CN113453666A - 用于肿瘤细胞的选择性成像的融合脂质体 - Google Patents

用于肿瘤细胞的选择性成像的融合脂质体 Download PDF

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Abstract

提供了一种融合脂质体，其包含可检测试剂和在其内部水性隔室中或结合至脂质体膜的任选细胞毒性药物，其中所述融合脂质体包含脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14‑24个碳原子的脂质分子，且所述脂质分子中的至少一个进一步包含阳离子基团、阳离子的天然的或合成的聚合物、阳离子的氨基糖、阳离子的聚氨基酸或两亲的癌细胞结合肽；且所述脂质分子中的至少一个进一步包含选自以下的稳定化部分：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚氨基酸、甲基‑聚噁唑啉、聚甘油、聚(丙烯酰基吗啉)和聚丙烯酰胺。进一步提供了在癌症的治疗中利用这些脂质体的方法。

Description

用于肿瘤细胞的选择性成像的融合脂质体
发明领域
本发明总体上涉及选择性地检测癌细胞的方法。
发明背景
荧光检测(WO 03/057259、US 8,956,591、US 9,289,517)、核磁共振成像(MRI)、计算机断层摄影术(CT)和超声成像通常被用作癌病灶成像的方法。但是，这些技术间接地标记肿瘤的部位，并且不利于癌细胞本身的选择性标记。因此，迫切需要选择性癌细胞成像的方法。
发明内容
PCT申请号PCT/IL2018/050434(通过引用并入，如同在本文中完全公开)公开了融合脂质体和它们在治疗癌症中的用途。癌症选择性的融合脂质体可以全身施用，并在本文中显示其在体内条件下与癌细胞融合。该癌症选择性的脂质体可以进一步用于将可检测的部分携带至体内的癌症部位。这些脂质体选择性地与癌细胞(而不与正常细胞)融合的固有能力在本发明中用于选择性检测癌细胞。
在一个方面，本发明提供了一种融合脂质体，其包含可检测试剂和在其内部水性隔室中或结合至脂质体膜的任选细胞毒性药物，其中
所述融合脂质体包含脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14-24个碳原子的脂质分子，且所述脂质分子中的至少一个进一步包含阳离子基团、阳离子的天然的或合成的聚合物、阳离子的氨基糖、阳离子的聚氨基酸或两亲的癌细胞结合肽；且
所述脂质分子中的至少一个进一步包含选自以下的稳定化部分：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚氨基酸、甲基-聚噁唑啉、聚甘油、聚(丙烯酰基吗啉)和聚丙烯酰胺。
在另一个方面，本发明提供了一种用于选择性地检测癌细胞的方法，所述方法包括：使所述癌细胞与本文定义的融合脂质体接触；和在所述可检测试剂是可活化的荧光探针的情况下，通过用具有被所述荧光探针吸收的波长的光照射所述细胞和检测由受激发的荧光探针发射的光来检测所述荧光探针；在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者。
在另一个方面，本发明提供了一种用于选择性地检测癌细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述癌细胞与根据以上涉及官能化的融合脂质体的实施方案中的任一项的官能化的融合脂质体接触；(b)使所述癌细胞与可检测试剂接触，所述可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂，其中所述可检测试剂用能够结合所述脂质分子的所述第一官能团的结合对的互补性第二官能团官能化；和(c)在所述可检测试剂是荧光探针的情况下，通过用具有被所述荧光探针吸收的波长的光照射所述细胞和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针；在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者，由此选择性地检测所述癌细胞。
在另一个方面，本发明提供了一种通过荧光引导的外科手术或靶向放射疗法来治疗癌症的方法，所述方法包括上面定义的选择性地检测癌细胞和取出含有所述癌细胞的肿瘤的方法之一。
在上面定义的选择性地检测癌细胞的任一种方法的某些实施方案中，癌症患者正在经历肿瘤(诸如皮肤癌)的成像，或全身成像，且所述方法或用途包含全身性地施用或局部地应用所述融合脂质体和任选的官能化的可检测试剂；和，在所述可检测试剂是可活化的荧光探针或荧光探针的情况下，通过照射所述皮肤区域或全身和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针，在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于扫描器官(诸如皮肤)区域或全身的MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，由此定义肿瘤位置和边缘。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，包括这样的方法：其中所述癌症患者正在经历肿瘤(诸如皮肤癌)的成像，或上述的全身成像，和通过外科手术取出含有所述癌细胞的肿瘤。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含：(a)第一容器，其含有包含脂质双层的融合脂质体，所述脂质双层包含多个具有14-24个碳原子的脂质分子，且所述脂质分子中的至少一个进一步包含阳离子基团、阳离子的天然的或合成的聚合物、阳离子的氨基糖、阳离子的聚氨基酸或两亲的癌细胞结合肽；所述脂质分子中的至少一个进一步包含选自以下的稳定化部分：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚氨基酸、甲基-聚噁唑啉、聚甘油、聚(丙烯酰基吗啉)和聚丙烯酰胺；且其中所述脂质分子中的至少一个被特异性结合对的能够结合所述结合对的互补性第二官能团的第一官能团官能化；(b)第二容器，其包含可检测试剂，所述可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂，其中所述可检测试剂用能够结合所述脂质分子的所述第一官能团的结合对的互补性第二官能团官能化；和(c)小册子，其具有关于选择性地检测癌细胞的方法的说明，所述方法包括给癌症患者施用(a)的融合脂质体和随后施用(b)的可检测试剂。
附图说明
图1A-D显示了在小鼠中原位检测三重阴性的乳腺癌的照片。在静脉内注射负载ICG的脂质体后24小时，使用
Figure BDA0003082793100000031
Spectrum体内成像系统(PerkinElmer)对荷瘤小鼠进行成像。记录肿瘤信号(mCherry；A和C)和脂质体信号(ICG；B和D)。使用PEG4-叠氮化物修饰注射给A和B图像中所示的小鼠的脂质体，并用以PEG4-生物素修饰的脂质体注射小图C和D中所示的小鼠。
图2A-C显示了在注射后48小时器官的荧光和非荧光图像的重叠图像。在静脉内注射负载ICG的脂质体后48小时，处死小鼠，取出器官，并在与图1A-D(激发和发射)相同的条件下成像，以确定来自脂质体的ICG信号。器官顺序从上至下、从左至右：肺、肝、脾、肾的肿瘤。未治疗的小鼠(A)用于确定阈值水平。来自叠氮化物修饰的脂质体(B)和来自生物素修饰的脂质体(C)的三只小鼠的器官在肿瘤和肝脏处显示荧光信号。
图3A-C显示了与Gd-DTPA的肿瘤到达和最后一次注射后24小时的生物分布概况相比，荷瘤小鼠的肿瘤中的荧光信号变化。将与T细胞活化抗体(抗-CD3和抗-CD8)结合的、钆(Gd)和吲哚菁绿(ICG)共同负载的脂质体注射给荷瘤小鼠以测试在第二次治疗时的肿瘤部位到达，以确定治疗之间的最佳间隔。该概念证明将MRI造影剂Gd-DTPA与荧光探针ICG的递送进行了对比。A.使用ICP分析在335.048nm发射处确定肿瘤Gd水平。将单次治疗与在以下条件下的第二次治疗进行对比：48小时(垂直线)，72小时(斜纹矩形)和96小时(水平线)，每组N＝4只动物。B.IVIS Spectrum CT体内成像系统用于记录mCherry(肿瘤)和ICG(脂质体)信号。使用mCherry信号确定感兴趣的手动(Manual)肿瘤区域，并用于记录每秒的ICG光子数。呈现的数据是第二次治疗相对于单次治疗的比率。误差条代表标准偏差。C.将通过ICP确定的脂质体的生物分布呈现为每克组织的注射剂量百分比。在以不同间隔进行单次或两次治疗时，关于肝(水平线)、脾(水平矩形)、肾(垂直线)、心脏(对角线)和肺(斜纹矩形)，对比了肿瘤脂质体到达。
图4A-D显示了使用负载ICG的脂质体，在治疗的小鼠中相对于在未治疗的小鼠中的脂质体清除和它们的积累。A.在治疗当天使用
Figure BDA0003082793100000041
Spectrum体内成像系统(PerkinElmer)将4T1 mCherry荷瘤小鼠成像以确定从肿瘤发射的mCherry信号(激发570nm，发射640nm，暴露时间1秒)(左小鼠和右小鼠)。B.将小鼠(从左侧第一和第四小鼠)用与结合至脂质体的治疗性抗体(抗-CD3和抗-CD8)一起共包封的ICG-和Gd-DTPA治疗，并在治疗当天使用
Figure BDA0003082793100000042
Spectrum体内成像系统(PerkinElmer)成像以确定从整个动物体内发射的脂质体ICG信号(激发745nm，发射870nm，暴露时间4秒)。左起第2和第3小鼠未接受ICG-和Gd-DTPA脂质体。C.在治疗后24小时，呈现的从肿瘤发射的mCherry信号与A相同。D.在治疗后24小时，呈现的从整个动物体发射的脂质体ICG信号与B相同。
具体实施方式
在以下描述中，将描述本申请的各个方面。为了解释的目的，阐述了特定的配置和细节以便提供本申请的透彻理解。但是，对于本领域技术人员来说也将显而易见的是，可以在没有本文所呈现的具体细节的情况下实践本申请。此外，可以省略或简化众所周知的特征，以免模糊本申请。
在权利要求书中使用的术语“包含”是“开放式的”，并且是指所列举的要素或其在结构或功能上的等同物，以及未列举的任何其它一种或多种要素。不应将其解释为限于此后列出的方式；其不排除其它要素或步骤。需要将其解释为指定所提及的所述特征、整数、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个其它特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。因此，表述“包含x和z的装置”的范围不应限于仅由组件x和z组成的装置。并且，表述“包括步骤x和z的方法”的范围不应限于仅由这些步骤组成的方法。
除非特别说明，否则本文中使用的术语“约”应理解为在本领域的正常公差的范围内，例如在平均值的两个标准差内。在一个实施方案中，术语“约”是指在与它一起使用的数字的所报告数值的10％以内，优选地在所报告数值的5％以内。例如，术语“约”可以立即理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。在其它实施方案中，术语“约”可以是指较高的变化公差，取决于例如所使用的实验技术。规定值的所述变化是技术人员所理解的，并且是在本发明的上下文中。作为说明，“约1至约5”的数值范围应解释为不仅包括约1至约5的明确列举的值，而且包括在指示范围内的各个值和子范围。因此，在该数值范围内包括各个值，诸如2、3和4和子范围，例如1-3、2-4和3-5、以及单独的1、2、3、4、5或6。该同样原理适用于仅列举一个数值作为最小值或最大值的范围。除非另外从上下文明白，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。其它类似的术语，诸如“基本上”、“通常”、“最多”等应被解释为修饰术语或值，使得其不是绝对的。这样的术语将由它们所修饰的环境和术语来定义，因为那些术语是本领域技术人员所理解的。这至少包括对于用于测量值的给定实验、技术或仪器而言预期的实验误差、技术误差和仪器误差的程度。
本文中使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的列出的项目的任何和所有组合。除非另有定义，否则本文中使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。进一步理解，术语诸如在常用词典中定义的那些，应被解释为具有与其在说明书和相关技术的上下文中的含义相一致的含义，并且不应以理想化或过于正式的含义进行解释，除非在本文中明确地如此定义。为了简洁和/或清楚起见，可能不会详细描述众所周知的功能或构造。
根据本发明已经发现，具有相对于正常细胞优选与癌细胞融合的特征的融合脂质体可以用于在体内或在体外选择性地检测和可视化癌细胞。
因而，在一个方面，本发明提供了一种融合脂质体，其包含可检测试剂和在其内部水性隔室中或结合至脂质体膜的任选细胞毒性药物，其中
所述融合脂质体包含脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14-24个碳原子的脂质分子，且所述脂质分子中的至少一个进一步包含阳离子基团、阳离子的天然的或合成的聚合物、阳离子的氨基糖、阳离子的聚氨基酸或两亲的癌细胞结合肽；且
所述脂质分子中的至少一个进一步包含选自以下的稳定化部分：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚氨基酸、甲基-聚噁唑啉、聚甘油、聚(丙烯酰基吗啉)和聚丙烯酰胺。
本文中使用的术语“脂质体”表示脂质纳米颗粒或构建体，其包含由内部和外部小叶组成的脂质双层，其包封脂质体的水性内部。
本文中使用的术语“融合脂质体”表示脂质体构建体，其优先与靶细胞的质膜融合并且在较小的程度上通过胞吞作用吸收。
一般而言，如本文中定义的，术语“细胞的标记”涉及在结构上将细胞与未修饰的细胞区分开的对细胞的任何修饰。具体地，用融合脂质体的官能团或用可检测试剂修饰或“标记”本发明中的细胞。
本文中使用的术语“稳定化部分”表示这样的部分：其当掺入脂质体的脂质双层中时，与缺少稳定化部分的相同脂质体相比，提供脂质体的延长的血液循环半衰期。
在某些实施方案中，所述可检测试剂选自荧光探针、用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂和光动力剂。
在某些实施方案中，所述可检测试剂是选自以下的荧光探针：cy3、cy5、cy5.5、cy7cy9、FITC、荧光素、alexa fluor 790、alexa fluor 750、alexa fluor700、alexa fluor680、alexa fluor 660、alexa fluor 647、alexa fluor 633、alexa fluor 594、在585nm-800nm范围内的Qdot、荧光原卟啉寡聚体、异花青绿(ICG)；或可活化的荧光探针、可活化的酯键可切割的荧光团类型。在荧光团上的酯修饰使其不发荧光，并且在脂质体与癌细胞融合后并随后被细胞质酯酶进行细胞质切割后变成发荧光。
