KR101791244B1 - 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 리포좀 및 상기 합성 수용체에 결합 가능한, 기능성 물질이 결합된 리간드를 유효성분으로 함유하는 기능성 물질 전달용 조성물 - Google Patents

합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 리포좀 및 상기 합성 수용체에 결합 가능한, 기능성 물질이 결합된 리간드를 유효성분으로 함유하는 기능성 물질 전달용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 리포좀 및 상기 합성 수용체에 결합 가능한, 기능성 물질이 결합된 리간드를 유효성분으로 함유하는 기능성 물질 전달용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 합성 수용체-인지질(synthetic receptor-phospholipids)의 접합체를 포함하는 리포좀을 제조하여 세포에 처리하는 경우, 처리된 세포 주변부로 그 세포로부터 분비되는 세포막성 소포에 의해서 효율적으로 합성 수용체-인지질을 전달할 수 있었고, 합성 수용체-인지질을 표적화하는 물질에 치료 약물을 결합시켜 처리하는 경우, 현저한 약물 효과를 나타냄을 확인하여, 상기 합성 수용체-인지질을 포함하는 리포좀 및 그 합성 수용체-인지질을 표적화하는 물질은 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약물 전달용 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 리포좀 및 상기 합성 수용체에 결합 가능한, 기능성 물질이 결합된 리간드를 유효성분으로 함유하는 기능성 물질 전달용 조성물{Composition for delivery of a liposome comprising synthetic receptor-phospholipid conjugates and a functional substance containing the functional substance conjugated ligand binding to the synthetic receptor}
본 발명은 합성 수용체-인지질(synthetic receptor-phospholipids)의 접합체를 포함하는 세포막성 소포의 제조방법, 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 이중 지질막으로 구성되며, 세포막에 융합하여 세포로 하여금 상기 접합체를 포함하는 세포막성 소포를 방출하게 하는 리포좀, 및 상기 합성 수용체에 결합이 가능하며 기능성 물질이 결합된 리간드를 유효성분으로 함유하는 기능성 물질 전달용 조성물에 관한 것이다.
다양한 종양을 표적하는 분자들 및 나노입자들이 항암 약물의 부작용을 감소시키고 종양 표적 효과를 증가시키기 위하여 개발되고 있다. 나노입자들의 종양-선택적인 축적을 향상시키기 위하여, 단일클론 항체, 펩티드, 올리고뉴클레오티드 등과 같은 능동적인 표적 분자들이 나노입자의 표면에 결합되었다. 그러나, 고형의 종양에서, 비정상적인 혈관 구조(abnormal vasculature structure) 및 빽빽한 세포 간 기질(matrix)과 같은 생리학적 장벽들이 향상된 투과성과 정체성(Enhanced permeability and retention; EPR) 효과를 통해 축적된 나노입자들의 확산을 막아, 결국 세포에 대한 치료적인 효과가 혈관 주변 영역에만 한정되도록 한다(Jain, R.K. & Stylianopoulos, Nature reviews. Clinical oncology 7, 653-664 (2010)). 또한, 표적 분자들에 대한 결합 위치의 결핍 및 이질성(heterogeneity)은 종양에서 치료 약물의 고르지 않은 분포를 야기시키며, 이는 능동-표적 전략의 효과를 약화시킬 수 있다.
두 단계 치료(two-step therapy)는 나노입자들에 대한 결합 자리를 생성함으로써 나노입자들의 종양 표적 유도 효과를 현저하게 증가시킨다. 일반적으로 두 단계 치료 전략은 첫번째 투여 약물로 종양에서 생물학적 또는 인공적인 결합 위치를 유도하여, 종양의 미세환경(microenvironment)을 변화시킨 후, 치료적 효과를 갖는 두번째 투여 약물이 그 미세환경이 변화된 종양을 표적화하도록 함으로써, 수행된다. 하지만 여전히 치료적 약물의 균등한 분배를 위하여 종양 전체에 걸쳐서 결합 위치를 생성하는 것에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
EV(extracellular vesicles)는 직접적인 세포 표면과의 접촉, 소포체의 세포내 섭취(endocytosis), 소포체-세포 막 융합을 통하여 지질, 세포질 단백질 및 RNA 등을 전달함으로써 세포간 신호 전달을 매개하는 것으로 알려져 있다. 여기서, 본 발명자들은 MFL(membrane fusogenic liposomes)을 이용, EV의 변형을 유도하여, 인지질(phospholipid)-기반의 합성 수용체(synthetic receptor)의 생물학적 전달체로써 EV를 이용할 수 있을 것으로 생각하였다. MFL은 DNA, RNA 및 단백질과 같은 세포 외부의 분자들을 세포 내부로 전달하거나, 형광 염료 또는 기능적인 그룹과 같은 원하는 분자들로 세포 표면을 조작하는데 사용되어져 왔다(Connor, J. 등., PNatl Acad Sci - Biol 81, 1715-1718 (1984)). 본 발명자들은 이전에, MFL을 통해서 암세포의 원형막(plasma membrane)에 선택적으로 전달된 소수성 분자 또는 지질이 EV의 세포막에 성공적으로 결합하고, 주변의 세포들에 이동될 수 있음을 밝힌바 있다(Lee, J. 등, Nano letters 15, 2938-2944 (2015)). 하지만 상기 선행기술의 경우, 리포좀과 약물을 직접적으로 연결하기 위해서는 약물의 특성에 따라 리포좀과의 결합 조건을 확립해야 하는 단계가 필요하였고, 결합을 시킨 후에도 표적 위치로 약물이 효율적으로 전달이 되지 않고, 그 전에 약물이 작용하여 효과를 나타내기도 하는 문제점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 1차적으로 합성 수용체-인지질(synthetic receptor-phospholipids)을 MFL에 도입하여 종양에 처리하고, 종양에 처리된 합성 수용체-인지질이 종양내 세포막을 통하여 종양 전체로 퍼지게 되어, 합성 수용체-인지질을 표적화하는 물질에 치료 약물을 결합시켜 처리하는 경우, 그 약물의 치료효과가 현저히 증가됨을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 합성 수용체-인지질(synthetic receptor-phospholipids)의 접합체를 포함하는 세포막성 소포의 제조방법, 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 이중 지질막으로 구성되며, 세포막에 융합하여 세포로 하여금 상기 접합체를 포함하는 세포막성 소포를 방출하게 하는 리포좀, 및 상기 합성 수용체에 결합이 가능하며 기능성 물질이 결합된 리간드를 유효성분으로 함유하는 기능성 물질 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하며, 세포막에 융합하여 상기 접합체를 포함하는 세포막성 소포를 분비시키는 리포좀을 제조하는 단계; 및
2) 단계 1)의 리포좀을 세포에 처리하여 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 세포막성 소포를 생성시키는 단계를 포함하는 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 세포막성 소포의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 세포막성 소포를 제공한다.
또한, 본 발명은 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 이중 지질막으로 구성되며, 세포막에 융합하여 세포로 하여금 상기 접합체를 포함하는 세포막성 소포를 방출하게 하는 리포좀을 제공한다.
또한, 본 발명은 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는, 상기 세포막성 소포 또는 상기 리포좀, 및 상기 합성 수용체에 결합이 가능하며 기능성 물질이 결합된 리간드를 유효성분으로 함유하는 기능성 물질 전달용 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는, 상기 세포막성 소포 또는 상기 리포좀, 및 상기 합성 수용체에 결합이 가능하며 항암제가 결합된 리간드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 합성 수용체-인지질(synthetic receptor-phospholipids)의 접합체를 포함하는 리포좀을 제조하여 세포에 처리하는 경우, 처리된 세포 주변부로 그 세포로부터 분비되는 세포막성 소포에 의해서 효율적으로 합성 수용체-인지질을 전달할 수 있었고, 합성 수용체-인지질을 표적화하는 물질에 치료 약물을 결합시켜 처리하는 경우, 현저한 약물 효과를 나타냄을 확인하였다.
