CN110501208A - 叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒、其制备方法和应用 - Google Patents
叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒、其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110501208A CN110501208A CN201810472017.5A CN201810472017A CN110501208A CN 110501208 A CN110501208 A CN 110501208A CN 201810472017 A CN201810472017 A CN 201810472017A CN 110501208 A CN110501208 A CN 110501208A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- magnetic nanoparticle
- nano particle
- folic acid
- streptavidin
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/34—Purifying; Cleaning
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4022—Concentrating samples by thermal techniques; Phase changes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4077—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids
- G01N2001/4094—Concentrating samples by other techniques involving separation of suspended solids using ultrasound
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了一种叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒,所述纳米颗粒为使用亲水性羧基化超顺磁性纳米颗粒以链霉亲和素修饰、进而结合生物素标记的偶联聚乙二醇的叶酸分子制得。还提供了该纳米颗粒的制备方法和应用。本发明所述的纳米颗粒成本低,生物相容性好,为在临床血液样品中的应用提供可能。另外,本发明不同于传统的靶向上皮细胞粘附分子的循环肿瘤细胞分离技术,叶酸功能化磁性纳米颗粒可捕获上皮细胞粘附分子表达受限、恶性程度较高的肿瘤细胞,提供了一种富集、分离和检测循环肿瘤的快速、准确和低成本的检测技术,为临床肿瘤转移患者的预后判断、疗效监测、转移复发监测、早期检测等提供了有效方法。
Description
技术领域
本发明属于基于功能化纳米材料的液体活检技术领域,具体涉及一种叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒,及其制备方法和应用。
背景技术
尽管基于靶向上皮细胞粘附分子的循环肿瘤细胞捕获技术取得了一定成功,但仍存在由上皮-间质转化过程导致的循环肿瘤细胞丢失的可能性,因此亟需建立上皮细胞粘附分子补充标志物库。叶酸受体是一类糖基磷脂酰肌醇受体,广泛过量表达于卵巢癌、宫颈癌、三阴性乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌等肿瘤细胞中,且其表达量水平与癌症恶化程度呈正相关关系,故有望作为用于循环肿瘤细胞分离的目标靶点。
目前应用于癌症和炎症疾病的叶酸受体靶向治疗方案主要基于对叶酸受体抗体、叶酸偶合物以及叶酸拮抗剂的研发,然而其作为有效的循环肿瘤细胞标志物在相关研究和临床应用中依然没有得到充分重视和发展。现今已有的唯一经CFDA批准的商品化肺癌循环肿瘤细胞检测--叶酸受体阳性循环肿瘤细胞检测试剂盒(上海格诺生物科技有限公司)基于较为复杂的PCR技术,通过有效结合CTC的探针数目与循环肿瘤细胞数目的比例换算最终得到循环肿瘤细胞检测结果。这一技术只能对循环肿瘤细胞进行简单和初步的技术,而无法保留细胞的完整形态实现进一步的分子生物学表征与分析。
发明内容
因此,本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷,提供一种叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒,及其制备方法和应用。
在阐述本发明内容之前,定义本文中所使用的术语如下:
术语“EDC”是指:1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
术语“sulfo-NHS”是指:N-羟基硫代琥珀酰亚胺。
术语“PBS”是指:磷酸缓冲盐溶液。
术语“MNP”是指:磁性纳米颗粒。
术语“DiO”是指:3-十八烷基-2-[3-(3-十八烷基-2(3H)-苯并恶唑-2-亚基)-1-丙烯-1-基]苯并恶唑高氯酸盐。
术语“MES”是指:2-吗啉乙磺酸。
