KR20240011714A - 치료용 항체를 발현하는 비바이러스성 dna 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

치료용 항체를 발현하는 비바이러스성 dna 벡터 및 이의 용도 Download PDF

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KR20240011714A
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나다니엘 실버
더글라스 앤서니 커
필립 사마요아
싯다르트 진달
라파엘 가네
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제너레이션 바이오 컴퍼니
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Abstract

본 출원은 세포, 조직 또는 대상에서 항체 및 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 데 유용한 ceDNA 벡터를 포함하는 방법 및 조성물과, 다양한 질환, 장애 및 암의 치료 및/또는 예방 방법을 설명한다.

Description

치료용 항체를 발현하는 비바이러스성 DNA 벡터 및 이의 용도
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2021년 4월 27일자 출원된 미국 임시출원 제63/180,382호를 우선권 주장하며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
기술분야
본 개시내용은 대상 또는 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키기 위한 비(non)바이러스성 벡터를 포함하는 항체 치료제 분야에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 핵산을 포함하는 핵산 작제물, 프로모터, 벡터 및 숙주세포뿐 아니라, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 전이유전자를 표적 세포, 조직, 기관 또는 유기체로 전달하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 본 개시내용은 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키기 위해, 예를 들어 감염, 질환 또는 장애가 있는 대상의 치료를 위해 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키기 위해 비바이러스성 ceDNA 벡터를 사용하는 방법을 제공한다. 항체 치료제로 치료될 수 있는 임의의 감염, 질환 또는 장애가 본 개시내용에 의해 구상된다. 상기 방법 및 조성물은 또한, 예를 들어 이를 필요로 하는 대상에서 치료적 또는 예방적 목적을 위해 적용될 수 있다.
항체 기반 치료제(예를 들어, mAb)는 면역 장애, 암 및 감염성 질환을 치료하는 가장 성공적인 전략 중 하나로 제시되었다. 장기간 지속되는 치료 효과를 위해 충분히 높은 농도의 항체를 달성하기 위해서, 항체 요법은 전형적으로 반복 투여, 예를 들어 다회 주사를 통해 전달된다. 하지만, 이러한 투여 요법은 치료 기간에 전반에 걸쳐 항체 수준이 일정하지 않고, 투여당 효율이 제한적이고, 투여 비용이 높으며, 항체가 소모된다.
재조합 AAV(rAAV)는 수백 건의 임상 시험을 통해 형질도입의 안전성이 입증된, 아마도 인간에서 유전자 전달을 위해 가장 잘 연구된 벡터이다. 아데노연관바이러스(AAV: adeno-associated virus)는 파르보바이러스과(Parvoviridae)에 속하며, 더욱 구체적으로는 데펜도파르보바이러스(Dependoparvovirus)속을 구성한다. AAV 유래 벡터(즉, rAVV 또는 AAV 벡터)는 다음과 같은 이유로 유전 물질의 전달에 매력적이다: (i) 이는 근세포와 뉴런을 포함하는 다양한 비(non)분열 및 분열 세포 유형을 감염(형질도입)시킬 수 있는 능력이 있음; (ii) 이는 바이러스 구조 유전자가 없기 때문에, 바이러스 감염에 대한 숙주세포 반응, 예를 들어 인터페론 매개 반응을 감소시킬 수 있음; (iii) 야생형 바이러스는 인간에서 비(non)병적으로 간주됨; (iv) 숙주세포 게놈에 통합될 수 있는 야생형 AAV와 대조적으로, 복제불능 AAV 벡터에는 복제(rep) 유전자가 결여되어 있고 일반적으로 에피솜으로 지속되기 때문에, 삽입 돌연변이유발 또는 유전독성의 위험을 제한할 수 있음; 및 (v) 다른 벡터 시스템과 비교하여, AAV 벡터는 일반적으로 상대적으로 불량한 면역원인 것으로 여겨져 중요한 면역반응((ii) 참조)을 촉발시키지 않기 때문에, 벡터 DNA의 지속, 및 잠재적으로 치료용 전이유전자의 장기 발현을 얻을 수 있음.
하지만, 유전자 전달 벡터로서 AAV 입자를 사용하는 데에는 몇 가지 주요 결함이 있다. rAAV와 관련된 하나의 주요 단점은 약 4.5 kb로 제한된 이종 DNA 바이러스 패키징 용량으로(Dong 등의 문헌(1996); Athanasopoulos 등의 문헌(2004); Lai 등의 문헌(2010)), 그 결과, AAV 벡터의 사용은 150,000 Da 단백질 코딩 용량 미만으로 제한되어 있다. 특히 항체 전달과 관련하여, AAV의 패키징 제한은 천연 항체 구조를 형성하는 중쇄와 경쇄 둘 모두의 효율적인 전달에 대한 중요한 과제를 나타낸다. 두 번째 단점은, 집단에서 야생형 AAV 감염의 유병률로 인해, rAAV 유전자 요법 후보가 환자에서 벡터를 제거하는 중화 항체의 존재에 대해 스크리닝되어야 한다는 점이다. 세 번째 단점은, 초기 치료에서 제외되지 않았던 환자에게의 재투여를 막는 캡시드 면역원성과 관련이 있다. 환자의 면역계는 향후 치료를 방해하는 높은 역가의 항-AAV 항체를 생성하는 면역계를 자극하기 위해 "부스터(booster)" 주사 역할을 효과적으로 수행하는 벡터에 반응할 수 있다. 기존 면역은 형질도입의 효율성을 심각하게 제한할 수 있다. 일부 최근 보고서는, 고용량 조건에서 면역원성에 대한 우려를 나타낸다. 또 다른 주목할 만한 단점은, 단일가닥 AAV DNA가 이종 유전자 발현 전 이중가닥 DNA로 전환되어야 한다는 점을 고려할 때, AAV 매개 유전자 발현의 개시가 상대적으로 느리다는 점이다.
또한, 캡시드를 갖는 통상적인 AAV 비리온은 AAV 게놈, rep 유전자 및 cap 유전자를 함유하는 플라스미드 또는 플라스미드들을 도입하는 방식으로 생산된다(Grimm 등의 문헌(1998)). 하지만, 이러한 캡시드화된 AAV 바이러스 벡터는 특정 세포 및 조직 유형을 비효율적으로 형질도입하는 것으로 확인되었으며, 캡시드 또한 면역반응을 유도한다.
따라서, 항체 치료제의 전달을 위한 아데노연관바이러스(AAV) 벡터의 사용은 (환자 면역반응으로 인해) 환자에게의 단회 투여, 최소 바이러스 패키징 용량(약 4.5 kb)으로 인한 AAV 벡터에서 전달에 적합한 전이유전자 유전 물질의 제한된 범위, 및 느린 AAV 매개 유전자 발현으로 인해 제한된다.
개선된 치료제의 개발을 위해, 대안적인 투여 경로 또는 방식을 통한 항체와 항체 기반 치료제의 전달이 여전히 당업계에 필요하다.
본원에 기재된 기술은 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 캡시드 미함유(예를 들어, 비바이러스성) DNA 벡터(본원에서 "폐쇄형 DNA 벡터" 또는 "ceDNA 벡터"로 지칭됨)로서, 항체 중쇄와 항체 경쇄로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 이러한 ceDNA 벡터는 질환 및 장애(예를 들어, 면역 장애, 암, 감염성 질환)의 치료, 모니터링 및 진단을 위해 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 데 사용될 수 있다. 항체 중쇄와 항체 경쇄로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 발현하는 하나 이상의 ceDNA 벡터를 대상에게 적용하는 것은, 대상에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하거나, 이의 중증도를 감소시키고/시키거나, 전달 시 최소 침습이 되게 하고/하거나, 반복 가능하며 용량에 따른 효과가 나타나게 하고/하거나, 치료 효과가 신속하게 개시되게 하고/하거나, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 지속적인 발현을 유도하는 데 유용하다. 나아가, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 전이유전자(예를 들어, 핵산 서열)를 세포 또는 조직으로 전달하기 위해 ceDNA 벡터를 이용하면, 적응 면역반응이 우회되고, 면역화 또는 수동 전달의 사용 없이 목적하는 항체 특이성이 생성된다. 즉, ceDNA 벡터는 세포내이입을 통해 세포에 들어간 후, 엔도솜 구획에서 빠져나와 핵으로 운반된다. 전사적으로 활성인 ceDNA 에피솜은 인코딩된 항체를 발현시켜, 세포에서 순환계로 분비될 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터는 단회 주사로 투여된 항체(예를 들어, 본원에 기재된 치료용 항체 또는 그 안의 항원 결합 단편)의 연속적이고, 지속적이며, 장기적인 전달을 가능하게 할 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 항체 중쇄와 항체 경쇄로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 ceDNA 벡터는 리포좀 나노입자 제형(LNP)에 존재한다.
본원에 기재된 바와 같은 항체 중쇄와 항체 경쇄로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 ceDNA 벡터는, 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 상보적 DNA의 연속 가닥으로부터 형성된 캡시드 미함유 선형 이중체 DNA 분자(선형, 연속 및 비캡시드화된 구조)로서, 이는 5' 역말단반복(ITR) 서열과 3' ITR 서열을 포함하며, 여기서 5' ITR과 3' ITR은 서로에 대해 동일한 대칭인 3차원 구성을 가질 수 있거나(즉, 대칭 또는 실질적으로 대칭임), 또는 대안적으로, 5' ITR과 3' ITR은 서로에 대해 상이한 3차원 구성을 가질 수 있다(즉, 비대칭인 ITR). 또한, ITR은 동일하거나 상이한 혈청형에서 유래할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 기하학적 공간에서의 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖거나, 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는 ITR 서열을 포함할 수 있다(즉, 이들은 동일하거나 서로에 대해 거울상임). 일부 실시형태에 따르면, 하나의 ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 ITR은 상이한 AAV 혈청형에서 유래할 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 기술의 일부 양태는 항체 중쇄와 항체 경쇄로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 플랭킹하는 ITR 서열을 포함하는 상기 기재된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 개선된 단백질 발현 및/또는 생산을 위한 ceDNA 벡터로서, 여기서 ITR 서열은 (i) 적어도 하나의 WT ITR과 적어도 하나의 변형된 AAV 역말단반복서열(ITR)(예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (ii) 2개의 변형된 ITR(여기서 mod-ITR 쌍은 서로에 대해 상이한 3차원 공간 구성을 가짐)(예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (iii) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍(여기서 각각의 WT-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐); 또는 (iv) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍(여기서 각각의 mod-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐) 중 임의의 것에서 선택되는 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 진핵세포에서 생산될 수 있기 때문에, 곤충 세포에서 원핵세포 DNA 변형 및 박테리아 내독소 오염이 없다.
제1 양태에 따르면, 본 개시내용은 플랭킹 역말단반복서열(ITR) 사이에 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 ceDNA 벡터를 포함하는 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터 조성물로서, 여기서 적어도 하나의 핵산 서열은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄(HC) 및/또는 경쇄(LC)를 인코딩하는 ceDNA 벡터 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 핵산 서열은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 인코딩한다. 일부 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 핵산 서열은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 인코딩한다. 일부 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 핵산 서열은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC와 LC를 모두 인코딩한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 플랭킹 역말단반복서열(ITR) 사이에 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 제1 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터(여기서 적어도 하나의 핵산 서열은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄(HC)를 인코딩함)와, 플랭킹 역말단반복서열(ITR) 사이에 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 제2 ceDNA 벡터(여기서 적어도 하나의 핵산 서열은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄(LC)를 인코딩함)를 포함하는 캡시드 미함유 ceDNA 벡터 조합물을 제공한다.
상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, HC와 LC는 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:3 내지 3:1, 가장 바람직하게는 1.5:1(HC:LC)의 몰비로 존재한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, HC와 LC는 1:1 내지 2.5:1(HC:LC)의 몰비로 존재한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, HC와 LC는 1.5:1 내지 2.5:1(HC:LC)의 몰비로 존재한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, HC와 LC는 대략 1.5:1(HC:LC)의 몰비로 존재한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, HC와 LC는 대략 2.0:1(HC:LC)의 몰비로 존재한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, HC와 LC는 대략 2.5:1(HC:LC)의 몰비로 존재한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, 제1 ceDNA와 제2 ceDNA는 함께, HC와 LC를 포함하는 적어도 1 ug/mL, 2 ug/mL, 3 ug/mL, 4 ug/mL, 5 ug/mL, 6 ug/mL, 7 ug/mL, 8 ug/mL, 9 ug/mL또는 10 ug/mL의 항체를 발현한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 핵산은 플랭킹 역말단반복서열(ITR) 사이에 제1 ORF와 제2 ORF를 포함하는 이중 ORF를 포함하며, 여기서 제1 ORF는 항체의 HC를 인코딩하고, 제2 ORF는 항체의 LC를 인코딩하며, 제1 ORF와 제2 ORF는 중첩되지 않는다. 일부 실시형태에 따르면, 이중 ORF는 양방향성이다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 인핸서 서열인 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 적어도 하나의 poly A 서열을 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 5' UTR 및/또는 인트론 서열을 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 3' UTR 서열을 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 인핸서 서열을 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 ITR은 기능성 말단 분해 부위와 Rep 결합 부위를 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 파르보바이러스(Parvovirus), 데펜도바이러스(Dependovirus) 및 아데노연관바이러스(AAV)에서 선택되는 바이러스에서 유래한 것이다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, 플랭킹 ITR은 서로에 대해 대칭 또는 비대칭이다. 실시형태에 따르면, 플랭킹 ITR은 대칭 또는 실질적으로 대칭이다. 실시형태에 따르면, 플랭킹 ITR은 비대칭이다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 야생형이거나, 두 개의 ITR은 모두 야생형 ITR이다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, 플랭킹 ITR은 상이한 바이러스 혈청형에서 유래한 것이다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, 플랭킹 ITR은 표 2에 제시된 임의의 바이러스 혈청형 쌍에서 선택된다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 표 3의 서열 중 하나 이상에서 선택되는 서열을 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 적어도 하나는 ITR의 전체적인 3차원 입체형태에 영향을 미치는 결실, 부가 또는 치환에 의해 야생형 AAV ITR 서열로부터 변경된 것이다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12에서 선택되는 AAV 혈청형에서 유도된 것이다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 합성된 것이다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 야생형이 아니거나, 두 개의 ITR은 모두 야생형 ITR이 아니다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 A, A', B, B', C, C', D 및 D'에서 선택되는 ITR 영역 중 적어도 하나에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것이다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, 상기 결실, 삽입 및/또는 치환은 통상적으로 A, A', B, B' C, 또는 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시킨다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부의 결실을 초래하는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것이다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 통상적으로 C 및 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부의 결실을 초래하는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것이다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 일부 및/또는 통상적으로 C 및 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 일부의 결실을 초래하는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것이다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템-루프 구조를 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템과 2개의 루프를 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템과 단일 루프를 포함한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ITR이 서로에 대해 역전될 때, 두 개의 ITR은 모두 전체적인 3차원 대칭을 이루는 방식으로 변경된다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, 벡터 조성물은 지질 나노입자(LNP)에 캡슐화된다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 표 7에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 서열번호 404, 서열번호 405, 서열번호 406, 서열번호 407 또는 서열번호 408과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 포함하는 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 서열번호 404, 서열번호 405, 서열번호 406, 서열번호 407 또는 서열번호 408로 이루어지는 군에서 선택되는 핵산 서열로 이루어진 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터를 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 방법으로서, 세포를 본원의 양태 또는 실시형태 중 임의의 것의 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 벡터 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 실시형태에 따르면, 세포는 시험관내 또는 생체내에 존재한다. 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 핵산 서열은 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균 감염된 대상을 치료하는 방법으로서, 본원의 양태 또는 실시형태 중 임의의 것의 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 벡터 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 암을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, 본원의 양태 또는 실시형태 중 임의의 것의 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 벡터 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 자가면역 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, 본원의 양태 또는 실시형태 중 임의의 것의 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 벡터 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 대상에서 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균 감염을 예방하는 방법으로서, 본원의 양태 또는 실시형태 중 임의의 것의 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 벡터 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 대상에서 암을 예방하는 방법으로서, 본원의 양태 또는 실시형태 중 임의의 것의 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 벡터 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 대상에서 자가면역 질환을 예방하는 방법으로서, 본원의 양태 또는 실시형태 중 임의의 것의 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 벡터 조성물을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, 대상은 하나 이상의 추가 치료제를 투여받는다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터 또는 ceDNA 벡터 조성물은 정맥내, 피하, 종양내 또는 근육내 주사를 통해 투여된다. 상기 양태 및 실시형태의 실시형태에 따르면, 상기 방법은 상기 대상에게 면역조절제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 양태 또는 실시형태 중 임의의 것의 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 벡터 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 실시형태에 따르면, 약제학적 조성물은 하나 이상의 추가 치료제를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 양태 또는 실시형태 중 임의의 것의 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 벡터 조성물과 지질을 포함하는 조성물을 제공한다. 실시형태에 따르면, 지질은 지질 나노입자(LNP)이다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 본원의 양태 또는 실시형태 중 임의의 것의 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 벡터 조성물, 또는 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
본 개시내용의 이러한 및 다른 양태는 하기에 보다 상세하게 기재되어 있다.
상기에 간략하게 개략되어 있고 하기에 보다 상세하게 논의되는 본 개시내용의 실시형태는, 첨부된 도면에 도시된 본 개시내용의 예시적인 실시형태를 참조로 이해될 수 있다. 하지만, 첨부된 도면은 본 개시내용의 단지 전형적인 실시형태를 예시하는 것으로, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되며, 본 개시내용은 다른 동등하게 효과적인 실시형태를 허용할 수 있다.
도 1a는, 비대칭인 ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, HC 또는 LC)의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 이러한 실시형태에서, 예시적인 ceDNA 벡터는 CAG 프로모터, WPRE, 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 전이유전자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열)를 인코딩하는 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위(R3/R4)에 삽입될 수 있다. 발현 카세트는 2개의 역말단반복서열(ITR), 즉, 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 야생형 AAV2 ITR과 발현 카세트의 다운스트림(3'-말단)에 있는 변형된 ITR에 의해 플랭킹되어 있으므로, 발현 카세트를 플랭킹하는 2개의 ITR은 서로에 대해 비대칭이다.
도 1b는, CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트와 함께, 비대칭인 ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, HC 또는 LC)의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 전이유전자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열)를 인코딩하는 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입될 수 있다. 발현 카세트는 2개의 역말단반복서열(ITR), 즉, 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 변형된 ITR과 발현 카세트의 다운스트림(3'-말단)에 있는 야생형 ITR에 의해 플랭킹되어 있다.
도 1c는, 인핸서/프로모터, 전이유전자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열), 전사 후 요소(WPRE) 및 polyA 신호를 함유하는 발현 카세트와 함께, 비대칭인 ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에의 전이유전자의 삽입을 가능하게 한다. 발현 카세트에는 서로 비대칭인 2개의 역말단반복서열(ITR), 즉, 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 변형된 ITR과 발현 카세트의 다운스트림(3'-말단)에 있는 변형된 ITR이 플랭킹되어 있으며, 여기서 5' ITR과 3' ITR은 모두 변형된 ITR이지만, 상이한 변형을 갖는다(즉, 이들은 동일한 변형을 갖지 않음).
도 1d는, CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트와 함께, 본원에 정의된 바와 같은 대칭인 변형된 ITR 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, HC 또는 LC)의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 전이유전자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열)를 인코딩하는 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입된다. 발현 카세트는 2개의 변형된 역말단반복서열(ITR)에 의해 플랭킹되어 있으며, 여기서 5' 변형된 ITR과 3' 변형된 ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 1e는, 인핸서/프로모터, 전이유전자, 전사 후 요소(WPRE) 및 polyA 신호를 함유하는 발현 카세트와 함께, 본원에 정의된 바와 같은 대칭인 변형된 ITR 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, HC 또는 LC)의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에의 전이유전자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열)의 삽입을 가능하게 한다. 발현 카세트는 2개의 변형된 역말단반복서열(ITR)에 의해 플랭킹되어 있으며, 여기서 5' 변형된 ITR과 3' 변형된 ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 1f는, CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트와 함께, 본원에 정의된 바와 같은 대칭인 WT-ITR 또는 실질적으로 대칭인 WT-ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, HC 또는 LC)의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 전이유전자(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 서열)를 인코딩하는 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에 삽입된다. 발현 카세트는 2개의 야생형 역말단반복서열(WT-ITR)에 의해 플랭킹되어 있으며, 여기서 5' WT-ITR과 3' WT-ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 1g는, 인핸서/프로모터, 전이유전자, 전사 후 요소(WPRE) 및 polyA 신호를 함유하는 발현 카세트와 함께, 본원에 정의된 바와 같은 대칭인 변형된 ITR 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이의 클로닝 부위에의 전이유전자의 삽입을 가능하게 한다. 발현 카세트는 2개의 야생형 역말단반복서열(WT-ITR)에 의해 플랭킹되어 있으며, 여기서 5' WT-ITR과 3' WT-ITR은 대칭이거나 실질적으로 대칭이다.
도 2a는, A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위(RBE 및 RBE')가 확인되는 AAV2의 야생형 좌측 ITR의 T형 스템-루프 구조를 제공하고, 또한 말단 분해 부위(trs)를 보여준다. RBE는 Rep 78 또는 Rep 68과 상호작용하는 것으로 여겨지는 일련의 4개의 이중체 사량체를 함유한다. 또한, RBE'는 또한 작제물 내 야생형 ITR 또는 돌연변이된 ITR 상에 어셈블링된 Rep 복합체와 상호작용하는 것으로 여겨진다. D 및 D' 영역은 전사인자 결합 부위와 다른 보존된 구조를 함유한다. 도 2b는, A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위(RBE 및 RBE')가 확인되는 AAV2의 야생형 좌측 ITR의 T형 스템-루프 구조를 포함하는 야생형 좌측 ITR에서의 제안된 Rep 촉매화된 닉킹 및 결찰 활성을 보여주고, 또한 말단 분해 부위(trs), 및 몇몇 전사인자 결합 부위와 다른 보존된 구조를 포함하는 D 및 D' 영역을 보여준다.
도 3a는, 야생형 좌측 AAV2 ITR의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 아암의 1차 구조(폴리뉴클레오타이드 서열)(좌측)와 2차 구조(우측)를 보여준다. 도 3b는, 좌측 ITR에 대한 예시적인 돌연변이된 ITR(변형된 ITR로도 지칭됨) 서열을 보여준다. 예시적인 돌연변이된 좌측 ITR(ITR-1, 좌측)의 A-A' 아암의 RBE 부분과 C 아암 및 B-B' 아암의 1차 구조(좌측)와 예측된 2차 구조(우측)가 제시되어 있다. 도 3c는, 야생형 우측 AAV2 ITR의 A-A' 루프의 RBE 함유 부분과 B-B' 및 C-C' 아암의 1차 구조(좌측)와 2차 구조(우측)를 보여준다. 도 3d는, 예시적인 우측 변형된 ITR을 보여준다. 예시적인 돌연변이 우측 ITR(ITR-1, 우측)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 B-B' 및 C 아암의 1차 구조(좌측)와 예측된 2차 구조(우측)가 제시되어 있다. 좌측 및 우측 ITR(예를 들어, AAV2 ITR, 또는 다른 바이러스 혈청형 또는 합성 ITR)의 임의의 조합이 본원에 교시된 바와 같이 사용될 수 있다. 도 3a 내지 도 3d 각각에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA를 생산하는 데 사용되는 플라스미드 또는 박미드/바큘로바이러스 게놈에 사용된 서열을 나타낸다. 또한, 도 3a 내지 도 3d 각각에는, 플라스미드 또는 박미드/바큘로바이러스 게놈의 ceDNA 벡터 구성 및 예측된 깁스 자유 에너지 값에서 추론된 상응하는 ceDNA 2차 구조가 포함되어 있다.
도 4a는, 도 4b의 개략도에 기재된 공정에서 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산에 유용한 바큘로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 제조하는 업스트림 공정을 예시하는 개략도이다. 도 4b는 예시적인 ceDNA 생산 방법의 개략도이고, 도 4c는 ceDNA 벡터 생산을 확인하기 위한 생화학적 방법 및 공정을 예시한다. 도 4d 및 도 4e는, 도 4b의 ceDNA 생산 공정 동안 수득된 세포 펠릿에서 수거된 DNA에서 ceDNA의 존재를 식별하는 공정을 설명하는 개략도이다. 도 4d는, 절단되지 않은 채로 유지되거나 제한 엔도뉴클레아제로 소화된 후, 미변성 겔 또는 변성 겔 상에서 전기영동에 적용된 예시적인 ceDNA에 대한 개략적인 예상 밴드를 보여준다. 가장 좌측의 개략도는 미변성 겔이며, 이는 이중체 및 절단되지 않은 형태에서 ceDNA가, 더 빠르게 이동하는 더 작은 단량체와 단량체 크기의 2배인 더 느리게 이동하는 이량체로 보이는, 적어도 단량체와 이량체 상태로 존재함을 시사하는 다수의 밴드를 보여준다. 좌측에서 두 번째 개략도는, ceDNA가 제한 엔도뉴클레아제로 절단되는 경우, 본래 밴드가 사라지고, 절단 후 남아있는 예상 단편 크기에 상응하는 더 빠르게 이동하는(예를 들어, 더 작은) 밴드가 나타남을 보여준다. 변성 조건 하에서, 본래 이중체 DNA는 단일가닥이며, 이는 상보적 가닥이 공유결합으로 연결되어 있기 때문에, 미변성 겔 상에서 관찰된 것 보다 2배 더 큰 종으로 이동한다. 따라서, 우측에서 두 번째 개략도에서, 소화된 ceDNA는 미변성 겔에서 관찰된 것과 유사한 밴딩 분포를 보여주지만, 밴드는 미변성 겔 대응물의 2배 크기의 단편으로 이동한다. 가장 우측의 개략도는, 변성 조건 하에서 절단되지 않은 ceDNA가 단일가닥 개방형 고리로 이동하기 때문에, 관찰된 밴드는 고리가 개방되지 않은 미변성 조건에서 관찰된 것의 2배 크기임을 보여준다. 이러한 도면에서, "kb"는, 문맥에 따라, 뉴클레오타이드 사슬 길이(예를 들어, 변성 조건에서 관찰된 단일가닥 분자의 경우) 또는 염기쌍의 수(예를 들어, 미변성 조건에서 관찰된 이중가닥 분자의 경우)를 기반으로 뉴클레오타이드 분자의 상대적인 크기를 나타내는 데 사용된다. 도 4e는, 비연속 구조를 갖는 DNA를 보여준다. ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되어, 중성 및 변성 조건 모두에서 상이한 크기(1 kb 및 2 kb)를 갖는 2개의 DNA 단편을 생성할 수 있다. 도 4e는, 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA를 또한 보여준다. ceDNA 벡터는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되어, 중성 조건에서는 1 kb 및 2 kb로 이동하는 2개의 DNA 단편을 생성할 수 있지만, 변성 조건에서는 가닥이 연결된 채로 유지되어 2 kb 및 4 kb로 이동하는 단일 가닥을 생성할 수 있다.
도 5는, 엔도뉴클레아제로 소화되거나(+) 소화되지 않은(-) ceDNA 벡터의 변성 겔 전개의 예시적인 도면이다(ceDNA 작제물 1 및 2의 경우 EcoRI; ceDNA 작제물 3 및 4의 경우 BamH1; ceDNA 작제물 5 및 6의 경우 SpeI; 및 ceDNA 작제물 7 및 8의 경우 XhoI). 작제물 1 내지 8은 국제 특허출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 실시예 1에 기재되어 있다. 별표로 강조된 밴드의 크기를 결정하고 도면의 하단에 제공하였다.
도 6은, 실시예 6에서 시험된 ceDNA 작제물에 의한 항체 발현의 검출을 보여주는 그래프이다. 항스파이크 인간 IgG(***)를 사용하여 항체 발현을 검출하였으며, 이러한 발현을 ceDNA 작제물의 주입 후 최대 35일까지 항스파이크 hIgG(단위: ng/ml)로 정량화하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, LNP1에 공동 제형화된 ceDNA-1856(LC를 인코딩함)과 ceDNA-1859(HC를 인코딩함)의 ceDNA 이중 벡터(ceDNA-1: LNP1)를 이용한 경우, 14일차까지 SARS-CoV-2에 대한 약 1 ug/mL 의 단클론 항체가 검출되었고, 35일차까지 최대 약 8 ug/mL의 항체가 검출되었다. 비히클(V); LNP 제형 1에 공동 제형화된 ceDNA 이중 벡터 작제물 1856/1859(ceDNA-1 LNP1 (1)); LNP 제형 2 내 ceDNA 이중 벡터 작제물 1856/1859(ceDNA-1 LNP2 (2)); 및 단일 ceDNA 작제물 2157(LNP 제형 1에 제형화된 단일 ceDNA("양방향성 단일 ceDNA 벡터") 내 HC와 LC에 대한 이중 ORF)(ceDNA-2 LNP1 (3)).
도 7a는, 다양한 ceDNA 벡터 형식의 개략도를 보여준다. 도 7b는, 이중 ORF 작제물(ORF 1에 연결된 구성적 프로모터; 및 ORF 2에 연결된 간 특이적 프로모터); 단일 ceDNA 벡터의 푸린/2A 절단 설계; 및 ceDNA-1의 이중 벡터 설계(ceDNA 1856 및 1859)(모두 항 SARS-CoV-2 스파이크(S) 항체를 인코딩함)을 사용한 경우 항원 생산 수준을 보여주는 그래프이다. 이중 벡터 설계는 최고 발현 작제물을 산출하였다. 도 7c는, ceDNA의 단일 벡터(이중 ORF ceDNA 2157; "ceDNA-2")의 발현과 비교하여, 마우스에서 8 ug/mL의 지속적이고, 치료적으로 관련이 있는 항스파이크 hIgG 농도를 달성한 이중 벡터("ceDNA-1"; LNP 제형 1에 공동 제형화된 ceDNA 이중 벡터 작제물 1856/1859)의 LNP 전달을 보여주는 그래프이다.
도 8은, 유체역학적 전달 후 항체 HC와 LC를 발현하는 ceDNA 이중 벡터 설계와 ceDNA 이중 ORF 설계 사이의 항체 발현의 용량 의존적 증가를 비교한다.
도 9는, 다양한 HC:LC 몰비를 갖는 ceDNA 벡터 작제물을 사용한 경우의 시험관내 스크리닝 결과를 보여주는 그래프이다.
도 10은, 다양한 HC:LC 몰비로 고정된 HC 또는 LC를 갖는 ceDNA 벡터 작제물을 사용한 경우의 생체내 스크리닝 결과를 보여주는 그래프이다.
도 11a는, FcγRIIIa-V 수용체와 회합된 후 이로부터 해리될 때, 세포주 유래(재조합 LS) 또는 ceDNA 유래(혈청 정제된 ceDNA 유래 LS) 항체 1과 세포주 유래(재조합 LS-GAALIE) 또는 ceDNA 유래(혈청 정제된 ceDNA 유래 LS-GAALIE) 항체 2의 해리 상수(K D) 값을 보여주는 그래프이다. 도 11b는, FcγRIIIa-F 수용체와 회합된 후 이로부터 해리될 때, 세포주 유래(재조합 LS) 또는 ceDNA 유래(혈청 정제된 ceDNA 유래 LS) 항체 1과 세포주 유래(재조합 LS-GAALIE) 또는 ceDNA 유래(혈청 정제된 ceDNA 유래 LS-GAALIE) 항체 2의 해리 상수(K D) 값을 보여주는 그래프이다.
본 개시내용의 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터를 통해 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 전달하기 위한 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 치료 목적에 유용하다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편은 진단 목적에 유용하다.
I. 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 본 개시내용이 속하는 업계의 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 본 개시내용이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 면역학 및 분자생물학에서의 상용 용어 정의는, 하기 문헌에서 확인할 수 있다: 문헌[The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)]; 문헌[Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013)]; 문헌[Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)]; 문헌[Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]; 문헌[Immunology by Werner Luttmann, Elsevier, 2006]; 문헌[Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)]; 문헌[Lewin's Genes XI, Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055)]; 문헌[Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)]; 문헌[Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)]; 문헌[Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385)]; 문헌[Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005] 및 문헌[Current Protocols in Immunology (CPI), John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)](상기 문헌들의 내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용됨).
본원에 사용된 "항체"라는 용어는, 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 면역글로불린 분자를 나타내는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약어화됨)과 중쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성되어 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약어화됨)과 경쇄 불변 영역으로 구성되어 있다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인, CL로 구성되어 있다. VH 영역과 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더 보존되는 영역 사이에 산재된 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH와 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단 방향으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본원에 사용된 "단클론 항체"라는 용어는, 실질적으로 균질한 항체 집단으로서, 즉, 집단을 구성하는 항체 분자가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고 아미노산 서열이 동일한 항체 집단을 나타낸다. 조성물 내 이러한 단클론 항체 및 단편의 "복수"는, 자연에서, 예를 들어 마우스 또는 인간과 같은 숙주 유기체의 혈액에서 일반적으로 발생할 수 있는 것보다 높은 동일한(즉, 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외한 아미노산 서열) 항체 및 단편의 농도를 나타낸다.
본원에 사용된 "CDR"이라는 용어는, 항체 가변 서열 내 상보성 결정 영역을 나타낸다. 중쇄와 경쇄의 각각의 가변 영역에는, 각각의 가변 영역에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된 3개의 CDR이 존재한다. 본원에 사용된 "CDR 세트"라는 용어는, 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역에서 발생하는 3개 CDR의 그룹을 나타낸다. 이러한 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. Kabat에 의해 설명된 시스템(문헌[Kabat et al. (1987; 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.])은 항체의 임의의 가변 영역에 적용 가능한 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐 아니라, 3개의 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계를 제공한다. 이러한 CDR은 Kabat CDR로 지칭될 수 있다. Chothia와 동료들(문헌[Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917] 및 문헌[Chothia et al. (1989) Nature 342: 877-883])은, Kabat CDR 내 특정 하위부분이 아미노산 서열 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고 거의 동일한 펩타이드 백본 구성을 채택한다는 것을 발견하였다. 이러한 하위부분은 L1, L2 및 L3, 또는 H1, H2 및 H3, 또는 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3, 또는 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3으로 지정되었으며, 여기서 "L"과 "H"는, 각각, 경쇄 영역과 중쇄 영역을 나타낸다. 이러한 영역은 Kabat CDR과 중첩되는 경계를 갖는 Chothia CDR로 지칭될 수 있다. Kabat CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 경계는 문헌[Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139] 및 문헌[MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5): 732-45]에 기재되어 있다. 또 다른 CDR 경계 정의는 본원의 시스템 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있으며, 특정 잔기 또는 잔기의 그룹, 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수 있지만, 그럼에도 불구하고 Kabat CDR과 중첩될 것이다(예를 들어, 문헌[Lu X et al., MAbs. 2019 Jan;11(1):45-57] 참조). 본원에 사용된 방법은 이러한 시스템 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있지만, 특정 실시형태는 Kabat 또는 Chothia 정의된 CDR을 사용한다.
본원에 사용된 항체의 "항원 결합 단편" 또는 "항원 결합 부분"(또는 간단히 "항체 단편")이라는 용어는, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다. 항체의 항원 결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 확인되었다. 결합 단편에는, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, 단일 사슬 및 단일 사슬 항체가 포함된다. 항체의 "항원 결합 단편"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예에는, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 도메인과 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 도메인과 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(문헌[Ward et al. (1989) Nature 341:544-546]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 나아가, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL과 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여, VL 영역과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬로 만들어 질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다(단일 사슬 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어, 문헌[Bird et al. (1988) Science 242:423-426] 및 문헌[Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 이러한 단일 사슬 항체가 또한 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함되는 것으로 의도된다. 디아바디와 같은 단일 사슬 항체의 다른 형태가 또한 포함된다. 디아바디는, VH 도메인과 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 사슬에서 발현되지만, 너무 짧은 링커를 사용하여 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍을 이룰 수 없기 때문에, 이러한 도메인이 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루도록 하여 2개의 항원 결합 부위를 형성하는, 2가 이중특이적 항체이다(예를 들어, 문헌[Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]' 문헌[ Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조). 본 개시내용의 항체 부분은 미국 특허 제6,090,382호, 제6,258,562호, 제6,509,015호에 추가로 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
"CL"이라는 용어는, "면역글로불린 경쇄 불변 영역" 또는 "경쇄 불변 영역", 즉, 항체 경쇄의 불변 영역을 나타낸다. "CH"라는 용어는, 항체 아이소타입에 따라, CH1, CH2 및 CH3 도메인(IgA, IgD, IgG), 또는 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인(IgE, IgM)으로 추가로 분할 가능한 "면역글로불린 중쇄 불변 영역" 또는 "중쇄 불변 영역"을 나타낸다. 항체 중쇄의 Fc 영역은 본원에 추가로 설명되어 있다. 본원에 개시된 실시형태 중 임의의 것에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편은 CL, CH1, CH2 및 CH3 중 임의의 하나 이상을 포함한다. 예를 들어, 포유류 세포주에서의 생산은 항체 중쇄의 하나 이상의 C-말단 리신을 제거할 수 있음을 이해할 것이다(예를 들어, 문헌[Liu et al. mAbs 6(5):1145-1154 (2014)] 참조). 따라서, 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄, CH1-CH3, CH3 또는 Fc 폴리펩타이드를 포함할 수 있고, 여기서 C-말단 리신 잔기는 존재하거나 존재하지 않으며, 즉, 중쇄, CH1-CH3 또는 Fc 폴리펩타이드의 C-말단 잔기가 리신이 아닌 실시형태와, 리신이 C-말단 잔기인 실시형태가 포함된다. 특정 실시형태에서, 조성물은 본 개시내용의 복수의 항체 및/또는 항원 결합 단편을 포함하며, 여기서 특정 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄, CH1-CH3 또는 Fc 폴리펩타이드의 C-말단에 리신 잔기를 포함하지 않고, 특정 항체 또는 항원 결합 단편은 중쇄, CH1-CH3 또는 Fc 폴리펩타이드의 C-말단에 리신 잔기를 포함한다. "키메라 항체"는, 중쇄와 경쇄의 각각의 아미노산 서열의 일부가 특정 종에서 유도되거나 특정 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 상동성이지만, 사슬의 나머지 분절은 또 다른 종의 상응하는 서열과 상동성인 항체를 나타낸다.
"인간화 항체"는, 실질적으로 인간 항체 사슬(수용체 면역글로불린 또는 항체로 지칭됨)에서 유래한 가변 영역 프레임워크 잔기와, 실질적으로 비인간 항체(예를 들어, 마우스)에서 유래한 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 적어도 하나의 사슬을 포함하는 항체를 나타낸다. 또한, 인간화 항체는 전형적으로 친화도 및/또는 면역원성을 개선시키기 위해 추가의 변형을 거친다.
"다가 항체"라는 용어는, 하나 초과의 항원 인식 부위를 포함하는 항체를 나타낸다. 예를 들어, "2가" 항체는 2개의 항원 인식 부위를 갖고, "4가" 항체는 4개의 항원 인식 부위를 갖는다. "단일특이적", "이중특이적", "삼중특이적", "사중특이적" 등의 용어는, 다가 항체에 존재하는 상이한 항원 인식 부위 특이성의 수(항원 인식 부위의 수와 반대)를 나타낸다. 예를 들어, "단일특이적 항체" 항원의 항원 인식 부위는 모두 동일한 에피토프에 결합한다. "이중특이적" 또는 "이중 특이적" 항체는 제1 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 항원 인식 부위와 제1 에피토프와 상이한 제2 에피토프에 결합하는 적어도 하나의 항원 인식 부위를 갖는다. "다가 단일특이적" 항체는 모두 동일한 에피토프에 결합하는 다수의 항원 인식 부위를 갖는다. "다가 이중특이적" 항체는 다수의 항원 인식 부위를 가지며, 이 중 일부는 제1 에피토프에 결합하고, 일부는 제1 에피토프와 상이한 제2 에피토프에 결합한다.
본원에 사용된 "인간 항체"라는 용어는, 인간 생식계열 면역글로불린 서열에서 유도된 가변 영역과 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는, 예를 들어 CDR과 특정 CDR3에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발, 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 하지만, 본원에 사용된 "인간 항체"라는 용어는, 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식계열에서 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 "재조합 인간 항체"라는 용어는, 재조합 방식에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 숙주세포에 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "중화 항체"는, 숙주에서 감염을 개시하고/하거나 지속시키기 위해 병원체의 능력을 중화시킬 수 있는, 즉, 막거나, 저해하거나, 감소시키거나, 지연시키거나 또는 방해할 수 있는 항체이다. 이러한 저해는 생물학적 활성(시험관내 또는 생체내), 세포 활성화 및/또는 수용체 결합의 하나 이상의 지표를 측정하는 방식으로 평가될 수 있다.
본원에 사용된 "항원"이라는 용어는, 숙주의 면역계를 자극하여 체액성 및/또는 세포성 항원 특이적 반응을 일으키는 하나 이상의 에피토프(선형, 입체형태 또는 둘 모두)를 함유하는 분자를 나타내는 것으로 여겨진다. 상기 용어는, "면역원"이라는 용어와 상호교환적으로 사용된다. 통상적으로, B세포 에피토프는 적어도 약 5개 아미노산을 포함하지만, 3개 내지 4개 아미노산 정도로 작을 수 있다. CTL 에피토프와 같은 T세포 에피토프는 적어도 약 7개 내지 9개 아미노산을 포함하지만, 헬퍼 T세포 에피토프 적어도 약 12개 내지 20개 아미노산을 포함한다. 통상적으로, 에피토프는 약 7개 내지 15개 아미노산(경계에 있는 숫자 포함), 예컨대 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개 아미노산을 포함한다. 상기 용어는, 본원에 정의된 바와 같이, 단백질이 면역반응을 유발하는 능력을 보유하는 한, 천연 서열과 비교하여 결실, 부가 및 치환(일반적으로 자연에서 보존적임)과 같은 변형을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 변형은 부위 지향 돌연변이유발을 통하는 것과 같이 의도적일 수 있거나, 항원을 생산하는 숙주의 돌연변이를 통하는 것과 같이 우발적일 수 있다.
"에피토프"라는 용어는, 결합제, 면역글로불린 또는 T세포 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자 결정인자(예를 들어, 폴리펩타이드 결정인자)인 항원 결정인자로도 지칭될 수 있다. 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹을 포함하며, 특정 실시형태에서, 특정 3차원 구조 특징 및/또는 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 구조 에피토프 또는 기능성 에피토프로 정의될 수 있다. 기능성 에피토프는 일반적으로 구조 에피토프의 서브세트이며, 상호작용의 친화도에 직접적으로 기여하는 잔기를 갖는다. 에피토프는 선형 또는 입체형태(즉, 비선형 아미노산으로 구성됨)일 수 있다. 항체 또는 항체의 항원 결합 단편에 의해 인식되는 에피토프는 항체 또는 단편의 CDR(예를 들어, 상보적 부위)과 상호작용하는 항원의 구조 요소이다. 에피토프는 특이성을 생성하기 위해 항체의 CDR과 상호작용하는 몇몇 아미노산 잔기의 기여에 의해 형성될 수 있다. 항원 단편은 하나 초과의 에피토프를 함유할 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 이의 표적 항원을 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 항체는, 항체가 교차 경쟁하는 경우(하나가 다른 하나의 결합 또는 조절 효과를 막음), "동일한 에피토프에 결합한다"라고 한다.
본원에 사용된 "표면 플라즈몬 공명"이라는 용어는, 예를 들어 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden 및 Piscataway, N.J.)을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내 단백질 농도의 변화를 검출하는 방식으로 실시간 생물특이적 상호작용을 분석할 수 있게 하는 광학 현상을 나타낸다. 추가의 설명에 대해서는, 미국 특허 제6,258,562호, 및 문헌[ . (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19]; 문헌[
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. (1991) Biotechniques 11:620-627]; 문헌[Johnsson et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125] 및 문헌[Johnnson et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268]의 실시예 1을 참조한다.
본원에 사용된 "특이적으로 결합한다"는, 항체 또는 항원 결합 단편이, 샘플 내 임의의 다른 분자 또는 구성요소와 유의하게 회합하거나 결합하지 않으면서, 105 M-1(이러한 회합 반응에 대한 회합 속도(on-rate)[Kon] 대 해리 속도(off rate)[Koff]의 비와 동일함) 이상의 친화도 또는 Ka(즉, 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(단위 1/M))로 항원에 회합 또는 결합하는 것을 나타낸다. 대안적으로, 친화도는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)(단위 M)(예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M)로 정의될 수 있다. 항체는 "고친화도" 항체 또는 "저친화도" 항체로 분류될 수 있다. "고친화도" 항체는 Ka가 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1 또는 적어도 1013 M-1인 항체를 나타낸다. "저친화도" 항체는 Ka가 최대 107 M-1, 최대 106 M-1, 최대 105 M-1인 항체를 나타낸다. 대안적으로, 친화도는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)(단위 M)(예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M)로 정의될 수 있다.
본원에 사용된 "Koff"라는 용어는, 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리에 대한 해리 속도 상수를 나타내는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "Kd"라는 용어는, 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 나타내는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "IC50"이라는 용어는, 관심 생물학적 평가변수를 저해하는 데 필요한 저해제의 농도를 나타내는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "이종 핵산 서열" 및 "전이유전자"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 혼입되고, 이에 의해 전달 및 발현될 수 있는 (캡시드 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 이외의) 관심 핵산을 나타낸다. 일부 실시형태에 따르면, "이종 핵산"이라는 용어는, 이와 접촉해 있는 세포 또는 대상에 존재하거나, 이에 의해 발현되거나 또는 이에서 유도되지 않는 핵산(또는 전이유전자)을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "발현 카세트" 및 "전사 카세트"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 하나 이상의 프로모터, 또는 전이유전자의 전사를 지시하는 데 충분한 다른 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 전이유전자를 포함하지만, 캡시드 인코딩 서열, 다른 벡터 서열 또는 역말단반복 영역을 포함하지 않는 핵산의 선형 스트레치를 나타낸다. 발현 카세트는 하나 이상의 시스-작용 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 억제제), 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 전사 후 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"이라는 용어는, 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 즉, 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 중합체 형태를 나타낸다. 따라서, 이러한 용어에는, 단일가닥, 이중가닥 또는 다중가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비천연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체가 포함된다. "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 단일가닥 또는 이중가닥 DNA의 약 5개 내지 약 100개 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 하지만, 본 개시내용을 목적을 위해, 올리고뉴클레오타이드의 길이에는 상한이 없다. 올리고뉴클레오타이드는 "올리고머" 또는 "올리고"로도 알려져 있으며, 유전자에서 단리되거나, 당업계에 알려진 방법에 따라 화학적으로 합성될 수 있다. "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"이라는 용어는, 기재되는 실시형태에 적용되는 바에 따라, 단일가닥(예컨대 센스 및 안티센스) 및 이중가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함한다는 것을 이해해야 한다.
DNA는, 예를 들어 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, DNA-DNA 이중체, 사전 축합된 DNA, PCR 산물, 벡터(P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라 서열, 염색체 DNA, 또는 이러한 그룹의 유도체 및 조합의 형태일 수 있다. DNA는 미니서클(minicircle), 플라스미드, 박미드, 미니유전자(minigene), 미니스트링(ministring) DNA(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터), 폐쇄형 선형 이중체 DNA(CELiD 또는 ceDNA), 개뼈형(dbDNA™) DNA, 덤벨형 DNA, 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터의 형태일 수 있다. RNA는 소형 간섭 RNA(siRNA), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, rRNA, tRNA, 바이러스성 RNA(vRNA) 및 이들의 조합의 형태일 수 있다. 핵산에는, 합성, 자연 발생 및 비자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는, 알려진 뉴클레오타이드 유사체, 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산이 포함된다. 이러한 유사체 및/또는 변형된 잔기의 예에는, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(모르폴리노), 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 잠금 핵산(LNA™) 및 펩타이드 핵산(PNA)이 포함된다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오타이드의 알려진 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 퇴화 코돈 치환), 대립유전자, 동원체(ortholog), SNP 및 상보적 서열뿐 아니라, 명백하게 제시된 서열을 암시적으로 포함한다.
"뉴클레오타이드"는, 당 옥시리보오스(DNA) 또는 리보오스(RNA), 염기 및 포스페이트기를 함유한다. 뉴클레오타이드는 포스페이트기를 통해 함께 연결된다.
"염기"에는, 퓨린 및 피리미딘(이에는 천연 화합물인 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체가 추가로 포함됨) 및 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체(이에는, 비제한적으로, 아민, 알코올, 티올, 카르복실레이트 및 알킬할라이드와 같은 새로운 반응성기가 대체된 변형이 포함됨)가 포함된다.
본원에 사용된 "핵산 작제물"이라는 용어는, 자연 발생 유전자에서 단리되거나, 자연에 달리 존재하지 않을 수 있는 방식으로 핵산의 분절을 함유하도록 변형되거나 또는 합성된, 단일가닥 또는 이중가닥의 핵산 분자를 나타낸다. 핵산 작제물이라는 용어는, 핵산 작제물이 본 개시내용의 코딩 서열의 발현에 필요한 제어 서열을 함유하는 경우, "발현 카세트"라는 용어와 동의어이다. "발현 카세트"는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 코딩 서열을 포함한다.
"혼성화 가능한" 또는 "상보적인" 또는 "실질적으로 상보적인"이란, 핵산(예를 들어, RNA)이 이에 대한 비공유결합을 가능하게 하는, 즉, 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍 및/또는 G/U 염기 쌍을 형성하거나, 온도 및 용액 이온 강도의 적절한 시험관내 및/또는 생체내 조건 하에서 서열 특이적인 역평행 방식으로 또 다른 핵산(즉, 상보적인 핵산에 특이적으로 결합하는 핵산)에 "어닐링" 또는 "혼성화"하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 당업계에 알려진 바와 같이, 표준 왓슨-크릭 염기쌍 형성에는, 아데닌(A)과 티미딘(T)의 쌍 형성, 아데닌(A)과 우라실(U)의 쌍 형성, 및 구아닌(G)과 시토신(C)의 쌍 형성이 포함된다. 또한, 당업계에는 2개의 RNA 분자(예를 들어, dsRNA) 사이의 혼성화, 구아닌(G)과 우라실(U)의 염기 쌍에 대해서도 알려져 있다. 예를 들어, G/U 염기쌍 형성은 tRNA 안티코돈과 mRNA 코돈의 염기쌍 형성의 맥락에서 유전자 코드의 축퇴(즉, 중복)에 부분적으로 관여한다. 본 개시내용의 맥락에서, 대상 DNA 표적화 RNA 분자의 단백질 결합 분절(dsRNA 이중체)의 구아닌(G)은 우라실(U)에 상보적인 것으로 간주되며, 그 반대도 마찬가지이다. 이와 같이, G/U 염기쌍이 소정의 뉴클레오타이드 위치에서 대상 DNA 표적화 RNA 분자의 단백질 결합 분절(dsRNA 이중체)로 만들어질 수 있는 경우, 해당 위치는 비상보적인 것으로 간주되지 않고, 대신 상보적인 것으로 간주된다.
"펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 코딩된 및 비코딩된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산, 및 변형된 펩타이드 백본을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 나타낸다.
특정 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 "인코딩하는" DNA 서열은 특정 RNA 및/또는 단백질로 전사되는 DNA 핵산 서열이다. DNA 폴리뉴클레오타이드는 단백질로 번역되는 RNA(mRNA)를 인코딩할 수 있거나, DNA 폴리뉴클레오타이드는 단백질로 번역되지 않는 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA 또는 DNA 표적화 RNA; "비코딩" RNA 또는 "ncRNA"로도 불림)를 인코딩할 수 있다.