따라서, 상기 합성 수용체-인지질을 포함하는 리포좀 및 그 합성 수용체-인지질을 표적화하는 물질은 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약물 전달용 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 두 단계의 타겟화 암 치료(Two-step targeted cancer therapy)의 개략도이다:
MFL: 세포막 융합성 리포좀(membrane fusogenic liposomes);
SR-L: 합성 수용체-지질 결합체(synthetic receptor-lipid conjugates)(붉은색);
EV: 세포외 소포체(extracellular vesicles).
도 2는 합성 수용체-지질 결합체의 암-특이적인 세포막 전달 및 세포내 이동을 나타낸 도이다:
(a) MFL에 의해서 형광 지질(붉은색)이 전달된 암 세포(HeLa 및 4T1), 대식세포(Raw264.7 및 J774A.1)의 공초점 형광 현미경의 사진. 리소좀은 Lyso Tracker로 염색되었다(녹색);
(b) MFL로 매개된 바이오틴-지질의 전달 직후 또는 전달 후, 또는 4시간째 Alexa594-streptavidin(SA)(붉은색)으로 처리된 암 세포(HeLa), 대식세포(Raw264.7 및 J774A.1)의 공초점 형광 현미경의 사진. 세포 핵은 Hoechst로 염색되었다(푸른색);
(c) 다양한 종류의 리포좀을 사용하여, 트랜스웰 필터에서 세포로 바이오틴-지질을 전달 한 후에 Alexa594-SA로 처리한 위쪽 트랜스웰 필터 및 아래쪽 챔버의 각 HeLa 세포의 공초점 형광 현미경 사진 및 형광세기의 정량을 나타낸 사진이다. 데이터는 평균±표준오차(n≥≥10, ***p<0.001, Tukey post 시험과 함께 One-way ANOVA 수행);
(d) (c)에서 트랜스웰 필터 및 아래쪽 챔버에 있는 세포의 시간-의존적인 Alexa594-SA 형광의 변화를 나타낸다. 세포 표면에서 바이오틴-지질의 반감기는 약 16시간 이었다. 데이터는 평균±표준오차(n=3). 기준자는 20 ㎛이다.
도 3은 트랜스웰 실험의 도식을 나타낸 도이다.
도 4는 세포막에 MFL에 의해 전달된 합성 수용체-지질 결합체의 위치 및 보유정도를 나타낸 도이다;
아래쪽 도면은 위쪽 도면에서 화살표로 표시된 세포를 나타낸다;
형광 지질: 붉은색;
Lyso Tracker: 녹색;
기준자는 20 ㎛이다.
도 5는 합성 수용체-지질 결합체의 용량(dose)-의존적인 세포성 전달 및 생존율을 나타낸 도이다:
(a) 다양한 리포좀 농도에서 바이오틴-지질의 MFL-매개의 전달 이후, Alexa594-SA로 처리된 HeLa 세포의 형광세기를 정량한 것이다. 데이터는 평균±표준오차(n=5);
(b) 다양한 리포좀 농도에서 바이오틴-지질의 MFL-매개의 전달 이후, 세포 생존율을 나타낸다. 데이터는 평균±표준오차(n=3, NS: 유의성 없음).
도 6은 합성 수용체-지질 결합체의 세포외 소포체-매개의 세포간 이동을 나타낸 도이다:
(a) 바이오틴-지질-결합된 MFL로 처리된 세포로부터 수확한 EV를 포함하는 또는 EV를 제거한 상층액으로 처리한 후 Alexsa594-SA로 처리된 HeLa 세포의 형광세기의 정량을 나타낸다. 데이터는 평균±표준오차(n=5, ***p<0.001, Student's 검정);
(b) MFL을 사용하여 위쪽 트랜스웰 필터에서 바이오틴-지질을 siRNA(scrambled, ARF6, 또는 RAB 27A)-전처리된 세포로 전달하고 4시간 후, Alexa594-SA를 아래쪽 챔버의 HeLa 세포에 처리하고, 그 형광세기를 정량한 것이다. 데이터는 평균±표준오차(n=5, ***p<0.001, Student's 검정을 사용하여 무처리된 대조군에 비교함).
도 7은 합성 수용체-지질 접합체가 전달된 종양세포에서 세포막-특이적인 광독성을 나타낸 도이다:
(a) Ce6-SA가 세포막에 위치해 있는 HeLa 세포의 공초점 형광 현미경 도면이다. 바이오틴-지질-결합된 MFL-처리된 세포는 1시간 또는 5시간 동안 Ce6-SA로 처리되었다. 기준자는 20 ㎛이다;
(b) 광역학 치료 이후의 방사선 양-의존적인 세포 사멸을 나타낸 도이다. 바이오틴-지질-결합된 MFL-처리된 HeLa 세포는 Ce6-SA로 1시간 동안 처리되었고, 세척된 후 방사선 조사되었다;
(c) PDT 이후의 배양시간-의존적인 세포 사멸을 나타낸 도이다. 바이오틴-지질-결합된 MFL-처리된 HeLa 세포는 Ce6-SA로 1시간 또는 5시간 동안 처리되었고, 세척된 후 PDT를 위해 방사선 조사되었다;
(d) PDT 이후의 바이오틴-지질-결합된 MFL-의존적인 세포 사멸을 나타낸 도이다. 바이오틴-지질-결합된 MFL-처리 또는 무처리 세포들을 Ce6-SA로 1시간 또는 5시간 동안 처리하고, 세척한 후 PDT를 위해 방사선 조사하였다;
(e) 배양액 내의 비결합 Ce6-SA의 광독성 효과를 나타낸 도이다. 바이오틴-지질-결합된 MFL-처리 또는 무처리 세포들을 Ce6-SA로 1시간 동안 처리하고 세척 과정 없이 PDT를 위해 방사선 조사하였다;
(f) PDT 이후의 활성 산소(Reactive oxygen species)-의존적인 세포 사멸을 나타낸 도이다. 바이오틴-지질-결합된 MFL-처리된 세포들을 Ce6-SA로 1시간 동안 처리한 후, 세척하였다. 그런다음, 서로 다른 농도의 소듐 아자이드(NaN3)로 처리하였고, PDT를 위해 방사선 조사하였다;
(g) 방사선 조사 동안 서로 다른 농도에서 Ce6-SA를 포함하는 배양액의 온도 변화를 나타낸 도이다;
(h 및 i) 다양한 종류의 리포좀을 사용하여 위쪽 필터에서 세포로 바이오틴-지질 결합체를 전달하고 4시간 후에, 스트렙타비딘(SA)-Alexa594를 처리한 위쪽 트랜스웰 필터(h) 및 아래쪽 챔버(i)의 종양 세포[(HeLa, 4T1, 및 MDA-MB-231(MDA)]의 광독성을 나타낸 도이다. 데이터는 평균±표준오차[n≥≥3; NS: 유의성 없음, ***p<0.001, (b-e, h 및 i)에 대한 Student's 검정; **p<0.01, ***p<0.001, (f)에 대한 Tukey post 검정과 함께 one-way ANOVA].
도 8은 광역학 치료(PDT) 후의 방사선 조사 양-의존적인 세포 사멸을 나타낸 도이다;
(a 및 b) Ce6-SA로 1시간 동안 처리된 바이오틴-지질-결합된 MFL-처리된 4T1(a) 또는 MDA-MB-231(b) 세포이고, 상기 세포들은 세척된 후 PDT를 위해 방사선 조사되었다. 데이터는 평균±표준오차(n≥≥3, ***p<0.001, Student's 검정을 사용하여 무처리된 대조군에 비교함).
도 9는 세포막에 Ce6-지질 결합체를 직접적으로 전달한 결과를 나타낸 도이다;
(a) 바이오틴-지질-결합된 MFL로 처리한 후 Ce6-SA를 처리하거나 또는 Ce6-MFL로 직접적으로 처리된 HeLa 세포의 공초점 형광 현미경 사진 및 형광 세기의 정량을 나타낸 도이다. 데이터는 평균±표준오차(n≥≥25, ***p<0.001, Student's 검정을 사용하여 Ce6-MFL에 비교함). 기준자는 20 ㎛이다;
(b) 위쪽 필터의 세포를 바이오틴-지질-결합된 MFL로 처리한 후 4시간 이후에 Ce6-SA로 처리하거나 또는 위쪽 필터의 세포에 Ce6-MFL로 직접 처리한 후 4시간 이후의 위쪽 트랜스웰.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하며, 세포막에 융합하여 상기 접합체를 포함하는 세포막성 소포를 분비시키는 리포좀을 제조하는 단계; 및
2) 단계 1)의 리포좀을 세포에 처리하여 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 세포막성 소포를 생성시키는 단계를 포함하는 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 세포막성 소포의 제조방법을 제공한다.
상기 합성 수용체는 바이오틴(biotin), 아자이드(azide), 니트릴로트리아세틱 산(Nitrilotriacetic acid, NTA), 사이클로덱스트린 (Cyclodextrin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하여, 본 발명의 실시예에 의하면 바이오틴인 것이 더욱 바람직하다.
인지질은 포스포티딜 콜린(Phosphoatidylcholine, DDPC(l,2-dimyristoylamido-l,2-deoxyphosphatidylcholine), DLPC(dilauroylphosphatidylcholine), DMPC(dimyristoylphosphatidylcholine), DPPC(dipalmitoyl phosphatidylcholine), DSPC(Distearoylphosphatidylcholine), DOPC(1, 2-di-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC(1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine), DEPC(diethyl phosphorocyanidate)), 포스포티딜글리세롤 (Phosphotidylglycerol, DMPG(dimyristoyl phosphatidylglycerol), DPPG(dipalmitoyl-phosphatidylglycerol), DSPG(dermatan sulfate proteoglycan), POPG(1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol)), 포스포티딜이탄올아민(Phosphatidyletahnolamine, DMPE(bis (1, 2-dimethylphosphino) ethane), DPPE(1,2-Bis(diphenylphosphino)ethane), DSPE(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine)), 포스포티딜서린 (Phosphoditylserine, DOPS(dioleoylphosphatidylserine))로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다. 본 발명의 실시예에 의하면 디파미토일(dipalmitoyl)인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 세포막성 소포를 제공한다.
또한, 본 발명은 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는 이중 지질막으로 구성되며, 세포막에 융합하여 세포로 하여금 상기 접합체를 포함하는 세포막성 소포를 방출하게 하는 리포좀을 제공한다.
상기 합성 수용체는 바이오틴(biotin), 아자이드(azide), 니트릴로트리아세틱 산(Nitrilotriacetic acid, NTA), 사이클로덱스트린 (Cyclodextrin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하여, 본 발명의 실시예에 의하면 바이오틴인 것이 더욱 바람직하다.
상기 인지질은 포스포티딜 콜린(Phosphoatidylcholine, DDPC(l,2-dimyristoylamido-l,2-deoxyphosphatidylcholine), DLPC(dilauroylphosphatidylcholine), DMPC(dimyristoylphosphatidylcholine), DPPC(dipalmitoyl phosphatidylcholine), DSPC(Distearoylphosphatidylcholine), DOPC(1, 2-di-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC(1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine), DEPC(diethyl phosphorocyanidate)), 포스포티딜글리세롤 (Phosphotidylglycerol, DMPG(dimyristoyl phosphatidylglycerol), DPPG(dipalmitoyl-phosphatidylglycerol), DSPG(dermatan sulfate proteoglycan), POPG(1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol)), 포스포티딜이탄올아민(Phosphatidyletahnolamine, DMPE(bis (1, 2-dimethylphosphino) ethane), DPPE(1,2-Bis(diphenylphosphino)ethane), DSPE(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine)), 포스포티딜서린 (Phosphoditylserine, DOPS(dioleoylphosphatidylserine))로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하다. 본 발명의 실시예에 의하면 디파미토일(dipalmitoyl)인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 리포좀은 친수성 약물 등의 기능성 물질이 접합된 인지질을 포접하며, 세포막에 융합하여 상기 기능성 물질이 결합된 인지질을 포접하는 세포막성 소포를 분비시킬 수 있고, 상기 세포막성 소포는 세포막으로부터 분비된 것이므로 세포막의 이중지질층으로 구성되어 있다. 또한, 리포좀의 이중지질막은 세포의 이중지질막과 유사한 성분으로 구성되고, 구체적으로, 기본 인지질, 다양한 기능성 물질들과 접합 가능한 기능성 인지질(conjugated phopholipie), 양전하를 띄는 인지질(cationic phospholipid) 및 PEG(polyethylene glycol; 폴리에틸렌 글리콜)가 결합된 지질로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, DMPC, DSPE-PEG, DOPAP 및 바이오틴화 PE(biotinylated PE)를 이용하여, 바이오틴-지질-결합된 MFL(biotinylated MFL; BMFL)을 제조하였고, 바이오틴-지질-결합된 MFL이 세포막 융합 과정을 통해 BNFL(biotinylated non-fusogenic liposomes) 및 BPL(biotinylated pegylated liposomes) 보다 더 효과적으로 암 세포막에 결합함을 확인하였으며, 상기 암세포에서 분비되는 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)를 통해 주변의 다른 세포로 합성 수용체-인지질(synthetic receptor- phospholipid conjugates; SRL)의 접합체를 전달함을 확인하였다(도 2c 참조).
또한, 본 발명은 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는, 상기 세포막성 소포 또는 상기 리포좀, 및 상기 합성 수용체에 결합이 가능하며 기능성 물질이 결합된 리간드(ligand)를 유효성분으로 함유하는 기능성 물질 전달용 조성물을 제공한다.
상기 기능성 물질은 친수성 약물, 형광물질, MRI 조영제 및 클릭 화학(click chemistry)을 이용하여 부착가능한 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 상기 리간드는 스트렙타비딘(streptavidin), 사이클로옥틴(cyclooctyne), 폴리히스티딘(polyhistidine), 콜레스테롤(cholesterol)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 본 발명의 실시예에 의하면 스트렙타비딘인 것이 더욱 바람직하다.
또한, 상기 약물은 세포막 염료, 광과민제, 항암제, 항생제인 것이 바람직하다.