为实现上述目的,本发明的第一方面提供了一种叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒,所述纳米颗粒为使用亲水性羧基化超顺磁性纳米颗粒以链霉亲和素修饰、进而结合生物素标记的偶联聚乙二醇的叶酸分子制得。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的纳米颗粒的制备方法,该制备方法可以包括以下步骤:
(1)羧基化磁性纳米颗粒的制备:将FeCl3·6H2O溶于乙二醇形成透明溶液后,加入无水乙酸钠与无水丙烯酸钠,加热剧烈搅拌,形成悬浮液后超声,加热超声后的悬浊液制得羧基化磁性纳米颗粒;
(2)链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒的制备:将步骤(1)制得的羧基化磁性纳米颗粒转移至缓冲溶液中形成分散体系;将EDC和sulfo-NHS溶解于上述磁性纳米颗粒分散体系中对所述羧基化磁性纳米颗粒进行活化;洗涤所述活化后的磁性纳米颗粒重新分散于链霉亲和素溶液振荡反应,制得链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒;
(3)叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒的制备:将步骤(2)制得的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒分散于牛血清蛋白溶液中并生物素标记的偶联聚乙二醇的叶酸分子共同孵育,制得叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒。
根据本发明第二方面的制备方法,其中,所述步骤(1)中,所述FeCl3·6H2O的乙二醇溶液浓度为0.05M~0.5M,优选为0.1M~0.2M,最优选为0.125M。
根据本发明第二方面的制备方法,其中,所述步骤(1)中,所述加热温度为150~250℃,优选为180℃~220℃,最优选为200℃;所述加热时间为4~10小时,优选为6~9小时,最优选为8小时。根据本发明第二方面的制备方法,其中,所述步骤(2)中:
所述缓冲溶液选自以下一种或多种:MES缓冲溶液,PBS缓冲溶液;优选为MES缓冲溶液;和/或
所述链霉亲和素溶液的溶剂为PBS。
根据本发明第二方面的制备方法,其中,所述步骤(3)中,所述孵育温度为4℃~37℃,优选为4℃~-25℃,最优选为4℃;所述孵育时间为1小时~16小时,优选为4小时~12小时,最优选为10小时。
本发明的第三方面提供了第一方面所述的纳米颗粒或按照第二方面所述的方法制备的纳米颗粒在制备用于循环肿瘤细胞捕获的药物和/或医疗产品中的应用。
根据本发明第三方面的应用,其中,所述肿瘤细胞为叶酸受体阳性的肿瘤细胞;优选地,所述肿瘤细胞选自以下一种或多种:卵巢癌肿瘤细胞、宫颈癌肿瘤细胞、三阴性乳腺癌肿瘤细胞、结肠癌肿瘤细胞、非小细胞肺癌肿瘤细胞。
本发明的第四方面提供了一种基于叶酸受体的用于捕获循环肿瘤细胞的纳米材料,所述材料包含:根据第一方面所述的、或按照第二方面所述方法所制备的纳米颗粒;以及用于捕获所述循环肿瘤细胞的有需要的载体或辅料。
本发明的第五方面提供了一种用于循环肿瘤细胞捕获的试剂盒,所述试剂盒包括根据第一方面所述的纳米颗粒或按照第二方面所述方法制备的纳米颗粒。
本发明涉及叶酸功能化磁性纳米颗粒对循环肿瘤细胞特异性识别捕获的应用,本发明的目的是提供一种功能化纳米材料及其在循环肿瘤细胞的捕获与检测方面的应用。所述技术可通过优化的溶剂热还原法制备得到亲水性羧基化超顺磁性纳米颗粒,并经过EDC/sulfo-NHS结合手段用链霉亲和素修饰产物,进而结合生物素标记的偶联聚乙二醇的叶酸分子(biotin-PEG-FA)实现特异性功能化,最终实现对叶酸受体阳性的肿瘤细胞的高效捕获。本发明方法简单、成本低,且叶酸功能化磁性纳米颗粒对循环肿瘤细胞具有较高的灵敏性以及较弱的非特异性吸附;丰富了现今循环肿瘤细胞的捕获方法。
所述应用用于实现对叶酸受体阳性、恶性程度较高的循环肿瘤细胞的高效磁性免疫捕获,提高灵敏度以及纯度。
本发明提供一种制备用于高效捕获循环肿瘤细胞的功能化纳米材料的方法,所述方法包括:
1)通过优化的溶剂热还原法制备得到亲水性羧基化超顺磁性纳米颗粒,并经过EDC/sulfo-NHS结合手段用链霉亲和素修饰产物,进而结合生物素标记的偶联聚乙二醇的叶酸分子(biotin-PEG-FA),实现特异性功能化。
2)通过叶酸功能化磁性纳米颗粒与血液中的循环肿瘤细胞共同孵育和在外加磁场下进行磁性分离的过程,实现对循环肿瘤细胞的高灵敏度和高特异性捕获。
具体地,上述实现对叶酸受体阳性、恶性程度较高的循环肿瘤细胞的高效磁性免疫捕获方法,包括以下步骤:
1)将FeCl3·6H2O溶于乙二醇形成透明溶液后,加入无水乙酸钠与无水丙烯酸钠,加热剧烈搅拌,形成悬浮液后超声,转移并密封于四聚氟乙烯不锈钢反应釜中,从室温缓慢升温至反应温度并持续加热。
2)将磁性纳米颗粒在转移至缓冲溶液中;将EDC和sulfo-NHS溶解于上述磁性纳米颗粒分散体系中,在室温下剧烈振荡反应。
3)链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒分散于牛血清蛋白溶液中并生物素标记的偶联聚乙二醇的叶酸分子共同孵育。