본원에 사용된 "말단반복서열" 또는 "TR"이라는 용어는, 적어도 하나의 최소 필수 복제 기점과 회문 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는, 임의의 바이러스 말단반복 또는 합성 서열을 포함한다. Rep 결합 서열("RBS")(RBE(Rep 결합 요소)로도 지칭됨)과 말단 분해 부위("TRS")는 함께 "최소 필수 복제 기점"을 구성하기 때문에, TR은 적어도 하나의 RBS와 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 소정의 스트레치 내에서 서로 역 보체인 TR은, 전형적으로 각각 "역말단반복" 또는 "ITR"로 지칭된다. 바이러스의 맥락에서, ITR은 복제, 바이러스 패키징, 통합 및 프로바이러스 회수(rescue)를 매개한다. 예상치 못하게 발견된 바와 같이, 전체 길이에 걸쳐 역 보체가 아닌 TR은 여전히 ITR의 전형적인 기능을 수행할 수 있기 때문에, 본원에 사용된 ITR이라는 용어는 ceDNA 벡터의 복제를 매개할 수 있는 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 TR을 나타낸다. 당업자는, 복잡한 ceDNA 벡터 구성에서, 2개 초과의 ITR 또는 비대칭 ITR 쌍이 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. ITR은 AAV ITR 또는 비(non)AAV ITR일 수 있거나, AAV ITR 또는 비AAV ITR에서 유도될 수 있다. 예를 들어, ITR은 파르보바이러스 및 데펜도바이러스(예를 들어, 개 파르보바이러스, 소 파르보바이러스, 마우스 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스, 인간 파르보바이러스 B-19)를 포함하는 파르보바이러스과에서 유도될 수 있거나, 또는 SV40 복제 기점으로 작용하는 SV40 헤어핀이 ITR로서 사용될 수 있으며, 이는 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의해 추가로 변형될 수 있다. 파르보바이러스과 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파르보바이러스아과(Parvovirinae)와 무척추동물을 감염시키는 덴소바이러스아과(Densovirinae)의 2개의 아과로 이루어진다. 데펜도파르보바이러스에는, 비제한적으로, 인간, 영장류, 소, 개, 말 및 양 종을 포함하는 척추동물 숙주에서 복제 가능한 아데노연관바이러스(AAV)의 바이러스과가 포함된다. 본원에서 편의를 위해, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 업스트림) 5'에 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 다운스트림) 3'에 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
"야생형 ITR" 또는 "WT-ITR"은, 예를 들어 Rep 결합 활성과 Rep 닉킹 능력을 보유하는, AAV 또는 다른 데펜도바이러스 내 자연 발생 ITR 서열의 서열을 나타낸다. 임의의 AAV 혈청형의 WT-ITR의 핵산 서열은 유전자 코드 또는 드리프트의 축퇴로 인해 기본형 자연 발생 서열에서 약간 달라질 수 있기 때문에, 본원에의 사용을 위해 포함된 WT-ITR 서열은 생산 과정 동안 일어나는 자연적으로 발생하는 변화(예를 들어, 복제 오류)의 결과로서의 WT-ITR 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "실질적으로 대칭인 WT-ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍"이라는 용어는, 둘 모두 이의 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 야생형 ITR인, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 WT-ITR의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, ITR은, 기본형 자연 발생 서열에서 벗어난 하나 이상의 뉴클레오타이드를 갖더라도, 변화가 서열의 특성 및 전체 3차원 구조에 영향을 미치지 않는 한, 야생형 서열인 것으로 간주될 수 있다. 일부 양태에 따르면, 벗어난 뉴클레오타이드는 보존적 서열 변화를 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 다른 WT-ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 3D 공간에 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은, 이것이 적절한 Rep 단백질과 쌍을 이루는 작동 가능한 Rep 결합 부위(RBE 또는 RBE')와 말단 분해 부위(trs)를 가지고 있음을 결정하는 방식으로 WT로서 기능적으로 확인될 수 있다. 선택적으로, 허용 조건 하에서의 전이유전자 발현을 포함하는 다른 기능을 시험할 수 있다.
본원에 사용된 "변형된 ITR" 또는 "mod-ITR" 또는 "돌연변이 ITR"이라는 구절은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 동일한 혈청형의 WT-ITR과 비교하여 적어도 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 돌연변이를 갖는 ITR을 나타낸다. 돌연변이는 ITR 내 A, C, C', B, B' 영역 중 하나 이상을 변경시킬 수 있으며, 동일한 혈청형의 WT-ITR의 3D 공간 구성과 비교하여 3차원 공간 구성(즉, 기하학적 공간에서의 3D 구조)을 변경시킬 수 있다.
본원에 사용된 "비대칭인 ITR"이라는 용어(이는 "비대칭인 ITR 쌍"으로도 지칭됨)는, 전체 길이에 걸쳐 역 보체가 아닌 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 ITR의 쌍을 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 비대칭인 ITR 쌍은 3D 구조가 기하학적 공간에서 상이한 형상이 되도록 이의 동족 ITR과 대칭인 3차원 공간 구성을 갖지 않는다. 달리 말하면, 비대칭인 ITR 쌍은 전체적인 기하 구조가 상이하며, 즉, 이들은 3D 공간에서 A, C-C' 및 B-B' 루프의 구성이 상이하다(예를 들어, 하나의 ITR은 동족 ITR과 비교하여 짧은 C-C' 아암 및/또는 짧은 B-B' 아암을 가질 수 있음). 2개의 ITR 사이의 서열 차이는 하나 이상의 뉴클레오타이드 부가, 결실, 절단 또는 점 돌연변이로 인한 것일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 비대칭인 ITR 쌍 중 하나의 ITR은 야생형 AAV ITR 서열일 수 있고, 다른 하나의 ITR은 본원에 정의된 바와 같이 변형된 ITR(예를 들어, 비야생형 또는 합성 ITR 서열)일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 비대칭인 ITR 쌍 중 어느 ITR도 야생형 AAV 서열이 아니며, 2개의 ITR은 기하학적 공간에서 상이한 형상을 갖는(즉, 전체 기하 구조가 상이한) 변형된 ITR이다. 일부 실시형태에 따르면, 비대칭 ITR 쌍 중 하나의 mod-ITR은 짧은 C-C' 아암을 가질 수 있고, 다른 하나의 ITR은 동족 비대칭 mod-ITR과 비교하여 상이한 3차원 공간 구성을 갖도록 상이한 변형(예를 들어, 단일 아암 또는 짧은 B-B' 아암 등)을 가질 수 있다.
본원에 사용된 "대칭 ITR"이라는 용어는, 야생형 데펜도바이러스 ITR 서열에 비해 돌연변이되거나 변형되고 전체 길이에 걸쳐 역 보체인, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 ITR의 쌍을 나타낸다. ITR 중 어느 것도 야생형 ITR AAV2 서열이 아니며(즉, 이는 변형된 ITR이며, 돌연변이 ITR로도 지칭됨), 뉴클레오타이드 부가, 결실, 치환, 절단 또는 점 돌연변이로 인해 야생형 ITR의 서열과 차이가 있을 수 있다. 본원에서 편의를 위해, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 업스트림) 5'에 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 다운스트림) 3'에 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
본원에 사용된 "실질적으로 대칭인 변형된 ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍"이라는 용어는, 둘 모두 이의 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 변형된 ITR의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, 변형된 ITR은, 역 보체 서열에서 벗어난 일부 뉴클레오타이드 서열을 갖더라도, 변화가 특성 및 전체 형상에 영향을 미치지 않는 한, 실질적으로 대칭인 것으로 간주될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 동족 변형된 ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 달리 말하면, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은 3D 공간에 구성된 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 일부 실시형태에 따르면, mod-ITR 쌍으로부터의 ITR은 상이한 역 보체 뉴클레오타이드 서열을 갖지만, 여전히 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 가질 수 있으며, 즉, 두 개의 ITR은 동일한 전체 3D 형상을 생성하는 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, mod-ITR 쌍에서 하나의 ITR(예를 들어, 5' ITR)은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 ITR(예를 들어, 3' ITR)은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있지만, 두 가지 모두 동일한 상응하는 돌연변이를 가질 수 있으므로(예를 들어, 5' ITR이 C 영역에 결실을 갖는 경우, 상이한 혈청형의 동족 변형된 3' ITR은 C' 영역의 상응하는 위치에 결실을 가짐), 변형된 ITR 쌍은 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 이러한 실시형태에서, 변형된 ITR 쌍의 각각의 ITR은 상이한 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12), 예컨대 AAV2와 AAV6의 조합에서 유래할 수 있으며, 여기서 하나의 ITR에서의 변형은 상이한 혈청형의 동족 ITR 내 상응하는 위치에 반영된다. 일부 실시형태에 따르면, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은, ITR 사이의 뉴클레오타이드 서열 차이가 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고 이들이 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 갖는 한, 변형된 ITR(mod-ITR)의 쌍을 나타낸다. 비제한적인 예로서, BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 또는 기본 설정의 BLASTN과 같은 당업계에 널리 알려진 표준 수단에 의해 측정 시 기본형 mod-ITR과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 mod-ITR. 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 갖고, 또한 이의 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상으로 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다.
본원에 사용된 "내부 리보솜 진입 부위"(IRES)는, mRNA 서열의 중앙에서 번역 개시를 가능하게 하는 뉴클레오타이드 서열(>500개 뉴클레오타이드)을 나타내는 것으로 여겨진다(문헌[Kirn, JIT. et al., 2011. PLoS One 6(4): el 8556]; 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). IRES 서열을 사용하면 IRES 전후 유전자의 동시 발현이 보장되지만, IRES에 후속하는 서열은 IRES 서열에 선행하는 서열보다 낮은 수준으로 전사되고 번역될 수 있다.
본원에 사용된 "2A 펩타이드"는, 수족구병 바이러스(F2A), 돼지 테스코바이러스-1(P2A), 토세아 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus)(T2A) 또는 말 A형 비염 바이러스(E2A)와 같은 바이러스에서 유도된 소형 자가 절단 펩타이드를 나타내는 것으로 여겨진다. 2A라는 표기는 구체적으로 2A 펩타이드의 O-말단에 있는 글리실-프롤릴 결합에서 리보솜 스키핑을 유도하는 피코마바이러스(picomavirus) 다단백질의 영역을 나타낸다(문헌[Kim, J.IT. et al. 2011. PLoS One 6(4)]; 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). 이러한 스키핑은 2A 펩타이드와 이의 바로 다운스트림에 있는 펩타이드 사이의 절단을 유도한다.
"플랭킹"이라는 용어는, 또 다른 핵산 서열에 대한 하나의 핵산 서열의 상대적인 위치를 나타낸다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B는 A와 C에 의해 플랭킹되어 있다. 이는 배열 AxBxC에 대해서도 동일하게 적용된다. 따라서, 플랭킹 서열은 플랭킹된 서열의 앞에 있거나 뒤에 있지만, 플랭킹된 서열에 인접하거나 바로 근접할 필요는 없다. 일부 실시형태에 따르면, 플랭킹이라는 용어는, 선형 이중체 ceDNA 벡터의 각 말단에 있는 말단반복서열을 나타낸다.
본원에 사용된 "ceDNA 게놈"이라는 용어는, 적어도 하나의 역말단반복 영역을 추가로 포함하는 발현 카세트를 나타낸다. ceDNA 게놈은 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 게놈은 DNA의 분자간 이중체 폴리뉴클레오타이드로서 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 혼입된다.
본원에 사용된 "ceDNA 스페이서 영역"이라는 용어는, ceDNA 벡터 또는 ceDNA 게놈에서 기능성 요소를 분리하는 개재 서열을 나타낸다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 스페이서 영역은 최적의 기능을 위해 2개의 기능성 요소를 목적하는 거리로 유지시킨다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 스페이서 영역은, 예를 들어 플라스미드 또는 바큘로바이러스 내에 ceDNA 게놈의 유전적 안정성을 제공하거나 부가한다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 스페이서 영역은, 클로닝 부위 등에 대한 편리한 위치를 제공하는 방식으로, ceDNA 게놈의 준비된 유전자 조작을 용이하게 한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 몇몇 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 "폴리링커", 또는 알려진 단백질(예를 들어, 전사인자) 결합 부위를 갖지 않도록 설계된 비(non)오픈리딩프레임 서열은, 시스-작용 인자를 분리하기 위해, 예를 들어 말단 분해 부위와 업스트림 전사 조절 요소 사이에 6량체, 12량체, 18량체, 24량체, 48량체, 86량체, 176량체 등을 삽입하는 방식으로, ceDNA 게놈에 배치될 수 있다. 유사하게, 스페이서는 폴리아데닐화 신호 서열과 3'-말단 분해 부위 사이에 혼입될 수 있다.
본원에 사용된 "Rep 결합 부위", "Rep 결합 요소", "RBE" 및 "RBS"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, Rep 단백질에 의해 결합될 때, Rep 단백질이 RBS를 포함하는 서열에서 이의 부위 특이적 엔도뉴클레아제 활성을 수행할 수 있게 하는 Rep 단백질(예를 들어, AAV Rep 78 또는 AAV Rep 68)에 대한 결합 부위를 나타낸다. RBS 서열과 이의 역 보체는 함께 단일 RBS를 형성한다. RBS 서열은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 AAV2에서 식별된 RBS 서열인 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'를 포함한다. 다른 알려진 AAV RBS 서열, 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 RBS 서열을 포함하는, 임의의 알려진 RBS 서열이 본 개시내용의 실시형태에서 사용될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, Rep 단백질의 뉴클레아제 도메인은 이중체 핵산 서열 GCTC에 결합하기 때문에, 2개의 알려진 AAV Rep 단백질이 이중체 올리고뉴클레오타이드인 5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'에 직접 결합하여 이에서 안정적으로 어셈블링된다고 여겨진다. 또한, 가용성 응집된 이형태체(conformer)(즉, 정의되지 않은 수의 상호연관된 Rep 단백질)는 해리되어, Rep 결합 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드에 결합한다. 각각의 Rep 단백질은 각 가닥에서 질소성 염기 및 포스포디에스테르 백본과 상호작용한다. 질소성 염기와의 상호작용은 서열 특이성을 제공하지만, 포스포디에스테르 백본과의 상호작용은 비(non)서열 특이적 또는 덜 서열 특이적이며, 단백질-DNA 복합체를 안정화시킨다.
본원에 사용된 "말단 분해 부위" 및 "TRS"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, Rep가 5' 티미딘과 티로신-포스포디에스테르 결합을 형성하여, 세포 DNA 폴리머라아제, 예를 들어 DNA pol 델타 또는 DNA pol 엡실론을 통해 DNA 연장을 위한 기질로서 작용하는 3' OH를 생성하는 영역을 나타낸다. 대안적으로, Rep-티미딘 복합체는 조정된 결찰 반응에 참여할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, TRS는 염기쌍을 이루지 않은 티미딘을 최소한으로 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, TRS의 닉킹 효율은 RBS로부터의 동일한 분자 내 거리에 의해 적어도 부분적으로 제어될 수 있다. 수용체 기질이 상보적 ITR인 경우, 생성되는 산물은 분자내 이중체이다. TRS 서열은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 AAV2로 식별된 헥사뉴클레오타이드 서열인 5'-GGTTGA-3'를 포함한다. 다른 알려진 AAV TRS 서열 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 TRS 서열, 예컨대 AGTT, GGTTGG, AGTTGG, AGTTGA, 및 RRTTRR과 같은 다른 모티프를 포함하는, 임의의 알려진 TRS 서열이 본 개시내용의 실시형태에서 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "ceDNA"라는 용어는, 비바이러스성 유전자 전달을 위한 합성 또는 그 이외의 다른 캡시드 미함유 폐쇄형 선형 이중가닥(ds) 이중체 DNA를 나타낸다. ceDNA에 대한 상세한 설명은, 2017년 3월 3일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2017/020828에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 명백하게 본원에 참조로 인용된다. 세포 기반 방법을 사용하여 다양한 역말단반복(ITR) 서열 및 구성을 포함하는 ceDNA의 생산을 위한 특정 방법은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US18/49996 및 2018년 12월 6일자 출원된 PCT/US2018/064242의 실시예 1에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 다양한 ITR 서열 및 구성을 포함하는 합성 ceDNA 벡터의 생산을 위한 특정 방법은, 예를 들어 2019년 1월 18일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2019/14122에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다. 본원에 사용된 "ceDNA 벡터" 및 "ceDNA"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 적어도 하나의 말단 회문구조를 포함하는 폐쇄형 DNA 벡터를 나타낸다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 2개의 공유결합으로 폐쇄된 말단을 포함한다.
본원에 사용된 "ceDNA-플라스미드"라는 용어는, 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 플라스미드를 나타내다.
본원에 사용된 "ceDNA-박미드"라는 용어는, 플라스미드로서 대장균에서 증식할 수 있고, 따라서 바큘로바이러스에 대한 셔틀 벡터로서 작용할 수 있는 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 감염성 바큘로바이러스 게놈을 나타낸다.
본원에 사용된 "ceDNA-바큘로바이러스"라는 용어는, 바큘로바이러스 게놈 내에 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 바큘로바이러스를 나타낸다.
본원에 사용된 "ceDNA-바큘로바이러스 감염된 곤충 세포" 및 "ceDNA-BIIC"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, ceDNA-바큘로바이러스로 감염된 무척추동물 숙주세포(비제한적으로, 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포) 포함)를 나타낸다.
본원에 사용된 "폐쇄형 DNA 벡터"라는 용어는, 적어도 하나의 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖고 벡터의 적어도 일부가 분자내 이중체 구조를 갖는 캡시드 미함유 DNA 벡터를 나타낸다.
본원에 정의된 "리포터"란, 검출 가능한 판독물을 제공하는 데 사용될 수 있는 단백질을 나타낸다. 리포터는 일반적으로 형광, 색상 또는 발광과 같은 측정 가능한 신호를 생성한다. 리포터 단백질 코딩 서열은 세포 또는 유기체에서의 존재가 용이하게 관찰되는 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 형광 단백질은 특정 파장의 빛으로 여기될 때 세포가 형광을 나타내게 하고, 루시퍼라아제는 세포가 빛을 생성하는 반응을 촉진시키게 하며, β-갈락토시다아제와 같은 효소는 기질을 착색된 산물로 전환시킨다. 실험 또는 진단 목적에 유용한 예시적인 리포터 폴리펩타이드에는, 비제한적으로, β-락타마아제, β -갈락토시다아제(LacZ), 알칼리성 포스파타아제(AP), 티미딘 키나아제(TK), 녹색 형광 단백질(GFP) 및 다른 형광 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시퍼라아제, 및 당업계에 널리 알려진 다른 것들이 포함된다.
본원에 사용된 "이펙터(effector) 단백질"이라는 용어는, 예를 들어 리포터 폴리펩타이드, 또는 보다 적절하게는, 세포를 사멸시키는 폴리펩타이드, 예를 들어 독소, 또는 선택된 작용제 또는 이의 결여로 인해 세포를 사멸시키기 쉽게 만드는 작용제로서 검출 가능한 판독물을 제공하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 이펙터 단백질에는, 숙주세포의 DNA 및/또는 RNA를 직접 표적으로 하거나 이를 손상시키는 임의의 단백질 또는 펩타이드가 포함된다. 예를 들어, 이펙터 단백질은, 비제한적으로, 숙주세포 DNA 서열(게놈 요소인지 또는 염색체외 요소인지에 관계없이)을 표적으로 하는 제한 엔도뉴클레아제, 세포 생존에 필요한 폴리펩타이드 표적을 분해하는 프로테아제, DNA 자이라아제(gyrase) 저해제 및 리보뉴클레아제 유형 독소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 합성 생물학적 회로에 의해 제어되는 이펙터 단백질의 발현은, 또 다른 합성 생물학적 회로에 인자로 참여하여, 생물학적 회로 시스템의 반응성의 범위 및 복잡성을 확장시킬 수 있다.
전사 조절인자는 전이유전자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산)의 전사를 활성화시키거나 억제하는 전사 활성인자와 전사 억제인자를 나타낸다. 프로모터는 특정 유전자의 전사를 개시하는 핵산의 영역이다. 전사 활성인자는 전형적으로 전사 프로모터 근처에 결합하고, RNA 폴리머라아제를 동원하여 직접 전사를 개시한다. 억제인자는 전사 프로모터에 결합하여, RNA 폴리머라아제에 의한 전사 개시를 입체적으로 방해한다. 다른 전사 조절인자는 이들의 결합하는 위치, 및 세포 및 환경 조건에 따라 활성인자 또는 억제인자로 작용할 수 있다. 전사 조절인자 부류의 비제한적인 예에는, 비제한적으로, 호메오도메인(homeodomain) 단백질, 아연-핑거 단백질, 날개있는 나선형(winged-helix)(포크헤드(forkhead)) 단백질 및 류신-지퍼 단백질이 포함된다.
본원에 사용된 "억제 단백질" 또는 "유도 단백질"은, 조절 서열 요소에 결합하여, 조절 서열 요소에 작동적으로 연결된 서열의 전사를, 각각, 억제 또는 활성화시키는 단백질이다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 억제 및 유도 단백질은 적어도 하나의 입력물질 또는 환경 입력의 존재 또는 부재에 민감하다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 단백질은, 예를 들어 분리 가능한 DNA 결합 및 입력물질 결합, 또는 반응성 요소 또는 도메인을 포함하는 형태의 모듈이다.
본원에 사용된 "담체"에는, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등이 포함된다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 알려져 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. "약제학적으로 허용 가능한"이라는 구절은, 숙주에게 투여될 때 독성, 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 나타낸다.
본원에 사용된 "입력물질 반응성 도메인"은, 연결된 DNA 결합 융합 도메인을 해당 조건 또는 입력의 존재에 대해 반응성으로 만드는 방식으로 조건 또는 입력물질에 결합하거나 다르게는 이에 반응하는 전사인자의 도메인이다. 일부 실시형태에 따르면, 조건 또는 입력의 존재는 입력물질 반응성 도메인 또는 이와 융합되는 단백질에서 입체형태 변화를 유도하여, 전사인자의 전사 조절 활성을 변형시킨다.
"생체내"라는 용어는, 다세포 동물과 같은 유기체에서 또는 유기체 내에서 일어나는 검정 또는 과정을 나타낸다. 본원에 기재된 일부 양태에 따르면, 방법 또는 용도는, 박테리아와 같은 단세포 유기체가 사용될 때, "생체내"에서 일어난다고 할 수 있다. "생체외"라는 용어는, 다세포 동물 또는 식물의 체외, 예를 들어 특히 외식편, 배양된 세포(1차 세포 및 세포주 포함), 형질전환된 세포주, 및 추출된 조직 또는 세포(혈액 세포 포함)에 있는 온전한 막을 갖는 살아있는 세포를 사용하여 수행되는 방법 및 용도를 나타낸다. "시험관내"라는 용어는, 세포 추출물과 같은 온전한 막을 갖는 세포의 존재를 필요로 하지 않는 검정 및 방법을 나타내며, 세포를 포함하지 않는 배지와 같은 비(non)세포 시스템, 또는 세포 추출물과 같은 세포 시스템에 프로그래밍 가능한 합성 생물학적 회로를 도입하는 것을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 "프로모터"라는 용어는, 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 이종 표적 유전자일 수 있는 핵산 서열의 전사를 유도하는 방식으로 또 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 임의의 핵산 서열을 나타낸다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직 특이적 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 핵산 서열의 나머지 부분의 전사 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 제어 영역이다. 프로모터는 또한 RNA 폴리머라아제 및 다른 전사인자와 같은, 조절 단백질 및 분자에 결합할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 양태의 일부 실시형태에 따르면, 프로모터는 프로모터 자체의 발현을 조절하는 전사인자의 발현을 유도할 수 있다. 프로모터 서열 내에는 전사 개시 부위뿐 아니라, RNA 폴리머라아제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인이 발견될 것이다. 진핵생물 프로모터는 종종, 항상은 아니지만, "TATA" 박스와 "CAT" 박스를 함유할 것이다. 유도성 프로모터를 포함하는 다양한 프로모터는, 본원에 개시된 ceDNA 벡터의 전이유전자의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 프로모터 서열은 이의 3' 말단에서 전사 개시 부위에 의해 결합될 수 있으며, 배경보다 높은 검출 가능한 수준으로 전사를 개시하는 데 필요한 최소한의 염기 또는 요소의 수를 포함하도록 업스트림(5' 방향)으로 연장된다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용의 프로모터는 간 특이적 프로모터이다.
본원에 사용된 "인핸서"라는 용어는, 핵산 서열의 전사 활성화를 증가시키기 위해 하나 이상의 단백질(예를 들어, 활성화 단백질 또는 전사인자)과 결합하는 시스-작용 조절 서열(예를 들어, 10개 내지 1,500개 염기쌍)을 나타낸다. 인핸서는 이들이 조절하는 유전자 시작 부위의 업스트림 또는 유전자 시작 부위의 다운스트림에 최대 1,000,000개 염기쌍으로 배치될 수 있다. 인핸서는 인트론 영역 내, 또는 관련없는 유전자의 엑손 영역에 배치될 수 있다.
프로모터는 이것이 조절하는 핵산 서열의 발현을 유도하거나 전사를 유도한다고 할 수 있다. "작동 가능하게 연결된", "작동적으로 배치된", "작동적으로 연결된", "제어 하에 있는" 및 "전사 제어 하에 있는"이라는 구절은, 프로모터가 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 조절하는 핵산 서열에 대해 정확한 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재한다는 것을 나타낸다. 본원에 사용된 "역 프로모터"는, 코딩 가닥이 비코딩 가닥이 되고, 그 반대로도 되도록, 핵산 서열이 역 배향으로 존재하는 프로모터를 나타낸다. 역 프로모터 서열은 다양한 실시형태에서 스위치의 상태를 조절하는 데 사용될 수 있다. 또한, 다양한 실시형태에서, 프로모터는 인핸서와 함께 사용될 수 있다.
프로모터는 소정의 유전자 또는 서열의 코딩 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5' 비코딩 서열을 단리하여 얻을 수 있는 바와 같이 유전자 또는 서열과 자연적으로 회합된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 실시형태에 따르면, 인핸서는 해당 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한, 핵산 서열과 자연적으로 회합된 것일 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 코딩 핵산 분절은 "재조합 프로모터" 또는 "이종 프로모터"의 제어 하에 배치되며, 여기서 두 가지 프로모터는 모두 자연 환경에서 작동 가능하게 연결된 인코딩된 핵산 서열과 통상적으로 회합되어 있지 않은 프로모터를 나타낸다. "재조합 또는 이종 인핸서"는, 자연 환경에서 소정의 핵산 서열과 통상적으로 회합되어 있지 않은 인핸서를 나타낸다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는, 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서; 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포에서 단리된 프로모터 또는 인핸서; 및 "자연 발생"이 아닌, 즉, 상이한 전사조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 당업계에 알려진 유전자 조작 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함하는 합성 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터와 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것에 더하여, 프로모터 서열은 본원에 개시된 합성 생물학적 회로 및 모듈과 관련하여, 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술(PCR 포함)을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호(이들은 각각 본원에 참조로 인용됨) 참조). 나아가, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비(non)핵 세포소기관 내 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열이 또한 이용될 수 있다고 고려된다.
본원에 기재된 "유도성 프로모터"는, 유도제 또는 유도 작용제의 존재 하에 있거나, 이에 의해 영향을 받거나 또는 이와 접촉될 때 전사 활성을 개시하거나 증강시키는 것을 특징으로 하는 것이다. 본원에 정의된 "유도제" 또는 "유도 작용제"는, 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 유도하는 데 활성이 되는 방식으로 투여되는, 내인성, 또는 통상적으로 외인성 화합물 또는 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 유도제 또는 유도 작용제, 즉, 화학물질, 화합물 또는 단백질은, 그 자체가 핵산 서열의 전사 또는 발현 결과일 수 있으며(즉, 유도제는 또 다른 구성요소 또는 모듈에 의해 발현된 유도제 단백질일 수 있음), 이는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 유도성 프로모터는 억제인자와 같은 특정 작용제의 부재 하에서 유도된다. 유도성 프로모터의 예에는, 비제한적으로, 테트라시클린(tetracycline), 메탈로티오닌(metallothionine), 엑디손(ecdysone), 포유류 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 및 마우스 유선 종양 바이러스 긴말단반복서열(MMTV-LTR)), 및 다른 스테로이드 반응성 프로모터, 라파마이신(rapamycin) 반응성 프로모터 등이 포함된다.
본원에서 교환가능하게 사용되는 "DNA 조절 서열", "제어 요소" 및 "조절 요소"라는 용어는, 비코딩 서열(예를 들어, DNA 표적화 RNA) 또는 코딩 서열(예를 들어, 부위 지정 변형 폴리펩타이드 또는 Cas9/Csn1 폴리펩타이드)을 제공하고/하거나 이의 전사를 조절하고/하거나, 인코딩된 폴리펩타이드의 전사를 조절하는, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결인자, 단백질 분해 신호 등과 같은 전사 및 번역 제어 서열을 나타낸다.
본원에 사용된 "오픈리딩프레임(ORF)"이라는 용어는, 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있는 몇몇 뉴클레오타이드 삼중체 서열을 나타내는 것으로 여겨진다. 오픈리딩프레임은 바람직하게는 개시 코돈, 즉, 5'-말단에서 통상적으로 아미노산 메티오닌을 코딩하는 3개의 후속 뉴클레오타이드 조합(ATG), 및 통상적으로 3개 뉴클레오타이드 배수 길이를 나타내는 후속 영역을 함유한다. ORF는 바람직하게는 종결 코돈(예를 들어, TAA, TAG, TGA)에 의해 종결된다. 전형적으로, 이는 오픈리딩프레임의 유일한 종결 코돈이다. 따라서, 본 개시내용의 맥락에서 오픈리딩프레임은 바람직하게는 개시 코돈(예를 들어, ATG)으로 시작하고, 바람직하게는 종결 코돈(예를 들어, TAA, TGA 또는 TAG)으로 종결되는, 3으로 나눌 수 있는 다수의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 서열이다. 오픈리딩프레임은 단리될 수 있거나, 더 긴 핵산 서열, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터에 혼입될 수 있다.
"작동 가능하게 연결된"이란, 기재된 바와 같은 구성요소가 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 관계에 있는 근접부위(juxtaposition)를 나타낸다. 예를 들어, 프로모터가 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. "발현 카세트"는, ceDNA 벡터에서 전이유전자의 전사를 지시하는 데 충분한 프로모터 또는 다른 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 포함한다. 적합한 프로모터에는, 예를 들어 조직 특이적 프로모터가 포함된다. 프로모터는 또한 AAV 기원일 수 있다.
본원에 사용된 "대상"이라는 용어는, 본 개시내용에 따른 ceDNA 벡터로 치료(예방적 치료 포함)가 제공되는 인간 또는 동물을 나타낸다. 본원에 사용된 "대상"이라는 용어에는, 인간과 다른 동물이 포함된다. 전형적으로, 대상은 인간이다. 예를 들어, 대상은 성인, 청소년, 아동(2세 내지 14세), 유아(출생 시부터 2세까지) 또는 신생아(2개월 이하)일 수 있다. 특정 양태에서, 대상은 4개월 이하 또는 6개월 이하이다. 일부 양태에 따르면, 대상은 약 65세 이상 또는 약 60세 이상의 노인이다. 일부 양태에 따르면, 대상은 임산부 또는 임신하려는 여성이다. 다른 양태에서, 대상은 인간이 아니며; 예를 들어 개코원숭이(baboon), 침팬지, 고릴라 또는 마카크(macaque)와 같은 비인간 영장류이다. 특정 양태에서, 대상은 개 또는 고양이와 같은 애완동물일 수 있다.
본원에 사용된 "숙주세포"라는 용어는, 본 개시내용의 핵산 작제물 또는 ceDNA 발현 벡터를 이용한 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입 등에 민감한 임의의 세포 유형을 나타낸다. 비제한적인 예로서, 숙주세포는 단리된 1차 세포, 다능성 줄기세포, CD34+ 세포, 유도된 다능성 줄기세포, 또는 다수의 불멸화된 세포주 중 임의의 것(예를 들어, HepG2 세포)일 수 있다. 대안적으로, 숙주세포는 조직, 기관 또는 유기체의 제자리 또는 생체내 세포일 수 있다.
"외인성"라는 용어는, 천연 공급원 이외의 세포에 존재하는 물질을 나타낸다. 본원에 사용된 "외인성"이라는 용어는, 인간의 손이 관여하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템에 도입된 핵산(예를 들어, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산) 또는 폴리펩타이드로서, 세포 또는 유기체에서 통상적으로 발견되지 않으며, 인간이 이러한 세포 또는 유기체에 도입하고자 하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 대안적으로, "외인성"은, 인간의 손이 관여하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템에 도입된 핵산 또는 폴리펩타이드로서, 비교적 낮은 수준으로 발견되며, 인간이, 예를 들어 이소성(ectopic) 발현 또는 수준을 생성하도록 이러한 세포 또는 유기체 내에서 양을 증가시키고자 하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 대조적으로, "내인성"이라는 용어는, 생물학적 시스템 또는 세포에 고유한 물질을 나타낸다.
"서열 동일성"이라는 용어는, 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 관련성을 나타낸다. 본 개시내용의 목적을 위해, 2개의 데옥시리보뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 동일성 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 상기 Rice 등의 문헌(2000) 참조)의 니들(Needle) 프로그램(바람직하게는 버전 3.0.0 이상)에서 구현된 바와 같이 니들만 브니쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘(상기 Needleman 및 Wunsch의 문헌(1970) 참조)을 사용하여 결정된다. 사용되는 선택적 매개변수는 갭 오픈 페널티 10, 갭 연장 페널티 0.5 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 표지된 "최장 동일성"의 출력(-nobrief 옵션을 사용하여 수득됨)은 동일성%로 사용되며, 이는 다음과 같이 계산된다: (동일한 데옥시뉴클레오타이드 x 100)/(정렬 길이 - 정렬의 총 갭 수). 정렬의 길이는 바람직하게는 적어도 10개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 25개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오타이드 및 가장 바람직하게는 적어도 100개 뉴클레오타이드이다.
본원에 사용된 "상동성" 또는 "상동"이라는 용어는, 서열을 정렬하고, 최대 서열 동일성%를 달성하기 위해 필요한 경우 갭을 도입한 후, 표적 염색체 상의 상응하는 서열의 뉴클레오타이드 잔기와 동일한 뉴클레오타이드 잔기의 백분율로 정의된다. 뉴클레오타이드 서열 상동성%를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술 내에서 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 예를 들어 상동성 아암의 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)은, 서열이 숙주세포의 상응하는 천연 또는 미편집된 핵산 서열(예를 들어, 게놈 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상 동일한 경우, "상동"인 것으로 간주된다.
본원에 사용된 "이종"이라는 용어는, 각각, 천연 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 의미한다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전자 조작에 의해) 자연 발생 핵산 서열(또는 이의 변이체)에 연결되어, 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하는 키메라 뉴클레오타이드 서열을 생성할 수 있다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전자 조작에 의해) 변이형 폴리펩타이드에 연결되어, 융합 변이형 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 생성할 수 있다. 대안적으로, "이종"이라는 용어는 세포 또는 대상에 자연적으로 존재하지 않는 핵산 서열을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 "벡터" 또는 "발현 벡터"는, 세포 내 부착된 분절의 복제를 야기하도록, 또 다른 DNA 분절, 즉, "삽입물"에 부착될 수 있는, 플라스미드, 박미드, 파지, 바이러스, 비리온 또는 코스미드(cosmid)와 같은 레플리콘이다. 벡터는 숙주세포로의 전달, 또는 상이한 숙주세포 사이에서의 전달을 위해 설계된 핵산 작제물일 수 있다. 본원에 사용된 벡터는 본래 및/또는 최종 형태가 바이러스성 또는 비바이러스성일 수 있지만, 본 개시내용의 목적을 위해, "벡터"는 일반적으로 본원에 사용된 바와 같은 용어로서의 ceDNA 벡터를 나타낸다. "벡터"라는 용어는, 적절한 제어 요소와 회합될 때 복제 가능하고, 유전자 서열을 세포로 전달할 수 있는 임의의 유전 요소를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 벡터는 발현 벡터 또는 재조합 벡터일 수 있다.
본원에 사용된 "발현 벡터"라는 용어는, 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 벡터를 나타낸다. 발현된 서열은 반드시는 아니지만, 종종 세포에 대해 이종성일 수 있다. 발현 벡터는 추가 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있기 때문에, 2가지 유기체에서, 예를 들어 인간 세포에서 발현을 위해, 원핵생물 숙주에서 클로닝 및 증폭을 위해 유지될 수 있다. "발현"이라는 용어는, 적용 가능한 경우, 비제한적으로, 예를 들어 전사, 전사체 처리, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 처리를 포함하는, RNA 및 단백질의 생산, 및 적절한 경우, 단백질 분비에 관여하는 세포 과정을 나타낸다. "발현 산물"에는, 유전자에서 전사된 RNA, 및 유전자에서 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩타이드가 포함된다. "유전자"라는 용어는, 적절한 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 때 시험관내 또는 생체내에서 RNA로 전사되는 핵산 서열(DNA)을 의미한다. 유전자는 코딩 영역의 앞뒤 영역, 예를 들어 5' 미번역(5' UTR) 또는 "리더(leader)" 서열과 3' UTR 또는 "트레일러(trailer)" 서열뿐 아니라, 개별 코딩 분절(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수도 포함하지 않을 수도 있다.
"재조합 벡터"란, 이종 핵산 서열, 또는 생체내에서 발현 가능한 "전이유전자"를 포함하는 벡터를 의미한다. 본원에 기재된 벡터가, 일부 실시형태에 따르면, 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 일부 실시형태에 따르면, 벡터는 에피솜이다. 적합한 에피솜 벡터의 사용은 대상에서 관심 뉴클레오타이드를 염색체외 DNA에 높은 카피수로 유지하여, 염색체 통합의 잠재적인 영향을 제거하는 수단을 제공한다.
본원에 사용된 "투여", "투여하는"이라는 용어 및 이의 변형은, 대상에게 조성물 또는 작용제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA)를 도입하는 것을 나타내며, 하나 이상의 조성물 또는 작용제의 동시 및 순차적 도입을 포함한다. "투여"는, 예를 들어 치료, 약동학, 진단, 연구, 위약 및 실험 방법을 나타낼 수 있다. "투여"는 또한 시험관내 및 생체외 처리를 포함한다. 대상으로의 조성물 또는 작용제의 도입은, 경구, 폐, 비강, 비경구(정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하), 직장, 림프내, 종양내 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 경로로 이루어진다. 투여는 자가 투여와 다른 이에 의한 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로로 수행될 수 있다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 작용제가 이의 의도된 기능을 수행하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물은 조성물 또는 작용제를 대상의 정맥에 도입하는 방식으로 투여된다.
본원에 사용된 "감염"이라는 용어는, 병원체가 숙주에 처음으로 유입되는 것과 병원체가 숙주의 세포 또는 조직 내 또는 상에 확립된 상태를 나타내며, 이러한 상태가 반드시 질환을 구성하거나 질환으로 이어지는 것은 아니다.
본원에 사용된 "면역반응"이라는 용어는, 이러한 반응의 결과가 대상에게 유익한지 유해한지에 관계없이, 외래 또는 자가 항원에 대한 대상의 면역계의 임의의 기능성 발현을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "생물학적 샘플"이라는 용어는, 예를 들어 DNA, RNA, 지질, 탄수화물 및 단백질을 포함하는 대상에서 단리된 생물학적 기원의 임의의 유형의 물질을 나타낸다. "생물학적 샘플"이라는 용어에는, 대상에서 단리된 조직, 세포 및 생물학적 유체가 포함된다. 생물학적 샘플에는, 예를 들어, 비제한적으로, 전혈, 혈장, 혈청, 정액, 타액, 눈물, 소변, 대변, 땀, 협측, 피부, 뇌척수액, 골수, 담즙, 모발, 근육 생검, 기관 조직, 또는 당업자에게 알려진 다른 생물학적 기원의 물질이 포함된다. 생물학적 샘플은 진단 또는 연구를 위해 대상에서 얻을 수 있거나, 대조군 또는 기초 연구를 위해 건강한 대상에서 얻을 수 있다.
본원에 사용된 "암"이라는 용어는, 비정상 세포가 통제를 벗어난 상태로 분열하여 다른 조직에 침범할 수 있는 질환을 나타낸다. 100가지가 넘는 상이한 유형의 암이 존재한다. 대부분의 암은 암이 시작된 기관 또는 세포 유형에 따라 명명되며, 예를 들어 결장에서 시작되는 암은 결장암으로 불리고; 피부의 멜라닌세포에서 시작되는 암은 흑색종으로 불린다. 암 유형은 더 광범위한 범주로 그룹화될 수 있다. 암의 주요 범주에는 하기가 포함된다: 암종(피부, 또는 내부 기관의 경계를 이루거나 이를 포함하는 조직에서 시작되는 암으로, 이의 하위유형에는 선암종, 기저세포 암종, 편평세포 암종 및 이행세포 암종이 포함됨); 육종(뼈, 연골, 지방, 근육, 혈관, 또는 다른 결합 또는 지지 조직에서 시작되는 암을 의미함); 백혈병(혈액 형성 조직(예를 들어, 골수)에서 시작되어, 다수의 비정상 세포 생성을 유도하여 혈액으로 들어가는 암을 의미함); 림프종 및 골수종(면역계의 세포에서 시작되는 암을 의미함); 및 중추신경계(CNS) 암(뇌와 척수의 조직에서 시작되는 암을 의미함). "골수이형성 증후군"이라는 용어는, 골수가 건강한 혈액 세포(백혈구, 적혈구 및 혈소판)를 충분히 만들지 못하고, 혈액 및/또는 골수에 비정상 세포가 존재하는 암의 유형의 나타낸다. 골수이형성 증후군은 급성 골수성 백혈병(AML)이 될 수 있다. 특정 실시형태에서, 암은, 비제한적으로, 급성 림프구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 항문암, 담관암, 방광암, 골암, 대장암, 뇌암, 유방암, 원발부위 불명암, 뼈로 전이된 암, 뇌로 전이된 암, 간으로 전이된 암, 폐로 전이된 암, 카르시노이드, 자궁경부암, 융모막암종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 안구암, 담낭암, 위암, 임신 융모성 종양(GTT), 모발세포 백혈병, 두경부암, 호지킨 림프종, 신장암, 후두암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 흑색종 피부암, 중피종, 남성암, 기태임신, 구강 및 구인두 암, 골수종, 비강 및 부비동 암, 비인두암, 비호지킨 림프종(NHL), 식도암, 난소암, 췌장암, 음경암, 전립선암, 희귀암, 직장암, 타액선암, 속발성 암, 피부암(비흑색종), 연조직 육종, 위암, 고환암, 갑상선암, 원발부위 불명암, 자궁암, 질암 및 외음부암을 포함하는 암에서 선택된다.
본원에 사용된 "용량"이라는 용어는, 대상에게 한 번에 취해지거나 투여되는 물질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA)의 양을 나타낸다.
본원에 사용된 "투약"이라는 용어는, 치료 목적(예를 들어, 치료)을 달성하기 위해 물질(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA)을 투여하는 것을 나타낸다.
"제2 작용제와 병용되는 제1 작용제"라는 구절에서 "병용(조합)"이라는 용어는, 예를 들어 동일한 약제학적으로 허용 가능한 담체에 용해되거나 혼합될 수 있는 제1 작용제와 제2 작용제의 병용투여, 또는 제1 작용제의 투여 후 제2 작용제의 투여, 또는 제2 작용제의 투여 후 제1 작용제의 투여를 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 병용 치료 방법과 약제학적 조성물의 병용을 포함한다.
"동시 치료법"이라는 구절에서 "동시"라는 용어는, 제2 작용제의 존재 하에서 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 동시 치료 방법은 제1, 제2, 제3 또는 추가의 작용제가 병용투여되는 방법을 포함한다. 동시 치료 방법은 또한, 제1 또는 추가 작용제가 제2 또는 추가 작용제의 존재 하에서 투여되는 방법으로서, 여기서, 예를 들어 제2 또는 추가 작용제가 이전에 투여되었을 수 있는 방법을 포함한다. 동시 치료 방법은 상이한 행위자에 의해 단계적으로 실행될 수 있다. 예를 들어, 한 명의 행위자는 대상에게 제1 작용제를 투여할 수 있고, 제2 작용자는 대상에게 제2 작용제를 투여할 수 있으며, 투여 단계는 동시에, 또는 거의 동시에, 또는 제1 작용제(및 추가 작용제)가 투여 후 제2 작용제(및 추가 작용제)의 존재 하에 있는 한, 시간 간격을 두고 실행될 수 있다. 실행자와 대상은 동일한 엔티티(예를 들어, 인간)일 수 있다.
본원에 사용된 "병용 요법"이라는 용어는, 둘 이상의 치료 물질, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편과, 또 다른 약물의 투여를 나타낸다. 다른 약물(들)은 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편과 동시에, 이의 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다.
본원에 사용된 "핵산 치료제", "치료용 핵산" 및 "TNA"라는 구절은 상호교환적으로 사용되며, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제의 활성 성분으로서 핵산을 사용하는 임의의 치료 양식을 나타낸다. 본원에 사용된 이러한 구절은 RNA 기반 치료제와 DNA 기반 치료제를 나타낸다. RNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA)가 포함된다. DNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 합성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone™ DNA 벡터, 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터) 또는 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA")가 포함된다. 일부 실시형태에 따르면, 치료용 핵산은 ceDNA이다.
본원에 사용된 "치료 효과"라는 용어는, 바람직하고 유익한 것으로 판단되는 치료 결과를 나타낸다. 치료 효과는, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다. 치료 효과는 또한, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현 진행의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 치료제의 경우, 치료적 유효량은 초기에 예비 시험관내 연구 및/또는 동물 모델에서 결정될 수 있다. 치료적 유효 용량은 또한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용되는 용량은 투여된 화합물의 상대적인 생체이용률 및 효능을 기반으로 조정될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 다른 널리 알려진 방법을 기반으로 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은, 당업자의 능력에 속한다. 문헌[Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw-Hill (New York) (2001)](상기 문헌은 본원에 참조로 인용됨)의 챕터 1에서 확인할 수 있는 치료 효과를 결정하는 일반 원리가 하기에 요약되어 있다.
약동학적 원리는, 허용 가능하지 않은 부작용을 최소화하면서 목적하는 정도의 치료 효능을 얻기 위해 투여 요법을 변경하는 기반을 제공한다. 약물의 혈장 농도가 측정될 수 있고 이것이 치료 범위와 관련이 있는 상황에서, 투여량 변경을 위한 추가 지침을 얻을 수 있다.
본원에 사용된 "바이러스 감염"은, 대상의 체내에 바이러스가 침입하여 증식하는 것을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "치료하다", "치료하는" 및/또는 "치료"라는 용어는, 병태의 진행을 중단시키거나, 실질적으로 저해하거나, 느리게 하거나 또는 역전시키는 것; 병태의 임상 증상을 실질적으로 개선하는 것; 또는 병태의 임상 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 통해 유익하거나 목적하는 임상 결과를 수득하는 것을 포함한다. 치료는 나아가 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 나타낸다: (a) 장애의 중증도를 감소시키는 것; (b) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 발달을 제한하는 것; (c) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화를 제한하는 것; (d) 이전에 장애(들)를 앓았던 환자에서 장애(들)의 재발을 제한하는 것; 및 (e) 장애(들)에 대해 이전에 증상이 없었던 환자에서 증상의 재발을 제한하는 것.
약리학적 및/또는 생리학적 효과와 같은 유익하거나 목적하는 임상 결과에는, 비제한적으로, 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만, 질환의 증상을 아직 경험하지 않았거나 나타내지 않은 대상에서 질환, 장애 또는 병태의 발생을 예방하는 것(예방적 치료), 질환, 장애 또는 병태의 증상 경감, 질환, 장애 또는 병태의 정도 감소, 질환, 장애 또는 병태의 안정화(즉, 악화시키지 않음), 질환, 장애 또는 병태의 확산 예방, 질환, 장애 또는 병태 진행의 지연 또는 늦추기, 질환, 장애 또는 병태의 개선 또는 완화, 및 이들의 조합뿐 아니라, 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존기간에 비해 생존기간을 연장시키는 것이 포함된다.
"이를 필요로 하는" 대상에는, 이미 질환 또는 장애, 감염 또는 암에 걸린 인간과 같은 포유동물이 포함된다.
본원에 사용된 "증가시키다", "증강시키다", "상승시키다" (및 유사 용어)라는 용어는, 일반적으로, 본래 값, 예측 값 또는 평균 값에 비해, 또는 대조군 조건에 비해, 농도, 수준, 기능, 활성 또는 거동을, 직접적으로 또는 간접적으로, 증가시키는 작용을 나타낸다.
본원에 사용된 "억제하다", "감소시키다", "방해하다", "저해하다" 및/또는 "줄이다" (및 유사 용어)라는 용어는, 일반적으로, 본래 값, 예측 값 또는 평균 값에 비해, 또는 대조군 조건에 비해, 농도, 수준, 기능, 활성 또는 거동을, 직접적으로 또는 간접적으로, 감소시키는 작용을 나타낸다.
본원에 사용된 "대조군"은 참조 표준을 나타낸다. 일부 실시형태에 따르면, 대조군은 건강한 환자에서 얻은 음성 대조군 샘플이다. 다른 실시형태에서, 대조군은 질환 또는 장애, 감염 또는 암으로 진단받은 환자에서 얻은 양성 대조군 샘플이다. 또 다른 실시형태에서, 대조군은 과거 대조군 또는 표준 참조 값 또는 값의 범위이다(예컨대, 이전에 시험된 대조군 샘플, 또는 기준선 또는 정상 값을 나타내는 샘플의 군). 시험 샘플과 대조군의 차이는 증가하거나 반대로 감소할 수 있다. 차이는 정성적 차이 또는 정량적 차이, 예를 들어 통계적으로 유의한 차이일 수 있다. 일부 예에 따르면, 차이는, 대조군과 비교하여, 적어도 약 5%, 예컨대 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 적어도 약 300%, 적어도 약 350%, 적어도 약 400%, 적어도 약 500% 또는 500% 초과의 증가 또는 감소이다.
본원에 사용된 "포함하는" 또는 "포함하다"라는 용어는, 방법 또는 조성물에 필수적이지만, 필수적인지 여부에 관계없이 명시되지 않은 요소를 포함할 수도 있는, 조성물, 방법, 및 이의 각 구성요소(들)에 관하여 사용된다.
본원에 사용된 "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 용어는, 소정의 실시형태에 필요한 요소를 나타낸다. 상기 용어는, 해당 실시형태의 기본적인 및 신규한 또는 기능적 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다. "포함하는"이라는 용어의 사용은 제한이 아닌 포함을 나타낸다.
"~로 이루어진"이라는 용어는, 실시형태의 설명에 언급되지 않은 임의의 요소를 배제하는, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 이의 각 구성요소를 나타낸다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 표현은, 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 및/또는 본 개시내용 등을 읽을 때 당업자에게 명백해질 수 있는 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다. 유사하게, "또는"이라는 단어는, 문맥에서 달리 명백하게 지시되지 않는 한, "및"을 포함한다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재되어 있다. "e.g."라는 약어는, 라틴어 예를 들어(exempli gratia)에서 유도된 것이며, 이는 본원에서 비제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, "e.g."라는 약어는, "예를 들어"라는 용어와 동의어이다.
실시예 이외에 또는 달리 지시된 경우에, 본원에 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 표현하는 모든 수치는, 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 변형되는 것으로 이해해야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 때 "약"은, 평균 ±1%일 수 있다. 본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 상세하게 설명되지만, 본 개시내용의 범위가 이에 제한되어서는 안 된다.
본원에 개시된 본 개시내용의 대안적인 요소 또는 실시형태의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로, 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 확인되는 다른 요소와 임의의 조합으로 참조되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나, 그룹에서 결실될 수 있다. 임의의 이러한 포함 또는 결실이 발생하는 경우, 본 명세서는 본원에 변형된 그룹을 포함하는 것으로 간주되어 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹에 대한 서면 기재를 충족시킨다.
다른 용어는 본 개시내용의 다양한 양태의 설명 내에서 본원에 정의된 바와 같다.
본 개시내용의 실시형태의 설명은 개시된 정확한 형태로 본 개시내용을 제한하거나, 총망라하려는 것으로서 의도되지 않는다. 본 개시내용의 특정 실시형태 및 이에 대한 예는 예시의 목적으로 본원에 기재되어 있으며, 당업자가 이해하는 바와 같이 본 개시내용의 범위 내에서 다양한 등가의 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 소정의 순서로 제시되어 있지만, 대안적인 실시형태는 상이한 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 기능들이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시내용의 교시는 적절하게 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 실시형태는 조합되어 추가 실시형태를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 양태는, 필요한 경우, 본 개시내용의 추가의 실시형태를 제공하기 위해 상기 참고문헌 및 적용의 조성물, 기능 및 개념을 이용하도록 변형될 수 있다. 나아가, 생물학적 기능 동등성을 고려할 때, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않는 한 단백질 구조에 약간의 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 및 다른 변경은 상세한 설명을 고려하여 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
전술한 실시형태 중 임의의 것의 특정 요소는 조합되거나, 다른 실시형태의 요소로 치환될 수 있다. 나아가, 본 개시내용의 특정 실시형태와 관련된 이점이 이러한 실시형태의 맥락에서 기재되어 있지만, 다른 실시형태 또한 이러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 실시형태가 본 개시내용의 범위 내에 속하기 위해 반드시 이러한 이점을 나타낼 필요가 있는 것은 아니다.
본원에 기재된 기술은 하기 예에 의해 추가로 예시되며, 이러한 예는 어떠한 방식으로든 추가적인 제한으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시내용이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
II. ceDNA 벡터로부터 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현
본원에 기재된 기술은 일반적으로 하나 이상의 비바이러스성 DNA 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터로부터의 세포 내 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현 및/또는 생산에 관한 것이다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원의 "ceDNA 벡터 전반"이라는 제목의 섹션에 기재되어 있다. 특히, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 대칭 또는 비대칭인) ITR 쌍과, ITR 쌍 사이에, 프로모터 또는 조절 서열에 작동적으로 연결된 본원에 기재된 바와 같은 항체 중쇄(HC) 및/또는 항체 경쇄(LC), 또는 이의 일부를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 전형적인 AAV 벡터, 및 심지어 렌티바이러스 벡터에 비해 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 뚜렷한 이점은, 목적하는 HC 또는 LC, 또는 HC와 LC 둘 모두를 인코딩하는 핵산 서열에 크기 제한이 없다는 점이다. HC와 LC가 동일한 ceDNA 또는 상이한 ceDNA로부터 발현될 수 있다는 점이 본 개시내용의 특징이다.
