KR20180010217A - 리포솜 나노작제물, 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

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기르기스 오바이드
타이야바 하산
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더 제너럴 하스피탈 코포레이션
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Abstract

본원에서는, a) 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체; b) 제1 인지질 및 스트레인된 시클로옥틴 모이어티를 포함하는 제1 유도체화된 인지질; c) 제2 인지질 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 포함하는 제2 유도체화된 인지질; 및 d) 양이온성 또는 음이온성 지질을 포함하는 리포솜이 제공된다. 또한 본원에서는, a) 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체; b) 제1 인지질 및 표적화 모이어티를 포함하는 제1 유도체화된 인지질; c) 제2 인지질 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 포함하는 제2 유도체화된 인지질; 및 d) 양이온성 또는 음이온성 지질을 포함하는 리포솜이 제공된다. 본원에서 제공되는 리포솜은, 예를 들어, 암의 치료 또는 암 종양의 영상화에 사용될 수 있다.

Description

리포솜 나노작제물, 및 그의 제조 및 사용 방법
우선권의 주장
본 출원은 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되는, 2015년 5월 26일자로 출원된 미국 가출원 제 62/166,353호의 이익을 주장한다.
기술분야
본 개시내용은 접합된 광감작제를 포함하는 리포솜에 관한 것이다.
나노규모의 약제 전달 시스템(예를 들어, 리포솜)은 분자 표적에 선택적으로 영양물질 및 약제를 방출할 수 있게 한다. 리포솜은 종종 인지질-함유 외부 층(예를 들어, 포스파티딜콜린 및/또는 난자 포스파티딜에탄올아민을 함유함) 및 수성 핵으로 구성된다. 리포솜의 유형들의 예는 다중 라멜라 소포(multilamellar vesicle)(여러 개의 라멜라 상 지질 이중 층을 포함함), 작은 단일 라멜라 소포(하나의 지질 이중 층을 포함함), 큰 단일 라멜라 소포 및 코클리에이트(cochleate) 소포를 포함한다(예를 들어, WO/ 09032716 참조). 소수성 영역 및 친수성 영역 둘 모두의 존재로 인해, 리포솜에는, 예를 들어 약제, DNA, 및/또는 다른 생물활성 분자를 포함하여, 소수성 및/또는 친수성 분자가 로딩될 수 있다. 리포솜의 표면은 특이적 표적과 결합하는 리간드가 부속됨으로써, 리포솜에 로딩된 분자가 표적으로 선택적으로 전달되게 할 수 있다. 리포솜은, 예를 들어 세포막의 이중 층과의 융합(예를 들어, 문헌[Advanced Drug Delivery Reviews 38(3):207-232, 1993] 참조) 또는 대식세포 식균작용을 포함한 다양한 수단에 의해 분자들을 방출한다.
a) 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체; b) 제1 인지질 및 스트레인된 시클로옥틴 모이어티(strained cyclooctyne moiety)를 포함하는 제1 유도체화된 인지질; c) 제2 인지질 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 포함하는 제2 유도체화된 인지질; 및 d) 양이온성 또는 음이온성 지질을 포함하는 리포솜이 본 명세서에서 제공된다. 또한 a) 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체; b) 제1 인지질 및 표적화 모이어티를 포함하는 제1 유도체화된 인지질; c) 제2 인지질 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 포함하는 제2 유도체화된 인지질; 및 d) 양이온성 또는 음이온성 지질을 포함하는 리포솜이 본 명세서에서 제공된다. 본 명세서에 제공되는 리포솜은, 예를 들어, 암의 치료 또는 암 종양의 영상화에 사용될 수 있다.
환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 본 명세서에 제공되는 리포솜의 치료적 유효량을 환자에 투여하는 단계; 및 리포솜을 파괴하기 위해 환자에 광을 조사하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에서 추가로 제공된다.
본 명세서에 제공되는 리포솜은 또한 환자에서 암을 영상화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 명세서에 제공되는 리포솜의 유효량을 환자에 투여하는 단계; 리포솜을 파괴하기 위해 환자에 광을 조사하는 단계; 및 환자를 영상화하는 단계를 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 상세사항이 첨부 도면 및 하기의 개시내용에서 제시된다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점이 개시내용 및 도면 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 (1) 지질 이중 층에 포매된 BPD를 갖는 리포솜, (2) 16:0 Lyso PC-BPD에 접합된 BPD를 갖는 리포솜, 및 (3) 20:0 Lyso PC-BPD에 접합된 BPD를 갖는 리포솜에 대한 OVCAR-5 세포에서 리포솜 제형에서의 중앙값 BPD 형광 강도 대 BPD의 농도를 도시한다.
도 2는 인지질 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-mPEG2000)의 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 및 0.5%의 혼입에 의해 입체적으로 안정화된 16:0 Lyso PC-BPD를 함유하는 리포솜에 대한 Z-평균 직경 및 다분산 지수를 도시한다.
도 3a 내지 도 3c는 각각, DOTAP, DOPG를 함유하거나, 전하가 첨가되지 않은 ADIBO-변형된 16:0 Lyso PC-BPD-함유 리포솜에 대한 ζ-전위, Z 평균 직경, 및 다분산 지수(PDI)를 도시한다.
도 4는 OVCAR-5 세포, A431 세포 및 T47D 세포에서 비표적화된 DOTAP- 및 DOPG-함유 리포솜에 대한 세포 흡수(pmol 16:0 Lyso PC-BPD/μg 세포 단백질)의 정량화를 도시한다.
도 5는 690 nm의 광을 이용한 (1) Lyso PC-BPD를 갖는 리포솜(최상단 플롯), (2) Lyso PC-BPD 및 아지드를 갖는 리포솜(중간 플롯), 및 (3) Lyso PC-PBD를 갖지 않는 리포솜(최하단 플롯)의 방출 배수 대 플루엔스(광 투사량)를 도시한다.
도 6a는 구리 무함유 클릭 화학을 통해 세툭시맙-단백질 Z(cetuximab-protein Z)에 결합된 리포솜 표면의 도식적 대표도이다. 단백질 Z는 임의의 IgG 분자(예를 들어, 세툭시맙)의 Fc 영역에 부위 특이적으로 결합하며, 비천연 벤조일페닐알라닌 아미노산을 통해 광교차-연결(photocross-linking)된다. 펩티드-결합 단백질 Z 상의 말단 아지드는 최적의 표면 몰비의 DSPE-PEG2000-ADIBO, 스트레인된-시클로옥틴 유도체화된 인지질에 클릭 접합된다. 도 6b는 구리 무함유 클릭 화학을 통해 아지도-세툭시맙 Z에 결합된 리포솜 표면의 도식적 대표도이다. 표적화 단백질(예를 들어, 세툭시맙)에 확률적으로 부착된 PEG4 분자 상의 말단 아지드는 최적의 몰비의 DSPE-PEG2000-ADIBO, 스트레인된-시클로옥틴 유도체화된 인지질과 클릭 접합된다.
도 7a 및 도 7b는 각각 부위 특이적 아지드 접합체의 자외선-가시광선 스펙트럼 및 구조적 도식을 도시한다. 세툭시맙으로의 아지드 모이어티의 확률적 도입은 PEG4-아지드의 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르를 사용하여 달성하였다. 단일 형광단(부위 특이적 세툭시맙의 경우, 5-FAM 및 확률적 세툭시맙의 경우 AlexaFluor® 488)을 각각의 항체 접합체 내로 도입시켰다. 단백질 Z 대 세툭시맙의 비는 1.13 ± 0.17이다.
도 8a 및 도 8b는 각각 AlexaFluor® 488을 혼입시키는 확률적 아지드 접합체의 자외선-가시광선 스펙트럼 및 그의 구조적 도식을 도시한다. AlexaFluor® 488 대 세툭시맙의 비는 1.00 ± 0.04이다.
도 9는 부위 특이적 접합(도 9a) 및 확률적 접합(도 9b)에 대한 리포솜 크기(각 도면의 최상단 플롯) 및 다분산 지수(각 도면의 하부 플롯)의 비교를 도시한다.
도 10은 80kV의 가속 전압 및 46,000x의 배율에서 영상화된 세툭시맙-단백질 Z에 부위 특이적으로 클릭 접합된 리포솜의 투과 전자 현미경(TEM) 영상을 도시한다.
도 11은 부위 특이적 접합(좌측 최상단 플롯) 및 확률적 접합(좌측 하부 플롯)에 대한 ζ-전위 대 접합 효율의 비교를 도시한다.
도 12는 부위 특이적 접합(최상단 플롯) 및 확률적 접합(하부 플롯)에 대한 리포솜당 접합된 세툭시맙의 수 대 접합 효율의 비교를 도시한다.
도 13은 A431 세포(고 EGFR; 최상단 플롯), T47D 세포(저 EGFR; 중간 플롯) 및 CHO-WT 세포(EGFR 없음; 하부 플롯)에서의 결합 선택성의 비교를 도시한다.
도 14는 A431 세포(고 EGFR; 최상단 플롯), T47D 세포(저 EGFR; 중간 플롯) 및 CHO-WT 세포(EGFR 없음; 하부 플롯)에서의 AlexaFluor® 488을 갖는 리포솜-세툭시맙 접합체의 결합 선택성의 비교를 도시한다.
도 15는 표적화된 리포솜 및 비특이적 리포솜뿐만 아니라, EGFR이 블로킹된 경우의 표적화된 리포솜 및 비특이적 리포솜에 대한 유동세포계측 데이터를 도시한다.
도 16은 세툭시맙에 부위 특이적으로 접합된 16:0 Lyso PC-BPD 리포솜 및 확률적으로 접합된 것을 사용한 선택적 광역동 요법 후의 세포 생존율을 도시한다.
도 17은 트라스투주맙(Trastuzumab)(항-HER-2 항체, Herceptin®) 및 트랜스페린(트랜스페린 수용체에 대한 천연 리간드)의 확률적 아지도 변형이 ADIBO-변형된 16:0 Lyso PC-BPD-함유 리포솜에 클릭되는 경우 세포 결합의 선택성을 나타낸다는 것을 입증한다.
도 18a는 막에 포집된 16:0 Lyso PC-BPD를 갖지 않는 ADIBO-변형된 리포솜에 수용성 광감작제 클로린 e6 모노에틸렌 디아민 모노아미드(CMA)가 로딩된 것을 도시하며, 이는 세툭시맙에 확률적으로 접합된 경우 세포 선택성을 제공하는 것을 보여준다. 리포솜의 도식은 도 18b에 도시되어 있다.
도 19는 표적화된 리포솜의 세포 내재화를 나타내는, 점진적 시간 간격으로 OVCAR-5 세포에서 비표적화된 리포솜 및 확률적으로 표적화된 리포솜의 공초점 형광 현미경 영상을 도시한다.
도 20은 생체내 영상화에 사용할 수 있는 안정한 클릭-반응성 리포솜의 패널을 제조하기 위해, 0.2% DSPE-PEG2000-NH2를 ADIBO-변형된 리포솜 내에 혼입시키고, 근적외선 염료의 아민-반응성 NHS-에스테르와 접합시킨 것을 도시한다.
도 21a는 다양한 염료를 포함하는 리포솜의 크기 및 다분산 지수를 도시하며, 도 21b는 각각의 자외선-가시광선 스펙트럼을 도시한다.
도 22는 리포솜당 세툭시맙-단백질 Z(Cet-Pz) 밀도의 함수로서 중앙값 리사민 로다민 B(Lissamine Rhodamine B) 강도를 도시하며, 이는 형광 표지된 리포솜이 T47D 세포(저 EGFR; 하부 플롯)와 비교하여, A431 세포(고 EGFR; 상부 플롯)에 선택적으로 결합한다는 것을 입증하는 것이다.
도 23은 IRDye® 680RD(상부 플롯) 및 IRDye® 800CW(하부 플롯)의 평균 보정 형광 대 시간을 도시하며, 이는 모의 인간 IgG1 대조군(sham human IgG1 control)에 클릭 접합된 공동-주사된 IRDye800CW 표지 리포솜과 비교하여, 세툭시맙(Erbitux)에 클릭 접합된 IRDye680RD 표지 리포솜과 피하의 U251 종양의 선택적 결합을 입증하는 것이다.
도 24는 표적화된 리포솜(각각의 쌍 중 우측 막대)이 비표적화된 리포솜(각각의 쌍의 막대 중 좌측 막대)보다 A431 종양에 대해 더 선택적이었다는 것을 도시한다.
도 25는 생체분포를 정량적으로 영상화하고, 비접합된 DIBO-함유 16:0 Lyso PC-BPD 리포솜 대조군에 비해, 0.25 mg/kg BPD 당량의 투여 24시간 후, 피하의 A431(고 EGFR) 종양을 갖는 마우스에서 확률적으로 클릭 접합된 리포솜의 종양 선택성을 확인하기 위해, 16:0 Lyso PC-BPD의 형광을 사용할 수 있음을 도시한다.
도 26은 PEG 사슬을 보여주는 것으로, 16:0 Lyso PC-BPD 광감작제를 포함하는 리포솜의 구조적 도식을 도시한다.
도 27은 이중 층 또는 핵-포획 PEG-PLGA 나노입자 내에 작용제들을 함유하는 표적화된 리포솜의 개념적 표현이다.
도 28은 유동세포계측 데이터를 제공하며, 리포솜당 v0, 10, 50 또는 100의 세툭시맙-단백질 Z 접합체(Cet-Pz)와 반응한 리포솜으로부터의 중앙값 광감작제(BPD) 강도를 도시한다.
도 29a는 리포솜 막으로부터 유래된 중앙값 광감작제(BPD) 강도를 도시하는 유동세포계측 데이터를 제공한다. 도 29b는 단백질 Z에 부착된 형광 표지된 펩티드로부터 유래된 중앙값 5-FAM 형광 강도를 도시한다.
도 30a 및 도 30b는 A431 세포에서 세툭시맙에 결합된 5-FAM 단백질 Z 및 BPD의 중앙값 형광 강도 사이의 상관관계는 도 30a(고 EGFR)에 도시되어 있으며, T47D 세포의 경우는 도 30b(저 EGFR)에 도시되어 있는 것을 보여준다. 높은 상관 계수는 리포솜에 클릭 접합된 세툭시맙의 완전성을 나타낸다.
도 31a 내지 31c는 유동세포계측 데이터를 도시하며, 여기서, 중앙값 BPD 강도는 개별적으로 측정된 50,000개의 세포의 평균이다. 세포를 50의 세툭시맙/리포솜(도 31a)에 클릭 접합된 리포솜 대 비-접합된 리포솜(도 31b)으로 30분, 90분 또는 180분 동안 인큐베이션하였다. 리포솜의 선택성(도 31c)은 표적화된 리포솜으로 인큐베이션된 세포의 중앙값 BPD 강도를 비특이적 리포솜으로 인큐베이션된 세포의 중앙값 BPD 강도로 나눈 대표값이다.
도 32는 20J/cm2의 690 nm 레이저 광에 의한 PDT 치료 후 A431 및 OVCAR-5 세포(고 EGFR) 및 T47D 세포(저 EGFR)의 MTT 분석의 결과를 도시한다. 확률적으로 표적화된 리포솜을 세포와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다.
도 33은 리포솜당 세툭시맙-단백질 Z 밀도의 함수로서 중앙값 5-FAM 형광 강도를 도시하며, 이는 또한, T47D 세포(하부 플롯)와 비교하여, A431 세포(상부 플롯)에 대한 높은 선택성을 입증하는 것이다. 최적의 밀도는 약 100 Cet-Pz/리포솜에서 발생한다.
도 34는 500 nM 및 100 nM 농도의 리사민 로다민 B에서 A431 세포에 대한 최적의 세툭시맙-단백질 Z 밀도(각각, 최상단 플롯 및 하부의 다음 플롯) 및 500 nM 및 100 nM 농도의 리사민 로다민 B에서 T47D 세포에 대한 최적의 세툭시맙-단백질 Z 밀도(하부의 2개의 플롯)를 도시한다.
도 35는 500 nM 리사민 로다민 B 당량으로 GOA_111-CetPz(10 CetPz/리포솜) 중앙값 리사민 로다민 B 강도를 사용한 다양한 암세포주에 대한 선택성 배수를 도시한다. 100 μL 리포솜 샘플을 37℃에서 30분 동안 50,000개의 세포와 함께 인큐베이션하였다.
도 36은 전술된 절차에 따라 처리된 리포솜의 투과 전자 현미경(TEM) 영상을 도시한다.
도 37은 선택성 배수 대 로다민의 nM 당량을 도시하며, 이는 세툭시맙에 클릭 접합되고, 지질 앵커링된 로다민 염료 및 소수성으로 포집된 유리 BPD 둘 모두를 포함하는 리포솜이 항체와 접합되지 않은 리포솜과 비교하여, 상이한 수준의 선택성을 나타낸다는 것을 보여준다.
