WO2014042450A1 - 표적지향형 난용성 약물 전달체 - Google Patents

표적지향형 난용성 약물 전달체 Download PDF

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poorly soluble
soluble drug
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drug carrier
taxol
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박근칠
김진호
김영욱
배기현
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    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides

Definitions

  • the present invention relates to a poorly soluble drug carrier, a method for preparing the same, a method for delivering a poorly soluble drug using the same, and a pharmaceutical composition comprising the same as an active ingredient.
  • Radiation therapy is a method of irradiating cancer cells with X-rays or rays, and the emitted rays may be used in areas where surgery is difficult to operate or in cancer cells that are particularly good at radiation, or may be used before or after surgery.
  • drug treatment employs a method of destroying DNA or enzymes necessary for the proliferation of cancer cells by administering cytotoxic drugs orally or by injection.
  • the advantages of drug therapy over surgical or radiotherapy are that it can reach the drug and treat the metastasized cancer no matter where the cancer is invented in any part of the body. It is widely used as a standard therapy for cancer treatment.
  • drug therapies are not able to cure cancers, but they play an important role in relieving symptoms, improving the quality of life of patients and extending their lifespan.
  • doxorubicin In general, in the case of drug treatment, to date, doxorubicin, Cisplatin. Chemotherapy with poorly soluble drugs such as taxol and 5-fluorouracil is widely used, but is limited to administration. Because these drugs are poorly soluble, they can cause severe pain to patients even when administered in amounts that are curable. It is brought, and due to excessive side effects can not be administered a large amount. The cause of this side effect is due to the non-selectivity of the anticancer drugs, the anticancer drugs do not act only on the cancer cells, but also on the normal cells do not kill the cancer cells only, and the growth of the normal cells, the patient feels severe pain.
  • the same carrier is prepared and used to deliver a poorly soluble anticancer agent.
  • an anticancer agent is added to allow the anticancer agent to be contained in the carrier.
  • solid lipid nanoparticles which are similar to Low Density Lipoprotein (LDL), which implement a natural carrier that does not trigger immune response, are anti-cancer delivery agents.
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • the low density lipoprotein (LDL) is involved in the transport of lipids and proteins, specifically, the delivery of cholester to the extrahepatic tissue throughout the systemic circulation.
  • non-hydrophilic drugs such as cyclosporin A and amphotericin B lipid complexitis (ABLC) have been effectively delivered by binding to LDL during pre-clinical or clinical treatment.
  • LDL low density lipoprotein
  • the present invention is to solve the problems of the prior art as described above. It is an object of the present invention to mimic the components of naturally occurring low density lipoproteins to reconstruct surface modifications.
  • Low Density Lipoprotein (LDL) -like nanoparticles prepared by binding a labeled antibody to the surface; A complex comprising the LD-like nanoparticles and a poorly soluble drug; By using the complex, it is to provide a target-oriented poorly soluble drug carrier, and a method of washing them, which have improved apoptosis efficiency and stability and reduced toxicity.
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • the objective is to provide a complex comprising LDL-like nanoparticles and poorly soluble drugs that, unlike micelles and liposomes, do not trigger an immune response; Apoptosis efficiency and stability using the complex is improved and toxicity is reduced. It is to provide a target-oriented poorly soluble drug carrier, and a method for producing the same containing poorly soluble drugs.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for delivering a target-oriented poorly soluble drug using the LDL-like nanoparticles, which has improved apoptosis efficiency and stability and reduced toxicity.
  • Figure 1 shows a schematic diagram representing the synthesis process and configuration of poorly soluble drug delivery vehicle.
  • Figure 3 shows a graph measuring the volume of cancer tissue over time according to Examples 2-4 and methods, in order to confirm the cancer treatment effect (lung cancer) of the poorly soluble drug delivery vehicle (arrow in the drawing is a drug injection Point of view).
  • Figure 4 shows a graph measuring the volume of cancer tissue over time according to the method of Example 3-4, in order to confirm the cancer treatment effect (breast cancer) of the poorly soluble drug delivery vehicle (arrow in the drawing is a drug injection Indicates a time point).
  • Figure 5 shows the MTT assay according to Example 4-2 in the ' NCI-H1975 cell line.
  • Figure 6 shows the MTT assay according to Example 4-3 in the SK-BR-3 cell line.
  • Figure 8 shows the evaluation of the delivery effect in the SK-BR-3 cell line according to Example 5-6 (FACS analysis).
  • Figure 9 is a graphical representation of the volume of cancer tissue in accordance with the concentration of the taxol containing SLN-PEG (derivative) -cetuximab injected (arrows in the drawing indicate the time of drug injection)
  • Figure 10 is taxol containing shows the comparative antitumor activity of PM in a graph (the arrow in the figure indicates the time when the injection of the drug) - SLN-PEG (derivative) and -cetuximab Genexol ®.
  • LDL Low Density Lipoprotein
  • the naturally occurring low density lipoprotein is composed of two lipid phases, namely, a surface lipid portion composed of phospholipids and apolipoproteins and a core lipid portion composed of cholesterol esters and triglycerides, and the composition thereof is shown in Table 1 below.
  • Phospholipids and apolipoproteins of the surface lipids emulsify the non-lipid lipids composed of ester and triglycerides, the core lipid cholesterol, to provide surface stability and thus form stable biological microemulsions.
  • low-density lipoproteins that are natural in the blood Low Density Lipoprotein, The method of isolating LDL is too complicated and time consuming, so the LDL mimetic delivery vehicle was developed from cholesterol esters and phospholipids instead of containing apolipoproteins.
  • a carrier that mimics the structure and composition of such a natural carrier can be developed as a carrier that delivers drugs in vivo because it does not trigger an immune response unlike micelles and liposomes.
  • the present inventors have found that the inclusion in the I LDL- similar solid nanoparticles and the inner core lipid portion in a manner to selectively target the delivery system comprising a poorly soluble anticancer agent I, for poorly soluble drugs, for example in cancer cells, "delivery system to the surface of the carrier It was confirmed that the poorly soluble anticancer agent was delivered to the cancer cells by binding the polymer to increase the retention time of the body and binding the targeting antibody to the polymer attached to the surface of the carrier.
  • the present invention relates to a core lipid part containing cholesteryl ester and triglyceride; Surface lipids containing phospholipids, cholesterol and cationic lipids; A polymer linker connected to the surface lipid part; And LDL-like solid nanoparticles comprising a target oriented material linked with the polymer linker.
  • the present invention also provides a target-oriented drug delivery vehicle containing a complex comprising a poorly soluble drug encapsulated in the core lipid portion of the LDL-like solid nanoparticles.
  • the ability of the drug carrier to remain in the blood for some time without being removed is essential. Therefore, the size and surface properties of the drug carriers administered are important.
  • the surface of the drug carrier is ionic or hydrophobic, it is trapped and removed by macrophages located in the reticulo-enclothelial system in the liver or spleen. More specifically, the surface of the drug carrier is ionic or hydrophobic.
  • plasma proteins such as fibrcmectin, complements, IgG, and the like are adsorbed by electrostatic attraction and recognized by macrophages of the reticuloendothelial system, resulting in drug delivery. It is therefore desirable to make the surface of poorly soluble drug carriers thick or near to escape from such macrophages.
  • the size of the poorly soluble drug delivery vehicle may be 30 to 300 nm, preferably 150 to 250 nm to more effectively deliver the drug to the target tumor tissue. If the size of the drug carrier is too small, it can pass through normal blood vessels, allowing the drug to be delivered to normal tissues rather than tumor tissue, and the amount of drug payload enclosed inside the drug carrier is insufficient. Larger cells are trapped and removed by macrophages located in the reticulo ⁇ endothelial system in the body's circulation and in the spleen.
  • the complex comprising the LDL-like nanoparticles and poorly soluble drug is based on the total weight of the total complex cholesteryl ester is 20 to 60 weight triglycerides 0.1 to 10 weight 9 &; 5-30% phospholipids; Cholester may contain from 10 to 50% by weight of 3 to 20% by weight cationic lipids and from 10 to 20% by weight of poorly soluble drugs.
  • poorly soluble drugs preferably 24 to 28% by weight of cholesteryl ester, 1 to 3% by weight of triglyceride, 14 to 18% by weight of phospholipid 3 to 7% by weight of cholesteric lipid 30 to 35% by weight And poorly soluble drugs to 14 to 18% by weight.
  • the cholesteryl ester applicable to this invention is cholesterol and carbon number It may be an ester compound of 10 to 24 unsaturated fatty acids.
  • Triglycerides applicable to the present invention include triacetin, tributyrin, tricaproin, tricaprylin, tricaprin, and triolein. It may be one or more selected from the group consisting of.
  • Phospholipids applicable to the present invention include dioleoylphosphatidylethane (DOPE),
  • POP palmitololeoylphosphatidylcholine
  • EPC phosphatidylcholine
  • DvSPC disoylylphosphatidylcholine
  • DOPG DPPCidipalmitoylphosphatidylcholine
  • Cationic lipids applicable to the present invention include 3beta- [ ⁇ - ( ⁇ ', ⁇ ', ⁇ '-trimethylaminoethane) carbamoyl] cholester (TC —cholesterol), 3beta [ ⁇ - ( ⁇ ', ⁇ '-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol (DC-cholesterol), 3beta [N- (N 1 —monomethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol (MC-cholesterol), 3beta [ N
  • Octadidieneoxy) propane CpLinDMA
  • DMOBA ⁇ , ⁇ -dimethyl-3,4-dioleoyloxybenzylamine
  • DOcarbDAP 1,2— ⁇ , ⁇ '-dioleoylcarbamyl-3-dimethylaminopropane
  • 1,2-Diacyl-3 trimes At least one selected from the group consisting of thiammonium-propane (TAP) and 1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane (DAP).
  • TEP thiammonium-propane
  • DAP 1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane
  • the polymer linker applicable to the present invention is polyethylene glycol (PEG), PLACpolylactic acid (PGA), polyglycolic acid (PGA), polyester, polyorthoester, polyanhydride, ' peptide, ⁇ PHA (polyhydroxyalkanoate), PCL (polycaprolactone), Polyalkyl ⁇ "bonate, albumin, gelatin, collagen, fibrin, alginic acid, chitin. Chitosan, dextran, hyaluronic acid, starch and derivatives thereof may be at least one selected from derivatives.
  • An atom refers to a compound in which a specific atomic group is replaced by another atom or atomic group.
  • the polymer linker may include a functional group capable of binding to the surface lipid portion of the nanoparticles at one end and a deductor capable of binding to a targeting antibody at the other end.
  • the polymer linker is formed on the surface lipid portion of the nanoparticle at one end .
  • -NHs succinimide groups
  • —CH0 aldehyde groups
  • -COOH carboxyl groups
  • -SH thiol
  • the polymer linker may be PEG or derivatives thereof. If the molecular weight of the PEG or its derivatives is less than 500, there is a problem that the PEG derivative is oxidized to a toxic compound by alcohol dihydrogenase in the body, and if it exceeds 50.000, there may be a manufacturing problem, so 500 to 50,0 ⁇ ⁇ It could be the molecular weight of Preferably from 2.000 to 20,000. Specific examples of the PEG derivative may be a compound having the formula (1).
  • n is 4 to 1, 130, preferably an integer of 38 to 447.
  • the polyethyl3 ⁇ 43 ⁇ 4glycol derivative is formed by an amide bond formed between the cationic amine (_NH 2 ) present on the surface lipid portion of the nanoparticle and NHS present at one end of the polymer linker. Is bonded to the surface.
  • the other end of the polymer linker that is, the maleimide group present at the outer end of the polymer linker, -CO is "! (Carboxyl group) or -SH (thiol group) and -SH (thiol group) present in the targeting antibody
  • the targeting antibody is bound to the surface of the nanobib by a chemical bond formed therebetween /
  • the target directing material is bevacizumab, erlotinih, gefitinib, Metytinib mesylate, cetuximab. May be one or more selected from the group consisting of rituximab, trastzumab, folate, and RGD
  • the poorly soluble drug is poorly soluble anticancer agent.
  • Anti-viral agents Scotland, steroid-based anti-inflammatory agents (steroidal anti-inflammatory drugs), antibiotics, antifungal agents eu vitamin. Prostacyclin, antimetabolic agents, mitotics.
  • Adrenaline antagonist anticonvulsant, anti-ophthalmic. Thermostatic, antidepressant.
  • Anesthetics "eu analgesics, anabolic steroids, be at least one member selected from the group consisting of immunosuppressants and immunostimulants, and the poorly water-soluble anticancer agent is taxol (Taxol), Aida ruby Shin (idarubicin), US toksan fluorocarbon (mitoxantrone) , Paclitaxel, docetaxel, mesotrexate, trimetrexate, thioguanine,.
  • the present invention is the step of preparing a complex of poorly soluble drug-encapsulated nanoparticles by dissolving cholesteryl ester, triglyceride, phospholipid, cholester, cationic lipids and poorly soluble drugs in an organic solvent and then adding water ; Binding a polymer linker to an amide bond on the surface of the complex; And it provides a method for producing a complex of nanoparticles are drug-enclosed inside the core lipid portion comprising the step of binding a targeting antibody to the polymer linker.