4)取培养的肿瘤细胞,消化为单细胞分散于缓冲溶液中,用DIO预染细胞质膜。取经充分染色的肿瘤细胞分散至经叶酸功能化磁性纳米颗粒的牛血清蛋白溶液中。肿瘤细胞与磁性纳米颗粒振荡共孵育后,在外加磁场的作用下分离得到被磁性纳米颗粒捕获到的肿瘤细胞,并使用荧光显微镜对其进行观察、分析和拍照。
优选地,肿瘤细胞为肺癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、卵巢癌细胞、结肠癌细胞等。
本发明的叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒可以具有但不限于以下有益效果:
本发明所述的对肿瘤细胞表面叶酸受体进行特异性识别的新方法所用的叶酸功能化磁性纳米颗粒材料成本低,生物相容性好,为在临床血液样品中的应用提供可能。另外,本发明不同于传统的靶向上皮细胞粘附分子的循环肿瘤细胞分离技术,叶酸功能化磁性纳米颗粒可捕获上皮细胞粘附分子表达受限、恶性程度较高的肿瘤细胞,提供了一种富集、分离和检测循环肿瘤的快速、准确和低成本的检测技术,为临床肿瘤转移患者的预后判断、疗效监测、转移复发监测、早期检测等提供了有效方法。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1示出了羧基化Fe3O4纳米颗粒的透射电镜显微图像;其中图1a示出了单位长度为1微米下的透射电镜显微图像;图1b示出了单位长度为0.5微米下的透射电镜显微图像。
图2示出了羧基化Fe3O4纳米颗粒的粒径分布;其中图2a示出了透射电镜显微图像统计结果,图2b示出了动态光散射统计结果。
图3示出了羧基化Fe3O4纳米颗粒磁滞后曲线。
图4示出了羧基化Fe3O4纳米颗粒傅里叶变换红外光谱分析;其中a为未修饰Fe3O4纳米颗粒红外吸收曲线;b为羧基化Fe3O4纳米颗粒红外吸收曲线;c为链霉亲和素修饰的Fe3O4纳米颗粒红外吸收曲线;d为叶酸功能化的Fe3O4纳米颗粒红外吸收曲线。
图5示出了动态光散射测得不同类别磁性纳米颗粒在纯水中水合直径的变化;其中a为未修饰Fe3O4纳米颗粒在纯水中水合直径的分布;b为羧基化Fe3O4纳米颗粒在纯水中水合直径的分布;c为链霉亲和素修饰的Fe3O4纳米颗粒在纯水中水合直径的分布;d为叶酸功能化的Fe3O4纳米颗粒在纯水中水合直径的分布。
图6示出了叶酸功能化磁性纳米颗粒捕获得到Hela细胞的荧光显微图像;其中a为光学图像;b为绿色荧光标记的DIO预染活细胞图像;c为a与b的叠加图像。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的,但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚,在上下文中,如果未特别说明,本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
除非特别指明,以下实施例中所用的细胞系Hela购自中国医学科学院。
除非特别指明,以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液。
除非特别指明,以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。
除非特别指明,以下实施例中所用的PBS溶液均为1×PBS溶液。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下:
试剂:
FeCl3·6H2O,乙二醇,无水乙酸钠,无水丙烯酸钠,乙醇,购自国药集团化学试剂有限公司;
MES缓冲溶液,EDC,sulfo-NHS,PBS,PBS的链霉亲和素溶液,牛血清蛋白溶液,RPMI-1640培养基购自赛默飞世尔科技有限公司;
生物素标记的偶合聚乙二醇叶酸分子购自上海芃硕生物科技有限公司;
人急性早幼粒白血病细胞HL-60细胞,,购自中国医学科学院。
仪器:
200KV六硼化镧透射电子显微镜,购自美国FEI公司、型号Tecnai G2 20S-TWIN;
纳米粒度及Zeta电位分析仪,购自英国马尔文仪器有限公司、型号ZetasizerNano ZS;
物理性能分析仪(PPMS)磁强计,购自美国量子设计公司、型号PPMS-9;
傅里叶变换红外光谱仪,购自美国Perkin Elmer InstrumentsCo.Ltd.、型号Spectrum One;
流式细胞仪,购自美国BD医疗器械有限公司、型号Accuri C6;
荧光显微镜,购自奥林巴斯有限公司、型号IX75。
实施例1
本实施例用于说明本发明磁性纳米颗粒的合成。
1)将1.35gFeCl3·6H2O溶于40ml乙二醇形成橙红色透明溶液后,加入3.6g无水乙酸钠与1.0g无水丙烯酸钠,并加热50℃剧烈搅拌,形成土黄色悬浮液后超声30分钟以上。充分超声后的悬浊液转移并密封于四聚氟乙烯不锈钢反应釜中,从室温以升温速率3℃/分钟缓慢升温至反应温度200℃并持续加热8小时。
2)产物在磁场强度为1000kOe外加磁场作用下从液体中分离出来后,先后用50ml乙醇和100ml超纯水洗涤三次去除残余溶剂和无机盐。完成预处理之后,磁性纳米颗粒保存于乙醇中待用。
磁性纳米颗粒的形貌以及粒径特征由透射电子显微镜成像表征。从图1中的透射电镜图像中可以看出,磁性纳米颗粒呈现出规整的球形,粒径分布主要位于300-400纳米之间。经统计分析,透射电镜图像呈现的纳米粒子平均粒径为389.36纳米,且同一批次的样品经动态光散射测算的结果显示其平均粒径为386.8纳米。