도 38은 로다민 표지된 리포솜(적색)으로 30분 동안 인큐베이션된 MGG6 세포 신경구(neurosphere)(Hoechst 33324로 염색된 핵, 청색)의 공초점 형광 현미경 영상을 도시한다. 도 38은 30분째에, 세툭시맙-항 EGFR에 클릭 접합된 표적화된 리포솜이 비표적화된 리포솜(도 38b)과 비교하여, 우선적 결합을 나타낸다는 것(도 38a)을 보여준다.
도 39a는 지질 앵커링된 형광단 리사민 로다민 B-DPPE를 혼입시키는 예시적 제형을 제공한다. 3개의 샘플(50% v/v GOA_111 + 5 x ADIBO 1(최상단 플롯), 50% v/v GOA_111 + 5 x ADIBO 2(중간 플롯), 및 50% v/v GOA_111 + 5 x ADIBO 3(최하단 플롯))에 대한 크기 및 다분산 지수가 도 39b에 도시되어 있다.
도 40은 각각의 샘플에 대한 크기 및 다분산 지수를 도시한다.
안정한 구리 무함유 클릭 화학 리포솜(copper-free click chemistry liposome)이 본 명세서에서 제공된다. 리포솜은, 리포솜 카르고(cargo)의 시공간적-제어 광촉발성 방출을 위한 광역동 요법제, 형광단, 및/또는 매개인자로서 작용할 수 있는 지질 앵커링(anchoring)된 광감작제 분자를 안정적으로 혼입시키기 위해, 화학적으로 최적화되었다. 리포솜 카르고는, 광감작제와 상승작용할 수 있는, 나노입자와 결합되거나, 이를 함유하지 않는 2차 생물학적 또는 화학적 치료요법을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 리포솜은 결합 및 광독성의 안정성 및 선택성에 대해, 화학적으로 조정된다. 예를 들어, 리포솜은 표적화 모이어티, 예를 들어 광감작제 및 선택적 카르고를 선택적으로 표적화하는 항체를 포함할 수 있다. 리포솜은 표적화된 리포솜의 병행된 심부 조직 추적 및 영상화를 허용하기 위해, 근적외선 영상화제의 안정한 모듈형의 비간섭 접합을 위해 추가로 조정될 수 있다.
예를 들어, 도 27은 본 명세서에서 제공된 바와 같은 표적화된 리포솜의 개념적 표현이다. 일부 구현예에서, 리포솜은 이중 층 또는 핵-포집 PEG-PLGA 나노입자 내에 작용제들을 함유한다. 이러한 작용제는 광감작제, 영상화제, 약제, 또는 키나제 억제제를 포함할 수 있다. 친수성 광감작제, 영상화제, 약제, 또는 키나제 억제제는 수성 핵 내에 포획될 수 있다. 리포솜의 표면은, 예를 들어, DSPE-PEG2000-ADIBO의 리포솜 조성물을 사용하여, 구리 무함유 클릭 화학을 통해, 표적화 모이어티, 예를 들어 항체에 접합된다.
a) 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체; b) 제1 인지질 및 스트레인된 시클로옥틴 모이어티를 포함하는 제1 유도체화된 인지질; c) 제2 인지질 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 포함하는 제2 유도체화된 인지질; 및 d) 양이온성 또는 음이온성 지질을 포함하는 리포솜이 본 명세서에서 제공된다.
또한, a) 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체; b) 제1 인지질 및 표적화 모이어티를 포함하는 제1 유도체화된 인지질; c) 제2 인지질 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 포함하는 제2 유도체화된 인지질; 및 d) 양이온성 또는 음이온성 지질을 포함하는 리포솜이 본 명세서에서 제공된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 광감작제는, 리포솜의 시공간적-제어 광촉발성 파괴 및/또는 리포솜 카르고의 방출을 위한 소분자 광역동 요법제, 형광단, 및/또는 매개인자를 지칭한다. 일부 구현예에서, 광감작제는 소수성이다. 일부 구현예에서, 광감작제는 친수성이다. 일부 구현예에서, 광감작제는 포르피린 광감작제이다. 예를 들어, 광감작제는 벤조포르피린 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 광감작제는 벤조포르피린 유도체(BPD)이다.
일부 구현예에서, 광감작제는 포르피린, 클로린, 박테리오클로린, 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌, 텍사프린, 안트라퀴논, 안트라시클린, 페릴렌퀴논, 크산텐, 시아닌, 아크리딘, 페녹사진, 페노티아진, 트리아릴메탄, 칼로제나피릴륨 염료 및 프탈레인 염료를 포함한 광감작제의 부류로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 광감작제는 베르테포르핀(3-[(23S,24R)-14-에테닐-5-(3-메톡시-3-옥소프로필)-22,23-bis(메톡시카보닐)-4,10,15,24-테트라메틸-25,26,27,28-테트라아자헥사시클로[16.6.1.13,6.18,11.113,16.019,24]옥타코사-1,3,5,7,9,11(27),12,14,16,18(25),19,21-도데칸-9-일]프로판산); 프로토포르피린 IX; 테모포르핀(temoporfin)(3,3',3'',3'''-(2,3-디하이드로포르피린-5,10,15,20-테트라일)테트라페놀); 모톡사핀 루테튬(motoxafin lutetium); 9-아세톡시-2,7,12,17-테트라키스-(β-메톡시에틸)-포르피센(ATMPn); 클로린 e6; 클로린 모노에틸렌 디아민 모노아미드; 프로토포르피린 IX; 아연 프탈로시아닌; 실리콘 프탈로시아닌 Pc 4; 및 나프탈로시아닌으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 광감작제는 리소인지질에 접합된다. 예를 들어, 문헌[J. Lovell, C. Jin, E. Huynh, H. Jin, C. Kim, J. Rubinstein, W. Chan,W. Cao, L. Wang and G. Zheng. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents 2011 Nature Materials, 10, 324-332]을 참조한다. 일부 구현예에서, 광감작제는 수성적으로 포획된다. 일부 구현예에서, 광감작제는 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 중합체와의 접합을 통해) 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 유도체화된 인지질에 접합된다. 일부 구현예에서, 광감작제는 인지질의 포스페이트 헤드 기(phosphate head group)와의 반응을 통해, 본 명세서에서 제공된 바와 같은 인지질에 접합된다(문헌[K.A. Riske, T.P. Sudbrack, N.L. Archilha, A.F. Uchoa, A.P. Schroder, C.M. Marques, M.S. Baptista, R. Itri, Biophys. J. 97(2009) 1362-1370] 참조). 일부 구현예에서, 광감작제는 인지질의 아실 사슬에 접합된다(문헌[T. Komatsu, M. Moritake, A. Nakagawa, E. Tsuchida, Chemistry 8(2002) 5469-5480] 참조). 일부 구현예에서, 광감작제는 리포솜의 또 다른 성분, 예를 들어 콜레스테롤에 접합된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 리소인지질은, 아실 유도체 중 하나 또는 둘 모두가 가수분해에 의해 제거된 인지질의 임의의 유도체이다. 일부 구현예에서, 리소인지질은 지방산 사슬 내에 14 내지 22개의 탄소를 포함한다. 예를 들어, 리소인지질은 지방산 사슬 내에 16 내지 20개의 탄소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 리소인지질은 불포화 지방산 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, 리소인지질은 16:0 리소인지질, 20:0 리소인지질, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체는 리포솜 중에 약 0.01 mol% 내지 약 1 mol%, 예를 들어, 리포솜 중에 약 0.05 mol% 내지 약 0.5 mol%; 리포솜 중에 약 0.08 mol% 내지 약 0.12 mol%로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체는 리포솜 중에 약 0.1 내지 약 0.2 mol%로 존재한다. 예를 들어, 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체는 리포솜 중에 약 0.1 mol%로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 접합체(예를 들어, 16:0 리소인지질(LysoPC) 및/또는 20:0 LysoPC의 BPD 접합체, 및 16:0 LysoPC-BPD 및 20:0 LysoPC-BPD에 의해 형성된 안정한 리포솜)는, 표적화 리간드의 클릭 접합을 위해 완전히 최적화된 표면을 갖는 인지질 이중 층으로 안정적으로 포매될 수 있다. 모든 접합이 다른 것과 마찬가지로 적합하지는 않다. 예를 들어, BPD의 카복실레이트와 콜레스테롤의 히드록실의 접합은, 양 분자가 나타내는 임의의 극성을 제거하고, 양친매성 지질 이중 층 내에는 안정한 입체구조가 존재할 수 없으며, 포획은 거의 0%이다. 유사하게, 소수성 BPD와 DSPE-PEG2000-아민의 친수성 말단의 아미드 접합은 BPD를 막 내로 앵커링시키지만, 내부-리포솜 표면 BPD 모이어티의 말단부의 소수성 스태킹(stacking)으로 인해, 불안정한 리포솜을 생성한다. 본 명세서에 제시된 바와 같이, 안정한 리포솜은 광감작제와 리소인지질의 접합(예를 들어, 16:0 LysoPC-BPD 및 20:0 LysoPC-BPD)에 의해 형성될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 리포솜은, 지질 이중 층에서 소수성 BPD 포집에 의해 관찰되는 것과 같이, 주변 세포로의 광감작제의 비특이적 누설을 차단한다.
-OH, -COOH, -NH2, 및 -SH와 같은 화학적으로 반응성인 작용기를 함유하는 소수성 광감작제와 리소인지질의 접합은 리소인지질, 예를 들어 본 명세서에서 제공되는 것(예를 들어, 리소인지질 및 리소인지질-링커 유도체(예를 들어, 리소인지질-PEG 유도체))에 대한 표준 접합 방법을 사용하여, 달성될 수 있다. -OH, -COOH, -NH2 및 -SH와 같은 화학적으로 반응성인 작용기를 함유하는 친수성 광감작제의 접합은 콜레스테롤의 극성 -OH 기 또는 DPPC, DPPE, DSPE-PEG-NH2, DSPE-PEG-COOH, DSPE-PEG-OH, DOPG와 같은 인지질의 포스페이트 헤드 기의 유도체와의 접합을 통해 달성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 제1 인지질은: 포스파티딜콜린; 포스파티드산; 포스파티딜에탄올아밈; 포스파티딜글리세롤; 및 포스파티딜세린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 명세서에 제공되는 리포솜의 제1 인지질의 비제한적 예는 수소화된 콩 포스포티딜콜린(HSPC); 1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DDPC); 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스페이트(DEPA); 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC); 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE); 1,2-디엘라이도일-포스파티딜글리세롤(DEPG); 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLOPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스페이트(DLPA); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DLPG); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포세린(DLPS); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DMPA); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DMPG); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포세린(DMPS); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(DOPA); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DOPG); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포세린(DOPS); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DPPA); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DPPG); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포세린(DPPS); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스페이트(DSPA); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DSPG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포세린(DSPS); 1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로 3-포스포콜린(MPPC); 1-미리스토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MSPC); 1-팔미토일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PMPC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(POPG); 1-팔미토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PSPC); 1-스테아로일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SMPC); 및 1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SOPC); 1-스테아로일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SPPC), 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE)이다.
일부 구현예에서, 제1 유도체화된 인지질은 링커를 추가로 포함한다. 예를 들어, 링커는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있고, 폴리에틸렌 글리콜은 이가이고, 제1 인지질과 스트레인된 시클로옥텐 모이어티 사이의 링커이거나, 제1 인지질과 표적화 모이어티 사이의 링커이다. 일부 구현예에서, 링커는 스트레인된 시클로옥틴 및 표적화 모이어티의 구리 무함유 클릭 화학 반응 산물과 제1 인지질 사이의 링커일 수 있다.
일부 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 350 g/mol 내지 약 30,000 g/mol의 분자량을 갖는다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜은 350 g/mol, 550 g/mol, 750 g/mol, 1000 g/mol, 2000 g/mol, 3000 g/mol, 5000 g/mol, 10,000 g/mol, 20,000 g/mol, 또는 30,000 g/mol로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자량을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜은 2000 g/mol의 분자량을 갖는다.
일부 구현예에서, 제1 유도체화된 인지질은 DSPE-PEG2000을 포함한다.
스트레인된 시클로옥틴의 비제한적인 예는 아자-디벤조시클로옥틴(ADIBO), 디벤조시클로옥틴(DIBO), (OCT), 무아릴 옥틴(ALO), 모노플루오르화된 시클로옥틴(MOFO), 디플루오르화된 시클로옥틴(DIFO), 비아릴아자시클로옥티논(BARAC), 또는 디메톡시아자시클로옥틴(DIMAC) 모이어티를 포함한다. 제1 인지질 또는 링커와의 반응 전에, 스트레인된 시클로옥틴은: 디벤조시클로옥틴-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르(ADIBO-NHS), 디벤조시클로옥틴-C6-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 디벤조시클로옥틴-설포-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 디벤조시클로옥틴-PEG(4, 5, 13 또는 n)-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 디벤조시클로옥틴-S-S-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 디벤조시클로옥틴-말레이미드, 디벤조시클로옥틴-PEG(4, 5, 13 또는 n)-말레이미드, 및 (1R,8S,9s)-비시클로[6.1.0]논-4-yn-9-일메틸 N-숙신이미딜 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 표적화 모이어티 표적화 모이어티는 엽산, RGD 펩티드, 천연 단백질 리간드(예를 들어, TNF, EGF, 트랜스페린), 애피바디, 항체, 항체 단편, 조작된 항체-기반 단백질, 암 관련 수용체, 엽산 수용체, 전달 수용체, HER-2 수용체, avb5 이네그린 및 소마토스타틴 수용체 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 항체이다.
일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 제1 유도체화된 인지질과 접합되기 전의 아지드 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 제1 인지질과 접합되기 전의 본 명세서에서 제공된 바와 같은 스트레인된 시클로옥틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 모이어티는 Cu-무함유 클릭 화학을 사용하여, 제1 인지질과 접합된다. 예를 들어, 표적화 모이어티 상의 아지드 또는 스트레인된 시클로옥틴은 Cu-무함유 클릭 화학을 통해, 각각, 제1 인지질 상의 스트레인된 시클로옥틴 또는 아지드와 반응할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 유도체화된 인지질은 아지드를 포함하는 표적화 모이어티와 스트레인된 시클로옥틴의 반응 산물과 제1 인지질을 포함한다.
스트레인된 시클로옥틴에 의해 사전에 변형된 리포솜 표면과 표적화 모이어티의 구리 무함유 클릭 접합에서, 표적화 모이어티는 아지도 모이어티에 의해 변형된다. 예를 들어, 세툭시맙(cetuximab)에 대한 아지드 모이어티의 부위-특이적 도입은 IgG 분자의 Fc 부분과만 결합하는 생물공학적으로 조작된 단백질 Z 분자를 사용하여 달성될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hui, J.Z. , Al Zaki, A. , Cheng , Z., Popik, V., Zhang, H., Prak, E.T.L and Tsourkas, A. Facile Method for the Site-Specific, Covalent Attachment of Full-Length IgG onto Nanoparticles (2014) 10(16):3354-63. doi: 10.1002/smll.201303629.] 참조). 세툭시맙으로의 아지드 모이어티의 확률적 도입은 PEG4-아지드의 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르를 사용하여 달성될 수 있다. 단일 형광단(부위 특이적 세툭시맙의 경우 5-FAM 및 확률적 세툭시맙의 경우 AlexaFluor® 488)은 각각의 항체 접합체로 도입될 수 있다. 일부 구현예에서, 스트레인된 시클로옥틴 지질로 사전에 클릭된 미셀화된 아지도 표적화 리간드는 또한 임의의 치료적/영상화 카르고를 보유하는 사전에 형성된 리포솜으로 후속-삽입될 수 있다. 표적화 리간드는 또한 아지도-변형된 리포솜(예를 들어, 제1 인지질 및 아지도 모이어티를 포함하는 제1 유도체화된 인지질)과의 클릭 접합을 위해, 스트레인된 시클로옥틴에 의해 변형될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 표적화 모이어티는 본 명세서에 제공되는 리포솜의 선택성을 증가시킨다. 예를 들어, 선택적 결합 및 광독성은 그의 개별 표적-과발현 세포주에 의해, 임의의 클릭 접합된 표적화 모이어티에 대해 달성될 수 있다. 리포솜 플랫폼과의 구리 무함유 클릭 접합을 위한 잠재적 후보인 아지도 변형된 리간드는 엽산, RGD 펩티드, 천연 단백질 리간드(예를 들어, TNF, EGF, 트랜스페린), 애피바디, 또는 항체 단편의 임의의 변이체를 포함한다. 선택적 결합 및 광독성은 수성 광감작제(예를 들어, 클로린 e6, 메틸렌 블루, 설폰화된 알루미늄 프탈로시아닌, Rose Bengal)를 포획하는 임의의 표적화된 시클로옥틴-변형된 리포솜에 대해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 임의의 소수성 광감작제를 포집하는 수용성 PEG-PLGA 나노입자는 선택적 PDT-기반 방식을 위해, 표적화된 DIBO-변형된 리포솜 내에 포획될 수 있다. 선택적 결합 및 광독성은 또한, 포집된 소수성 지질-앵커링된 광감작제, 예를 들어 프로토포르피린 IX를 추가로 포함하는 본 명세서에 제공되는 리포솜에 대해 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 유도체화된 인지질은 리포솜 중에 최대 약 0.5 mol%의 양으로 존재한다. 예를 들어, 제1 유도체화된 인지질은 약 0.05 mol% 내지 약 0.5 mol%(예를 들어, 약 0.1 mol%, 약 0.2 mol%, 약 0.25 mol%, 약 0.3 mol%, 및 약 0.4 mol%)의 양으로 존재할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 인지질은: 포스파티딜콜린; 포스파티드산; 포스파티딜에탄올아밈; 포스파티딜글리세롤; 및 포스파티딜세린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 제2 인지질의 비제한적인 예는 수소화된 콩 포스포티딜콜린(HSPC); 1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DDPC); 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스페이트(DEPA); 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC); 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE); 1,2-디엘라이도일-포스파티딜글리세롤(DEPG); 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLOPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스페이트(DLPA); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DLPG); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포세린(DLPS); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DMPA); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DMPG); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포세린(DMPS); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(DOPA); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DOPG); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포세린(DOPS); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DPPA); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DPPG); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포세린(DPPS); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스페이트(DSPA); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DSPG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포세린(DSPS); 1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로 3-포스포콜린(MPPC); 1-미리스토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MSPC); 1-팔미토일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PMPC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(POPG); 1-팔미토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PSPC); 1-스테아로일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SMPC); 및 1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SOPC); 1-스테아로일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SPPC); 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE)이다.
일부 구현예에서, 제2 유도체화된 인지질에 존재하는 폴리에틸렌 글리콜 중합체는 약 350 g/mol 내지 약 30,000 g/mol의 분자량을 가질 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 중합체는 350 g/mol, 550 g/mol, 750 g/mol, 1000 g/mol, 2000 g/mol, 3000 g/mol, 5000 g/mol, 10,000 g/mol, 20,000 g/mol 및 30,000 g/mol로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자량을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체는 2000 g/mol의 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체는 알콕실, 카복실, 아민, 비오틴, 말레이미드, 숙시닐, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 설포-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 실란, 피리딜디티올 또는 시아누르 모이어티에 의해 종결된다. 일부 구현예에서, 제2 유도체화된 인지질은 DSPE-PEG2000, DSPE-mPEG2000, 또는 이들의 조합이다.
일부 구현예에서, 제2 유도체화된 인지질은 리포솜 중에 약 0.5 mol% 내지 약 5 mol%의 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 접합체 대 제2 유도체화된 인지질의 몰비는 약 1:10이다. 일부 구현예에서, 제2 유도체화된 인지질은 리포솜 중에 접합체의 양보다 약 10배 더 많은 양으로 존재한다.
임의의 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 제2 유도체화된 인지질은 리포솜에 안정성을 부여할 수 있다.
일부 구현예에서, 리포솜은 음이온성 지질을 포함한다. 예를 들어, 리포솜은 음이온성 인지질을 포함할 수 있다. 음이온성 인지질의 비제한적인 예는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG); 포스파티딜 글리세롤(PG); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DMPG); 포스파티딜세린(PS); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS); 및 디세틸포스페이트(DCP)를 포함한다. 음이온성 지질(예를 들어, 음이온성 인지질)은 리포솜 중에 최대 약 10 mol%(예를 들어, 약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%)의 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 음이온성 지질은 리포솜 중에 약 5 내지 약 10 mol%의 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 음이온성 지질은 리포솜 중에 약 7 내지 약 9 mol%의 양으로 존재한다.
일부 구현예에서, 리포솜은 양이온성 지질을 포함한다. 예를 들어, 리포솜은 양이온성 인지질을 포함할 수 있다. 양이온성 인지질의 비제한적인 예는 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)을 포함한다. 양이온성 지질(예를 들어, 양이온성 인지질)은 리포솜 중에 최대 약 10 mol%(예를 들어, 약 0.1 mol% 내지 약 10 mol%)의 양으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 음이온성 지질은 리포솜 중에 약 5 내지 약 10 mol%의 양으로 존재한다. 일부 구현예에서, 음이온성 지질은 리포솜 중에 약 7 내지 약 9 mol%의 양으로 존재한다.
임의의 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 양이온성 또는 음이온성 지질은 리포솜의 정전식 안정화를 제공하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 정전식 안정화의 부족은 리포솜의 침전을 야기할 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 또는 음이온성 지질의 존재는 양이온성 또는 음이온성 지질이 부족한 리포솜과 비교하여, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 리포솜의 증가된 세포 흡수에 기여할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 리포솜은 하나 이상의 화학요법 화합물; 하나 이상의 중합체성 나노입자; 하나 이상의 단백질계 나노입자; 하나 이상의 덴드리머 구조체; 하나 이상의 무기 나노입자; 하나 이상의 영상화제; 하나 이상의 키나제 억제제; 하나 이상의 생물제제; 및 이들의 2개 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 카르고를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키나제 억제제는 수용체 티로신 키나제 억제제이다.
카르고는 생물제제(문헌[S. Tangutoori, B. Q. Spring, Z. Mai, A. Palanisami, L. Mensah and T. Hasan, Nanomedicine, 2015, DOI: 10.1016/j.nano.2015.08.007]); 화학요법(문헌[H. C. Huang, S. Mallidi, J. Liu, C. T. Chiang, Z. Mai, R. Goldschmidt, N. Ebrahim-Zadeh, I. Rizvi and T. Hasan, Cancer Res, 2016, 76, 1066-1077]); 또는 소분자 수용체 티로신 키나제 억제제(문헌[B. Q. Spring, R. B. Sears, L. K. Zheng, Z. Mai, R. Watanabe, M. E. Sherwoord, D. A. Schoenfeld, B. W. Pogue, S. P. Pereira, E. Villa and T. Hasan, Nat. Nanotechnol., 2016, in press])일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 화학요법 화합물 중 하나 이상은 광감작제와 상승작용을 나타낸다.
일부 구현예에서, 카르고는 리포솜 이중 층에 포집될 수 있다(예를 들어, 소수성 화학요법 또는 소분자 억제제).
본 명세서에 제공되는 리포솜은 하나 이상의 인지질, 스핑고지질, 생물활성 지질, 천연 지질, 콜레스테롤, 스테롤 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 인지질은: 포스파티딜콜린; 포스파티드산; 포스파티딜에탄올아밈; 포스파티딜글리세롤; 및 포스파티딜세린으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 인지질의 비제한적인 예는 수소화된 콩 포스포티딜콜린(HSPC); 1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DDPC); 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스페이트(DEPA); 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC); 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE); 1,2-디엘라이도일-포스파티딜글리세롤(DEPG); 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLOPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스페이트(DLPA); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DLPG); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포세린(DLPS); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DMPA); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DMPG); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포세린(DMPS); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(DOPA); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DOPG); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포세린(DOPS); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DPPA); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DPPG); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포세린(DPPS); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스페이트(DSPA); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DSPG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포세린(DSPS); 1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로 3-포스포콜린(MPPC); 1-미리스토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MSPC); 1-팔미토일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PMPC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(POPG); 1-팔미토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PSPC); 1-스테아로일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SMPC); 및 1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SOPC); 1-스테아로일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SPPC); 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 인지질 중 적어도 하나는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC)이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 인지질은 리포솜 중에 약 40 mol% 내지 약 80 mol%로 존재한다. 예를 들어, 하나 이상의 인지질은 리포솜 중에 약 50 내지 약 70 mol%; 리포솜 중에 약 55 내지 약 65 mol%; 리포솜 중에 약 15 mol% 내지 약 45 mol%; 또는 리포솜 중에 약 20 mol% 내지 약 30 mol%로 존재한다.
일부 구현예에서, 콜레스테롤은 리포솜 중에 약 10 mol% 내지 약 50 mol%의 양으로 존재한다. 예를 들어, 리포솜 중에 약 20 mol% 내지 약 40 mol%; 리포솜 중에 약 25 내지 약 35 mol%; 및 약 27 mol% 내지 약 29 mol%.
일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 리포솜은 약 50 mol% 내지 약 65 mol%의 하나 이상의 인지질; 약 5 mol% 내지 약 10 mol%의 음이온성 또는 양이온성 지질; 약 20 내지 약 35 mol%의 콜레스테롤; 약 2 mol% 내지 약 8 mol%의 제2 유도체화된 인지질; 및 약 0.05 mol% 내지 약 0.25 mol%의 접합체를 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 제공되는 리포솜은 약 55 mol% 내지 약 60 mol%의 하나 이상의 인지질; 약 7 mol% 내지 약 9 mol%의 음이온성 또는 양이온성 지질; 약 25 내지 약 30 mol%의 콜레스테롤; 약 4 mol% 내지 약 6 mol%의 제2 유도체화된 인지질; 및 약 0.08 mol% 내지 약 0.12 mol%의 접합체를 포함한다.
일부 구현예에서, 리포솜은 형광단, 조영제(예를 들어, MRI, PET, 또는 SPECT 조영제), 또는 이들의 조합을 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "형광단"은 광 여기(예를 들어, 가시 스펙트럼의 광)시에 광을 재방출할 수 있는 임의의 소분자일 수 있다. 예를 들어, 형광단은 로다민(rhodamine), 플루오레세인(fluorescein), 붕소-디피로메탄, 쿠마린(coumarin), 피렌(pyrene), 시아닌(cyanine), 옥사진(oxazine), 아크리딘(acridine), 아우라민 Os(auramine Os), 및 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 일부 경우, 유도체는 설폰화된 유도체, 예를 들어 설폰화된 피렌, 설폰화된 쿠마린, 설폰화된 로다민 및 설폰화된 시아닌(예를 들어, ALEXAFLUOR® 염료)을 포함한다.
일부 구현예에서, -OH, -COOH, -NH2, -SH와 같은 화학적으로 반응성인 작용기를 함유하는 임의의 소수성 형광단의 지질 앵커링은 리소인지질 및 리소인지질 유도체(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 중합체에 결합된 리소인지질)와의 접합을 통해 달성될 수 있다. 이들 리포솜은 임의의 표적화 모이어티에 클릭 접합될 수 있으며, 그의 표적과 선택적으로 결합할 것이다. -OH, -COOH, -NH2 및 -SH와 같은 화학적으로 반응성인 작용기를 함유하는 임의의 친수성 형광단의 지질 앵커링은 콜레스테롤의 극성 -OH 기 또는 DPPC, DPPE, DSPE-PEG-NH2, DSPE-PEG-COOH, DSPE-PEG-OH, DOPG와 같은 인지질의 포스페이트 헤드 기의 유도체와의 접합을 통해 달성될 수 있다. 이들 리포솜은 임의의 표적화 모이어티와 클릭 접합될 수 있으며, 그의 표적과 선택적으로 결합한다.
본 명세서에서 제공된 바와 같은 리포솜은 당업자에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리포솜은 현탁액 형태로 제조될 수 있거나, 본 명세서에서 제공되는 리포솜 조성물을 함유하는 동결건조된 분말을 수용액으로 재구성하여 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 리포솜은 200 nm 미만의 평균 입자 크기 분포를 갖는다. 예를 들어, 본 명세서에 제공되는 리포솜은약 100 nm 내지 약 150 nm의 평균 입자 크기 분포를 가질 수 있다.
본 명세서에 제공되는 리포솜 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본 명세서에서 제공된다.
본 명세서에 제공되는 리포솜은 단독으로 또는 통상의 약제학적 담체, 부형제 등과 조합하여 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 약제학적 투여 형태로 사용되는 계면활성제, 예를 들어 트윈(Tween), 폴록사머 또는 다른 유사한 중합체성 전달 매트릭스, 완충액 물질, 예를 들어 포스페이트, 트리스, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 식물성 포화 지방산의 부분적 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어 황산프로타민, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 폴리에틸렌 글리콜 및 소듐 카복시메틸 셀룰로스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 시클로덱스트린, 예를 들어 α-, β, 및 γ-시클로덱스트린, 또는 화학적으로 변형된 유도체, 예를 들어 2- 및 3-하이드록시프로필-β-시클로덱스트린을 포함하는 하이드록시알킬시클로덱스트린, 또는 다른 가용성 유도체가 또한 사용될 수 있다. 무독성 담체와 균형이 이루어지도록 하여, 본 명세서에 기재된 바와 같은 리포솜을 0.005% 내지 100%의 범위로 함유하는 투여 형태 또는 조성물이 제조될 수 있다. 고려되는 조성물은 본 명세서에 제공되는 리포솜을 0.001% 내지 100%, 일 구현예에서는 0.1 내지 95%, 또 다른 구현예에서는 75 내지 85%, 추가의 구현예에서는 20 내지 80% 함유할 수 있다. 이러한 투여 형태를 제조하는 실제적인 방법은 당업자에 공지되어 있거나, 명백할 것이며; 예를 들어 문헌[Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition (Pharmaceutical Press, London, UK. 2012]을 참조한다.
약제학적으로 투여 가능한 액상 조성물은, 예를 들어, 담체(예를 들어, 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올 등) 중에 본 명세서에서 제공되는 화합물 및 선택적 약제학적 애주번트(adjuvant)의 용해, 분산 등에 의해, 용액, 콜로이드, 리포솜, 에멀젼, 복합체, 코아세르베이트(coacervate) 또는 현탁액을 형성함으로써, 제조될 수 있다. 요망되는 경우, 약제학적 조성물은 또한 소량의 무독성 보조 물질, 예를 들어 습윤제, 유화제, 공용매, 가용화제, pH 완충제 등(예를 들어, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 시클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 아세테이트, 트리에탄올아민 올리에이트 등)을 함유할 수 있다.
주사제는 액상 용액, 콜로이드, 리포솜, 복합체, 코아세르베이트 또는 현탁액으로서, 에멀젼으로서 또는 주사 전에 액상으로 재구성하기에 적합한 고형물 형태의 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 이러한 비경구 조성물에 함유된 본 명세서에서 제공되는 리포솜의 백분율은 리포솜의 특정 성질 및 환자의 필요에 매우 의존적이다.
농도 및 투여량 값은 특정 리포솜 및 완화시킬 증상의 중증도에 따라 달라질 수 있음을 알아야 한다. 임의의 특정 환자에 대해, 특정 투여 용법이 조성물의 투여를 감독하거나, 투여하는 사람의 개별적 필요 및 전문적 판단에 따라, 시간에 따라 조정되어야 함이 추가로 이해되어야 한다.
환자에서 암을 치료하는 방법으로서, 본 명세서에 제공되는 리포솜의 치료적 유효량을 환자에 투여하는 단계; 및 리포솜을 파괴하기 위해 환자에 광을 조사하는 단계를 포함하는 방법이 본 명세서에서 추가로 제공된다.
본 명세서에 제공되는 리포솜은 또한 환자에서 암을 영상화하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본 명세서에 제공되는 리포솜의 유효량을 환자에 투여하는 단계; 리포솜을 파괴하기 위해 환자에 광을 조사하는 단계; 및 환자를 영상화하는 단계를 포함한다.
비제한적인 암은 하기의 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
1) 예를 들어 ER+ 유방암, ER- 유방암, her2- 유방암, her2+ 유방암을 포함하는 유방암, 간질 종양, 예를 들어 섬유선종, 엽상 종양 및 육종, 및 상피 종양, 예를 들어 거대 유관 유두종(large duct papillomas); 침습성 유관 암종, 침습성 소엽 암종, 수질 암종, 콜로이드질(점액) 암종, 세관 암종, 및 침습성 유두상 암종; 및 여러 종류의 악성 신생물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 유관 제자리 암종(파제트병을 포함함) 및 소엽 제자리 암종 및 침습성(침윤성) 암종을 포함하는 제자리(비침습성) 암종을 포함하는 유방의 암종. 유방암의 추가의 예는 에스트로겐 수용체 음성(ER-), 프로게스테론 수용체 음성, 및 her2 음성(her2-)인 루미날 A(luminal A), 루미날 B, 기저 A, 기저 B, 및 삼중 음성 유방암을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 유방암은 고위험 온코타입 지수(Oncotype score)를 가질 수 있다.
2) 예를 들어 육종, 예를 들어, 혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 및 지방육종; 점액종; 횡문근종; 섬유종; 지방종 및 기형종을 포함하는 심장암(Cardiac cancer).
3) 예를 들어, 기관지원성 암종(bronchogenic carcinoma), 예를 들어, 편평 세포, 미분화 소세포, 미분화 거대 세포 및 선암; 폐포 및 세기관지 암종; 기관지 선종(bronchial adenoma); 육종; 림프종; 연골종성 과오종; 및 중피종을 포함하는 폐암.
4) 예를 들어, 식도의 암, 예를 들어, 편평 세포 암종, 선암, 평활근육종, 및 림프종; 위의 암, 예를 들어, 암종, 림프종, 및 평활근육종; 이자의 암, 예를 들어, 유관 선암, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 유암종 종양, 및 비포마(vipoma); 작은 창자의 암, 예를 들어, 선암, 림프종, 유암종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 및 섬유종; 큰 창자의 암, 예를 들어, 선암, 세관 선종, 융모 선종, 과오종, 및 평활근종을 포함하는 소화관암.
5) 예를 들어, 신장의 암, 예를 들어, 선암, 빌름 종양(Wilm's tumor)(신장모세포종), 림프종, 및 백혈병; 방광 및 요도의 암, 예를 들어, 편평 세포 암종, 이행세포 암종, 및 선암; 전립선의 암, 예를 들어, 선암, 및 육종; 고환의 암, 예를 들어, 정상피종, 기형종, 배아 암종, 기형암종, 융모막암종, 육종, 사이 세포 암종, 섬유종, 섬유선종, 유선종성 종양, 및 지방종을 포함하는 비뇨생식관암.
6) 예를 들어, 간세포암, 예를 들어, 간세포 암종; 담관암종; 간모세포종; 혈관육종; 간세포 선종; 및 혈관종을 포함하는 간암.
7) 예를 들어, 골원성 육종(골육종), 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 연골육종, 유잉 육종(Ewing's sarcoma), 악성 림프종(망상 세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거대 세포 종양 척삭종, 골연골종(뼈연골 골종), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액섬유종, 유골골종 및 거대 세포 종양을 포함하는 골암.
8) 예를 들어, 두개골의 암, 예를 들어, 골종, 혈관종, 육아종, 황색종, 및 변형성 골염; 뇌척수막의 암, 예를 들어, 뇌수막종, 뇌척수막육종, 및 신경교종증; 뇌의 암, 예를 들어, 성상세포종, 수모세포종, 신경교종, 상의세포종, 배아세포종(송과체부종양), 다형성 교모세포종, 핍돌기신경교종, 슈반종, 망막모세포종, 및 선천성 종양; 및 척수의 암, 예를 들어, 신경섬유종, 뇌수막종, 신경교종, 및 육종을 포함하는 신경기관 암.
9) 예를 들어, 자궁의 암, 예를 들어, 자궁내막 암종; 자궁경부의 암, 예를 들어, 자궁경부 암종, 및 종양 전 자궁경부 이형성(pre tumor cervical dysplasia); 난소의 암, 예를 들어, 혈청의 낭종암, 점액 낭종암, 미분류 암종, 과립 난포막 세포 종양, 세르톨리 라이디히 세포 종양, 미분화배세포종, 및 악성 기형종을 포함하는 난소 암종; 외음부의 암, 예를 들어, 편평 세포 암종, 상피내 암종, 선암, 섬유육종, 및 흑색종; 질의 암, 예를 들어, 투명 세포 암종, 편평 세포 암종, 포도상구상체 육종, 및 배아형횡문근육종; 및 나팔관의 암, 예를 들어, 암종을 포함하는 부인과 암.
10) 예를 들어, 혈액의 암, 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 질병, 다발성 골수종, 및 골수이형성 증후군, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(악성 림프종) 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 포함하는 혈액암.
11) 예를 들어, 악성 흑색종 및 전이성 흑색종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 카포시 육종, 기태 이형성 모반(moles dysplastic nevi), 지방종, 맥관종, 피부섬유종, 켈로이드, 및 피부경화증을 포함하는 피부암 및 피부 장애.
12) 예를 들어, 신경모세포종을 포함하는 부신암.
암은 전이성이거나, 전이성이 아닐 수 있는 고형 종양일 수 있다. 암은 또한 백혈병에서와 같이, 미만성 조직으로서 발생할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 용어 "종양 세포"는 상기에서 확인된 장애 중 임의의 하나를 앓고 있는 세포를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물 또는 조성물을 사용하여 암을 치료하는 방법은, 예를 들어 화학요법, 방사선 조사 또는 수술(예를 들어, 난소절제술)에 의한 현존하는 암의 치료 방법과 병용될 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물 또는 또는 조성물은 또 다른 항암제 또는 치료 전에, 도중에 또는 그 후에 투여될 수 있다.
치료적 효과는 질병의 하나 이상의 증상을 일정 정도 경감시킨다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료하다", "치료" 또는 "치료하는"은 치료 목적을 위한 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 화합물 또는 약제학적 조성물의 투여를 지칭한다. 용어 "치료적 치료"는 이미 질병을 앓고 있는 환자에 치료를 투여함으로써, 치료적으로 유리한 효과, 예를 들어 존재하는 증상의 호전, 증상의 근본 대사적 원인의 호전, 장애의 추가적 발병의 연기 또는 예방 및/또는 발병될 것이거나, 발병이 예상되는 증상의 중증도의 감소를 야기하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 제공되는 리포솜은 광산화에 불안정하다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 리포솜은 리포솜 내용물의 광촉발성 방출을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[B. Q. Spring, R. B. Sears, L. K. Zheng, Z. Mai, R. Watanabe, M. E. Sherwoord, D. A. Schoenfeld, B. W. Pogue, S. P. Pereira, E. Villa and T. Hasan, Nat. Nanotechnol., 2016, in press]을 참조한다. 본 명세서에 제공되는 리포솜의 광감작제의 활성을 위해, 임의의 적합한 흡수 파장이 사용된다. 이러한 흡수 파장은 세포독성 또는 형광 방사, 예를 들어 발광 다이오드와 같은 백열 또는 형광 광원 또는 포토다이오드를 포함하는 가시광선을 매개하기 위한 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 레이저 광은 또한 국소화된 리포솜으로의 광의 현장 전달에 사용된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 리포솜은 형광 영상화를 사용하여 생체내에서 영상화된다. 예를 들어, 이러한 방법의 사용은 본 명세서에서 제공되는 리포솜으로 표지된 세포 또는 조직의 간편한 실시간 영상화 및 국소화를 허용한다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공되는 리포솜은 복강경 검사 및/또는 현미경 내시경을 사용하여 생체내에서 영상화된다. 예를 들어, 복강경 검사의 사용은 본 명세서에서 제공되는 리포솜으로 표지된 세포 또는 조직의 간편한 실시간 영상화 및 국소화를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 리포솜은 광섬유 현미경 내시경을 사용하여 영상화될 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 리포솜에 대한 다수의 전임상 및 임상적 적용이 구상될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 리포솜은: 1) 암의 조기 발견; 2) (예를 들어, 암세포의 실시간 검출을 허용함으로써) 수술 중 외과의 지원; 및 3) (예를 들어, 치료 전, 도중 및 그 후에 존재하는 암세포를 정량화함으로써) 암 치료의 진행을 모니터링하는 방법을 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 제공되는 리포솜은 수술적 방법, 예를 들어 종양의 절제와 병용하여, 대상체에 투여될 수 있다. 리포솜은 수술 전, 도중 또는 그 후에 개체에 투여될 수 있다. 리포솜은, 종양 제거 후, 예를 들어 잔여의 암세포를 영상화 또는 검출하기 위해, 비경구적으로 투여되거나, 정맥내로 투여되거나, 종양 또는 주변 영역으로 주사될 수 있다. 예를 들어, 리포솜은 종양의 존재를 검출하고, 절제 수술을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜은, 적어도 일부분의(예를 들어, 모든) 이러한 세포가 대상체로부터 제거될 때까지, 잔여의 암세포의 존재를 검출하고, 지속적 수술적 치료를 유도하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 대상체로부터 적어도 일부분의 종양을 제거하기 위한 유도 수술의 방법으로서, 본 명세서에서 제공되는 리포솜을 제공하는 단계; 적어도 일부의 암세포에 리포솜의 존재를 야기하는 단계; 리포솜의 활성(예를 들어, 형광) 후에 영상을 관찰하는 단계; 및 검출된 암세포를 포함하는 적어도 일부분의 종양을 제거하기 위해 대상체에서 수술을 수행하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
시험관내 영상화 방법과 관련하여, 본 명세서에 기재된 리포솜 및 조성물은 다양한 시험관내 분석에 사용될 수 있다. 예시적인 시험관내 영상화 방법은: 샘플, 예를 들어 생물학적 샘플(예를 들어, 세포)과 본 명세서에서 제공되는 하나 이상의 리포솜을 접촉시키는 단계; 샘플 중의 생물학적 표적과 리포솜의 상호작용을 허용하는 단계; 광감작제 또는 영상화제에 의해 흡수 가능한 파장의 광을 샘플에 조사하는 단계를 포함한다.
친수성 형광단의 안정한 앵커링은 콜레스테롤, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE)과 같은 인지질의 포스페이트 헤드 기 또는, 예를 들어 DSPE-PEG2000-NH2와 같은 페길화(PEGylation)된 인지질의 말단부와 형광단의 접합을 통해 달성될 수 있다.
구리 무함유 클릭 화학의 높은 화학선택성은 클릭 화학 반응물(예를 들어, 스트레인된 시클로옥틴 또는 아지드 모이어티)과의 교차 반응성 없이, 리포솜의 표면과 상이한 반응성 객체의 모듈형 접합을 가능하게 한다. 예를 들어, 0.2% DSPE-PEG2000-NH2 및 DIBO-변형된 리소인지질을 함유하는 리포솜은, 심부 조직의 생체내 영상화를 가능하게 하는 안정한 클릭 반응성 리포솜의 패널을 제조하기 위해, DSPE-PEG2000-NH2의 말단 아민과 근적외선 염료의 아민 반응성 NHS-에스테르를 접합시키기 위해 사용되었다. 이러한 염료는 AlexaFluor® 633, AlexaFluor® 647, AlexaFluor® 680, AlexaFluor®700, IRDye® 680RD 및 IRDye® 800CW를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 리포솜은, 형광단 표지, 표적화 모이어티의 접합 또는 선택성에 영향을 주지 않는 것으로, 아민-함유 지질과 아민-반응성 염료의 반응 전에, 막 중에 16:0 LysoPC-BPD(또는, 광역동 요법을 위한 임의의 다른 지질-앵커링된 소수성 광감작제)를 함유할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 리포솜은 또한, 형광단 표지, 표적화 모이어티의 접합 또는 선택성에 영향을 주지 않는 것으로, 아민-함유 지질과 아민-반응성 염료의 반응 전에, 핵 중에 수성 치료제를 함유할 수 있다.
본 명세서에 개시된 리포솜의 투여는 허용되는 임의의 투여 방식을 통해 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜은 비경구적(예를 들어, 정맥내)으로 투여된다.
실시예
재료 및 방법
BPD 광감작제와 인지질 16:0 Lyso PC 및 20:0 Lyso PC의 커플링
벤조포르피린 유도체 광감작제의 카복실레이트를 변형된 합성 프로토콜에 따른 에스테르화를 통해, 인지질 1-팔미토일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린(16:0 Lyso PC) 또는 인지질 1-아라키도일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린(20:0 Lyso PC)의 하이드록실 모이어티과 커플링시켰다. 문헌[J. Lovell, C. Jin, E. Huynh, H. Jin, C. Kim, J. Rubinstein, W. Chan, W. Cao, L. Wang and G. Zheng. Porphysome nanovesicles generated by porphyrin bilayers for use as multimodal biophotonic contrast agents 2011 Nature Materials, 10, 324-332]을 참조한다. 16:0 Lyso PC(99.13 μl, 클로로포름 중 25 mg/ml 원액) 또는 20:0 Lyso PC(110.35 μl, 클로로포름 중 25 mg/ml 원액)를 13 x 100 mm Pyrex® 튜브에 배치하고, 16 게이지 바늘을 통한 질소 가스의 유동을 사용하여, 클로로포름을 증발시켰다. 광감작제 벤조포르피린 유도체 1산 고리 A(BPD, 베르테포르핀, 17.97 mg, 718.79 g/mol)를 건조된 16:0 Lyso PC 또는 20:0 Lyso PC에 첨가하였다. 이어서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC, 38.81 mg, 155.24 g/mol; Sigma-Aldrich), 4-(디메틸아미노)피리딘(DMAP, 15.27 mg, 122.17 g/mol; Sigma-Aldrich), 및 N,N￢-디이소프로필에틸아민(DIPEA, 52.25 μl, 129.24 g/mol, 0.742 g/ml; Sigma-Aldrich)을 BPD 혼합물과 함께 16:0 Lyso PC 또는 20:0 Lyso PC의 건조 혼합물에 첨가하였다. 16:0 Lyso PC/20:0 Lyso PC:BPD:EDC:DMAP:DIPEA의 몰비는 1:5:50:25:300였다. 상기 혼합물을 디클로로메탄(DCM, 5 ml) 중에 용해시키고, 자기 교반 플레이트를 사용하여 실온의 암소에서 24시간 동안 2500회전/분으로 철저하게 교반하였다. 16:0 Lyso PC-BPD 및 20:0 Lyso PC-BPD 지질 접합체를 Analtech Preparative Thin Layer Chromatography Silica Uniplate를 사용하여 정제하고, DCM 중의 10% 메탄올에 의해 용리시켰다. 최대 극성인 16:0 Lyso PC-BPD 또는 20:0 Lyso PC-BPD -함유 실리카 분획(Rf 약 0.144)을 TLC 플레이트로부터 제거하고, 50 ml의 폴리프로필렌 튜브에 배치하였다. 16:0 Lyso PC-BPD 또는 20:0 Lyso PC-BPD를 10분 동안 DCM(30 ml) 중의 33% 메탄올에서 초음파 처리에 의해 실리카 분획으로부터 추출하였다. 실리카를 10분 동안 3,700 xg에서 원심분리함으로써, 앙금이 생기도록 하고, 추출된 16:0 Lyso PC-BPD 또는 20:0 Lyso PC-BPD를 함유하는 상청액을 250 ml의 둥근 바닥 플라스크에 수집하였다. 실리카 분획을 DCM 중의 33% 메탄올에 의해 추가로 2회 세척하고, 모든 16:0 Lyso PC-BPD 또는 20:0 Lyso PC-BPD 용액을 250 ml의 둥근 바닥 플라스크 내로 개별적으로 조합시켰다. 용매 혼합물을 추출된 16:0 Lyso PC-BPD 또는 20:0 Lyso PC-BPD로부터 40℃에서 감압하에, 액체 질소 트랩 응축기(trap condenser)에 연결된 회전 증발에 의해 제거하였다. 이전에 메탄올-DCM 용매 혼합물 중에 용해된 잔여의 실리카를 100% DCM 중에 건조된 16:0 Lyso PC-BPD 또는 20:0 Lyso PC-BPD 추출물을 재용해시킴으로써, 제거하였다. 불용성 실리카 침전물을 폴리프로필렌 주사기의 단부에 부착된 FisherbrandTM 폴리(테트라플루오로에틸렌)(PTFE) 필터(0.22 μm 기공 크기, 13 mm 직경)를 사용하여 여과에 의해 제거하였다. DCM을 여과된 16:0 Lyso PC-BPD 또는 20:0 Lyso PC-BPD 용액으로부터 회전 증발을 사용하여 제거하였다. 이어서, 정제된 접합체를 클로로포름(5 ml) 중에 재용해시키고, -20℃의 암소에 저장하였다. DMSO 중에 인지질 접합체를 희석시키고, 34,895 M- 1.cm-1의 흡광 계수 ε687 nm을 사용하여 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼을 측정함으로써, 16:0 Lyso PC-BPD 또는 20:0 Lyso PC-BPD의 농도를 결정하였다.
리포솜 합성
모든 리포솜 제형을 수화된 지질 필름 과정을 사용하여 제조하였다. 지질 필름을 처음에 13 x 100 mm Pyrex® 튜브에서 모든 지질 및 도펀트(dopant)의 클로로포름 용액으로부터 제조하였다. 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC, 734.04 g/mol), 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(염화염)(DOTAP, 양이온성, 698.54 g/mol) 또는 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(나트륨염)(DOPG, 음이온성, 797.026 g/mol), 콜레스테롤(386.65 g/mol), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염)(DSPE-mPEG2000, 2805.50 g/mol) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[디벤조시클로옥틸(폴리에틸렌 글리콜)-2000](암모늄염)(DSPE-PEG2000-ADIBO, 3077.80 g/mol)으로부터 지질 혼합물을 제조하였다. 모든 전술된 시약들은 Avanti® Polar Lipids, Inc.로부터 구입하였고, 총 34.043 μmol 지질로 제조하였다. DPPC, DOTAP(양이온성)/DOPG(음이온성), 콜레스테롤, DSPE-mPEG2000 및 DSPE-PEG2000-ADIBO를 다른 부분에서 달리 명시되지 않는 한, 각각 58.2 : 7.9 : 28.9 : 4.5 : 0.5의 mol% 비로 혼합하였다. 페길화된 DSPE를 총 5%로 일관되게 유지시켰으며, 아지드-유도체화된 항체와의 구리 무함유 클릭 접합을 매개하는 DSPE-PEG2000-ADIBO의 경우 0.5% 치환되었다. 한 가지 실험에서, 페길화된 DSPE의 mol%는 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 및 0.5%로 다양하였으며, 1:10 비의 DSPE-PEG2000-ADIBO:DSPE-mPEG2000이 유지되었다. 광감작제-인지질 접합체인 16:0 Lyso PC-BPD 또는 20:0 Lyso PC-BPD를 DPPC 200 nmol(0.6 mol%)의 일부분으로 대체하였다. 유리 BPD 소수성 혼입이 필요한 리포솜 제형의 경우, 비접합된 BPD의 클로로포름 용액을 클로로포름 중의 지질 혼합물에 첨가하였다. 모든 지질을 간단하게 와류시키고, 연속 회전에 의해 16 게이지 바늘을 통한 질소 가스의 유동을 사용하여 클로로포름을 증발시킴으로써, 얇은 지질 필름을 형성하였다. 24시간 동안 진공 하에 지질 필름을 저장함으로써, 잔여의 클로로포름을 제거하였다. 1x 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 사용하여, 동결-해동-와류법을 사용함으로써, 건조된 지질 필름을 수화하였다. 1x DPBS(1 ml)를 지질 필름에 첨가하고, Pyrex® 튜브를 Parafilm®에서 단단히 밀봉하여, 랩핑(wrapping)하였다. 수성 광감작제, 예를 들어 클로린 e6 모노에틸렌 디아민 모노아미드(CMA)를 이용한 실험에서, 지질 필름 공극 16:0 Lyso PC-BPD를 CMA 스태킹을 방지하기 위한 부형제로서 1% PEG300 및 400 μM CMA를 함유하는 1 ml의 PBS에 의해 수화시켰다. 이어서, 튜브를 42℃의 암조건의 수조에서 10분 동안 인큐베이션하고, 30초 동안 최대 속도로 와류시킨 후, 빙점조(ice bath)에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이 사이클을 4회 추가로 반복함으로써, 다중 라멜라 소포를 제조하였다. 단분산의 단일 라멜라 리포솜을 제조하기 위해, 다중 라멜라 소포 현탁액(1 ml)을 Avanti® Mini-Extruder 키트를 사용하여 2개의 폴리카보네이트 막(0.1 μm 기공 크기, 19 mm 직경)을 통해 42℃에서 5회 압출하였다. 리포솜을 4℃의 암조건의 용기에 저장하였다. 리포솜을 DMSO 중에 희석시켜, 균질화하고, 34,895 M- 1.cm-1의 흡광 계수 ε687 nm를 사용하여 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼을 측정함으로써, 리포솜 제형 내의 16:0 Lyso PC-BPD의 농도를 결정하였다.
리포솜 내용물의 광촉발성 방출
최적의 DSPE-PEG2000-ADIBO 농도 및 200 nmol의 16:0 Lyso PC-BPD를 함유하거나, 대조군으로서 광감작제를 함유하지 않는 리포솜을 100 mM의 칼세인 디소듐 염을 함유하는 1 ml의 PBS에 의한 수화를 제외하고, 전술된 바와 같이 제조하였다. 리포솜을 전술된 바와 같이, 2개의 폴리카보네이트 막(0.1 μm 기공 크기, 19 mm 직경)을 통해 42℃에서 5회 압출하였다. 비포획된 칼세인 디소듐 염을 Float-A-Lyzer® 투석 튜브(300 kDa 분자량 컷-오프)에서 48시간 동안 4℃에서 1x PBS에 대해 1 ml의 리포솜 분취량의 투석에 의해 제거하였다. 이어서, 리포솜을 Sephadex G-25에 의해 사전에 패킹(packing)된 illustra NAP 컬럼을 통해 구동시킴으로써, 잔여 여분의 리포솜 칼세인 디소듐 염을 제거하였다. 70,000 M- 1.cm-1의 ε492 nm를 사용하여, 칼세인 디소듐 염의 농도를 측정하고, 반응성 분자 종의 소광제(quencher)로서 1x PBS 또는 10 mM의 아지드화나트륨을 함유하는 1x PBS 중에 2 μM로 희석하였다. 690 nm 다이오드 레이저를 사용하여, 플루엔스를 최대 100 J/cm2까지 점진적으로 증가시키면서, 150 mW/cm2의 조사량으로 리포솜에 광을 조사하였다. 리포솜 내용물 중 칼세인 대용물의 방출을 형광 탈소광도(degree of fluorescence dequenching)의 함수로서 측정하였으며, 이는 450 nm 여기 필터, 475 nm 컷-오프 및 500 내지 70 nm에서의 방사 프로파일을 사용하여 플레이트 판독기로 측정하였다.
세툭시맙과의 부위 특이적 단백질 Z 접합
단백질 Z와 세툭시맙의 부위 특이적 접함을 종래에 공개된 프로토콜에 따라 수행하였다. 문헌[J. Hui, S. Tamsen, Y. Song and A. Tsourkas. LASIC: Light Activated Site-Specific Conjugation of Native IgGs, 2015 Bioconjugate Chemistry, 26, 1456-1460]을 참조한다. 생물공학적으로 조작된 단백질 Z 분자는 365 nm UV 광교차-연결을 통한 공유적 교차 연결을 매개하는 IgG 결합 부위 및 비천연 아미노산 벤조일페닐알라닌(BPA)을 함유하였다. 단백질 Z 작제물은 또한 클릭 화학을 위한 아지드 모이어티 및 5-카복시플루오레세인 분자(5-FAM)를 갖는 말단 커스텀 펩티드(custom peptide)를 함유하였다. 세툭시맙의 농도를 자외선-가시광선 분광광도계 및 217,315 M- 1.cm-1의 흡광 계수 ε280 nm(Expasy Protoparam Tools를 사용하여 획득된 정보)를 사용하여 결정하였다. 부위 특이적으로 접합된 단백질 Z 분자에 상응하는 5-FAM의 농도를 자외선-가시광선 분광광도계 및 82,000 M- 1.cm-1의 흡광 계수 ε492 nm를 사용하여 결정하였다. 정제된 아지도 세툭시맙-단백질 Z를 리포솜과의 클릭 접합을 위해 필요해질 때까지, 4℃의 암소에 저장하였다.
항체에 대한 확률적 아지도 변형 및 표적화 모이어티
아지도 모이어티를 항체의 라이신 잔기와 N-하이드록시숙신이미딜 아지도 폴리(에틸렌 글리콜)4(NHS-PEG4-아지드, 388.37 g/mol)의 확률적 접합을 통해, 세툭시맙으로 확률적으로 도입시켰다. 동시에, 세툭시맙을 Alexa Fluor® 488(AF488-NHS, 643.4 g/mol)의 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르에 확률적으로 접합시켰다. 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO) 중의 NHS-PEG4-아지드(10 mg/ml) 및 AF488-NHS(1 mg/ml)의 원액 용액 둘 모두를, 항체 용액을 첨가하기 전에, 세툭시맙보다 각 분자의 2.5배 몰 과량에 상응하는 양으로 혼합하였다. 이어서, 세툭시맙(1x DPBS 중 2 mg/ml, 145781.6 g/mol(FASTA 서열 분석), Erbitux®; Bristol-Myers Squibb)을 NHS-PEG4-아지드 및 AF488-NHS 혼합물에 첨가하고, 4℃의 암소에서 24시간 동안 궤도 회전에 의해 혼합하였다. 반응하지 않은 NHS-PEG4-아지드 및 AF488-NHS를 Sephadex G-25에 의해 사전에 패킹된 illustra NAP 컬럼에 의해 접합된 세툭시맙으로부터 제거하고, 1x DPBS로 평형화하였다. AF488 및 PEG4-아지드(AF488-Cet-PEG4-아지드)에 접합된 정제된 세툭시맙을 수집하고, 4℃에서 20분 동안 2,500 xg에서 30 kDa 한외여과 튜브에서 원심분리하여 농축시켰다. 세툭시맙의 농도를 자외선-가시광선 분광광도계 및 217,315 M- 1.cm-1의 흡광 계수 ε280 nm(Expasy Protoparam Tools를 사용하여 획득된 정보)를 사용하여 결정하였다. AF488-Cet-PEG4-아지드 작제물에 접합된 Alexa Fluor® 488의 농도를 자외선-가시광선 분광광도계 및 71,000 M- 1.cm-1의 흡광 계수 ε494 nm를 사용하여 결정하였다. 정제된 AF488-Cet-PEG4-아지드를 리포솜과의 클릭 접합을 위해 필요해질 때까지, 4℃의 암소에 저장하였다. 항-HER-2 항체, 트라스투주맙 및 트랜스페린 수용체에 대한 천연 리간드인 트랜스페린에 대해 동일한 접근법을 실시하였다. 모든 확률적 아지도 리간드를 리포솜과의 클릭 접합을 위해 필요해질 때까지, 4℃의 암소에 저장하였다.
리포솜에의 구리 무함유 클릭 접합
모든 리포솜을, 표적화 모이어티에 대해 아지도 작용성을 갖는 리포솜 표면 ADIBO의 구리 무함유 클릭 접합에 의해, 세툭시맙과 부위 특이적으로 접합시키거나, 세툭시맙, 트라스투주맙과 확률적으로 접합시켰다. 리포솜과 표적화 모이어티 사이의 클릭 접합을 실온에서 밤새 수행하였다. 과량의 표적화 모이어티를 크기 배제 Sepharose CL-4B 겔 여과 크로마토그래피에 의해 클릭 접합된 리포솜으로부터 제거하고, 전반적인 물리적 및 분광학적 특성화 후, 4℃의 암소에 저장하였다.
동적 광산란 및 ζ 전위 특성화
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.)를 사용하여, 각 변형 후의 모든 리포솜의 Z 평균 직경, 다분산 지수 및 ζ 전위를 측정하였다. z-평균 직경 및 다분산 지수를 동시에 측정하기 위해, 2 μl의 리포솜을 4 ml 폴리스티렌 4x 광학 큐벳에 배치하고, 1 ml의 1 x DPBS를 리포솜에 첨가하였다. 각 샘플에 대해 3회의 개별 측정을 수행하기 전에, 120초 동안 온도 평형을 수행하였다. ζ 전위 측정을 Folded Zeta Capillary Cell을 사용하여 수행하였다. 10 μl의 리포솜을 1 ml의 3 mM NaCl로 희석하고, 세포에 로딩하였으며, 각각의 샘플에 대해 3회의 개별 측정을 수행하였다.
세포 결합의 선택성을 위한 유동세포계측법
모든 유동세포계측법 분석은 동일한 절차에 따라, BD FACSAria를 사용하여 수행되었다. 간단히 말하면, 75% 컨플루언트 단층 세포 배양물을 1 x PBS(5 ml)에서 1회 세척하고, 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 5 mM 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA)을 함유하는 1 x PBS에서 1회 세척하고, 37℃에서 빈번하게 교반하면서, 새로운 EDTA 및 EGTA-함유 1x PBS(5 ml)에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 트립신 무함유 세포 현탁액을 분당 1000 회전으로 5분 동안 원심분리하고, EDTA 및 EGTA 함유 1x PBS를 흡인하고, 세포를 각각의 배양 배지에 재분산시키고, Coulter 계수기를 사용하여 계수하였다. 각각의 조건에 대해, 50,000개의 세포를 1.5 ml의 개별 원심분리 튜브에 배치하고, 5분 동안 1000 xg에서 원심분리함으로써, 세포를 펠릿화하였다. 배지를 흡인하고, 세포 펠릿을 각각의 농도에서 시험되는 리포솜 제형을 포함하는 100 μl의 각각의 배양 배지에 재분산시켰다. 30분, 90분 또는 180분의 시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 세포를 1000 xg에서 5분 동안 원심분리함으로써, 세포를 펠릿화하고, 배지를 흡인하고, 세포 펠릿을 200 μl의 냉각 PBS 중에 재분산시켰다. BD FACSAria 세포계측 분석을 수행할 때까지, 세포를 얼음에 저장하였다. 세포로부터의 BPD 형광 방사를 405 nm 레이저로부터의 여기를 사용하여 검출하고, 세포로부터의 5-카복시플루오레세인(5-FAM) 및 AlexaFluor® 488 방사를 488 nm 레이저로부터의 여기를 사용하여 달성하고, 세포로부터의 리사민 로다민 B 방사를 488 nm 레이저로부터의 여기를 사용하여 달성하였다. 경쟁적 블로킹 분석(Competitive blocking assay)을 세포와의 리포솜 인큐베이션 동안 1 mg/ml의 최종 농도의 유리 세툭시맙을 사용하여 수행하였다.
투과 전자 현미경
200 nmol 16:0 Lyso PC-BPD 또는 0.1% DPPE-리사민 로다민 B를 함유하는 ADIBO-변형된 리포솜을 전술된 바와 같이 제조하였다. 두 리포솜 모두를 세툭시맙-단백질 Z와 부위 특이적으로 클릭 접합시키고, Sepharose CL-4B 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 30 kD 분자량 컷-오프 4 ml 셀룰로스 한외여과 튜브를 사용한 한외여과 원심분리를 사용하여, 실온에서 30분 동안 3000xg에서 원심분리하여 농축시켰다. 10 μl의 농축된 리포솜을 구리 메쉬 탄소 피복 그리드(copper mesh carbon coated grid) 상에 1분 동안 로딩한 후, 포스포텅스텐산으로 10초 동안 염색하였다. 샘플을 밤새 건조시킨 후, Philips CM10 투과 전자 현미경(TEM)을 사용하여 가속 전압 80kV 및 배율 46,000x로 영상화하였다.
공초점 현미경
OVCAR-5(고 EGFR) 세포를 웰당 2000개의 세포의 밀도로 혈청 함유 RPMI 배지에서 48시간 동안 유리 바닥 96 웰 플레이트 상에 시딩(seeding)하였다. 배지를 확률적으로 접합되거나, 비접합된 리포솜의 100 nM 16:0 Lyso PC-BPD 당량과 함께 새로운 혈청 함유 RPMI 배지로 대체하였다. 세포를 A Leica TCS NT 공초점 현미경을 사용하여 인큐베이션한 후, 1시간, 6시간 및 24시간째에 공초점 형광 현미경을 사용하여 영상화하였다.
세포 흡수 연구
관심대상 세포를 웰당 100,000개의 세포의 밀도로 각각의 혈청 함유 배지에서 24시간 동안 96 웰 플레이트에 시딩하였다. 배지를 상이한 전하의 요망되는 리포솜을 함유하는 새로운 배지로 대체하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 필요한 시점에서, 리포솜을 함유하는 배지를 흡인하고, 세포를 100 μl의 1x PBS로 3회 세척한 후, Solvable® 조직 분해 용액으로 용해시켰다. 25 μl 분취량을 채취하고, 이를 사용하여, 비색법 BCA® 분석을 사용하여, 각 웰의 세포 단백질 농도를 정량화하였다. 잔여의 세포 분해물을 사용하여, 형광을 사용하여 내재화된 Lyso PC-BPD 농도를 정량화하고, 최종적으로 유도된 단백질 농도로 정규화하였다.
시험관내 표적화된 광독성
200 nmol의 16:0 Lyso PC-BPD 및 최적량의 DSPE-PEG2000-ADIBO를 포함하는 음이온성 리포솜을 전술된 바와 같이 합성하고, 리포솜당 114개의 부위 특이적 세툭시맙-단백질 Z 분자 또는 리포솜당 11개의 확률적 세툭시맙 분자에 클릭 접합시켰다. 비접합 항체를 Sepharose CL-4B 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, Thermo Fisher 자외선-가시광선 분광광도계를 사용하여, 16:0 Lyso PC-BPD의 농도를 결정하였다. 모든 리포솜은 사용하기 전에 4℃의 암소에 저장하였다.
A431 인간 표피 암종 세포(고 EGFR) 및 야생형 중국 햄스터 난소 세포 (CHO-WT, EGFR 결손(null))를 바닥이 투명하고, 벽면이 흑색인 96 웰 플레이트 상에 혈청 함유 E-MEM 배지(A431 세포)에 웰당 3000개의 세포의 밀도로 시딩하고, 혈청 함유 F12K 배지(CHO-WT)에 웰당 2500개의 세포의 밀도로 시딩하였다. 시딩 24시간 후, 웰 플레이트 내의 배지를, 세툭시맙에 부위 특이적 또는 확률적으로 클릭 접합된 리포솜의 요망되는 농도를 함유하는 새로운 배지로 교체하고, 3시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 리포솜을 함유하는 배지를 새로운 배지로 교체하고, 690 nm 다이오드 레이저에 의해 150 mW/cm2의 조사량 및 40 J/cm2의 플루엔스에서 세포를 조사하였다. 조사 24시간 후, 배지를 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 함유하는 새로운 배지로 교체하고, 세포를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 배지를 제거하고, 세포 및 포르마잔 MTT 산물을 DMSO로 용해시키고, 플레이트 판독기를 사용하여 576 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율을 대사 활성의 함수로서 도시하고, 처리되지 않은 대조군 세포에 대해 정규화하였다.
리포솜 플랫폼의 모듈형 근적외선 염료 표지
음이온성 지질 필름을 광감작성 16:0 Lyso PC-BPD 접합체의 부재 하에 4.3% DSPE-mPEG2000, 0.5% DSPE-PEG2000-ADIBO 및 0.2% DSPE-PEG2000-NH2에 의해, 전술된 바와 같이 제조하였다. 지질 필름을 전술된 바와 같이, 1xPBS에서 수화시키고, 2개의 100nm 폴리카보네이트 막을 통해 압출시켰다. 근적외선 염료를 아미노 말단 DSPE-PEG2000-NH2에 직접 접합시키기 위해, 염료 AlexaFluor® 633, AlexaFluor® 647, AlexaFluor® 680, AlexaFluor®700, IRDye® 680RD 및 IRDye® 800CW의 N-하이드록시숙신이미딜(NHS) 에스테르의 DMSO 용액(10 mg/ml)을 표면-접근성 아미노 인지질보다 5배 몰 과량으로 리포솜과 반응시켰다. 간단히 말하면, 1 ml의 리포솜 제형 중의 표면-접근성 DSPE-PEG2000-NH2 모이어티 0.034 μmol을 5배 몰 과량(0.171 μmol)의 염료 NHS 에스테르와 반응시켰다. 리포솜 염료 혼합물을 실온에서 24시간 동안 자기 교반기를 사용하여 분당 2500 회전으로 교반한 후, 4℃에서 48시간 동안 1x PBS에 대해 투석하였다. 마지막으로, 리포솜을 실온에서 24시간 동안 표면 DSPE-PEG2000-ADIBO 모이어티를 통해, 리포솜당 50개의 확률적 아지도 세툭시맙 분자 또는 리포솜당 50개의 아지도 IgG 분자에 클릭 접합시켰다. 비접합된 항체를 Sepharose CL-4B 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, Thermo Fisher 자외선-가시광선 분광광도계를 사용하여, 리포솜에 접합된 근적외선 염료의 농도를 결정하였다. 모든 리포솜을 4℃의 암소에 저장하였다.
생체내 동적 이중 추적 영상화
IRDye®680RD 또는 IRDye®800CW에 의해 모듈형으로 표지된 ADIBO-변형된 리포솜을 각각 리포솜당 50개의 세툭시맙 분자 또는 리포솜당 50개의 IgG 분자에 확률적으로 클릭 접합시켰다. Sepharose CL-4B 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제한 후, IRDye®680RD 또는 IRDye®800CW의 농도를 Thermo Fisher 자외선-가시광선 분광광도계를 사용하여 결정하였다. 암컷 Swiss 누드 마우스(6주령)의 좌측 옆구리 하부에 성장 인자 감소 마트리겔(Matrigel)에 1x106개의 U251 인간 교모세포종 세포(고 EGFR)를 피하로 이식하고, 2주 동안 성장을 허용하였다. 마우스에 리포솜 접합체당 0.1 nmol 염료 당량의 양으로, 세툭시맙 표적화된 IRDye®680RD 리포솜 및 IgG 비표적화된 IRDye®800CW 리포솜의 혼합물로 공동 주사하였다. 상대적 종양 형광 강도를 Pearl® Impulse Small Animal Imaging System을 사용하여 표적화된 IRDye®680RD 리포솜 및 IgG 비표적화된 IRDye®800CW 대조군 리포솜 둘 모두에 대해 동적으로 그리고 종단적으로 모니터링하였다. 종양을 이중 추적 나노플랫폼의 공동 투여 후 최대 120시간까지 영상화하였다.
표적화된 광감작성 리포솜 플랫폼의 생체분포
6주령의 암컷 Swiss 누드 마우스의 우측 옆구리 하부에 성장 인자 감소 마트리겔에 1x106개의 A431 인간 표피 암종 세포(고 EGFR)를 피하 이식하고, 세포를 2주 동안 성장을 허용하였다. 이어서, 마우스에 (1) 리포솜당 10개의 확률적 세툭시맙 분자에 클릭 접합되거나, (2) 비접합된 16:0 Lyso PC-BPD 리포솜의 0.25 mg/kg BPD 당량을 주사하였다. 정맥내 투여 24시간 후, 동물을 희생시키고, IVIS® Lumina III 생체내 전임상 영상화 스테이션을 사용하여 장기를 영상화하였다. 16:0 Lyso PC-BPD 리포솜의 형광 강도를 Living Image® 소프트웨어를 사용하여 분석하여, 정량화하고, 조직 선택성을 정량화하기 위해, 종양에서의 강도를 장기에서의 각각의 강도에 대해 정규화하였다.
최적화 연구
16:0 Lyso PC 지질- 앵커링된 벤조포르피린 유도체 광감작제 (16:0 Lyso PC-BPD)
광감작제가 리포솜에 안정적으로 고정되지 않아, 감소된 선택성이 야기되는 경우, 나노리포솜 담체의 막으로부터 광감작제 또는 형광단이 누출되는 것이 관찰되었다. 소수성 형광단 또는 광감작제의 막으로의 안정한 앵커링은 형광단 또는 광감작제와 리소인지질의 접합에 의해 달성될 수 있다.
16:0 Lyso PC 및 20:0 Lyso PC의 벤조포르피린 유도체(BPD) 접합체를 합성하고, 아지도-변형된 표적화 리간드의 클릭 접합을 위해 완전히 최적화된 표면을 갖는 인지질 이중충으로 포매된 16:0 Lyso PC-BPD 및 20:0 Lyso PC-BPD 접합체에 의해 안정한 리포솜을 형성시켰다. 리포솜으로부터의 비특이적 BPD 누출을 평가하기 위해, OVCAR-5 세포 현탁액(50,000 세포/조건)을 (1) 비접합된 BPD, (2) 16:0 Lyso PC-BPD, 및 (3) 20:0 Lyso PC-BPD 접합체에 의해 제형화된 리포솜의 BPD 당량의 다양한 농도로 30분 동안 인큐베이션한 후, 유동세포계측법에 의해 BPD 흡수를 분석하였다. 도 1은 (1) 지질 이중 층에 포매된 BPD를 갖는 리포솜, (2) 16:0 Lyso PC-BPD에 접합된 BPD를 갖는 리포솜, 및 (3) 20:0 Lyso PC-BPD에 접합된 BPD를 갖는 리포솜에 대한 OVCAR-5 세포에서 리포솜 제형에서의 중앙값 BPD 형광 강도 대 BPD의 농도를 도시한다. 비-Lyso PC 접합된 BPD는 BPD 당량의 농도가 증가함에 따라, 중앙값 형광 강도의 증가를 나타내었으며, 이는 세포로의 BPD의 비특이적 누출을 시사한다. Lyso PC-접합된 BPD 함유 리소좀은 이러한 누출을 나타내지 않았으며, 이는 16:0 Lyso PC-BPD 및 20:0 Lyso PC-BPD에 의해 형성된 안정한 리포솜이, 이중 층에의 소수성 BPD 포집에 의해 관찰되는 세포로의 광감작제의 모든 비특이적 누출을 블로킹한다는 것을 입증한다.
클릭 화학을 위한 최적화된 표면 작용화
리포솜의 표면이 강하게 소수성 스트레인된 시클로옥틴 모이어티, 예를 들어 디벤조시클로옥틴(DIBO)에 의해 유도체화된 경우, 구리 무함유 클릭 화학이 가능하다.
페길화
도 2는 인지질 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-mPEG2000)의 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 및 0.5%의 혼입에 의해 입체적으로 안정화된 16:0 Lyso PC-BPD를 함유하는 리포솜에 대한 Z-평균 직경 및 다분산 지수를 도시한다. 스트레인된 시클로옥틴(ADIBO)-접합된 지질 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[디벤조시클로옥틸(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG2000-ADIBO)을 통한 클릭 화학 작용성에서, DSPE-PEG2000-ADIBO:DSPE-mPEG2000의 1:10 몰비가 도입되어, 유지되는 경우, 리포솜은 안정하게 남아 있었다. DSPE-mPEG2000을 사용한 DSPE-PEG2000-ADIBO의 소수성의 9배 몰의 역-안정화(counter-stabilization)는 전체 리포솜 안정성을 지원하는 것으로 여겨진다. ADIBO의 N-하이드록시숙신이미딜(NHS) 에스테르는 인지질 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌 글리콜)-2000](DSPE-PEG-NH2)와 커플링되었다. DSPE-PEG-NH2는 리포솜 내로 혼입되었으며, DSPE-mPEG2000의 9배 몰 양만큼 역-안정화되었다. 표적화 리간드와 안정한 ADIBO-작용화된 리포솜의 구리 무함유 클릭 접합을 또한 수행하였다. 도 26은 16:0 Lyso PC-BPD 광감작제를 포함하는 리포솜의 구조적 도식을 도시한 것으로, PEG 사슬을 함께 보여준다. 예시적 제형은 57.6% DPPC, 7.9% DOPG, 28.9% 콜레스테롤, 4.5% DSPE-mPEG2000, 0.5% DSPE-mPEG2000-ADIBO, 및 0.6% 16:0 Lyso PC-BPD를 포함한다.
정전학
음이온성 및 양이온성 전하를 7.9% 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP, 양이온성) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG, 음이온성)의 혼입을 통해, 벤조포르피린 유도체 광감작제를 함유하는 리포솜 내로 도입시켰다. 도 3a 내지 도 3c는 각각, DOTAP, DOPG를 함유하거나, 전하가 첨가되지 않은 ADIBO-변형된 16:0 Lyso PC-BPD-함유 리포솜에 대한 ζ-전위, Z 평균 직경, 및 다분산 지수(PDI)를 도시한다. 음이온성 또는 양이온성 전하가 ADIBO-변형된 16:0 Lyso PC-BPD-함유 리포솜의 추가의 정전식 안정화를 제공한다는 것이 밝혀졌다. 도 3c에 도시된 하전된 리포솜 대 중성 리포솜의 상대적 다분산 지수는 하전된 지질이 도입되지 않은 경우, 리포솜이 응집되어, 침전된다는 것을 시사한다. 도 4는 OVCAR-5 세포, A431 세포 및 T47D 세포에서 비표적화된 DOTAP- 및 DOPG-함유 리포솜에 대한 세포 흡수(pmol 16:0 Lyso PC-BPD/μg 세포 단백질)의 정량화를 도시한다. 음이온성 전하의 지질 DOPG가 리포솜 내로 혼입된 경우, ADIBO-변형된 16:0 Lyso PC-BPD-함유 리포솜의 비특이적 흡수는 세포주들 간에 더 균일해지는 것으로 밝혀졌다. 균일한 비특이적 흡수 프로파일은 정확한 세포 표적화를 도모한다.
광촉발성 방출
칼세인을 형광단(100 mM)의 자체 소광을 위해 충분한 고농도로 리포솜 내에 로딩하였다. 리포솜 제형은 막에 16:0 Lyso PC-BPD를 갖거나, 대조군으로서 광감작제를 갖지 않는다. 리포솜 형성 후, 모든 리포솜 외부의 칼세인 형광단을 투석 및 겔 여과에 의해 정제하고, 리포솜을 96 웰 플레이트에 배치하였다. 리포솜에 690 nm의 광을 조사함으로써, 리포솜 내부의 칼세인을 방출시켰으며, 이는 방출 시 탈소광된다. 방출 후, 칼세인의 탈소광(및, 형광의 증가)을 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였으며, 조사 전에 대조군으로 정규화하였다. 도 5는 690 nm의 광을 이용한 (1) Lyso PC-BPD를 갖는 리포솜(최상단 플롯), (2) Lyso PC-BPD 및 아지드를 갖는 리포솜(중간 플롯), 및 (3) Lyso PC-PBD를 갖지 않는 리포솜(최하단 플롯)의 방출 배수 대 플루엔스(광 투사량)를 도시한다. 리포솜 포획 요법제의 대용물인 형광단 칼세인 디소듐 염의 소광 농도는 표면 DSPE-PEG-ADIBO 및 막 내에 16:0 Lyso PC-BPD를 함유하는 리포솜의 조사 시 방출되었다. 막 내에 16:0 Lyso PC-BPD를 갖는 경우에는 방출이 나타나지 않으며, 10 mM 아지드화나트륨이 존재하는 경우에는 방출이 억제된다. 이는 ADIBO-변형된 16:0 Lyso PC-BPD-함유 리포솜이 광산화 및 리포솜 내용물의 광촉발성 방출에 불안정하다는 것을 보여주는 것으로 생각된다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 이는 아지드화나트륨의 존재하에 광촉발성 방출의 억제율이, 이 방법이 광화학적이며, 반응성 분자 종에 의존적임을 시사하는 것으로 생각된다.
표적화 리간드와 리포솜의 구리 무함유 클릭 접합
항체의 아지도 변형
스트레인된 시클로옥틴에 의해 사전에 변형된 리포솜 표면과 표적화 모이어티의 구리 무함유 클릭 접합에서, 표적화 모이어티는 아지도 기에 부속되어 있다. 광감작제 및/또는 영상화제를 함유하는 최적화된 리포솜 플랫폼과의 IgG 클릭 접합에 대한 원리 증명으로서, 세툭시맙(항-EGFR 항체, Erbitux®)의 부위 특이적 또는 확률적 아지드 변형을 수행하였다. 세툭시맙으로의 아지드 모이어티의 부위 특이적 도입을 IgG 분자의 Fc 부분과만 결합하는 생물공학적으로 조작된 단백질 Z 분자를 사용하여 수행하였다(문헌[Hui, J.Z. , Al Zaki, A. , Cheng , Z., Popik, V., Zhang, H., Prak, E.T.L and Tsourkas, A. Facile Method for the Site-Specific, Covalent Attachment of Full-Length IgG onto Nanoparticles (2014) Small 10(16):3354-63. doi: 10.1002/smll.201303629]). 도 6a는 구리 무함유 클릭 화학을 통해 세툭시맙-단백질 Z에 결합된 리포솜 표면의 도식적 대표도이다. 단백질 Z는 임의의 IgG 분자(예를 들어, 세툭시맙)의 Fc 영역에 부위 특이적으로 결합하며, 비천연 벤조일페닐알라닌 아미노산을 통해 광교차-연결된다. 펩티드-결합 단백질 Z 상의 말단 아지드는 최적의 표면 몰비의 DSPE-PEG2000-ADIBO, 스트레인된-시클로옥틴 유도체화된 인지질에 클릭 접합된다. 도 6b는 구리 무함유 클릭 화학을 통해 아지도-세툭시맙 Z에 결합된 리포솜 표면의 도식적 대표도이다. 표적화 단백질(예를 들어, 세툭시맙)에 확률적으로 부착된 PEG4 분자 상의 말단 아지드는 최적의 몰비의 DSPE-PEG2000-ADIBO, 스트레인된-시클로옥틴 유도체화된 인지질과 클릭 접합된다.
도 7a 및 도 7b는 각각 부위 특이적 아지드 접합체의 자외선-가시광선 스펙트럼 및 구조적 도식을 도시한다. 세툭시맙으로의 아지드 모이어티의 확률적 도입은 PEG4-아지드의 N-하이드록시숙신이미딜 에스테르를 사용하여 달성하였다. 단일 형광단(부위 특이적 세툭시맙의 경우, 5-FAM 및 확률적 세툭시맙의 경우 AlexaFluor® 488)을 각각의 항체 접합체 내로 도입시켰다. 단백질 Z 대 세툭시맙의 비는 1.13 ± 0.17이다. 도 8a 및 도 8b는 각각 AlexaFluor® 488을 혼입시키는 확률적 아지드 접합체의 자외선-가시광선 스펙트럼 및 그의 구조적 도식을 도시한다. AlexaFluor® 488 대 세툭시맙의 비는 1.00 ± 0.04이다.
클릭 접합
아지도 변형된 세툭시맙과 ADIBO-변형된 16:0 Lyso PC-BPD-함유 음이온성 리포솜의 부위 특이적 및 확률적 구리 무함유 클릭 접합을 접합된 항체의 다양한 표면 밀도로 수행하였다. 동적 광 산란을 사용하여, 크기 및 분산 데이터를 수집하였다. 도 9는 부위 특이적 접합(도 9a) 및 확률적 접합(도 9b)에 대한 리포솜 크기(각 도면의 최상단 플롯) 및 다분산 지수(각 도면의 하부 플롯)의 비교를 도시한다. 도 9a 및 도 9b에 따르면, 부위 특이적 및 확률적 접합 둘 모두는 안정한 리포솜을 생성시킨다. 도 10은 80kV의 가속 전압 및 46,000x의 배율에서 영상화된 세툭시맙-단백질 Z에 부위 특이적으로 클릭 접합된 리포솜의 투과 전자 현미경(TEM) 영상을 도시한다. 도 11은 부위 특이적 접합(좌측 최상단 플롯) 및 확률적 접합(좌측 하부 플롯)에 대한 ζ-전위 대 접합 효율의 비교를 도시한다. 도 12는 부위 특이적 접합(최상단 플롯) 및 확률적 접합(하부 플롯)에 대한 리포솜당 접합된 세툭시맙의 수 대 접합 효율의 비교를 도시한다. 적어도 도 12에 도시된 데이터를 기반으로 하여, 세툭시맙과 리포솜의 부위 특이적으로 클릭 접합이 리포솜과의 확률적 클릭 접합보다 유의하게 더 효율적이라고 생각된다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 확률적 접합에서 관찰된 더 낮은 효율은 DIBO 모이어티에 대한 일부 아지드 기의 더 낮은 접근성의 결과이며, 이는 항체의 임의의 부분에 대한 아지드의 무작위 도입의 결과일 수 있다고 생각된다.
A431 세포에서 세툭시맙에 결합된 5-FAM 단백질 Z 및 BPD의 중앙값 형광 강도 사이의 상관관계는 도 30a(고 EGFR)에 도시되어 있으며, T47D 세포의 경우는 도 30b(저 EGFR)에 도시되어 있다. 높은 상관 계수는 리포솜에 클릭 접합된 세툭시맙의 완전성을 나타낸다.
시험관내 결합 및 광독성의 선택성
제조된 모든 밀도에서 부위 특이적 또는 확률적 세툭시맙 접합으로부터 제조된 표적화된 리포솜의 EGFR 선택성을 리포솜-세포 결합에 대한 마커로서 BPD 형광을 사용한 유동세포계측기를 사용하여 평가하였다. 도 13은 A431 세포(고 EGFR; 최상단 플롯), T47D 세포(저 EGFR; 중간 플롯) 및 CHO-WT 세포(EGFR 없음; 하부 플롯)에서의 결합 선택성의 비교를 도시한다. 도 14는 A431 세포(고 EGFR; 최상단 플롯), T47D 세포(저 EGFR; 중간 플롯) 및 CHO-WT 세포(EGFR 없음; 하부 플롯)에서의 AlexaFluor® 488을 갖는 리포솜-세툭시맙 접합체의 결합 선택성의 비교를 도시한다. 도 13 및 14에서, A431 세포에서 리포솜당 세툭시맙의 수가 증가함에 따라, 선택성은 증가하며, T47D 및 CHO-WT 세포에서는 변화가 거의 나타나지 않는다. 도 14는 확률적 방법의 접합의 선택성이 부위 특이적 방법보다 세포 결합에 더 효율적이라는 것을 보여준다.
유동세포계측 데이터는 도 28에 도시되어 있으며, 리포솜당 v0, 10, 50 또는 100의 세툭시맙-단백질 Z 접합체(Cet-Pz)와 반응한 리포솜으로부터의 중앙값 광감작제(BPD) 강도를 도시한다. 리포솜을 표적화된 리포솜의 250 nM 또는 500 nM BPD 당량으로 A431(고 EGFR) 또는 T47D(저 EGFR) 세포와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 리포솜당 100 Cet-Pz의 더 많은 반응이 리포솜당 50 Cet-Pz와 반응하는 리포솜에 대한 표적화된 세포 결합에 유의한 이점을 제공하지 않는다는 것은 분명하다.
도 31a 및 31b는 유동세포계측 데이터를 도시하며, 여기서, 중앙값 BPD 강도는 개별적으로 측정된 50,000개의 세포의 평균이다. 세포를 50의 세툭시맙/리포솜(도 31a)에 클릭 접합된 리포솜 대 비-접합된 리포솜(도 31b)으로 30분, 90분 또는 180분 동안 인큐베이션하였다. 데이터는, 모두 3개의 시점에서, 표적화된 리포솜이 비표적화된 당량과 비교하여, OVCAR-5 세포(고 EGFR을 발현함)와의 우선적 결합을 나타낸다는 것을 보여준다. 리포솜의 선택성(도 31c)은 표적화된 리포솜으로 인큐베이션된 세포의 중앙값 BPD 강도를 비특이적 리포솜으로 인큐베이션된 세포의 중앙값 BPD 강도로 나눈 대표값이다.
표적화된 리포솜과 OVCAR-5 세포의 결합의 세툭시맙 의존성은 세포 표면 EGFR과 표적화된 리포솜의 상호작용을 블로킹하는 1 mg/ml의 유리 세툭시맙에 의한 인큐베이션에 의해 입증되었다. 도 15는 표적화된 리포솜 및 비특이적 리포솜뿐만 아니라, EGFR이 블로킹된 경우의 표적화된 리포솜 및 비특이적 리포솜에 대한 유동세포계측 데이터를 도시한다. 3개의 시점(180분, 90분 및 30분) 모두에서, 유리 세툭시맙의 존재는 표적화된 리포솜과 OVCAR-5 세포의 결합을 완전히 블로킹하였으며, 이는 세포에 대한 표적화된 16:0 Lyso PC-BPD 리포솜 결합으로부터 야기되는 중앙값 BPD 방사 신호의 감소에 의해 설명되는 바와 같다.
광독성의 선택성을 690 nm 레이저 조사를 사용하여, CHO-WT 세포(EGFR 없음) 및 A431 세포(고 EGFR)에서 비교하였다. 도 16은 세툭시맙에 부위 특이적으로 접합된 16:0 Lyso PC-BPD 리포솜 및 확률적으로 접합된 것을 사용한 선택적 광역동 요법 후의 세포 생존율을 도시한다. 조사되지 않은 경우, 표적화된 리포솜에 의한 인큐베이션은 A431 세포 또는 CHO-WT 세포의 생존율에 대해 영향을 주지 않는다. 표적화된 리포솜은 CHO-WT 세포에서 미미한 수준의 광독성을 유도하였고, A431 생존율은 대략 50%로 감소되었으며, 이는 선택적 암 요법을 매개하는 표적화된 리포솜 플랫폼의 능력을 강조하는 것이다. 생존율을 나타내는 대사 활성을 MTT 비색 분석을 사용하여, PDT 치료 24시간 후에 평가하였다(*=P≤0.05, **=P≤0.01, ***=P≤0.001).
도 32는 20J/cm2의 690 nm 레이저 광에 의한 PDT 치료 후 A431 및 OVCAR-5 세포(고 EGFR) 및 T47D 세포(저 EGFR)의 MTT 분석의 결과를 도시한다. 확률적으로 표적화된 리포솜을 세포와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 생존율을 나타내는 대사 활성을 MTS 비색 분석을 사용하여, PDT 치료 24시간 후에 평가하였다(*=P≤0.05, **=P≤0.01, ***=P≤0.001). T47D 세포의 세포 생존율은 모든 BPD 농도에서 가장 높았으며, 세포 생존율은 BPD 농도가 증가함에 따라 더 낮았다.
NHS-PEG4-N3은 또한 임의의 일차 아민-함유 표적화 리간드에 확률적으로 접합될 수 있으며, 동일한 광감작성 나노작제물에 클릭 접합될 수 있다. 이는 세툭시맙(항-EGFR 항체), 트라스투주맙(항-HER-2 항체) 및 인간 트랜스페린(트랜스페린 수용체에 대한 천연 리간드)의 접합에 의해 입증되었다. 선택성 배수를 유동세포계측법을 사용하여 얻었으며, 이는 표적 수용체를 과발현하는 세포의 중앙값 BPD 형광을 표적 수용체를 거의 또는 전혀 발현하지 않는 세포의 중앙값 BPD 신호로 나눈 대표값이다(도 17). 적색 선은, 비표적 세포에 비해, 표적 세포와 표적화된 리포솜의 우세한 결합이 존재하지 않는 1배 선택성을 나타낸다. A431 세포는 EGFR 수용체를 과발현하는 인간 표피 암종 세포이고, SKOV-3 세포는 HER-2 수용체를 과발현하는 난소 암종 세포이고, T47D 세포는 트랜스페린 수용체를 과발현하는 유방 흉막삼출 암종 세포이며, CHO 세포는 비-암성 중국 햄스터 난소 세포이다. 도 17은 트라스투주맙(항-HER-2 항체, Herceptin®) 및 트랜스페린(트랜스페린 수용체에 대한 천연 리간드)의 확률적 아지도 변형이 ADIBO-변형된 16:0 Lyso PC-BPD-함유 리포솜에 클릭되는 경우 세포 결합의 선택성을 나타낸다는 것을 입증한다.
막에 포집된 16:0 Lyso PC-BPD를 갖지 않는 ADIBO-변형된 리포솜에 수용성 광감작제 클로린 e6 모노에틸렌 디아민 모노아미드(CMA)를 로딩하였으며, 이는 세툭시맙에 확률적으로 접합된 경우 세포 선택성을 제공하는 것을 보여준다(도 18a). 리포솜의 도식은 도 18b에 도시되어 있다.
유동세포계측 데이터를 얻었으며, 이는 리포솜 막으로부터 유래된 중앙값 광감작제(BPD) 강도(도 29a) 및 단백질 Z에 부착된 형광 표지된 펩티드로부터 유래된 중앙값 5-FAM 형광 강도(도 29b)를 도시한다. A431(고 EGFR) 및 T47D(저 EGFR) 세포를 표적화된 세툭시맙-단백질 Z 클릭된 리포솜 또는 항체가 접합되지 않은 비특이적 리포솜의 25, 50, 100 및 250 nM BPD 당량으로 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이러한 데이터는 클릭 접합된 리포솜의 막에 포매된 16:0 Lyso PC-BPD와 형광 표지된 세툭시맙-단백질 Z의 EGFR-의존성 세포 결합 사이의 강한 양의 상관관계가 존재한다는 것을 보여준다. 이러한 상관관계는, 구리 무함유 클릭 접합된 리포솜이, 표적 암세포에 리포솜 내용물을 균일하게 전달할 수 있는 안정한 객체라는 것을 입증한다.
선택적 내포작용 :
표적화된 리포솜 플랫폼의 선택적인 세포내 전달은 광역동 요법의 세포내 유도 및 생물학적/화학요법제의 세포내 광촉발성 전달을 가능하게 한다. 도 19는 표적화된 리포솜의 세포 내재화를 나타내는, 점진적 시간 간격으로 OVCAR-5 세포에서 비표적화된 리포솜 및 확률적으로 표적화된 리포솜의 공초점 형광 현미경 영상을 도시한다. 현미경 사진은, 세툭시맙에 클릭 접합된 16:0 Lyso PC-BPD 함유 리포솜이 시간-의존적 방식으로 EGFR을 과발현하는 OVCAR-5 세포 내에서 세포내로 선택적으로 전달할 수 있다는 것을 입증한다.
표적화된 나노작제물의 시험관내 영상화 및 생체내 생체 영상화를 위한 리포솜 나노작제물의 형광단 표지.
친수성 형광단의 안정한 앵커링은 (1) 콜레스테롤, (2) 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE)과 같은 인지질의 포스페이트 헤드 기 또는 (3) DSPE-PEG2000-NH2와 같은 페길화된 인지질의 말단부에 대한 접합을 통해 달성될 수 있다.
모듈형 형광단 표지
구리 무함유 클릭 화학의 성분으로서, ADIBO의 높은 화학선택성은 ADIBO와 교차-반응성 없이, 리포솜의 표면과 상이한 반응성 객체의 모듈형 접합을 가능하게 하였다. 생체내 영상화에서 사용할 수 있는 안정한 클릭-반응성 리포솜의 패널을 제조하기 위해, 0.2% DSPE-PEG2000-NH2를 ADIBO-변형된 리포솜 내에 혼입시키고, 근적외선 염료의 아민-반응성 NHS-에스테르와 접합시켰다(도 20). ADIBO-변형된 리포솜의 표지에 사용되는 염료는 AlexaFluor® 633, AlexaFluor® 647, AlexaFluor® 680, AlexaFluor®700, IRDye® 680RD and IRDye® 800CW를 포함한다. 제조된 제형은 58.2% DPPC, 7.9% DOPG/DOTAP, 28.9% 콜레스테롤, 4.3% DSPE-mPEG2000, 0.5% DSPE-PEG2000-ADIBO(항체와의 클릭 접합을 위한 것임) 및 0.2% DSPE-PEG2000-NH2(염료와의 아미드 커플링을 위한 것임)를 포함하였다. 모든 리포솜은 세툭시맙 또는 모의(sham) IgG1 대조군에 확률적으로 클릭 접합된 후, 안정하게 남아 있었다. 도 21a는 다양한 염료를 포함하는 리포솜의 크기 및 다분산 지수를 도시하며, 도 21b는 각각의 자외선-가시광선 스펙트럼을 도시한다.
형광단 -표지 리포솜의 시험관내 선택성
지질 앵커링된 형광단 리사민 로다민 B-DPPE를 혼입시키는 예시적 제형은 도 39a에 도시되어 있다. ADIBO를 혼입시키기 위해, 디벤조시클로옥틴 NHS 에스테르(ADIBO-NHS 0.426 mM)의 5 당량을 10% DMSO를 갖는 pH 8 100 mM 포스페이트 완충액에서 아민과 반응시켰다. 3개의 샘플(50% v/v GOA_111 + 5 x ADIBO 1(최상단 플롯), 50% v/v GOA_111 + 5 x ADIBO 2(중간 플롯), 및 50% v/v GOA_111 + 5 x ADIBO 3(최하단 플롯))에 대한 크기 및 다분산 지수가 도 39b에 도시되어 있다.
로다민을 포함하는 리포솜을 50 mL의 분취량에서 리포솜당 0, 10, 50, 및 100의 세툭시맙-단백질 Z와 함께 실온에서 밤새 인큐베이션하였다. 각각의 접합체를 Sepharose CL-4B 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 비결합 항체로부터 정제하고, 자외선-가시광선 분광광도계 및 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 특성화하였다. 도 40은 각각의 샘플에 대한 크기 및 다분산 지수를 도시한다.
리사민 로다민 B에 결합된 0.1%의 DPPE를 ADIBO-변형된 리포솜 내에 혼입시키고, 세툭시맙에 부위 특이적으로 클릭 접합시켰다. 도 22는 리포솜당 세툭시맙-단백질 Z(Cet-Pz) 밀도의 함수로서 중앙값 리사민 로다민 B 강도를 도시하며, 이는 형광 표지된 리포솜이 T47D 세포(저 EGFR; 하부 플롯)와 비교하여, A431 세포(고 EGFR; 상부 플롯)에 선택적으로 결합한다는 것을 입증하는 것이다. 최적의 밀도는 10 내지 50 Cet-Pz/리포솜에 발생한다.
도 35는 500 nM 리사민 로다민 B 당량으로 GOA_111-CetPz(10 CetPz/리포솜) 중앙값 리사민 로다민 B 강도를 사용한 다양한 암세포주에 대한 선택성 배수를 도시한다. 100 μL 리포솜 샘플을 37℃에서 30분 동안 50,000개의 세포와 함께 인큐베이션하였다. 고 EGFR A431 세포는 최고의 선택성을 나타낸다.
세툭시맙-단백질 Z에 접합된 BPD-로다민 리포솜을 제조하고, 투과 전자 현미경으로 영상화하였다. 리포솜당 0 또는 10의 세툭시맙을 갖는 200 μl GOA_113을 제조한 후, 20분 동안 2000 xg 100 kDa 한외 여과하였다. 10 μl의 농축된 리포솜을 구리 메쉬 탄소 피복 그리드 상에 1분 동안 로딩한 후, 포스포텅스텐산으로 10초 동안 염색하였다. 샘플을 밤새 건조시켰다. 도 36은 전술된 절차에 따라 처리된 리포솜의 투과 전자 현미경(TEM) 영상을 도시한다.
도 34는 500 nM 및 100 nM 농도의 리사민 로다민 B에서 A431 세포에 대한 최적의 세툭시맙-단백질 Z 밀도(각각, 최상단 플롯 및 하부의 다음 플롯) 및 500 nM 및 100 nM 농도의 리사민 로다민 B에서 T47D 세포에 대한 최적의 세툭시맙-단백질 Z 밀도(하부의 2개의 플롯)를 도시한다. 최적의 밀도는 A431에서 500 nM에서의 10의 CetPz/리포솜이고, A431에서 100 nM에서의 50의 CetPz/리포솜이다.
도 37은 선택성 배수 대 로다민의 nM 당량을 도시하며, 이는 세툭시맙에 클릭 접합되고, 지질 앵커링된 로다민 염료 및 소수성으로 포집된 유리 BPD 둘 모두를 포함하는 리포솜이 항체와 접합되지 않은 리포솜과 비교하여, 상이한 수준의 선택성을 나타낸다는 것을 보여준다. 지질 앵커링된 로다민이 항체와 공유적으로 접합된 막 내에 고정되므로, 로다민 결합에서 최대 4.5배의 선택성(FACS 형광 신호에 의해 결정된 바와 같음)이 농도-의존적 방식으로 30분에 나타난다. 유리 세툭시맙은 이러한 선택성을 블로킹하며, 이는 로다민(및, 리포솜) 선택성이 EGFR 결합에 의존적임을 확인시킨다. 동일한 리포솜에 소수성으로 포집된 유리 BPD는 매우 상이한 선택성 프로파일을 가지며, 비표적화된 리포솜에 비해 표적화된 리포솜에서 단지 1.5배의 우선도(preference)가 관찰된다. 이러한 관찰을 기반으로 하여, 항체 접합은 리포솜 선택성을 제공하지만, 유리 BPD는 리포솜 결합에 상관없이 세포 내로 누출된다.
