JP2018522825A - リポソームナノ構造並びにそれを製造及び使用する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照により全内容が本明細書に組み入れられる、2015年5月26日出願の米国仮特許出願第62/166,353号明細書の利益を請求する。
1)ER+乳癌、ER−乳癌、her2−乳癌、her2+乳癌、間質腫瘍、例えば、線維腺腫、葉状腫瘍、及び肉腫、並びに上皮腫瘍、例えば、大管乳頭腫を含む乳癌;in situ腺管癌(パジェット病を含む)及びin situ小葉癌を含むin situ(非侵襲性)腺癌、並びに限定されるものではないが、侵襲性腺管癌、侵襲性小葉癌、髄様癌、膠様(粘液性)癌、管状癌、及び侵襲性乳頭癌を含む侵襲性(浸潤性)癌腫を含む乳房の癌腫;並びにその他の悪性新生物。乳癌の更なる例としては、管腔A、管腔B、基底A、基底B、及び三重陰性乳癌を挙げることができ、この三重陰性乳癌は、エストロゲン受容体陰性(ER−)、プロゲステロン受容体陰性、及びher2陰性(her2−)である。一部の実施形態では、乳癌は、高リスクのOncotypeスコアを有し得る。
2)例えば、肉腫、例えば、血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、及び脂肪肉腫;粘液腫;横紋筋腫;線維腫;脂肪腫、及び奇形腫を含む噴門癌。
3)例えば、気管支原性癌、例えば、扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、及び腺癌;肺胞及び気管支肺癌;気管支腺腫;肉腫;リンパ腫;軟骨腫性過誤腫;及び中皮腫を含む肺癌。
4)例えば、食道の癌、例えば、扁平上皮細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、及びリンパ腫;胃の癌、例えば、癌腫、リンパ腫、及び平滑筋肉腫;膵臓の癌、例えば、腺管癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、及び血管腫;小腸の癌、例えば、腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、及び線維腫;大腸の癌、例えば、腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、及び平滑筋腫を含む消化管癌。
5)例えば、腎臓の癌、例えば、腺癌、ウィルムス腫瘍(腎芽細胞腫)、リンパ腫、及び白血病;膀胱及び尿道の癌、例えば、扁平上皮細胞癌、移行上皮癌、及び腺癌;前立腺の癌、例えば、腺癌及び肉腫;精巣の癌、例えば、セミノーマ、奇形腫、胚性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、及び脂肪腫を含む尿生殖路癌。
6)例えば、肝細胞腫、例えば、肝細胞癌;胆管癌;肝芽腫;血管肉腫;肝細胞腺腫;及び血管腫を含む肝癌。
7)例えば、骨原性肉腫(骨肉腫)、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫(細網肉腫)、多発性骨髄腫、悪性巨大細胞腫瘍脊索腫、骨軟骨腫(骨軟骨外腫)、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨線維腫、類骨骨種、及び巨細胞腫を含む骨肉腫。
8)例えば、頭蓋骨の癌、例えば、骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、及び変形性骨炎;髄膜の癌、例えば、髄膜腫、髄膜肉腫、及び神経膠腫症;脳の癌、例えば、星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、上衣腫、胚芽腫(松果体腫)、多形神経膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽腫、及び先天性腫瘍;及び脊髄の癌、例えば、神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、及び肉腫を含む神経系の癌。
9)例えば、子宮の癌、例えば、子宮内膜の癌;子宮頸部の癌、例えば、子宮頸癌及び前腫瘍性子宮頸部異形成;卵巣の癌、例えば、漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類癌腫、顆粒膜莢壁細胞腫瘍、セルトリライディッヒ細胞腫瘍、未分化胚細胞腫、及び悪性奇形腫を含む卵巣癌;外陰部の癌、例えば、扁平上皮細胞癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、及び黒色腫;膣の癌、例えば、明細胞癌、扁平上皮細胞癌、ブドウ状肉腫、及び胎児性横紋筋肉腫;及び卵管の癌、例えば、癌腫を含む婦人科癌。
10)例えば、血液の癌、例えば、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、及び骨髄異形成症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫(悪性リンパ腫)、及びヴァルデンスレームマクログロブリン血症を含む血液癌。
11)例えば、悪性黒色腫及び転移性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、カポジ肉腫、異型性母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、及び強皮症を含む皮膚癌及び皮膚疾患。
12)例えば、神経芽細胞腫を含む副腎癌。
BPD光増感剤のリン脂質16:0 Lyso PC及び20:0 Lyso PCへの結合
ベンゾポルフィリン誘導体光増感剤のカルボン酸塩を、変更された合成プロトコルに従って、エステル化によってリン脂質1−パルミトイル−2−ヒドロキシ−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(16:0 Lyso PC)又はリン脂質1−アラキドイル−2−ヒドロキシ−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(20:0のLyso PC)のヒドロキシル部分に結合した。J.Lovell、C.Jin、E.Huynh、H.Jin、C.Kim、J.Rubinstein、W.Chan、W.Cao、L.Wang、及びG.Zhengを参照されたい。マルチモジュール式バイオフォトニック造影剤として使用されるポルフィリン二重層によって形成されるポルフィソームナノ小胞である、2011 Nature Materials,10,324−332。16:0 Lyso PC(クロロホルム中、99.13μl、25mg/mlストック)又は20:0 Lyso PC(クロロホルム中、110.35μl、25mg/mlストック)を13×100mmのPyrex(登録商標)管に入れ、16ゲージの針からの窒素ガス流を用いてクロロホルムを蒸発させた。光増感剤ベンゾポルフィリン誘導体一酸環A(BPD、ベルテポルフィン、17.97mg、718.79g/モル)を乾燥16:0 Lyso PC又は20:0 Lyso PCに添加した。次いで、1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC、38.81mg、155.24g/モル;Sigma−Aldrich)、4−(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP、15.27mg、122.17g/モル;Sigma−Aldrich)Sigma−Aldrich)、及びN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA、52.25μl、129.24g/モル、0.742g/ml;Sigma−Aldrich)を、16:0 Lyso PC又は20:0 Lyso PCとBPD混合物との乾燥混合物に添加した。16:0 Lyso PC/20:0 Lyso PC:BPD:EDC:DMAP:DIPEAのモル比は、1:5:50:25:300とした。この混合物をジクロロメタン(DCM、5ml)に溶解し、磁気撹拌プレートを用いて暗所で24時間、室温、2500rpmで激しく撹拌した。16:0 Lyso PC−BPDと20:0 Lyso PC−BPDの脂質コンジュゲートを、Analtech Preparative Thin Layer Chromatography Silica Uniplatesを用いて精製し、DCM中、10%メタノールで溶出した。ほとんどのシリカ画分(Rf約0.144)を含む極性16:0 Lyso PC−BPD又は20:0 Lyso PC−BPDをTLCプレートから取り出して、50mlのポリプロピレン管に入れた。16:0 Lyso PC−BPD又は20:0 Lyso PC−BPDをDCM(30ml)中、33%メタノールでの10分間の超音波処理によってシリカ画分から抽出した。シリカを10分間の3,700×gでの遠心分離によって沈殿させ、抽出された16:0 Lyso PC−BPD又は20:0 Lyso PC−BPDを含む上清を250mlの丸底フラスコに収集した。シリカ画分をDCM中、33%メタノールで更に2回洗浄し、全ての16:0 Lyso PC−BPD又は20:0 Lyso PC−BPD溶液を別々に250mlの丸底フラスコで混合した。この溶媒混合物を、液体窒素トラップ凝縮装置に接続された40℃での低圧下における回転蒸発により、抽出された16:0 Lyso PC−BPD又は20:0 Lyso PC−BPDから除去した。メタノール−DCM溶媒混合物に既に溶解された残存シリカを、乾燥16:0 Lyso PC−BPD又は20:0 Lyso PC−BPD抽出物を100%DCMに再溶解することによって除去した。不溶性シリカ沈殿物を、ポリプロピレンシリンジの末端に固定されたFisherbrand(商標)ポリ(テトラフルオロエチレン)(PTFE)フィルター(0.22μmの細孔径、13mmの直径)を用いた濾過によって除去した。DCMを、回転蒸発を用いて、濾過された16:0 Lyso PC−BPD又は20:0 Lyso PC−BPD溶液から除去した。次いで、精製されたコンジュゲートをクロロホルム(5ml)に再溶解して、−20℃の暗所で保存した。16:0 Lyso PC−BPD又は20:0 Lyso PC−BPDの濃度を、リン脂質コンジュゲートをDMSOで希釈し、34,895M−1.cm−1の吸光係数ε687nmを用いて紫外−可視吸収スペクトルを測定することによって決定した。
全てのリポソーム調合物を、水和脂質膜プロセスを用いて調製した。脂質膜を、全ての脂質及びドーパントのクロロホルム溶液から13×100mmのPyrex(登録商標)管で最初に調製した。脂質混合物を1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DPPC、734.04g/モル)、1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン(塩化物塩)(DOTAP、カチオン性、698.54g/モル又は1,2−ジ−(9Z−オクタデセノイル)−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール)(ナトリウム塩)(DOPG、アニオン性、797.026g/モル)、コレステロール(386.65/モル)、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−2000](アンモニウム塩)(DSPE−mPEG2000、2805.50g/モル)、及び1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[ジベンゾシクロオクチル(ポリエチレングリコール)−2000](アンモニウム塩)(DSPE−PEG2000−ADIBO、3077.80g/モル)から調製した。前述の試薬の全てをAvanti(登録商標)Polar Lipids,Inc.から購入し、合計34.043μモルの脂質に調製した。特段の記載がない限り、DPPC、DOTAP(カチオン性)/DOPG(アニオン性)、コレステロール、DSPE−mPEG2000、及びDSPE−PEG2000−ADIBOは、それぞれ58.2:7.9:28.9:4.5:0.5のモルパーセント比で混合した。PEG化DSPEを常に合計5%に維持し、アジド誘導体化抗体への銅フリーのクリックコンジュゲーションを媒介するために0.5%をDSPE−PEG2000−ADIBOの代わりとした。1つの実験では、PEG化DSPEのモルパーセントは、5%、4%、3%、2%、1%、及び0.5%に変更したが、DSPE−PEG2000−ADIBO:DSPE−mPEG2000の比率は1:10に維持した。光増感剤−リン脂質コンジュゲート、16:0 Lyso PC−BPD又は20:0 Lyso PC−BPDは、DPPC 200nモル(0.6モル%)の一部を置換した。フリーのBPD疎水性取り込みを必要とするリポソームの調合では、非コンジュゲートBPDのクロロホルム溶液をクロロホルム中の脂質混合物に添加した。全ての脂質を短時間ボルテックスし、クロロホルムを、連続的に回転させながら、16ゲージの針からの窒素ガス流を用いて蒸発させて薄い脂質膜を形成した。残留クロロホルムを、脂質膜を真空下で24時間保存することによって除去した。乾燥した脂質膜を、凍結融解ボルテックス法を用いて1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で水和した。1×DPBS(1ml)を脂質膜に添加し、Pyrex(登録商標)管を密閉してParafilm(登録商標)で包んだ。水性光増感剤、例えば、クロリンe6モノエチレンジアミンモノアミド(CMA)を用いた実験では、脂質膜ボイド16:0Lyso PC−BPDを、CMAスタッキングを防止する賦形剤として400μM CMA及び1%PEG300を含む1mlのPBSで水和した。次いで、この管を42℃の暗い水槽で10分間インキュベートし、最大速度で30秒間ボルテックスし、次いで氷浴で10分間インキュベートした。このサイクルを更に4回繰り返して、多重膜小胞を形成した。単分散単層リポソームを調製するために、多重膜小胞懸濁液(1ml)を、Avanti(登録商標)Mini−Extruderキットを用いて2つのポリカーボネート膜(0.1μmの細孔径、19mmの直径)に通して42℃で5回押し出した。リポソームを、暗い容器内において4℃で保存した。リポソーム調合物内の16:0 Lyso PC−BPDの濃度を、リポソームをDMSOで希釈して均質化し、34,895M−1.cm−1の吸光係数ε687nmを用いて紫外−可視吸収スペクトルを測定することによって決定した。
最適なDSPE−PEG2000−ADIBO濃縮物及び200nモルの16:0 Lyso PC−BPDを含むリポソーム、又は最適なDSPE−PEG2000−ADIBO濃縮物を含むが光増感剤を含まない対照としてのリポソームを上記のように調製したが、100mM カルセイン二ナトリウム塩を含む1mlのPBSで水和した。リポソームを上記のように2つのポリカーボネート膜(0.1μmの細孔径、19mmの直径)によって42℃で5回押し出した。封入されなかったカルセイン二ナトリウム塩を、1×PBSに対する、Float−A−Lyzer(登録商標)透析管(300kDaの分子量のカットオフ)内の1mlのリポソームアリコートの4℃で48時間の透析によって除去した。次いで、リポソームを、Sephadex G−25が事前に充填されたillustra NAP Columnsに通して、残存する過剰なリポソームカルセイン二ナトリウム塩を除去した。カルセイン二ナトリウム塩の濃度を、70,000M−1.cm−1のε492nmを用いて測定し、1×PBSで、又は反応性分子種の失活剤として10mM アジ化ナトリウムを含む1×PBSで2μMに希釈した。リポソームを、150mW/cm2の照射量で690nmのダイオードレーザーを用いて照射し、フルエンスを100J/cm2まで徐々に上昇させた。リポソームペイロードの代理のカルセインの放出を蛍光脱消光(fluorescence dequenching)の程度の関数として測定し、これを、450nmの励起フィルター、475nmのカットオフ、500nm〜70nmからの発光プロフィールを用いてプレートリーダーによって測定した。
プロテインZのセツキシマブへの部位特異的コンジュゲーションを、既に公開されているプロトコルに従って行った。J.Hui、S.Tamsen、Y.Song、及びA.Tsourkas、LASIC:Light Activated Site−Specific Conjugation of Native IgGs,2015 Bioconjugate Chemistry,26,1456−1460を参照されたい。遺伝子操作プロテインZ分子は、365nmの紫外光架橋によって共有結合型の架橋を媒介するために非天然アミノ酸ベンゾイルフェニルアラニン(BPA)及びIgG結合部位を含んでいた。プロテインZ構築物は、クリック化学のために5−カルボキシフルオレセイン分子(5−FAM)及びアジド部分を有する末端カスタムペプチド(terminal custom peptide)も含んでいた。セツキシマブの濃度を、紫外−可視分光光度法及び217,315M−1.cm−1の吸光係数ε280nm(Expasy Protoparam Toolsを用いて得られた情報)を用いて決定した。部位特異的にコンジュゲートしたプロテインZ分子に一致する5−FAMの濃度を、紫外−可視分光光度法及び82,000M−1.cm−1の吸光係数ε492nmを用いて決定した。精製されたアジドセツキシマブ−プロテインZは、リポソームへのクリックコンジュゲーションが必要となるまで4℃の暗所で保存した。
アジド部分を、N−ヒドロキシスクシンイミジルアジドポリ(エチレングリコール)4(NHS−PEG4−アジド、388.37g/モル)の抗体のリジン残基への確率的コンジュゲーションによってセツキシマブに確率的に導入した。同時に、セツキシマブをAlexa Fluor(登録商標)488(AF488−NHS、643.4g/モル)のN−ヒドロキシスクシンイミジルエステルに確率的にコンジュゲートさせた。無水ジメチルスルホキシド(DMSO)中、NHS−PEG4−アジド(10mg/ml)のストック溶液及びAF488−NHS(1mg/ml)のストック溶液の両方を、抗体溶液の添加前に各分子の2.5倍モル過剰に一致する量でセツキシマブと混合した。次いで、セツキシマブ(1×DPBS中、2mg/ml、145781.6g/モル(FASTA配列分析)、Erbitux(登録商標);Bristol−Myers Squibb)を、NHS−PEG4−アジドとAF488−NHSとの混合物に添加し、4℃の暗所で24時間、軌道回転によって混合した。未反応NHS−PEG4−アジド及びAF488−NHSを、Sephadex G−25が事前に充填されたillustra NAP Columnsによってコンジュゲートしたセツキシマブから除去して、1×DPBSで平衡にした。AF488及びPEG4−アジドにコンジュゲートした精製セツキシマブ(AF488−Cet−PEG4−アジド)を収集し、4℃で20分間の2,500×gでの、30kDa限外濾過管内での遠心分離によって濃縮した。セツキシマブの濃度を、紫外−可視分光光度法及び217,315M−1.cm−1の吸光係数ε280nm(Expasy Protoparam Toolsを用いて得られた情報)を用いて決定した。AF488−Cet−PEG4−アジド構築物にコンジュゲートしたAlexa Fluor(登録商標)488の濃度を、紫外−可視分光光度法及び71,000M−1.cm−1の吸光係数ε494nmを用いて決定した。精製されたAF488−Cet−PEG4−アジドは、リポソームへのクリックコンジュゲーションが必要となるまで4℃の暗所で保存した。同じアプローチを抗HER−2抗体、トラスツズマブ、及びトランスフェリン、トランスフェリン受容体の天然リガンドでも行った。全ての確率的アジドリガンドは、リポソームへのクリックコンジュゲーションが必要となるまで4℃の暗所で保存した。
全てのリポソームを、リポソーム表面のADIBOと標的部分の機能的なアジドとの銅フリーのクリックコンジュゲーションにより、部位特異的にセツキシマブに、又は確率的にセツキシマブ、トラスツズマブにコンジュゲートさせた。リポソームと標的部分との間のクリックコンジュゲーションを室温で一晩行った。過剰な標的部分を、サイズ排除セファロースCL−4Bゲル濾過クロマトグラフィーによってクリックコンジュゲートしたリポソームから除去し、十分な物理的及び分光学的同定後に4℃の暗所に保存した。
それぞれの修飾後の全てのリポソームのz平均直径、多分散性指数、及びζ電位を、Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.)を用いて測定した。z平均直径及び多分散性指数の同時測定では、2μlのリポソームを4mlのポリスチレンの4つの光学キュベットに入れ、1mlの1×DPBSをリポソームに添加した。120秒の時間の温度平衡を、各試料で行われる3つの個々の測定前に行った。ζ電位測定を、Folded Zeta Capillary Cellを用いて行った。10μlのリポソームを1mlの3mM NaClで希釈して細胞に添加し、それぞれの試料に対して3つの個々の測定を行った。
全てのフローサイトメトリー分析は、同じ手順後にBD FACSAriaを用いて行った。簡単に述べると、75%コンフルエントの単層細胞培養物を1×PBS(5ml)で1回洗浄し、5mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)及び5mM エチレングリコール四酢酸(EGTA)を含む1×PBSで1回洗浄し、新鮮なEDTA及びEGTAを含む1×PBS(5ml)中、37℃で15分間、頻繁に撹拌しながらインキュベートした。次いで、トリプシンフリーの細胞懸濁液を1000rpmで5分間遠心分離し、EDTA及びEGTAを含む1×PBSを吸引し、細胞をそれぞれの培養培地で再分散させて、コールターカウンターを用いてカウントした。50,000の細胞をそれぞれの条件の個々の1.5mlの遠心管に入れ、1000×gで5分間遠心分離して細胞をペレットにした。培地を吸引して、細胞ペレットを、それぞれの濃度で試験されるべきリポソーム調合物を含む100μlのそれぞれの培養培地で再分散させた。37℃で30分間、90分間、又は180分間のインキュベーション後、細胞を1000×gで5分間遠心分離して細胞をペレットにし、培地を吸引し、細胞ペレットを200μlの氷冷PBSで再分散させた。細胞は、BD FACSAriaサイトメトリー分析が行われるまで氷上に維持した。細胞からのBPD蛍光発光を、405nmのレーザーからの励起を用いて検出し、細胞からの5−カルボキシフルオレセイン(5−FAM)及びAlexaFluor(登録商標)488の発光を、488nmのレーザーからの励起を用いて達成し、細胞からのリサミンローダミンBの発光を、488nmのレーザーからの励起を用いて達成した。リポソームの細胞とのインキュベーション中、1mg/mlの最終濃度の遊離セツキシマブを用いて競合阻害アッセイを行った。
200nモルの16:0 Lyso PC−BPD又は0.1% DPPE−リサミンローダミンBを含むADIBO修飾リポソームを既に述べたように調製した。両方のリポソームをセツキシマブ−プロテインZに部位特異的にクリックコンジュゲートさせ、セファロースCL−4Bゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製し、3000×gにおいて、室温で30分間遠心分離した30kDの分子量カットオフの4mlのセルロース限外濾過管を用いる限外濾過遠心分離を用いて濃縮した。10μlの濃縮リポソームを銅メッシュ炭素被覆格子に1分間載せ、続いてリンタングステン酸で10秒間染色した。試料を一晩乾燥させ、次いで、Philips CM10透過電子顕微鏡(TEM)を用いて80kVの加速電圧及び46,000倍の拡大で画像化した。
OVCAR−5(高EGFR)細胞を2000細胞/ウェルの密度において血清含有RPMI培地で48時間、ガラス底の96ウェルプレートに播種した。培地を、100nM 16:0 Lyso PC−BPD当量の確率的にコンジュゲートした又はコンジュゲートしていないリポソームを含む新鮮な血清含有RPMI培地と交換した。細胞を、A Leica TCS NT共焦点顕微鏡を用いたインキュベーションの1時間後、6時間後、及び24時間後に共焦点蛍光顕微鏡法を用いて画像化した。
目的の細胞を100,000細胞/ウェルの密度において96ウェルプレートで24時間、それぞれの血清含有培地に播種した。培地を、異なる電荷の所望のリポソームを含む新鮮な培地と交換し、37℃でインキュベートした。必要な時点で、リポソームを含む培地を吸引し、細胞を100μlの1×PBSで3回洗浄し、次いでSolvable(登録商標)組織消化溶液で溶解した。25μlのアリコートにし、これを使用して、比色分析BCA(登録商標)アッセイを用いて各ウェル内の細胞タンパク質濃度を定量した。残りの細胞消化物を使用して、蛍光を用いて取り込まれたLyso PC−BPD濃度を定量し、これを、得られたタンパク質濃度に対して最終的に正規化した。
200nモルの16:0 Lyso PC−BPD及び最適な量のDSPE−PEG2000−ADIBOを含むアニオン性リポソームを上記のように合成し、114の部位特異的セツキシマブ−プロテインZ分子/リポソーム又は11の確率的セツキシマブ分子/リポソームにクリックコンジュゲートさせた。非コンジュゲート抗体を、セファロースCL−4Bゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製し、16:0 Lyso PC−BPDの濃度を、Thermo Fisher紫外−可視分光光度計を用いて決定した。全てのリポソームを使用前に4℃の暗所で保存した。
光増感16:0 Lyso PC−BPDコンジュゲートの非存在下において、4.3% DSPE−mPEG2000、0.5% DSPE−PEG2000−ADIBO、及び0.2% DSPE−PEG2000−NH2を含むアニオン性脂質膜を上記のように調製した。この脂質膜を1×PBSで水和し、上記のように2つの100nmのポリカーボネート膜から押し出した。近赤外線色素をアミノ末端DSPE−PEG2000−NH2に直接コンジュゲートさせるために、色素AlexaFluor(登録商標)633、AlexaFluor(登録商標)647、AlexaFluor(登録商標)680、AlexaFluor(登録商標)700、IRDye(登録商標)680RD、及びIRDye(登録商標)800CWのN−ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)エステルのDMSO溶液(10mg/ml)を、表面に到達可能なアミノリン脂質に対して5倍モル過剰でリポソームと反応させた。簡単に述べると、1mlのリポソーム調合物中、0.034μモルの表面に到達可能なDSPE−PEG2000−NH2部分を5倍モル過剰(0.171μモル)の色素NHSエステルと反応させた。リポソーム色素混合物を室温で24時間、マグネチックスターラーを用いて2500rpmで撹拌し、次いで4℃で48時間、1×PBSで透析した。最終的に、リポソームを、表面DSPE−PEG2000−ADIBO部分により、室温で24時間、1リポソーム当たり50の確率的アジドセツキシマブ分子又は1リポソーム当たり50のアジドIgG分子にクリックコンジュゲートさせた。非コンジュゲート抗体を、セファロースCL−4Bゲル濾過クロマトグラフィーを用いて精製し、リポソームにコンジュゲートした近赤外線色素の濃度を、Thermo Fisher紫外−可視分光光度計を用いて決定した。全てのリポソームを4℃の暗所で保存した。
IRDye(登録商標)680RD又はIRDye(登録商標)800CWでモジュール標識されたADIBO修飾リポソームを、それぞれ1リポソーム当たり50のセツキシマブ分子又は1リポソーム当たり50のIgG分子に確率的にクリックコンジュゲートさせた。セファロースCL−4Bゲル濾過クロマトグラフィーを用いた精製後、IRDye(登録商標)680RD又はIRDye(登録商標)800CWの濃度を、Thermo Fisher紫外−可視分光光度計を用いて決定した。雌スイスヌードマウス(6週齢)に、増殖因子低減マトリゲル(growth factor reduced Matrrigel)中、1×106のU251ヒト膠芽細胞(高EGFR)を下部左脇腹に皮下移植し、2週間成長させた。マウスに、1リポソームコンジュゲート当たり0.1nモルの色素当量の量でセツキシマブ標的IRDye(登録商標)680RDリポソームとIgG非標的IRDye(登録商標)800CWリポソームとの混合物を同時注射した。相対腫瘍蛍光強度を、Pearl(登録商標)Impulse Small Animal Imaging Systemを用いて、標的IRDye(登録商標)680RDリポソーム及びIgG非標的IRDye(登録商標)800CW対照リポソームの両方について動的且つ縦方向に監視した。腫瘍を二重トレーサーナノプラットフォームの同時投与から最大120時間画像化した。
6週齢の雌スイスヌードマウスに、増殖因子低減マトリゲル中、1×106のA431ヒト表皮癌細胞(高EGFR)を下部右脇腹に皮下移植し、細胞を2週間成長させた。次いで、マウスに、(1)1リポソーム当たり10の確率的セツキシマブ分子にクリックコンジュゲートされた、又は(2)コンジュゲートされていない0.25mg/kg BPD当量の16:0 Lyso PC−BPDリポソームを注射した。静脈投与の24時間後に動物を屠殺し、器官を、IVIS(登録商標)Lumina III in vivo前臨床イメージングステーションを用いて画像化した。16:0 Lyso PC−BPDリポソームの蛍光強度を、Living Image(登録商標)Softwareを用いて分析及び定量し、腫瘍の強度を器官のそれぞれの強度に対して正規化して組織選択性を定量した。
16:0 Lyso PC脂質固定ベンゾポルフィリン誘導体光増感剤(16:0 Lyso PC−BPD)
光増感剤がリポソームに安定して固定されていない場合、光増感剤又はフルオロフォアがナノリポソーム担体の膜から滲出し、選択性が低下することが観察された。疎水性フルオロフォア又は光増感剤の膜への安定した固定は、このフルオロフォア又は光増感剤のリゾリン脂質へのコンジュゲートによって達成することができる。
銅フリーのクリック化学は、リポソームの表面が強い疎水性の歪んだシクロオクチン部分、例えば、ジベンゾシクロオクチン(DIBO)で誘導体化された場合に可能である。
図2は、5%、4%、3%、2%、1%、及び0.5%のリン脂質1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[メトキシ(ポリエチレングリコール)−2000](DSPE−mPEG2000)の取り込みによって立体的に安定化された、16:0 Lyso PC−BPDを含むリポソームのZ平均直径及び多分散性指数を示す。歪んだシクロオクチン(ADIBO)−コンジュゲート脂質1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[ジベンゾシクロオクチル(ポリエチレングリコール)−2000](DSPE−PEG2000−ADIBO)によるクリック化学機能化では、1:10のモル比のDSPE−PEG2000−ADIBO:DSPE−mPEG2000が導入されて維持されたときに、リポソームは安定性を維持した。DSPE−mPEG2000を用いた疎水性のDSPE−PEG2000−ADIBOの9倍モルの反安定化(counter−stabilization)が全リポソーム安定性を促進すると考えられる。ADIBOのN−ヒドロキシスクシンイミジル(NHS)エステルをリン脂質1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−[アミノ(ポリエチレングリコール)−2000](DSPE−PEG−NH2)に結合した。DSPE−PEG−NH2をリポソーム内に組み込んで、これを9倍モル量のDSPE−mPEG2000で反安定化させた。標的リガンドの安定したADIBO機能化リポソームへの銅フリーのクリックコンジュゲーションも行った。図26は、図示されているPEG鎖を有する16:0 Lyso PC−BPD光増感剤を含むリポソームの構造概略図を示す。調合物の一例は、57.6%のDPPC、7.9%のDOPG、28.9%のコレステロール、4.5%のDSPE−mPEG2000、0.5%のDSPE−mPEG2000−ADIBO、及び0.6%の16:0 Lyso PC−BPDを含む。
アニオン電荷及びカチオン電荷を、7.9% 1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン(DOTAP、カチオン性)又は1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール)(DOPG、アニオン性)の取り込みによってベンゾポルフィリン誘導体光増感剤を含むリポソームに導入した。図3A〜図3Cは、それぞれDOTAPを含む、DOPGを含む、又は追加の電荷を含まないADIBO修飾、16:0 Lyso PC−BPD含有リポソームについてのζ電位、Z平均直径、及び多分散性指数(PDI)を示す。アニオン電荷又はカチオン電荷は、ADIBO修飾、16:0 Lyso PC−BPD含有リポソームの静電安定性を更に提供することが分かった。図3Cに示されている荷電リポソームの中性リポソームに対する相対多分散性指数は、荷電脂質を導入しなくてもリポソームが凝集して沈殿することを示唆している。図4は、OVCAR−5細胞、A431細胞、及びT47D細胞での非標的DOTAP含有及びDOPG含有リポソームの細胞最新情報の定量化(pモル16:0 Lyso PC−BPD/μg細胞タンパク質)を示す。ADIBO修飾、16:0 Lyso PC−BPD含有リポソームの非特異的取り込みが、アニオン荷電脂質DOPGがリポソーム内に取り込まれたときに細胞株間でより均一であることが分かった。均一な非特異的な取り込みプロフィールは、正確な細胞標的を促進する。
カルセインを、フルオロフォアの自己消光に十分な高い濃度(100mM)でリポソーム内に充填した。リポソーム調合物は、膜内に16:0 Lyso PC−BPDを含んでいたか、又は対照として光増感剤を含んでいなかった。リポソーム形成後、全てのリポソーム外のカルセインフルオロフォアを透析及びゲル濾過によって精製し、リポソームを96ウェルプレートに入れた。リポソームを690nmの光で照射して、放出時に脱消光するリポソーム内のカルセインを放出させた。放出後のカルセインの脱消光(及び蛍光の増加)を、プレートリーダーを用いて測定し、照射前に対照に対して正規化した。図5は、(1)Lyso PC−BPD(一番上のプロット)を含むリポソーム、(2)Lyso PC−BPD及びアジド(真中のプロット)を含むリポソーム、及び(3)Lyso PC−PBD(一番下のプロット)を含まないリポソームの690nmの光でのフルエンス(光線量)に対する倍率放出を示す。リポソーム封入治療薬の代用である、消光濃度のフルオロフォアカルセイン二ナトリウム塩が、膜内16:0 Lyso PC−BPD及び表面DSPE−PEG−ADIBOを含むリポソームの照射時に放出された。膜内16:0 Lyso PC−BPDの放出は見られず、放出は10mM アジ化ナトリウムの存在下で阻害された。これは、ADIBO修飾、16:0 Lyso PC−BPD含有リポソームが、リポソームペイロードの光酸化及び光誘発性放出に対して不安定であることを示すと考えられる。理論に拘束されるものではないが、アジ化ナトリウムの存在下での光誘発性放出の抑制率が、このプロセスが光化学であり、反応性分子種に依存することを示唆すると考えられる。
抗体のアジド修飾
歪んだシクロオクチンで事前に修飾されたリポソーム表面への標的部分の銅フリーのクリックコンジュゲーションでは、この標的部分にアジド基を付加する。光増感剤及び/又はイメージング剤を含む最適化リポソームプラットフォームへのIgGクリックコンジュゲーションの原理の証明として、セツキシマブ(抗EGFR抗体、Erbitux(登録商標))の部位特異的又は確率的アジド修飾を行った。アジド部分のセツキシマブへの部位特異的導入を、遺伝子操作プロテインZ分子を用いて行い、この遺伝子操作プロテインZ分子は、IgG分子のFc部分にのみ結合する(Hui,J.Z.、Al Zaki,A.、Cheng,Z.、Popik,V.、Zhang,H.、Prak,E.T.L、及びTsourkas,A.、Facile Method for the Site−Specific,Covalent Attachment of Full−Length IgG onto Nanoparticles(2014)Small 10(16):3354−63.doi:10.1002/smll.201303629)。図6Aは、銅フリーのクリック化学によってセツキシマブ−プロテインZに結合したリポソーム表面の概略図である。プロテインZは、任意のIgG分子(例えば、セツキシマブ)のFc領域に部位特異的に結合して、非天然ベンゾイルフェニルアラニンアミノ酸によって光架橋している。ペプチド結合プロテインZの末端アジドは、最適な表面モル比のDSPE−PEG2000−ADIBO、歪んだシクロオクチン誘導体化リン脂質にクリックコンジュゲートしている。図6Bは、銅フリーのクリック化学によってアジド−セツキシマブZに結合したリポソーム表面の概略図である。標的タンパク質(例えば、セツキシマブ)に確率的に付着したPEG4分子の末端アジドは、最適なモル比のDSPE−PEG2000−ADIBO、歪んだシクロオクチン誘導体化リン脂質にクリックコンジュゲートしている。
ADIBO修飾、16:0 Lyso PC−BPD含有アニオン性リポソームへのアジド修飾セツキシマブの部位特異的及び確率的銅フリーのクリックコンジュゲーションをコンジュゲート抗体の様々な表面密度で行った。サイズ及び分散度のデータを動的光散乱によって収集した。図9は、部位特異的(図9A)及び確率的(図9B)コンジュゲーションのリポソームサイズ(各図面の一番上のプロット)及び多分散性指数(各図面の下側のプロット)の比較を示す。図9A及び図9Bによると、部位特異的及び確率的コンジュゲーションの両方が安定したリポソームを生じさせた。図10は、80kVの加速電圧及び46,000倍の拡大で画像化された、セツキシマブ−プロテインZに部位特異的にクリックコンジュゲートしたリポソームの透過電子顕微鏡(TEM)画像を示す。図11は、部位特異的(左の一番上のプロット)及び確率的(左の下側のプロット)コンジュゲーションについてのζ電位とコンジュゲーション効率との比較を示す。図12は、部位特異的(一番上のプロット)及び確率的(下側のプロット)コンジュゲーションについての1リポソーム当たりのコンジュゲートしたセツキシマブの数とコンジュゲーション効率との比較を示す。少なくとも図12に示されているデータに基づくと、セツキシマブのリポソームへの部位特異的クリックコンジュゲーションは、リポソームへの確率的クリックコンジュゲーションよりも著しく効率的であると考えられる。理論に拘束されることを望むものではないが、確率的コンジュゲーションで観察される低い効率は、一部のアジド基のDIBO部分への低い到達可能性の結果であり、これは、抗体の任意の部分へのアジドのランダム導入の結果であり得ると考えられる。
調製された全ての密度での部位特異的又は確率的セツキシマブコンジュゲーションで形成された標的リポソームのEGFR選択性を、リポソーム細胞結合用のマーカーとしてのBPD蛍光を用いたフローサイトメトリーを用いて評価した。図13は、A431細胞(高EGFR;一番上のプロット)、T47D細胞(低EGFR;真中のプロット)、及びCHO−WT細胞(EGFRなし;下側のプロット)における結合選択性の比較を示す。図14は、A431細胞(高EGFR;一番上のプロット)、T47D細胞(低EGFR;真中のプロット)、及びCHO−WT細胞(EGFRなし;下側のプロット)におけるAlexaFluor(登録商標)488を含むリポソーム−セツキシマブコンジュゲートの結合選択性の比較を示す。図13及び図14のそれぞれでは、選択性は、A431細胞における1リポソーム当たりのセツキシマブの数の増加と共に上昇しているが、T47D細胞及びCHO−WT細胞ではほとんど変化を示していない。図14は、コンジュゲーションの確率的方法の選択性が部位特異的方法よりも細胞結合でより効率的であることを示す。
標的リポソームプラットフォームの選択的細胞内送達が光線力学療法の細胞内導入、及び生物剤/化学療法剤の細胞内光誘発性送達を可能にする。図19は、漸進的時間間隔でのOVCAR−5細胞における非標的及び確率的標的リポソームの共焦点蛍光顕微鏡画像を示し、標的リポソームの細胞内への内部移行を示唆している。この顕微鏡写真は、セツキシマブにクリックコンジュゲートした16:0 Lyso PC−BPD含有リポソームを、時間依存的にEGFRを過剰発現するOVCAR−5細胞内に選択的に細胞内送達できることを実証している。
親水性フルオロフォアの安定した固定は、(1)コレステロール、(2)リン脂質様1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPPE)のリン酸頭基、又は(3)PEG化リン脂質、例えば、DSPE−PEG2000−NH2の末端へのこれらのコンジュゲーションによって達成することができる。
銅フリーのクリック化学の成分としてのADIBOの高い化学選択性は、ADIBOとの交差反応性なしで、異なる反応性実体のリポソーム表面へのモジュール式コンジュゲーションを可能にした。0.2% DSPE−PEG2000−NH2を、ADIBO修飾リポソーム内に取り込み、近赤外線色素のアミン反応性NHS−エステルとコンジュゲートさせて、in vivoイメージングに使用できる安定したクリック反応性リポソームのパネルを形成した(図20)。ADIBO修飾リポソームを標識するために使用される色素としては、AlexaFluor(登録商標)633、AlexaFluor(登録商標)647、AlexaFluor(登録商標)680、AlexaFluor(登録商標)700、IRDye(登録商標)680RD、及びIRDye(登録商標)800CWが挙げられる。調製される調合物は、58.2%のDPPC、7.9%のDOPG/DOTAP、28.9%のコレステロール、4.3%のDSPE−mPEG2000、0.5%のDSPE−PEG2000−ADIBO(抗体へのクリックコンジュゲーションのための)、及び0.2%のDSPE−PEG2000−NH2(色素へのアミド結合のための)を含んでいた。全てのリポソームは、セツキシマブ又はsham IgG1対照に確率的にクリックコンジュゲートした後に安定性を維持した。図21Aは、様々な色素を含むリポソームのサイズ及び多分散性指数を示し、図21Bは、それぞれの紫外−可視スペクトルを示す。
脂質固定フルオロフォアリサミンローダミンB−DPPEを取り込んでいる調合物の一例が図39Aに示されている。ADIBOを取り込むために、5当量のジベンゾシクロオクチンNHSエステル(ADIBO−NHS 0.426mM)を、10% DMSOを含むpH8の100mM リン酸緩衝液中でアミンと反応させた。3つの試料(50%(v/v)GOA_111+5×ADIBO 1(一番上のプロット)、50%(v/v)GOA_111+5×ADIBO 2(真中のプロット)、及び50%(v/v)GOA_111+5×ADIBO 3(一番下のプロット))のサイズ及び多分散性指数が図39Bに示されている。
IRDye(登録商標)680RD及びIRDye(登録商標)800CWで標識されたADIBO修飾リポソームをそれぞれセツキシマブ又はヒトIgG1 sham抗体対照に確率的にクリックコンジュゲートさせることができる。図23は、時間に対するIRDye(登録商標)680RD(上側のプロット)及びIRDye(登録商標)800CW(下側のプロット)の平均補正蛍光を示し、shamヒトIgG1対照にクリックコンジュゲートした同時注射IRDye800CW標識リポソームと比較した、セツキシマブ(Erbitux)にクリックコンジュゲートしたIRDye680RD標識リポソームの皮下U251腫瘍に対する選択的結合性を実証している。
Claims (67)
- a)リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲート;
b)第1のリン脂質及び歪んだシクロオクチン部分を含む第1の誘導体化リン脂質;
c)第2のリン脂質及びポリエチレングリコールポリマーを含む第2の誘導体化リン脂質;及び
d)カチオン性脂質又はアニオン性脂質
を含むリポソーム。 - a)リゾリン脂質及び光増感剤を含むコンジュゲート;
b)第1のリン脂質及び標的部分を含む第1の誘導体化リン脂質;
c)第2のリン脂質及びポリエチレングリコールポリマーを含む第2の誘導体化リン脂質;及び
d)カチオン性脂質又はアニオン性脂質を含むリポソーム。 - 前記光増感剤が疎水性である、請求項1又は2に記載のリポソーム。
- 前記光増感剤がポルフィリン光増感剤である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記光増感剤がベンゾポルフィリン部分を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記光増感剤がベンゾポルフィリン誘導体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記リゾリン脂質が脂肪酸鎖に14〜22の炭素を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記リゾリン脂質が前記脂肪酸鎖に16〜20の炭素を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記リゾリン脂質が不飽和脂肪酸鎖を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記リゾリン脂質が、16:0リゾリン脂質、20:0リゾリン脂質、及びこれらの組み合わせから選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記コンジュゲートがリゾリン脂質を含み、及び光増感剤が前記リポソーム中に約0.01モルパーセント〜約1モルパーセントで存在する、請求項1〜10のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記コンジュゲートがリゾリン脂質を含み、及び光増感剤が前記リポソーム中に約0.05モルパーセント〜約0.5モルパーセントで存在する、請求項1〜11のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記コンジュゲートがリゾリン脂質を含み、及び光増感剤が前記リポソーム中に約0.08モルパーセント〜約0.12モルパーセントで存在する、請求項1〜12のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記コンジュゲートがリゾリン脂質を含み、及び光増感剤が前記リポソーム中に約0.1モルパーセントで存在する、請求項1〜13のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記第1のリン脂質が、水素化大豆ホスホチジルコリン(HSPC);1,2−ジデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DDPC);1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DEPA);1,2−ジエライドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DEPC);1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DEPE);1,2−ジエライドイル−ホスファチジルグリセロール(DEPG);1,2−ジリノレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DLOPC);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DLPA);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DLPC);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DLPE);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DLPG);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DLPS);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DMPA);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DMPE);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DMPG);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DMPS);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DOPA);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DOPC);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DOPG);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DOPS);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DPPA);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DPPC);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPPE);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DPPG);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DPPS);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DSPA);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DSPE);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DSPG);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DSPS);1−ミリストイル−2−パルミトイル−sn−グリセロ 3−ホスホコリン(MPPC);1−ミリストイル−2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(MSPC);1−パルミトイル−2−ミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(PMPC);1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(POPC);1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(POPE);1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(POPG);1−パルミトイル−2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(PSPC);1−ステアロイル−2−ミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(SMPC);及び1−ステアロイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(SOPC);1−ステアロイル−2−パルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(SPPC)、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜14のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記第1のリン脂質が1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DSPE)である、請求項15に記載のリポソーム。
- 前記第1の誘導体化リン脂質がリンカーを更に含む、請求項15又は16に記載のリポソーム。
- 前記リンカーがポリエチレングリコールである、請求項15〜17のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記ポリエチレングリコールが約350g/モル〜約30,000g/モルの分子量を有する、請求項18に記載のリポソーム。
- 前記ポリエチレングリコールが、350g/モル、550g/モル、750g/モル、1000g/モル、2000g/モル、3000g/モル、5000g/モル、10,000g/モル、20,000g/モル、及び30,000g/モルからなる群から選択される分子量を有する、請求項18又は19に記載のリポソーム。
- 前記ポリエチレングリコールが2000g/モルの分子量を有する、請求項18〜20のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記第1の誘導体化リン脂質がDSPE−PEG2000を含む、請求項18〜22のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記歪んだシクロオクチンが、アザ−ジベンゾシクロオクチン(ADIBO)、ジベンゾシクロオクチン(DIBO)、(OCT)、アリールレスオクチン(ALO)、モノフッ素化シクロオクチン(MOFO)、ジフッ素化シクロオクチン(DIFO)、ビアリールアザシクロオクチノン(BARAC)、又はジメトキシアザシクロオクチン(DIMAC)部分を含む、請求項1又は3〜22のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記リゾリン脂質へのコンジュゲーション前の前記歪んだシクロオクチンが、ジベンゾシクロオクチン−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(ADIBO−NHS)、ジベンゾシクロオクチン−C6−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−PEG(4、5、13又はn)−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−S−S−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−マレイミド、ジベンゾシクロオクチン−PEG(4、5、13又はn)−マレイミド、及び(1R,8S,9s)−ビシクロ[6.1.0]ノナ−4−イン−9−イルメチルN−スクシンイミジルカーボネートからなる群から選択される、請求項1又は3〜22のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記標的部分が、葉酸、RGDペプチド、天然タンパク質リガンド、アフィボディ、抗体、抗体断片、及びエンジニアリングされた抗体ベースのタンパク質からなる群から選択される、請求項2〜22のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記標的部分が抗体である、請求項2〜22のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記標的部分が、銅フリーのクリック化学を用いて前記第1の誘導体化リン脂質にコンジュゲートされている、請求項2〜22又は25のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記標的部分が、前記第1のリン脂質にコンジュゲートする前にアジド部分を含む、請求項2〜22、25又は26のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記第1の誘導体化リン脂質が、前記第1のリン脂質と、歪んだシクロオクチン及びアジドを含む前記標的部分の反応産物とを含む、請求項28に記載のリポソーム。
- 前記歪んだシクロオクチンが、アザ−ジベンゾシクロオクチン(ADIBO)、ジベンゾシクロオクチン(DIBO)、(OCT)、アリールレスオクチン(ALO)、モノフッ素化シクロオクチン(MOFO)、ジフッ素化シクロオクチン(DIFO)、ビアリールアザシクロオクチノン(BARAC)、又はジメトキシアザシクロオクチン(DIMAC)部分を含む、請求項29に記載のリポソーム。
- 前記リン脂質へのコンジュゲーション前の前記歪んだシクロオクチンが、ジベンゾシクロオクチン−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(ADIBO)、ジベンゾシクロオクチン−C6−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−PEG(4、5、13又はn)−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−S−S−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ジベンゾシクロオクチン−マレイミド、ジベンゾシクロオクチン−PEG(4、5、13又はn)−マレイミド、及び(1R,8S,9s)−ビシクロ[6.1.0]ノナ−4−イン−9−イルメチルN−スクシンイミジルカーボネートからなる群から選択される、請求項30に記載のリポソーム。
- 前記第2のリン脂質が、水素化大豆ホスホチジルコリン(HSPC);1,2−ジデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DDPC);1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DEPA);1,2−ジエライドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DEPC);1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DEPE);1,2−ジエライドイル−ホスファチジルグリセロール(DEPG);1,2−ジリノレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DLOPC);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DLPA);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DLPC);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DLPE);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DLPG);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DLPS);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DMPA);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DMPE);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DMPG);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DMPS);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DOPA);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DOPC);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DOPG);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DOPS);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DPPA);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DPPC);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPPE);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DPPG);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DPPS);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DSPA);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DSPE);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DSPG);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DSPS);1−ミリストイル−2−パルミトイル−sn−グリセロ 3−ホスホコリン(MPPC);1−ミリストイル−2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(MSPC);1−パルミトイル−2−ミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(PMPC);1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(POPC);1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(POPE);1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(POPG);1−パルミトイル−2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(PSPC);1−ステアロイル−2−ミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(SMPC);及び1−ステアロイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(SOPC);1−ステアロイル−2−パルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(SPPC);並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜31のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記第2のリン脂質が1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DSPE)である、請求項32に記載のリポソーム。
- 前記第2の誘導体化リン脂質中の前記ポリエチレングリコールポリマーが約350g/モル〜約30,000g/モルの分子量を有する、請求項1〜33のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記ポリエチレングリコールポリマーが、350g/モル、550g/モル、750g/モル、1000g/モル、2000g/モル、3000g/モル、5000g/モル、10,000g/モル、20,000g/モル、及び30,000g/モルからなる群から選択される分子量を有する、請求項1〜34のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記ポリエチレングリコールポリマーが約2000g/モルの分子量を有する、請求項1〜35のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記ポリエチレングリコールポリマーが、アルコキシル、カルボキシル、アミン、ビオチン、マレイミド、スクシニル、N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、シラン、ピリジルジチオール、又はシアノ部分で終端されている、請求項1〜36のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記第2の誘導体化リン脂質がDSPE−PEG2000、DSPE−mPEG2000、又はこれらの組み合わせである、請求項1〜37のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記第2の誘導体化リン脂質が前記リポソーム中に約0.5モルパーセント〜約5モルパーセントの量で存在する、請求項1〜38のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記コンジュゲートの前記第2の誘導体化リン脂質に対するモル比が約1:10である、請求項1〜39のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記第2の誘導体化リン脂質が前記リポソーム中の前記コンジュゲートの量よりも約8倍〜約10倍多い量で存在する、請求項1〜40のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記リポソームがアニオン性脂質を含む、請求項1〜41のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記アニオン性脂質がアニオン性リン脂質である、請求項1〜42のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記アニオン性リン脂質が、1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール)(DOPG);ホスファチジルグリセロール(PG);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール)(DMPG);ホスファチジルセリン(PS);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−L−セリン(DOPS);及びリン酸ジセチル(DCP)からなる群から選択される、請求項43に記載のリポソーム。
- 前記アニオン性脂質が前記リポソーム中に約5モルパーセント〜約10モルパーセントの量で存在する、請求項1〜44のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記アニオン性脂質が前記リポソーム中に約7モルパーセント〜約9モルパーセントの量で存在する、請求項1〜45のいずれか一項に記載のリポソーム。
- カチオン性脂質を含む、請求項1〜41のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記カチオン性脂質がカチオン性リン脂質である、請求項1〜41のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記カチオン性リン脂質が1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン(DOTAP)である、請求項48に記載のリポソーム。