磁性纳米颗粒的磁饱和强度由振动样品磁强计测得,结果如图3所示。磁饱和强度的测算结果显示,该磁性纳米颗粒的磁饱和强度为48em/g;且样品的磁曲线包含有坐标原点(0,0);这一结果确认了合成产物为超顺磁性材料,在没有外加磁场作用的条件下不受内部的磁相互作用,从而确保其在溶液中具有分散稳定性的优势。
实施例2
本实施例用于说明本发明磁性纳米颗粒的叶酸功能化与表征。
1)固含量为5mg磁性纳米颗粒在充分超声后转移至1ml MES缓冲溶(pH=6.5)液中;10mg EDC(保存于-20℃)和10mg sulfo-NHS(保存于4℃)放置至室温后溶解于上述磁性纳米颗粒分散体系中,在室温下剧烈振荡反应15分钟。
2)活化后的磁性纳米颗粒经1ml PBS洗涤三次除去多余EDC并重新分散于溶解于1ml PBS的浓度为1.0mg/ml链霉亲和素溶液。新的磁性纳米颗粒分散液以之前的转速1000rpm在室温下振荡反应4小时。修饰后的磁性纳米颗粒经1ml PBS洗涤三次并保存于PBS中。
3)链霉亲和素修饰的MNP分散于1ml溶于PBS中5%牛血清蛋白溶液中并与浓度为1mg/ml生物素标记的偶合聚乙二醇叶酸分子在4℃下共同孵育10小时。经叶酸功能化后的磁性纳米颗粒用1ml PBS洗涤三次除去多余聚乙二醇。
产物修饰以及功能化前后傅里叶变换红外光谱表征结果如附图4所示。材料修饰以及功能化前后均大约在波数560cm-1处有一峰面积较大的峰,该处的特征吸收峰为Fe3O4的特征信号,这一结果表明颗粒的最主要成分确为Fe3O4;且在不添加丙烯酸钠的条件下,1550cm-1和1400cm-1附近两处位置附近没有出现明显的羧酸酸盐特征峰(分别对应丙烯酸盐的不对称振动和对称振动),该结果是丙烯酸钠与铁原子络合的有力证据。
在动态光散射的分析结果中(如图5及表1所示),未经修饰的磁性纳米颗粒在纯水中的平均水合直径为1258纳米,说明其具有较强的团聚趋势,在水溶剂中的分散性较差;羧基化的磁性纳米颗粒在纯水中的平均水合直径为386.8纳米,接近透射电镜图像统计计算的结果389.36纳米,说明其在水溶剂趋向于单颗粒分散,具有较好的分散稳定性;而经链霉亲和素修饰后的磁性纳米颗粒在纯水中的平均水合直径上升至720.1纳米,再进一步偶合叶酸功能化分子后颗粒的平均水合直径变为664.4纳米,并没有产生明显变化,这是由于柔性高分子链PEG具有很好的亲水性和抗非特异性吸附的能力,从而确保叶酸功能化磁性纳米颗粒在组分复杂的血液环境中能够具有较好的分散稳定性以及较弱的非特异性吸附。
除了在纯水中的水合直径的变化,Zeta电势的变化也能体现磁性纳米颗粒表面组分的改变。完全裸露的Fe3O4纳米颗粒显电正性,Zeta电势为14.3mV;羧基化的磁性纳米颗粒表面羧基基团主要以羧酸盐阴离子的形式存在,故显电负性,Zeta电势为-48.9mV;经链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒Zeta电势变为-28.5mV,这是由于链霉亲和素中和了一部分羧酸盐的电负性;而进一步偶合聚乙二醇-叶酸分子后,由于聚乙二醇分子具有电中性导致Zeta电势没有发生显著变化。
表1不同类别磁性纳米颗粒的平均直径、PDI、Zeta电势的变化
磁性纳米颗粒类别 | Z-平均直径(nm) | PDI | Zeta电势(mV) |
未修饰 | 1258 | 0.346 | 14.3 |
羧基化 | 386.8 | 0.071 | -48.9 |
链霉亲和素化 | 720.1 | 0.175 | -28.5 |
叶酸功能化 | 664.4 | 0.194 | -29.7 |
试验例1
本实施例用于说明本发明叶酸功能化磁性纳米颗粒的癌细胞捕获。
1)宫颈癌Hela细胞和人急性早幼粒白血病细胞HL-60细胞持续使用添加10%高温灭活胎牛血清以及1%链霉素-青霉素的RPMI-1640培养基在细胞培养箱中培养,箱内保持37℃恒温以及湿润空气的5%CO2气体环境。
2)取对数生长期中的培养细胞,经胰蛋白酶消化为单细胞分散于PBS中,经过洗涤、计数后分别用叶酸结合蛋白抗体染色,染色过程严格遵照相关产品使用说明。另有IgG作为同型对照。在进行流式细胞检测前,用PBS洗去未结合抗体。通过流式细胞术的检测,确定细胞中叶酸受体表达水平。
3)取对数生长期中的培养细胞,经胰蛋白酶消化为单细胞分散于PBS中,经过洗涤、计数后用DIO预染细胞质膜。取少量经充分染色的细胞分散至经叶酸功能化磁性纳米颗粒的牛血清蛋白溶液中。细胞与磁性纳米颗粒在室温下避光轻微振荡共孵育后,在外加磁场的作用下分离得到被磁性纳米颗粒捕获到的细胞,并使用荧光显微镜对其进行观察、分析和拍照。
链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒经叶酸功能化用于捕获实验室培养的叶酸受体过量表达的宫颈癌细胞Hela。选择DIO作为细胞的荧光标记物对Hela进行预染。染色后的Hela与叶酸功能化的磁性纳米颗粒在室温条件下共同孵育1小时,在这一过程中被磁性纳米颗粒所捕获的细胞在外加磁场的作用下被分离收集,并通过荧光显微成像技术进行观察。在图6的荧光显微图像中可以观察到,肉眼可见的DIO染色细胞被致密的磁性纳米颗粒层所包覆,这一现象意味着叶酸功能化的磁性纳米颗粒有望在血液样本中以高灵敏度和高特异性捕获循环肿瘤细胞。
