CN111569085A - 一种模块化双特异性磁性纳米复合物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种模块化双特异性磁性纳米复合物与应用。所述纳米复合物核心部分是链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒水溶液，另外一部分是两种或两种以上以不同比例复配的生物素修饰的功能化配体的冻干粉，两部分使用时按照所需比例进行复配并分散于葡萄糖或氯化钠注射液中。这种构建方法的特点是不同生物素修饰的配体可作为模块，仅需对不同模块进行简单地替换和组合，即可制备出具有不同配体修饰的具有多种功能的纳米复合物。通过对功能化配体的筛选，制备出的纳米复合物一方面能够主动靶向肿瘤细胞，直接诱导肿瘤细胞凋亡；另一方面也能招募和激活T细胞，产生T细胞介导的肿瘤细胞杀伤效果，是一种具有双特异性杀伤肿瘤细胞效果的纳米复合物。

Description

一种模块化双特异性磁性纳米复合物及应用
技术领域
本发明属于生物与医学纳米材料及技术领域，具体涉及一种模块化双特异性磁性纳米复合物及应用。
背景技术
现今，对恶性肿瘤的传统治疗方法主要有手术切除、放疗、化疗以及放疗和化疗相结合的方式。虽然这些传统疗法或其组合形式具有一定的治疗效果，但无法根治肿瘤疾病。与传统肿瘤治疗方式不同，肿瘤免疫疗法旨在开发肿瘤特异性抗体的治疗，建立和提高免疫细胞效应机制，实现对恶性肿瘤的免疫治疗效果。随着纳米技术的进步，大量的纳米材料被设计并作为纳米载体系统用来靶向肿瘤并传递免疫相关的治疗成分，引起并改善特异性抗肿瘤免疫反应并降低全身毒性。在基于纳米材料的免疫治疗中，有效的肿瘤靶向能力非常重要，因为它可以增强治疗效果。纳米载体可通过被动(称为增强的渗透和保留效应，EPR效应)和/或主动机制靶向肿瘤部位。一方面，通过纳米载体将治疗成分直接递送至肿瘤部位，直接诱导免疫原性细胞死亡实现免疫治疗。另一方面，在肿瘤免疫微环境中，纳米载体还可以通过靶向免疫细胞或器官来改变免疫抑制途径，提高免疫治疗效果。
多种材料被设计为纳米载体应用于免疫治疗中，特别是一些无机纳米颗粒常被作为理想的载体材料。在这些无机纳米材料中，获得FDA临床批准的磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒常作为生物安全性载体应用于免疫治疗中。这是由于铁元素在人体中的含量丰富，并且在多种生物过程中始终发挥着重要作用。同时，Fe3O4纳米颗粒也具有相关的免疫杀伤作用，例如，Fe3O4纳米颗粒可通过Fenton反应诱导肿瘤相关巨噬细胞表型从M2表型极化为M1表型，产生的活性氧(ROS)和激活的巨噬细胞联合促进了肿瘤细胞的凋亡。另外，也有研究报道了OVA修饰的Fe3O4纳米颗粒用于肿瘤免疫治疗，其中，低剂量的Fe3O4纳米颗粒就可作为激活剂促进免疫治疗的效果。在众多研究中，Fe3O4纳米颗粒最常见的作用是在免疫治疗中被用作纳米载体，将治疗成分传递给肿瘤。
双特异性抗体是通过基因工程将两个单链抗体的Fab端通过短链(Fc端)连接而成的抗体，是一种可以与两种特异性抗原结合的人工抗体。双特异性抗体最常见的形式是同时结合两种抗原，一种抗原是肿瘤表面特异性表达的，具有驱使抗体主动靶向肿瘤的功能；另一种抗原是T细胞上的CD3，能实现对T细胞的活化。在多例临床试验中，双特异性抗体已被证实在增强肿瘤治疗方面具有突出的效果，在调节抗癌活性方面非常有效。例如，博纳吐单抗(blinatumomab)，作为一种抗CD3和CD19的双特异性抗体，临床试验证明，这种抗体在剂量较低情况下(0.015mg/m2/天或0.6ng/mL血清)能有效缓解B细胞淋巴瘤患者的疾病进展。卡妥索单抗，作为可有效靶向CD3和上皮细胞粘附分子(EpCAM)的双特异性抗体，能有效缓解胃癌和卵巢癌患者的恶性腹水，减缓恶性肿瘤的生长速度。虽然这些双特异性抗体均表现出很好的免疫杀伤效果，但在临床应用中也存在一定的问题，例如在抗体制备工艺复杂、批量生产时一致性难于控制，血液半衰期较短，因此很难有效地传递并靶向到肿瘤部位。同时，由于抗体本身结合价数低，亲和力难于调控，功能相对单一等问题，因此亟需发展新型的可控性更强的靶向抗体免疫治疗策略。