  • the organic solvent may be a hydrophobic and / or hydrophilic solvent, the hydrophobic solvent may include chloroform, cyclonucleic acid, and the like, and the hydrophilic solvent may include ethane and methanol.
  • An organic solvent in which a hydrophilic or hydrophobic organic solvent alone or a hydrophilic and hydrophobic solvent is mixed at a predetermined ratio may be used, but is not limited thereto.
  • the organic solvent is used to dissolve lipid components used in the synthesis of nanoparticles. After that, water is added to the nanoparticles (O / W emultion), which exhibits ambivalent nature on the surface by self-exploration of the lipid components.
  • the condition that the organic solvent is removed is characterized in that at the temperature above the melting point of the cholesteryl ester in addition to the evaporation at a temperature above the boiling point of the organic solvent, which is the cholesterol ester at a temperature above the melting point Since the phase transition from solid to liquid forms, the organic solvent existing inside the nanoparticles can be easily diffused to the outside of the nanoparticles to facilitate removal of the organic solvent inside the nanoparticles, thereby making the core part of the nanoparticles stable. to be.
  • cholesterolate having a melting point of 52 ° C is a liquid form above the melting point, so when the organic solvent is removed at a temperature of 52 ° C or higher during the preparation of the nanoparticles, the organic solvent present in the core portion of the liquid is nano Removed to the outside of the particles, then vaporized and at the same time liquid Stable nanoparticles are made by reassembling the core of the nanoparticles once again by using the fluidity of cholesterol acrylate.
  • the boiling point of the organic solvent should be higher than the melting point of the ester and the boiling point of water.
  • the melting point of the cholesteryl oleate taking into account that the 52 ° C
  • the potential nanoparticle surface charges are neutralized and the possibility of being trapped by macrophages is reduced, and the body ' circulation time is increased. The chance of delivering the drug to the tissue is increased.
  • the molar ratio of the cationic amine group (-NH 2 ) included in the cationic lipid of the surface lipid portion and the functional group contained in the polymer linker may be 1: 1 to 1: 5, preferably 1: 1 to 3.5, For example, 1: 2, 1: 1.5, or 1: 3. Specific examples may be banung banung in addition to water so as to correspond to the cationic amine expected PEG eu wherein the molar ratio of functional groups NHS span "of. As many cationic amine groups as possible, the surface charges of the nanoparticles that can bind to the functional groups of the polymer ' linker can approach zero. If the functional group capable of bonding to the amine group is a polymer linker including one in one molecule, the molar ratio of the functional group contained in the polymer linker may be a molar ratio of the polymer linker.
  • the targeting antibody binds to the nanoparticles by a chemical bond formed between the functional group present at the baccal end of the polymer linker and the thiol group of the targeting antibody.
  • the target directing material is bound to the surface of the nanoparticles by a chemical bond formed between the maleimide group present at the other end of the polyethylene glycol derivative of Formula 1 and the thiol group present in the targeting antibody.
  • the ratio of the semi-molar molar ratio of the functional group of the polymerizable linker to the functional group of the polymer linker is 1: 1 to 1:10, preferably 1: 2 to 1: 7, for example 1: 3, 1: 3.5, 1: 4.
  • the molar ratio of the target-directed material to the polyethylene glycol derivative as much as possible ' the surface charge can be close to zero.
  • Surface charge has the technical advantage of being able to actively regulate the number of molecules of the targeting antibody that binds to the maleimide group present at the outer end of the polyethylene glycol derivative.
  • the molar ratio may be a mole ratio of the polymer link and the target directing material added, respectively. .
  • the poorly soluble drug carrier developed by the present invention can actively control a variety of target-oriented materials that bind to the polymer linker according to the antigen overexpressed in cancer cells.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition containing a poorly soluble drug carrier as an active ingredient.
  • the: poorly soluble drug carrier may be a pharmaceutical composition included in the range of 20 to 200mg / kg.
  • the pharmaceutical composition may be administered to a mammal including a human by various routes including parenteral administration.
  • the parenteral administration may be applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically.
  • Intravenous admintration (IV) is used because the only route of drug delivery to the tissues is by blood vessels. The dosage varies depending on the patient's condition and weight, extent of disease, type of drug, route of administration, and time of day. It may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • diluents such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, etc. that are commonly used or It is prepared using excipients.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories, and the like.
  • Non-aqueous solvent As the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate and the like can be used.
  • the suppository bases are witepsol and macrogol. Tween 61. Cacao butter, laurin butter, glycerol, gelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment.
  • the effective dose level depends on the type of disease, severity, drug activity, drug sensitivity, time of administration, route of administration and rate of administration, duration of treatment, factors including concurrent medications, and other factors well known in the medical field. Can be determined.
  • the pharmaceutical composition of the present invention, administration to an individual therapeutic agent or can be administered in combination with other therapeutic agents, and with conventional therapeutic agents may be administered simultaneously or sequentially, and may be single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be readily determined by one skilled in the art.
  • the effective amount of the compound according to the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and in general, 0.1 to 100 poorly soluble drugs per kg of body weight.
  • 0.5 to 10 mg of poorly soluble drug may be administered daily or every other day or divided into 1 to 3 times a day.
  • the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the poorly soluble drug carrier of the present invention When the poorly soluble drug carrier of the present invention is injected in vivo, the polymer and the target-directed material combined on the surface of the poorly soluble drug carrier showed an increase in the expansion of the poorly soluble drug carrier to cancer cells, and the poorly soluble drug carrier Because the poorly soluble drug was encapsulated in a stable and high efficiency, the drug delivered to the cancer cells by the poorly soluble drug carrier showed excellent cancer cell killing effect.
  • it is possible to bind to the surface of the poorly soluble drug carrier by varying the type of cancer cell target-directing material that can specifically react with the antigen overexpressed in cancer cells, and the type of poorly soluble drug encapsulated inside There is an advantage that can be variously adjusted according to the type and treatment purpose.
  • Example 1-1 Preparation of I from insoluble drugs (taxol) the average size and zeta potential measurements of the solid lipid nanoparticles encapsulated was determined by laser light scattering method, a wavelength of He-Ne laser at 632nm and the detection angle 90 ° It was measured with a dynamic light scattering device equipped with (DSLXZeta-Plus. Brookhevon Instruments, NY). When the concentration of the solid lipid nanoparticles (prepared in Example 1-1) containing the poorly soluble drug texol dispersed in distilled water at 25 ° C was 5 mg / ml, the size was measured three times.
  • High Performance Liquid Chromatography was used to evaluate the content and the encapsulation rate of the drug contained in the solid lipid nanoparticles encapsulated with the drug (taxol). Distilled water was removed by freeze drying the solid lipid nanoparticle solution containing the poorly soluble drug (taxol). The freeze-dried poorly soluble drug (taxol) -encapsulated solid lipid nanoparticles were dispersed in 20 ml of methanol and completely dissolved, and then the poorly soluble drug was extracted through a filter (Millex SR 0.45um filter unit), and then high performance liquid chromatography was used. The amount of poorly soluble drug was analyzed and the results are shown in Table 3 below.
  • the amount of the poorly soluble drug was quantitatively analyzed by comparing with the calibration curve according to the concentration of the drug, and the amount (%, w / w) and the loading rate (%) of the poorly soluble drug contained were Analysis was performed as in Equation 1. .
  • the i character is a stable physical and chemical properties in aqueous solution. More specifically, 11% (w / w) of the solid lipid nanoparticles encapsulated with a poorly soluble drug (taxol) were encapsulated with an efficiency of 80-100 nm and poorly soluble with a surface charge of 65-85 mV. It was confirmed that the drug (taxol) was enclosed solid lipid nanoparticles.
  • a poorly soluble drug taxol
  • the surface of the solid lipid nanoparticle nanoparticles containing the poorly soluble drug (taxol) prepared in Example 1-1 has a cationic amine ( ⁇ NH 2) by DC-cholesterol.
  • the cetusimab substituted by replacing the amine (-NH 2 ) group of cetusimab with a thiol (-SH) group is a poorly soluble drug (Taxol) to which the polymer linker (PEG derivative) prepared in Examples 1-3 is bound.
  • the maleimide group and the thiol-maleimide reaction at the end of the PEG derivative bound to the encapsulated solid lipid nanoparticles were chemically bound by stirring at 4 ° C. overnight, Sephacryl S-200 Poorly soluble drug with target-directed substance (cetusimab) bound through column Only the carrier (Taxol containing SLN—PEG (derivative) -cetuximab) was isolated.
  • the poorly soluble drug carrier to which the target directed substance (cetusimab) is bound was observed by an atomic force microscope. Specifically, the atomic force microscopy image was carried out by dropping a poorly soluble drug carrier (5 mg / ml) bound to ⁇ -targeted colitis (cetusimab) onto a transparent mica bubble, and then using a solvent through nitrogen drying. After removal, only poorly soluble drug carriers bound to the target-directed substance (cetusimab) were allowed to chemisorb on the mica surface and then measured. Measurement conditions were obtained using a non-contact mode XE-100 AFM system (Park System, Korea) with a scan area of 10 ⁇ m ⁇ 10 urn, and the results are shown in FIG. 2.
  • the poorly soluble drug carrier to which the target directing substance (cetusimab) is bound is spherical, and the naked eye has a uniform size with little variation in size.
  • the nanoparticles were prepared in the same manner as in Example 1-1 except for Taxol as components, and the drug was not encapsulated in the same manner as in Examples 1-3 and 1-4.
  • Drug delivery vehicle SN- PEG (derivative) —cetuximab (vehicle) was prepared.
  • the CD20 + cell-targeted drug carrier in which a target-directed substance called Rituxan, which can target CD20 +, was introduced to the surface of the nanoparticle, using the same method as in Example 1-4, except that Rispecialsimb was used as the target-directed substance. Prepared using the method.
  • the lung cancer cell line-derived rodents were prepared by dividing the animals into nine groups with a constant cancer cell value per group. 2-4. Identification of anticancer effects on lung cancer cells (NCI-H1975)
  • Phosphate buffered saline is a physiologically equivalent equivalence of salt concentrations in vivo and is administered only to mice intravenously. It was used as a comparison group corresponding to the group of mice that did not expect any effect without any treatment in which mice were administered the same volume as that of other nanoparticle solutions.
  • Taxol containing SLN-PEG is a comparative group to determine the effect of the target oriented cetuximab compared to Taxol containing SUM-PEG (derivative) -cetuximab
  • Taxol containing SLN is a taxol containing SLN-PEG (Derivatives) by derivatives of polyethylenglipol (PEG), a biocompatible polymeric material for increasing the retention time in the body compared to -cetuximab or Taxol containing SLN-PEG (derivatives) It was used as a comparison group to see how effective it was.
  • Taxol also containing SLN-PEG (derivative) is -rituximab
  • Taxol containing SLN- PEG (derivative) as compared to -cetuximab have the same molecular weight and the size (Mw 170,000), but over-expression in lung cancer cell lines (NCI-H1975) were planted in the mouse,
  • rituximab used in the Taxol containing SLN-PEG (derivative) -rituximab means that the material has no specific reactivity to EGFR1.
  • volume of cancer tissue 1/2 X larger diameter x (smaller diameter) 2
  • a poorly soluble drug carrier (Taxol containing SLN-PEG (derivative)) introduced to the surface a target-directing substance called cetuximab, which can target the EGFR1 antigen overexpressed in lung cancer cells (H1975).
  • cetuximab a target-directing substance that can target the EGFR1 antigen overexpressed in lung cancer cells (H1975).
  • cetuximab showed better cancer treatment effect than the other groups.
  • Breast cancer cell line-derived rodents were prepared using the same method as Example 2-3 except that breast cancer cells (SK-BR-3, ATCC HTB-30) were used (7 2 6).
  • Anticancer efficacy was evaluated by measuring cell viability by the method with MTT reagent. After dispensing NCI-H1975 cells in 96 wells to be 5 X 10 3 cells per well and incubating for 24 hours, SLN (vehicle) prepared in Example 4-1, Taxol prepared in Example 1-1 containing SLN, Taxol containing SLN-PEG (derivatives) prepared in Examples 1-3 and Taxol containing SLN-PEG (derivatives) -cetuximab prepared in Examples 1-4. Each was added to a well plate and incubated for 72 hours in a C0 2 cell incubator at 37 ° C.
  • taxol containing SLN-PEG (derivative)-more enhanced cancer cell killing effect in the cetuximab conditions As shown in Figure 5, it was confirmed that the taxol containing SLN-PEG (derivative)-more enhanced cancer cell killing effect in the cetuximab conditions. These results indicate that taxol containing SLN-PEG (derivative)-cetuximab delivers enhanced anticancer efficacy by more effectively delivering taxol into the NCI-H1975 cell line.