당업자가 이해하는 바와 같이, 본원에 기재된 ceDNA 벡터 기술은 임의의 복잡성 수준에 맞게 조정될 수 있거나, 항체의 상이한 구성요소(예를 들어, HC, LC, 링커)의 발현이 독립적인 방식으로 제어될 수 있는 모듈 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설계된 ceDNA 벡터 기술은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC와 LC 둘 모두, 또는 이의 부분을 발현시키기 위해 단일 ceDNA 벡터를 사용하거나, 각각의 벡터가 HC 또는 LC, 또는 이의 부분, 또는 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 프로모터에 의해 제어되는 또 다른 구성요소를 발현하는 다수의 ceDNA 벡터를 사용할 수 있는 것으로 고려된다. 하기 실시형태는 본원에서 구체적으로 고려되며, 목적하는 바대로 당업자에 의해 조정될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 단일 ceDNA 벡터는 단일 프로모터의 제어 하에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 발현시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 단일 ceDNA 벡터는 단일 프로모터의 제어 하에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 발현시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 단일 ceDNA 벡터는 선택적으로 각각의 구성요소의 적절한 발현을 보장하기 위해 IRES 서열(들)을 사용하여, 단일 프로모터(예를 들어, 강력한 프로모터)의 제어 하에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC와 HC를 모두 발현시키는 데 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 적어도 2개의 삽입물을 포함하는 단일 ceDNA 벡터(예를 들어, HC 또는 LC를 발현시킴)가 또한 본원에서 고려되며, 여기서 각각의 삽입물의 발현은 이의 고유한 프로모터의 제어 하에 있다. 프로모터는 동일한 프로모터의 다수의 카피, 다수의 상이한 프로모터 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
하기에 보다 상세하게 기재되는 바와 같이, 항체의 구성요소(예를 들어, HC 또는 LC)를 상이한 발현 수준으로 발현시켜, 이에 따라 발현되는 개별 구성요소의 화학량론을 제어하는 방식으로 세포에서 효율적인 조합을 보장하는 것이 종종 바람직하다는 것이 본 개시내용의 발견이다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 ceDNA 벡터를 제공한다. 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 표적(즉, 항원)은, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 진균 및 기생충 감염원을 포함하는 다양한 병원체에서 선택될 수 있다. 적합한 표적은 암 또는 암 관련 항원 등을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 표적은 류마티스 관절염(RA) 또는 다발성 경화증(MS)과 같은 자가면역 병태를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편은 이의 표적 항원에 특이적으로 결합한다.
본원에 사용된 "특이적으로 결합한다"는, 항체 또는 항원 결합 단편이, 샘플 내 임의의 다른 분자 또는 구성요소와 유의하게 회합하거나 결합하지 않으면서, 105 M-1(이러한 해리 반응에 대한 회합 속도[Kon] 대 해리 속도[Koff]의 비와 동일함) 이상의 친화도 또는 Ka(즉, 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(단위 1/M))로 항원에 회합 또는 결합하는 것을 나타낸다. 대안적으로, 친화도는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)(단위 M)(예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M)로 정의될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, "특이적으로 결합한다"라는 용어는, 항원 결합 단백질(예를 들어, mAb)의 Kd로 표시되는 항원에 대한 결합 친화도가, 예를 들어 25℃ 또는 37℃에서 실시간 무표지 생체층 간섭계 검정, 예를 들어 Octet® HTX 바이오센서, 또는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 BIACORE™, 또는 용액 친화도 ELISA로 측정 시, 적어도 약 10-8 M임을 나타낸다.
항체는 "고친화도" 항체 또는 "저친화도" 항체로 분류될 수 있다. "고친화도" 항체는 Ka가 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1 또는 적어도 1013 M-1인 항체를 나타낸다. "저친화도" 항체는 Ka가 최대 107 M-1, 최대 106 M-1, 최대 105 M-1인 항체를 나타낸다. 대안적으로, 친화도는, 예를 들어 25℃ 또는 37℃에서 실시간 무표지 생체층 간섭계 검정, 예를 들어 Octet® HTX 바이오센서, 또는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 BIACORE™, 또는 용액 친화도 ELISA로 측정 시, 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)(단위 M)(예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M)로 정의될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 개시내용의 항체는 병원체에 의한 감염을 중화시킬 수 있다. 본원에 사용된 "중화 항체"는, 숙주에서 감염을 개시하고/하거나 지속시키기 위해 병원체의 능력을 중화시킬 수 있는, 즉, 방지하거나, 저해하거나, 감소시키거나, 지연시키거나 또는 방해할 수 있는 항체이다. "중화 항체", "중화시키는 항체" 또는 "중화시키는 항체들"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본원에 개시된 실시형태 중 임의의 것에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 감염의 시험관내 모델 및/또는 감염의 생체내 동물 모델 및/또는 인간에서 감염을 예방 및/또는 중화시킬 수 있다.
전형적인 AAV 벡터, 및 심지어 렌티바이러스 벡터에 비해 ceDNA 벡터의 뚜렷한 이점은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열에 대한 크기 제한이 없다는 점이다. 또한, 필요한 화학량론에 따라, HC와 LC(또는 HCVR 또는 LCVR)의 몰비를 변화시킬 수 있으며, 최적의 발현을 위해 동일하거나 상이한 프로모터를 사용할 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 목적하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 제1 ceDNA 벡터 내 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 인코딩하는 핵산 서열과, 제2 ceDNA 벡터 내 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, LC를 인코딩하는 핵산 서열은 제1 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시형태에 따르면, HC를 인코딩하는 핵산 서열은 제2 프로모터의 제어 하에 있다. 일부 실시형태에 따르면, 제1 프로모터와 제2 프로모터는 동일하다. 일부 실시형태에 따르면, 제1 프로모터와 제2 프로모터는 상이하다.
일부 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 ceDNA 벡터와 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 ceDNA 벡터는, 1:10 내지 1:10의 (HC:LC) 몰비로 혼합되고 공동 제형화된다. 일부 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 ceDNA 벡터와 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 ceDNA 벡터는, 3:1 내지 1:1의 (HC:LC) 몰비로 혼합되고 공동 제형화된다. 일부 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 ceDNA 벡터와 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 ceDNA 벡터는, 3:1의 (HC:LC) 몰비로 혼합되고 공동 제형화된다. 일부 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 ceDNA 벡터와 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 ceDNA 벡터는, 2:1의 (HC:LC) 몰비로 혼합되고 공동 제형화된다. 일부 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 ceDNA 벡터와 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 ceDNA 벡터는, 1.5:1의 (HC:LC) 몰비로 혼합되고 공동 제형화된다. 일부 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 ceDNA 벡터와 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 ceDNA 벡터는, 3:1 내지 2:1의 (HC:LC) 몰비로 혼합되고 공동 제형화된다. 일부 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 ceDNA 벡터와 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 ceDNA 벡터는, 1:10, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:5 또는 1:10 에서 선택되는 (HC:LC) 몰비로 혼합되고 공동 제형화된다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 인코딩하는 핵산 서열과 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 인코딩하는 핵산 서열은 제1 오픈리딩프레임(ORF)을 포함하고, 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 인코딩하는 핵산 서열은 제2 ORF를 포함하며, 여기서 제1 ORF와 제2 ORF는 이시스트론성(bicistronic) 프로모터의 제어 하에 있다.
예를 들어 본원에 개시된 항체(예를 들어, HC, LC, HV, LV)의 알려지고/알려지거나 공개적으로 이용 가능한 단백질 서열을 취하고, 이러한 단백질을 인코딩하기 위해 cDNA 서열을 역으로 조작하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 따라서, cDNA는 의도된 숙주세포와 일치하도록 코돈 최적화되고 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터에 삽입될 수 있다.
III. 항체 및 이의 항원 결합 단편의 생산에 사용되는 ceDNA 벡터 전반
본 개시내용의 실시형태는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 발현시킬 수 있는 폐쇄형 선형 이중체화(ceDNA) 벡터를 포함하는 방법 및 조성물을 기반으로 한다. 본원에 기재된 바와 같이, 본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 표적(즉, 항원)은, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 진균 및 기생충 감염원을 포함하는 다양한 병원체에서 선택될 수 있다. 적합한 표적은 암 또는 암 관련 항원 등을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 표적은 류마티스 관절염(RA) 또는 다발성 경화증(MS)과 같은 자가면역 병태를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 전이유전자는 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 HC와 LC를 인코딩하는 핵산 서열이다. 일부 실시형태에 따르면, 전이유전자는 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 HC를 인코딩하는 핵산 서열이다. 일부 실시형태에 따르면, 전이유전자는 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 LC를 인코딩하는 핵산 서열이다. ceDNA 벡터는 바람직하게는 이중체이며, 예를 들어 발현 카세트와 같은 분자의 적어도 일부에 걸쳐 자가 상보적이다(예를 들어, ceDNA는 이중가닥 원형 분자가 아님). ceDNA 벡터는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖기 때문에, 예를 들어 37℃에서 1시간 초과 동안 엑소뉴클레아제 소화(예를 들어, 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 III)에 대한 내성이 있다.
일반적으로, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함한다. ITR 서열은, (i) 적어도 하나의 WT ITR과 적어도 하나의 변형된 AAV 역말단반복서열(mod-ITR)(예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (ii) 2개의 변형된 ITR(여기서 mod-ITR 쌍은 서로에 대해 상이한 3차원 공간 구성을 가짐)(예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (iii) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍(여기서 각각의 WT-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐); 또는 (iv) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍(여기서 각각의 mod-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐) 중 임의의 것에서 선택된다.
비제한적으로, 리포좀 나노입자 전달 시스템과 같은 전달 시스템을 추가로 포함할 수 있는, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 생산을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 방법 및 조성물이 본원에 포함된다. 사용을 위해 포함되는 비제한적인 예시적인 리포좀 나노입자 시스템이 본원에 개시되어 있다. 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 ceDNA와 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다. 예를 들어, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/050042(이는 본원에 참조로 인용됨)에 기재된 바와 같은 방법으로 수득된 ceDNA 벡터로 제조되고 로딩되는 지질 나노입자 제형.
본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드 내 제한적인 공간에 의해 부과되는 패키징 제약이 없다. ceDNA 벡터는, 캡슐화된 AAV 게놈과 대조적으로, 원핵생물에서 생산된 플라스미드 DNA 벡터에 대한 실행 가능한 진핵생물에서 생산된 대안을 나타낸다. 이는, 제어 요소, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 대형 전이유전자, 다중 전이유전자 등의 삽입을 허용한다.
도 1a 내지 도 1e는, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 비제한적이며 예시적인 ceDNA 벡터, 또는 ceDNA 플라스미드의 상응하는 서열의 개략도를 보여준다. 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 캡시드를 함유하지 않으며, 제1 ITR, 전이유전자를 포함하는 발현 카세트 및 제2 ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 플라스미드에서 수득될 수 있다. 발현 카세트는 전이유전자의 발현을 가능하게 하고/하거나 제어하는 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 여기서 발현 카세트는 인핸서/프로모터, ORF 리포터(전이유전자), 전사 후 조절 요소(예를 들어, WPRE), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호(예를 들어, BGH polyA) 중 하나 이상을 이러한 순서로 포함할 수 있다.
발현 카세트는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및/또는 2A 요소를 포함할 수 있다. 시스-조절 요소에는, 비제한적으로, 프로모터, 리보스위치, 절연인자, mir-조절 요소, 전사 후 조절 요소, 조직 및 세포 유형 특이적 프로모터, 및 인핸서가 포함된다. 일부 실시형태에 따르면, ITR은 전이유전자에 대한 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 조절하기 위한 추가의 구성요소, 예를 들어 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 제어하고 조절하기 위한 조절 스위치를 포함하며, 목적하는 경우, ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 제어된 세포 사멸을 가능하게 하는 사멸 스위치인 조절 스위치를 포함할 수 있다.
발현 카세트는 4000개 초과의 뉴클레오타이드, 5000개 뉴클레오타이드, 10,000개 뉴클레오타이드 또는 20,000개 뉴클레오타이드, 또는 30,000 뉴클레오타이드, 또는 40,000개 뉴클레오타이드 또는 50,000개 뉴클레오타이드, 또는 약 4000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드, 또는 10,000개 내지 50,000개 뉴클레오타이드 사이의 임의의 범위, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 50,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 75,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 발현 카세트는 길이가 1000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 5,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 캡시드화된 AAV 벡터의 크기 제한이 없기 때문에, 대형 발현 카세트를 전달하여 효율적인 전이유전자 발현을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터에는 원핵생물 특이적 메틸화가 없다.
본원에 기재된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 발현 작제물인 발현 카세트에 제공된 서열은 표적 숙주세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본원에 사용된 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"라는 용어는, 관심 척추동물, 예를 들어 마우스 또는 인간의 세포에서 발현 증강을 위해 핵산 서열을 변경하는 과정으로서, 천연 서열(예를 들어, 원핵생물 서열) 중 적어도 하나, 하나 초과 또는 유의한 수의 코돈을, 해당 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하는 과정을 나타낸다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 전형적으로, 코돈 최적화는 원래 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은, 예를 들어 Aptagen의 GENE FORGE® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼(Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171), 또는 또 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 핵산은 인간 발현을 위해 최적화된다.
본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 의해 발현된 전이유전자는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 인코딩한다. 플라스미드 기반 발현 벡터와 상이한 ceDNA 벡터의 다수의 구조적 특징이 있다. ceDNA 벡터는 다음 특징 중 하나 이상을 보유할 수 있다: 본래(즉, 삽입되지 않은) 박테리아 DNA의 결여; 원핵생물 복제 기점의 결여; 자가 함유, 즉, 이들은 Rep 결합 부위와 말단 분해 부위(RBS 및 TRS)를 포함하는 2개의 ITR 이외의 임의의 서열, 및 ITR 사이의 외인성 서열을 필요로 하지 않음; 헤어핀을 형성하는 ITR 서열의 존재; 및 박테리아 유형 DNA 메틸화 또는 실제로 포유류 숙주에 의해 비정상적인 것으로 간주되는 임의의 다른 메틸화의 부재. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 임의의 원핵생물 DNA를 함유하지 않는 것이 바람직하지만, 일부 원핵생물 DNA가, 비제한적인 예로서, 프로모터 또는 인핸서 영역에 외인성 서열로서 삽입될 수 있다고 고려된다. ceDNA 벡터를 플라스미드 발현 벡터와 구별하는 또 다른 중요한 특징은, ceDNA 벡터는 폐쇄형 말단을 갖는 단일가닥 선형 DNA이지만, 플라스미드는 항상 이중가닥 DNA라는 점이다.
본원에 제공된 방법에 의해 생산된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 바람직하게는 제한 효소 소화 검정으로 측정 시, 비연속 구조라기보다는 선형 및 연속 구조이다(도 4d). 선형 및 연속 구조는 세포 엔도뉴클레아제에 의한 공격으로부터 보다 안정적일 뿐 아니라, 재조합되어 돌연변이를 유발할 가능성이 적은 것으로 여겨진다. 따라서, 선형 및 연속 구조의 ceDNA 벡터가 바람직한 실시형태이다. 연속, 선형, 단일가닥 분자내 이중체 ceDNA 벡터는, AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열 없이, 공유결합으로 결합된 말단을 가질 수 있다. 이러한 ceDNA 벡터는 박테리아 기원의 원형 이중체 핵산 분자인 플라스미드(본원에 기재된 ceDNA 플라스미드 포함)와 구조적으로 구별된다. 플라스미드의 상보적 가닥은 변성 후 분리되어 2개의 핵산 분자를 생성할 수 있지만, 대조적으로, 상보적 가닥을 갖는 ceDNA 벡터는, 단일 DNA 분자이기 때문에, 변성되더라도 단일 분자로 남게 된다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는, 플라스미드와 달리, 원핵생물 유형의 DNA 염기 메틸화 없이 생산될 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터와 ceDNA-플라스미드는 구조(특히, 선형 대 원형)의 측면에서, 또한 이러한 상이한 목적물을 생산하고 정제하는 데 사용되는 방법(하기 참조)의 측면에서, 또한 ceDNA 플라스미드의 경우 원핵생물 유형이고 ceDNA 벡터의 경우 진핵생물 유형인 이의 DNA 메틸화의 측면에서 모두 상이하다.
플라스미드 기반 발현 벡터에 비해 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 사용하는 데에는 몇 가지 이점이 존재하며, 이러한 이점에는, 비제한적으로, 하기가 포함된다: 1) 플라스미드는 박테리아 DNA 서열을 함유하고 원핵생물 특이적 메틸화, 예를 들어 6-메틸 아데노신 및 5-메틸 시토신 메틸화에 적용되지만, 캡시드 미함유 AAV 벡터 서열은 진핵생물 기원으로 원핵생물 특이적 메틸화를 거치지 않으며; 그 결과, 캡시드 미함유 AAV 벡터는 플라스미드에 비해 염증 및 면역반응을 유도할 가능성이 적음; 2) 플라스미드는 생산 과정 동안 내성 유전자의 존재를 필요로 하지만, ceDNA 벡터는 그렇지 않음; 3) 원형 플라스미드는 세포에의 도입 시 핵으로 전달되지 않고 세포 뉴클레아제에 의한 분해를 우회하기 위해서는 과부하가 필요하지만, ceDNA 벡터는 뉴클레아제에 대한 내성을 부여하는 바이러스성 시스-요소, 즉, ITR을 함유하고, 핵을 표적으로 하여 이에 전달되도록 설계될 수 있음. ITR 기능에 없어서는 안 될 최소 정의 요소를, Rep 결합 부위(RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호__))와 말단 분해 부위(TRS; AAV2의 경우 5'-AGTTGG-3'), 그리고 헤어핀 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열; 및 4) ceDNA 벡터가 T세포 매개 면역반응을 유발하는 톨유사(Toll-like) 수용체 패밀리의 멤버와 결합하는 것으로 보고된 원핵생물 유래 플라스미드에서 종종 발견되는 CpG 디뉴클레오타이드의 과대표현(over-representation)을 갖지 않는 것이라고 가정하였다. 대조적으로, 본원에 개시된 캡시드 미함유 AAV 벡터를 이용한 형질도입은, 다양한 전달 시약을 사용하여 통상적인 AAV 비리온으로 형질도입하기 곤란한 세포 및 조직 유형을 효율적으로 표적화할 수 있다.
A. 역말단반복서열(ITR)
본원에 개시된 바와 같이, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 2개의 역말단반복서열(ITR) 사이에 배치된 전이유전자 또는 핵산 서열을 함유하며, 여기서 ITR 서열은 비대칭인 ITR 쌍, 또는 대칭 또는 실질적으로 대칭인 ITR 쌍(이러한 용어는 본원에 정의된 바와 같음)일 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는, (i) 적어도 하나의 WT ITR과 적어도 하나의 변형된 AAV 역말단반복서열(mod-ITR)(예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (ii) 2개의 변형된 ITR(여기서 mod-ITR 쌍은 서로에 대해 상이한 3차원 공간 구성을 가짐)(예를 들어, 비대칭인 변형된 ITR); (iii) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 WT-WT ITR 쌍(여기서 각각의 WT-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐); 또는 (iv) 대칭 또는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍(여기서 각각의 mod-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 가짐) 중 임의의 것에서 선택되는 ITR 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 본 개시내용의 방법은, 비제한적으로, 리포좀 나노입자 전달 시스템과 같은 전달 시스템을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, ITR 서열은 척추동물을 감염시키는 파르보바이러스아과와 곤충을 감염시키는 덴소바이러스아과의 2개의 아과를 포함하는 파르보바이러스과의 바이러스에서 유래할 수 있다. 파르보바이러스아과(파르보바이러스로 지칭됨)에는, 대부분의 조건 하에서, 생산적인 감염을 위해 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로의 동시감염을 필요로 하는 구성원인 데펜도바이러스속이 포함된다. 데펜도바이러스속에는, 통상적으로 인간(예를 들어, 혈청형 2, 3A, 3B, 5 및 6) 또는 영장류(예를 들어, 혈청형 1 및 4)를 감염시키는 아데노연관바이러스(AAV), 및 다른 온혈동물을 감염시키는 관련 바이러스(예를 들어, 소, 개, 말 및 양 아데노연관바이러스)가 포함된다. 파르보바이러스 및 파르보바이러스과의 다른 구성원은 일반적으로 문헌[Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication", Chapter 69 in FIELDS VIROLOGY (3d Ed. 1996)]에 기재되어 있다.
본원의 명세서 및 실시예에 예시된 ITR이 AAV2 WT-ITR이지만, 당업자는 상기 언급된 바와 같이 임의의 알려진 파르보바이러스, 예를 들어 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈; 예를 들어 NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261)와 같은 데펜도바이러스 유래의 ITR, 키메라 ITR, 또는 임의의 합성 AAV 유래의 ITR을 사용할 수 있다는 것을 알고 있다. 일부 실시형태에 따르면, AAV는 온혈동물, 예를 들어 조류(AAAV), 소(BAAV), 개, 말 및 양 아데노연관바이러스를 감염시킬 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ITR은 B19 파르보바이러스(GenBank 수탁번호: NC 000883), 마우스 유래 미세생쥐바이러스(MVM: Minute Virus from Mouse)(GenBank 수탁번호 NC 001510); 거위 파르보바이러스(GenBank 수탁번호: NC 001701); 뱀 파르보바이러스 1(GenBank 수탁번호 NC 006148)에서 유래한 것이다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 논의된 바와 같이, 5' WT-ITR은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 3' WT-ITR은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있다.
당업자는, ITR 서열이 전형적으로 T-형 또는 Y-형 헤어핀 구조(예를 들어, 도 2a 및 도 3a 참조)인 이중가닥 홀리데이(Holliday) 접합의 공통 구조를 갖고, 여기서 각각의 WT-ITR은 보다 큰 회문구조 아암(A-A')에 포매된 2개의 회문구조 아암 또는 루프(B-B' 및 C-C'), 및 단일가닥 D 서열로 형성된다(여기서, 이러한 회문구조 서열의 순서는 ITR의 플립 또는 플랍 배향을 정의함)는 것을 알고 있다. 예를 들어, 상이한 AAV 혈청형(AAV1 내지 AAV6) 유래의 ITR의 구조 분석 및 서열 비교는 문헌[Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439]; 문헌[Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379]; 문헌[Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14]에 기재된 것을 참조한다. 당업자는, 본원에 제공된 예시적인 AAV2 ITR 서열에 기반하여 ceDNA 벡터 또는 ceDNA-플라스미드에 사용되는 임의의 AAV 혈청형 유래의 WT-ITR 서열을 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들어, 다른 혈청형 유래의 좌측 ITR에 대한 AAV2의 좌측 ITR의 동일성%: AAV-1(84%), AAV-3(86%), AAV-4(79%), AAV-5(58%), AAV-6(좌측 ITR)(100%) 및 AAV-6(우측 ITR)(82%)을 보여주는, 문헌[Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439]에 기재된 상이한 AAV 혈청형(AAV1 내지 AAV6, 및 조류 AAV(AAAV) 및 소 AAV(BAAV)) 유래 ITR의 서열 비교를 참조한다.
(i) 대칭인 ITR 쌍
일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하고, 여기서 제1 ITR(5' ITR)과 제2 ITR(3' ITR)은 서로에 대해 대칭이거나 실질적으로 대칭이며, 즉, ceDNA 벡터는, 이의 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이거나, 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖도록, 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 ITR 서열을 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 대칭인 ITR 쌍 또는 실질적으로 대칭인 ITR 쌍은, 야생형 ITR이 아닌 변형된 ITR(예를 들어, mod-ITR)일 수 있다. mod-ITR 쌍은 야생형 ITR로부터 하나 이상의 변형을 갖고, 서로 역 보체(역상)인 동일한 서열을 가질 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 변형된 ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 갖지만, 상응하거나 동일한 대칭인 3차원 형상을 가질 수 있다.
(a) 야생형 ITR
일부 실시형태에 따르면, 대칭인 ITR 또는 실질적으로 대칭인 ITR은 본원에 기재된 바와 같은 야생형(WT-ITR)이다. 즉, 2개의 ITR은 야생형 서열을 갖지만, 반드시 동일한 AAV 혈청형의 WT-ITR일 필요는 없다. 즉, 일부 실시형태에 따르면, 하나의 WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나는 WT-ITR은 상이한 AAV 혈청형에서 유래할 수 있다. 이러한 실시형태에서, WT-ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 이들은 대칭인 3차원 공간 구성을 여전히 유지하면서, 하나 이상의 보존적 뉴클레오타이드 변형을 가질 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 바와 같이, ceDNA 벡터는 서로 역 보체(역상)이거나, 또는 대안적으로, 서로 실질적으로 대칭인, 즉, WT-ITR 쌍이 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는, 2개의 플랭킹 야생형 역말단반복서열(WT-ITR) 사이에 배치된 전이유전자 또는 핵산 서열을 함유한다. 일부 실시형태에 따르면, 야생형 ITR 서열(예를 들어, AAV WT-ITR)은 기능성 Rep 결합 부위(RBS; 예를 들어 AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', 서열번호 __)와 기능성 말단 분해 부위(TRS; 예를 들어 5'-AGTT-3')를 포함한다.
하나의 양태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 2개의 WT 역말단반복서열(WT-ITR)(예를 들어, AAV WT-ITR) 사이에 작동적으로 배치된 핵산을 인코딩하는 벡터 폴리뉴클레오타이드에서 수득될 수 있다. 즉, 2개의 ITR은 야생형 서열을 갖지만, 반드시 동일한 AAV 혈청형의 WT-ITR일 필요는 없다. 즉, 일부 실시형태에 따르면, 하나의 WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나는 WT-ITR은 상이한 AAV 혈청형에서 유래할 수 있다. 이러한 실시형태에서, WT-ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 이들은 대칭인 3차원 공간 구성을 여전히 유지하면서, 하나 이상의 보존적 뉴클레오타이드 변형을 가질 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 5' WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래한 것이고, 3' WT-ITR은 동일하거나 상이한 AAV 혈청형에서 유래한 것이다. 일부 실시형태에 따르면, 5' WT-ITR과 3' WT-ITR은 서로 거울상이며, 즉, 이들은 대칭이다. 일부 실시형태에 따르면, 5' WT-ITR과 3' WT-ITR은 동일한 AAV 혈청형에서 유래한 것이다.
WT ITR은 널리 알려져 있다. 일부 실시형태에 따르면, 2개의 ITR은 동일한 AAV2 혈청형에서 유래한 것이다. 특정 실시형태에서, 다른 혈청형에서 유래한 WT를 사용할 수 있다. 다수의 상동인 혈청형, 예를 들어 AAV2, AAV4, AAV6, AAV8이 존재한다. 일부 실시형태에 따르면, 거의 상동인 ITR(예를 들어, 유사한 루프 구조를 갖는 ITR)이 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 보다 다양한 AAV WT ITR, 예를 들어 AAV2와 AAV5가 사용될 수 있으며, 또 다른 실시형태에서는, 실질적으로 WT인, 즉, WT의 기본 루프 구조를 갖지만, 특성을 변경시키거나 이에 영향을 미치지 않는 일부 보존적 뉴클레오타이드 변경을 갖는 ITR이 사용될 수도 있다. 동일한 바이러스 혈청형 유래의 WT-ITR이 사용되는 경우, 하나 이상의 조절 서열이 추가로 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조절 서열은 ceDNA의 활성, 예를 들어 인코딩된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 조절할 수 있는 조절 스위치이다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 기술의 하나의 양태는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 관한 것으로, 여기서 ceDNA 벡터는, 예를 들어 2개의 야생형 역말단반복서열(WT-ITR) 사이에 작동 가능하게 배치된 HC 및/또는 LC을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하고, 여기서 WT-ITR은 동일한 혈청형, 상이한 혈청형에서 유래하거나, 또는 서로에 대해 실질적으로 대칭일 수 있다(즉, 기하학적 공간에서의 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖거나, 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가짐). 일부 실시형태에 따르면, 대칭인 WT-ITR은 기능성 말단 분해 부위와 Rep 결합 부위를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 핵산 서열은 전이유전자를 인코딩하고, 여기서 벡터는 바이러스 캡시드 내에 존재하지 않는다.
일부 실시형태에 따르면, WT-ITR은 동일하지만, 서로 역 보체이다. 예를 들어, 5' ITR에서 서열 AACG은 상응하는 부위의 3' ITR에서 CGTT(즉, 역 보체)일 수 있다. 일부 예에서, 5' WT-ITR 센스 가닥은 ATCGATCG의 서열을 포함하고, 상응하는 3' WT-ITR 센스 가닥은 CGATCGAT(즉, ATCGATCG의 역 보체)의 서열을 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, WT-ITR ceDNA는 말단 분해 부위와 복제 단백질 결합 부위(RPS)(때때로 복제성 단백질 결합 부위로 지칭됨), 예를 들어 Rep 결합 부위를 추가로 포함한다.
WT-ITR을 포함하는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용되는 예시적인 WT-ITR 서열은 본원의 표 2에 제시되어 있으며, 이는 WT-ITR의 쌍(5' WT-ITR과 3' WT-ITR)으로 나타나 있다.
예시적인 예로서, 본 개시내용은 조절 스위치의 존재 또는 부재 하에 전이유전자(예를 들어, 핵산 서열)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터로서, 캡시드 단백질이 없으며, (a) WT-ITR을 인코딩하는 ceDNA-플라스미드로부터 생산되고(예를 들어, 도 1f 및 도 1g 참조)(여기서 각각의 WT-ITR은 이의 헤어핀 2차 구성에서 동일한 수의 분자내 이중체화된 염기쌍을 가짐)(바람직하게는 이의 참조 서열과 비교하여 이러한 구성에서 임의의 AAA 또는 TTT 말단 루프의 결실을 배제함), (b) 실시예 1의 미변성 겔 및 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동에 의해 ceDNA를 식별하는 검정을 사용한 경우 ceDNA로서 식별되는 ceDNA 벡터를 제공한다.
일부 실시형태에 따르면, 플랭킹 WT-ITR은 서로 실질적으로 대칭이다. 이러한 실시형태에서, 5' WT-ITR은 AAV의 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 3' WT-ITR은 AAV의 상이한 혈청형에서 유래할 수 있기 때문에, WT-ITR은 동일한 역 보체가 아니다. 예를 들어, 5' WT-ITR은 AAV2에서 유래할 수 있고, 3' WT-ITR은 상이한 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12)에서 유래할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, WT-ITR은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 뱀 파르보바이러스(예를 들어, 공비단뱀 파르보바이러스), 소 파르보바이러스, 염소 파르보바이러스, 조류 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 말 파르보바이러스, 새우 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스 또는 곤충 AAV 중 임의의 것에서 선택되는 2개의 상이한 파르보바이러스에서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, WT ITR의 이러한 조합은 AAV2와 AAV6에서 유래한 WT-ITR의 조합이다. 일부 실시형태에 따르면, 실질적으로 대칭인 WT-ITR은, 하나가 다른 하나의 ITR에 대해 역상인 경우, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96%...97%... 98%... 99%....99.5%(및 이러한 동일성% 사이의 모든 지점 포함) 동일하며, 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 일부 실시형태에 따르면, WT-ITR 쌍은 대칭인 3차원 공간 구성, 예를 들어 A, C-C', B-B' 및 D 아암의 동일한 3D 구성을 갖기 때문에 실질적으로 대칭이다. 일부 실시형태에 따르면, 실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍은 다른 하나에 대해 역상이며, 서로 적어도 95% 동일, 적어도 96%...97%... 98%... 99%....99.5% 동일(이러한 동일성% 사이의 모든 지점 포함)하고, 하나의 WT-ITR은 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 60)의 Rep 결합 부위(RBS)와 말단 분해 부위(trs)를 보유한다. 일부 실시형태에 따르면, 실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍은 서로 역상이며, 서로 적어도 95% 동일, 적어도 96%...97%... 98%... 99%....99.5% 동일(이러한 동일성% 사이의 모든 지점 포함)하고, 하나의 WT-ITR은 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 __)의 Rep 결합 부위(RBS)와 말단 분해 부위(trs), 및 헤어핀 2차 구조 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열을 보유한다. 상동성은 기본 설정의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool), BLASTN과 같은 당업계에 널리 알려진 표준 수단에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, ITR의 구조 요소는 ITR과 대형 Rep 단백질(예를 들어, Rep 78 또는 Rep 68)의 기능적 상호작용에 관여하는 임의의 구조 요소일 수 있다. 특정 실시형태에서, 구조 요소는 ITR과 대형 Rep 단백질의 상호작용에 대한 선택성을 제공하며, 즉, 적어도 부분적으로 어느 Rep 단백질이 ITR과 기능적으로 상호작용하는지를 결정한다. 다른 실시형태에서, 구조 요소는, Rep 단백질이 ITR에 결합될 때, 대형 Rep 단백질과 물리적으로 상호작용한다. 각각의 구조 요소는, 예를 들어 ITR의 2차 구조, ITR의 핵산 서열, 둘 이상의 요소 사이의 간격, 또는 상기 중 임의의 것의 조합일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 구조 요소는 A 및 A' 아암, B 및 B' 아암, C 및 C' 아암, D 아암, Rep 결합 부위(RBE) 및 RBE'(즉, 상보적 RBE 서열), 및 말단 분해 부위(trs)로 이루어지는 군에서 선택된다.
단지 예로서, 표 2는 WT-ITR의 예시적인 조합을 나타낸다.
표 2: 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형, 또는 상이한 파르보바이러스 유래의 WT-ITR의 예시적인 조합. 표시된 순서는 ITR 위치를 나타내지 않으며, 예를 들어 "AAV1, AAV2"는, ceDNA가 5' 위치에 WT-AAV1 ITR을 3' 위치에 WT-AAV2 ITR을 포함할 수 있거나, 그 반대로, 5' 위치에 WT-AAV2 ITR을 3' 위치WT-AAV1 ITR을 포함할 수 있음을 나타낸다. 약어: AAV 혈청형 1(AAV1), AAV 혈청형 2(AAV2), AAV 혈청형 3(AAV3), AAV 혈청형 4(AAV4), AAV 혈청형 5(AAV5), AAV 혈청형 6(AAV6), AAV 혈청형 7(AAV7), AAV 혈청형 8(AAV8), AAV 혈청형 9(AAV9), AAV 혈청형 10(AAV10), AAV 혈청형 11(AAV11) 또는 AAV 혈청형 12(AAV12); AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈(예를 들어, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), 온혈동물 유래의 ITR(조류 AAV(AAAV), 소 AAV(BAAV), 개, 말 및 양 AAV), B19 파르보바이러스 유래의 ITR(GenBank 수탁번호: NC 000883), 마우스 유래 미세생쥐바이러스(MVM)(GenBank 수탁번호: NC 001510); 거위: 거위 파르보바이러스(GenBank 수탁번호: NC 001701); 뱀: 뱀 파르보바이러스 1(GenBank 수탁번호: NC 006148).
[표 2]
Figure pct00003
Figure pct00004
단지 예로서, 표 3은 일부 상이한 AAV 혈청형 유래의 예시적인 WT-ITR의 서열을 보여준다.
[표 3]
Figure pct00005
일부 실시형태에 따르면, WT-ITR 서열의 핵산 서열은 변형될 수 있으며(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드, 또는 그 안의 임의의 범위의 뉴클레오타이드 변형), 여기서 변형은 상보적 뉴클레오타이드로, 예를 들어 C의 경우 G, 및 그 반대로, 및 A의 경우 T, 및 그 반대로의 치환이다.
본 개시내용의 특정 실시형태에서, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 서열번호 1, 2, 5 내지 14 중 임의의 것에서 선택되는 핵산 서열로 이루어진 WT-ITR을 갖지 않는다. 본 개시내용의 대안적인 실시형태에서, ceDNA 벡터가 서열번호 1, 2, 5 내지 14 중 임의의 것에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 WT-ITR을 갖는 경우, 플랭킹 ITR은 또한 WT이고, ceDNA 벡터는, 예를 들어 본원 및 국제 특허출원 PCT/US18/49996(예를 들어, PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 표 11 참조)에 개시된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치와, 서열번호 1, 2, 5 내지 14로 이루어지는 군 중 임의의 것에서 선택되는 핵산 서열을 갖는 선택된 WT-ITR을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 작동 가능한 RBE, trs 및 RBE' 부분을 보유하는 WT-ITR 구조를 포함할 수 있다. 도 2a 및 도 2b는, 예시 목적으로 야생형 ITR을 사용하여, ceDNA 벡터의 야생형 ITR 구조 부분 내에서 trs 부위의 작동을 위한 하나의 가능한 메커니즘을 보여준다. 일부 실시형태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 Rep 결합 부위(예를 들어, RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 __))와 말단 분해 부위(TRS; 예를 들어, 5'-AGTT)를 포함하는 하나 이상의 기능성 WT-ITR 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 WT-ITR은 기능성이다. 대안적인 실시형태에서, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터가 서로 실질적으로 대칭인 2개의 WT-ITR을 포함하는 경우, 적어도 하나의 WT-ITR은 기능성이고, 적어도 하나의 WT-ITR은 비기능성이다.
B. 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 ITR 쌍을 포함하는 ceDNA 벡터에 대한 변형된 ITR(mod-ITR) 전반
본원에 논의된 바와 같이, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 대칭인 ITR 쌍 또는 비대칭인 ITR 쌍을 포함할 수 있다. 두 경우 모두, ITR 중 하나 또는 둘 모두는 변형된 ITR일 수 있으며, 여기서 차이점은, 첫 번째 경우(즉, 대칭인 mod-ITR), mod-ITR은 동일한 3차원 공간 구성을 갖지만(즉, 동일한 A-A', C-C' 및 B-B' 아암 구성을 가짐), 두 번째 경우(즉, 비대칭인 mod-ITR), mod-ITR은 상이한 3차원 공간 구성을 갖는다(즉, 상이한 A-A', C-C' 및 B-B' 아암 구성을 가짐)는 점이다.
일부 실시형태에 따르면, 변형된 ITR은 야생형 ITR 서열(예를 들어, AAV ITR)과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 ITR이다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터에서 ITR 중 적어도 하나는 기능성 Rep 결합 부위(RBS; 예를 들어 AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3')와 기능성 말단 분해 부위(TRS; 예를 들어 5'-AGTT-3')를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, ITR 중 적어도 하나는 비기능성 ITR이다. 일부 실시형태에 따르면, 상이한 또는 변형된 ITR은 각각 상이한 혈청형 유래의 야생형 ITR이 아니다.
ITR의 특정 변경 및 돌연변이가 본원에 상세하게 설명되어 있지만, ITR의 맥락에서, "변경된" 또는 "돌연변이된" 또는 "변형된"은 뉴클레오타이드가 야생형, 참조 또는 본래 ITR 서열에 비해 삽입, 결실 및/또는 치환된 것을 나타낸다. 변경된 또는 돌연변이된 ITR은 조작된 ITR일 수 있다. 본원에 사용된 "조작된"은, 인간의 손에 의해 조작된 양태를 나타낸다. 예를 들어, 폴리펩타이드는, 폴리펩타이드의 적어도 하나의 양태, 예를 들어 이의 서열이, 자연에 존재하는 양태와 상이하도록 인간의 손에 의해 조작된 경우, "조작된" 것으로 간주된다.
일부 실시형태에 따르면, mod-ITR은 합성일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 합성 ITR은 하나 초과의 AAV 혈청형에서 유래한 ITR 서열을 기반으로 한다. 또 다른 실시형태에서, 합성 ITR은 AAV 기반 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 실시형태에서, 합성 ITR은 AAV 유래 서열을 갖지 않거나 일부만 갖지만, 상기 기재된 ITR 구조를 보존한다. 일부 양태에 따르면, 합성 ITR은 야생형 Rep 또는 특정 혈청형의 Rep와 우선적으로 상호작용할 수 있거나, 또는 일부 경우에 따르면, 야생형 Rep에 의해 인식되지 않고 돌연변이된 Rep에 의해서만 인식될 수 있다.
당업자는 알려진 수단을 통해 다른 혈청형에서 상응하는 서열을 결정할 수 있다. 예를 들어, A, A', B, B', C, C' 또는 D 영역에 변경이 존재하는지 여부를 결정하고, 또 다른 혈청형에서 상응하는 영역을 결정한다. 기본 설정의 BLAST®(Basic Local Alignment Search Tool) 또는 다른 상동성 정렬 프로그램을 사용하여 상응하는 서열을 결정할 수 있다. 본 개시내용은 나아가 상이한 AAV 혈청형의 조합인 mod-ITR, 즉, 하나의 mod-ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고 다른 하나의 mod-ITR은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있는 mod-ITR을 포함하는 ceDNA 벡터의 집단 및 복수의 ceDNA 벡터를 제공한다. 이론에 구애됨 없이, 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터의 하나의 ITR은 AAV2 ITR 서열에서 유래하거나 이를 기반으로 할 수 있고, 다른 하나의 ITR은 AAV 혈청형1(AAV1), AAV 혈청형 4(AAV4), AAV 혈청형 5(AAV5), AAV 혈청형 6(AAV6), AAV 혈청형 7(AAV7), AAV 혈청형 8(AAV8), AAV 혈청형 9(AAV9), AAV 혈청형 10(AAV10), AAV 혈청형 11(AAV11) 또는 AAV 혈청형 12(AAV12) 중 임의의 하나 이상의 ITR 서열에서 유래하거나 이를 기반으로 할 수 있다.
임의의 파르보바이러스 ITR이 ITR로서 또는 변형을 위한 기본 ITR로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 파르보바이러스는 데펜도바이러스이다. 더욱 바람직하게는, AAV이다. 선택된 혈청형은 혈청형의 조직 친화성을 기반으로 할 수 있다. AAV2는 폭넓은 조직 친화성을 갖고, AAV1은 뉴런 및 골격근을 우선적으로 표적화하고, AAV5는 뉴런, 망막색소 상피세포 및 광수용체를 우선적으로 표적으로 한다. AAV6은 골격근 및 폐를 우선적으로 표적으로 한다. AAV8은 간, 골격근, 심장 및 췌장 조직을 우선적으로 표적으로 한다. AAV9는 간, 골격 및 폐 조직을 우선적으로 표적으로 한다. 일부 실시형태에 따르면, 변형된 ITR은 AAV2 ITR을 기반으로 한다.
보다 구체적으로, 특정 대형 Rep 단백질과 기능적으로 상호작용하는 구조 요소의 능력은 구조 요소의 변형을 통해 변경될 수 있다. 예를 들어, 구조 요소의 핵산 서열은 ITR의 야생형 서열과 비교하여 변형될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ITR의 구조 요소(예를 들어, A 아암, A' 아암, B 아암, B' 아암, C 아암, C' 아암, D 아암, RBE, RBE' 및 trs)는 제거되어, 상이한 파르보바이러스의 야생형 구조 요소로 대체될 수 있다. 예를 들어, 대체 구조는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 뱀 파르보바이러스(예를 들어, 공비단뱀 파르보바이러스), 소 파르보바이러스, 염소 파르보바이러스, 조류 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 말 파르보바이러스, 새우 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스 또는 곤충 AAV에서 유래할 수 있다. 예를 들어, ITR은 AAV2 ITR일 수 있고, A 또는 A' 아암, 또는 RBE는 AAV5의 구조 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, ITR은 AAV5 ITR일 수 있고, C 또는 C' 아암, RBE, 및 trs는 AAV2의 구조 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, AAV ITR은 B 및 B' 아암이 AAV2 ITR B 및 B' 아암으로 대체된 AAV5 ITR일 수 있다.
단지 예로서, 표 4는 변형된 ITR 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 예시적인 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타내며, 여기서 X는 상응하는 야생형 ITR에 대한 해당 섹션에서의 적어도 하나의 핵산의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타낸다. 일부 실시형태에 따르면, C 및/또는 C' 및/또는 B 및/또는 B'의 임의의 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 예를 들어, 변형이 단일 아암 ITR(예를 들어, 단일 C-C' 아암 또는 단일 B-B' 아암), 또는 변형된 C-B' 아암 또는 C'-B 아암, 또는 적어도 하나의 절단된 아암(예를 들어, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암)을 갖는 2개의 아암 ITR 중 임의의 것을 생성하는 경우, 적어도 단일 아암, 또는 2개의 아암 ITR 중 적어도 하나의 아암(여기서 하나의 아암은 절단될 수 있음)은 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 일부 실시형태에 따르면, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암은 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 갖는다.
[표 4]
Figure pct00006
ITR의 상이한 B-B' 및 C-C' 영역 또는 아암에 대한 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 예시적인 조합(X는 뉴클레오타이드 변형, 예를 들어 해당 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 부가, 결실 또는 치환을 나타냄).
일부 실시형태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용되는 mod-ITR은 본원에 개시된 바와 같은 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 mod-ITR 쌍을 포함하며, 표 4에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A'와 C 사이, C와 C' 사이, C'와 B 사이, B와 B' 사이, 및 B'와 A 사이에서 선택되는 영역 중 임의의 하나 이상에서의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, C 또는 C' 또는 B 또는 B' 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 여전히 스템-루프의 말단 루프를 보존한다. 일부 실시형태에 따르면, C와 C' 사이 및/또는 B와 B' 사이의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 대안적인 실시형태에서, C와 C' 사이 및/또는 B와 B' 사이의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 A 뉴클레오타이드(즉, AAA)를 보유한다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 사용되는 변형된 ITR은 표 4에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A', A 및/또는 D에서 선택되는 영역 중 임의의 하나 이상에서의 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 사용되는 변형된 ITR은 표 4에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 사용되는 변형된 ITR은 표 4에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A' 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 사용되는 변형된 ITR은 표 4에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A 및/또는 A' 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 사용되는 변형된 ITR은 표 4에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 D 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 구조 요소의 뉴클레오타이드 서열을 변형시켜(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상(또는 상기 제시된 개수 내 임의의 범위)의 뉴클레오타이드를 변형시켜) 변형된 구조 요소를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ITR에 대한 특정 변형은 본원에 예시된 것(예를 들어, 서열번호 3, 4, 15 내지 47, 101 내지 116 또는 165 내지 187), 또는 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/064242의 도 7a 및 도 7b에 제시된 것(예를 들어, PCT/US2018/064242의 서열번호 97 내지 98, 101 내지 103, 105 내지 108, 111 내지 112, 117 내지 134, 545 내지 54)이다. 일부 실시형태에 따르면, ITR을 변형시킬 수 있다(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상(또는 상기 제시된 개수 내 임의의 범위)의 뉴클레오타이드를 변형시킴). 다른 실시형태에서, ITR은 서열번호 3, 4, 15 내지 47, 101 내지 116 또는 165 내지 187의 변형된 ITR 중 하나, 또는 서열번호 3, 4, 15 내지 47, 101 내지 116 또는 165 내지 187의 A-A' 아암의 RBE 함유 섹션, 및 C-C' 및 B-B' 아암, 또는 국제 특허출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 표 2 내지 표 9(즉, 서열번호 110 내지 112, 115 내지 190, 200 내지 468)에 제시된 바와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 변형된 ITR은, 예를 들어 특정 아암의 전부, 예를 들어 A-A' 아암의 전부 또는 일부, 또는 B-B' 아암의 전부 또는 일부, 또는 C-C' 아암의 전부 또는 일부의 제거 또는 결실, 또는 대안적으로, 스템(예를 들어, 단일 아암)을 캡핑하는 최종 루프가 여전히 존재하는 한, 루프의 스템을 형성하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다(예를 들어, 2018년 12월 6일자 출원된 PCT/US2018/064242의 도 7a의 ITR-21 참조). 일부 실시형태에 따르면, 변형된 ITR은 B-B' 아암으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다(예를 들어, 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/064242의 도 3b의 ITR-1 또는 도 7a의 ITR-45 참조). 일부 실시형태에 따르면, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거, 및 B-B' 아암으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 염기쌍의 제거의 임의의 조합이 고려되며, 예를 들어 C-C' 아암에서 6개의 염기쌍이 제거되고 B-B' 아암에서 2개의 염기쌍이 제거될 수 있다. 예시적인 예로서, 도 3b는, C 부분과 C' 부분 각각에서 적어도 7개의 염기쌍 결실, C 영역과 C' 영역 사이의 루프에서 뉴클레오타이드의 치환, 및 변형된 ITR이 적어도 하나의 아암(예를 들어, C-C')이 절단된 2개의 아암을 포함하도록 B 영역과 B' 영역 각각에서의 적어도 하나의 염기쌍 결실을 갖는 예시적인 변형된 ITR을 보여준다. 일부 실시형태에 따르면, 변형된 ITR은 또한 B-B' 아암이 또한 WT ITR에 비해 절단되도록 B 영역과 B' 영역 각각에서의 적어도 하나의 염기쌍 결실을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 변형된 ITR은 전장 야생형 ITR 서열에 비해 1개 내지 50개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개 또는 50개)의 뉴클레오타이드 결실을 가질 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 변형된 ITR은 전장 WT ITR 서열에 비해 1개 내지 30개의 뉴클레오타이드 결실을 가질 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 변형된 ITR은 전장 야생형 ITR 서열에 비해 2개 내지 20개의 뉴클레오타이드 결실을 갖는다.
일부 실시형태에 따르면, 변형된 ITR은, DNA 복제(예를 들어, Rep 단백질에 의한 RBE에의 결합, 또는 말단 분해 부위에서의 닉킹)를 방해하지 않도록, A 또는 A' 영역의 RBE 함유 부분에서 임의의 뉴클레오타이드 결실을 함유하지 않는다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에의 사용을 위해 포함된 변형된 ITR은 본원에 기재된 바와 같은 B, B', C, 및/또는 C' 영역에 하나 이상의 결실을 갖는다.
일부 실시형태에 따르면, 대칭인 ITR 쌍 또는 비대칭인 ITR 쌍을 포함하는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치와, 서열번호 3, 4, 15 내지 47, 101 내지 116 또는 165 내지 187로 이루어지는 군 중 임의의 것에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 선택된 적어도 하나의 변형된 ITR을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 구조 요소의 구조는 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조 요소는 스템의 높이 및/또는 루프 내 뉴클레오타이드 수가 변경된다. 예를 들어, 스템의 높이는 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 또는 상기 개수 내 임의의 범위의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 스템의 높이는 약 5개 뉴클레오타이드 내지 약 9개 뉴클레오타이드일 수 있으며, Rep와 기능적으로 상호작용한다. 또 다른 실시형태에서, 스템의 높이는 약 7개 뉴클레오타이드일 수 있으며, Rep와 기능적으로 상호작용한다. 또 다른 예에서, 루프는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 또는 상기 개수 내 임의의 범위의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, RBE 또는 연장된 RBE 내 GAGY 결합 부위 또는 GAGY 관련 결합 부위의 수가 증가 또는 감소할 수 있다. 일부 예에 따르면, RBE 또는 연장된 RBE는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개, 또는 그 이상의 GAGY 결합 부위, 또는 상기 개수 내 임의의 범위의 GAGY 결합 부위를 포함할 수 있다. 각각의 GAGY 결합 부위는 독립적으로 정확한 GAGY 서열, 또는 서열이 Rep 단백질에 결합하는 데 충분하다면 GAGY에 유사한 서열일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 2개의 요소(예컨대, 비제한적으로, RBE와 헤어핀) 사이의 간격을 변경시켜(예를 들어, 증가 또는 감소시켜), 대형 Rep 단백질과의 기능적 상호작용을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 간격은 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 또는 상기 개수 내 임의의 범위의 뉴클레오타이드일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원에 개시된 야생형 AAV2 ITR 구조에 대해 변형된 ITR 구조를 포함할 수 있지만, 작동 가능한 RBE, trs 및 RBE' 부분은 여전히 보유한다. 도 2a 및 도 2b는, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 야생형 ITR 구조 부분 내에서 trs 부위의 작동을 위한 하나의 가능한 메커니즘을 보여준다. 일부 실시형태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 Rep 결합 부위(예를 들어, RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3')와 말단 분해 부위(TRS; 예를 들어, 5'-AGTT)를 포함하는 하나 이상의 기능성 ITR 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부 실시형태에 따르면, 적어도 하나의 ITR(wt 또는 변형된 ITR)은 기능성이다. 대안적인 실시형태에서, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터가 서로 상이하거나 비대칭인 2개의 ITR을 포함하는 경우, 적어도 하나의 ITR은 기능성이고, 적어도 하나의 ITR은 비기능성이다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 변형된 ITR(예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)은, 루프 아암, 절단된 아암 또는 스페이서 내에 변형을 갖는다. 루프 아암, 절단된 아암 또는 스페이서 내에 변형을 갖는 ITR의 예시적인 서열은 국제 특허출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 표 2(즉, 서열번호 135 내지 190, 200 내지 233); 표 3(예를 들어, 서열번호 234 내지 263); 표 4(예를 들어, 서열번호 264 내지 293); 표 5(예를 들어, 서열번호 294 내지 318); 표 6(예를 들어, 서열번호 319 내지 468; 및 표 7 내지 표 9(예를 들어, 서열번호 101 내지 110, 111 및 112, 115 내지 134) 또는 표 10A 또는 표 10B(예를 들어, 서열번호 9, 100, 469 내지 483, 484 내지 499)에 열거되어 있다.
일부 실시형태에 따르면, 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 mod-ITR 쌍을 포함하는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용되는 변형된 ITR은, 국제 특허출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 9, 및 표 10A 및 표 10B에 제시된 것들 중 임의의 것 또는 이들의 조합에서 선택된다.
비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 mod-ITR 쌍을 포함하는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용되는 상기 각 부류의 추가의 예시적인 변형된 ITR은 표 5A 및 표 5B에 제공되어 있다. 표 5A의 우측 변형된 ITR의 예측된 2차 구조는 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/064242의 도 7a에 제시되어 있고, 표 5B의 좌측 변형된 ITR의 예측된 2차 구조는 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/064242의 도 7b에 제시되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
표 5A 및 표 5B에는 예시적인 우측 및 좌측 변형된 ITR의 서열번호가 열거되어 있다.
[표 5A]
Figure pct00007
[표 5B]
Figure pct00008
일부 실시형태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 핵산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하고, 여기서 제1 ITR(5' ITR)과 제2 ITR(3' ITR)은 서로에 대해 비대칭이며, 즉, 이들은 서로 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 예시적인 실시형태로서, 제1 ITR은 야생형 ITR이고, 제2 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있거나, 또는 그 반대로 제1 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR이고, 제2 ITR은 야생형 ITR일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 제1 ITR과 제2 ITR은 모두 mod-ITR이지만, 상이한 서열을 갖거나 상이한 변형을 갖기 때문에, 동일한 변형된 ITR이 아니고, 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 달리 말하면, 비대칭인 ITR을 갖는 ceDNA 벡터는, WT-ITR과 비교하여 하나의 ITR에서의 임의의 변화가 다른 하나의 ITR에 반영되지 않거나; 또는 대안적으로, 비대칭인 ITR이 변형된 비대칭인 ITR 쌍을 갖고 서로에 대해 상이한 서열과 상이한 3차원 형상을 가질 수 있는 ITR을 포함한다. 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현 및 ceDNA-플라스미드를 생성에 사용하기 위한 ceDNA 벡터의 예시적인 비대칭인 ITR은 표 5A 및 표 5B에 제시되어 있다.
대안적인 실시형태에서, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 2개의 대칭인 mod-ITR을 포함하며, 즉, 두 개의 ITR은 동일한 서열을 갖지만, 서로 역 보체(역상)이다. 일부 실시형태에 따르면, 대칭인 mod-ITR 쌍은 동일한 AAV 혈청형의 야생형 ITR 서열에 대한 결실, 삽입 또는 치환 중 적어도 하나 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 대칭인 ITR에서 부가, 결실 또는 치환은 동일하지만, 서로 역 보체이다. 예를 들어, 5' ITR의 C 영역에의 3개의 뉴클레오타이드의 삽입은 3' ITR의 C' 영역 내 상응하는 섹션에의 3개의 역 보체 뉴클레오타이드의 삽입으로 반영될 것이다. 단지 예시의 목적으로, 부가가 5' ITR에의 AACG인 경우, 이러한 부가는 상응하는 부위의 3' ITR에의 CGTT이다. 예를 들어, 5' ITR 센스 가닥이 ATCGATCG인 경우, G와 A 사이에 AACG가 부가되면 ATCG AACG ATCG의 서열이 생성된다. 상응하는 3' ITR 센스 가닥은 CGATCGAT(ATCGATCG의 역 보체)이고, T와 C 사이에 CGTT(즉, AACG의 역 보체)가 부가되어, CGAT CGTT CGAT(ATCG AACG ATCG의 역 보체) 서열이 생성된다.
대안적인 실시형태에서, 변형된 ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 갖지만, 상응하거나 동일한 대칭인 3차원 형상을 가질 수 있다. 예를 들어, 하나의 변형된 ITR은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 변형된 ITR은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있지만, 동일한 영역에 동일한 돌연변이(예를 들어, 뉴클레오타이드 삽입, 결실 또는 치환)을 가질 수 있다. 달리 말하면, 단지 예시의 목적으로, 5' mod-ITR은 AAV2에 유래할 수 있고 C 영역에 결실을 가질 수 있으며, 3' mod-ITR은 AAV5에서 유래할 수 있고 C' 영역에 상응하는 결실을 가질 수 있으며, 단, 5' mod-ITR과 3' mod-ITR은 동일하거나 대칭인 3차원 공간 구성을 갖고, 이들은 변형된 ITR 쌍으로서 본원에의 사용을 위해 포함된다.
일부 실시형태에 따르면, 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 갖고, 또한 이의 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상으로 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다. 단지 예로서, 실질적으로 대칭인 ITR은, 이의 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 대칭인 공간 구성을 가질 수 있다. 이는, G-C 쌍이, 예를 들어 C-G 쌍으로, 또는 그 반대로 변형되거나, A-T 쌍이 T-A 쌍으로, 또는 그 반대로 변형되는 경우에 일어날 수 있다. 따라서, ATCG AACG ATCG로서의 변형된 5' ITR과 CGAT CGTT CGAT로서의 변형된 3' ITR(즉, ATCG AACG ATCG의 역 보체)의 상기 예시적인 예를 사용하면, 이러한 변형된 ITR은, 예를 들어 5' ITR이 ATCG AAC C ATCG의 서열(여기서, 추가의 G가 C로 변형됨)을 갖고, 실질적으로 대칭인 3' ITR이 A에 더하여 T의 상응하는 변형 없이 CGAT CGTT CGAT의 서열을 갖는 경우, 여전히 대칭일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 이러한 변형된 ITR 쌍은 대칭인 입체화학을 갖기 때문에 실질적으로 대칭이다.
표 6은, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 사용되는 예시적인 대칭인 변형된 ITR 쌍(즉, 좌측 변형된 ITR과 대칭인 우측 변형된 ITR)을 보여준다. 서열의 볼드체(적색) 부분은 부분 ITR 서열(즉, A-A', C-C' 및 B-B' 루프의 서열)을 식별하며, 이는 또한 도 31a 내지 도 46b에 도시되어 있다. 이러한 예시적인 변형된 ITR은 GCGCGCTCGCTCGCTC-3'의 RBE, ACTGAGGC의 스페이서, 스페이서 보체 및 GAGCGAGCGAGCGCGC의 RBE'(즉, RBE에 대한 보체)를 포함할 수 있다.
[표 6]
Figure pct00009
Figure pct00010
일부 실시형태에 따르면, 비대칭인 ITR 쌍을 포함하는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원의 표 5A 및 표 5B 중 임의의 하나 이상에 제시된 ITR 서열 또는 ITR 부분 서열에서의 임의의 변형에 상응하는 변형을 갖는 ITR, 또는 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/064242(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 도 7a 및 도 7b에 제시된, 또는 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 9, 또는 표 10A 및 표 10B에 개시된 서열을 포함할 수 있다.
B. 예시적인 ceDNA 벡터
상기 기재된 바와 같이, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 비대칭인 ITR 쌍, 대칭인 ITR 쌍 또는 실질적으로 대칭인 ITR 쌍 중 어느 하나를 포함하는, 항체 및 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 재조합 ceDNA 발현 벡터 및 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용은 플랭킹 ITR 서열과 전이유전자를 갖는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 재조합 ceDNA 벡터로서, 여기서 ITR 서열은 본원에 정의된 바와 같이 서로 비대칭, 대칭 또는 실질적으로 대칭이고, ceDNA는 플랭킹 ITR 사이에 위치한 관심 핵산 서열(예를 들어, 전이유전자의 핵산을 포함하는 발현 카세트)을 추가로 포함하며, 여기서 상기 핵산 분자에는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없는 재조합 ceDNA 벡터에 관한 것이다.
항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 발현 벡터는, 적어도 하나의 ITR이 변경된 본원에 기재된 바와 같은 핵산 서열(들)을 포함하는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용될 수 있는 임의의 ceDNA 벡터일 수 있다. 본 개시내용의 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터가 도입되는 숙주세포와 양립 가능하다. 특정 실시형태에서, ceDNA 벡터는 선형일 수 있다. 특정 실시형태에서, ceDNA 벡터는 염색체외 엔티티로서 존재할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 개시내용의 ceDNA 벡터는 숙주세포의 게놈으로의 공여체 서열의 통합을 가능하게 하는 요소(들)를 함유할 수 있다. 본원에 사용된 "전이유전자", "핵산 서열" 및 "이종 핵산 서열"은 동의어이며, 본원에 기재된 바와 같이 항체 및 이의 항원 결합을 인코딩한다.
이제 도 1a 내지 도 1g를 참조하면, 항체 및 이의 항원 결합의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 제조에 유용한 2개의 비제한적인 플라스미드의 기능성 구성요소의 개략도가 제시되어 있다. 도 1a, 도 1b, 도 1d 및 도 1f는, 항체 및 이의 항원 결합의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 작제물 또는 ceDNA 플라스미드의 상응하는 서열을 보여준다. ceDNA 벡터는 캡시드를 함유하지 않고, 제1 ITR, 발현 가능한 전이유전자 카세트 및 제2 ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 플라스미드에서 수득될 수 있으며, 여기서 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열은 본원에 정의된 바와 같이 서로 비대칭, 대칭 또는 실질적으로 대칭이다. 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 캡시드를 함유하지 않고, 제1 ITR, 발현 가능한 전이유전자(단백질 또는 핵산) 및 제2 ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 플라스미드에서 수득될 수 있으며, 여기서 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열은 본원에 정의된 바와 같이 서로 비대칭, 대칭 또는 실질적으로 대칭이다. 일부 실시형태에 따르면, 발현 가능한 전이유전자 카세트는, 필요한 경우, 인핸서/프로모터, 하나 이상의 상동성 아암, 공여체 서열, 전사 후 조절 요소(예를 들어, WPRE, 예를 들어 서열번호 67), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호(예를 들어, BGH polyA, 예를 들어 서열번호 68)를 포함한다.
도 5는, 실시예에 기재된 방법을 사용하여 다수의 플라스미드 작제물로부터 ceDNA의 생산을 확인시켜 주는 겔이다. ceDNA는, 상기 도 4a 및 실시예에 논의된 바와 같이, 겔에서의 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다.
(i). 조절 요소
본원에 정의된 바와 같은 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 ITR 쌍을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 시스-조절 요소의 특정 조합을 추가로 포함할 수 있다. 시스-조절 요소에는, 비제한적으로, 프로모터, 리보스위치, 절연인자, mir-조절 요소, 전사 후 조절 요소, 조직 및 세포 유형 특이적 프로모터, 및 인핸서가 포함된다.
일부 실시형태에 따르면, 다양한 시스-조절 요소의 서열은 2021년 3월 24일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2021/023891에 개시된 것들 중 임의의 것에서 선택될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
실시형태에서, 제2 핵산 서열은 조절 서열과, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 유전자 조절 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 특정 실시형태에서, 조절 서열은 숙주세포에서 뉴클레아제의 발현을 제어하는 데 적합하다. 특정 실시형태에서, 조절 서열은 본 개시내용의 뉴클레아제(들)를 인코딩하는 핵산 서열과 같은 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 지시할 수 있는, 적합한 프로모터 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 제2 핵산 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열의 5' 말단에 연결된 인트론 서열을 포함한다. 특정 실시형태에서, 프로모터의 효능을 증가시키기 위해 인핸서 서열이 프로모터의 업스트림에 제공된다. 특정 실시형태에서, 조절 서열은 인핸서와 프로모터를 포함하며, 여기서 제2 핵산 서열은 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열의 업스트림에 있는 인트론 서열을 포함하고, 인트론은 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위(들)를 포함하고, 프로모터는 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다.
적합한 프로모터는 바이러스에서 유도될 수 있고, 따라서 바이러스 프로모터로 지칭될 수 있거나, 원핵생물 또는 진핵생물 유기체를 포함하는 임의의 유기체에서 유도될 수 있다. 적합한 프로모터는 임의의 RNA 폴리머라아제(예를 들어, pol I, pol II, pol III)에 의한 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터에는, 비제한적으로, SV40 초기 프로모터, 마우스 유선종양바이러스 긴말단반복서열(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순헤르페스바이러스(HSV) 프로모터, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 극초기 프로모터 영역(CMVIE), 라우스육종(rous sarcoma) 바이러스(RSV) 프로모터, 인간 U6 소형 핵 프로모터(U6, 예를 들어, 서열번호 80)(문헌[Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)]), 증강된 U6 프로모터(예를 들어, 문헌[Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31(17))], 인간 H1 프로모터(H1)(예를 들어, 서열번호 81 또는 서열번호 155), CAG 프로모터, 인간 알파 1-항트립신(HAAT) 프로모터(예를 들어, 서열번호 82) 등이 포함된다. 특정 실시형태에서, 이러한 프로모터는 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위를 포함하도록 이의 다운스트림 인트론 함유 말단에서 변경된다. 특정 실시형태에서, 뉴클레아제 절단 부위(들)를 함유하는 DNA는 프로모터 DNA에 대해 이질적이다.
일부 실시형태에 따르면, 프로모터는 또한 인간 유비퀴틴 C(hUbC), 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자 유래의 프로모터일 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 추가 실시형태에 따르면, 조직 특이적 프로모터는 간 특이적 프로모터이다. 일부 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 간에 표적화되고/되거나, 간 특이적 프로모터에 의해 간에서 생산된다.
당업계에 알려진 임의의 간 특이적 프로모터가 본 개시내용에서의 사용을 위해 고려된다. 일부 실시형태에 따르면, 간 특이적 프로모터는, 비제한적으로, 천연 또는 합성의 인간 알파 1-항트립신(HAAT)에서 선택된다. 일부 실시형태에 따르면, 간으로의 전달은, 간세포 표면에 존재하는 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체를 통해, 간세포에 대한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 내인성 ApoE 특이적 표적화를 사용하여 달성될 수 있다.
본 개시내용에 따라 사용하기에 적합한 프로모터의 비제한적인 예에는, 비제한적으로, CAG 프로모터, EF1a 프로모터, IE2 프로모터 및 래트 EF1-α 프로모터, mEF1 프로모터 또는 1E1 프로모터 단편 중 임의의 것이 포함된다.
일부 실시형태에 따르면, 프로모터는 2021년 3월 24일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2021/023891에 개시된 임의의 프로모터 서열에서 선택될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
(ii). 폴리아데닐화 서열:
ceDNA 벡터로부터 발현되는 mRNA를 안정화시키고, 핵 방출 및 번역을 돕기 위해, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터에 폴리아데닐화 서열을 인코딩하는 서열을 포함시킬 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개 또는 그 이상의 아데닌 또는 디뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 폴리아데닐화 서열은 약 43개의 뉴클레오타이드, 약 40 내지 50개의 뉴클레오타이드, 약 40개 내지 55개의 뉴클레오타이드, 약 45개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 약 35개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 또는 상기 개시된 범위 사이의 임의의 범위의 뉴클레오타이드를 포함한다.
발현 카세트는 당업계에 알려진 임의의 폴리아데닐화 서열 또는 이의 변형을 포함할 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 polyA 신호 업스트림 인핸서(USE) 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, USE 서열은 SV40pA 또는 이종 polyA 신호와 조합으로 사용될 수 있다. polyA 서열은 항체 및 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 전이유전자의 3'에 위치한다.
일부 실시형태에 따르면, 폴리아데닐화 서열은 2021년 3월 24일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2021/023891에 개시된 임의의 폴리아데닐화 서열에서 선택될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
발현 카세트는 또한 전이유전자의 발현을 증가시키기 위해 전사 후 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 우드척 간염 바이러스(WHP: Woodchuck Hepatitis Virus) 전사 후 조절 요소(WPRE)가 전이유전자의 발현을 증가시키기 위해 사용된다. B형 간염 바이러스(HBV) 또는 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나아제 유전자의 전사 후 요소와 같은 다른 전사 후 처리 요소가 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 전사 후 조절 요소는 2021년 3월 24일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2021/023891에 개시된 임의의 전사 후 조절 요소에서 선택될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열은 또한, 단백질이 골지체 및 소포체로 향하고, ER을 통과하여 세포 밖으로 나올 때 샤페론 분자에 의해 정확한 형태로 폴딩되도록 분비 서열을 인코딩할 수 있다. 예시적인 분비 서열에는, 비제한적으로, VH-02 및 VK-A26 및 Igĸ 신호 서열뿐 아니라, 태그된 단백질이 시토졸 외부로 분비되게 하는 Gluc 분비 신호, 태그된 단백질이 골지로 향하게 하는 TMD-ST 분비 서열이 포함된다.
일부 실시형태에 따르면, 분비 서열은 2021년 3월 24일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2021/023891에 개시된 임의의 분비 서열에서 선택될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
(iii) 핵 국소화 서열
일부 실시형태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS), 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 NLS를 포함한다. 일부 실시형태에 따르면, 하나 이상의 NLS는 아미노 말단에 또는 그 근처에, 카르복시 말단에 또는 그 근처에, 또는 이들의 조합에 위치한다(예를 들어, 아미노 말단에 있는 하나 이상의 NLS 및/또는 카르복시 말단에 있는 하나 이상의 NLS). 하나 초과의 NLS가 존재하는 경우, 각각은 서로 독립적으로, 단일 NLS가 하나 초과의 카피에 존재하고/하거나 하나 이상의 카피에 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 조합으로 존재하도록 선택될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, NLS는 2021년 3월 24일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2021/023891에 개시된 임의의 NLS에서 선택될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
C. 예시적인 ceDNA 항-CoV-2 S 벡터
일부 실시형태에 따르면, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 예시적인 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터로서, ceDNA 작제물은 표 7에 제시된 작제물에서 선택된다.
[표 7]
Figure pct00011
일부 실시형태에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 하기 제시되는 서열번호 404를 포함하는 ceDNA-1856이다.
CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG CCCGGGCGTCGGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TTGTAGTTAA TGATTAACCC GCCATGCTAC TTATCGCGGC CGCGGGGGAG GCTGCTGGTG AATATTAACC AAGGTCACCC CAGTTATCGG AGGAGCAAAC AGGGGCTAAG TCCACCGGGG GAGGCTGCTG GTGAATATTA ACCAAGGTCA CCCCAGTTAT CGGAGGAGCA AACAGGGGCT AAGTCCACCG GGGGAGGCTG CTGGTGAATA TTAACCAAGG TCACCCCAGT TATCGGAGGA GCAAACAGGG GCTAAGTCCA CGGTACCCAC TGGGAGGATG TTGAGTAAGA TGGAAAACTA CTGATGACCC TTGCAGAGAC AGAGTATTAG GACATGTTTG AACAGGGGCC GGGCGATCAG CAGGTAGCTC TAGAGGATCC CCGTCTGTCT GCACATTTCG TAGAGCGAGT GTTCCGATAC TCTAATCTCC CTAGGCAAGG TTCATATTTG TGTAGGTTAC TTATTCTCCT TTTGTTGACT AAGTCAATAA TCAGAATCAG CAGGTTTGGA GTCAGCTTGG CAGGGATCAG CAGCCTGGGT TGGAAGGAGG GGGTATAAAA GCCCCTTCAC CAGGAGAAGC CGTCACACAG ATCCACAAGC TCCTGAAGAG GTAAGGGTTT AAGGGATGGT TGGTTGGTGG GGTATTAATG TTTAATTACC TGGAGCACCT GCCTGAAATC ACTTTTTTTC AGGTTGGGTT TAAACCGCAG CCACCATGGA CATGAGAGTG CCCGCCCAGC TGCTGGGCCT GCTGCTGCTG TGGCTGTCCG GAGCCAGATG CGAAATCGTG CTGACCCAGA GCCCTGGCAC CCTGAGCCTGTCACCCGGCG AACGGGCTAC CCTGTCTTGT AGAGCCTCTC AGACCGTGTC CAGCACCAGCCTGGCCTGGT ACCAGCAGAA ACCTGGACAG GCTCCTAGAC TGCTGATCTA CGGAGCTTCTAGTAGAGCCA CCGGCATCCC CGATAGATTC AGCGGCAGCG GCAGCGGCAC TGATTTCACCCTGACAATTA GCCGGCTGGA ACCTGAGGAC TTTGCCGTGT ATTACTGCCA GCAACACGACACCAGCCTGA CATTCGGCGG CGGAACCAAA GTTGAGATCA AGCGGACCGT GGCCGCTCCATCTGTGTTCA TCTTTCCACC TAGCGACGAG CAGCTGAAGT CCGGCACAGC CTCTGTGGTGTGCCTGCTCA ACAACTTCTA CCCTCGCGAG GCCAAGGTGC AGTGGAAGGT GGACAACGCCCTGCAAAGCG GCAACAGCCA GGAGAGCGTC ACAGAACAGG ACAGCAAGGA CTCTACATACAGCCTGAGCA GCACACTGAC CCTCAGCAAG GCCGATTACG AGAAGCACAAGGTTTACGCCTGCGAGGTGA CCCACCAGGG CCTGTCCAGC CCTGTGACAAAGAGCTTCAA TAGAGGCGAATGTTGATAGT TAATTAAGAG CATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGT TCTGTTTTTCTTGATTTGGG TATACATTTA AATGTTAATA AAACAAAATGGTGGGGCAAT CATTTACATTTTTAGGGATA TGTAATTACTAGTTCAGGTG TATTGCCACA AGACAAACAT GTTAAGAAACTTTCCCGTTA TTTACGCTCTGTTCCTGTTA ATCAACCTCT GGATTACAAA ATTTGTGAAAGATTGACTGA TATTCTTAACTATGTTGCTC CTTTTACGCT GTGTGGATAT GCTGCTTTATAGCCTCTGTA TCTAGCTATTGCTTCCCGTA CGGCTTTCGT TTTCTCCTCC TTGTATAAATCCTGGTTGCT GTCTCTTTTAGAGGAGTTGT GGCCCGTTGT CCGTCAACGT GGCGTGGTGTGCTCTGTGTT TGCTGACGCAACCCCCACTG GCTGGGGCAT TGCCACCACC TGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTC CCCCTCCCGA TCGCCACGGC AGAACTCATC GCCGCCTGCCTTGCCCGCTG CTGGACAGGG GCTAGGTTGC TGGGCACTGA TAATTCCGTG GTGTTGTCTGTGCCTTCTAG TTGCCAGCCA TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGGAAGGTGCCAC TCCCACTGTC CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG CATTGTCTGAGTAGGTGTCA TTCTATTCTG GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA CAGCAAGGGG GAGGATTGGGAAGACAATAG CAGGCATGCT GGGGATGCGG TGGGCTCTAT GGCTCTAGAG CATGGCTACGTAGATAAGTA GCATGGCGGG TTAATCATTA ACTACACCTG CAGGAGGAAC CCCTAGTGATGGAGTTGGCC ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC GACCAAAGGTCGCCCGACGC CCGGGCGGCC TCAGTGAGCG AGCGAGCGCG CAGCTGCCTG CAGG
일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 서열번호 404와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 실시형태에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 하기 제시되는 서열번호 405를 포함하는 ceDNA-1859이다.
CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG CCCGGGCGTC GGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC GCGCAGAGAG GGAGTGGCCA ACTCCATCAC TAGGGGTTCC TTGTAGTTAA TGATTAACCC GCCATGCTAC TTATCGCGGC CGCGGGGGAG GCTGCTGGTG AATATTAACC AAGGTCACCC CAGTTATCGG AGGAGCAAAC AGGGGCTAAG TCCACCGGGG GAGGCTGCTG GTGAATATTA ACCAAGGTCA CCCCAGTTAT CGGAGGAGCA AACAGGGGCT AAGTCCACCG GGGGAGGCTG CTGGTGAATA TTAACCAAGG TCACCCCAGT TATCGGAGGA GCAAACAGGG GCTAAGTCCA CGGTACCCAC TGGGAGGATG TTGAGTAAGA TGGAAAACTA CTGATGACCC TTGCAGAGAC AGAGTATTAG GACATGTTTG AACAGGGGCC GGGCGATCAG CAGGTAGCTC TAGAGGATCC CCGTCTGTCT GCACATTTCG TAGAGCGAGT GTTCCGATAC TCTAATCTCC CTAGGCAAGG TTCATATTTG TGTAGGTTAC TTATTCTCCT TTTGTTGACT AAGTCAATAA TCAGAATCAG CAGGTTTGGA GTCAGCTTGG CAGGGATCAG CAGCCTGGGT TGGAAGGAGG GGGTATAAAA GCCCCTTCAC CAGGAGAAGC CGTCACACAG ATCCACAAGC TCCTGAAGAG GTAAGGGTTT AAGGGATGGT TGGTTGGTGG GGTATTAATG TTTAATTACC TGGAGCACCT GCCTGAAATC ACTTTTTTTC AGGTTGGGTT TAAACCGCAG CCACCATGGA ATTCGGCCTG TCCTGGGTCT TTCTGGTGGC CATCCTGAAG GGCGTGCAGT GCCAGGTCCA GCTGGTTCAG AGCGGCGCCG AGGTTAAGAA ACCTGGCGCC AGCGTGAAAG TGTCCTGCAA GGCCAGCGGC TACCCCTTCA CCAGCTACGG CATCTCTTGG GTGCGGCAGG CCCCTGGACA AGGACTGGAG TGGATGGGAT GGATCAGCAC TTACCAGGGC AATACCAACT ACGCCCAGAA ATTCCAGGGC AGAGTGACAA TGACCACCGA CACCAGCACAACCACAGGCT ACATGGAACT GCGGAGACTG AGAAGCGATG ATACAGCCGT GTACTACTGCGCCAGAGATT ATACAAGAGG TGCTTGGTTC GGCGAGAGCC TGATCGGCGG ATTCGACAAC TGGGGACAAG GCACCCTGGT GACCGTGTCA TCCGCCTCTA CCAAGGGCCC TAGCGTGTTTCCACTGGCCC CTAGCTCTAA AAGCACAAGC GGCGGCACCG CCGCTCTGGG ATGTCTGGTGAAGGACTACT TCCCAGAGCC CGTGACCGTG AGCTGGAACA GCGGCGCTCT CACATCTGGGGTGCATACCT TTCCCGCCGT GCTGCAGTCT TCTGGACTGT ACAGCCTGAG CAGCGTGGTGACCGTGCCCT CCAGCAGCCT GGGCACACAG ACCTACATCT GCAACGTGAA CCACAAGCCA TCTAATACCA AGGTGGATAA GAAGGTGGAA CCTAAGAGCT GTGACAAGAC ACACACATGC CCCCCCTGCC CTGCTCCTGA GCTGCTGGCC GGCCCCTCCG TGTTTCTCTT CCCTCCTAAA CCCAAGGACA CACTGATGAT TAGCCGGACC CCAGAGGTGA CCTGTGTGGT GGTTGACGTG AGTCACGAAG ATCCTGAAGT GAAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAAC GCCAAAACCA AGCCTCGGGA AGAGCAGTAC AACAGCACCT ATAGAGTGGT GAGCGTGCTT ACAGTGCTGC ATCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAATACA AGTGCAAGGT GTCCAACAAA GCCCTGCCTC TGCCTGAAGA AAAGACCATC AGCAAGGCCA AGGGCCAACC AAGAGAGCCT CAAGTGTACA CCCTGCCCCC CAGCAGAGAT GAGCTGACCA AGAATCAGGT GTCCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCTAGCGAC ATCGCCGTCG AGTGGGAGAG CAATGGCCAG CCTGAGAACA ACTACAAGAC CACCCCTCCT GTGCTGGACA GCGACGGCAG CTTCTTCCTG TATAGCAAGC TGACCGTGGA CAAGTCCAGG TGGCAGCAGG GCAATGTGTT CAGCTGTAGC GTGCTGCACG AGGCCCTGCA CAGCCACTAC ACACAGAAGT CTCTGAGCCT GTCTCCTGGC AAGTGATAGT TAATTAAGAG CATCTTACCG CCATTTATTC CCATATTTGT TCTGTTTTTC TTGATTTGGG TATACATTTA AATGTTAATA AAACAAAATG GTGGGGCAAT CATTTACATT TTTAGGGATA TGTAATTACT AGTTCAGGTG TATTGCCACA AGACAAACAT GTTAAGAAAC TTTCCCGTTA TTTACGCTCT GTTCCTGTTA ATCAACCTCT GGATTACAAA ATTTGTGAAAGATTGACTGA TATTCTTAAC TATGTTGCTC CTTTTACGCT GTGTGGATAT GCTGCTTTAT AGCCTCTGTA TCTAGCTATT GCTTCCCGTA CGGCTTTCGT TTTCTCCTCC TTGTATAAAT CCTGGTTGCT GTCTCTTTTA GAGGAGTTGT GGCCCGTTGT CCGTCAACGT GGCGTGGTGT GCTCTGTGTT TGCTGACGCA ACCCCCACTG GCTGGGGCAT TGCCACCACC TGTCAACTCC TTTCTGGGAC TTTCGCTTTC CCCCTCCCGA TCGCCACGGC AGAACTCATC GCCGCCTGCC TTGCCCGCTG CTGGACAGGG GCTAGGTTGC TGGGCACTGA TAATTCCGTG GTGTTGTCTG TGCCTTCTAG TTGCCAGCCA TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGG AAGGTGCCAC TCCCACTGTC CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG CATTGTCTGA GTAGGTGTCA TTCTATTCTG GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA CAGCAAGGGG GAGGATTGGG AAGACAATAG CAGGCATGCT GGGGATGCGG TGGGCTCTAT GGCTCTAGAG ATGGCTACG TAGATAAGTA GCATGGCGGG TTAATCATTA ACTACACCTG CAGGAGGAAC CCCTAGTGAT GGAGTTGGCC ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC GACCAAAGGT CGCCCGACGC CCGGGCGGCC TCAGTGAGCG AGCGAGCGCG CAGCTGCCTG CAGG
일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 서열번호 405와 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 실시형태에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 하기 제시되는 서열번호 406을 포함하는 ceDNA-1966이다.
CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG CCCGGGCGTCGGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC GCGCAGAGAG GGAGTGGCCAACTCCATCAC TAGGGGTTCC TTGTAGTTAA TGATTAACCC GCCATGCTAC TTATCGCGGCCGCGGGGGAG GCTGCTGGTG AATATTAACC AAGGTCACCC CAGTTATCGG AGGAGCAAACAGGGGCTAAG TCCACCGGGG GAGGCTGCTG GTGAATATTA ACCAAGGTCA CCCCAGTTATCGGAGGAGCA AACAGGGGCT AAGTCCACCG GGGGAGGCTG CTGGTGAATA TTAACCAAGGTCACCCCAGT TATCGGAGGA GCAAACAGGG GCTAAGTCCA CGGTACCCAC TGGGAGGATG TTGAGTAAGA TGGAAAACTA CTGATGACCC TTGCAGAGAC AGAGTATTAG GACATGTTTG AACAGGGGCC GGGCGATCAG CAGGTAGCTC TAGAGGATCC CCGTCTGTCT GCACATTTCGTAGAGCGAGT GTTCCGATAC TCTAATCTCC CTAGGCAAGG TTCATATTTG TGTAGGTTACTTATTCTCCT TTTGTTGACT AAGTCAATAA TCAGAATCAG CAGGTTTGGA GTCAGCTTGGCAGGGATCAG CAGCCTGGGT TGGAAGGAGG GGGTATAAAA GCCCCTTCAC CAGGAGAAGCCGTCACACAG ATCCACAAGC TCCTGAAGAG GTAAGGGTTT AAGGGATGGT TGGTTGGTGGGGTATTAATG TTTAATTACC TGGAGCACCT GCCTGAAATC ACTTTTTTTC AGGTTGGGTT
TAAACCGCAG CCACCATGGA ATTCGGCCTG AGCTGGGTGT TCCTGGTGGC TATCCTGAAGGGCGTGCAGT GCCAGGTGCA GCTGGTTCAG AGCGGCGCTG AGGTTAAGAA ACCTGGCGCTAGCGTGAAAG TGAGCTGCAA GGCTAGCGGC TACCCTTTCA CAAGCTACGG CATCTCTTGGGTGCGGCAGG CTCCTGGACA AGGACTGGAG TGGATGGGAT GGATCAGCAC TTACCAGGGC AATACAAACT ACGCTCAGAA ATTCCAGGGC AGAGTGACAA TGACAACAGA CACAAGCACA ACAACAGGCT ACATGGAACT GCGGAGACTG AGAAGCGACG ACACAGCTGT GTACTACTGCGCTAGAGACT ATACAAGAGG CGCTTGGTTC GGCGAGAGCC TGATCGGCGG ATTCGACAACTGGGGACAAG GCACACTGGT GACAGTGTCA AGCGCTTCTA CAAAGGGCCC TAGCGTGTTCCCACTGGCTC CTAGCTCTAA AAGCACAAGC GGCGGCACAG CTGCTCTGGG ATGCCTGGTG AAGGACTACT TCCCAGAGCC TGTGACAGTG AGCTGGAACA GCGGCGCTCT GACATCTGGG GTGCACACAT TCCCTGCTGT GCTGCAGTCT TCTGGACTGT ACAGCCTGAG CAGCGTGGTGACAGTGCCTA GCAGCAGCCT GGGCACACAG ACATACATCT GCAACGTGAA CCACAAGCCATCTAATACAA AGGTGGACAA GAAGGTGGAA CCTAAGAGCT GCGACAAGAC ACACACATGCCCTCCTTGCC CTGCTCCTGA GCTGCTGGCT GGCCCTAGCG TGTTCCTGTT CCCTCCTAAA CCTAAGGACA CACTGATGAT TAGCCGGACA CCAGAGGTGA CCTGCGTGGT GGTTGACGTG
AGCCACGAAG ACCCTGAAGT GAAGTTCAAC TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCACAACGCTAAAACAA AGCCTCGGGA AGAGCAGTAC AACAGCACAT ATAGAGTGGT GAGCGTGCTT ACAGTGCTGC ACCAGGACTG GCTGAACGGC AAGGAATACA AGTGCAAGGT GAGCAACAAAGCTCTGCCTC TGCCTGAAGA AAAGACAATC AGCAAGGCTA AGGGCCAACC AAGAGAGCCTCAAGTGTACA CACTGCCTCC TAGCAGAGAC GAGCTGACAA AGAATCAGGT GAGCCTGACA
TGCCTGGTGA AAGGCTTCTA CCCTAGCGAC ATCGCTGTGG AGTGGGAGAG CAATGGCCAG CCTGAGAACA ACTACAAGAC AACACCTCCT GTGCTGGACA GCGACGGCAG CTTCTTCCTGTATAGCAAGC TGACAGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GCAATGTGTT CAGCTGCAGCGTGCTGCACG AGGCTCTGCA CAGCCACTAC ACACAGAAGT CTCTGAGCCT GTCTCCTGGCAAGTGATAGT TAATTAAGAG CATCTTACCG CCATTTATTC CCATATTTGT TCTGTTTTTC TTGATTTGGG TATACATTTA AATGTTAATA AAACAAAATG GTGGGGCAAT CATTTACATTTTTAGGGATA TGTAATTACT AGTTCAGGTG TATTGCCACA GACAAACAT GTTAAGAAACTTTCCCGTTA TTTACGCTCT GTTCCTGTTA ATCAACCTCT GGATTACAAA ATTTGTGAAAGATTGACTGA TATTCTTAAC TATGTTGCTC CTTTTACGCT GTGTGGATAT GCTGCTTTATAGCCTCTGTA TCTAGCTATT GCTTCCCGTA CGGCTTTCGT TTTCTCCTCC TTGTATAAATCCTGGTTGCT GTCTCTTTTA GAGGAGTTGT GGCCCGTTGT CCGTCAACGT GGCGTGGTGTGCTCTGTGTT TGCTGACGCA ACCCCCACTG GCTGGGGCAT GCCACCACC TGTCAACTCCTTTCTGGGAC TTTCGCTTTC CCCCTCCCGA TCGCCACGGC AGAACTCATC GCCGCCTGCCTTGCCCGCTG CTGGACAGGG GCTAGGTTGC TGGGCACTGA AATTCCGTG GTGTTGTCTGTGCCTTCTAG TTGCCAGCCA TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGGAAGGTGCCAC TCCCACTGTC CTTTCCTAAT AAAATGAGGA ATTGCATCG CATTGTCTGAGTAGGTGTCA TTCTATTCTG GGGGTGGGG TGGGGCAGGA AGCAAGGGG GAGGATTGGGAAGACAATAG CAGGCATGCT GGGGATGCGG TGGGCTCTAT GGCTCTAGAG ATGGCTACGTAGATAAGTA CATGGCGGG TTAATCATTA ACTACACCTG CAGGAGGAAC CCTAGTGATGGAGTTGGCC ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC GACCAAAGGTCGCCCGACGC GGGCGGCC TCAGTGAGCG AGCGAGCGCG CAGCTGCCTG CAGG
일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 서열번호 406과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 실시형태에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 하기 제시되는 서열번호 407을 포함하는 ceDNA-1967이다.
CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG CCCGGGCGTCGGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC GCGCAGAGAG GGAGTGGCCAACTCCATCAC TAGGGGTTCC TTGTAGTTAA TGATTAACCC GCCATGCTAC TTATCGCGGC CGCGGGGGAG GCTGCTGGTG AATATTAACC AAGGTCACCC CAGTTATCGG AGGAGCAAACAGGGGCTAAG TCCACCGGGG GAGGCTGCTG GTGAATATTA ACCAAGGTCA CCCCAGTTAT CGGAGGAGCA AACAGGGGCT AAGTCCACCG GGGGAGGCTG CTGGTGAATA TTAACCAAGGTCACCCCAGT TATCGGAGGA GCAAACAGGG GCTAAGTCCA CGGTACCCAC TGGGAGGATGTTGAGTAAGA TGGAAAACTA CTGATGACCC TTGCAGAGAC AGAGTATTAG GACATGTTTGAACAGGGGCC GGGCGATCAG CAGGTAGCTC TAGAGGATCC CCGTCTGTCT GCACATTTCGTAGAGCGAGT GTTCCGATAC TCTAATCTCC CTAGGCAAGG TTCATATTTG TGTAGGTTAC
TTATTCTCCT TTTGTTGACT AAGTCAATAA TCAGAATCAG CAGGTTTGGA GTCAGCTTGG CAGGGATCAG CAGCCTGGGT TGGAAGGAGG GGGTATAAAA GCCCCTTCAC CAGGAGAAGCCGTCACACAG ATCCACAAGC TCCTGAAGAG GTAAGGGTTT AAGGGATGGT TGGTTGGTGGGGTATTAATG TTTAATTACC TGGAGCACCT GCCTGAAATC ACTTTTTTTC AGGTTGGGTTTAAACCGCAG CCACCATGGA CATGAGAGTG CCTGCTCAGC TGCTGGGCCT GCTGCTGCTG TGGCTGAGCG GAGCTAGATG CGAAATCGTG CTGACCCAGA GCCCTGGCAC CCTGAGCCTGTCACCTGGCG AACGGGCTAC CCTGTCTTGC AGAGCTTCTC AGACCGTGAG CAGCACCAGCCTGGCTTGGT ACCAGCAGAA ACCTGGACAG GCTCCTAGAC TGCTGATCTA CGGAGCTTCTAGCAGAGCTA CCGGCATCCC TGACAGATTC AGCGGCAGCG GCAGCGGCAC TGACTTCACC CTGACAATTA GCCGGCTGGA ACCTGAGGAC TTCGCTGTGT ATTACTGCCA GCAACACGAC ACCAGCCTGA CATTCGGCGG CGGAACCAAA GTTGAGATCA AGCGGACCGT GGCTGCTCCATCTGTGTTCA TCTTCCCACC TAGCGACGAG CAGCTGAAGA GCGGCACAGC TTCTGTGGTG TGCCTGCTGA ACAACTTCTA CCCTCGGGAG GCTAAGGTGC AGTGGAAGGT GGACAACGCTCTGCAAAGCG GCAACAGCCA GGAGAGCGTG ACAGAACAGG ACAGCAAGGA CTCTACATACAGCCTGAGCA GCACACTGAC CCTGAGCAAG GCTGACTACG AGAAGCACAA GGTTTACGCT TGCGAGGTGA CCCACCAGGG CCTGAGCAGC CCTGTGACAA AGAGCTTCAA TAGAGGCGAATGCTGATAGT TAATTAAGAG CATCTTACCG CCATTTATTC CCATATTTGT TCTGTTTTTC TTGATTTGGG TATACATTTA AATGTTAATA AAACAAAATG GTGGGGCAAT CATTTACATTTTTAGGGATA TGTAATTACT AGTTCAGGTG TATTGCCACA AGACAAACAT GTTAAGAAACTTTCCCGTTA TTTACGCTCT GTTCCTGTTA ATCAACCTCT GGATTACAAA ATTTGTGAAA GATTGACTGA TATTCTTAAC TATGTTGCTC CTTTTACGCT GTGTGGATAT GCTGCTTTAT AGCCTCTGTA TCTAGCTATT GCTTCCCGTA CGGCTTTCGT TTTCTCCTCC TTGTATAAATCCTGGTTGCT GTCTCTTTTA GAGGAGTTGT GGCCCGTTGT CCGTCAACGT GGCGTGGTGT GCTCTGTGTT TGCTGACGCA ACCCCCACTG GCTGGGGCAT TGCCACCACC TGTCAACTCC
TTTCTGGGAC TTTCGCTTTC CCCCTCCCGA TCGCCACGGC AGAACTCATC GCCGCCTGCCTTGCCCGCTG CTGGACAGGG GCTAGGTTGC TGGGCACTGA TAATTCCGTG GTGTTGTCTGTGCCTTCTAG TTGCCAGCCA TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGGAAGGTGCCAC TCCCACTGTC CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG CATTGTCTGAGTAGGTGTCA TTCTATTCTG GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA CAGCAAGGGG GAGGATTGGGAAGACAATAG CAGGCATGCT GGGGATGCGG TGGGCTCTAT GGCTCTAGAG CATGGCTACG TAGATAAGTA GCATGGCGGG TTAATCATTA ACTACACCTG CAGGAGGAAC CCCTAGTGATGGAGTTGGCC ACTCCCTCTC TGCGCGCTCG CTCGCTCACT GAGGCCGGGC GACCAAAGGT CGCCCGACGC CCGGGCGGCC TCAGTGAGCG AGCGAGCGCG CAGCTGCCTG CAGG
일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 서열번호 407과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 실시형태에 따르면, 예시적인 ceDNA 벡터는 하기 제시되는 서열번호 408을 포함하는 ceDNA-2157이다.
CCTGCAGGCA GCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGC CCGGGCAAAG CCCGGGCGTCGGGCGACCTT TGGTCGCCCG GCCTCAGTGA GCGAGCGAGC GCGCAGAGAG GGAGTGGCCAACTCCATCAC TAGGGGTTCC TTGTAGTTAA TGATTAACCC GCCATGCTAC TTATCTACGT AGCCATGCAT ATGTACCACA TTTGTAGAGG TTTTACTTGC TTTAAAAAAC CTCCCACATCTCCCCCTGAA CCTGAAACAT AAAATGAATG CAATTGTTGT TGTTAACTTG TTTATTGCAG CTTATAATGG TTACAAATAA AGCAATAGCA TCACAAATTT CACAAATAAA GCATTTTTTT CACTGCATTC TAGTTGTGGT TTGTCCAAAC TCATCAATGT ATCTTATCAT GTCTGTAAAATACAGCATAG CAAAACTTTA ACCTCCAAAT CAAGCCTCTA CTTGAATCCT TTTCTGAGGGATGAATAAGG CATAGGCATC AGGGGCTGTT GCCAATGTGC ATTAGCTGTT TGCAGCCTCACCTTCTTTCA TGGAGTTTAA GATATAGTGT ATTTTCCCAA GGTTTGAACT AGCTCTTCATTTCTTTATGT TTTAAATGCA CTGACCTCCC ACATTCCCTT TTTAGTAAAA TATTCAGAAATAATTTAAAT ACATCATTGC AATGAAAATA AATGTTTTTT ATTAGGCAGA ATCCAGATGCTCAAGGCCCT TCATAATATC CCCCAGTTTA GTAGTTGGAC TTAGGGAACA AAGGAACCTT
TAATAGAAAT TGGACAGCAA GAAAGCGAGC TTAATTAACT ATCAACATTC GCCTCTATTGAAGCTCTTTG TCACAGGGCT GGACAGGCCC TGGTGGGTCA CCTCGCAGGC GTAAACCTTGTGCTTCTCGT AATCGGCCTT GCTGAGGGTC AGTGTGCTGC TCAGGCTGTA TGTAGAGTCCTTGCTGTCCT GTTCTGTGAC GCTCTCCTGG CTGTTGCCGC TTTGCAGGGC GTTGTCCACCTTCCACTGCA CCTTGGCCTC GCGAGGGTAG AAGTTGTTGA GCAGGCACAC CACAGAGGCTGTGCCGGACT TCAGCTGCTC GTCGCTAGGT GGAAAGATGA ACACAGATGG AGCGGCCACG GTCCGCTTGA TCTCAACTTT GGTTCCGCCG CCGAATGTCA GGCTGGTGTC GTGTTGCTGGCAGTAATACA CGGCAAAGTC CTCAGGTTCC AGCCGGCTAA TTGTCAGGGT GAAATCAGTGCCGCTGCCGC TGCCGCTGAA TCTATCGGGG ATGCCGGTGG CTCTACTAGA AGCTCCGTAGATCAGCAGTC TAGGAGCCTG TCCAGGTTTC TGCTGGTACC AGGCCAGGCT GGTGCTGGACACGGTCTGAG AGGCTCTACA AGACAGGGTA GCCCGTTCGC CGGGTGACAG GCTCAGGGTG
CCAGGGCTCT GGGTCAGCAC GATTTCGCAT CTGGCTCCGG ACAGCCACAG CAGCAGCAGGCCCAGCAGCT GGGCGGGCAC TCTCATGTCC ATGGTGGCTG CGGTTTAAAC TCAGTTCCAAAGGTTGGAAT CTAAAAGAGA GAAACAATTA GAATCAGTAG TTTAACACAT TATACACTTAAAAATTTTAT ATTTACCTTA GAGTAATTAT TCACTGTCCC AGGTCAGTGG TGGTGCCTGAAGCTGAGGAG ACAGGGCCCT GTCCTCGTCC GTATTTAAGC AGTGGATCCA GAGGGGCAACGGGGGAGGCT GCTGGTGAAT ATTAACCAAG GTCACCCCAG TTATCGGAGG AGCAAACAGG GGCTAAGTCC ACTGGCTGGG ATCTGAGTCG CCCGCCTACG CTGCCCGGAC GCTTTGCCTGGGCAGTGTAC AGCTTCCACT GCACTTACCG AAAGGAGTCA TTGTACCTGG CTCAGAAACCACAGCGTCCT GTGTCCAAGG TGGAGGGGGT GGCGTGAGTC AGACAGTCTC TGGGAGAGTACCACTTAGCT GGCCCTCTGC TCTCACTGCA GAATCCTTAG TGGCTGTTCC ACTGGTAGCAAGATCCAGTA CCTCTAGACC AGCCTGACCA ACATGGTGAA ACCCCGTCCC TGTCAAAAAT
AGAAAAAATT AGCCGGGTGT GGTGGCACAG GCCTGTAATC CCAGTTACTT GGGAGGCTGAGGCTGACCAA CATGGAGAAA CCCGTCTCTA CTAAAAATAG AAAATTAGCC AGGTGTGGTGGCACATGCTT GTAATCCCAG CTACTTGGGA GGCTGAGGCA GGGGAAGGTT GTGGTGAGATGAGATTGTGT CACTGCACTC CAGCCTGGGC GACAGAGCAA ACCTCCATCT CAAAAAACAA AACAAAACAA AACAAAAAAA CCAAATGTTT ATTTGCCACA AAAACCCTAT CAGATGGGCG TCTTTATCAT TTCCATTGTA CAGATGGGGA AACAGGCTTC GGGGTCGGGG CATAGCCACT TACTGACGAC TCCCCACCCA GCAAGTGGTT TTGAACCCGG ACCCTCTCAC ACTACCTAAACCACGCCAGG ACAACCTCTG CTCCTCTCCA CCGAAATTCC AAGGGGTCGA GTGGATGTTGGAGGTGGCAT GGGCCCAGAG AGGTCTCTGA CCTCTGCCCC AGCTCCAAGG TCAGCAGGCA GGGAGGGCTG TGTGTTTGCT GTTTGCTGCT TGCAATGTTT GCCCATTTTA GGGACATGAG TAGGCTGAAG TTTGTTCAGT GTGGACTTCA GAGGCAGCAC ACAAACAGCT GCTGGAGGATGGGAACTGAG GGGTTGGAAG GGGGCAGGGT GAGCCCAGAA ACTCCTGTGT GCCTCTGAGCCTACATTCTT AACTACCCTC CGCCCTACTC CTGTCCCTCC CCCATTTCCT GTTTGCAGTACCCAAGGCAA ATATTAGTCT AAGTAGGACA GAGGGACAAA GAGCAGGAAC ACGGGGAGGCACAAGTTCTC GCATCGATTG TACCAAAGTA CAAGCGTTAA TGATTAACTG TACCAAAGTACAAGCGTTAA TGATTAACTG TACCAAAGTA CAAGCGTTAA TGATTAACGG GGGAGGCTGC
TGGTGAATAT TAACCAAGGT CACCCCAGTT ATCGGAGGAG CAAACAGGGG CTAAGTCCACCGGGGGAGGC TGCTGGTGAA TATTAACCAA GGTCACCCCA GTTATCGGAG GAGCAAACAGGGGCTAAGTC CACCGGGGGA GGCTGCTGGT GAATATTAAC CAAGGTCACC CCAGTTATCGGAGGAGCAAA CAGGGGCTAA GTCCACGGTA CCCACTGGGA GGATGTTGAG TAAGATGGAAAACTACTGAT GACCCTTGCA GAGACAGAGT ATTAGGACAT GTTTGAACAG GGGCCGGGCG ATCAGCAGGT AGCTCTAGAG GATCCCCGTC TGTCTGCACA TTTCGTAGAG CGAGTGTTCCGATACTCTAA TCTCCCTAGG CAAGGTTCAT ATTTGTGTAG GTTACTTATT CTCCTTTTGTTGACTAAGTC AATAATCAGA ATCAGCAGGT TTGGAGTCAG CTTGGCAGGG ATCAGCAGCCTGGGTTGGAA GGAGGGGGTA TAAAAGCCCC TTCACCAGGA GAAGCCGTCA CACAGATCCACAAGCTCCTG AAGAGGTAAG GGTTTAAGGG ATGGTTGGTT GGTGGGGTAT TAATGTTTAATTACCTGGAG CACCTGCCTG AAATCACTTT TTTTCAGGTT GGACCAGGTC GCAGCCACCA
TGGAATTCGG CCTGTCCTGG GTCTTTCTGG TGGCCATCCT GAAGGGCGTG CAGTGCCAGGTCCAGCTGGT TCAGAGCGGC GCCGAGGTTA AGAAACCTGG CGCCAGCGTG AAAGTGTCCTGCAAGGCCAG CGGCTACCCC TTCACCAGCT ACGGCATCTC TTGGGTGCGG CAGGCCCCTG GACAAGGACT GGAGTGGATG GGATGGATCA GCACTTACCA GGGCAATACC AACTACGCCCAGAAATTCCA GGGCAGAGTG ACAATGACCA CCGACACCAG CACAACCACA GGCTACATGG AACTGCGGAG ACTGAGAAGC GATGATACAG CCGTGTACTA CTGCGCCAGA GATTATACAAGAGGTGCTTG GTTCGGCGAG AGCCTGATCG GCGGATTCGA CAACTGGGGA CAAGGCACCCTGGTGACCGT GTCATCCGCC TCTACCAAGG GCCCTAGCGT GTTTCCACTG GCCCCTAGCTCTAAAAGCAC AAGCGGCGGC ACCGCCGCTC TGGGATGTCT GGTGAAGGAC TACTTCCCAGAGCCCGTGAC CGTGAGCTGG AACAGCGGCG CTCTCACATC TGGGGTGCAT ACCTTTCCCG
CCGTGCTGCA GTCTTCTGGA CTGTACAGCC TGAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCAGCCTGGGCAC ACAGACCTAC ATCTGCAACG TGAACCACAA GCCATCTAAT ACCAAGGTGGATAAGAAGGT GGAACCTAAG AGCTGTGACA AGACACACAC ATGCCCCCCC TGCCCTGCTCCTGAGCTGCT GGCCGGCCCC TCCGTGTTTC TCTTCCCTCC TAAACCCAAG GACACACTGATGATTAGCCG GACCCCAGAG GTGACCTGTG TGGTGGTTGA CGTGAGTCAC GAAGATCCTG AAGTGAAGTT CAACTGGTAC GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAACGCCAAA ACCAAGCCTCGGGAAGAGCA GTACAACAGC ACCTATAGAG TGGTGAGCGT GCTTACAGTG CTGCATCAGG ACTGGCTGAA CGGCAAGGAA TACAAGTGCA AGGTGTCCAA CAAAGCCCTG CCTCTGCCTGAAGAAAAGAC CATCAGCAAG GCCAAGGGCC AACCAAGAGA GCCTCAAGTG TACACCCTGC CCCCCAGCAG AGATGAGCTG ACCAAGAATC AGGTGTCCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCTAG CGACATCGCC GTCGAGTGGG AGAGCAATGG CCAGCCTGAG AACAACTACAAGACCACCCC TCCTGTGCTG GACAGCGACG GCAGCTTCTT CCTGTATAGC AAGCTGACCGTGGACAAGTC CAGGTGGCAG CAGGGCAATG TGTTCAGCTG TAGCGTGCTG CACGAGGCCCTGCACAGCCA CTACACACAG AAGTCTCTGA GCCTGTCTCC TGGCAAGTGA TAGCTTAAGGAGCATCTTAC CGCCATTTAT TCCCATATTT GTTCTGTTTT TCTTGATTTG GGTATACATT
TAAATGTTAA TAAAACAAAA TGGTGGGGCA ATCATTTACA TTTTTAGGGA TATGTAATTACTAGTTCAGG TGTATTGCCA CAAGACAAAC ATGTTAAGAA ACTTTCCCGT TATTTACGCTCTGTTCCTGT TAATCAACCT CTGGATTACA AAATTTGTGA AAGATTGACT GATATTCTTA ACTATGTTGC TCCTTTTACG CTGTGTGGAT ATGCTGCTTT ATAGCCTCTG TATCTAGCTATTGCTTCCCG TACGGCTTTC GTTTTCTCCT CCTTGTATAA ATCCTGGTTG CTGTCTCTTT TAGAGGAGTT GTGGCCCGTT GTCCGTCAAC GTGGCGTGGT GTGCTCTGTG TTTGCTGACGCAACCCCCAC TGGCTGGGGC ATTGCCACCA CCTGTCAACT CCTTTCTGGG ACTTTCGCTT TCCCCCTCCC GATCGCCACG GCAGAACTCA TCGCCGCCTG CCTTGCCCGC TGCTGGACAGGGGCTAGGTT GCTGGGCACT GATAATTCCG TGGTGTTGTC TGTGCCTTCT AGTTGCCAGC CATCTGTTGT TTGCCCCTCC CCCGTGCCTT CCTTGACCCT GGAAGGTGCC ACTCCCACTG TCCTTTCCTA ATAAAATGAG GAAATTGCAT CGCATTGTCT GAGTAGGTGT CATTCTATTC TGGGGGGTGG GGTGGGGCAG GACAGCAAGG GGGAGGATTG GGAAGACAAT AGCAGGCATG CTGGGGATGC GGTGGGCTCT ATGGCTCTAG AGCATGGCTA CGTAGATAAG TAGCATGGCG GGTTAATCAT TAACTACACC TGCAGGAGGA ACCCCTAGTG ATGGAGTTGG CCACTCCCTC
TCTGCGCGCT CGCTCGCTCA CTGAGGCCGG GCGACCAAAG GTCGCCCGAC GCCCGGGCGG CCTCAGTGAG CGAGCGAGCG CGCAGCTGCC TGCAGG
일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 서열번호 408과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일하다.
일부 실시형태에 따르면, 서열번호 404는 하기 구성요소를 포함하며, 여기서 숫자는 핵산 잔기를 나타낸다:
856..921 = 면역글로불린 카파 가변 1D-33 신호 펩타이드
856..1566 = LC1(경쇄 1)_코돈 최적화
922..1242 = S309_VL(가변 경쇄)
1243..1563 = hIg카파 불변 영역[P01834]
1243..1563 = S309 불변 영역(인간 카파)
일부 실시형태에 따르면, 서열번호 405는 하기 구성요소를 포함하며, 여기서 숫자는 핵산 잔기를 나타낸다:
856..912 = 인간 IGHV3-43 중쇄 신호 펩타이드
856..2286 = HC1 중쇄 1(HC1)_코돈 최적화
913..1293 = S309_VH(가변 중쇄)
1294..2283 = GAALIE 및 LS 돌연변이가 있는 S309 불변 영역(hIgG1)
일부 실시형태에 따르면, 서열번호 406은 하기 구성요소를 포함하며, 여기서 숫자는 핵산 잔기를 나타낸다:
856..912 = 인간 IGHV3-43 중쇄 신호 펩타이드[P0DP04]
856..2286 = HC1_코돈 최적화
913..1293 = S309_VH
1294..2283 = GAALIE 및 LS 돌연변이가 있는 S309 불변 영역(hIgG1)
일부 실시형태에 따르면, 서열번호 407은 하기 구성요소를 포함하며, 여기서 숫자는 핵산 잔기를 나타낸다:
856..921 = 면역글로불린 카파 가변 1D-33 신호 펩타이드
856..1566 = LC1_코돈 최적화
922..1242 = S309_VL
1243..1563 = hIg카파 불변 영역[P01834]
1243..1563 = S309 불변 영역(인간 카파)
일부 실시형태에 따르면, 서열번호 408은 하기 구성요소를 포함하며, 여기서 숫자는 핵산 잔기를 나타낸다:
1..141 = 좌측-ITR_v1
142..193 = 스페이서_좌측-ITR_536
보체(194..415) = SV40_polyA
416..810 = HBB_3pUTR
보체(416..810) = HBBv2_3pUTR
811..818 = PacI_부위
보체(822..1532) = 번역 1532-822
보체(822..1532) = LC1_코돈 최적화
보체(825..1145) = hIg카파 불변 영역[P01834]
보체(825..1145) = S309 불변 영역(인간 카파)
보체(1146..1466) = S309_VL(가변 경쇄)
보체(1467..1532) = 면역글로불린 카파 가변 1D-33 신호 펩타이드[P01593.2]
보체(1533..1539) = Mod_최소_공통_Kozak
보체(1533..1542) = Mod_최소_공통_Kozak_v2
1543..1550= PmeI_부위
보체(1551..2822) = CpGmin_hAAT_프로모터_세트
스페이서 보체(2823..2832) = 10mer_2A
보체(2823..3048) = 3xHNF1-4_ProEnh_10mer
인핸서 보체(2833..2952) = ProEnh
보체(2959..2975) = HNF4 부위
보체(2976..2988) = HNF1 부위
보체(2989..3005)= HNF4 부위
보체(3006..3018) = HNF1 부위
보체(3019..3035) = HNF4 부위
보체(3036..3048) = HNF1 부위
3049..3120 = 세르핀 인핸서
3122..3193 = 세르핀 인핸서
3195..3266 = 세르핀 인핸서
3427..3610 = 마우스 TTR 5pUTR(NM_013697.5)
3579..3610 = EPD 실험적으로 결정된 5'UTR
3590..3610 = EPD 실험적으로 결정된 5'UTR
3611..3701 = MVM 인트론
3703..3709 = SexAI_부위
3710..3719 = Mod_최소_공통_Kozak_v2
3713..3719 = Mod_최소_공통_Kozak
3720..3776 = 인간 IGHV3-43 중쇄 신호 펩타이드[P0DP04]
3720..5150 = HC1_코돈 최적화
3777..4157 = S309_VH
4158..5147 = GAALIE 및 LS 돌연변이가 있는 S309 불변 영역(hIgG1)
5154..5159 = AflII_부위
5160..5740 = WPRE_3pUTR
5741..5965 = bGH
5966..6026 = 스페이서_우측-ITR_v1
6027..6156 = 우측-ITR_v1
V. ceDNA 벡터의 생산 방법
A. 생산 전반
본원에 정의된 바와 같은 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 ITR 쌍을 포함하는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산을 위한 특정 방법은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 섹션 IV에 기재되어 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 본원에 기재된 바와 같이 곤충 세포를 사용하여 생산될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 합성적으로, 일부 실시형태에 따르면, 2019년 1월 18일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US19/14122(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)에 개시된 바와 같은 무세포 방법으로 생산될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 일부 실시형태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어 하기 단계를 포함하는 공정에 따라 수득될 수 있다: a) 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 폴리뉴클레오타이드 발현 작제물 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큘로바이러스)을 보유하는 숙주세포(예를 들어, 곤충 세포) 집단을, Rep 단백질의 존재 하에서, 숙주세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 숙주세포는 바이러스 캡시드 코딩 서열을 포함하지 않는 단계; 및 b) 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리하는 단계. Rep 단백질의 존재는 변형된 ITR을 갖는 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제를 유도하여, 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 생산한다. 하지만, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 비리온)는 발현되지 않는다. 따라서, AAV 또는 다른 바이러스 기반 벡터에 자연적으로 부과되는 것과 같은 크기 제한이 없다.
숙주세포에서 단리된 ceDNA 벡터의 존재는, 숙주세포에서 단리된 DNA를 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 소화된 DNA 물질을 미변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하는 방식으로 확인될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은, 예를 들어 문헌[Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879]에 기재된 바와 같이, 비바이러스성 DNA 벡터의 생산에서 DNA 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 주형(ceDNA 주형)을 이의 자체 게놈에 안정적으로 통합시킨 숙주 세포주의 용도를 제공한다. 바람직하게는, Rep는 약 3의 MOI로 숙주 세포에 첨가된다. 숙주 세포주가 포유류 세포주, 예를 들어 HEK293 세포인 경우, 상기 세포주는 안정적으로 통합된 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형을 가질 수 있고, 헤르페스 바이러스와 같은 제2 벡터를 사용하여 Rep 단백질을 세포에 도입하여, Rep 및 헬퍼 바이러스의 존재 하에서 ceDNA의 절제 및 증폭을 가능하게 할 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 제조하는 데 사용되는 숙주세포는 곤충 세포이고, 바큘로바이러스는 Rep 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드와, 예를 들어 도 4a 내지 도 4c 및 실시예 1에 기재된 바와 같은 ceDNA에 대한 비바이러스성 DNA 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 작제물 주형을 전달하는 데 사용된다. 일부 실시형태에 따르면, 숙주세포는 Rep 단백질을 발현하도록 조작된다.
이어서, 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리한다. 상기 세포에서 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 수거하고 수집하는 시간은, ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하기 위해 선택 및 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존능, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 바큘로바이러스 감염 후 세포를 성장시키고 ceDNA 벡터를 생산하기에 충분한 시간 후에, 하지만 바큘로바이러스 독성으로 인해 세포의 대부분이 사멸되기 시작하기 전에 수거한다. DNA 벡터는 Qiagen Endo-Free 플라스미드 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법이 또한 DNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
DNA 벡터는 DNA의 정제에 대해 당업자에게 알려진 임의의 수단을 통해 정제될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 또 다른 실시형태에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 미세입자로 정제된다.
항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 존재는, 세포에서 단리된 벡터 DNA를 DNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 소화 및 미소화된 DNA 물질을 겔 전기영동을 사용하여 분석하여, 선형 및 비연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하는 방식으로 확인될 수 있다. 도 4c 및 도 4d는, 본원의 공정에 의해 생산된 폐쇄형 ceDNA 벡터의 존재를 확인하는 하나의 실시형태를 예시한다.
일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 무세포 환경에서 합성적으로 생산된다.
B. ceDNA 플라스미드
ceDNA-플라스미드는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 추후 생산에 사용되는 플라스미드이다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA-플라스미드는 적어도 다음과 같은 요소를 전사 방향으로 작동적으로 연결된 구성요소로서 제공하기 위해 알려진 기술을 사용하여 작제될 수 있다: (1) 변형된 5' ITR 서열; (2) 시스-조절 요소, 예를 들어 프로모터, 유도성 프로모터, 조절 스위치, 인핸서 등을 함유하는 발현 카세트; 및 (3) 변형된 3' ITR 서열(여기서, 3' ITR 서열은 5' ITR 서열에 대칭임). 일부 실시형태에 따르면, ITR이 플랭킹된 발현 카세트는 외인성 서열을 도입하기 위한 클로닝 부위를 포함한다. 발현 카세트는 AAV 게놈의 rep 및 cap 코딩 영역을 대체한다.
일부 양태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 돌연변이되거나 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 "ceDNA-플라스미드"로 본원에 지칭되는 플라스미드로부터 수득되며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다. 대안적인 실시형태에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') 변형되거나 돌연변이된 AAV ITR, 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' ITR과 3' ITR은 서로 대칭이다. 대안적인 실시형태에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') 변형되거나 돌연변이된 AAV ITR, 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') 돌연변이되거나 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' 변형된 ITR과 3' 변형된 ITR은 동일한 변형을 갖는다(즉, 이들은 서로에 대해 역 보체 또는 대칭임).
추가의 실시형태에서, ceDNA-플라스미드 시스템에는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다(즉, AAV 캡시드 유전자뿐 아니라 다른 바이러스의 캡시드 유전자가 없음). 또한, 특정 실시형태에서, ceDNA-플라스미드에는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 없다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, ceDNA-플라스미드에는 AAV2에 대한 기능성 AAV cap 및 AAV rep 유전자 GG-3', 및 헤어핀 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열이 없다.
본 개시내용의 ceDNA-플라스미드는 당업계에 널리 알려진 임의의 AAV 혈청형의 게놈의 천연 핵산 서열을 사용하여 생성될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈에서 유도된다. 예를 들어, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; Kotin and Smith, The Springer Index of Viruses(Springer가 유지 관리하는 URL에서 이용 가능함)(www 웹 주소: oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.)(참고: URL 또는 데이터베이스에 대한 참조는 현재 본 출원의 유효 출원일자의 URL 또는 데이터베이스의 내용을 나타냄). 특정 실시형태에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV2 게놈에서 유도된다. 또 다른 특정 실시형태에서, ceDNA-플라스미드 백본은 이러한 AAV 게놈 중 하나에서 유도된 5' ITR과 3' ITR을 포함하도록 유전자 조작된 합성 백본이다.
ceDNA-플라스미드는 선택적으로 ceDNA 벡터 생산 세포주의 확립에 사용하기 위한 선별 가능한 또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 선별 마커는 3' ITR 서열의 다운스트림(즉, 3')에 삽입될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 선별 마커는 5' ITR 서열의 업스트림(즉, 5')에 삽입될 수 있다. 적절한 선별 마커에는, 예를 들어 약물 내성을 부여하는 것들이 포함된다. 선별 마커, 예를 들어 블라스티시딘(blasticidin) S 내성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 게네티신(geneticin) 등일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 약물 선별 마커는 블라스티시딘 S 내성 유전자이다.
항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 예시적인 ceDNA(예를 들어, rAAV0) 벡터는 rAAV 플라스미드에서 생산된다. rAAV 벡터의 생산 방법은 (a) 상기 기재된 바와 같은 rAAV 플라스미드를 갖는 숙주세포를 제공하는 단계로서, 여기서 숙주세포와 플라스미드에는 모두 캡시드 단백질 인코딩 유전자가 없는 단계, (b) ceDNA 게놈의 생성을 가능하게 하는 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계, 및 (c) 세포를 수거하고 상기 세포로부터 생산된 AAV 게놈을 단리하는 단계를 포함할 수 있다.
C. ceDNA 플라스미드로부터 ceDNA 벡터를 제조하는 예시적인 방법
항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 캡시드 미함유 ceDNA 벡터를 제조하는 방법, 특히 생체내 실험에 충분한 벡터를 충분히 고수율로 제공하는 방법이 또한 본원에 제공된다.
일부 실시형태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산 방법은 (1) 발현 카세트와 2개의 대칭인 ITR 서열을 포함하는 핵산 작제물을 숙주세포(예를 들어, Sf9 세포)에 도입하는 단계, (2) 선택적으로, 예를 들어 플라스미드 상에 존재하는 선별 마커를 사용하여 클론 세포주를 확립하는 단계, (3) Rep 코딩 유전자를 (상기 유전자를 운반하는 바큘로바이러스로 트랜스펙션 또는 감염시켜) 상기 곤충 세포에 도입하는 단계, 및 (4) 세포를 수거하고 ceDNA 벡터를 정제하는 단계를 포함한다. ceDNA 벡터의 생산을 위한, 상기 기재된 발현 카세트와 2개의 ITR 서열을 포함하는 핵산 작제물은, ceDNA 플라스미드, 또는 하기 기재되는 바와 같이 ceDNA 플라스미드를 이용하여 생성된 박미드 또는 바큘로바이러스의 형태일 수 있다. 핵산 작제물은 트랜스펙션, 바이러스 형질도입, 안정적인 통합 또는 당업계에 알려진 다른 방법에 의해 숙주세포에 도입될 수 있다.
D. 세포주
항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산에 사용되는 숙주 세포주는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(예컨대, Sf9, Sf21) 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포에서 유도된 곤충 세포주, 또는 다른 무척추동물, 척추동물 또는 다른 진핵생물 세포주(포유류 세포 포함)를 포함할 수 있다. HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, 단핵구 및 성숙 및 미성숙 수지상세포와 같은 당업자에게 알려진 다른 세포주가 또한 사용될 수 있다. 숙주 세포주는 고수율 ceDNA 벡터 생산을 위한 ceDNA-플라스미드의 안정적인 발현을 위해 트랜스펙션될 수 있다.
ceDNA-플라스미드는 당업계에 알려진 시약(예를 들어, 리포좀, 인산칼슘) 또는 물리적 수단(예를 들어, 전기천공)을 사용하여 일시적 트랜스펙션에 의해 Sf9 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, ceDNA-플라스미드를 게놈에 안정적으로 통합시킨 안정적인 Sf9 세포주가 확립될 수 있다. 이러한 안정적인 세포주는 선별 마커를 상기 기재된 바와 같은 ceDNA-플라스미드에 혼입시키는 방식으로 확립될 수 있다. 세포주를 트랜스펙션시키는 데 사용되는 ceDNA-플라스미드가 항생제와 같은 선별 마커를 포함하는 경우, ceDNA 플라스미드로 트랜스펙션되고 ceDNA-플라스미드 DNA를 게놈에 통합된 세포는 세포 성장 배지에 항생제를 첨가하여 선별할 수 있다. 이어서, 세포의 내성 클론을 단일 세포 희석 또는 집락 전달 기술로 단리하고, 증식시킬 수 있다.
E. ceDNA 벡터의 단리 및 정제
ceDNA 벡터를 수득하고 단리하는 공정의 예는, 도 4a 내지 도 4e, 및 하기 특정예에 기재되어 있다. 본원에 개시된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 또는 ceDNA-바큘로바이러스로 추가로 형질전환된, AAV Rep 단백질(들)을 발현하는 생산 세포로부터 수득될 수 있다. ceDNA 벡터의 생산에 유용한 플라스미드에는, 항체 및 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 플라스미드, 또는 하나 이상의 REP 단백질을 인코딩하는 플라스미드가 포함된다.
일부 양태에 따르면, 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드(Rep-플라스미드), 박미드(Rep-박미드) 또는 바큘로바이러스(Rep-바큘로바이러스)에서 생산 세포에 전달된 AAV Rep 단백질(Rep 78 또는 68)을 인코딩한다. Rep-플라스미드, Rep-박미드 및 Rep-바큘로바이러스는 상기 기재된 방법에 의해 생성될 수 있다.
항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 생산 방법은 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 생성하는 데 사용되는 발현 작제물은 플라스미드(예를 들어, ceDNA-플라스미드), 박미드(예를 들어, ceDNA-박미드) 및/또는 바큘로바이러스(예를 들어, ceDNA-바큘로바이러스)일 수 있다. 단지 예시로서, ceDNA-벡터는 ceDNA-바큘로바이러스 및 Rep-바큘로바이러스로 동시 감염된 세포에서 생성될 수 있다. Rep-바큘로바이러스에서 생성된 Rep 단백질은 ceDNA-바큘로바이러스를 복제하여 ceDNA-벡터를 생성할 수 있다. 대안적으로, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 Rep-플라스미드, Rep-박미드 또는 Rep-바큘로바이러스에 전달된 AAV Rep 단백질(Rep78/52)을 인코딩하는 서열을 포함하는 작제물로 안정적으로 트랜스펙션된 세포에서 생성될 수 있다. ceDNA-바큘로바이러스를 세포에 일시적으로 트랜스펙션시키고, Rep 단백질을 통해 복제하여, ceDNA 벡터를 생산할 수 있다.
박미드(예를 들어, ceDNA-박미드)를 Sf9, Sf21, Tni(트리코플루시아 니) 세포, High Five 세포와 같은 허용 곤충 세포에 트랜스펙션시켜, 대칭인 ITR과 발현 카세트를 포함하는 서열을 포함하는 재조합 바큘로바이러스인 ceDNA-바큘로바이러스를 생성할 수 있다. ceDNA-바큘로바이러스를 다시 곤충 세포에 감염시켜, 차세대 재조합 바큘로바이러스를 수득할 수 있다. 선택적으로, 상기 단계를 1회 또는 다회 반복하여 재조합 바큘로바이러스를 보다 많은 양으로 생산할 수 있다.
상기 세포에서 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 수거하고 수집하는 시간은, ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하기 위해 선택되고 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존능, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 통상적으로, 세포는 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 벡터)를 생산하기 위한 바큘로바이러스 감염 후 충분한 시간 후에, 하지만 바이러스 독성으로 인해 세포의 대부분이 사멸되기 시작하기 전에 수거될 수 있다. ceDNA-벡터는 Qiagen ENDO-FREE PLASMID® 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 Sf9 세포에서 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법이 또한 ceDNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 업계에 알려진 핵산 정제 방법뿐 아니라, 상업적으로 입수 가능한 DNA 추출 키트가 채택될 수 있다.
대안적으로, 정제는 세포 펠릿을 알칼리성 용해 과정에 적용하고, 생성된 용해물을 원심분리하고, 크로마토그래피 분리를 수행하는 방식으로 구현될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 상기 공정은 핵산을 보유하는 이온 교환 컬럼(예를 들어, SARTOBIND Q®) 상에 상청액을 로딩한 후, 용리(예를 들어, 1.2 M NaCl 용액을 이용하여)하고, 겔 여과 컬럼(예를 들어, 6 fast flow GE) 상에서 추가로 크로마토그래피 정제를 수행하는 방식으로 수행될 수 있다. 이어서, 캡시드 미함유 AAV 벡터를, 예를 들어 침전으로 회수한다.
일부 실시형태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 또한 엑소좀 또는 미세입자 형태로 정제될 수 있다. 다수의 세포 유형이 막 미세소포 배출을 통해 가용성 단백질뿐 아니라, 복합 단백질/핵산 카고를 방출하는 것으로 당업계에 알려져 있다(Cocucci 등 (2009); EP 10306226.1). 이러한 소포에는 미세소포(미세입자로도 지칭됨) 및 엑소좀(나노소포로도 지칭됨)이 포함되며, 이 둘 모두 카고로서 단백질과 RNA를 포함한다. 미세소포는 원형질막의 직접 버딩(budding)으로부터 생성되고, 엑소좀은 다소포성 엔도솜과 원형질막의 융합 시 세포외 환경으로 방출된다. 따라서, ceDNA 벡터 함유 미세소포 및/또는 엑소좀은 ceDNA-플라스미드, 또는 ceDNA-플라스미드를 이용하여 생성된 박미드 또는 바큘로바이러스로 형질도입된 세포에서 단리될 수 있다.
배양 배지를 여과 또는 20,000 x g로 초원심분리에 적용하여 미세소포를 단리하고, 100,000 x g로 초원심분리하여 엑소좀을 단리할 수 있다. 초원심분리의 최적 기간은 실험적으로 결정될 수 있고, 소포가 단리되는 특정 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 배양 배지를 먼저 저속 원심분리(예를 들어, 2000 x g로 5분 내지 20분 동안)로 정제하고, 예를 들어 AMICON® 스핀 컬럼(Millipore, Watford, UK)을 사용하여 스핀 농축에 적용한다. 미세소포와 엑소좀은 미세소포와 엑소좀 상에 존재하는 특정 표면 항원을 인식하는 특정 항체를 사용하여 FACS 또는 MACS를 통해 추가로 정제될 수 있다. 다른 미세소포 및 엑소좀 정제 방법에는, 비제한적으로, 면역침강, 친화성 크로마토그래피, 여과, 및 특정 항체 또는 압타머가 코팅된 자성 비드가 포함된다. 정제 시, 소포를, 예를 들어 인산염 완충 식염수로 세척한다. ceDNA 함유 소포를 전달하는 데 미세소포 또는 엑소좀을 사용하는 하나의 이점은, 이러한 소포가 각각의 세포 유형에 대한 특정 수용체에 의해 인식되는 막 단백질을 포함하기 때문에 다양한 세포 유형에 대해 표적화될 수 있다는 점이다. (또한 EP 10306226 참조)
본원의 개시내용의 또 다른 양태는, ceDNA 작제물이 그 자체의 게놈에 안정적으로 통합된 숙주 세포주로부터 ceDNA 벡터를 정제하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 또 다른 실시형태에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 미세입자로 정제된다.
국제 특허출원 PCT/US18/49996의 도 5는, 실시예에 기재된 방법을 사용하여 다수의 ceDNA-플라스미드 작제물로부터 ceDNA의 생산을 확인시켜 주는 겔을 보여준다. ceDNA는, 실시예에서 도 4d에 대해 논의된 바와 같이, 겔에서의 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다.
VI. 약제학적 조성물
또 다른 양태에서, 약제학적 조성물이 제공된다. 약제학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터와, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.
본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 대상의 세포, 조직 또는 기관으로의 생체내 전달을 위해 대상에게의 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약제학적 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
본원에 개시된 약제학적 제형에는 액체, 예를 들어 바로 투여될 수 있는 수용액과, 투여 전 희석제를 첨가하여 용액으로 재구성될 수 있는 동결건조된 분말이 포함된다. 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 포함하는 제형은, 적어도 하나의 추가 치료제의 존재 유무 하에, 적절한 부형제를 사용하여 동결건조물로 제형화될 수 있다. 동결건조는 상업적으로 입수 가능한 동결건조기(예를 들어, VirTis Lab Scale Lyophilizer)에서 일반 동결건조 주기를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 치료용 투여(예를 들어, 비경구 투여)의 목적하는 경로에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 전달이 또한 고려된다. 치료 목적의 약제학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은, 필요한 경우 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 ceDNA 벡터 화합물을 혼입시켜 제조할 수 있고, 이어서 ceDNA 벡터를 포함하는 멸균 여과를 통해 핵산의 전이유전자를 수용체의 세포에 전달하도록 제형화하여, 그 안의 전이유전자 또는 공여체 서열의 치료적 발현을 유도할 수 있다. 상기 조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 약제학적 활성 조성물은 다양한 목적을 위한 전이유전자를 세포, 예를 들어 대상의 세포에 전달하도록 제형화될 수 있다.
치료 목적을 위한 약제학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균성이고 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은, 필요한 경우 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 ceDNA 벡터 화합물을 혼입시킨 후, 여과 멸균하는 방식으로 제조될 수 있다.
특정 실시형태에서, 비경구 투여용 제형은 동결건조된 형태 또는 용액으로 저장될 수 있다. 특정 실시형태에서, 비경구 제형은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘을 통해 관통 가능한 마개가 있는 바이알에 배치된다.
특정 실시형태에서, 약제학적 제형이 제형화되면, 이는 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체, 또는 수화되거나 동결건조된 분말로 멸균 바이알에 저장될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 제형은 즉시 사용 가능한 형태, 또는 투여 전 재구성되는 형태(예를 들어, 동결건조된 형태)로 저장될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 국소, 전신, 양막내, 경막내, 두개내, 동맥내, 정맥내, 림프내, 복강내, 피하, 기관, 조직내(예를 들어, 근육내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 경막내, 방광내, 결막(예를 들어, 안와외, 안와내, 안와후방, 망막내, 망막하, 맥락막, 맥락막하, 간질내, 전방내 및 유리체내), 달팽이관내 및 점막(예를 들어, 구강, 설하, 비강) 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 전달이 또한 고려된다.
일부 양태에 따르면, 본원에 제공된 방법은 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 하나 이상의 ceDNA 벡터를 숙주세포에 전달하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법에 의해 생산된 세포, 및 이러한 세포로부터 생산되거나 이러한 세포를 포함하는 유기체(예컨대, 동물, 식물 또는 진균)가 본원에 제공된다. 핵산의 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주사, 유전자총, 리포좀, 면역리포좀(immunoliposome), 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 및 DNA의 작용제 증강된 흡수를 포함할 수 있다. 리포펙션은, 예를 들어 미국 특허 제5,049,386호, 제4,946,787호 및 제4,897,355호에 기재되어 있으며, 리포펙션 시약은 상업적으로 시판되고 있다(예를 들어, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 전달은 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직(예를 들어, 생체내 투여)으로 이루어질 수 있다.
핵산을 세포에 전달하는 다양한 기술 및 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA와 같은 핵산은 지질 나노입자(LNP), 리피도이드, 리포좀, 지질 나노입자, 리포플렉스 또는 코어-쉘 나노입자로 제형화될 수 있다. 전형적으로, LNP는 핵산(예를 들어, ceDNA) 분자, 하나 이상의 이온화 가능하거나 양이온성인 지질(또는 이의 염), 하나 이상의 비이온성 또는 중성 지질(예를 들어, 인지질), 응집을 방지하는 분자(예를 들어, PEG 또는 PEG-지질 접합체), 및 선택적으로 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)로 구성된다.
항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA와 같은 핵산을 세포에 전달하는 또 다른 방법은, 핵산을 세포에 의해 내재화된 리간드와 접합시키는 것이다. 예를 들어, 리간드는 세포 표면 상의 수용체에 결합하여 세포내이입을 통해 내재화될 수 있다. 리간드는 핵산의 뉴클레오타이드에 공유결합으로 연결될 수 있다. 핵산을 세포에 전달하기 위한 예시적인 접합체는, 예를 들어 WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 및 WO2017/177326에 기재되어 있다.
항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터와 같은 핵산은 또한 트랜스펙션에 의해 세포에 전달될 수 있다. 유용한 트랜스펙션 방법에는, 비제한적으로, 지질 매개 트랜스펙션, 양이온성 중합체 매개 트랜스펙션 또는 인산칼슘 침전이 포함된다. 트랜스펙션 시약은 당업계에 널리 알려져 있으며, 이에는, 비제한적으로, TurboFect 트랜스펙션 시약(Thermo Fisher Scientific), Pro-Ject 시약(Thermo Fisher Scientific), TRANSPASS™ P 단백질 트랜스펙션 시약(New England Biolabs), CHARIOT™ 단백질 전달 시약(Active Motif), PROTEOJUICE™ 단백질 트랜스펙션 시약(EMD Millipore), 293fectin, LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTAMINE™ 3000(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTAMINE™(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTIN™(Thermo Fisher Scientific), DMRIE-C, CELLFECTIN™(Thermo Fisher Scientific), OLIGOFECTAMINE™(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FUGENE™(Roche, Basel, Switzerland), FUGENE™ HD(Roche), TRANSFECTAM™(Transfectam, Promega, Madison, Wis.), TFX-10™(Promega), TFX-20™(Promega), TFX-50™(Promega), TRANSFECTIN™(BioRad, Hercules, Calif.), SILENTFECT™(Bio-Rad), Effectene™(Qiagen, Valencia, Calif.), DC-chol(Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™(Gene Therapy Systems, San Diego, Calif.), DHARMAFECT 1™(Dharmacon, Lafayette, Colo.), DHARMAFECT 2™(Dharmacon), DHARMAFECT 3™(Dharmacon), DHARMAFECT 4™(Dharmacon), ESCORT™ III(Sigma, St. Louis, Mo.) 및 ESCORT™ IV(Sigma Chemical Co.)가 포함된다. ceDNA와 같은 핵산은, 또한 당업자에게 알려진 미세유체 방법을 통해 세포에 전달될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 또한 생체내 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 투여는 분자를 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적 접촉에 도입하는 데 통상적으로 사용되는 임의의 경로를 통해 이루어지며, 이에는, 비제한적으로, 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공이 포함된다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용 가능하고 당업자에 널리 알려져 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
본 개시내용에 따른 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 대상의 세포 또는 표적 기관으로의 전달을 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포좀은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료제 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약제학 성분(API)을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다. 예시적인 리포좀 및 리포좀 제형(비제한적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관능기 함유 화합물을 포함함)은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/050042 및 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/064242(예를 들어, "약제학적 제형"이라는 제목의 섹션 참조)에 개시되어 있다.
당업계에 알려진 다양한 전달 방법 또는 이의 변형을 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 ceDNA 벡터를 전달할 수 있다. 예를 들어, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 표적화된 세포로의 DNA 유입이 용이하도록 기계적, 전기적, 초음파, 유체역학적 또는 레이저 기반 에너지에 의해 세포막에 일시적으로 침투하는 방식으로 전달된다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 세포막을 일시적으로 파괴하거나, 크기 제한 채널을 통해 세포를 밀어넣거나, 또는 당업계에 알려진 다른 수단에 의해 전달될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터만 네이키드 DNA로서 폐, 간, 신장, 담낭, 전립선, 부신, 심장, 장, 위, 피부, 흉선, 심장근 또는 골격근에서 선택되는 임의의 하나 이상의 조직에 직접 주사된다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 유전자 총에 의해 전달된다. 캡시드 미함유 AAV 벡터로 코팅된 금 또는 텅스텐 구형 입자(직경 1 μm 내지 3 μm)는 가압 가스에 의해 고속으로 가속화되어 표적 조직세포에 침투할 수 있다.
항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터와 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 구체적으로 본원에서 고려된다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 지질 전달 시스템, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 리포좀을 이용하여 제형화된다. 일부 실시형태에 따르면, 이러한 조성물은 숙련된 의사에 의해 임의의 목적하는 경로로 투여된다. 상기 조성물은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입, 협측 투여, 흉막내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내, 경막내 및 관절내, 또는 이들의 조합을 포함하는 상이한 경로로 대상에게 투여될 수 있다. 수의학적 사용을 위해, 상기 조성물은 통상의 수의학적 관행에 따라 적합하게 허용 가능한 제형으로 투여될 수 있다. 수의사는 특정 동물에 가장 적절한 투여 방식 및 투여 경로를 용이하게 결정할 수 있다. 상기 조성물은 전형적인 시린지, 무바늘 주사 장치, "미세사출법(microprojectile bombardment) 유전자 총", 또는 전기천공("EP"), 유체역학적 방법 또는 초음파와 같은 다른 물리적 방법에 의해 투여될 수 있다.
일부 경우에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 유체역학적 주사에 의해 전달되는데, 이는 임의의 수용성 화합물 및 입자를 사지 전체의 내부 기관 및 골격근에 직접 세포내 전달하기 위한 간단하고 고도로 효율적인 방법이다.
일부 실시형태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 DNA 입자의 내부 기관 또는 종양 세포로의 세포내 전달을 용이하게 하기 위해 막 내에 나노범위 공극을 만들어 초음파를 통해 전달되므로, 플라스미드 DNA의 크기 및 농도는 상기 시스템의 효율에 큰 역할을 한다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 핵산을 함유하는 입자를 표적세포 내로 농축시키기 위해 자기장을 사용하는 자기주입법(magnetofection)을 통해 전달된다.
일부 실시형태에 따르면, 양이온성 리포좀/미셀 또는 양이온성 중합체에 속하는 다가양이온성 나노머 입자에 의한 음으로 하전된 핵산의 압축을 포함하는, 예를 들어 나노머 복합체를 사용하는 화학적 전달 시스템이 사용될 수 있다. 전달 방법에 사용되는 양이온성 지질에는, 비제한적으로, 1가 양이온성 지질, 다가 양이온성 지질, 구아닌 함유 화합물, 콜레스테롤 유도체 화합물, 양이온성 중합체(예를 들어, 폴리(에틸렌이민), 폴리-L-리신, 프로타민, 다른 양이온성 중합체) 및 지질-중합체 하이브리드가 포함된다.
A. 엑소좀:
일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 엑소좀에 패키징되는 방식으로 전달된다. 엑소좀은 다소포체와 원형질막의 융합 후 세포외 환경으로 방출되는 세포내이입 기원의 작은 막 소포이다. 이의 표면은 공여체 세포의 세포막 유래의 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 엑소좀을 생산한 세포의 세포질을 함유하고, 표면에 모세포(parental cell)의 막 단백질을 나타낸다. 엑소좀은 상피세포, B 및 T 림프구, 비만세포(MC)뿐 아니라, 수지상세포(DC)를 포함하는 다양한 세포 유형에 의해 생성된다. 일부 실시형태에 따르면, 직경이 10 nm 내지 1 μm, 20 nm 내지 500 nm, 30 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 100 nm인 엑소좀이 사용을 위해 고려된다. 엑소좀은 이의 공여체 세포를 사용하거나 특정 핵산을 도입하는 방식으로 표적세포로의 전달을 위해 단리될 수 있다. 당업계에 알려진 다양한 접근법을 사용하여 본 개시내용의 캡시드 미함유 AAV 벡터를 함유하는 엑소좀을 생산할 수 있다.
B. 미세입자/나노입자
일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 지질 나노입자를 통해 전달된다. 일반적으로, 지질 나노입자는, 예를 들어 문헌[Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507]에 개시된 바와 같은, 이온화 가능한 아미노 지질(예를 들어, 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트, DLin-MC3-DMA, 포스파티딜콜린(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DSPC), 콜레스테롤 및 코트 지질(폴리에틸렌 글리콜-디미리스톨글리세롤, PEG-DMG)을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자의 평균 직경은 약 10 nm 내지 약 1000 nm이다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자의 평균 직경은 300 nm 미만이다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자의 평균 직경은 약 10 nm 내지 약 300 nm이다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자의 평균 직경은 200 nm 미만이다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자의 직경은 약 25 nm 내지 약 200 nm이다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자 제제(예를 들어, 복수의 지질 나노입자를 포함하는 조성물)는, 평균 크기(예를 들어, 직경)가 약 70 nm 내지 약 200 nm이고, 전형적으로 평균 크기가 약 100 nm 이하인 크기 분포를 갖는다.
당업계에 알려진 다양한 지질 나노입자를 사용하여 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 전달할 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자를 사용하는 다양한 전달 방법은 미국 특허 제9,404,127호, 제9,006,417호 및 제9,518,272호에 기재되어 있다.
C. 접합체
일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 세포 흡수를 증가시키는 작용제에 접합된다(예를 들어, 공유결합으로 결합됨). "세포 흡수를 증가시키는 작용제"는 지질 막을 통한 핵산의 수송을 용이하게 하는 분자이다. 예를 들어, 핵산은 친유성 화합물(예를 들어, 콜레스테롤, 토코페롤 등), 세포 침투 펩타이드(CPP)(예를 들어, 페네트라틴(penetratin), TAT, Syn1B 등) 및 폴리아민(예를 들어, 스페르민(spermine))에 접합될 수 있다. 세포 흡수를 증가시키는 작용제의 추가 예는, 예를 들어 문헌[Winkler (2013). Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809]에 개시되어 있다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 중합체(예를 들어, 중합체 분자) 또는 폴레이트 분자(예를 들어, 엽산 분자)에 접합된다. 일반적으로, 중합체에 접합된 핵산의 전달은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 WO2000/34343 및 WO2008/022309에 기재되어 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 미국 특허 제8,987,377호에 기재된 바와 같이 폴리(아미드) 중합체에 접합된다. 일부 실시형태에 따르면, 본 개시내용에 기재된 핵산은 미국 특허 제8,507,455호에 기재된 바와 같이 엽산 분자에 접합된다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어 미국 특허 제8,450,467호 기재된 바와 같이 탄수화물에 접합된다.
D. 나노캡슐
대안적으로, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 나노캡슐 제형이 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정적이고 재현 가능한 방식으로 물질을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 회피하기 위해, 이러한 초미세 입자(크기 약 0.1 μm)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이러한 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 사용을 위해 고려된다.
E. 리포좀
본 개시내용에 따른 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 대상의 세포 또는 표적 기관으로의 전달을 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포좀은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료제 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약제학 성분(API)을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다.
리포좀의 형성 및 사용은 일반적으로 당업자에게 알려져 있다. 리포좀은 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 갖도록 개발되었다(미국 특허 제5,741,516호). 나아가, 잠재적인 약물 담체로서의 리포좀 및 리포좀 유사 제제의 다양한 방법이 기재되어 있다(미국 특허 제5,567,434호; 제5,552,157호; 제5,565,213호; 제5,738,868호 및 제5,795,587호).
F. 예시적인 리포좀 및 지질 나노입자(LNP) 조성물
본 개시내용에 따른 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 세포, 예를 들어 전이유전자의 발현을 필요로 하는 세포로의 전달을 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포좀은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료제 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약제학 성분(API)을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다.
ceDNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)는 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/050042 및 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/064242(이들은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)에 개시되어 있으며, 이는 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 위한 방법 및 조성물에의 사용을 위해 고려된다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 면역원성/항원성을 감소시키고, 화합물(들)에 친수성 및 소수성을 제공하고, 투여 빈도를 감소시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관능기를 갖는 하나 이상의 화합물(소위 "PEG화 화합물")을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 또는, 리포좀 제형은 단순히 추가 구성요소로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 포함한다. 이러한 양태에서, PEG 또는 PEG 관능기의 분자량은 62 Da 내지 약 5,000 Da일 수 있다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 수시간 내지 수주의 기간에 걸쳐 연장 방출 또는 제어 방출 프로파일로 API를 전달하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 관련 양태에 따르면, 리포좀 제형은 지질 이중층에 의해 결합된 수성 챔버를 포함할 수 있다. 다른 관련 양태에서, 리포좀 제형은 수시간 내지 수주의 기간에 걸쳐 API를 방출하는 승온에서 물리적 전이를 거치는 구성요소로 API를 캡슐화한다.
일부 양태에 따르면, 리포좀 제형은 스핑고미엘린과, 본원에 개시된 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 양태에 따르면, 리포좀 제형은 옵티좀(optisome)을 포함한다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 소듐 염, (디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합된 지질, HSPC(수소첨가된 대두 포스파티딜콜린); PEG(폴리에틸렌 글리콜); DSPE(디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민); DSPC(디스테아로일포스파티딜콜린); DOPC(디올레오일포스파티딜콜린); DPPG(디팔미토일포스파티딜글리세롤); EPC(달걀 포스파티딜콜린); DOPS(디올레오일포스파티딜세린); POPC(팔미토일올레오일포스파티딜콜린); SM(스핑고미엘린); MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜); DMPC(디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG(디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DSPG(디스테아로일포스파티딜글리세롤); DEPC(디에루코일포스파티딜콜린); DOPE(디올레오일-sn-글리세로-포스포에탄올아민); 콜레스테릴 설페이트(CS); 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG); DOPC(디올레오일-sn-글리세로-포스파티딜콜린) 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 56:38:5의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에 따르면, 리포좀 제형의 전체 지질 함량은 2 mg/mL 내지 16 mg/mL이다. 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질 및 PEG화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질 및 PEG화 지질을, 각각, 3:0.015:2의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질과 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에 따르면, PEG화 지질은 PEG-2000-DSPE이다. 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 DPPG, 대두 PC, MPEG-DSPE 지질 접합체 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 하나 이상의 지질과 에탄올아민 관능기를 함유하는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질, 및 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤 중 하나 이상을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에 따르면, 리포좀 제형은 DOPC/DEPC; 및 DOPE를 포함한다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 하나 이상의 약제학적 부형제, 예를 들어 수크로오스 및/또는 글리신을 추가로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 단일라멜라 또는 다중라멜라 구조의 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 다소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 통상의 나노입자에 비해 크기가 크고, 크기가 약 150 nm 내지 250 nm인 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에 따르면, 리포좀 제형은 동결건조된 분말이다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 리포좀 외부에 단리된 ceDNA를 갖는 혼합물에 약염기를 첨가하는 방식으로, 본원에 개시되거나 기재된 ceDNA 벡터로 제조되고 로딩되는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 첨가는 리포좀 외부의 pH를 대략 7.3으로 증가시키고, API를 리포좀으로 유도한다. 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 리포좀 내부에서 산성인 pH를 갖는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 리포좀의 내부는 pH 4 내지 6.9, 더욱 바람직하게는 pH 6.5일 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 리포좀내 약물 안정화 기술을 사용하여 제조된 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 중합체성 또는 비중합체성의 고도로 하전된 음이온과, 리포좀내 포획제, 예를 들어 폴리포스페이트 또는 수크로오스 옥타설페이트가 이용된다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 ceDNA와 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다. 예를 들어, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/050042(이는 본원에 참조로 인용됨)에 기재된 바와 같은 방법으로 수득된 ceDNA로 제조되고 로딩되는 지질 나노입자 제형. 이는, 이온화 가능한 지질을 양성자화하고 ceDNA/지질 회합 및 입자의 핵형성에 유리한 에너지를 제공하는, 낮은 pH에서의 에탄올성 지질과 수성 ceDNA의 고에너지 혼합에 의해 달성될 수 있다. 상기 입자는 수성 희석 및 유기 용매의 제거를 통해 추가로 안정화될 수 있다. 상기 입자는 목적하는 수준으로 농축될 수 있다.
일반적으로, 지질 나노입자는 약 10:1 내지 60:1의 총 지질 대 ceDNA의 (질량 또는 중량) 비로 제조된다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 대 ceDNA 비(질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 60:1, 약 1:1 내지 약 55:1, 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 45:1, 약 1:1 내지 약 40:1, 약 1:1 내지 약 35:1, 약 1:1 내지 약 30:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 약 6:1 내지 약 9:1; 약 30:1 내지 약 60:1 범위일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 약 60:1의 ceDNA 대 총 지질의 (질량 또는 중량) 비로 제조된다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 입자는 약 10:1 내지 30:1의 총 지질 대 ceDNA의 (질량 또는 중량) 비로 제조된다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 대 ceDNA 비(질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 수 있다. 지질과 ceDNA의 양은 목적하는 N/P 비, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 N/P 비를 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 지질 입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL 범위일 수 있다.
이온화 가능한 지질은 전형적으로 낮은 pH에서 핵산 카고, 예를 들어 ceDNA를 응축시키고, 막 회합과 융합원성(fusogenicity)을 유도하는 데 이용된다. 일반적으로, 이온화 가능한 지질은 산성 조건 하에서, 예를 들어 6.5 이하의 pH에서 양으로 하전되거나 양성자화되는 적어도 하나의 아미노기를 포함하는 지질이다. 이온화 가능한 지질은 또한 본원에서 양이온성 지질로 지칭된다.
예시적인 이온화 가능한 지질은 국제 PCT 특허출원 공개공보 WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346 및 WO2013/086354, 및 미국 특허출원 공개공보 US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458 및 US2013/0195920에 기재되어 있으며, 모든 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에 따르면, 이온화 가능한 지질은 하기 구조를 갖는 MC3, 즉 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다:
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지질 DLin-MC3-DMA는 문헌[Jayaraman et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533]에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에 따르면, 이온화 가능한 지질은 WO2015/074085에 기재된 바와 같은 지질 ATX-002이며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에 따르면, 이온화 가능한 지질은 WO2012/040184에 기재된 바와 같은 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)이며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에 따르면, 이온화 가능한 지질은 WO2015/199952에 기재된 바와 같은 화합물 6 또는 화합물 22이며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
비제한적으로, 이온화 가능한 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20% 내지 90%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 이온화 가능한 지질 몰 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20% 내지 70%(몰), 30% 내지 60%(몰) 또는 40% 내지 50%(몰)일 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 이온화 가능한 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol% 내지 약 90 mol%를 차지한다.
일부 양태에 따르면, 지질 나노입자는 비양이온성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 비이온성 지질에는, 양친매성 지질, 중성 지질 및 음이온성 지질이 포함된다. 따라서, 비양이온성 지질은 중성의 하전되지 않은 지질, 쯔비터이온성(zwitterionic) 지질 또는 음이온성 지질일 수 있다. 비양이온성 지질은 전형적으로 융합원성을 증강시키는 데 이용된다.
본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에 사용하기 위해 고려되는 예시적인 비양이온성 지질은 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/050042 및 2018년 12월 6일자 출원된 PCT/US2018/064242에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 예시적인 비양이온성 지질은 국제 특허출원 공개공보 WO2017/099823 및 미국 특허출원 공개공보 US2018/0028664에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
비양이온성 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0 내지 30%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 비양이온성 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 5% 내지 20%(몰) 또는 10% 내지 15%(몰)이다. 다양한 실시형태에서, 이온화 가능한 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1 범위이다.
일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자는 임의의 인지질을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자는 막 온전성을 제공하기 위해 스테롤과 같은 구성요소를 추가로 포함할 수 있다.
지질 나노입자에 사용될 수 있는 하나의 예시적인 스테롤은 콜레스테롤 및 이의 유도체이다. 예시적인 콜레스테롤 유도체는 국제 특허출원 WO2009/127060 및 미국 특허출원 공개공보 US2010/0130588에 기재되어 있으며, 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
스테롤과 같은 막 온전성을 제공하는 구성요소는, 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0 내지 50%(몰)를 차지할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 이러한 구성요소는 지질 나노입자의 총 지질 함량의 20% 내지 50%(몰) 또는 30% 내지 40%(몰)이다.
일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 접합된 지질 분자를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들은 지질 나노입자의 응집을 저해하고/하거나 입체 안정화를 제공하기 위해 사용된다. 예시적인 접합된 지질에는, 비제한적으로, PEG-지질 접합체, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체), 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 실시형태에 따르면, 접합된 지질 분자는 PEG-지질 접합체, 예를 들어 (메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합된 지질이다. 예시적인 PEG-지질 접합체에는, 비제한적으로, PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대, 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), peg화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), PEG 석시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대, 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카르밤, N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 소듐 염, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 추가의 예시적인 PEG-지질 접합체는, 예를 들어 US5,885,613, US6,287,591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224 및 US2017/0119904에 기재되어 있으며, 모든 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에 따르면, PEG-지질은 US2018/0028664에 정의된 바와 같은 화합물이며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 일부 실시형태에 따르면, PEG-지질은 US20150376115 또는US2016/0376224에 개시되어 있으며, 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
PEG-DAA 접합체는, 예를 들어 PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필일 수 있다. PEG-지질은 PEG-DMG, PEG-디라우릴글리세롤, PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테릴글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글리카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르) 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 중 하나 이상일 수 있다. 일부 예에 따르면, PEG-지질은 PEG-DMG, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]로 이루어지는 군에서 선택된다.
PEG 이외의 분자와 접합된 지질이 또한 PEG-지질 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체) 및 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체가 PEG-지질 대신 또는 이에 더하여 사용될 수 있다. 예시적인 접합된 지질, 즉, PEG-지질, (POZ)-지질 접합체, ATTA-지질 접합체 및 양이온성 중합체-지질은, 국제 특허출원 공개공보 WO1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104 및 WO2010/006282; 미국 특허출원 공개공보 US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587 및 US20110123453; 및 US 특허 US5,885,613, US6,287,591, US6,320,017 및 US6,586,559에 기재되어 있으며, 상기 모든 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 실시형태에 따르면, 하나 이상의 추가 화합물은 치료제일 수 있다. 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 다시 말해서, 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 다시 말해서, 치료제는 치료 목적 및 목적하는 생물학적 작용에 따라 선택될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 추가 화합물은 본원에 기재된 또 다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
일부 실시형태에 따르면, 추가 작용제는 항바이러스 약물 또는 백신이다. 일부 실시형태에 따르면, 추가 작용제는 항염증제, 항말라리아제, 및 CoV-S에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어지는 군에서 선택된다. 추가 실시형태에서, 항말라리아제는 클로로퀸(chloroquine) 또는 히드록시클로로퀸이다. 일부 실시형태에 따르면, 항염증제는, 예를 들어 사릴루맙(sarilumab), 토실리주맙(tocilizumab) 또는 김실루맙(gimsilumab)과 같은 항체이다.
일부 실시형태에 따르면, 추가 화합물은 면역자극제이다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 지질 나노입자 캡슐화된 곤충 세포에서 생산된 또는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터와, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 1종 이상의 약제학적 부형제를 추가로 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자 제형은 수크로오스, 트리스(tris), 트레할로오스 및/또는 글리신을 추가로 포함한다.
ceDNA 벡터는 입자의 지질 부분과 복합체화되거나, 지질 나노입자의 지질 위치에 캡슐화될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는 지질 나노입자의 지질 위치에서 완전히 캡슐화되어, 예를 들어 수용액에서 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자 내 ceDNA는 지질 나노입자를 37℃에서 적어도 약 20분, 30분, 45분 또는 60분 동안 뉴클레아제에 노출시킨 후 실질적으로 분해되지 않는다. 일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자 내 ceDNA는 상기 입자를 37℃에서 적어도 약 30분, 45분 또는 60분, 또는 적어도 약 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간 또는 36시간 동안 혈청에서 인큐베이션한 후 실질적으로 분해되지 않는다.
특정 실시형태에서, 지질 나노입자는 대상, 예를 들어 인간과 같은 포유동물에 실질적으로 비독성이다. 일부 양태에 따르면, 지질 나노입자 제형은 동결건조된 분말이다.
일부 실시형태에 따르면, 지질 나노입자는 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 고체 코어 입자이다. 다른 실시형태에서, 지질 나노입자는 비(non)이중층 구조, 즉, 비(non)라멜라(즉, 비이중층) 형태를 갖는다. 비제한적으로, 비이중층 형태는, 예를 들어 3차원 튜브, 막대, 입방 대칭 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자의 형태(라멜라 대 비라멜라)는, 예를 들어 US2010/0130588에 기재된 바와 같은 Cryo-TEM 분석을 사용하여 용이하게 평가되고 특징분석될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
일부 추가 실시형태에 따르면, 비라멜라 형태를 갖는 지질 나노입자는 전자 밀도가 높다. 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 단일라멜라 또는 다중라멜라 구조의 지질 나노입자를 제공한다. 일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 다소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.
지질 구성요소의 조성 및 농도를 제어하는 방식으로, 지질 접합체가 지질 입자로부터 교환되는 속도, 및 결국, 지질 나노입자가 융합원성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 또한, 예를 들어 pH, 온도 또는 이온 강도를 포함하는 다른 변수를 사용하여, 지질 나노입자가 융합원성이 되는 속도를 변화시키고/시키거나 제어할 수 있다. 지질 나노입자가 융합원성이 되는 속도를 제어하는 데 사용될 수 있는 다른 방법이, 본 개시내용을 기반으로 당업자에게 명백할 것이다. 지질 접합체의 조성 및 농도를 제어하여 지질 입자 크기를 제어할 수 있다는 것이 또한 명백할 것이다.
제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 유효성과 상관관계가 있을 수 있다(문헌[Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; 문헌[Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)] 참조, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 검정을 사용하여 지질 나노입자에서 결정될 수 있다.
VII. 치료 방법
본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 또한 관심 핵산 서열을 표적세포(예를 들어, 숙주세포)로 전달하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 특히 항체 및 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 대상의 세포에 전달하여 질환 또는 장애를 치료하는 방법일 수 있다.
본원에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편에 대한 표적(즉, 항원)은, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 진균 및 기생충 감염원을 포함하는 다양한 병원체에서 선택될 수 있다. 적합한 표적은 암 또는 암 관련 항원 등을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 표적은 류마티스 관절염(RA) 또는 다발성 경화증(MS)과 같은 자가면역 병태를 포함할 수 있다.
또한, 본 개시내용은 항체 및 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 대상의 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 항체 및 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 본 개시내용의 ceDNA 벡터의 다회 투여를 포함하는 방법을 제공한다. 본 개시내용의 ceDNA 벡터는 캡시드화된 바이러스 벡터에 대해 통상적으로 관찰되는 바와 같은 면역반응을 유도하지 않기 때문에, 이러한 다회 투여 전략은 ceDNA 기반 시스템에서 큰 성공을 거둘 가능성이 높다. ceDNA 벡터는 목적하는 조직의 세포를 트랜스펙션시키고, 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달, 및 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 제공하는 데 충분한 양으로 투여된다.
본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 전달은 발현된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 전달에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 통상적으로 생산된(예를 들어, 세포 기반 생산 방법(예를 들어, 곤충세포 생산 방법)을 사용하여) 또는 합성적으로 생산된 ceDNA 벡터는, 유전자 요법의 일부를 제공하기 위해 제공된 다른 전달 시스템과 함께 사용될 수 있다. 본 개시내용에 따른 ceDNA 벡터와 조합될 수 있는 시스템의 하나의 비제한적인 예에는, 항체 및 이의 항원 결합 단편을 발현하는 ceDNA 벡터의 효과적인 유전자 발현을 위한 하나 이상의 보조인자 또는 면역억제제를 별도로 전달하는 시스템이 포함된다.
본원에 기재된 면역글로불린 작제물에 대한 표적은, 예를 들어 박테리아, 바이러스, 진균 및 기생충 감염원을 포함하는 다양한 병원체에서 선택될 수 있다. 적합한 표적은 암 또는 암 관련 항원 등을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 표적은 류마티스 관절염(RA) 또는 다발성 경화증(MS)과 같은 자가면역 병태를 포함할 수 있다.
바이러스 표적의 예에는, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 인플루엔자 C를 포함하는 오르토믹소바이러스과(orthomyxoviridae)의 인플루엔자 바이러스가 포함된다. A형 바이러스가 가장 치명적인 인간 병원체이다. 범유행병과 관련이 있는 인플루엔자 A의 혈청형에는, 1918년 스페인 독감과 2009년 돼지 독감을 유발한 H1N1; 1957년 아시아 독감을 유발한 H2N2; 1968년 홍콩 독감을 유발한 H3N2; 2004년 조류 독감을 유발한 H5N1; H7N7; H1N2; H9N2; H7N2; H7N3; 및 H10N7이 포함된다.
인플루엔자 A에 대한 광범위 중화 항체가 설명되어 있다. 본원에 사용된 "광범위 중화 항체"는, 다수의 하위유형으로부터의 다수의 균주를 중화시킬 수 있는 중화 항체를 나타낸다. 예를 들어, CR6261[The Scripps Institute/Crucell]은 1918년 "스페인 독감" 바이러스(SC1918/H1)와 2004년 베트남에서 닭에서 인간으로 전파된 H5N1 계열 조류 인플루엔자 바이러스(Viet04/H5)를 포함하는 광범위한 인플루엔자 바이러스에 결합하는 단클론 항체로 설명되어 있다. CR6261은 인플루엔자 바이러스의 표면의 주요 단백질인 헤마글루티닌의 막 근위 줄기에서 고도로 보존된 나선형 영역을 인식한다. 이러한 항체는 WO 2010/130636에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참조로 인용된다. 또 다른 중화 항체, F10[XOMA Ltd]은 H1N1과 H5N1에 대해 유용한 것으로 설명되어 있다. 문헌[Sui et al, Nature Structural and Molecular Biology (Sui, et al. 2009, 16(3):265-73)]. 인플루엔자에 대한 다른 항체, 예를 들어 Fab28 및 Fab49가 선택될 수 있다. 예를 들어, WO 2010/140114 및 WO 2009/115972(상기 문헌들은 본원에 참조로 인용됨) 참조. WO 2010/010466, 미국 특허출원 공개공보 US/2011/076265 및 WO 2008/156763에 기재된 바와 같은 또 다른 항체가 용이하게 선택될 수 있다.
다른 표적 병원성 바이러스에는, 아레나바이러스(arenavirus)(푸닌(funin), 마추포(machupo) 및 라싸(Lassa) 바이러스 포함), 필로바이러스(filovirus)(마르부르크(Marburg) 및 에볼라(Ebola) 바이러스 포함), 한타바이러스(hantavirus), 피코르나바이러스과(picornaviridae)(리노바이러스(rhinovirus), 에코바이러스(echovirus) 포함), 코로나바이러스(coronavirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 모르빌리바이러스(morbillivirus), 호흡기세포융합바이러스, 토가바이러스(togavirus), 콕사키바이러스(coxsackievirus), 파르보바이러스 B19, 파라인플루엔자, 아데노바이러스, 레오바이러스(reovirus), 폭스바이러스(poxvirus)과 유래의 두창(대두창(천연두(Smallpox))) 및 백시니아바이러스(우두(Cowpox)), 및 수두대상포진바이러스(거짓광견병)가 포함된다.
바이러스성 출혈열은 아레나바이러스과(라싸열)(림프구성 맥락수막염(LCM)과도 관련이 있는 과임)의 구성원인, 필로바이러스(에볼라 바이러스) 및 한타바이러스(푸말라(puumala))에 의해 유발된다. 피코르나바이러스(리노바이러스의 아과)의 구성원은 인간에서 감기와 관련이 있다. 코로나바이러스과에는, 감염성 기관지염 바이러스(가금류), 돼지 전염성 위장관 바이러스(돼지), 돼지 헤마글루티닌 뇌척수염 바이러스(돼지), 고양이 감염성 복막염 바이러스(고양이), 고양이 장 코로나바이러스(고양이), 개 코로나바이러스(개)와 같은 다수의 비인간 바이러스가 포함된다. 인간 호흡기 코로나바이러스는 감기, 비-A형, B형 또는 C형 간염, 및 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)과 관련이 있는 것으로 추정되었다. 파라믹소바이러스과에는, 파라인플루엔자 바이러스 1형, 파라인플루엔자 바이러스 3형, 소 파라인플루엔자 바이러스 3형, 루불라바이러스(멈프스 바이러스(mumps virus)), 파라인플루엔자 바이러스 2형, 파라인플루엔자 바이러스 4형, 뉴캐슬병 바이러스(닭), 우역, 모르빌리바이러스(홍역 및 개 디스템퍼(distemper) 포함), 및 폐렴바이러스(호흡기세포융합바이러스(RSV) 포함)가 포함된다. 파르보바이러스과에는, 고양이 파르보바이러스(고양이 장염), 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 개 파르보바이러스 및 돼지 파르보바이러스가 포함된다. 아데노바이러스과에는, 호흡기 질환을 유발하는 바이러스(EX, AD7, ARD, O.B.)가 포함된다.
박테리아 병원체에 대한 중화 항체 작제물이 또한 본 개시내용에서의 사용을 위해 선택될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 중화 항체 작제물은 박테리아 그 자체에 대해 지시된다. 또 다른 실시형태에서, 중화 항체 작제물은 박테리아에 의해 생산된 독소에 대해 지시된다. 공기 매개 박테리아 병원체의 예에는, 예를 들어 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis)(수막염), 클레브시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia)(폐렴), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(폐렴), 슈도모나스 슈도말레이(Pseudomonas pseudomallei)(폐렴), 슈도모나스 말레이(Pseudomonas mallei)(폐렴), 아시네토박테르(Acinetobacter)(폐렴), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis), 모락셀라 라쿠나타(Moraxella lacunata), 알칼리게네스(Alkaligenes), 카르디오박테리움(Cardiobacterium), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)(독감), 헤모필루스 파라인플루엔자, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)(백일해), 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)(폐렴/발열), 레지오넬라 뉴모니아(Legionella pneumonia)(레지오넬라병(Legionnaires disease)), 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci)(폐렴), 클라미디아 뉴모니아에(Chlamydia pneumoniae)(폐렴), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)(결핵(TB)), 마이코박테리움 칸사시(Mycobacterium kansasii)(TB), 마이코박테리움 아비움(Mycobacterium avium)(폐렴), 노카르디아 아스테로이데스(Nocardia asteroides)(폐렴), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)(탄저병), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(폐렴), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(성홍열(scarlet fever)), 스트렙토코커스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)(폐렴), 코리네박테리아 디프테리아(Corynebacteria diphtheria)(디프테리아), 마이코플라스마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae)(폐렴)가 포함된다.
탄저병의 원인 물질은 바실러스 안트라시스에 의해 생산된 독소이다. 톡소이드를 형성하는 3가지 펩타이드 중 하나인 보호제(PA)에 대한 중화 항체가 설명되어 있다. 다른 2가지 폴리펩타이드는 치사 인자(LF: lethal factor)와 부종 인자(EF: edema factor)로 이루어져 있다. 항-PA 중화 항체는 탄저병에 대한 수동 면역화에 효과적인 것으로 설명되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제7,442,373호; 문헌[R. Sawada-Hirai et al, J Immune Based Ther Vaccines. 2004; 2: 5. (온라인 2004년 5월 12일)] 참조. 또 다른 항탄저병 독소 중화 항체가 설명되어 있고/있거나 생성될 수 있다. 유사하게, 다른 박테리아 및/또는 박테리아 독소에 대한 중화 항체가 본원에 기재된 바와 같은 AAV 전달 항병원체 작제물을 생성하는 데 사용될 수 있다.
다른 감염성 질환은, 예를 들어 아스페르길루스(Aspergillus) 종, 압시디아 코림비페라(Absidia corymbifera), 릭스푸스 스톨로니페르(Rhixpus stolonifer), 무코르 플룸베아우스(Mucor plumbeaus), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라즘 캅술라툼(Histoplasm capsulatum), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 코시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 페니실륨(Penicillium) 종, 미크로폴리스포라 파에니(Micropolyspora faeni), 테르모악티노마이세스 불가리스(Thermoactinomyces vulgaris), 알테르나리아 알테르나테(Alternaria alternate), 클라도스포리움(Cladosporium) 종, 헬민토스포리움(Helminthosporium) 및 스타키보트리스(Stachybotrys) 종을 포함하는 공기 매개 진균에 의해 유발될 수 있다.
또한, 수동 면역화는 직접 접촉에 의해 전염될 수 있는 진균 감염(예를 들어, 무좀), 백선, 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 및 다른 병원체를 예방하는 데 사용될 수 있다. 또한, 가정용 애완동물, 소 및 다른 가축, 및 다른 동물에 영향을 미치는 다양한 병태가 있다. 예를 들어, 개에서, 개 부비동 아스페르길루스증에 의한 상기도 감염은 심각한 질환을 유발한다. 고양이에서, 코에서 발생하는 상기도 질환 또는 고양이 호흡기 질환 복합 감염증은, 치료하지 않고 방치하는 경우 이환률과 사망률을 유발한다. 소는 소의 급성 전염성 바이러스 질환인 감염성 소 비기관염(통상적으로 IBR 또는 딸기코로 불림)에 의해 감염되기 쉽다. 또한, 소는 경증 내지 중증 호흡기 질환을 유발하고, 다른 질환에 대한 내성을 손상시킬 수 있는 소 호흡기세포융합바이러스(BRSV)에 감염되기 쉽다. 또 다른 병원체와 질환이 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 항-호흡기세포융합바이러스(RSV) 중화 항체의 생성에 대해 기술한 미국 특허 제5,811,524호 참조. 상기 문헌에 기재된 기술은 다른 병원체에도 적용 가능하다. 이러한 항체는 그 자체로 사용될 수 있거나, 인공 또는 재조합 중화 항체 작제물을 생성하기 위해 변형된 이의 서열(스캐폴드)로 사용될 수 있다. 이러한 방법은 설명되어 있다(예를 들어, WO 2010/13036; WO 2009/115972; WO 2010/140114 참조).
본원에 기재된 바와 같은 항신생물 면역글로불린은 HER2와 같은 인간 표피 성장인자 수용체(HER)를 표적으로 할 수 있다. 예를 들어, 트라스투주맙(trastuzumab)은 세포 기반 검정에서 고친화도(Kd=5 nM)로 인간 표피 성장인자 수용체 단백질의 세포외 도메인에 선택적으로 결합하는 재조합 IgG1 카파, 인간화 단클론 항체이다. 상업적으로 입수 가능한 제품은 CHO 세포 배양에서 생산된 것이다. 예를 들어, www.drugbank.ca/drugs/DB00072 참조. 트라스투주맙 경쇄 1 및 2와 중쇄 1 및 2의 아미노산 서열뿐 아니라, 트라스투주맙의 x선 구조 연구에서 얻은 서열은 상기 데이터베이스에 수탁번호 DB00072로 제공되어 있으며, 상기 서열은 본원에 참조로 인용된다. 또한, 212-Pb-TCMC-트라스투주맙[Areva Med, Bethesda, Md.] 참조. 또 다른 관심 항체에는, 예를 들어 인간 표피 성장인자 수용체 2 단백질(HER2)의 세포외 이량체화 도메인(서브도메인 II)을 표적으로 하는 재조합 인간화 단클론 항체인 페르투주맙(pertuzumab)이 포함된다. 이는, 각각, 448개 잔기와 214개 잔기를 갖는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 이루어져 있다. FDA는 2012년 6월 8일에 승인하였다. 이의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열은, 예를 들어 www.drugbank.ca/drugs/DB06366(동의어에는 2C4, MOAB 2C4, 단클론 항체 2C4 및 rhuMAb-2C4가 포함됨)에서 이러한 데이터베이스에 수탁번호 DB06366로 제공되어 있다. HER2에 더하여, 다른 HER 표적이 선택될 수 있다.
예를 들어, MM-121/SAR256212는 HER3 수용체를 표적으로 하며, 소세포폐암(NSCLC), 유방암 및 난소암의 치료에 유용한 것으로 보고되어 있는 완전 인간 단클론 항체[Merrimack's Network Biology]이다. SAR256212는 HER3(ErbB3) 수용체를 표적으로 하는 연구 중인 완전 인간 단클론 항체[Sanofi Oncology]이다. 또 다른 항-Her3/EGFR 항체는 두경부암에 유용한 것으로 기재되어 있는 RG7597[Genentech]이다. 또 다른 항체, HER을 표적으로 하는 차세대 Fc 최적화 단클론 항체(mAb)인 마르게툭시맙(margetuximab)(또는 MGAH22)[MacroGenics]이 또한 이용될 수 있다.
대안적으로, 다른 인간 상피세포 표면 마커 및/또는 다른 종양 수용체 또는 항원이 표적화될 수 있다. 다른 세포 표면 마커 표적의 예에는, 예를 들어 5T4, CA-125, CEA(예를 들어, 라베투주맙(labetuzumab)에 의해 표적화됨), CD3, CD19, CD20(예를 들어, 리툭시맙(rituximab)에 의해 표적화됨), CD22(예를 들어, 에프라투주맙(epratuzumab) 또는 벨투주맙(veltuzumab)에 의해 표적화됨), CD30, CD33, CD40, CD44, CD51(또한 인테그린 αvβ3), CD133(예를 들어, 교모세포종 세포), CTLA-4(예를 들어, 신경모세포종의 치료에 사용되는 이필리무맙(ipilimumab)), 케모카인(C-X-C 모티프) 수용체 2(CXCR2)(뇌의 상이한 영역에서 발현됨; 예를 들어, 항-CXCR2(세포외) 항체 #ACR-012(Alomene Labs)); EpCAM, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)[예를 들어, WO 2012020006 A2 참조, 뇌암], 폴레이트 수용체 알파(예를 들어, 소아 뇌실막 뇌종양, 두경부암), 섬유아세포 성장인자 수용체 1(FGFR1)(항-FGFR1 항체를 이용한 암 치료에 대한 논의에 대해서는 WO2012125124A1 참조), FGFR2(예를 들어, WO2013076186A와 WO2011143318A2에 기재된 항체 참조), FGFR3(예를 들어, 미국 특허 제8,187,601호 및 WO2010111367A1에 기재된 항체 참조), FGFR4(예를 들어, WO2012138975A1에 기재된 항-FGFR4 항체 참조), 간세포 성장인자(HGF)(예를 들어, WO2010119991A3의 항체 참조), 인테그린 α5β1, IGF-1 수용체, 강글리오시드 GD2(예를 들어, WO2011160119A2에 기재된 항체 참조), 강글리오시드 GD3, 막관통 당단백질 NMB(GPNMB)(신경아교종과 관련이 있으며, 특히 항체 글렘바투무맙(glembatumumab)(CR011)의 표적임), 뮤신, MUC1, 포스파티딜세린(예를 들어, 바비툭시맙(bavituximab)에 의해 표적화됨, [Peregrine Pharmaceuticals, Inc]), 전립선 암종 세포, PD-L1(예를 들어, 니볼루맙(nivolumab))(BMS-936558, MDX-1106, ONO-4538), 완전 인간 gG4(예를 들어 전이성 흑색종), 혈소판 유래 성장인자 수용체 알파(PDGFR α) 또는 CD140, 종양 관련 당단백질 72(TAG-72), 테나신 C, 종양 괴사인자(TNF) 수용체(TRAIL-R2), 혈관내피 성장인자(VEGF)-A(예를 들어, 베바시주맙(bevacizumab)에 의해 표적화됨) 및 VEGFR2(예를 들어, 라무시루맙(ramucirumab)에 의해 표적화됨)가 포함된다.
다른 항체 및 이의 표적에는, 예를 들어 단클론 항체 APN301(hu14.19-IL2)[아동의 악성 흑색종 및 신경모세포종, Apeiron Biolgics, Vienna, Austria]이 포함된다. 또한, 예를 들어 전이성 뇌암을 포함하는 고형 종양의 치료에 유용한 것으로 기재되어 있는 단클론 항체 8H9를 참조한다. 단클론 항체 8H9는 B7H3 항원에 대해 특이성이 있는 마우스 IgG1 항체[United Therapeutics Corporation]이다. 이러한 마우스 항체는 인간화될 수 있다. B7-H3 및/또는 B7-H4 항원을 표적으로 하는 또 다른 면역글로불린 작제물이 본원에 사용될 수 있다. 또 다른 항체는 S58(항-GD2, 신경모세포종)이다. Cotara™[Perregrince Pharmaceuticals]는 재발성 교모세포종의 치료에 대해 기재된 단클론 항체이다. 다른 항체는, 예를 들어 아바스틴(avastin), 피클라투주맙(ficlatuzumab), medi-575 및 올라라투맙(olaratumab)을 포함할 수 있다. 또 다른 면역글로불린 작제물 또는 단클론 항체가 본원에서의 사용을 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, [Medicines in Development Biologics, 2013 Report, pp. 1-87], [PhRMA's Communications & Public Affairs Department.의 간행물 (202) 835-3460](이는 본원에 참조로 인용됨) 참조.
예를 들어, 면역원은 다양한 바이러스과에서 선택될 수 있다. 면역반응이 바람직할 수 있는 바이러스과의 예에는, 피코르나바이러스과(리노바이러스속 포함, 감기 사례의 약 50%의 원인임); 엔테로바이러스(enterovirus)속(폴리오바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 및 A형 간염 바이러스와 같은 인간 엔테로바이러스 포함); 및 아프토바이러스(apthovirus)속(주로 비인간 동물에서 수족구병의 원인임)이 포함된다. 피코르나바이러스과의 바이러스 내에서, 표적 항원에는 VP1, VP2, VP3, VP4 및 VPG가 포함된다. 또 다른 바이러스과에는, 유행성 위장염의 중요한 원인 물질인 노르워크(Norwalk) 바이러스군을 포함하는 칼시바이러스(calcivirus)과가 포함된다. 인간과 비인간 동물에서 면역반응을 유도하기 위해 항원을 표적화하는 데 사용하기에 바람직한 또 다른 바이러스과는, 토가바이러스과(신드비스(Sindbis) 바이러스, 로스리버(RossRiver) 바이러스, 및 베네주엘라, 동부 및 서부 말 뇌염 바이러스를 포함하는 알파바이러스속 포함), 및 루비바이러스(rubivirus)(루벨라(Rubella) 바이러스 포함)이다. 플라비바이러스과(flaviviridae)에는, 뎅기열, 황열병, 일본 뇌염, 세인트루이스 뇌염 및 진드기 매개 뇌염 바이러스가 포함된다. 다른 표적 항원은 감염성 기관지염 바이러스(가금류), 돼지 전염성 위장관 바이러스(돼지), 돼지 헤마글루티닌 뇌척수염 바이러스(돼지), 고양이 감염성 복막염 바이러스(고양이), 고양이 장 코로나바이러스(고양이), 개 코로나바이러스(개) 및 인간 호흡기 코로나바이러스(감기 및/또는 비-A형, B형 또는 C형 간염을 유발할 수 있음)와 같은 다수의 비인간 바이러스를 포함하는 C형 간염 또는 코로나바이러스과에서 생성될 수 있다. 코로나바이러스과 내에서, 표적 항원에는 E1(M 또는 매트릭스 단백질로도 불림), E2(S 또는 스파이크 단백질로도 불림), E3(HE 또는 헤마글루티닌 엘테로오스(hemagglutin-elterose)로도 불림) 당단백질(모든 코로나바이러스에 존재하지 않음) 또는 N(뉴클레오캡시드)이 포함된다. 또 다른 항원은 수포성바이러스(vesiculovirus)속(예를 들어, 수포성 구내염 바이러스)과 리싸바이러스(lyssavirus)속(예를 들어, 광견병)을 포함하는 랍도바이러스(rhabdovirus)과에 대해 표적화될 수 있다.
랍도바이러스과 내에서, 적합한 항원은 G 단백질 또는 N 단백질에서 유도될 수 있다. 마르부르크 및 에볼라 바이러스와 같은 출혈열 바이러스를 포함하는 필로바이러스과가 적합한 항원 공급원일 수 있다. 파라믹소바이러스과에는, 파라인플루엔자 바이러스 1형, 파라인플루엔자 바이러스 3형, 소 파라인플루엔자 바이러스 3형, 루불라바이러스(멈프스 바이러스), 파라인플루엔자 바이러스 2형, 파라인플루엔자 바이러스 4형, 뉴캐슬병 바이러스(닭), 우역, 모르빌리바이러스(홍역 및 개 디스템퍼 포함), 및 폐렴바이러스(호흡기세포융합바이러스 포함)가 포함된다. 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스과로 분류되며, 적합한 항원 공급원(예를 들어, HA 단백질, N1 단백질)이다. 분야바이러스(bunyavirus)과에는, 분야바이러스속(캘리포니아 뇌염, La Crosse), 플레보바이러스(phlebovirus)(리프트 계곡 열(Rift Valley Fever)), 한타바이러스(푸말라는 출혈열 바이러스임), 나이로바이러스(nairovirus)(나이로비 양 질환) 및 다양한 지정되지 않은 분야바이러스가 포함된다. 아레나바이러스과는 LCM과 라싸열 바이러스에 대한 항원 공급원을 제공한다. 레오바이러스과에는, 레오바이러스속, 로타바이러스(rotavirus)(아동에서 급성 위장염을 유발함), 오르비바이러스(orbivirus) 및 쿨티바이러스(cultivirus)(콜로라도 진드기열(Colorado Tick fever), 레봄보(Lebombo)(인간), 말 뇌증, 청설(blue tongue))가 포함된다.
레트로바이러스과에는, 고양이 백혈병 바이러스, HTLVI 및 HTLVII, 렌티바이러스(인간 면역결핍 바이러스(HIV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 말 감염성 빈혈 바이러스 및 스푸마바이러스 포함)와 같은 인간 및 수의학적 질환을 포함하는 온코바이러스아과가 포함된다. 렌티바이러스 중에서 다수의 적합한 항원이 기재되어 있으며, 표적으로 용이하게 선택될 수 있다. 적합한 HIV 및 SIV 항원의 예에는, 비제한적으로, gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef 및 Rev 단백질뿐 아니라, 이의 다양한 단편이 포함된다. 예를 들어, Env 단백질의 적합한 단편은 gp120, gp160, gp41, 또는 이의 더 작은 단편, 예를 들어 길이가 적어도 약 8개 아미노산인 단편과 같은 이의 서브유닛 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 유사하게, tat 단백질의 단편이 선택될 수 있다. [미국 특허 제5,891,994호 및 제6,193,981호 참조]. 또한, 문헌[D. H. Barouch et al, J. Virol., 75(5):2462-2467 (March 2001)] 및 문헌[R. R. Amara, et al, Science, 292:69-74 (6 Apr. 2001)]에 기재된 HIV 및 SIV 단백질 참조. 또 다른 예에서, HIV 및/또는 SIV 면역원성 단백질 또는 펩타이드가 융합 단백질 또는 다른 면역원성 분자를 형성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, WO 01/54719(2001년 8월 2일에 공개됨)와 WO 99/16884(1999년 4월 8일에 공개됨)에 기재된 HIV-1 Tat 및/또는 Nef 융합 단백질 및 면역화 요법 참조. 본 발명은 본원에 기재된 HIV 및/또는 SIV 면역원성 단백질 또는 펩타이드에 제한되지 않는다. 또한, 이러한 단백질에 대한 다양한 변형이 기재되어 있거나 당업자에 의해 용이하게 이루어질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,972,596호 기재된 변형된 gag 단백질 참조.
파포바바이러스과에는, 폴리오마바이러스(polyomavirus)아과(BKU 및 JCU 바이러스)와 파필리오마바이러스(papillomavirus)아과(암 또는 유두종의 악성 진행과 관련이 있음)가 포함된다. 아데노바이러스과에는, 호흡기 질환 및/또는 장염을 유발하는 바이러스(EX, AD7, ARD, O.B.)가 포함된다. 파르보바이러스과에는, 고양이 파르보바이러스(고양이 장염), 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 개 파르보바이러스 및 돼지 파르보바이러스가 포함된다. 헤르페스바이러스과에는, 알파헤르페스바이러스과의 아과(단순바이러스속(HSVI, HSVII), 바리셀로바이러스(varicellovirus)(거짓광견병, 대상포진) 포함), 베타헤르페스바이러스과의 아과(시토메갈로바이러스속(HCMV, 무로메갈로바이러스(muromegalovirus)) 포함) 및 감마헤르페스바이러스과의 아과(림포크립토바이러스(lymphocryptovirus)속, EBV(버킷 림프종), 감염성 비기관염, 마렉병(Marek's disease) 바이러스 및 라디노바이러스(rhadinovirus) 포함)가 포함된다. 폭스바이러스과에는, 코르도폭스바이러스과(chordopoxvirinae)의 아과(오르토폭스바이러스속(두창(천연두) 및 백시니아(우두)), 파라폭스바이러스(parapoxvirus), 아비폭스바이러스(avipoxvirus), 카프리폭스바이러스(capripoxvirus), 레포리폭스바이러스(leporipoxvirus), 수이폭스바이러스(suipoxvirus) 포함)와, 엔토모폭스바이러스과(entomopoxvirinae)의 아과가 포함된다. 헤파드나바이러스(hepadnavirus)과에는 B형 간염 바이러스가 포함된다. 적합한 항원 공급원일 수 있는 미분류 바이러스 중 하나는 간염 델타 바이러스이다. 또 다른 바이러스 공급원은 조류 감염성 점액낭 질환 바이러스와, 돼지 호흡기 및 생식기 증후군 바이러스를 포함할 수 있다. 알파바이러스과에는, 말 동맥염 바이러스와 다양한 뇌염 바이러스가 포함된다.
항체에 대한 다른 병원성 표적은, 예를 들어 암 세포 또는 종양 세포에서 유래하거나, 인간과 비인간 척추동물을 감염시키는 박테리아, 진균, 기생충 미생물 또는 다세포 기생충을 포함할 수 있다. 박테리아 병원체의 예에는, 뉴모코커스(pneumococcus); 스타필로코커스 및 스트렙토코커스를 포함하는 병원성 그람 양성 간균(coccus)이 포함된다. 병원성 그람 음성 간균에는 메닌고코커스(meningococcus)와 고노코커스(gonococcus)가 포함된다. 병원성 장내 그람 음성 바실러스에는, 엔테로박테리아세아에(enterobacteriaceae); 슈도모나스, 아시네토박테리아 및 에이케넬라(eikenella); 유비저(melioidosis); 살모넬라(salmonella); 쉬겔라(shigella); 헤모필루스; 모락셀라; 헤모필루스 듀크레이(H. ducreyi)(무른궤양을 유발함); 브루셀라(brucella); 프란시셀라 툴라렌시스(야토병을 유발함); 예르시니아(yersinia)(파스테우렐라(pasteurella)); 스트렙토바실러스 모닐리포르미스 및 스피릴룸(spirillum)이 포함되고; 그람 양성 바실러스에는, 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes); 에리시펠로트릭스 루시오파티아에(Erysipelothrix rhusiopathiae); 코리네박테리움 디프테리아(디프테리아); 콜레라; 바실러스 안트라시스(탄저병); 도노바노시스(donovanosis)(서혜부 육아종); 및 바르토넬로시스(bartonellosis)가 포함된다. 병원성 혐기성 박테리아에 의해 유발되는 질환에는, 파상풍; 보툴리누스 중독; 기타 클로스트리디아(clostridia) 질환; 결핵; 나병; 및 기타 마이코박테리아 질환이 포함된다. 병원성 스피로헤타(spirochetal) 질환에는, 매독; 트레포네마증(treponematosis): 요스(yaws), 핀타(pinta) 및 풍토병 매독; 및 렙토스피라증(leptospirosis)이 포함된다. 고등 병원체 박테리아 및 병원성 진균에 의해 유발되는 다른 감염에는, 방선균증(actinomycosis); 노카르디아증(nocardiosis); 크롭토코커스증(cryptococcosis), 분아균증(blastomycosis), 히스토플라스마증(histoplasmosis) 및 콕시디오이데스진균증(coccidioidomycosis); 칸디다증(candidiasis), 아스페르길루스증(aspergillosis) 및 모균증(mucormycosis); 스포로트릭스증(sporotrichosis); 파라콕시디오이데스진균증(paracoccidiodomycosis), 페트리엘리디아증(petriellidiosis), 토룰롭시스증(torulopsosis), 진균종(mycetoma) 및 색소진균증(chromomycosis); 및 피부사상균증(dermatophytosis)이 포함된다. 리케차 감염(Rickettsial infection)에는 장티푸스열(Typhus fever), 로키산 홍반열(Rocky Mountain spotted fever), Q열(Q fever) 및 리케차두창(Rickettsialpox)이 포함된다. 마이코플라스마 및 클라미디아 감염의 예에는, 마이코플라스마 폐렴; 성병성 림프육아종; 앵무새병(psittacosis); 및 주산기 클라미디아 감염이 포함된다. 병원성 진핵생물은 병원성 원생동물과 연충류를 포함하며, 이에 의해 생성되는 감염에는, 아메바증(amebiasis); 말라리아; 리슈만편모충증(leishmaniasis); 트리파노소마증(trypanosomiasis); 톡소플라스마증(toxoplasmosis); 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii); 트리칸스(Trichans); 톡소플라스마 곤디(Toxoplasma gondii); 바베시아증(babesiosis); 편모충증(giardiasis); 선모충증(trichinosis); 사상충증(filariasis); 주혈흡충증(schistosomiasis); 선충류; 흡충류(trematode 또는 fluke); 및 조충(cestode)(촌충(tapeworm)) 감염이 포함된다.
이러한 유기체 및/또는 이에 의해 생성된 독소 중 다수는 질병 통제 센터(Centers for Disease Control)[(CDC), 미국 보건복지부(Department of Health and Human Services, USA)]에 의해 생물학적 공격에 사용할 가능성이 있는 작용제로서 식별되었다. 예를 들어, 이러한 생물학적 작용제 중 일부에는, 바실러스 안트라시스(탄저병), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum) 및 이의 독소(보툴리눔독소증), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)(역병), 대두창(천연두), 프란시셀라 툴라렌시스(야토병), 바이러스성 출혈열[필로바이러스(예를 들어, 에볼라, 마르부르크], 및 아레나바이러스[예를 들어, 라싸, 마추포]), (모두 현재 A 작용제 범주로 분류되어 있음); 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetti)(Q열); 브루셀라 종(브루셀라증), 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei)(마비저), 부르크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei)(유사비저), 리시누스 코무니스(Ricinus communis) 및 이의 독소(리신 독소), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens) 및 이의 독소(엡실론 독소), 스타필로코커스 종 및 이의 독소(장독소 B), 클라미디아 시타시(앵무새병), 물 안전 위협(예를 들어, 비브리오 콜레라, 크립토스포리듐 파르붐(Crytosporidium parvum)), 장티푸스열(리케차 포와제키(Richettsia powazekii)) 및 바이러스성 뇌염(알파바이러스, 예를 들어 베네주엘라 말 뇌염; 동부 말 뇌염; 서부 말 뇌염), (모두 현재 B 작용제 범주로 분류되어 있음); 및 니판 바이러스(Nipan virus) 및 한타바이러스, (모두 현재 C 작용제 범주로 분류되어 있음)가 포함된다. 또한, 이와 같이 분류되거나 상이하게 분류되는 다른 유기체가 향후 이러한 목적을 위해 식별되고/되거나 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바이러스 벡터 및 다른 작제물이 이러한 유기체, 바이러스, 이의 독소 또는 다른 부산물로부터의 항원을 표적으로 하는 데 유용하며, 이러한 생물학적 작용제를 이용하여 감염 또는 다른 유해 반응을 예방하고/하거나 치료할 수 있을 것임이 용이하게 이해될 것이다.
바이러스 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 유효 용량 또는 치료적 유효 용량은, 치료받은 대상에서 감염의 하나 이상의 징후 및/또는 증상을 완화시키는 데 충분한 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 양으로서, 이러한 징후 및/또는 증상의 퇴행 또는 제거를 유도하거나, 이러한 징후 및/또는 증상의 진행을 저해하는 양을 나타낸다. 용량의 양은 투여하고자 하는 대상의 연령 및 체격, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 본 개시내용의 일 실시형태에서, 예를 들어 인간 성인 대상에서 바이러스 감염을 치료하거나 예방하기 위한, 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 유효 용량 또는 치료적 유효 용량은, 약 0.01 mg/kg 내지 약 200 mg/kg, 예를 들어 최대 약 150 mg/kg이다. 본 개시내용의 일 실시형태에서, 투여량은 최대 약 10.8 g 또는 11 g(예를 들어, 약 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 6 g, 7 g, 8 g, 9 g, 10 g 또는 11 g)이다. 질환 또는 감염의 중증도에 따라, 치료 빈도와 지속기간이 조정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 초기 용량으로 투여된 후, 1회 이상의 2차 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 초기 용량 후, 초기 용량과 대략 동일하거나 이보다 적을 수 있는 양으로의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 두 번째 또는 수차례 후속 용량의 투여가 이어질 수 있으며, 여기서 후속 용량은 적어도 1일 내지 3일; 적어도 1주; 적어도 2주; 적어도 3주; 적어도 4주; 적어도 5주; 적어도 6주; 적어도 7주; 적어도 8주; 적어도 9주; 적어도 10주; 적어도 12주 또는 적어도 14주의 간격을 갖는다.
ceDNA 벡터가 투여되는 대상은 바이러스 감염, 예를 들어 인플루엔자 감염을 앓고 있을 수 있거나, 감염이 발생하기 쉬운 경향이 있을 수 있다. 감염이 발생하기 쉬운 대상, 또는 감염(예를 들어, 코로나바이러스 또는 인플루엔자 바이러스)에 걸릴 위험이 높을 수 있는 대상에는, 자가면역 질환으로 인해 면역계가 손상된 대상, 면역억제 요법을 받고 있는 대상(예를 들어, 기관 이식 후), 인간 면역결핍 증후군(HIV) 또는 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)을 앓고 있는 대상, 백혈구를 고갈시키거나 파괴하는 형태의 빈혈을 앓고 있는 대상, 방사선 또는 화학요법을 받고 있는 대상, 또는 염증성 장애를 앓고 있는 대상이 포함된다. 또한, 유아(예를 들어, 5세 이하) 또는 노인(예를 들어, 65세 이상)이 위험이 높다. 나아가, 대상은 질환 발생지와 근접하기 때문에 바이러스 감염에 걸릴 위험이 있을 수 있는 대상, 예를 들어 인구 밀집 도시 또는 바이러스 감염이 확인되거나 의심되는 대상과 근접하게 거주하는 대상, 또는 고용 선택에 따른 대상, 예를 들어 병원 근무자, 제약 연구원, 감염된 지역의 여행자 또는 항공기를 자주 이용하는 승객일 수 있다.
본 개시내용은 또한 질환 또는 장애, 예를 들어 바이러스 감염의 위험이 높은 대상에서 이러한 감염을 예방하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 예방적으로 투여하는 것을 포함한다. "예방하다" 또는 "예방하는"은, 대상의 신체에서 질환 또는 감염(예를 들어, 바이러스 감염)의 발현을 저해하기 위해 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 대상에게 투여하는 것을 의미하며, 여기서 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 유효 또는 치료적 유효 용량 또는 양으로 대상에게 투여될 때 효과적이다.
일부 실시형태에 따르면, 대상에서 바이러스 감염의 징후 또는 증상은, 예를 들어 바이러스 역가 검정(예를 들어, 발육란에서의 코로나바이러스 증식 또는 코로나바이러스 스파이크 단백질 검정)으로 결정 시, 대상의 신체에서 바이러스의 생존 또는 증식이다. 바이러스 감염의 다른 징후 및 증상은 본원에 논의되어 있다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 실시형태에 따르면, 대상은 비인간 동물일 수 있고, 본원에 논의된 항체 및 항원 결합 단편은 비인간 동물(예를 들어, 고양이, 개, 돼지, 소, 말, 염소, 토끼, 양 등)에서 질환을 치료하고/하거나 예방하는 수의학적 맥락에서 사용될 수 있다.
본 개시내용은 바이러스 감염(예를 들어, 코로나바이러스 감염)을 치료 또는 예방하거나, 또는 바이러스 감염에 이차적인 징후 또는 증상인 발열 또는 열감/오한; 기침; 인후통; 콧물 또는 코막힘; 재채기; 근육통 또는 신체 통증; 두통; 피로(피곤함); 구토; 설사; 호흡기 감염; 가슴 통증; 숨참; 기관지염; 및/또는 폐렴과 같은 바이러스 감염의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 퇴행 또는 제거를 유도하거나, 이의 진행을 저해하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상(예를 들어, 인간)에게 투여하는 방법을 제공한다.
A. 생체외 치료
일부 실시형태에 따르면, 대상에서 세포가 제거되고, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터가 그 안에 도입된 후, 세포가 다시 대상에 배치된다. 생체외 치료를 위해 대상에서 세포를 제거한 후, 다시 대상에게 도입하는 방법은 당업계에 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호; 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). 대안적으로, ceDNA 벡터가 또 다른 대상의 세포, 배양된 세포 또는 임의의 다른 적합한 공급원의 세포에 도입되며, 세포가 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다.
본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터로 형질도입된 세포는 바람직하게는 약제학적 담체와 조합으로 "치료적 유효량"으로 대상에게 투여된다. 당업자는, 일부 유익이 대상에게 제공되는 한, 치료 효과가 완전하거나 치유적일 필요가 없다는 것을 이해할 것이다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 시험관내, 생체외 또는 생체내 세포에서 생산되게 되는 본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편을 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 본원에 논의된 바와 같은 치료 방법에서의 본원에 기재된 ceDNA 벡터의 사용과 대조적으로, 일부 실시형태에 따르면, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는, 예를 들어 항체 및 융합 단백질의 생산을 위해 배양된 세포 및 이러한 세포로부터 단리된 발현된 항체 및 이의 항원 결합 단편에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 배양된 세포는, 예를 들어 항체 또는 융합 단백질의 소규모 또는 대규모 생물제조(biomanufacturing)를 위한 세포 공급원으로서 작용하여, 항체 또는 융합 단백질의 상업적 생산을 위해 사용될 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 소규모 생산뿐 아니라 상업적 대규모 항체 및 이의 항원 결합 단편의 생산을 포함하는 항체 또는 융합 단백질의 생체내 생산을 위해, 숙주 비인간 대상의 세포에 도입된다.
본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 수의학적 및 의학적 적용 모두에 사용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 생체외 유전자 전달 방법에 적합한 대상에는, 조류(예를 들어, 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩) 및 포유류(예를 들어, 인간, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개 및 토끼)가 모두 포함되며, 이 중 포유류가 바람직하다. 인간 대상이 가장 바람직하다. 인간 대상에는, 신생아, 유아, 청소년 및 성인이 포함된다.
B. 용량 범위
본원에 기재된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편을 인코딩하는 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 본원에 제공된다.
생체내 및/또는 시험관내 검정은 선택적으로 사용을 위한 최적 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 이용될 수 있다. 제형에 이용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 병태의 중증도에 따라 달라질 것이며, 당업자의 판단과 각 대상의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 유도된 용량 반응 곡선에서 추론될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터는 목적하는 조직의 세포를 트랜스펙션시키고, 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하는 데 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약제학적으로 허용 가능한 투여 경로에는, 비제한적으로, 선택된 기관에의 직접 전달(예를 들어, 간에의 문맥내 전달), 경구, 흡입(비강내 및 기관내 전달 포함), 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내 및 다른 비경구 투여 경로와 같은 "투여" 섹션에 상기 기재된 것들이 포함된다. 투여 경로는, 목적하는 경우, 조합될 수 있다.
특정 "치료 효과"를 달성하는 데 필요한 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 양의 용량은, 비제한적으로, 핵산 투여 경로, 치료 효과를 달성하는 데 필요한 유전자 또는 RNA 발현 수준, 치료하고자 하는 특정 질환 또는 장애, 및 유전자(들), RNA 산물(들) 또는 생성되는 발현된 단백질(들)의 안정성을 포함하는 몇 가지 인자에 기반하여 달라질 것이다. 당업자는, 상기 언급된 인자뿐 아니라, 당업계에 널리 알려진 다른 인자를 기반으로, 특정 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 ceDNA 벡터 용량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.
투여 요법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 반복적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 수회 용량이 매일 투여될 수 있거나, 치료 상황의 긴급성에 따라 용량이 지시된 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있다. 당업자는 올리고뉴클레오타이드가 세포에 투여되는지 대상에 투여되는지에 관계없이, 대상 올리고뉴클레오타이드의 적절한 용량 및 투여 스케줄을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
임상 사용을 위한 "치료적 유효 용량"은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이며, 특정 적용에 따라 달라질 것이다(예를 들어, 신경세포는 매우 소량을 필요로 하지만, 전신 주사는 많은 양을 필요로 할 수 있음). 예를 들어, 인간 대상의 골격 또는 심장 근육에의 직접 생체내 주사의 경우, 치료적 유효 용량은 약 1 μg 내지 100 g의 ceDNA 벡터 정도일 것이다. 엑소좀 또는 미세입자가 ceDNA 벡터를 전달하는 데 사용되는 경우, 치료적 유효 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 1 μg 내지 약 100 g의 벡터를 전달할 것으로 예측된다. 나아가, 치료적 유효 용량은 대상에게 영향을 미치는 데 충분한 양의 전이유전자를 발현시키는 ceDNA 벡터의 양으로서, 질환의 하나 이상의 증상의 감소를 유도하지만, 유의한 표적외 효과 또는 유의한 부작용을 초래하지 않는 양이다. 일부 실시형태에 따르면, "치료적 유효 용량"은 소정의 질환 증상의 감소에 있어서 통계적으로 유의하고 측정 가능한 변화를 생성하는 데 충분한 발현된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 양이다. 이러한 유효량은 소정의 ceDNA 벡터 조성물에 대한 임상 시험 및 동물 연구에서 측정될 수 있다.
시험관내 트랜스펙션의 경우, 세포(1×106개의 세포)에 전달되는 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 유효량은, 0.1 μg 내지 100 μg, 바람직하게는 1 μg 내지 20 μg, 더욱 바람직하게는 1 μg 내지 15 μg 또는 8 μg 내지 10 μg 정도의 ceDNA 벡터일 것이다. ceDNA 벡터가 클수록 더 높은 용량이 필요할 것이다. 엑소좀 또는 미세입자가 사용되는 경우, 효과적인 시험관내 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 일반적으로 동일한 양의 ceDNA 벡터를 전달하도록 의도될 것이다.
일부 실시형태에 따르면, 대상의 세포에 전달되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 양은, 1 μg 내지 10 μg, 예를 들어 1 μg 내지 9 μg, 1 μg 내지 8 μg, 1 μg 내지 7 μg, 1 μg 내지 6 μg, 1 μg 내지 5 μg, 2 μg 내지 9 μg, 2 μg 내지 8 μg, 2 μg 내지 7 μg, 2 μg 내지 6 μg, 2 μg 내지 5 μg, 3 μg 내지 9 μg, 3 μg 내지 8 μg, 3 μg 내지 7 μg, 3 μg 내지 6 μg, 3 μg 내지 5 μg, 4 μg 내지 9 μg, 4 μg 내지 8 μg, 4 μg 내지 7 μg, 4 μg 내지 6 μg, 4 μg 내지 5 μg, 5 μg 내지 10 μg, 5 μg 내지 9 μg, 5 μg 내지 8 μg, 5 μg 내지 7 μg, 5 μg 내지 6 μg, 6 μg 내지 10 μg, 6 μg 내지 9 μg, 6 μg 내지 8 μg, 6 μg 내지 7 μg, 7 μg 내지 10 μg, 7 μg 내지 9 μg, 7 μg 내지 8 μg, 8 μg 내지 10 μg, 8 μg 내지 9 μg, 9 μg 내지 10 μg, 또는 10 μg 이상이다.
치료는 단일 용량 또는 다회 용량의 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 1회 초과의 용량이 대상에게 투여될 수 있으며; 실제로, ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드의 부재로 인해 항캡시드 숙주 면역반응을 일으키지 않기 때문에, 필요한 경우 다회 용량이 투여될 수 있다. 이와 같이, 당업자는 적절한 용량의 횟수를 용이하게 결정할 수 있다. 투여되는 용량의 횟수는, 예를 들어 1회 내지 100회, 바람직하게는 2회 내지 20회 용량 정도일 수 있다.
임의의 특정 이론에 구애됨 없이, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터의 투여에 의해 유발되는 전형적인 항바이러스 면역반응의 결여는(즉, 캡시드 구성요소의 부재)는, 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터가 숙주에 여러 차례 투여되는 것을 가능하게 한다. 일부 실시형태에 따르면, 핵산이 대상에게 전달되는 경우의 횟수는, 2회 내지 10회 범위(예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회)이다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터는 대상에게 10회 초과로 전달된다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 달력일(calendar day)(예를 들어, 24시간 기간)당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 2달력일, 3달력일, 4달력일, 5달력일, 6달력일 또는 7달력일당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 달력주(calendar week)(예를 들어, 7달력일)당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 2주에 1회(예를 들어, 2달력주 기간 중 1회) 이하로 투여된다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 달력달(calendar month)당 1회(예를 들어, 30달력일 중 1회) 이하로 투여된다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 6달력달당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 달력년(예를 들어, 365일 또는 윤년의 경우 366일)당 1회 이하로 투여된다.
일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터의 용량은 0일차에 투여된다. 0일차의 초기 치료 후, 두 번째 투여(재투여)는, ceDNA 벡터를 이용한 초기 치료 후, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 또는 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 또는 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 약 10년, 약 11년, 약 12년, 약 13년, 약 14년, 약 15년, 약 16년, 약 17년, 약 18년, 약 19년, 약 20년, 약 21년, 약 22년, 약 23년, 약 24년, 약 25년, 약 26년, 약 27년, 약 28년, 약 29년, 약 30년, 약 31년, 약 32년, 약 33년, 약 34년, 약 35년, 약 36년, 약 37년, 약 38년, 약 39년, 약 40년, 약 41년, 약 42년, 약 43년, 약 44년, 약 45년, 약 46년, 약 47년, 약 48년, 약 49년 또는 약 50년 내에 수행될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 치료용 핵산의 재투여는 치료용 핵산의 발현을 증가시킨다. 일부 실시형태에 따르면, 첫 번째 투여 후 치료용 핵산의 발현과 비교한 재투여 후 치료용 핵산의 발현 증가는, 치료용 핵산의 재투여 후 약 0.5배 내지 약 10배, 약 1배 내지 약 5배, 약 1배 내지 약 2배, 또는 약 0.5배, 약 1배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배 또는 약 10배 더 높다.
특정 실시형태에서, 다양한 간격의 기간, 예를 들어 매일, 매주, 매월, 매년 등에 걸쳐 목적하는 수준의 항체 발현을 달성하기 위해, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터의 1회 초과의 투여(예를 들어, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 투여)가 이용될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 치료용 항체 및 이의 항원 결합 단편은, 이것이 대상에서 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 5시간, 적어도 10시간, 적어도 12시간, 적어도 18시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 적어도 48시간, 적어도 72시간, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월/1년, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 적어도 15년, 적어도 20년, 적어도 30년, 적어도 40년, 적어도 50년 또는 그 이상 동안 대상에서 발현되도록, 조절 스위치, 유도성 또는 억제성 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 발현은 선결된 또는 목적하는 간격으로 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 반복 투여하는 방식으로 달성될 수 있다.
일부 실시형태에 따르면, 본원에 기재된 항체 및 이의 항원 결합 단편을 발현하는 ceDNA 벡터는 추가 화합물과 조합으로 투여될 수 있다.
C. 단위 투여 형태
일부 실시형태에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 위한 ceDNA 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 편리하게 단위 투여 형태로 제시될 수 있다. 단위 투여 형태는 전형적으로 약제학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 맞게 조정될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, 단위 투여 형태는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 맞게 조정된다. 일부 실시형태에 따르면, 단위 투여 형태는 흡입에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 실시형태에 따르면, 단위 투여 형태는 기화기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 실시형태에 따르면, 단위 투여 형태는 분무기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 실시형태에 따르면, 단위 투여 형태는 에어로졸 생성기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 실시형태에 따르면, 단위 투여 형태는 경구 투여, 협측 투여 또는 설하 투여에 맞게 조정된다.
D. ceDNA 벡터를 사용한 성공적인 유전자 발현 시험
ceDNA 벡터에 의한 항체 및 이의 항원 결합 단편의 유전자 전달 효율을 시험하는 데 사용될 수 있는 당업계에 널리 알려진 검정은 시험관내 및 생체내 모델 둘 모두로 수행될 수 있다. ceDNA에 의한 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현 수준은 항체 및 이의 항원 결합 단편의 mRNA 및 단백질 수준을 측정하는 방식(예를 들어, 역전사 PCR, 웨스턴 블롯 분석 및 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA))으로 당업자에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시형태에 따르면, ceDNA는, 예를 들어 형광 현미경 또는 발광 플레이트 판독기로 리포터 단백질의 발현을 검사하는 방식으로 항체 및 이의 항원 결합 단편의 발현을 평가하는 데 사용될 수 있는 리포터 단백질을 포함한다. 생체내 적용의 경우, 유전자 발현이 성공적으로 일어나는지 여부를 결정하기 위해 소정의 항체 및 이의 항원 결합 단편의 기능을 시험하는 단백질 기능 검정이 사용될 수 있다. 당업자는 시험관내 또는 생체내에서 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 항체 및 이의 항원 결합 단편의 기능을 측정하는 최상의 시험을 결정할 수 있다.
세포 또는 대상에서 ceDNA 벡터로부터의 항체 및 이의 항원 결합 단편의 유전자 발현 효과는 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 10개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 적어도 2년, 적어도 5년, 적어도 10년, 적어도 20년 동안 지속될 수 있거나, 영구적일 수 있다고 본원에서 고려된다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허 및 다른 간행물(참고 문헌, 등록된 특허, 공개된 특허출원 및 동시 계류중인 특허출원 포함)은, 예를 들어 본원에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기재된 방법론을 설명하고 개시하기 위한 목적으로 명백하게 본원에 참조로 인용된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여, 선행 개시내용으로 인해 또는 임의의 다른 이유로, 본 발명자가 그러한 개시내용보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이러한 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 출원인이 이용 가능한 정보를 기반으로 하며, 이러한 문헌의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 승인을 구성하는 것으로 여겨지지 않는다.
실시예
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다. 당업자는, ceDNA 벡터가 본원에 기재된 야생형 또는 변형된 ITR 중 임의의 것으로부터 작제될 수 있으며, 하기 예시적인 방법을 사용하여 이러한 ceDNA 벡터를 작제하고 이의 활성을 평가할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 방법이 특정 ceDNA 벡터를 이용하는 것으로 예시되어 있지만, 설명에 따라 임의의 ceDNA 벡터에 적용할 수 있다.
실시예 1: 곤충 세포 기반 방법을 사용한 ceDNA 벡터의 작제
폴리뉴클레오타이드 작제물 주형을 사용한 ceDNA 벡터의 생산은 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 실시예 1에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 ceDNA 벡터를 생성하는 데 사용되는 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형은 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큘로바이러스일 수 있다. 이론에 제한됨 없이, 허용 숙주세포에서, 예를 들어 Rep의 존재 하에서, 2개의 대칭인 ITR과 발현 작제물을 갖는 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형(여기서, ITR 중 적어도 하나는 야생형 ITR 서열에 대해 변형됨)을 복제하여 ceDNA 벡터를 생산한다. ceDNA 벡터 생산은 다음과 같은 2단계를 거친다: 첫 번째로, Rep 단백질을 통한 주형 백본(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큘로바이러스 게놈 등)으로부터의 주형의 절제("회수") 단계, 및 두 번째로, 절제된 ceDNA 벡터의 Rep 매개 복제 단계.
ceDNA 벡터를 생산하는 예시적인 방법은, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA-플라스미드에서 시작하는 방법이다. 도 1a 및 도 1b를 참조하면, 각각의 ceDNA-플라스미드의 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형은 좌측 변형된 ITR과 우측 변형된 ITR을 포함하고, 상기 ITR 서열 사이에 다음을 갖는다: (i) 인핸서/프로모터; (ii) 전이유전자의 클로닝 부위; (iii) 전사 후 반응 요소(예를 들어, 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)); 및 (iv) 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 소 성장호르몬 유전자(BGHpA) 유래). 작제물의 특정 부위에 새로운 유전 구성요소의 도입을 용이하게 하기 위해, 고유한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위(R1 내지 R6)(도 1a 및 도 1b에 제시됨)를 또한 각 구성요소 사이에 도입하였다. R3(PmeI) GTTTAAAC(서열번호 123) 및 R4(PacI) TTAATTAA(서열번호 124) 효소 부위를 클로닝 부위로 조작하여, 전이유전자의 오픈리딩프레임을 도입하였다. 이러한 서열을 ThermoFisher Scientific에서 입수한 pFastBac HT B 플라스미드에 클로닝하였다.
ceDNA-박미드의 생산:
DH10Bac 적격세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells, Thermo Fisher)를 제조업체의 설명서에 따른 프로토콜에 따라 시험 또는 대조군 플라스미드로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 플라스미드와 바큘로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 ceDNA-박미드를 생성하였다. 박미드와 트랜스포사아제 플라스미드의 형질전환체 및 유지를 위해 선택한 항생제와 함께 X-gal 및 IPTG가 함유된 박테리아 한천 플레이트 상에서, 대장균(E. coli)에서의 청백색 스크리닝을 기반으로 하는 양성 선별을 스크리닝하여 재조합 박미드를 선별하였다(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다아제 유전자의 α-상보성을 제공함). β-갈락토시드 지표 유전자를 교란시키는 전위에 의해 생성된 백색 집락을 선별하고, 10 ml 배지에서 배양하였다.
재조합 ceDNA-박미드를 대장균에서 단리하고, FugeneHD를 사용하여 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 트랜스펙션시켜 감염성 바큘로바이러스를 생산하였다. 부착성 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 25℃에서 T25 플라스크 내 50 ml 배지에서 배양하였다. 4일 후, 배양 배지(P0 바이러스 함유)에서 세포를 꺼내고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하여, 세포 또는 세포 잔해물로부터 감염성 바큘로바이러스 입자를 분리하였다.
선택적으로, 50 ml 내지 500 ml 배지 중에서 나이브(naㅿve) Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 바큘로바이러스(P0)를 증폭시켰다. 세포의 직경이 18 nm 내지 19 nm(본래 직경 14 nm 내지 15 nm), 밀도가 약 4.0E+6개의 세포/mL에 도달할 때까지, 세포 직경 및 생존율을 모니터링하면서, 25℃에서 130 rpm으로 오비탈 진탕기 인큐베이터에서 현탁 배양으로 세포를 유지시켰다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 세포 및 잔해물을 제거하기 위한 원심분리와 0.45 μm 필터를 통한 여과 후, 배지 중 P1 바큘로바이러스 입자를 수집하였다.
시험 작제물을 포함하는 ceDNA-바큘로바이러스를 수집하고, 바큘로바이러스의 감염 활성 또는 역가를 측정하였다. 구체적으로, 4개 × 20 ml Sf9 세포 배양물(2.5E+6개의 세포/ml)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큘로바이러스로 처리하고, 25℃ 내지 27℃에서 인큐베이션하였다. 4일 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가율과 세포주기 정지율 및 세포 생존율의 변화로 감염성을 측정하였다.
PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 도 8a에 개시된 바와 같은 "Rep-플라스미드"를, Rep78(서열번호 131 또는 133)과 Rep52(서열번호 132) 또는 Rep68(서열번호 130)과 Rep40(서열번호 129)을 포함하는 pFASTBAC™-이중 발현 벡터(ThermoFisher)에서 생산하였다. Rep-플라스미드를 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 DH10Bac 적격세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells)(Thermo Fisher)로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 Rep-플라스미드와 바큘로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 박미드("Rep-박미드")를 생성하였다. X-gal 및 IPTG가 함유된 박테리아 한천 플레이트 상에서 대장균에서의 청백색 스크리닝을 포함하는 양성 선별을 통해 재조합 박미드를 선별하였다(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다아제 유전자의 α-상보성을 제공함). 단리된 백색 집락을 선별하고, 10 ml의 선택된 배지(LB 브로쓰 중의 카나마이신, 겐타마이신, 테트라시클린)에 접종하였다. 재조합 박미드(Rep-박미드)를 대장균에서 단리하고, Rep-박미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 트랜스펙션시켜 감염성 바큘로바이러스를 생산하였다.
Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 50 ml 배지에서 4일 동안 배양하고, 감염성 재조합 바큘로바이러스("Rep-바큘로바이러스")를 배양물에서 단리하였다. 선택적으로, 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 Rep-바큘로바이러스(P0)를 증폭시키고, 50 ml 내지 500 ml 배지에서 배양하였다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 원심분리 또는 여과 또는 또 다른 분별 과정을 통해 세포를 분리하여, 배지 중 P1 바큘로바이러스 입자를 수집하였다. Rep-바큘로바이러스를 수집하고, 바큘로바이러스의 감염 활성을 측정하였다. 구체적으로, 4개 × 20 mL Sf9 세포 배양물(2.5×106개의 세포/mL)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큘로바이러스로 처리하고, 인큐베이션하였다. 4일 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가율과 세포주기 정지율, 및 세포 생존율의 변화로 감염성을 측정하였다.
ceDNA 벡터 생성 및 특징분석
도 4b를 참조하여, (1) ceDNA-박미드 또는 ceDNA-바큘로바이러스를 함유하는 샘플, 및 (2) 상기 기재된 Rep-바큘로바이러스를 함유하는 Sf9 곤충 세포 배양 배지를, 각각, 1:1000 및 1:10,000의 비로, Sf9 세포의 새로운 배양물(2.5E+6개의 세포/ml, 20 ml)에 첨가하였다. 이어서, 세포를 25℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 공동 감염 4일 내지 5일 후, 세포 직경과 생존율을 검출하였다. 세포 직경이 18 nm 내지 20 nm에 도달하고, 생존율이 약 70% 내지 80%에 도달하면, 세포 배양물을 원심분리하고, 배지를 제거하고, 세포 펠릿을 수집하였다. 세포 펠릿을 먼저 적절한 부피의 물 또는 완충액인 수성 배지에 재현탁시켰다. Qiagen MIDI PLUS™ 정제 프로토콜(Qiagen, 컬럼당 처리되는 세포 펠릿 질량 0.2 mg)을 사용하여, 세포에서 ceDNA 벡터를 단리하고 정제하였다.
Sf9 곤충 세포에서 생산되고 정제된 ceDNA 벡터의 수율을 초기에 260 nm에서의 UV 흡광도를 기반으로 측정하였다.
ceDNA 벡터는 도 4d에 예시된 미변성 또는 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동으로 확인하여 평가할 수 있으며, 여기서 (a) 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 겔 전기영동 분석 후 미변성 겔에 비해 변성 겔에서 2배 크기로 이동하는 특징적인 밴드의 존재, 및 (b) 절단되지 않은 물질의 경우 미변성 겔에서 단량체 및 이량체(2x) 밴드의 존재가, ceDNA 벡터 존재의 특징이다.
공동 감염된 Sf9 세포(본원에 기재된 바와 같음)에서 수득된 DNA를, a) ceDNA 벡터 내 오로지 단일 절단 부위만 존재, 및 b) 0.8% 변성 아가로오스 겔 상에서 분별 시 명확하게 확인할 수 있을 만큼 큰 생성된 단편(>800 bp)에 대해 선별된 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜, 단리된 ceDNA 벡터의 구조를 추가로 분석하였다. 도 4d 및 도 4e에 예시된 바와 같이, 비연속 구조를 갖는 선형 DNA 벡터와 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터를 이의 반응 생성물의 크기로 구별할 수 있다: 예를 들어 비연속 구조를 갖는 DNA 벡터는 1 kb 및 2 kb 단편을 생성할 것으로 예상되고, 연속 구조를 갖는 비캡시드화된 벡터는 2 kb 및 4 kb 단편을 생성할 것으로 예상된다.
따라서, 단리된 ceDNA 벡터가 정의에 따라 필요한 바와 같이 공유결합으로 폐쇄되어 있다는 것을 정성적으로 입증하기 위해, 샘플을 단일 제한 부위를 갖는 특정 DNA 벡터 서열의 맥락에서 확인된 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜, 바람직하게는 동일하지 않은 크기의 2개의 절단 산물(예를 들어, 1000 bp 및 2000 bp)을 수득하였다. 소화 및 변성 겔 상에서의 전기영동(이는 2개의 상보적 DNA 가닥을 분리함) 후, 선형의 비공유결합으로 폐쇄된 DNA는 1000 bp 및 2000 bp의 크기로 분리될 것이지만, 공유결합으로 폐쇄된 DNA(즉, ceDNA 벡터)는 2개의 DNA 가닥이 연결되고 언폴딩되어 (단일가닥이지만) 길이가 2배가 됨으로써, 2배 크기(2000 bp 및 4000 bp)로 분리될 것이다. 나아가, 단량체, 이량체 및 n량체 형태의 DNA 벡터의 소화는 모두 다량체 DNA 벡터의 말단 대 말단 연결로 인해 동일한 크기의 단편으로 분리될 것이다(도 4d 참조).
본원에 사용된 "미변성 겔 및 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동에 의한 DNA 벡터의 식별을 위한 검정"이라는 구절은, 제한 엔도뉴클레아제 소화, 이어서 소화 산물의 전기영동을 수행하는 방식으로 ceDNA의 폐쇄형 말단을 평가하는 검정을 나타낸다. 하나의 이러한 예시적인 검정이 하기에 이어지지만, 당업자는 이러한 예에 대한 다수의 업계에 알려진 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 벡터 길이의 대략 1/3x 및 2/3x인 산물을 생성하게 되는 관심 ceDNA 벡터에 대한 단일 절단 효소인 것으로 선택된다. 이는, 미변성 및 변성 겔 모두에 대한 밴드를 분리한다. 변성 전, 샘플에서 완충액을 제거하는 것이 중요하다. Qiagen PCR 클린업 키트(clean-up kit) 또는 탈염 "스핀 컬럼", 예를 들어 GE HEALTHCARE ILUSTRA™ MICROSPIN™ G-25 컬럼이 엔도뉴클레아제 소화에 대한 일부 업계에 알려진 옵션이다. 상기 검정은, 예를 들어 i) 적절한 제한 엔도뉴클레아제(들)를 이용하여 DNA를 소화시키는 단계, ii) 예를 들어 Qiagen PCR 클린업 키트에 적용하고, 증류수로 용리하는 단계, iii) 10x 변성 용액(10x = 0.5 M NaOH, 10 mM EDTA)을 첨가하고, 완충되지 않은 10X 염료를 첨가하고, NaOH 농도가 겔과 겔 박스에서 균일하도록 보장하기 위해 1 mM EDTA 및 200 mM NaOH와 함께 이전에 인큐베이션한 0.8% 내지 1.0% 겔 상에 10X 변성 용액을 4배로 첨가하여 제조된 DNA ladder와 함께 분석하고, 1x 변성 용액(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)의 존재 하에서 겔에서 전개시키는 단계를 포함한다. 당업자는, 결과의 크기 및 목적하는 시기에 기반하여 전기영동을 수행하는 데 어떤 전압을 사용해야 하는지를 이해할 것이다. 전기영동 후, 겔을 배수하고, 1x TBE 또는 TAE에서 중화시키고, 1x SYBR Gold가 함유된 1x TBE/TAE 또는 증류수로 옮겼다. 이어서, 밴드를, 예를 들어 Thermo Fisher, SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain(DMSO 중 10,000X 농축물) 및 에피형광(청색) 또는 UV(312 nm)를 이용하여 가시화할 수 있다.
생성된 ceDNA 벡터의 순도는 임의의 업계에 알려진 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 하나의 예시적이고 비제한적인 방법으로서, ceDNA 벡터의 형광 강도를 표준과 비교하여 샘플의 전체 UV 흡광도에 대한 ceDNA-플라스미드의 기여를 추정할 수 있다. 예를 들어, UV 흡광도에 기반하여, 4 μg의 ceDNA 벡터가 겔 상에 로딩되고, ceDNA 벡터 형광 강도가 1 μg인 것으로 알려진 2 kb 밴드와 동등한 경우, 1 μg의 ceDNA 벡터가 존재하며, ceDNA 벡터는 총 UV 흡수 물질의 25%이다. 이어서, 겔 상의 밴드 강도를 밴드가 나타내는 계산된 입력에 대해 플롯팅한다: 예를 들어 총 ceDNA 벡터가 8 kb이고, 절제된 비교용 밴드가 2 kb인 경우, 밴드 강도는 총 입력의 25%로서 플롯팅될 것이며, 이러한 경우 1.0 μg 입력에 대한 값은 0.25 μg일 것이다. ceDNA 벡터 플라스미드 적정을 사용하여 표준 곡선을 플롯팅한 후, 회귀선 방정식을 사용하여 ceDNA 벡터 밴드의 양을 계산한 다음, 이를 사용하여 ceDNA 벡터로 표시되는 총 입력의 % 또는 순도%를 결정할 수 있다.
비교 목적으로, 실시예 1에는 곤충 세포 기반 방법 및 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형을 사용한 ceDNA 벡터의 생산 방법이 기재되어 있으며, 이는 또한 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 실시예 1에 기재되어 있다. 예를 들어, 실시예 1에 따른 본 개시내용의 ceDNA 벡터를 생성하는 데 사용되는 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형은 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큘로바이러스일 수 있다. 이론에 제한됨 없이, 허용 숙주세포에서, 예를 들어 Rep의 존재 하에서, 2개의 대칭인 ITR과 발현 작제물을 갖는 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형(여기서, ITR 중 적어도 하나는 야생형 ITR 서열에 대해 변형됨)을 복제하여 ceDNA 벡터를 생산한다. ceDNA 벡터 생산은 다음과 같은 2단계를 거친다: 첫 번째로, Rep 단백질을 통한 주형 백본(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큘로바이러스 게놈 등)으로부터의 주형의 절제("회수") 단계, 및 두 번째로, 절제된 ceDNA 벡터의 Rep 매개 복제 단계.
곤충 세포를 사용하는 방법으로 ceDNA 벡터를 생산하는 예시적인 방법은, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA-플라스미드에서 시작하는 방법이다. 도 1a 및 도 1b를 참조하면, 각각의 ceDNA-플라스미드의 폴리뉴클레오타이드 작제물 주형은 좌측 변형된 ITR과 우측 변형된 ITR을 포함하고, 상기 ITR 서열 사이에 다음을 갖는다: (i) 인핸서/프로모터; (ii) 전이유전자의 클로닝 부위; (iii) 전사 후 반응 요소(예를 들어, 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)); 및 (iv) 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 소 성장호르몬 유전자(BGHpA) 유래). 작제물의 특정 부위에 새로운 유전 구성요소의 도입을 용이하게 하기 위해, 고유한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위(R1 내지 R6)(도 1a 및 도 1b에 제시됨)를 또한 각 구성요소 사이에 도입하였다. R3(PmeI) GTTTAAAC(서열번호 123) 및 R4(PacI) TTAATTAA(서열번호 124) 효소 부위를 클로닝 부위로 조작하여, 전이유전자의 오픈리딩프레임을 도입하였다. 이러한 서열을 ThermoFisher Scientific에서 입수한 pFastBac HT B 플라스미드에 클로닝하였다.
ceDNA-박미드의 생산:
DH10Bac 적격세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells, Thermo Fisher)를 제조업체의 설명서에 따른 프로토콜에 따라 시험 또는 대조군 플라스미드로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 플라스미드와 바큘로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 ceDNA-박미드를 생성하였다. 박미드와 트랜스포사아제 플라스미드의 형질전환체 및 유지를 위해 선택한 항생제와 함께 X-gal 및 IPTG가 함유된 박테리아 한천 플레이트 상에서, 대장균에서의 청백색 스크리닝을 기반으로 하는 양성 선별을 스크리닝하여 재조합 박미드를 선별하였다(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다아제 유전자의 α-상보성을 제공함). β-갈락토시드 지표 유전자를 교란시키는 전위에 의해 생성된 백색 집락을 선별하고, 10 ml 배지에서 배양하였다.
재조합 ceDNA-박미드를 대장균에서 단리하고, FugeneHD를 사용하여 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 트랜스펙션시켜 감염성 바큘로바이러스를 생산하였다. 부착성 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 25℃에서 T25 플라스크 내 50 ml 배지에서 배양하였다. 4일 후, 배양 배지(P0 바이러스 함유)에서 세포를 꺼내고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하여, 세포 또는 세포 잔해물로부터 감염성 바큘로바이러스 입자를 분리하였다.
선택적으로, 50 ml 내지 500 ml 배지 중에서 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 바큘로바이러스(P0)를 증폭시켰다. 세포의 직경이 18 nm 내지 19 nm(본래 직경 14 nm 내지 15 nm), 밀도가 약 4.0E+6개의 세포/mL에 도달할 때까지, 세포 직경 및 생존율을 모니터링하면서, 25℃에서 130 rpm으로 오비탈 진탕기 인큐베이터에서 현탁 배양으로 세포를 유지시켰다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 세포 및 잔해물을 제거하기 위한 원심분리와 0.45 μm 필터를 통한 여과 후, 배지 중 P1 바큘로바이러스 입자를 수집하였다.
시험 작제물을 포함하는 ceDNA-바큘로바이러스를 수집하고, 바큘로바이러스의 감염 활성 또는 역가를 측정하였다. 구체적으로, 4개 x 20 ml Sf9 세포 배양물(2.5E+6개의 세포/ml)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큘로바이러스로 처리하고, 25℃ 내지 27℃에서 인큐베이션하였다. 4일 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가율과 세포주기 정지율, 및 세포 생존율의 변화로 감염성을 측정하였다.
"Rep-플라스미드"를 Rep78(서열번호 131 또는 서열번호 133) 또는 Rep68(서열번호 130) 및 Rep52(서열번호 132) 또는 Rep40(서열번호 129) 둘 모두를 포함하는 pFASTBAC™-이중 발현 벡터(ThermoFisher)에서 생산하였다. Rep-플라스미드를 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 DH10Bac 적격세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells)(Thermo Fisher)로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 Rep-플라스미드와 바큘로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 박미드("Rep-박미드")를 생성하였다. X-gal 및 IPTG가 함유된 박테리아 한천 플레이트 상에서 대장균에서의 청백색 스크리닝을 포함하는 양성 선별을 통해 재조합 박미드를 선별하였다(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다아제 유전자의 α-상보성을 제공함). 단리된 백색 집락을 선별하고, 10 ml의 선택된 배지(LB 브로쓰 중의 카나마이신, 겐타마이신, 테트라시클린)에 접종하였다. 재조합 박미드(Rep-박미드)를 대장균에서 단리하고, Rep-박미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 트랜스펙션시켜 감염성 바큘로바이러스를 생산하였다.
Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 50 ml 배지에서 4일 동안 배양하고, 감염성 재조합 바큘로바이러스("Rep-바큘로바이러스")를 배양물에서 단리하였다. 선택적으로, 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 Rep-바큘로바이러스(P0)를 증폭시키고, 50 ml 내지 500 ml 배지에서 배양하였다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 원심분리 또는 여과 또는 또 다른 분별 과정을 통해 세포를 분리하여, 배지 중 P1 바큘로바이러스 입자를 수집하였다. Rep-바큘로바이러스를 수집하고, 바큘로바이러스의 감염 활성을 측정하였다. 구체적으로, 4개 × 20 mL Sf9 세포 배양물(2.5×106개의 세포/mL)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큘로바이러스로 처리하고, 인큐베이션하였다. 4일 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가율과 세포주기 정지율, 및 세포 생존율의 변화로 감염성을 측정하였다.
ceDNA 벡터 생성 및 특징분석
(1) ceDNA-박미드 또는 ceDNA-바큘로바이러스를 함유하는 샘플, 및 (2) 상기 기재된 Rep-바큘로바이러스를 함유하는 Sf9 곤충 세포 배양 배지를, 각각, 1:1000 및 1:10,000의 비로, Sf9 세포의 새로운 배양물(2.5E+6개의 세포/ml, 20 ml)에 첨가하였다. 이어서, 세포를 25℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 공동 감염 4일 내지 5일 후, 세포 직경과 생존율을 검출하였다. 세포 직경이 18 nm 내지 20 nm에 도달하고, 생존율이 약 70% 내지 80%에 도달하면, 세포 배양물을 원심분리하고, 배지를 제거하고, 세포 펠릿을 수집하였다. 세포 펠릿을 먼저 적절한 부피의 물 또는 완충액인 수성 배지에 재현탁시켰다. Qiagen MIDI PLUS™ 정제 프로토콜(Qiagen, 컬럼당 처리되는 세포 펠릿 질량 0.2 mg)을 사용하여, 세포에서 ceDNA 벡터를 단리하고 정제하였다.
Sf9 곤충 세포에서 생산되고 정제된 ceDNA 벡터의 수율을 초기에 260 nm에서의 UV 흡광도를 기반으로 측정하였다. 정제된 ceDNA 벡터를 실시예 5에 기재된 전기영동 방법을 사용하여 적절한 폐쇄형 구성에 대해 평가할 수 있다.
실시예 2: 이중가닥 DNA 분자로부터의 절제를 통한 합성 ceDNA 생산
ceDNA 벡터의 합성 생산은 2019년 1월 18일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US19/14122의 실시예 2 내지 실시예 6에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 이중가닥 DNA 분자의 절제를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 하나의 예시적인 방법. 간략하게, ceDNA 벡터는 이중가닥 DNA 작제물을 사용하여 생성할 수 있다(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 7a 내지 도 8e 참조). 일부 실시형태에 따르면, 이중가닥 DNA 작제물은 ceDNA 플라스미드이다(예를 들어, 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허출원 PCT/US2018/064242의 도 6 참조).
일부 실시형태에 따르면, ceDNA 벡터 제조용 작제물은 본원에 기재된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다.
예시 목적으로, 실시예 2는 이러한 방법을 사용하여 생성된 예시적인 폐쇄형 DNA 벡터로서의 ceDNA 벡터의 생산을 설명한다. ITR과 발현 카세트(예를 들어, 핵산 서열)를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드의 절제, 이어서 본원에 기재된 바와 같은 유리된 3' 및 5' 말단의 결찰에 의해 폐쇄형 DNA 벡터를 생성하는 시험관내 합성 생산 방법을 예시하는 본 실시예에 ceDNA 벡터가 예시되어 있지만, 당업자는, 상기 예시된 바와 같이, 비제한적으로, 개뼈형 DNA, 덤벨형 DNA 등을 포함하는 임의의 목적하는 폐쇄형 DNA 벡터가 생성되도록, 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드 분자를 변형시킬 수 있다는 것을 알고 있다. 실시예 2에 기재된 합성 생산 방법에 따라 생산될 수 있는 항체 또는 융합 단백질의 생산을 위한 예시적인 ceDNA 벡터는, "III. ceDNA 벡터 전반"이라는 제목의 섹션에 논의되어 있다. ceDNA 벡터에 의해 발현되는 예시적인 항체 및 융합 단백질은, "IIC ceDNA 벡터에 의해 발현되는 예시적인 항체 및 융합 단백질"이라는 제목의 섹션에 설명되어 있다.
상기 방법은 (i) 이중가닥 DNA 작제물로부터 발현 카세트를 인코딩하는 서열을 절제하는 단계, (ii) ITR 중 하나 이상에서 헤어핀 구조를 형성하는 단계, 및 (iii) 유리된 5' 및 3' 말단을 결찰, 예를 들어 T4 DNA 리가아제에 의해 결합하는 단계를 포함한다.
이중가닥 DNA 작제물은, 5'→3' 순서로, 제1 제한 엔도뉴클레아제 부위; 업스트림 ITR; 발현 카세트; 다운스트림 ITR; 및 제2 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다. 이어서, 이중가닥 DNA 작제물을 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시켜, 양쪽 제한 엔도뉴클레아제 부위에 이중가닥 절단물을 생성한다. 하나의 엔도뉴클레아제가 2개의 부위를 모두 표적으로 할 수 있거나, 제한 부위가 ceDNA 벡터 주형에 존재하지 않는 한 각각의 부위는 상이한 엔도뉴클레아제에 의해 표적화될 수 있다. 이는 나머지 이중가닥 DNA 작제물로부터 제한 엔도뉴클레아제 부위 사이의 서열을 절제한다(PCT/US19/14122의 도 9 참조). 결찰시켜, 폐쇄형 DNA 벡터를 형성한다.
상기 방법에 사용되는 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 야생형 ITR일 수 있다. 변형된 ITR을 또한 사용할 수 있으며, 여기서 변형은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하거나(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 6 내지 도 8, 도 10 및 도 11b 참조), 2개 이상의 헤어핀 루프(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 6 내지 도 8 및 도 11b 참조) 또는 단일 헤어핀 루프(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 10a, 도 10b 및 도 11b 참조)를 가질 수 있다. 헤어핀 루프 변형된 ITR은 기존 올리고의 유전적 변형 또는 새로운(de novo) 생물학적 및/또는 화학적 합성으로 생성할 수 있다.
비제한적인 예에서, 좌측 및 우측 ITR-6(서열번호 111 및 서열번호 112)은 AAV2의 야생형 ITR로부터 B-B' 및 C-C' 아암의 40개 뉴클레오타이드 결실을 포함한다. 변형된 ITR에 남아있는 뉴클레오타이드는 단일 헤어핀 구조를 형성할 것으로 예측된다. 상기 구조의 언폴딩 깁스 자유 에너지는 약 -54.4 kcal/mol이다. 기능성 Rep 결합 부위 또는 Trs 부위의 선택적 결실을 포함하는 ITR에 대한 다른 변형이 또한 이루어질 수 있다.
실시예 3: 올리고뉴클레오타이드 작제를 통한 ceDNA 생산
다양한 올리고뉴클레오타이드의 어셈블리를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 또 다른 예시적인 방법이, PCT/US19/14122의 실시예 3에 제공되어 있으며, 여기서 ceDNA 벡터는 5' 올리고뉴클레오타이드와 3' ITR 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계, 및 ITR 올리고뉴클레오타이드를 발현 카세트를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드에 결찰시키는 단계를 통해 생산된다. PCT/US19/14122의 도 11b는, 5' ITR 올리고뉴클레오타이드와 3' ITR 올리고뉴클레오타이드를 발현 카세트를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드에 결찰시키는 예시적인 방법을 보여준다.
본원에 개시된 바와 같이, ITR 올리고뉴클레오타이드는 WT-ITR(예를 들어, 도 3a, 도 3c 참조) 또는 변형된 ITR(예를 들어, 도 3b 및 도 3d 참조)을 포함할 수 있다. (또한, PCT/US19/14122(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 도 6a, 도 6b, 도 7a 및 도 7b 참조). 예시적인 ITR 올리고뉴클레오타이드에는, 비제한적으로, 서열번호 134 내지 145가 포함된다(예를 들어, PCT/US19/14122의 표 7 참조). 변형된 ITR은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 무세포 합성에 사용되는 본원에 기재된 바와 같은 WT-ITR 또는 mod-ITR을 포함하는 ITR 올리고뉴클레오타이드는, 유전적 변형, 또는 생물학적 및/또는 화학적 합성으로 생성할 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 실시예 2와 실시예 3의 ITR 올리고뉴클레오타이드는 WT-ITR, 또는 본원에 논의된 바와 같은 대칭 또는 비대칭 구성의 변형된 ITR(mod-ITR)을 포함할 수 있다.
실시예 4: 단일가닥 DNA 분자를 통한 ceDNA 생산
합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 또 다른 예시적인 방법이 PCT/US19/14122의 실시예 4에 제공되어 있으며, 이는 센스 발현 카세트 서열을 플랭킹하고, 안티센스 발현 카세트를 플랭킹하는 2개의 안티센스 ITR에 공유결합으로 부착된 2개의 센스 ITR을 포함하는 단일가닥 선형 DNA를 사용하며, 이러한 단일가닥 선형 DNA의 말단을 결찰시켜 폐쇄형 단일가닥 분자를 형성한다. 하나의 비제한적인 예는, 단일가닥 DNA 분자를 합성 및/또는 생산하는 단계, 분자의 일부를 어닐링하여 하나 이상의 2차 구조 염기쌍 영역을 갖는 단일 선형 DNA 분자를 형성하는 단계, 및 유리된 5' 및 3' 말단을 서로 결찰시켜 폐쇄형 단일가닥 분자를 형성하는 단계를 포함한다.
ceDNA 벡터 생산을 위한 예시적인 단일가닥 DNA 분자는, 5'→3' 방향으로, 하기를 포함한다:
센스 제1 ITR;
센스 발현 카세트 서열;
센스 제2 ITR;
안티센스 제2 ITR;
안티센스 발현 카세트 서열; 및
안티센스 제1 ITR.
실시예 4의 예시적인 방법에 사용되는 단일가닥 DNA 분자는 본원에 기재된 임의의 DNA 합성 방법, 예를 들어 시험관내 DNA 합성으로 형성하거나, 뉴클레아제를 이용하여 DNA 작제물(예를 들어, 플라스미드)을 절단하고 생성된 dsDNA 단편을 용융시켜 ssDNA 단편을 제공하는 방식으로 제공할 수 있다.
센스 및 안티센스 서열 쌍의 계산된 용융 온도 미만으로 온도를 저하시켜 어닐링을 달성할 수 있다. 용융 온도는 특정 뉴클레오타이드 염기 함량과, 사용되는 용액의 특징, 예를 들어 염 농도에 따라 달라진다. 당업자는 임의의 소정의 서열과 용액 조합에 대한 용융 온도를 용이하게 계산할 수 있다.
어닐링된 분자의 유리된 5' 및 3' 말단을 서로 결찰시키거나 헤어핀 분자에 결찰시켜, ceDNA 벡터를 형성할 수 있다. 적합한 예시적인 결찰 방법 및 헤어핀 분자는 실시예 2 및 실시예 3에 기재되어 있다.
실시예 5: ceDNA의 정제 및/또는 생산 확인
예를 들어 실시예 1에 기재된 곤충 세포 기반 생산 방법, 또는 실시예 2 내지 4에 기재된 합성 생산 방법을 포함하는 본원에 기재된 방법에 의해 생산된 임의의 DNA 벡터 산물을, 당업자에게 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 불순물, 미사용 구성요소 또는 부산물을 제거하기 위해 정제할 수 있고/있거나; 생산된 DNA 벡터(이러한 경우, ceDNA 벡터)가 목적하는 분자인지를 확인하기 위해 분석할 수 있다. DNA 벡터, 예를 들어 ceDNA의 예시적인 정제 방법은, Qiagen Midi Plus 정제 프로토콜(Qiagen) 및/또는 겔 정제를 사용하는 것이다.
ceDNA 벡터의 정체를 확인하는 예시적인 방법은 다음과 같다.
ceDNA 벡터는 도 4d에 예시된 미변성 또는 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동으로 확인하여 평가할 수 있으며, 여기서 (a) 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 겔 전기영동 분석 후 미변성 겔에 비해 변성 겔에서 2배 크기로 이동하는 특징적인 밴드의 존재, 및 (b) 절단되지 않은 물질의 경우 미변성 겔에서 단량체 및 이량체(2x) 밴드의 존재가, ceDNA 벡터 존재의 특징이다.
정제된 DNA를, a) ceDNA 벡터 내 오로지 단일 절단 부위만 존재, 및 b) 0.8% 변성 아가로오스 겔 상에서 분별 시 명확하게 확인할 수 있을 만큼 큰 생성된 단편(>800 bp)에 대해 선별된 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜, 단리된 ceDNA 벡터의 구조를 추가로 분석하였다. 도 4c 및 도 4d에 예시된 바와 같이, 비연속 구조를 갖는 선형 DNA 벡터와 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터를 이의 반응 생성물의 크기로 구별할 수 있다: 예를 들어 비연속 구조를 갖는 DNA 벡터는 1 kb 및 2 kb 단편을 생성할 것으로 예상되고, 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터는 2 kb 및 4 kb 단편을 생성할 것으로 예상된다.
따라서, 단리된 ceDNA 벡터가 정의에 따라 필요한 바와 같이 공유결합으로 폐쇄되어 있다는 것을 정성적으로 입증하기 위해, 샘플을 단일 제한 부위를 갖는 특정 DNA 벡터 서열의 맥락에서 확인된 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜, 바람직하게는 동일하지 않은 크기의 2개의 절단 산물(예를 들어, 1000 bp 및 2000 bp)을 수득하였다. 소화 및 변성 겔 상에서의 전기영동(이는 2개의 상보적 DNA 가닥을 분리함) 후, 선형의 비공유결합으로 폐쇄된 DNA는 1000 bp 및 2000 bp의 크기로 분리될 것이지만, 공유결합으로 폐쇄된 DNA(즉, ceDNA 벡터)는 2개의 DNA 가닥이 연결되고 언폴딩되어 (단일가닥이지만) 길이가 2배가 됨으로써, 2배 크기(2000 bp 및 4000 bp)로 분리될 것이다. 나아가, 단량체, 이량체 및 n량체 형태의 DNA 벡터의 소화는 모두 다량체 DNA 벡터의 말단 대 말단 연결로 인해 동일한 크기의 단편으로 분리될 것이다(도 4e 참조).
본원에 사용된 "미변성 겔 및 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동에 의한 DNA 벡터의 식별을 위한 검정"이라는 구절은, 제한 엔도뉴클레아제 소화, 이어서 소화 산물의 전기영동을 수행하는 방식으로 ceDNA의 폐쇄형 말단을 평가하는 검정을 나타낸다. 하나의 이러한 예시적인 검정이 하기에 이어지지만, 당업자는 이러한 예에 대한 다수의 업계에 알려진 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 벡터 길이의 대략 1/3x 및 2/3x인 산물을 생성하게 되는 관심 ceDNA 벡터에 대한 단일 절단 효소인 것으로 선택된다. 이는, 미변성 및 변성 겔 모두에 대한 밴드를 분리한다. 변성 전, 샘플에서 완충액을 제거하는 것이 중요하다. Qiagen PCR 클린업 키트(clean-up kit) 또는 탈염 "스핀 컬럼", 예를 들어 GE HEALTHCARE ILUSTRA™ MICROSPIN™ G-25 컬럼이 엔도뉴클레아제 소화에 대한 일부 업계에 알려진 옵션이다. 상기 검정은, 예를 들어 i) 적절한 제한 엔도뉴클레아제(들)를 이용하여 DNA를 소화시키는 단계, ii) 예를 들어 Qiagen PCR 클린업 키트에 적용하고, 증류수로 용리하는 단계, iii) 10x 변성 용액(10x = 0.5 M NaOH, 10 mM EDTA)을 첨가하고, 완충되지 않은 10X 염료를 첨가하고, NaOH 농도가 겔과 겔 박스에서 균일하도록 보장하기 위해 1 mM EDTA 및 200 mM NaOH와 함께 이전에 인큐베이션한 0.8% 내지 1.0% 겔 상에 10X 변성 용액을 4배로 첨가하여 제조된 DNA ladder와 함께 분석하고, 1x 변성 용액(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)의 존재 하에서 겔에서 전개시키는 단계를 포함한다. 당업자는, 결과의 크기 및 목적하는 시기에 기반하여 전기영동을 수행하는 데 어떤 전압을 사용해야 하는지를 이해할 것이다. 전기영동 후, 겔을 배수하고, 1x TBE 또는 TAE에서 중화시키고, 1x SYBR Gold가 함유된 1x TBE/TAE 또는 증류수로 옮겼다. 이어서, 밴드를, 예를 들어 Thermo Fisher, SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain(DMSO 중 10,000X 농축물) 및 에피형광(청색) 또는 UV(312 nm)를 이용하여 가시화할 수 있다. 겔 밴드에서 ceDNA 벡터를 분리하고 이를 재생시키는 방식으로 전술한 겔 기반 방법을 정제 목적에 맞게 조정할 수 있다.
생성된 ceDNA 벡터의 순도는 임의의 업계에 알려진 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 하나의 예시적이고 비제한적인 방법으로서, ceDNA 벡터의 형광 강도를 표준과 비교하여 샘플의 전체 UV 흡광도에 대한 ceDNA-플라스미드의 기여를 추정할 수 있다. 예를 들어, UV 흡광도에 기반하여, 4 μg의 ceDNA 벡터가 겔 상에 로딩되고, ceDNA 벡터 형광 강도가 1 μg인 것으로 알려진 2 kb 밴드와 동등한 경우, 1 μg의 ceDNA 벡터가 존재하며, ceDNA 벡터는 총 UV 흡수 물질의 25%이다. 이어서, 겔 상의 밴드 강도를 밴드가 나타내는 계산된 입력에 대해 플롯팅한다: 예를 들어 총 ceDNA 벡터가 8 kb이고, 절제된 비교용 밴드가 2 kb인 경우, 밴드 강도는 총 입력의 25%로서 플롯팅될 것이며, 이러한 경우 1.0 μg 입력에 대한 값은 0.25 μg일 것이다. ceDNA 벡터 플라스미드 적정을 사용하여 표준 곡선을 플롯팅한 후, 회귀선 방정식을 사용하여 ceDNA 벡터 밴드의 양을 계산한 다음, 이를 사용하여 ceDNA 벡터로 표시되는 총 입력의 % 또는 순도%를 결정할 수 있다.
실시예 6: 수컷 Rag2 마우스에서 정맥내 전달을 통한 Covid Ab 작제물의 스크리닝 연구.
ceDNA 벡터를 상기 실시예 1에 기재된 방법에 따라 생산하였다.
연구의 목적은, LNP와 면역억제제 TKI로서 룩솔리티닙(ruxolitinib)(야누스 관련 키나아제(JAK: Janus Associated Kinase) 저해제)을 통해 전달된 제형화된 ceDNA의 정맥내 전달 후 단백질 발현을 결정하고, 항체 HC를 단독으로, 항체 LC를 단독으로, 또는 항체 HC와 LC를 함께 발현하는 다양한 ceDNA 작제물에서 단백질 발현을 비교하기 위한 것이었다. 항-SARS-CoV-2 Ab의 중쇄(HC)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 ceDNA와 항-SARS-CoV-2 Ab의 경쇄(LC)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 ceDNA를, 면역억제제 TKI(예를 들어, 룩솔리티닙)와 조합으로 마우스(n=5)에 투여하였다. 연구 설계 및 세부사항은 하기 제시된 바와 같이 수행하였다.
연구 설계
표 8은 본 연구의 키나아제 저해제 투여 구성요소의 설계를 나타낸다. 표 8에 제시된 바와 같이, 4개의 수컷 Rag2 마우스 군(n=5)에 10 mL/kg의 용량 부피로 룩솔리티닙(300 mg/kg)을 경구(PO) 투여하거나 투여하지 않았다. 투여된 동물의 경우, 투약은 0일차, 투여 30분 전, 투여 5시간 후에 수행하였다.
[표 8]
Figure pct00013
표 9는 본 연구의 시험 물질 투여 구성요소의 설계를 나타낸다. 표 9에 제시된 바와 같이, 0일차에, 4개의 Rag2 마우스 군(n=5)에 비히클(군 1) 또는 시험 화합물(군 2 내지 군 4)을 2 mg/kg의 용량 수준과 5 mL/kg의 용량 부피로 정맥내 투여하였다. 35일차는 연구의 종결 시점이었다. 군 1은 비히클 대조군이었다. 군 2에서, ceDNA-1856(LC를 인코딩함) 작제물과 ceDNA-1859(HC를 인코딩함) 작제물에서 HC 대 LC의 몰비는 3:2(HC: LC)였으며, 이중 ceDNA 벡터는 LNP1에 제형화하였다. 군 3의 단일 벡터 ceDNA-2157 ceDNA 작제물은 LNP1에 제형화된 이중 ORF, 양방향성 작제물이었다. 군 4에서, ceDNA1856(LC) 작제물과 ceDNA1859(HC) 작제물에서 HC 대 LC의 몰비는 3:2(HC: LC)였으며, 이중 ceDNA 벡터는 LNP1과 상이한 LNP2에 제형화하였다. 연구에 이용된 ceDNA 작제물 및/또는 ORF의 서열은 상기 표 7에 제시되어 있다.
[표 9]
Figure pct00014
시험 시스템
시험 시스템은 하기와 같았다:
종: 무스 무스쿨루스(Mus musculus)
계통: Rag2(B6.129S6-Rag2<tm1Fwa>)
수컷의 수: 25마리 + 예비용 2마리
연령: 도착 시 5주령
공급원: Taconic
수용: 동물의 군을 처치실 내 접촉 침구가 있는 투명 폴리카보네이트 케이지에 수용하였다.
먹이 및 물: 동물에게 임의로 마우스 먹이 5058과, 1 N HCl을 이용하여 2.5 내지 3.0의 목표 pH로 산성화시킨 여과된 수돗물을 제공하였다.
시험 물질
화합물 부류: 재조합 DNA 벡터: ceDNA
투여 제형: 시험 물품은 즉시 투여 가능한 분취량으로 공급하였다. 시험 물품 농도는 수령 시 기록하였다.
스톡을 실온까지 가온시키고, 필요 시, 사용 직전 제공된 PBS를 이용하여 희석하였다. 투여가 즉시 수행되지 않는 경우, 준비된 물질을 약 4℃에서 보관하였다.
저해제는 투여 분취량으로 매일 준비하여 공급하였다. 경구 위관영양법 투여 용액은 0.5% 메틸셀룰로오스 중에 제형화하였다. 경구 위관영양법 현탁액의 미립자를 분산시키기 위해 투여 전 경구 위관영양법 제형을 혼합(피펫팅)하고/하거나 초음파처리하였다.
저해제 투여: 저해제를 상기 표 8에 따라 0일차에 10 mL/kg으로 PO 투여(경구 위관영양법)로 투여하였다. 저해제를 0일차 ceDNA 투여 30분(± 5분) 전, 및 투여 5시간(± 10분) 후에 투여하였다.
시험 물질 투여 0일차에, 시험 물질의 용량을 측면 꼬리 정맥으로 정맥내 투여를 통해 투여하였다. 용량은 5 mL/kg의 용량 부피로 투여하였다. 용량은 가장 가까운 0.01 mL로 반올림하였다.
남은 물질: 모든 남은 개방된 스톡은 냉장고에 넣었으며, 연구의 실제 부분이 완료된 후 폐기하였다. 준비한 투여 물질은 투약 완료 후 폐기하였다.
생전 관찰 및 측정
케이지에서의 관찰(동물 건강 점검): 일반 건강, 치사율 및 빈사 상태를 확인하기 위해 적어도 1일 1회 케이지에서 동물 건강 검사를 수행하였다.
임상 관찰: 임상 관찰은 0일차: 투여 60분 내지 120분 후와 투여일의 끝 무렵(3시간 내지 6시간 후), 및 1일차: 0일차 시험 물질 투여 22시간 내지 26시간 후에 수행하였다. 예외적으로 추가 관찰이 이루어졌다.
체중: 모든 동물의 체중을 0일차, 1일차, 2일차, 3일차, 7일차, 14일차, 21일차, 29일차 및 35일차에 기록하였다. 필요에 따라 추가 체중을 기록하였다. 체중은 가장 가까운 0.1 g으로 반올림하였다.
혈액 채취
하기 제시된 표 10에 따라 3일차, 7일차, 14일차, 21일차 및 29일차에, 군 1 내지 군 5의 모든 동물에서 중간 채혈을 수행하였다.
[표 10]
Figure pct00015
채취 후, 동물에게 젖산 링거액 0.5 mL 내지 1.0 mL를 피하 투여하였다.
꼬리정맥 닉, 복재정맥 또는 안와정맥굴 천자를 통해 흡입용 이소플루란 하에서 혈청용 전혈을 채취하였다. 전혈을 혈전 활성화제가 포함된 혈청 분리기 튜브에 채취하고, 25 μL의 2개의 혈청 분취량으로 처리하였다.
모든 샘플을 드라이 아이스 상에서 배송될 때까지 공칭 -70℃에서 보관하였다.
마취 회복: 해당하는 경우, 동물을 마취 하에 있는 동안, 회복하는 동안 및 움직일 때까지 지속적으로 모니터링하였다.
최종 절차 및 수집
[표 11]
Figure pct00016
종료 시 혈액: 혈청용 전혈을 혈전 활성화제가 포함된 혈청 분리기 튜브에 채취하고, 시설 SOP에 따라 50 μL의 2개의 혈청 분취량과 1개의 잔여 분취량으로 처리하였다. 모든 샘플을 드라이 아이스 상에서 배송될 때까지 공칭 -70℃에서 보관하였다.
결과
항스파이크 인간 IgG(***)를 사용하여 본원에 기재된 바와 같은 항체 발현을 검출하였으며, 이러한 발현을 ceDNA 작제물(들)의 주입 후 3일차, 7일차, 14일차, 21일차, 29일차 및 35일차에 검출된 항스파이크 hIgG(단위: ng/ml)로 정량화하였다. 도 6에 제시된 바와 같이, 1.5:1(HC: LC)의 몰비로 ceDNA-1856(LC를 인코딩함) 벡터와 ceDNA-1859(HC를 인코딩함) 벡터를 갖는 이중 ceDNA 작제물을 이용한 경우, 14일차에 약 1 ug/ml의 항스파이크 hIgG가 검출되었고, 항체 수준은 35일차까지 지속적으로 상승하여 약 8 ug/ml에 도달하였다.
실시예 7: ceDNA 벡터 최적화
상기 기재된 바와 같이 LNP1에 ceDNA-1856(LC를 인코딩함)과 ceDNA-1859(HC를 인코딩함)의 공동제형을 포함하는 이중 ceDNA 벡터 작제물을 하기 실험에 이용하였다.
연구의 목적은, HC와 LC를 발현시키기 위해, 하기와 같은 다양한 벡터 설계를 사용하여 항체 발현을 결정하기 위한 것이었다: 이시스트론성 카세트(ceDNA를 함유하는 IRES 또는 푸린/2A 절단 부위), 이중 ORF 카세트(양방향성) 및 이중 벡터. 설계의 개략도는 도 7a에 제시되어 있다. 도 7b는, 유체역학적 전달 후 측정된 벡터 설계 사이의 항체 발현(항스파이크 huIgG(단위: ug/mL) 검출)을 비교하는 실험 결과를 보여준다. 도 7b에 제시된 바와 같이, HC:LC 몰비 1:1로 간 특이적, 이중 ORF 및 이중 벡터 설계를 이용한 경우 높은 항체 발현이 얻어졌다. 벡터가 유체역학적으로 전달되는 경우 HC-LC 함유 항체의 최적의 발현을 위해 이중 벡터 접근법이 단일 벡터 설계보다 우수하다는 데이터도 존재한다(도 7b). 추가 실험에서, LNP 제형("LNP 1") 내 ceDNA 이중 벡터 형식(ceDNA-1; 이중 벡터-LNP 1 또는 LNP 2)(도 6에 제시된 바와 같음) 또는 이중 ORF(ceDNA-2; 이중 ORF-LNP 1)로서의 HC와 LC의 전달을, 35일 연구 기간에 걸쳐 이러한 ceDNA 형식과 LNP 제형 사이의 항체 발현(일례로서, 항스파이크 huIgG(단위: ug/mL) 검출)을 결정하는 방식으로 비교하였다. 도 7c는, ceDNA-1856(LC를 인코딩함)과 ceDNA-1859(HC를 인코딩함) 둘 모두를 캡슐화하는("이중 벡터" 형식) LNP 전달의 결과를 보여주며, 35일차까지 항스파이크 huIgG의 강력한 발현을 나타냈다. 도 7c에 제시된 바와 같이, 이중 벡터의 LNP 전달은 35일차에 약 8 ug/mL의 항스파이크 hIgG 농도를 달성하였다. 따라서, 2개의 ceDNA 작제물(ceDNA1856(LC)과 ceDNA1859(HC); 도 7c, "ceDNA-1")을 캡슐화하는 LNP를 갖는 이중 벡터 설계의 발현은 생체내 간세포에 전달될 수 있으며, 단일 이중 ORF ceDNA 형식(도 7c, "ceDNA-2")과 비교하여 mAb 발현을 최적화하는 추가 자유도를 가능하게 한다.
도 8은, 유체역학적 전달 후 7일차에, 항체 HC와 LC를 발현하는 1.5:1(HC:LC) 몰비로의 ceDNA 이중 벡터 설계("ceDNA-1")와 ceDNA 이중 ORF 설계("ceDNA-2") 사이의 항체 발현의 용량 의존적 증가를 비교한다. 도 8에 제시된 바와 같이, 1856(LC)과1859(HC) 이중 벡터(1.5:1; HC:LC)의 ceDNA 형식과 이중 ORF 설계는 모두 발현의 용량 의존적 증가를 나타냈으며, 여기서 최상의 이중 벡터 설계는 이중 ORF 설계와 비교하여 5배 내지 10배 더 높은 활성을 나타냈다.
일반적으로, 혈청 항스파이크 hIgG 농도 수준은 ELISA로 결정하였다. 간략하게, 정제된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(LakePharma®, 카탈로그 번호 46328)을 96웰 검정 플레이트(Greiner Bio-One®, 카탈로그 번호 655085) 상에 DPBS(ThermoFisher®) 중 2 μg/mL로 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이어서, 실온에서 2시간 동안 300 μL의 SuperBlock(PBS) 차단 완충액(ThermoFisher®, 카탈로그 번호 37515)을 사용하여 플레이트를 비특이적 결합에 대해 차단하였다. 이를 웰당 300 μL의 1X PBST(ThermoFisher®)로 3회 세척하였다. 샘플과 참조 표준 희석액을 일반 혈청 희석제(General Serum Diluent)(Immuno Chemistry Technologies®, 카탈로그 번호 649) 중에 준비하고, 이러한 희석액 중 100 μL를 각각의 웰에 이중으로 첨가하였다. 플레이트를 500 rpm으로 온건하게 진탕시키면서 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBST로 3회 세척하고, 흡수용 종이에 두드려 나머지 액체를 제거하였다. 염소 항인간 IgG(H+L) HRP 효소 접합된 2차 항체(Invitrogen®, 카탈로그 번호 31410)를 일반 혈청 희석제 중에 1:5000로 희석하고, 100 μL를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 500 rpm으로 진탕시키면서 실온에서 60분 동안 인큐베이션한 후, PBST로 3회 세척하였다. 최종적으로, 100 μL의 기질 용액(KPLSUREBLUE™ TMB Microwell Substrate, SeraCare®, 카탈로그 번호 5120-0077)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL의 정지 용액(SeraCare®, 카탈로그 번호 5150-0020)을 각각의 웰에 첨가하고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과를 표준 곡선에 보간하였다.
시험관내 트랜스펙션 예
항체 발현을 위한 HC: LC의 최적의 몰비가 있는지를 결정하기 위해, ceDNA-1856(LC를 인코딩함)과 ceDNA-1859(HC를 인코딩함)를 포함하는 이중 형식의 ceDNA 벡터 작제물을 다양한 HC와 LC의 몰비로 시험하였다. 본 검정은 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 ceDNA 총 10 ng으로 트랜스펙션된 HepG2 세포를 사용하였다. 72시간 후 상청액을 수거하고, ELISA로 항스파이크 hIgG의 농도를 측정하였다.
인간 간암 HepG2 세포(ATCC, 카탈로그 번호 HB-8065)를 10% 열 불활성화 소태아 혈청(ThermoFisher®, 카탈로그 번호 16140071)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(ThermoFisher®, 카탈로그 번호 15140163)이 보충된 DMEM 배지(ThermoFisher®, 카탈로그 번호 10569010)에서 배양하였다. 세포를 95% 공기와 5% CO2가 함유된 포화 습도 분위기 하 37℃에서 유지시켰다. 세포(3×104개 세포/웰)를 96웰 플레이트(Corning®, 카탈로그 번호 354650)에 씨딩하고, 10% FBS가 보충된 DMEM 배지에 웰당 100 μL로 24시간 동안 배양하여 트랜스펙션 전 대략 70% 내지 80% 컨플루언스(confluence)에 이르게 하였다. 24시간 후, HepG2 세포를, 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 3000 시약(ThermoFisher®, 카탈로그 번호 L3000015)을 사용하여, 각각의 웰에 대해 총량 100 ng의 DNA(여기서 ceDNA 양은 10 ng이었고, 나머지는 담체 DNA(Promega®, 카탈로그 번호 E4882)였음)로 일시적으로 트랜스펙션시켰다. 간략하게, 트랜스펙션을 위해, 별도의 튜브에, 필요한 양의 리포펙타민 3000 시약, 중쇄 대 경쇄 몰비가 상이한 DNA를 각각 Opti-MEM 저혈청 배지(ThermoFisher®, 카탈로그 번호 31985-062)에 희석하고; 이어서 P3000 시약을 희석된 DNA에 첨가하였다. P3000 시약과 함께인 희석된 DNA를 희석된 리포펙타민 3000 시약에 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 생성된 복합체 10 μL를 새로 보충된 완전 배지 중 세포에 첨가하고, 트랜스펙션 플레이트를 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션하였다.트랜스펙션 72시간 후 트랜스펙션 상청액에서 항체 역가를 측정하였다.HC:LC 몰비의 시험관내 스크리닝을 예시한 도 9에 제시된 바와 같이, ceDNA를 이용한 간 IgG 발현은 1.5:1 내지 2:1 범위의 더 높은 HC:LC 몰비를 이용한 경우 증강되었다. 도 9에 제시된 바와 같이, 3:2의 HC 대 LC 몰비(1.5:1)가 이중 벡터 ceDNA 작제물 쌍에 대해 최적이었다.
유체역학적 생체내 예
다음으로, HC와 LC의 몰비가 다양한 ceDNA 벡터 작제물을 사용하여 생체내 스크리닝을 수행하였다. 하나의 군은, 고정된 용량의 HC를 인코딩하는 ceDNA와 가변적인 용량의 LC를 인코딩하는 ceDNA를 포함하는 제형을 이용하였다. 간략하게, ceDNA를 C57Bl/6 마우스(6주령; Jackson Laboratories)에 유체역학적 정맥내(IV) 주사로 전달하였다. ceDNA를 PBS에 희석하고, 고정 부피(90 mL/g 내지 100 mL/g)로 5초의 기간에 걸쳐 측면 꼬리 정맥에 신속하게 주사하였다. 중쇄(ceDNA 1859) 인코딩 ceDNA와 경쇄(ceDNA 1856) 인코딩 ceDNA를 사전 혼합하고, 명시된 몰비로 전달하였다. 중쇄 또는 경쇄 중 하나의 용량은 고정시키고, 동족 사슬의 용량은 증가시키면서 동물에 투여하였다. 투여 후 3일차에 혈청 샘플을 수집하였다.
도 10에 제시된 바와 같이, LC 또는 HC를 인코딩하는 ceDNA의 고정 용량에서, HC의 용량을 증가시키면 발현이 개선되었지만, LC의 용량을 증가시키면 효과가 제한되었다. 이러한 결과는 시험관내 결과와 일치하며, HC:LC의 비가 >1 내지 2인 경우가 바람직함을 시사한다.
종합하면, 본원에 보고된 결과는 작제물 설계에 대한 중요한 통찰력을 제공하며, ceDNA 벡터 설계와 HC:LC 몰비를 추가로 최적화하여 항체 치료제 또는 진단제를 대상에게 전달할 수 있는 기회를 제공한다. 결과는, LNP 내 이중 벡터를 이용한 기능성 발현이 mAb 발현을 최적화하기 위한 추가의 자유도를 가능하게 함을 보여주었다. 나아가, 결과는, 공통 발현 카세트를 HC와 LC 둘 모두에 대해 사용할 수 있으며, 단일, 이중 ORF 또는 F/2A 벡터를 이용하여 발현을 최적하는 데 필요한 요건을 잠재적으로 제거할 수 있음을 보여주었다.
실시예 8: 세포주에서 생산된 재조합 항-SARS-Cov2 S 항체와 ceDNA 이중 벡터(HC/LC)로 처리된 마우스에서 생산되고 정제된 항-SARS-Cov2 S 항체에 대한 비교 시험관내 이펙터 기능 연구.
본 연구의 목적은 플라스미드 유래 항-SARS-CoV2 항체와 ceDNA 유래 항-SARS-CoV2 항체의 결합 친화도를 비교하기 위한 것이었다. CHO(중국 햄스터 난소) 세포를 문헌[Stettler et al., Science, 2016, 353(6301):823-826]에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 항-SARS-CoV2 HC 및 LC를 발현하는 플라스미드로 일시적으로 공동 트랜스펙션시켜, 플라스미드 유래 단클론 항체를 생성하였다. 본원에 기재된 바와 같은 항-SARS-CoV2 HC 또는 LC를 인코딩하는 네이키드 ceDNA를 C57/Bl6 마우스의 꼬리 정맥에 유체역학적 IV 주사로 전달하여 ceDNA 유래 항-SARS-CoV2 항체를 생성하였다. 이러한 방법을 통한 DNA의 전달은 주로 간에서 외래 DNA의 효율적인 생체내 트랜스펙션을 가능하게 하였다(예를 들어, 문헌[Kim & Ahituv, Methods Mol Biol. 2013; 1015: 279―289] 참조). 따라서, 마우스의 간에서 항체를 생산한 후, 혈청에서 수집하고 정제하여, ceDNA 생성 항체를 수득하였다.
항체 1과 항체 2는 2003 SARS-CoV 생존자에서 확인된 모 항체에서 유도된 변형된 항체였다. 항체 1과 항체 2 둘 모두의 가변 영역을 반감기가 연장되도록 개발하였으며, 여기서 항체 1은 단일 "LS" 돌연변이로 조작하였고, 항체 2는 "LS" 및 "GAALIE" 이중 변형으로 조작하였다. 구체적으로, 두 가지 항체 모두 신생아 Fc 수용체에의 결합에 의해 연장된 반감기를 부여하는 본원에 정의된 바와 같은 Fc "LS" 돌연변이를 가지고 있었다. 항체 2는 본원에 정의된 바와 같은 Fc에 대한 추가의 "GAALIE" 변형을 제외하고는 항체 1과 동일하였다. "GAALIE" 변형은, 특히 시험관내에서 FcγRIIIa 수용체에 대한 결합을 증강시키고, 생체내 바이러스 호흡기 감염의 맥락에서 보호성 CD8+ T세포를 유발하는 것으로 확인되었다.
하기 항체를 시험하였다: 항체 1(세포주 유래), 시험관내에서 트랜스펙션된 CHO 세포에서 재조합적으로 생산된 단일 "LS" 돌연변이체; ceDNA 항체 1, 유체역학적 IV 주사를 통해 ceDNA(본원에 기재된 바와 같은 HC와 LC)로 처리된 마우스에서 생산되고, 주사 3일 후 처리된 마우스의 혈청에서 정제된 단일 "LS" 돌연변이체; 항체 2, 시험관내에서 CHO 세포에서 재조합적으로 생산된 "LS"와 "GAALIE"의 이중 변형을 가짐; ceDNA 항체 2, 유체역학적 IV 주사를 통해 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA HC/LC 이중 벡터로 처리된 마우스에서 생산되고, 유체역학적 주사 3일 후 처리된 마우스의 혈청에서 정제된 "LS"와 "GAALIE"의 이중 변형을 가짐. 해리 상수(K D)를 측정하기 위해, OCTET® FAB2G 바이오센서의 기준선을 먼저 2x 완충액(PBS 중 0.02% BSA, 0.004% Tween-20 함유)에서 60초 동안 보정하였다. 이어서, 항체 샘플을30 nM로 300초 동안 로딩하였다. 상기 언급된 바와 동일한 유형의 완충액에서 바이오센서로 다시 기준선을 측정하였다. 이어서, FcγRIIIa 수용체("V"로 지정된 다형체 또는 "F"로 지정된 다형체)를 다양한 농도(약 3 nM 내지 약 300 nM, 상기 범위에서 4개 내지 7개의 상이한 농도 적용)로 시험된 항체와 480초 동안 회합시킨 후, 480초 동안 해리시키고, 바이오센서로 해리 상수(K D) 값을 측정하고, 소프트웨어 OCTET® Analysis Studio를 사용하여 계산하였다.
해리 상수(K D) 값은 표 12와, 또한 도 11a(FcγRIIIa-V의 경우) 및 도 11b(FcγRIIIa-F의 경우)에 제시되어 있다. 표 12는, 측정되고 계산된 모든 K D 값이 >0.95의 통계적 회귀값(R2)을 나타내며, 이는 측정된 모든 데이터가 회귀 모델에 매우 잘 부합함을 나타낸다.
[표 12]
Figure pct00017
K D 값이 낮을수록 결합 친화도가 높다는 것을 나타낸다. 표 12와, 또한 도 11a 및 도 11b에 제시된 바와 같이, ceDNA가 유체역학적으로 주사된 마우스에서 생산된 항체와 재조합적으로 생산된 항체("세포주")를 비교할 때, 수용체(FcγRIIIa-V 및 FcγRIIIa-F)에 대한 항체의 결합 친화도의 극적인 증가가 있었다. 예상한 바와 같이, 항체 2는, 세포주 유래 또는 ceDNA 유래이든, FcγRIIIa-V 또는 FcγRIIIa-F이든, 각각의 항체 1 대응물보다 더 높은 결합 친화도를 나타냈다. 하지만, ceDNA 유래 항체(본원에 기재된 바와 같은 ceDNA HC/LC 이중 벡터)의 생체내 간 발현은 전형적인 포유류 세포주에서 재조합적으로 생산된 단클론 항체와 비교하여 훨씬 탁월한 결합 성능을 달성하였다. 이론에 구애됨 없이, 이는 간에서 생산된 ceDNA 유래 항체의 비푸코실화(afucosylation) 수준이 높아졌기 때문일 수 있으며, GDP-푸코오스 공여체 기질에서 수용체 기질로 L-푸코오스 당을 전달하는 효소가 존재하지 않을 것으로 예상된다. 이는, 결국, 항체가 비푸코실화될 때, 항체 의존적 세포독성(ADCC)이 또한 증가하기 때문에 이펙터 기능의 수준이 증가하게 될 수 있다.
종합하면, 이러한 결과는, ceDNA 유래 항체를 생성하기 위해 ceDNA를 간으로 전달하면 FcγRIIIa에 대한 친화도가 증강된 항체가 생산되며, 이는 생체내 치료용 항체 생산을 위한 새롭고 개선된 플랫폼을 나타냄을 입증한다.
실시예 9: 세포주 유래 항-VEGF 항체와 ceDNA 유래 항-VEGF 항체에 대한 비교 시험관내 이펙터 기능 연구
본 연구의 목적은 세포주 유래 항-VEGF 항체와 ceDNA 유래 항-VEGF 항체의 결합 친화도를 비교하기 위한 것이었다. VEGF 단클론 항체 베바시주맙과 라니비주맙(ranibizumab)을 사용하였다.
CHO(중국 햄스터 난소) 세포를 문헌[Stettler et al., Science, 2016, 353(6301):823-826]에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 베바시주맙(Fab 중쇄: Accession 7V5N_F; Fab 경쇄: Accession 7V5N_E) 또는 라니비주맙(중쇄 AB 단편: Accession: QWX93388.1; 경쇄 Ab 단편: Accession QWX93389.1)을 발현하는 플라스미드로 일시적으로 공동 트랜스펙션시켜, 세포주 유래 단클론 항체를 생성하였다. 본원에 기재된 바와 같은 단일 또는 이중 벡터 시스템에서 베바시주맙과 라니비주맙을 인코딩하는 네이키드 ceDNA를 C57/Bl6 마우스의 꼬리 정맥에 유체역학적 IV 주사로 전달하여, ceDNA 유래 베바시주맙과 ceDNA 유래 라니비주맙을 생성하였다. 이러한 방법을 통한 ceDNA의 전달은 주로 간에서 ceDNA의 효율적인 생체내 트랜스펙션을 가능하게 하였다(예를 들어, 문헌[Kim & Ahituv, Methods Mol Biol. 2013; 1015: 279―289] 참조). 따라서, 마우스의 간에서 생산된 후, 혈청에서 수집되고 정제된 결과로 얻은 항-VEGF 항체는, CHO 세포에서 생성된 대응물과 비교하여 FcγRIIIa에 대한 더 높은 친화도와 항체 의존적 세포독성(ADCC)의 상승된 수준을 나타낼 것이다.
이는 또한, FcγRIIIa에 대한 결합 친화도가 더 높은 항체를 이용한 치료를 필요로 하는 인간 대상의 간에서 FcγRIIIa에 대한 결합 친화도 수준이 증가된 항체를 생산하는 강력한 치료제로서 ceDNA를 효과적으로 구현할 수 있음을 시사한다.
참고문헌
본 명세서 및 본원의 실시예에 인용된, 비제한적으로, 특허 및 특허출원을 포함하는 모든 간행물 및 참고문헌은, 각각의 개별적인 간행물 또는 참고문헌이 구체적으로 및 개별적으로 완전하게 기재된 것으로서 본원에 참조로 인용되는 것으로 표시된 바와 같이, 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 본 출원이 우선권을 주장하는 임의의 특허출원 또한 간행물 및 참고문헌에 대해 상기 기재된 방식으로 본원에 참조로 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENERATION BIO CO. <120> NON-VIRAL DNA VECTORS EXPRESSING THERAPEUTIC ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> 131698-08520 <140> PCT/US2022/026560 <141> 2022-04-27 <150> 63/180,382 <151> 2021-04-27 <160> 419 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 141 <212> DNA <213> Adeno-associated virus 2 <400> 1 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 2 <211> 141 <212> DNA <213> Adeno-associated virus 2 <400> 2 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <400> 4 000 <210> 5 <211> 143 <212> DNA <213> Adeno-associated virus <400> 5 ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga ggtctcctct gccggcccca ccgagcgagc gacgcgcgca gagagggagt 120 gggcaactcc atcactaggg taa 143 <210> 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 35 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcgcc cgggcgtcgg gcgacctttg 60 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120 ggggttcct 129 <210> 36 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 36 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcaaa gcctcagtga gcgagcgagc 60 gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc t 101 <210> 37 <211> 139 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 37 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacttt gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac 120 tccatcacta ggggttcct 139 <210> 38 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 38 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 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137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 42 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccggaaaccg ggcgtcgggc 60 gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 120 catcactagg ggttcct 137 <210> 43 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 43 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgaaacggg cgtcgggcga 60 cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120 tcactagggg ttcct 135 <210> 44 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 44 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccaaagggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt cct 133 <210> 45 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 45 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc caaaggcgtc gggcgacctt 60 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120 taggggttcc t 131 <210> 46 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 46 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc aaagcgtcgg gcgacctttg 60 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120 ggggttcct 129 <210> 47 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 47 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccga aacgtcgggc gacctttggt 60 cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg 120 ggttcct 127 <210> 48 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 48 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 49 <400> 49 000 <210> 50 <400> 50 000 <210> 51 <400> 51 000 <210> 52 <400> 52 000 <210> 53 <400> 53 000 <210> 54 <400> 54 000 <210> 55 <400> 55 000 <210> 56 <400> 56 000 <210> 57 <400> 57 000 <210> 58 <400> 58 000 <210> 59 <400> 59 000 <210> 60 <211> 16 <212> DNA <213> Adeno-associated virus 2 <400> 60 gcgcgctcgc tcgctc 16 <210> 61 <400> 61 000 <210> 62 <400> 62 000 <210> 63 <400> 63 000 <210> 64 <400> 64 000 <210> 65 <400> 65 000 <210> 66 <400> 66 000 <210> 67 <400> 67 000 <210> 68 <400> 68 000 <210> 69 <400> 69 000 <210> 70 <400> 70 000 <210> 71 <400> 71 000 <210> 72 <400> 72 000 <210> 73 <400> 73 000 <210> 74 <400> 74 000 <210> 75 <400> 75 000 <210> 76 <400> 76 000 <210> 77 <400> 77 000 <210> 78 <400> 78 000 <210> 79 <400> 79 000 <210> 80 <400> 80 000 <210> 81 <400> 81 000 <210> 82 <400> 82 000 <210> 83 <400> 83 000 <210> 84 <400> 84 000 <210> 85 <400> 85 000 <210> 86 <400> 86 000 <210> 87 <400> 87 000 <210> 88 <400> 88 000 <210> 89 <400> 89 000 <210> 90 <400> 90 000 <210> 91 <400> 91 000 <210> 92 <400> 92 000 <210> 93 <400> 93 000 <210> 94 <400> 94 000 <210> 95 <400> 95 000 <210> 96 <400> 96 000 <210> 97 <400> 97 000 <210> 98 <400> 98 000 <210> 99 <400> 99 000 <210> 100 <400> 100 000 <210> 101 <400> 101 000 <210> 102 <400> 102 000 <210> 103 <400> 103 000 <210> 104 <400> 104 000 <210> 105 <400> 105 000 <210> 106 <400> 106 000 <210> 107 <400> 107 000 <210> 108 <400> 108 000 <210> 109 <400> 109 000 <210> 110 <400> 110 000 <210> 111 <400> 111 000 <210> 112 <400> 112 000 <210> 113 <400> 113 000 <210> 114 <400> 114 000 <210> 115 <400> 115 000 <210> 116 <400> 116 000 <210> 117 <400> 117 000 <210> 118 <400> 118 000 <210> 119 <400> 119 000 <210> 120 <400> 120 000 <210> 121 <400> 121 000 <210> 122 <400> 122 000 <210> 123 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 gtttaaac 8 <210> 124 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 ttaattaa 8 <210> 125 <400> 125 000 <210> 126 <400> 126 000 <210> 127 <400> 127 000 <210> 128 <400> 128 000 <210> 129 <400> 129 000 <210> 130 <400> 130 000 <210> 131 <400> 131 000 <210> 132 <400> 132 000 <210> 133 <400> 133 000 <210> 134 <400> 134 000 <210> 135 <400> 135 000 <210> 136 <400> 136 000 <210> 137 <400> 137 000 <210> 138 <400> 138 000 <210> 139 <400> 139 000 <210> 140 <400> 140 000 <210> 141 <400> 141 000 <210> 142 <400> 142 000 <210> 143 <400> 143 000 <210> 144 <400> 144 000 <210> 145 <400> 145 000 <210> 146 <400> 146 000 <210> 147 <400> 147 000 <210> 148 <400> 148 000 <210> 149 <400> 149 000 <210> 150 <400> 150 000 <210> 151 <400> 151 000 <210> 152 <400> 152 000 <210> 153 <400> 153 000 <210> 154 <400> 154 000 <210> 155 <400> 155 000 <210> 156 <400> 156 000 <210> 157 <400> 157 000 <210> 158 <400> 158 000 <210> 159 <400> 159 000 <210> 160 <400> 160 000 <210> 161 <400> 161 000 <210> 162 <400> 162 000 <210> 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 405 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatcgcggc 180 cgcgggggag gctgctggtg aatattaacc aaggtcaccc cagttatcgg aggagcaaac 240 aggggctaag tccaccgggg gaggctgctg gtgaatatta accaaggtca ccccagttat 300 cggaggagca aacaggggct aagtccaccg ggggaggctg ctggtgaata ttaaccaagg 360 tcaccccagt tatcggagga gcaaacaggg gctaagtcca cggtacccac tgggaggatg 420 ttgagtaaga tggaaaacta ctgatgaccc ttgcagagac agagtattag gacatgtttg 480 aacaggggcc gggcgatcag caggtagctc tagaggatcc ccgtctgtct gcacatttcg 540 tagagcgagt gttccgatac tctaatctcc ctaggcaagg ttcatatttg tgtaggttac 600 ttattctcct tttgttgact aagtcaataa tcagaatcag caggtttgga gtcagcttgg 660 cagggatcag cagcctgggt tggaaggagg gggtataaaa gccccttcac caggagaagc 720 cgtcacacag atccacaagc tcctgaagag gtaagggttt aagggatggt tggttggtgg 780 ggtattaatg tttaattacc tggagcacct gcctgaaatc actttttttc aggttgggtt 840 taaaccgcag ccaccatgga attcggcctg tcctgggtct ttctggtggc catcctgaag 900 ggcgtgcagt gccaggtcca gctggttcag agcggcgccg aggttaagaa acctggcgcc 960 agcgtgaaag tgtcctgcaa ggccagcggc taccccttca ccagctacgg catctcttgg 1020 gtgcggcagg cccctggaca aggactggag tggatgggat ggatcagcac ttaccagggc 1080 aataccaact acgcccagaa attccagggc agagtgacaa tgaccaccga caccagcaca 1140 accacaggct acatggaact gcggagactg agaagcgatg atacagccgt gtactactgc 1200 gccagagatt atacaagagg tgcttggttc ggcgagagcc tgatcggcgg attcgacaac 1260 tggggacaag gcaccctggt gaccgtgtca tccgcctcta ccaagggccc tagcgtgttt 1320 ccactggccc ctagctctaa aagcacaagc ggcggcaccg ccgctctggg atgtctggtg 1380 aaggactact tcccagagcc cgtgaccgtg agctggaaca gcggcgctct cacatctggg 1440 gtgcatacct ttcccgccgt gctgcagtct tctggactgt acagcctgag cagcgtggtg 1500 accgtgccct ccagcagcct gggcacacag acctacatct gcaacgtgaa ccacaagcca 1560 tctaatacca aggtggataa gaaggtggaa cctaagagct gtgacaagac acacacatgc 1620 cccccctgcc ctgctcctga gctgctggcc ggcccctccg tgtttctctt ccctcctaaa 1680 cccaaggaca cactgatgat tagccggacc ccagaggtga cctgtgtggt ggttgacgtg 1740 agtcacgaag atcctgaagt gaagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataac 1800 gccaaaacca agcctcggga agagcagtac aacagcacct atagagtggt gagcgtgctt 1860 acagtgctgc atcaggactg gctgaacggc aaggaataca agtgcaaggt gtccaacaaa 1920 gccctgcctc tgcctgaaga aaagaccatc agcaaggcca agggccaacc aagagagcct 1980 caagtgtaca ccctgccccc cagcagagat gagctgacca agaatcaggt gtccctgacc 2040 tgcctggtca aaggcttcta ccctagcgac atcgccgtcg agtgggagag caatggccag 2100 cctgagaaca actacaagac cacccctcct gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg 2160 tatagcaagc tgaccgtgga caagtccagg tggcagcagg gcaatgtgtt cagctgtagc 2220 gtgctgcacg aggccctgca cagccactac acacagaagt ctctgagcct gtctcctggc 2280 aagtgatagt taattaagag catcttaccg ccatttattc ccatatttgt tctgtttttc 2340 ttgatttggg tatacattta aatgttaata aaacaaaatg gtggggcaat catttacatt 2400 tttagggata tgtaattact agttcaggtg tattgccaca agacaaacat gttaagaaac 2460 tttcccgtta tttacgctct gttcctgtta atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa 2520 gattgactga tattcttaac tatgttgctc cttttacgct gtgtggatat gctgctttat 2580 agcctctgta tctagctatt gcttcccgta cggctttcgt tttctcctcc ttgtataaat 2640 cctggttgct gtctctttta gaggagttgt ggcccgttgt ccgtcaacgt ggcgtggtgt 2700 gctctgtgtt tgctgacgca acccccactg gctggggcat tgccaccacc tgtcaactcc 2760 tttctgggac tttcgctttc cccctcccga tcgccacggc agaactcatc gccgcctgcc 2820 ttgcccgctg ctggacaggg gctaggttgc tgggcactga taattccgtg gtgttgtctg 2880 tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 2940 aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 3000 gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 3060 aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggctctagag atggctacgt 3120 agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacacctgc aggaggaacc cctagtgatg 3180 gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc 3240 gcccgacgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 3293 <210> 406 <211> 3283 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 406 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatcgcggc 180 cgcgggggag gctgctggtg aatattaacc aaggtcaccc cagttatcgg aggagcaaac 240 aggggctaag tccaccgggg gaggctgctg gtgaatatta accaaggtca ccccagttat 300 cggaggagca aacaggggct aagtccaccg ggggaggctg ctggtgaata ttaaccaagg 360 tcaccccagt tatcggagga gcaaacaggg gctaagtcca cggtacccac tgggaggatg 420 ttgagtaaga tggaaaacta ctgatgaccc ttgcagagac agagtattag gacatgtttg 480 aacaggggcc gggcgatcag caggtagctc tagaggatcc ccgtctgtct gcacatttcg 540 tagagcgagt gttccgatac tctaatctcc ctaggcaagg ttcatatttg tgtaggttac 600 ttattctcct tttgttgact aagtcaataa tcagaatcag caggtttgga gtcagcttgg 660 cagggatcag cagcctgggt tggaaggagg gggtataaaa gccccttcac caggagaagc 720 cgtcacacag atccacaagc tcctgaagag gtaagggttt aagggatggt tggttggtgg 780 ggtattaatg tttaattacc tggagcacct gcctgaaatc actttttttc aggttgggtt 840 taaaccgcag ccaccatgga attcggcctg agctgggtgt tcctggtggc tatcctgaag 900 ggcgtgcagt gccaggtgca gctggttcag agcggcgctg aggttaagaa acctggcgct 960 agcgtgaaag tgagctgcaa ggctagcggc taccctttca caagctacgg catctcttgg 1020 gtgcggcagg ctcctggaca aggactggag tggatgggat ggatcagcac ttaccagggc 1080 aatacaaact acgctcagaa attccagggc agagtgacaa tgacaacaga cacaagcaca 1140 acaacaggct acatggaact gcggagactg agaagcgacg acacagctgt gtactactgc 1200 gctagagact atacaagagg cgcttggttc ggcgagagcc tgatcggcgg attcgacaac 1260 tggggacaag gcacactggt gacagtgtca agcgcttcta caaagggccc tagcgtgttc 1320 ccactggctc ctagctctaa aagcacaagc ggcggcacag ctgctctggg atgcctggtg 1380 aaggactact tcccagagcc tgtgacagtg agctggaaca gcggcgctct gacatctggg 1440 gtgcacacat tccctgctgt gctgcagtct tctggactgt acagcctgag cagcgtggtg 1500 acagtgccta gcagcagcct gggcacacag acatacatct gcaacgtgaa ccacaagcca 1560 tctaatacaa aggtggacaa gaaggtggaa cctaagagct gcgacaagac acacacatgc 1620 cctccttgcc ctgctcctga gctgctggct ggccctagcg tgttcctgtt ccctcctaaa 1680 cctaaggaca cactgatgat tagccggaca ccagaggtga cctgcgtggt ggttgacgtg 1740 agccacgaag accctgaagt gaagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac 1800 gctaaaacaa agcctcggga agagcagtac aacagcacat atagagtggt gagcgtgctt 1860 acagtgctgc accaggactg gctgaacggc aaggaataca agtgcaaggt gagcaacaaa 1920 gctctgcctc tgcctgaaga aaagacaatc agcaaggcta agggccaacc aagagagcct 1980 caagtgtaca cactgcctcc tagcagagac gagctgacaa agaatcaggt gagcctgaca 2040 tgcctggtga aaggcttcta ccctagcgac atcgctgtgg agtgggagag caatggccag 2100 cctgagaaca actacaagac aacacctcct gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg 2160 tatagcaagc tgacagtgga caagagcagg tggcagcagg gcaatgtgtt cagctgcagc 2220 gtgctgcacg aggctctgca cagccactac acacagaagt ctctgagcct gtctcctggc 2280 aagtgatagt taattaagag catcttaccg ccatttattc ccatatttgt tctgtttttc 2340 ttgatttggg tatacattta aatgttaata aaacaaaatg gtggggcaat catttacatt 2400 tttagggata tgtaattact agttcaggtg tattgccaca gacaaacatg ttaagaaact 2460 ttcccgttat ttacgctctg ttcctgttaa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag 2520 attgactgat attcttaact atgttgctcc ttttacgctg tgtggatatg ctgctttata 2580 gcctctgtat ctagctattg cttcccgtac ggctttcgtt ttctcctcct tgtataaatc 2640 ctggttgctg tctcttttag aggagttgtg gcccgttgtc cgtcaacgtg gcgtggtgtg 2700 ctctgtgttt gctgacgcaa cccccactgg ctggggcatg ccaccacctg tcaactcctt 2760 tctgggactt tcgctttccc cctcccgatc gccacggcag aactcatcgc cgcctgcctt 2820 gcccgctgct ggacaggggc taggttgctg ggcactgaaa ttccgtggtg ttgtctgtgc 2880 cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag 2940 gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaatt gcatcgcatt gtctgagtag 3000 gtgtcattct attctggggg tggggtgggg caggaagcaa gggggaggat tgggaagaca 3060 atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggctct agagatggct acgtagataa 3120 gtacatggcg ggttaatcat taactacacc tgcaggagga accctagtga tggagttggc 3180 cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg 3240 cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 3283 <210> 407 <211> 2574 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 407 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatcgcggc 180 cgcgggggag gctgctggtg aatattaacc aaggtcaccc cagttatcgg aggagcaaac 240 aggggctaag tccaccgggg gaggctgctg gtgaatatta accaaggtca ccccagttat 300 cggaggagca aacaggggct aagtccaccg ggggaggctg ctggtgaata ttaaccaagg 360 tcaccccagt tatcggagga gcaaacaggg gctaagtcca cggtacccac tgggaggatg 420 ttgagtaaga tggaaaacta ctgatgaccc ttgcagagac agagtattag gacatgtttg 480 aacaggggcc gggcgatcag caggtagctc tagaggatcc ccgtctgtct gcacatttcg 540 tagagcgagt gttccgatac tctaatctcc ctaggcaagg ttcatatttg tgtaggttac 600 ttattctcct tttgttgact aagtcaataa tcagaatcag caggtttgga gtcagcttgg 660 cagggatcag cagcctgggt tggaaggagg gggtataaaa gccccttcac caggagaagc 720 cgtcacacag atccacaagc tcctgaagag gtaagggttt aagggatggt tggttggtgg 780 ggtattaatg tttaattacc tggagcacct gcctgaaatc actttttttc aggttgggtt 840 taaaccgcag ccaccatgga catgagagtg cctgctcagc tgctgggcct gctgctgctg 900 tggctgagcg gagctagatg cgaaatcgtg ctgacccaga gccctggcac cctgagcctg 960 tcacctggcg aacgggctac cctgtcttgc agagcttctc agaccgtgag cagcaccagc 1020 ctggcttggt accagcagaa acctggacag gctcctagac tgctgatcta cggagcttct 1080 agcagagcta ccggcatccc tgacagattc agcggcagcg gcagcggcac tgacttcacc 1140 ctgacaatta gccggctgga acctgaggac ttcgctgtgt attactgcca gcaacacgac 1200 accagcctga cattcggcgg cggaaccaaa gttgagatca agcggaccgt ggctgctcca 1260 tctgtgttca tcttcccacc tagcgacgag cagctgaaga gcggcacagc ttctgtggtg 1320 tgcctgctga acaacttcta ccctcgggag gctaaggtgc agtggaaggt ggacaacgct 1380 ctgcaaagcg gcaacagcca ggagagcgtg acagaacagg acagcaagga ctctacatac 1440 agcctgagca gcacactgac cctgagcaag gctgactacg agaagcacaa ggtttacgct 1500 tgcgaggtga cccaccaggg cctgagcagc cctgtgacaa agagcttcaa tagaggcgaa 1560 tgctgatagt taattaagag catcttaccg ccatttattc ccatatttgt tctgtttttc 1620 ttgatttggg tatacattta aatgttaata aaacaaaatg gtggggcaat catttacatt 1680 tttagggata tgtaattact agttcaggtg tattgccaca agacaaacat gttaagaaac 1740 tttcccgtta tttacgctct gttcctgtta atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa 1800 gattgactga tattcttaac tatgttgctc cttttacgct gtgtggatat gctgctttat 1860 agcctctgta tctagctatt gcttcccgta cggctttcgt tttctcctcc ttgtataaat 1920 cctggttgct gtctctttta gaggagttgt ggcccgttgt ccgtcaacgt ggcgtggtgt 1980 gctctgtgtt tgctgacgca acccccactg gctggggcat tgccaccacc tgtcaactcc 2040 tttctgggac tttcgctttc cccctcccga tcgccacggc agaactcatc gccgcctgcc 2100 ttgcccgctg ctggacaggg gctaggttgc tgggcactga taattccgtg gtgttgtctg 2160 tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 2220 aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 2280 gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 2340 aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggctctagag catggctacg 2400 tagataagta gcatggcggg ttaatcatta actacacctg caggaggaac ccctagtgat 2460 ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt 2520 cgcccgacgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcctg cagg 2574 <210> 408 <211> 6156 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 408 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgtagttaa tgattaaccc gccatgctac ttatctacgt 180 agccatgcat atgtaccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacatc 240 tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg tttattgcag 300 cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt 360 cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtaaaa 420 tacagcatag caaaacttta acctccaaat caagcctcta cttgaatcct tttctgaggg 480 atgaataagg cataggcatc aggggctgtt gccaatgtgc attagctgtt tgcagcctca 540 ccttctttca tggagtttaa gatatagtgt attttcccaa ggtttgaact agctcttcat 600 ttctttatgt tttaaatgca ctgacctccc acattccctt tttagtaaaa tattcagaaa 660 taatttaaat acatcattgc aatgaaaata aatgtttttt attaggcaga atccagatgc 720 tcaaggccct tcataatatc ccccagttta gtagttggac ttagggaaca aaggaacctt 780 taatagaaat tggacagcaa gaaagcgagc ttaattaact atcaacattc gcctctattg 840 aagctctttg tcacagggct ggacaggccc tggtgggtca cctcgcaggc gtaaaccttg 900 tgcttctcgt aatcggcctt gctgagggtc agtgtgctgc tcaggctgta tgtagagtcc 960 ttgctgtcct gttctgtgac gctctcctgg ctgttgccgc tttgcagggc gttgtccacc 1020 ttccactgca ccttggcctc gcgagggtag aagttgttga gcaggcacac cacagaggct 1080 gtgccggact tcagctgctc gtcgctaggt ggaaagatga acacagatgg agcggccacg 1140 gtccgcttga tctcaacttt ggttccgccg ccgaatgtca ggctggtgtc gtgttgctgg 1200 cagtaataca cggcaaagtc ctcaggttcc agccggctaa ttgtcagggt gaaatcagtg 1260 ccgctgccgc tgccgctgaa tctatcgggg atgccggtgg ctctactaga agctccgtag 1320 atcagcagtc taggagcctg tccaggtttc tgctggtacc aggccaggct ggtgctggac 1380 acggtctgag aggctctaca agacagggta gcccgttcgc cgggtgacag gctcagggtg 1440 ccagggctct gggtcagcac gatttcgcat ctggctccgg acagccacag cagcagcagg 1500 cccagcagct gggcgggcac tctcatgtcc atggtggctg cggtttaaac tcagttccaa 1560 aggttggaat ctaaaagaga gaaacaatta gaatcagtag tttaacacat tatacactta 1620 aaaattttat atttacctta gagtaattat tcactgtccc aggtcagtgg tggtgcctga 1680 agctgaggag acagggccct gtcctcgtcc gtatttaagc agtggatcca gaggggcaac 1740 gggggaggct gctggtgaat attaaccaag gtcaccccag ttatcggagg agcaaacagg 1800 ggctaagtcc actggctggg atctgagtcg cccgcctacg ctgcccggac gctttgcctg 1860 ggcagtgtac agcttccact gcacttaccg aaaggagtca ttgtacctgg ctcagaaacc 1920 acagcgtcct gtgtccaagg tggagggggt ggcgtgagtc agacagtctc tgggagagta 1980 ccacttagct ggccctctgc tctcactgca gaatccttag tggctgttcc actggtagca 2040 agatccagta cctctagacc agcctgacca acatggtgaa accccgtccc tgtcaaaaat 2100 agaaaaaatt agccgggtgt ggtggcacag gcctgtaatc ccagttactt gggaggctga 2160 ggctgaccaa catggagaaa cccgtctcta ctaaaaatag aaaattagcc aggtgtggtg 2220 gcacatgctt gtaatcccag ctacttggga ggctgaggca ggggaaggtt gtggtgagat 2280 gagattgtgt cactgcactc cagcctgggc gacagagcaa acctccatct caaaaaacaa 2340 aacaaaacaa aacaaaaaaa ccaaatgttt atttgccaca aaaaccctat cagatgggcg 2400 tctttatcat ttccattgta cagatgggga aacaggcttc ggggtcgggg catagccact 2460 tactgacgac tccccaccca gcaagtggtt ttgaacccgg accctctcac actacctaaa 2520 ccacgccagg acaacctctg ctcctctcca ccgaaattcc aaggggtcga gtggatgttg 2580 gaggtggcat gggcccagag aggtctctga cctctgcccc agctccaagg tcagcaggca 2640 gggagggctg tgtgtttgct gtttgctgct tgcaatgttt gcccatttta gggacatgag 2700 taggctgaag tttgttcagt gtggacttca gaggcagcac acaaacagct gctggaggat 2760 gggaactgag gggttggaag ggggcagggt gagcccagaa actcctgtgt gcctctgagc 2820 ctacattctt aactaccctc cgccctactc ctgtccctcc cccatttcct gtttgcagta 2880 cccaaggcaa atattagtct aagtaggaca gagggacaaa gagcaggaac acggggaggc 2940 acaagttctc gcatcgattg taccaaagta caagcgttaa tgattaactg taccaaagta 3000 caagcgttaa tgattaactg taccaaagta caagcgttaa tgattaacgg gggaggctgc 3060 tggtgaatat taaccaaggt caccccagtt atcggaggag caaacagggg ctaagtccac 3120 cgggggaggc tgctggtgaa tattaaccaa ggtcacccca gttatcggag gagcaaacag 3180 gggctaagtc caccggggga ggctgctggt gaatattaac caaggtcacc ccagttatcg 3240 gaggagcaaa caggggctaa gtccacggta cccactggga ggatgttgag taagatggaa 3300 aactactgat gacccttgca gagacagagt attaggacat gtttgaacag gggccgggcg 3360 atcagcaggt agctctagag gatccccgtc tgtctgcaca tttcgtagag cgagtgttcc 3420 gatactctaa tctccctagg caaggttcat atttgtgtag gttacttatt ctccttttgt 3480 tgactaagtc aataatcaga atcagcaggt ttggagtcag cttggcaggg atcagcagcc 3540 tgggttggaa ggagggggta taaaagcccc ttcaccagga gaagccgtca cacagatcca 3600 caagctcctg aagaggtaag ggtttaaggg atggttggtt ggtggggtat taatgtttaa 3660 ttacctggag cacctgcctg aaatcacttt ttttcaggtt ggaccaggtc gcagccacca 3720 tggaattcgg cctgtcctgg gtctttctgg tggccatcct gaagggcgtg cagtgccagg 3780 tccagctggt tcagagcggc gccgaggtta agaaacctgg cgccagcgtg aaagtgtcct 3840 gcaaggccag cggctacccc ttcaccagct acggcatctc ttgggtgcgg caggcccctg 3900 gacaaggact ggagtggatg ggatggatca gcacttacca gggcaatacc aactacgccc 3960 agaaattcca gggcagagtg acaatgacca ccgacaccag cacaaccaca ggctacatgg 4020 aactgcggag actgagaagc gatgatacag ccgtgtacta ctgcgccaga gattatacaa 4080 gaggtgcttg gttcggcgag agcctgatcg gcggattcga caactgggga caaggcaccc 4140 tggtgaccgt gtcatccgcc tctaccaagg gccctagcgt gtttccactg gcccctagct 4200 ctaaaagcac aagcggcggc accgccgctc tgggatgtct ggtgaaggac tacttcccag 4260 agcccgtgac cgtgagctgg aacagcggcg ctctcacatc tggggtgcat acctttcccg 4320 ccgtgctgca gtcttctgga ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca 4380 gcctgggcac acagacctac atctgcaacg tgaaccacaa gccatctaat accaaggtgg 4440 ataagaaggt ggaacctaag agctgtgaca agacacacac atgccccccc tgccctgctc 4500 ctgagctgct ggccggcccc tccgtgtttc tcttccctcc taaacccaag gacacactga 4560 tgattagccg gaccccagag gtgacctgtg tggtggttga cgtgagtcac gaagatcctg 4620 aagtgaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taacgccaaa accaagcctc 4680 gggaagagca gtacaacagc acctatagag tggtgagcgt gcttacagtg ctgcatcagg 4740 actggctgaa cggcaaggaa tacaagtgca aggtgtccaa caaagccctg cctctgcctg 4800 aagaaaagac catcagcaag gccaagggcc aaccaagaga gcctcaagtg tacaccctgc 4860 cccccagcag agatgagctg accaagaatc aggtgtccct gacctgcctg gtcaaaggct 4920 tctaccctag cgacatcgcc gtcgagtggg agagcaatgg ccagcctgag aacaactaca 4980 agaccacccc tcctgtgctg gacagcgacg gcagcttctt cctgtatagc aagctgaccg 5040 tggacaagtc caggtggcag cagggcaatg tgttcagctg tagcgtgctg cacgaggccc 5100 tgcacagcca ctacacacag aagtctctga gcctgtctcc tggcaagtga tagcttaagg 5160 agcatcttac cgccatttat tcccatattt gttctgtttt tcttgatttg ggtatacatt 5220 taaatgttaa taaaacaaaa tggtggggca atcatttaca tttttaggga tatgtaatta 5280 ctagttcagg tgtattgcca caagacaaac atgttaagaa actttcccgt tatttacgct 5340 ctgttcctgt taatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact gatattctta 5400 actatgttgc tccttttacg ctgtgtggat atgctgcttt atagcctctg tatctagcta 5460 ttgcttcccg tacggctttc gttttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt 5520 tagaggagtt gtggcccgtt gtccgtcaac gtggcgtggt gtgctctgtg tttgctgacg 5580 caacccccac tggctggggc attgccacca cctgtcaact cctttctggg actttcgctt 5640 tccccctccc gatcgccacg gcagaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag 5700 gggctaggtt gctgggcact gataattccg tggtgttgtc tgtgccttct agttgccagc 5760 catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg 5820 tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc 5880 tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg 5940 ctggggatgc ggtgggctct atggctctag agcatggcta cgtagataag tagcatggcg 6000 ggttaatcat taactacacc tgcaggagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 6060 tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggcgg 6120 cctcagtgag cgagcgagcg cgcagctgcc tgcagg 6156 <210> 409 <211> 16 <212> DNA <213> Adeno-associated virus 2 <400> 409 gagcgagcga gcgcgc 16 <210> 410 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 410 atcgaacgat cg 12 <210> 411 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 411 cgatcgttcg at 12 <210> 412 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 412 atcgaaccat cg 12 <210> 413 <211> 165 <212> DNA <213> Adeno-associated virus 2 <400> 413 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct 165 <210> 414 <211> 140 <212> DNA <213> Adeno-associated virus 2 <400> 414 cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc 60 cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg 120 cgcagagaga tcactagggg 140 <210> 415 <211> 91 <212> DNA <213> Adeno-associated virus 2 <400> 415 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg 60 tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91 <210> 416 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 416 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 417 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 417 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcg 79 <210> 418 <211> 91 <212> DNA <213> Adeno-associated virus 2 <400> 418 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 60 ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91 <210> 419 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 419 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80

Claims (62)

  1. 플랭킹 역말단반복서열(ITR) 사이에 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는 ceDNA 벡터를 포함하는 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터 조성물로서, 여기서 적어도 하나의 핵산 서열은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄(HC) 및/또는 경쇄(LC)를 인코딩하는 ceDNA 벡터 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 서열이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC를 인코딩하는, ceDNA 벡터 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 서열이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 LC를 인코딩하는, ceDNA 벡터 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 서열이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 HC와 LC를 모두 인코딩하는, ceDNA 벡터 조성물.
  5. 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터 조성물로서,
    플랭킹 역말단반복서열(ITR) 사이에 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 핵산 서열은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄(HC)를 인코딩하는 제1 ceDNA 벡터와,
    플랭킹 역말단반복서열(ITR) 사이에 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 핵산 서열은 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄(LC)를 인코딩하는 제2 ceDNA 벡터를 포함하는 ceDNA 벡터 조성물.
  6. 제5항에 있어서, HC와 LC가 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:3 내지 3:1, 가장 바람직하게는 1.5:1(HC:LC)의 몰비로 존재하는, ceDNA 벡터 조성물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, HC와 LC가 1:1 내지 2.5:1(HC:LC)의 몰비로 존재하는, ceDNA 벡터 조성물.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, HC와 LC가 1.5:1 내지 2.5:1(HC:LC)의 몰비로 존재하는, ceDNA 벡터 조성물.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, HC와 LC가 대략 1.5:1(HC:LC)의 몰비로 존재하는, ceDNA 벡터 조성물.
  10. 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, HC와 LC가 대략 2.0:1(HC:LC)의 몰비로 존재하는, ceDNA 벡터 조성물.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, HC와 LC가 대략 2.5:1(HC:LC)의 몰비로 존재하는, ceDNA 벡터 조성물.
  12. 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 ceDNA와 제2 ceDNA가 함께, HC와 LC를 포함하는 적어도 1 ug/mL, 2 ug/mL, 3 ug/mL, 4 ug/mL, 5 ug/mL, 6 ug/mL, 7 ug/mL, 8 ug/mL, 9 ug/mL또는 10 ug/mL의 항체를 발현하는, ceDNA 벡터 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 핵산이 플랭킹 역말단반복서열(ITR) 사이에 제1 ORF와 제2 ORF를 포함하는 이중 ORF를 포함하며, 여기서 제1 ORF는 항체의 HC를 인코딩하고, 제2 ORF는 항체의 LC를 인코딩하며, 제1 ORF와 제2 ORF는 중첩되지 않는, ceDNA 벡터 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 이중 ORF가 양방향성인, ceDNA 벡터 조성물.
  15. ceDNA 벡터가 인핸서 서열인 적어도 하나의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터 또는 제5항의 ceDNA 벡터 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA 벡터가 적어도 하나의 poly A 서열을 포함하는, ceDNA 벡터 조성물.
  17. ceDNA 벡터가 5' UTR 및/또는 인트론 서열을 포함하는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터 조성물 또는 제5항의 ceDNA 벡터 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA 벡터가 3' UTR 서열을 포함하는, ceDNA 벡터 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA 벡터가 인핸서 서열을 포함하는, ceDNA 벡터 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 ITR이 기능성 말단 분해 부위와 Rep 결합 부위를 포함하는, ceDNA 벡터 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 파르보바이러스(Parvovirus), 데펜도바이러스(Dependovirus) 및 아데노연관바이러스(AAV: adeno-associated virus)에서 선택되는 바이러스에서 유래한 것인, ceDNA 벡터 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 플랭킹 ITR이 서로에 대해 대칭 또는 비대칭인, ceDNA 벡터 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 플랭킹 ITR이 대칭 또는 실질적으로 대칭인, ceDNA 벡터 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 플랭킹 ITR이 비대칭인, ceDNA 벡터 조성물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 야생형이거나, 두 개의 ITR이 모두 야생형 ITR인, ceDNA 벡터 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 플랭킹 ITR이 상이한 바이러스 혈청형에서 유래한 것인, ceDNA 벡터 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 플랭킹 ITR이 표 2에 제시된 임의의 바이러스 혈청형 쌍에서 선택되는, ceDNA 벡터 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 표 3의 서열 중 하나 이상에서 선택되는 서열을 포함하는, ceDNA 벡터 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 적어도 하나가 ITR의 전체적인 3차원 입체형태에 영향을 미치는 결실, 부가 또는 치환에 의해 야생형 AAV ITR 서열로부터 변경된 것인, ceDNA 벡터 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12에서 선택되는 AAV 혈청형에서 유도된 것인, ceDNA 벡터 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 합성된 것인, ceDNA 벡터 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 야생형 ITR이 아니거나, 두 개의 ITR이 모두 야생형 ITR이 아닌, ceDNA 벡터 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 A, A', B, B', C, C', D 및 D'에서 선택되는 ITR 영역 중 적어도 하나에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것인, ceDNA 벡터 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 결실, 삽입 및/또는 치환이 통상적으로 A, A', B, B' C 또는 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조(stem-loop structure)의 전부 또는 일부의 결실을 초래하는, ceDNA 벡터 조성물.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부의 결실을 초래하는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것인, ceDNA 벡터 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 통상적으로 C 및 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부의 결실을 초래하는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것인, ceDNA 벡터 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 일부 및/또는 통상적으로 C 및 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 일부의 결실을 초래하는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것인, ceDNA 벡터 조성물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템-루프 구조를 포함하는, ceDNA 벡터 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템과 2개의 루프를 포함하는, ceDNA 벡터 조성물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, ITR 중 하나 또는 둘 모두가 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템과 단일 루프를 포함하는, ceDNA 벡터 조성물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, ITR이 서로에 대해 역전될 때, 두 개의 ITR이 모두 전체적인 3차원 대칭을 이루는 방식으로 변경되는, ceDNA 벡터 조성물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자(LNP)에 캡슐화되는 ceDNA 벡터 조성물.
  43. 표 7에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터.
  44. 서열번호 404, 서열번호 405, 서열번호 406, 서열번호 407 또는 서열번호 408과 적어도 85% 동일한 핵산 서열을 포함하는 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터.
  45. 서열번호 404, 서열번호 405, 서열번호 406, 서열번호 407 또는 서열번호 408로 이루어지는 군에서 선택되는 핵산 서열로 이루어진 캡시드 미함유 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터.
  46. 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 방법으로서, 상기 세포를 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 세포가 시험관내 또는 생체내에 존재하는, 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 적어도 하나의 핵산 서열이 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 것인, 방법.
  49. 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균 감염을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터 조성물 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  50. 암을 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터 조성물 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  51. 자가면역 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터 조성물 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  52. 대상에서 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균 감염을 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터 조성물 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  53. 대상에서 암을 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터 조성물 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  54. 대상에서 자가면역 질환을 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터 조성물 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  55. 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA 벡터에 의해 인코딩되고 대상의 간에서 발현되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 푸코실트랜스퍼라아제를 발현하는 포유류 세포주에서 생산된 이의 대응물과 비교하여 FcγRIIIa에 대해 더 높은 결합 친화도를 나타내는, 방법.
  56. 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, ceDNA 벡터 또는 ceDNA 벡터 조성물이 정맥내, 피하, 종양내 또는 근육내 주사로 투여되는, 방법.
  57. 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 대상에게 면역조절제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  58. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터 조성물 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
  59. 제50항에 있어서, 하나 이상의 추가 치료제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
  60. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터 조성물 또는 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항의 ceDNA 벡터와, 지질을 포함하는 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 지질이 지질 나노입자(LNP)인, 조성물.
  62. 제1항의 ceDNA 벡터, 제58항의 약제학적 조성물 또는 제60항의 조성물과, 사용설명서를 포함하는 키트.
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