CN107708671B - 包含钴卟啉-磷脂缀合物和聚组氨酸标签的纳米结构 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了纳米结构(例如单分子层或双分子层纳米结构),其包含卟啉(具有钴与其螯合),使得钴金属位于卟啉大环中的单分子层或双分子层内。纳米结构可以具有呈递分子(具有与其连接的组氨酸标签),使得至少一部分的his‑标签位于单分子层或双分子层内,以及与钴金属芯配位并且呈递分子暴露于纳米结构的外部。纳米结构还可以包含货物。纳米结构可用于将货物递送到个体。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年4月16日提交的申请号为62/148,292的美国临时专利申请的优先权,其公开内容通过引用并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在国家卫生研究院授予的编号为DP5OD017898和R21AI122964的资助在政府的支持下完成的。政府对发明有一定的权利。
技术领域
本公开大体上涉及功能化的纳米结构领域。更具体地,本公开涉及包含钴-卟啉的纳米结构。
背景技术
在功能化的纳米颗粒领域,挑战之一就是容易且可靠地将肽和蛋白质连接到较大的支架上。靶向纳米颗粒需要有效的配体,并且未缀合的肽本身是弱免疫原性的。生物缀合化学提供了一系列策略,但是大多数纳米颗粒缀合受到与以下一个或多个相关的限制的困扰:1)低缀合产率和必需的纯化步骤;2)与生物缓冲液不相容,使得无法对完整纳米颗粒进行标记;3)多变的标记位点和缀合的多肽构象,产生功效不同的不均匀粒子群;4)复杂和外源化学方法的必要性。
用于将配体连接到水性纳米颗粒的标准方法是利用马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯和碳二亚胺活化的羧酸。这些可与多肽的胺和硫醇基团共价地反应。已经广泛地研究了在抗体缀合的免疫脂质体中使用马来酰亚胺-脂质。过夜反应后的缀合产率可高达90%,但随后需要对游离马来酰亚胺基团进行淬灭和另外的纯化。蛋白质可能需要在缀合之前进行硫醇化和纯化的预备步骤。抗体取向是影响缀合的抗体靶标结合功效的主要因素,但是这些方法导致许多地抗体标记位点和不加选择的取向。近来,诸如点击反应的双正交合成策略已经应用于预形成的脂质体,然而这些需要使用外源性催化剂和非常规氨基酸。
适用于较不容易在有机溶剂中永久变性的较小肽的另一种方法是将肽与脂质锚定物缀合。然后可以在脂质体形成过程中将所得的脂肽与其它脂质一起掺入。该方法已被用于产生诱导针对其它非免疫原性肽产生抗体的合成疫苗。然而,由于它们的两亲性,在这种情况下难以对脂肽进行纯化,产率为5-10%。还显示在形成过程中脂肽没有完全掺入到脂质体中而导致聚集。
公开内容
本公开提供了功能化的纳米结构。纳米结构可用于货物的递送、靶向递送和/或呈递分子(presentation molecule)的递送。纳米结构可以是在其中包围水性隔室的单分子层或双分子层。包围水性隔室的双分子层结构在本文中称为脂质体。纳米结构可以是涂覆在纳米颗粒上的单分子层或双分子层。单分子层或双分子层包括钴卟啉-磷脂缀合物、任选地未与卟啉缀合的磷脂、任选地固醇,以及任选地聚乙二醇(PEG)。将具有聚组氨酸标签的一种或多种靶向肽或多肽(本文称为呈递分子)掺入到单分子层或双分子层中,以使得聚组氨酸标签的一部分位于单分子层或双分子层中,并且将呈递分子暴露于单分子层或双分子层的外部。可以使用钴卟啉代替钴卟啉磷脂缀合物,或者除了钴卟啉磷脂缀合物还可以采用钴卟啉。
本公开的纳米结构可以装载有货物用于递送到可被聚组氨酸标记的呈送分子靶向的位点。例如,脂质体可以装载有货物用于通过采用聚组氨酸标记的呈递分子递送至所需的位点。
这里提供了的数据表明含有钴-卟啉例如钴卟啉-磷脂(CoPoP)的双分子层可以稳定地结合聚组氨酸标记的(本文中也称为“his-标记的”)的多肽(图1a)。其它金属-卟啉例如锌、镍和铜不能稳定地结合his-标记的多肽。这代表了一种新型结合范例,其中至少有一些聚组氨酸被掩埋在膜相中,因为卟啉本身形成双分子层的疏水部分并且不能被外部水性环境所接近(图1b)。这带来更稳定的结合,使得纳米颗粒形成之后非共价的后标记范例明显更加简单,并且消除关于配体取向的歧义。
我们显示了含有与钴而不与其它金属螯合的卟啉-磷脂的脂质双分子层可以有效地捕获his-标记的蛋白质和肽。结合遵循Co(II)至Co(III)的转变,并发生在掩蔽的疏水双分子层内,导致例如血清中基本上不可逆的连接或百万倍过量的竞争性咪唑。采用这种方法,我们将归巢肽(homing peptides)插入到预先形成的空的和装载有货物的脂质体的双分子层中,以实现位点靶向(例如靶向肿瘤),而不破坏双分子层的完整性。可以将肽或合成肽结合到含有佐剂(例如脂质单磷酰脂质A)的脂质体上,用于产生针对其它非抗原性肽的抗体。
本公开提供了单分子层或双分子层结构,其中单分子层或双分子层包含与钴螯合的卟啉以使得钴金属位于单分子层或双分子层内和卟啉大环中,并且还具有与组氨酸标签非共价连接的分子以使得his-标签的至少一部分位于单分子层或双分子层内并且与钴金属芯配位。呈递分子可用于各种应用,包括靶向和产生免疫应答。由本公开的分子层形成的脂质体或胶束(micelles)可以装载货物以在所需的位置释放。钴卟啉可以为钴卟啉-磷脂(CoPoP)。本公开的分子层还可以用作用于包括金属纳米颗粒、纳米管等的其它纳米结构的涂层。
附图说明
图1、His-标签与PoP-双分子层结合。(a)示出了具有(绿色)His标签的肽在水溶液中结合到预先形成的CoPoP脂质体的示意图。(b)将His-标记的多肽插入含CoPoP的双分子层中。仅显示双分子层的单片层。(c)本研究中采用的金属-PoP的化学结构。
图2、His-标记的蛋白质与Co(III)-PoP脂质体结合。(a)包含与Venus(V)融合的Cerulean(C)的七组氨酸-标记的荧光蛋白显示与PoP-双分子层结合。当C被激发时,发生FRET并且V发射荧光(左),但是在与PoP-双分子层结合时由于与光刺激性双分子层(中间)竞争的FRET而被抑制。即使当蛋白质与双分子层结合时,C荧光也可以直接被探测到(右)。(b)与指定的金属-PoP脂质体孵育后融合蛋白电泳迁移变动的多光谱荧光图像。(c)基于C至V FRET的损失,融合蛋白与指定的金属-Po脂质体的结合动力学。(d)CoPoP上的乙烯基的下划线质子的NMR峰宽显示在氘代氯仿(CDCl3)中Co(II)的顺磁性增宽,而形成CoPoP-脂质体后在氘化水中Co(III)的非顺磁性峰。对于每组的条形图,从左到右的条形为:CoPoP和2H-PoP。(e)加入2M硫酸钠后,与CoPoP脂质体结合的His-标记的肽的逆转。用10摩尔%的CoPoP或Ni-NTA磷脂形成脂质体。对于每组条形图,从左到右的条形是:水和+2M亚硫酸盐。
图3、His-标记的蛋白质与CoPoP脂质体的强烈结合。(a)与含有指定的脂质的脂质体孵育的荧光报告蛋白的多光谱电泳迁移改变的图像。(b)与1:1血清中与指定的脂质体结合的报告蛋白的结合稳定性。(c)在过量游离咪唑中与指定的脂质体结合的报告蛋白的结合稳定性。n=3的平均值+/-标准偏差。
图4、短His-标记的RGD肽与CoPoP脂质体的结合。(a)用FAM标记的短肽与金属-PoP脂质体的结合。(b)His-标签的长度对与CoPoP脂质体的半数结合时间(binding half-time)的影响。无His-标签的肽没有观察到结合“N.B.”。当在PBS(c)或5mg/mL BSA(d)中孵育时,脂质体组成对与指定组成的CoPoP脂质体的半数结合时间的影响。一式三份的测量值显示为平均值+/-标准偏差。在(c)和(d)中,对于每组条形图,从左到右的条形是50和0。
图5、装载有货物的脂质体的RGD-His-靶向。(a)在肽结合期间,在PoP脂质体中包埋的磺酰罗丹明B的释放。对于每组条形图,从左到右的条形是:8小时和24小时。(b)装载有磺酰罗丹明B的脂质体的靶向摄取。在指定的条件下孵育细胞,并通过测定磺酰罗丹明B荧光来评估摄取。对于每组条形图,从左到右的条形是:MCF7细胞和U87细胞。(c)显示脂质体摄取的共聚焦显微照片。将细胞与指定的脂质体溶液孵育2小时,洗涤并成像。所有图像都在相同的设置下获取。(d)在注射到U87肿瘤皮下荷瘤裸鼠中45分钟后,包埋在具有或不具有His-标记的环状RGD靶向肽连接的CoPoP脂质体中的磺酰罗丹明B的生物学分布。n=3的平均值+/-标准偏差。对于每组条形图,从左到右的条形是:无靶向的,和+cRGD-His。
图6、采用免疫原性的CoPoP脂质体的HIV肽疫苗接种。(a)用含有25μg MPL和25μg来源于HIV gp41包膜蛋白的His-标记的MPER肽的CoPoP脂质体免疫BALB/c或无胸腺裸鼠。血清滴度利用具有无His-标签的生物素化的MPER肽并用抗IgG二抗探测的ELISA来评估。箭头表示接种的时间。(b)按指示接种的BALB/c小鼠中的抗-MPER滴度。在第0周和第2周对小鼠接种并在第4周收集血清。(c)用含有MPL的CoPoP脂质体接种的小鼠中的持续的抗-MPER滴度。每组n=4只小鼠的平均值+/-标准偏差。在左侧的前两个条(连接的)是CoPoP和Ni-NTA。(d)在所指示抗体的存在下在293细胞中HIV感染的中和。利用蛋白A从小鼠血清中纯化IgG。n=3的平均值+/-标准偏差。
图7、RGD-His肽与脂质体结合的稳定性。(a)FAM-标记的RGD-His肽与含有10摩尔%Ni-NTA-脂质、Co-NTA-脂质或CoPoP的脂质体的结合。(b)肽结合后的凝胶过滤。只有CoPoP脂质体保持稳定的结合。(c)按1:1稀释在胎牛血清中进行孵育后的肽的稳定性。只有CoPoP脂质体保持稳定的结合。