  • Taxol containing SLN—PEG (derivative) —herceptin instead of using Taxol containing SLN—PEG (derivative) —herceptin, the same method as in Example 4-2 was used, and the results are shown in FIG. 6 (control group). No cells were used.
  • the molar ratio of the cationic amine (-NH 2 ) and Dylight 488 NHS Ester (Mw 1011) (Thermoscientific) of the solid lipid nanoparticles containing the drug (Taxol) prepared in Example 1-1 was 10: The reaction was carried out at room temperature overnight at a rate of 1 mol / mol and reacted with stirring at room temperature overnight. The cationic amine (_NH 2 ) of the solid lipid nanoparticles containing the drug (Taxol) and N of Dylight 488 NHS Ester were reacted.
  • SLN—PEG derivative
  • D- cetuximab conjugated taxol containing SLN- PEG
  • Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG (derivative) prepared in Example 5-2, using herceptin instead of cetuximab, Dylight 488 conjugated taxol containing SI ⁇ N-PEG was prepared in the same manner as in Example 1-4. (Derivative) —herceptin was prepared.
  • NCI-H1975 cells were seeded in 6 wells to be 2 X 10 4 cells per well and incubated for 24 hours, followed by Dylight 488 conjugated taxol containing SLN prepared in Example 5-1, prepared in Example 5-2.
  • Taxol containing SLN-PEG (derivative) -cetuximab was added to each well plate and incubated for 0.5 hour in a C0 2 cell incubator at 37 ° C.
  • the medium (RPMI1640) was then removed from the well plate, and TrypLE TM Express was added to remove the three 3 ⁇ 4 adhering to the well plate and redispersed in phosphate buffer (PBS). It was measured using a BD FACS CALIBUR, and the results are shown in FIG. 7 (cells treated with nothing were used as controls).
  • Dylight 488 conjugated taxol containing SLN— PEG (derivative) Example 5 except Dylight 488 conjugated taxol containing SLN— PEG (derivative) —herceptin instead of cetuximab and SK-BR-3 cells instead of NCI—H1975 cells. Measured using the same method as 5. The result is shown in FIG. 8 (A cell treated with nothing was used as a control).
  • taxol containing SLN-PEG (derivative) -herceptin delivers enhanced delivery efficiency by more effectively delivering poorly soluble drugs (taxols) to SK-BR-3 cell lines.
  • Taxol containing SLN-PEG—cetuximab anticancer effect To examine the anticancer effect of the taxol containing SLN-PEG-cetuximab injected to verify the excellent anticancer effect of the poorly soluble drug carrier encapsulated inside Taxol. Observed. This is to confirm the concentration range of the injectable poorly soluble drug carrier in which the anticancer effect is observed by observing the anticancer effect according to the concentration of the poorly soluble drug carrier to be injected.
  • Lung cancer cell line-derived rodents were prepared in the same manner as in Example 2-3, except that the size of the cancer was fixed to each group when the size was about 50 to 100 mm 3 .
  • MTD maximum tolerance dose
  • PBS PBS group had no effect expected
  • the volume change of cancer and tissue with time in each group was confirmed.
  • the group receiving the MTD value of 22 mg (taxoD / kg (mouse) and other groups (11, 5.5. 2.2, 1.1 mg (taxoD / kg (mouse injection group) the significant difference in cancer tissue volume was evaluated on day 21. More specifically, p-value of 0.01 or less was analyzed using Student's t-test. Means that the MTD value of 22 mg (taxoD / kg (mouse) is significantly different from the volume of cancer tissue in the group injected with /) — If the value is greater than or equal to ⁇ .
  • the MTD value of 22 mg (taxoD / kg (mouse) was analyzed using means that there is no significant difference with the cancer tissue volume of the group injected.
  • Taxol which is currently used for chemotherapy in cancer patients, is a nanoparticle encapsulated on the inside, and compared with Samyang Corp.'s Genexol ® -PM, which has a micelle structure, to compare cancer treatment effects was:
  • Lung cancer cell line-derived rodents were prepared using the same method as in Example 2-3, except that the size of the cancer was constant in each group when the size was about 50 to 100 mm 3 , divided into six animals.
  • mice were administered intravenously at Genexol ® —PM and Taxol containing SLN-PEG (derivatives) —cetuximab for MTD values, respectively.
  • Example 1-4 Prepared in Example 1-4 Simi intravenous administration containing taxol SLN- PEG (induction treatment)) - cetuximab amount of 22 mg (taxol / kg (mouse ) and Genexol ® - the amount of the PM 60 mg (taxol) / kg Except for the (mouse) was tested and confirmed using the same method as Example 2-4, and the results are shown in FIG. As shown in Figure 10, Genexol ® — confirmed that the anticancer effect of taxol containing SLN-PEG (derivative) -cetuximab is superior to PM.
  • the content range of Taxol containing SLN-PEG (derivative)-cetuximab that is actually injected into the body is 22 mg (taxol) / kg (mouse).
  • the MTD value of 22 mg (taxol) / kg (mouse) was not statistically similar to the administration of 2.2 mg (taxoD / kg (mouse), which was determined by Genexol ® -PM. It contains less than 60 mg (taxoD / kg (mouse)) of injectable Taxol, which can be expected to show better anticancer effect than currently available Genexol ® PM.
  • the content of the taxol can provide a better anticancer effect while minimizing the side effects caused by Taxol.
  • the same result is due to the ability of poorly soluble drug carriers to target cancer tissues and their ability to deliver poorly soluble drugs.

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Abstract

본 발명은 난용성 약물 전달체, 그의 제조방법, 이를 이용한 난용성 약물의 전달방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암세포 특이 표적 지향화를 목표로 하는 난용성 약물 전달체에 관한 것으로, 암세포에서 과발현되는 항원에 특이적으로 반응할 수 있는 암 세포 표적 지향 물질의 종류를 다양하게 조절하여 난용성 약물 전달체의 표면에 결합할 수 있고, 내부에 봉입되는 난용성 약물의 종류를 암의 종류 및 치료 목적에 따라 다양하게 조절할 수 있어 암치료법에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

【발명의 명칭】
표적지향형 난용성 약물 전달체
【기술분야】
본 발명은 난용성 약물 전달체， 그의 제조방법, 이를 이용한 난용성 약물의 전달방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
【발명의 배경이 되는 기술】
통상적으로 암을 치료하는 방법에는 외과적 수술， 방사선 치료 및 약물 치료의 세 가지 방법이 있다. 각 방법은 암 치료를 위해 독자적으로 사용될 수도 있고 두 가지 이상의 방법이 함께 사용될 수도 있으며， 많은 초기 단계의 암들은 외과적 수술로 치료가 가능하지만， 암이 많이 진전되거나 전이가 일어날 경우에는 외과적 수술만으로는 치료가 어렵고, 방사선 치료 또는 약물 치료 등와 방법이 병행되어야 한다.
방사선 치료는 X-선이나 선을 암세포에 조사하는 방법으로서, 이때 방출되는 광선은 외과적으로 수술이 곤란한 부위나 방사선에 특히 반웅성이 좋은 암세포에 사용되거나 수술 전후에 사용될 수도 있다. 또한， 약물 치료는 세포독성 (cytotoxic) 약을 경구나 주사로 투여하여 암세포의 증식에 필요한 DNA나 효소를 파괴하는 방법을 채용한다. 특히， 약물 치료법이 외과적 수술이나 방사선 치료에 비해 갖는 장점은 신체의 어떤 부위에 암이 발명되더라도 약물을 도달시킬 수 있고, 전이된 암을 치료할 수 있다는 점이며， 이와 같은 사유로 약물 치료법은 전이성 암 치료에 대한 표준요법으로 널리 사용되고 있다. 물론, 약물 치료법으로 전이된 암을 완치시킬 수 있는 것은 아니지만, 증상을 완화시켜 환자의 삶의 질을 개선시키고 수명을 연장시켜 주는 중요한 역할을 한다.
일반적으로 약물 치료의 경우， 현재까지 독소루비신 (doxorubicin), 시스플라틴 (cisplatin). 탁솔 (taxol), 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil) 등의 난용성 약물을 사용한 화학 치료요법이 광범위하게 사용되고 있으나， 투여에 제한적이다. 상기 약물들은 난용성이기 때문에 치료 가능한 정도의 양만 투여해도 환자에게 심한 고통을. 가져다 주고 있으며， 과도한 부작용으로 인하여 다량을 투여할 수 없는 실정이다. 이러한 부작용이 나타나는 원인은 항암제의 비선택성 때문인데， 항암제가 암세포에만 작용하지 않고 일반세포에도 작용함으로써 암세포만을 사멸시키지 못하고， 정상적인 세포의 성장도 억체, 괴사시키기 때문에 환자는 심한 고통을 느끼게 된다.
이를 위하여, 마이셀 및 리포좀과. 같은 전달체를 제조하여 난용성 항암제를 전달하는데 사용하고 있는데 상기 전달체를 제조할 때 항암제를 첨가하여 항암제가 전달체의 내부에 함유될 수 있게 한다.
최근에는 마이셀 및 리포좀과는 달리 면역반웅을 촉발하지 않는 자연계 담체를 구현하는 저밀도 지단백질 (Low Density Lipoprotein, LDL)과 유사한 전달체인 고형지질나노입자 (Solid Lipid Nanoparticle, SLN)가 항암제를 전달하는 전달체로 사용되고 있는데 상기 저밀도 지단백질 (Low Density Lipoprotein, LDL)은 기본적으로 지질 및 단백질의 이동, 구체적으로는 계통순환 전체의 간외부 조직에 대한 콜레스테를 전달에 관여한다. 실제로， 사이클로스포린 A 및 암포테리신 B 지질 착염 (ABLC)같은 비친수성 약물은 전임상 (pre-clinical) 또는 임상 (clinical) 치료 시 LDL과 결합함으로써 효과적으로 전달되었다.
하지만 혈액에서 자연 저밀도 지단백질 (Low Density Lipoprotein, LDL)을 분리하는 방법은 너무 복잡하고 시간 소모가 크기 때문에, 저밀도 지단백질 (Low Density Lipoprotein, LDL) 모방 모델인 고형지질 나노입자는 아포지질 단백질이 함유되지 않는 대신 콜레스테를 에스테르 및 인지질로부터 개발되었다.
그러나， 기존 고형지질 나노입자인 전달체의 경우 간에 존재하는 식세포에 흡수되거나 신장에 의하여 빠른 시간 안에 배출됨으로써 내부에 봉입된 항암제를 암조직으로 충분히 전달하지 못해 효과적인 항암 치료를 위한 한계를 가지고 있어 문제가 되어 왔다. 【발명의 내용】
[해결하고자 하는 과제]
본 발명은 상기와' 같은종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로. 본 발명의 목적은 자연상 존재하는 저밀도 지단백질의 구성성분을 모방하여 표면 개질을 재구성하고. 상기 표면에 표작화 항체를 결합시켜 제조된 저밀도 지질 단백질 (Low Density Lipoprotein. LDL)-유사 나노입자; 상기 LD느유사 나노입자와 난용성 약물을 포함하는 복합체; 상기 복합체를 이용하여 세포사멸 효율 및 안정성이 향상되고 독성은 감소한, 표적 지향형 난용성 약물 전달체, 및 이들의 쎄조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 . 목적은 마이셀 및 리포좀과는 달리 면역반응을 촉발하지 않는 LDL-유사 나노입자와 난용성 약물을 포함하는 복합체; 상기 복합체를 이용한 세포사멸 효율 및 안정성이 향상되고 독성은 감소한. 난용성 약물을 포함하는 표적 지향형 난용성 약물 전달체, 및 이들의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 LDL-유사 나노입자를 이용하여 세포사멸 효율 및 안정성이 향상되고 독성은 감소한, 표적 지향적 난용성 약물의 전달방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 난용성 약물 전달체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 아상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며， 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다ᅳ 【도면의 간단한 설명】
도 ,1은 난용성 약물 전달체의 합성 과정 및 구성을 표현한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1-4에서 제조된 난용성 약물 전달체의 원자힘 현미경 (Atomic Force Microscope) 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 난용성 약물 전달체의 암 치료 효과 (폐암)를 확인하기 위하여, 실시예 2-4와 방법에 따라 시간별 암조직의 부피를 측정한 그래프를 나타낸 것이다 (도면에서의 화살표는 약물을 주사한 시점을 나타낸다).
도 4은 난용성 약물 전달체의 암 치료 효과 (유방암)를 확인하기 위하여， 실시예 3-4의 방법에 따라 시간별 암조직의 부피를 측정한 그래프를 나타낸 것이다 (도면에서의 화살표는 약물을 주사한 시점을 나타낸다).
도 5는' NCI-H1975 세포주에서 실시예 4-2에 따른 MTT 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 SK-BR-3 세포주에서 실시예 4-3에 따른 MTT 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 5-5에 따른 NCI— H1975 세포주에서의 전달 효율
'평가 (FACS 분석)를 나타낸 것이다. . .
도 8은 실시예 5-6에 따른 SK-BR-3 세포주에서의 전달 효을 평가 (FACS 분석)를 나타낸 것이다.
