KR20140036338A - 표적지향형 난용성 약물 전달체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 난용성 약물 전달체, 그의 제조방법, 이를 이용한 난용성 약물의 전달방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암세포 특이 표적 지향화를 목표로 하는 난용성 약물 전달체에 관한 것으로, 암세포에서 과발현되는 항원에 특이적으로 반응할 수 있는 암 세포 표적지향물질의 종류를 다양하게 조절하여 난용성 약물 전달체의 표면에 결합할 수 있고, 내부에 봉입되는 난용성 약물의 종류를 암의 종류 및 치료 목적에 따라 다양하게 조절할 수 있어 암치료법에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

표적지향형 난용성 약물 전달체 {TARGETTED DRUG DELIVERY SYSTEM OF POORLY WATER-INSOLUBLE DRUGS}
본 발명은 난용성 약물 전달체, 그의 제조방법, 이를 이용한 난용성 약물의 전달방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
통상적으로 암을 치료하는 방법에는 외과적 수술, 방사선 치료 및 약물 치료의 세 가지 방법이 있다. 각 방법은 암 치료를 위해 독자적으로 사용될 수도 있고 두 가지 이상의 방법이 함께 사용될 수도 있으며, 많은 초기 단계의 암들은 외과적 수술로 치료가 가능하지만, 암이 많이 진전되거나 전이가 일어날 경우에는 외과적 수술만으로는 치료가 어렵고, 방사선 치료 또는 약물 치료 등의 방법이 병행되어야 한다.
방사선 치료는 X-선이나 γ-선을 암세포에 조사하는 방법으로서, 이때 방출되는 광선은 외과적으로 수술이 곤란한 부위나 방사선에 특히 반응성이 좋은 암세포에 사용되거나 수술 전후에 사용될 수도 있다. 또한, 약물 치료는 세포독성(cytotoxic) 약을 경구나 주사로 투여하여 암세포의 증식에 필요한 DNA나 효소를 파괴하는 방법을 채용한다. 특히, 약물 치료법이 외과적 수술이나 방사선 치료에 비해 갖는 장점은 신체의 어떤 부위에 암이 발명되더라도 약물을 도달시킬 수 있고, 전이된 암을 치료할 수 있다는 점이며, 이와 같은 사유로 약물 치료법은 전이성 암 치료에 대한 표준요법으로 널리 사용되고 있다. 물론, 약물 치료법으로 전이된 암을 완치시킬 수 있는 것은 아니지만, 증상을 완화시켜 환자의 삶의 질을 개선시키고 수명을 연장시켜 주는 중요한 역할을 한다.
일반적으로 약물 치료의 경우, 현재까지 독소루비신(doxorubicin), 시스플라틴(cisplatin), 탁솔(taxol), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil) 등의 난용성 약물을 사용한 화학 치료요법이 광범위하게 사용되고 있으나, 투여에 제한적이다. 상기 약물들은 난용성이기 때문에 치료 가능한 정도의 양만 투여해도 환자에게 심한 고통을 가져다 주고 있으며, 과도한 부작용으로 인하여 다량을 투여할 수 없는 실정이다. 이러한 부작용이 나타나는 원인은 항암제의 비선택성 때문인데, 항암제가 암세포에만 작용하지 않고 일반세포에도 작용함으로써 암세포만을 사멸시키지 못하고, 정상적인 세포의 성장도 억제, 괴사시키기 때문에 환자는 심한 고통을 느끼게 된다.
이를 위하여, 마이셀 및 리포좀과 같은 전달체를 제조하여 난용성 항암제를 전달하는데 사용하고 있는데 상기 전달체를 제조할 때 항암제를 첨가하여 항암제가 전달체의 내부에 함유될 수 있게 한다.
최근에는 마이셀 및 리포좀과는 달리 면역반응을 촉발하지 않는 자연계 담체를 구현하는 저밀도 지단백질(Low Density Lipoprotein, LDL)과 유사한 전달체인 고형지질나노입자(Solid Lipid Nanoparticle, SLN)가 항암제를 전달하는 전달체로 사용되고 있는데 상기 저밀도 지단백질(Low Density Lipoprotein, LDL)은 기본적으로 지질 및 단백질의 이동, 구체적으로는 계통순환 전체의 간외부 조직에 대한 콜레스테롤 전달에 관여한다. 실제로, 사이클로스포린 A 및 암포테리신 B 지질 착염(ABLC)같은 비친수성 약물은 전임상(pre-clinical) 또는 임상(clinical) 치료 시 LDL과 결합함으로써 효과적으로 전달되었다.
하지만 혈액에서 자연 저밀도 지단백질(Low Density Lipoprotein, LDL)을 분리하는 방법은 너무 복잡하고 시간 소모가 크기 때문에, 저밀도 지단백질(Low Density Lipoprotein, LDL) 모방 모델인 고형지질나노입자는 아포지질 단백질이 함유되지 않는 대신 콜레스테롤 에스테르 및 인지질로부터 개발되었다.
그러나, 기존 고형지질나노입자인 전달체의 경우 간에 존재하는 식세포에 흡수되거나 신장에 의하여 빠른 시간 안에 배출됨으로써 내부에 봉입된 항암제를 암조직으로 충분히 전달하지 못해 효과적인 항암 치료를 위한 한계를 가지고 있어 문제가 되어 왔다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 자연상 존재하는 저밀도 지단백질의 구성성분을 모방하여 표면 개질을 재구성함으로써, 세포사멸 효율 및 안정성이 향상된 표적 지향형 난용성 약물 전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포사멸 효율 및 안정성이 향상된 표적 지향형 난용성 약물 전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포사멸 효율 및 안정성이 향상되고 표적 지향형 난용성 약물 전달체를 이용하여 난용성 항암제를 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 난용성 약물 전달체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 해결하기 위한 수단으로, 자연상 존재하는 저밀도 지단백질의 구성성분을 모방하여 표면 개질을 재구성함으로써, 세포사멸 효율 및 안정성이 향상된 암세포 특이 표적 지향화를 목표로 하는 난용성 약물 전달체, 그의 제조방법, 이를 이용한 난용성 약물의 전달방법 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
자연상 존재하는 저밀도 지단백질은 두 개의 지질상, 즉 인지질 및 아포지질 단백질로 구성된 표면지질부와 콜레스테롤 에스테르와 트리글리세라이드로 구성된 코어지질부로 이루어지며 조성은 하기의 표 1과 같다.
구분 구성성분 함량 비율 (W/W)
표면지질부(surface) Phospholipid 22
Cholesterol 10
Apolipoprotein B-100 20
코어지질부(core) Cholesteryl ester 45
Triglyceride 3
표면지질부의 인지질 및 아포지질 단백질은 코어지질부인 콜레스테롤 에스테르와 트리글리세라이드로 구성된 비극성 지질을 유화시켜 표면의 안정성을 제공하며, 따라서 안정된 생물학적 마이크로에멀전을 형성할 수 있다.
그러나 혈액에서 자연 저밀도 지단백질(Low Density Lipoprotein, LDL)을 분리하는 방법은 너무 복잡하고 시간소모가 큰 문제점이 있어, LDL 모방 모델인 전달체는 아포지질 단백질이 함유되지 않은 대신 콜레스테롤 에스테르 및 인지질로부터 개발되었다.
이러한 자연계 담체의 구조와 조성을 모방하는 전달체는 마이셀, 리포좀과는 달리 면역반응을 촉발하지 않기 때문에 생체 내 약물을 전달하는 전달체로 개발 될 수 있다.