而用叶酸功能化磁性纳米颗粒对叶酸受体阴性的悬浮细胞人急性早幼粒白血病HL-60细胞进行捕获,则无法在荧光显微镜下观察到所捕获的细胞,说明该功能化磁性纳米颗粒具有高度特异性。
尽管本发明已进行了一定程度的描述,明显地,在不脱离本发明的精神和范围的条件下,可进行各个条件的适当变化。可以理解,本发明不限于所述实施方案,而归于权利要求的范围,其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (10)
1.一种叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒,其特征在于,所述纳米颗粒为使用亲水性羧基化超顺磁性纳米颗粒以链霉亲和素修饰、进而结合生物素标记的偶联聚乙二醇的叶酸分子制得。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)羧基化磁性纳米颗粒的制备:将FeCl3·6H2O溶于乙二醇形成透明溶液后,加入无水乙酸钠与无水丙烯酸钠,加热剧烈搅拌,形成悬浮液后超声,加热超声后的悬浊液制得羧基化磁性纳米颗粒;
(2)链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒的制备:将步骤(1)制得的羧基化磁性纳米颗粒转移至缓冲溶液中形成分散体系;将EDC和sulfo-NHS溶解于上述磁性纳米颗粒分散体系中对所述羧基化磁性纳米颗粒进行活化;洗涤所述活化后的磁性纳米颗粒重新分散于链霉亲和素溶液振荡反应,制得链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒;
(3)叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒的制备:将步骤(2)制得的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒分散于牛血清蛋白溶液中并生物素标记的偶联聚乙二醇的叶酸分子共同孵育,制得叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述FeCl3·6H2O的乙二醇溶液浓度为0.05M~0.5M,优选为0.1M~0.2M,最优选为0.125M。
4.根据权利要求2或3所述的方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述加热温度为150~250℃,优选为180℃~220℃,最优选为200℃;所述加热时间为4~10小时,优选为6-9小时,最优选为8小时。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法,其特征在于,所述步骤(2)中:
所述缓冲溶液选自以下一种或多种:MES缓冲溶液,PBS缓冲溶液;优选为MES缓冲溶液;和/或
所述链霉亲和素溶液的溶剂为PBS。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法,其特征在于,所述步骤(3)中,所述孵育温度为4℃~37℃,优选为4℃-25℃,最优选为4℃;所述孵育时间为1小时~16小时,优选为4小时-12小时,最优选为10小时。
7.根据权利要求1所述的纳米颗粒或按照权利要求2至6中任一项所述方法制备的纳米颗粒在制备用于循环肿瘤细胞捕获的药物和/或医疗产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述肿瘤细胞为叶酸受体阳性的肿瘤细胞;优选地,所述肿瘤细胞选自以下一种或多种:卵巢癌肿瘤细胞、宫颈癌肿瘤细胞、三阴性乳腺癌肿瘤细胞、结肠癌肿瘤细胞、非小细胞肺癌肿瘤细胞。
9.一种基于叶酸受体的用于捕获循环肿瘤细胞的纳米材料,其特征在于,所述材料包含:根据权利要求1所述的、或按照权利要求2至6中任一项所述方法所制备的纳米颗粒;以及用于捕获所述循环肿瘤细胞的有需要的载体或辅料。
10.一种用于循环肿瘤细胞捕获的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括根据权利要求1所述的纳米颗粒或按照权利要求2至6中任一项所述方法制备的纳米颗粒。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810472017.5A CN110501208B (zh) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | 叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒、其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810472017.5A CN110501208B (zh) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | 叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒、其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110501208A true CN110501208A (zh) | 2019-11-26 |