도 9는 주사되는 taxol containing SLN-PEG (유도체) -cetuximab의 농도에 따른 암 조직의 부피를 그래프로 나타낸 것이다 (도면쎄서의 화살표는 약물을 주사한 시점을 나타 ^다)ᅳ 도 10은 taxol containing SLN-PEG (유도체) -cetuximab과 Genexol®- PM의 항암효과 비교를 그래프로 나타낸 것이다 (도면에서의 화살표는 약물을 주사한 시점을 나타낸다). (도 1. 도 2 내지 도 10의 PEG는 PEG 유도체를 나타낸 것이다.)
【과제의 해결 수단】
상기와 같은 목적을 해결하기 위한 수단으로， 자연상 존재하는 저밀도 지단백질의 구성'성분을 모방하여 표면 개질을 재구성하고, 상기 표면에 표적화 항체를 결합시켜 제조된 저밀도 지단백질 (Low Density Lipoprotein, LDL)- 유사 나노입자; 상기 LDL-유사 나노입자와 난용성 약물을 포함하는 복합체; 상기 복합체를 이용한 세포사멸 효율 및 안정성이 향상되고 독성은 감소한， 난용성 약물을 포함하는 표적 지향형 난용성 약물 전달체. 및 이들의 제조방법을 제공하는 것이다.
자연상 존재하는 저밀도 지단백질은 두 개의 지질상, 즉 인지질 및 아포지질 단백질로 구성된 표면지질부와 콜레스테롤 에스테르와 트리글리세라이드로 구성된 코어지질부로 이루어지며 조성은 하기의 표 1과 같다.
' 【표 1】 .
Figure imgf000007_0001
표면지질부의 인지질 및 아포지질 단백질은 코어지질부인 콜레스테를 에스테르와 트리글리세라이드로 구성된 비극성 지질을 유화시켜 표면의 안정성을 제공하며, 따라서 안정된 생물학적 마이크로에멀전을 형성할 수 있다. 그러나 혈액에서 자연 저밀도 지단백질 (Low Density Lipoprotein, LDL)을 분리하는 방법은 너무 복잡하고 시간소모가 큰 문제점이 있어, LDL 모방 모델인 전달체는 아포지질 단백질이 함유되지 않은 대신 콜레스테롤 에스테르 및 인지질로부터 개발되었다.
이러한 자연계 담체의 구조와 조성을 모방하는 전달체는 마이셀， 리포좀과는 달리 면역반웅을 촉발하지 않기 때문에 생체 내 약물을 전달하는 전달체로 개발 될 수 있다.
본 발명자들은 상기 LDL—유사 고형 나노입자와 그 내부 코어 지질부에 봉입된 난용성 약물, 예를 들면 난용성 항암제를 포함하는 전달체를 암세포에 선택적으로 표적하기 위한 방법으로， 전달체의 표면에 '전달체의 체내 잔류시간을 증가시키기 위한 고분자를 결합하고 암세포에만 특별히 존재하는 항원을 인식하는 표적화 항체를 전달체 표면에 부착된 고분자와 결합시킴으로써 난용성 항암제가 암세포에 높은 효율로 전달되는 것을 확인하였다.
본 발명은 콜레스테릴 에스테르 (cholesteryl ester) 및 트리글리세라이드 (triglyceride)를 함유하는 코어지질부; 인지질 (phospholipid), 콜레스테를 (cholesterol) 및 양이온성 지질을 함유하는 표면지질부; 상기 표면지질부에 연결된 고분자 링커; 및 상기 고분자 링커와 연결된 표적 지향 물질을 포함하는 LDL-유사 고형 나노입자를 제공한다.'
또한, 본 발명은 상기 LDL-유사 고형 나노입자의 코어지질부에 봉입된 난용성 약물을 포함하는 복합체를 함유하는 표적 지향적 약물 전달체를 제공한다.
표적으로 약물을 효과적으로 전달하기 위해서는， 제거되지 않고 상당 기간 혈액 내에 잔존할 수 있는 약물 전달체의 능력이 필수적이다. 따라서 투여된 약물 전달체의 크기와 표면 특성은 중요하다.
상기 LDL-유사 고형 나노입자 및 난용성 약물 전달체의 표면 전하는 -
10 내지 10 mV 일 수 있으며， 표적 조직으로 약물을 더욱 효과적으로 전달하기 위하여 바람직하게는 -3 내지 3mV일 수 있디-.
약물 전달체의 표면아 이온성 혹은 소수성일 경우， 간 또는 비장 내의 세망내피계 (reticulo—enclothelial system)에 위치하는 대식세포 (macrophage)에 잡혀 제거되며, 조금 더 구체적으로 약물 전달체의 표면이 이온성 혹은 소수성일 경우 피브로넥틴 (fibrcmectin), 보체 (complements), IgG 등과 같은 혈장 단백질들과 정전기적 인력으로 인해 흡착되어 (opsonization) 세망내피계의 대식세포에 의하여 인지되어 결과적으로 약물 전달체는 제거된다. 따라서 이러한 대식세포의 포식으로부터 벗어나기 위해서는 난용성 약물 전달체의 표면을 증성 또는 이와 근접하게 만드는 것이 바람직하다.
상기 난용성 약물 전달체의.크기는 30 내지 300 nm일 수 있으며, 표적 종양조직으로 약물을 더 효과적으로 전달하기 위여 바람직하게는 150 내지 250 nm일 수 있다. 약물 전달체로서의 크기가 너무 작으면 정상혈관을 통과하게 되어 약물을 종양조직이 아닌 정상조직에도 전달할 수 있게 될 뿐만 아니라 약물 전달체 내부에 봉입되는 약물의 양 (drug payload)이 불충분하게 되고， 크기가 너무 크면 체내 순환시 간이나 비장에서 세망내피계 (reticulo¬ endothelial system )에 위치하는 대식세포 (macrophage)에 잡혀 제거된다. 본 발명의 일 구현예로서， 상기 LDL-유사 나노입자와 난용성 약물을 포함하는 복합체는 전체 복합체의 총 중량기준으로 콜레스테릴 에스테르는 20 내지 60 중량 트리글리세라이드 0.1 내지 10 중량 9 &; 인지질 5 내지 30 중량 %; 콜레스테를 3 내지 20 중량 양이온성 지질 10 내지 50 중량 % 및 난용성 약물 10 내지 20중량 %를 함유할 수 있으며. 난용성 약물의 봉입 효율을 고려하여 바람직하게는 콜레스테릴 에스테르 24 내지 28 중량 %, 트리글리세라이드 1 내지 3 중량 %， 인지질 14 내지 18 중량 콜레스테를 3 내지 7 중량 양이은성 지질 30 내지 35 중량 % 및 난용성 약물 내지 14 내지 18 % 중량을 함유할 수 있다.
본 발명에 적용 가능한 콜레스테릴 에스테르는， 콜레스테로과 탄소수 10 내지 24개의 불포화지방산의 에스테르 화합물일 수 있다.
본 발명에 적용 가능한 트리글리세라이드는 트리아세틴 (triacetin), 트리부티린 (tributyrin), 트리카프로인 (tricaproin), 트리카프릴린 (tricaprylin), 트리카프린 (tricaprin) 및 트리올레인 (triolein)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 적용 가능한 인지질은 디올레오일포스파티딜에탄을아민 (DOPE) ,
POPC(palmitoyloleoylphosphatidylcholine), EPC(egg phosphatidylcholine), DvSPC(distearoylphosphatidylcholine), DOPC(dioleoylphosphatidylcholine), DPPCidipalmitoylphosphatidylcholine), DOPG(dioleoylphosphatidylglycerol) 및 DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 적용 가능한 양이온성 지질은 3베타 -[Ν-(Ν',Ν',Ν'- 트리메틸아미노에탄)카바모일 ]콜레스테를 (TC—콜레스테롤), 3베타 [Ν- (Ν' ,Ν' - 디메틸아미노에탄)카바모일 ]콜레스테를 (DC-콜레스테롤), 3베타 [N- (N1— 모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테를 (MC-콜레스테를)， 3베타 [N
(아미노에탄)카바모일]콜레스테를 (AC-콜레스테를)， Ν-(Ν'— 아미노에탄)카바모—일프로파노익토코페를 (AC-토코페를)， . Ν-(Ν'- 메틸아미노에탄)카바모일프로파노익토코페롤 (MC-토코페를)， Ν,Ν-디올레일ᅳ Ν,Ν-디메틸암모늄클로라이드 (DODAC), Ν,Ν—디스테아릴 -Ν,Ν— 디메틸암모늄브로마이드 (DDAB), Ν— (1-(2，3-디을레오일옥시)프로필 -Ν,Ν,Ν- 트리메틸암모늄클로라이드 (DOTAP), 1시^-디메틸 (2，3-디 올레오일옥시)프로필아민 (DODMA), N-(l-(2,3-디올레오일옥시)프로필) - Ν,Ν,Ν-트리메틸암모늄클로라이드 (DOTMA), 1,2-디을레오일 -3-디메틸암모늄— 프로판 X)DAP), 1,2-디올레오일카바밀 -3-디메틸암모늄—프로판 (DOCDAP), 1，2-디리노일 -3-디메틸암모늄-프로판 (DLINDAP), 디올레오일옥시— N-[2- 스퍼민카복사미도)에틸 }-N.N-디메틸 -1—프로판아미늄 트리플루오르- 아세테이트 (DOSPA), 디옥타데실-아미도글리실스퍼민 (DOGS), 1,2- 디미리스틸옥시프로필 -3ᅳ디메틸-하이드록시에틸암모늄브로마이드 (DMRIE), 3- 디메틸아미노— 2- (콜레스트 -5-엔 -3—베타—옥시부탄 -4-옥시) -l-(cis,cis— 9,12- 옥타디카디엔옥ᅵ시) 프로판 (： CLinDMA), 2- [5'- (콜레스트 -5-엔 -3.베타. -옥시) - 3'-옥사펜록시) -3—디메틸— 1— (cis,cis-9',12'_
옥타디카디엔옥시 )프로판 (CpLinDMA), Ν,Ν-디메틸 -3,4- 디올레오일옥시벤질아민 (DMOBA), 1,2— Ν,Ν'-디올레일카바밀 -3- 디메틸아미노프로판 (DOcarbDAP), 1,2-디아실 -3 트리메.틸암모늄—프로판 (TAP) 및 1,2-디아실 -3-디메틸암모늄—프로판 (DAP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 적용 가능한 고분자 링커는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), PLACpolylactic acid), PGA(polyglycolic acid), 폴리에스테르, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, ' 펩타이드， ■ PHA(polyhydroxyalkanoate), PCL(polycaprolactone), 폴리알킬^"보네이트, 알부민， 젤라틴， 콜라젠, 피브린， 알긴산， 키틴. 키토산, 덱스트란， 히알루론산, 전분 및 그 유도체들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며， 유도체란 상기 고분자 링커의 수소원자는 또는 특정 원자단을 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 말한다.
상기 고분자 링커는 한쪽 말단에는 나노입자의 표면지질부와 결합할 수 있는 관능기와 다른 한쪽에는 표적화 항체와 결합가능한 관등기를 포함할 수 있다. 구체적인 예로서， 상기 고분자 링커는, 한쪽 말단에 나노입자의 표면지질부 상에 . 존재하는 양이은성 아민 (-NH2)과 결합가능한 - NHS (숙신이미드기)， — CH0 (알데하이드기) 또는 -COOH (카르복실기)을 가지고， 다른 쪽 말단에는 표적화 항체에 존재하는 -SH (티올기)와 결합가능한 말레이미드기， -COOH (카르복실기) 또는 -SH (티올기)을 가지는 것일 수 있다. PEG는 친수성 고분자로 혈장 단백질들의 흡착을 억제하는 능력을 가지고 있어서 약물 전달체의 체내 순환시간을 증가시켜 주는 역할을 하며, 상기 고분자 링커는 PEG 또는 이의 유도체일 수 있다. 상기 PEG 또는 이의 유도체의 분자량이 500 미만이면 PEG 유도체가 체내 알코올디하이드로게네이즈에 의해 독성을 가진 화합물로 산화되는 문제가 있고, 50.000 초과하면 제조상의 문제가 있을 수 있으므로 500 내지 50,0ᄋᄋ의 분자량일 수 았으며. 바람직하게는 2.000 내지 20,000일 수 있다. 상기 PEG 유도체의 구체적인 예는 하기 화학식 1을 갖는 화합물일 수 있다.
[화학식 1]
Figure imgf000012_0001
상기 화학식 1에서, n은 4 내지 1， 130이며, 바람직하게는 38 내지 447의 정수이다.
구체적으로 상기 나노입자의 표면지질부 상에 존재하는 양이온성 아민 (_NH2)과 고분자 링커의 한쪽 말단에 존재하는 NHS 사이에 형성돤 아미드 결합 (amide bond)에 의해 폴리에틸¾1글리콜 유도체가 나노입자 표면에 결합된다.