본 발명자들은 난용성 항암제가 봉입된 전달체를 암세포에 선택적으로 표적 하기 위한 방법으로 전달체의 표면에 전달체의 체내 잔류시간을 증가시키기 위한 고분자를 결합하고 암세포에만 특별히 존재하는 항원에 대한 수용체인 표적지향물질을 전달체 표면에 부착된 고분자와 결합시킴으로써 난용성 항암제가 암세포에 높은 효율로 전달되도록 하는 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 콜레스테릴 에스테르(cholesteryl ester) 및 트리글리세라이드(triglyceride)를 함유하는 코어지질부; 인지질(phospholipid), 콜레스테롤(cholesterol) 및 양이온성 지질을 함유하는 표면지질부; 상기 표면지질부에 연결된 고분자 링커; 및 상기 고분자 링커와 연결된 표적지향물질을 포함하며,
상기 코어지질부 내부에 난용성 약물이 봉입된 표적지향형 난용성 약물 전달체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 난용성 약물 전달체는 콜레스테릴 에스테르는 20 내지 60 중량％; 트리글리세라이드 0.1 내지 10 중량％; 인지질 5 내지 30 중량％; 콜레스테롤 3 내지 20 중량％; 양이온성 지질 10 내지 50 중량％; 및 난용성 약물 10 내지 20중량%를 함유할 수 있으며, 난용성 약물 봉입 효율을 위하여 바람직하게는 콜레스테릴 에스테르 24 내지 28 중량％, 트리글리세라이드 1 내지 3 중량％, 인지질 14 내지 18 중량％, 콜레스테롤 3 내지 7 중량％, 양이온성 지질 30 내지 35 중량％ 및 난용성 약물 내지 14 내지 18 % 중량을 함유할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 콜레스테릴 에스테르는 탄소수 10 내지 24개의 불포화지방산 에스테르일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 트리글리세라이드는 트리아세틴(triacetin), 트리부티린 (tributyrin), 트리카프로인(tricaproin), 트리카프릴린(tricaprylin), 트리카프린(tricaprin) 및 트리올레인(triolein)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 인지질은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), POPC(palmitoyloleoylphosphatidylcholine), EPC(egg phosphatidylcholine), DSPC(distearoylphosphatidylcholine), DOPC(dioleoylphosphatidylcholine), DPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine), DOPG(dioleoylphosphatidylglycerol) 및 DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 양이온성 지질은 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N (아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익토코페롤(AC-토코페롤), N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익토코페롤(MC-토코페롤), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디 올레오일옥시)프로필아민(DODMA), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP), 1,2-디올레오일카바밀-3-디메틸암모늄-프로판(DOCDAP), 1,2-디리노일-3-디메틸암모늄-프로판(DLINDAP), 디올레오일옥시-N-[2-스퍼민카복사미도)에틸}-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오르-아세테이트(DOSPA), 디옥타데실-아미도글리실스퍼민(DOGS), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸암모늄브로마이드(DMRIE), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(cis,cis-9,12-옥타디카디엔옥시) 프로판(CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3.베타.-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(cis,cis-9',12'-옥타디카디엔옥시)프로판(CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레오일옥시벤질아민(DMOBA), 1,2-N,N'-디올레일카바밀-3-디메틸아미노프로판(DOcarbDAP), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP) 및 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 고분자 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PLA(polylactic acid), PGA(polyglycolic acid), 폴리에스테르, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리아미노산, PHA(polyhydroxyalkanoate), PCL(polycaprolactone), 폴리알킬카보네이트, 알부민, 젤라틴, 콜라젠, 피브린, 알긴산, 키틴, 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 전분 및 그 유도체들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 유도체란 상기 고분자 링커의 수소원자는 또는 특정 원자단을 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 말한다.
PEG는 친수성 고분자로 혈장 단백질들의 흡착을 억제하는 능력을 가지고 있어서 약물 전달체의 체내 순환시간을 증가시켜 주는 역할을 하며, 본 발명의 일 구현예로 상기 고분자 링커는 PEG 유도체일 수 있다. 상기 PEG 유도체의 분자량이 500 미만이면 PEG 유도체가 체내 알코올디하이드로게네이즈에 의해 독성을 가진 디아시드와 수산 대사물로 산화되는 문제가 있고, 50000 초과하면 제조상의 문제가 있을 수 있으므로 500 내지 50000의 분자량일 수 있으며, 바람직하게는 2000 내지 20000일 수 있다. 상기 PEG 유도체는 하기 화학식 1에서 n은 4 내지 1130일 수 있으며(n= 4 ~ 1130), 더 바람직하게는 38 내지 447 일 수 있다(n= 38 ~ 447).
[화학식 1]
Figure pat00001
본 발명의 일 구현예로 상기 표적지향물질은 베바시주맙(Bevacizumab), 엘로티닙(erlotinib), 게피니티브(Gefitinib), 메실산이매티닙(imatinib mesylate), 세투시맙(cetuximab), 리투시맙(rituximab), 트라스트주맙(trastzumab), 폴레이트(folate) 및 RGD로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 난용성 약물은 난용성 항암제, 항바이러스제, 스테로이드계 소염제(steroidal anti-inflammatory drugs), 항생제, 항진균제, 비타민, 프로스타사이클린(prostacyclin), 항대사제, 축동제(mitotics), 아드레날린 길항제(adrenaline antagonist), 항경련제, 항불안제, 정온제, 항우울제, 마취제, 진통제, 동화성 스테로이드제, 면역 억제제 및 면역 촉진제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 난용성 항암제는 탁솔(Taxol), 아이다루비신(idarubicin), 미톡산프론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메소트렉세이트(methotrexate), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 치오구아닌(thioguanine), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 클라드리빈 (cladrabine), 암루비신(amrubicin), 옥트레오타이드(octreotide), 고세레린(Gosereline), 류프로라이드(leuprolide), 플루타마이드(Flutamide), 카소덱스(Casodex), 독소루비신(doxorubicin), 5-플로로우라실(5-fluorouracil), 플루다라빈(fludarabine), 시타라빈(cytarabine), 마이토마이신-C(mitomycin-C), 스티렌 말레산 네오카르지노 스타틴(Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 카뮤스틴(carmustine (BCNU)), 다카바진(dacabazine), 에토포사이드(etoposide), 다우노마이신(daunomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 빈카알칼로이드(vinca alkaloid), 블레오마이신(bleomycin), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 이포스파마이드(Ifosfamide), 젬시타빈(gemcitabine), 페메트렉시드(pemetrexed), 캄프토테신(camptothecin), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 클로람부실(chlorambucil) 및 멜파란(melphalan)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
목표로 하는 표적 종양조직으로 약물을 효과적으로 전달하기 위해서는 우선 제거 되지 않고 상당 기간 혈액 내에 잔존할 수 있는 약물 전달체의 능력이 필수적이다. 따라서 투여된 약물 전달체의 크기와 표면 특성은 중요하다.
약물 전달체로서 표면이 이온성 혹은 소수성일 경우 간 또는 비장과 같은 세망내피계(reticulo-endothelial system)에 위치하는 대식세포(macrophage)에 잡혀 제거된다. 보다 구체적으로 혈액 내에서 이온성 혹은 소수성 특성을 가진 나노입자는 피브로넥틴(fibronectin), 보체(complements), IgG 등과 같은 혈장 단백질들과의 정전기적 인력으로 인해 흡착되어(opsonization) 이들 (opsonins)은 다시 세망내피계의 대식세포에 의하여 인지되어 결과적으로 약물전달체는 포식 제거된다. 따라서 이러한 대식세포의 포식으로부터 벗어나기 위해서는 난용성 약물 전달체의 표면을 중성으로 만드는 것이 필수적이다.