상기 항암제는 젬시타빈(gemcitabine), 부술판(Busulfan), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 멜파란(Melphalan), 시스플라틴(Cisplatin), 이포스파미드(Ifosfamide), 시타라빈(Cytarabine), 5-플루오로우라실(5-FU), 메토트렉세이트(Methotrexate; MTX), 다우노루비신(Daunorubicin), 아드리아마이신(Adriamycin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 프로카바진(Procarbazine), 타목시펜(Tamoxifen), 메게스테롤 아세테이트(Megesterolacetate), 플루타미드(Flutamide) 및 고세렐린 아세테이트(Gosereline acetate, Zoladex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항생제는 페니실린(penicillin)계 항생제, 세팔로스포린(cephalosporine)계 항생제, 마크로라이드(macrolide)계 항생제, 테트라시클린(tetracycline)계 항생제, 퀘놀론(quinolone)계 항생제, 항히스타민제, 항균제, 클린다마이신(clindamycin), 메트로니다졸(metronidazole), 클로람페니콜(chloramphenicol), 악티노마이신-D(Actinomycin-D), 블레오마이신(Bleomycin) 및 미토마이신-C(Mitomycin-C)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 기능성 물질 전달용 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 하나 이상의 물, 식염수, 인산 완충 식염수, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다. 이러한 조성물은 투여 후 활성 성분의 빠른 방출, 또는 지속적이거나 지연된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 담체는 당업자에게 잘 알려진 여러 가지 인자에 따라 제조될 수 있는데, 예를 들면 이용된 특정 생리활성물질, 이의 농도, 안정성 및 의도된 생체이용성; 본 발명의 세포막 결합성 리포좀으로 치료하고자 하는 질환 및 질병 또는 상태; 치료받을 개체, 나이, 크기 및 일반적인 상태; 조성물을 투여하는데 이용되는 경로, 예를 들어 비강, 구강, 안구, 국소, 경피 및 근육 등의 요인을 고려해야 하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 경구 투여 경로 이외의 생리활성물질 투여에 이용되는 약제학적으로 이용가능한 담체에는 D5W, 덱스트로즈 및 생리학적 염을 용적의 5% 이내로 포함하는 수용액을 포함한다. 또한 약제학적으로 이용가능한 담체에는 보존제 및 항산화제와 같은 활성 성분들의 안정성을 보강시킬 수 있는 추가 성분들을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 기능성 물질 전달용 조성물의 투여량은 의도하는 치료에 유효한 용량으로 투여된다. 특정의 의학적 질환을 치료하거나 또는 이의 진행을 억제시키는데 요구되는 치료상 유효량은 의학 분야에 공지된 예비임상 연구 및 임상연구를 이용하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명에서 상기 치료상 유효량은 임상의 또는 연구자가 목적하는, 특정 조직, 시스템, 및 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발시키는 활성 성분의 양을 말한다. 본 발명의 기능성 물질 전달용 조성물의 투여 경로는 적합한 모든 투여 경로가 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 합성 수용체-인지질의 접합체를 포함하는, 제 4항의 세포막성 소포 또는 제 5항의 리포좀, 및 상기 합성 수용체에 결합이 가능하며 항암제가 결합된 리간드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 항암제는 젬시타빈(gemcitabine), 부술판(Busulfan), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 멜파란(Melphalan), 시스플라틴(Cisplatin), 이포스파미드(Ifosfamide), 시타라빈(Cytarabine), 5-플루오로우라실(5-FU), 메토트렉세이트(Methotrexate; MTX), 다우노루비신(Daunorubicin), 아드리아마이신(Adriamycin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 빈데신(Vindesine), 프로카바진(Procarbazine), 타목시펜(Tamoxifen), 메게스테롤 아세테이트(Megesterolacetate), 플루타미드(Flutamide) 및 고세렐린 아세테이트(Gosereline acetate, Zoladex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 암은 폐암, 고환암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 피부암, 위암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 마우스 동물 모델을 이용하여 바이오틴-지질-결합된 MFL(BMFL)과 Ce6-SA의 처리를 통한 생체 내 광역학 치료 효과를 확인한 결과, 바이오틴-지질-결합된 MFL에 의해 전달된 지질은 혈관으로부터 먼 곳까지 도달함을 확인하였고(도 10a 참조), 바이오틴-지질-결합된 MFL로 전처리를 한 마우스는 SA만을 주입시킨 마우스와 비교하여, 종양의 주변 및 안쪽 부분 모두에서 현저하게 증가된 SA의 축적을 확인하여(도 10b 참조), 바이오틴-지질-결합된 MFL의 전처리는 종양 미세환경에서, 결합 위치를 생성하는 것을 통해 SA의 축적을 증가시키고 균질한 전달을 가능하게 하게 함을 확인하였다.
또한, 상기 마우스에 빛을 조사하여 치료 효과를 확인한 결과, 바이오틴-지질-결합된 MFL과 Ce6-SA로 처리한 종양에서 종양 성장이 현저하게 억제됨을 확인하였고, 하여, 상기 종양에서 종양 세포의 개수가 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 10c 참조).
따라서, 바이오틴-지질-결합된 MFL의 전처리는 종양에서의 결합 위치를 생성하여, Ce6-SA의 축적 및 분포를 향상시킴으로써, PDT의 효능을 현저하게 증가시키므로, 본 발명의 합성 수용체-인지질을 포함하는 리포좀 및 그 합성 수용체-인지질을 표적화하는 물질은 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약물 전달용 조성물에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 실험 재료의 준비
<1-1> 세포 배양
HeLa 세포, B16-F10 세포는 DMEM(Hyclone)에서 배양하였고, 4T1 세포는 RPMI(Hyclone)에서 배양하였다. 상기 배양액은 10% FBS(Hyclone) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin, Hyclone)을 첨가하였고, 모든 세포는 95% 공기 및 5%의 이산화탄소의 대기의 37℃ 배양기에 있는 조직 배양 플라스크에서 배양하였다.
<1-2> 리포좀의 제조
리포좀(liposome)을 제조하기 위하여, 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DMPC, Avanti Polar Lipids), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000](DSPE-PEG, Avanti Polar Lipids), 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP, Avanti Polar Lipids), 및 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)(Biotinyl PE, Avanti Polar Lipids)를 사용하였다. 각각의 리포좀에 사용된 DMPC, DSPE-PEG, DOPAP 및 바이오틴화 PE(biotinylated PE)의 몰 비율은 71.2 : 3.8 : 20 : 5 (BMFL), 75 : 0 : 20 : 5 (BNFL) 및 91.2 : 3.8 : 0 : 5 (BPL)이다. 리포좀을 준비하기 위하여, 상기 각 종류의 지방(lipid)을 클로로포름(chloroform)에 용해하한 후, 적절한 비율로 혼합하였다. 상기 혼합물은 하루 동안 완전히 건조하였고, 남겨진 지방 필름(film)은 PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 수화시켰으며, 그런 다음 100 nm 멤브레인 여과지(Whatman)로 압출하였다. 리포좀의 크기(hydrodynamic size) 및 제타 포텐셜(zeta potential)은 나노입자분석기(dynamic light scattering, Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments)를 사용하여 측정하였다. 리포좀을 이용한 모델 합성 수용체 전달(model synthetic receptor delivery)은 바이오틴화 PE 대신에 형광 지질인, 1,2-dipalmitoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (Liss Rhod PE, Avanti polar lipids)를 적당량 첨가하여 수행하였다.
<1-3> Ce6 -SA 결합체의 합성
Ce6(Santa Cruz Biotechnology)의 카복실산 그룹(carboxylic group)을 활성화하기 위하여, 무수의(anhydrous) DMSO(10 mg/ml) 및 같은 몰의 Nhydroxysuccinimide(Sigma)에 용해하였고, DMSO(10 mg/ml)에 용해되어 있는 같은 몰의 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(Sigma)를 첨가하였다. 1시간 후에, 상기 DMSO 용액은 PBS(5 mg/ml)에 용해되어 있는 스트렙타비딘(streptavidin, Pierce Biotechnology)과 함께 상온에서 2시간 동안 혼합하였다. 반응 후, 초과된 양의 비결합 Ce6는 PD-10 탈염 컬럼(desalting columns, GE healthcare)를 사용하여 제거하였다.
< 실험예 1> 합성 수용체-인지질 결합체의 암-특이적인 세포막 전달 및 세포내부적인 이동 확인
<1-1> 바이오틴 -지질- 결합된 MFL ( biotinylated MFL ; BMFL )은 포식세포보다 암세포와의 결합이 우세함을 확인
본 발명자들은 먼저, 대식세포(macrophages)와 비교하여 바이오틴-지질-결합된 MFL이 합성 수용체-인지질을 암 세포에 특이적으로 전달할 수 있는지를 조사하였는데, 여기서 대식세포와 비교한 이유는 이들이 단핵식세포계(mononuclear phagocyte system)를 구성하고 우리의 몸 안에 주입되는 나노입자(nanoparticles)를 제거하는 데 기여하기 때문이다.
구체적으로, 세포로 전달되는 리포좀성(liposomal) 지질을 추적하기 위하여, 형광 지질을 포함하는 바이오틴-지질-결합된 MFL을 상기 실시예 <1-1>의 암 세포 및 대식세포에 1시간 동안 처리하여, 세포의 리소좀(lysosomes)을 염색하였다.