상기 고분자 링커의 다른 한 쪽 말단， 즉 고분자 링커의 바깥쪽 말단에 존재하는 말레이미드기， -CO이" !(카르복실기) 또는 -SH (티을기)와 표적화 항체에 존재하는 -SH (티올기)사이에 형성된 화학결합에 의해 표적화 항체가 나노빕자의 표면에 결합된다/
본 발명의 일 구현예로 상기 표적 지향 물질은 베바시주맙 (Bevacizumab), 엘로티닙 (erlotinih)), 게피니티브 (Gefitinib), 메실산이매티닙 (imatinib mesylate), 세투시맙 (cetuximab). 리투시맙 (rituximab), 트라스트주맙 (trastzumab), 폴레이트 (folate) 및 RGD로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다 ·
본 발명의 일 구현예로 상기 난용성 약물은 난용성 항암제. 항바이러스제, 스'테로이드계 소염제 (steroidal anti-inflammatory drugs), 항생제ᅳ 항진균제, 비타민. 프로스타사이클린 (prostacyclin), 항대사제, 축동제 (mitotics). 아드레날린 길항제 (adrenaline antagonist), 항경련제， 항 ί:안제. 정온제, 항우울제. 마취제， ' ᅳ진통제, 동화성 스테로이드제, 면역 억제제 및 면역 촉진제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 난용성 항암제는 탁솔 (Taxol), 아이다루비신 (idarubicin), 미톡산프론 (mitoxantrone), 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁셀 (clocetaxel), 메소트렉세이트 (methotrexate), 트리메트렉세이트 (trimetrexate), 치오구아닌 (thioguanine), . 메르캅토퓨린 (mercaptopurine), 클라드리빈 (claclrabine), 암루비신 (amrubicin), 옥트레오타이드 (octreotide), 고세레린 (Gosereline), 류프로라이드 (leuprolide), 플루타마이드 (Flutamide), 카소덱스 (Casoclex), 독소루비신 (doxorubicin), 5-플로로우라실 (5-fluorouracU), 폴루다라빈 (fludarabine), 시타라빈 (cytarabine), 마이토마이신 -C(mitomydn— C), 스티렌 말레산 네오카르지노 스타틴 (Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴 (dsplatin), 카보플라틴 (carboplatin), 옥사리플라틴 (oxaliplatin), 카뮤스틴 (carmustine (BCNU)). 다^ 진 (dacabazine), 에토포사이드 (etoposide)' 다우노口! "이신 (daunomycin), 닥티노마이신 (dactinomycin), 빈카알칼로이드 (vinca alkaloid), 블레오마이신 (bleomycin), 사이클로포스파마이드 (cycloph'osphamkle), ' 이포스파마이 H(Ifosfamide), 젬시타빈 (gemcitabine), 페메트렉시드 (pemetrexed), 캄프토테신 (camfitothecin), 이리노테칸 (irinotecan), 토포테칸 (topotecan), 클로람부실 (chlorambucil) 및 멜파란 (melphalan)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한 본 발명은 콜레스테릴 에스테르， 트리글리세라이드， 인지질， 콜레스테를, 양이온성 지질 및 난용성 약물을 유기용매에 용해시킨 후 물을 첨가하여 난용성 약물이 봉입된 나노입자의 복합체를 제조하는 단계; 상기 복합체의 표면에 고분자 링커가 아미드 결합 (amide bond)으로 결합하는 단계; 및 상기 고분자 링커에 표적화 항체를 결합하는 단계를 포함하는 코어지질부 내부에 약물이 봉입된 나노입자의 복합체를 제조하는 방법을 제공한다.
ᅳ 상기 유기용매는 소수성 및 /또는 친수성 용매일 수 있으며, 상기 소수성 용매로는 클로로포름, 사이클로핵산 등을 포함하며, 상기 친수성 용매로는 에탄을, 메탄올 둥을 포함한다. 친수성 또는 소수성 유기용매의 단독이나 친수성 및 소수성 용매를 일정 비율로 혼합한 유기용매를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 유기용매는 나노입자의 합성에 사용되는 지질성분들을 용해하기 위해 사용된다. 그 후에 물이 첨가되어 지질성분들의 자가조람으로 표면에 양이은성을 나타내는 나노입자 (ᄋ/W emultion)가 만들어지면 사용된 유기용매는 제거된다.
보다 구체적으로, 유기용매가 제거 되는 조건은 유기용매의 비점 이상의 온도에서 기화 (evaporation) 시키는 것 이외에 콜레스테릴 에스테르의 융점이상의 온도에서 이루어져야 하는 것을 특징으로 하고 있는데， 이는 콜레스테롤 에스테르가 융점이상의 온도에서는 고형에서 액체형으로 상변이를 하기 때문에 나노입자 내부에 존재하는 유기용매가 나노입자 외부로 잘 확산될 수 있도록 하여 나노입자 내부의 유기용매 제거를 용이하게 하고 이로 인해 나노입자의 코어부를 안정적으로 만들기 위함이다. 예를 들면， 52°C 의 융점을 갖는 콜레스테를 을레이트는 융점 이상에서는 액체형이므로， 나노입자의 제조시 52 °C 이상의 온도에서 유기용매를 제거하면 액체형의 코어부에 존재하는 유기용매는 나노입자 외부로 제거 된 후 기화되고 동시에 액체형의 콜레스테롤 을레이트가 갖는 유동성을 이용하여 나노입자의 코어부가 다시 한 번 재조립되는 과정을 통해 안정적인 나노입자가 만들어지게 된다.
따라서 상기 유기용매의 비점은 사용하는 콜레스테를 에스테르의 융점보다 높고 물의 끓는점보다 낮아야 한다. 예를 들면， 콜레스테를 올레이트의 융점이 52°C 임을 고려하여 상기 유기용매는 52°C 내지 80oC 의 비점을 갖는 것이 바람직하다.
상기 나노입자의 표면지질부 상에 존재하는 양이온성 아민과 풀리에틸렌글리콜 유도체와 결합하면, 상가 나노입자 표면전하가 중성화 되고 대식세포에 포획될 가능성이 줄어들게 되고 그만큼 체내 '순환시간이 증가하게 되어 암조직으로 약물을 전달 할 가능성이 커지게 된다.
상기 표면지질부의 양이온성 지질에 포함된 양이온성 아민기 (-NH2)과 고분자 링커에 함유된 관능기의 몰 비율을 1:1 내지 1:5， 바람직하게는 1:1 내지 3.5 일 수 있으며 구체적인 예로서 1:2， 1:1.5， 또는 1:3일 수 있다. 구체적인 예로는 상기 양이온성 아민기대 PEG의 ᅳ NHS 관능기의 몰비를 상기 범위'에 해당하도록 반웅물에 추가하여 반웅시킬 수 있다. 양이온성 아민기가 최대한 많이 고분자 '링커의 관능기와 결합할수톡 나노입자의 표면전하가 0에 가까워질 수 있다. 상기 아민기와 결합가능한 관능기가 1분자내에 한 개를 포함한 고분자 링커라면， 고분자 링커에 함유된 관능기의 몰 비율는 고분자 링커의 몰비일 수 있다.
고분자 링커의 바칼쪽 말단에 존재하는 관능기와 표적화 항체의 티올기 사이에 형성된 화학결합으로 표적화 항체가 나노입자에 결합하게 된다. 구체적으로， 상기 화학식 1의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 다른 한 쪽 말단에 존재하는 말레이미드기와 표적화 항체에 존재하는 티올기 사이에 형성되는 화학결합에 의해 표적 지향 물질이 나노입자의 표면에 결합된다. 상기 고분자 링커의 결합가능한 관능기대 표적화 물질의 관능기의 반웅몰 비율을 1:1 내지 1:10， 바람직하게는 1:2 내지 1： 7， 예를 들면 1:3， 1:3.5, 1:4， 1:4.5， 1:5， 1:5.5， 1:6， 또는 1:6.5일 수 있다. 상기 몰비가 표적 지향 물질이 최대한 많이 폴리에틸렌글리콜 유도체에' 결합하여 표면전하가 0에 가까워질 수 있다. 표면전하는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 바깥쪽 말단에 존재하는 말레이미드기와 결합하는 표적화 항체의 분자수를 능동적으로 조절하여 결합 할 수 있게 하는 기술적 장점을 가지게 한다. 구체적인 예로서， 상기 고분자 링커의 결합가능한 관능기가 1분자내에 한 개 포함되고， 표적화 물질의 관능기기 1분자내에 한 개 포함된다면， 상기 몰비는 각각 첨가되는 고분자 링크 및 표적 지향 물질의 몰비일 수도 있다.
고분자 링커의 말단 관능기와 결합가능한 티올기가 존재하지 않는 표적화 항체의 경우, 항체의 아민기를 티올기로 치환하여 고분자 링커에 결합할 수 있기 때문에 이를 이용하여 다양한 표적 지향 물질을 난용성 약물 전달체에 도입할 수 있으며 이는 본 발명에 의해 개발되어진 난용성 약물 전달체가 암세포에서 과발현되는 항원에 따라 고분자 링커에 결합하는 표작 지향 물질을 능동적으로 다양하게 조절할 수 있는 기술적 장점을 가지게 된다. 본 발명은 또한 난용성 약물 전달체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 구체적으로， 상기 : 난용성 약물 전달체는 20 내지 200mg/kg 범위로 포함되는 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 비경구 투여를 포함한 다양한 경로로 투여될 수 있으며， 비경구 투여는 정맥 내， 피하， 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며， 가장 바람직한 예로는 암세포가 있는 조직으로 약물이 전달되는 유일한 경로는 혈관이기 때문에 정맥 내 투여법 (Intravenous admintration, I.V.)을 이용하는 것이며， 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도， 약물형태， 투여경로 및 시간에 따라 다르지만， 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제， 증량제, 결합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제， 유제， 동결건조제제， 좌제 등이 포함된다.
비수성용제. 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골. 트원 (tween) 61. 카카오지, 라우린지， 글리세를， 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 /위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며. 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류， 중증도， 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간， 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은' 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 .있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로， 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이， 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며， 일반적으로는 체중 1 kg당 0.1 내지 100 의 난용성 약물. 바람직하게는 0.5 내지 10 mg의 난용성 약물을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로， 비만의 중증도， 성별， 체중， 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
【발명의 효과] 본 발명의 난용성 약물 전달체를 생체 내에 주입하였을 경우, 난용성 약물 전달체 표면에 합된 고분자 및 표적 지향 물질로 인해서 난용성 약물 전달체가 암세포에 전달되는 확를이 증가되는 효과를 보였으며, 난용성 약물 전달체에 난용성 약물이 안정적이고 높은 효율로 봉입되었기 때문에 난용성 약물 전달체에 의해 암세포에 전달된 약물은 우수한 암세포 사멸 효과를 보였다. 또한 암세포에서 과발현되는 항원쎄 특이적으로 반응할 수 있는 암 세포 표적 지향 물질의 종류를 다양하게 조절하여 난용성 약물 전달체의 표면에 결합할 수 있고, 내부에 봉입되는 난용성 약물의 종류를 암의 종류 및 치료 목적에 따라 다양하게 조절할 수 있는 장점이 있다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기. 위한 것일 뿐이며， 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은아니다. .
[실시예]
<실시예 1>난용상 약물 전달체의 제조
1-1： 약물 (Taxol)이 봉입된 고형지질나노입자 제조 (Taxol containing
SLN)
아래의 표 2에 나타난 바와 같이， 8.4mg(26.8중량 %)의 콜레스테릴 올레이트, 0.5mg(1.6중량 %)의 트리올레인, 5.21^ (16.6중량%)의 DOPE, 1.8mg(5.7중량 %)의 콜레스테롤, K).5mg(33.4중량 ¾)의 DCᅳ콜레스테를 및 5mg(15.9중량 %)의 탁솔 (taxol)을 유리병에 담긴 2mL의 클로로포름: ᅵ 메탄올 (2:1) 용액에 용해시켰다. 10mL의 증류수를 상기 유리병에 첨가하여
1분간 교반 (vortexing)하여 섞어 주었고, 그 후 용액을 Branson 초음파 , 처리기 450(20kHz, 듀티 주기 = 40， 출력 제어 =3.5)으로 3분간 초음파 처리하였다. 용액을 회전식 증발기로 옮겼고， 용매인 클로로포름: 메탄올 (2:1， v/v)용액을 콜레스테릴 을레이트의 융점인 60 °C이상의 온도에서 제거하였다. 증류수 안에서 하룻밤 동안 분획분자량 (Molecular weight of cut-off, MWCO) 5000의 투석 막 (dialysis membrane)을 이용하여 정제를 하였고. 정제된 난용성 약물 (taxol)이 봉입된 고형지질나노입자 용액은 4°C에서 보관하여 난용성 약물 (taxol)이 봉입된 고형지질나노입자 (Taxol containing SLN)를 제조하였다.
