CN109481697A - 一种组合物、利用该组合物制备双特异性脂质体纳米复合物的方法及该纳米复合物的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于制备双特异性脂质体纳米复合物的组合物、利用该组合物制备双特异性脂质体纳米复合物的方法及该纳米复合物的应用。组合物包含：用于制备脂质体的组合物A、人Endoglin适配体和CD3单克隆抗体；其中，人Endoglin适配体和CD3单克隆抗体的用量符合如下条件：人Endoglin适配体和CD3单克隆抗体按照2:1的摩尔比混合均匀，混合液与采用组合物A制备的脂质体的摩尔比为1:10。利用该组合物制得的纳米复合物能同时结合HepG2和T细胞，增强抗肝癌效应。

Description

一种组合物、利用该组合物制备双特异性脂质体纳米复合物 的方法及该纳米复合物的应用
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种组合物、利用该组合物制备双特异性脂质体纳米复合物的方法及该纳米复合物的应用。
背景技术
肿瘤过继免疫治疗是治愈肿瘤有前景的方法，T淋巴细胞是最重要的抗肿瘤免疫淋巴细胞群，是过继治疗的研究热点。一些恶性肿瘤根治术后接受过继治疗能提高患者免疫功能，降低复发率。但是，其总体生存率的提高却不明显，PD-1及其配体PD-L1、PD-L2，这类在活化T细胞的过程中传递抑制性(负性)信号分子表达上调，能够靶向到肿瘤部位的T细胞数量有限等，这些因素在很大程度上限制了T细胞的抗癌角色。
hEndglin(CD105)主要分布于人新生血管内皮细胞和肿瘤周围的新生血管内皮细胞表面，在增殖的内皮细胞和肿瘤组织的新生血管内皮细胞中呈过表达，而在正常成熟的血管内皮细胞中不表达或弱表达，是肿瘤血管生成的标志性分子之一，是肿瘤区别于其它正常体细胞的标记分子，可作为靶向抗肿瘤治疗的靶点。本专利使用的人Endoglin 适配体(hEnd-Apt)是由本实验室课题组前期筛选出来的一条能与 CD105特异性稳定结合的适配体，它能与肝癌细胞HepG2、人脐静脉细胞HUVEC等高表达CD105的细胞特异性结合。
人CD3分子是T细胞表面的标记性分子，与T细胞受体(TCR) 组成TCR-CD3复合体，在免疫信号传导过程中具有重要作用。CD3单克隆抗体可直接诱导静止期T淋巴细胞增殖,从而启动了膜信号传递，经一系列分子的生化改变和基因调控而使T细胞增殖，促进T细胞分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-4等多种细胞因子，诱导细胞毒作用，增强T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的作用。
脂质体(liposomes)是双层磷脂分子定向排列形成的超微粒子，作为药物载体具有组织兼容性，细胞亲和性、靶向性、缓释性等性质，能够使药物靶向网状内皮系统，降低药物毒性，改变给药途径，从而提高疗效，延长药效，避免产生药物耐受性，在临床上被广泛应用；作为基因载体，其与病毒载体相比，具有可自然降解、免疫原性低、可重复转染、易于制备及易于修饰等优点。
随着适配体技术的不断成熟，越来越多的针对不同靶标的适配体开始出现，并逐渐被应用于肿瘤治疗。开发出针对各类肿瘤细胞的纳米复合物，构建纳米复合物修饰的T细胞系统甚至多功能性T细胞系统，重定向T细胞，达到更加准确和快速的杀伤肿瘤细胞的目的，有望为肿瘤的个体化治疗与精准治疗提供一种新的技术和手段。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，如何制备有效治疗肿瘤的药物。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
1、一种用于制备双特异性脂质体纳米复合物的组合物，所述组合物包含：
用于制备脂质体的组合物A：包含1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂、胆固醇、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、双十二烷基二甲基溴化铵、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺，各组分的摩尔比为51.8:40:5:3:0.3；
人Endoglin适配体；和
CD3单克隆抗体；
其中，人Endoglin适配体和CD3单克隆抗体的用量符合如下条件：人Endoglin适配体和CD3单克隆抗体按照2:1的摩尔比混合均匀，混合液与采用组合物A制备的脂质体的摩尔比为1:10。
2、一种利用技术方案1所述的组合物制备双特异性脂质体纳米复合物的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将溶解在氯仿中的1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂、胆固醇、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、双十二烷基二甲基溴化铵、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺加入反应容器中；