图8、稳定的his标记的蛋白质与含有CoPoP的脂质体的结合。将报告蛋白与含有CoPoP、游离Co-卟啉或2H-PoP的脂质体一起孵育,然后在血清中孵育并进行EMSA。然后利用FRET通道(激发(ex):430nm,发射(em):525nm)对蛋白质成像。CoPoP泳道中没有信号表明与脂质体稳定的结合。Co-卟啉泳道中信号的减弱表明his-标记的蛋白质与脂质体的一些结合。
图9、90%RGD-His肽与不同组成的CoPoP脂质体结合的时间。脂质体组成对90%肽与CoPoP脂质体(10摩尔%CoPoP)结合的时间的影响,CoPoP脂质体含有在PBS中与RGD-His肽一起孵育时指定的组分。对于每组条形图,从左到右的条形是:有胆固醇和无胆固醇。
图10、RGD-His在血清或白蛋白的存在下与CoPoP脂质体的结合。将具有所指示组分的脂质体在50%的胎牛血清或50mg/mL的牛血清白蛋白的存在下与RGD-his肽一起孵育。通过将结合到CoPoP脂质体时的肽发射与2H-PoP脂质体比较,而将FAM标记的肽发射归一化。
图11、通过脂肽的膜透化。将装载有磺酰罗丹明B的脂质体在室温下与所指示的肽(5μg/mL)一起孵育,并利用荧光评估释放。对于每组条形图,从左到右的条形是:8小时和24小时。
图12、RGD-His肽与含有1摩尔%CoPoP的脂质体的结合和细胞靶向。(a)与含有1摩尔%CoPoP的CoPoP脂质体孵育时的归一化的肽荧光。通过比较CoPoP样品与2H-PoP将发射归一化。(b)含有1摩尔%CoPoP的磺酰罗丹明B脂质体(按所示的与细胞孵育)的细胞摄取。对于每组条形图,从左到右的条形是:MCF7细胞和U87细胞。
图13、用CoPoP his-标签结合表面涂覆金纳米颗粒。(a)分散金纳米球的涂覆方案照片。没有PoP涂层,重复的离心步骤后的柠檬酸盐稳定的金聚集(箭头)。(b)脂质涂覆前后纳米球的尺寸。插图显示具有50nm比例尺的CoPoP金的透射电子显微镜照片。(c)RGD-His结合后柠檬酸盐稳定的金和CoPoP金的吸收光谱。(d)显示靶向的纳米球摄取的共焦反射图。将细胞与所指示的金纳米球孵育2小时,洗涤然后成像。所有图像都在相同的设置下获取。
图14、(A)通过离心过滤测定法测量Psf25(Pfs25_B)的结合。这些数据表明Psf25蛋白与Co-pop脂质体的100%结合。(B)Psf25蛋白结合前后CoPoP脂质体的粒径。
图15、CD-1小鼠中的抗Psf25IgG水平。以肌肉注射的方式对小鼠接种缀合有Psf25的CofP/MPL或ISA70,其中(A)为加强前而(B)为加强后,三周预致敏(prime)/三周加强(每次注射5、0.5或0.05μg Pfs25)。通过ELISA在96孔板上测量用CoPoP(Psf25)脂质体或游离Psf25蛋白(含或不含ISA70)接种的小鼠的IgG滴度。数据表示为平均值±S.D.,其中每组n=5只小鼠。
图16、抗Psf25IgG滴度。滴度被定义为在背景下产生大于0.5的吸光度的血清稀释度的倒数。
图17、包覆在CoPoP脂质体上的不同长度的NANP肽的图示和表征。(A)含有7×组氨酸(His)标签的不同数量的NANP重复肽。(B)通过动态光散射(n=3)计算与不同长度的NANP肽缀合的CoPoP脂质体的平均直径和多分散性(PDI)。误差条,SD.。(C)通过微离心过滤方法和BCA测定(n=3)测量的NANP肽与CoPoP脂质体和2H CoPoP脂质体的肽结合。
图18、在用结合his-标记的MPER的CoPoP/磷脂酰丝氨酸脂质体预处理的小鼠中的抗-MPER IgG滴度。在注射结合有MPER的CoPoP/MPLA脂质体前4周和2周时,将小鼠用MPER/CoPoP/PS脂质体预处理,以诱导针对MPER的抗体应答。
图19、结合不同his-标记的CPP的CoPoP脂质体孵育后的U87细胞的荧光。
具体实施方式
本公开提供了包括至少单分子层的纳米结构。例如,所述结构可以包括单分子层或双分子层,其中单分子层或双分子层包括具有与其螯合的钴的卟啉-磷脂缀合物,使得钴位于双分子层内。双分子层结构可以形成脂质体。结构可以包含两个单分子层(双分子层),其中两个单分子层的疏水基团是相对的,而亲水基团暴露于表面。
本文中关于双分子层的公开内容也适用于单分子层。双分子层或单分子层在本文中有时被称为“膜”。
除非另有说明,本文提供了的所有范围包括落入至小数点后第十位的范围内的所有值。
单分子层或双分子层中的部分或全部钴卟啉可以非共价地结合聚组氨酸标记的分子,使得至少部分聚组氨酸标签位于双分子层内,并且将被标记的分子呈递在双分子层的表面上。在本公开的双分子层或单分子层中,认为聚组氨酸标签中的一个或多个组氨酸残基与双分子层内的钴金属芯配位,从而为结构提供了稳定性。聚组氨酸标签的组氨酸残基可以与膜中卟啉的芯中的钴金属配位。整个组氨酸标签可位于双分子层内。具有与其缀合的钴金属的卟啉磷脂缀合物在本文中被称为CoPoP。其中双分子层包含CoPoP的脂质体在本文中被称为CoPoP脂质体。CoPoP脂质体可以被组氨酸标记的分子功能化。本文所用的术语“his-标记的分子”是指具有组氨酸尾部的分子-诸如,例如肽、多肽或蛋白质。例如具有组氨酸尾部的肽是his-标记的分子。这种含有his-标签的CoPoP脂质体在本文中被称为his-标记的CoPoP脂质体或his-标记的CoPoP。
用本公开的his-标记的呈递分子功能化的CoPoP单分子层或双分子层提供了用于呈递循环中感兴趣的各种分子、或用于递送到所需的位置或用于产生针对那些his-标记的分子的特异性免疫应答的平台。这些分子在本文中被称为呈递分子(PM)。具有连接到组氨酸标签的PM的含有his-标记的CoPoP双分子层结构,表现出所需的稳定性。his-标记的分子非共价地连接到(配位到)CoPoP上,并可以通过孵育方法制备。因此,该方法不需要除去其它类型的缀合化学反应中使用的反应性部分-如马来酰亚胺等-或外源催化剂或非天然氨基酸。
钴-卟啉可以在自组装脂质体中的双分子层中,在脂质体中包围着水性隔室。或者,它可以在涂覆其它纳米颗粒的单分子层或双分子层涂层中。钴-卟啉磷脂(CoPoP)在其两亲性性质上表现得像常规脂质。因此,包含CoPoP的单分子层或双分子层可用于通过本领域技术人员已知的方法涂覆纳米颗粒。在一个实施方案中,本公开的双分子层或单分子层可以存在于其它纳米颗粒上,诸如,例如以涂层的形式存在。在一个实施方案中,含有钴-卟啉(例如钴卟啉-磷脂)的双分子层或单分子层作为金或二氧化硅纳米颗粒或具有亲水性表面的其它纳米颗粒上的涂层存在。在一个实施方案中,涂层可以是单分子层形式。在一个实施方案中,含有钴-卟啉(例如钴卟啉-磷脂)的单分子层或双分子层作为疏水表面如碳纳米管上的涂层存在。在一个实施方案中,单分子层可以形成围绕一个或多个疏水性分子的胶束。
本公开提供了包含单分子层或双分子层的纳米结构,其中单分子层或双分子层包含:i)任选地,磷脂和ii)卟啉,具有钴与其配位以形成钴-卟啉。任选地,纳米结构还具有一个或多个聚组氨酸标记的呈递分子。聚组氨酸标签的至少一部分位于单分子层或双分子层的疏水部分中,而聚组氨酸标签的一个或多个组氨酸与钴-卟啉中的钴配位。聚组氨酸标记的呈递分子的至少一部分暴露于纳米结构的外部。纳米结构可以是包围水性隔室的脂质体的形式。然而,纳米结构也可以涂覆亲水性材料或疏水性材料,例如金或二氧化硅纳米颗粒。钴卟啉可以与磷脂缀合以形成钴卟啉-磷脂缀合物。钴卟啉可以组成1至100mol%的单分子层或双分子层,包括0.1mol%的值和其间的范围。例如,钴卟啉可以组成1至20摩尔%或5至10mol%的单分子层或双分子层。如果钴卟啉组成了100%的单分子层或双分子层,则不存在未与钴卟啉缀合的磷脂。双分子层或单分子层也可以包含固醇和/或聚乙二醇。固醇可以是胆固醇。
单分子层或双分子层中聚组氨酸标签中的组氨酸数目可以为2至20。例如,聚组氨酸标签中的组氨酸数目可以为6至10。例如,组氨酸的数目可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
脂质体可以是球形的或非球形的。脂质体的尺寸可以为50至1000nm或更大。在一个实施方案中,脂质体具有50至1000nm的尺寸(例如,最长尺寸,诸如,例如直径),包括其间的所有整数nm值和范围。例如,尺寸可以为50至200nm,或20至1000nm。如果脂质体不是球形的,则最长的尺寸可以为50至1000nm。可以在实现这些尺寸的同时保持双分子层的单分子层的纳米结构的宽度。脂质体可以在水性隔室中携带货物。货物或其一部分也可以或替代地被掺入到单分子层或双分子层中。
在一个实施方案中,本公开提供了包含单分子层或双分子层的脂质体,其中所述单分子层或双分子层包含钴-卟啉磷脂缀合物,任选地未与钴卟啉缀合的磷脂,和聚组氨酸标记的呈递分子,其中聚组氨酸标签的至少一部分位于单分子层或双分子层的疏水部分中,而聚组氨酸标签的一个或多个组氨酸与钴-卟啉磷脂缀合物中的钴配位。聚组氨酸标记的呈递分子的至少一部分暴露于纳米结构的外部。纳米结构例如脂质体可以包围水性隔室。单分子层或双分子层不需要含有未与钴卟啉缀合的任何磷脂,并且在这种情况下仅具有钴卟啉磷脂缀合物。货物可以存在于水性隔室中。货物不需要仅仅存在于水性隔室中,其一部分可以位于单分子层或双分子层中。
本公开还提供了单分子层或双分子层,其中单分子层或双分子层包含磷脂单体和具有钴与其配位的卟啉(形成钴-卟啉)。单分子层或双分子层与一个或多个聚组氨酸标记的呈递分子相关联,其中聚组氨酸标签的至少一部分位于单分子层或双分子层的疏水部分中。聚组氨酸标签的一个或多个组氨酸与钴卟啉中的钴配位,而聚组氨酸标记的呈递分子的至少一部分在双分子层或单分子层外部。在多个示例中,单分子层或双分子层包围水性隔室或在纳米颗粒-例如金或二氧化硅纳米颗粒上形成涂层。
本公开提供了包含芯、和在芯上的单分子层或双分子层涂层的纳米结构,其中单分子层或双分子层包含磷脂,和卟啉(具有钴与其配位以形成钴-卟啉)。纳米结构可以具有一个或多个聚组氨酸标记的呈递分子,其中聚组氨酸标签的至少一部分位于单分子层或双分子层的疏水部分中,而聚组氨酸标签的一个或多个组氨酸与钴卟啉中的钴配位。聚组氨酸标记的呈递分子的至少一部分暴露于纳米颗粒的外部。纳米结构的芯可以是纳米颗粒,例如金或二氧化硅纳米颗粒。