【표 2]
Figure imgf000019_0001
1-2: 난용성 약물 (Taxol)이 봉입된 고형지질나노입자의 물리화학적 특성
' 실시예 1-1에서 제조된 난용성 약물 (taxol)이 봉입된 고형지질나노입자 의 평균 크기 및 제타 전위 측정은 레이저광 산란법으로 측정하였으며， 파장 632nm 및 검출각도 90°의 He-Ne 레이저가 탑재된 동적 광산란기 (DSLXZeta-Plus. 브룩헤본인스트루먼트사， NY)로 측정하였다. 25°C의 증류수 내에 분산된 난용성 약물 texol)이 봉입된 고형지질나노입자 (실시예 1- 1에서 제조된)의 농도가 5 mg/ml 일 때， 크기를 3회 측정하였으며， 상기 난용성 약물 (taxol)이 봉입된 고형지질나노입자에 포함된 약물의 함량 및 봉입율을 평가하기 위해 고성능액체크로마토크래피 (High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 사용하였다. 상기 난용성 약물 (taxol)이 봉입된 고형지질나노입자 용액을 동결건조 (Freeze drying)하여 증류수를 제거하였다. 동결 건조된 난용성 약물 (taxol)이 봉입된 고형지질나노입자를 메탄올 20 ml에 분산시켜 완전히 녹인 후 필터 (Millex SR 0.45um filter unit)를 통해 난용성 약물을 추출한 후 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 난용성 약물의 양을 분석하였고, 그 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.
이 때 약물의 농도에 따른 검량선 (calibration curve)과 함께 비교하여 난용성 약물의 양을 정량분석하였고, 봉입된 난용성 약물의 양(%, w/w) 및 봉입율 (%)은 아래의 수학식 1과 같이 분석하였다. .
[수학식 1] 봉업를 (%)= 죽정 s약職 ^ χ 100
합성.에.사용된약¾¾량 (mg) w ᅵ ᅩ,ᅳ， L 측 된약뭏의양 Cms)
약울 항량 (%, w/w) = · " " SJ X 100
합성 ¾전달제의양 (mg )
표 3에 나타난 바와 같이， 수용액 상에서 안정적인 물리화학적 특성을 자지고 있음을ᅵ 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로 난용성 약물 (taxol)이 봉입된 고형지질나노입자의 무게 대비 11 % (w/w)효율로 봉입되어 있었고 80-100 nm 수준의 크기와 65~85mV 수준의 표면전하를 가지는 난용성 약물 (taxol)이 봉입된 고형지질나노입자임을 확인하였다.
[표 3】
Figure imgf000020_0001
1-3： 고분자 링커 (PEG 유도체)가 결합된 난용성 약물 (Taxol)이 봉입된 고형지질나노입자의 제조 (Taxol containing SLN-PEG (유도체))
상기 실시예 1-1에서 제조된 난용성 약물 (taxol)이 봉입된 고형지질나노입자 나노입자의 표면은 DC-콜레스테를에 의해서 양이온성 아민 (ᅳ NH2)를 가지고 있다. 상기 난용성 약물 (taxol)이 봉입된 고형지질나노입자의 표면의 양이온성 아민과 상기 화학식 l(n=106)의 PEG 유도체 (NOF Corporation)의 몰비를 1:3의 비율로 반응을 하여 하룻밤 동안 상온에서 교반 (stirring)과 함께 상기 난용성 약물 (taxol)이 봉입된 고형지질나노입자의 양이온성 아민 (-NH2)과 상기 PEG 유도체의 N- 하이드록시숙신이미드 (NHS)와의 아민 -N-하이드록시숙신이미드 (NHS) 결합에 의해서 난용성 약물 (taxol)아 봉입된 고형지질나노입자와 상기 PEG 유도체를 화학적으로 결합 시켰고, Sephacryl S— 200 column을 통해서 고분자 링커 (PEG 유도체)가 결합된 난용성 약물 (Taxol)이 봉입된 고형지질나노입자 (Taxol containing SLN-PEG (유도체))만 분리 하였다. 1-4: 표적 지향 물질 (세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체 제조 (Taxol containing SLN-PEG (유도체) -cetuximab)
' nitrogen-purged HEPES buffer(pH 8)를 용매로 사용하여 녹아있는 traut's reagent를 세투시맙과 몰비 1:1의 비율로 상온에서 2시간 동안 교반 (stirring)시켰고， 세투시맙의 아민기를 티올기로 치환한 후 PD-10 column으로 아민기가 티올기로 치환된 세투시맙만 정제 분리하였다.
세투시맙의 아민 (― NH2)기를 티올 (-SH)기로 치환하여 치환된 세투시맙을 상기 실시예 1-3에서 제조된 고분자 링커 (PEG 유도체)가 결합된 난용성 약물 (Taxol)이 봉입된 고형지질나노입자에 결합된 PEG 유도체의 말단에 있는 말레이미드기 (-maleimide)와 티올 -말레이미드 반웅에 의해서 4°C에서 하룻밤 동안 교반 (stirring)하여 화학적으로 결합 시켰고, Sephacryl S-200 column을 통해서 표적 지향 물질 (세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체 (Taxol containing SLN—PEG (유도체) -cetuximab)만 분리하였다.
1-5： 표적 지향 물질 (세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체의 물리화학적 특징
실시예 1-4에서 제조된 표적 지향 물질 (세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체의 ᅵ물리화학적 특성을 실시예 1-2에 기재된 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과를 표 4에 나타냈다.
표 4에 나타난 바와 같이 상기 표적 지향 물질 (세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체의 물리화학적 특징을 확인할 수 있었으며， 구체적으로 상기 표적 지향 물질 (세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체가 150 200 nm 수준의 크기와 -3 내지 O mV 수준의 표면전하를 가짐을 확인할 수 있었다.
【표 4】
Figure imgf000022_0001
상기 표적 지향 물질 (세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체를 원자힘 현미경 (Atomic Force Microscope)으로 관찰하였다. 구체적으로 원자힘 현미경 영상은 ΙΟΟμΙ 의 표적 지향 볼질 (세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체 (5mg/ml)를 투명한 운모면 (mica) 뷔에 적하 (dropping) 한 후 질소 건조를 통한 용매를 제거 후 표적 지향 물질 (세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체만 운모면 위에 화학적 흡착이 되게 한 후 측정하였다. 측정 조건은 스캔 영역이 10 um X 10 urn 인 비접촉 방식 (non—contact mode)의 XE— 100 AFM 시스템 (Park System, Korea)를 이용하여 얻었고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 표적 지향 물질 (세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체는 구형이며， 크기의 편차가 크지 않은 균일한 크기임을 육안으로 확인 할 수 있었다.
〈실시예 2>난용성 약물 전달체의 폐암세포에서의 항암효과실험
2-1. 약물이 봉입되지 않고 표적 지향 물질 (세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체 (SLN-PEG (유도체) -세투시맙 (vehicle))의 제조
아래의 표 5에 나타난 바와 같이, 구성성분으로 탁솔을 제외한 것 외에는 상시 실시예 1-1과 동일한 방법으로 나노입자를 제조하였고， 실시예 1-3 및 1-4와 동일한 방법으로 약물이 봉입되지 않은， 약물 전달체 (SLN- PEG (유도체)— cetuximab(vehicle))를 제조하였다.
[표 5】
Figure imgf000023_0001
2-2. 표적 지향 물질 (리룩시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체 제조 (Taxol containing SLN— PEG (유도체) -rituximab)
CD20+를 표적할 수 있는 리특사맙 (Rituxan)이라는 표적 지향 물질을 나노입자의 표면에 도입한 CD20+ 세포 표적지향형 약물 전달체를 리특시맙을 표적 지향 물질로 사용한 것 외에는 상기 실시예 1ᅳ4와 동일한 방법을 사용하여 제조하였다.
2:1 2-3. 폐암세포주유래 설치류의 준비
폐암 세포 주 (NCI-H1975, ATCC CRLᅳ 5908)를 matrigel 100 μΐ에 lxlO6 개씩 희석 한 후， 8주령 된 마우스 (BALB/c-nu. (주)오리엔트바이오) 우측 허리 (마우스의 팔이나 다리가 접근 할 수 없는 부분) 피하 주사 (Subcutaneous Injection, S.C injection)하여 폐암 세포 주 유래 설치류 폐암모델을 유도하였다. 7일 후， Caliper를 이용하여 암의 크기를 측정한 다음， 크기가
50-100 mm3 정도 되었을 때 그룹 마다 암의 크가가 일정하도록 하여 9마리씩 나누어 폐암 세포주 유래 설치류를 준비하였다ᅳ 2-4. 폐암세포 (NCI-H1975)에서의 항암효과확인
PBS, 실시예 1-1에서 제조된 Taxol containing SLN, 실시예 1— 3에서 제조된 Taxol containing SLN-PEG (유도체), 실시예 1—4에서 Taxol containing SLN-PEG (유도체) -cetuximab, 실시예 2-1에서 제조된 약물을 함유하지 않는 SLN-PEG (유도체) -cetuximab(vehicle) 및 실시예 2-2에서 제조된 Taxol containing SLN-PEG (유도체) -rituximab을 암세포가 전이된 마우스에 미정맥 주사한 후 시간에 따른 암 조직의 부피를 측정하였다 (/7=9) 인산 완충 용액 (PBS, Phosphate buffered saline)은 생체 내의 염농도와 물리화학적으로 동알한 등작액으로서 단지 마우스에 미정맥 투여되는 상기 다른 나노입자 용액의 부피와 동일한 부피를 마우스에 투여 하는 아무런 처리를 하지 않은, 아무런 효과를 기대하지 않은 마우스 그룹에 해당하는 비교군으로 사용되었다. Taxol containing SLN-PEG (유도체)은 Taxol containing SUM-PEG (유도체) -cetuximab와 비교하여 표적 지향 물질인 cetuximab에 의한 효과가 얼마나 있는지를 확인 하기 위한 비교군이며， Taxol containing SLN은 Taxol containing SLN-PEG (유도체) -cetuximab 또는 Taxol containing SLN-PEG (유도체)과 비교하여 체내 잔류시간을 증가시키기 위한 생체 적합 고분자 물질인 폴리에틸린글리폴 (PEG)의 유도체에 의한 효과가 얼마나 있는지를 확인 하기 위한 비교군으로 사용되었다. 또한 Taxol containing SLN—PEG (유도체) -rituximab은 Taxol containing SLN— PEG (유도체) -cetuximab과 비교하여 동일한 분자량 및 크기 (Mw 170,000)를 가지고 있으나 마우스에 심어진 폐암 세포 주 (NCI-H1975)에서 과발현, 되는 EGFR1을 특이적으로 표적할 수 있는 특성에 의한 효과를 확인하기 위한 것으로 상기 Taxol containing SLN—PEG (유도체) -rituximab에 사용 된 rituximab은 EGFR1에 대한 특이적인 반응성이 없는 물질임을 의미한다.
상기 실시예 2— 3에 의해 준비된 마우스에 21일 동안 주 1회 각 그룹 별로 시료를 22 mg (taxol)/kg (마우스의 질량 (kg) 당 주사 되는 난용성 약물 (taxol)의 용량 (mg))의 함량으로 미정맥 투여 (Intravenous Injection, I.V injection)하였고,. 시료를 투여하는 기간을 포함하여 총 42일 동안 주 1회 암의 크기를 Caliper를 이용하여 측정하였고 아래의 수학식 2와 같이 계산하여， 그 결과를 도 3에 나타내었다.
[수학식 2]
암 조직의 부피 = 1/2 X larger diameter x (smaller diameter)2
Larger diameter = 암조직 중에서 긴 , smaller diameter = '암조직 중에서 짧은 축 '
도 3에 나타난 바와 같이， 폐암세포 (H1975)에서 과발현되는 EGFR1 항원을 표적할 수 있는 세투시맙 (Cetuximab)이라는 표적 지향 물질을 표면에 도입한 난용성 약물 전달체 (Taxol containing SLN-PEG (유도체)— cetuximab)의 경우 다른 비교군에 비해 우수한 암 치료효과를 나타냄을 확인 할 수 있었다.
〈실시예 3>난용성 약물전달체의유방암세포에서의 항암효과실험
3-1. 표적 지향 물질 (트라스트주맙)이 결합된 난용성 약물 전달체 제조 (Taxol containing SLN-PEG (유도체) -herceptin) 트라스트주맙 (상품명 : Herceptinᅳ허셉틴)을 표적 지향 물질로 사용한 것 외에는 상기 실시예 1-4와 동일한 방법을 사용하여 표적 지향 물질 (E라스트주맙)이 결합된 난용성 약물 전달체를 제조하였다.
3-2.유방암세포주유래 설치류의 준비
유방암세포 (SK-BR— 3， ATCC HTB-30)를 사용한 것 외에는 실시예 2ᅳ 3과 동일한 방법올 사용하여 유방암 세포주 유래 설치류를 준비하였다 (7二 6).
