NO328824B1 - Vaksinesammensetninger som omfatter fusjonsproteiner av HIV-1 NEF-proteiner, fremgangsmate for fremstilling av vaksinesammensetning og protein samt nukleinsyre, proteiner og vert. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye HIV-proteinkonstruksjoner, deres anvendelse i farmasøytiske sammensetninger som inneholdende disse, samt metoder for deres fremstilling.

Spesielt vedrører oppfinnelsen fusjonsproteiner som omfatter HIV 1 Nef-proteiner.

HIV-1 er hovedårsaken til ervervet immunsviktsyndrom (AIDS) som betraktes som en av verdens største helseproblemer. Det utføres utstrakt forskning i hele verden for å produsere en vaksine, slike forsøk har hittil ikke hatt suksess.

Non-kappeproteiner til HIV-1 er beskrevet og inkluderer for eksempel interne strukturelle proteiner slik som produktene fra gag- og pol- genene og andre ikke-strukturelle proteiner slik som Rev, Nef, Vif og Tat (Greene et al., New England J. Med, 324, 5, 308 et seq (1991) og Bryant et al. (Ed. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 et seq

(1992).

Forskjellige måter å forsterke antistoffreaksjoner til et vaksinepreparat på er beskrevet

(G. Goldstein, Nature Medicine, vol.l, nr.9, sept., 1996 s. 960 - 4)

WO 9404686 Al beskriver nye transport polypeptider, metoder for å fremskaffe disse, transport av polypeptid lastekonjugater, i tillegg til farmasøytiske sammensetninger som inneholder disse.

Ekspresjon av Nef-proteinet er beskrevet av Bodeus et al.,(J Gen Virol. 1995 Jun;76 (Pt6): 1337-44) og Azad et al., (J Gen Virol. 1994 Mar;75 (Pt 3):651-5.

HIV Nef- og Tat-proteiner er tidlige proteiner, hvilket betyr at uttrykkes tidlig i infek-sjonsforløpet og i fravær av strukturelle proteiner.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en vaksinesammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter et protein som omfatter: a) et fullstendig HIV Nef-protein eller Nef-derivat med en C-terminal histidinhale, eller Nef som har gjennomgått delesjon, addisjon eller substitusjon av en aminosyre, der HIV Nef er koblet til enten

i) en fusjonspartner;

ii) en fusjonspartner utvalgt protein D eller lipoprotein D fra Haeophilium

Influenzae B eller et derivat av en av disse; eller

iii) et fullstendig HIV Tat-protein eller Tat-derivat med en C-terminal histidinhale, eller et mutert Tat som har gjennomgått delesjon, addisjon eller

substitusjon av en aminosyre, eller et mutert Tat som definert ifølge SEQ ID NO: 23; eller

b) et fullstendig HIV Nef-protein som definert ifølge aiii) som er koblet til

et protein eller lipoproteinfusjonspartner;

og en TH 1-induserende adjuvans i blanding med en farmasøytisk akseptabel eksipiens.

Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for å fremstille en vaksinesammensetning, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene å blande et protein som definert over med en TH 1-induserende adjuvans og en farmasøytisk akseptabel eksipiens.

Videre omfatter oppfinnelsen et protein, som tilveiebringer et fullstendig HIV Nef-protein eller Nef-derivat med en C-terminal histidinhale, eller Nef som har gjennomgått delesjon, addisjon eller substitusjon av en aminosyre koblet til et fullstendig HIV Tat-protein eller Tat-derivat med en C-terminal histidin-hale, eller et mutert Tat som har gjennomgått delesjon, adhesjon eller substitusjon av en aminosyre, eller et mutert Tat som definert ifølge SEQ ID NO: 23.

Oppfinnelsen omfatter også en nukleinsyre, kjennetegnet ved at den koder for et protein som tidligere nevnt og en vert, som er transformert med nevnte nukleinsyre,

samt en fremgangsmåte for fremstilling av nevnte protein kjennetegnet ved at den omfatter å tilveiebringe en vert som nevnt over og at nevnte protein uttrykkes og gjenvinnes.

Til slutt omfatter oppfinnelsen Nef-Tat-His- eller Nef-Tat-mutant-His-protein som tidligere nevnt eller nevnte nukleinsyre som har aminosyre- eller DNA-sekvensen vist i SEQ ID NO: 12, 13, 16, 17, 20,21,24 eller 25.

Ved "fusjonspartner" menes enhver proteinsekvens som ikke er Tat eller Nef. Fortrinnsvis er fusjonspartneren D eller det lipiderte derivat Lipoprotein D, fra Haemophilius in-fluenza B. Spesielt er det foretrukket at den N-terminale tredje, dvs. omtrent de første 100-130 aminosyrene blir benyttet. Dette er beskrevet her som Lipo D 1/3.1 en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen kan Nef-proteinet eller derivatet derav bli koblet til Tat-proteinet eller derivatet derav. Slike Nef-Tat-fusjoner kan eventuelt også bli koblet til en fusjonspartner, slik som protein D.

Fusjonspartneren blir normalt koblet til den N-terminale enden av Nef- eller Tat-proteinet.

Derivater som er omfattet av foreliggende oppfinnelse inkluderer molekyler med en C-terminal histidin-hale som fortrinnsvis omfatter mellom 5-10 histidin-residier. Generelt, blir en histidin-hale som inneholder n residier, beskrevet heri som His (n). Forekoms-ten av et histidin (eller "His") hale, hjelper til i rensingen. Mer spesifikt tilveiebringer oppfinnelsen proteiner med den følgende struktur:

Figur 1 tilveiebringer aminosyren (Seq. ID. No. 7) og DNA-sekvens (Seq. ID. No. 6) av fusjonspartneren for slike konstruksjoner.

I en foretrukket utførelsesform blir proteinene uttrykt med en Histidin-hale som omfatter mellom 5 til 10 og fortrinnsvis 6 histidin-residier. Disse er fordelaktige når det gjelder å hjelpe til ved rensing. Separat ekspresjon i gjær (Sacccharomyces cerevisiae), av Nef (Macreadie I.G. et al., 1993, Yeast 9 (6) 565-573) og Tat (Braddock M et al., 1989, Cell 58 (2) 269-79) har allerede blitt rapportert. Bare Nef-protein er myristilert. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer for første gang ekspresjonen av Nef og Tat separat i et Pichia-ekspresjonssystem (Nef-His- og Tat-His-konstruksjoner), og den vel-lykkede ekspresjonen av en fusjonskonstruksjon Nef-Tat-His. DNA og aminosyresek-vensene til representativt Nef-His (Seq. ID. No. 8 og 9), Tat-His (Seq. ID, No. 10 og 11) og av Nef-Tat-His-fusjonsproteiner (Seq. ID. No. 12 og 13), er fremsatt i figur 2.

Derivater omfattet av foreliggende oppfinnelse inkluderer også muterte proteiner. Betegnelsen "mutert" blir brukt her for å beskrive et molekyl som har gjennomgått delesjon, addisjon eller substitusjon av én eller flere aminosyrer ved å bruke velkjente teknikker for setedirigert mutagenese eller enhver annen konvensjonell metode.

Et mutert Tat er vist i figur 2 (Seq. ED. No. 22 og 23) som er en Nef-Tat mutant-His (Seq. ID. No. 24 og 25).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et DNA som koder for proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse. Slike sekvenser kan bli satt inn i en egnet ekspresjonsvektor og uttrykt i en egnet vert.

En DNA-sekvens som koder for proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan bli syntetisert ved å bruke standard DNA-synteseteknikker, slik som ved enzymatisk ligering som beskrevet av D.M. Roberts et al. i Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, ved kjemisk syntese, ved in vitro enzymatisk polymerisering, eller ved PCR-teknologi ved å bruke for eksempel en varmestabil polymerase eller ved en kombinasjon av disse teknikkene.

Enzymatisk polymerisering av DNA kan bli utført in vitro ved å bruke en DNA-polymerase slik som DNA-polymerase I (Klenow-fragment) i en egnet buffer som inneholder de nukleosid-trifosfater dATP, dCTP, dGTP og dTTP som kreves ved en temperatur på 10°-37°C, generelt i et volum på 50 (al eller mindre. Enzymatisk ligering av DNA-fragmenter kan utføres ved å bruke en DNA-ligase slik som T4 DNA-ligase i en egnet buffer, slik som 0,05M Tris (pH 7,4), 0,01M MgCl2, 0,01M ditiotreitol, ImM spermidin, ImM ATP og 0,1 mg/ml bovint serumalbumin, ved en temperatur på 4°C til omgivelsestemperatur, generelt i et volum på 50 ml eller mindre. Den kjemiske synte-sen av DNA-polymeren eller fragmenter, kan utføres ved konvensjonell fosfotriester-, fosfitt- eller fosforamidittkjemi, ved å bruke fastfaseteknikker som er beskrevet i "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual" (ed. H.G. Gassen og A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), eller i andre vitenskapelige publikasjoner, for eksempel M. J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat og R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982,10, 6243; B.S. Sproat og W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci og M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21,719; M.D. Matteucci og M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981,103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biemat, J. McMannus og H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; og H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801.

For fremstilling av et protein i følge oppfinnelsen, kan følgende prosessen anvendes:

i) å fremstille en replikerbar eller integrerende ekspresjonsvektor som er istand til, i en vertcelle, å uttrykke en DNA-polymer som omfatter en nuk-leotidsekvens som koder for proteinet eller et derivat derav,

ii) transformere en vertcelle med nevnte vektor,

iii) dyrke nevnte transformerte vertcelle under betingelser som tillater ekspresjon av nevnte DNA-polymer å produsere nevnte protein; og

iv) gjenvinne nevnte protein.

Denne fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres ved konvensjonelle, rekombinante teknikker slik som beskrevet i Maniatis et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.

Betegnelsen "transformering" blir brukt heri for å betegne introduksjon av fremmed DNA inn i en vertcelle. Dette kan oppnås ved for eksempel transformasjon, transfeksjon eller infeksjon med et egnet plasmid eller en viralvektor ved å bruke for eksempel konvensjonelle teknikker som beskrevet i Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman og A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988. Betegnelsen "transformert" eller "transformant" vil heretter bli brukt på de resulterende vertcellene som inneholder og uttrykker det fremmede genet av interesse.

Ekspresjonsvektorene er nye og en del av oppfinnelsen.

De replikerbare ekspresjonsvektorene kan fremstilles i samsvar med oppfinnelsen ved å kutte en vektor som er kompatibel med vertcellen for å tilveiebringe et lineært DNA-segment som har et intakt replikon. Deretter kombinere nevnte lineære segment med ett eller flere DNA-molekyler som, sammen med nevnte lineære segment, koder for det ønskede produktet, slik som DNA-polymeren som koder for proteinet fra oppfinnelsen eller derivat derav, under ligeringsbetingelsene.

På denne måten kan DNA-polymeren etter ønske utføres eller dannes under konstruksjonene av vektoren.

Valg av vektor vil bli bestemt delvis av vertcellen som kan være prokaryot eller eukary-ot, men fortrinnsvis E. coli eller gjær. Egnede vektorer inkluderer plasmider, bakterio-fager, kosmider og rekombinante virus.

Fremstilling av den replikerbare ekspresjonsvektoren kan utføres konvensjonelt med egnede enzymer for restriksjon, polymerisering og ligering av DNA, ved prosedyrer beskrevet i for eksempel Maniatis et al, sitert over.

Den rekombinante vertcellen blir fremstilt i samsvar med oppfinnelsen ved å transformere en vertcelle med en replikerbar ekspresjonsvektor fra oppfinnelsen under trans-formerende betingelser. Egnede transformeringsbetingelser er konvensjonelle, og er beskrevet i for eksempel Maniatis et al, sitert ovenfor, eller "DNA Cloning" Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985.

Valget av transformeringsbetingelser blir bestemt ved vertcellen. Derfor kan en bakteriell vert, slik som E. coli, behandles med en oppløsning av CaCl2 (Cohen et al, Proe. Nat. Acad. Sei., 1973, 69,2110) eller med oppløsning som omfatter en blanding av RbCl, MnCh, kaliumacetat og glyserol, og deretter med 3-[N-morfolino]-propan-sul-fonsyre, RbCl og glyserol. Mammalske celler i kultur kan transformeres med kalsium ko-presipitering av vektor-DNA inn i cellene. Oppfinnelsen omfatter også en vertcelle transformert med en replikerbar ekspresjonsvektor fra oppfinnelsen.

Dyrkning av transformert vertcelle under betingelser som tillater ekspresjon av DNA-polymeren, blir utført konvensjonelt som beskrevet i for eksempel Maniatis et al. og "DNA Cloning" sitert ovenfor. Derfor blir cellen fortrinnsvis supplert med næringsstoff og dyrket ved en temperatur under 50°C.

Produktet blir gjenvunnet ved konvensjonelle metoder ifølge vertcellen. Der hvor vertcellen er bakteriell slik som E. coli - eller gjær slik som Pichia, kan den lyseres fysisk, kjemisk eller enzymatisk, og proteinproduktet isolert fra det resulterende lysatet. Der hvor vertcellen er mammalsk, kan produktet generelt isoleres fra næringsmediumet eller fra cellefrie ekstrakter. Konvensjonelle proteinisolasjonsteknikker inkluderer selektiv presipitering, adsorpsjonskromatografi og affinitetskromatografi inklusivt en monoklo-nal antistoff-affinitetskolonne.

For proteiner fra foreliggende oppfinnelse tilveiebragt med Hisitidin-haler, kan rensning lett oppnås ved anvendelse av en metallion-affinitetskolonne. I en foretrukket utførel-sesform blir proteinet ytterligere renset ved å utsette det for kationionebytte-kromato-grafi og/eller gelfiltreringskromatografi. Proteinet blir deretter sterilisert ved å la det passere gjennom en 0,22 um membran.

Proteinene i følge oppfinnelsen kan så formuleres som en vaksine, eller hisitidinresidie-ne enzymatisk renset.

Proteinene fra foreliggende oppfinnelse er tilveiebragt fortrinnsvis ved minst 80% renhet, mer foretrukket 90% renhet, visualisert ved SDS PAGE. Fortrinnsvis opptrer proteinene som et enkelt bånd ved SDS PAGE.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en farmasøytisk sammensetning som omfatter et protein fra foreliggende oppfinnelse i en farmasøytisk akseptabel eksipient.

Vaksinefremstilling blir generelt beskrevet i New Trends and Developments in Vacci-nes, Voller et al. (eds.), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978. Innkapsling inne i liposomer er beskrevet av Fullerton, US-patent 4.235.877.

Proteinene fra foreliggende oppfinnelse er fortrinnsvis adjuvantert i vaksineformule-ringen i følge oppfinnelsen. Egnede adjuvanter inkluderer et aluminiumsalt slik som aluminiumhydroksydgel (alum) eller aluminiumfosfat, men kan også være et salt av kalsium, jern eller sink, eller en uoppløselig suspensjon av acylert tyrosin eller acylerte sukkere, kationiske eller anioniske derivatiserte polysakkarider eller polyfosfazener.

I formuleringen fra oppfinnelsen er det foretrukket at adjuvantsammensetningen induse-rer en foretrukket TH 1-respons. Egnede adjuvantsystemer inkluderer for eksempel en-kombinasjon av monofosforyl-lipid A eller derivat derav, fortrinnsvis 3-de-O-acylerte monofosforyl-lipid A (3D-MPL) sammen med et aluminiumsalt.

Et sterkt reagerbart system involverer kombinasjonen av et monofosforyl-lipid A og et saponinderivat, spesielt kombinasjonen av QS21 og 3D- MPL som beskrevet i WO 94/00153, eller en mindre reagerbar sammensetning hvor QS21 blir stoppet med koles-terol som beskrevet i WA 96/33739.

En spesielt potent adjuvantformulering involverer QS21, 3D-MPL og tocoferol i en ol-je-i-vann-emulsjon beskrevet i WA 95/17210 og er en foretrukket formulering.

Følgelig er det i en utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebragt en vaksine som omfatter et protein ifølge oppfinnelsen, med et monofosforyl-lipid A eller derivat derav, spesielt 3D-MPL, med adjuvant.

Fortrinnsvis omfatter vaksinen i tillegg en saponin, mer foretrukket QS21.

Fortrinnsvis omfatter formuleringen i tillegg en olje-i-vann-emulsjon og tocoferol. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en metode for å produsere en vaksineformule-ring som omfatter å blande et protein fra foreliggende oppfinnelse sammen med en far-masøytisk akseptabel eksipient, slik som 3D-MPL.

Vaksinen fra foreliggende oppfinnelse kan i tillegg omfatte ytterligere HIV-proteiner, slik som kappe-glycoproteinet gpl60 eller dets derivat gpl20.

I et annet aspekt vedrører oppfinnelsen et HIV Nef-protein eller derivat derav uttrykt i Pichia pastoris.

Oppfinnelsen vil ytterligere bli beskrevet ved referanse til de følgende eksempler:

EKSEMPLER:

Generelt

Nef- og Tat-proteiner, to regulatoriske proteiner kodet for av det humane immunsvikt-viruset (HIV-1) ble produsert i E. coli og i metylotrofisk gjær Pichia pastoris.

Nef- genet fra Bru/Lai isolat (Cell 40:9-17,1985) ble selektert for disse konstruksjonene, siden dette genet er blant de som er nærmest beslektet med konsensus Nef.

Utgangsmaterialet for Bru/Lai nef- genet var et 1170bp DNA-fragment klonet i den mammalske ekspresjonsvektoren pcDNA3 (pcDNA3/«e/).

Tat- genet stammer fra den molekylære klonen BH10. Dette genet ble opttatt som en HTLV III cDNA-klon med navn pCVl og beskrevet i Science, 229, sidene 69-73, 1985.

1. EKSPRESJON AV HIV-1 nef OG tøf-SEKVENSER I E. coli.

Sekvenser som koder for Nef-proteinet så vel som en fusjon av nef- og tatf-sekvensene ble plassert i plasmidvektorer: pRIT14586 og pRIT14589 (se figur 1).

Nef- og Nef-Tat-fusjon ble produsert som fusjonsproteiner ved å bruke en del av proteinet D som fusjonspartner. Protein D er et immunoglobulin D som binder protein eks-ponert på overflaten av den gram-nagetive bakterien Haemophilus influenzae.

pRIT14586 inneholder, under kontroll av en X,PL-promoter, en DNA-sekvens avledet fra bakterien Haemophilus influenzae som koder for de første 127 aminosyrene av proteinet D (Infect.Immun. 60 : 1336-1342,1992), umiddelbart etterfulgt av en multippel kloningsseteregion pluss en DNA-sekvens som koder for ett glycin, 6 histidinresidier og et stoppkodon. (fig. IA).

Denne vektoren er designet for å uttrykke et prosessert lipidiert His-halet fusjonsprotein (LipoD-fusjonsprotein). Fusjonsproteinet blir syntetisert som en forløper med en 18 aminosyreresidielang signalsekvens, etter prosessering blir cysteinet i posisjon 19 i for-løpermolekylet den aminoterminale residien, som deretter blir modifisert ved kovalent bundede fettsyrer (fig. IB).

pRIT14589 er nesten identisk med pRIT14586 med unntak av den protD-avledede sekvensen som starter umiddelbart etter cystein 19 kodonet.

Ekspresjon fra denne vektoren resulterer i et His-halet, ikke-lipidiert fusjonsprotein (Prot D-fusjonsprotein).

Fire konstruksjoner ble fremstilt: LipD-«e/-His, LipD-ne/-ta*-His, ProtD-«e/-His og ProtD-/ie/-ta*-His.

De første to konstruksjonene ble fremstilt ved å bruke ekspresjonsvektoren pRIT14586, de siste to konstruksjonene brukte pRIT14589.

1.1 KONSTRUKSJON AV DEN REKOMBIANTE STAMMEN ECLD-N1

SOM PRODUSERER LIPOD-Nef-HIS-FUSJONSPROTEINET.

1.1.1 Konstruksjon av HpoD-ne/-His-ekspresjonsplasmidet pRIT14595

Nef- genet (Bru/Lai-isolat) ble amplifisert ved PCR fra psDNA3/Nef-plasmid med primere 01 og 02.

Afe/DNA-regionen som ble amplifisert, starter ved nukleotid 8357 og terminerer ved nukleotid 8971 (Cell, 40: 9-17, 1985).

Et Ncol-restirksjonssete (som bærer ATG-kodonet til «eggenet) ble introdusert i 5'enden til PCR-fragmentet, mens et Spel-sete ble introdusert i den 3'enden.

PCR-fragmentet som ble ervervet og ekspresjonsplasmidet pRIT14586, ble begge kuttet med Ncol og Spel, renset på en agarosegel, ligert og transformert i den egnede E. coli-vertcellen, stamme AR58. Denne stammen er et kryptisk X lysogen avledet fra N99 som ergaffi::TnlO, A-8 ( chlD- pgl), A-Hl ( cro- chIA), N<*> og cI857.

Det resulterende rekombinante plasmidet ble benevnt etter verifisering av den nef-amplifiserte regionen av automatisk sekvensering (se seksjon 1.1.2 nedenfor), pRIT14595.

1.1.2 Seleksjon av transformanter fra E. cø/i-stamme AR58 med pRIT14595

Når transformert i AR58 E. coli-vertstamme, dirigerer det rekombinante plasmidet varmeinduserbar produksjon av det heterologe proteinet.

Varmeinduserbar proteinproduksjon fra flere rekombinante lipD-Nef-His-transformanter ble analysert ved Coomassie-blåfarvet SDS-PAGE. Alle transformantene som ble analysert viste en varmeinduserbar heterolog proteinproduksjon. Overskuddet av det rekombinante Lipo D-Nef-Tat-His-fusjonproteinet ble estimert til 10% av totalt protein.

Én av transformantene ble selektert og gitt laboratorieaksesjonsnummer ECLD-N1.

Det rekombinante plasmidet ble reisolert fra stamme ECLD-N1, og sekvensen til den ne^His-kodende regionen ble bekreftet ved automatisk sekvensering. Dette plasmidet fikk den offisielle betegnelsen pRIT14595.

Det fullstendig prosesserte og acylerte rekombinante Lip D-ne^His-fusjonsproteinet produsert av stammen ECLD-N1 er sammensatt av:

"Fettsyrer

°109 aminosyrer av protein D (som starter fra aminosyre 19 og fortsetter til aminosyre 127).

°Et metionin, dannet ved anvendelsen av Ncol-kloningssete i pRIT14586 (fig.l). °205 aminosyrer av Nef-protein (som starter fra aminosyre 2 og strekker seg til aminosyre 206).

°Et treonin og et serin dannet ved kloningsprosedyren (kloning i Spel-setet til pRIT14586).

"Ett glycin og seks histidiner.

1.2 KONSTRUKSJON AV REKOMBINANT STAMME ECD-N1 SOM

PRODUSERER PROT D-Nef-HIS-FUSJONSPROTEIN.

Konstruksjon av ekspresjonsplasmid pRIT14600 som koder for Prot D-Nef-His-fusjonsproteinet, var identisk til plasmidkonstruksjonen beskrevet i eksempel 1.1.1 med unntak av at pRIT14589 ble brukt som reseptor-plasmid for det PCR-amplifiserte ^/-fragmentet.

E. coli AR58-stamme ble transformert med pRIT 14600, og transformantene ble analysert som beskrevet i eksempel 1.1.2. Transformanten som ble selektert, fikk laboratorieaksesjonsnummer ECD-N1.

1.3. KONSTRUKSJON AV REKOMBINANT STAMME ECLD-NT6

SOM PRODUSERER LIPO D-Nef-Tat-HIS-FUSJONSPROTEIN.

1.3.1 Konstruksjon av lipo D-Nef-Tat-His-ekspresjonspIasmid pRIT14596

Taf-genet (BH10 isolat) ble amplifisert ved PCR fra et derivat av pCVl-plasmidet med primere 03 og 04. Spel-restriksjonsseter ble introdusert ved begge ender av PCT-fragmentet.

Nukleotidsekvensen til det amplifiserte ta/-genet er illustrert i pCVl-klonet (Science 229 : 69-73,1985) og dekker nukleotid 5414 til nukleotid 7998.

PCR-fragmentet som ble ervervet og plasmidet pRIT14595 (som uttrykker lipoD-Nef-His-protein) ble begge kuttet med Spel-restriksjonsenzym, renset på en agarosegel, ligert og transformert i kompetente AR58-celler. Det resulterende rekombinante plasmidet som ble gjenvunnet, ble etter verifisering av den taf-amplifiserte sekvensen ved automatisk sekvensering (se avsnitt 1.3.2 nedenfor), kalt pRIT14596.

1.3.2. Seleksjon av transformanter fra stamme AR58 med pRITI4596

Transformantene ble dyrket, varmeindusert og deres proteiner analysert med Coomassie-blåfarvede geler. Produksjonsnivået av det rekombinante proteinet ble estimert ved 1% av totalt protein. Én rekombinant stamme ble selektert og fikk laboratorienavnet

ECLD-NT6.

Det lipoD-«e/"-taf-His-rekombinante plasmidet ble re-isolert fra ECLD-NT6-stamme, sekvensert, og fikk navnet pRIT14596.

Det fullstendig prosesserte og acylerte rekombinante Lip D-Nef-Tat-His-fusjonsproteinet produsert av stammen ECLD-N6, er sammensatt av:

"Fettsyrer

°109 aminosyrer av protein D (som starter ved aminosyre 19 og strekker seg til aminosyre 127).

°Et metionin, dannet av anvendelsen av Ncol-kloningssete til pRIT14586.

°205 aminosyrer av Nef-proteinet (som starter ved aminosyre 2 og som strekker seg til aminosyre 206).

°Et treonin og et serin dannet ved kloningsprosedyren.

°85 aminosyrer av Tat-proteinet (som starter fra aminosyre 2 og som strekker seg til aminosyre 86).

°Et treonin og et serin introdusert ved kloningsprosedyre.

°Ett glycin og seks histidiner.

1.4 KONSTRUKSJON AV REKOMBINANT STAMME ECD-NT1

SOM PRODUSERER PROT D-Nef-Tat-HIS-FUSJONSPROTEIN.

Konstruksjon av ekspresjonsplasmid pRIT14601 som koder for Prot D-Nef-Tat-His-fusjonsproteinet, var identisk til plasmidkonstruksjonen beskrevet i eksempel 1.3.1 med unntak av at pRIT14600 ble brukt som et reseptor-plasmid for PCR-amplifisert nef- fcag-ment.

E. coli AR58-stamme ble transformert med pRIT 14601 og transformanter ble analysert som beskrevet tidligere. Transformanten ble selektert og fikk laboratorie-aksesjons-nummerECD-NTl.

2. EKSPRESJON AV HIV-1 nef- OG tøf-SEKVENSER I PICHIA PASTORIS

Nef-protein, Tat-protein og fusjonen Nef-Tat ble uttrykt i metylotrofisk gjær Pichia pastoris under kontroll av den induserbare alkoholoksydase (AOX1) promoteren.

For å uttrykke disse HIV-1-genene ble en modifisert versjon av den integrative vektoren PHIL-D2 (INVITROGEN) brukt. Denne vektoren ble modifisert på en slik måte at ekspresjonen av heterologt protein starter umiddelbart etter det native ATG-kodonet i AOX1-genet, og vil produsere rekombinant protein med en hale av én glycin og seks histidinresidier. Denne PHIL-D2-MOD-vektoren ble konstruert ved kloning av en oli-gonukleotid-linker mellom de ved siden av liggende AsuII og EcoRI-setene til PHIL-D2-vektoren (se figur 3). I tillegg til denne His-halen, bærer linkeren Ncol, Spel og Xbal-restriksjonsseter mellom hvilke nef-, tat- og ne/-fa*-fusjonen ble satt inn.

2.1. KONSTRUKSJON AV DE INTEGRATIVE VEKTORENE pRIT14597

(som koder for Nef-His-protein), pRIT14598 (som koder for Tat-His-protein) og pRIT14599 (som koder for fusjon Nef-Tat-His).

Nef- g& aet ble amplifisert ved PCR fra pcDNA3/Nef-plasmidet med primere 01 og 02 (se avsnsitt 1.1.1 konstruksjon av pRIT14595). PCR-fragmentet som ble ervervet og den integrative PHIL-D2-MOD-vektoren ble både kuttet med Ncol og Spel, renset på agarosegel og ligert for å danne det integrative plasmidet pRIT14597 (se figur 3).

Tat- genet ble amplifisert ved PCR fra et derivat av pCVl-plasmidet med primere 05 og 04 (se avsnitt 1.3.1 konstruksjon av pRIT14596):

Et Ncol-restriksjonssete ble introdusert i 5'enden av PCR-fragmentet mens et Spel-sete ble introdusert i 3'enden med primer 04. PCR-fragmentet som ble ervervet og PHIL-D2-MOD-vektoren ble begge kuttet med Ncol og Spel, renset på agarosegel og ligert for å danne det integrative plasmidet pRIT14598.

Til konstruksjonen pRIT14599 ble et 910bp DNA-fragment korresponderende til den ne/^af-His-kodende sekvensen ligert mellom den EcoRI bluntede (T4 polymerase) og Ncol-seter fra PHIL-D2-MOD-vektor. Det ne/-taf-His-kodende fragmentet ble ervervet ved Xbal blutet (T4 polymerase) og Ncol-kuttinger av pRIT14596.

2.2. TRANSFORMASJON AV PICHIA PASTORIS-STAMME GS115(his4).

For å erverve Pichia pastoris- stsmmex som uttrykker Nef-His, Tat-His og fusjonen Nef-Tat-His, ble stammen GS115 transformert med lineære Noti-fragmenter som bærer de respektive ekspresjonskassettene pluss HIS4-genet for å komplementere his4 i verts-genomet. Transformasjon av GS115 med Notl-lineære fragmenter favoriserer rekombi-nering i AOXI-locus.

Multikopi-integrerende kloner ble selektert ved kvantitativ dot-blot-analyse og type integrering, insersjon (Mut<+>fenotype) eller transerstatning (Mut<5>fenotyp), ble bestemt. Fra hver transformasjon ble én transformant som viste et høyt produksjonsnivå for det rekombinante proteinet, selektert: Stamme Yl738 (Mut<+>fenotype) som produserer det rekombinante Nef-His-proteinet, en myristylert 215 aminosyreprotein, er sammensatt av:

<0>Myristinsyre

°Et metionin, dannet ved anvendelse av Ncol-kloningssete til PHIL-D2-MOD-vektor

°205 aminosyrer av Nef-protein (som starter ved aminosyre 2 og strekker seg til aminosyre 206)

°Et treonin og et serin dannet ved kloningsprosedyren (kloning av Spel-sete til PHIL-D2-vektor.

°Ett glycin og seks histidiner.

Stamme Y1739 (Mut<+>fenotype) som produserer Tat-His-proteinet, et 95 aminosyreprotein som er sammensatt av: °Et metionin dannet ved anvendelse av Ncol-kloningssete °85 aminosyrer av Tat-proteinet (som starter ved aminosyrer 2 og som strekker seg til aminosyrer 86).

°Et treonin og et serin introdusert ved kloningsprosedyre "Ett glycin og seks histidiner

Stamme Y1737 (Mut<5>fenotype) som produserer det rekombinante Nef-Tat-His-fusjonsproteinet, et myristylert 302 aminosyrerprotein som er sammensatt av:

"Myristinsyre

°Et metionin, dannet ved anvendelse av Ncol-kloningssete °205 aminosyrer av Nef-protein (som starter ved aminosyre 2 og som strekekr seg til aminosyrer 206)

°Et treonin og et serin dannet ved kloningsprosedyren

°85 aminosyrer av Tat-proteinet (som starter ved aminosyre 2 og som strekker seg til aminosyre 86)

°Et treonin og et serin introdusert ved kloningsprosedyren °Ett glycin og seks histidiner

3. EKSPRESJON AV HIV- 1 Tat- MUTANT I PICHIA PASTORIS

På samme måte som et Nef-Tat-mutantfusjonsprotein, har et mutant rekombinant Tat-protein også blitt uttrykt. Det mutante Tat-proteinet må være biologisk inaktivt mens det opprettholder dets immunogeniske epitoper.

Et dobbelt mutant tat- gen, konstruert av D. Clements (Tulane University) ble selektert for disse konstruksjonene.

Dette tat- genet (som opprinnelig er fra BH 10 molekylærklon) bærer mutasjonen i den aktive seteregionen (Lys41-»Ala) og i RGD-motivet (Arg78-»Lys og Asp80->Glu)

(Virology 235: 48-64,1997).

Det mutante ta/-genet ble oppnådd som et cDNA-fragment subklonet mellom EcoRI og Hindlll-seter i et CMV-ekspresjonsplasmid (pCMVLys41/KGE).

3.1. KONSTRUKSJON AV DE INTEGRATIVE VEKTORENE

pRIT14912 (som koder for Tat-mutant-His-protein) og pRIT14913 (som koder for fusjon Nef-Tat mutant-His).

7aMnutantgenet ble amplifisert ved PCR fra pCMVLys41/KGE-plasmidet med primere 05 og 04 (se avsnitt 2,1 konstruksjon av pRIT14598)

Et Ncol-restriksjonssete ble introdusert i 5'enden av PCR-fragmentet mens et Spel-sete ble introdusert i den 3'enden med primer 04. PCR-fragmentet som ble ervervet og PHIL-D2-MOD-vektoren ble begge kuttet med Ncol og Spel, renset på agarosegel og ligert for å danne det integrative plasmidet pRIT14912.

For å konstruere pRIT14913, ble taMnutantgenet amplifisert med PCR fra pCMVLys41/KGE-plasmidet med primere 03 og 04 (se avsnitt 1.3.1 konstruksjon av pRIT14596).

PCR-fragmentet ervervet og plasmidet pRIT14597 (som uttrykker Nef-His-protein) ble både kuttet med Spel-restriksjonsenzym, renset på agarosegel og ligert for å danne det integrative plasmidet pRIT14913.

3.2 TRANSFORMASJON AV PICHIA PASTORIS-STAMME GS115.

Pichia pastoris-stammer som uttrykker Tat-mutant-His-protein og fusjonen Nef-Tat-mutant-His, ble ervervet ved å anvende integrasjon og rekombinant stamme-selek-sjonstrategier som tidligere beskrevet i avsnitt 2.2.

To rekombinante stammer som produserer Tat-mutant-His-protein, et 95 aminosyrerprotein, ble selektert. Yl 775 (Mut<+>fenotype) og Yl 776(Mut5fenotype).

Én rekombinant stamme som uttrykker Nef-Tat-mutant-His-fusjonsprotein, et 302 aminosyrerprotein ble selektert: Y1774(Mut<+>fenotype).

4. RENSNING AV Nef-Tat-His-FUSJONSSPROTEIN (PICHIA PASTORIS)

Rensningsdiagrammet har blitt utviklet fra 146g rekombinant Pichia pastoris-celler (våt vekt) eller 2L Dyno-mill-homogenat OD 55, De kromatografiske trinnene er utført ved romtemperatur. Mellom trinnene blir Nef-Tat-positive fraksjoner oppbevart overnatt i et kaldt rom (+ 4°C); for oppbevaring i lengre tid, blir prøver frosset ved -20°C.

Renhet

Nivået av renhet som beregnet ved SDS-PAGE er vist i figur 4 ved Daiichi-sølvfarving og i figur 5 ved Coomassie-blå G250.

Gjenvinning

51 mg Nef-Tat-his-protein blir renset fra 146g av rekombinant Pichia pastoris-celler (= 2L av Dyno-mill-homogenat OD 55).

5. VAKSINEFREMSTILLING

En vaksine fremstilt i samsvar med oppfinnelsen, omfatter ekspresjonsproduktet av en DNA-rekombinant som koder for et antigen som eksemplifisert i eksempel 1 eller 2, og som adjuvant omfatter formuleringen av en blanding av 3 de -O-acylert monofosforyl-lipid A 3D-MPL og QS21 i en olje/vannemulsjon.

3D-MPL: Er en kjemisk detoksifisert form av lipopolysakkaridet (LPS) fra den Gram-negative bakterien Salmonella minnesota.

Eksperimenter utført ved SmithKline Beecham Biologicals har vist at 3D-MPL kombi-nert med forskjellige bindemidler, øker sterkt både den humorale og en THl-type av cellulær immunitet.

QS21: Er en saponin renset fra et rå-ekstrakt av barken til Quillaja Saponaria Molina-treet, som har en sterk adjuvantaktivitet: Den aktiverer både antigenspesifikk lymfoproliferering og CTL til flere antigener.

Ekseperimenter utført ved SmithKline Beecham Biologicals har vist en klar synergistisk effekt av kombinasjoner av 3D-MPL og QS21 i induksjonen av både humorale og THl-type cellulære immunresponser.

Olje/vannemulsjonen er sammensatt av 2 oljer (en tocoferol og squalen) og av PBS inneholdende Tween 80 som emulsjsonsmiddel. Emulsjonen omfattet 5% squalen, 5% tocoferol, 0,4% Tween 80, og hadde en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på 180 nm (se WO 95/17210).

Eksperimenter utført ved SmithKline Beecham Biologicals har vist at tilføyelse av denne O/W-emulsjonen til 3D-MPL/QS21 ytterligere øker deres immunostimulerende egenskaper.

Fremstilling av olje/vannemulsjonen (2 gangers konsentrat)

Tween 80 blir oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS) for å gi en 2% oppløsning i PBS. For å tilveiebringe 100 ml to gangers konsentratemulsjon, blir 5 g av DL alfa-tocoferol og 5 ml av squalen vortexsentrifugert for gjennomblanding. 90 ml PBS/Tween-oppløs-ning blir tilsatt og gjennomblandet. Den resulterende emulsjonen blir deretter kjørt gjennom en sprøyte og til slutt mikrofluidisert ved å bruke en Ml 10S mikrofluidiseringsma-skin. De resulterende oljedråpene har en størrelse på omtrent 180 nm.

Fremstilling av olje-i-vann-formulering

Antigen fremstilt i samsvar med eksempel 1 eller 2 (5 ug) ble fortynnet i 10 ganger konsentrert PBS pH 6,8 og H20 før etterfølgende tilsetting av SB62, 3D-MPL (5 ug), QS21 (5 ug) og 50 ug/ml tiomersal som et konserveringsmiddel ved 5 minutters inter-val. Emulsjonsvolumet er lik 50% av totalvolumet (50 ul for en dose på 100 ul).

Alle inkuberinger ble utført ved romtemperatur med risting.

6. IMMUNOGENISITET HOS Tat OG Nef-Tat I GNAGERE

Karakterisering av immunresponsen indusert etter immunisering med Tat og NefTat ble utført. For å få informasjon av isotype-profiler og cellemediert immunitet (CMI), ble to immuniseringseksperimenter i mus utført. I det første eksperimentet ble mus immunisert to ganger i løpet av to uker i fotpoten med Tat eller NefTat i den oksyderte eller reduserte formen, respektivt. Antigener ble formulert i en olje-i-vann-emulsjon omfattende squalen, Tween 80Tm (polyoksyetylen-sorbitanmonooleat) QS21, 3D-MPL og a-tocoferol, og en kontrollgruppe mottok adjuvanten alene. To uker etter den siste immu-niseringen ble sera ervervet og underkastet Tat-spesifikk ELISA (ved bruk av redusert Tat for overtrekk for bestemmelsen av antistofftitere og isotyper (figur 6a). Antistoffti-terne var høyest i mus som hadde mottatt oksydert Tat. Generelt induserte de oksyderte molekylene høyere antistofftitere enn de reduserte formene, og Tat alene induserte høy-ere antistofftitere enn NefTat. Den siste observasjonen ble bekreftet i det andre eksperimentet. Mest interessant var at isotypeprofilen til Tat-spesifikke antistoffer var forskjellige, avhengig av antigenene brukt for immunisering. Tat alene reiste en balansert IgGl og IgG2a-profil, mens NefTat induserte en mye sterker TH2"bias" (figur 6b). Dette ble igjen bekreftet i det andre eksperimentet.

I det andre museeksperimentet mottok dyrene bare reduserte former av molekylene eller adjuvanten alene. Ved siden av serologisk analyse (se ovenfor) ble lymfoproliferative responser fra lymfeknuteceller evaluert. Etter restimulering av disse celler in vitro med Tat eller NefTat, ble H-tymidininkorporering målt etter 4 dagers dyrking. Presentasjon av resultatene som stimuleringseksponenter indikerer at svært sterke responser ble indusert i begge grupper av mus som hadde mottatt antigen (figur 7).

Som konklusjon indikerer musestudiene at Tat så vel som Nef-Tat er svært immunoge-ne kandidat-vaksine-antigener. Immunresponsen rettet mot de to molekylene er kjennetegnet ved høye antistoffresponser med minst 50% IgGl. Dessuten ble sterke CMI-responser (som målt ved lymfoproliferering) observert.

7. FUNKSJONELLE EGENSKAPER AV Tat OG Nef-Tat-PROTEINER

Tat- og NefTat-molekyler i oksydert eller redusert form, ble undersøkt for deres evne til å binde til humane T-cellelinjer. Dessuten ble effekten av veksten til disse cellelinjene vurdert. ELISA-plater ble overtrukket overnatt med forskjellig konsentrasjon av Tat- og NefTat-proteinene, det irrelevante gD fra herpes simplex virustype II eller med en buf-ferkontroll alene. Etter fjerning av overtrekningsoppløsningen ble HUT-78 celler tilsatt til brønnene. Etter to timer med inkubering ble brønnene vasket og binding av celler til bunnen av brønnene vurdert mikroskopisk. Som et kvantitativt mål ble cellene farvet med toluidinblå, lysert med SDS og toluidinblå-konsentrasjonen i supernatanten ble bestemt med en ELISA plateleser. Resultatene indikerer at alle fire proteiner, Tat og NefTat i oksydert eller redusrt form, medierte binding av cellene til ELISA-platen (figur 8). Det irrelevante proteinet (data ikke vist) og bufferen, bandt seg ikke til cellene. Denne indikerer at rekombinant uttrykt Tat-inneholdende proteiner binder spesifikt til humane T-cellelinjer.

I et annet eksperiment ble HUT-78-celler bragt i kontakt med proteinene i 16 timer. På slutten av inkuberingsperioden ble cellene merket med [<3>H]-tymidin og inkorporerings-raten ble bestemt som et mål av cellevekst. Alle fire proteiner inkludert i denne analysen inhiberte cellevekst som bedømt ved minsket radioaktivitetsinkorporering (figur 9). Bufferkontrollen medierte ikke denne effekten. Disse resultater viser at de rekombinante Tat-inneholdende proteinene er istand til å inhibere vekst av en human T-cellelinje.

Som konklusjon viser den funksjonelle karakteriseringen at Tat og NefTat-proteinene er istand til å binde til humane T-celle-linjer. Dessuten er proteinene istand til å inhibere vekst av slike cellelinjer.

Claims (21)

1. Vaksinesammensetning, karakterisert ved at den omfatter et protein som omfatter: a) et fullstendig HIV Nef-protein eller Nef-derivat med en C-terminal histidinhale, eller Nef som har gjennomgått delesjon, addisjon eller substitusjon av en aminosyre, der HIV Nef er koblet til enten i) en fusjonspartner; ii) en fusjonspartner utvalgt protein D eller lipoprotein D fra Haeophilium Influenzae B eller et derivat av en av disse; eller iii) et fullstendig HIV Tat-protein eller Tat-derivat med en C-terminal histidinhale, eller et mutert Tat som har gjennomgått delesjon, addisjon eller substitusjon av en aminosyre, eller et mutert Tat som definert ifølge SEQ ID NO: 23; eller b) et fullstendig HIV Nef-protein som definert ifølge aiii) som er koblet til et protein eller lipoproteinfusjonspartner; og en TH 1-induserende adjuvans i blanding med en farmasøytisk akseptabel eksipiens.

2. Vaksinesammensetning ifølge krav 1, karakterisert v e d at HIV Nef er koblet til enten: iv) en fusjonspartner; v) en fusjonspartner utvalgt protein D eller lipoprotein D fra Haeophilium Influenzae B eller et derivat av en av disse; eller vi) et fullstendig HIV Tat-protein eller Tat-derivat med en C-terminal histidinhale, eller et mutert Tat som har gjennomgått delesjon, addisjon eller substitusjon av en aminosyre, eller et mutert Tat som definert ifølge SEQ ID NO: 23;

3. Vaksinesammensetning ifølge krav 1, karakterisert v e d at HIV Nef er koblet til et fullstendig HIV Tat-protein eller Tat-derivat med en C-terminal histidinhale, eller et mutert Tat som har gjennomgått delesjon, addisjon eller substitusjon av en aminosyre, eller et mutert Tat som definert ifølge SEQ ID NO: 23 og en protein eller lipoproteinfusjonspartner.

4. Sammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at fusjonspartneren omfatter mellom 100-130 aminosyrer fra N.terminalen til Haemophilus Influenzae B-protein D.

5. Sammensetning ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 4, karakterisert ved at proteinet har en histitdin-hale.

6. Sammensetning ifølge hvilket som helst av kravene 1-5, karakterisert ved at proteinet er et Nef-Tat-protein og er karboksymetylert.

7. Sammensetning ifølge krav 1 til 6, karakterisert ved at adjuvansen omfatter 3-de-O-acylert monofosforyl-lipid A.

8. Sammensetning ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at den ytterligere omfatter en saponinadjuvans.

9. Sammensetning ifølge krav 8, karakterisert ved at saponineterQS21.

10. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 9, karakterisert ved at den ytterligere omfatter en olje-i-vann-emulsjon.

11. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 10, karakterisert ved at adjuvansen omfatter 3D-MLP, QS21 og en olje-i-vann emulsjon av tocoferol, sqalen og Tween 80™.

12. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, karakterisert ved at den ytterligere omfatter HIV gp 160 eller gp 120.

13. Fremgangsmåte for å fremstille en vaksinesammensetning, karakterisert ved at den omfatter trinnene å blande et protein som definert ifølge krav 1 med en TH 1-induserende adjuvans og en farmasøytisk akseptabel eksipiens.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at den ytterligere omfatter tilsetting av HIV gpl60 eller dens derivat gpl20.

15. Protein, karakterisert ved at det omfatter et fullstendig HIV Nef-protein eller Nef-derivat med en C-terminal histidinhale, eller Nef som har gjennomgått delesjon, addisjon eller substitusjon av en aminosyre koblet til et fullstendig HIV Tat-protein eller Tat-derivat med en C-terminal histidin-hale, eller et mutert Tat som har gjennomgått delesjon, adhesjon eller substitusjon av en aminosyre, eller et mutert Tat som definert ifølge SEQ ID NO: 23.

16. Protein ifølge krav 15, karakterisert ved at det ytterligere omfatter en protein-eller lipoproteinfusjonspartner.

17. Nukleinsyre, karakterisert ved at den koder for et protein ifølge krav 15 eller 16.

18. Vert, karakterisert ved at den er transformert med nukleinsyren ifølge krav 17.

19. Vert ifølge krav 18, karakterisert ved at verten er enten E. coli eller Pichia pastoris.

20. Fremgangsmåte for fremstilling av et protein ifølge krav 15 til 16, karakterisert ved at den omfatter å tilveiebringe en vert ifølge krav 18 eller 19, uttrykkelse av nevnte protein og gjenvinning av proteinet.

21. Nef-Tat-His- eller Nef-Tat-mutant-His-protein ifølge krav 15 eller nukleinsyre ifølge krav 17 som har aminosyre- eller DNA-sekvensen vist i SEQ ID NO: 12, 13, 16,17, 2 21,24 eller 25.