CN110501208B CN110501208B (zh) | 2023-06-27 |
Family
ID=68583909
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810472017.5A Active CN110501208B (zh) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | 叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒、其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110501208B (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111333692A (zh) * | 2020-03-02 | 2020-06-26 | 湖南省中医药研究院 | 一种白桦脂酸衍生物及其制备方法和应用 |
CN111569085A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-08-25 | 东南大学 | 一种模块化双特异性磁性纳米复合物及应用 |
CN113789302A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-12-14 | 南昌大学第二附属医院 | 用于肺癌循环肿瘤细胞富集分离试剂盒 |
CN113985039A (zh) * | 2021-10-21 | 2022-01-28 | 深圳市希莱恒医用电子有限公司 | 一种叶酸检测试剂盒及检测方法 |
CN115058359A (zh) * | 2022-05-18 | 2022-09-16 | 南昌大学第一附属医院 | 一种磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2432363A1 (en) * | 1998-02-12 | 1999-08-19 | Immunivest And Board Of Regents | Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells |
US20090324494A1 (en) * | 2006-02-24 | 2009-12-31 | Atgen Co., Ltd | Magnetic nano-composite for contrast agent, intelligent contrast agent, drug delivery agent for simultaneous diagnosis and treatment, and separation agent for target substance |
US20110085987A1 (en) * | 2009-10-08 | 2011-04-14 | Kaohsiung Medical University | Folic acid-mediated magnetic nanoparticle clusters for combined targeting, diagnosis, and therapy applications |
CN103275934A (zh) * | 2013-06-05 | 2013-09-04 | 南昌大学 | 微量循环肿瘤细胞的分离方法 |
CN103923192A (zh) * | 2013-01-15 | 2014-07-16 | 国家纳米科学中心 | 用于富集、分离和检测循环肿瘤细胞的多肽及其应用 |
CN104316683A (zh) * | 2014-10-14 | 2015-01-28 | 南昌大学 | 针对全血的卵巢癌细胞检测试剂盒 |
CN105308185A (zh) * | 2013-06-11 | 2016-02-03 | 3M创新有限公司 | 使用羧基官能化超顺磁性纳米团簇的磁性分离方法 |
CN105717288A (zh) * | 2016-01-28 | 2016-06-29 | 上海交通大学 | 一种表面修饰的磁性纳米颗粒及其制备方法与应用 |
-
2018
- 2018-05-17 CN CN201810472017.5A patent/CN110501208B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2432363A1 (en) * | 1998-02-12 | 1999-08-19 | Immunivest And Board Of Regents | Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells |
US20090324494A1 (en) * | 2006-02-24 | 2009-12-31 | Atgen Co., Ltd | Magnetic nano-composite for contrast agent, intelligent contrast agent, drug delivery agent for simultaneous diagnosis and treatment, and separation agent for target substance |