그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰하였을 때, 리포좀성 지질이 대식세포에서 1시간 때에 리소좀과 동일위치(colocalization)에서 높게 발현하고 있음을 확인하였고, 이는 바이오틴-지질-결합된 MFL이 이러한 세포에 의해 능동적인 식세포작용을 거쳤다는 것을 의미한다. 반면, HeLa 및 4T1 세포에서는 리포좀성 지질과 리소좀이 동일위치에서 낮은 비율로 함께 관찰된 바, 이는 세포막 융합이 식세포작용보다 더 우세하다는 것을 나타낸다. 상기를 통해, 대식세포는 식세포작용이 우세하며, 여기에 바이오틴-지질-결합된 MFL을 전처리하는 것은 세포막에 SA(streptavidin)을 위한 결합 위치를 효과적으로 생성할 수 없을 것이다(도 2b). 결론적으로, 이러한 결과들은 바이오틴-지질-결합된 MFL이 식세포작용이 우세한 포식세포(phagocytes) 보다 암 세포와 더 잘 융합할 수 있음을 제시한다. 바이오틴-지질-결합된 MFL이 세포막과 융합하여 세포 표면으로 합성 수용체-인지질을 전달하여야 하고, SA를 위한 결합 위치를 제공해야 하기 때문에, 대식세포와 같은 포식세포에 의한 바이오틴-지질-결합된 MFL의 식세포작용은 세포 표면에 바이오틴을 제시(presentation)하는 효율을 저하시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명자들은 바이오틴-지질-결합된 MFL이 암-특이적인 결합 위치를 생성하고 치료적 분자들의 타겟을 증가시킬 수 있다고 가정하였다.
<1-2> 합성 수용체-인지질의 세포막으로의 전달에 대한 바이오틴 -지질- 결합된 MFL과 선행기술들의 비교
다음으로, 바이오틴-지질-결합된 MFL의 세포막 융합 과정을 통하여 합성 수용체-인지질을 세포막에 효과적으로 전달시킬 수 있는지 확인하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다. 상기 융합 과정을 능동 또는 느린 식세포작용 과정과 비교하기 위하여, 높은 양전하를 갖는 BNFL(biotinylated non-fusogenic liposomes) 및 음전하를 갖는 BPL(biotinylated pegylated liposomes)을 사용하였다.
구체적으로, HeLa 세포는 상기 각각의 리포좀으로 1시간 동안 처리하였고, 여분의 비결합 리포좀은 완전히 세척하여 제거하였다. 그런 다음, 세포막에 존재하는 바이오틴을 검출하기 위하여, 세포를 상기 형광단(fluorophores)에 결합한 SA와 함께 배양하였다.
공초점 현미경으로 측정한 결과, 도 2c에 나타난 바와 같이, 바이오틴-지질-결합된 MFL이 가장 효과적으로 바이오틴화 지질을 세포막으로 전달함을 알 수 있었다. BNFL을 처리한 세포는 세포 표면에 바이오틴이 고르지 못하게 분포하였으며, BPL은 세포막으로 바이오틴화 지질을 거의 전달하지 못함을 확인하였다(도 2c, 왼쪽 위). 정량을 위하여 상기의 형광 세기를 측정하였을 때, 바이오틴-지질-결합된 MFL 또는 BNFL을 처리한 세포는 표면 바이오틴의 양이 경쟁적이었으나, BPL을 처리한 세포들은 세포 표면의 바이오틴의 양을 무시할 수 있을 정도임을 확인하였다(도 2c, 오른쪽 위).
<1-3> 바이오틴 -지질- 결합된 MFL 전처리된 세포는 합성 수용체-인지질을 다른 세포로 전달하는 능력이 현저함을 확인
다음으로, 본 발명자들은 리포좀에 의해 우선적으로 세포 표면에 전달된 바이오틴화 지질이 EV(extracellular vesicles, 세포외 소포체)의 형태로 다른 세포에 전달될 수 있는지 확인하고자, 하기 실험을 수행하였다.
구체적으로, 세포에 의해 분비되는 세포막 소포체의 이동은 가능하나, 세포 자체의 이동은 불가능한, 트랜스웰(Transwell) 분석을 수행하였다.
이를 공초점 현미경으로 측정한 결과, 도 2c에 나타난 바와 같이, 다른 그룹보다 바이오틴-지질-결합된 MFL을 전처리한 위쪽 층(layer)에서 배양된 세포에서 표면 바이오틴의 양이 현저하게 증가함을 확인하였다(도 2c, 왼쪽 아래). 바이오틴-지질-결합된 MFL 또는 BNFL을 처리한 세포의 위쪽 트랜스웰 필터에서 유사한 정도로 표면 바이오틴의 양을 나타내었으나, EVs에 의해 매개되는 아래쪽 챔버 세포로의 바이오틴 전달은 바이오틴-지질-결합된 MFL이 전처리된 세포에서 훨씬 뛰어남을 확인하였다(도 2c, 오른쪽 아래).
또한, 합성 수용체-인지질이 세포막에 어느 정도의 시간 동안 존재하는지 조사하기 위하여, SA를 사용하여 48시간에 표면 바이오틴을 관찰하였고, 그 결과 도 2d에 나타난 바와 같이, 표면 바이오틴이 약 16시간의 반감기로 줄어드는 것을 확인하였다(도 2d). 이를 공초점 현미경으로 측정한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 리포좀성 지질은 처리 후 1시간째에 세포막에 주로 위치하고 있음을 확인하였다. 그 후, 5시간째에는 세포막 구조의 역동성(dynamic) 특성을 반영하여, 약간의 지질이 천천히 세포 안으로 내재화(internalized)되었으며, 리소좀과 동일위치에서 확인되었다(도 4).
<1-4> 바이오틴화 지질의 세포 내부로의 전달이 EV에 의해서 매개됨을 확인
바이오틴화 지질의 세포 내부로의 전달이 EV에 의해서 매개된다는 것을 증명하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다.
구체적으로, 바이오틴-지질-결합된 MFL이 전처리된 세포로부터 EV를 포함하는 세포 배양액을 준비하였다. 그런 다음, 배양액으로부터 EV가 제거되었을 때, 바이오틴 전달이 감소하는지를 조사하였다. 먼저, EV-포함된 배양액을 획득하기 위하여, 10,000×g에서 원심분리를 수행하여, 사멸 세포 및 세포 분순물을 제거하였다. 상기 EV-포함된 배양액은 100,000×g 에서 2시간동안 초원심분리를 수행하여, EV를 침전시킨 후 EV가 제거된 배양액인 상층액을 수득하였다. 그런 다음, 온전한 세포들을 각 배양액으로 처리하였고, 표면 바이오틴을 검출하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 표면 바이오틴은 배양액으로부터 EV가 제거되었을 때 현저하게 감소하였고, 이로부터 EV가 바이오틴화 지질의 전달에서 매개체라는 것을 알 수 있다(도 5a). 또한, 각각 원형질 막 미세 소포체(plasma membrane micro vesicles) 또는 엑소좀(exosomes)의 분비를 억제하는 ARF6-siRNA 또는 RAB27A-siRNA를 세포에 처리하였을 때, 바이오틴의 이동이 현저하게 감소함을 확인하였다(도 5b).
이 결과는, 바이오틴-지질-결합된 MFL이 세포 표면에 바이오틴화 지질을 전달하고, 이는 EV를 통해 다른 세포로 전달됨을 제시한다. 또한, 도 6에 나타난 바와 같이, 바이오틴-지질-결합된 MFL의 양을 증가시켜 세포에 처리하였을 때, 양(dose)-의존적인 표면 바이오틴 신호의 증폭을 나타내었고, 이는 세포 생존성(cell viability)에 영향이 없음을 확인하였다(도 6).
< 실험예 2> 합성 수용체로 조작된 암 세포에서 세포막-특이적인 광독성 확인
<2-1> 세포막으로 합성 수용체-인지질을 전달하는 것의 광역학 효과에 대한 영향 확인
세포막으로의 합성 수용체-인지질 전달 효과를 광역학 효과에 대한 측면에서 확인하기 위하여, 바이오틴-지질-결합된 MFL 및 Ce6-SA를 사용하여 하기의 실험을 수행하였다.
광독성 분석은 방사선을 조사 한 뒤, CE6-SA의 광독성을 LIVE/DEAD 분석으로 측정하였다. 구체적으로, HeLa 세포에 바이오틴-지질-결합된 MFL을 1시간 동안 처리한 후, 배양액으로부터 비결합 바이오틴-지질-결합된 MFL을 제거하였고, 세포에 Ce6-SA를 1시간 동안 처리한 다음, 방사선을 조사하고, 세포에 5 μM Ethidium homodier-1 (Invitrogen)를 상온에서 1시간 동안 처리하였다. 그 후, 공초점 형광 현미경(confocal fluorescence microscope, Nikon)을 사용하여 표면 바이오틴에 결합하는 Ce6-SA를 시각화 하였고, 손상된 세포막을 갖는 세포로부터의 붉은색 형광을 측정하였다.
그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, Ce6-SA가 성공적으로 세포의 표면에 결합함을 확인하였고, 배양 5시간 이후에 Ce6-SA가 세포 안으로 느리게 내재화되는 것을 확인하였다(도 7a).
또한, 실험관 내(in vitro) 광역학 치료효과를 확인하기 위하여, 하기의 방법으로 실험을 수행하였다.
구체적으로, 1만 개의 세포를 48웰 플레이트에 분주하고, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 각 리포좀의 140 μM을 포함하는 배양액을 세포에 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 비결합 리포좀을 세척한 다음, 상기 세포에 50 μM의 Ce6-SA를 포함하는 배양액을 다양한 시간대로 처리하여 37℃에서 더 배양한 후, 100 mW/cm2의 출력 밀도를 갖는 660 다이오드 레이저(diode laser)로 3분간 방사선을 조사하였다.
그 결과, 방사선의 처리 양(dose)에 의해 광독성(phototoxicity)이 현저하게 영향을 받음을 확인하였고(도 7b), 4T1 및 MDA-MB-231 세포에서도 비슷한 결과를 확인하였다(도 8). 또한, 바이오틴-지질-결합된 MFL이 전처리된 세포에서 Ce6-SA의 배양 시간은 방사선을 조사한 후의 광독성에 영향을 미치지 않음을 확인하였는데, 이는 Ce6-SA가 세포 내부로 내재화될 필요가 없고, Ce6-SA가 결합된 세포막이 광독성을 효과적으로 유도할 수 있음을 나타낸다(도 7c).
다음으로, 세포에서의 바이오틴-지질-결합된 MFL의 전처리 효과를 알아보기 위하여, 바이오틴-지질-결합된 MFL을 처리하지 않고, 세포에 Ce6-SA만을 처리한 후 1시간 및 5시간 동안 배양하였고, 비결합 Ce6-SA를 세척하여 제거하였다.
그 결과, 도 7d에 나타난 바와 같이, 급속한 세포 사멸을 나타낸 바이오틴-지질-결합된 MFL이 전처리된 세포와 달리, Ce6-SA만으로 처리된 세포는 방사선을 조사한 후에 세포 사멸을 나타내지 않았는데, 이는 Ce6-SA가 바이오틴-지질-결합된 MFL의 전처리 과정 없이는 세포를 사멸하기 위한 충분한 양으로 세포로 내재화되지 않고, 세포에 결합하지 않는다는 것을 의미한다(도 7d).
또한, 세포 배양액에 존재하는 비결합 Ce6-SA가 광독성을 나타내는지 시험하기 위하여, 바이오틴-지질-결합된 MFL로 처리하거나 처리하지 않은 세포에 Ce6-SA를 처리하여 1시간 동안 배양하였고, 비결합 Ce6-SA를 세척해내지 않고 방사선을 조사하였다. 그 결과, 도 7e에 나타난 바와 같이, 빛 조사 전에 세포를 세척하지 않는 것은 광독성 효과에 영향을 주지 않았고, 이는 세포막에 Ce6-SA의 결합이 광독성을 유도하는데 필수적임을 제시한다(도 7e).
<2-2> 광역학 효과 중심적인 세포 사멸의 확인
다음으로, 본 발명자들은 세포막에 결합한 Ce6-SA가 광열(photothermal) 또는 광역학(photodynamic) 효과에 의해 종양 세포를 사멸시키는지 조사하였다. 먼저, 산화 환원반응(redox)의 소광제(quencher) 및 일중항 산소 스캐빈저(singlet oxygen scavenger)인, 소듐 아자이드(sodium azide)의 존재에서 Ce6-SA의 광독성을 측정하여 Ce6-SA의 광역학 효과를 측정하였다.
그 결과, 도 7f에 나타난 바와 같이, 소듐 아자이드의 존재하에서 세포에 방사선을 조사하였을 때, 세포의 사멸이 현저하게 감소하였고 10 mM의 소듐 아자이드는 Ce6-SA의 광독성을 완전히 상쇄시킴을 확인하였다(도 7f). Ce6-SA의 광열 효과 또한 방사선 조사 동안에 Ce6-SA를 포함하는 배양액의 온도의 변화를 탐지할 수 있는 IR 카메라를 사용하여 조사하였다. 그 결과, 도 7g에 나타난 바와 같이, Ce6-SA(50 μg/ml)를 포함하는 배양액의 온도를 3분 동안 측정하였을 때, 온도의 변화가 없음을 확인하였고, Ce6-SA의 농도를 10배 증가하였을 때(500 μg/ml)에도, 같은 결과를 나타냄을 확인하였다(도 7g). 상기 결과를 통해서, Ce6-SA가 주로 광역학 효과를 통해 종양 세포를 사멸시키고, 광열 효과가 있다고 하더라도, 그 효과는 미미함을 알 수 있다.
<2-3> 바이오틴 -지질- 결합된 MFL이 다양한 세포에서 바이오틴화 지질을 포함하는 EV의 분비를 유도할 수 있음을 확인
다음으로, 트랜스웰 분석에서 위쪽 트랜스웰 필터 및 아래쪽 챔버에 있는 종양 세포의 광독성을 조사하였다. 위쪽 트랜스웰 필터에 HeLa, 4T1, 및 MDA-MB-231 세포를 바이오틴-지질-결합된 MFL, BNFL, 및 BPL로 1시간 동안 처리하였고, 비결합 리포좀을 배양액으로부터 세척하였다. 그런 다음, 세포를 1시간 동안 Ce6-SA로 처리하였고, 방사선 조사한 다음 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과, 도 7h에 나타난 바와 같이, 바이오틴-지질-결합된 MFL로 전처리한 세포가 가장 높은 광독성을 나타내었고, BNFL 및 BPL은 중간의 광독성을 나타냄을 확인하였다(도 7h). 또한, 아래쪽 챔버에 대해, 도 1e에 나타낸대로 트랜스웰 분석을 수행하였다. 세포 생존율을 측정하였고, 이를 통해 바이오틴-지질-결합된 MFL을 전처리한 위쪽 트랜스웰 필터와 함께 배양된 세포에서 현저한 세포 사멸이 유도되는 것을 확인하였으나, 다른 그룹에서는 현저한 세포 사멸을 확인할 수 없었다(도 7i). 이러한 결과는 바이오틴화 지질이 바이오틴-지질-결합된 MFL이 전처리된 세포로부터 분비된 EV를 통해 아래쪽 챔버에 있는 세포에 성공적으로 전달된다는 것을 제시한다.