在某些实施方案中，所述可活化的荧光探针选自：荧光素类似物(诸如二乙酸盐修饰的类似物),香豆素类似物(诸如py+BC690-(1-甲基-4-(2-氧代-8-(吡咯烷-1-基)-2H-苯并[g]色烯-3-基)吡啶鎓三氟甲磺酸盐)),CFSE(5(6)-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺基酯),罗丹明类似物(诸如gGlu-HMRG(γ-谷氨酰基羟基甲基罗丹明绿)),基于类姜黄色素二氟硼的靶向肿瘤的γ-谷氨酰基转肽酶(GGT)-可活化的)荧光探针(Glu-DFB),吲哚菁类似物(诸如AP-Glu(3H-吲哚鎓,2-[(1E)-2-[4-[[4-[[(4S)-4-氨基-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]苯基]甲氧基]苯基]乙烯基]-1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-,溴化物(1:1),CAS登记号1884698-06-9)和其它近红外荧光活化分子。
在体内条件下，远红色荧光团(630/661或更长波长；诸如Alexafluor633、细胞痕迹远红、或Cy5)是优选的，因为组织自发荧光是相对低的，并且长波长组织穿透优于较短波长的组织穿透。
在某些实施方案中，用于MRI的造影剂选自氧化铁造影剂(诸如磁石、Fe3O4)；硫酸钡；和钆造影剂，诸如钆特酸盐、钆双胺、钆贝酸盐、钆喷替酸盐、钆布醇；用于CT的造影剂选自金属元素，诸如碘、铋、溴、钽、金、铂、镱、钇、钆、钨、铟和镥；或用于PET的造影剂选自64Cu-PSTM、18F-FDG、18F-氟化物、18F-氟米索硝唑和镓。
在某些实施方案中，所述光动力剂选自卟吩姆钠
Figure BDA0003082793100000071
Figure BDA0003082793100000072
替莫泊芬/mTHPC/Foscan、他拉泊芬/NPe6/Laserphyrin、
Figure BDA0003082793100000073
Tookad、Photochlor、Fotolon、Antrin、Purlytin、TLD1433、WST11和Lutex，或金纳米颗粒诸如球形或杆(road)形纳米颗粒。
在某些实施方案中，所述多个脂质中的至少一个脂质的亲水头各自被结合对的第一官能团或第二官能团官能化，所述第一官能团或第二官能团能够在正常条件下彼此结合，这优于与其它分子结合，或在它们之间形成共价键或非共价的高亲和力缀合物，其中所述结合对的第一官能团和第二官能团是例如、但不限于：(i)点击化学反应的反应性基团；(ii)生物素和生物素结合肽或生物素结合蛋白。
本文中使用的术语“高亲和力”表示化学或生物物理结合，诸如螯合剂-金属偶联(例如Ni和包含几个His-残基的肽序列诸如His6)，或在结合对的两个成员(例如抗体及其靶表位或生物素和链霉抗生物素蛋白等)之间的缀合，其中两个结合对之间的结合具有10- 4M至10-30M(例如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或12-13M)的Kd。
在某些实施方案中，所述脂质分子中的至少一个被特异性结合对的能够结合所述结合对的互补性第二官能团的第一官能团官能化。
本文中使用的术语“结合对”表示一对不同的分子，各自包含其自身的特定官能团，两个官能团对彼此具有特定的特异性(或与之互补)。换而言之，这些基团在正常条件下能够彼此结合，这优于与其它分子结合。结合可以是共价的或非共价的。这样的结合对的非限制性例子是硫醇-马来酰亚胺、叠氮化物-炔烃、醛-羟胺等。
一般而言，官能团是分子内原子或键的特定基团或部分，其负责那些分子的特征性化学反应。具体地，本文所定义的官能团或结合对的官能团表示结合对的原子或键的特定反应性基团或部分(在下文中称为“第一官能团”)，其能够结合所述结合对的另一个官能团(在下文中称为“第二官能团”)。如上所述，第一和第二官能团彼此互补。在上述非限制性例子中，第一官能团是硫醇、叠氮化物或醛，且它们的互补(第二)官能团分别是马来酰亚胺、炔烃或羟胺。
一般而言，本文所定义的交联试剂(或交联剂)表示含有两个或更多个反应性末端(官能团)的分子，所述末端能够化学连接至蛋白或其它分子上的特定反应性基团(伯胺、巯基等)。具体地，本文所定义的交联剂包含官能团和间隔物。
在某些实施方案中，所述融合脂质体进一步包含在脂质双层和第一官能团之间的第一间隔物。
在某些实施方案中，所述融合脂质体中被第一官能团官能化的所述脂质分子中的至少一个进一步包含相同或不同的额外可检测试剂、光治疗剂(即光动力剂)或免疫系统活化剂，每一个被所述互补性第二官能团官能化并通过所述第二官能团结合至所述第一官能团，其中所述额外的相同或不同的可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂。
在某些实施方案中，所述免疫系统活化剂是选自以下的试剂：抗-CD3抗体、抗-CD8抗体、抗-NKG2D抗体或它们的组合、能够结合CD3和CD8两者的抗体以及能够结合CD3和NKG2D两者的抗体。
当融合脂质体包含免疫系统活化剂或光治疗剂诸如金纳米颗粒时，它基本上是治疗诊断剂。
在某些实施方案中，所述可检测试剂、光治疗剂或免疫系统活化剂结合在融合脂质体的外小叶处。
在某些实施方案中，所述可检测试剂或免疫系统活化剂进一步包含在可检测试剂或免疫系统活化剂和第二官能团之间的第二间隔物。
在某些实施方案中，所述第一或第二间隔物选自：PEG、(C6-C12)烷基、酚、苯或萘的单-、二-或三-羧酸、四氢芘的单-、二-或三-羧酸或其盐、环状醚、戊二酸、琥珀酸、粘康酸、己二酸、庚二酸、软木酸、壬二酸和癸二酸和肽，诸如约2-20个氨基酸残基长度(例如3个氨基酸残基长度)的聚-Gly肽。
在某些实施方案中，所述第一或第二间隔物是约106Da至约4kDa的分子量的PEG。
在某些实施方案中，所述第一或第二间隔物是约194Da的分子量的PEG(PEG4)。
在某些实施方案中，所述第一或第二间隔物是(C6-C12)烷基，优选庚基或十二烷酰基。
在某些实施方案中，所述免疫系统活化剂选自T-细胞活化剂；促炎细胞因子；记忆杀伤T细胞活化肽；可溶性人白细胞抗原(sHLA)呈递肽；和超抗原。
在某些实施方案中，所述免疫系统活化剂是T-细胞活化剂。
在某些实施方案中，所述T-细胞活化剂选自抗-CD3抗体、抗-CD8抗体、抗-NKG2D抗体或它们的组合、能够结合CD3和CD8两者的抗体以及能够结合CD3和NKG2D两者的抗体。
本文所述的抗体或其功能片段也指单链可变片段(scFv)；抗体的功能片段；单结构域抗体，诸如Nanobody；和重组抗体；(ii)抗体模拟物，诸如亲和体(affibody)分子；affilin；affimer；affitin；alphabody；anticalin；亲合体(avimer)；DARPin；fynomer；Kunitz结构域肽；和单体(monobody)；或(iii)适体。
应当明确的是，在本发明中使用的抗体或其功能片段不实现靶向试剂的功能(将脂质体带至特定靶细胞)，而是实现免疫系统活化剂的功能。
在以上实施方案中的任一个中，所述包含阳离子基团的脂质分子中的至少一个选自1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷氯化物(DOTAP)，双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)，1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，二甲基双十八烷基铵(18:0DDAB)，和N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基-甲酰氨基)乙基]-3，4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)。
在某些实施方案中，所述包含阳离子基团的脂质分子中的至少一个是DOTAP。
在以上实施方案中的任一个中，所述阳离子合成聚合物选自聚乙烯亚胺(PEI)和聚(2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯。
在以上实施方案中的任一个中，所述阳离子天然聚合物是壳聚糖。
在以上实施方案中的任一个中，所述阳离子氨基糖是葡糖胺。
在以上实施方案中的任一个中，所述阳离子聚氨基酸选自聚(L-赖氨酸)、聚(L-精氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚(D-精氨酸)、聚(L-鸟氨酸)和聚(D-鸟氨酸)。
在以上实施方案中的任一个中，所述两亲的癌细胞结合肽选自杀菌肽A；杀菌肽A1-8；和环状CNGRC。
在以上实施方案中的任一个中，所述脂质分子中的至少一个是选自以下的磷脂：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸或它们的组合，它们中的每一个包含一个或两个相同或不同的脂肪酸残基，其中所述磷脂酰部分中的脂肪酸残基是饱和的、单不饱和的或多不饱和的且具有14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个碳的碳链长度，诸如处于磷脂和溶血磷脂构型的肉豆蔻酰基、硬脂酰基、棕榈酰基、油酰基、亚油酰基、亚麻酰基(包括共轭的亚麻酰基)、花生四烯酰基和它们的组合。
在某些实施方案中，所述磷脂选自：1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)和1,2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-3-磷脂酰胆碱(DMPC)；1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)；1，2-二肉豆蔻酰油酰基(1，2-dimyristoleoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:1(Δ9-Cis)PC)；1，2-二反式肉豆蔻异烯酰基(1，2-dimyristelaidoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:1(Δ9-Trans)PC)；1,2-二顺式棕榈烯酰基(1,2-dipalmitoleoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:1(Δ9-Cis)PC)；1,2-二反式棕榈异烯酰基(dipalmitelaidoyl)-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:1(Δ9-Trans)PC)；1,2-dipetroselenoyl-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ6-Cis)PC)；1,2-二油酰基-3-磷脂酰胆碱(18:1(Δ9-Cis)PC(DOPC))；1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ9-Trans)PC)；1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:2(Cis)PC(DLPC))；1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:3(Cis)PC)；1,2-二二十碳烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:1(Cis)PC)；1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:4(Cis)PC)；1,2-二二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:6(Cis)PC)；1,2-二芥酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:1(Cis)PC)；1,2-二二十四碳烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(24:1(Cis)PC)；1,2-二肉豆蔻酰基-3--3-磷脂酰乙醇胺(DMPE)；1,2-二棕榈酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DPPE)；二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)；1,2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)；1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-3-磷脂酰丝氨酸(DMPS)；1,2-二棕榈酰基-3-磷脂酰丝氨酸(DPPS)；棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)；和1,2-二油酰基-3-磷脂酰丝氨酸(DOPS)。
在某些实施方案中，所述磷脂选自DOPC、POPC、DMPC、DPPC、DOPE、POPE、DSPE、DMPE和DPPE。
在以上实施方案中的任一个中，所述稳定化部分是约106Da至约4kDa的分子量的PEG。
在某些实施方案中，所述稳定化部分的PEG是约2kDa的分子量的PEG。
在以上实施方案中的任一个中，所述稳定化部分经由可切割的肽接头连接至所述脂质分子中的至少一个。
在涉及包含官能团的脂质体的以上实施方案中的任一个中，特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的所述互补性第二官能团形成共价键。
在某些实施方案中，所述特异性结合对的第一官能团能够经由点击化学反应与所述结合对的所述互补性第二官能团形成共价键。
在某些实施方案中，i)所述特异性结合对的第一官能团是炔烃或膦，且所述结合对的第二官能团是叠氮化物，或反之亦然；ii)所述特异性结合对的第一官能团是环烯烃、环炔烃、环丙烷、异腈(异氰化物)或乙烯基硼酸，且所述结合对的第二官能团是四嗪，或反之亦然；iii)所述特异性结合对的第一官能团是炔烃或马来酰亚胺，且所述结合对的第二官能团是硫醇，或反之亦然；iv)所述特异性结合对的第一官能团是共轭二烯，且所述结合对的第二官能团是取代的烯烃，或反之亦然；v)所述特异性结合对的第一官能团是烯烃、炔烃或乙炔化铜，且所述结合对的第二官能团是硝酮，或反之亦然；vi)所述特异性结合对的第一官能团是醛或酮，且所述结合对的第二官能团是烷氧基胺、羟胺、肼或酰肼，或反之亦然；或vii)所述特异性结合对的第一官能团是醛、酮、异硫氰酸盐、羧酸或其衍生物诸如酯、酸酐、酰卤、甲苯磺酰基和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，且所述结合对的第二官能团是胺，或反之亦然；viii)官能团。
在某些实施方案中，所述特异性结合对是炔烃-叠氮化物。
在涉及包含官能团的脂质体的以上实施方案中的任一个中，特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的所述互补性第二官能团形成非共价键。
在某些实施方案中，所述特异性结合对的第一官能团是生物素，且所述结合对的第二官能团是选自生物素-结合肽或生物素-结合蛋白的其结合配偶体，或反之亦然。
在某些实施方案中，所述生物素-结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和抗-生物素抗体。
在某些实施方案中，所述生物素-结合肽选自AEGEFCSWAPPKASCGDPAK(SEQ ID NO:1)、CSWRPPFRAVC(SEQ ID NO:2)、CSWAPPFKASC(SEQ ID NO:3)和CNWTPPFKTRC(SEQ ID NO:4)。
在以上实施方案中的任一个中，所述融合脂质体进一步包含胆固醇(CHO)或它的衍生物。
在以上实施方案中的任一个中，所述融合脂质体包含DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE或DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K和任选的胆固醇，其中PEG2K代表具有约2kDa的分子量的PEG，且DOPC的相对摩尔量是至多约80％，DOTAP的相对摩尔量是至多约80％，DSPE-PEG2K的相对摩尔量是至多约20％，DOPE的相对摩尔量是至多约20％，胆固醇的相对摩尔量是至多约40％。
在某些实施方案中，所述融合脂质体包含：
(i)摩尔比为52.5:35:0.6:10、52.5:35:1.25:10、52.5:35:2.5:10、52.5:35:5:10、52.5:35:0.6:5、52.5:35:1.25:5、52.5:35:2.5:5、52.5:35:5:5、65:20:5:10、50:35:5:10、52.5:35:1.25:7、52.5:35:1.25:5或52.5:35:2.5:7的DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE；或者
(ii)摩尔比为52.5:35:0.6、52.5:35:1.25、52.5:35:2.5、52.5:35:5、52.5:35:0.6、52.5:35:1.25、52.5:35:2.5、52.5:35:5、65:20:5、50:35:5、52.5:35:1.25、52.5:35:1.25或52.5:35:2.5的DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K。
在某些实施方案中，所述融合脂质体包含摩尔比为52.5:35:2.5:5的DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE；或摩尔比为52.5:35:2.5的DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K。
在以上实施方案中的任一个中，所述脂质体的熔化温度(Tm)低于45℃，在所述熔化温度，所述融合脂质体维持在非结晶转变相，由此提供脂质体与细胞膜的融合所需的膜流动性。
在以上实施方案中的任一个中，所述融合脂质体具有至多200nm的大小，例如约15nm至约200nm、约20nm至约100nm、约50nm至约150nm、约50nm至约90nm、约80nm至约100nm、约110nm至约200nm，例如约100nm的大小。
用于生产本发明的融合脂质体的方法是基于动力学反应控制的概念。脂质体是由脂质双层自组装而成，其反应速率比两个官能团之间形成化学键高得多。因此，在溶液中发生任何明显的化学反应之前，未反应的可检测试剂和其它试剂或催化剂(诸如用于铜依赖性点击化学反应的铜催化剂)被包封在脂质体的水性内部中。没有将化学反应所需的可检测试剂和/或其它试剂包封在脂质体内，例如通过洗涤形成的脂质体进一步从溶液中物理除去。用于点击化学反应以形成本发明的脂质体的催化剂的非限制性例子是乙酰基丙酮酸铜(II)、异腈铜(I)以及使用抗坏血酸钠作为还原剂从铜(I)盐或铜(II)盐产生的任意其它活性铜(I)催化剂。免疫系统活化剂和其它试剂或催化剂可以如下除去：例如通过透析或凝胶过滤，或通过使免疫活化剂或脂质的官能团中的一种或两种与过量的相应游离官能团反应，所述相应游离官能团耗尽免疫活化剂或脂质的官能团并因此停止或抑制反应。
制备脂质体的方法是本领域众所周知的，Batzri,S.和Korn,E.D.Single bilayerliposomes prepared without sonication.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes 298,1015-1019(1973)。例如，可以在导致脂质体形成的条件下将在有机溶剂中的脂质溶液注入具有高于Tm的温度的水溶液中，例如通过纳米组装器或其它类似装置的方式，由此产生融合脂质体；或将脂质溶液注入具有高于Tm的温度的水溶液中并混合，由此获得脂质体溶液，并通过挤出机挤出脂质体溶液，所述挤出机包含至少一个支持物和至少一个蚀刻膜，所述蚀刻膜具有在50和400nm之间的直径的孔。
在另一个方面，本发明提供了一种用于选择性地检测癌细胞的方法，所述方法包括使所述癌细胞与在以上实施方案中的任一个中和在它们的任意组合中定义的融合脂质体接触，和在所述可检测试剂是可活化的荧光探针的情况下，通过用具有被所述荧光探针吸收的波长的光照射所述细胞和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针；在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者。在某些实施方案中，非原位进行所述检测。
类似地，在另一个方面，本发明提供了用于选择性地检测癌细胞的以上实施方案中的任一个的融合脂质体，所述用途或检测包括使所述癌细胞与在以上实施方案中的任一个中和在它们的任意组合中定义的融合脂质体接触，和在所述可检测试剂是可活化的荧光探针的情况下，通过用具有被所述荧光探针吸收的波长的光照射所述细胞和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针；在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者。
类似地，在另一个方面，本发明提供了以上实施方案中的任一个的融合脂质体用于制备选择性地检测癌细胞的组合物的用途，所述用途或检测包括使所述癌细胞与在以上实施方案中的任一个中和在它们的任意组合中定义的融合脂质体接触，和在所述可检测试剂是可活化的荧光探针的情况下，通过用具有被所述荧光探针吸收的波长的光照射所述细胞和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针；在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者。
术语“使所述癌细胞与融合脂质体接触”在本文中用于描述其中将本发明的融合脂质体在体外施用于包含单独癌细胞或癌细胞和正常细胞的混合物的细胞或器官、或在体内或原位施用于具有癌症的患者或具有癌细胞的器官的任何情况。
在某些实施方案中，癌症患者中癌细胞的选择性检测通过预测包含所述癌症药物的纳米颗粒到达所述癌症患者中的肿瘤的能力，指示所述癌症患者对用包含在纳米颗粒中的癌症药物治疗癌症的应答性。
在某些实施方案中，在全身性第一结合对结合的脂质体施用(即用结合对的第一官能团官能化的脂质体的施用)后，使用第二官能团染色后，使用来自赘生性疑似组织的活组织检查进行癌症患者中癌细胞的选择性检测，所述第二官能团结合至酶诸如辣根过氧化物酶(HRP)或结合至荧光探针，其在活组织检查染料和/或复染剂(诸如苏木精、曙红、DAPI、荧光抗体、荧光鬼笔环肽)的标准染色以外添加。
在某些实施方案中，在将组织切片与结合至第一结合对的脂质体一起温育后，然后使用结合至HRP或结合至荧光探针的第二结合对染色后，使用来自赘生性疑似组织的活组织检查进行选择性检测，所述第二官能团在活组织检查染料和/或复染剂(诸如苏木精、曙红、DAPI、荧光抗体、荧光鬼笔环肽)的标准染色以外添加。
在某些实施方案中，用包含所述癌症药物的所述纳米颗粒治疗被确定为应答性的癌症患者。
在某些实施方案中，当癌症患者被确定为应答性时，包含所述癌症药物的纳米颗粒用于治疗癌症患者。
在某些实施方案中，当癌症患者被确定为应答性时，本发明提供了包含所述癌症药物的纳米颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌症患者。
在另一个方面，本发明提供了一种用于选择性地检测癌细胞的方法，所述方法包括：(a)使所述癌细胞与根据以上涉及官能化的融合脂质体的实施方案中的任一项的官能化的融合脂质体接触；(b)使所述癌细胞与可检测试剂接触，所述可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂，其中所述可检测试剂用能够结合所述脂质分子的所述第一官能团的结合对的互补性第二官能团官能化；和(c)在所述可检测试剂是荧光探针的情况下，通过用具有被所述荧光探针吸收的波长的光照射所述细胞和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针；在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者，由此选择性地检测所述癌细胞。
类似地，在另一个方面，本发明提供了用于选择性地检测癌细胞的以上实施方案中的任一个的融合脂质体，所述用途或检测包括(a)使所述癌细胞与根据以上涉及官能化的融合脂质体的实施方案中的任一项的官能化的融合脂质体接触；(b)使所述癌细胞与可检测试剂接触，所述可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂，其中所述可检测试剂用能够结合所述脂质分子的所述第一官能团的结合对的互补性第二官能团官能化；和(c)在所述可检测试剂是荧光探针的情况下，通过用具有被所述荧光探针吸收的波长的光照射所述细胞和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针；在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者，由此选择性地检测所述癌细胞。
也类似地，在另一个方面，本发明提供了以上实施方案中的任一个的融合脂质体用于制备选择性地检测癌细胞的组合物的用途，所述用途或检测包括(a)使所述癌细胞与根据以上涉及官能化的融合脂质体的实施方案中的任一项的官能化的融合脂质体接触；(b)使所述癌细胞与可检测试剂接触，所述可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂，其中所述可检测试剂用能够结合所述脂质分子的所述第一官能团的结合对的互补性第二官能团官能化；和(c)在所述可检测试剂是荧光探针的情况下，通过用具有被所述荧光探针吸收的波长的光照射所述细胞和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针；在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者，由此选择性地检测所述癌细胞。
可替换地，不是在步骤(b)中使所述癌细胞与被互补性第二官能团官能化的可检测试剂接触，而是使癌细胞与第二脂质体或纳米颗粒接触，所述第二脂质体或纳米颗粒在其表面中包含与(a)的官能化的融合脂质体的可检测试剂不同的可检测试剂和第二官能团。该组合可以以两步注射方式使用，以改善信噪比并减少组织(诸如肝和脾)中的假阳性。具有第一结合对的第一脂质体与癌细胞融合并添加一个荧光团。具有第二结合对的第二纳米颗粒结合被第一脂质体标记的癌细胞上的基团并递送第二荧光团。两个信号的存在减少假阳性，并且另外可以用于执行荧光共振能量转移(FRET)。FRET也可以在体内条件下使用，其中第一融合脂质体携带一个荧光团和第一个结合对，且第二个脂质体/纳米颗粒携带互补结合对和可以用在FRET中的第二荧光团，并且如果具有两种荧光团的两种脂质体紧密接触则产生信号。
在某些实施方案中，所述可检测试剂是选自以下的荧光探针：cy3、cy5、cy5.5、cy7cy9、FITC、荧光素、alexa fluor 790、alexa fluor 750、alexa fluor700、alexa fluor680、alexa fluor 660、alexa fluor 647、alexa fluor 633、alexa fluor 594、在585nm至800nm范围内的Qdot、荧光原卟啉寡聚体、异花青绿(ICG)；或
选自以下的可活化的荧光探针：荧光素类似物(诸如二乙酸盐修饰的类似物),香豆素类似物(诸如py+BC690-(1-甲基-4-(2-氧代-8-(吡咯烷-1-基)-2H-苯并[g]色烯-3-基)吡啶鎓三氟甲磺酸盐)),CFSE(5(6)-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺基酯),罗丹明类似物(诸如gGlu-HMRG(γ-谷氨酰基羟基甲基罗丹明绿)),基于类姜黄色素二氟硼的靶向肿瘤的γ-谷氨酰基转肽酶(GGT)-可活化的)荧光探针(Glu-DFB),吲哚菁类似物(诸如AP-Glu(ap-glu 3H-吲哚鎓，2-[(1E)-2-[4-[[4-[[(4S)-4-氨基-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]苯基]甲氧基]苯基]乙烯基]-1-(5-羧基戊基)-3,3-二甲基-,溴化物(1:1),CAS登记号1884698-06-9)和其它近红外荧光活化分子。
在某些实施方案中，癌症患者中的癌细胞的选择性检测指示通过预测包含所述癌症药物的纳米颗粒到达所述癌症患者中的肿瘤的能力，指示所述癌症患者对用包含在纳米颗粒中的癌症药物治疗癌症的应答性。
在某些实施方案中，用包含所述癌症药物的所述纳米颗粒治疗被确定为应答性的癌症患者。
在某些实施方案中，当癌症患者被确定为应答性时，包含所述癌症药物的纳米颗粒是用于治疗癌症患者。
在某些实施方案中，当癌症患者被确定为应答性时，本发明提供了包含所述癌症药物的纳米颗粒用于制备药物的用途，所述药物用于治疗癌症患者。
在癌症治疗中使用或开发的纳米颗粒的类型的非限制性例子是：脂质体；基于蛋白的纳米颗粒，诸如白蛋白、铁蛋白、明胶和转铁蛋白；共聚物诸如聚(乳酸-羟乙酸共聚物)(PLGA)；聚合胶束，诸如由三嵌段共聚物(含腙键的PEG-DiHyd-PLA)制成的胶束；金纳米颗粒；和用与体内应用相容的聚合物覆盖的磁石芯纳米颗粒。
可以配制在纳米颗粒中的细胞毒性药物的类型的非限制性例子是化学治疗剂，诸如烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、氮杂环丙烷、环氧化物、烷基磺酸酯)、顺铂及其类似物(例如，卡铂、奥沙利铂)、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、氟达拉滨)、拓扑异构酶相互作用剂(例如，喜树碱、伊立替康、托泊替康、依托泊苷、替尼泊苷、多柔比星、柔红霉素)、抗微管剂(例如，长春花生物碱，诸如长春新碱、长春碱和长春瑞滨；紫杉烷，诸如紫杉醇和多西他赛)、干扰素、白介素-2、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、单克隆抗体、雌激素调节剂(例如，他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬)、甲地孕酮、芳香酶抑制剂(例如，来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、奥曲肽)、奥曲肽、抗雄激素(例如，氟他胺、康士得)、激酶和酪氨酸抑制剂(例如，伊马替尼(STI571或Gleevac)；吉非替尼(易瑞沙)；和厄洛替尼(特罗凯)、两亲的癌细胞结合肽选自杀菌肽A；杀菌肽A1-8；和环状CNGRC；光动力剂诸如Photofrin、金。
因此，在上述纳米颗粒中包含的癌症药物可以是上述纳米颗粒和细胞毒性药物的任意组合。
纳米颗粒药物(即含有细胞毒性药物的颗粒)的非限制性例子是
Figure BDA0003082793100000181
(与白蛋白结合的紫杉醇，以延长循环时间和生物利用度)；和
Figure BDA0003082793100000182
(使用活性加载方法包封在脂质体中的多柔比星制剂)。这些多柔比星脂质体(由56.6:38.2:5.3摩尔比的HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000构成)是癌症疗法中的领先纳米药物之一。
在替代方案中，用包含所述癌症药物的所述纳米颗粒治疗借助于用结合对的第一官能团官能化的融合脂质体被确定为应答性的癌症患者，其中所述纳米颗粒被互补性第二官能团官能化。例如，全身性地注射其中白蛋白部分被第二结合对修饰的
Figure BDA0003082793100000183
或将多柔比星主动加载到被第二结合对官能化的脂质体中。官能化的第二纳米颗粒因此靶向至已经被第一官能团标记或官能化的癌细胞并通过第二官能团与其结合。
在另一个方面，本发明提供了一种通过荧光引导的外科手术或靶向放射疗法来治疗癌症的方法，所述方法包括上面定义的选择性地检测癌细胞和取出含有所述癌细胞的肿瘤的方法之一。
在某些实施方案中，在外科手术期间使用的带有酯酶可切割的荧光团(可活化的荧光团)的本发明的脂质体可以静脉内注射或用于冲洗肿瘤组织和疑似为赘生性组织的周围组织。然后用盐水溶液洗涤组织以除去多余的未结合的脂质体和血液以改善信噪比。脂质体与癌细胞的融合导致荧光团上的酯基的除去，并允许使用与所使用的荧光团相对应的荧光激发和发射波长进行检测。
在上面定义的用于选择性地检测癌细胞的方法中的任一种或用在选择性地检测癌细胞中的融合脂质体的某些实施方案中，所述癌症患者正在经历器官(诸如皮肤)区域的扫描或全身肿瘤(诸如皮肤癌)的成像，或全身成像，且所述方法或用途包括全身性地施用或局部地应用所述融合脂质体和任选的官能化的可检测试剂；和，在所述可检测试剂是可活化的荧光探针或荧光探针的情况下，通过照射所述皮肤区域或全身和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针，在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者，由此定义肿瘤位置和边缘。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，包括这样的方法：其中所述癌症患者正在经历肿瘤(诸如皮肤癌)的成像，或上述的全身成像，和通过外科手术取出含有所述癌细胞的肿瘤。
在上面定义的选择性地检测癌细胞的方法中的任一种的某些实施方案中，该方法旨在非原位在组织(诸如活组织检查，或从有此需要的患者取出的血液衍生级分)中选择性地检测癌细胞，所述方法包括将融合脂质体和任选的官能化的荧光探针全身性地施用或应用于从癌症患者取出的组织或血液衍生级分，和通过照射组织或血液衍生级分和非原位检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针，由此选择性地检测所述癌细胞。
在某些实施方案中，所述组织是皮肤，所述癌症患者正在经历用于除去皮肤癌的外科手术(Mohs外科手术)，和重复所述外科手术，直到通过非原位检测确定所述皮肤组织不再具有可检测的癌细胞。
在某些实施方案中，取出怀疑瘤形成的组织，并用生理学等渗缓冲液洗涤以除去血块，将组织用包含可活化的荧光团脂质体溶液(例如在0.1-50mM脂质)的溶液浸渍。将脂质体处理过的组织用PBS或其它生理学等渗溶液(诸如盐水)洗涤，并在荧光显微镜下用与荧光团相对应的激发和发射波长成像。
可替换地，取出怀疑瘤形成的组织，并用PBS或其它缓冲液洗涤以除去血块，用包含本发明的融合脂质体的溶液(诸如在5mM脂质的溶液)浸渍，所述融合脂质体包含特异性结合对的能够结合所述结合对的互补性第二官能团的第一官能团。然后将脂质体处理过的组织生理学等渗溶液洗涤，并在包含可检测荧光团(其包含互补性第二官能团)的溶液中浸渍，洗涤，和在荧光显微镜下用与荧光团相对应的激发和发射波长成像。
在某些实施方案中，将旨在非原位选择性地检测癌细胞的方法用于非原位选择性地检测在所述血液衍生级分中的循环肿瘤细胞(CTC)。这通过如下实现：使用本领域众所周知的方法分离CTC，并使它们与以上实施方案中任一个的融合脂质体接触。
在某些实施方案中，根据以上实施方案中的任一个选择性地检测或治疗的癌症选自乳腺癌诸如三重阴性的乳腺癌、黑素瘤、肺癌、甲状腺癌和前列腺癌。
在某些实施方案中，将旨在选择性地检测癌细胞的方法用于选择性地检测癌细胞和治疗癌症，所述方法包括全身性地施用或局部地应用所述融合脂质体和任选的官能化的可检测试剂，其中所述融合脂质体包含所述可检测试剂和细胞毒性剂和/或免疫系统活化剂；在所述可检测试剂是可活化的荧光探针或荧光探针的情况下，通过照射所述皮肤区域或全身和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针，在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者；和任选地通过随时间重复检测所述可检测试剂监测治疗应答。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括施用融合脂质体，所述融合脂质体在其内部水性隔室中包含或包封细胞毒性的药物或光动力剂，其中所述融合脂质体(a)包含脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14-24个碳原子的脂质分子，其中所述脂质分子中的至少一个进一步包含阳离子基团、阳离子的天然的或合成的聚合物、阳离子的氨基糖、阳离子的聚氨基酸或两亲的癌细胞结合肽；且所述脂质分子中的至少一个进一步包含选自以下的稳定化部分：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚氨基酸、甲基-聚噁唑啉、聚甘油、聚(丙烯酰基吗啉)和聚丙烯酰胺；(b)任选的特异性结合对的能够结合所述结合对的互补性第二官能团的第一官能团；和(c)在(b)存在的情况下，任选的免疫系统活化剂，其包含与所述第一官能团结合的所述结合对的所述互补性第二官能团。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的融合脂质体，其中所述融合脂质体在其内部水性隔室中包含或包封细胞毒性的药物或光动力剂，其中所述融合脂质体(a)包含脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14-24个碳原子的脂质分子，其中所述脂质分子中的至少一个进一步包含阳离子基团、阳离子的天然的或合成的聚合物、阳离子的氨基糖、阳离子的聚氨基酸或两亲的癌细胞结合肽；且所述脂质分子中的至少一个进一步包含选自以下的稳定化部分：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚氨基酸、甲基-聚噁唑啉、聚甘油、聚(丙烯酰基吗啉)和聚丙烯酰胺；(b)任选的特异性结合对的能够结合所述结合对的互补性第二官能团的第一官能团；和(c)在(b)存在的情况下，任选的免疫系统活化剂，其包含与所述第一官能团结合的所述结合对的所述互补性第二官能团。
在某些实施方案中，在(b)存在但(c)不存在的情况下，所述方法或用途进一步包括施用免疫系统活化剂，其用能够结合所述脂质分子的所述第一官能团的结合对的互补性第二官能团官能化。
在某些实施方案中，所述细胞毒性的药物是化学治疗剂，诸如烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、氮杂环丙烷、环氧化物、烷基磺酸酯)、顺铂及其类似物(例如，卡铂、奥沙利铂)、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、氟达拉滨)、拓扑异构酶相互作用剂(例如，喜树碱、伊立替康、托泊替康、依托泊苷、替尼泊苷、多柔比星、柔红霉素)、抗微管剂(例如，长春花生物碱，诸如长春新碱、长春碱和长春瑞滨；紫杉烷，诸如紫杉醇和多西他赛)、干扰素、白介素-2、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、单克隆抗体、雌激素调节剂(例如，他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬)、甲地孕酮、芳香酶抑制剂(例如，来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、奥曲肽)、奥曲肽、抗雄激素(例如，氟他胺、康士得)、激酶和酪氨酸抑制剂(例如，伊马替尼(STI571或Gleevac)；吉非替尼(易瑞沙)；和厄洛替尼(特罗凯)、两亲的癌细胞结合肽选自杀菌肽A；杀菌肽A1-8；和环状CNGRC；光动力剂诸如Photofrin、金。
在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含：(a)第一容器，其含有包含脂质双层的融合脂质体，所述脂质双层包含多个具有14-24个碳原子的脂质分子，且所述脂质分子中的至少一个进一步包含阳离子基团、阳离子的天然的或合成的聚合物、阳离子的氨基糖、阳离子的聚氨基酸或两亲的癌细胞结合肽；所述脂质分子中的至少一个进一步包含选自以下的稳定化部分：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚氨基酸、甲基-聚噁唑啉、聚甘油、聚(丙烯酰基吗啉)和聚丙烯酰胺；且其中所述脂质分子中的至少一个被特异性结合对的能够结合所述结合对的互补性第二官能团的第一官能团官能化；(b)第二容器，其包含可检测试剂，所述可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂，其中所述可检测试剂用能够结合所述脂质分子的所述第一官能团的结合对的互补性第二官能团官能化；和(c)小册子，其具有关于选择性地检测癌细胞的方法的说明，所述方法包括给癌症患者施用(a)的融合脂质体和随后施用(b)的可检测试剂。
术语“载体”表示与活性剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。药物组合物中的载体可以包含粘合剂，诸如微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮(polyvidone)或聚维酮(povidone))、黄蓍树胶、明胶、淀粉、乳糖或乳糖一水合物；崩解剂，诸如海藻酸、玉米淀粉等；润滑剂或表面活性剂，诸如硬脂酸镁或月桂基硫酸钠；和助流剂，诸如胶体二氧化硅。
可以将组合物配制成用于通过注射进行胃肠外施用，例如通过快速推注或连续输注或直接肿瘤注射。注射用制剂可以以单位剂型存在，例如，在安瓿或多剂量容器中，并加入防腐剂或稳定剂。所述组合物可以采取诸如在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液的形式，且可以含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替换地，活性成分可以呈粉末形式，用于在使用前用合适的媒介物(例如，无菌的无热原的水)配制。
所述组合物可以任选地以液体形式/粘膜粘着制剂形式配制为口腔洗剂以局部方式将脂质体递送至口腔癌并且可能递送至头颈癌、食管癌和其它上胃肠道肿瘤病灶。液体形式可以是溶液、糖浆剂或混悬液，或者它可以呈现为在使用前用水、可注射的等渗液或其它合适的媒介物重构的药物产品。这样的液体制剂可以通过常规方式用药学上可接受的添加剂制备，所述添加剂诸如助悬剂(例如，山梨醇糖浆剂、纤维素衍生物或氢化的可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂)；非水性媒介物(例如，扁桃仁油、油状酯或分级分离的植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。所述药物组合物可以采取例如片剂或胶囊剂的形式，所述片剂或胶囊剂通过常规方式用药学上可接受的赋形剂制备，所述赋形剂诸如粘合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅胶)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)。可以通过本领域众所周知的方法将片剂包衣。
对于含服施用，所述组合物可以采取以常规方式配制的片剂、粘膜粘着贴剂/粘着剂或锭剂的形式。
所述组合物也可以配制成直肠组合物诸如保留灌肠剂，例如，含有常规栓剂基质诸如可可脂或其它甘油酯。
对于通过吸入施用，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，从增压包或喷雾器以气溶胶喷雾呈递形式方便地递送用于根据本发明的用途的组合物。在增压气溶胶的情况下，通过提供阀门来递送计量的量，可以确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器中的胶囊和筒(例如由明胶或甘油制成)，其含有化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
本文中使用的术语“治疗”表示获得期望的生理效应的手段。就部分地或完全地治愈疾病和/或归因于该疾病的症状而言，所述效应可以是治疗性的。该术语表示抑制疾病，即阻止其发展；或改善疾病，即造成疾病的消退。
尽管本文已经举例说明和描述了本申请的某些特征，但是许多修改、替换、改变和等同形式将是本领域普通技术人员显而易见的。因此，应当理解，所附权利要求书意图涵盖落入本申请的真实精神内的所有这样的修改和改变。
总之，根据实施方案1，本发明提供了一种融合脂质体，其包含可检测试剂和在其内部水性隔室中或结合至脂质体膜的任选细胞毒性药物；其中
所述融合脂质体包含脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14-24个碳原子的脂质分子，且所述脂质分子中的至少一个进一步包含阳离子基团、阳离子的天然的或合成的聚合物、阳离子的氨基糖、阳离子的聚氨基酸或两亲的癌细胞结合肽；和
所述脂质分子中的至少一个进一步包含选自以下的稳定化部分：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚氨基酸、甲基-聚噁唑啉、聚甘油、聚(丙烯酰基吗啉)和聚丙烯酰胺。
实施方案2:权利要求1的方法，其中所述可检测试剂选自荧光探针、用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂和光动力剂。
实施方案3：实施方案1的融合脂质体，其中所述可检测试剂是选自以下的荧光探针：cy3、cy5、cy5.5、cy7 cy9、FITC、荧光素、alexa fluor790、alexa fluor 750、alexafluor 700、alexa fluor 680、alexa fluor 660、alexa fluor 647、alexa fluor 633、alexa fluor 594、在585nm至800nm范围内的Qdot、荧光原卟啉寡聚体、异花青绿(ICG)；或
选自以下的可活化的荧光探针：荧光素类似物(诸如二乙酸盐修饰的类似物),香豆素类似物(诸如py+BC690-(1-甲基-4-(2-氧代-8-(吡咯烷-1-基)-2H-苯并[g]色烯-3-基)吡啶鎓三氟甲磺酸盐)),CFSE(5(6)-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺基酯),罗丹明类似物(诸如gGlu-HMRG(γ-谷氨酰基羟基甲基罗丹明绿)),基于类姜黄色素二氟硼的靶向肿瘤的γ-谷氨酰基转肽酶(GGT)-可活化的)荧光探针(Glu-DFB),和吲哚菁类似物(诸如AP-Glu(3H-吲哚鎓,2-[(1E)-2-[4-[[4-[[(4S)-4-氨基-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]苯基]甲氧基]苯基]乙烯基]-1-(5-羧基戊基)-3，3-二甲基-,溴化物(1:1),CAS登记号1884698-06-9)和其它近红外荧光活化分子。
实施方案4:方面1的融合脂质体，其中所述用于MRI的造影剂选自：氧化铁造影剂(诸如磁石,Fe3O4)；硫酸钡；和钆造影剂，诸如钆特酸盐、钆双胺、钆贝酸盐、钆喷替酸盐、钆布醇；所述用于CT的造影剂选自：金属元素，诸如碘、铋、溴、钽、金、铂、镱、钇、钆、钨、铟和镥；或所述用于PET的造影剂选自64Cu-PSTM、18F-FDG、18F-氟化物、18F-氟米索硝唑和镓。
实施方案5：实施方案1-4中的任一个的融合脂质体，其中所述脂质分子中的至少一个被特异性结合对的能够结合所述结合对的互补性第二官能团的第一官能团官能化。
实施方案6：实施方案5的融合脂质体，其中所述融合脂质体进一步包含在脂质双层和第一官能团之间的第一间隔物。
实施方案7：实施方案5或6的融合脂质体，其进一步包含相同或不同的额外可检测试剂或免疫系统活化剂，其每一个被所述互补性第二官能团官能化并经由所述第二官能团结合至所述第一官能团，其中所述相同或不同的额外可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂。
实施方案8：实施方案7的融合脂质体，其中所述免疫系统活化剂是选自以下的试剂：抗-CD3抗体、抗-CD8抗体、抗-NKG2D抗体或它们的组合、能够结合CD3和CD8两者的抗体以及能够结合CD3和NKG2D两者的抗体。
实施方案9：实施方案5-8中的任一个的融合脂质体，其中所述可检测试剂或免疫系统活化剂结合在所述融合脂质体的外小叶处。
实施方案10：实施方案5-9中的任一个的融合脂质体，其中所述可检测试剂或免疫系统活化剂进一步包含在所述可检测试剂或免疫系统活化剂和所述第二官能团之间的第二间隔物。
实施方案11：实施方案10的融合脂质体，其中所述第一或第二间隔物选自：PEG、(C6-C12)烷基、酚、苯或萘的单-、二-或三-羧酸、四氢芘的单-、二-或三-羧酸或其盐、环状醚、戊二酸、琥珀酸、粘康酸、己二酸、庚二酸、软木酸、壬二酸和癸二酸和肽，诸如约2-20个氨基酸残基长度(例如3个氨基酸残基长度)的聚-Gly肽。
实施方案12：实施方案11的融合脂质体，其中所述第一或第二间隔物是约106Da至约4kDa的分子量的PEG。
实施方案13：实施方案12的融合脂质体，其中PEG具有约194Da的分子量(PEG4)。
实施方案14：实施方案10的融合脂质体，其中所述第一或第二间隔物是(C6-C12)烷基，优选庚基或十二烷酰基。
实施方案15：实施方案1-14中的任一个的融合脂质体，其中所述包含阳离子基团的脂质分子中的所述至少一个选自：1，2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷氯化物(DOTAP)，双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)，1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，二甲基双十八烷基铵(18:0DDAB)，和N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基-甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)。
实施方案16：实施方案15的融合脂质体，其中所述包含阳离子基团的脂质分子中的所述至少一个是DOTAP。
实施方案17：实施方案1-14中的任一个的融合脂质体，其中所述阳离子合成聚合物选自聚乙烯亚胺(PEI)和聚(2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯。
实施方案18：实施方案1-14中的任一个的融合脂质体，其中所述阳离子天然聚合物是壳聚糖。
实施方案19：实施方案1-14中的任一个的融合脂质体，其中所述阳离子氨基糖是葡糖胺。
实施方案20：实施方案1-14中的任一个的融合脂质体，其中所述阳离子聚氨基酸选自聚(L-赖氨酸)、聚(L-精氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚(D-精氨酸)、聚(L-鸟氨酸)和聚(D-鸟氨酸)。
实施方案21：实施方案1-14中的任一个的融合脂质体，其中所述两亲的癌细胞结合肽选自杀菌肽A；杀菌肽A1-8；和环状CNGRC。
实施方案22：实施方案1-21中的任一个的融合脂质体，其中所述脂质分子中的所述至少一个是选自以下的磷脂：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸或它们的组合，它们中的每一个包含一个或两个相同或不同的脂肪酸残基，其中所述磷脂酰部分中的脂肪酸残基是饱和的、单不饱和的或多不饱和的且具有14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个碳的碳链长度，诸如处于磷脂和溶血磷脂构型的肉豆蔻酰基、硬脂酰基、棕榈酰基、油酰基、亚油酰基、亚麻酰基(包括共轭的亚麻酰基)、花生四烯酰基，和它们的组合。
实施方案23：实施方案22的融合脂质体，其中所述磷脂选自：1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)和1,2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-3-磷脂酰胆碱(DMPC)；1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)；1,2-二肉豆蔻酰油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:1(Δ9-Cis)PC)；1,2-二反式肉豆蔻异烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:1(Δ9-Trans)PC)；1,2-二顺式棕榈烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:1(Δ9-Cis)PC)；1,2-二反式棕榈异烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:1(Δ9-Trans)PC)；1,2-dipetroselenoyl-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ6-Cis)PC)；1,2-二油酰基-3-磷脂酰胆碱(18:1(Δ9-Cis)PC(DOPC))；1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ9-Trans)PC)；1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:2(Cis)PC(DLPC))；1，2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:3(Cis)PC)；1,2-二二十碳烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:1(Cis)PC)；1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:4(Cis)PC)；1,2-二二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:6(Cis)PC)；1，2-二芥酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:1(Cis)PC)；1,2-二二十四碳烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(24:1(Cis)PC)；1,2-二肉豆蔻酰基-3--3-磷脂酰乙醇胺(DMPE)；1,2-二棕榈酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DPPE)；二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)；1,2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)；1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)；1，2-二肉豆蔻酰基-3-磷脂酰丝氨酸(DMPS)；1,2-二棕榈酰基-3-磷脂酰丝氨酸(DPPS)；棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)；和1,2-二油酰基-3-磷脂酰丝氨酸(DOPS)。
实施方案24：实施方案23的融合脂质体，其中所述磷脂选自DOPC、POPC、DMPC、DPPC、DOPE、POPE、DSPE、DMPE和DPPE。
实施方案25：实施方案1-24中的任一个的融合脂质体，其中所述稳定化部分是约106Da至约4kDa的分子量的PEG。
实施方案26：实施方案25的融合脂质体，其中PEG是约2kDa的分子量的PEG。
实施方案27：实施方案1-26中的任一个的融合脂质体，其中所述稳定化部分经由可切割的肽接头连接至所述脂质分子中的至少一个。
实施方案28：实施方案4-27中的任一个的融合脂质体，其中所述特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的所述互补性第二官能团形成共价键。
实施方案29：实施方案28的融合脂质体，其中所述特异性结合对的第一官能团能够经由点击化学反应与所述结合对的所述互补性第二官能团形成共价键。
实施方案30：实施方案28的融合脂质体，其中i)所述特异性结合对的第一官能团是炔烃或膦，且所述结合对的第二官能团是叠氮化物，或反之亦然；ii)所述特异性结合对的第一官能团是环烯烃、环炔烃、环丙烷、异腈(异氰化物)或乙烯基硼酸，且所述结合对的第二官能团是四嗪，或反之亦然；iii)所述特异性结合对的第一官能团是炔烃或马来酰亚胺，且所述结合对的第二官能团是硫醇，或反之亦然；iv)所述特异性结合对的第一官能团是共轭二烯，且所述结合对的第二官能团是取代的烯烃，或反之亦然；v)所述特异性结合对的第一官能团是烯烃、炔烃或乙炔化铜，且所述结合对的第二官能团是硝酮，或反之亦然；vi)所述特异性结合对的第一官能团是醛或酮，且所述结合对的第二官能团是烷氧基胺、羟胺、肼或酰肼，或反之亦然；或vii)所述特异性结合对的第一官能团是醛、酮、异硫氰酸盐、羧酸或其衍生物诸如酯、酸酐、酰卤、甲苯磺酰基和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，且所述结合对的第二官能团是胺，或反之亦然；viii)官能团。
实施方案31：实施方案30的融合脂质体，其中所述特异性结合对是炔烃-叠氮化物。
实施方案32：实施方案4-27中的任一个的融合脂质体，其中所述特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的所述互补性第二官能团形成非共价键。
实施方案33：实施方案32的融合脂质体，其中所述特异性结合对的第一官能团是生物素，且所述结合对的第二官能团是选自生物素-结合肽或生物素-结合蛋白的其结合配偶体，或反之亦然。
实施方案34：实施方案33的融合脂质体，其中所述生物素-结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和抗-生物素抗体。
实施方案35：实施方案34的融合脂质体，其中所述生物素-结合肽选自AEGEFCSWAPPKASCGDPAK(SEQ ID NO:1)、CSWRPPFRAVC(SEQ ID NO:2)、CSWAPPFKASC(SEQ IDNO:3)和CNWTPPFKTRC(SEQ ID NO:4)。
实施方案36：实施方案1-35中的任一个的融合脂质体，其中所述融合脂质体进一步包含胆固醇(CHO)或它的衍生物。
实施方案37：实施方案1-36中的任一个的融合脂质体，其中所述融合脂质体包含DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE或DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K和任选的胆固醇，其中PEG2K代表具有约2kDa的分子量的PEG，且DOPC的相对摩尔量是至多约80％，DOTAP的相对摩尔量是至多约80％，DSPE-PEG2K的相对摩尔量是至多约20％，DOPE的相对摩尔量是至多约20％，胆固醇的相对摩尔量是至多约40％。
实施方案38：实施方案37的融合脂质体，其中所述融合脂质体包含：
摩尔比为52.5:35:0.6:10、52.5:35:1.25:10、52.5:35:2.5:10、52.5:35:5:10、52.5:35:0.6:5、52.5:35:1.25:5、52.5:35:2.5:5、52.5:35:5:5、65:20:5:10、50:35:5:10、52.5:35:1.25:7、52.5:35:1.25:5或52.5:35:2.5:7的DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE；或者
摩尔比为52.5:35:0.6、52.5:35:1.25、52.5:35:2.5、52.5:35:5、52.5:35:0.6、52.5:35:1.25、52.5:35:2.5、52.5:35:5、65:20:5、50:35:5、52.5:35:1.25、52.5:35:1.25或52.5:35:2.5的DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K。
实施方案39：实施方案38的融合脂质体，其中所述融合脂质体包含摩尔比为52.5:35:2.5:5的DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE；或摩尔比为52.5:35:2.5的DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K。
实施方案40：实施方案1-39中的任一个的融合脂质体，其中所述脂质体的熔化温度(Tm)低于45℃，在所述熔化温度，所述融合脂质体维持在非结晶转变相，由此提供脂质体与细胞膜的融合所需的膜流动性。
实施方案41：实施方案1-40中的任一个的融合脂质体，其中所述融合脂质体具有至多200nm的大小，例如约15nm至约200nm、约20nm至约100nm、约50nm至约150nm、约50nm至约90nm、约80nm至约100nm、约110nm至约200nm，例如约100nm的大小。
实施方案42:一种用于选择性地检测癌细胞的方法，所述方法包括使所述癌细胞与实施方案1-39中的任一个的融合脂质体接触；和在所述可检测试剂是可活化的荧光探针的情况下，通过用具有被所述荧光探针吸收的波长的光照射所述细胞和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针；在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者。
实施方案43:实施方案42的方法，其中癌症患者中的癌细胞的选择性检测指示所述癌症患者对用包含在纳米颗粒中的癌症药物治疗癌症的应答性。
实施方案44:实施方案43的方法，其中用包含所述癌症药物的所述纳米颗粒治疗被确定为应答性的癌症患者。
实施方案45:一种用于选择性地检测癌细胞的方法，所述方法包括(a)使所述癌细胞与实施方案4-41中的任一个的官能化的融合脂质体接触；(b)使所述癌细胞与可检测试剂接触，所述可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂，其中所述可检测试剂用能够结合所述脂质分子的所述第一官能团的结合对的互补性第二官能团官能化；和(c)在所述可检测试剂是荧光探针的情况下，通过用具有被所述荧光探针吸收的波长的光照射所述细胞和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针；在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者，由此选择性地检测所述癌细胞。
实施方案46:实施方案42-45中的任一个的方法，其中所述可检测试剂是(a)选自以下的荧光探针：cy3、cy5、cy5.5、cy7 cy9、FITC、荧光素、alexa fluor 790、alexa fluor750、alexa fluor 700、alexa fluor 680、alexa fluor 660、alexa fluor 647、alexafluor 633、alexa fluor 594、在585nm至800nm范围内的Qdot、荧光原卟啉寡聚体、异花青绿(ICG)；或(b)选自以下的可活化的荧光探针：荧光素类似物(诸如二乙酸盐修饰的类似物)，香豆素类似物(诸如py+BC690-(1-甲基-4-(2-氧代-8-(吡咯烷-1-基)-2H-苯并[g]色烯-3-基)吡啶鎓三氟甲磺酸盐))，CFSE(5(6)-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺基酯)，罗丹明类似物(诸如gGlu-HMRG(γ-谷氨酰基羟基甲基罗丹明绿))，基于类姜黄色素二氟硼的靶向肿瘤的γ-谷氨酰基转肽酶(GGT)-可活化的)荧光探针(Glu-DFB),和吲哚菁类似物，诸如AP-Glu(3H-吲哚鎓,2-[(1E)-2-[4-[[4-[[(4S)-4-氨基-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]苯基]甲氧基]苯基]乙烯基]-1-(5-羧基戊基)-3,3-二甲基-,溴化物(1:1,)和其它近红外荧光活化分子。在可活化的荧光团上的酯修饰使它是非荧光的，且它在脂质体与癌细胞融合后并随后被细胞质酯酶进行细胞质切割后变成发荧光。
实施方案47:实施方案45或46的方法，其中癌症患者中的癌细胞的选择性检测指示所述癌症患者对用包含在纳米颗粒中的癌症药物治疗癌症的应答性。
实施方案48:实施方案47的方法，其中用包含所述癌症药物的所述纳米颗粒治疗被确定为应答性的癌症患者。
实施方案49:一种通过荧光引导的外科手术或靶向放射疗法治疗癌症的方法，所述方法包括实施方案42-48中的任一个的方法和取出含有所述癌细胞的肿瘤。
实施方案50:实施方案42-48中的任一个的方法，其中所述癌症患者正在经历肿瘤(诸如皮肤癌)的成像或全身成像，所述方法包括全身性地施用或局部地应用所述融合脂质体和任选的官能化的可检测试剂；和，在所述可检测试剂是可活化的荧光探针或荧光探针的情况下，通过照射所述皮肤区域或全身和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针，在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者，扫描器官(诸如皮肤)区域或全身，由此定义肿瘤位置和边缘。
实施方案51:一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括实施方案50的方法和取出含有所述癌细胞的肿瘤。
实施方案52:实施方案42或45的方法，其用于在从有此需要的癌症患者取出的组织或血液衍生级分中非原位选择性地检测癌细胞，所述方法包括将所述融合脂质体和任选的官能化的荧光探针全身性地施用或应用于所述组织或血液衍生级分，和通过照射所述组织或血液衍生级分和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针，由此选择性地检测所述癌细胞。
实施方案53:实施方案52的方法，其中所述组织是皮肤，所述癌症患者正在经历用于除去皮肤癌的外科手术(Mohs外科手术)，并重复所述外科手术，直到所述皮肤组织不具有可检测的癌细胞。
实施方案54:实施方案52的方法，其用于选择性地检测在所述血液衍生级分中的循环肿瘤细胞(CTC)。
实施方案55:实施方案42-54中的任一个的方法，其中所述癌症选自乳腺癌诸如三重阴性的乳腺癌、黑素瘤、肺癌、甲状腺癌和前列腺癌。
实施方案56:实施方案42或45的方法，其用于选择性地检测癌细胞和治疗癌症，所述方法包括全身性地施用或局部地应用所述融合脂质体和任选的官能化的可检测试剂，其中所述融合脂质体包含所述可检测试剂和细胞毒性剂和/或免疫系统活化剂；在所述可检测试剂是可活化的荧光探针或荧光探针的情况下，通过照射所述皮肤区域或全身和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针，在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者；和任选地通过随时间重复检测所述可检测试剂监测治疗应答。
实施方案57:一种试剂盒，其包含：(a)第一容器，其包含实施方案5-41中的任一个的融合脂质体；(b)第二容器，其包含可检测试剂，所述可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂，其中所述可检测试剂用能够结合所述脂质分子的所述第一官能团的结合对的互补性第二官能团官能化；和(c)小册子，其具有关于选择性地检测癌细胞的方法的说明，所述方法包括给癌症患者施用(a)的融合脂质体和随后施用(b)的可检测试剂。
现在将通过下述非限制性实施例举例说明本发明。
实施例
材料和方法：
脂质:DOPE(1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺,Lipoid)，DSPE(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)，DOPC(1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱，DOPC，Lipoid)，HSPC(氢化的大豆磷酸胆碱，Lipoid)，DOTAP(1,2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷氯化物,Lipoid)，DSPE-PEG2000(N-(羰基-甲氧基聚乙二醇-2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺,MPEG-2000-DSPE,Lipoid)，胆固醇(Sigma)，DOPE-FITC(内部合成)，DSPE-PEG4-叠氮化物(内部合成)，DOPE-PEG4-叠氮化物(内部合成)，DSPE-PEG4-生物素(内部合成)。
PEG4代表具有约194Da的分子量的PEG。
异花青绿,Cardiogreen(Sigma,目录号21980)。
无水乙醇用于在70℃溶解脂质。
使用薄膜水合生产可检测的脂质体：
将脂质溶解在氯仿或氯仿甲醇混合物中以实现在玻璃泡中的完全溶解。在真空下或在氮气流下蒸发，同时不断旋转玻璃泡以实现均匀的膜形成。在可见的溶剂已经蒸发以后，让溶剂在真空下蒸发1小时。
根据所用的磷脂，用可检测的试剂诸如Gd-DTPA或ICG在最高Tm以上预温热水性缓冲液(诸如PBS)。将玻璃泡加热至相同温度，并向脂质膜添加水性缓冲液。涡旋以混合并旋转60分钟。使用挤出机或探头声处理或基于微流体的流动池，大小缩小为脂质体。使用透析或尺寸排阻方法除去未包封的材料。在25℃使用5摩尔过量的NHS-接头-第二官能团修饰乙醇-胺基1小时，在400RPM混合。使用透析或尺寸排阻方法除去未结合的接头-第二官能团。
使用乙醇注射生产免疫标记脂质体：
脂质体制备是本领域众所周知的技术，并且可以例如根据在Torchilin V.P.和Weissig V.,Liposomes:a practical approach第2版(OUP Oxford,2003)中公开的方案进行。
在我们的情况下，根据所需的组成称量脂质(Avanti-极性脂质或类脂)，并以所需脂质体体积的10％的最终体积将其溶于无水EtOH中。将脂质-EtOH混合物加热至脂质的Tm(熔化温度)以上。在相同的温度，将EtOH注射入不含钙或镁的PBS(pH＝7.2-7.4)中，并且混合脂质-缓冲液并使用挤出机挤出以产生约90nm至100nm的期望尺寸分布的脂质体。
可替换地，在玻璃容器中将脂质溶解在氯仿或氯仿-MeOH(2:1)或氯仿-MeOH(3:1)中，并彻底混合以获得均匀溶液。然后将有机溶剂中的脂质在负压(150mBar)下蒸发2小时以除去有机溶剂，由此在玻璃容器上产生脂质薄膜。使用经预热(脂质Tm以上)且含有荧光团(诸如PBS/0.9％NaCl/DDW/5％右旋糖，其含量取决于目标荧光团)的浓缩水溶液使脂质膜水合。例如，吲哚菁绿(ICG,Cardiogreen)容易溶解在5％右旋糖中，并能够实现脂质体包封。但是，ICG在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中产生聚集体，且因此，出于脂质体包封的目的，它与PBS不相容。
如果荧光团连接至脂质(诸如异硫氰酸荧光素(FITC)-DOPE)，则在EtOH注射之前，将荧光团添加到脂质混合物中并溶解在EtOH中。这样的荧光地标记的脂质也可以用在薄膜水合方法或使用纳米组装器或其它基于微流体的脂质体组装方法中。然后将脂质-水溶液混合(涡旋)并加热至Tm以上。如果看到沉淀物，则进行声处理，直到膜完全水合并获得均匀的乳状溶液。
在以下所示的研究中，通常使用命名为N8制剂的非限制性例子以35:52.5:10:2.5(DOTAP:DOPC:DOPE:DSPE-PEG2000)的摩尔比与癌细胞选择性融合。
常规进行脂质体大小确定，在该情况下使用动态光散射(DLS,Malverninstruments)完成，并且也可以使用冷冻-TEM电子显微术确定。
Tm确定：使用示差扫描量热法(DSC)确定Tm，机器先加热，且然后冷却样品，并测量样品中的变化。参见例如Epand R.M.High sensitivity differential scanningcalorimetry of the bilayer to hexagonal phase transitions ofdiacylphosphatidylethanolamines(Chemistry and Physics of Lipids 1985)。我们还使用了
Figure BDA0003082793100000331
Lipids网站和Lipoid网站来确定Tm。
用于细胞介导的标记的荧光团包封：
对于薄膜和对于乙醇注射，以1mg/ml浓度(但可以在必要时降低或升高)使用荧光团(例如吲哚菁绿(ICG))，或CFSE(5(6)-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺基酯)，一种官能化的可活化的荧光团，其可以共价结合伯胺，并具有在荧光素上的两个酯修饰，所述修饰使它不发荧光。在脂质体与癌细胞融合并随后细胞质切割后，它变成发荧光。具有类似酯修饰的其它分子可通过ThermoFisher获得(细胞痕迹：蓝色，紫罗兰色，CFSE，黄色，远红，并可以分别在375/410nm、405/450nm、495/519nm、546/579nm、630/661nm的激发/发射波长使用)。
使用透析(针对2L缓冲液的5-1ml脂质体，在24小时内更换至少3次)或使用尺寸排阻方法，除去过量的未包封的荧光团。当使用乙醇胺脂质诸如DOPE时，在CFSE中的NHS(和其它类似的Thermofisher分子探针)与脂质共价结合，这改善荧光脂质体的稳定性，因为荧光团不可从脂质体中泄漏。
当制备具有可活化的荧光团的脂质体时，这些荧光团的包封必须在不切割酯结合的基团的条件下进行。碱性pH条件和升高的温度导致从荧光素的甲基-醚(methyl-Esther)切割，并将导致假阳性。
生产后脂质体修饰：
使用NHS酯化学反应(N-羟基琥珀酰亚胺)，用接头和叠氮化物(结合对的一个成员)对含有乙醇胺基团的脂质体进行挤出后化学修饰。通常，以每个伯胺基团((DOPE脂质)5摩尔当量使用NHS-聚乙二醇(PEG)4-叠氮化物(NHS基团)。使用尺寸排阻色谱法除去未结合的过量物。
可替换地，使用预先修饰的脂质制备脂质体以产生类似的脂质体产物，其允许铜依赖性的或非依赖性的点击反应。简而言之，在EtOH注射之前，将用PEG4-炔烃或叠氮化物预修饰的DSPE或DOPE脂质掺入脂质混合物中。
使用修饰的抗体和修饰的脂质体创建2STEP和OUT方案：
2STEP:在该方法中，在两个步骤中标记癌细胞。首先，使细胞与官能化的脂质体接触，并在第二步中，使细胞与官能化的抗体或可检测的探针或用于MRI/CT/PET/荧光的纳米颗粒接触。将与结合对的一个成员(例如叠氮化物)共价连接的脂质体以适当的稀释度直接用于细胞上(或在动物模型中静脉内(IV)注射)，然后洗涤处理过的细胞(不适用于体内场合下)，并使其与经结合对的互补性成员(例如BCN)修饰的抗体、荧光探针(吲哚菁绿)或用于MRI/CT/PET/荧光的纳米颗粒反应。
OUT:在该方法中，在一个步骤中用在它们的外小叶上携带官能化的抗体或可检测的探针的脂质体标记癌症细胞。使与结合对的一个成员(例如叠氮化物)共价连接的脂质体与具有结合对的互补性成员(例如BCN)的抗体或吲哚菁绿反应。然后将修饰的脂质体以适当的稀释度直接用于细胞上(或在动物模型下静脉内注射)，然后洗涤处理过的细胞(不适用于体内场合下)。
实施例1:使用单步骤程序原位检测三重阴性的乳腺癌.
将含有吲哚菁绿(ICG)的脂质体静脉内注射进携带4T1mCherry(三重阴性的乳腺癌)肿瘤的小鼠中。在脂质体注射后24小时，使用
Figure BDA0003082793100000341
Spectrum体内成像系统(PerkinElmer)对小鼠进行关于ICG信号和mCherry的成像。左小图上的图像显示了肿瘤mCherry信号(图1A和C)，且右小图上的图像(图1B和D)显示了在负载ICG的脂质体注射后24小时记录的ICG信号，所述脂质体用PEG4-叠氮化物(C)或用PEG4-生物素(D)修饰，作为第一结合对的例子。叠氮化物或生物素官能团的存在实现脂质体的治疗诊断学应用，这通过施用T细胞活化剂(诸如BCN-或抗生物素蛋白-官能化的抗-CD3和抗-CD8抗体，其将结合被标记的癌细胞)来实现，且因此，该方法不仅使癌细胞可视化，而且引起针对它们的T细胞应答。
荧光信号显示了我们的脂质体在荧光肿瘤中的共定位，如在图1A-D中所见，其中脂质体信号(ICG)与mCherry信号重叠。
在图2A-C中所示的数据尽管在死后收集，但显示融合脂质体可以用于荧光成像辅助的外科手术、光动力学疗法(假设使用相关的光动力学荧光团)或癌块的辐照，以及用于非原位分析活组织检查。
类似地，将含有MRI/CT/PET造影剂的脂质体静脉内注射到携带4T1mCherry(三重阴性的乳腺癌)肿瘤的小鼠中。在脂质体注射后24小时，使用
Figure BDA0003082793100000351
Spectrum体内成像系统(PerkinElmer)对小鼠进行mCherry成像，并使用适当的成像装置对MRI/CT/PET造影剂信号进行成像。
实施例2.使用两步程序对癌症的原位检测.
静脉内地注射包含特异性结合对的第一官能团(诸如叠氮化物)的融合脂质体，并在30分钟至48小时后，注射包含带有可检测探针的互补性官能团的第二纳米颗粒(诸如BCN-官能化的纳米金颗粒或在CT中可检测的携带BCN-碘的脂质体或BCN-结合的负载ICG的脂质体)。第一融合脂质体和第二纳米颗粒的循环半衰期和药效动力学概况决定了最佳成像时间，并可以用于避免在器官(诸如肝脏和脾脏)中的脱靶标记。
两种类型的脂质体或两种基于纳米技术的颗粒或它们的组合的应用可以改善信噪比并减少假阳性。也可以使用具有与癌细胞选择性融合的第一结合对的一种脂质体，以及具有第二结合对以帮助检测融合细胞的第二纳米颗粒。这种组合(带正电荷的脂质体与具有更长循环时间的其它CT/MRI/荧光可检测的脂质体或与金纳米颗粒或其它聚合物纳米颗粒)可以以两步注射方式使用，以改善信噪比并减少在组织、诸如肝脏和脾脏中的假阳性。第一脂质体发生与癌细胞的选择性融合，向癌细胞的膜外小叶添加第一结合对，而第二纳米颗粒则使用第二结合对进行结合。通过首先注射脂质体和间隔至少两个半衰期时间注射第二纳米颗粒，我们可以改善在肝脏和脾脏中的信噪比。还可以在体内条件下使用荧光共振能量转移(FRET)，其中第一融合脂质体携带一种与脂质结合的荧光团和特异性结合对的第一官能团，且第二脂质体/纳米颗粒携带互补性官能团和可用于FRET中并且如果具有两种荧光团的两种脂质体发生紧密接触将产生信号的第二荧光团，这意味着当脂质体标记的癌细胞的膜与具有其它荧光团的第二脂质体靠近时，FRET是可能的，并且发生信号荧光偏移。
实施例3.使用可活化的荧光探针原位检测癌症.
将在外科手术期间使用的携带酯酶可切割的荧光团的脂质体静脉内注射或用于冲洗肿瘤组织和疑似为赘生性组织的周围。然后用盐水溶液洗涤组织以除去未结合的脂质体和血液以改善信噪比。脂质体与癌细胞的融合导致荧光团上的酯基的除去，并允许使用与所使用的荧光团相对应的荧光激发和发射波长进行检测。
然后将该技术用于荧光引导的外科手术或靶向放射疗法中以除去可视化的肿瘤。
实施例4.非原位选择性地检测癌细胞.
一步程序:将疑似瘤形成的组织(诸如在Mohs外科手术的情况下的皮肤)取出，并用PBS或其它缓冲液洗涤以除去血块，以改善信噪比，并将其在5mM脂质的可活化的荧光团脂质体溶液中浸渍15分钟。将脂质体处理过的组织用PBS或其它生理学等渗溶液(诸如盐水)洗涤，并在荧光显微镜下用与荧光团相对应的激发和发射波长成像。
两步程序:将疑似瘤形成的组织取出，并用PBS或其它缓冲液洗涤以除去血块，以改善信噪比，并将其在包含特异性结合对的官能团诸如叠氮化物的选择性融合脂质体(例如在5mM脂质)中浸渍15分钟。将脂质体处理过的组织用PBS或其它生理学等渗溶液(诸如盐水)洗涤，并在5-500微克/ml的包含互补性官能团的荧光团(诸如DBCO-Cy5)的4℃溶液中浸渍1小时，洗涤，并在荧光显微镜下用与荧光团相对应的激发和发射波长成像。
如果在分析的组织样品中检测到癌细胞，则从可疑区域取出其它组织，并如上所述进行分析，直到在样品中未检测到信号为止。
实施例5.在血液中的循环癌细胞(CTC)的检测.
不同的装置用于分离循环的活肿瘤细胞，诸如过滤。
这些细胞与需要抗-CD45染色用于鉴定的白细胞共分离。癌细胞并不总是具有已知的靶标志物，且因此，携带荧光染料或可活化染料的选择性融合脂质体可以用于直接标记从血液中分离出来的癌细胞。
实施例6.全身性治疗肿瘤、检测肿瘤存在和预测治疗效力：
以单剂量或以重复剂量给荷瘤小鼠施用结合至抗-CD3和抗-CD8的、Gd和ICP共包封的脂质体(效应T细胞活化脂质体)，其中测试的因子是注射之间的时间。这些脂质体可以与DSPE-DTPA(Gd)(即1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-二亚乙基三胺五乙酸(钆盐)，其具有预结合至脂质首基的DTPA螯合剂)(Avanti极性脂质)整合在一起。
将第二次治疗施用给小鼠，其第一次治疗是具有相同剂量的抗-CD3和抗-CD8抗体的空脂质体(每只小鼠每个mAb 100微克)。测试的第二次治疗间隔为间隔48小时、间隔48小时和间隔96小时。在第二次治疗后24小时的肿瘤荧光团到达和积累使用Gd和ICG测量结果呈现在图3A-C中。从死后的肿瘤收集的Gd信号与在体内研究(活小鼠)中记录的ICG信号较好地关联，并显示出第二次治疗到达肿瘤的相似趋势。在图3C中，呈现了加载Gd的脂质体的生物分布，并显示了单次和第二次治疗的相似概况。在肝脏和脾脏中的积累归因于组织特异性巨噬细胞/单核细胞的摄取。全身图像呈现在图4A-D中，并通过测量ICG信号显示了从全身的清除和在肿瘤部位中的积累(图4B和D)。肿瘤mCherry信号呈现在图4A和C中。基于通过mCherry肿瘤信号确定的目标区域，完成在图3B中的ICG信号的定量。
获取图像(图4C和D)后，处死小鼠，并将器官分离，称重，打成灰烬，溶解于1％硝酸中，并使用0.45微米过滤器过滤。使用ICP元素分析确定器官相关的Gd水平，以确定每克组织到达的注射剂量的百分比(图3C)。
序列表
<110> APA先进技术有限公司
I·努德尔曼
G·卡奈提
R·米利辛
A·戈德索贝尔
A·思科罗德
D·吉尔逊
H·阿尔卡雷
<120> 用于肿瘤细胞的选择性成像的融合脂质体
<130> APA-009 PCT
<150> 62/749,794
<151> 2018-10-24
<160> 4
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
Ala Glu Gly Glu Phe Cys Ser Trp Ala Pro Pro Lys Ala Ser Cys Gly
1 5 10 15
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<210> 2
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成的
<400> 4
Cys Asn Trp Thr Pro Pro Phe Lys Thr Arg Cys
1 5 10

Claims (57)

1.一种融合脂质体，其包含可检测试剂和在其内部水性隔室中或结合至脂质体膜的任选细胞毒性药物，其中
所述融合脂质体包含脂质双层，所述脂质双层包含多个具有14-24个碳原子的脂质分子，且所述脂质分子中的至少一个进一步包含阳离子基团、阳离子的天然的或合成的聚合物、阳离子的氨基糖、阳离子的聚氨基酸或两亲的癌细胞结合肽；且
所述脂质分子中的至少一个进一步包含选自以下的稳定化部分：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚氨基酸、甲基-聚噁唑啉、聚甘油、聚(丙烯酰基吗啉)和聚丙烯酰胺。
2.权利要求1的方法，其中所述可检测试剂选自荧光探针、用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂和光动力剂。
3.权利要求2的方法，其中所述可检测试剂是(a)选自以下的荧光探针：cy3、cy5、cy5.5、cy7 cy9、FITC、荧光素、alexa fluor 790、alexa fluor 750、alexa fluor 700、alexa fluor 680、alexa fluor 660、alexa fluor 647、alexa fluor 633、alexa fluor594、在585nm至800nm范围内的Qdot、荧光原卟啉寡聚体、异花青绿(ICG)；或(b)选自以下的可活化的荧光探针：荧光素类似物(诸如二乙酸盐修饰的类似物)，香豆素类似物(诸如py+BC690-(1-甲基-4-(2-氧代-8-(吡咯烷-1-基)-2H-苯并[g]色烯-3-基)吡啶鎓三氟甲磺酸盐))，CFSE(5(6)-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺基酯)，罗丹明类似物(诸如gGlu-HMRG(γ-谷氨酰基羟基甲基罗丹明绿))，基于类姜黄色素二氟硼的靶向肿瘤的γ-谷氨酰基转肽酶(GGT)-可活化的)荧光探针(Glu-DFB),和吲哚菁类似物，诸如AP-Glu(3H-吲哚鎓,2-[(1E)-2-[4-[[4-[[(4S)-4-氨基-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]苯基]甲氧基]苯基]乙烯基]-1-(5-羧基戊基)-3,3-二甲基-，溴化物(1:1)和其它近红外荧光活化分子。
4.权利要求2的方法，其中所述用于MRI的造影剂选自：氧化铁造影剂(诸如磁石、Fe3O4)；硫酸钡；和钆造影剂，诸如钆特酸盐、钆双胺、钆贝酸盐、钆喷替酸盐、钆布醇；所述用于CT的造影剂选自：金属元素，诸如碘、铋、溴、钽、金、铂、镱、钇、钆、钨、铟和镥；或所述用于PET的造影剂选自64Cu-PSTM、18F-FDG、18F-氟化物、18F-氟米索硝唑和镓。
5.权利要求1的融合脂质体，其中所述脂质分子中的至少一个被特异性结合对的能够结合所述结合对的互补性第二官能团的第一官能团官能化。
6.权利要求5的融合脂质体，其中所述融合脂质体进一步包含在所述脂质双层和所述第一官能团之间的第一间隔物。
7.权利要求5的融合脂质体，其进一步包含额外的相同或不同的可检测试剂或免疫系统活化剂，其每一个被所述互补性第二官能团官能化并经由所述第二官能团结合至所述第一官能团，
其中所述额外的相同或不同的可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂。
8.权利要求7的融合脂质体，其中所述免疫系统活化剂是选自以下的试剂：抗-CD3抗体、抗-CD8抗体、抗-NKG2D抗体或它们的组合、能够结合CD3和CD8两者的抗体以及能够结合CD3和NKG2D两者的抗体。
9.权利要求7的融合脂质体，其中所述可检测试剂或免疫系统活化剂结合在所述融合脂质体的外小叶处。
10.权利要求7的融合脂质体，其中所述可检测试剂或免疫系统活化剂进一步包含在所述可检测试剂或免疫系统活化剂和所述第二官能团之间的第二间隔物。
11.权利要求6的融合脂质体，其中所述第一间隔物选自：PEG、(C6-C12)烷基、酚、苯或萘的单-、二-或三-羧酸、四氢芘的单-、二-或三-羧酸或其盐、环状醚、戊二酸、琥珀酸、粘康酸、己二酸、庚二酸、软木酸、壬二酸和癸二酸和肽，诸如约2-20个氨基酸残基长度、例如3个氨基酸残基长度的聚-Gly肽。
12.权利要求11的融合脂质体，其中所述第一间隔物是约106Da至约4kDa的分子量的PEG。
13.权利要求12的融合脂质体，其中PEG具有约194Da的分子量(PEG4)。
14.权利要求11的融合脂质体，其中所述第一间隔物是(C6-C12)烷基，优选庚基或十二烷酰基。
15.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述包含阳离子基团的脂质分子中的所述至少一个选自：1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷氯化物(DOTAP)，双十八烷基酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)，1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，二甲基双十八烷基铵(18:0DDAB)，和N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基-甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)。
16.权利要求15的融合脂质体，其中所述包含阳离子基团的脂质分子中的所述至少一个是DOTAP。
17.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述阳离子合成聚合物选自聚乙烯亚胺(PEI)和聚(2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯。
18.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述阳离子天然聚合物是壳聚糖。
19.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述阳离子氨基糖是葡糖胺。
20.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述阳离子聚氨基酸选自聚(L-赖氨酸)、聚(L-精氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚(D-精氨酸)、聚(L-鸟氨酸)和聚(D-鸟氨酸)。
21.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述两亲的癌细胞结合肽选自杀菌肽A；杀菌肽A1-8；和环状CNGRC。
22.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述脂质分子中的所述至少一个是选自以下的磷脂：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸或它们的组合，它们中的每一个包含一个或两个相同或不同的脂肪酸残基，其中所述磷脂酰部分中的脂肪酸残基是饱和的、单不饱和的或多不饱和的且具有14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个碳的碳链长度，诸如处于磷脂和溶血磷脂构型的肉豆蔻酰基、硬脂酰基、棕榈酰基、油酰基、亚油酰基、亚麻酰基(包括共轭的亚麻酰基)、花生四烯酰基，和它们的组合。
23.权利要求22的融合脂质体，其中所述磷脂选自：1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(POPC)和1,2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-3-磷脂酰胆碱(DMPC)；1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰胆碱(DSPC)；1,2-二肉豆蔻酰油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:1(Δ9-Cis)PC)；1,2-二反式肉豆蔻异烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(14:1(Δ9-Trans)PC)；1,2-二顺式棕榈烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:1(Δ9-Cis)PC)；1,2-二反式棕榈异烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(16:1(Δ9-Trans)PC)；1,2-dipetroselenoyl-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ6-Cis)PC)；1,2-二油酰基-3-磷脂酰胆碱(18:1(Δ9-Cis)PC(DOPC))；1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:1(Δ9-Trans)PC)；1,2-二亚油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:2(Cis)PC(DLPC))；1,2-二亚麻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(18:3(Cis)PC)；1,2-二二十碳烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:1(Cis)PC)；1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(20:4(Cis)PC)；1,2-二二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:6(Cis)PC)；1,2-二芥酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(22:1(Cis)PC)；1,2-二二十四碳烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(24:1(Cis)PC)；1,2-二肉豆蔻酰基-3--3-磷脂酰乙醇胺(DMPE)；1,2-二棕榈酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DPPE)；二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)；1,2-二油酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)；1,2-二硬脂酰基-3-磷脂酰乙醇胺(DSPE)；1,2-二肉豆蔻酰基-3-磷脂酰丝氨酸(DMPS)；1,2-二棕榈酰基-3-磷脂酰丝氨酸(DPPS)；棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)；和1,2-二油酰基-3-磷脂酰丝氨酸(DOPS)。
24.权利要求23的融合脂质体，其中所述磷脂选自DOPC、POPC、DMPC、DPPC、DOPE、POPE、DSPE、DMPE和DPPE。
25.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述稳定化部分是约106Da至约4kDa的分子量的PEG。
26.权利要求25的融合脂质体，其中PEG是约2kDa的分子量的PEG。
27.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述稳定化部分经由可切割的肽接头连接至所述脂质分子中的至少一个。
28.权利要求4-14中的任一项的融合脂质体，其中所述特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的所述互补性第二官能团形成共价键。
29.权利要求28的融合脂质体，其中所述特异性结合对的第一官能团能够经由点击化学反应与所述结合对的所述互补性第二官能团形成共价键。
30.权利要求28的融合脂质体，其中i)所述特异性结合对的第一官能团是炔烃或膦，且所述结合对的第二官能团是叠氮化物，或反之亦然；ii)所述特异性结合对的第一官能团是环烯烃、环炔烃、环丙烷、异腈(异氰化物)或乙烯基硼酸，且所述结合对的第二官能团是四嗪，或反之亦然；iii)所述特异性结合对的第一官能团是炔烃或马来酰亚胺，且所述结合对的第二官能团是硫醇，或反之亦然；iv)所述特异性结合对的第一官能团是共轭二烯，且所述结合对的第二官能团是取代的烯烃，或反之亦然；v)所述特异性结合对的第一官能团是烯烃、炔烃或乙炔化铜，且所述结合对的第二官能团是硝酮，或反之亦然；vi)所述特异性结合对的第一官能团是醛或酮，且所述结合对的第二官能团是烷氧基胺、羟胺、肼或酰肼，或反之亦然；或vii)所述特异性结合对的第一官能团是醛、酮、异硫氰酸盐、羧酸或其衍生物诸如酯、酸酐、酰卤、甲苯磺酰基和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，且所述结合对的第二官能团是胺，或反之亦然；viii)官能团。
31.权利要求30的融合脂质体，其中所述特异性结合对是炔烃-叠氮化物。
32.权利要求4-14中的任一项的融合脂质体，其中所述特异性结合对的第一官能团能够与所述结合对的所述互补性第二官能团形成非共价键。
33.权利要求32的融合脂质体，其中所述特异性结合对的第一官能团是生物素，且所述结合对的第二官能团是选自生物素-结合肽或生物素-结合蛋白的其结合配偶体，或反之亦然。
34.权利要求33的融合脂质体，其中所述生物素-结合蛋白选自抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和抗-生物素抗体。
35.权利要求34的融合脂质体，其中所述生物素-结合肽选自AEGEFCSWAPPKASCGDPAK(SEQ ID NO:1)、CSWRPPFRAVC(SEQ ID NO:2)、CSWAPPFKASC(SEQ ID NO:3)和CNWTPPFKTRC(SEQ ID NO:4)。
36.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述融合脂质体进一步包含胆固醇(CHO)或它的衍生物。
37.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述融合脂质体包含DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE或DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K和任选的胆固醇，
其中PEG2K代表具有约2kDa的分子量的PEG，且DOPC的相对摩尔量是至多约80％，DOTAP的相对摩尔量是至多约80％，DSPE-PEG2K的相对摩尔量是至多约20％，DOPE的相对摩尔量是至多约20％，胆固醇的相对摩尔量是至多约40％。
38.权利要求37的融合脂质体，其中所述融合脂质体包含：
(iii)摩尔比为52.5:35:0.6:10、52.5:35:1.25:10、52.5:35:2.5:10、52.5:35:5:10、52.5:35:0.6:5、52.5:35:1.25:5、52.5:35:2.5:5、52.5:35:5:5、65:20:5:10、50:35:5:10、52.5:35:1.25:7、52.5:35:1.25:5或52.5:35:2.5:7的DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE；或者
(iv)摩尔比为52.5:35:0.6、52.5:35:1.25、52.5:35:2.5、52.5:35:5、52.5:35:0.6、52.5:35:1.25、52.5:35:2.5、52.5:35:5、65:20:5、50:35:5、52.5:35:1.25、52.5:35:1.25或52.5:35:2.5的DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K。
39.权利要求38的融合脂质体，其中所述融合脂质体包含摩尔比为52.5:35:2.5:5的DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K:DOPE；或摩尔比为52.5:35:2.5的DOPC:DOTAP:DSPE-PEG2K。
40.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述脂质体的熔化温度(Tm)低于45℃，在所述熔化温度，所述融合脂质体维持在非结晶转变相，由此提供脂质体与细胞膜的融合所需的膜流动性。
41.权利要求1-14中的任一项的融合脂质体，其中所述融合脂质体具有至多200nm的大小，例如约15nm至约200nm、约20nm至约100nm、约50nm至约150nm、约50nm至约90nm、约80nm至约100nm、约110nm至约200nm，例如约100nm的大小。
42.一种用于选择性地检测癌细胞的方法，所述方法包括使所述癌细胞与权利要求1的融合脂质体接触，且在所述可检测试剂是荧光探针的情况下，通过用具有被所述荧光探针吸收的波长的光照射所述细胞和检测由受激发的荧光探针发射的光来检测所述荧光探针；在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者。
43.权利要求42的方法，其中癌症患者中的癌细胞的选择性检测指示所述癌症患者对用包含在纳米颗粒中的癌症药物治疗癌症的应答性。
44.权利要求43的方法，其中用包含所述癌症药物的所述纳米颗粒治疗被确定为应答性的癌症患者。
45.一种用于选择性地检测癌细胞的方法，所述方法包括
a.使所述癌细胞与权利要求5的官能化的融合脂质体接触；
b.使所述癌细胞与可检测试剂接触，所述可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂，其中所述可检测试剂用能够结合所述脂质分子的所述第一官能团的结合对的互补性第二官能团官能化；和
c.在所述可检测试剂是荧光探针的情况下，通过用具有被所述荧光探针吸收的波长的光照射所述细胞和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针；在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者，由此选择性地检测所述癌细胞。
46.权利要求45的方法，其中所述可检测试剂是(a)选自以下的荧光探针：cy3、cy5、cy5.5、cy7 cy9、FITC、荧光素、alexa fluor 790、alexa fluor 750、alexa fluor 700、alexa fluor 680、alexa fluor 660、alexa fluor 647、alexa fluor 633、alexa fluor594、在585nm至800nm范围内的Qdot、荧光原卟啉寡聚体、异花青绿(ICG)；或(b)选自以下的可活化的荧光探针：荧光素类似物(诸如二乙酸盐修饰的类似物),香豆素类似物(诸如py+BC690-(1-甲基-4-(2-氧代-8-(吡咯烷-1-基)-2H-苯并[g]色烯-3-基)吡啶鎓三氟甲磺酸盐)),CFSE(5(6)-羧基二乙酸荧光素N-琥珀酰亚胺基酯),罗丹明类似物(诸如gGlu-HMRG(γ-谷氨酰基羟基甲基罗丹明绿)),基于类姜黄色素二氟硼的靶向肿瘤的γ-谷氨酰基转肽酶(GGT)-可活化的)荧光探针(Glu-DFB),和吲哚菁类似物，诸如AP-Glu(3H-吲哚鎓,2-[(1E)-2-[4-[[4-[[(4S)-4-氨基-4-羧基-1-氧代丁基]氨基]苯基]甲氧基]苯基]乙烯基]-1-(5-羧基戊基)-3,3-二甲基-,溴化物(1:1)。
47.权利要求45的方法，其中癌症患者中的癌细胞的选择性检测指示所述癌症患者对用包含在纳米颗粒中的癌症药物治疗癌症的应答性。
48.权利要求47的方法，其中用包含所述癌症药物的所述纳米颗粒治疗被确定为应答性的癌症患者。
49.一种通过荧光引导的外科手术或靶向放射疗法来治疗癌症的方法,所述方法包括权利要求42或45的方法和取出含有所述癌细胞的肿瘤。
50.权利要求42或45的方法，其中所述癌症患者正在经历肿瘤、诸如皮肤癌的成像或全身成像，所述方法包括全身性地施用或局部地应用所述融合脂质体和任选的官能化的可检测试剂；和，在所述可检测试剂是可活化的荧光探针或荧光探针的情况下，通过照射所述皮肤区域或全身和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针，在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者，由此定义肿瘤位置和边缘。
51.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括权利要求50的方法和取出含有所述癌细胞的肿瘤。
52.权利要求42或45的方法，用于在从有此需要的癌症患者取出的组织或血液衍生级分中非原位选择性地检测癌细胞，所述方法包括将所述融合脂质体和任选的官能化的荧光探针全身性地施用或应用于所述组织或血液衍生级分，和通过照射所述组织或血液衍生级分和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针，由此选择性地检测所述癌细胞。
53.权利要求52的方法，其中所述组织是皮肤，所述癌症患者正在经历用于除去皮肤癌的外科手术(Mohs外科手术)，并重复所述外科手术，直到所述皮肤组织不具有可检测的癌细胞。
54.权利要求52的方法，其用于选择性地检测在所述血液衍生级分中的循环肿瘤细胞(CTC)。
55.权利要求42或45的方法，其中所述癌症选自乳腺癌诸如三重阴性的乳腺癌、黑素瘤、肺癌、甲状腺癌和前列腺癌。
56.权利要求42或45的方法，其用于选择性地检测癌细胞和治疗癌症，所述方法包括全身性地施用或局部地应用所述融合脂质体和任选的官能化的可检测试剂，其中所述融合脂质体包含所述可检测试剂和细胞毒性剂和/或免疫系统活化剂；在所述可检测试剂是可活化的荧光探针或荧光探针的情况下，通过照射所述皮肤区域或全身和检测从所述荧光探针发射的光来检测所述荧光探针，在所述可检测试剂是造影剂的情况下，通过借助于MRI、CT或PET装置分析信号强度的变化来描绘图像，或在所述融合脂质体包含荧光探针和造影剂两者的情况下，检测所述荧光探针和所述造影剂两者；和任选地通过随时间重复检测所述可检测试剂监测治疗应答。
57.一种试剂盒，其包含：
a.第一容器，其含有包含脂质双层的融合脂质体，所述脂质双层包含多个具有14-24个碳原子的脂质分子，且所述脂质分子中的至少一个进一步包含阳离子基团、阳离子的天然的或合成的聚合物、阳离子的氨基糖、阳离子的聚氨基酸或两亲的癌细胞结合肽；
所述脂质分子中的至少一个进一步包含选自以下的稳定化部分：聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚氨基酸、甲基-聚噁唑啉、聚甘油、聚(丙烯酰基吗啉)和聚丙烯酰胺；和
其中所述脂质分子中的至少一个被特异性结合对的能够结合所述结合对的互补性第二官能团的第一官能团官能化；
b.第二容器，其包含可检测试剂，所述可检测试剂选自荧光探针和用于磁共振成像(MRI)、计算机体层摄影术(CT)或正电子发射断层摄影术(PET)的造影剂，其中所述可检测试剂用能够结合所述脂质分子的所述第一官能团的结合对的互补性第二官能团官能化；和
c.小册子，其具有关于选择性地检测癌细胞的方法的说明，所述方法包括给癌症患者施用(a)的融合脂质体和随后施用(b)的可检测试剂。
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