US20110085987A1 (en) * | 2009-10-08 | 2011-04-14 | Kaohsiung Medical University | Folic acid-mediated magnetic nanoparticle clusters for combined targeting, diagnosis, and therapy applications |
CN103923192A (zh) * | 2013-01-15 | 2014-07-16 | 国家纳米科学中心 | 用于富集、分离和检测循环肿瘤细胞的多肽及其应用 |
CN103275934A (zh) * | 2013-06-05 | 2013-09-04 | 南昌大学 | 微量循环肿瘤细胞的分离方法 |
CN105308185A (zh) * | 2013-06-11 | 2016-02-03 | 3M创新有限公司 | 使用羧基官能化超顺磁性纳米团簇的磁性分离方法 |
CN104316683A (zh) * | 2014-10-14 | 2015-01-28 | 南昌大学 | 针对全血的卵巢癌细胞检测试剂盒 |
CN105717288A (zh) * | 2016-01-28 | 2016-06-29 | 上海交通大学 | 一种表面修饰的磁性纳米颗粒及其制备方法与应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
SHOUHU XUAN 等: "Tuning the Grain Size and Particle Size of Superparamagnetic Fe3O4Microparticles", 《CHEM. MATER.》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111333692A (zh) * | 2020-03-02 | 2020-06-26 | 湖南省中医药研究院 | 一种白桦脂酸衍生物及其制备方法和应用 |
CN111569085A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-08-25 | 东南大学 | 一种模块化双特异性磁性纳米复合物及应用 |
CN113789302A (zh) * | 2021-09-15 | 2021-12-14 | 南昌大学第二附属医院 | 用于肺癌循环肿瘤细胞富集分离试剂盒 |
CN113985039A (zh) * | 2021-10-21 | 2022-01-28 | 深圳市希莱恒医用电子有限公司 | 一种叶酸检测试剂盒及检测方法 |
CN115058359A (zh) * | 2022-05-18 | 2022-09-16 | 南昌大学第一附属医院 | 一种磁分离富集蜡样芽胞杆菌的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110501208B (zh) | 2023-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110501208A (zh) | 叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒、其制备方法和应用 | |
Song et al. | Fluorescent-magnetic-biotargeting multifunctional nanobioprobes for detecting and isolating multiple types of tumor cells | |
Sun et al. | Preparation and characterization of Fe3O4/CdTe magnetic/fluorescent nanocomposites and their applications in immuno-labeling and fluorescent imaging of cancer cells | |
Wu et al. | Nanosphere-based one-step strategy for efficient and nondestructive detection of circulating tumor cells | |
Hu et al. | Aptamer combined with fluorescent silica nanoparticles for detection of hepatoma cells | |
CN107614458A (zh) | 稳定的纳米磁性颗粒分散体 | |
Brown et al. | Intracellular in situ labeling of TiO 2 nanoparticles for fluorescence microscopy detection | |
Zhao et al. | Electrical-charge-mediated cancer cell targeting via protein corona-decorated superparamagnetic nanoparticles in a simulated physiological environment | |