如本文所述的具有涂层或单分子层或双分子层的脂质体或纳米颗粒上可以具有呈递分子,呈递分子可以是抗原分子和/或靶向分子。呈递分子还可以提供靶向能力和/或成像或其它功能。
包含his-标记的多肽和CoPoP组合物的脂质体或其它纳米结构在his-标记的多肽与脂质体的结合方面表现出高的血清稳定性。在一个实施方案中,当在室温下与血清(例如经过稀释的血清)一起孵育时,超过60%的his-标记的肽在孵育24小时后仍与含CoPoP的双分子层保持结合。在一个实施方案中,超过85%的his-标记的肽在与血清孵育24小时后与CoPoP分子层保持结合。
CoPoP脂质体或his-标记的CoPoP脂质体可以装载货物,货物通常位于水性隔室中,但如果是疏水性的或具有疏水性成分,则可以全部或部分地包埋在双分子层中。除了在表面上具有呈递分子之外,这些结构还可以用于在结构中的水性隔室或双分子层中装载货物。货物从CoPoP-脂质体中的释放可以通过近红外(NIR)光来触发。货物可以在所需的位置释放,例如通过内化在靶向细胞中或通过光触发释放。
单分子层或双分子层的钴-卟啉是具有与卟啉缀合的钴(Co)阳离子的卟啉。卟啉可以与磷脂缀合(本文被称为钴卟啉-磷脂或钴卟啉-磷脂缀合物)。
组成了一些脂质体或其它结构的双分子层的至少一部分的钴-卟啉或钴-卟啉缀合物的卟啉部分包括卟啉、卟啉衍生物、卟啉类似物或其组合。示例性的卟啉包括血卟啉、原卟啉和四苯基卟啉。示例性的卟啉衍生物包括焦脱镁叶绿酸、细菌叶绿素、叶绿素A、苯并卟啉衍生物、四羟基苯基二氢卟酚、红紫素、苯并二氢卟酚、萘并二氢卟酚、维尔丁(verdins)、罗丁(rhodins)、酮二氢卟酚、氮杂二氢卟吩、细菌二氢卟酚、托尼卟啉和苯并细菌二氢卟酚。示例性的卟啉类似物包括扩展的卟啉家族成员(例如得克萨卟啉(texaphyrins)、sapphyrins和六卟啉(hexaphyrins))和卟啉异构体(例如类卟吩化合物(porphycenes)、错位卟啉(inverted porphyrins)、酞菁和萘酞菁)。例如,钴卟啉可以是维生素B12(钴胺素)或衍生物。
在一个实施方案中,PoP是焦脱镁叶绿酸-磷脂。焦脱镁叶绿酸-磷脂的结构如下所示:
在一个实施方案中,分子层(单分子层或双分子层)仅具有CoPoP,CoPoP具有嵌入其中的his-标记的呈递分子。在该实施方案中,该分子层中仅有的磷脂是CoPoP(即CoPoP为100mol%)。在一个实施方案中,分子层(单分子层或双分子层)仅具有CoPoP和卟啉缀合的磷脂(PoP),其中CoPoP具有嵌入其中的组氨酸,其中组氨酸具有连接于其上的肽或其它呈递分子。在某些实施方案中,不存在其它磷脂,但是分子层(单分子层或双分子层)可任选地含有固醇和/或PEG-脂质。
在一个实施方案中,除了CoPoP之外,双分子层或单分子层还具有未与卟啉缀合因此未与Co配位的磷脂。这样的磷脂在本文中可被称为“另外的磷脂”。双分子层或单分子层也可以包含固醇和PEG-脂质。在一个实施方案中,双分子层或单分子层基本上由以下组成或由以下组成:CoPoP、未与卟啉缀合的磷脂,以及任选地固醇和/或PEG成,其中PEG可以与脂质缀合。在一个实施方案中,双分子层中仅有的金属-PoP是CoPoP,其具有嵌入其中的his-标记的呈递分子。在一个实施方案中,双分子层中仅有的金属是Co。
在一个实施方案中,脂质体的双分子层包含CoPoP和PoP。除了CoPoP和PoP之外,双分子层还可以含有另外的磷脂。双分子层或单分子层可进一步包含固醇和/或PEG。PEG可以与脂质缀合。在一个实施方案中,双分子层基本上由以下组成或由以下组成:CoPoP、PoP,另外的磷脂,和任选地固醇和/或PEG,其中PEG可以与脂质缀合。在一个实施方案中,双分子层中仅有的金属-PoP是CoPoP。在一个实施方案中,双分子层中仅有的金属是Co。
在一个实施方案中,CoPoP以0.1至10mol%存在于纳米颗粒中,其余的99.9至90mol%由另外的脂质组成,其百分比为基于整个双分子层脂质的百分比。例如,CoPoP的组合可以以0.1至10mol%存在,固醇可以以0.1-50mol%存在,任选地,弱化脂质A衍生物(attenuated lipid A derivatives)例如单磷酰脂质A或3-脱酰单磷酰脂质A或相关类似物可以以0至20mol%或0.1至20mol%存在,其余的可以由另外的磷脂组成。磷脂是DOPC、DSPC、DMPC或其组合,固醇(如果存在)可以是胆固醇。
在一个实施方案中,CoPoP和PoP的组合可以以0.1至10mol%存在于纳米颗粒中,其余的99.9至90mol%由另外的磷脂组成。例如,CoPoP和PoP的组合可以以0.1至10mol%存在,固醇可以0至50mol%或0.1至50mol%存在,任选地,PEG可以以0至20mol%或0.1至20mol%存在,其余可以由磷脂组成。磷脂可以是DOPC、DSPC、DMPC或其组合,固醇(如果存在)可以是胆固醇。
如本文所用,“磷脂”是具有亲水头基的脂质,亲水头基具有通过甘油主链连接到疏水脂质尾部的磷酸基。磷脂包含6-22个碳原子的酰基侧链,包括其间所有整数个碳原子和之间的范围。在某些实施方案中,卟啉缀合物中的磷脂是1-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱。卟啉缀合物的磷脂可以包含以下、或基本上由以下组成:磷脂酰胆碱、磷脂酰基乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酰肌醇组成。
在某些实施方案中,卟啉通过1至20个碳(包括其间的所有整数个碳)的碳链接头与磷脂上的甘油基团缀合。
在多个实施方案中,除了本文公开的卟啉缀合物之外,脂质体的双分子层还包含其它磷脂。这些磷脂的脂肪酸链可以含有合适数量的碳原子以形成双分子层。例如,脂肪酸链可以含有12、14、16、18或20个碳原子。在不同的实施方案中,双分子层包含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酰肌醇。
本公开的双分子层和单分子层也可以包含固醇。固醇可以是动物固醇或植物固醇。固醇的实例包括胆固醇、谷甾醇、豆甾醇和胆固醇。在实施方案中,胆固醇可以为0mol%至50mol%,或0.1至50mol%。在其它的实施方案中,胆固醇可以以1至50mol%、5至45mol%、10至30mol%存在。
在某些实施方案中,双分子层或单分子层还包含PEG-脂质。PEG-脂质可以是DSPE-PEG,例如DSPE-PEG-2000、DSPE-PEG-5000或其它大小的DSPE-PEG。PEG-脂质以0至20mol%(包括其间至小数点后第十位的所述百分比的量)的量存在。PEG部分的平均分子量可以在500至5000道尔顿之间,以及其间的所有整数值和之间的范围。
在某些实施方案中,双分子层或单分子层还包含佐剂,例如弱化脂质A衍生物,例如单磷酰脂质A或3-脱酰单磷酰脂质A。
组氨酸标签(his标签)可包含各种各样感兴趣的呈递分子,用于各种应用。His-标签的至少一个或两个末端可以位于靠近脂质体的外表面。在一个实施方案中,聚组氨酸标签的至少一个末端共价地连接到呈递分子。在一个实施方案中,his标签是至少2个组氨酸的串。在一个实施方案中,his标签是2至20个组氨酸序列的串。在一个实施方案中,his标签是4至12个以及其间所有整数个的组氨酸的串。在一个实施方案中,它是6至10个组氨酸。在一个实施方案中,它是6、7、8、9或10个组氨酸。在一个实施方案中,his标签的一个末端是游离的,肽或其它分子连接到另一个末端。认为his-标签的至少一部分位于双分子层内,使得它与钴金属芯配位。
本公开的脂质体(不含His标记的分子)可以基本上是球形的并且具有30nm至250nm(包括其间nm级别的所有整数和之间的范围)的尺寸(例如,最长尺寸,诸如,例如直径)。在一个实施方案中,脂质体的尺寸为100-175nm。在一个实施方案中,组合物中至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%或100%的脂质体具有30至250nm或100至175nm的尺寸。脂质体或纳米结构可以为大于200nm。在一个实施方案中,纳米结构为大于1000nm。在一个实施方案中,纳米结构为200至1000nm。脂质体或纳米结构可以是球形的或非球形的。在一个实施方案中,纳米结构的最大尺寸小于200nm,同时保留单分子层或双分子层的纳米结构宽度。在一个实施方案中,纳米结构的尺寸在一些维度上超过200nm,同时保持单分子层或双分子层的纳米结构宽度。在一个实施方案中,纳米结构的尺寸在一些维度上超过1000nm,同时保持单分子层或双分子层的纳米结构宽度。
一方面,本公开提供了包含本公开的脂质体或其它结构或不同脂质体或其它结构的混合物的组合物。组合物还可以包含合适的无菌载体用于施用给包括人的个体,诸如,例如生理缓冲液例如蔗糖、葡萄糖、生理盐水、pH缓冲(例如pH 5至9,pH 7至8,pH 7.2至7.6(例如7.4))因子,例如组氨酸、柠檬酸盐或磷酸盐。在一个实施方案中,组合物包含至少0.1%(w/v)的CoPoP脂质体或his-标记的CoPoP脂质体或其它结构。在多个实施方案中,组合物包含0.1至100mol%的CoPoP脂质体或his-标记的CoPoP脂质体或其它结构例如双分子层涂覆的纳米颗粒。在一个实施方案中,组合物包含0.1至99mol%的CoPoP脂质体,CoPoP脂质体具有与其相关联的具有his-标记的呈递分子。
在一个实施方案中,本公开的组合物不含马来酰亚胺或琥珀酰亚胺酯反应性基团。在一个实施方案中,待连接于膜的被标记的分子不具有非天然氨基酸。