磁性纳米颗粒作为纳米载体不仅自身具有一些免疫效应，还具有负载化疗药物、磁靶向、磁分离、磁共振成像、磁感应热疗等功能，同时表面易于化学修饰而引入各种功能基团，从而化学偶联各种功能性生物分子，如抗体、适配体、多肽、小分子配体等。磁性纳米颗粒的尺寸从5nm到200nm可调，因此为生物分子偶联提供了较大的可调的表面积，种类上可以偶联不同的抗体等生物分子，数量上可以偶联几个、几十个甚至成千上万个抗体等分子，从而可构建出多特异性、多价结合并可调可控的纳米颗粒-抗体复合物，因此表现出比双特异性抗体更丰富的可设计性与多功能性。
发明内容
技术问题：本发明的目的是针对双特异性或多特异性抗体免疫治疗需求，以磁性纳米颗粒作为载体，设计一种模块化易于组合的双特异性磁性纳米复合物，用于实现影像学指导下的靶向直接杀伤肿瘤细胞与诱导免疫治疗。
技术方案：本发明通过以下技术方案予以实现：
本发明的一种模块化双特异性磁性纳米复合物主要由两部分组成，其核心部分是链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒水溶液，另外一部分是两种或两种以上以不同比例复配的生物素修饰的功能化配体的冻干粉，所述两部分使用时按照所需比例进行复配并分散于葡萄糖或氯化钠注射液中，制成具有双特异性的肿瘤杀伤效果的磁性纳米复合物。
所述核心部分的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒为球形、立方体、哑铃型或星形具有不同形貌的Fe3O4纳米颗粒经高分子聚合物修饰后通过化学键连接链霉亲和素，制备出的磁性纳米颗粒在水溶液中稳定存在，其水动力尺寸在5-200nm之间。
所述的生物素修饰的功能化配体包括抗体、适配体、多肽、化学药物具有特异性的功能化分子，其通过化学键与生物素交联，每个配体上标记上不少于一个生物素；将两种或两种以上以不同比例复配的生物素修饰的功能化配体分散于缓冲溶液中，加入冻干保护剂与赋形剂，制备成冻干粉。
构成纳米复合物中核心部分的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒与生物素修饰的功能化配体的连接通过亲和素和生物素的特异性结合，并且这些生物素修饰的配体作为不同模块，通过简单的替换和组合修饰在磁性纳米颗粒表面，构建出具有不同功能的纳米复合物。
所述纳米复合物包含两种或两种以上不同功能化的配体作为不同模块，修饰在纳米复合物表面；其中，不同的配体在纳米颗粒表面分布的数量是随机的，且各配体间不存在相互作用效果。
所述纳米复合物中的功能化配体需包含一种或一种以上具有招募和诱导免疫细胞杀伤肿瘤细胞的分子，经修饰后的纳米复合物能增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
所述纳米复合物中的功能化配体需包含一种或一种以上具有靶向肿瘤细胞并可诱导肿瘤细胞凋亡的分子，经修饰后的纳米复合物具有直接杀伤肿瘤细胞的效果。
本发明的一种模块化双特异性磁性纳米复合物的应用，该模块化双特异性磁性纳米复合物通过磁性纳米颗粒进行磁靶向与磁共振成像，实现磁场与影像指导下的肿瘤精准治疗。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明与现有纳米复合物的构建方式不同，该方法提出了以生物素-亲和素特异性结合的方式构建模块化纳米复合物的方法，这种方法的优点是通过对不同模块进行简单替换和组合，可构建出多种配体修饰的具有不同功能的纳米复合物。其中，功能化的模块包含具有免疫激活和肿瘤细胞靶向的分子，这些分子修饰在磁性Fe3O4纳米颗表面构建出的纳米复合物一方面能主动靶向肿瘤细胞诱导细胞凋亡，另一方面也能激活免疫细胞，提高免疫细胞的杀伤效果。这种模块化复合物可根据治疗需求灵活进行组合，制备简单方便，易于控制和批量制备。同时，基于磁性纳米颗粒自身的免疫效应、负载化疗药物、磁靶向、磁分离、磁共振成像、磁感应热疗等功能，还可以实现影像学指导下的多机制协同治疗。
附图说明
图1是模块化双特异性磁性纳米复合物的构成结构示意图。
图2a至图2d是不同表面修饰的Fe3O4(核尺寸为5纳米)纳米颗粒的透射电镜图。其中，图2a为高温热解法制备的油胺(OAm)修饰的Fe3O4纳米颗粒(OAm@Fe3O4)；图2b为配体交换法制备的水溶性聚乙二醇(PEG)修饰的Fe3O4纳米颗粒(PEG@Fe3O4)，图2c为链霉亲和素(SA)偶联后的Fe3O4纳米颗粒(SA@Fe3O4)；图2d为CD20单抗和CD3
单抗修饰的模块化双特异性磁性纳米复合物(CD20&CD3@Fe3O4)。
图3a至图3d是不同表面修饰的水溶性Fe3O4(核尺寸为5纳米)的表征数据图。其中，图3a为PEG@Fe3O4，SA@Fe3O4，CD20&CD3@Fe3O4的水动力尺寸；图3b为PEG@Fe3O4，SA@Fe3O4，CD20&CD3@Fe3O4的饱和磁化强度；图3c为PEG@Fe3O4和SA@Fe3O4的红外光谱；图3d为PEG@Fe3O4，SA@Fe3O4，CD20&CD3@Fe3O4的弛豫率。
图4a至图4f为体外细胞实验数据图。其中图4a至图4c分别是不同浓度的SA@Fe3O4和CD20@Fe3O4与Raji细胞共孵育24小时，48小时和72小时后，Raji细胞的细胞活性图；图4d至图4f分别是在效靶比分别为5:1，10:1和20:1的条件下，加入不同浓度的CD20&CD3@Fe3O4纳米复合物24小时后，靶细胞的细胞活性图(其中效应细胞为T细胞，靶细胞为Raji细胞和K562细胞)。
图5a至图5e为Raji细胞构建的淋巴瘤小鼠的体内实验数据图。其中，图5a为荷瘤小鼠注射CD20@Fe3O4纳米复合物后不同时间点的T1增强的磁共振成像图(纳米复合物的注射方式为尾静脉注射，注射剂量为5毫克[Fe]/Kg)；图5b为小鼠肿瘤部位的信噪比变化图；图5c至图5e为经不同治疗组治疗后，各组荷瘤小鼠的肿瘤生长情况，体重变化和生存曲线(治疗组分为四组，分别是PBS治疗组，T细胞治疗组，CD20&CD3@Fe3O4纳米复合物和T细胞与CD20&CD3@Fe3O4纳米复合物联合治疗组。其中，T细胞为单次给药，给药剂量为每只小鼠注射1×107个细胞；纳米复合物和PBS为多次给药，纳米复合物的注射剂量为5毫克[Fe]/Kg，总计给药4次，间隔5天给药一次。所有治疗均在小鼠进行皮下移植瘤10天后开始)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读本发明之后，本领域的技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请的权利要求所限定的范围。
本发明的一种模块化双特异性磁性纳米复合物主要由两部分组成(图1)，其核心部分是链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒水溶液，另外一部分是两种或两种以上以不同比例复配的生物素修饰的功能化配体的冻干粉，所述两部分使用时按照所需比例进行复配并分散于葡萄糖或氯化钠注射液中，制成具有双特异性的肿瘤杀伤效果的磁性纳米复合物。具体实施例如下。
实施例1
高温热解法制备油相尺寸为5nm的Fe3O4纳米颗粒。
取5.25克乙酰丙酮铁(Fe(acac)3)粉末于500毫升三口烧瓶中，然后加入40毫升二苄醚和60毫升油胺，混合均匀，反应物在氮气保护及冷凝管回流状态下进行程序升温反应。调节控温装置设置成两个阶段的程序升温过程，第一阶段为从室温升至220℃后温度恒定维持1小时，升温速度为3.3℃/min；第二阶段为从220℃继续升温至290℃后维持恒定温度5分钟，升温速度为3.3℃/min。反应结束后，冷却至室温，即可获得粒径为5纳米的OAm@Fe3O4。为了除去体系中未反应的残留物，将反应后的溶液转移到烧杯中，加入100毫升无水乙醇，磁分离洗涤4次，倒掉上清液，取OAm@Fe3O4沉淀将其溶于100毫升的氯仿中(浓度为每毫升10毫克[Fe])，常温状态下保存。
实施例2
配体交换法制备水溶性磁性纳米颗粒PEG@Fe3O4。
准确称取60毫克双羧基端PEG2000，3.9毫克盐酸多巴胺，9毫克NHS，11毫克DCC和30毫克无水碳酸钠置于100毫升的三口烧瓶中，加入3毫升DMF和6毫升氯仿，混合均匀，室温静置1小时。在35℃下水浴中静置1小时，以每分钟500转速度搅拌2小时后加入15毫克OAm@Fe3O4，将转速降至每分钟250转，继续反应18小时。最后，将反应所得产物置于烧杯中加入15毫升正己烷混匀后进行磁分离，舍弃上清液，下层沉淀用氮气吹干，加入10毫升超纯水超声溶解后即得PEG化的Fe3O4纳米颗粒(PEG@Fe3O4)。将水溶后的产物用30KDa的透析袋透析72小时除去过量的反应物，再用0.22微米的滤膜除去较大的聚集体，得到纯化后的PEG@Fe3O4水溶液(浓度每毫升1毫克[Fe])
实施例3
化学偶联法制备水溶性磁性纳米颗粒SA@Fe3O4。
将1毫克PEG@Fe3O4，2.3毫克EDC，1.3毫克NHS混合置于0.01M pH＝5.5的MES缓冲液中，室温下摇床振荡30分钟，摇速为每分钟120转，将所得的溶液移入30KDa的超滤离心管中，超滤离心3次，转速为每分钟5000转，时长5分钟。然后，将活化后的PEG@Fe3O4与1.5毫克链霉亲和素置于0.02M pH＝8.0的硼酸盐(BB)缓冲液中，摇床振荡过夜，摇速为每分钟120转，溶液过磁分离柱后，洗脱后即得SA@Fe3O4纳米颗粒水溶液。
实施例4
单克隆抗体的生物素化与冻干粉制备。
将Biotin-PEG-NHS用无水DMF配制成浓度为每毫升1毫克的溶液置于-20℃冰箱中，备用。在1毫克单克隆抗体(CD3抗体或CD20抗体)中加入8微升生物素溶液并用0.1M的硼酸缓冲液调节反应体系pH＝9.0，置于37℃摇床中，每分钟120转摇速下振荡45分钟，反应完成后将所得样品用0.01M pH＝8.0的硼酸缓冲液超滤离心4次，离心转速为每分钟5000转，每次时长10分钟，即得生物素修饰的单克隆抗体。将生物素修饰的CD3抗体与CD20抗体混合，加入PEG400、蔗糖、白蛋白作为保护剂与赋形剂，冷冻干燥后的生物素修饰的CD3抗体与CD20抗体的冻干粉。
实施例5
模块化纳米复合物的构建。
将含有1毫克SA@Fe3O4的水溶液(1毫升)与含有1.5毫克生物素修饰的CD20和CD3单抗的冻干粉混合，充分震荡混匀，即得模块化纳米复合物(CD20&CD3@Fe3O4)，使用时根据需要采用5％葡萄糖注射液、或0.9％氯化钠注射液、或PBS等缓冲溶液分散即可。
实施例6
模块化纳米复合物体外杀伤效果。
将不同铁含量浓度的SA@Fe3O4和CD20@Fe3O4与Raji细胞共孵育24小时，48小时和72小时后，测定Raji细胞的细胞活性，验证纳米复合物对Raji细胞的杀伤作用。在效靶比分别为5:1，10:1和20:1的条件下，加入不同浓度的CD20&CD3@Fe3O4，共孵育24小时后，测定靶细胞的细胞活性，验证纳米复合物可以增强T细胞介导细胞杀伤效果(其中效应细胞为T细胞，靶细胞为实验组Raji细胞和对照组K562细胞)。
实施例7
模块化纳米复合物体内杀伤效果。
选取荷瘤小鼠(Raji细胞构建的皮下瘤)20只，每组5只，随机分为4组，分别是双特异模块化磁性纳米复合物治疗组(CD20&CD3@Fe3O4)，T细胞治疗组(T Cell)，双特异性纳米复合物联合T细胞治疗组(CD20&CD3@Fe3O4，T Cell)，注射PBS缓冲液空白组(PBS)。建模10天后，通过尾静脉注射方式给药，具体治疗方案和时间为：T细胞为单次注射，浓度为每毫升5×108个细胞，每只小鼠尾静脉注射100微升细胞悬液；纳米复合物分4次注射，每次给药剂量为每公斤小鼠体重注射5毫克以铁含量计的纳米复合物，间隔5天给药一次。注意缓慢注射给药防止注射速度过快引起小鼠心力衰竭，同时也能避免药物溢出。
以上详细描述了本发明的实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种等同变换，这些等同变换均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种模块化双特异性磁性纳米复合物，其特征在于该纳米复合物主要由两部分组成，其核心部分是链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒水溶液，另外一部分是两种或两种以上以不同比例复配的生物素修饰的功能化配体的冻干粉，所述两部分使用时按照所需比例进行复配并分散于葡萄糖或氯化钠注射液中，制成具有双特异性的肿瘤杀伤效果的磁性纳米复合物。
2.根据权利要求1所述一种模块化双特异性磁性纳米复合物，其特征在于所述核心部分的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒为球形、立方体、哑铃型或星形具有不同形貌的Fe3O4纳米颗粒经高分子聚合物修饰后通过化学键连接链霉亲和素，制备出的磁性纳米颗粒在水溶液中稳定存在，其水动力尺寸在5-200nm之间。
3.根据权利要求1所述一种模块化双特异性磁性纳米复合物，其特征在于所述的生物素修饰的功能化配体包括抗体、适配体、多肽、化学药物具有特异性的功能化分子，其通过化学键与生物素交联，每个配体上标记上不少于一个生物素；将两种或两种以上以不同比例复配的生物素修饰的功能化配体分散于缓冲溶液中，加入冻干保护剂与赋形剂，制备成冻干粉。
4.根据权利要求1所述一种模块化双特异性磁性纳米复合物，其特征在于构成纳米复合物中核心部分的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒与生物素修饰的功能化配体的连接通过亲和素和生物素的特异性结合，并且这些生物素修饰的配体作为不同模块，通过简单的替换和组合修饰在磁性纳米颗粒表面，构建出具有不同功能的纳米复合物。
5.根据权利要求1所述一种模块化双特异性磁性纳米复合物，其特征在于所述纳米复合物包含两种或两种以上不同功能化的配体作为不同模块，修饰在纳米复合物表面；其中，不同的配体在纳米颗粒表面分布的数量是随机的，且各配体间不存在相互作用效果。
6.根据权利要求1所述一种模块化双特异性磁性纳米复合物，其特征在于所述纳米复合物中的功能化配体需包含一种或一种以上具有招募和诱导免疫细胞杀伤肿瘤细胞的分子，经修饰后的纳米复合物能增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。
7.根据权利要求1所述一种模块化双特异性磁性纳米复合物，其特征在于所述纳米复合物中的功能化配体需包含一种或一种以上具有靶向肿瘤细胞并可诱导肿瘤细胞凋亡的分子，经修饰后的纳米复合物具有直接杀伤肿瘤细胞的效果。
8.一种如权利要求1所述一种模块化双特异性磁性纳米复合物的应用，其特征在于该模块化双特异性磁性纳米复合物通过磁性纳米颗粒进行磁靶向与磁共振成像，实现磁场与影像指导下的肿瘤精准治疗。
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