3- 3.유방암세포 (SK-BR-3)에서의 항암효과 확인
PBS, 실시예 1-3에서 제조된 Taxol containing SL^N— PEG (유도체), 실시예 3-1에서 제조된 Taxol containing SLN—PEG (유도체)ᅳ herceptin을 실시예 2-4와 동일한 방법으로 암세포가 전이된 마우스에 미정맥 주사한 후 시간에 따른 암 조직의 부피를 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다 (n=6)
도 4에 나타난 바와 같이， 유방암세포 (SK-BH3)에서 과발현하는. 항원인 EGFR2를 표적할 수 있는 허셉틴 (Herceptin)이라는 표적 지향 물질을 표면에 도입한 표적 지향 물질 (트라스트주맙)이 결합된 난용성 약물 전달체 (Taxol containing SLN-PEG (유도체)— herceptin)의 경우 다른 대조군에 비해 우수한 암 치료효과를 나타냄을 확인 할 수 있었다.
.
〈실시예 4〉 MTT분석
4- 1. 약물이 봉입되지 않은 고형지질나노입자의 제조 (SLN(vehicle)) 상기 표 5에 나타난 바와 같이, 구성성분으로 탁솔을 제외한 것 외에는 상시 실시예 1-1과 동일한 방법으로 약물이 봉입되지 않은 고형지질나노입자를 제조하였다. 4-2. 폐암세포주 (NCI-H1975)에서의 세포 생존율 확인
항암 효능은 MTT 시약에 의한 방법으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다. NCI-H1975 세포를 웰 당 5 X 103 세포가 되도록 96 well에 분주 (seeding)하고 24 시간 배양한 후， 실시예 4—1에서 제조된 SLN(vehicle), 실시예 1-1에서 쎄조된 Taxol containing SLN, 실시예 1-3에서 제조된 Taxol containing SLN-PEG (유도체) 및 실시예 1-4에서 제조된 Taxol containing SLN-PEG (유도체) -cetuximab을. 각각 well 플레이트에 첨가하여 37. °C의 C02 세포배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 그 후 배지 (RPMI1640)를 well plate에서 제거 한 후 MTT 용액을 가하였고，' 4시간 더 배양한 후 MTT 용액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더 (elisa reader)를 이용하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였고， 그 결과를 도 5에 나타내었다 (대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다). ' ᅳ
도 5에 나타난 바와 같이， taxol containing SLN-PEG (유도체) - cetuximab 조건에서 더 증강된 암세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 taxol containing SLN-PEG (유도체)― cetuximab의 경우 NCI-H1975 세포주 내부에 보다 효과적으로 탁솔을 전달하여 증강된 항암 효능을 나타내는 것을 알 수 있ᅳ다.
4-3.유방암세포주 (SK-BR-3)에서의 세포생존율 확인
Taxol containing SLN— PEG (유도체)— cetuximab ■대신에 Taxol containing SLN— PEG (유도체)— herceptin을 사용한 것 외에는 상기 실시예 4- 2와 동일한 방법을 사용하였고， 그 결과를 도 6에 나타내었다 (대조군으로는 아무것도 처：리하지 않은 세포가사용되었다). /
도 6에 나타난 바와 같이， taxol containing SLN-PEG (유도체) - herceptin 조건에서 더 증강된 암세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 taxol containing SLN— PEG (유도체) -herceptin의 경우 SK— BR-3 세포주 내부에 보다 효과적으로 탁솔을 전달하여 증강된 항암 효능을 나타내는 것을 알 수 있다. 〈실시예 5. FACS분석 >
5-1. Dylight 488 conjugated taxol containing SLN의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조된 약물 (Taxol)이 봉입된 고형지질나노입자의 양이온성 아민 (-NH2)과 Dylight 488 NHS Ester(Mw 1011)(Thermoscientific)의 몰비 (moral ratio)를 10:1 mol/mol의 비율로 반웅을 하며 하룻밤 동안 상온에서 교반 (stirring)과 함께 반응을 하여 상기 약물 (Taxol)이 봉입된 고형지질나노입자의 양이온성 아민 (_NH2)과 Dylight 488 NHS Ester의 N-하이드특시숙신이미드 (NHS)와의 아민 -N- 하이드록시숙신이미드 (NHS) 결합에 의해서 상기 약물 (Taxol)이 봉입돤 고형지질나노입자와 형광물질 (Dylight 488 NHS Ester)을 화학적으로 결합을 시켰고， Sephacryl S-200 column을 통해서 형광물질만 결합된 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN만 분리 하였다..
5-2. Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG (유도체)의 제조
Acj-7] 실시예 5一1에서 제조된 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN을 상기 실시예 1-3과 같은 방법을 사용하여 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG (유도체)를 제조하였다.
5-3. Dylight 488 conjugated taxol containing SLN— PEG (유도체) - cetuximab의 제조
상기 실入 1예 5一 2에서 제조된 Dylight 488 conjugated taxol containing
SLN— PEG (유도체)을 상기 실시예 1—4와 같은 방법을 사용하여 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN— PEG (유도처 D— cetuximab을 제조하였다.
5-4. Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG (유도체) - herceptin의 제조
상기 실시예 5— 2에서 제조된 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG (유도체)을 cetuximab 대신 herceptin을 사용한 것 외에는 상기 실시예 1-4와 같은 방법을 사용하여 Dylight 488 conjugated taxol containing SI^N-PEG (유도체)— herceptin을 제조하였다.
5-5. NCI-H1975세포주에서의 전달효율 평가
NCI-H1975 세포를 웰 당 2 X 104 세포가 되도록 6 well에 분주 (seeding)하고 24 시간 배양한 후， 실시예 5-1에서 제조된 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN, 실시예 5-2에서 제조된 Dylight :488 conjugated taxol containing SLN-PEG (유도체), 실시예 5—3에서 제조된 Dylight 4.88 conjugated . taxol containing SLN-PEG (유도체) -cetuximab을 각각 well 플레이트에 첨가하여 37 °C의 C02 세포배양기에서 0.5시간 동안 배양하였다. 그 후 배지 (RPMI1640)를 well plate에서 제거 한 후, TrypLE™ Express 을 가해서 well plate에 유착 (adhesion)되어 있는 세 ¾를 떼어 내었고， 인산완충용액 (PBS)에 재분산 시킨 후 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR를 사용하여 측정하였고， 그 결과를 도 7에 나타내었다 (대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가사용되었다).
도 7에 나타난 바와 같이， Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG (유도체) -cetuximab 조건에서 더 우수한 세포의 형광 강도 피크의 이동을 확인하였다. 이러한 결과로부터 taxol containing SLN-PEG (유도체) - cetuximab 경우 NCI-H1975 세포주 내부에 보다 효과적으로 난용성 약물 (taxol)을 전달하여 증강된 전달 효율을 나타내는 것을 알 수 있다. 5-6. SK-BR-3 세포주에서의 전달효율평가
Dylight 488 conjugated taxol containing SLN— PEG (유도체) - cetuximab 대신 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN— PEG (유도체 )— herceptin을 사용한 것 및 NCI—H1975 세포 대신 SK-BR-3 세포를 사용한 것 외에는 실시예 5-5와 같은 방법을 사용하여 측정하였고. 그 결과를 도 8에 나타내었다 (대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다).
도 8에 나타난 바와 같이, Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG (유도체) -herceptin 조건에서 더 우수한 세포의 형광 강도 피크의 이동을 확인하였다. 이러한 결과로부터 taxol containing SLN—PEG (유도체)― herceptin 경우 SK—BR-3 세포주 내부에 보다 효과적으로 난용성 약물 (taxol)을 전달하여 증강된 전달 효율을 나타내는 것을 알 수 있다.
〈실시예 6. taxol containing SLN-PEG—cetuximab 항암효능> 탁솔이 내부에 봉입되어 있는 난용성 약물 전달체의 우수한 항암효과를 검증하기 위해 주사되는 taxol containing SLN-PEG-cetuximab의 농도에 따른 항암효과를 관찰하였다. 이는 주사되는 난용성 약물 전달체의 농도에 따른 항암효과를 관찰함으로써， 항암효과가 관찰되는 주사 가능한 난용성 약물 전달체의 농도 범위를 확인 하기 위함이다.
크기가 50 100 mm3 정도 되었을 때 그룹 마다 암의 크기가 일정하도록 하여 4마리씩 나눈 것 외에는 상기 실시예 2-3과 동일한 방법을 사용하여 폐암 세포주 유래 설치류를 준비하였다.
최대내성용량 (MTD, maximum tolerance dose, 10 %정도의 체중감소가 관찰되는 정도의 용량， 심한 독성학적인 변화가 관찰되지 않는 용량 및 사망이 관찰되지 않는 최대.량) 값은 실험을 통해 확인하였다. 0, 100, 200, 400 mg
(난용성 약 1"이 봉입 된 나노입자) /kg (mouse)의 용량을 각각 용량 별 마우스 그룹에 미정맥 주사하고 그 후 1， 2， 3， 4일 후에 다시 미정맥 주사하였고 (총 4회 주사), 주사 기간 동안 마우스의 체중변화와 상태 (움직임， 사망유무)를 관찰하였다ᅳ 투여용량 중 0이 의미하는 것은 PBS 용액 (인산완충용액， phosphate buffered saline. pH7.4)을 의미하며, 실험결과 200 mg (난용성 약물이 봉입 된 나노 자) /kg (mouse) or 22 mg (taxoD/kg (mouse)가 Taxol containing SLN-PEG (유도체)— cetuximab의 MTD 값으로 확립돠었다.
PBS(PBS 그룹은 아무런 효과가 기대되지 않은 그룹)， 1.1, 2.2， 5.5, 11， 22 mg (taxol)/kg (mouse)의 용량을 각각 용량 별 마우스 그룹에 미정맥 주사하고， 그 후 7, 14, 21일 후에 다시 미정맥 주사하였고 (총 4회 주사)， 그 결과를 도 9에 나타내었다 (77=6).
도 9에 나타난 바와 같이. 각 그룹에서의 시간에 따른 암 ,조직의 부피 변화를 확인하였다. 결과를 분석하기 위해 스류던트티검정 (student's t-test) 통계기법을 이용하여 MTD 값인 22 mg (taxoD/kg (mouse) 를 주사하는 그룹과 다른 그룹 (11， 5.5. 2.2， 1.1 mg (taxoD/kg (mouse) 주사그룹)에서의 21일 째 암 조직 부피의 유의적 차이를 평가하였다. 보다 구체적으로 스튜던트티검정 (student's t-test) 통계기법을 이용하여 분석을 하였을 때 p- value 가 0.01 이하가 되면 MTD 값인 22 mg (taxoD/kg (mouse)을 주사하는 그룹의 암 조직 부피와 유의적으로 차이가 있음을 의미하고， /)— value 가 ᄋ.이 이상이 되면 되면 MTD 값인 22 mg (taxoD/kg (mouse)을 주사하는 그룹의 암 조직 부피와 유의적으로 차이가 없음을 의미하는 것을 이용하여 분석하였다.
MTD 값인 22 mg (taxoD/kg (mouse)을 주사하는 그룹과 나머지 그룹 (11， 5.5, 2.2， 1.1 mg (taxoD/kg (mouse)을 주사하는 그룹)에서의 21일 째 암 조직 부피의 유의적 차이를 평가하였는데 1.1 mg (taxol)/kg (mouse)을 주사하는 그룹에서의 p-value가 0.01이하를 나타내었다. 이는 MTD 값인 22 mg (taxoD/kg (mouse)을 주사하는 그룹과 암 조직 부피가 유의적으로 차이가 있음을 의미한다. 나머지 그룹 (11, 5.5, 2.2 mg (taxoD/kg (mouse)을 주사하는 그룹)은 ?一 value가 0.0Γ 이상을 나타내었다. 이는 MTD 값인 22 mg (taxoD/kg (mouse)을 주사하는'그룹과 암 조직 부피가 유의적으로 차이가 없다는 것을 의미하며， 이를 통해 11， 5.5， 2.2 mg (taxol)/kg (mouse)을 주사하였을 때에도 MTD 값인 22 mg (taxoD/kg (mouse)을 주사하였을 때와 동일한 항암 효과가 있다는 것을 알았다.
이를 통해 난용성 약물 전달체의 최대 항암효과가 관찰 되는 주사 가능한 농도는 2.2~22 mg (taxol)/kg (mouse)이다는 것을 알 수 있었다. 〈실시예 7. Genexol®-PM과비교실험〉
현재 암환자들의 항암치료를 위해 이용되고 있는 탁솔 (Taxol)이 내부 상에 봉입된 나노입자로서, 마이셀 (micelle) 구조를 가지고 있는 삼양사의 Genexol®-PM을 비교군으로 선정하여 암 치료효과를 비교하였다.:
크기가 50~100 mm3 정도 되었을 때 그룹 마다 암의 크기가 일정하도록 하여 6 마리씩 나눈 것 외에는 상기 실시예 2-3과 동.일한 방법을 사용하여 폐암 세포주 유래 설치류를 준비하였다.
마우스에 미정맥 투여하는 용량으로 Genexol®— PM 및 Taxol containing SLN-PEG (유도체)—cetuximab의 경우 각각 MTD 값 만큼 투여하였다.
Genexol®-PM의 MTD 값은 제조사인 삼양사에 발표한 논문을 참고하였.다 (In vivo evaluation of polymeric micellar paclitaxel formulation: toxicity and efficacy. Journal of Controlled Release 2012；72： 191-202.).
미정맥 투여 시 상기 실시예 1-4에서 제조한 taxol containing SLN— PEG (유도처))— cetuximab의 양은 22 mg (taxol/kg (mouse)이고 Genexol®— PM의 양은 60 mg (taxol)/kg (mouse)인 것 이외에는 상기 실시예 2ᅳ 4와 동일한 방법을 사용하여 실험하고 확인하였고， 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, Genexol®— PM에 비해 taxol containing SLN-PEG (유도체) -cetuximab의 항암효과가 더 우수하다는 것을 확인하였다. 아래에 표 6에 나타난 바와 같이, Taxol containing SLN-PEG (유도체) - cetuximab의 실제로 몸 안으로 주사되는 탁솔의 함량 범위는 22 mg (taxol)/kg (mouse)이다. 그러나 실시예 6의 결과와 같이 MTD값인 22 mg (taxol)/kg (mouse)은 2.2 mg (taxoD/kg (mouse)의 투여와 통계학적으로 유와적인 차이가 없으며, 이는 Genexol®-PM에 의해 주사되는 탁솔의 함량인 60 mg (taxoD/kg (mouse) 보다 낮은 함량을 포함하고 있어 더 낮은 탁솔 함량으로도 현재 상용되고 있는 Genexol®ᅳ PM보다 우수한 항암효과를 나타낼 수 있을 것으로 예상할 수 있다. 또한 더 낮은 탁솔 함량으로도 더 우수한 항암효과를 나타낼 수 있기 때문에 주사하는 난용성 약물 전달체의 농도를 조절하여 탁솔의 함량을 조절한다면 탁솔에 의한 부작용을 최소화 하면서 더 우수한 항암효과를 나타낼 수 있으며， 이와 같은 결과는 난용성 약물 전달체의 우수한 암 조직으로의 표적능력 및 난용성 약물 전달 능력 때문이다.
【표 6】
Figure imgf000033_0001

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1.】 .
콜레스테릴 에스테르 (cholesteryl ester) 및 트리글리세라이드 (triglyceride)를 함유하는 코어 지질부 및 인지질 (phospholipid), 콜레스테를 (cholesterol) 및 양이온성 지질을 함유하는 표면지질부를 함유하는 고형 나노입자와，
상기 고형 나노입자의 내부에 봉입된 난용성 약물과， 상기 표면지질부에 고분자 링커를 통해 연결된 표적 지향 물질을 포함하는, 표적지향형 난용성 약물 전달체.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서, 상기 난용성 약물 전달체의 표면 전하는 -10 내지 10niV인, 난용성 약물 전달체. .
[청구항 3】
제 1 항에 있어서， 상기 고분자 링커는 상기 양이온성 지질에 함유된 아민기 (-NH2)와 결합가능한 제 1 관능기와 상기 표적 지향 물질에 함유된 관능기에 결합 가능한 제 2 관능기를 포함하며， 상기 제 1 관능기는 - NHS (숙신이미드기), -CH0 (알데하이드기) 또는 -COOH (카르복실기)이고, 상기 제 2 관능기는 말레이미드기， -COOH (카르복실기) 또는 -SH (티올기)인 난용성 약물 전달체.
[청구항 4】
제 3 항에 있어서， 상기 양이온성 지질의 아민기와 고분자 링커의 관능기의 몰비 (아민기: 제 1 관능기)는 1:1 내지 1:5인 난용성 약물 전달체.
【청구항 5】
제 3 항에 있어서, 상기 고분자 링커의 제 2 관능기와 표적 지향 물질의 관능기의 몰비 (제 2 관능기: 표적 지향 물질의 관능기)는 1:1 내지 1:10인 난용성 약물 전달체.
【청구항 6】
제 5 항에 있어서, 상기 표적 지향 물질의 관능기는 아미노기 또는 티올기인 난용성 약물 전달체.
【청구항 7】
제 1 항에 있어서. 상기 고분자 링커는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). PLACpolylactic acid), PGA(polyglycolic acid), 폴리에스테르. 폴리오르토에스테 ， 폴리안하이드라이드, 폴리아미노산,
PHA(polyhydroxyalkanoate), PCL(polycaprolactone), 폴리알킬카보네이트, 알부민, 젤라틴， 콜라젠， 피브린, 알긴산, 키틴， 키토산, 덱스트란， 하알루론산, 전분 및 그 유도체들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체,
【청구항 8】
제 7 항에 있어서, 상기 고분자 링커는 하기 화학식 1의 폴리에틸렌 글리콜 유도체인 난용성 약물 전달체;
[화학식 1]
Figure imgf000036_0001
상기 화학식 1에서， n은 4 내지 1130이다.
[청구항 9】
' 제 1항에 있어서, 상기 약물 전달체는 콜레스테릴 에스테르는 30 내지
60 중량 트리글리세라이드 0.1 내지 10 중량 %; 인지질 5 내지 30 중량 <¾; 콜레스테롤 5 내지 20 중량 양이온성 지질 10 내지 50 중량 %; 및 난용성 약물 10 내지 20중량 <¾을 함유하는 난용성 약물 전달체.
[청구항 10】
제 1항에 있어서， 상기 콜레스테릴 에스테르는 탄소수 .10 내지 24개의 불포화지방산과 콜레스테를의 에스테르인 난용성 약물 전달체.
【청구항 11】
― 제 1항에 있어서 , 상기 트'리글리세라이드는 트리아세틴 (triacetin)， 트리부티린 (tributyrin), 트리카프로민 (tricaproin), 트리카프릴린 (tricaprylin), 트리카프된 (tricaprin) 및 트리올레인 (triolein)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체.
【청구항 12】
제 1항에 있어서， 상기 인지질은 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), POPC(palmitoyloleoylphosphatidylcholine), EPC(egg phosphatidylcholine), DSPC(distearoylphosphatidylcholine), DOPC(dioleoylphosphatidylcholine). DPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine), DOPG(dioleoylphosphatidylglycerol) 및 DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체.
【청구항 13】
제 1항에 있어서. 상기 양이온성 지질은 3베타 -[Ν-(Ν'.Ν',Ν'- 트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테를 (TC-콜레스테를)，. 3베타 [Ν-(Ν',Ν'- 디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤 (DCᅳ콜레스테를), 3베타 [N— (Ν'- 모노메틸아미노에탄)카바모일 ]콜레스테를 (MCᅳ콜레스테를), 3베타 [Ν
(아미노에탄)카바모일 ]콜레스테롤 (AC -콜레스테롤), Ν-(Ν'- 아미노에탄)카바모일프로파노익토코페를 (AO토코페를), Ν-(Ν'- 메틸아미노에탄)카바모일프'로파노익토코페를 (MC -토코페를), Ν,Νᅳ디을레일- Ν,Ν-디메틸암모늄클로라이드 (D0DAC), Ν,Ν—디스테아릴 -Ν,Ν- 디메틸암모늄브로마이드 (DDAB), -(1ᅳ(2，3-디올레오일옥시)프로필- ^， - 트리메틸암모늄클로라이드 (DOTAP), 1시^-디메틸-(2，3-디 을레오일옥시)프로필아민 (DODMA), Nᅳ (1ᅳ(2,3-디올레오일옥시)프로필) -
N . N, N -트리메틸암모늄클로라이드 (DOTM A)， 1， 2 -디올레오일 - 3 -디메틸암모늄— 프로판 (D0DAP), 1,2-디올레오일카바밀 -3-디메틸암모늄—프로관 (D0CDAP), 1， 2ᅳ디리노일 - 3 -디메틸암모늄ᅳ프로판 (DLIND AP ) , 디올레오일옥시— N - [ 2 - 스퍼민카복사미도)에틸 }-N,N-디메틸 -1-프로판아미늄 트리플루오르- 아세테이트 (D0SPA), 디옥타데실-아미도글리실스퍼민 (DOGS), 1,2- 디미리스틸옥사프로필ᅳ 3-디메틸-하이드록시에틸암모늄브로마이드 (DMRIE), 3- 디메틸아미노 -2— (콜레스트 -5-엔 -3ᅳ베타-옥시부탄 -4-옥시) -l-(cis.ds-9,12- 옥타디카디엔옥시) 프로판 (CLinDMA), 2ᅳ [5'ᅳ (콜레스트 -5-엔 -3.베타.—옥시) - 3'—옥사펜특시)ᅳ 3-디메틸 -l-(cisᅳ cis-9',12'- 옥타디카디엔옥시)프로판 (CpLinDMA), N—디메 ¾-3，4- 디올레오일옥시벤질아민 (DMOBA), 1.2-N.N'ᅳ디올레일카바밀ᅳ 3- 디메틸아미노프로판 (DOcarbDAP). 1,2-디아실 3-트리메틸암모늄—프로판 (TAP) 및 1,2-디아실 -3-디메틸암모늄-프로판 (DAP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체.
[청구항 14】
제 1항에 있어서, 상기 표적 지향 물질은 베바시주맙 (Bevacizumab), 앨로티닙 (edot iib), 게피티니브 (Gefitinib). 메실산이매티닙 (imatinib mesylate), 세투시맙 (cetuximab), 리투시맙 (rituximab), 트라스트주맙 (trastzumab), 폴레이트 (folate) 및 RGD로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체.
【청구항 15】
제 1항에 있어서, 상기 난용성 약물은 난용성 항암제， 항바이러스제, 스테로이드계 소염제 (steroidal anti-inflammatory drugs), 항생제， 항진균제. 비타민， 프로스타사이클린 (prostacyclin), 항대사제， 축동제 (mitotics), 아드레날린 길항제 (adrenaline antagonist), 항경련제， 항불안제, 정은제， 항우을제， 마취제， 진통제， 동화성 스테로이드제， 면역 억제제 및 면역 촉진제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체.
[청구항 16】
제 15항에 있어서， 상기 난용성 항암제는 상기 난용성 항암제는 탁솔 (Taxol), 아이다루비신 (idarubicin), 미특산프론 (mitoxantrone), 파클리탁셀 (paclitaxel), 도세탁샐 (docetaxel), 메소트렉세이트 (methotrexate), 트리 메트렉세이트 (trimetrexate), 치오구아닌 (thioguanine), 메르캅토퓨린 (mercaptopurine), 클라드리 빈 (claclrabine), 암루비신 (amrubicin), 옥트레오타이 드 (octreotide), 고세 레린 (Gosereline), 류프로라이 드 (leuprolide), 플루타마이 드 (Flutamide). 카소텍스 (Casoclex). 독소루비신 (doxorubicin). 5- 플로로우라살 (5-fluorouracil), 플루다라빈 (fludarabine), 시타라빈 (cytarabine), 마이토마이신 C(mitomycin-C). 스티 렌 말레산 네오카르지 노 스타틴 (Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴 (cisplatin), 카보플라틴 (carboplatin), 옥사리플라틴 (oxaliplatin), 카뮤스틴 (carmustine (BCNU)), 다카바진 (dacabazine), 에토포사이드 (etoposide), 다우노마이 신 (daunomycin), 닥티 노마이신 (dactinomycin). 빈카알칼로이드 (vinca alkaloid). 블레오마이신 (bleomycin). 사이 클로포스파마이드 (cyclophosphamide), 이 포스파마이 드 (Ifosfamide), 젬시타빈 (gemcitabine), 페메트렉시드 (pemetrexed), 캄프토테신 (camptothecin), 이 리노테칸 Grinotecan), 토포테 칸 (topotecan), 클로람부실 (chlorambucil) 및 멜파란 (meiphalan)로 이루어 진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체 .
【청구항 17】
제 1 항에 있어서 , 상기 난용성 약물 전달체의 크기 는 30 내지 300 nm인 , 난용성 약물 전달체 .
【청구항 18】
제 1항 내지 제 17항 증 어 느 한 항의 난용성 약물 전달체를 20 내지 200 mg/kg 범위로 포함하는 약학적 조성물.
【청구항 19】 콜레스테릴 에스테르， 트리글리세라이드, 인지질， 콜레스테를， 양이온성 지질 및 난용성 약물을 유기용매에 용해시킨 후 물을 첨가하여， 콜레스테릴 에스테르 (cholesteryl ester) 및 트리글리세라이드 (triglyceride)를 함유하고 그 내부에 난용성 약물이 봉입된 코어지질부 및 인지질 (phospholipid), 콜레스테를 (cholesterol) 및 양이온성 지질을 함유하는 표면지질부를 포함하는 나노입자를 제조하고;
상기 나노입자의 표면지질부에 아미드 결합 (amide bond)으로 고분자 링커를 결합하고; 및
상기 고분자 링커에 표적 지향 물질을 결합하는 단계를 포함하는, 제 1항의 난용성 약물 전달체를 제조하는 방법. 【청구항 20】
제 19 항에 있어서, 상기 유기용매는 상기 콜레스테를 에스테르의 융점보다 높고 물의 끓는점보다 낮은 비점을 갖는 유기용매인 방법.
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