- 前記カチオン性脂質が前記リポソーム中に約5モルパーセント〜約10モルパーセントの量で存在する、請求項1〜41のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記カチオン性脂質が前記リポソーム中に約7モルパーセント〜約9モルパーセントの量で存在する、請求項1〜41のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 1つ以上の化学療法化合物;1つ以上のポリマーナノ粒子;1つ以上のタンパク質ベースのナノ粒子;1つ以上のデンドリマー構造;1つ以上のキトサンナノ粒子;1つ以上のポリグリカン構造;1つ以上の無機ナノ粒子;1つ以上のイメージング剤;1つ以上のキナーゼ阻害剤;1つ以上の生物製剤;及びこれらの2つ以上の組み合わせからなる群から選択されるカーゴを更に含む、請求項1又は2に記載のリポソーム。
- 前記キナーゼ阻害剤が受容体チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項52に記載のリポソーム。
- 前記1つ以上の化学療法化合物の1つ以上が前記光増感剤との相乗作用を示す、請求項53に記載のリポソーム。
- 1つ以上のリン脂質、スフィンゴ脂質、生物活性脂質、天然脂質、コレステロール、ステロール、又はこれらの組み合わせを更に含む、請求項1又は2に記載のリポソーム。
- 前記1つ以上のリン脂質が、ホスファチジルコリン;ホスファチジン酸;ホスファチジルエタノールアミメ;ホスファチジルグリセロール;及びホスファチジルセリンからなる群から選択される、請求項55に記載のリポソーム。
- 前記1つ以上のリン脂質が、水素化大豆ホスホチジルコリン(HSPC);1,2−ジデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DDPC);1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DEPA);1,2−ジエライドイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DEPC);1,2−ジエルコイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DEPE);1,2−ジエライドイル−ホスファチジルグリセロール(DEPG);1,2−ジリノレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DLOPC);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DLPA);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DLPC);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DLPE);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DLPG);1,2−ジラウロイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DLPS);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DMPA);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DMPC);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DMPE);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DMPG);1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DMPS);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DOPA);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DOPC);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DOPG);1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DOPS);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DPPA);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DPPC);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DPPE);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DPPG);1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DPPS);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−リン酸(DSPA);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DSPE);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(DSPG);1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホセリン(DSPS);1−ミリストイル−2−パルミトイル−sn−グリセロ 3−ホスホコリン(MPPC);1−ミリストイル−2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(MSPC);1−パルミトイル−2−ミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(PMPC);1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(POPC);1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(POPE);1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルグリセロール(POPG);1−パルミトイル−2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(PSPC);1−ステアロイル−2−ミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(SMPC);及び1−ステアロイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(SOPC);1−ステアロイル−2−パルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(SPPC);並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項55又は56に記載のリポソーム。
- 前記1つ以上のリン脂質の少なくとも1つが1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DPPC)である、請求項55〜57のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記1つ以上のリン脂質が前記リポソーム中に約40モルパーセント〜約80モルパーセントで存在する、請求項55〜58のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記1つ以上のリン脂質が前記リポソーム中に約50モルパーセント〜約70モルパーセントで存在する、請求項55〜59のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記1つ以上のリン脂質が前記リポソーム中に約55モルパーセント〜約65モルパーセントで存在する、請求項55〜60のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記コレステロールが前記リポソーム中に約15モルパーセント〜約45モルパーセントで存在する、請求項55〜61のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 前記コレステロールが前記リポソーム中に約20モルパーセント〜約30モルパーセントで存在する、請求項55〜62のいずれか一項に記載のリポソーム。
- フルオロフォア、造影剤、又はこれらの組み合わせを更に含む、請求項1〜63のいずれか一項に記載のリポソーム。
- 請求項1〜63のいずれか一項に記載のリポソーム及び薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物。
- 患者の癌を処置する方法であって、
(a)治療有効量の、請求項2〜22又は25〜63のいずれか一項に記載のリポソームを前記患者に投与するステップ;及び
(b)前記患者に放射線を照射して前記リポソームを破壊するステップ
を含む方法。 - 患者の癌を画像化する方法であって、
(a)治療有効量の、請求項1〜63のいずれか一項に記載のリポソームを前記患者に投与するステップ;
(b)前記患者に放射線を照射して前記リポソームを破壊するステップ;及び
(c)前記患者を画像化するステップ
を含む方法。
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