CN114502159A - 包含钴卟啉-磷脂缀合物和多组氨酸标签的纳米结构 - Google Patents

包含钴卟啉-磷脂缀合物和多组氨酸标签的纳米结构 Download PDF

Info

Publication number
CN114502159A
CN114502159A CN202080048088.8A CN202080048088A CN114502159A CN 114502159 A CN114502159 A CN 114502159A CN 202080048088 A CN202080048088 A CN 202080048088A CN 114502159 A CN114502159 A CN 114502159A
Authority
CN
China
Prior art keywords
liposomes
copop
liposome
bilayer
cobalt
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080048088.8A
Other languages
English (en)
Inventor
乔纳森·罗维尔
帅·邵
耿具民
玮-朝·黄
淑-曼·李
查尔斯·里希特·金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Pass Co
Research Foundation of State University of New York
Original Assignee
Pass Co
Research Foundation of State University of New York
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US16/399,581 external-priority patent/US11207421B2/en
Application filed by Pass Co, Research Foundation of State University of New York filed Critical Pass Co
Publication of CN114502159A publication Critical patent/CN114502159A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/41—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002—Protozoa antigens
    • A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/0225—Spirochetes, e.g. Treponema, Leptospira, Borrelia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A61K47/544—Phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本公开提供了纳米结构(例如，单层或双层纳米结构)，包含卟啉，所述卟啉具有与其螯合的钴，使得钴金属在卟啉大环中位于单层或双层内。纳米结构可以具有包含来自微生物的表位的呈递分子，所述呈递分子具有与其连接的组氨酸标签，使得his标签的至少一部分在单层或双层内并与钴金属核配位并且呈递分子暴露于纳米结构的外部。纳米结构还可以包含货物。纳米结构可用于将货物递送至个体。

Description

包含钴卟啉-磷脂缀合物和多组氨酸标签的纳米结构
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年4月30日提交的美国专利申请第16/399,581号的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的资助号DP5OD017898和R21AI122964的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本公开一般地涉及功能化纳米结构领域。更具体地，本公开涉及包含钴-卟啉的纳米结构。
背景技术
在功能化纳米颗粒领域，挑战之一是容易且可靠地将肽和蛋白质连接到更大的骨架上。靶向纳米颗粒需要有效的配体，并且未缀合的肽本身具有弱免疫原性。生物缀合物化学提供了一系列策略，但大多数纳米颗粒缀合受到与以下一项或多项相关的限制：1)低缀合产率和必要的纯化步骤；2)与生物缓冲液不相容，使得无法标记完整的纳米颗粒；3)可变的标记位点和缀合多肽构象，产生不同功效的非均质颗粒群；4)需要复杂和外源化学方法。
用于将配体连接到水性纳米颗粒的标准方法利用马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯和碳二亚胺活化的羧酸。这些可以与多肽的胺和硫醇基团共价反应。已广泛探索了马来酰亚胺-脂质在抗体缀合的免疫脂质体中的应用。过夜反应的缀合产率可高达90％，但随后需要淬灭游离马来酰亚胺基团并进行额外纯化。蛋白质在缀合之前可能需要硫醇化和纯化的制备步骤。抗体方向是影响缀合的抗体靶标结合功效的主要因素，但这些方法会导致众多的抗体标记位点和任意的方向。双正交合成策略如点击反应最近已应用于预先形成的脂质体，但是这些需要使用外源催化剂和非常规氨基酸。
适用于在有机溶剂中不易永久变性的较小肽的另一种方法是将肽与脂质锚缀合。然后可以在脂质体形成过程中将所得脂肽与其它脂质一起并入。这种方法已被用于生产合成疫苗，以诱导针对其它非免疫原性肽的抗体产生。然而，由于其两亲性特征，在这种情况脂肽难以纯化，产率为5-10％。还表明，脂肽在形成过程中没有完全并入到脂质体中，导致聚集。
发明内容
本公开提供了功能化纳米结构。该纳米结构可用于递送货物、靶向递送和/或递送呈递分子。纳米结构可以是包围其中的水性隔室的单层或双层。包围水性隔室的双层结构在本文中称为脂质体。纳米结构可以是纳米颗粒上的单层或双层涂层。单层或双层包含钴卟啉-磷脂缀合物、任选的未与卟啉缀合的磷脂、任选的固醇和任选的聚乙二醇(PEG)。将具有多组氨酸标签的一种或多种靶向肽或多肽(在本文中称为呈递分子)并入单层或双层中，使得多组氨酸标签的一部分位于单层或双层中，并且呈递分子暴露于单层或双层的外部。代替钴卟啉磷脂缀合物或除了钴卟啉磷脂缀合物以外，可以使用钴卟啉。
本公开的纳米结构可以装载货物，用于递送到可以被带多组氨酸标签的呈递分子靶向的位点。例如，脂质体可以装载货物，用于通过使用带多组氨酸标签的呈递分子递送至期望位点。
这里提供的数据表明，包含钴-卟啉(例如钴卟啉-磷脂(CoPoP))的双层可以稳定地结合带多组氨酸标签的(在本文中也称为“带his标签的”)多肽(图1a)。其它金属卟啉如锌、镍和铜不能稳定地结合带his标签的多肽。这代表了一种新的结合范式，其中至少有一些多组氨酸埋藏在膜相中，因为卟啉本身形成双层的疏水部分并且无法进入外部水性环境(图1b)。这导致更稳定的结合，允许在纳米颗粒形成后显著更简单的非共价标记后范例，并消除关于配体方向的不确定。
我们表明，包含与钴而不是与其它金属螯合的卟啉-磷脂的脂质双层可以有效地捕获带his标签的蛋白质和肽。这种结合遵循Co(II)到Co(III)的转变，并发生在掩蔽的疏水双层内，导致例如血清中基本上不可逆的连接或竞争性咪唑的数百万倍过量。使用这种方法，我们将归巢肽插入到预先形成的空脂质体和装载货物的脂质体的双层中，以实现位点靶向(例如肿瘤靶向)而不会破坏双层完整性。肽或合成肽可以与含有佐剂(例如脂质单磷酰脂质A)的脂质体结合，用于其它非抗原肽的抗体产生。
本公开提供了单层或双层结构，其中所述单层或双层包含卟啉，所述卟啉具有与其螯合的钴，使得钴金属位于单层或双层和卟啉大环内，并且进一步具有非共价连接有组氨酸标签的分子，使得his标签的至少一部分在单层或双层内并与钴金属核配位。呈递分子可用于各种应用，包括靶向和产生免疫应答。由本发明层形成的脂质体或胶束可装载货物以在期望位置释放。钴卟啉可以是钴卟啉-磷脂(CoPoP)。本发明层还可以用作其它纳米结构(包括金属纳米颗粒、纳米管等)的涂层。
附图说明
图1.His标签与PoP-双层的结合。(a)示意图示出了水溶液中具有His标签(绿色)的肽与预先形成的CoPoP脂质体结合。(b)带His标签的多肽插入含有CoPoP的双层中。仅示出了双层的单片。(c)本研究中使用的金属-PoP的化学结构。
图2.带His标签的蛋白质与Co(III)-PoP脂质体的结合。(a)包含与Venus(V)融合的Cerulean(C)的带七his标签的荧光蛋白显示与PoP双层的结合。当C被激发时，发生FRET并且V发出荧光(左)，但由于与光子双层竞争FRET，所以当与PoP双层结合时，这种荧光被抑制(中)。即使蛋白质与双层结合，也可以直接探测到C荧光(右)。(b)在与指定金属-PoP脂质体孵育后，融合蛋白电泳迁移率位移的多光谱荧光图像。(c)基于C至V FRET的损失，融合蛋白与指定金属-PoP脂质体的结合动力学。(d)CoPoP上乙烯基基团的带下划线的质子的NMR峰宽证明了氘化氯仿(CDCl3)中Co(II)的顺磁展宽，但氘化水中CoPoP-脂质体形成后Co(III)的非顺磁峰。对于每组柱子，从左到右分别是代表以下的柱子：CoPoP和2H-PoP。(e)添加2M硫酸钠后，带His标签的肽与CoPoP脂质体结合的逆转。脂质体由10摩尔％的CoPoP或Ni-NTA磷脂形成。对于每组柱子，从左到右的柱子是：水和+2M亚硫酸盐。
图3.带His标签的蛋白质与CoPoP脂质体的稳健结合。(a)与含有指定脂质的脂质体孵育的荧光报告蛋白的多光谱电泳迁移率位移图像。(b)在1:1血清中与指定脂质体结合的报告蛋白的结合稳定性。(c)在过量游离咪唑中与指定脂质体结合的报告蛋白的结合稳定性。n＝3的平均值+/-标准偏差。
图4.短的带His标签的RGD肽与CoPoP脂质体的结合。(a)用FAM标记的短肽与金属-PoP脂质体的结合。(b)His标签长度对与CoPoP脂质体的结合半衰期的影响。对于缺少His标签的肽，观察到无结合(No binding，“N.B.”)。当在PBS(c)或5mg/mL BSA(d)中孵育时，脂质体组成对与指定组成的CoPoP脂质体的结合半衰期的影响。示出了三次重复测量的平均值+/-标准偏差。在(c)和(d)中，对于每组柱子，从左到右的柱子分别为50和0。
图5.装载货物的脂质体的RGD-His靶向。(a)在肽结合过程中，PoP脂质体中包裹的磺酰罗丹明B的释放。对于每组柱子，从左到右的柱子为：8小时和24小时。(b)装载磺酰罗丹明B的脂质体的靶向摄取。细胞在指定条件下孵育，并且通过检查磺酰罗丹明B荧光来评估摄取。对于每组柱子，从左到右的柱子是：MCF7细胞和U87细胞。(c)示出了脂质体摄取的共聚焦显微照片。细胞与指定脂质体溶液孵育2小时，洗涤并成像。所有图像均使用相同的设置获取。(d)在注射到具有皮下U87肿瘤的裸小鼠中后45分钟，包裹在连接有或没有连接带His标签的环状RGD靶向肽的CoPoP脂质体中的磺酰罗丹明B的生物分布。n＝3的平均值+/-标准偏差。对于每组柱子，从左到右的柱子为：未靶向和+cRGD-His。
图6.使用免疫原性CoPoP脂质体的HIV肽疫苗接种。(a)BALB/c或无胸腺裸小鼠用含有25μg MPL和25μg带His标签的MPER肽的CoPoP脂质体进行免疫，所述肽源自HIV gp41包膜蛋白。使用缺乏His标签的生物素化MPER肽通过ELISA评估血清滴度，并用抗IgG二抗进行探测。箭头指示疫苗接种的时间。(b)如所示疫苗接种的BALB/c小鼠中的抗MPER滴度。小鼠在第0周和第2周进行疫苗接种，并在第4周收集血清。(c)用含有MPL的CoPoP脂质体疫苗接种的小鼠中的持续抗MPER滴度。每组n＝4只小鼠的平均值+/-标准偏差。左侧的前两个柱子(连接的)是CoPoP和Ni-NTA。(d)在指定抗体的存在下293细胞中的HIV感染的中和。使用蛋白A从小鼠血清中纯化IgG。n＝3的平均值+/-标准偏差。
图7.RGD-His肽与脂质体结合的稳定性。(a)FAM标记的RGD-His肽与含有10摩尔％Ni-NTA-脂质、Co-NTA-脂质或CoPoP的脂质体的结合。(b)肽结合后的凝胶过滤。仅CoPoP脂质体保持稳定结合。(c)用1:1稀释的胎牛血清孵育后的肽稳定性。仅CoPoP脂质体保持稳定结合。
图8.带his标签的蛋白质与含有CoPoP的脂质体的稳定结合。报告蛋白与含有CoPoP、游离Co-卟啉或2H-PoP的脂质体孵育，然后在血清中孵育并进行EMSA。然后使用FRET通道(ex：430nm，em：525nm)对蛋白质进行成像。CoPoP泳道中信号的缺乏表明与脂质体的稳定结合。Co-卟啉泳道中减弱的信号表明带his标签的蛋白质与脂质体有一些结合。
图9.RGD-His与不同组成的CoPoP脂质体的90％肽结合的时间。当在PBS中与RGD-His肽孵育时，脂质体组成对与包含指定组分的CoPoP脂质体(10摩尔％CoPoP)的90％肽结合时间的影响。对于每组柱子，从左到右的柱子为：+胆固醇和–胆固醇。
图10.在血清或白蛋白存在下RGD-His与CoPoP脂质体的结合。在50％胎牛血清或50mg/mL牛血清白蛋白存在下，将指定组成的脂质体与RGD-his肽孵育。通过将与CoPoP脂质体结合时的肽发射和与2H-PoP脂质体结合时的肽发射进行比较来将FAM标记的肽发射进行归一化。
图11.通过脂肽的膜透化。将装载磺酰罗丹明B的脂质体在室温下与指定的肽(5μg/mL)孵育，并使用荧光评估释放。对于每组柱子，从左到右的柱子为：8小时和24小时。
图12.RGD-His肽与含有1摩尔％CoPoP的脂质体的结合和细胞靶向。(a)与含有1摩尔％CoPoP的CoPoP脂质体孵育后归一化的肽荧光。通过将CoPoP样品与2H-PoP进行比较来将发射归一化。(b)与指定细胞孵育的含有1摩尔％CoPoP的磺酰罗丹明B脂质体的细胞摄取。对于每组柱子，从左到右的柱子为：MCF7细胞和U87细胞。
图13.用结合表面的CoPoP his标签涂覆金纳米颗粒。(a)分散金纳米球的涂覆方案的照片。在没有PoP涂层的情况，在重复离心步骤后柠檬酸盐稳定的金聚集体(箭头)。(b)脂质涂覆之前和之后纳米球的尺寸。插图示出了具有50nm比例尺的CoPoP金的透射电子显微照片。(c)柠檬酸盐稳定金和CoPoP金在RGD-His结合后的吸收光谱。(d)示出了靶向纳米球的摄取的共聚焦反射图像。细胞与指定的金纳米球孵育2小时，洗涤，然后成像。所有图像均使用相同的设置获取。
图14.(A)通过离心过滤试验测量Psf25(Pfs25_B)结合。这些数据表明Psf25蛋白与Co-pop脂质体的100％结合。(B)Psf25蛋白结合之前和之后CoPoP脂质体的颗粒尺寸。
图15.CD-1小鼠中的抗Psf25 IgG水平。小鼠按照肌肉内注射用CoPoP/MPL或ISA70中的Psf25进行疫苗接种，其中(A)加强前和(B)加强后，三周初免/三周加强(每次注射5、0.5或0.05ug Pfs25)。在来自用CoPoP(Psf25)脂质体或游离Psf25蛋白(有或没有ISA70)进行疫苗接种的小鼠的96孔板上通过ELISA测量IgG滴度。数据显示平均值+/-S.D.，每组n＝5只小鼠。
图16.抗Psf25 IgG滴度。滴度定义为产生比背景大0.5吸光度的血清稀释度的倒数。
图17.涂覆在CoPoP脂质体上不同长度的NANP肽的图示和表征。(A)不同数量的含有7×组氨酸(His)标签的NANP重复肽。(B)通过动态光散射(n＝3)计算与不同长度的NANP肽缀合的CoPoP脂质体的平均直径和多分散性(PDI)。误差棒，SD。(C)NANP肽与CoPoP脂质体和2HPoP脂质体的肽结合通过微量离心过滤过程和BCA测定进行测量(n＝3)。
图18.用与带his标签的MPER结合的CoPoP/磷脂酰丝氨酸脂质体预处理的小鼠中的抗MPER IgG滴度。在注射CoPoP/MPLA脂质体中的MPER以诱导针对MPER的抗体应答之前4周和2周，将小鼠用MPER/CoPoP/PS脂质体预处理。
图19.与多种带his标签的CPP结合的CoPoP脂质体孵育后，U87细胞的荧光。
图20.在室温下孵育2小时后，带有his标签的DS-Cavl实现与CoPoP纳米颗粒几乎完全结合(图20，左)。带His标签的DS-Cav1与缺乏钴的PoP颗粒(2HPoP)没有显著结合，并且没有His标签的DS-Cav1与任一颗粒均未实现显著结合。基于脂质体直径(图20，中)或多分散性(图20，右)，带His标签的DS-Cav1在结合后不会诱导脂质体聚集。
图21.CoPoP/DS-Cavl疫苗接种导致加强注射之前和之后更高的IgG抗体滴度。在初次注射后35天，CoPoP疫苗实现了最大的RSV中和作用。在第0天和第21天向CD-1小鼠肌肉内注射100ng DS-Cav1，在第42天收集血清并评估中和作用。
图22.带His标签的OspA的产生。
图23.使用CoPoP/PHAD脂质体形成的基于OspA的脂蛋白体的表征。(A)通过天然PAGE(组氨酸-MOPS缓冲系统pH 6.8)评估的OspA:CoPoP/PHAD脂质体的最佳结合质量比。(B)在室温下以1:4质量比孵育的OspA与CoPoP/PHAD脂质体结合的动力学。(C)带his标签的OspA与CoPoP/PHAD脂质体的特异性结合，其通过对获自脂质体高速离心的上清液进行microBCA测定来测量。(D)使用动态光散射测量的脂质体的流体动力学直径和多分散指数。(E)具有和不具有结合的带his标签的蛋白质的CoPoP/PHAD脂质体的TEM图像。在脂质体与蛋白质孵育3小时后进行采集。误差棒代表n＝3个测量的标准偏差。
图24.评估抗原功能化纳米脂质体的表位可用性和稳定性。(A)基于荧光淬灭测定的纳米脂质体-抗原颗粒在20％(v/v)人血清中的稳定性。(B)OspA特异性单克隆抗体LA-2对OspA结合脂质体的免疫沉淀。(C)鼠RAW264.7巨噬细胞在与指定样品孵育2小时后对DY-490-OspA的摄取。在孵育前1小时将细胞松弛素B补充到培养基中。误差棒代表n＝3实验的标准偏差。
图25.基于OspA的纳米脂质体疫苗的免疫原性评价。(A)与其它商业佐剂相比，由CoPoP/PHAD脂质体诱导的抗OspA IgG滴度。通过(B)使用山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗
Figure BDA0003443623140000061
488缀合物对渗透化的伯氏疏螺旋体B31(B.burgdorferi B31)进行间接免疫荧光测定，和通过(C)使用伯氏疏螺旋体B31和B.azfelii的全细胞裂解物进行免疫印迹测定，检测抗OspA IgG抗体。水平线代表几何平均值。
图26.OspA结合的CoPoP/PHAD脂质体的Th1偏向免疫应答。(A)使用ELISA对免疫后血清(第42天)进行IgG同种型分析。(B)用OspA刺激72小时后检测干扰素-γ和白细胞介素-4分泌的脾细胞刺激研究。误差棒代表来自n＝3三次重复刺激实验的标准偏差。水平线表示几何平均值。
图27.SNAP诱导的OspA抗体的杀疏螺旋体(borreliacidal)活性的评估。(A)使用豚鼠补体进行的血清杀菌抗体测定。存活百分比源自血清过夜处理后螺旋体数量相对于孵育后立即的螺旋体数量的归一化。使用暗视野显微镜对存活的伯氏疏螺旋体B31-A3进行计数。(B)来自三个不同小鼠血清的平均50％杀疏螺旋体活性(有效消除50％细菌的血清稀释率)。误差棒表示平均值的标准差。NI表示无抑制。杀菌滴度之间差异的统计显著性(p<0.05，由星号表示)通过具有Dunn事后检验的Kruskal-Wallis检验进行评估。
图28.SNAP免疫小鼠中抗OspAIgG水平的寿命。分别在第0天和第21天施用100ngOspA和CoPoP/PHAD脂质体的初免和加强疫苗接种。终点滴度定义为吸光度截止值为0.5时血清稀释度的倒数。数据点代表几何平均值，误差棒代表95％置信区间。
图29.来自H3N2毒株Fr1478的带his标签的HA蛋白与CoPoP脂质体的结合。
图30.(A-F)中所示，三组(n＝8)的小鼠用具有佐剂CoPoP/MPLA、2HPoP/MPLA或Alum(氢氧化铝)的100ng H3抗原Fr1478(来自流感毒株A/犬/Illinois/11613/2015)进行疫苗接种并且接种A/Hong Kong/1/1968。用在整个疫苗接种期间采集的血清样本进行的(A)IgG ELISA和(B)HAI测定表明，CoPoP/MPLA+Fr1478颗粒在病毒攻击之前实现了最佳抗体应答。(C-D)在8天的攻击期内体重保持稳定，并且肺组织中的(E)病毒载量和(F)白细胞计数在CoPoP疫苗接种的小鼠中最小，表明对病毒的有效保护。(G-I)进行了一项后续攻击研究，以研究与不含MPLA的CoPoP和另一种佐剂montanide ISA720相比，CoPoP/MPLA的保护作用如何。同样，CoPoP/MPLA疫苗接种的小鼠表现出最一致的体重保持和最低的肺部病毒载量和白细胞计数。
图31.虽然疫苗接种小鼠血清的被动转移产生比直接疫苗接种低的保护，但来自用CoPoP疫苗接种的小鼠血清的转移产生(A)显著减少的体重减轻，(B)更高的存活率，和(C)较低的临床评分。该数据支持这样的假设，即CoPoP疫苗接种引起的免疫应答是显著抗体介导的。
图32.(A)所示，获得了来自多种亚型的带his标签的流感抗原，并测试了与CoPoP的结合亲和力。带his标签的抗原的结合潜力似乎与亚型无关，大多数抗原在室温下孵育3小时后实现与CoPoP约100％结合。(B)用与十种选定抗原之一孵育的CoPoP对小鼠进行疫苗接种，收集血清并使用ELISA来量化所得血清抗体的结合反应。针对与疫苗抗原同源的抗原的抗体反应导致最高的IgG结合，而由其它亚型引起的抗体的非特异性结合往往平均降低一到两个数量级的结合。
图33.合成佐剂的一些实例的结构。
图34.脂质体由4:2:1:X的DPPC:胆固醇:CoPoP:MPLA形成，其中MPLA是这些类型的合成形式中的每一种，并且变量X为5、4、3、2、1。示出了CP(PHAD)、C3D6A(3D6A-PHAD)、CP504(PHAD-504)和CA(无MPLA)的抗Pfs25滴度的结果。
具体实施方式
本公开提供了至少包含单层的纳米结构。例如，该结构可以包含单层或双层，其中单层或双层包含卟啉-磷脂缀合物，所述卟啉-磷脂缀合物具有与其螯合的钴，使得钴位于双层内。双层结构可以形成脂质体。该结构可以包含两个单层(双层)，其中两个单层的疏水基团相对，并且亲水基团暴露于表面。
本文关于双层的公开也适用于单层。双层或单层在本文中有时称为“膜”。
本文提供的所有范围包括落入范围内至小数点后第十位的所有值，除非另有说明。
单层或双层中的一些或全部钴卟啉可以非共价结合带多组氨酸标签的分子，使得多组氨酸标签的至少一部分位于双层内并且带标签的分子存在于双层的表面上。在本发明双层或单层中，认为多组氨酸标签中的一个或多个组氨酸残基与双层内的钴金属核配位，从而为结构提供稳定性。多组氨酸标签的组氨酸残基可以与膜中卟啉核中的钴金属配位。整个组氨酸标签可位于双层内。具有与其缀合的钴金属的卟啉磷脂缀合物在本文中称为CoPoP。其中双层包含CoPoP的脂质体在本文中称为CoPoP脂质体。CoPoP脂质体可以用带组氨酸标签的分子进行功能化。如本文所用，术语“带his标签的分子”是指具有组氨酸尾部的分子——例如肽、多肽或蛋白质。例如，具有组氨酸尾部的肽是带his标签的分子。这种含his标签的CoPoP脂质体在本文中称为带his标签的CoPoP脂质体或带his标签的CoPoP。
用本公开的带His标签的呈递分子功能化的CoPoP单层或双层提供了用于在循环中呈递各种感兴趣的分子或用于递送至期望位置或用于产生针对那些带his标签的分子的特异性免疫应答的平台。这些分子在本文中被称为呈递分子(PM)。包含带his标签的CoPoP双层的结构(其具有连接到组氨酸标签的PM)表现出理想的稳定性。带his标签的分子与CoPoP非共价连接(配位)，并且可以通过孵育过程制备。因此，该过程不需要去除反应性部分(例如马来酰亚胺等)或用于其它类型缀合化学的外源催化剂或非天然氨基酸。
钴-卟啉可以在包围其中的水性隔室的自组装脂质体中的双层中。或者，其可以在涂覆其它纳米颗粒的单层或双层涂层中。钴-卟啉磷脂(CoPoP)就其两亲性质而言，其行为类似于常规脂质。因此，包含CoPoP的单层或双层可用于通过本领域技术人员已知的方法涂覆纳米颗粒。在一个实施方案中，本公开的双层或单层可以存在于其它纳米颗粒上，例如以涂层的形式。在一个实施方案中，包含钴-卟啉(例如钴卟啉-磷脂)的双层或单层作为具有亲水表面的金或二氧化硅纳米颗粒或其它纳米颗粒上的涂层存在。在一个实施方案中，涂层可以是单层的形式。在一个实施方案中，包含钴-卟啉(例如钴卟啉-磷脂)的单层或双层作为疏水表面(例如碳纳米管)上的涂层存在。在一个实施方案中，单层可以形成围绕一种或多种疏水性分子的胶束。
本公开提供了包含单层或双层的纳米结构，其中该单层或双层包含：i)任选的磷脂和ii)卟啉，所述卟啉具有与其配位的钴以形成钴-卟啉。任选地，纳米结构还具有一种或多种带多组氨酸标签的呈递分子。多组氨酸标签的至少一部分位于单层或双层的疏水部分，并且多组氨酸标签的一个或多个组氨酸与钴-卟啉中的钴配位。带多组氨酸标签的呈递分子的至少一部分暴露于纳米结构的外部。纳米结构可以是包围水性隔室的脂质体的形式。然而，纳米结构也可以涂覆亲水性或疏水性材料，例如金或二氧化硅纳米颗粒。钴卟啉可与磷脂缀合以形成钴卟啉-磷脂缀合物。钴卟啉可以占单层或双层的1至100摩尔％，包括其之间0.1摩尔％的值和范围。例如，钴卟啉可以占单层或双层的1至20摩尔％，或5至10摩尔％。如果钴卟啉占单层或双层的100％，则不存在未与钴卟啉缀合的磷脂。双层或单层还可包含固醇和/或聚乙二醇。固醇可以是胆固醇。
单层或双层中多组氨酸标签中组氨酸的数量可以为2至20。例如，多组氨酸标签中的组氨酸数量可以为6至10。例如，组氨酸的数量可以为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
脂质体可以是球形的或非球形的。脂质体的尺寸可以为50至1000nm或更大。在一个实施方案中，脂质体的尺寸(例如最长尺寸，例如直径)为50至1000nm，包括其之间的所有整数nm值和范围。例如，尺寸可以为50至200nm或20至1000nm。如果脂质体不是球形的，最长的尺寸可以为50至1000nm。可以在保持双层的单层的纳米结构宽度的同时实现这些尺寸。脂质体可以在水性隔室中携带货物。货物或其部分也可以或替代地并入单层或双层中。
在一个实施方案中，本公开提供了包含单层或双层的脂质体，其中所述单层或双层包含钴-卟啉磷脂缀合物、任选的未与钴卟啉缀合的磷脂和带多组氨酸标签的呈递分子，其中多组氨酸标签的至少一部分位于单层或双层的疏水部分，并且多组氨酸标签的一个或多个组氨酸与钴-卟啉磷脂缀合物中的钴配位。带多组氨酸标签的呈递分子的至少一部分暴露于纳米结构的外部。纳米结构(例如脂质体)可以包围水性隔室。单层或双层不需要包含任何未与钴卟啉缀合的磷脂，并且在这种情况仅具有钴卟啉磷脂缀合物。货物可以存在于水性隔室中。货物不必仅存在于在水性隔室中，并且其一部分可以存在于单层或双层中。
本发明还提供了单层或双层，其中该单层或双层包含磷脂单体和卟啉，所述卟啉具有与其配位的钴(形成钴-卟啉)。单层或双层具有与其缔合的一种或多种带多组氨酸标签的呈递分子，其中多组氨酸标签的至少一部分位于单层或双层的疏水部分。多组氨酸标签的一个或多个组氨酸与钴卟啉中的钴配位，并且带多组氨酸标签的呈递分子的至少一部分在双层或单层的外部。在各种实例中，单层或双层包围水性隔室或在纳米颗粒(例如金或二氧化硅纳米颗粒)上形成涂层。
本公开提供了纳米结构，包含核和核上的单层或双层涂层，其中所述单层或双层包含磷脂和卟啉，所述卟啉具有与其配位的钴以形成钴-卟啉。纳米结构可以具有一种或多种带多组氨酸标签的呈递分子，其中多组氨酸标签的至少一部分位于单层或双层的疏水部分，并且多组氨酸标签的一个或多个组氨酸与钴-卟啉中的钴配位。带多组氨酸标签的呈递分子的至少一部分暴露于纳米颗粒的外部。纳米结构的核可以是纳米颗粒，例如金或二氧化硅纳米颗粒。
如本文所述的脂质体或具有涂层或单层或双层的纳米颗粒可以在其上具有呈递分子，呈递分子可以是抗原分子和/或靶向分子。呈递分子还可以提供靶向能力和/或成像或其它功能。
包含带his标签的多肽和CoPoP组合物的脂质体或其它纳米结构在带his标签的多肽与脂质体的结合方面表现出高血清稳定性。在一个实施方案中，当在室温与血清(例如稀释的血清)孵育时，在孵育24小时后，超过60％的带his标签的肽保持与含CoPoP的双层结合。在一个实施方案中，在与血清孵育24小时后，超过85％的带his标签的肽保持与CoPoP层结合。
CoPoP脂质体或带his标签的CoPoP脂质体可以装载货物——所述货物通常位于水性隔室中，但如果其是疏水的或具有疏水组分，则可以完全或部分嵌入双层中存在。除了在表面具有呈递分子之外，这些结构还可用于在结构内的水性隔室或双层中装载货物。货物从CoPoP脂质体的释放可以由近红外(NIR)光触发。货物可以在期望的位置释放——例如通过在靶细胞中内化或通过光触发的释放。
单层或双层的钴-卟啉是具有与卟啉缀合的钴(Co)阳离子的卟啉。卟啉可以与磷脂缀合(在本文中称为钴卟啉-磷脂或钴卟啉-磷脂缀合物)。
构成脂质体或其它结构的一些双层的至少一部分的钴-卟啉或钴-卟啉缀合物的卟啉部分包括卟啉、卟啉衍生物、卟啉类似物或它们的组合。示例性卟啉包括血卟啉、原卟啉和四苯基卟啉。示例性的卟啉衍生物包括焦脱镁叶绿酸(pyropheophorbide)、细菌叶绿素(bacteriochlorophyll)、叶绿素A、苯并卟啉衍生物、四羟苯基二氢卟酚(tetrahydroxyphenyl chlorin)、红紫素(purpurin)、苯并二氢卟酚(benzochlorin)、萘并二氢卟酚(naphthochlorin)、verdins、rhodins、酮二氢卟酚(keto chlori)、氮杂二氢卟酚(azachlorin)、菌绿素(bacteriochlorin)、甲苯基卟啉(tolyporphyrin)和苯并菌绿素。示例性的卟啉类似物包括扩大的卟啉家族成员(例如德克萨卟啉(texaphyrins)、sapphyrins和hexaphyrins)和卟啉异构体(例如porphycenes、倒卟啉、酞菁和萘酞菁)。例如，钴卟啉可以是维生素B12(钴胺素)或衍生物。
在一个实施方案中，PoP是焦脱镁叶绿酸-磷脂。焦脱镁叶绿酸-磷脂的结构如下图所示：
Figure BDA0003443623140000111
在一个实施方案中，该层(单层或双层)仅具有具嵌入其中的带His标签的呈递分子的CoPoP。在该实施方案中，该层中唯一的磷脂是CoPoP(即，CoPoP为100摩尔％)。在一个实施方案中，该层(单层或双层)仅具有CoPoP和卟啉缀合的磷脂(PoP)，其中CoPoP具有嵌入其中的组氨酸，且组氨酸具有与其连接的肽或其它呈递分子。在某些实施方案中，没有其它磷脂，但该层(单层或双层)可任选地包含固醇和/或PEG-脂质。
在一个实施方案中，除了CoPoP之外，双层或单层还具有未与卟啉缀合并因此未与Co配位的磷脂。此类磷脂在本文中可称为“额外磷脂”。双层或单层还可包含固醇和PEG-脂质。在一个实施方案中，双层或单层基本上由或由CoPoP、未与卟啉缀合的磷脂和任选的固醇和/或PEG组成，其中PEG可以与脂质缀合。在一个实施方案中，双层中唯一的金属-PoP是CoPoP，其具有嵌入其中的带His标签的呈递分子。在一个实施方案中，双层中唯一的金属是Co。
在一个实施方案中，脂质体的双层包含CoPoP和PoP。除了CoPoP和PoP之外，双层还可以具有额外磷脂。双层或单层还可以包含固醇和/或PEG。PEG可以与脂质缀合。在一个实施方案中，双层基本上由或由CoPoP、PoP、额外磷脂和任选的固醇和/或PEG组成，其中PEG可以与脂质缀合。在一个实施方案中，双层中唯一的金属-PoP是CoPoP。在一个实施方案中，双层中唯一的金属是Co。
在一个实施方案中，CoPoP以0.1至10摩尔％存在于纳米颗粒中，其余99.9至90摩尔％由额外脂质构成，百分比为整个双层脂质的百分比。例如，CoPoP的组合可以以0.1至10摩尔％存在，固醇可以以0.1至50摩尔％存在，任选地，减毒脂质A衍生物例如单磷酰脂质A或3-脱酰单磷酰脂质A或相关类似物可以以0至20摩尔％或0.1至20摩尔％存在，其余部分可由额外磷脂构成。磷脂是DOPC、DSPC、DMPC或其组合，并且的固醇(如果存在)可以是胆固醇。
在一个实施方案中，CoPoP和PoP的组合可以以0.1至10摩尔％存在于纳米颗粒中，而剩余的99.9至90摩尔％由额外磷脂构成。例如，CoPoP和PoP的组合可以以0.1至10摩尔％存在，固醇可以以0至50摩尔％或0.1至50摩尔％存在，任选的PEG可以以0至20摩尔％或0.1至20摩尔％存在，并且其余部分可由磷脂构成。磷脂可以是DOPC、DSPC、DMPC或其组合，并且固醇(如果存在)可以是胆固醇。
如本文所用，“磷脂”是这样的脂质，其具有亲水性头部基团，所述亲水性头部基团具有通过甘油骨架连接至疏水性脂质尾部的磷酸基团。磷脂包含6至22个碳(包括其之间的所有整数个碳及范围)的酰基侧链。在某些实施方案中，卟啉缀合物中的磷脂是1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱。卟啉缀合物的磷脂可以包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酰肌醇，或由其组成。
在某些实施方案中，卟啉通过1至20个碳(包括其之间的所有整数个碳)的碳链接头与磷脂上的甘油基团缀合。
在多种实施方案中，除了本文公开的卟啉缀合物之外，脂质体的双层还包含其它磷脂。这些磷脂的脂肪酸链可以包含合适数量的碳原子以形成双层。例如，脂肪酸链可以包含12、14、16、18或20个碳原子。在不同的实施方案中，双层包含磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和/或磷脂酰肌醇。
本发明的双层和单层还可包含固醇。固醇可以是动物固醇或植物固醇。固醇的实例包括胆固醇、谷固醇、豆固醇和胆固醇。在实施方案中，胆固醇可以为0摩尔％至50摩尔％，或0.1至50摩尔％。在另一些实施方案中，胆固醇可以以1至50摩尔％、5至45摩尔％、10至30摩尔％存在。
在某些实施方案中，双层或单层进一步包含PEG-脂质。PEG-脂质可以是DSPE-PEG，例如DSPE-PEG-2000、DSPE-PEG-5000或其它尺寸的DSPE-PEG。PEG-脂质以0至20摩尔％(包括其之间至小数点后第十位的所有百分比量)的量存在。PEG部分的平均分子量可以为500至5000道尔顿以及其之间的所有整数值和范围。
在某些实施方案中，双层或单层还包含佐剂，例如减毒脂质A衍生物，例如单磷酰脂质A或3-脱酰单磷酰脂质A。
组氨酸标签(his标签)可以携带用于各种应用的多种感兴趣的呈递分子。his标签的至少一端或两端可以靠近脂质体的外表面。在一个实施方案中，多组氨酸标签的至少一端共价连接到呈递分子。在一个实施方案中，his标签是至少2个组氨酸的串。在一个实施方案中，his标签是2-20个组氨酸的串。在一个实施方案中，his标签是4-12个组氨酸及其之间的所有整数的串。在一个实施方案中，其为6-10个组氨酸。在一个实施方案中，其为6、7、8、9或10个组氨酸。在一个实施方案中，his标签的一端是游离的并且肽或其它分子连接到另一端。认为his标签的至少一部分位于双层内，使得其与钴金属核配位。
本公开的脂质体(没有带his标签的分子)可以是基本上球形的并且尺寸(例如最长尺寸，例如直径)为30nm至250nm，包括其之间的至nm的所有整数和范围。在一个实施方案中，脂质体的尺寸为100-175nm。在一个实施方案中，组合物中至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的脂质体的尺寸为30至250nm或100至175nm。脂质体或纳米结构可以超过200nm。在一个实施方案中，纳米结构超过1000nm。在一个实施方案中，纳米结构为200至1000nm。脂质体或纳米结构可以是球形的或非球形的。在一个实施方案中，纳米结构的最大尺寸小于200nm，同时保持单层或双层的纳米结构宽度。在一个实施方案中，纳米结构的尺寸在一些维度上超过200nm，同时保持单层或双层的纳米结构宽度。在一个实施方案中，纳米结构的尺寸在一些维度上超过1000nm，同时保持单层或双层的纳米结构宽度。
在一个方面，本公开提供了组合物，包含本公开的脂质体或其它结构或不同脂质体或其它结构的混合物。组合物还可以包含用于施用于包括人在内的个体的无菌、合适的载体，例如生理缓冲液，例如蔗糖、右旋糖、盐水、pH缓冲(例如pH 5至9、pH 7至8、pH7.2至7.6(例如，7.4))元素如组氨酸、柠檬酸盐或磷酸盐。在一个实施方案中，组合物包含至少0.1％(w/v)CoPoP脂质体或带his标签的CoPoP脂质体或其它结构。在多种实施方案中，组合物包含0.1至100摩尔％的CoPoP脂质体或带his标签的CoPoP脂质体或其它结构，例如双层涂覆的纳米颗粒。在一个实施方案中，组合物包含0.1至99摩尔％的CoPoP脂质体，其具有与其相缔合的带His标签的呈递分子。
在一个实施方案中，本公开的组合物不含马来酰亚胺或琥珀酰亚胺酯反应性基团。在一个实施方案中，待连接到膜的带标签的分子不具有非天然氨基酸。
带有his标签的呈递分子可以是小分子或大分子。在一个实施方案中，分子是肽或肽衍生物。在一个实施方案中，分子是多肽、多核苷酸、碳水化合物或聚合物。His标签可以化学缀合至感兴趣的分子。His标签可以并入多肽的一级氨基酸序列中。在一个实施方案中，分子是抗原，例如肽(2-50个氨基酸和氨基酸长度为2至50的所有肽)或多肽(50-1,000个氨基酸和氨基酸长度为50-1,000个氨基酸的所有多肽)或蛋白质(大于1,000个氨基酸)。肽、多肽或蛋白质可以仅具有天然存在的氨基酸，或者可以是天然存在和非天然存在的氨基酸的混合物，或者可以仅具有非天然存在的氨基酸。
连接至his标签的呈递分子可以是抗原分子、靶向分子、治疗分子、诊断分子或提供任何其它类型功能的分子。带标签的分子可用于靶向，即将带有单层或双层的结构引导至其靶向位置。例如，肽配体可以连接至his标签，使得配体将脂质体(或其它结构)引导至具有配体的受体或识别分子的细胞。在一个实施方案中，连接的肽可以提供替代的或额外的功能——例如，连接的肽可以提供治疗、诊断或免疫原性功能。
在具体实施方案中，呈递分子可以是靶向分子，例如抗体、肽、适体或其它分子例如叶酸。术语“靶向分子”用于指能够将诸如脂质体的带有双层的结构引导至特定靶标的任何分子，例如通过与被靶向细胞表面上的受体或其它分子结合。靶向分子可以是蛋白质、肽、核酸分子、糖类或多糖、受体配体或其它小分子。特异性程度可以通过选择靶向分子来调节。例如，抗体通常表现出高特异性。这些可以是多克隆抗体、单克隆抗体、片段抗体、重组抗体、单链抗体或纳米抗体，其中许多是可商购的或使用标准技术容易获得。
呈递分子可以是抗原分子——即，带有抗原表位的分子。在一个实施方案中，分子是肽。在一个实施方案中，肽是带有RGD的肽序列。这样的序列可以是带有表位的7-20个氨基酸或更长。肽可以是作为微生物例如病原微生物(例如，病毒、细菌、寄生虫或真菌)的一部分的多肽或蛋白质的片段或者可以包含其表位。实例包括呼吸道合胞病毒、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(本文称为莱姆疏螺旋体)、流感病毒等。肽可以是通常不具有免疫原性的多肽或蛋白质的片段，例如未知实际上具有免疫原性的病毒蛋白质。肽可以是HIV抗原(HIV外包膜蛋白)的片段，或者可以包含其表位。在一个实施方案中，HIV抗原是gp41。例如，肽可以是gp41包膜的膜近端外部区域(MPER)。抗原的其它实例包括但不限于用于RSV的DS-Cav1、用于莱姆病的OspA和用于流感的血凝素和神经氨酸酶。
在一个实施方案中，本公开提供了抗原组合物。组合物包含带有双层的结构，其中具有组氨酸尾部的抗原与钴卟啉(或钴卟啉磷脂)非共价缀合，使得组氨酸标签嵌入双层中并且抗原的一个或多个表位暴露在表面上。组合物可包含本领域已知的佐剂和其它载体。佐剂的实例包括完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、单磷酰脂质A(MPL)、磷酸铝、氢氧化铝、alum、磷酸化六酰基二糖(PHAD)、Sigma佐剂系统(SAS)、AddaVax(Invitrogen)或皂苷。也可以使用其它载体，如润湿剂、乳化剂、填料等。
可以将多种货物装载到本公开的脂质体或其它结构中。可以使用近红外光将货物递送至期望位置。例如，生物活性剂或治疗剂、药学物质或药物可以封装在CoPoP脂质体的内部。这包括水溶性药物，并且还包括弱酸或弱碱药物，它们可以通过化学梯度装载并浓缩在脂质体的水性核中。因此，在多种实施方案中，脂质体包含包封在其中的活性剂，例如治疗剂和/或诊断剂，其可以是化学治疗剂，例如多柔比星。化学治疗剂多柔比星可以主动装载并以NIR照射释放，使用CoPoP脂质体提供稳健且直接的光触发释放。
在一个实施方案中，脂质与药物(或任何其它货物剂)的比率为10:1至5:1。在多种实施方案中，脂质与药物/货物的比率为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1或5:1。用于计算比率的脂质包括所有脂质，包括作为卟啉磷脂缀合物的一部分的磷脂、额外磷脂、或固醇，以及与PEG(如果存在)缀合的脂质。尽管有时在本公开中将货物描述为药物，但该描述同样适用于包含用于治疗和/或递送至期望位置的任何药剂，并且术语“药物”旨在指代任何药剂。药剂可以全部或部分地包含在PoP-脂质体内或中——无论是存在于水性隔室、双层或两者中。
在一个实施方案中，装载在脂质体或其它载体中的货物是治疗剂。术语“治疗剂”是本领域公认的，是指具有生物学、生理学或药理学活性物质的任何化学部分。治疗剂(也称为“药物”)的实例在众所周知的参考文献中例如Merck Index、The Physicians DeskReference和The Pharmacological Basis of Therapeutics有所描述，并且包括但不限于药物；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或缓解疾病或病症的物质；影响身体结构或功能的物质；或前药，其在置于生理环境中后变得具有生物活性或更具活性。可以使用多种形式的治疗剂，其在施用于受试者后能够从本发明组合物释放到邻近组织或流体中。已知通过活性梯度装载的药物包括多柔比星、柔红霉素、吉西他滨、表柔比星、拓扑替康、长春新碱、米托蒽醌、环丙沙星和顺铂。治疗性货物还包括各种抗生素(例如庆大霉素)或其它有效对抗由细菌、真菌、寄生虫或其它生物体引起的感染的药剂。这些药物可以在CoPoP脂质体中装载和释放。
在一个实施方案中，装载在脂质体中的货物是诊断剂。“诊断”或“诊断剂”是可用于诊断的任何化学部分。例如，诊断剂包括显像剂，例如含有放射性同位素如铟或锝的那些；含有碘或钆的造影剂；酶，例如辣根过氧化物酶、GFP、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶；荧光物质，例如铕衍生物；发光物质，例如N-甲基吖啶鎓(N-methylacrydium)衍生物等。
货物可以包含多于一种的药剂。例如，货物可以包含诊断剂、治疗剂、免疫原性剂和/或显像剂和/或任何其它类型的药剂的组合。相同的药剂可以具有多种功能。例如，药剂可以具有诊断性和治疗性，或者药剂可以具有成像性和免疫原性等。
由本公开的层形成的结构是血清稳定的。例如，在体外，当室温在50％牛血清中孵育24小时后，his标签与CoPoP双层的结合稳定性是稳定的。因此，这些结构可以在血清或浓缩或稀释的血清条件下是稳定的。
本公开还提供了使用如本文所述的带有双层的结构的方法。在一个实施方案中，本公开提供了在宿主中引发免疫应答的方法。免疫应答可产生抗体。该方法包括向个体施用组合物，所述组合物包含带有与带组氨酸标签的抗原缀合的CoPoP双层的结构。组合物可以通过任何标准的免疫途径施用，包括皮下、皮内、肌内、瘤内或任何其它途径。组合物可以以单次施用来施用，或可以以包括加强注射的多次施用来施用。可以测量抗体滴度以监测免疫应答。
本发明的纳米结构可用于降低针对期望抗原的抗体滴度。例如，如果希望降低免疫原性，可以使用其中存在包含PS(或其它)磷脂的纳米结构。可以施用包含这些纳米结构的组合物以降低免疫原性。
在一个方面，本公开提供了将作为货物包含在脂质体或其它纳米结构中的药剂递送至期望位置的方法。药剂可以全部或部分地包含在CoPoP脂质体内或中——无论是存在于水性隔室、双层或两者中。该方法包括：1)提供包含本公开带有的双层的脂质体或其它结构的组合物，任选地包含货物(例如活性剂)；2)使脂质体到达选定的或期望的目的地；3)在使至少一部分货物从脂质体释放的条件下用具有近红外波长的辐射照射脂质体。通过使脂质体内化然后在细胞内过程的作用下释放货物，货物可以替代地或另外地到达细胞内部。
可以用近红外光照射脂质体，所述近红外光来自功率为50至1000mW/cm2(包括其之间至mW/cm2的所有整数数值和范围)且波长为650至1000nm(包括其之间至nm的所有整数数值及和范围)的激光。在另一个实施方案中，波长为650至800nm(包括其之间至nm的所有整数数值和所有范围)。可以照射脂质体长至30分钟或更短时间。在多种实施方案中，可以在体外或体内照射脂质体0.5至30分钟，以及其之间至小数点后第十位的所有数值。在一个实施方案中，用658nm激光二极管照射脂质体长至10分钟。在另一些实施方案中，用665或671nm的波长照射脂质体。红外照射可以通过将激光照射到该区域或使用光纤探头直接递送到所需区域。在肿瘤的情况，可以将光纤探头插入肿瘤(即，通过导管或内窥镜装置)以向局部区域提供照射。
在一个方面，本公开提供了制备包含CoPoP的双层的方法。游离碱PoP可以通过以下产生，使用氯仿中的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶使单羧酸卟啉例如焦脱镁叶绿酸-a与2-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(lyso-C16-PC)(Avanti#855675P)以1:1:2:2的lyso-C16-PC:Pyro:EDC:DMAP摩尔比在室温下搅拌过夜来进行酯化。然后通过硅胶色谱纯化PoP。CoPoP可以通过将卟啉-磷脂缀合物与摩尔过量(例如，10倍摩尔过量)的钴盐(例如，四水合乙酸钴(II))在溶剂(例如甲醇)中在黑暗中接触来产生。
在一个实施方案中，本公开提供了用钴-卟啉(例如，CoPoP)双层或单层涂覆纳米颗粒的方法。该方法通常包括用脂质溶液水合纳米颗粒以将颗粒分散在水中。
为了将货物递送至期望位置或用于一般施用，可以通过任何合适的途径将包含合适载体中的脂质体的组合物施用于个体。在一个实施方案中，其通过静脉输注施用，从而进入脉管系统(循环系统)。组合物可以全身施用或可以直接施用到特定器官或组织或肿瘤的血液供应中。当通过NIR照射时，PoP脂质体的内容物可以释放在循环系统内，然后可以进入周围组织。
在以下陈述中，描述了本公开的纳米结构、组合物和方法的各种实例：
1.一种纳米结构(例如，脂质体)，包含：a)单层或双层，其中所述单层或双层包含：i)任选的磷脂，和ii)卟啉，所述卟啉具有与其配位的钴以形成钴-卟啉；和b)任选的带多组氨酸标签的呈递分子，其中所述多组氨酸标签的至少一部分位于所述单层或所述双层或单层的疏水部分，并且所述多组氨酸标签的一个或多个组氨酸与所述钴-卟啉中的钴配位，其中所述带多组氨酸标签的呈递分子的至少一部分暴露于所述纳米结构(例如，脂质体)的外部，并且其中在脂质体的情况，所述脂质体包围水性隔室。
2.如陈述1的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述钴卟啉与磷脂缀合形成钴卟啉-磷脂缀合物。
3.如陈述2的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述钴卟啉-磷脂缀合物占所述单层或所述双层的1至25摩尔％。
4.如陈述3的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述钴卟啉-磷脂缀合物占所述单层或双层的5至10摩尔％。
5.如陈述1至4中任一项的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述双层还包含固醇(例如，胆固醇)。
6.如陈述1至4中任一项的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述双层还包含磷脂酰丝氨酸和任选的胆固醇。
7.如陈述1至4中任一项的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述多组氨酸标签包含6至10个组氨酸残基。
8.如陈述1至4中任一项的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述脂质体的尺寸为50nm至200nm。
9.如陈述1至4中任一项的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述纳米结构(例如，脂质体)包含货物，并且在脂质体的情况，所述货物的至少一部分位于所述脂质体的所述水性隔室中。
10.如前述陈述中任一项的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述呈递分子是4至50个氨基酸的肽，所述氨基酸数目不包括his标签的组氨酸。
11.如前述陈述中任一项的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述呈递分子是4至500kDa的蛋白质。
12.如前述陈述中任一项的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述呈递分子是抗原分子并且所述单层或所述双层还包含并入其中的佐剂。
13.如陈述12的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述佐剂是减毒脂质A衍生物。
14.如陈述13的纳米结构(例如，脂质体)，其中所述减毒脂质A衍生物是单磷酰脂质A或3-脱酰单磷酰脂质A。
15.一种纳米结构，包含：a)核；和b)所述核上的单层或双层，其中所述单层或双层包含：i)任选的磷脂单体，和ii)卟啉，所述卟啉具有与其配位的钴以形成钴-卟啉(例如，CoPoP)；和c)任选的带多组氨酸标签的呈递分子，其中所述多组氨酸标签的至少一部分位于所述单层或所述双层的疏水部分，所述多组氨酸标签的一个或多个组氨酸与所述钴-卟啉中的钴配位，并且所述带多组氨酸标签的呈递分子的至少一部分暴露于所述纳米结构的外部。
16.如陈述15的纳米结构，其中所述核是金纳米颗粒。
17.一种靶向递送货物的方法，包括：a)向个体施用包含药物载体中的陈述9至16中任一项的纳米结构(例如，脂质体)或陈述9至16中任一项的纳米结构(例如，脂质体)的组合的组合物；和b)在合适的一段时间以使所述纳米结构(例如，脂质体)到达个体的期望位置之后，将所述脂质体暴露于波长为650至1000nm的近红外照射，以实现所述货物从所述脂质体的释放。
18.如陈述17的方法，其中所述个体是人或非人动物。
19.一种用于在宿主个体中产生免疫应答的方法，包括向个体施用包含药物载体中的陈述1至16中任一项的纳米结构(例如，脂质体)或陈述1至16中任一项的组合纳米结构(例如，脂质体)的组合物，其中呈递分子包含免疫原性表位。
20.如陈述19的方法，其中所述呈递分子是源自病原微生物的肽、多肽或蛋白质。
21.如陈述19或20中任一项的方法，其中所述个体是人或非人动物。
提供以下实施例以说明本公开。它们无意以任何方式进行限制。
实施例1
本实施例描述了具有带组氨酸标签的配体和抗原的钴卟啉-磷脂(CoPoP)双层的合成和功能化。
材料和方法。除非另有说明，否则材料均获自Sigma。肽获自商业供应商，通过HPLC确定纯度并通过质谱法确认身份：
表1.肽的性质
Figure BDA0003443623140000191
Figure BDA0003443623140000201
对于蛋白质结合，重组带七组氨酸标签的cerulean-venus融合报告蛋白在大肠杆菌中产生，并如先前所述进行纯化和表征。化学计量近似值基于每个～100nm脂质体包含80,000个脂质的假设。
PoP-脂质、PoP-脂质体和PoP-金的产生。如先前所述合成游离碱(2H)PoP sn-1-棕榈酰sn-2-焦脱镁叶绿酸磷脂酰胆碱。通过将100mg 2H-PoP与10倍摩尔过量的四水乙酸钴(II)在4mL甲醇中在黑暗中搅拌17小时来产生CoPoP。通过TLC(>90％纯度)监测反应完成和产物纯度。然后通过旋转蒸发除去溶剂，PoP用氯仿:甲醇:水(1:1.8:1)萃取3次。收集氯仿层，通过旋转蒸发除去溶剂，并且将产物在叔丁醇中的20％水中冷冻干燥，得到81.5mg(77％产率)(用质谱法确认身份)。使用相同的方法合成其它金属-PoP。对于Ni-PoP，使用四水乙酸酸镍(II)并孵育17小时。对于Zn-PoP，使用无水乙酸锌(II)并孵育17小时。对于Mn-PoP，使用乙酸锰(II)并孵育30小时。对于Cu-PoP，使用乙酸铜(II)并在四氢呋喃中孵育3小时。
PoP-脂质体以1mg的规模配制。在试管中将脂质溶解在氯仿中后，蒸发溶剂并将膜进一步真空干燥过夜。脂质用1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)再水合、声处理、进行10次冻融循环，然后用手持式挤出机(Avanti#610000)通过100nm聚碳酸酯膜(VWR#28157-790)挤出。对于蛋白质和肽结合分析，脂质体由10摩尔％的PoP和85摩尔％的DOPC(Avanti#850375P)和5摩尔％PEG-脂质(Avanti#880120P)形成。Ni-NTA脂质体包含10摩尔％的Ni-NTA脂质二油酰-甘油-Ni-NTA(Avanti#790404P)以及10摩尔％的2H-PoP。并入游离Co-卟啉的脂质体包含10摩尔％的Co-焦脱镁叶绿酸与85摩尔％的DOPC和5摩尔％的PEG-脂质。Co-NTA-脂质体是使用含有10摩尔％的二油酰-甘油-NTA(Avanti#790528P)的脂质体制备的。脂质体与20mg/mL氯化钴(II)孵育2小时，然后在PBS中透析。装载磺酰罗丹明B的脂质体如所示含有10摩尔％的PoP、35摩尔％的胆固醇(Avanti#700000P)、55摩尔％的DOPC和PEG-脂质。使用磺酰罗丹明B(VWR#89139-502)的溶液来水合脂质膜，然后将其冻融，然后进行声处理。用10mL Sephadex G-75(VWR#95016-784)柱去除未包埋的染料，然后在PBS中进行透析。对于双层完整性和定量细胞结合研究，使用了50mM染料，而显微镜研究使用10mM染料。
对于金涂层，使用60nm柠檬酸盐稳定的金纳米球(Ted Pella#15709-20)使由45摩尔％的二硬脂酰磷酸胆碱(Avanti#850365P)、45摩尔％的二硬脂酰磷酸甘油(Avanti#840465X)和10摩尔％的PoP构成的1mg脂质膜水合。在短暂的涡旋和声处理后，将样品以1500的相对离心力(rcf)反复离心15分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬并且再离心2次。将PoP金重悬在水中用于进一步分析。
多肽结合。在96孔板中，将1μg荧光报告蛋白与200μL PBS中的20μg脂质体孵育。用荧光酶标仪(Tecan Infinite II)定期测量FRET通道中的荧光(ex:430nm,em:525nm)。将数据相对于不添加脂质体的蛋白质中的FRET信号进行归一化。用2.5μg蛋白质进行EMSA试验，所述蛋白质与50μg脂质体孵育，然后在0.75％琼脂糖凝胶中以施加的50V电压电泳90分钟，并使用具有指定的激发和发射滤光片的IVIS Lumina II系统进行成像。对于血清稳定性测试，3mg蛋白质与60mg脂质体在40ul PBS中预孵育。孵育24小时后，加入40ul FBS并再孵育8h(小时)。对于咪唑置换实验，1μg报告蛋白与PBS中的20μg脂质体结合。然后滴定咪唑并用荧光评估结合。对于血清稳定性，将1μg报告蛋白与100μL PBS中的20μg脂质体结合，然后加入等体积的胎牛血清(VWR#82013-602)并用荧光监测结合。在将500ng肽与20μg脂质体孵育后，使用RGD-His FAM荧光团淬灭评估肽结合。
靶向实验。U-87细胞株和MCF-7细胞株从ATCC获得并根据供应商方案进行培养。将2×104个细胞播种在96孔板孔中，过夜。使500ng RGD-His肽与20μg装载磺酰罗丹明B的脂质体结合，将脂质体与细胞孵育2小时。去除培养基，用PBS洗涤细胞3次，然后用1％TritonX-100溶液裂解细胞和脂质体。通过测量磺酰罗丹明B的荧光来评估脂质体吸收。
对于共聚焦成像，将104个细胞播种在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中的Nunc腔室载玻片(Nunc#155411)中，过夜。将20μg脂质体加入到含有血清的培养基中并孵育2小时。去除培养基并用PBS洗涤细胞3次。添加新鲜培养基，并使用Zeiss LSM 710共聚焦荧光显微镜通过显微镜对细胞进行成像。金成像以相同的方式进行，但使用633nm光进行反向散射成像的激发和发射。肽结合后，将金离心以去除任何未结合的RGD肽。
对于体内实验，根据布法罗大学机构动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee，IACUC)的政策和批准进行动物程序。在5周龄雌性无胸腺裸小鼠(Jackson Labs)的侧腹接种U87细胞，并且当肿瘤生长达到4-5mm直径时治疗小鼠。小鼠静脉注射200μL装载磺酰罗丹明B的脂质体(1mg/mL脂质)，靶向有或没有cRGD-his。注射后45分钟处死小鼠，收集器官，称重，在0.2％Triton X-100溶液中机械匀浆，并评估荧光以确定生物分布。
疫苗接种。除非另有说明，否则8周龄雌性BALB/c小鼠(Harlan Laboratories)在第0天和第14天接受50μL无菌PBS中含有25μg MPER肽的后腹足垫注射。在指明的情况，注射还包括在包含摩尔比为50:30:5:5的DOPC:胆固醇:MPL:PoP的脂质体中的25μg MPL(Avanti#699800P)或TDB(Avanti#890808P)。对于弗氏佐剂，将肽直接混合在弗氏完全佐剂(Fisher#PI-77140)中并注射。第一次注射后4周，或如指示的，从下颌下静脉收集血液，在血液凝固并以2000rcf离心15分钟后获得血清，储存在-80℃。
在链霉亲和素涂覆的96孔板(GBiosciences#130804)中通过ELISA评估抗MPER滴度。将100μL含有0.1％吐温20的PBS(PBS-T)中的1μg无His标签的MPER-生物素在孔中在37℃孵育2小时。然后将孔用PBS-T洗涤5次，并将小鼠血清在含有0.1％酪蛋白的PBS(PBS-C)中连续稀释，并在37℃孵育30分钟。将孔用PBS-T洗涤5次，然后将100μL用PBS-C稀释的山羊抗小鼠IgG-HRP(GenScript#A00160)加入孔中以提供含有终浓度为1μg/mL的二抗并在37℃孵育30分钟。将孔用PBS-T洗涤5次，然后将100μL四甲基联苯胺底物溶液(Amresco#J644)加入到每个孔中并在37℃孵育20分钟。用100μL 1M HCl终止反应，并在450nm处测量吸收。滴度定义为稀释度的倒数，在该稀释度下，450nm处吸光度超过无血清背景的相同稀释度大于0.05的吸光度单位。每个样品从重复测量中取平均值。
病毒进入实验。如先前所述进行病毒进入实验。简而言之，通过在293T细胞中共转染pHXB2-env和pNL4-3.HSA.R-E-产生HIV-1。转染后2天，将细胞培养基通过0.45μm过滤器并离心。将病毒沉淀物干燥，重悬在600μL PBS中并储存在-80℃。如先前所述，通过X-Gal染色确定HIV-1原液的感染滴度。
合并来自用MPER和CoPoP脂质体免疫的3只小鼠的血清，并根据供应商方案使用固定蛋白G珠粒(VWR#PI20398)分离IgG。用Bradford测定法通过吸收测定浓度。2F5是从免费的NIH AIDS试剂项目中获得的。在感染前一天将每孔1×104个TZM-bl受体细胞铺板到96孔板。将HIV(感染复数为0.1)与抗体在37℃孵育30分钟，添加到细胞并在25℃以1000rcf离心(spinoculated)1小时，然后在5％CO2培养箱中37℃进一步孵育2天。然后根据制造商方案使用CellTiter-Fluor Assay(Promega)测量细胞活力。然后根据制造商方案通过萤光素酶测定系统(ONE-Glo,Promega)测量病毒进入水平，并相对于仅病毒样品进行归一化。将数据相对于细胞活力(所有组表现出的活力都在对照未处理细胞的10％以内)进行归一化。
结果
带His标签的蛋白质与CoPoP脂质体的结合。使用过渡金属Co、Cu、Zn、Ni和Mn生成了一系列sn-1-棕榈酰sn-2-焦脱镁叶绿酸磷脂酰胆碱螯合物(图1c)。然后通过挤出到100nm脂质体中，用10摩尔％的金属-PoP连同85摩尔％的二油酰磷酸胆碱(DOPC)和5摩尔％的聚乙二醇缀合的二硬脂酰磷酸乙醇胺(PEG-脂质)形成PoP双层。用荧光报告蛋白评估带His标签的蛋白质与PoP双层的结合。如图2a所示，该系统包含由两种连接的荧光蛋白构成的融合蛋白；Cerulean(蓝色发射)和Venus(绿色发射)。由于它们连接的接近度和光谱重叠，Cerulean作为Venus的
Figure BDA0003443623140000231
共振能量转移(FRET)供体，因此Cerulean激发导致来自Venus的FRET发射。将Cerulean的C末端用七组氨酸标签标记。然而，如果结合到PoP双层，来自Cerulean的能量转移被转向到双层本身，其在Cerulean发射范围内吸收，从而竞争与Venus的FRET。另一方面，由于Venus不直接连接在光子双层，其在直接激发时不会完全淬灭，这使得能够追踪结合的融合蛋白。
开发了3色电泳迁移率位移测定(EMSA)以评估报告融合蛋白与各种PoP脂质体的结合。将2.5μg蛋白质与50μg的各种PoP脂质体孵育24小时，然后进行琼脂糖凝胶电泳。如图2b中的顶部图像所示，当对PoP-脂质体成像时，只有游离碱(2H)脂质体容易可视化，而Zn-PoP脂质体的可视化程度较低。这表明金属对PoP具有淬灭作用，并证实它们稳定螯合在双层中。正如预期的那样，脂质体由于其相对较大的尺寸而表现出最低程度的电泳迁移率。接下来，使用Cerulean激发和Venus发射对同一凝胶进行成像，以探测对FRET的抑制，这将表明融合蛋白与PoP脂质体的结合。所有样品都表现出相同数量的FRET并作为游离蛋白质迁移相同的距离，除了与CoPoP脂质体孵育的蛋白质，在后一种情况，FRET完全消失(中图)。为了验证蛋白质的存在，Venus被直接激发并成像。仅CoPoP脂质体是与脂质体共定位的报道的蛋白质。总之，这些图像表明蛋白质与CoPoP脂质体定量结合。基于溶液的研究证实了这一发现(图2c)。在检查的所有类型的PoP脂质体中，由于与脂质体的结合，只有CoPoP脂质体导致Cerulean和Venus之间的FRET效率急剧下降。结合需要大约一天才能完全完成，但达到50％结合的时间(t1/2)仅为3小时。2H-PoP双层的分子动力学模拟表明，卟啉的中心(金属螯合发生的地方)无法进入双层周围的水相。因此，这种缓慢的结合可归因于His标签，该标签被蛋白质的其余部分部分遮蔽，并且不得不进入掩蔽的疏水双层。
多组氨酸与CoPoP配位。His标签与固定金属结合的潜在机制涉及金属与组氨酸残基的含氮咪唑基团的配位。His标签没有与Ni(II)、Cu(II)、Zn(II)和Mn(II)PoP形成的脂质体结合可能与轴向配体结合亲和力或卟啉内的配位数有关。例如，有提出Ni(II)和Cu(II)卟啉螯合物可以与周围的4个大环氮原子完全配位，而无需轴向配体。对于Zn(II)和Mn(III)卟啉，配体结合强度可能不足以赋予稳定的多组氨酸结合。
为了确定CoPoP的电子状态，评估了顺磁性。由于Co(II)是顺磁性的，而Co(III)卟啉是低自旋和反磁性的，因此使用NMR来探测由顺磁性物质引起的峰展宽。如图2d所示，基于PoP中乙烯基的每个碳的氢，仅对于CoPoP并且仅在有机溶剂中观察到宽峰展宽。当CoPoP形成水性脂质体时，峰变窄，表明在双层内氧化为反磁性Co(III)。为了进一步验证这一机制，在CoPoP脂质体定量结合荧光标记的带His标签的肽后，将还原剂亚硫酸钠添加到CoPoP脂质体中。如图2e所示，2M亚硫酸盐诱导肽从CoPoP脂质体释放。也与市售Ni-NTA脂质形成了脂质体。带His标签的肽与Ni-NTA脂质体的结合力不强。在向系统中加入亚硫酸盐后，没有观察到肽的释放，正如对不能被轻易还原的Ni(II)所预期的。总之，这些数据表明CoPoP在形成CoPoP脂质体后从Co(II)转变为Co(III)，并且多组氨酸咪唑基团在双层中与PoP中的螯合Co(III)配位。
His标签与CoPoP脂质体的稳定结合。然后使用荧光报告蛋白来比较带His标签的蛋白质与并入CoPoP或Ni-NTA-脂质的脂质体的结合(图3a)。Ni-NTA脂质体包含10摩尔％的2H-PoP，以实现基于FRET的蛋白质结合测定。通过EMSA，当在没有脂质体孵育时或当与2H-PoP脂质体孵育时，在FRET通道和蛋白质通道中蛋白质迁移不受阻碍。当与Ni-NTA脂质体孵育时，蛋白质的迁移仅受到轻微抑制，表明蛋白质结合无法承受电泳条件。FRET通道未淬灭，证实与Ni-NTA脂质体没有结合。相比之下，当与CoPoP脂质体孵育时，蛋白质稳定结合，FRET通道完全消失，电泳迁移率降低，这与蛋白质保持与脂质体结合一致。
对于生物医学应用，使用Ni-NTA-脂质的一个难以处理的障碍是它无法在生物介质如血清中保持稳定的His标签结合。为了检查脂质体是否能在血清存在下保持结合，将胎牛血清以1:1的体积比添加到已结合带His标签的蛋白质的脂质体溶液中。如图3b所示，Ni-NTA脂质体并未完全螯合(sequester)所有蛋白质，这与EMSA结果中表现的弱结合一致。此外，在血清添加后，所有结合在24小时内都消失了。在相同条件下，CoPoP脂质体稳定螯合带His标签的报告蛋白，而没有大量蛋白质释放。
由于组氨酸侧链包含咪唑基团，因此使用咪唑竞争测定来比较Ni-NTA和CoPoP脂质体与带His标签的多肽的结合稳定性。如图3c所示，即使在接近1M咪唑的浓度，CoPoP脂质体也能保持超过75％的与报告蛋白的结合。这代表了相对于结合研究中使用的100nM蛋白质浓度过量约1000万倍的咪唑。相比之下，Ni-NTA脂质体在存在仅30mM咪唑的情况释放了超过90％的His标签。CoPoP脂质体与His标签的显著更强的结合可能归因于至少两个因素；Co(III)与咪唑基团的优异稳定螯合和CoPoP双层的保护性疏水环境，其限制了接近竞争性外部分子。
利用Ni-NTA-脂质、钴螯合的Co-NTA-脂质和CoPoP形成的脂质体可以结合溶液中的荧光肽(图7a)。然而，在凝胶过滤色谱期间，Co-NTA和Ni-NTA的结合并未保持(图7b)。当在血清中孵育时，由Co-NTA和Ni-NTA形成的脂质体释放了肽，但是由CoPoP形成的脂质体没有释放肽(图7c)。这证明了双层限制的多组氨酸结合的重要性。我们接下来检查了CoPoP是否是在血清中稳定结合所需要的，或者简单的脂质体插入的钴卟啉(Co-pyro)是否就足够了。初始结合后，与血清孵育导致多肽从脂质体中置换出来(图8)。这一结果与最近的证明一致，即膜插入的卟啉，而不是PoP，与血清成分迅速交换并离开脂质体。这些结果共同表明CoPoP在稳定结合带His标签的多肽方面的重要作用。
肽与CoPoP脂质体的结合
肽靶向已引起用作疾病和组织特异性“邮政编码”的兴趣。在纤连蛋白和玻连蛋白中发现的短RGD三肽是一种很有前途的靶向配体，因为其有效地与肿瘤内皮细胞上表达的整合素αVβ3结合。检查CoPoP脂质体以验证它们是否可以通过具有短线性氨基酸序列GRGDSPKGAGAKG-HHHHHHH(SEQ ID NO:1)的带His标签的配体方法递送至靶细胞上的分子受体。将羧基荧光素(FAM)在N端进行标记，以便能够通过FRET检测与PoP脂质体的结合。已经表明，线性RGD肽可以用荧光团标记，而不会破坏整联蛋白的结合。如图4a所示，当该肽与各种金属-PoP脂质体孵育时，只有CoPoP脂质体与肽结合。与蛋白质结合相比，肽结合快约五倍。据推测，肽的更小尺寸、更快的分子运动和减少的空间位阻使得能够更快地交错进入双层以与CoPoP相互作用并不可逆地结合。根据之前的估计，每个～100nm脂质体包含约80,000个脂质，这相当于每个脂质体8000个CoPoP和750个肽。由于每个肽含有7个组氨酸残基，因此双层中CoPoP与组氨酸的比率为1:0.66。对于与Ni-NTA结合的常规His标签，在其His标签中的所有残基中，认为只有第i个和i+2或i+5个组氨酸残基参与与金属的配位。CoPoP双层中的卟啉和多组氨酸密度可能更高，因此配位机制可能不同。
检查了His标签长度对肽与CoPoP脂质体结合的影响。合成了一系列N端FAM标记的肽，其C端连接有不同长度的His标签。如图4b所示，当从肽中省略His标签时，没有观察到肽结合。具有2个组氨酸残基，结合缓慢，结合t1/2接近10小时。随着His标签长度的增加，结合速度迅速增加。具有6个残基，对应于常见的六组氨酸标签，结合t1/2不到一小时。通过将His标签长度增加到10个残基，结合t1/2减少到20分钟。
接下来，改变脂质组成以确定膜流动性对His标签结合的影响。脂质体由90摩尔％的DSPC、DMPC或DOPC连同10摩尔％的CoPoP形成。或者，将50摩尔％的胆固醇并入双层中，其中相应减少标准脂质的用量。DSPC在室温形成刚性的凝胶相双层，而DMPC和DOPC具有较低的转变温度并处于液晶相。胆固醇在双层中占据空间并且可以对膜流动性产生调节作用。有趣的是，在与具有或不具有胆固醇的不同组成的膜的肽结合率方面，没有观察到重大差异(图4c)。肽结合过程可能发生在多步骤过程中，并且一旦肽开始插入双层，多组氨酸的配位作用就不受脂质组成的影响。然而，在5mg/mL牛血清白蛋白(BSA)中，观察到具有和不具有胆固醇的膜之间的显著差异(图4d)。在无胆固醇的脂质体中较慢的结合可能是由于BSA与膜的更大相互作用，其干扰了肽结合。50mg/mL的BSA未达到结合半衰期，并且血清完全抑制结合(图9图10)。
装载货物的脂质体的生物靶向。鉴于带His标签的肽对脂质体的结合功效，评估了双层完整性以确定肽结合是否诱导膜不稳定。脂质体的水性核心装载有自淬灭浓度的有荧光团磺酰罗丹明B(一种水溶性染料)以探测膜透化。如图5a所示，装载染料的脂质体在8小时内没有释放大量染料，其中肽与脂质体完全结合。在24小时时，与肽结合的CoPoP脂质体释放了不到10％的染料。因此，His标签的插入和结合过程足够温和且无破坏性，因此双层完整性和包裹的货物保持完整。类似的棕榈酰化脂肽在孵育后导致装载货物的脂质体的透化(图11)，进一步证明了His-tag方法的稳健性。
接下来，利用已建立的U87胶质母细胞瘤细胞(RGD结合)和MCF7乳腺癌细胞(RGD非结合)的配对细胞株评估了RGD修饰的脂质体是否可以结合到它们的分子靶标上。在磺酰罗丹明B包埋后，脂质体首先与带His标签的RGD肽孵育，然后与两种细胞株孵育。约550个肽连接到每个脂质体。通过在洗涤和裂解(以消除货物自淬灭的任何影响)后检查细胞中的荧光来评估脂质体吸收。如图5b所示，在与靶向CoPoP脂质体孵育的U87细胞中观察到高脂质体摄取，而与MCF7细胞发生的结合可忽略不计。如预期的，在没有RGD靶向配体的情况，任一细胞株都没有发生摄取。在脂质体制剂中包含PEG-脂质导致脂质体不靶向任一细胞株。很可能PEG的存在对直接连接到双层表面的肽有阻碍作用。过量游离RGD肽的存在可能抑制结合，证实了该方法的靶向特异性。共聚焦显微镜证实了这些结合结果(图5c)。尽管FAM标记的肽被PoP脂质体淬灭，但仍有足够的信号来验证靶向肽和脂质体货物二者的结合。货物和肽都被内化并在U87细胞中保持共定位。当CoPoP脂质体和靶向肽在临与U87细胞孵育之前混合时，靶向肽本身与U87细胞结合，但没有时间连接在脂质体上，这仍然是未靶向的。对于不结合肽的2H-PoP脂质体观察到相同的结果。当脂质体仅由1摩尔％的CoPoP形成时，肽结合得以保持(图12a)并保持与U87细胞的选择性结合(图12b)。将与带His标签的cRGD部分孵育的装载货物的脂质体静脉注射到携带U87肿瘤的裸小鼠体内。如图5d所示，静脉注射后45分钟，靶向脂质体累积在肿瘤中，活性是未靶向脂质体的2.5倍。这些数据表明，CoPoP脂质体可以在脂质体的核中装载货物，用带His标签的靶向肽标记而不会导致货物泄漏，并针对在体外和体内表达特定表面蛋白的细胞上表达的分子受体。
脂质体仅代表在生物医学应用中使用的所有类型的纳米材料的子集。CoPoP被评估为具有对His标签的选择性粘附的通用表面涂层。金纳米颗粒被用作模型纳米颗粒，因为它们已用于许多生物应用。使用对金纳米球进行脂质涂覆的已建立方案，使用柠檬酸盐稳定的60nm金分散体来使PoP脂质薄膜水合。在反复离心和重悬后，置换柠檬酸盐，导致纳米球聚集(图13a)。然而，在PoP-脂质的存在下，纳米球被涂覆并保持可分散。与柠檬酸盐稳定的金相比，PoP涂覆的纳米球具有稍大的流体动力学尺寸，对应于金上的双层涂层(图13b)。His标签结合后涂层的存在不影响金在540nm处的等离子体峰，表明配体结合的温和性质(图13c)。如图13d所示，仅RGD-His CoPoP涂覆的金纳米颗粒靶向U87细胞，游离RGD抑制结合，如反向散射显微镜确定的那样。仅CoPoP金以及带有RGD-His肽的2H-PoP涂覆的金在靶向U87细胞方面是无效的。
抗原性脂质体的开发。许多广泛中和HIV病毒进入的单克隆抗体(例如2F5、Z13和4E10)靶向gp41包膜蛋白的膜近端外部区域(MPER)中的保守线性表位，使MPER成为HIV肽疫苗的主要靶点。然而，其仅在病毒进入期间暴露，并且使用MPER肽产生中和抗体的尝试已面临挑战。这产生了这样一种范式，即疫苗接种策略应考虑抗体与MPER所存在的脂质双层的相互作用。我们利用了含有Toll样受体4(TLR-4)激动剂单磷酰脂质A(MPL)的脂质体与结合脂质体的MPER肽序列。然而，使用基于MPER带His标签的多肽与Ni-NTA脂质体结合的简单锚定技术会产生低抗体滴度。我们开始研究CoPoP脂质体是否可以增强相同的方法。
脂质体-肽疫苗接种系统与MPER-His序列NEQELLELDKWASLWNGGKGG-HHHHHHH(SEQID NO:11)一起使用。MPER-His肽与含有MPL的CoPoP脂质体结合。向BALB/c小鼠和无胸腺裸小鼠施用含有25μg MPER-His和25μg MPL的单次注射。这在BALB/c小鼠和裸小鼠二者中引起了104的滴度，证明了强烈的体液免疫应答(图6a)。这可能是重要的，因为HIV会感染辅助T细胞群，从而使B细胞介导的应答变得重要。加强注射后，无胸腺裸小鼠的抗MPER滴度不受影响，但在健康小鼠中，滴度增加了一个数量级，表明T细胞介导的记忆效应。因此，疫苗接种方案导致B细胞和T细胞二者介导的免疫。
接下来，检查了各种疫苗组分以更好地确定免疫应答的特异性(图6b)。MPER-His肽在单独注射、在弗氏完全佐剂中注射或与含有MPL的2H-PoP脂质体一起注射时不会引发任何抗体。有趣的是，当肽与缺乏MPL的CoPoP脂质体一起施用时，也没有产生任何抗体。另一种脂质佐剂海藻糖二山萮酸酯(trehalose dibehenate，TDB)也未能引发任何抗体产生。TDB不作用于TLR-4，这强调了MPL在脂质体疫苗系统免疫激活中的重要性。当使用与Ni-NTA脂质体结合的MPER-His时，实现了小于103的弱抗体滴度，与之前的报告一致。然而，当使用CoPoP脂质体时，观察到了2个数量级的更强响应。据推测，体内肽与脂质体的稳定结合直接导致了这种效果。CoPoP免疫策略是有效的，抗体滴度持续至少3个月，而1个月后用Ni-NTA脂质体未检测到抗体(图6c)。
合并来自小鼠的疫苗接种后血清并使用蛋白G琼脂糖纯化以产生纯化的IgG。然后将其用于评估对HIV病毒进入的抑制作用(图6d)。当来自疫苗接种小鼠的纯化IgG以0.2mg/mL的终浓度使用时，病毒进入被抑制了超过75％。这种抑制作用的功效大于广泛中和单克隆抗体2F5以2μg/mL浓度孵育时的抑制作用，但是小于2F5以20μg/mL浓度孵育时的抑制作用。这些数据显示了利用具有HIV衍生肽的CoPoP脂质体来诱导可以阻止病毒进入的抗体产生的疫苗接种方法的潜力。
实施例2
在该实施例中，开发了使用带his标签的Pfs25和含有CoPoP和MPLA的脂质体的疫苗，Pfs25是源自恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的重组蛋白。
脂质体制备。为了产生CoPoP和2H-PoP脂质体，将1,2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、胆固醇(CHOL)、单磷酰脂质A(MPLA)和CoPoP(或2H-PoP)以指定的摩尔比(表2)溶解在氯仿中。在氮气流和真空过夜后形成干燥的脂质膜，并在PBS中再水合至最终脂质浓度为3mg/mL。将脂质体混悬液使用冰冷的CO2/丙酮和水浴进行11次冷冻/解冻循环，然后在60℃通过200nm聚碳酸酯膜挤出10次。
将Psf25昆虫蛋白(从超级sf9细胞中纯化的重组亚基Pfs25，通过BCA测定确定的浓度为1mg/mL)与脂质体合并，在4℃过夜(20小时)。在H2O中孵育的Psf25作为对照。BSA与脂质体合并作为阴性对照。Psf25蛋白与脂质体的结合通过微量离心过滤法测定。
表2.用于每只小鼠注射的Psf25 CoPoP/MPLA脂质体的制剂
每只小鼠注射剂量 DMPC CHOL CoPoP MPLA Psf25
摩尔比 55 35 5 5
μg/50μl 84.6 30.7 12.1 20.0 5/0.5/0.05
nmole 127.75 79.39 11.34 11.34 0.25/0.025/0.0025
用于结合的微量离心过滤。将具有CoPoP的Psf25蛋白、具有标准PoP(无钴)的Psf25蛋白和具有水的Psf25蛋白放入Nanosep离心装置(100K，OMEGA)中。该装置在使用前用QH2O冲洗并以1100rpm离心3min。添加每个样品并以1400rpm旋转3min。该装置用QH2O洗涤两次并以1400rpm离心3min(分钟)。收集来自底部滤液的样品，并通过测量562nm处的吸光度的BCA测定(Thermo cat.23235)分析蛋白质浓度。
疫苗接种。在第0天和第21天，CD-1小鼠(8周雌性，Envigo)接受5、0.5和0.05μgPsf25蛋白的肌肉注射(i.m.)。在指明的情况，注射还包括并入脂质体中的20μg MPLA(Avanti No.699800P)。ISA720也用作佐剂，与5μg Psf25蛋白孵育。治疗组及流程图见表3。
表3.血清IgG滴度的治疗组(每组n＝10只小鼠)。
CoPoP/MPLA Psf25(ug) ISA720
组1(G1) + 5 -
组2(G2) + 0.5 -
组3(G3) + 0.05 -
组4(G4) + 0 -
组5(G5) - 5 -
组6(G6) - 5 +
通过ELISA测定血清抗Psf25 IgG水平。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)在96孔板(Thermo,Maxisorp)中评估抗Psf25滴度。将100μl涂层缓冲液(3.03g Na2CO3和6.0gNaHCO3/1L蒸馏水，pH 9.6)中的带His标签的Psf25(0.1μg)在孔中在4℃孵育过夜。孔用含有0.1％吐温的PBS(PBS-T)洗涤3次，用含有0.1％酪蛋白的PBS(PBS-C)封闭，然后孵育2h。将孔然后用PBS-T洗涤3次，将山羊抗小鼠IgG-HRP(GenScript No.A00160)在PBS-C中稀释至1μg/ml，并且添加到各孔中。在添加四甲基联苯胺(Amresco No.J644)之前，将孔再次用PBS-T洗涤6次。
结果。
Psf25蛋白质涂覆后脂质体和蛋白质结合能力的表征。通过动态光散射测量Psf25蛋白结合之前和之后CoPoP脂质体的平均尺寸分别为122.9和139nm(图14B)，具有约0.05的相似多分散指数，表明结合后具有高单分散性的有利脂质体尺寸。此外，为了研究Psf25蛋白是否与CoPoP脂质体有效和特异性结合，我们将Pfs25与CoPoP脂质体或2H-PoP脂质体在4℃孵育过夜，然后微量离心过滤以确定蛋白质与脂质体的结合。根据通过BCA测定检测到的滤液中Pfs25的量，大多数Psf25结合CoPoP脂质体(99.27％)，而不是2H-Pop脂质体(12.33％)。Pfs25与CoPoP脂质体的结合为约99％(图14A)。
抗Pfs25 IgG水平。
将CD-1小鼠在第0天(初免)和第21天(加强)通过i.m.用缀合有或没有Psf25(浓度为5、0.5和0.05μg)的CoPoP/MPLA/Pfs25脂质体或用游离Psf25(有或没有ISA70)进行疫苗接种。在第20天和第42天，收集血清并通过ELISA测定抗Psf25 IgG滴度(图15A和图15B)。在5μg和0.5μg Psf25缀合组中，使用CoPoP/MPLA/Psf25脂质体加强前的小鼠在血清中显示出类似的IgG水平。对于每个治疗组，通过Psf25(plant)ELISA测试了抗Psf25 IgG血清样品的不同稀释度(从1/1000开始)(表3)。在这里，截止点设置在O.D.等于0.5。数据显示，在G1和G2中，加强后IgG滴度从1/5000变为1/45000，这代表与5或0.5μg Psf25蛋白缀合的CoPoP/MPLA/Pfs25脂质体(表3)。另一方面，与0.05μg Psf25蛋白缀合的CoPoP/MPLA/Pfs25脂质体的IgG滴度在加强后从1/1000变为1/15000，在G6中显示类似结果，其代表与ISA70孵育的5μg Psf25蛋白。该数据也反映在图16中，该图显示CoPoP/MPLA脂质体中0.05ug Pfs25的滴度，其比ISA720中的5μg Pfs25产生更高的滴度。
实施例3
在该实施例中，开发了一种脂质体疫苗，该疫苗利用含有源自恶性疟原虫的环子孢子蛋白的重复NANP序列的合成的带his标签的肽。脂质体具有与实施例1相同的组成，但使用肽而不是蛋白质。检查的肽示出在图17A中。通过动态光散射测量的不同NANP结合之前和之后CoPoP脂质体的平均尺寸分别为122.9和139nm(图17B)，具有约0.05的相似多分散指数，显示结合后具有高单分散性的有利脂质体尺寸。此外，为了研究NANP肽是否与CoPoP脂质体有效和特异性结合，我们将NANP肽与CoPoP脂质体或2H-PoP脂质体在4℃℃孵育过夜，然后微量离心过滤以确定肽与脂质体的结合。根据通过BCA测定检测到的滤液中肽的量，大量NANP结合CoPoP脂质体(不同长度的肽中约80％)，而不是2H-Pop脂质体(小于20％)。在所有不同长度的肽中，NANP与CoPoP脂质体的结合为约80％。(图17C)
实施例4
在该实施例中，使用含有磷脂酰丝氨酸(PS)的CoPoP脂质体来减少对带His标签的呈递分子的抗体应答。脂质体由10:30:30:30的CoPoP:磷脂酰丝氨酸:DOPC:胆固醇通过薄膜水合和挤出形成。然后使带His标签的MPER与脂质体结合。在用MPER修饰的CoPoP/MPLA脂质体进行疫苗接种前4周和2周，将这些PS脂质体通过足垫注射到小鼠体内。如图18所示，用PS脂质体预处理导致针对MPER的IgG滴度降低。
实施例5
在该实施例中，CoPoP脂质体通过带his标签的细胞穿透肽靶向细胞。获得以下带his标签的细胞穿透肽：HHHHHHHGRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:13)(TAT肽)；HHHHHHHRRRRRRRRR(SEQ ID NO:14)(R8肽)；HHHHHHHRQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:15)(PEN肽)。如图19所示，在与含有[2:5:30:63][PoP:CoP:CHOL:DMPC]的CoPoP脂质体直接进行水性孵育后，这些脂质体可以在与U87细胞孵育1小时后结合并被摄取。
实施例6
在该实施例中，CoPoP脂质体与融合前RSV抗原(带his标签的抗原，RSV的DS-Cavl)一起使用。带His标签的抗原可与CoPoP/PHAD系统一起使用，以产生功能性抗体。
抗原DS-Cavl是RSV病毒表面上F蛋白的融合前形式。已显示带His标签的DS-Cav1诱导针对RSV A2的中和抗体。
通过抗原和脂质体的简单混合来使CoPoP脂质体结合带his标签的蛋白质，使得所得脂质体被以均匀的方向呈现的构象完整的抗原修饰。抗原结合在生物环境中是非共价稳定的。这表明(利用另一种带his标签的抗原Pfs25，一种疟疾传播阻断抗原)，CoPoP脂质体导致在体外和体内改善的向抗原呈递细胞的抗原递送。
表明带his标签的DS-Cav1有效结合CoPoP脂质体。使用CoPoP和PoP(也称为2H)制备50μL体积的抗原-脂质体溶液并稀释至200μL。还制备了不含抗原的脂质体和不含脂质体的抗原的参考样品。样品以20,000rcf离心90分钟，并且从所得脂质体沉淀物提取上清液。添加等体积的BCA，使总体积为400μL。然后将样品在60℃的水浴中孵育10分钟。将每个样品以100μL体积转移到96孔板的3个孔中，并在562nm处测量吸光度。抗原-脂质体上清液和仅脂质体的参考样品之间的吸光度差异用于计算结合百分比，较高的吸光度对应于上清液中较高的蛋白质浓度并且因此较少的结合。
然后向小鼠注射与六种佐剂之一联合的RSV抗原：具有PHAD的CoPoP、不含PHAD的CoPoP、具有PHAD的2HPoP、氢氧化铝(Alum)、Sigma佐剂系统(SAS)和AddaVax。当小鼠用RSV进行疫苗接种时，所有注射了含有CoPoP/PHAD颗粒的RSV疫苗的小鼠在接受加强疫苗接种之前都表现出可检测的IgG抗体滴度(图21A)。相比之下，其余五组中只有总共两只小鼠表现出可检测的IgG滴度。接受加强疫苗接种两周后，疫苗接种CoPoP、2HPoP和SAS的小鼠的IgG滴度均显著增加；然而，具有PHAD的CoPoP仍然是诱导抗体产生的最有效制剂(图21B)。CoPoP/PHAD组的平均抗体滴度超过了其它五组，并且CoPoP/PHAD是唯一没有小鼠在接受加强注射后对疫苗没有反应性的组。
使用在初次注射后35天从小鼠采集的血清进行RSV中和测定(图21C、D)。测定结果表明，响应于CoPoP/PHAD疫苗产生的抗体在中和A型和B型RSV方面比任何其他它疫苗组更有效。从数据中可以得出结论，与替代佐剂如Alum、SAS和AddaVax相比，CoPoP/PHAD的表现更佳。此外，CoPoP脂质体和CoPoP的单独PHAD佐剂成分都不足以提高有效性；这些结果只能归因于新CoPoP/PHAD制剂的综合作用。
实施例7
在该实施例中，CoPoP脂质体与莱姆病抗原OspA一起使用。带His标签的抗原可与CoPoP/PHAD系统一起使用，以产生功能性抗体。
OspA是莱姆病抗原。生成了基于B31毒株蛋白质序列而没有脂质尾部的带His标签的OspA，并如图22所示对其进行了纯化。
脂蛋白体的自发形成通过将组氨酸标签插入疏水双层中并随后使咪唑部分与金属中心配位而发生。结合条件使用非变性电泳进行评估，由于丙烯酰胺凝胶的孔尺寸有限，因此可以物理分离脂质体结合蛋白质和游离蛋白质。观察到的PHAD:OspA的4:1最佳结合质量比(图23A)与先前使用疟疾抗原Pfs25的研究一致。将80μg/mL OspA与等体积的320μg/mLCoPoP脂质体孵育需要在室温孵育三个小时(图23B)。丙烯酰胺凝胶的目视检查表明，结合动力学在15分钟后开始趋于稳定，这可能是由于随后与附近未缀合位点结合的位阻所致。根据时间点0和15分钟的相对条带强度，可以推断出结合的初始阶段以较快的速度发生。在颗粒化条件下，根据高速离心获得的上清液的microBCA测定，估计特异性结合为约80％(图23C)。使用相同的方法，对缺乏螯合金属的PoP/PHAD脂质体观察到低非特异性结合。未带组氨酸标签的蛋白质溶菌酶既不能与CoPoP/PHAD脂质体结合也不能与PoP/PHAD脂质体结合。根据DLS测量，CoPoP/PHAD脂质体和PoP/PHAD脂质体二者的孵育后脂质体尺寸基本保持相同(图23D)。此外，透射电子显微照片显示CoPoP/PHAD脂质体在抗原结合后保持其形状(图23E)。
血清稳定性研究(图24A)表明，脂蛋白体与人在37℃孵育12天后没有显著增加荧光信号。这基本上表明，在研究期间，OspA仍然主要与金属螯合脂质体缔合。由于疏水性双层内金属螯合键的战略空间位置，与镍螯合的脂质体相比，CoPoP脂质体表现出稳定性提高了超过100倍。血清稳定的抗原结合确保脂蛋白体在转运至引流淋巴结期间的完整性。
先前使用类似纳米颗粒系统的研究证明了免疫原性和保护功效随纳米颗粒骨架的连接点的变化。这突出了在颗粒表面上适当抗原表位呈递的重要性。在这项研究中，多组氨酸标签被附加在与保护性表位位置相对的N端，以确保脂质体表面上的表位可及性，并避免重要的C端表位的可能闭塞。这种配置基本上模拟了与莱姆疏螺旋体外膜的脂蛋白整合。使用免疫沉淀法评估表位可用性表明LA-2表位暴露在表面结合的OspA上(图24B)。阴性对照是对非同源蛋白的单克隆抗体，其表现出低PoP荧光信号。这些结果间接证实了阐明重组OspA的二级结构的CD光谱测量中的发现。此外，LA-2抗体-OspA识别表明结合抗原的结构完整性在连接到脂质体后得以保持。
脂质体作为抗原递送囊泡的实际应用归因于其被抗原呈递细胞的摄取得到增强。使用鼠巨噬细胞样细胞的纳米颗粒内化研究(图24C)显示只有使用表面功能化的脂质体(CoPoP/PoP脂质体)的抗原摄取高。用游离的不添加佐剂或混合的非缔合(即PoP/PHAD)形式的抗原观察到最低限度的摄取。这些结果证实了证明纳米颗粒形式的抗原内化增强的研究。混合形式的PoP/PHAD脂质体的巨噬细胞选择性摄取进一步暗示抗原与脂质体的物理缔合对于脂质体佐剂性可能是必要的。将表面暴露的抗原和免疫刺激剂共同递送至免疫细胞是CoPoP/PHAD脂质体的一个重要方面。在细胞松弛素B存在下，抗原和脂质体的摄取减少支持通过吞噬作用进行的细胞摄取机制。
使用ELISA的免疫原性评估表明这种新疫苗平台可以在低抗原剂量下刺激强免疫应答。用CoPoP/PHAD脂质体进行的同源初免-加强疫苗接种引发了比其它商业佐剂更高的OspA特异性IgG抗体滴度(图25A)。此外，伯氏疏螺旋体B31细胞的表面标记(图25B)表明产生的OspA特异性抗体可以识别细胞表面上的表位，支持从免疫沉淀测定中获得的结果。荧光显微照片进一步揭示了由alum免疫诱导的抗OspA抗体的低功能性。使用来自CoPoP/PHAD免疫的抗血清的免疫印迹显示，OspA特异性抗体识别不同毒株的莱姆疏螺旋体，但程度不同(图22C)。不同的条带强度描述了OspA在不同基因种间的抗原异质性。缺乏ospa基因的阴性对照赫姆斯疏螺旋体(B.hermsii)没有明显的条带。对于具有带组氨酸标签的OspA的大肠杆菌裂解物，观察到最低程度的非特异性条带。对于OspA条带观察到的较低分子量是由于脂化信号序列被较短的多组氨酸片段替换。
在脂质体制剂中包含合成形式的单磷酰脂质A，PHAD，其是TLR-4激动剂，使免疫应答偏向Thl，将同种型转换为IgG2a。CoPoP/PHAD脂质体产生比IgG1更高水平的OspA特异性IgG2a抗体(图23A)。另一方面，Alum诱导更高水平的IgG1同种型。IgG2a同种型的优势至关重要，因为与IgG1同种型相比，该同种型具有更高的杀菌活性和更高的激活补体的能力。在脾细胞研究中观察到的CoPoP/PHAD脂质体的Th1偏向免疫应答与干扰素-γ比白细胞介素-4的更高刺激性相关(图23B)。
OspA特异性抗体根除螺旋体的能力使用杀菌测定来证明。与alum或PoP/PHAD脂质体相比，由CoPoP/PHAD-OspA免疫产生的抗体表现出更高的杀菌活性(图27)。计算出的CoPoP/PHAD脂质体的50％疏螺旋体滴度显著高于alum。
基于OspA的传播阻断疫苗非常依赖高水平的循环抗体。在不同时间点计算的ELISA滴度在一年后保持基本不变，表明图28中的抗体应答具有高持久性。
实施例8
在该实施例中，CoPoP脂质体与血凝素抗原和神经氨酸酶一起用于流感。带His标签的抗原可与CoPoP/PHAD系统一起使用，以产生功能性抗体。
流感血凝素(HA)是流感病毒的主要表面抗原和主要的疫苗靶标。我们获得了带His标签的H3毒株HA。如图29所示，带His标签的HA与CoPoP脂质体有效结合。
使用CoPoP和PoP(也称为2H)制备50μL体积的抗原-脂质体溶液并稀释至200μL。还制备了不含抗原的脂质体和不含脂质体的抗原的参考样品。样品以20,000rcf离心90分钟，并且从所得脂质体沉淀物中提取上清液。添加等体积的BCA，使总体积为400μL。然后将样品在60℃的水浴中孵育10分钟。将每个样品以100μL体积转移到96孔板的3个孔中，并在562nm处测量吸光度。抗原-脂质体上清液和仅脂质体的参考样品之间的吸光度差异用于计算结合百分比，较高的吸光度对应于上清液中较高的蛋白质浓度并且因此较少的结合。
如图30所示，用CoPoP脂质体和带his标签的HA免疫是高度有效的。
被动血清转移实验确定疫苗介导的保护至少部分是由于抗体产生(图31)。
然后使用多个带his标签的HA评估多路复用的能力。如图32A所示，各种HA和NA蛋白与CoPoP脂质体结合。免疫后，所有HA都可以产生具有最低程度交叉反应性的特异性抗体(图32B)。
实施例9
该实施例证明了不同类型的合成MPLA可用于本发明组合物和方法中，包括PHAD、PHAD-504和3D6A-PHAD。这些佐剂的结构如图33所示。脂质体由4:2:1:X的DPPC:胆固醇:CoPoP:MPLA形成，其中MPLA是这些类型的合成形式中的每一种，并且变量X是5、4、3、2、1。
如图34所示，包含所有类型的MPLA可产生脂质体并导致抗体产生，其如下通常高于省略MPLA(“CA”)。将带His标签的Pfs25以1:4质量比的抗原:CoPoP混合，并在第0天和第21天对小鼠进行免疫。在第42天收集血清，并评估血清的Pfs25结合IgG ELISA。
虽然已经通过特定实施方案描述了本发明，但是常规修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的并且这些修改旨在在本公开的范围内。
序列表
<110> 纽约州立大学研究基金会（University at Buffalo）
帕斯公司（Lovell, Jonathan）
<120> 包含钴卟啉-磷脂缀合物和多组氨酸标签的纳米结构
<130> 011520.01197
<140> US 16/399,581
<141> 2019-04-30
<150> US 15/566,140
<151> 2017-10-12
<150> 62148292
<151> 2015-04-16
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 荧光报告肽
<400> 1
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Lys Gly Ala Gly Ala Lys Gly His His His
1 5 10 15
His His His His
20
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> RGD肽
<400> 2
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Lys
1 5
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 荧光报告肽
<400> 3
Gly Arg Gly Asp Ser Pro Lys Gly Ala Gly Ala Lys Gly
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 带his标签的肽
<400> 4
Arg Gly Asp Tyr His His His His His His His
1 5 10
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 荧光报告肽
<400> 5
Lys Lys Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 荧光报告肽
<400> 6
Lys Lys Gly Gly Gly Gly His His
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 荧光报告肽
<400> 7
Lys Lys Gly Gly Gly Gly His His His His
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 荧光报告肽
<400> 8
Lys Lys Gly Gly Gly Gly His His His His His His
1 5 10
<210> 9
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 荧光报告肽
<400> 9
Lys Lys Gly Gly Gly Gly His His His His His His His His
1 5 10
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 荧光报告肽
<400> 10
Lys Lys Gly Gly Gly Gly His His His His His His His His His His
1 5 10 15
<210> 11
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MPER肽
<400> 11
Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Gly Gly Lys Gly Gly His His His His His His His
20 25
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MPER肽
<400> 12
Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn
1 5 10 15
Gly Gly Lys
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞穿透肽
<400> 13
His His His His His His His Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg
1 5 10 15
Arg Pro Pro Gln
20
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞穿透肽
<400> 14
His His His His His His His Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 细胞穿透肽
<400> 15
His His His His His His His Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn
1 5 10 15
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
20

Claims (20)

1.一种脂质体，包含：
a)双层，其中所述双层包含：
i)磷脂，和
ii)卟啉，所述卟啉具有与其配位的钴以形成钴-卟啉；和
b)带多组氨酸标签的呈递分子，其中所述多组氨酸标签的至少一部分位于所述单层或所述双层的疏水部分中，并且所述多组氨酸标签的一个或多个组氨酸与所述钴-卟啉中的钴配位，
其中所述带多组氨酸标签的呈递分子的至少一部分暴露于所述脂质体的外部，并且所述带多组氨酸标签的呈递分子包含来自微生物的表位，并且其中所述脂质体包围水性隔室。
2.根据权利要求1所述的脂质体，其中所述微生物是病毒、细菌或寄生虫。
3.根据权利要求2所述的脂质体，其中所述表位来自呼吸道合胞病毒(RSV)、伯氏疏螺旋体或流感病毒。
4.根据权利要求3所述的脂质体，其中所述表位来自DS-Cav1、OspA、血凝素或神经氨酸酶。
5.根据权利要求1所述的脂质体，其中所述钴卟啉与磷脂缀合以形成钴卟啉-磷脂缀合物。
6.根据权利要求5所述的脂质体，其中所述钴卟啉-磷脂缀合物占所述单层或所述双层的1至25摩尔％。
7.根据权利要求6所述的脂质体，其中所述钴卟啉-磷脂缀合物占所述单层或所述双层的5至10摩尔％。
8.根据权利要求1所述的脂质体，其中所述双层还包含胆固醇和/或磷脂酰丝氨酸。
9.根据权利要求1所述的脂质体，其中所述多组氨酸标签包含6至10个组氨酸残基。
10.根据权利要求1所述的脂质体，其中所述脂质体的尺寸为50nm至200nm。
11.根据权利要求18所述的脂质体，其中所述佐剂是减毒脂质A衍生物或磷酸化六酰基二糖。
12.一种纳米结构，包含：
a)核；和
b)在所述核上的单层或双层，其中所述单层或双层包含：
i)磷脂单体，和
ii)卟啉，所述卟啉具有与其配位的钴以形成钴-卟啉；和
c)包含来自微生物的表位的带多组氨酸标签的呈递分子，其中所述多组氨酸标签的至少一部分位于所述单层或所述双层的疏水部分中，所述多组氨酸标签的一个或多个组氨酸与所述钴-卟啉中的钴配位，并且所述带多组氨酸标签的呈递分子的至少一部分暴露于所述纳米结构的外部。
13.根据权利要求12所述的纳米结构，其中所述核是金纳米颗粒。
14.根据权利要求12所述的纳米结构，其中所述微生物是病毒、细菌或寄生虫。
15.根据权利要求12所述的纳米结构，其中所述表位来自呼吸道合胞病毒(RSV)、伯氏疏螺旋体或流感病毒。
16.根据权利要求12所述的纳米结构，其中所述表位来自DS-Cav1、OspA、血凝素或神经氨酸酶。
17.一种用于在宿主个体中产生免疫应答的方法，包括向所述个体施用包含药物载体中的权利要求1所述的脂质体的组合物，其中所述呈递分子包含来自病毒、细菌或寄生虫的免疫原性表位。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述表位来自呼吸道合胞病毒(RSV)、伯氏疏螺旋体或流感病毒。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述表位来自DS-Cav1、OspA、血凝素或神经氨酸酶。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述个体是人或非人动物。
CN202080048088.8A 2019-04-30 2020-04-29 包含钴卟啉-磷脂缀合物和多组氨酸标签的纳米结构 Pending CN114502159A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/399,581 US11207421B2 (en) 2015-04-16 2019-04-30 Nanostructures comprising cobalt porphyrin-phospholipid conjugates and polyhistidine-tags
US16/399,581 2019-04-30
PCT/US2020/030537 WO2020223395A1 (en) 2019-04-30 2020-04-29 Nanostructures comprising cobalt porphyrin-phospholipid conjugates and polyhistidine-tags

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114502159A true CN114502159A (zh) 2022-05-13

Family

ID=73028666

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080048088.8A Pending CN114502159A (zh) 2019-04-30 2020-04-29 包含钴卟啉-磷脂缀合物和多组氨酸标签的纳米结构

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP3962477A4 (zh)
JP (1) JP2022530539A (zh)
CN (1) CN114502159A (zh)
AU (1) AU2020266139A1 (zh)
CA (1) CA3138856A1 (zh)
WO (1) WO2020223395A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023183287A2 (en) * 2022-03-21 2023-09-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Composite bioactive compositions and applications thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107708671A (zh) * 2015-04-16 2018-02-16 纽约州立大学研究基金会 包含钴卟啉‑磷脂缀合物和聚组氨酸标签的纳米结构
WO2018170260A1 (en) * 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3439693A4 (en) * 2016-04-05 2020-05-27 The Research Foundation For The State University Of New York University at Buffalo NEW PNEUMOCOCCAL VACCINE FORMULATIONS

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107708671A (zh) * 2015-04-16 2018-02-16 纽约州立大学研究基金会 包含钴卟啉‑磷脂缀合物和聚组氨酸标签的纳米结构
WO2018170260A1 (en) * 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
EP3962477A4 (en) 2023-05-03
AU2020266139A1 (en) 2021-12-02
JP2022530539A (ja) 2022-06-29
CA3138856A1 (en) 2020-11-05
EP3962477A1 (en) 2022-03-09
WO2020223395A1 (en) 2020-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107708671B (zh) 包含钴卟啉-磷脂缀合物和聚组氨酸标签的纳米结构
US11406597B2 (en) Fusogenic liposome-coated porous silicon nanoparticles
Vyas et al. Endogenous carriers and ligands in non-immunogenic site-specific drug delivery
BG61215B1 (en) Synthetic membrane vesicles containing functionally active fusion peptides as drug delivery systems
Van Herck et al. Nanomedicine-mediated alteration of the pharmacokinetic profile of small molecule cancer immunotherapeutics
Lara Liposomes as drug delivery systems
Norpi et al. New modular platform based on multi-adjuvanted amphiphilic chitosan nanoparticles for efficient lipopeptide vaccine delivery against group A streptococcus
US11207421B2 (en) Nanostructures comprising cobalt porphyrin-phospholipid conjugates and polyhistidine-tags
CN114502159A (zh) 包含钴卟啉-磷脂缀合物和多组氨酸标签的纳米结构
EP2896401B1 (en) Targeted drug delivery system for poorly soluble drug
Morilla et al. Liposomal pH-sensitive nanomedicines in preclinical development
US20170209605A1 (en) Carbohydrate functionalized catanionic surfactant vesicles for drug delivery
US20230390414A1 (en) Particle based formulation of sars-cov-2 receptor binding domain
Nahar et al. Self-assembled monovalent lipidated mannose ligand as a standalone nanoadjuvant
WO2017004518A1 (en) Site-targeted nano-liposomal nitroglycerin therapeutics
Stefanick Design of ligand-targeted nanoparticles for enhanced cancer targeting
Alharbi et al. Cholesterol as an inbuilt immunoadjuvant for a lipopeptide vaccine against group A Streptococcus infection
WO2024167958A1 (en) Antigen-capturing nanoparticles and formulations for immunotherapy
Platt Surface functionalization of liposomes with proteins and carbohydrates for use in anti-cancer applications
Rabinsky Effect of Protein Coatings on the Delivery Performance of Liposomes.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination