CN116510009B - 一种hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种hEnd‑AptCD3‑Lipo纳米复合物的制备方法及应用。本发明hEnd‑AptCD3‑Lipo纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将hEnd‑Apt和CD3单克隆抗体混合，得到混合液；(2)在所述混合液中加入MAL‑PEG2000‑DSPE和铜催化剂，混合均匀，在氮气保护下反应；(3)反应后采用琥珀酸钠缓冲液进行第一次洗脱，再以组氨酸缓冲溶液进行第二次洗脱，制得hEnd‑AptCD3‑Lipo纳米复合物。采用本发明的方法，有效减少产物中杂质残留，进一步保证药物安全性，而且提高抗肿瘤活性。
Description
技术领域
本发明涉及纳米药物领域，特别涉及一种hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物的制备方法及应用。
背景技术
Endoglin适配体(hEnd-Apt)能与CD105特异性稳定结合的适配体，能与肝癌细胞HepG2等高表达CD105的细胞特异性结合。人CD3分子是T细胞表面的标记性分子，与T细胞受体(TCR)组成TCR-CD3复合体，在免疫信号传导过程中具有重要作用。基于hEnd-Apt与CD3单克隆抗体修饰纳米脂质体的纳米复合物，即hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物。利用该纳米复合物修饰PD-1-T，，能够增强对HepG2细胞的杀伤活性，即提高其抗肿瘤活性。但现有方法制备产品存在适配体或抗体残留及其他杂质，影响其抗肿瘤活性进一步提高。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物的制备方法及应用，解决上述问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将hEnd-Apt(Endoglin适配体)和CD3单克隆抗体混合，得到混合液；
(2)在所述混合液中加入MAL-PEG2000-DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺)和铜催化剂，混合均匀，在氮气保护下反应；
(3)反应后采用琥珀酸钠缓冲液(琥珀酸钠-琥珀酸缓冲液)进行第一次洗脱，再以组氨酸缓冲溶液(组氨酸-醋酸盐缓冲液)进行第二次洗脱，制得hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物。
进一步的技术方案是，步骤(1)，所述hEnd-Apt和CD3单克隆抗体的摩尔比为2：0.9～1.1。
进一步的技术方案是，步骤(2)，所述MAL-PEG2000-DSPE的质量浓度为9～11g/L，所述混合液和MAL-PEG2000-DSPE的体积比为1：10～11。
进一步的技术方案是，步骤(2)，所述铜催化剂为双核铜配合物[Cu2(foac)2(phen)2]·10H2O。
进一步的技术方案是，步骤(2)，所述催化剂的加入量为所述混合液质量的1％～2％。
进一步的技术方案是，步骤(2)，所述反应时间为15～20h。
进一步的技术方案是，步骤(3)，所述琥珀酸钠缓冲液为50mM的琥珀酸钠缓冲溶液，其pH值为5.2～5.5。
进一步的技术方案是，步骤(3)，所述组氨酸缓冲溶液为5mM组氨酸缓冲溶液，其pH值为6.5～7.0。
进一步的技术方案是，步骤(3)，所述第一次洗脱的流速为4～6ml/min。
进一步的技术方案是，步骤(3)，所述第二次洗脱的流速为2～4ml/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)采用本发明的方法，有效减少产物中杂质残留，进一步保证药物安全性，而且提高抗肿瘤活性。
(2)其中，本发明加入铜催化剂，有效促进hEnd-Apt和CD3单克隆抗体混合液与MAL-PEG2000-DSPE反应，显著提高反应效率，缩短反应时间，同时减少杂质产生，采用琥珀酸钠缓冲液、组氨酸缓冲溶液依次洗脱，充分去除未反应的适配体或抗体残留，有效减少杂质残留，提高目标产物收率以及纯度。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[Cu2(foac)2(phen)2]·10H2O的制备：采用现有方法制备：
取Cu(CH3COOH)2·H2O、邻菲罗啉和4-氟水杨酸按照摩尔比1：2：1加入无水甲醇中，料液比mol/L为1：5，搅拌均匀后，转移至带聚四氟乙烯衬底的水热反应釜中，并用三乙胺调pH值为6后密闭，加热至80℃反应120h，反应后室温条件下自然冷却，过滤并洗涤，制得[Cu2(foac)2(phen)2]·10H2O。
琥珀酸钠缓冲液为琥珀酸钠-琥珀酸缓冲液。
组氨酸缓冲溶液为组氨酸-醋酸盐缓冲液。
实施例1
一种hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将hEnd-Apt和CD3单克隆抗体按照摩尔比2：1混合，得到混合液；
(2)在所述混合液中加入MAL-PEG2000-DSPE和铜催化剂双核铜配合物[Cu2(foac)2(phen)2]·10H2O，其中，MAL-PEG2000-DSPE的质量浓度为10g/L，混合液和MAL-PEG2000-DSPE的体积比为1：10，铜催化剂的加入量为混合液质量的1.5％，混合均匀，在氮气保护下反应18h；
(3)反应后采用50mM琥珀酸钠缓冲液(pH 5.5)进行第一次洗脱，洗脱流速为5ml/min；再以5mM组氨酸缓冲溶液(pH 6.8)进行第二次洗脱，洗脱流速为3ml/min；制得目标纳米复合物。
实施例2
一种hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将hEnd-Apt和CD3单克隆抗体按照摩尔比2：1混合，得到混合液；
(2)在所述混合液中加入MAL-PEG2000-DSPE和铜催化剂双核铜配合物[Cu2(foac)2(phen)2]·10H2O，其中，MAL-PEG2000-DSPE的质量浓度为10g/L，混合液和MAL-PEG2000-DSPE的体积比为1：10，铜催化剂的加入量为混合液质量的1.3％，混合均匀，在氮气保护下反应20h；
(3)反应后采用50mM琥珀酸钠缓冲液(pH 5.5)进行第一次洗脱，洗脱流速为4ml/min；再以5mM组氨酸缓冲溶液(pH 6.5)进行第二次洗脱，洗脱流速为2ml/min；制得目标纳米复合物。
实施例3
一种hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将hEnd-Apt和CD3单克隆抗体按照摩尔比2：1混合，得到混合液；
(2)在所述混合液中加入MAL-PEG2000-DSPE和铜催化剂双核铜配合物[Cu2(foac)2(phen)2]·10H2O，其中，MAL-PEG2000-DSPE的质量浓度为10g/L，混合液和MAL-PEG2000-DSPE的体积比为1：10，铜催化剂的加入量为混合液质量的1.8％，混合均匀，在氮气保护下反应15h；
(3)反应后采用50mM琥珀酸钠缓冲液(pH 5.2)进行第一次洗脱，洗脱流速为6ml/min；再以5mM组氨酸缓冲溶液(pH 7.0)进行第二次洗脱，洗脱流速为4ml/min；制得目标纳米复合物。
实施例4
一种hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将hEnd-Apt和CD3单克隆抗体按照摩尔比2：1混合，得到混合液；
(2)在所述混合液中加入MAL-PEG2000-DSPE和铜催化剂双核铜配合物[Cu2(foac)2(phen)2]·10H2O，其中，MAL-PEG2000-DSPE的质量浓度为10g/L，混合液和MAL-PEG2000-DSPE的体积比为1：10，铜催化剂的加入量为混合液质量的0.5％，混合均匀，在氮气保护下反应18h；
(3)反应后采用50mM琥珀酸钠缓冲液(pH 5.5)进行第一次洗脱，洗脱流速为5ml/min；再以5mM组氨酸缓冲溶液(pH 6.8)进行第二次洗脱，洗脱流速为3ml/min；制得目标纳米复合物。
对比例1
一种hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物的制备方法，与实施例1主要区别的是加入催化剂不同：
(1)将hEnd-Apt和CD3单克隆抗体按照摩尔比2：1混合，得到混合液；
(2)在所述混合液中加入MAL-PEG2000-DSPE和醋酸钯催化剂，其中，MAL-PEG2000-DSPE的质量浓度为10g/L，混合液和MAL-PEG2000-DSPE的体积比为1：10，醋酸钯催化剂的加入量为混合液质量的1.5％，混合均匀，在氮气保护下反应18h；
(3)反应后采用50mM琥珀酸钠缓冲液(pH 5.5)进行第一次洗脱，洗脱流速为5ml/min；再以5mM组氨酸缓冲溶液(pH 6.8)进行第二次洗脱，洗脱流速为3ml/min；制得目标纳米复合物。
对比例2
一种hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物的制备方法，与实施例1主要区别的是加入缓冲液不同：
一种hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将hEnd-Apt和CD3单克隆抗体按照摩尔比2：1混合，得到混合液；
(2)在所述混合液中加入MAL-PEG2000-DSPE和铜催化剂双核铜配合物[Cu2(foac)2(phen)2]·10H2O，其中，MAL-PEG2000-DSPE的质量浓度为10g/L，混合液和MAL-PEG2000-DSPE的体积比为1：10，铜催化剂的加入量为混合液质量的1.5％，混合均匀，在氮气保护下反应18h；
(3)反应后采用悬浮液(50mM Tris-HCl，140mM氯化钠，pH＝7)洗脱，洗脱流速为4ml/min，制得目标纳米复合物。
试验例
1毒性测试
待测样品溶液配置：分别将实施例1-4以及对比例1-2所制的纳米复合物，分别制成浓度为1nM、10nM、100nM、500nM或1000nM的样品溶液。
将293T细胞、A549细胞与1nM、10nM、100nM、500nM或1000nM的样品溶液在RPMI1640完全培养基(含10％FBS)中孵育24、48小时，分别在24h、48h检测细胞的活性，使用CCK-8试剂盒测定细胞活力。结果显示该纳米复合物对293T细胞和A549细胞均无毒性。
2抗肿瘤活性测试
采用实施例1-4以及对比例1-2所制得纳米复合物修饰的PD-1-T细胞组对HepG2肝癌细胞的杀伤活性，设置效靶比10：1，考察实施例1-4以及对比例1-2所制得纳米复合物修饰的PD-1-T细胞组对靶细胞HepG2细胞的杀伤活性，对照组：PD-1-T细胞。抗肿瘤活性提高百分比＝(药物组－对照组)/对照组*100％结果如下表1：
表1抗肿瘤活性测试结果
上述结果表明，实施例1-4以及对比文件1-2所制的纳米复合物修饰PD-1-T细胞对HepG2肿瘤细胞均具有较强的杀伤活性。其中，实施例1-4的杀伤活性更强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将hEnd-Apt和CD3单克隆抗体混合，得到混合液；
（2）在所述混合液中加入MAL-PEG2000-DSPE和铜催化剂，混合均匀，在氮气保护下反应；
（3）反应后采用琥珀酸钠缓冲液进行第一次洗脱，再以组氨酸缓冲溶液进行第二次洗脱，制得hEnd-AptCD3-Lipo纳米复合物；
步骤（1），所述hEnd-Apt和CD3单克隆抗体的摩尔比为2：0.9~1.1；
步骤（2），所述铜催化剂为双核铜配合物[Cu2(foac)2(phen)2]·10H2O；
步骤（2），所述MAL-PEG2000-DSPE的质量浓度为9~11g/L，所述混合液和MAL-PEG2000-DSPE的体积比为1：10~11；
步骤（2），所述铜催化剂的加入量为所述混合液质量的1%~2%；
步骤（2），反应时间为15~20h；
步骤（3），所述琥珀酸钠缓冲液为50 mM的琥珀酸钠缓冲溶液，其pH值为5.2~5.5；
步骤（3），所述组氨酸缓冲溶液为5 mM组氨酸缓冲溶液，其pH值为6.5~7.0；
步骤（3），所述第一次洗脱的流速为4~6ml/min；
步骤（3），所述第二次洗脱的流速为2~4ml/min。
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