(2)将反应容器置于旋转蒸发仪中，真空条件下水浴旋转；
(3)将反应容器放入真空干燥箱进行干燥；
(4)将收集到的反应产物与HEPES缓冲液混合，然后将混合溶液超声，得到白色悬浮液；
(5)将白色悬浮液装入脂质体挤推器，分别过200nm、100nm和 50nm的聚碳酸酯膜，得到脂质体；
(6)采用二硫苏糖醇还原CD3单克隆抗体；
(7)将人Endoglin适配体与PBS缓冲液混合，配制成适配体溶液；
(8)将脂质体、步骤(6)处理后的CD3单克隆抗体、适配体溶液混合混匀，然后在氮气保护环境下反应；
(9)将反应后的溶液置于透析杯中以HEPES液透析，得到双特异性脂质体纳米复合物。
3、根据技术方案1所述的方法，在步骤(1)中，将溶解在氯仿中的10.35nmol1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂、8nmol胆固醇、1nmol 二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、0.6nmol双十二烷基二甲基溴化铵、0.06nmol二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺加入反应容器中。
4、根据技术方案3所述的方法，在步骤(2)中，旋转蒸发的时间控制在10-15min。
5、根据技术方案3所述的方法，在步骤(3)中，所述干燥的时间控制在3-4h。
6、根据技术方案3所述的方法，在步骤(4)中，所述超声的时间控制在5-10min。
7、根据技术方案3所述的方法，在步骤(5)中，过200nm的聚碳酸酯膜20次、100nm的聚碳酸酯膜20次和50nm的聚碳酸酯膜21 次。
8、根据技术方案3所述的方法，在步骤(5)中，将得到的脂质体置于4℃的环境中进行保存。
9、根据技术方案3所述的方法，在步骤(8)中，在氮气保护环境下反应24-30h。
10、一种利用技术方案2至9任一项所述方法制得的双特异性脂质体纳米复合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
有益效果
本发明的上述技术方案具有如下优点：
本发明设计了基于人Endoglin适配体与CD3单克隆抗体修饰纳米脂质体的纳米复合物，将其命名为hEnd-Apt/CD3-Lipo，该纳米复合物能同时结合HepG2和T细胞，增强抗肝癌效应。
附图说明
图1是纳米复合物透射电镜观察结果；其中，A图代表Lipo、B图代表hEnd-Apt-Lipo、C图代表CD3-Lipo、D图代表S2.2/CD3-Lipo、E图代表hEnd-Apt/CD3-Lipo；
图2是纳米粒子粒径分布；其中，A图代表Lipo、B图代表hEnd-Apt-Lipo、C图代表CD3-Lipo、D图代表S2.2/CD3-Lipo、E图代表hEnd-Apt/CD3-Lipo；
图3是流式细胞术检测hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物能够与T 细胞结合；
图4流式细胞术检测hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物能与靶细胞 HepG2细胞靶向结合；
图5荧光共聚焦显微镜结果显示hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物能够与HepG2肝癌细胞特异性结合。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供了一种用于制备双特异性脂质体纳米复合物的组合物，所述组合物包含：
用于制备脂质体的组合物A：包含1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂 (POPC，1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphochholine)、胆固醇 (cholesterol)、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(PEG2000-DSPE， (1,2-distearoyl-sn-glycerol-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000]))、双十二烷基二甲基溴化铵(DDAB， Dimethyldioctadecylammonium)、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-马来酰亚胺(MAL-PEG2000-DSPE)，各组分的摩尔比为 51.8:40:5:3:0.3；
人Endoglin适配体；和
CD3单克隆抗体；
其中，人Endoglin适配体和CD3单克隆抗体的用量符合如下条件：人Endoglin适配体和CD3单克隆抗体按照2:1的摩尔比混合均匀，混合液与采用组合物A制备的脂质体的摩尔比为1:10。混合溶液的摩尔量是指混合溶液中的人Endoglin适配体的摩尔数和CD3单克隆抗体的摩尔数的总和。
磷脂和胆固醇是构成脂质体的最基础原材料。磷脂主要含有一个磷酸基团、一个亲水性基团和两个亲脂性基团，本实验所用的磷脂是 1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂。胆固醇的主要作用是调节脂质体双分子膜的流动性，从而保证脂质体膜的稳定性。采用组合物A制得的脂质体具有亲水性和疏水性两种性质，马来酰亚胺(Maleinimide,MAL) 为亲水端，能和适配体及抗体上的巯基(-SH)反应生成适配体/抗体修饰的脂质体。
本发明还提供了一种利用该组合物制备双特异性脂质体纳米复合物的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将溶解在氯仿中的1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂、胆固醇、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、双十二烷基二甲基溴化铵、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺加入反应容器中；
(2)将反应容器置于旋转蒸发仪中，真空条件下水浴旋转；
(3)将反应容器放入真空干燥箱进行干燥；
(4)将收集到的反应产物与HEPES缓冲液混合，然后将混合溶液超声，得到白色悬浮液；
(5)将白色悬浮液装入脂质体挤推器，分别过200nm、100nm和 50nm的聚碳酸酯膜，得到脂质体；
(6)采用二硫苏糖醇还原CD3单克隆抗体；
(7)将人Endoglin适配体与PBS缓冲液混合，配制成适配体溶液；
(8)将脂质体、步骤(6)处理后的CD3单克隆抗体、适配体溶液混合混匀，然后在氮气保护环境下反应；
(9)将反应后的溶液置于透析杯中以HEPES液透析，得到双特异性脂质体纳米复合物。
本发明还特别针对脂质体提供了适用的纳米复合物的制备步骤和参数，优化后的制备工艺包括：
在步骤(1)中，将溶解在氯仿中的10.35nmol1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂、8nmol胆固醇、1nmol二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000、0.6nmol双十二烷基二甲基溴化铵、0.06nmol二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺加入反应容器中。在步骤(2)中，旋转蒸发的时间控制在10-15min。
在步骤(3)中，所述干燥的时间控制在3-4h。
在步骤(4)中，所述超声的时间控制在5-10min。
在步骤(5)中，过200nm的聚碳酸酯膜20次、100nm的聚碳酸酯膜20次和50nm的聚碳酸酯膜21次。
在步骤(5)中，将得到的脂质体置于4℃的环境中进行保存。
在步骤(8)中，在氮气保护环境下反应24-30h。
本发明还提供了一种利用本发明提供的制备方法制得的纳米复合物的应用，具体是在制备治疗肿瘤药物中的应用。该双特异性脂质体纳米复合物能同时结合HepG2和T细胞，增强抗肝癌效应。
以下是本发明列举的实施例。
下述实施例中4-6周龄雌性SCID鼠(维通利华公司，北京，中国)，所有的动物实验方案均遵照广西医科大学动物保护与使用管理条例。人肝癌细胞系HepG2，人肺癌细胞系A549(ATCC，USA)，RPMI 1640 培养基培养(含10％的胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)，(GIBCO，USA)。细胞均置于37℃，5％CO2的培养箱中培养。
实施例1
hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物的合成
1.1采用薄膜水化法制备马来酰亚胺修饰的脂质体(Lipo)
实验原理：磷脂和胆固醇是构成脂质体的最基础原材料。磷脂主要含有一个磷酸基团、一个亲水性基团，和两个亲脂性基团，本发明所用的磷脂是1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂。胆固醇的主要作用是调节脂质体双分子膜的流动性，从而保证脂质体膜的稳定性。
(1)将溶解在氯仿中的1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂、胆固醇、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、双十二烷基二甲基溴化铵、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺按摩尔比为 51.8:40:5:3:0.3的比例加入到5mL的圆底烧瓶中，(即7.87mg、3.2mg、 2.8mg、0.38mg和0.138mg)。在加各种材料时要注意将圆底烧瓶稍微倾斜，同时不停地转动混匀，加完将其封口，避免有机溶剂的挥发。