<2-4> 바이오틴 -지질- 결합된 MFL과 Ce6 -SA의 혼합 사용의 PDT 효과 확인
두번째 시료인 SA의 사용은 약물 전달체로서 MFL만을 사용하는 것을 뛰어넘는 장점을 갖는데, 이는 세포막 융합 과정이 MFL의 표면 성질에 민감하기 때문이며, MFL의 표면에서 직접적인 약물의 결합은 순표면 전하에 영향을 미치고 세포막 융합을 억제한다. Ce6에 결합된 지질이 포함된 MFL에 의하여 Ce6가 직접적으로 전달 될 때와 비교하여, 본 발명의 바이오틴-지질-결합된 MFL을 처리한 후 Ce6-SA를 처리하였을 때, Ce6의 세포막으로의 전달 효능이 50배 더 높음을 확인하였다(도 9a). 또한, 예측한 바와 같이, 바이오틴-지질-결합된 MFL과 Ce6-SA를 혼합하여 사용하였을 때 PDT 효과가 높음을 확인하였다(도 9b). Ce6를 포함하는 MFL의 세포에의 융합 감소 및 PDT 효능은 MFL에 음성적인 순표면 전하를 주는 Ce6의 카복실 그룹으로부터 기인하는, MFL의 순표면 전하에서의 변화에 의해 야기된다고 생각된다(도 9c). 이러한 결과는 다른 치료용 약물을 사용하는 것을 고려하더라도 SA가 바이오틴에 결합하는 정도는 SA에 결합된 약물에 의해 거의 영향을 받지 않으므로, SA가 약물 운반체로써 통상적으로 사용될 수 있음을 제시한다.
< 실험예 3> 바이오틴 -지질- 결합된 MFL의 전처리는 종양에서 SA의 축적 및 분포를 증가시킴을 확인
<3-1> 생체 내( in vivo ) 광역학 치료 효과 확인
Balb/c 마우스에 5×105개의 4T1 세포를 주입하여 종양 이종이식(xenograft) 모델을 제조하였다. 종양의 부피가 일정한 사이즈에 도달하였을 때, 마우스를 임의의 다섯 개의 그룹으로 나누었고, 하기와 같이 처리하였다: (i) 마우스에 Ce6-SA(1.5 mg/kg의 농도의 Ce6)를 주입하기 하루 전에, 10 mM 바이오틴-지질-결합된 MFL 용액 200 ㎕를 주입하였다. 2일째에, 종양에 빛을 조사하였다(660 nm, ~ 100mW/cm2, 30분). (ii) 마우스에 Ce6-SA를 주입하기 하루 전에, 10 mM의 바이오틴-지질-결합된 MFL 용액 200 ㎕를 주입하였다. 2일째에, 종양에 빛을 조사하였다. (iii) 마우스에 Ce6-SA를 주입하기 하루 전에, 10 mM의 BPL 용액 200 ㎕을 주입하였다. 2일째에, 종양에 빛을 조사하였다. (iv) 마우스에 BMFL 처리를 하지 않고 Ce6-SA를 주입하였다. 2일째에, 종양에 빛을 조사하였다. (v) 아무런 처리를 하지 않았다.
<3-2> 조직학적 분석 및 혈관 염색
희생된 마우스로부터 획득한 조직 샘플은 액체 질소에 즉시 담근 뒤, -80℃에서 저장하였다. 그 후, 조직을 절편하여(10 ㎛), 상온으로 옮긴 후, 1시간 동안 건조시키고 아세톤 또는 4% 포름알데히드(formaldehyde)로 고정하였다. 혈관 염색을 위하여, 블로킹 용액에 희석된 랫 항-마우스 CD31(Invitrogen) 처리에 앞서 20분 동안 블로킹 용액으로 고정된 분획을 처리하였다. 2시간째에, 조직 분획을 완전히 세척하였고 Alexa Fluor 488이 결합된 염소 항-랫 IgG(Invitrogen)으로 1시간 동안 처리하였다. 완전히 세척한 다음, 봉입제(mounting medium, Sigma)에 조직 분획을 봉입하였다. 그런 다음, 조직 분획은 공초점 현미경으로 관찰하였다(Nikon).
통계적 분석을 위하여, 데이터는 평균±SEM으로 나타내었고, SPSS 16.0 소프트웨어로 분석하였다. 그룹간의 평균의 차이는 one-way ANOVA 시험으로 결정하였다. P<0.05을 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 것으로 고려하였다.
<3-3> 생체 내에서 바이오틴 -지질- 결합된 MFL에 의한 SA의 분포 확인
합성 수용체-인지질과 함께 전달되는 종양에서 SA의 타겟팅 효과를 조사하기 전에, 먼저 바이오틴-지질-결합된 MFL에 의해 전달된 지질의 분포를 상기 <실시예 2>의 마우스 모델을 사용하여, 형광 지질의 결합을 시각화하여 확인하였다.
구체적으로, 마우스에 형광 지질을 포함하는 바이오틴-지질-결합된 MFL를 주입하였고, 2시간째, 8시간째 및 24시간째에 종양을 수득하였다. 공초점 현미경으로 측정한 결과, 바이오틴-지질-결합된 MFL에 의해 전달된 형광 지질의 분포가 투입 후 2시간째에는 혈관 지역에 제한됨을 확인하였으나, 투여 후 오랜 시간이 지났을 때(8시간째 및 24시간째)에는 지질이 종양 조직 전체에 걸쳐서 나타남을 확인하였다. 바이오틴-지질-결합된 MFL 및 BPEG에 의해 전달된 형광 지질의 분포를 서로 비교하였을 때, BPEG에 의한 전달은 혈관주위의(perivascular) 영역에 형광이 매우 집중된 반면, 바이오틴-지질-결합된 MFL에 의해 전달된 지질은 혈관으로부터 먼 곳까지 도달함을 확인하였다(도 10a).
다음으로, 이종이식 4T1 종양 모델을 사용하여 종양에서의 SA 축적 및 분포에 바이오틴-지질-결합된 MFL의 전처리가 어떻게 영향을 미치는지 확인하였다.
구체적으로, 조직내 SA 축적의 정량은 Balb/c 마우스에 5×105개의 4T1 세포를 주입하여 종양 이종이식(xenograft) 모델을 제조하여 수행하였다. 종양의 부피가 약 50 mm3에 도달하였을 때, 마우스에 5 μM 바이오틴-지질-결합된 MFL 또는 PBS 200 ㎕를 정맥주사로(intravenously) 주입하였고, 처리 후 1일째에, Alexa 647 형광 염료가 결합된 500 ㎍의 SA를 주입하였다. 그 후, 2일째에, 상기 마우스의 조직학적 분석을 수행하였다. SA 축적의 정량을 위하여, 비교적 낮은 IFP(interstitial fluid pressure)를 가지며 고도로 혈관이 발달된 종양의 주변 부분과 높은 IFP로 인하여 붕괴된 혈관구조(vasculature)를 나타내는 종양의 내부 모두에서, Alexa 647 염료의 형광 세기를 NIS-elements BR 소프트웨어(Nikon)을 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 10b에 나타난 바와 같이, 바이오틴-지질-결합된 MFL을 전처리 한 마우스는 SA만을 주입시킨 마우스와 비교하여, 종양의 주변 및 안쪽 부분 모두에서 현저하게 증가된 SA의 축적을 확인하였다. 또한, 상기 영역에서의 종양 혈관 주위의 SA의 형광 세기를 측정하였을 때, 바이오틴-지질-결합된 MFL을 전처리한 종양은 대조군과 비교하여 현저하게 증가된 SA 신호를 나타내었다(도 10b). 일반적으로, 종양은 높은 IFP를 나타낸다는 것이 알려져 있는데, 이는 혈관의 붕괴를 유발시키고, 중심으로부터 주변으로 혈관의 방향을 바꾸도록 한다. 또한, 림프성 혈관의 부족과 이로 인한 좋지 않은 수술(convection)은 종양으로의 약물 전달을 어렵게 만든다. 그러므로, 상기 결과는 바이오틴-지질-결합된 MFL의 전처리가 종양 미세환경에서, 결합 위치를 생성하는 것을 통해 SA의 축적을 증가시키고 균질한 전달을 가능하게 하게 함으로써 상기와 같은 생리적인 장애물을 극복할 수 있음을 나타낸다.
또한, 바이오틴-지질-결합된 MFL의 대부분이 주요 단핵성 식세포 시스템인 비장과 간에 축적됨을 확인하였다(도 11a). 이는 식세포에 의한 능동적인 흡수 및 약간 양성적으로 전하를 띤 바이오틴-지질-결합된 MFL의 표면으로부터 기인하는 아주 짧은 혈액 내 반감기에 기여한다. 하지만, 도 11b에 나타난 것처럼, 정상 조직에서는 바이오틴-지질-결합된 MFL 처리 후에 장기에서 SA의 축적이 거의 차이가 없음을 보여준다. 이러한 결과는 바이오틴-지질-결합된 MFL이 식세포성 세포에 의해 능동적으로 흡수되기 보다는 종양 세포와 융합하는 것을 선호하기 때문에, 종양 안에서의 결합 위치를 특이적으로 생성할 수 있음을 나타낸다. 그러므로, 종양 세포와 특이적으로 융합할 수 있고, 인공적인 수용체를 제조할 수 있는 바이오틴-지질-결합된 MFL을 사용함으로써, 본 발명자들은 SA에 의한 종양-특이적인 타겟 효과의 증가를 달성할 수 있다.
< 실험예 4> 바이오틴 -지질- 결합된 MFL의 전처리는 Ce6 -SA에 의해 PDT를 증가시킴을 확인
상기 <실험예 3>에서 바이오틴-지질-결합된 MFL이 종양 특이적인 방법으로 SA의 축적과 분포를 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인한 뒤, 4T1 종양을 갖고 있는 마우스에서 상기의 시스템의 치료적 효능을 측정하였다.
구체적으로, 마우스 동물 모델에 종양을 형성시킨 후, 종양 부피가 적당한 사이즈에 도달하였을 때, 바이오틴-지질-결합된 MFL, BNFL, BPL 또는 살린(saline)을 마우스에 주입하였고, Ce6-SA(1.5 mg/kg의 농도의 Ce6)를 24시간 후에 투여하였다. 종양은 Ce6-SA 주입 2일 후에 단일 도스의 빛(660nm, ~100mW/cm2 , 30분)을 조사하였다. 빛을 조사한 종양은 평균 ~60 mm3의 부피를 가졌고, 이들의 부피는 서로 현저한 차이를 나타내지 않았다. 종양의 부피는 빛 조사 후 2주에 걸쳐서 측정하였는데, 그 결과, 도 10d에 나타난 바와 같이, 다른 대조군 그룹에서는 현저한 효과가 나타나지 않았으나, 바이오틴-지질-결합된 MFL과 Ce6-SA로 처리한 4T1 종양에서 종양 성장이 현저하게 억제됨을 확인하였다. 마찬가지로 조직학적 분석을 통하여, 바이오틴-지질-결합된 MFL 및 Ce6-SA를 처리한 종양에서만 살아 있는 종양 세포의 개수가 현저하게 감소됨을 확인하였다(도 10c).
또한, MDA-MB-231 종양을 갖는 마우스에서 PDT를 수행하였는데, MDA-MB-231 종양 세포는 3중의 음성 유방 종양 세포(triple negative breast tumor cell) 종류 중 하나이고, 이들은 세 개의 가장 일반적인 타겟 수용체(에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체, 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2/neu)가 결여되어 있어, 표적치료(targeted therapy)가 어렵다. 본 발명자들은 합성 수용체의 전달을 위한 바이오틴-지질-결합된 MFL의 전처리를 통해 MDA-MB-231 종양의 표적 치료가 가능한 지 확인하였다.
그 결과, 도 10e에 나타난 바와 같이, 다른 대조군 그룹에서는 치료 효과가 없없으나, 바이오틴-지질-결합된 MFL과 Ce6-SA의 조합은 마우스에서 MDA-MB-231 종양을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였다. 모든 그룹에서, 몸 무게의 현저한 변화는 없었는데, 이는 상기 치료 방법이 독성 등의 부작용이 거의 없음을 의미한다. 상기 생체 내 실험은 바이오틴-지질-결합된 MFL의 전처리가 종양에서의 결합 위치의 생성으로 Ce6-SA의 축적 및 분포를 향상시켜, PDT의 효능을 현저하게 증가시킬 수 있음을 보여준다.

Claims (14)

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  8. 제1성분으로써, 합성수용체-인지질의 접합체를 포함하며 세포막에 융합하여 상기 접합체를 포함하는 세포막성 소포를 분비시키는 리포좀, 또는 상기 리포좀을 세포에 처리하여 생성된 상기 합성수용체-인지질의 접합체를 포함하는 세포막성 소포; 및
    제2성분으로써, 기능성 물질이 결합된 리간드(ligand);
    를 유효성분으로 함유하는 기능성 물질 전달용 조성물로,
    상기 합성수용체는 바이오틴(biotin), 아자이드(azide), 니트릴로트리아세틱 산(Nitrilotriacetic acid, NTA) 및 사이클로덱스트린(Cyclodextrin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이고;
    상기 기능성 물질은 친수성 약물, 형광물질, PET/SPECT 조영제, CT 조영제 및 MRI 조영제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이고; 및
    상기 리간드는 스트렙타비딘(streptavidin), 사이클로옥틴(Cyclooctyne), 폴리 히스티딘(poly histidine) 및 콜레스테롤(cholesterol)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 기능성 물질 전달용 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 인지질은 포스포티딜 콜린(Phosphoatidylcholine, DDPC(l,2-dimyristoylamido-l,2-deoxyphosphatidylcholine), DLPC(dilauroylphosphatidylcholine), DMPC(dimyristoylphosphatidylcholine), DPPC(dipalmitoyl phosphatidylcholine), DSPC(Distearoylphosphatidylcholine), DOPC(1, 2-di-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), POPC(1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine), DEPC(diethyl phosphorocyanidate)), 포스포티딜글리세롤 (Phosphotidylglycerol, DMPG(dimyristoyl phosphatidylglycerol), DPPG(dipalmitoyl-phosphatidylglycerol), DSPG(dermatan sulfate proteoglycan), POPG(1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol)), 포스포티딜이탄올아민(Phosphatidyletahnolamine, DMPE(bis (1, 2-dimethylphosphino) ethane), DPPE(1,2-Bis(diphenylphosphino)ethane), DSPE(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine)), 포스포티딜서린 (Phosphoditylserine, DOPS(dioleoylphosphatidylserine))로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 기능성 물질 전달용 조성물.
  10. 삭제
  11. 제 8항에 있어서, 상기 약물은 세포막 염료, 광과민제, 항암제, 항생제인 것을 특징으로 하는 기능성 물질 전달용 조성물.
  12. 제1성분으로써, 합성수용체-인지질의 접합체를 포함하며 세포막에 융합하여 상기 접합체를 포함하는 세포막성 소포를 분비시키는 리포좀, 또는 상기 리포좀을 세포에 처리하여 생성된 상기 합성수용체-인지질의 접합체를 포함하는 세포막성 소포; 및
    제2성분으로써, 항암제가 결합된 리간드;
    를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로,
    상기 합성수용체는 바이오틴(biotin), 아자이드(azide), 니트릴로트리아세틱 산(Nitrilotriacetic acid, NTA) 및 사이클로덱스트린(Cyclodextrin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이고; 및
    상기 리간드는 스트렙타비딘(streptavidin), 사이클로옥틴(Cyclooctyne), 폴리 히스티딘(poly histidine) 및 콜레스테롤(cholesterol)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 항암제는 젬시타빈(gemcitabine), 부술판(Busulfan), 클로람부실(Chlorambucil), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 멜파란(Melphalan), 시스플라틴(Cisplatin), 이포스파미드(Ifosfamide), 시타라빈(Cytarabine), 5-플루오로우라실(5-FU), 메토트렉세이트(Methotrexate; MTX), 다우노루비신(Daunorubicin), 아드리아마이신(Adriamycin), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine),
    빈데신(Vindesine), 프로카바진(Procarbazine), 타목시펜(Tamoxifen), 메게스테롤 아세테이트(Megesterolacetate), 플루타미드(Flutamide) 및 고세렐린 아세테이트(Gosereline acetate, Zoladex)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 암은 폐암, 고환암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 췌장암, 피부암, 위암 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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