따라서 본 발명의 일 구현예로 상기 난용성 약물 전달체의 표면 전하는 -10 내지 10 mV 일수 있으며, 표적 종양조직으로 약물을 더 효과적으로 전달하기 위하여 바람직하게는 -3 내지 3mV일 수 있다.
약물 전달체로서의 크기가 너무 작으면 정상혈관을 통과하게 되어 약물을 종양조직이 아닌 정상조직에도 전달할 수 있게 될 뿐만 아니라 약물 전달체 내부에 봉입되는 약물의 양(drug payload)이 불충분하게 되고, 너무 크게 되면 체내 순환시 장기 즉 간이나 비장에서 세망내피계(reticulo-endothelial system )에 위치하는 대식세포 (macrophage)에 잡혀 제거된다.
따라서 본 발명의 일 구현예로 상기 난용성 약물 전달체의 크기는 30 내지 300 nm일 수 있으며, 표적 종양조직으로 약물을 더 효과적으로 전달하기 위히여 바람직하게는 150 내지 250 nm일 수 있다.
또한 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 난용성 약물 전달체의 제조방법을 제공한다.
1) 콜레스테릴 에스테르, 트리글리세라이드, 인지질, 콜레스테롤, 양이온성 지질 및 난용성 약물을 유기용매에 용해시킨 후 물을 첨가하여 난용성 약물이 봉입된 고형지질나노입자를 제조하는 단계
2) 상기 고형지질나노입자에 고분자 링커가 아마이드 결합(amide bond)으로 결합되고 난용성 약물이 봉입된 고형지질나노입자를 제조하는 단계; 및
3) 상기 고분자 링커가 결합되고 난용성 약물이 봉입된 고형지질나노입자에 표적지향물질이 이황화 결합으로 연결된 난용성 약물 전달체를 제조하는 단계.
상기 콜레스테릴 에스테르, 트리글리세라이드, 인지질, 콜레스테롤, 양이온성 지질 및 난용성 약물 각각의 바람직한 함유범위 및 상기 범위의 의의에 대해서는 상기 난용성 약물 전달체에서 설명한 바와 같으며, 상기 콜레스테릴 에스테르, 트리글리세라이드, 인지질, 양이온성 지질, 고분자 링커, 표적지향물질, 난용성 약물에 대한 각각의 구현예도 상기 난용성 약물 전달체에서 설명한 바와 같다.
상기 1)단계의 유기용매는 소수성 및/또는 친수성 용매일 수 있으며, 상기 소수성 용매로는 클로로포름, 사이클로핵산 등을 포함하며, 상기 친수성 용매로는 에탄올, 메탄올 등을 포함한다. 친수성 또는 소수성 유기용매의 단독이나 친수성 및 소수성 용매를 일정 비율로 혼합한 유기용매를 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 유기용매는 고형지질나노입자의 합성에 사용되는 지질성분들을 용해하기 위해 사용된다. 그 후에 물이 첨가되어 지질성분들의 자가조립으로 표면에 양이온성을 나타내는 고형지질나노입자가 만들어지면 사용된 유기용매는 제거되어야 한다.
보다 구체적으로, 유기용매의 제거는 콜레스테릴 올레이트의 융점이상의 온도에서 이루어져야 하는데, 이는 콜레스테롤 올레이트가 융점이상의 온도에서 고형에서 액체형으로 상 변이를 하게 되어 더 이상 고형지질나노입자가 만들어지지 못하게 하는 이유를 가지고 있다. 콜레스테롤 올레이트는 52℃ 의 융점을 가지고 있어서 상온에서 고형이다. 따라서 나노입자의 합성 시 고형의 콜레스테롤 올레이트가 나노입자의 코어부를 형성하게 하여 안정적인 나노입자가 만들어 지게 된다.
따라서 상기 유기용매는 끓는점이 콜레스테롤 올레이트의 융점보다 높고 물의 끓는점보다 낮아야 한다. 따라서 콜레스테롤 올레이트의 융점이 52℃ 임을 고려하여 상기 유기용매는 52°C 내지 80°C 의 온도가 바람직하다.
상기 고형지질나노입자의 표면지질부 상에 존재하는 양이온성 아민(-NH2)과 고분자 링커의 한쪽 말단에 존재하는 -NHS(숙신이미드기), -CHO(알데하이드기) 또는 -COOH(카르복실기)와의 화학반응에 의해 유도된 아마이드 결합(amide bond)에 의해 고분자 링커가 고형지질나노입자 표면에 결합된다. 고형지질나노입자 표면전하가 중성화(neotralizaiton)되어 0에 가까워 질 수 있도록 고형지질나노입자의 표면지질부 상에 존재하는 양이온성 아민이 고분자 링커와 결합한다.
보다 구체적으로 상기 고형지질나노입자의 표면지질부 상에 존재하는 양이온성 아민(-NH2)과 상기 화학식 1의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 한쪽 말단에 존재하는 -NHS(숙신이미드기)와의 화학반응에 의해 유도된 아마이드 결합(amide bond)에 의해 폴리에틸렌글리콜 유도체가 고형지질나노입자 표면에 결합된다. 고형지질나노입자 표면전하가 중성화(neotralizaiton)되어 0에 가까워 질 수 있도록 고형지질나노입자의 표면지질부 상에 존재하는 양이온성 아민이 폴리에틸렌글리콜 유도체와 결합한다. 양이온성 아민(-NH2)과 폴리에틸렌글리콜 유도체의 몰 비율을 1:3으로 하는 경우 양이온성 아민기가 최대한 많이 폴리에틸렌글리콜 유도체에에 결합하여 표면전하가 0에 가까워질 수 있다.
상기 고분자 링커의 다른 한 쪽 말단, 고분자 링커의 바깥쪽 말단에 존재하는 말레이미드기, -COOH(카르복실기) 또는 -SH(티올기)와 표적지향물질에 존재하는 -SH(티올기)와의 화학반응에 의해 형성되는 이황화결합에 의해 표적지향물질이 고형지질나노입자의 표면에 결합된다.
보다 구체적으로, 상기 화학식 1의 폴리에틸렌글리콜 유도체의 다른 한 쪽 말단, 폴리에틸렌글리콜 유도체의 바깥쪽 말단에 존재하는 말레이미드기와 표적지향물질에 존재하는 티올기와의 화학반응에 의해 형성되는 이황화결합에 의해 표적지향물질이 고형지질나노입자의 표면에 결합된다. 이 때 말레이드기와 표적지향물질의 반응 몰 비율을 1:5로 하는 경우 표적지향물질이 최대한 많이 폴리에틸렌글리콜 유도체에 결합하여 표면전하가 0에 가까워질 수 있다. 표면전하는 폴리에틸렌글리콜 유도체의 바깥쪽 말단에 존재하는 말레이미드기와 결합하는 표적지향물질의 분자 수를 능동적으로 조절하여 결합 할 수 있게 하는 기술적 장점을 가지게 한다.
따라서 링커의 말레이미드기와 결합하는 티올기가 분자 구조 내에 존재하지 않는 표적지향물질의 경우 아민기를 티올기로 치환하여 고분자 링커에 결합 할 수 있기 때문에 이를 이용하여 다양한 표적지향물질을 난용성 약물 전달체에 도입할 수 있으며 이는 본 발명에 의해 개발되어진 난용성 약물 전달체가 암세포에서 과발현되는 항원에 따라 고분자 링커에 결합하는 표적지향물질을 능동적으로 다양하게 조절할 수 있는 기술적 장점을 가지게 된다.
본 발명은 또한 난용성 약물 전달체를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 난용성 약물 전달체는 20 내지 200mg/kg 범위로 포함되는 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 사람을 포함하는 포유동물에 비경구 투여를 포함한 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 비경구 투여는 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 가장 바람직한 예로는 암세포가 있는 조직으로 약물이 전달되는 유일한 경로는 혈관이기 때문에 정맥 내 투여법(Intravenous admintration, I.V)을 이용하는 것이며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏당 0.1 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 난용성 약물 전달체를 생체 내에 주입하였을 경우, 난용성 약물 전달체 표면에 결합된 고분자 및 표적지향 물질로 인해서 난용성 약물 전달체가 암세포에 전달되는 확률이 증가되는 효과를 보였으며, 난용성 약물 전달체에 난용성 약물이 안정적이고 높은 효율로 봉입되었기 때문에 난용성 약물 전달체에 의해 암세포에 전달된 약물은 우수한 암세포 사멸 효과를 보였다. 또한 암세포에서 과발현되는 항원에 특이적으로 반응할 수 있는 암 세포 표적지향물질의 종류를 다양하게 조절하여 난용성 약물 전달체의 표면에 결합할 수 있고, 내부에 봉입되는 난용성 약물의 종류를 암의 종류 및 치료 목적에 따라 다양하게 조절할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 난용성 약물 전달체의 합성 과정 및 구성을 표현한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1-4에서 제조된 난용성 약물 전달체의 원자힘 현미경(Atomic Force Microscope) 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 난용성 약물 전달체의 암 치료 효과(폐암)를 확인하기 위하여, 실시예 2-4의 방법에 따라 시간별 암조직의 부피를 측정한 그래프를 나타낸 것이다(도면에서의 화살표는 약물을 주사한 시점을 나타낸다).
도 4은 난용성 약물 전달체의 암 치료 효과(유방암)를 확인하기 위하여, 실시예 3-4의 방법에 따라 시간별 암조직의 부피를 측정한 그래프를 나타낸 것이다(도면에서의 화살표는 약물을 주사한 시점을 나타낸다).
도 5는 NCI-H1975 세포주에서 실시예 4-1에 따른 MTT 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 SK-BR-3 세포주에서 실시예 4-2에 따른 MTT 분석을 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 5-5에 따른 NCI-H1975 세포주에서의 전달 효율 평가(FACS 분석)를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 5-6에 따른 SK-BR-3 세포주에서의 전달 효율 평가(FACS 분석)를 나타낸 것이다.
도 9는 주사되는 taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab의 농도에 따른 암 조직의 부피를 그래프로 나타낸 것이다(도면에서의 화살표는 약물을 주사한 시점을 나타낸다).
도 10은 taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab과 genexol®-PM의 항암효과 비교를 그래프로 나타낸 것이다(도면에서의 화살표는 약물을 주사한 시점을 나타낸다).
(도 1, 도 2 내지 도 10의 PEG는 PEG 유도체를 나타낸 것이다.)
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
< 실시예1 > 난용성 약물 전달체의 제조
1-1: 약물( Taxol )이 봉입된 고형지질나노입자 제조( Taxol containing SLN )
아래의 표 2에 나타난 바와 같이, 8.4mg(26.8중량％)의 콜레스테릴 올레이트, 0.5mg(1.6중량％)의 트리올레인, 5.2mg(16.6중량％)의 DOPE, 1.8mg(5.7중량％)의 콜레스테롤, 10.5mg(33.4중량％)의 DC-콜레스테롤 및 5mg(15.9중량％)의 탁솔(taxol)을 유리병에 담긴 2mL의 클로로포름: 메탄올(2:1) 용액에 용해시켰다. 10mL의 증류수를 상기 유리병에 첨가하여 1분간 교반(vortexing)하여 섞어 주었고, 그 후 용액을 Branson 초음파 처리기 450(20kHz, 듀티 주기= 40, 출력 제어=3.5)으로 3분간 초음파 처리하였다. 용액을 회전식 증발기로 옮겼고, 용매인 클로로포름: 메탄올(2:1, v/v)용액을 콜레스테릴 올레이트의 융점인 60 ℃이상의 온도에서 제거하였다. 증류수 안에서 하룻밤 동안 분획분자량(Molecular weight of cut-off, MWCO) 5000의 투석 막(dialysis membrane)을 이용하여 정제를 하였고, 정제된 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자 용액은 4℃에서 보관하여 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자(Taxol containing SLN)를 제조하였다.
구분 구성성분 함량 (mg) 함량 비율 (%)
표면지질부
(surface lipid)		 DOPE 5.2 16.6
Cholesterol 1.8 5.7
DC-chol 10.5 33.4
코어지질부
(core lipid)		 Cholesteryl oleate 8.4 26.8
Triolein 0.5 1.6
약물(core) Taxol 5 15.9
1-2: 난용성 약물( Taxol )이 봉입된 고형지질나노입자의 물리화학적 특성
실시예 1-1에서 제조된 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자 의 평균 크기 및 제타 전위 측정은 레이저광 산란법으로 측정하였으며, 파장 632nm 및 검출각도 90°의 He-Ne 레이저가 탑재된 동적 광산란기(DSL)(Zeta-Plus, 브룩헤븐인스트루먼트사, NY)로 측정하였다. 25℃의 증류수 내에 분산된 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자(실시예 1-1에서 제조된)의 농도가 5 mg/ml 일 때, 크기를 3회 측정하였으며, 상기 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자에 포함된 약물의 함량 및 봉입율을 평가하기 위해 고성능액체크로마토크래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 사용하였다.
상기 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자 용액을 동결건조(Freeze drying)하여 증류수를 제거하였다. 동결 건조된 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자를 메탄올 20 ml에 분산시켜 완전히 녹인 후 필터(Millex SR 0.45um filter unit)를 통해 난용성 약물을 추출한 후 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 난용성 약물의 양을 분석하였고, 그 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.
이 때 약물의 농도에 따른 검량선(calibration curve)과 함께 비교하여 난용성 약물의 양을 정량분석하였고, 봉입된 난용성 약물의 양(%, w/w) 및 봉입율(%)은 아래의 수학식 1과 같이 분석하였다.
[수학식 1]
Figure pat00002

표 3에 나타난 바와 같이, 수용액 상에서 안정적인 물리화학적 특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다. 보다 구체적으로 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자의 무게 대비 11 % (w/w)효율로 봉입되어 있었고 115~125nm 수준의 크기와 65~85mV 수준의 표면전하를 가지는 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자임을 확인하였다.
크기 (nm) 표면전하(mV) 약물 봉입 효율(%) 약물 함량(%, W/W)
120.1±2.4 76.1±8.4 69 11
1-3: 고분자 링커( PEG 유도체)가 결합된 난용성 약물( Taxol )이 봉입된 고형지질나노입자의 제조( Taxol containing SLN - PEG (유도체))
상기 실시예 1-1에서 제조된 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자 나노입자의 표면은 DC-콜레스테롤에 의해서 양이온성 아민(-NH2)를 가지고 있다. 상기 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자의 표면의 양이온성 아민과 상기 화학식 1(n=106)의 PEG 유도체(NOF Corporation)의 몰비를 1:3의 비율로 반응을 하여 하룻밤 동안 상온에서 교반(stirring)과 함께 상기 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자의 양이온성 아민(-NH2)과 상기 PEG 유도체의 N-하이드록시숙신이미드(NHS)와의 아민-N-하이드록시숙신이미드(NHS) 결합에 의해서 난용성 약물(taxol)이 봉입된 고형지질나노입자와 상기 PEG 유도체를 화학적으로 결합 시켰고, Sephacryl S-200 column을 통해서 고분자 링커(PEG 유도체)가 결합된 난용성 약물(Taxol)이 봉입된 고형지질나노입자(Taxol containing SLN-PEG(유도체))만 분리 하였다.
1-4: 표적지향물질( 세투시맙 )이 결합된 난용성 약물 전달체 제조( Taxol containing SLN - PEG (유도체)- cetuximab )
nitrogen-purged HEPES buffer(pH 8)를 용매로 사용하여 녹아있는 traut's reagent를 세투시맙과 몰비 1:1의 비율로 상온에서 2시간 동안 교반(stirring)시켰고, 세투시맙의 아민기를 티올기로 치환한 후 PD-10 column으로 아민기가 티올기로 치환된 세투시맙만 정제 분리하였다.
세투시맙의 아민(-NH2)기를 티올(-SH)기로 치환하여 치환된 세투시맙을 상기 실시예 1-3에서 제조된 고분자 링커(PEG 유도체)가 결합된 난용성 약물(Taxol)이 봉입된 고형지질나노입자에 결합된 PEG 유도체의 말단에 있는 말레이미드기(-maleimide)와 티올-말레이미드 반응에 의해서 4°C에서 하룻밤 동안 교반(stirring)하여 화학적으로 결합 시켰고, Sephacryl S-200 column을 통해서 표적지향물질(세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체(Taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab)만 분리하였다.
1-5: 표적지향물질( 세투시맙 )이 결합된 난용성 약물 전달체의 물리화학적 특징
실시예 1-4에서 제조된 표적지향물질(세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체의 물리화학적 특성을 실시예 1-2에 기재된 방법과 실질적으로 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과를 표 4에 나타냈다.
표 4에 나타난 바와 같이, 상기 표적지향물질(세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체의 물리화학적 특징을 확인할 수 있었으며, 구체적으로 상기 표적지향물질(세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체가 220~235 nm 수준의 크기와 -3 내지 0 mV 수준의 표면전하를 가짐을 확인할 수 있었다.
크기 (nm) 표면전하 (mV)
228.7±7.0 -1.8±1.0
상기 표적지향물질(세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체를 원자힘 현미경(Atomic Force Microscope)으로 관찰하였다. 구체적으로 원자힘 현미경 영상은 100μl 의 표적지향물질(세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체 (5mg/ml)를 투명한 운모면(mica) 위에 적하(dropping) 한 후 질소 건조를 통한 용매를 제거 후 표적지향물질(세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체만 운모면 위에 화학적 흡착이 되게 한 후 측정하였다. 측정 조건은 스캔 영역이 10 x 10 인 비접촉 방식(non-contact mode)의 XE-100 AFM 시스템 (park system, Korea)를 이용하여 얻었고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 표적지향물질(세투시맙)이 결합된 난용성 약물 전달체는 구형이며, 크기의 편차가 크지 않은 균일한 크기임을 육안으로 확인 할 수 있었다.
< 실시예 2> 난용성 약물 전달체의 폐암세포에서의 항암 효과 실험
2-1. 약물이 봉입되지 않고 표적지향물질( 세투시맙 )이 결합된 난용성 약물 전달체( SLN - PEG (유도체)- 세투시맙 ( vehicle ))의 제조
아래의 표 5에 나타난 바와 같이, 구성성분으로 탁솔을 제외한 것 외에는 상시 실시예 1-1과 동일한 방법으로 나노입자를 제조하였고, 실시예 1-3 및 1-4와 동일한 방법으로 약물이 봉입되지 않은, 약물 전달체(SLN-PEG(유도체)-cetuximab(vehicle))를 제조하였다.
구분 구성성분 함량 (mg) 함량 비율 (%)
표면지질부
(surface lipid)		 DOPE 5.2 19.7
Cholesterol 1.8 6.8
DC-chol 10.5 39.8
코어지질부
(core lipid)		 Cholesteryl oleate 8.4 31.8
Triolein 0.5 1.9
2-2. 표적지향물질( 리툭시맙 )이 결합된 난용성 약물 전달체 제조( Taxol containing SLN - PEG (유도체)- rituximab )
CD20+를 표적할 수 있는 리툭시맙(Rituxan)이라는 표적지향물질을 나노입자의 표면에 도입한 CD20+ 세포 표적지향형 약물 전달체를 리툭시맙을 표적지향물질로 사용한 것 외에는 상기 실시예 1-4와 동일한 방법을 사용하여 제조하였다.
2-3. 폐암 세포주 유래 설치류의 준비
폐암 세포 주(NCI-H1975, ATCC CRL-5908)를 matrigel 100 μl에 1x106 개씩 희석 한 후, 8주령 된 마우스(BALB/c-nu, ㈜오리엔트바이오) 우측 허리(마우스의 팔이나 다리가 접근 할 수 없는 부분) 피하 주사(Subcutaneous Injection, S.C injection)하여 폐암 세포 주 유래 설치류 폐암모델을 유도하였다. 7일 후, Caliper를 이용하여 암의 크기를 측정한 다음, 크기가 50~100 mm3 정도 되었을 때 그룹 마다 암의 크기가 일정하도록 하여 9마리씩 나누어 폐암 세포주 유래 설치류를 준비하였다.
2-4. 폐암세포( NCI - H1975 )에서의 항암효과 확인
PBS, 실시예 1-1에서 제조된 Taxol containing SLN, 실시예 1-3에서 제조된 Taxol containing SLN-PEG(유도체), 실시예 1-4에서 Taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab, 실시예 2-1에서 제조된 약물을 함유하지 않는 SLN-PEG(유도체)-cetuximab(vehicle) 및 실시예 2-2에서 제조된 Taxol containing SLN-PEG(유도체)-rituximab을 암세포가 전이된 마우스에 미정맥 주사한 후 시간에 따른 암 조직의 부피를 측정하였다.
인산 완충 용액(PBS, Phosphate buffered saline)은 생체 내의 염농도와 물리화학적으로 동일한 등작액으로서 단지 마우스에 미정맥 투여되는 상기 다른 나노입자 용액의 부피와 동일한 부피를 마우스에 투여 하는 아무런 처리를 하지 않은, 아무런 효과를 기대하지 않은 마우스 그룹에 해당하는 비교군으로 사용되었다. Taxol containing SLN-PEG(유도체)은 Taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab와 비교하여 표적지향물질인 cetuximab에 의한 효과가 얼마나 있는지를 확인 하기 위한 비교군이며, Taxol containing SLN은 Taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab 또는 Taxol containing SLN-PEG(유도체)과 비교하여 체내 잔류시간을 증가시키기 위한 생체 적합 고분자 물질인 폴리에틸린글리폴(PEG)의 유도체에 의한 효과가 얼마나 있는지를 확인 하기 위한 비교군으로 사용되었다. 또한 Taxol containing SLN-PEG(유도체)-rituximab은 Taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab과 비교하여 동일한 분자량 및 크기(Mw 170,000)를 가지고 있으나 마우스에 심어진 폐암 세포 주(NCI-H1975)에서 과발현 되는 EGFR1을 특이적으로 표적할 수 있는 특성에 의한 효과를 확인하기 위한 것으로 상기 Taxol containing SLN-PEG(유도체)-rituximab에 사용 된 rituximab은 EGFR1에 대한 특이적인 반응성이 없는 물질임을 의미한다.
상기 실시예 2-3에 의해 준비된 마우스에 21일 동안 주 1회 각 그룹 별로 시료를 200mg/kg(마우스의 질량(kg) 당 주사 되는 난용성 약물 전달체의 용량(mg))의 함량으로 미정맥 투여(Intravenous Injection, I.V injection)하였고, 시료를 투여하는 기간을 포함하여 총 42일 동안 주 1회 암의 크기를 Caliper를 이용하여 측정하였고 아래의 수학식 2와 같이 계산하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
[수학식 2]
암 조직의 부피 = 1/2 x larger diameter x (smaller diameter)2
Larger diameter = 암조직 중에서 긴 축, smaller diameter = 암조직 중에서 짧은 축
도 3에 나타난 바와 같이, 폐암세포(H1975)에서 과발현되는 EGFR1 항원을 표적할 수 있는 세투시맙(Cetuximab)이라는 표적지향물질을 표면에 도입한 난용성 약물 전달체(Taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab)의 경우 다른 비교군에 비해 우수한 암 치료효과를 나타냄을 확인 할 수 있었다.
< 실시예 3> 난용성 약물 전달체의 유방암세포에서의 항암 효과 실험
3-1. 약물이 봉입되지 않은 고형지질나노입자의 제조( SLN ( vehicle ))
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 구성성분으로 탁솔을 제외한 것 외에는 상시 실시예 1-1과 동일한 방법으로 약물이 봉입되지 않은 고형지질나노입자를 제조하였다.
3-2. 표적지향물질( 트라스트주맙 )이 결합된 난용성 약물 전달체 제조( Taxol containing SLN - PEG (유도체)- herceptin )
트라스트주맙(상품명:Herceptin,허셉틴)을 표적지향물질로 사용한 것 외에는 상기 실시예 1-4와 동일한 방법을 사용하여 표적지향물질(트라스트주맙)이 결합된 난용성 약물 전달체를 제조하였다.
3-3. 유방암 세포주 유래 설치류의 준비
유방암세포(SK-BR-3, ATCC HTB-30)를 사용한 것 외에는 실시예 2-3과 동일한 방법을 사용하여 유방암 세포주 유래 설치류를 준비하였다.
3-4. 유방암세포( SK - BR -3)에서의 항암효과 확인
PBS, 실시예 3-1에서 제조된 SLN(vehicle), 실시예 3-2에서 제조된 Taxol containing SLN-PEG(유도체)-herceptin을 실시예 2-4와 동일한 방법으로 암세포가 전이된 마우스에 미정맥 주사한 후 시간에 따른 암 조직의 부피를 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 유방암세포(SK-BR-3)에서 과발현하는 항원인 EGFR2를 표적할 수 있는 허셉틴(Herceptin)이라는 표적지향물질을 표면에 도입한 표적지향물질(트라스트주맙)이 결합된 난용성 약물 전달체(Taxol containing SLN-PEG(유도체)-herceptin)의 경우 다른 대조군에 비해 우수한 암 치료효과를 나타냄을 확인 할 수 있었다.
< 실시예 4> MTT 분석
4-1. 폐암세포주(NCI-H1975)에서의 세포 생존율 확인
항암 효능은 MTT 시약에 의한 방법으로 세포 생존율을 측정하여 평가하였다. NCI-H1975 세포를 웰 당 5 x 103 세포가 되도록 96 well에 분주(seeding)하고 24 시간 배양한 후, 실시예 3-1에서 제조된 SLN(vehicle), 실시예 1-1에서 제조된 Taxol containing SLN, 실시예 1-3에서 제조된 Taxol containing SLN-PEG(유도체) 및 실시예 1-4에서 제조된 Taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab을 각각 well 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 72시간 동안 배양하였다. 그 후 배지(RPMI1640)를 well plate에서 제거 한 후 MTT 용액을 가하였고, 4시간 더 배양한 후 MTT 용액을 제거하고 0.04 N 염산 이소프로판올 용액을 첨가한 후에 엘라이져 리더(elisa reader)를 이용하여 570 nm에서 그 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다(대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다).
도 5에 나타난 바와 같이, taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab 조건에서 더 증강된 암세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab의 경우 NCI-H1975 세포주 내부에 보다 효과적으로 탁솔을 전달하여 증강된 항암 효능을 나타내는 것을 알 수 있다.
4-2. 유방암세포주(SK-BR-3)에서의 세포 생존율 확인
Taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab 대신에 Taxol containing SLN-PEG(유도체)-herceptin을 사용한 것 외에는 상기 실시예 4-1와 동일한 방법을 사용하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다(대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다).
도 6에 나타난 바와 같이, taxol containing SLN-PEG(유도체)-herceptin 조건에서 더 증강된 암세포 사멸효과를 나타낸다는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 taxol containing SLN-PEG(유도체)-herceptin의 경우 SK-BR-3 세포주 내부에 보다 효과적으로 탁솔을 전달하여 증강된 항암 효능을 나타내는 것을 알 수 있다.
< 실시예 5. FACS 분석 >
5-1. Dylight 488 conjugated taxol containing SLN 의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조된 약물(Taxol)이 봉입된 고형지질나노입자의 양이온성 아민(-NH2)과 Dylight 488 NHS Ester(Mw 1011)(Thermoscientific)의 몰비(moral ratio)를 10:1 mol/mol의 비율로 반응을 하며 하룻밤 동안 상온에서 교반(stirring)과 함께 반응을 하여 상기 약물(Taxol)이 봉입된 고형지질나노입자의 양이온성 아민(-NH2)과 Dylight 488 NHS Ester의 N-하이드록시숙신이미드(NHS)와의 아민-N-하이드록시숙신이미드(NHS) 결합에 의해서 상기 약물(Taxol)이 봉입된 고형지질나노입자와 형광물질(Dylight 488 NHS Ester)을 화학적으로 결합을 시켰고, Sephacryl S-200 column을 통해서 형광물질만 결합된 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN만 분리 하였다.
5-2. Dylight 488 conjugated taxol containing SLN - PEG (유도체)의 제조
상기 실시예 5-1에서 제조된 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN을 상기 실시예 1-3과 같은 방법을 사용하여 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG(유도체)를 제조하였다.
5-3. Dylight 488 conjugated taxol containing SLN - PEG (유도체)- cetuximab 의 제조
상기 실시예 5-2에서 제조된 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG(유도체)을 상기 실시예 1-4와 같은 방법을 사용하여 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab을 제조하였다.
5-4. Dylight 488 conjugated taxol containing SLN - PEG (유도체)- herceptin 의 제조
상기 실시예 5-2에서 제조된 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG(유도체)을 cetuximab 대신 herceptin을 사용한 것 외에는 상기 실시예 1-4와 같은 방법을 사용하여 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG(유도체)-herceptin을 제조하였다.
5-5. NCI - H1975 세포주에서의 전달 효율 평가
NCI-H1975 세포를 웰 당 2 x 104 세포가 되도록 6 well에 분주(seeding)하고 24 시간 배양한 후, 실시예 5-1에서 제조된 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN, 실시예 5-2에서 제조된 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG(유도체), 실시예 5-3에서 제조된 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab을 각각 well 플레이트에 첨가하여 37 ℃의 CO₂세포배양기에서 0.5시간 동안 배양하였다. 그 후 배지(RPMI1640)를 well plate에서 제거 한 후, TrypLE™ Express 을 가해서 well plate에 유착(adhesion)되어 있는 세포를 떼어 내었고, 인산완충용액(PBS)에 재분산 시킨 후 형광 유세포 분석기인 BD FACS CALIBUR를 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다(대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다).
도 7에 나타난 바와 같이, Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab 조건에서 더 우수한 세포의 형광 강도 피크의 이동을 확인하였다. 이러한 결과로부터 taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab 경우 NCI-H1975 세포주 내부에 보다 효과적으로 난용성 약물(taxol)을 전달하여 증강된 전달 효율을 나타내는 것을 알 수 있다.
5-6. SK - BR -3 세포주에서의 전달 효율 평가
Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab 대신 Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG(유도체)-herceptin을 사용한 것 및 NCI-H1975 세포 대신 SK-BR-3 세포를 사용한 것 외에는 실시예 5-5와 같은 방법을 사용하여 측정하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다(대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 세포가 사용되었다).
도 8에 나타난 바와 같이, Dylight 488 conjugated taxol containing SLN-PEG(유도체)-herceptin 조건에서 더 우수한 세포의 형광 강도 피크의 이동을 확인하였다. 이러한 결과로부터 taxol containing SLN-PEG(유도체)-herceptin 경우 SK-BR-3 세포주 내부에 보다 효과적으로 난용성 약물(taxol)을 전달하여 증강된 전달 효율을 나타내는 것을 알 수 있다.
< 실시예 6. taxol containing SLN - PEG - cetuximab 항암 효능>
탁솔이 내부에 봉입되어 있는 난용성 약물 전달체의 우수한 항암효과를 검증하기 위해 주사되는 taxol containing SLN-PEG-cetuximab의 농도에 따른 항암효과를 관찰하였다. 이는 주사되는 난용성 약물 전달체의 농도에 따른 항암효과를 관찰함으로써, 항암효과가 관찰되는 주사 가능한 난용성 약물 전달체의 농도 범위를 확인 하기 위함이다.
크기가 50~100 mm3 정도 되었을 때 그룹 마다 암의 크기가 일정하도록 하여 3마리씩 나눈 것 외에는 상기 실시예 2-3과 동일한 방법을 사용하여 폐암 세포주 유래 설치류를 준비하였다.
최대내성용량(MTD, maximum tolerance dose, 10 %정도의 체중감소가 관찰되는 정도의 용량, 심한 독성학적인 변화가 관찰되지 않는 용량 및 사망이 관찰되지 않는 최대량) 값은 실험을 통해 확인하였다. 0, 100, 200, 300, 400, 500 mg/kg의 용량을 각각 용량 별 마우스 그룹에 미정맥 주사하고 그 후 1, 3, 4일 후에 다시 미정맥 주사하였고(총 4회 주사), 주사 기간 동안 마우스의 체중변화와 상태(움직임, 사망유무)를 관찰하였다. 투여용량 중 0이 의미하는 것은 PBS 용액(인산완충용액, phosphate buffered saline, pH7.4)을 의미하며, 실험결과 200 mg/kg가 Taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab의 MTD 값으로 확립되었다.
PBS(PBS 그룹은 아무런 효과가 기대되지 않은 그룹), 10, 20, 50, 100, 200mg/kg의 용량을 각각 용량 별 마우스 그룹에 미정맥 주사하고, 그 후 7, 14, 21일 후에 다시 미정맥 주사하였고(총 4회 주사), 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 각 그룹에서의 시간에 따른 암 조직의 부피 변화를 확인하였다. 결과를 분석하기 위해 스튜던트티검정(student's t-test) 통계기법을 이용하여 MTD 값인 200 mg/kg 를 주사하는 그룹과 다른 그룹 (50, 20, 10 mg/kg 주사그룹)에서의 21일 째 암 조직 부피의 유의적 차이를 평가하였다. 보다 구체적으로 스튜던트티검정(student's t-test) 통계기법을 이용하여 분석을 하였을 때 p value 가 0.01 이하가 되면 MTD 값인 200 mg/kg을 주사하는 그룹의 암 조직 부피와 유의적으로 차이가 있음을 의미하고, p value 가 0.01 이상이 되면 되면 MTD 값인 200 mg/kg을 주사하는 그룹의 암 조직 부피와 유의적으로 차이가 없음을 의미하는 것을 이용하여 분석하였다.
MTD 값인 200 mg/kg을 주사하는 그룹과 나머지 그룹(50, 20, 10 mg/kg을 주사하는 그룹)에서의 21일 째 암 조직 부피의 유의적 차이를 평가하였는데 10 mg/kg을 주사하는 그룹에서의 p value가 0.01이하를 나타내었다. 이는 MTD 값인 200mg/kg을 주사하는 그룹과 암 조직 부피가 유의적으로 차이가 있음을 의미한다.
나머지 그룹(50, 20, 10 mg/kg을 주사하는 그룹)은 p value가 0.01 이상을 나타내었다. 이는 MTD 값인 200mg/kg을 주사하는 그룹과 암 조직 부피가 유의적으로 차이가 없다는 것을 의미하며, 이를 통해 50, 20, 10 mg/kg을 주사하였을 때에도 MTD 값인 200 mg/kg을 주사하였을 때와 동일한 항암 효과가 있다는 것을 알았다.
또한 이를 통해 난용성 약물 전달체의 최대 항암효과가 관찰 되는 주사가능한 농도는 20~200 mg/kg이다는 것을 알 수 있었다. Genexol?-PM은 최대내성용량은 60mg/kg이고, 약물 전달체에 포함된 약물 함량은 16.7 중량%이므로 최대 주사되는 약물량은 10 mg/kg이므로, 본 발명에 따른 약물 전달체는 주사가능한 MTD 값 수치가 매우 높고, 결국 투여가능한 약물의 양이 더욱 높아진 것으로 확인할 수 있어, 우수한 약물 전달체로 사용될 수 있다.
< 실시예 7. genexol ® - PM 과 비교 실험>
현재 암환자들의 항암치료를 위해 이용되고 있는 탁솔(Taxol)이 내부 상에 봉입된 나노입자로서, 마이셀(micelle) 구조를 가지고 있는 삼양사의 genexol?-PM을 비교군으로 선정하여 암 치료효과를 비교하였다.
크기가 50~100 mm3 정도 되었을 때 그룹 마다 암의 크기가 일정하도록 하여 3마리씩 나눈 것 외에는 상기 실시예 2-3과 동일한 방법을 사용하여 폐암 세포주 유래 설치류를 준비하였다.
마우스에 미정맥 투여하는 용량으로 Genexol?-PM 및 Taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab의 경우 각각 MTD 값 만큼 투여하였다.
Genexol?-PM의 MTD 값은 제조사인 삼양사에 발표한 논문을 참고하였다(In vivo evaluation of polymeric micellar paclitaxel formulation: toxicity and efficacy. Journal of Controlled Release 2012;72:191-202.).
미정맥 투여 시 상기 실시예 1-4에서 제조한 taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab의 양은 200mg/kg 이고 genexol?-PM의 양은 60mg/kg인 것 이외에는 상기 실시예 2-4와 동일한 방법을 사용하여 실험하고 확인하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, genexol?-PM에 비해 taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab의 항암효과가 더 우수하다는 것을 확인하였다.
상기 Taxol containing SLN-PEG-cetuximab는 최대내성 용량이 200mg/kg이고, 약물 전달체에 포함된 약물 함량은 11 중량%이었다. 비교예로 사용된 Genexol?-PM은 최대내성용량은 60mg/kg이고, 약물 전달체에 포함된 약물 함량은 16.7 중량%이었다. 따라서, 상기 Taxol containing SLN-PEG-cetuximab는 최대내성 용량인 200mg/kg으로 주입할 경우, 주입되는 탁솔함량은 22 mg/kg이고, Genexol?-PM은 최대내성 용량인 60mg/kg으로 주입할 경우, 주입되는 탁솔함량은 10 mg/kg이었다(표 6).
Taxol containing SLN-PEG-cetuximab Genexol?-PM
최대내성용량(MTD) (mg/kg) 200 60
약물 전달체에 포함된 약물 함량(%, w/w) 11 16.7
taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab를 200mg/kg으로 주사한 경우
주사되는 탁솔 함량(mg/kg)		 22 10
상기 표 6에 나타난 바와 같이, Taxol containing SLN-PEG(유도체)-cetuximab의 탁솔 함량이 11%(w/w)이므로 실제로 몸 안으로 주사되는 탁솔의 함량 범위는 22 mg/kg이다. 그러나 실시예 6의 결과와 같이 MTD값인 200mg/kg은 20mg/kg(주사되는 탁솔 함량 2.2mg/kg)의 투여와 통계학적으로 유의적인 차이가 없으며, 이는 Genexol?-PM에 의해 주사되는 탁솔의 함량인 10 mg/kg 보다 낮은 함량을 포함하고 있어 더 낮은 탁솔 함량으로도 현재 상용되고 있는 Genexol?-PM보다 우수한 항암효과를 나타낼 수 있을 것으로 예상할 수 있다.또한 더 낮은 탁솔 함량으로도 더 우수한 항암효과를 나타낼 수 있기 때문에 주사하는 난용성 약물 전달체의 농도를 조절하여 탁솔의 함량을 조절한다면 탁솔에 의한 부작용을 최소화 하면서 더 우수한 항암효과를 나타낼 수 있으며, 이와 같은 결과는 난용성 약물 전달체의 우수한 암 조직으로의 표적능력 및 난용성 약물 전달 능력 때문이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (16)

  1. 콜레스테릴 에스테르(cholesteryl ester) 및 트리글리세라이드(triglyceride)를 함유하는 코어지질부; 인지질(phospholipid), 콜레스테롤(cholesterol) 및 양이온성 지질을 함유하는 표면지질부; 상기 표면지질부에 연결된 고분자 링커; 및 상기 고분자 링커와 연결된 표적지향물질을 포함하며,
    상기 코어지질부 내부에 난용성 약물이 봉입된 표적지향형 난용성 약물 전달체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 약물 전달체는 콜레스테릴 에스테르는 30 내지 60 중량％; 트리글리세라이드 0.1 내지 10 중량％; 인지질 5 내지 30 중량％; 콜레스테롤 5 내지 20 중량％; 양이온성 지질 10 내지 50 중량％; 및 난용성 약물 10 내지 20중량%을 함유하는 난용성 약물 전달체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 콜레스테릴 에스테르는 탄소수 10 내지 24개의 불포화지방산과 콜레스테롤의 에스테르인 난용성 약물 전달체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 트리글리세라이드는 트리아세틴(triacetin), 트리부티린 (tributyrin), 트리카프로인(tricaproin), 트리카프릴린(tricaprylin), 트리카프린(tricaprin) 및 트리올레인(triolein)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 인지질은 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), POPC(palmitoyloleoylphosphatidylcholine), EPC(egg phosphatidylcholine), DSPC(distearoylphosphatidylcholine), DOPC(dioleoylphosphatidylcholine), DPPC(dipalmitoylphosphatidylcholine), DOPG(dioleoylphosphatidylglycerol) 및 DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 양이온성 지질은 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N (아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익토코페롤(AC-토코페롤), N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익토코페롤(MC-토코페롤), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디 올레오일옥시)프로필아민(DODMA), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTMA), 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP), 1,2-디올레오일카바밀-3-디메틸암모늄-프로판(DOCDAP), 1,2-디리노일-3-디메틸암모늄-프로판(DLINDAP), 디올레오일옥시-N-[2-스퍼민카복사미도)에틸}-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오르-아세테이트(DOSPA), 디옥타데실-아미도글리실스퍼민(DOGS), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-하이드록시에틸암모늄브로마이드(DMRIE), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(cis,cis-9,12-옥타디카디엔옥시) 프로판(CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3.베타.-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸-1-(cis,cis-9',12'-옥타디카디엔옥시)프로판(CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레오일옥시벤질아민(DMOBA), 1,2-N,N'-디올레일카바밀-3-디메틸아미노프로판(DOcarbDAP), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP) 및 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PLA(polylactic acid), PGA(polyglycolic acid), 폴리에스테르, 폴리오르토에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리아미노산, PHA(polyhydroxyalkanoate), PCL(polycaprolactone), 폴리알킬카보네이트, 알부민, 젤라틴, 콜라젠, 피브린, 알긴산, 키틴, 키토산, 덱스트란, 히알루론산, 전분 및 그 유도체들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 고분자 링커는 하기 화학식 1의 폴리에틸렌 글리콜 유도체인 난용성 약물 전달체;
    [화학식 1]
    Figure pat00003

    화학식 1에서, n은 4 내지 1130이다.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 표적지향물질은 베바시주맙(Bevacizumab), 엘로티닙(erlotinib), 게피티니브(Gefitinib), 메실산이매티닙(imatinib mesylate), 세투시맙(cetuximab), 리투시맙(rituximab), 트라스트주맙(trastzumab), 폴레이트(folate) 및 RGD로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체.
  10. 제1항에 있어서
    상기 난용성 약물은 난용성 항암제, 항바이러스제, 스테로이드계 소염제(steroidal anti-inflammatory drugs), 항생제, 항진균제, 비타민, 프로스타사이클린(prostacyclin), 항대사제, 축동제(mitotics), 아드레날린 길항제(adrenaline antagonist), 항경련제, 항불안제, 정온제, 항우울제, 마취제, 진통제, 동화성 스테로이드제, 면역 억제제 및 면역 촉진제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체.
  11. 제10항에 있어서
    상기 난용성 항암제는 상기 난용성 항암제는 탁솔(Taxol), 아이다루비신(idarubicin), 미톡산프론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 메소트렉세이트(methotrexate), 트리메트렉세이트(trimetrexate), 치오구아닌(thioguanine), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 클라드리빈 (cladrabine), 암루비신(amrubicin), 옥트레오타이드(octreotide), 고세레린(Gosereline), 류프로라이드(leuprolide), 플루타마이드(Flutamide), 카소덱스(Casodex), 독소루비신(doxorubicin), 5-플로로우라실(5-fluorouracil), 플루다라빈(fludarabine), 시타라빈(cytarabine), 마이토마이신-C(mitomycin-C), 스티렌 말레산 네오카르지노 스타틴(Styrene maleic acid neocarzinostatin (SMANCS)), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 카뮤스틴(carmustine (BCNU)), 다카바진(dacabazine), 에토포사이드(etoposide), 다우노마이신(daunomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 빈카알칼로이드(vinca alkaloid), 블레오마이신(bleomycin), 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide), 이포스파마이드(Ifosfamide), 젬시타빈(gemcitabine), 페메트렉시드(pemetrexed), 캄프토테신(camptothecin), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 클로람부실(chlorambucil) 및 멜파란(melphalan)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 난용성 약물 전달체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 난용성 약물 전달체의 표면 전하는 -10 내지 10mV인, 난용성 약물 전달체.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 난용성 약물 전달체의 크기는 30 내지 300 nm인, 난용성 약물 전달체.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 난용성 약물 전달체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 난용성 약물 전달체는 20 내지 200mg/kg 범위로 포함되는 약학적 조성물.
  16. 하기의 단계를 포함하는 난용성 약물 전달체의 제조방법:
    1) 콜레스테릴 에스테르, 트리글리세라이드, 인지질, 콜레스테롤, 양이온성 지질 및 난용성 약물을 유기용매에 용해시킨 후 물을 첨가하여 난용성 약물이 봉입된 고형지질나노입자를 제조하는 단계
    2) 상기 고형지질나노입자에 고분자 링커가 아마이드 결합(amide bond)으로 결합되고 난용성 약물이 봉입된 고형지질나노입자를 제조하는 단계; 및
    3) 상기 고분자 링커가 결합되고 난용성 약물이 봉입된 고형지질나노입자에 표적지향물질이 이황화 결합으로 연결된 난용성 약물 전달체를 제조하는 단계.
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