworu do pokrywania do studzienek dodawano komórki HUT-78. Po dwóch godzinach inkubacji studzienki płukano i oceniano wiązanie komórek z dnem studzienki mikroskopowo. W celu ilościowej oceny komórki barwiono błękitem toluidyny, poddano lizie SDS i oznaczano stężenie błękitu toluidyny w nadsączu przy użyciu czytnika do płytek ELISA. Wyniki wskazują, że wszystkie cztery białka Tat i NefTat w postaci utlenionej i zredukowanej wiążą komórki z płytką ELISA (fig. 8). Niespokrewnione białko (dane niepokazane) oraz bufor nie wiązały komórek. Wskazuje to, że rekombinacyjnie wyrażane białka Tat wiążą swoiście linie ludzkich limfocytów T.
W drugim doświadczeniu, komórki HUT-78 pozostawiono w kontakcie z białkami przez 16 godzin. Na zakończenie okresu inkubacji, komórki znakowano 3H-tymidyną i oznaczano wielkość wzrostu komórek. Wszystkie cztery białka w teście hamowały wzrost komórek, co oceniono spadkiem inkorporowania radioaktywności (fig. 9). Bufor kontrolny nie powodował takiego efektu. Wyniki te wskazują, że rekombinowane białka zawierające Tat są zdolne do hamowania wzrostu linii ludzkich limfocytów T.
Podsumowując, funkcjonalna charakterystyka białek Tat i NefTat wskazała, że białka te są zdolne do wiązania linii ludzkich limfocytów T. Ponadto, białka są zdolne do hamowania wzrostu takich linii.
Claims (26)
1. Kompozycja szczepionki obejmująca czynnik aktywny w domieszce z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera białko obejmujące:
a) pełne białko Tat HIV albo Tat zawierające C końcowy „ogon” histydynowy albo zmutowane Tat, które było poddane delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu, albo zmutowane Tat, jak określone w SEK. NR ID. 23, w połączeniu z (i) białkowym lub lipoproteinowym partnerem fuzji albo z (ii) pełnym białkiem Nef HIV albo Nef zawierającym C końcowy „ogon” histydynowy albo Nef poddanym delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu; albo
b) peene białkoNee HIV alboNee zawierające C końcowy„ogon” hissydynowy albo Nee, ftórebyło poddane delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu, w połączeniu z (i) białkowym lub lipoproteinowym partnerem fuzji albo z (ii) pełnym białkiem Tat HIV albo Tat zawierającym C końcowy „ogon” histydynowy albo zmutowanym Tat poddanym delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu albo zmutowanym Tat, jak określone w SEK. NR ID. 23; albo
c) peene białkoNee HIV albo Nee zawierające C końcowy „ogon” hissydynowy albo Nee, które było poddane delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu, w połączeniu z pełnym białkiem Tat HIV albo Tat zawierającym C końcowy „ogon histydynowy albo zmutowanym Tat poddanym delecji, addycji lub substytucji jednego aminokwasu albo zmutowanym Tat, jak określone w SEK NR ID. 23, oraz z białkowym lub lipoproteinowym partnerem fuzji.
2. Kompozycja według zas^z. 1, znamienna tym, że obeemuje białko fuzyyne TattNee albo „ ego pochodną.
PL 195 243 B1
3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, be- obejmuje białko fuzyjne Nef-Tat albojego ozchzdeą.
4. Kooppozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że- lipoprzbeiną be-t białko D Haemophiluz ie-lzdeasd typu B siOo jego pochodes.
5. Kompooycja wedługzastrz. 4, 2^i^^r^i^i^r^a tym, że partne- fuzji obejnuujeod 100 do 130 aminokwasów Oońcs e OlskOs D Hsdmoohiizs ie-izdeasd typu B.
6. Kompooycja według zastrz. 1, znamienaa tym, be białko Tał jedt pooddne 1ugji z białkiem Nd- HIV ozsa osttedtdm -ζζϊϊ.
7. Komooaccjs wddkzg astrza. 1, naaminaaa tym, ed OiskOo oosisds „ogoe” hittydceowc.
8. Komooaccjs wddkzg astrza. 1, naaminaaa tym, ed OiskOo e-tr OiskOidm -za^ecm N---Tsr izO e-go oochodeą i jdsr OstOoOscmdtyiowsed.
9. Komooaccjs wddkzg astrza. 1, naaminaaa tym, ed ooesdro oOdjmzjd sdizwser.
10. Kompooycje według zantrz. 9, znamienna tym, że aSiuwentem jest asiuwant w^c/wojującc tdsOcję TH1.
11. Kompooacjewedług zzstrz. 9 albO 10, z namienaa tym, że aSiuwen”oOojmujempoafonfuιZj ioiioid A siOo e-go oochodeą, rsOą esO 3 dd-O-scciowsec moeo-os-otcioiioid A.
12. Komooaccjs wddkzg astrza. 9, naaminaaa tym, ed ooesdro oOdjmzjd sdizwser ssooeieowc.
13. Kompooacjawedługzantrz. b, z namienaa tym, ze bObaSto oOejmuje zmulsje zle-w wwOdie ozsa roOo--zoi.
14. według zas^z. 9, znamienaa tym, że adiuwet obojmι.ιje 3D-MPL, QS21 oozs dmzisję bide w wodaid rzOo-droiz, tOwside i awdde 80.
15. Kompozyge ow—ług bystrz. 1 albO b, znamienaa tym, be pozaSto aOejmuje agno HIV l uZ e-go oochodeą go120.
16. Białko aOejmujncc po-ne białko TaS HIV albO TaS zawie-zjecc C kobchow jOOgz” żistyCdnawc siOo amzrowsed Tsr, Orózd Ocko ooddsed d-i-cei, sddccji izO szOsrcrzcji e-de-go smieoOwstz, siOo amzrowsed Tsr, esO oOtdśioed w SEK. NR ID. 23, w ookącadeiz a odkecm OiskOidm Nd- HIV siOo N-aswidtsjąccm C Oońcowc „ogoe” hittydceowc siOo Nd- ooddsecm d-i-cei, sddccji izO tzOtrcrzcji e-dedgo smieoOwstz, w otiderscji Nd--Tsr izO Tsr-Nd-.
17. Kwst ezOidieowc Oodzeącc OiskOo oOtdśioed w astrzz. 16.
18. Gotoodszz rzset-ozmowsec Owstdm ezOidieowcm oOzdśioecm w astrza. 17.
19. Gotoodszz wddkzg astrza. 18, naaminaay tym, ed edtr eim E. coli siOo Pichis ostrozit.
20. Ssootó wejwetzznia białkO oOrzdloη”-ο w zas^z. 11, anamienan tym, ae oOejmuje o-oso dotrszcaseis gotoodszas oOzdśioedgo w astrza. 18 izO 19, wczseseis OiskOs ozsa ooactOiwseis OiskOs.
21. Ssootó wejwetzania białkO w Pichia pontojis, anamienan tym, be aOejmuje z-oso teznaf-Ot mowseis Pichis ostrozit DNA Oodzjąccm OiskOo, wczseseis OiskOs ozsa ooactOiwseis OiskOs, ozac cacm OiskOo ro aswidzs
s) po-u” bi^łk^o Tał HIV albO Tał zawinfzjącc C ko ζομο^ jObon” histoddnawe albO zmuZowane Tsr, Orózd Ocko ooddsed d-i-cei, sddccji izO tzOtrcrzcji eddedgo smieoOwstz, siOo amzrowsed Tsr, esO oOzdśioed w SEK. NR ID. 23, w ookącadeiz a (i) OiskOowcm izO iiooozordieowcm osrtedzdm -zaei siOo a (ii) o-kecm OiskOidm Nd- HIV siOo Nd- aswidzsjąccm C Oońcowc „ogoe” hittydceowc siOo Nd- ooddsecm d-i-cei, sddccei izO tzOtrcrzcei eddedgo smieoOwstz; siOo
O) po-ne białkoHIV NefalboNefzawiefztnccC koOccwe,ι oogo”histyCdnawealboNef, OrórzbOj ko ooddsed d-i-cei, sddccei izO tzOtryezcji e-de-go smieoOwstz, w ookącadeiz a (i) OiskOowcm izO iiooozordieowcm osrtedzdm -zaei siOo a (ii) o-kecm OiskOidm Tsr HIV siOo Tsr aswidzseąccm C Oońcowc „ogoe” hittydceowc siOo amzrowsecm Tsr ooddsecm ddidcei, sddccei izO tzOtrcrzcei e-de-go smieoOwstz siOo amzrowsecm Tsr, esO oOz-śioe- w SEK. NR ID. 23; siOo
c) po-ne białko 1*^- HIV alboNefzawiefztnccC koOccwe,ιoogo”histyCdnawealboNef, którebic ko ooddse- d-i-cei, sddccei izO tzOtrcrzcei e-de-go smieoOwstz, w ookąca-eiz a o-kecm OiskOi-m Tsr HIV siOo Tsr aswi-zseąccm C Oońcowc „ogoe hittydceowc siOo amzrowsecm Tsr ooddsecm d-i-cei, sddccei izO tzOtrcrzcei e-de-go smieoOwstz siOo amzrowsecm Tsr, esO oOz-śioe- w SEK. NR ID. 23, ozsa a OiskOowcm izO iiooozor-ieowcm oszte-z-m -zaei.
22. SsooSó we-ług οζ^-Ζ^ ztym, że białko j e-t białkiem fugajnam I uZ> jego oochodeą, s tootóO oO-emze- ooesdro -rso OszOoOtcm-rciscei wczsese-go OiskOs.
23. SsooSó wejwetzania οζ^ο^Μ^ε^-^κ:)η”^ό annmienan tym, ae aOejmuje zmie-tanie białko obre-śoe-go w astrzz. 20, 21 izO 22 a -szmsc-zrccaei- dooztacasiecm zoaci-ńcasieiOi-m.
PL 195 243 B1
24. Sposóbwedług zastrz. 23, znamienny tym, że ponadto obejmuje dodanie gp160 HIV lub jego onchnOadj po12O.
25. Sposób według zastrz. 2(3, znamienny tym, że ponadto obejmuje dodanie adiuwanta, w óacaegblaości sOigwsars wywołującego zeskcję TH1.
20. Białkk Nef-TTt-His I ub białkk Nef-zmutowesa 2TS-His o sóeweeaji aminadwenowej pizaeórswioaej w PEK. NR ID. 13, 17, 21 lub 25.
27. Poliabkleotya o óekweacji DNA oraeOórswioaej w PEK. NR ID. 12, 10, 20 lub 24.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9720585.0A GB9720585D0 (en) | 1997-09-26 | 1997-09-26 | Vaccine |
| PCT/EP1998/006040 WO1999016884A1 (en) | 1997-09-26 | 1998-09-17 | Fusion proteins comprising hiv-1 tat and/or nef proteins |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL339432A1 PL339432A1 (en) | 2000-12-18 |
| PL195243B1 true PL195243B1 (pl) | 2007-08-31 |
Family
ID=10819735
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL98339432A PL195243B1 (pl) | 1997-09-26 | 1998-09-17 | Kompozycja szczepionki, białko obejmujące białka Tat HIV i Nef HIV-1 albo ich pochodne oraz kwas nukleinowy kodujący to białko i komórka transformowana tym kwasem, sposób wytwarzania tego białka orazbiałka zawierającego białko Tat HIV i/lub Nef HIValbo ich pochodne, polinukleotyd oraz białko Nef-Tat-His lub Nef-zmutowany Tat-His |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1015596B2 (pl) |
| JP (2) | JP2001518300A (pl) |
| KR (1) | KR100554487B1 (pl) |
| CN (1) | CN1188519C (pl) |
| AR (2) | AR017147A1 (pl) |
| AT (1) | ATE338128T1 (pl) |
| AU (1) | AU746564B2 (pl) |
| BR (1) | BR9812547A (pl) |
| CA (1) | CA2305013C (pl) |
| CO (1) | CO4810339A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ302878B6 (pl) |
| DE (1) | DE69835756T3 (pl) |
| DK (1) | DK1015596T4 (pl) |
| ES (1) | ES2272012T5 (pl) |
| GB (1) | GB9720585D0 (pl) |
| HK (1) | HK1030431A1 (pl) |
| HU (1) | HUP0004896A3 (pl) |
| IL (1) | IL135102A0 (pl) |
| NO (2) | NO328824B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ503482A (pl) |
| PL (1) | PL195243B1 (pl) |
| PT (1) | PT1015596E (pl) |
| SA (1) | SA98190877B1 (pl) |
| SI (1) | SI1015596T2 (pl) |
| TR (1) | TR200000864T2 (pl) |
| TW (1) | TW499436B (pl) |
| WO (1) | WO1999016884A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA988789B (pl) |
Families Citing this family (48)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9706957D0 (en) | 1997-04-05 | 1997-05-21 | Smithkline Beecham Plc | Formulation |
| GB9720585D0 (en) * | 1997-09-26 | 1997-11-26 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| GB9820525D0 (en) * | 1998-09-21 | 1998-11-11 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
| JP2002537354A (ja) * | 1999-02-25 | 2002-11-05 | スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ペプチド、及びＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのプロテインＤ由来の担体を含む免疫原 |
| AU4342900A (en) * | 1999-04-12 | 2000-11-14 | Modex Therapeutiques, S.A. | Transiently immortalized cells for use in gene therapy |
| ATE306938T1 (de) * | 1999-06-29 | 2005-11-15 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Verwendung von cpg als adjuvans für hivimpstoff |
| GB0000891D0 (en) | 2000-01-14 | 2000-03-08 | Allergy Therapeutics Ltd | Formulation |
| PL211762B1 (pl) * | 2000-01-31 | 2012-06-29 | Smithkline Beecham Biolog | Zastosowanie białka fuzyjnego zawierającego białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko, białka lub polinukleotydu HIV gp120, białka lub polinukleotydu SIV Nef, adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego oraz kompozycja szczepionki |
| WO2006033665A1 (en) | 2004-03-16 | 2006-03-30 | Inist Inc. | Tat-based vaccine compositions and methods of making and using same |
| US6472176B2 (en) | 2000-12-14 | 2002-10-29 | Genvec, Inc. | Polynucleotide encoding chimeric protein and related vector, cell, and method of expression thereof |
| GB0110431D0 (en) * | 2001-04-27 | 2001-06-20 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel compounds |
| EP1279404A1 (en) * | 2001-07-26 | 2003-01-29 | Istituto Superiore di Sanità | Use of HIV-1 tat, fragments or derivatives thereof, to target or to activate antigen-presenting cells, to deliver cargo molecules for vaccination or to treat other diseases |
| GB0118367D0 (en) * | 2001-07-27 | 2001-09-19 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel use |
| NZ532383A (en) | 2001-11-21 | 2007-03-30 | Univ Pennsylvania | Pan-7 simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use |
| EP1944043A1 (en) | 2001-11-21 | 2008-07-16 | The Trustees of the University of Pennsylvania | Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use |
| KR100466382B1 (ko) * | 2002-01-08 | 2005-01-14 | 주식회사 엘지생명과학 | 인간 면역 결핍 바이러스-1, -2 타입의 단백질이 융합된 재조합 콤보 단백질, 이의 생산방법, 이를 포함하는 벡터, 형질전환된 대장균 및 진단키트 |
| GB0206359D0 (en) | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
| GB0206360D0 (en) | 2002-03-18 | 2002-05-01 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Viral antigens |
| DK1506223T3 (da) | 2002-05-16 | 2006-04-10 | Bavarian Nordic As | Fusionsprotein af regulatoriske/accessoriske HIV-proteiner |
| GB0225788D0 (en) | 2002-11-05 | 2002-12-11 | Glaxo Group Ltd | Vaccine |
| TW200613554A (en) | 2004-06-17 | 2006-05-01 | Wyeth Corp | Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV |
| GB0417494D0 (en) | 2004-08-05 | 2004-09-08 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
| GB0507003D0 (en) * | 2005-04-06 | 2005-05-11 | Molmed Spa | Therapeutic |
| IN2014DN06624A (pl) | 2005-10-18 | 2015-07-10 | Univ Colorado | |
| BRPI0819774A2 (pt) | 2007-11-28 | 2014-10-14 | Univ Pennsylvania | Subfamília c de adenovírus sadv-40, -31 e -34 de símio e seus usos |
| DK2220241T3 (en) | 2007-11-28 | 2017-01-09 | Univ Pennsylvania | Adenovirus comprising a simian adenovirus E-SAdV-39-capsidhexonprotein and uses thereof |
| JP5661476B2 (ja) | 2008-03-04 | 2015-01-28 | ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア | サルアデノウイルスＳＡｄＶ−３６、−４２．１、−４２．２および−４４ならびにそれらの用途 |
| CA2723114C (en) | 2008-05-16 | 2018-02-27 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Antibodies and processes for preparing the same |
| CN102083970B (zh) | 2008-07-21 | 2014-10-22 | 泰加生物工艺学公司 | 分化无核细胞及其制备方法 |
| DK2966084T3 (en) | 2008-08-28 | 2018-08-06 | Taiga Biotechnologies Inc | MODULATORS OF MYC, PROCEDURES FOR USING SAME AND PROCEDURES FOR IDENTIFYING SUBSTANCES MODULATING MYC |
| EP2350269B1 (en) | 2008-10-31 | 2015-09-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Simian adenoviruses with sadv-46 hexon capsid proteins and uses thereof |
| CA2755897C (en) | 2009-03-23 | 2020-01-28 | Nanirx, Inc. | Treatment of cancers with immunostimulatory hiv tat derivative polypeptides |
| US8846031B2 (en) | 2009-05-29 | 2014-09-30 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Simian adenovirus 41 and uses thereof |
| EP2643465B1 (en) | 2010-11-23 | 2016-05-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Subfamily e simian adenovirus a1321 and uses thereof |
| US9110059B2 (en) * | 2011-03-15 | 2015-08-18 | Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University | Bio-pin |
| BR112014028684A2 (pt) | 2012-05-18 | 2017-07-25 | Univ Pennsylvania | subfamília e adenovírus de símio a1302, a1320, a1331 e a1337 e usos dos mesmos |
| WO2014012090A1 (en) * | 2012-07-13 | 2014-01-16 | The Broad Institute, Inc. | Molecular sleds comprising a positively-charged amino acid sequence and a molecular cargo and uses thereof |
| US9789135B2 (en) | 2012-07-20 | 2017-10-17 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment |
| US9365825B2 (en) | 2013-03-11 | 2016-06-14 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Expansion of adult stem cells in vitro |
| US10272115B2 (en) | 2013-03-11 | 2019-04-30 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Production and use of red blood cells |
| US9663556B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-05-30 | Pin Pharma, Inc. | Treatment of cancers with immunostimulatory HIV tat derivative polypeptides |
| CA2947614C (en) | 2014-05-13 | 2023-10-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions comprising aav expressing dual antibody constructs and uses thereof |
| CN107708671B (zh) * | 2015-04-16 | 2020-12-04 | 纽约州立大学研究基金会 | 包含钴卟啉-磷脂缀合物和聚组氨酸标签的纳米结构 |
| US11207421B2 (en) | 2015-04-16 | 2021-12-28 | The Research Foundation For The State University Of New York | Nanostructures comprising cobalt porphyrin-phospholipid conjugates and polyhistidine-tags |
| KR20190092472A (ko) | 2016-12-02 | 2019-08-07 | 타이가 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 | 나노입자 제제 |
| US10149898B2 (en) | 2017-08-03 | 2018-12-11 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Methods and compositions for the treatment of melanoma |
| MX2023012643A (es) | 2021-04-27 | 2024-01-05 | Generation Bio Co | Vectores de adn no virales que expresan anticuerpos terapéuticos y usos de estos. |
| WO2023177655A1 (en) | 2022-03-14 | 2023-09-21 | Generation Bio Co. | Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9003010D0 (en) * | 1990-02-09 | 1990-04-04 | Glaxo Group Ltd | Gene expression in yeast cells |
| JPH07502646A (ja) * | 1991-10-21 | 1995-03-23 | メディミューン，インコーポレーテッド | リポタンパク質の分泌シグナルをコード化するｄｎａを含む細菌発現ベクター |
| ES2123062T3 (es) * | 1992-08-21 | 1999-01-01 | Biogen Inc | Polipeptidos de transporte derivados de la proteina tat. |
| NZ262582A (en) * | 1993-01-26 | 1997-10-24 | David B Weiner | Compositions and methods for delivery of genetic material |
| EP0814834B2 (fr) * | 1995-03-08 | 2009-03-18 | Neovacs | Immunogenes denues de toxicite derivant d'une proteine de regulation retrovirale, anticorps diriges contre ces immunogenes, procede pour leur preparation et compositions pharmaceutiques les renfermant |
| GB9720585D0 (en) * | 1997-09-26 | 1997-11-26 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
-
1997
- 1997-09-26 GB GBGB9720585.0A patent/GB9720585D0/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-09-17 EP EP98952625A patent/EP1015596B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-17 CN CNB988114321A patent/CN1188519C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-17 JP JP2000513953A patent/JP2001518300A/ja not_active Withdrawn
- 1998-09-17 DK DK98952625.6T patent/DK1015596T4/da active
- 1998-09-17 SI SI9830860T patent/SI1015596T2/sl unknown
- 1998-09-17 CZ CZ20001091A patent/CZ302878B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-09-17 TR TR2000/00864T patent/TR200000864T2/xx unknown
- 1998-09-17 PL PL98339432A patent/PL195243B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1998-09-17 WO PCT/EP1998/006040 patent/WO1999016884A1/en active IP Right Grant
- 1998-09-17 NZ NZ503482A patent/NZ503482A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-09-17 AU AU10255/99A patent/AU746564B2/en not_active Ceased
- 1998-09-17 DE DE69835756T patent/DE69835756T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-17 HU HU0004896A patent/HUP0004896A3/hu unknown
- 1998-09-17 PT PT98952625T patent/PT1015596E/pt unknown
- 1998-09-17 ES ES98952625T patent/ES2272012T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-17 KR KR1020007003180A patent/KR100554487B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-09-17 IL IL13510298A patent/IL135102A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-09-17 AT AT98952625T patent/ATE338128T1/de active
- 1998-09-17 BR BR9812547-8A patent/BR9812547A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-09-17 CA CA002305013A patent/CA2305013C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-24 AR ARP980104779A patent/AR017147A1/es active IP Right Grant
- 1998-09-25 ZA ZA9808789A patent/ZA988789B/xx unknown
- 1998-09-25 CO CO98056054A patent/CO4810339A1/es unknown
- 1998-10-22 TW TW087117493A patent/TW499436B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-12-15 SA SA98190877A patent/SA98190877B1/ar unknown
-
2000
- 2000-03-23 NO NO20001508A patent/NO328824B1/no not_active IP Right Cessation
- 2000-12-27 HK HK00108429A patent/HK1030431A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-12-14 NO NO20076467A patent/NO20076467L/no unknown
-
2009
- 2009-06-30 JP JP2009155916A patent/JP2009213492A/ja active Pending
-
2011
- 2011-02-28 AR ARP110100606A patent/AR080331A2/es not_active Application Discontinuation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL195243B1 (pl) | Kompozycja szczepionki, białko obejmujące białka Tat HIV i Nef HIV-1 albo ich pochodne oraz kwas nukleinowy kodujący to białko i komórka transformowana tym kwasem, sposób wytwarzania tego białka orazbiałka zawierającego białko Tat HIV i/lub Nef HIValbo ich pochodne, polinukleotyd oraz białko Nef-Tat-His lub Nef-zmutowany Tat-His | |
| KR101501495B1 (ko) | Ｈｉｖ-감염의 예방 및 치료를 위한 백신 | |
| AU765940B2 (en) | Particles of HCV envelope proteins: use for vaccination | |
| ES2251734T3 (es) | Genes sinteticos de hiv. | |
| PL211762B1 (pl) | Zastosowanie białka fuzyjnego zawierającego białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko, białka lub polinukleotydu HIV gp120, białka lub polinukleotydu SIV Nef, adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego oraz kompozycja szczepionki | |
| PT778888E (pt) | Particulas semelhantes a retrovírus não infecciosas antigenicamente marcadas. | |
| KR20190090775A (ko) | 항-말라리아 백신으로서의 바이오융합 단백질 | |
| JPH08504090A (ja) | 抗−ネコ免疫不全ウイルス（ｆｉｖ）ワクチン | |
| US20240252617A1 (en) | Coronavirus spike protein designs, compositions and methods for their use | |
| CA2018297A1 (en) | Conjugate immunogen for aids | |
| EP0471407A2 (en) | New embodiments of the HIV principal neutralizing determinant | |
| JP2003516741A (ja) | コドン最適化ＨＩＶ−１Ｎｅｆ及び修飾ＨＩＶ−１Ｎｅｆを発現するポリヌクレオチドワクチン | |
| KR20110114600A (ko) | 재조합 닭 전염성 코라이자 백신 및 그 제조방법 | |
| RU2390525C2 (ru) | Новая растворимая и стабилизированная тримерная форма полипептидов gp41 | |
| Deng et al. | Immunological response of female macaques to the PH-20 sperm protein following injection of recombinant proteins or synthesized peptides | |
| WO2019059817A1 (en) | VACCINE BASED ON FUSION PROTEIN AND PLASMIDIC DNA | |
| US20100215681A1 (en) | Fusion proteins comprising hiv-1 tat and/or nef proteins | |
| KR20060041179A (ko) | 비정상적인 이황화물 구조를 지닌 ｈｉｖ-1 외피 당단백질 | |
| CN115515628A (zh) | 腮腺炎和麻疹病毒免疫原及其用途 | |
| WO1994002613A1 (en) | Anti-feline immunodeficiency virus (fiv) vaccines | |
| MXPA00002973A (en) | Fusion proteins comprising hiv-1 tat and/or nef proteins | |
| WO1998055627A1 (fr) | Antigenes mutants du virus de la rougeole et genes les codant | |
| KR19980032276A (ko) | 서울 바이러스 r22의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자, 재조합 플라스미드, 형질전환 대장균, 및 신증후 출혈열 진단제 및 예방백신 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20140917 |