도 33은 리포솜당 세툭시맙-단백질 Z 밀도의 함수로서 중앙값 5-FAM 형광 강도를 도시하며, 이는 또한, T47D 세포(하부 플롯)와 비교하여, A431 세포(상부 플롯)에 대한 높은 선택성을 입증하는 것이다. 최적의 밀도는 약 100 Cet-Pz/리포솜에서 발생한다.
생체내 생체영상화 및 선택성
IRDye® 680RD 및 IRDye® 800CW에 의해 표지된 ADIBO-변형된 리포솜은 각각 세툭시맙 또는 인간 IgG1 모의 항체 대조군에 확률적으로 클릭 접합될 수 있다. 도 23은 IRDye® 680RD(상부 플롯) 및 IRDye® 800CW(하부 플롯)의 평균 보정 형광 대 시간을 도시하며, 이는 모의 인간 IgG1 대조군에 클릭 접합된 공동-주사된 IRDye800CW 표지 리포솜과 비교하여, 세툭시맙(Erbitux)에 클릭 접합된 IRDye680RD 표지 리포솜과 피하의 U251 종양의 선택적 결합을 입증하는 것이다.
EGFR을 과발현하는 피하의 U251 쥣과동물 이종이식 교모세포종 종양을 각각의 리포솜의 0.1 nmol 염료 당량의 마우스 내로의 정맥내 주사(리포솜당 50개의 확률적 PEG-아지드 세툭시맙 분자 및 리포솜당 50개의 확률적 PEG-아지드 비특이적 IgG 분자에 클릭 접합된 표적화된 리포솜) 후 영상화하였다. 표적화된 리포솜을 근적외선 형광단 IRDye® 680RD에 의해 태깅(tagging)하고, 비특이적 리포솜을 근적외선 형광단 IRDye® 800CW에 의해 태깅하였다. PEARL 영상화 시스템을 사용하는 이중 추적 영상화 접근법을 수행하였다. 표적화된 리포솜은 IgG1 모의 접합된 리포솜과 비교하여, 투여 24시간 후 최대 선택성에 도달하는 것으로 밝혀졌다.
표적화된 광치료적 16:0 Lyso PC-BPD 함유 리포솜의 개별적 생체분포 연구에서, 피하의 A431 표피 암종 종양을 보유하는 마우스에 비표적화된 리포솜 및 확률적 세툭시맙 표적화된 리포솜의 0.25 mg/kg BPD 당량을 주사하였다. 주사 24시간 후 종양 및 장기를 수집하고, 16:0 Lyso PC-BPD 생체분포를 정량적으로 영상화하였다. 도 24는 표적화된 리포솜(각각의 쌍 중 우측 막대)이 비표적화된 리포솜(각각의 쌍의 막대 중 좌측 막대)보다 A431 종양에 대해 더 선택적이었다는 것을 도시한다. 도 25는 16:0 Lyso PC-BPD의 형광이 생체분포를 정량적으로 영상화하기 위해 사용될 수 있으며, 비접합된 DIBO-함유 16:0 Lyso PC-BPD 리포솜 대조군에 비해, 0.25 mg/kg BPD 당량의 투여 24시간 후, 피하의 A431(고 EGFR) 종양을 갖는 마우스에서 확률적으로 클릭 접합된 리포솜의 종양 선택성을 확인시킨다는 것을 도시한다.
도 38은 로다민 표지된 리포솜(적색)으로 30분 동안 인큐베이션된 MGG6 세포 신경구(neurosphere)(Hoechst 33324로 염색된 핵, 청색)의 공초점 형광 현미경 영상을 도시한다. 도 38은 30분째에, 세툭시맙-항 EGFR에 클릭 접합된 표적화된 리포솜이 비표적화된 리포솜(도 38b)과 비교하여, 우선적 결합을 나타낸다는 것(도 38a)을 보여준다.
본 발명의 다양한 구현예가 기재되었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어남이 없이, 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 다른 구현예들이 하기 첨부된 청구범위의 범위 내에 있다.

Claims (67)

  1. a) 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체;
    b) 제1 인지질 및 스트레인된 시클로옥틴 모이어티(strained cyclooctyne moiety)를 포함하는 제1 유도체화된 인지질;
    c) 제2 인지질 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 포함하는 제2 유도체화된 인지질; 및
    d) 양이온성 또는 음이온성 지질을 포함하는 리포솜.
  2. a) 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체;
    b) 제1 인지질 및 표적화 모이어티를 포함하는 제1 유도체화된 인지질;
    c) 제2 인지질 및 폴리에틸렌 글리콜 중합체를 포함하는 제2 유도체화된 인지질; 및
    d) 양이온성 또는 음이온성 지질을 포함하는 리포솜.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 광감작제는 소수성인 리포솜.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 광감작제는 포르피린 광감작제인 리포솜.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 광감작제는 벤조포르피린 모이어티를 포함하는 리포솜.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 광감작제는 벤조포르피린 유도체인 리포솜.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 리소인지질은 지방산 사슬 내에 14 내지 22개의 탄소를 포함하는 리포솜.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 리소인지질은 지방산 사슬 내에 16 내지 20개의 탄소를 포함하는 리포솜.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 리소인지질은 불포화 지방산 사슬을 포함하는 리포솜.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 리소인지질은 16:0 리소인지질, 20:0 리소인지질 및 이들의 조합으로부터 선택되는 리포솜.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체는 리포솜 중에 약 0.01 mol% 내지 약 1 mol%로 존재하는 리포솜.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체는 리포솜 중에 약 0.05 mol% 내지 약 0.5 mol%로 존재하는 리포솜.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체는 리포솜 중에 약 0.08 mol% 내지 약 0.12 mol%로 존재하는 리포솜.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 리소인지질 및 광감작제를 포함하는 접합체는 리포솜 중에 약 0.1 mol%로 존재하는 리포솜.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 인지질은: 수소화된 콩 포스포티딜콜린(HSPC); 1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DDPC); 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스페이트(DEPA); 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC); 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE); 1,2-디엘라이도일-포스파티딜글리세롤(DEPG); 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLOPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스페이트(DLPA); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DLPG); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포세린(DLPS); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DMPA); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DMPG); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포세린(DMPS); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(DOPA); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DOPG); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포세린(DOPS); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DPPA); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DPPG); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포세린(DPPS); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스페이트(DSPA); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DSPG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포세린(DSPS); 1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로 3-포스포콜린(MPPC); 1-미리스토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MSPC); 1-팔미토일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PMPC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(POPG); 1-팔미토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PSPC); 1-스테아로일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SMPC); 및 1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SOPC); 1-스테아로일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SPPC), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 리포솜.
  16. 제15항에 있어서, 제1 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE)인 리포솜.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 제1 유도체화된 인지질은 링커를 추가로 포함하는 리포솜.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 폴리에틸렌 글리콜인 리포솜.
  19. 제18항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 약 350 g/mol 내지 약 30,000 g/mol의 분자량을 갖는 리포솜.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 350 g/mol, 550 g/mol, 750 g/mol, 1000 g/mol, 2000 g/mol, 3000 g/mol, 5000 g/mol, 10,000 g/mol, 20,000 g/mol 및 30,000 g/mol로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자량을 갖는 리포솜.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜은 2000 g/mol의 분자량을 갖는 리포솜.
  22. 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 유도체화된 인지질은 DSPE-PEG2000을 포함하는 리포솜.
  23. 제1항 및 제3항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 스트레인된 시클로옥틴은 아자-디벤조시클로옥틴(ADIBO), 디벤조시클로옥틴(DIBO), (OCT), 무아릴 옥틴(ALO), 모노플루오르화된 시클로옥틴(MOFO), 디플루오르화된 시클로옥틴(DIFO), 비아릴아자시클로옥티논(BARAC), 또는 디메톡시아자시클로옥틴(DIMAC) 모이어티를 포함하는 리포솜.
  24. 제1항 및 제3항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 리소인지질과 접합되기 이전에 스트레인된 시클로옥틴은 디벤조시클로옥틴-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르(ADIBO-NHS), 디벤조시클로옥틴-C6-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 디벤조시클로옥틴-설포-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 디벤조시클로옥틴-PEG(4, 5, 13 또는 n)-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 디벤조시클로옥틴-S-S-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 디벤조시클로옥틴-말레이미드, 디벤조시클로옥틴-PEG(4, 5, 13 또는 n)-말레이미드, 및 (1R,8S,9s)-비시클로[6.1.0]논-4-yn-9-일메틸 N-숙신이미딜 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 리포솜.
  25. 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 모이어티는 엽산, RGD 펩티드, 천연 단백질 리간드, 애피바디, 항체, 항체 단편, 및 조작된 항체-기반 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 리포솜.
  26. 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 모이어티는 항체인 리포솜.
  27. 제2항 내지 제22항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 모이어티는 Cu-무함유 클릭 화학을 사용하여 제1 유도체화된 인지질에 접합되는 리포솜.
  28. 제2항 내지 제22항, 제25항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 모이어티는 제1 인지질과 접합되기 이전에 아지드 모이어티를 포함하는 리포솜.
  29. 제28항에 있어서, 제1 유도체화된 인지질은 아지드를 포함하는 표적화 모이어티와 스트레인된 시클로옥틴의 반응 산물 및 제1 인지질을 포함하는 리포솜.
  30. 제29항에 있어서, 스트레인된 시클로옥틴은 아자-디벤조시클로옥틴(ADIBO), 디벤조시클로옥틴(DIBO), (OCT), 무아릴 옥틴(ALO), 모노플루오르화된 시클로옥틴(MOFO), 디플루오르화된 시클로옥틴(DIFO), 비아릴아자시클로옥티논(BARAC), 또는 디메톡시아자시클로옥틴(DIMAC) 모이어티를 포함하는 리포솜.
  31. 제30항에 있어서, 리소인지질과 접합되기 이전에 스트레인된 시클로옥틴은: 디벤조시클로옥틴-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르(ADIBO), 디벤조시클로옥틴-C6-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 디벤조시클로옥틴-설포-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 디벤조시클로옥틴-PEG(4, 5, 13 또는 n)-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 디벤조시클로옥틴-S-S-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 디벤조시클로옥틴-말레이미드, 디벤조시클로옥틴-PEG(4, 5, 13 또는 n)-말레이미드, 및 (1R,8S,9s)-비시클로[6.1.0]논-4-yn-9-일메틸 N-숙신이미딜 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 리포솜.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 인지질은 수소화된 콩 포스포티딜콜린(HSPC); 1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DDPC); 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스페이트(DEPA); 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC); 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE); 1,2-디엘라이도일-포스파티딜글리세롤(DEPG); 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLOPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스페이트(DLPA); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DLPG); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포세린(DLPS); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DMPA); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DMPG); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포세린(DMPS); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(DOPA); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DOPG); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포세린(DOPS); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DPPA); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DPPG); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포세린(DPPS); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스페이트(DSPA); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DSPG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포세린(DSPS); 1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로 3-포스포콜린(MPPC); 1-미리스토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MSPC); 1-팔미토일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PMPC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(POPG); 1-팔미토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PSPC); 1-스테아로일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SMPC); 및 1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SOPC); 1-스테아로일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SPPC); 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 리포솜.
  33. 제32항에 있어서, 제2 인지질은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE)인 리포솜.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 유도체화된 인지질의 폴리에틸렌 글리콜 중합체는 약 350 g/mol 내지 약 30,000 g/mol의 분자량을 갖는 리포솜.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체는 350 g/mol, 550 g/mol, 750 g/mol, 1000 g/mol, 2000 g/mol, 3000 g/mol, 5000 g/mol, 10,000 g/mol, 20,000 g/mol 및 30,000 g/mol로 이루어진 군으로부터 선택되는 분자량을 갖는 리포솜.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체는 2000 g/mol의 분자량을 갖는 리포솜.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜 중합체는 알콕실, 카복실, 아민, 비오틴, 말레이미드, 숙시닐, N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 설포-N-하이드록시숙신이미딜 에스테르, 실란, 피리딜디티올 또는 시아누르 모이어티에 의해 종결되는 리포솜.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 유도체화된 인지질은 DSPE-PEG2000, DSPE-mPEG2000, 또는 이들의 조합인 리포솜.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 유도체화된 인지질은 리포솜 중에 약 0.5 mol% 내지 약 5 mol%의 양으로 존재하는 리포솜.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체 대 제2 유도체화된 인지질의 몰비는 약 1:10인 리포솜.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 유도체화된 인지질은 리포솜 중의 접합체의 양보다 약 8 내지 약 10배 더 높은 양으로 존재하는 리포솜.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜은 음이온성 지질을 포함하는 리포솜.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온성 지질은 음이온성 인지질인 리포솜.
  44. 제43항에 있어서, 음이온성 인지질은: 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DOPG); 포스파티딜 글리세롤(PG); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤)(DMPG); 포스파티딜세린(PS); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린(DOPS); 및 디세틸포스페이트(DCP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 리포솜.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온성 지질은 리포솜 중에 약 5 내지 약 10 mol%의 양으로 존재하는 리포솜.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온성 지질은 리포솜 중에 약 7 내지 약 9 mol%의 양으로 존재하는 리포솜.
  47. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜은 양이온성 지질을 포함하는 리포솜.
  48. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질은 양이온성 인지질인 리포솜.
  49. 제48항에 있어서, 양이온성 인지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP)인 리포솜.
  50. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질은 리포솜 중에 약 5 내지 약 10 mol%의 양으로 존재하는 리포솜.
  51. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질은 리포솜 중에 약 7 내지 약 9 mol%의 양으로 존재하는 리포솜.
  52. 제1항 또는 제2항에 있어서, 리포솜은 하나 이상의 화학요법 화합물; 하나 이상의 중합체성 나노입자; 하나 이상의 단백질계 나노입자; 하나 이상의 덴드리머 구조체; 하나 이상의 키토산 나노입자; 하나 이상의 폴리글리칸 구조체; 하나 이상의 무기 나노입자; 하나 이상의 영상화제; 하나 이상의 키나제 억제제; 하나 이상의 생물제제; 및 이들의 2개 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 카르고(cargo)를 추가로 포함하는 리포솜.
  53. 제52항에 있어서, 키나제 억제제는 수용체 티로신 키나제 억제제인 리포솜.
  54. 제53항에 있어서, 하나 이상의 화학 요법 화합물 중 하나 이상이 광감작제와의 상승작용을 나타내는 리포솜.
  55. 제1항 또는 제2항에 있어서, 리포솜은 하나 이상의 인지질, 스핑고지질, 생물활성 지질, 천연 지질, 콜레스테롤, 스테롤 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 리포솜.
  56. 제55항에 있어서, 하나 이상의 인지질은: 포스파티딜콜린; 포스파티드산; 포스파티딜에탄올아밈; 포스파티딜글리세롤; 및 포스파티딜세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 리포솜.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 하나 이상의 인지질은: 수소화된 콩 포스포티딜콜린(HSPC); 1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DDPC); 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스페이트(DEPA); 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC); 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE); 1,2-디엘라이도일-포스파티딜글리세롤(DEPG); 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLOPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스페이트(DLPA); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DLPG); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포세린(DLPS); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DMPA); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DMPG); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포세린(DMPS); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트(DOPA); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DOPG); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포세린(DOPS); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트(DPPA); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DPPG); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포세린(DPPS); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스페이트(DSPA); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(DSPG); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포세린(DSPS); 1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로 3-포스포콜린(MPPC); 1-미리스토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MSPC); 1-팔미토일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PMPC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스파티딜글리세롤(POPG); 1-팔미토일-2-스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(PSPC); 1-스테아로일-2-미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SMPC); 및 1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SOPC); 1-스테아로일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(SPPC); 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 리포솜.
  58. 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 인지질 중 적어도 하나는 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC)인 리포솜.
  59. 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 인지질은 리포솜 중에 약 40 mol% 내지 약 80 mol%로 존재하는 리포솜.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 인지질은 리포솜 중에 약 50 내지 약 70 mol%로 존재하는 리포솜.
  61. 제55항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 인지질은 리포솜 중에 약 55 내지 약 65 mol%로 존재하는 리포솜.
  62. 제55항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤은 리포솜 중에 약 15 mol% 내지 약 45 mol%로 존재하는 리포솜.
  63. 제55항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤은 리포솜 중에 약 20 mol% 내지 약 30 mol%로 존재하는 리포솜.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 리포솜은 형광단, 조영제, 또는 이들의 조합을 추가로 포함하는 리포솜.
  65. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 리포솜 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  66. 환자에서 암을 치료하는 방법으로서,
    (a) 제2항 내지 제22항 및 제25항 내지 제63항 중 어느 한 항의 리포솜의 치료적 유효량을 환자에게 투여하는 단계; 및
    (b) 리포솜을 파괴하기 위해 환자에 광을 조사하는 단계를 포함하는 방법.
  67. 환자에서 암을 영상화하는 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항의 리포솜의 치료적 유효량을 환자에 투여하는 단계;
    (b) 리포솜을 파괴하기 위해 환자에 광을 조사하는 단계; 및
    (c) 환자를 영상화하는 단계를 포함하는 방법.
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