(2)将混合有五种材料的圆底烧瓶放置于旋转蒸发仪，真空条件下浴旋转15min抽干氯仿，使其在烧瓶底部形成一层均匀的脂膜。
(3)取出圆底烧瓶，将其放入真空干燥箱干燥4h以去除残留的有机溶剂。
(4)取出干燥的完的脂质体，在烧瓶中加入1mLHEPES缓冲液(pH6.5,10mmol/L)。
(5)在水浴超声机中超声5min，形成白色悬液。
(6)将上述白色溶液装入脂质体挤推器，分别过200nm、100nm 的聚碳酸酯膜各20次，50nm的聚碳酸酯膜21次，得到马来酰亚胺修饰的脂质体，用1.5mL的EP管盛放过滤完的脂质体溶液，4℃保存。为获得DiI修饰的磷脂双分子层脂质体，在步骤(5)中得到的脂质体加入占总脂质0.5％mol的DiI染液(5mg/mL)，并且整个制备过程需要避光操作，所得的产物避光保存在4℃。
1.2hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物的制备
实验原理：本文采用Post-insertion方法将适配体和抗体连接至纳米脂质体表面。首先化合物MAL-PEG2000-DSPE具有亲水性和疏水性两种性质，马来酰亚胺(Maleinimide,MAL)为亲水端，能和适配体及抗体上的巯基(-SH)反应生成适配体/抗体修饰的脂质体。
(1)采用二硫苏糖醇(DTT)还原抗体，将抗体巯基化，4℃保存备用。
(2)将适配体按比例要求加入适宜的PBS配制为100μM适配体溶液，-20℃保存备用。
(3)将hEndoglin适配体与抗体按照2:1的比例混匀，再将混合液与MAL-PEG2000-DSPE按照1:10的摩尔比将适配体/抗体混合物加入到上述制备的纳米脂质体中。
(4)用移液枪上下混匀数分钟，氮气保护环境下反应24h。
(5)将上述的溶液至于透析杯中以HEPES液透析，去除未反应的适配体和抗体，即得到适配体/抗体修饰的磷脂双分子层特异性靶向纳米复合物，本发明将其命名为hEnd-Apt/CD3-Lipo。
hEnd-Apt/CD3-Lipo的表征
(一)透射电子显微镜H-7650镜下观察拍摄纳米复合物的透射电镜显微图像
(1)将制备好的纳米粒子：Lipo、hEnd-Apt-Lipo、CD3-Lipo、 S2.2/CD3-Lipo和hEnd-Apt/CD3-Lipo用单蒸水按1：1200稀释，混匀。
本实验以及本发明下文中所做的其它实验中所提及的 hEnd-Apt-Lipo、CD3-Lipo、S2.2/CD3-Lipo这三种粒子的制备方法可以参考现有技术(例如，可以参考[Pu Y,ZhuZ,Liu H,etc.Using aptamers to visualize and capture cancer cells[J].AnalBioanal Chem,2010,397(8): 3225-33.])，本发明对此不再详述。(2)取各组纳米复合物放置于特制铜网上静止3min(在吸取材料前一定要用吸管再次吹打混匀，避免材料混合不均匀)。
(3)滤纸吸取多余的液体，滴1滴2％磷钨酸(pH＝7.0)负染1min。
(4)再次使用滤纸吸除多余的液体。
(5)透射电子显微镜下拍摄纳米粒子显微图像。检测结果见图1。
(二)纳米粒子粒径电位分析
(1)分别准备Lipo、hEnd-Apt-Lipo、CD3-Lipo、S2.2/CD3-Lipo 和hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米粒子。
(2)将制得的纳米粒子，用单蒸水稀释100倍。
(3)取经稀释的各组纳米粒子使用动态光散射法(Dynamiclightscattering，DLS)对纳米粒子的粒径大小和电位分布进行测量。
测量结果见图2。从图2中可以看出，各类纳米粒子(包含本发明要求保护的纳米复合物)的分散性良好，大小较均匀，均在100nm以内。
(三)hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物与T细胞的结合实验
实验分组：
Control组；
Lipo组；
hEnd-Apt(F)-Lipo组；
CD3-Lipo组；
S2.2/CD3-Lipo组；
hEnd-Apt(F)/CD3-Lipo组。
其中，Control组：不加任何材料；Lipo组：空白Lipo； hEnd-Apt(F)-Lipo组：FITC-hEndoglin适配体修饰Lipo合成的纳米复合物；CD3-Lipo组：CD3单克隆抗体与Lipo合成的纳米复合物； S2.2/CD3-Lipo组：由S2.2适配体与CD3单克隆抗体修饰Lipo合成的纳米复合物；hEnd-Apt(F)/CD3-Lipo组：FITC-hEndoglin适配体与CD3 单克隆抗体修饰Lipo合成的纳米复合物。
实验步骤：
3.1分选PD-1-T细胞
3.1.1人外周血分离T细胞
鉴定各类细胞的生物学免疫功能，首先要从人或动物外周血或器官组织中得到活性较高的细胞。获取细胞的方法有多种，主要通过细胞的大小、细胞密度、获得量、纯度等使用不同的方法，常用的提取外周血单个核细胞的方法是Ficoll梯度离心法。Ficoll是一种合成的聚合物(聚蔗糖-泛影葡胺)，比重为1.077±0.001，Ficoll为蔗糖的多聚体且中性，分子量约为400，000，不穿过生物膜且低渗压无毒性。
(1)用一次性医用采血袋静脉采取健康志愿者的新鲜外周血，采血过程中要不断混匀，无凝血溶血现象出现，将血液与提前在细胞间 37℃水浴预热的PBS等体积1:1稀释入50mL离心管中。
(2)吸取37℃水浴预热得人T淋巴细胞分离液分装于新的50mL 离心管中，每管15mL分离液。
(3)将稀释后的血液加入到分离液中，离心管稍微倾斜，沿壁缓慢加入30mL稀释后的血液，要避免血液进入淋巴液液面。通常血与分离液的比例为2:1。
(4)将上述血细胞进行离心，2000rpm，25min。注意将离心机升速和降速都调至最慢档1档。
(5)轻轻地取出50mL离心管，管内液体分为四层，从下到上依次为红细胞层、分离液、白膜层、血清层。用细的吸管沿管壁轻轻地吸出含单个核细胞的白膜层液体，放置于干净的15mL离心管中。
(6)在上述离心管中加入5倍体积的PBS，1500rpm，离心10min。重复洗涤3次，洗去残留的淋巴细胞分离液。
(8)如果离心后的细胞沉淀中有红色成分，则需要加入3倍体积的红细胞裂解液裂解红细胞，混匀后静置5min。
(7)离心后弃上清，用完全RPMI-1640培养基重悬细胞在培养箱中静置2h后，吸取悬浮细胞即T淋巴细胞，离心1500rpm，10min后用完全培养基重悬于新的48孔板中同时加入人IL-2100U/mL。
3.1.2磁珠分选CD8+T细胞
(1)收集之前从外周血分离的T淋巴细胞悬液，1200rpm，5min 离心。
(2)用2mL Isolationbuffer重悬T淋巴细胞，分装至2mL EP管中，每管加入500μL细胞悬液，同时加入25μLCD8Ab，混匀后于4℃环境中静置10min。
(3)加入Isolationbuffer至2mL，在提前预冷的4℃离心机中350g，离心8min。
(4)弃上清，每管加入1mL Isolationbuffer，涡旋磁珠，每管加入磁珠75μL，混匀。室温摇床孵育15min。
(5)将2mLEP管置于磁力架上静置1min，吸出上清至离心管中。
(6)从磁力架上取下EP管，加入1mL Isolationbuffer混匀。
(7)再次将EP管置于磁力架上静置1min，同样吸出上清液。
(8)取下EP管，加入1mL releasebuffer静置10min。
(9)EP管上磁力架1min后吸出CD8+T细胞于新的离心管中。重复(6)(7)步骤各一次。
(10)将分选出来的的CD8+T细胞进行计数，后加入 ConA20U/mL(5μg/mL)刺激48h后进行转染。
3.1.3转染pX330-PD-1gRNA质粒至T细胞
电穿孔技术：电穿孔技术是将外源性分子导入细胞内的一种方法，主要是通过利用一定强度的电场环境，瞬间提高细胞膜的通透性使其可逆性出现纳米级的微孔，从而使得一些DNA、蛋白或病毒颗粒进入细胞内。目前已研发出针对细胞的电转保护剂，可大大降低细胞的死亡率，进一步提高转染效率。本实验中由于T细胞是原代悬浮细胞，体积小，通常的脂质体转染效率较低，为提高转染效率采用电穿孔转染方法。
(1)收集从外周血分选获得的CD8+T淋巴细胞，调整细胞浓度为1×107/mL。
(2)将pX330-PD-1gRNA质粒调整为同样的浓度。分别吸取100 μL细胞悬液和4μL质粒入1.5mL的EP管，并将其吹打混匀。
(3)将上述悬液吸入无菌的电转杯中，电转条件分别设置为：310V， 20ms。
(4)将电转后的细胞快速转移至12孔板中，并加入2mL37℃水浴预热的1640完全培养基，48h后进行细胞分选。
3.1.4磁珠分选PD-1-T细胞
(1)收集之前电转后的T细胞悬液进行计数，用完全1640培养基调整细胞浓度为1×108/mL，每只分选管总体积不超过2.5mL。
(2)加入FCR封闭非特异性结合，100μL/mL。
(3)加入CD279-PE结合抗体0.3-3.0μg/mL，充分混匀后室温放置15min。
(4)加入CD279-PE混合物100μL/mL，混匀，室温放置15min。
(5)涡旋磁珠后加入50μL/mL,混匀，室温放置10min。
(6)用完全培养基1640调整总体积为2.5mL后将分选管放入磁力架内，静置5min。
(7)将管内液体倒出，PD-1-T细胞在倒出的上清液，计数，后经 1200rpm，离心5min。
(8)用RPMI-1640完全培养基培养于六孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
3.2流式细胞术检测hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物与PD-1-T细胞的结合
为验证hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物与PD-1-T细胞结合，本发明利用分选出的PD-1-T细胞与hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物进行结合能力验证。具体步骤如下：
(1)使用50nM的hEnd-Apt(F)/CD3-Lipo纳米复合物(对照组： Control、Lipo组、hEnd-Apt(F)-Lipo、CD3-Lipo、S2.2/CD3-Lipoh)与 2×105个PD-1-T细胞在冰上孵育50min。
(2)用500μL洗涤缓冲液充分洗涤3次，使用结合缓冲液对细胞沉淀进行重悬，之后进行流式细胞仪检测。
(3)使用Flowjo10软件对检测结果进行分析处理。
检测结果见图3。
(四)hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物与HepG2细胞的结合实验为验证hEnd/CD3-Lipo纳米复合物能够与HepG2细胞结合，本发明利用人肝癌细胞系HepG2细胞与hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物进行结合能力验证。
实验分组：
Control组；
Lipo组；
hEnd-Apt-Lipo组；
CD3(F)-Lipo组；
S2.2/CD3(F)-Lipo组；
hEnd-Apt/CD3(F)-Lipo组。
其中，CD3(F)-Lipo组：FITC-CD3单克隆抗体与Lipo合成的纳米复合物；S2.2/CD3(F)-Lipo组：由S2.2适配体与FITC-CD3单克隆抗体修饰Lipo合成的纳米复合物；hEnd-Apt/CD3(F)-Lipo组：hEndoglin适配体与FITC-CD3单克隆抗体修饰Lipo合成的纳米复合物。
实验步骤：
4.1HepG2、A549细胞系培养
(1)取4只15mL离心管，其中2管分别加入5mL的PBS，分别标记HepG2细胞和A549细胞，另外两管分别加入5mL的RPMI-1640。完全培养基。放在37℃培养箱中预热。
(2)按照实验室具体操作要求，从液氮罐内取出冻存的HepG2 细胞、A549细胞各一支，迅速放入37℃水浴锅中均匀晃动解冻复苏。
(3)将完全解冻后的细胞悬液移入提前预热的PBS中，1000rpm， 5min离心。
(4)用提前预热的完全1640培养基分别重悬两种细胞，放入无菌细胞培养瓶中。
(5)显微镜下观察细胞形态、状态，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，及时观察后进行更换培养液、传代。
4.2流式细胞术检测hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物与HepG2细胞的结合实验
一个较成功的纳米复合物应该具有较高的特异性，即对靶细胞选择性识别，而对其他细胞结合能力较弱或不与其他细胞结合。为验证此特性，本研究设置对照细胞A549细胞、靶细胞HepG2细胞与 hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物进行结合能力验证。具体操作步骤如下：
(1)使用50nM的hEnd-Apt/CD3(F)-Lipo纳米复合物(对照组：Control、Lipo、hEnd-Apt-Lipo、CD3(F)-Lipo、S2.2/CD3(F)-Lipo)与2 ×105个A549细胞、HepG2细胞在冰上孵育50min。
(2)用500μL洗涤缓冲液充分洗涤2-3次，使用结合缓冲液对细胞沉淀进行重悬，之后进行流式细胞仪检测。
(3)使用FLowjo10软件对检测结果进行分析处理。
结果见图4。
4.3荧光共聚焦显微镜检测hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物与 HepG2细胞的结合实验
考察靶细胞与hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物的结合能力，一方面可以使用流式细胞术进行定量分析，另一方面也可以直接使用荧光共聚焦显微镜对结合情况进行较为直观的观察。本次实验中的荧光共聚焦显微镜成像使用细胞爬片方法进行。具体步骤如下：
(1)准备一块六孔板，在孔板中央预先滴加5μl左右的PBS，将经酒精消毒及酒精灯烤干的盖玻片放进六孔板中，用镊子轻压盖玻片。将3×105个HepG2细胞或A549细胞滴加在盖玻片中央，体积为100 μL。滴加完全RPMI-1640培养基至覆盖玻片，混合均匀，使细胞均匀的分散在玻片上。
(2)将加好细胞的的六孔板移入37℃、5％CO2细胞培养箱内，再次摇晃使细胞混合均匀，放置3h使细胞完全贴壁。
(3)轻轻取出六孔板，每孔加入2mL完全RPMI-1640培养基，将六孔板再次置于培养箱当中使其贴壁过夜。
(4)取出六孔板，吸弃各孔中的培养基，并用PBS清洗2-3次，之后分别加入50nMhEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物(对照组：Control、 hEnd-Lipo、S2.2/CD3-Lipo)，冰上摇床孵育50min。
(5)移除液体，用洗涤缓冲液清洗六孔板4遍，对细胞进行DAPI 染色8min；最后，使用4％多聚甲醛室温固定15min。
(6)吸弃孔内4％多聚甲醛，用洗涤缓冲液清洗3次。
(7)取洁净的载玻片，在中央滴一滴抗荧光淬灭封片剂，将盖玻片用注射器针头勾起之后，将有细胞的一面倒扣于载玻片上。
(7)荧光共聚焦显微镜下观察细胞荧光强度并拍照。图5为荧光共聚焦显微镜检测hEnd-Apt/CD3-Lipo纳米复合物以及各对照组与 HepG2肝癌细胞的靶向结合；红色为DiI染料，绿色为FITC荧光，蓝色DAPI为细胞核。标尺长度为50μm，放大倍数600倍。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种用于制备双特异性脂质体纳米复合物的组合物，其特征在于，所述组合物包含：
用于制备脂质体的组合物A：包含1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂、胆固醇、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、双十二烷基二甲基溴化铵、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺，各组分的摩尔比为51.8:40:5:3:0.3；
人Endoglin适配体；和
CD3单克隆抗体；
其中，人Endoglin适配体和CD3单克隆抗体的用量符合如下条件：人Endoglin适配体和CD3单克隆抗体按照2:1的摩尔比混合均匀，混合液与采用组合物A制备的脂质体的摩尔比为1:10。
2.一种利用权利要求1所述的组合物制备双特异性脂质体纳米复合物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将溶解在氯仿中的1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂、胆固醇、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、双十二烷基二甲基溴化铵、二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺加入反应容器中；
(2)将反应容器置于旋转蒸发仪中，真空条件下水浴旋转；
(3)将反应容器放入真空干燥箱进行干燥；
(4)将收集到的反应产物与HEPES缓冲液混合，然后将混合溶液超声，得到白色悬浮液；
(5)将白色悬浮液装入脂质体挤推器，分别过200nm、100nm和50nm的聚碳酸酯膜，得到脂质体；
(6)采用二硫苏糖醇还原CD3单克隆抗体；
(7)将人Endoglin适配体与PBS缓冲液混合，配制成适配体溶液；
(8)将脂质体、步骤(6)处理后的CD3单克隆抗体、适配体溶液混合混匀，然后在氮气保护环境下反应；
(9)将反应后的溶液置于透析杯中以HEPES液透析，得到双特异性脂质体纳米复合物。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，将溶解在氯仿中的10.35nmol 1-棕榈酰基-2-硬脂酰基卵磷脂、8nmol胆固醇、1nmol二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000、0.6nmol双十二烷基二甲基溴化铵、0.06nmol二硬质酰基脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺加入反应容器中。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，旋转蒸发的时间控制在10-15min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述干燥的时间控制在3-4h。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述超声的时间控制在5-10min。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，过200nm的聚碳酸酯膜20次、100nm的聚碳酸酯膜20次和50nm的聚碳酸酯膜21次。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，将得到的脂质体置于4℃的环境中进行保存。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(8)中，在氮气保护环境下反应24-30h。
10.一种利用权利要求2至9任一项所述方法制得的双特异性脂质体纳米复合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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