包含his标签的呈递分子可以是小分子或大分子。在一个实施方案中,分子是肽或肽衍生物。在一个实施方案中,分子是多肽、多核苷酸、碳水化合物或聚合物。His-标签可以化学缀合到感兴趣的分子。His-标签可以掺入到多肽的一级氨基酸序列中。在一个实施方案中,分子是抗原,例如肽(2至50个氨基酸以及2和50之间的氨基酸长度的所有肽)或多肽(50-1000个氨基酸以及50至1000之间的氨基酸长度的所有多肽)或蛋白质(大于1000个氨基酸)。肽、多肽或蛋白质可以仅具有天然存在的氨基酸,或者可以是天然存在的和非天然存在的氨基酸的混合物,或者可以仅具有非天然存在的氨基酸。
连接到his-标签的呈递分子可以是抗原分子、靶向分子、治疗分子、诊断分子或提供任何其它类型功能的分子。被标记的分子可以用于靶向,即将具有单分子层或双分子层的结构引导到其靶向位置。例如,肽配体可以连接到his-标签上以使得配体将脂质体(或其它结构)引导至具有针对配体的受体或识别分子的细胞。在一个实施方案中,所连接的肽可以提供替代或附加的功能-诸如,例如,所连接的肽可以提供治疗性、诊断性或免疫原性功能。
在具体实施方案中,呈递分子可以是靶向分子,例如抗体、肽、适体或其它分子如叶酸。术语“靶向分子”用于指可以将具有双分子层的结构如脂质体引导至特定靶标的任何分子,例如通过结合至靶向细胞表面上的受体或其它分子。靶向分子可能是蛋白质、肽、核酸分子、糖或多糖、受体配体或其它小分子。通过选择靶向分子可以调节特异性程度。例如,抗体通常表现出高特异性。这些可以是多克隆、单克隆、片段、重组、单链或纳米抗体,其中许多是可商购获得的或使用标准技术容易获得的。
呈递分子可以是抗原性分子,即具有抗原表位的分子。在一个实施方案中,分子是肽。在一个实施方案中,肽是包含RGD的肽序列。这样的序列可以是具有表位的7至20个氨基酸或更长的序列。肽可以是微生物例如病原微生物的一部分的多肽或蛋白质的表位的片段,或者可以包含微生物例如病原微生物的一部分的多肽或蛋白质的表位。肽可以是通常不是免疫原性的多肽或蛋白质的片段,诸如,例如已知实际上不是免疫原性的病毒蛋白质。肽可以是HIV抗原例如HIV外包膜蛋白的表位的片段,或可以包含HIV抗原例如HIV外包膜蛋白的表位。在一个实施方案中,HIV抗原是gp41。例如,肽可以是gp41包膜的膜近端外部区域(MPER)。
在一个实施方案中,本公开提供了抗原性组合物。组合物包含具有双分子层的结构,所述结构中具有组氨酸尾部的抗原与钴卟啉(或钴卟啉磷脂)非共价地缀合以使得his-标签嵌入双分子层中,抗原的一个或多个表位暴露在表面上。组合物可以包含本领域已知的佐剂和其它载体。佐剂的示例包括弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、单磷酰脂质A(MPL)、磷酸铝、氢氧化铝、明矾或皂苷。也可以使用其它载体如润湿剂、乳化剂、填料等。
可以将各种各样的货物装载到本公开的脂质体或其它结构中。利用近红外光可以将货物递送到所需位置。例如,生物活性或治疗药剂,药用物质或药物可以被封装在CoPoP脂质体的内部。这包括水溶性药物以及可以通过化学梯度而被装载并浓缩在脂质体的水性芯中的弱酸或弱碱的药物。因此,在多个实施方案中,脂质体包含封装在其中的活性剂,例如治疗剂和/或诊断剂,其可以是化疗剂如阿霉素(多柔比星)。化学治疗剂阿霉素可以通过NIR照射被主动装载和释放,从而利用CoPoP脂质体提供强效且直接的光触发的释放。
在一个实施方案中,脂质与药物(或任何其它货物药剂)的比例为10:1至5:1。在多个实施方案中,脂质与药物/货物比的比例为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1或5:1。用于计算比例的脂质包括所有脂质,包括作为卟啉磷脂缀合物的一部分的磷脂、另外的磷脂或固醇、以及与PEG缀合的脂质(如果存在)。虽然在本公开中有时将货物描述为药物,但是该描述同样适用于用于治疗和/或递送至所需位置的任何药剂,术语“药物”旨在表示任何药剂。所述药剂可以全部或部分地包含在PoP-脂质体内或CoPoP脂质体中,无论是存在于水性隔室、双分子层或两者中。
在一个实施方案中,装载在脂质体或其它载体内的货物是治疗剂。术语“治疗剂”是本领域公认的,并且是指作为生物学、生理学或药理学活性物质的任何化学部分。也称为“药物”的治疗剂的示例在公知的参考文献例如Merck Index、Physicians DeskReference、和Pharmacological Basis of Therapeutics中有所描述,并且它们包括但不限于,药物;维生素;矿物质补充剂;用于治疗、预防、诊断、治愈或减轻疾病或感染(illness)的物质;影响机体结构或功能的物质;或前药,它们被放置在生理环境中后变得具有生物活性或更有活性。可以使用各种形式的治疗剂,它们能够在施用于受试者时从目标组合物被释放到相邻组织或液体中。已知通过主动梯度被装载的药物包括阿霉素、柔红霉素、吉西他滨、表阿霉素、拓扑替康、长春新碱、米托蒽醌、环丙沙星和顺铂。治疗性货物还包括各种抗生素(例如庆大霉素)或其它有效抵抗由细菌、真菌、寄生虫或其它生物引起的感染的药剂。这些药物可以被装载到PoP脂质体中并从PoP脂质体中释放出来。
在一个实施方案中,装载在脂质体中的货物是诊断剂。“诊断”或“诊断剂”是可用于诊断的任何化学部分。例如,诊断剂包括成像剂,诸如,例如含有放射性同位素如铟或锝的成像剂;含有碘或钆的造影剂;酶,诸如,例如辣根过氧化物酶、GFP、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶;荧光物质,诸如,例如铕衍生物;发光物质,诸如,例如N-methylacrydium衍生物等。
货物可以包括多于一种的药剂。例如,货物可以包括诊断性、治疗性、免疫原性和/或成像剂和/或任何其它类型的药剂的组合。相同的药剂可以具有多种功能。例如,试剂可以具有诊断性和治疗性,或者试剂可以具有成像功能和免疫原功能等。
由本公开的分子层形成的结构是血清稳定的。例如,在体外,当在室温下在50%牛血清中孵育24小时时,his-标签与CoPoP双分子层的结合稳定性是稳定的。因此,这些结构在血清或浓缩的或稀释的血清条件下可以是稳定的。
本公开还提供了使用如本文所述的具有双分子层的结构的方法。在一个实施方案中,本公开提供了在宿主中引发免疫应答的方法。该方法包括向个体施用包含具有CoPoP双分子层的结构的组合物,该结构缀合有组氨酸标记的抗原。组合物可以通过任何标准的免疫途径施用,包括皮下、皮内、肌内、肿瘤内或任何其它途径。组合物可以在单次施用中施用或者可以在包括加强注射的多次施用中施用。可以测量抗体滴度以监测免疫反应。
本公开的纳米结构可用于降低针对所需抗原的抗体滴度。例如,如果希望降低免疫原性,则可以使用其中存在含有PS(或其它)的磷脂的纳米结构。可以施用包含这些纳米结构的组合物以降低免疫原性。
一方面,本公开提供了将作为货物含有在脂质体或其它纳米结构中的药剂递送到所需的位置的方法。所述药剂可以全部或部分地包含在CoPoP脂质体内或CoPoP脂质体中,无论是存在于水性隔室、双分子层或两者中。所述方法包括:1)提供组合物,组合物包含具有本公开的双分子层的脂质体或其它结构,组合物任选地包含货物(例如活性剂);2)允许脂质体到达所选择的或所需的目的地;3)在使至少部分的货物从脂质体释放出来的条件下用具有近红外波长的照射对脂质体进行。货物可以替代地或另外地通过使脂质体内化而到达细胞的内部,然后在细胞内过程的作用下释放出货物。
可以用来自功率为50至1000mW/cm2(包括其间mW/cm2级别的所有整数值和之间的范围)的激光器的波长为650至1000nm(包括其间nm级别的所有整数值和之间的范围)的近红外光照射脂质体。在另一个实施方案中,波长为650至800nm,包括其间nm级别的所有整数值及之间的所有范围。可以对脂质体照射长达30分钟或更短时间。在多个实施方案中,体外或体内的脂质体可以照射0.5至30分钟以及其间至小数点后第十位的所有数值。在一个实施方案中,用658nm激光二极管照射脂质体长达10分钟。在其它实施方案中,用665或671nm的波长照射脂质体。可通过在该区域上照射激光可以将红外照射直接递送至所需的区域,或者可以使用光纤探针。在肿瘤的情况下,可以将光纤探针插入肿瘤(即,通过导管或内窥镜装置)以向局部区域提供照射。
一方面,本公开提供了制备包含CoPoP的双分子层的方法。单体PoP可以采用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶将单羧酸卟啉(例如焦脱镁叶绿酸-a)与2-棕榈酰基-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(溶血-C16-PC,Avanti#855675P)在氯仿中以摩尔比为1:1:1:2:2的溶血C16-PC:Pyro:EDC:DMAP通过在室温下过夜搅拌酯化而制备。然后通过硅胶色谱法纯化PoP。CoPoP可以通过在黑暗中使卟啉-磷脂缀合物与摩尔过量(例如,10倍摩尔过量)的钴盐(例如,四水合钴酸(II))在溶剂(例如甲醇)中接触而产生。
在一个实施方案中,本公开提供了用钴-卟啉(例如CoPoP)双分子层或单分子层涂覆纳米颗粒的方法。该方法通常包括用脂质溶液水合纳米颗粒,以将颗粒分散在水中。
为了将货物递送至所需的位置或为了一般施用,可以将包含在合适载体中的脂质体的组合物通过任何合适的途径施用于个体。在一个实施方案中,通过静脉输注施用,使其将进入脉管系统(循环系统)。可以全身施用组合物,或者可以直接施用至供应给特定器官或组织或肿瘤的血液中。当被NIR照射时,PoP脂质体的内容物可以在循环系统内释放出来,然后可以进入周围组织。
在下面的附加项中,描述了本公开的纳米结构、组合物和方法的各种示例:
1、一种纳米结构(例如脂质体),其包含:a)单分子层或双分子层,其中所述单分子层或双分子层包含:i)任选地,磷脂,和ii)卟啉,具有钴与其配位以形成钴-卟啉;和b)任选地,聚组氨酸-标记的呈递分子,其中聚组氨酸标签的至少一部分位于单分子层或双分子层或单分子层的疏水部分中,而聚组氨酸标签的一个或多个组氨酸与钴-卟啉中的钴配位,其中聚组氨酸标记的呈递分子的至少一部分暴露于纳米结构(例如,脂质体)的外部,并且其中在脂质体的情况下,脂质体包围水性隔室。
2、附加项1的纳米结构(例如,脂质体),其中钴卟啉与磷脂缀合以形成钴卟啉-磷脂缀合物。
3、附加项2的纳米结构(例如,脂质体),其中钴卟啉-磷脂缀合物组成了1至25mol%的单分子层或双分子层。
4、附加项3的纳米结构(例如,脂质体),其中钴卟啉-磷脂缀合物组成了5至10mol%的单分子层或双分子层。
5、附加项1至4中任一项的纳米结构(例如,脂质体),其中双分子层还包含固醇(例如胆固醇)。
6、附加项1至4中任一项的纳米结构(例如,脂质体),其中所述双分子层还包含磷脂酰丝氨酸和,任选地,胆固醇。
7、如附加项1至4中任一项的纳米结构(例如,脂质体),其中聚组氨酸-标签包含6至10个组氨酸残基。
8、附加项1至4中任一项的纳米结构(例如,脂质体),其中脂质体的尺寸为50nm至200nm。
9、附加项1至4中任一项的纳米结构(例如,脂质体),其中纳米结构(例如,脂质体)包含货物,并且在脂质体的情况下,所述货物的至少一部分位于脂质体的水性隔室中。
10、前述任一项附加项的纳米结构(例如,脂质体),其中呈递分子是4至50个氨基酸的肽,所述数目的氨基酸不包括his-标签的组氨酸。
11、前述任一项附加项的纳米结构(例如,脂质体),其中呈递分子是4至500kDa的蛋白质。
12、前述任一项附加项的纳米结构(例如,脂质体),其中呈递分子是抗原分子,并且单分子层或双分子层还包含掺入其中的佐剂。
13、附加项12的纳米结构(例如,脂质体),其中佐剂是弱化的脂质A衍生物。
14、附加项13的纳米结构(例如脂质体),其中弱化的脂质A衍生物是单磷酰脂质A或3-脱酰单磷酰脂质A。
15、一种纳米结构,包括:a)芯;和b)所述芯上的单分子层或双分子层,其中单分子层或双分子层包括:i)任选地,磷脂单体,和ii)卟啉,具有钴与其配位以形成钴-卟啉(例如CoPoP);和c)任选地,聚组氨酸-标记的呈递分子,其中聚组氨酸标签的至少一部分位于单分子层或双分子层的疏水部分中,而聚组氨酸标签的一个或多个组氨酸与钴-卟啉中的钴配位,而聚组氨酸-标记的呈递分子的至少一部分暴露在纳米结构的外部。
16、附加项15的纳米结构,其中芯是金纳米颗粒。
17、一种靶向递送货物的方法,包括:a)向个体施用包含在药物载体中的附加项9至16中任一项的纳米结构(例如,脂质体)的组合物或附加项9至16中任一项的纳米结构(例如,脂质体)的组合;和b)在合适的时间段之后,允许纳米结构(例如,脂质体)到达个体中的所需位置,将脂质体暴露于波长为650至1000nm的近红外照射,以实现货物从脂质体的释放。
18、附加项17的方法,其中个体是人或非人的动物。
19、一种用于在宿主个体中产生免疫应答的方法,包括向所述个体施用包含在药物载体中的附加项1至16中任一项的纳米结构(例如,脂质体)的组合物或附加项1至16中任一项纳米结构(例如,脂质体)的组合,其中呈递分子包含免疫原性表位。
20、附加项19的方法,其中呈递分子是来源于病原微生物的肽、多肽或蛋白质。
21、附加项19或20中任一项的方法,其中个体是人或非人动物。
提供以下示例以说明本公开。它们并不以任何方式进行限制。
示例1
本示例描述了具有组氨酸-标记的配体和抗原的钴卟啉-磷脂(CoPoP)双分子层的合成和功能化。
材料和方法。除非另有说明,材料从Sigma获得。肽从商业渠道获得,其通过HPLC测定纯度并通过质谱确认成分:
表1、肽的性质
对于蛋白质结合,在大肠杆菌(Escherichia coli)中产生重组七组氨酸-标记的雨蛙素-venus融合的报告蛋白(cerulean-venus fusion reporter protein),并如前所述进行纯化和表征。化学计量近似是基于每约100nm脂质体含有80000个脂质的假设。
PoP-脂质、PoP-脂质体和PoP-金的产生。如前所述合成了单体(2H)PoP sn-1-棕榈酰基sn-2-焦脱镁叶绿素磷酰胆碱。通过在黑暗中将100毫克2H-PoP与10倍摩尔过量的乙酸钴(II)四水合物在4毫升甲醇中搅拌17小时来产生CoPoP。通过TLC监测反应完成和产物纯度(>90%纯度)。然后通过旋转蒸发除去溶剂,PoP用氯仿:甲醇:水(1:1.8:1)萃取3次。收集氯仿层,通过旋转蒸发除去溶剂,将产物在20%的叔丁醇水溶液中冷冻干燥,得到81.5mg(77%产率)(用质谱鉴定成分)。利用相同的方法合成其它金属-PoP。对于Ni-PoP,采用乙酸镍(II)四水合物并孵育17小时。对于Zn-PoP,采用脱水乙酸锌(II),并孵育17小时。对于Mn-PoP,采用乙酸锰(II)并孵育30小时。对于Cu-PoP,采用乙酸铜(II),并在四氢呋喃中孵育3小时。
PoP-脂质体以1mg的比例配制。将脂质溶解在试管中的氯仿中后,蒸发溶剂,将膜进一步过夜真空干燥。用1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)将脂质再水化,超声处理,进行10次冷冻-解冻循环,然后用手持式挤出机(Avanti#610000)通过100nm聚碳酸酯膜(VWR#28157-790)挤出。对于蛋白质和肽的结合分析,采用10mol%PoP连同85mol%DOPC(Avanti#850375P)和5mol%PEG-脂质(Avanti#880120P)一起形成脂质体。Ni-NTA脂质体包含10摩尔%的Ni-NTA脂质二油酰-甘油-Ni-NTA(Avanti#790404P)以及10摩尔%2H-PoP。掺入游离Co-卟啉的脂质体包括10摩尔%的Co-焦脱镁叶绿酸与85mol%DOPC和5mol%PEG-脂质。采用含有10mol%二油酰-甘油(Gycero)-NTA(Avanti#790528P)的脂质体制备Co-NTA-脂质体。将脂质体与20mg/mL氯化钴(II)一起孵育2小时,然后在PBS中透析。如所示,装载磺酰罗丹明B的脂质体含有10mol%PoP、35mol%胆固醇(Avanti#700000P)、55mol%DOPC和PEG-脂质。采用磺酰罗丹明B(VWR#89139-502)的溶液来水合脂质膜,然后将其冷冻-解冻,然后进行超声处理。用10mL的Sephadex G-75(VWR#95016-784)柱除去未包埋的染料,然后在PBS中透析。对于双分子层完整性和定量细胞结合的研究,采用50mM染料,而显微镜研究采用10mM染料。
对于金涂覆,采用60nm柠檬酸盐稳定的金纳米球(Ted Pella#15709-20)来水合1mg的由45mol%二硬脂酰磷酸胆碱(Avanti#850365P)、45mol%二硬脂酰磷酸甘油(Avanti#840465X)和10mol%PoP组成的脂质膜。在简短的涡旋和超声处理之后,将样品以1500的相对离心力(rcf)反复离心15分钟。弃去上清液,将沉淀重新悬浮并重新再离心2次。将PoP金重悬于水中用于进一步分析。
多肽结合。将1μg荧光报告蛋白与200μL PBS中的20μg脂质体在96孔板中孵育。利用荧光酶标仪(Tecan Infinite II)定期测定FRET通道中的荧光(激发(ex):430nm,发射(em):525nm)。将数据归一化到不添加脂质体的蛋白质中的FRET信号。采用2.5μg蛋白质与50μg脂质体一起孵育,随后在0.75%琼脂糖凝胶上电泳(50V施加90分钟),并利用具有所示激发和发射滤光片的IVIS Lumina II系统进行成像而进行EMSA实验。对于血清稳定性测试,将3mg蛋白质与40μl PBS中的60mg脂质体预孵育。孵育24小时后,加入40μl FBS并再孵育8h(小时)。对于咪唑置换实验,将1μg报告蛋白与PBS中的20μg脂质体结合。然后滴定咪唑,并利用荧光评估结合。对于血清稳定性,将1μg报告蛋白与100μL PBS中的20μg脂质体结合,然后加入等体积的胎牛血清(VWR#82013-602),并利用荧光监测结合。在500ng肽与20μg脂质体孵育后,采用RGD-His FAM荧光团淬灭评估肽结合。
靶向实验。U-87和MCF-7细胞系是从ATCC获得的,并根据供应商方案进行培养。将2×104个细胞种在96孔板孔中过夜。500ng RGD-His肽与20μg的装载有磺酰罗丹明B的脂质体结合,脂质体与细胞孵育2小时。除去培养基,用PBS洗涤细胞3次,然后用1%Triton X-100溶液裂解细胞和脂质体。通过测量磺酰罗丹明B的荧光来评估脂质体的摄取。
对于共聚焦成像,将104个细胞种在具有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中的Nunc室载玻片(Nunc#155411)中过夜。将20μg脂质体加入含血清的培养基中并孵育2h。除去培养基,用PBS洗涤细胞3次。加入新鲜培养基,利用显微镜用Zeiss LSM 710共焦荧光显微镜成像细胞。金成像以相同的方式进行,但633nm光用于背向散射成像的激发和发射。肽结合后,将金离心以除去任何未结合的RGD肽。
对于体内实验,动物程序是根据布法罗大学机构动物管理和使用委员会(IACUC)的政策和批准进行的。将U87细胞接种到5周龄的雌性无胸腺裸鼠(Jackson Labs)的腹侧上,当肿瘤生长达到4-5mm直径时,对小鼠进行处理。给小鼠静脉注射200μL的用或不用cRGD-his靶向的装载有硫酸罗丹明B的脂质体(1mg/mL脂质)。注射后45分钟,处死小鼠,提取器官,称重,在0.2%Triton X-100溶液中进行机械匀浆,并评估荧光以确定生物学分布。
接种。除非另有说明,否则8周龄的雌性BALB/c小鼠(Harlan Laboratories)在第0天和第14天接受后腹脚垫注射50μL无菌PBS中含有的25μg的MPER肽。如所指出,注射剂还包含在脂质体中的25μg MPL(Avanti#699800P)或TDB(Avanti#890808P),脂质体包含摩尔比为50:30:5:5的DOPC:胆固醇:MPL:PoP。对于弗氏佐剂,将肽直接混合在弗氏完全佐剂(Fisher#PI-77140)中并注射。第一次注射后4周,或如示,从颌下静脉采集血液,血液凝固后在2000rcf下离心15min获得血清并储存于-80℃。
通过ELISA在链霉亲和素包被的96孔板(GBiosciences#130804)中评估抗-MPER滴度。将溶解在100μL含有0.1%吐温20(PBS-T)的PBS中的1μg无His-标签的MPER-生物素在孔中在37℃下孵育2小时。然后将孔用PBS-T洗涤5次,并将小鼠血清在含有0.1%酪蛋白(PBS-C)的PBS中连续稀释,并在37℃下孵育30分钟。孔用PBS-T洗涤5次,然后将100μL的稀释在PBS-C中的山羊抗小鼠IgG-HRP(GenScript#A00160)加入到孔中,以提供含有终浓度为1μg/mL的二抗,并在37℃下孵育30分钟。孔用PBS-T洗涤5次,然后向每个孔中加入100μL四甲基联苯胺底物溶液(Amresco#J644),并在37℃下孵育20分钟。通过100μL 1M HCl终止反应,并在450nm下测量吸收度。滴度被定义为稀释度的倒数,以该稀释度在450nm处的吸光度超过非血清背景的相同稀释度多于0.05吸光度单位。每一个样品都是从一式两份的测量中取平均值。
病毒进入实验。如前所述进行病毒进入实验。简而言之,通过在293T细胞中共转染pHXB2-env和pNL4-3.HSA.R-E-产生HIV-1。转染后2天,将细胞培养基通过0.45μm过滤器并离心。将病毒沉淀物干燥,重悬浮于600μL的PBS中并储存在-80℃。如前所述,HIV-1储存液的感染滴度通过X-Gal染色确定。
合并来自用MPER和CoPoP脂质体免疫的3只小鼠的血清,并利用固定的蛋白G珠(VWR#PI20398)根据供应商方案分离IgG。利用Bradford测定法的吸收度测定浓度。2F5是从无NIH的AIDS试剂程序获得的。在感染前一天将TZM-bl受体细胞以1×104个细胞/孔铺板到96孔板中。HIV(感染的多重性为0.1)与抗体在37℃下孵育30分钟,加入到细胞中,并在25℃下以1000rcf旋转1小时,然后在37℃下在5%的CO2培养箱中进一步培养2天。然后利用CellTiter-Fluor Assay(Promega)根据制造商方案测量细胞活性。然后通过荧光素酶测定系统(ONE-Glo,Promega)根据制造商方案测量病毒进入水平,并将其归一化为只有病毒的样品。数据进一步归一化到细胞活性(所有组显示出对照未处理的细胞的10%内的活性)。
结果
His标记的蛋白质与CoPoP脂质体结合。采用过渡金属Co、Cu、Zn、Ni和Mn生成一系列sn-1-棕榈酰sn-2-焦脱镁叶绿酸磷脂酰胆碱(phosphtatidylcholine)螯合物(图1c)。然后通过挤出到100nm脂质体中,形成具有10摩尔%金属-PoP和85摩尔%二油酰磷酸胆碱(DOPC)和5摩尔%聚乙二醇缀合的二硬脂酰磷酸乙醇胺(PEG-脂质)一起的PoP双分子层。利用荧光蛋白报告物评估与PoP双分子层结合的His-标记的蛋白。如图2a所示,该系统包含由两个连接的荧光蛋白组成的融合蛋白;Cerulean(蓝光发射)和Venus(绿光发射)。由于其连接的邻近和光谱的重叠,Cerulean作为Venus的共振能量转移(FRET)供体,使得Cerulean的激发导致Venus的FRET发射。Cerulean在其C-末端被标记有七组氨酸标签。然而,如果与PoP双分子层结合,来自Cerulean的能量转移被转移到双分子层本身,双分子层在Cerulean发射范围吸收,从而与Venus的FRET竞争。另一方面,由于Venus不直接连接于光激性双分子层,所以当直接激发时不会完全淬灭,因此能够跟踪结合的融合蛋白。
研制了3色电泳迁移变动分析(EMSA)以评估报告融合蛋白与各种PoP脂质体的结合。将2.5μg蛋白质与50μg的各种PoP脂质体孵育24小时,然后进行琼脂糖凝胶电泳。如图2b的顶部图像所示,当对PoP-脂质体成像时,只有游离碱(2H)脂质体可以轻易被可视化,连同Zn-PoP脂质体以较低的程度被可视化。这表明金属对PoP具有淬灭效应,并证实它们在双分子层中稳定地螯合的。如预期的那样,脂质体由于其相对较大的尺寸而表现出最小的电泳迁移。接下来,利用Cerulean激发和Venus发射对相同的凝胶进行成像以探测FRET的抑制,这将表明融合蛋白与PoP脂质体的结合。所有样品均显示出相同量的FRET,并与游离蛋白质迁移了相同的距离,除了用CoPoP脂质体孵育的蛋白质外,这种情况下FRET完全消失(中间图像)。为了验证蛋白质的存在,Venus被直接激发并成像。只有具有CoPoP脂质体才是与脂质体共定位的蛋白质。总之,这些图像证明蛋白质定量结合到CoPoP脂质体。基于解决方案的研究证实了这一发现(图2c)。在检查的所有类型的PoP脂质体中,由于脂质体结合,仅CoPoP脂质体诱导了Cerulean和Venus之间的FRET效率的显著降低。结合需要大约一天才能完全完成,尽管实现50%结合(t1/2)的时间只有3小时。通过2H-PoP双分子层的分子动力学模拟显示,卟啉的中心(其中发生金属配位)对于双分子层周围的水相是不可接近的。因此,这种缓慢的结合可以归因于His-标签,蛋白质的其余部分部分地遮挡了His-标签,以及需要进入庇护的疏水性双分子层。
聚组氨酸与CoPoP的配位。为His-标签与固定化的金属结合基础的机制涉及与组氨酸残基的含氮咪唑基的金属配位。由Ni(II)、Cu(II)、Zn(II)和Mn(II)PoP形成的脂质体与His-标签的结合是不存在的,可能与轴向配体结合亲和力或卟啉内的配位数有关。例如,已经提出,Ni(II)和Cu(II)卟啉螯合物可以与没有轴向配体的4个周围的大环氮原子完全配位。对于Zn(II)和Mn(III)卟啉,配体结合强度可能不足以赋予稳定的聚组氨酸结合。
为了确定CoPoP的电子状态,评估了顺磁性。因为Co(II)是顺磁性的,而Co(III)卟啉是低自旋和反磁性的,所以利用NMR探测由顺磁性物质引起的峰拓宽。如图2d所示,基于PoP中乙烯基的每个碳的氢,仅观察到CoPoP的宽峰拓宽,并且仅在有机溶剂中。当CoPoP形成水性脂质体时,峰变窄,表明氧化成双分子层内的反磁性Co(III)。为了进一步验证这一机理,将还原剂亚硫酸钠定量结合荧光-标记的His-标记的肽后,加入到CoPoP脂质体中。如图2e所示,2M亚硫酸盐诱导了肽从CoPoP脂质体中释放出来。还用商购可得的Ni-NTA脂质形成脂质体。His-标记的肽不像与Ni-NTA脂质体那样亲和地结合。当向体系中加入亚硫酸盐时,没有观察到肽的释放,正如所预计的不容易被还原的Ni(II)那样。总之,这些数据表明CoPoP在形成CoPoP脂质体时从Co(II)转变为Co(III),并且聚组氨酸咪唑基团在双分子层中与PoP中螯合的Co(III)配位。
稳定的His-标签与CoPoP脂质体结合。然后利用荧光报告蛋白来比较His-标记的蛋白质与掺入CoPoP或Ni-NTA-脂质的脂质体的结合(图3a)。Ni-NTA脂质体包括10摩尔%的2H-PoP,以能够基于FRET进行蛋白质结合测定。通过EMSA,在FRET通道和蛋白质通道中,在没有脂质体的情况下孵育蛋白质时或将蛋白质与2H-PoP脂质体一起孵育时蛋白质迁移不受阻碍。当与Ni-NTA脂质体一起孵育时,蛋白质的迁移仅被轻微抑制,表明蛋白质的结合不能承受电泳条件。FRET通道未消除,证实没有与Ni-NTA脂质体的结合。相比之下,当与CoPoP脂质体一起孵育时,蛋白质被稳定结合,其中FRET通道完全消失并且电泳迁移降低(这与仍然结合到脂质体的蛋白质是一致的)。
对于生物医学应用,采用Ni-NTA-脂质的棘手障碍在于其不能在诸如血清的生物培养基中保持稳定的His-标签结合。为了检查脂质体是否能够在血清存在下保持结合,将胎牛血清以1:1的体积比添加到已结合His-标记的蛋白质的脂质体溶液中。如图3b所示,Ni-NTA脂质体没有完全螯合所有蛋白质,这与EMSA结果中显示的弱结合一致。此外,在加入血清之后,所有结合在24小时内消除。在相同条件下,CoPoP脂质体稳定地螯合了His-标记的报告蛋白而没有大量的蛋白质释放。
由于组氨酸侧链包含咪唑基团,所以采用咪唑竞争测定来比较Ni-NTA和CoPoP脂质体与His-标记的多肽的结合稳定性。如图3c所示,即使在接近1M咪唑的浓度下,CoPoP脂质体仍保持与报告蛋白75%以上的结合。这表示比在结合研究中使用的100nm蛋白质浓度超过大约1000万倍的咪唑。相比之下,Ni-NTA脂质体在仅有30mm咪唑的存在下释放超过90%的His-标签。CoPoP脂质体与His标签的显著强烈结合可归因于至少2个因素;Co(III)对咪唑基团的极其稳定配位和限制了竞争性外部分子接近的CoPoP双分子层的保护性疏水环境。
用Ni-NTA-脂质、钴螯合的Co-NTA-脂质和CoPoP分别形成的脂质体都可以结合溶液中的荧光肽(图7a)。然而,在凝胶过滤色谱法中,Co-NTA脂质体的结合和Ni-NTA脂质体的结合不能保持(图7b)。用Co-NTA和Ni-NTA分别形成的脂质体在血清中孵育时释放出肽,而CoPoP形成的脂质体在血清中孵育时并不释放出肽(图7c)。这表明双分子层限制的聚组氨酸结合的意义。接下来我们检测对于血清中的稳定结合是否需要的CoPoP,或者简单的脂质体插入的钴卟啉(Co-pyro)是否是足够的。初始结合后,与血清一起孵育引起多肽从脂质体中转移(图8)。该结果与最近的证据是一致的,最近的证据表明膜插入的卟啉,但不是PoP,与血清成分快速交换并离开脂质体。总之这些结果指出CoPoP的重要作用以稳定地结合His-标记的多肽。
肽与CoPoP脂质体结合
肽靶向引起了用作疾病和组织特异性“邮政编码”的兴趣。在纤连蛋白和玻连蛋白中发现的短RGD三肽是有希望的靶向配体,由于其与肿瘤内皮细胞上表达的整合素αVβ3的有效结合。测定CoPoP脂质体以验证它们是否可以通过具有短线性氨基酸序列GRGDSPKGAGAKG-HHHHHHH(SEQ ID NO:1)的His-标记的配体途径被递送至靶标细胞上的分子受体。在N-末端标记羧基荧光素(FAM),以能够通过FRET检测与PoP-脂质体的结合。已经显示线性RGD肽可以用荧光团标记而不破坏整联蛋白结合。如图4a所示,当这种肽与多种金属-PoP脂质体一起孵育时,只有CoPoP脂质体与肽结合。与蛋白质结合相比,肽结合速度快约五倍。据推测,由于肽的体积更小、分子运动更快、位阻减小,使得肽能够更快速地交错结合到双分子层中以与CoPoP相互作用并与CoPoP不可逆地结合。基于以前的估计,每个约100nm脂质体含有约80,000个脂质,这相当于每个脂质体含有8000个CoPoP和750个肽。由于每个肽含有7个组氨酸残基,所以双分子层中CoPoP与组氨酸的比例为1:0.66。对于His-标签中所有残基的常规His-标签与Ni-NTA的结合,只有第i和i+2或i+5个组氨酸残基被认为参与了与金属配位。CoPoP双分子层中的卟啉和聚组氨酸密度可能较高,因此配位机制可能不同。
测定了His-标签长度对肽与CoPoP脂质体结合的影响。合成了一系列N-末端FAM标记的具有不同长度的连接至C-末端的His标签的肽。如图4b所示,当从肽中没有His标签时,没有观察到肽结合。具有2个组氨酸残基,结合缓慢,结合t1/2接近10小时。随着His标签长度的增加,结合速度迅速增加。具有6个残基,相当于常规的六组氨酸标签,结合t1/2小于1小时。通过将His标签长度增加到10个残基,结合t1/2降低到20分钟。
接下来,改变脂质组成以确定膜流动性对His-标签结合的影响。以90mol%的DSPC、DMPC或DOPC与10mol%CoPoP一起形成脂质体。或者,在双分子层中掺入50mol%的胆固醇,同时相应地减少了所使用的标准脂质的量。DSPC在室温下形成刚性的凝胶相双分子层,而DMPC和DOPC具有较低的转变温度并处于液晶相。胆固醇在双分子层中占据空间,并且可以对膜流动性具有调节作用。有趣的是,没有观察到肽与不同组成(具有或不具有胆固醇)的膜的结合速率存在很大差异(图4c)。肽结合过程可能发生在多步骤过程中,并且肽一旦开始插入双分子层,聚组氨酸的协同作用不受脂质组成的影响。然而,在5mg/mL牛血清白蛋白(BSA)中,在具有和不具有胆固醇的膜之间观察到了显著差异(图4d)。不含胆固醇的脂质体中较慢的结合可能是由于BSA与膜更大的相互作用干扰了肽结合。用50mg/mL的BSA不能实现半数结合时间,血清完全抑制了结合(图9图10)
装载有货物的脂质体的生物靶向。鉴于His标记的肽与脂质体的结合功效,评估双分子层完整性以确定肽结合是否诱导膜不稳定。脂质体的水性芯装载有荧光团磺酰罗丹明B(一种水溶性染料),以自淬灭浓度探测膜透化。如图5a所示,装载有染料的脂质体在肽已经完全与脂质体结合的8小时的时期内不释放大量的染料。在24小时,具有肽结合的CoPoP脂质体释放了少于10%的染料。因此,His-标签插入和结合过程是足够温和且非破坏性的,因此双分子层完整性和包载的货物保持完整。类似的棕榈酰化脂肽在孵育时导致装载有货物的脂质体的透化(图11),进一步证明了His-标签方法的强效性。
接下来,评估RGD-修饰的脂质体是否可以在U87胶质母细胞瘤细胞(RGD-结合)和MCF7乳腺癌细胞(RGD-非结合)的一对成熟细胞系中结合它们的分子靶标。在包载磺酰罗丹明B之后,首先将脂质体与His-标记的RGD肽一起孵育,然后分别与两种细胞系一起孵育。每个脂质体连接约550个肽。对细胞进行洗涤和裂解后(以消除货物自身淬灭的任何影响),通过测定细胞中的荧光来评估脂质体摄取。如图5b所示,在用靶向的CoPoP脂质体孵育的U87细胞中观察到高脂质体摄取,而与MCF7细胞中发生可忽略的结合。如预期的那样,没有RGD靶向配体,在任一细胞系中都不发生摄取。在脂质体制剂中包含PEG-脂质产生出不靶向任一细胞系的脂质体。PEG的存在可能具有阻碍直接连接到双分子层表面的肽的作用。可以通过存在过量游离的RGD肽来抑制结合,证实该方法的靶向特异性。共焦显微镜证实了这些结合结果(图5c)。虽然FAM-标记的肽被PoP脂质体淬灭,但仍有足够的信号来验证靶向肽和脂质体货物的结合。货物和肽均被内化,并共同保留在U87细胞中。将CoPoP脂质体和靶向肽混合后立即与U87细胞孵育时,靶向肽本身与U87细胞结合,但没有时间连接到仍未被靶向的脂质体上。没有结合肽的2H-PoP脂质体中观察到相同的结果。当仅用1摩尔%的CoPoP形成脂质体时保持肽结合(图12a),并保持与U87细胞的选择性结合(图12b)。将孵育有His-标记的cRGD部分的装载有货物的脂质体静脉注射到U87肿瘤荷瘤裸鼠中。如图5d所示,在静脉注射后45分钟,与未靶向的脂质体相比,靶向的脂质体以2.5倍活性积累在肿瘤中。这些数据显示,CoPoP脂质体可以将货物装载在脂质体芯中,可以用His-标记的靶向肽进行标记而不引起货物泄漏,并且可以被引导到在体外和体内表达特异性表面蛋白的细胞上所表达的分子受体上。
脂质体仅代表用于生物医学应用的所有类型的纳米材料的子集。CoPoP被评估为具有对His标签具有选择性粘附的广义的表面涂层。金纳米颗粒用作模型纳米颗粒,因为它们已经用于许多生物应用。采用已建立的方案对金纳米球进行脂质涂覆,采用柠檬酸盐稳定的60nm金分散体来水合PoP-脂质的薄膜。重复离心并重新悬浮后,柠檬酸盐被置换,导致纳米球聚集(图13a)。然而,在PoP-脂质的存在下,纳米球被涂覆并保持分散。与柠檬酸盐稳定的金相比,PoP涂覆的纳米球具有略大的流体动力学尺寸,对应于金上的双分子层涂层(图13b)。His-标签结合后涂层的存在并不影响540nm处金的等离子体峰,证明了配体结合的温和性质(图13c)。如图13d所示,只有RGD-His CoPoP涂覆的金纳米颗粒靶向U87细胞而游离RGD如通过背向散射显微镜所测定的那样抑制结合。单独的CoPoP金,以及具有RGD-His肽的2H-PoP涂覆的金在靶向U87细胞时是无效的。
抗原性脂质体的开发。广泛中和HIV病毒进入的多种单克隆抗体,例如2F5、Z13和4E10,靶向gp41包膜蛋白的近膜外膜区域(MPER)中的保守线性表位,使得MPER成为HIV肽疫苗的主要靶标。然而,它仅在病毒进入期间暴露,并且利用MPER肽产生中和抗体的尝试已经面临挑战。这给出了疫苗接种策略应该考虑抗体与MPER存在于其中的脂质双分子层的相互作用的范例。我们利用含有Toll样受体4(TLR-4)激动剂单磷酰脂质A(MPL)的脂质体与结合MPER肽序列的脂质体组合。然而,利用基于MPER His标签多肽与Ni-NTA脂质体的结合的简单锚定技术产生低抗体滴度。我们着手研究用CoPoP脂质体相同的方法是否可以被增强。
脂质体-肽疫苗接种体系与MPER-His序列NEQELLELDKWASLWNGGKGG-HHHHHHH(SEQID NO:11)一起使用。MPER-His肽与含有MPL的CoPoP脂质体结合。分别向BALB/c小鼠和无胸腺裸鼠施用含有25μg MPER-His和25μg MPL的单次注射。这在BALB/c小鼠和裸鼠中引起了大约104级的滴度,表现出强烈的体液免疫应答(图6a)。这可能是重要的,因为HIV感染辅助性T细胞群体,使B细胞介导的应答变得重要。在加强注射后,无胸腺裸鼠中的抗-MPER滴度不受影响,但在健康小鼠中,滴度增加一个数量级,表明T细胞介导的记忆效应。因此,该疫苗接种方案产生了B细胞和T细胞介导的免疫。
接下来,测定各种疫苗组分以更好地确定免疫应答的特异性(图6b)。当注射MPER-His肽本身、注射在弗氏完全佐剂中的MPER-His肽或将MPER-His肽与包含MPL的2H-PoP脂质体一起注射时,MPER-His肽不引起任何抗体。有趣的是,当将肽与无MPL的CoPoP脂质体一起施用时,不产生任何抗体。另一种脂质佐剂,海藻糖二苯甲酸酯(TDB)也未能引发任何抗体产生。TDB不对TLR-4起作用,这强调了MPL在脂质体疫苗接种体系的免疫激活中的重要性。当采用与Ni-NTA脂质体结合的MPER-His时,与以前的报道一致,实现了小于103的弱抗体滴度。然而,当采用CoPoP脂质体时,观察到强2个数量级的反应。可假定,肽与脂质体的体内稳定结合是直接造成这种影响的原因。CoPoP免疫策略是有效的,抗体滴度持续至少3个月,而用Ni-NTA脂质体在一个月后没有检测到抗体(图6c)。
接种后合并小鼠血清,并利用蛋白G琼脂糖进行纯化以产生纯化的IgG。然后将其用于评估HIV病毒进入的抑制(图6d)。当采用终浓度为0.2mg/mL的来自经过接种小鼠的纯化IgG时,病毒进入被抑制了大于75%。当以2μg/mL但小于和20μg/mL的浓度孵育时,这种抑制作用大于广泛中和的单克隆抗体2F5的功效。这些数据显示了利用CoPoP脂质体与来源于HIV的肽的接种方法的潜力,以便诱导能够预防病毒进入的抗体产生。
示例2
在该示例中,开发了利用his-标记的Pfs25(来源于恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)的重组蛋白)以及含有CoPoP和MPLA的脂质体的疫苗。
脂质体制备。为了产生CoPoP脂质体和2H-PoP脂质体,将1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、胆固醇(CHOL)、单磷酰脂质A(MPLA)和CoPoP(或2H-PoP)以指定的摩尔比(表2)溶于氯仿。在N2流和真空过夜后形成干燥的脂质膜,并在PBS中再水化至3mg/mL的最终脂质浓度。利用冰冷的CO2/丙酮和水浴使脂质体悬浮液进行11次冷冻/融化循环,然后在60℃下通过200nm聚碳酸酯膜挤出10次。
将Psf25昆虫蛋白(从超级sf9细胞纯化出的重组亚基Pfs25,通过BCA测定法测定的浓度为1mg/mL)与脂质体合并在一起在4℃过夜(20小时)。在H2O中孵育的Psf25用作对照。BSA与脂质体合并作为阴性对照。通过微离心过滤法测定Psf25蛋白和脂质体的结合。
表2、每只小鼠注射的Psf25CoPoP/MPLA脂质体的配方
用于结合的微离心过滤。将具有CoPoP的Psf25蛋白、具有标准PoP(无钴)的Psf25蛋白和具有水的Psf25蛋白置于纳米离心装置(100K,OMEGA)中。将装置用QH2O冲洗,并在使用前以1100rpm离心3分钟。加入每个样品并以1400rpm旋转3分钟。将装置用QH2O洗涤两次,并以1400rpm离心3分钟(分钟)。收集底部滤液的样品,通过BCA测定测量在562nm处的吸光度(Thermo cat.23235)分析蛋白质浓度。
接种。在第0天和第21天,CD-1小鼠(8周雌性,Envigo)接受5、0.5和0.05μg Psf25蛋白的肌内注射(i.m.)。其中指出,注射还包括掺入脂质体(Avanti No.699800P)的20μgMPLA。ISA720也用作与5μg Psf25蛋白一起孵育的佐剂。治疗组和流程图如表3所示。
表3、用于血清IgG滴度的治疗组(每组n=10只小鼠)。
CoPoP/MPLA | Psf25(μg) | ISA720 | |
组1(G1) | + | 5 | - |
组2(G2) | + | 0.5 | - |
组3(G3) | + | 0.05 | - |
组4(G4) | + | 0 | - |
组5(G5) | - | 5 | - |
组6(G6) | - | 5 | + |
通过ELISA的血清抗Psf25IgG水平。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)在96孔板(Thermo,Maxisorp)中评估抗Psf25滴度。将在100μL涂覆缓冲液(3.03g Na2CO3和6.0gNaHCO3/1L蒸馏水,pH 9.6)中的His-标记的Psf25(0.1μg)在孔中在4℃下过夜孵育。用含有0.1%吐温(PBS-T)的PBS洗涤孔3次,用含有0.1%酪蛋白(PBS-C)的PBS封闭,然后孵育2小时。洗涤孔,然后用PBS-T洗涤3次,并将山羊抗小鼠IgG-HRP(GenScript No.A00160)在PBS-C中稀释至1μg/ml,并加入每个孔中。在加入四甲基联苯胺(Amresco No.J644)之前,用PBS-T再次洗涤孔6次。
结果。
Psf25蛋白涂覆后脂质体与蛋白质结合能力的表征。通过动态光散射测量出Psf25蛋白结合之前和之后CoPoP脂质体的平均尺寸分别为122.9和139nm(图14A),其中多分散性指数相似为约0.05,显示出结合后的有利的脂质体尺寸具有高度单分散性。此外,为了研究Psf25蛋白是否有效且特异地与CoPoP脂质体结合,我们将Pfs25与CoPoP脂质体或2H-PoP脂质体在4℃过夜孵育,然后进行微离心过滤以确定蛋白质与脂质体的结合。基于通过BCA测定检测的滤液中Pfs25的量,大部分Psf25与CoPoP脂质体(99.27%)结合而不与2H-Pop脂质体(12.33%)结合。Pfs25与CoPoP脂质体的结合为约99%(图14A)。
抗Pfs25 IgG水平。
在第0天(预致敏)和第21天(加强)通过肌肉注射(i.m.)给CD-1小鼠接种缀合有或未缀合Psf25(浓度为5、0.5和0.05μg)的CoPoP/MPLA/Pfs25脂质体、或接种游离的Psf25(含有或不含有ISA70)。在第20天和第42天,收集血清,通过ELISA测定抗Psf25IgG滴度(图15A和图15B)。用CoPoP/MPLA/Psf25脂质体加强前的小鼠在缀合有5μg和0.5μg Psf25的处理组显示出相似的血清IgG水平。不同稀释度(从1/1000开始)的抗Psf25IgG-血清样品通过Psf25(植物)ELISA对每个处理组的(表3)进行测试。这里,截止点设定为O.D.等于0.5。数据显示,在加强后的G1和G2(代表缀合有5或0.5μg Psf25蛋白的CoPoP/MPLA/Pfs25脂质体)中,IgG滴度从1/5000变为1/45000(表3)。另一方面,在加强后,缀合有0.05μg Psf25蛋白质的CoPoP/MPLA/Pfs25脂质体的IgG滴度从1/1000转换为1/15000,与代表与ISA70孵育的5μgPsf25蛋白质的G6中显示相似的结果。该数据也反映在图16中,其显示了在CoPoP/MPLA脂质体中0.05μg Pfs25的滴度产生比在ISA720中的5μg Pfs25的滴度更高的滴度。
示例3
在该示例中,开发了利用含有重复NANP序列的合成的his-标记的肽制成的脂质体疫苗,所述重复NANP序列来源于恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的环子孢子蛋白。脂质体具有与示例1相同的组成,但使用肽代替蛋白质。测定的肽显示在图17A中。通过动态光散射测量出在不同NANP结合之前和之后CoPoP脂质体的平均尺寸分别为122.9和139nm(图17B),其中多分散性指数相似为约0.05,显示出结合后的有利的脂质体尺寸具有高度单分散性。此外,为了研究NANP肽是否有效且特异地与CoPoP脂质体结合,我们将NANP肽与CoPoP脂质体或2H-PoP脂质体在4℃下过夜孵育,然后进行微离心过滤以确定肽与脂质体的结合。基于通过BCA测定检测的滤液中的肽的量,大量的NANP与CoPoP脂质体(约80%不同长度的肽)结合,而不与2H-Pop脂质体(小于20%)结合。在所有不同长度的肽中,NANP与CoPoP脂质体的结合约为80%。(图17C)
示例4
在该示例中,利用含有磷脂酰丝氨酸(PS)的CoPoP脂质体来减少对his-标记的呈递分子的抗体应答。利用10:30:30:30的CoPoP:磷脂酰丝氨酸:DOPC:胆固醇通过薄膜水合和挤出形成脂质体。然后将his-标记的MPER与脂质体结合。在用MPER装饰的CoPoP/MPLA脂质体接种前4周和2周,通过脚垫将这些PS脂质体注射到小鼠中。如图18所示,用PS脂质体预处理导致抗-MPER的IgG滴度降低。
示例5
在该示例中,通过his-标记的细胞穿透肽将CoPoP脂质体靶向细胞。获得以下his-标记的细胞穿透肽:HHHHHHHGRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:13)(TAT肽);HHHHHHRRRRRRRR(SEQID NO:14)(R8肽);HHHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:15)(PEN肽)。如图19所示,与含有[2:5:30:63]的[PoP:CoP:CHOL:DMPC]的CoPoP脂质体进行简单水性孵育后,这些脂质体可以在与U87细胞孵育1小时后结合并被摄取。
虽然已经通过具体实施方案描述了本公开,但是常规修改对于本领域技术人员将是显而易见的,并且这样的修改旨在在本公开的范围内。
Claims (19)
1.一种脂质体,包含:
a)双分子层,其中所述双分子层包含:
i)磷脂,和
ii)卟啉,具有钴与其配位以形成钴-卟啉,其中所述钴卟啉与磷脂缀合以形成钴卟啉-磷脂缀合物;和
b)聚组氨酸标记的呈递分子,其中聚组氨酸标签的至少一部分位于所述双分子层的疏水部分中,而所述聚组氨酸标签的一个或多个组氨酸与所述钴-卟啉中的所述钴配位,
其中所述聚组氨酸标记的呈递分子的至少一部分暴露于所述脂质体的外部,并且其中所述脂质体包围水性隔室,所述钴卟啉-磷脂缀合物组成0.1至10mol%的所述双分子层。
2.如权利要求1所述的脂质体,其中所述双分子层还包含胆固醇。
3.如权利要求1所述的脂质体,其中所述双分子层还包含磷脂酰丝氨酸和,任选地,胆固醇。
4.如权利要求1所述的脂质体,其中所述聚组氨酸标签包含6至10个组氨酸残基。
5.如权利要求1所述的脂质体,其中所述脂质体的尺寸为30nm至250nm。
6.如权利要求1所述的脂质体,其中所述脂质体包含货物。
7.如权利要求1所述的脂质体,其中所述呈递分子是2至50个氨基酸的肽,所述数目的氨基酸不包括所述聚组氨酸标签的所述组氨酸。
8.如权利要求1所述的脂质体,其中所述呈递分子是具有50至1000个氨基酸的多肽。
9.如权利要求1所述的脂质体,其中所述呈递分子是抗原分子,并且所述双分子层还包含掺入其中的佐剂。
10.如权利要求9所述的脂质体,其中所述佐剂是弱化的脂质A衍生物。
11.如权利要求10所述的脂质体,其中所述弱化的脂质A衍生物是单磷酰脂质A或3-脱酰单磷酰脂质A。
12.一种纳米结构,包括:
a)芯;和
b)在所述芯上的双分子层,其中所述双分子层包含:
i)磷脂单体,和
ii)卟啉,具有钴与其配位以形成钴-卟啉,其中所述钴卟啉与磷脂缀合以形成钴卟啉-磷脂缀合物;和
c)聚组氨酸标记的呈递分子,其中聚组氨酸标签的至少一部分位于所述双分子层的疏水部分中,所述聚组氨酸标签的一个或多个组氨酸与所述钴-卟啉中的所述钴配位,而所述聚组氨酸标记的呈递分子的至少一部分暴露于所述纳米结构的外部并且其中所述纳米结构包围水性隔室,所述钴卟啉-磷脂缀合物组成0.1至10mol%的所述双分子层。
13.如权利要求12所述的纳米结构,其中所述芯是金纳米颗粒。
14.权利要求1至11中任一项所述的脂质体在制备药物中的用途,其中所述药物用于靶向递送货物,包括:
a)向个体施用包含在药物载体中的所述脂质体的组合物;
b)在合适的时间段之后,允许所述脂质体到达所述个体中的所需位置,将所述脂质体暴露于650-1000nm波长的近红外照射,以实现货物从脂质体的释放。
15.如权利要求14所述的用途,其中所述个体是人或非人动物。
16.权利要求1至11中任一项所述的脂质体在制备药物中的用途,其中所述药物用于在宿主个体中产生免疫应答,包括向所述个体施用包含在药物载体中的所述脂质体的组合物,其中所述呈递分子包含免疫原性表位。
17.如权利要求16所述的用途,其中所述呈递分子是来源于病原微生物的肽或蛋白质。
18.如权利要求16所述的用途,其中所述呈递分子是来源于病原微生物的多肽。
19.如权利要求17或18所述的用途,其中所述个体是人或非人动物。
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