Li et al. | Affordable and simple method for separating and detecting ovarian cancer circulating tumor cells using BSA coated magnetic nanoprobes modified with folic acid | |
Ma et al. | Synthesis of magnetic and fluorescent bifunctional nanocomposites and their applications in detection of lung cancer cells in humans | |
Cui et al. | Rapid and efficient isolation and detection of circulating tumor cells based on ZnS: Mn2+ quantum dots and magnetic nanocomposites | |
CN105920620A (zh) | 磁性荧光多模态纳米生物探针及其制备方法和应用 | |
CN106366196B (zh) | 一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法 | |
Li et al. | A novel low-field NMR biosensor based on dendritic superparamagnetic iron oxide nanoparticles for the rapid detection of Salmonella in milk | |
Xie et al. | Wheat germ agglutinin-modified trifunctional nanospheres for cell recognition | |
Kiplagat et al. | Aptamer-conjugated magnetic nanoparticles for the efficient capture of cancer biomarker proteins | |
Wang et al. | Anti-CD133 monoclonal antibody conjugated immunomagnetic nanosensor for molecular imaging of targeted cancer stem cells | |
Oghabian et al. | Detectability of Her2 positive tumors using monoclonal antibody conjugated iron oxide nanoparticles in MRI | |
Chang et al. | Biomimetic immunomagnetic gold hybrid nanoparticles coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry for the detection of circulating tumor cells | |
Yang et al. | Highly specific and sensitive point-of-care detection of rare circulating tumor cells in whole blood via a dual recognition strategy | |
Mandal et al. | Collagen based magnetic nanobiocomposite as MRI contrast agent and for targeted delivery in cancer therapy | |
Dong et al. | Simple and rapid extracellular vesicles quantification via membrane biotinylation strategy coupled with fluorescent nanospheres-based lateral flow assay | |
CN115554992B (zh) | 一种聚合物修饰的磁性纳米材料、其制备方法及应用 | |
Yang et al. | Hedgehog-inspired magnetic nanoparticles for effectively capturing and detecting exosomes | |
Rashid et al. | Surface modification and bioconjugation of anti-CD4 monoclonal antibody to magnetic nanoparticles as a highly efficient affinity adsorbent for positive selection of peripheral blood T CD4+ lymphocytes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |