KR20010024287A - ＨＩＶ-1 Ｔａｔ 및/또는 Ｎｅｆ 단백질을 포함하는 융합단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) (ⅰ) 융합 파트너 또는 (ⅱ) HIV Nef 단백질 또는 이것의 유도체에 연결된 HIV Tat 단백질 또는 이것의 유도체; (b) (ⅰ) 융합 파트너 또는 (ⅱ) HIV Tat 단백질 또는 이것의 유도체에 연결된 HIV Nef 단백질 또는 이것의 유도체; 또는 (c) HIV Tat 단백질 또는 이것의 유도체, 및 융합 파트너에 연결된 HIV Nef 단백질 또는 이것의 유도체를 포함하는 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 이러한 단백질을 코드화하는 핵산 및 상기 핵산으로 형질전화된 숙주 세포, 예컨데, 피히아 파스토리스를 제공한다.
Description
본 발명은 신규한 HIV 단백질 구성물, 의약에서 이들의 용도, 이들을 함유하는 약제 조성물 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 HIV-1 Tat 및/또는 Nef 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
HIV-1은 세계의 주요 보건 문제중 하나로서 여겨지는 후천성 면역결핍증(AIDS)의 주요 요인이다. 세계 도처에서 백신을 생산하고자 하는 광대한 연구가 수행되었음에도 불구하고, 지금까지 이러한 노력은 성공적이지 못하였다.
HIV-1의 비엔벨로프 단백질은 설명되어 있으며, 예를 들어, 내부 구조 단백질, 예컨데, gag 및 pol 유전자의 생성물, 및 그밖의 비구조 단백질, 예컨데, Rev, Nef, Vif 및 Tat를 포함한다[참조: Greene et al., New England J.Med, 324, 5, 308 et seq(1991) and Bryant et al.(Ed. Pizzo), Pediatr. Infect.Dis. J., 11, 5, 390 et seq(1992)].
HIV Nef 및 Tat 단백질은 초기 단백질이며, 즉, 이들은 구조 단백질의 없이 감염 초기에 발현된다.
본 발명에 있어서, (a) (ⅰ) 융합 파트너 또는 (ⅱ) HIV Tat 단백질 또는 이것의 유도체에 연결된 HIV Nef 단백질 또는 이것의 유도체;
(b) (ⅰ) 융합 파트너 또는 (ⅱ) HIV Nef 단백질 또는 이것의 유도체에 연결된 HIV Tat 단백질 또는 이것의 유도체; 또는
(c) HIV Tat 단백질 또는 이것의 유도체, 및 융합 파트너에 연결된 HIV Nef 단백질 또는 이것의 유도체를 포함하는 단백질이 제공된다.
본원에 사용된 용어 "융합 파트너"는 Tat 또는 Nef 이외의 임의의 단백질 서열을 의미한다. 바람직하게는, 융합 파트너는 헤모필루스 인플루엔자 B의 단백질 D 또는 이것의 리피드화된 유도체인 지질단백질이다. 특히, N-말단 1/3, 즉 처음 약 100 내지 130개의 아미노산이 사용되는 것이 바람직하다. 본원에서는 Lipo D 1/3으로서 나타내었다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, Nef 단백질 또는 이것의 유도체는 Tat 단백질 또는 이것의 유도체에 연결될 수 있다. 이러한 Nef-Tat 융합단백질은 또한, 임의로 융합 파트너, 예컨데, 단백질 D에 연결된다.
융합 파트너는 일반적으로, Nef 또는 Tat 단백질의 N-말단에 연결된다.
본 발명에 포함된 유도체는 바람직하게는 5 내지 10개의 히스티딘 잔기를 포함하는 C 말단 히스티딘 테일을 갖는 분자를 포함한다. 일반적으로, n 잔기를 함유하는 히스티딘 테일은 His(n)으로써 나타내었다. 히스티딘(또는 "His") 테일은 정제를 촉진한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 하기 구조의 단백질을 제공한다.
Lipo D 1/3 - Nef - His(6)
Lipo D 1/3 - Nef-Tat - His(6)
Prot D 1/3 - Nef - His(6)
Prot D 1/3 - Nef-Tat - His(6)
Nef-Tat - His(6)
도 1에는 이러한 구조에 대한 융합 파트너의 아미노산(서열 번호: 7) 및 DNA 서열(서열 번호: 6)이 도시되어 있다.
바람직한 구체예에서, 단백질은 5 내지 10개, 바람직하게는 6개의 히스티딘 잔기를 포함하는 히스티딘 테일과 함께 발현된다. 이는 정제를 촉진시키는데 유리하다. 효모(사카로미세스 세레비시애(Saccaromyces cerevisiae))에서의 Nef(Macreadie I.G. et al., 1993, Yeast 9(6) 565-573) 및 Tat(Braddock M et al., 1989, Cell 58(2) 269-79)의 개별적인 발현은 이미 보고되어 있다. Nef 단백질만이 미리스틸화(myristilate)된다. 본 발명은 우선 피히아(Pichia) 발현 시스템에서 Nef 및 Tat를 개별적으로 발현시켰으며(Nef-His 및 Tat-His 구성물), 융합 구조인 Nef-Tat-His를 성공적으로 발현시켰다. Nef-His의 DNA 및 아미노산 서열(서열 번호: 8 및 9), Tat-His의 DNA 및 아미노산 서열(서열 번호: 10 및 11), 및 Nef-Tat-His 융합 단백질의 DNA 및 아미노산 서열(서열 번호: 12 및 13)은 도 2에 도시되어 있다.
본 발명에 포함된 유도체는 또한, 변이된 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "변이된"은 특정부위의 돌연변이 유발 또는 그밖의 통상적인 방법에 대해 널리 공지된 방법을 이용하여 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환처리된 분자를 의미한다.
변이된 Tat는 Nef-Tat 변이-His(서열 번호: 24 및 25)와 도 2(서열 번호: 22 및 23)에 예시되어 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA를 제공한다. 이러한 서열은 적합한 발현 벡터에 삽입되어, 적합한 숙주에서 발현될 수 있다.
본 발명의 단백질을 코드화하는 DNA 서열은 표준 DNA 합성 기술, 예컨데, 문헌[D.M.Roberts et al. in Biochemistry 1985, 24, 5090-5098]에 설명된 효소 결합, 화학 합성, 시험관내 효소 중합화, 또는 예를 들어, 내열성 중합효소를 사용한 PCR 기술 또는 이러한 기술의 조합에 의해 합성될 수 있다.
DNA의 효소 중합화는, 10 내지 37℃에서 일반적으로 50㎕ 이하의 용량으로 필요에 따라, 누클레오시드 트리포스페이트인 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 함유하는 적합한 완충액중에서 DNA 중합효소 Ⅰ(클레노우 단편)과 같은 DNA 중합효소를 사용하여 시험관내에서 수행될 수 있다. DNA 단편의 효소 결합은 적합한 완충액, 예컨데, 0.05M Tris(pH7.4), 0.01M MgCl2, 0.01M 디티오트레이톨, 1mM 스페르미딘, 1mM ATP 및 0.1mg/ml 소과동물 혈청 알부민중의 DNA 리가아제, 예컨데, T4 DNA 리가아제를 사용하여 4℃ 내지 실온에서 일반적으로 50ml 이하의 용량으로 수행될 수 있다. DNA 중합체 또는 단편의 화학 합성은 고체상 기술, 예컨데, 문헌['Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual'(ed. H.G. Gassen and A.Lang), Verlag Chemie, Weinheim(1982)] 또는 다른 과학 문헌, 예컨데, 문헌[M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, and R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat, and W.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Mattercci and M.H. Caruthers, Tetrahedro Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981,103,3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J.Biernat, J.McMannus, and H.Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; and H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984, 3, 801]에 설명된 기술을 사용하여 통상적인 포스포트리에스테르, 포스피트 또는 포스포르아미디테 화학작용에 의해 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 단백질을 제조하는 방법을 제공하며, 이는
ⅰ) 숙주 세포에서 단백질 또는 이것의 유도체를 코드화하는 누클레오티드 서열을 포함하는 DNA 중합체를 발현시킬 수 있는 복제가능 또는 삽입 발현 벡터를 제조하는 단계,
ⅱ) 숙주 세포를 벡터로 형질전환시키는 단계,
ⅲ) DNA 중합체를 발현시켜 단백질을 생성시킬 수 있는 조건하에 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
ⅳ) 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989]에 기재된 통상적인 재조합 기술에 의해 수행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "형질전환"은 숙주 세포로의 이종 DNA의 삽입을 의미한다. 예를 들어, 이는 예를 들어, 문헌[Genetic Engineering;Eds. S.M.Kingsman and A.J.Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988]에 설명된 통상적인 기술을 이용하여 적합한 플라스미드 또는 바이러스 벡터로의 형질전환, 형질감염 또는 감염에 의해 달성될 수 있다. 이후부터 용어 '형질전환된' 또는 "형질전환체"는 관심있는 이종 유전자를 함유하고 발현하는 생성된 숙주 세포에 적용될 것이다.
발현 벡터는 신규한 것이며, 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
복제가능한 발현 벡터는 숙주 세포와 양립가능한 벡터를 절단하여 손상되지 않은 리플리콘을 갖는 직쇄 DNA 시그먼트를 제공하고, 결합 조건하에 하나 이상의 DNA 분자를 갖는 상기 직쇄 시그먼트와, 목적하는 단백질을 코드화하는 직쇄 시그먼트, 예컨데, 본 발명의 단백질 또는 이것의 유도체를 코드화하는 DNA 중합체를 배합시키므로써 제조될 수 있다.
이리하여, DNA 중합체는 필요에 따라 미리 형성되거나 벡터의 구성 동안 형성될 수 있다.
원핵세포 또는 직핵세포일 수 있으며, 바람직하게는 대장균 또는 효모인 숙주 세포에 따라 벡터가 부분적으로 결정될 것이다. 적합한 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 코스미드 및 재조합 바이러스를 포함한다.
복제가능한 발현 벡터의 제조는 DNA의 제한, 중합화 및 결합에 적합한 효소로 예를 들어, 상기 언급된 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌에 설명된 공정에 의해 통상적으로 수행될 수 있다.
재조합 숙주 세포는 본 발명에 따라, 형질전환 조건하에 숙주 세포를 본 발명의 복제가능한 발현 벡터로 형질전환시키므로써 제조된다. 적합한 형질전환 조건은 통상적인 것이며, 예를 들어, 상기 언급된 마니아티스 등의 문헌 또는 문헌["DNA Cloning" Vol. Ⅱ, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985]에 설명되어 있다.
숙주 세포에 의해 형질전환 조건이 결정된다. 따라서, 대장균과 같은 박테리아 숙주는 CaCl2용액(Cohen et al., Proc.Nat.Acad.Sci., 1973, 63, 2110) 또는 RbC1, MnCl2, 칼륨 아세테이트 및 글리세롤의 혼합물을 포함하는 용액으로 처리된 후, 3-[N-몰폴리노]-프로판-술폰산, RbC1 및 글리세롤로 처리될 수 있다. 배양물중의 포유동물 세포는 세포상으로의 벡터 DNA의 칼슘 공동침전에 의해 형질전환될 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 복제가능 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포까지 확장된다.
DNA 중합체를 발현시킬 수 있는 조건하에 형질전환된 숙주 세포의 배양은 예를 들어, 상기 언급된 마니아티스 등에 의한 문헌 및 문헌["DNA Cloning"]에 설명된 바와 같이 통상적으로 수행된다. 따라서, 바람직하게는, 세포는 영양분이 제공되고, 50℃ 미만의 온도에서 배양된다.
생성물은 숙주 세포에 따라 통상적인 방법에 의해 회수된다. 따라서, 숙주 세포가 대장균과 같은 박테리아 또는 피히아와 같은 효모일 경우, 이는 물리적, 화학적 또는 효소적으로 세포융해되며, 단백질 생성물은 생성된 세포 융해물로부터 단리된다. 숙주 세포가 포유동물인 경우, 생성물은 일반적으로, 영양물 배지 또는 세포 비함유 추출물로부터 단리된다. 통상적인 단백질 단리 기술은 선택적인 침전 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 및 모노클로날 항체 친화성 칼럼을 포함한 친화성 크로마토그래피를 포함한다.
히스티딘 테일을 갖도록 제공된 본 발명의 단백질에 있어서, 정제는 금속 이온 친화성 칼럼에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 단백질은, 단백질을 양이온 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 겔 여과 크로마토그래피로 처리하므로써 추가로 정제된다. 그 후, 단백질은 0.22μm 막을 통과하므로써 멸균된다.
그 후, 본 발명의 단백질은 백신으로서 제형화될 수 있거나, 히스티딘 잔기는 효소적으로 제거된다.
본 발명의 단백질은 SDS PAGE에 의해 가시화된 것으로서, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 순도를 갖는다. 바람직하게는, 단백질은 SDS PAGE에 의해 단일 밴드로서 나타난다.
본 발명은 또한, 약제학적으로 허용되는 부형제중의 본 발명의 단백질을 포함하는 약제 조성물을 제공한다.
백신 제조물은 일반적으로, 문헌[New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al.(eds.), University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978.]에 설명되어 있다. 리포좀내로의 캡슐화는 풀러톤(Fullerton)의 미국 특허 제 4,235,877호에 설명되어 있다.
본 발명의 단백질은 바람직하게는, 본 발명의 백신 제형에 도움이 된다. 적합한 보조제는 알루미늄 염, 예컨데, 알루미늄 히드록시드 겔(알룸) 또는 알루미늄 포스페이트를 포함하나, 칼슘, 이온 또는 아연의 염일 수 있거나, 아실화된 티로신, 또는 아실화된 당, 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 폴리사카라이드 또는 폴리포스파젠의 불용성 현탁액일 수 있다.
본 발명의 제형에 있어서, 보조제 조성물이 우선적인 TH1 반응을 유도하는 것이 바람직하다. 적합한 보조제 시스템은 예를 들어, 모노포스포릴 리피드 A 또는 이것의 유도체, 바람직하게는 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A(3D-MPL)와 알루미늄 염과의 배합물을 포함한다.
강화된 시스템은 모노포스포릴 리피드 A와 사포닌 유도체의 배합물, 특히 WO 94/00153에 기재된 QS21과 3D-MPL의 배합물, 또는 반응유도(reactogenic) 조성물을 포함하며, 상기에서 QS21은 WO 96/33739에 기재된 바와 같이 콜레스테롤로 제지된다.
수중유 에멀션중의 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 효과적인 보조제 제형은 WO 95/17210에 기재되어 있으며, 이는 바람직한 제형이다.
본 발명의 한 구체예에 있어서, 모노포스포릴 리피드 A 또는 이것의 유도체, 특히 3D-MPL로 보조된 본 발명에 따른 단백질을 포함하는 백신이 제공되어 있다.
바람직하게는, 백신은 추가적으로, 사포닌, 더욱 바람직하게는 QS21을 포함한다.
바람직하게는, 추가적인 제형은 수중유 에멀션 및 토코페롤을 추가적으로 포함한다. 본 발명은 또한, 약제학적으로 허용되는 부형제, 예컨데, 3D-MPL와 함께 본 발명에 따른 단백질을 혼합하는 것을 포함하여, 백신 제형을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 백신은 추가의 HIV 단백질, 예컨데, 엔벨로프 글리코단백질인 gp160 또는 이것의 유도체인 gp 120을 추가적으로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 피히아 파스토리스(Pichia pastoris)에 발현된 HIV Nef 또는 HIV Tat 단백질, 또는 이것의 유도체에 관한 것이다.
본 발명은 하기 실시예를 참조로 하여 추가로 설명될 것이다.
일반적
사람 면역결핍 바이러스(HIV-1)에 의해 코드화된 Nef 및 Tat 단백질, 즉 두개의 조절 단백질을 대장균 및 메틸로트로픽 효모인 피히아 파스토리스에서 생성시켰다.
Bru/Lai 단리물(Cell 40:9-17, 1985)로부터의 nef 유전자를, 이 유전자가 콘센서스 Nef에 가장 밀접하게 관련된 유전자중 하나이기 때문에, 이러한 구성물에 대해 선택하였다.
Bru/Lai nef 유전자에 대한 초기 물질은 포유동물 발현 벡터인 pcDNA3(pcDNA3/nef)상에 클로닝된 1170bp DNA 단편이었다.
tat 유전자는 BH10 분자 클론으로부터 기원되었다. 이 유전자는 HTLV Ⅲ cDNA 클론, 소위 pCV1으로서 수용되며, 문헌[Science, 229, p69-73, 1985]에 설명되어 있다.
1. 대장균에서 HIV-1 nef 및 tat 서열의 발현
Nef 단백질 뿐만 아니라 nef와 tat 서열의 융합물을 코드화하는 서열을 플라스미드 벡터에 위치시켰다: pRIT14586 및 pRIT14589(도 1 참조).
융합 파트너로서 단백질 D의 일부를 사용하므로써 융합 단백질로서의 Nef 및 Nef-Tat 융합 단백질을 생성시켰다. 단백질 D는 그람-네거티브 박티리아인 헤모필루스 인플루엔자의 표면에 노출된 면역글로불린 D 결합 단백질이다.
pRIT14586은 λPL 프로모터의 조절하의, 단백질 D(Infect. Immun. 60: 1336-1342, 1992)의 첫 번째 127개 아미노산을 코딩하는 박테리아 헤모필루스 인플루엔자로부터 유도된 DNA 서열, 바로 뒤에, 다중 클로닝 부위 영역, 및 하나의 글리신, 6개의 히스티딘 잔기 및 정지 코돈을 코딩하는 DNA 서열을 함유한다(도 1A).
본 벡터는 프로세싱된 리피드화 His 테일링된 융합 단백질을 발현하도록 고안되었다(Lipo D 융합 단백질). 융합 단백질은 18개의 아미노산 잔기의 긴 시그널 서열을 갖는 프리커서로서 합성되며, 프로세싱 후, 프리커서 분자의 위치 19에서의 시스테인은 아미노 말단 잔기가 되며, 이는 그 후, 공유 결합 지방산에 의해 변형된다(도 1B).
pRIT14589는 protD 유도된 서열이 시스테인 19 코돈 직후에 시작된다는 것을 제외하고는 pRIT14586과 거의 동일하다.
본 벡터로부터의 발현은 His 테일링되고, 리피드화된 융합 단백질을 유도한다(Prot D 융합 단백질).
네개의 구성물이 하기와 같이 제조되었다: LipoD-nef-His, LipoD-nef-tat-His, ProtD-nef-His, 및 ProtD-nef-tat-His.
처음 두개의 구성물은 발현 벡터 pRIT14586을 사용하여 제조하였으며, 나머지 두개의 구성물은 pRIT14589를 사용하여 제조하였다.
1.1 LIPOD-Nef-HIS 융합 단백질을 생성하는 재조합 균주 ECLD-N1의 구성
1.1.1 lipoD-nef-His 발현 플라스미드 pRIT14595의 구성
nef 유전자(Bru/Lai 단리물)를 프라이머 01 및 02를 갖는 pcDNA3/Nef 플라스미드로부터 PCR에 의해 증폭하였다.
NcoI
프라이머 01(서열 번호: 1): 5' ATCGTCCATG.GGT.GGC.AAG.TGG.T 3'
SpeI
프라이머 02(서열 번호: 2): 5' CGGCTACTAGTGCAGTTCTTGAA 3'
증폭된 nefDNA 영역은 누클레오티드 8357에서 시작하여, 누클레오티드 8971에서 종료된다(Cell, 40:9-17, 1985).
NcoI 제한 부위(nef 유전자의 ATG 코돈을 수반)를 PCR 단편의 5' 말단에 도입시키고, SpeI 부위를 3' 말단에 도입시켰다.
수득된 PCR 단편 및 발현 플라스미드 pRIT14586 둘 모두를 NcoI 및 SpeI로 제한시키고, 아가로스 겔상에서 정제시키고, 결합시켜, 적합한 대장균 숙주인 균주 AR58을 형질전환시켰다. 이 균주는 N99로부터 유도된 잠복성 λ 용원균이며, 즉 galE::Tn10, △-8(chlD-pgl), △-H1(cro-chlA), N+및 cI857이다.
자동 시퀀싱에 의해 nef 증폭된 영역을 검정한 후(하기 1.1.2 참조), 생성된 재조합 플라스미드에 pRIT14595 명칭을 부여하였다.
1.1.2 pRIT14595를 갖는 대장균 균주 AR58의 형질전환체의 선택
AR58 대장균 숙주 균주를 형질전환시킬 경우, 재조합 플라스미드는 내열성 이종 단백질 생성을 유도한다.
수개의 재조합 lipoD-Nef-His 형질전환체의 내열성 단백질 생성물을 코마시에 블루(Coomassie Blue) 염색시킨 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 분석된 모든 형질전환체는 내열성의 이종 단백질을 생성하는 것으로 나타났다. 다양한 재조합 LipoD-Nef-Tat-His 융합 단백질이 총 단백질의 10%인 것으로 추정되었다.
하나의 형질전환체를 선택하고, 실험실 획득 번호 ECLD-N1을 부여하였다.
재조합 플라스미드를 균주 ECLD-N1으로부터 재단리시키고, nef-His 코딩 영역의 서열을 자동화된 시퀀싱에 의해 확인하였다. 이러한 플라스미드는 공인 명칭 pRIT14595를 부여받았다.
균주 ECLD-N1에 의해 생성된 완전히 프로세싱되고 아실화된 재조합체인 Lipo D-nef-His 융합 단백질은 하기로 구성되어 있다:
。 지방산
。 단백질 D의 109개의 아미노산(아미노산 19에서 시작하여 아미노산 127까지 확장)
。 pRIT14586의 NcoI 클로닝 부위를 사용하여 생성된 메티오닌(도 1)
。 Nef 단백질의 205개의 아미노산(아미노산 2에서 시작하여 아미노산 206까지 확장)
。 클로닝 공정에 의해 생성된 트레오닌(pRIT14586의 SpeI 부위에서 클로닝)
。 하나의 글리신 및 여섯개의 히스티딘
1.2 PROT D-Nef-HIS 융합 단백질을 생성하는 재조합 균주 ECD-N1의 구성
Prot D-Nef-His 융합 단백질을 코드화하는 발현 플라스미드 pRIT14600의 구성물은, PCR 증폭된 nef 단편에 대한 수용체 플라스미드로서 pRIT14589를 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 1.1.1에 설명된 플라스미드 구성물과 동일하였다.
대장균 AR58 균주를 pRIT14600으로 형질전환시키고, 형질전환체를 실시예 1.1.2.에 설명된 바와 같이 분석하였다. 선택된 형질전환체에 실험실 획득 번호 ECD-N1을 부여하였다.
1.3 LIPO D-Nef-HIS 융합 단백질을 생성하는 재조합 균주 ECLD-NT6의 구성
1.3.1 lipo D-Nef-Tat-His 발현 플라스미드 pRIT14596의 구성
tat 유전자(BH10 단리물)를 프라이머 03 및 04를 갖는 pCV1의 유도체로부터 PCR에 의해 증폭하였다.
SpeI
프라이머 03(서열 번호: 3): 5' ATCGTACTAGT.GAG.CCA.GTA.GAT.C 3'
SpeI
프라이머 04(서열 번호: 4): 5' CGGCTACTAGTTTCCTTCGGGCCT 3'
증폭된 tat 유전자의 누클레오티드 서열은 pCV1 클론에 예시되어 있으며(Science 229:69-73, 1985), 이는 누클레오티드 5414에서 누클레오티드 7998에 걸쳐있다.
수득된 PCR 단편 및 플라스미드 pRIT14595(lipoD-Nef-His 단백질을 발현) 둘 모두를 SpeI 제한 효소로 절단하고, 아가로스 겔상에서 정제하고, 결합시켜 적합한 AR58 세포를 형질전환시켰다. 자동 시퀀싱에 의해 tat 증폭된 영역을 검정한 후(하기 1.3.2 참조), 생성된 재조합 플라스미드에 pRIT14596 명칭을 부여하였다.
1.3.2 pRIT14596을 갖는 균주 AR48의 형질전환체의 선택
형질전환체를 성장시키고, 열 유발시키고, 이것의 단백질을 코마시에 블루 염색시킨 겔에 의해 분석하였다. 재조합 단백질의 생성 수준은 총 단백질의 1%인 것으로 추정되었다. 한 재조합 균주를 선택하고, 실험실 명칭 ECLD-NT6을 부여하였다.
lipoD-nef-tat-His 재조합 플라스미드를 ECLD-NT6 균주로부터 재단리시키고, 시퀀싱하여, 공인 명칭 pRIT14596을 부여하였다.
계통 ECLD-N6에 의해 생성된 완전하게 프로세싱되고 아실화된 재조합체인 Lipo D-Nef-Tat-His 융합 단백질은 하기로 구성되어 있다:
。 지방산
。 단백질 D의 109개의 아미노산(아미노산 19에서 시작하여 아미노산 127까지 확장)
。 pRIT14586의 NcoI 클로닝 부위를 사용하여 생성된 메티오닌
。 Nef 단백질의 205개의 아미노산(아미노산 2에서 시작하여 아미노산 206까지 확장)
。 클로닝 공정에 의해 생성된 트레오닌 및 세린
。 Tat 단백질의 85개의 아미노산(아미노산 2에서 시작하여 아미노산 86까지 확장)
。 클로닝 공정에 의해 유도된 트레오닌 및 세린
。 하나의 글리신 및 여섯개의 히스티딘
1.4 PROT D-Nef-Tat-HIS 융합 단백질을 생성하는 재조합 균주 ECD-NT1의 구성
Prot D-Nef-Tat-His 융합 단백질을 코드화하는 발현 플라스미드 pRIT14601의 구성물은, PCR 증폭된 nef 단편에 대한 수용체 플라스미드로서 pRIT14600를 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 1.3.1에 설명된 플라스미드 구성물과 동일하였다.
대장균 AR58 균주를 pRIT14601로 형질전환시키고, 형질전환체를 상기 설명된 바와 같이 분석하였다. 선택된 형질전환체에 실험실 획득 번호 ECD-NT1을 부여하였다.
2. 피히아 파스토리스에서 HIV-1 nef 및 tat 서열의 발현
Nef 단백질, Tat 단백질 및 융합 단백질 Nef-Tat를 유도가능한 알코올 옥시다아제(AOX1) 프로모터의 조절하에 메틸로트로픽 효모인 피히아 파스토리스에서 발현시켰다.
이러한 HIV-1 유전자를 발현시키기 위해, 변형된 변형물의 통합 벡터 PHIL-D2(시험관내)를 사용하였다. AOX1 유전자의 천연 ATC 코돈 바로 뒤에서 이종 단백질의 발현이 개시되어, 하나의 글리신 및 여섯개의 히스티딘 잔기를 갖는 재조합 단백질이 생성될 수 있는 방식으로, 상기 벡터를 변형시켰다. 이러한 PHIL-D2-MOD 벡터를 PHIL-D2 벡터의 인접한 AsuⅡ 및 EcoRⅠ 사이의 올리고누클레오티드 링커를 클로닝하므로써 구성시켰다(도 3참조). His 테일 이외에, 이 링커는 NcoI, SpeI 및 XbaI 제한 부위를 수반하며, 이 부위 사이에는 nef, tat 및 nef-tat 융합 단백질이 삽입되어 있다.
2.1 통합 벡터인 pRIT14597(Nef-His 단백질을 코드화), pRIT14598(Tat-His 단백질을 코드화) 및 pRIT14599(융합 단백질 Nef-Tat-His를 코드화)의 구성
nef 유전자를, 프라이머 01 및 02를 갖는 pcDNA3/Nef 플라스미드로부터의 PCR에 의해 증폭하였다(1.1.1의 pRIT14595의 구성 참조). 수득된 PCR 단편 및 통합 PHIL-D2-MOD 벡터 둘 모두를 NcoI 및 SpeI에 의해 제한시키고, 아가로스 겔상에서 정제시키고, 결합시켜 통합 플라스미드 pRIT14597을 생성시켰다(도 3 참조).
tat 유전자를, 프라이머 05 및 04를 갖는 pCV1 플라스미드 유도체로부터 PCR에 의해 증폭하였다(1.3.1의 pRIT14596의 구성 참조):
NcoI
프라이머 05(서열 번호: 1): 5' ATCGTCCATGGAGCCAGTAGATC 3'
NcoI 제한 부위를 PCR 단편의 5' 말단에 도입시키고, SpeI 부위를 프라이머 04를 갖는 3' 말단에 도입시켰다. 수득된 PCR 단편 및 PHIL-D2-MOD 벡터 둘 모두를 NcoI 및 SpeI로 제한시키고, 아가로스 겔상에서 정제시키고, 결합시켜 통합 플라스미드 pRIT14598을 생성시켰다.
pRIT14599를 구성하기 위해, nef-tat-His 코딩 서열에 상응하는 DNA 단편을 PHIL-D2-MOD 벡터의 EcoR1 블런트(blunt)된 부위(T4 중합효소) 및 NcoI 부위 사이에 결합시켰다. nef-tat-His 코딩 단편을 pRIT14596의 XbaI 블런트된 분해(T4 중합효소)와 NcoI 분해에 의해 수득하였다.
2.2 피히아 파스토리스 균주 GS115(his4)의 형질전환
Nef-His, Tat-His 및 융합 단백질 Nef-Tat-His를 발현하는 피히아 파스토리스 균주를 수득하기 위해서, 균주 GS115를 숙주 게놈에서 his4를 보충하기 위한 HIS4 유전자를 갖는 각각의 발현 카세트를 수반하는 직쇄 NotI 단편으로 형질전환시켰다. NotI 직쇄 단편으로의 GS115 형질전환은 AOXI 유전자좌에서의 재조합에 유리하다.
다중복사 성분 클론을 정량적 닷 블롯 분석(quantitative dot blot analysis)에 의해 선택하고, 통합, 삽입(Mut+표현형) 또는 트랜스플레이스먼트(Mut5표현형)의 유형을 측정하였다.
각각의 형질전환으로부터, 재조합 단백질의 높은 생산 수준을 나타내는 한 형질전환체를 선택하였다:
재조합 Nef-His 단백질인 미리스틸화된 215개의 아미노산 단백질을 생성하는 균주 Y1738(Mut+표현형)은 하기로 구성되어 있다:
。 미리스트산
。 PHIL-D2-MOD 벡터의 NcoI 클로닝 부위를 사용하여 생성된 메티오닌
。 Nef 단백질의 205개의 아미노산(아미노산 2에서 시작하여 아미노산 206까지 확장)
。 클로닝 공정에 의해 생성된 트레오닌 및 세린(PHIL-D2-MOD 벡터의 SpeI 부위에서 클로닝)
。 하나의 글리신 및 여섯개의 히스티딘
Tat-His 단백질인 95개의 아미노산 단백질을 생성하는 균주 Y1739(Mut+표현형)은 하기로 구성되어 있다:
。 NcoI 클로닝 부위를 사용하여 생성된 메티오닌
。 Tat 단백질의 85개의 아미노산(아미노산 2에서 시작하여 아미노산 86까지 확장)
。 클로닝 공정에 의해 유도된 트레오닌 및 세린
。 하나의 글리신 및 여섯개의 히스티딘
재조합체인 Nef-Tat-His 융합 단백질인 미리스틸화된 302 아미노산 단백질을 생성하는 균주 Y1737(Mut5표현형)은 하기로 구성되어 있다:
。 미리스트산
。 NcoI 클로닝 부위를 사용하여 생성된 메티오닌
。 Nef 단백질의 205개의 아미노산(아미노산 2에서 시작하여 아미노산 206까지 확장)
。 클로닝 공정에 의해 생성된 트레오닌 및 세린
。 Tat 단백질의 85개의 아미노산(아미노산 2에서 시작하여 아미노산 86까지 확장)
。 클로닝 공정에 의해 유도된 트레오닌 및 세린
。 하나의 글리신 및 여섯개의 히스티딘
3. 피히아 파스토리스에서 HIV-1 Tat-변이의 발현
Nef-Tat 단백질 뿐만 아니라, 변이 재조합체 Tat 단백질 또한 발현되었다. 변이 Tat 단백질은 이것의 면역원적 에피토프는 유지하면서 생물학적으로는 불활성이어야 한다.
이러한 구성물에 있어서 디.클레먼츠(D.Clements)(Tulane University)에 의해 구성된 이중 변이 tat 유전자를 선택하였다.
이러한 tat 유전자(BH10 분자 클론으로부터 기원됨)는 활성 부위 영역(Lys41-＞Ala) 및 RGD 모티프(Arg78-＞Lys 및 Asp80-＞Glu)에서 변이를 함유한다(Virology 235:48-64, 1997)
변이 tat 유전자는 CMV 발현 플라스미드(pCMVLys41/KGE)내의 EcoRI과 HindⅢ 부위 사이로 서브클로닝된 cDNA 단편으로서 수용되었다.
3.1 통합 벡터의 구성
pRIT14912(Tat 변이-His 단백질을 코드화) 및 pRIT14913(융합 Nef-Tat 변이-His)
tat 변이 유전자를 프라이머 05 및 04를 갖는 pCMVLys41/KGe 플라스미드로부터 PCR에 의해 증폭시켰다(2.1의 pRIT14598의 구성 참조).
NcoI 제한 부위를 PCR 단편의 5' 말단에 도입시키고, SpeI 부위를 프라이머 04를 갖는 3' 말단에 도입시켰다. 수득된 PCR 단편 및 PHIL-D2-MOD 벡터 둘 모두를 NcoI 및 SpeI에 의해 제한시키고, 아가로스 겔상에서 정제시키고, 결합시켜 통합 플라스미드 pRIT14912를 생성시켰다.
pRIT14913을 구성하기 위해, tat 변이 유전자를 프라이머 03 및 04를 갖는 pCMVLys41/KGE 플라스미드로부터 PCR에 의해 증폭하였다(1.3.1 pRIT14596의 구성 참조).
수득된 PCR 단편 및 플라스미드 pRIT14597(Nef-His 단백질 발현) 둘 모두를 SpeI 제한 효소에 의해 절단하고, 아가로스 겔상에서 정제하고, 결합시켜 통합 플라스미드 pRIT14913을 생성시켰다.
3.2 피히아 파스토리스 균주 GS115의 형질전환
Tat 변이-His 단백질 및 융합 Nef-Tat 변이-His를 발현하는 피히아 파스토리스 균주를, 상기 2.2에 설명된 통합 및 재조합 균주 선택 방법을 적용시켜 수득하였다.
Tat 변이-His 단백질인 95개의 아미노산 단백질을 생성하는 2종의 재조합 균주를 선택하였다: Y1775(Mut+표현형) 및 Y1776(Mut5표현형)
Nef-Tat 변이-His 융합 단백질인 302 아미노산 단백질을 발현하는 1종의 재조합 균주를 선택하였다: Y1774(Mut+표현형)
4. Nef-Tat-His 융합 단백질의 정제화(피히아 파스토리스)
146g의 재조합 피히아 파스토리스 세포(습식 중량) 또는 2L의 디노-밀(Dyno-mill) 균등물 OD 55로부터 정제 개략도를 전개시켰다. 크로마토그래피 단계를 실온에서 수행하였다. 상기 단계 사이에, Nef-Tat 파지티브 분획을 저온(+4℃)에서 밤새 유지시켰다; 더 긴 시간 동안 샘플을 -20℃에서 냉각시켰다.
146g의 피히아 파스토리스 세포
↓
균질화 완충액: 2L 50mM PO4pH 7.0 최종 OD:50
↓
디노-밀 분해(4회)
↓
원심분리 JA10 로터/9500rpm/30분/실온
↓
세척 완충액: +2L 10mM PO4pH7.5 -
(1h-4℃) 150mM-NaCl 0.5% 엠피젠(empigen)
↓
원심분리 JA10 로터/95000rpm/30분/실온
↓
펠렛
↓
용해 완충액: +660ml 10mM PO4pH7.5 -
(O/N-4℃) 150mM NaCl-4.0M GuHCl
↓
환원 +0.2M 2-메르캅토에탄술폰산,
(4H-실온-암실) 나트륨염(분말 첨가)/인큐베이션 전에 pH를
↓ 7.5로 조절(0.5M NaOH로)
카르복시메틸화 +0.25M 요오도아세트아미드(분말 첨가)/
(1/2h-실온-암실) 인큐베이션 전에 pH를 7.5로 조절
↓ (0.5M NaOH로)
Ni++-NTA-아가로스상에 평형 완충액: 10mM PO4pH7.5 -
부동화된 금속이온 친화성 150mM NaCl - 4.0M GuHCl
크로마토그래피 세척 완충액: 1) 평형 완충액
2) 10mM PO4pH7.5 - 150mM NaCl - 6M 우레아
3) 10mM PO4pH7.5 - 150mM Nacl- 6M 우레아-
25mM 이미다졸
용리 완충액: 10mM PO4pH7.5 - 150mM NaCl -
↓ 6M 우레아 - 0.5M 이미다졸
희석 18mS/cm의 이온 강도로 저하
↓ 희석 완충액: 10mM PO4pH7.5 - 6M 우레아
SP 세파로오스 FF 상에서의 평형 완충액: 10mM PO4pH7.5 -
양이온 교환 크로마토그래피 150mM NaCl - 6.0M 우레아
(파마시아 - 30ml의 수지) 세척 완충액: 1) 평형 완충액
2) 10mM PO4pH7.5 - 250mM NaCl - 6M 우레아
용리 완충액: 10mM 보레이트 pH9.0 -
↓ 2M NaCl - 6M 우레아
농축 5mg/ml 까지 10kDa 오메가 막(필트론)
↓
수퍼덱스200 XK 16/60상에서 용리 완충액: 10mM PO4pH7.5 -
겔 여과 크로마토그래피 150mM NaCl - 6M 우레아
(파마시아 - 120ml의 수지) 5ml의 샘플/주입-＞5회 주입
↓
투석 완충액: 10mM PO4pH6.8 -
(O/N - 4℃) 150mM NaCl - 0.5M 아르기닌*
↓
멸균 여과 밀렉스 GV 0.22μm
* 비: 1600㎍/ml의 단백질 농도에 대해서 0.5M 아르기닌
순도
SDS-PAGE에 의해 추정된 순도 수준은 다이히 실버 염색(Daiichi Silver Staining)에 의해 도 4에 나타냈으며, 코마시에 블루 G250에 의해 도 5에 나타내었다.
수퍼덱스200 단계 후: ＞95%
투석 및 멸균 여과 단계 후: ＞95%
회수
51mg의 Nef-Tat-his 단백질을 146g의 재조합체 피히아 파스토리스 세포(=2L의 디노-밀 균등물 OD 55)로부터 정제하였다.
5. 백신 제조
본 발명에 따라 제조된 백신은 실시예 1 또는 2에 예시된 바와 같은 항원을 코드화하는 DNA 재조합체의 발현 생성물 및 보조제로서, 수중유 에멀션중의 3 데-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A 3D-MPL 및 QS21의 혼합물을 포함하는 제형을 포함한다.
3D-MPL:은 그람-네거티브 박테리아 살모넬라 미네소타의 리포폴리사카라이드(LPS)의 화학적으로 해독된 형태이다.
스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈에서 수행된 실험은, 다양한 비히클과 배합된 3D-MPL이 체액성 및 TH1 유형의 세포 면역성 둘 모두를 매우 증진시키는 것으로 나타냈다.
QS21:은 퀼리야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina) 나무의 껍질의 미정제 추출물로부터 정제된 한 사포닌이며, 이는 강한 보조 활성을 갖는다: 이는 항원 특이적 림프구증식 및 여러 항원에 대한 CTL을 활성화시킨다.
스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈에서 수행된 실험은, 체액성 및 TH1 유형의 세포 면역 반응 유도에서 3D-MPL 및 QS21의 배합의 명백한 공동상승 효과를 입증하였다.
오일/물 에멀션은 2 오일(토코페롤 및 스쿠알렌) 및 에멀션화제로서 트윈 80을 함유하는 PBS로 구성되어 있다. 에멀션은 5% 스쿠알렌, 5% 토코페롤, 0.4% 트윈 80을 포함하며, 180nm의 평균 입자 크기를 갖는다(WO 95/17210 참조).
스미스클라인 비이참 바이오로지칼즈에서 수행된 실험은, 3D-MPL/QS21에 대한 O/W 에멀션의 첨가가 추가로 이들의 면역자극 특성을 증가시킨다는 것을 입증하였다.
오일/물 에멀션의 제조(2배 농도)
트윈 80을 인산염 완충 염수(PBS)에 용해시켜, PBS중의 2% 용액을 제공하였다. 100ml의 2배 농도 에멀션을 제공하기 위해, 5g의 DL 알파 토코페롤 및 5ml의 스쿠알렌을 볼텍스하여 완전히 혼합시켰다. 90ml의 PBS/트윈 용액을 첨가하고, 완전히 혼합하였다. 그 후, 생성된 에멀션을 주사기를 통과시키고, 최종적으로 M110S 미세유동화 기기를 사용하여 미세유동화시켰다. 생성된 오일 점적의 크기는 약 180nm이었다.
수중유 제형의 제조
실시예 1 또는 2에 따라 제조된 항원(5㎍)을 10배 농축된 PBS(pH6.8) 및 H2O로 희석시킨 후, 연속적으로 SB62, 3D-MPL(5㎍), QS21(5㎍) 및 방부제로서의 50㎍/ml의 티오머살을 5분 간격으로 첨가하였다. 에멀션 용량은 총 용량의 50%이었다(100㎕의 용량에 대해 50㎕).
모든 인큐베이션은 교반시키면서 실온에서 수행하였다.
6. 설치동물에서 Tat 및 Nef-Tat의 면역원성
Tat 및 NefTat로 면역화시킨 후 유도된 면역 반응을 특징화를 수행하였다. 이소타입 프로필 및 세포 매개된 면역성(CMI)에 대한 정보를 수득하기 위해, 두번의 면역화 실험을 마우스에서 시험하였다. 첫 번째 실험에서, 마우스를 2주 동안 2회 산화되거나 환원된 형태의 Tat 또는 NefTat 각각을 별도로 발바닥에 주입하여 면역화시켰다. 항원을, 스쿠알렌, 트윈 80(등록 상표명: TWEEN 80)(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트), QS21, 3D-MPL 및 α-토코페롤을 포함하는 수중유 에멀션중에 제형화시키고, 대조군은 단지 보조제만 수용하게 하였다. 마직막 면역화시킨 2주 후에, 혈청을 수득하고, 항체 역가 및 이소타입을 측정하기 위해 Tat-특이적 ELISA(코딩에 대해 환원된 Tat 사용)로 처리하였다(도 6a). 항체 역가는 산화된 Tat를 수용한 마우스에서 가장 높았다. 일반적으로, 산화된 분자는 환원된 형태보다 더 높은 항체 역가를 유도하며, 단독 Tat가 NefTat 보다 더 높은 항체를 유도하였다. 후자의 관찰은 두번째 실험에서 확인되었다. 가장 흥미롭게도, Tat-특이적 항체의 이소타입 프로필은 면역화에 사용되는 항원에 따라 상이하다. 단독 Tat가 균형을 이룬 IgG1 및 IgG2a 프로필을 유도해낸 반면, NefTat는 더욱 강한 TH2성향을 유도해냈다(도 6b). 이 또한, 두 번째 실험에서 확인되었다.
두 번째 마우스 실험에서, 동물이 단지 환원된 형태의 분자 또는 보조제만을 수용하게 하였다. 혈청학적 분석(상기 참조) 이외에, 림프절 세포로부터의 림프구증식 반응을 평가하였다. 이러한 세포를 시험관내에서 Tat 또는 NefTat로 재자극시킨 후,3H-티미딘 삽입을 배양 4일 후에 측정하였다. 자극 인덱스로서 나타낸 결과는, 매우 강한 반응이 항원을 수용한 두 마우스 그룹 모두에서 유도된다는 것을 보여주었다(도 7).
결론적으로, 마우스 연구는, Nef-Tat 뿐만 아니라 Tat는 매우 면역원성인 후부 백신 항원이다. 두 분자에 대해 유도된 면역 반응은, 50% 이상의 IgG1의 높은 항체 반응을 특징으로 한다. 게다가, 강한 CMI 반응(림프구증식에 의해 측정된 바와 같이)이 관찰되었다.
7. Tat 및 Nef-Tat 단백질의 작용 특성
산화되거나 환원된 형태의 Tat 및 NefTat 분자를, 사람 T 세포계에 결합하는 이들의 능력에 대해 조사하였다. 게다가, 이러한 세포주의 성장에 대한 영향을 평가하였다. ELISA 플레이트를 밤새 상이한 농도의 Tat 및 NefTat 단백질, 단순포진 바이러스 유형 Ⅱ로부터의 무관한 gD 또는 대조를 위한 완충액 단독으로 피복시켰다. 피복 용액을 제거한 후, HUT-78 세포를 웰에 첨가하였다. 2시간 동안 인큐베이션 시킨 후, 웰을 세척하고, 웰의 바닥에 결합된 세포를 현미경으로 평가하였다. 정량적 측정으로서, 세포를 톨루이딘 블루로 염색하고, SDS로 용해시키고, ELISA 플레이트 리더를 사용하여 상청액중의 톨루이딘 블루 농도를 측정하였다. 결과는, 모든 네개의 단백질, 산화되거나 환원된 형태의 Tat 및 NefTat가 ELISA 플레이트로의세포 결합을 매개한다는 것을 보여준다(도 8). 무관한 단백질(데이타는 미기재됨) 및 완충액은 세포를 고정시키지 못하였다. 이는 재조합적으로 발현된 Tat 함유 단백질이 사람 T 세포주에 특이적으로 결합한다는 것을 보여준다.
두 번째 실험에서, HUT-78 세포를 16시간 동안 단백질과 접촉시켰다. 인큐베이션 말기에, 세포를 [3H]-티미딘으로 라벨링시키고, 혼입율을 측정하여 세포 성장을 측정하였다. 이 분석에 포함된 모든 네 단백질은, 감소된 방사성 혼입으로 판단컨데 세포 성장을 억제하였다(도 9). 완충액 대조군은 이러한 효과를 조절하지 못하였다. 이러한 결과는, 재조합체 Tat 함유 단백질이 사람 T 세포주의 성장을 억제할 수 있다는 것을 입증한다.
요약하면, Tat 및 NefTat 단백질은 작용 특징화는, 이러한 단백질이 사람 T 세포주에 결합할 수 있다는 것을 보여준다. 게다가, 상기 단백질은 이러한 세포주의 성장을 억제시킬 수 있다.
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(B) 서열의 형: 아미노산
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(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :13:
(2) 서열 번호 14에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
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(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :14:
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(B) 서열의 형: 아미노산
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(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :15:
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(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 1290 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :16:
(2) 서열 번호 17에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 412 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :17:
(2) 서열 번호 18에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 981 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :18:
(2) 서열 번호 19에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 327 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :19:
(2) 서열 번호 20에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 1242 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :20:
(2) 서열 번호 21에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 414 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :21:
(2) 서열 번호 22에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 288 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :22:
(2) 서열 번호 23에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 96 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :23:
(2) 서열 번호 24에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 909 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :24:
(2) 서열 번호 25에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 303 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :25:
(2) 서열 번호 26에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 57 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :26:
(2) 서열 번호 27에 대한 사항:
(ⅰ) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 17 아미노산
(B) 서열의 형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅹⅰ) 서열 설명: 서열 번호 :27:
Claims (24)
- (a) (ⅰ) 융합 파트너 또는 (ⅱ) HIV Nef 단백질 또는 이것의 유도체에 연결된 HIV Tat 단백질 또는 이것의 유도체;(b) (ⅰ) 융합 파트너 또는 (ⅱ) HIV Tat 단백질 또는 이것의 유도체에 연결된 HIV Nef 단백질 또는 이것의 유도체; 또는(c) HIV Tat 단백질 또는 이것의 유도체, 및 융합 파트너에 연결된 HIV Nef 단백질 또는 이것의 유도체를 포함하는 단백질.
- 제 1 항에 있어서, Tat-Nef 융합 단백질 또는 이것의 유도체임을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항에 있어서, Nef-Tat 융합 단백질 또는 이것의 유도체임을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항에 있어서, Tat 단백질의 유도체가 변이된 Tat 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항에 있어서, Nef 단백질의 유도체가 변이된 Nef 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항 내지 제 5 항중의 어느 한 항에 있어서, 융합 파트너가 지질단백질 또는 이것의 유도체임을 특징으로 하는 단백질.
- 제 6 항에 있어서, 지질단백질이 헤모필루스 인플루엔자 B 단백질 D 또는 이것의 유도체임을 특징으로 하는 단백질.
- 제 7 항에 있어서, 융합 파트너가 헤모필루스 인플루엔자 B 단백질 D의 N 말단으로부터의 100 내지 130개의 아미노산을 포함함을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항 내지 제 8 항중의 어느 한 항에 있어서, Tat 단백질이 전체 Tat 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항 내지 제 8 항중의 어느 한 항에 있어서, Nef 단백질이 전체 Nef 단백질임을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항 내지 제 10 항중의 어느 한 항에 있어서, Tat 단백질이 HIV Nef 단백질 및 융합 파트러에 융합됨을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항 내지 제 11 항중의 어느 한 항에 있어서, 단백질이 히스티딘 테일을 가짐을 특징으로 하는 단백질.
- 제 1 항 내지 제 12 항중의 어느 한 항에 따른 단백질을 코드화하는 핵산.
- 제 13 항에 따른 핵산으로 형질전환된 숙주.
- 제 14 항에 있어서, 숙주가 피히아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 대장균임을 특징으로 하는 숙주.
- 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 제 1 항 내지 제 12 항중의 어느 한 항에 따른 단백질을 포함하는 백신.
- 보조제를 추가적으로 포함하는 제 16 항에 따른 백신.
- 제 17 항에 있어서, 보조제가 TH1 유도 보조제임을 특징으로 하는 백신.
- 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 보조제가 모노포스포릴 리피드 A 또는 이것의 유도체, 예컨데, 3 데-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A를 포함함을 특징으로 하는 백신.
- 사포닌 보조제를 추가로 포함하는 제 16 항 내지 제 19 항중의 어느 한 항에 따른 백신.
- 제 1 항 내지 제 12 항중의 어느 한 항에 따른 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 제 1 항 내지 제 12 항중의 어느 한 항에 따른 단백질을 코드화하는 핵산으로 숙주를 형질전환시키는 단계, 단백질을 발현시키는 단계 및 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
- 제 21 항에 있어서, 숙주가 대장균 또는 피히아 파스토리스임을 특징으로 하는 방법.
- 제 16 항 내지 제 20 항중의 어느 한 항에 있어서, 제 1 항 내지 제 12 항중의 어느 한 항에 따른 단백질을 약제학적으로 허용되는 희석액과 혼합시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
- 피히아 파스토리스에서 (ⅰ) HIV Nef 단백질 또는 이것의 유도체, 또는 (ⅱ) HIV Tat 단백질 또는 이것의 유도체를 제조하는 방법으로서, 피히아 파스토리스를, HIV Nef 단백질 또는 이것의 유도체, 또는 HIV Tat 단백질 또는 이것의 유도체를 코드화하는 DNA로 형질전환시키는 단계, 단백질을 발현시키는 단계 및 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
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| KR100466382B1 (ko) * | 2002-01-08 | 2005-01-14 | 주식회사 엘지생명과학 | 인간 면역 결핍 바이러스-1, -2 타입의 단백질이 융합된 재조합 콤보 단백질, 이의 생산방법, 이를 포함하는 벡터, 형질전환된 대장균 및 진단키트 |
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