CN117881786A - 表达治疗性抗体的非病毒dna载体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请描述了包含可用于在细胞、组织或受试者中表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的方法和组合物,以及治疗和/或预防各种疾病、病症和癌症的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月27日提交的美国临时申请63/180,382的优先权的权益,该临时申请的内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及抗体治疗领域,该抗体治疗包括用于在受试者或细胞中表达抗体或其抗原结合片段的非病毒载体。本公开还涉及包含核酸的核酸构建体、启动子、载体和宿主细胞,以及将编码抗体或其抗原结合片段的转基因递送至靶细胞、组织、器官或生物体的方法。例如,本公开提供了使用非病毒ceDNA载体从例如表达抗体或其抗原结合片段的细胞内表达该抗体或其抗原结合片段的方法,用于治疗患有感染、疾病或病症的受试者。本公开设想了可以用抗体治疗剂治疗的任何感染、疾病或病症。该方法和组合物还可以应用于例如有需要的受试者的治疗或预防目的。
背景技术
基于抗体的治疗剂(例如,mAb)已经显示是治疗免疫障碍、癌症和感染性疾病的最成功的策略之一。为了获得足够高浓度的抗体以实现持久的治疗效果,抗体疗法传统上通过重复施用,例如通过多次注射来递送。然而,这种给药方案导致在整个治疗期间抗体水平不一致、每次施用的效率有限、施用成本和抗体消耗高。
重组AAV(rAAV)可能是人类基因转移研究最好的载体,数百项临床试验证明转导的安全性。腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科(Parvoviridae family),并且更具体地说,构成依赖病毒属(Dependoparvovirus genus)。来源于AAV的载体(即,rAVV或AAV载体)对于递送遗传物质是有吸引力的,因为(i)它们能够感染(转导)各种各样的非分裂和分裂细胞类型,包括肌细胞和神经元;(ii)它们缺乏病毒结构基因,因此减少宿主细胞对病毒感染的应答,例如干扰素介导的应答;(iii)野生型病毒在人类中被认为是非病理性的;(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV不同,复制缺陷型AAV载体缺乏复制(rep)基因并且通常持续作为附加体,因此限制了插入诱变或基因毒性的风险;并且(v)与其他载体系统相比,AAV载体通常被认为是相对较差的免疫原,因此不会触发显著的免疫应答(参见(ii)),从而获得载体DNA的持久性和治疗性转基因的潜在长期表达。
然而,使用AAV粒子作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关的一个主要缺点是其病毒包装容量有限,为约4.5kb的异源DNA(Dong等人,1996;Athanasopoulos等人,2004;Lai等人,2010),因此,AAV载体的用途被限制在小于150,000Da的蛋白质编码容量。特别是与抗体递送有关,AAV的包装限制对形成天然抗体结构的重链和轻链的有效递送提出了重大挑战。第二个缺点是,由于人群中野生型AAV感染盛行,所以必须筛查rAAV基因疗法候选者中从患者消除所述载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳免疫原性有关,该免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的该载体作出反应,以刺激免疫系统生成高滴度的抗AAV抗体,从而杜绝了进一步治疗。预先存在的免疫可能严重限制转导的效率。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是,鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAVDNA转化为双链DNA,所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。
另外,通过引入一种或多种含有AAV基因组、rep基因和cap基因的质粒,产生具有衣壳的常规AAV病毒粒子(Grimm等人,1998)。然而,发现这种衣壳化AAV病毒载体不能有效地转导某些细胞和组织类型,并且衣壳还诱导免疫应答。
相应地,由于单次施用于患者(因患者免疫应答)、适于AAV载体递送的转基因遗传物质的范围因最小病毒包装容量(约4.5kb)而受限,以及AAV介导的基因表达缓慢,因此抗体治疗的递送使用腺相关病毒(AAV)载体受到限制。
本领域仍然需要通过另选的施用途径或方式递送抗体和基于抗体的治疗剂,以开发改进的治疗剂。
发明内容
本文所述的技术涉及具有共价封闭端的无衣壳(例如,非病毒)DNA载体(本文称为“封闭端DNA载体”或“ceDNA载体”),其中ceDNA载体包含编码选自由抗体重链和抗体轻链组成的组的一种或多种多肽的核酸序列。这些ceDNA载体可以用于产生抗体或其抗原结合片段,用于治疗、监测和诊断疾病和病症(例如,免疫病症、癌症、感染性疾病)。将表达编码选自由抗体重链和抗体轻链组成的组的一种或多种多肽的一个或多个核酸序列的一种或多种ceDNA载体应用于受试者可用于:治疗、预防或降低受试者的疾病或病症的严重程度,在递送中是微创的,是可重复的和剂量有效的,具有治疗效果的快速起效,和/或导致抗体或其抗原结合片段的持续表达。此外,通过使用ceDNA载体将编码抗体或其抗原结合片段的转基因(例如,核酸序列)递送至细胞或组织,避开了适应性免疫应答,并且在不使用免疫或被动转移的情况下产生了期望的抗体特异性。即,ceDNA载体通过内吞作用进入细胞,然后从内涵体区室逃逸并转运到细胞核。具有转录活性的ceDNA附加体导致编码抗体的表达,然后该抗体可以从细胞分泌到循环中。因此,ceDNA载体可以使得能够连续、持续和长期递送通过单次注射施用的抗体(例如,本文所述的治疗性抗体或其抗原结合片段)。
根据一些实施方案,包含编码选自由抗体重链和抗体轻链组成的组的一种或多种多肽的一个或多个核酸序列的ceDNA载体存在于脂质体纳米粒子制剂(LNP)中。
包含编码选自由如本文所述的抗体重链和抗体轻链组成的组的一种或多种多肽的一个或多个核酸序列的ceDNA载体是由具有共价封闭端的互补DNA的连续链形成的无衣壳线性双链体DNA分子(线性、连续和非衣壳化结构),其包含5'反向末端重复(ITR)序列和3'ITR序列,其中5'ITR和3'ITR相对于彼此能够具有相同的对称三维组织(即,对称或基本上对称),或另选地,5'ITR和3'ITR相对于彼此能够具有不同的三维组织(即,不对称ITR)。另外,ITR能够来自相同或不同的血清型。根据一些实施方案,ceDNA载体能够包含ITR序列,该ITR序列具有对称的三维空间组织,以便其结构在几何空间中呈相同形状,或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环(即,它们是相同的或相对于彼此呈镜像)。根据一些实施方案,一个ITR可以来自一种AAV血清型,而另一个ITR可以来自不同的AAV血清型。
因此,本文所述的技术的一些方面涉及用于改善蛋白质表达和/或产生上述抗体或其抗原结合片段的ceDNA载体,其包含侧接编码选自由抗体重链和抗体轻链组成的组的一种或多种多肽的核酸序列的ITR序列,其中ITR序列选自以下任一种:(i)至少一种WT ITR和至少一种修饰的AAV反向末端重复序列(ITR)(例如,不对称的经修饰ITR);(ii)两个经修饰ITR,其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组织(例如,不对称的经修饰ITR),或者(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对,其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组织,或者(iv)对称或基本上对称的经修饰ITR对,其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组织。本文公开的ceDNA载体可以在真核细胞中产生,因此在昆虫细胞中没有原核DNA修饰和细菌内毒素污染。
根据第一方面,本公开提供了一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体组合物,其包含含有在侧接反向末端(ITR)之间的至少一个核酸序列的ceDNA载体,其中至少一个核酸序列编码抗体或其抗原结合片段的重链(HC)和/或轻链(LC)。根据一些实施方案,至少一个核酸序列编码抗体或其抗原结合片段的HC。根据一些实施方案,至少一个核酸序列编码抗体或其抗原结合片段的LC。根据一些实施方案,至少一个核酸序列编码抗体或其抗原结合片段的HC和LC两者。
根据另一方面,本公开提供了一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体组合,其包含第一ceDNA载体,其包含在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个核酸序列的,其中所述至少一个核酸序列编码抗体或其抗原结合片段的重链(HC);以及第二ceDNA载体,其包含在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个核酸序列,其中所述至少一个核酸序列编码抗体或其抗原结合片段的轻链(LC)。
根据上述方面和实施方案的实施方案,HC和LC以1:10或10:1,优选1:3至3:1,最优选1.5:1(HC:LC)的摩尔比存在。根据上述方面和实施方案的实施方案,HC和LC以1:1至2.5:1(HC:LC)之间的摩尔比存在。根据上述方面和实施方案的实施方案,HC和LC以1.5:1至2.5:1(HC:LC)之间的摩尔比存在。根据上述方面和实施方案的实施方案,HC和LC以约1.5:1(HC:LC)的摩尔比存在。根据上述方面和实施方案的实施方案,HC和LC以约2.0:1(HC:LC)的摩尔比存在。根据上述方面和实施方案的实施方案,HC和LC以约2.5:1(HC:LC)的摩尔比存在。根据上述方面和实施方案的实施方案,第一ceDNA和第二ceDNA一起表达至少1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL或10μg/mL的包含HC和LC的抗体。根据上述方面和实施方案的实施方案,至少一个核酸包含双ORF,该双ORF包含在侧接反向末端(ITR)之间的第一ORF和第二ORG,其中第一ORF编码HC并且第二ORF编码抗体的LC并且第一ORF和第二ORF不重叠。根据一些实施方案,双ORF是双向的。根据上述方面和实施方案的实施方案,ceDNA载体包含可操作地连接到至少一个核酸序列的启动子序列、增强子序列。根据上述方面和实施方案的实施方案,ceDNA载体包含至少一个聚A序列。根据上述方面和实施方案的实施方案,ceDNA载体包含5'UTR和/或内含子序列。根据上述方面和实施方案的实施方案,ceDNA载体包含3'UTR序列。根据上述方面和实施方案的实施方案,ceDNA载体包含增强子序列。根据上述方面和实施方案的实施方案,至少一个ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR来自选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)的病毒。根据上述方面和实施方案的实施方案,侧接ITR相对于彼此对称或不对称。根据实施方案,侧接ITR是对称的或基本上对称的。根据实施方案,侧接ITR是不对称的。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR是野生型的,或者其中ITR中的两个ITR都是野生型ITR。根据上述方面和实施方案的实施方案,侧接ITR来自不同病毒血清型。根据上述方面和实施方案的实施方案,侧接ITR选自表2中示出的任何病毒血清型对。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR包含选自表3中的一个或多个序列的序列。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的至少一个ITR由于影响ITR的整体三维构象的缺失、添加或取代而相对于野生型AAVITR序列改变。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR来源于选自以下的AAV血清型:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR是合成的。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR不是野生型ITR,或者其中ITR中的两个ITR都不是野生型ITR。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR通过选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的ITR区域中的至少一个ITR区域中的缺失、插入和/或取代而被修饰。根据上述方面和实施方案的实施方案,缺失、插入和/或取代使得通常由A、A'、B、B'、C或C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰,该缺失、插入和/或取代使得通常由B和B'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰,该缺失、插入和/或取代使得通常由C和C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰,该缺失、插入和/或取代使得通常由B和B'区域形成的茎-环结构的一部分和/或通常由C和C'区域形成的茎-环结构的一部分发生缺失。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR在通常包含由B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR在通常包含由B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。根据上述方面和实施方案的实施方案,ITR中的一个或两个ITR在通常包含由B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。根据上述方面和实施方案的实施方案,两个ITR以使得当ITR相对于彼此反转时产生整体三维对称性的方式改变。根据上述方面和实施方案的实施方案,载体组合物囊封在脂质纳米粒子(LNP)中。
根据另一方面,本公开提供了一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体,其包含选自表7的核酸序列。
根据另一方面,本公开提供了一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体,其包含与SEQID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406、SEQ ID NO:407或SEQ ID NO:408具有至少85%同一性的核酸序列。
根据另一方面,本公开提供了一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体,其由选自由以下组成的组的核酸序列组成:SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406、SEQ ID NO:407或SEQ ID NO:408。
根据另一方面,本公开提供了一种在细胞中表达抗体或其抗原结合片段的方法,其包括使细胞与本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体或ceDNA载体组合物接触。根据实施方案,细胞在体外或体内。根据实施方案,至少一个核酸序列经密码子优化以在细胞中表达。
根据另一方面,本公开提供了一种用细菌、病毒、寄生虫或真菌感染治疗受试者的方法,其包括向受试者施用本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体或ceDNA载体组合物。
根据另一方面,本公开提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法,其包括向受试者施用本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体或ceDNA载体组合物。
根据另一方面,本公开提供了一种治疗患有自身免疫疾病或病症的受试者的方法,其包括向受试者施用本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体或ceDNA载体组合物。
根据另一方面,本公开提供了一种预防受试者的细菌、病毒、寄生虫或真菌感染的方法,其包括施用本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体或ceDNA载体组合物。
根据另一方面,本公开提供了一种预防受试者的癌症的方法,其包括向受试者施用本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体或ceDNA载体组合物。
根据另一方面,本公开提供了一种预防受试者的自身免疫疾病的方法,其包括向受试者施用本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体或ceDNA载体组合物。根据上述方面和实施方案的实施方案,向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。根据上述方面和实施方案的实施方案,ceDNA载体或ceDNA载体组合物通过静脉内、皮下、瘤内或肌肉内注射施用。根据上述方面和实施方案的实施方案,该方法还包括向受试者施用免疫调节剂。
根据另一方面,本公开提供了一种药物组合物,其包含本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体或ceDNA载体组合物。根据实施方案,药物组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。
根据另一方面,本公开提供了一种组合物,其包含本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体或ceDNA载体组合物以及脂质。根据实施方案,脂质是脂质纳米粒子(LNP)。
根据另一方面,本公开提供了一种试剂盒,其包含本文的任何方面或实施方案的ceDNA载体或ceDNA载体组合物,或药物组合物。
本公开的这些和其他方面在下文中更详细地描述。
附图说明
通过参考在附图中描绘的本公开的说明性实施方案,可以理解上面简要概述并且在下面更详细论述的本公开的实施方案。但是,附图仅示出了本公开的典型实施方案,因此不应视为对范围的限制,因为本公开可以允许其它等效的实施方案。
图1A示出了用于表达如本文所公开的抗体或其抗原结合片段(例如,HC或LC)的ceDNA载体的示例性结构,该ceDNA载体包含不对称ITR。在此实施方案中,示例性ceDNA载体包括含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因的开放阅读框(ORF)(例如,编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列)可以插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点(R3/R4)中。表达盒侧接在两个反向末端重复序列(ITR)-表达盒上游(5'端)的野生型AAV2 ITR和下游(3'端)的经修饰ITR,因此侧接表达盒的两个ITR彼此不对称。
图1B示出了如本文所公开的用于表达抗体或其抗原结合片段(例如,HC或LC)的ceDNA载体的示例性结构,该ceDNA载体包含不对称ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因的开放阅读框(ORF)(例如,编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列)可以插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。该表达盒侧接两个反向末端重复序列(ITR)-该表达盒上游(5'端)的经修饰ITR和下游(3'端)的野生型ITR。
图1C示出了如本文所公开的用于表达抗体或其抗原结合片段的ceDNA载体的示例性结构,该ceDNA载体包含不对称ITR以及含有增强子/启动子、转基因(例如,编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列)、转录后元件(WPRE)和聚A信号的表达盒。开放阅读框(ORF)允许将转基因插入在CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个彼此不对称的反向末端重复(ITR);表达盒上游(5'端)的经修饰ITR和下游(3'端)的经修饰ITR,其中5'ITR和3'ITR都是经修饰ITR,但是具有不同的修饰(即,它们不具有相同的修饰)。
图1D示出了如本文所公开的用于表达抗体或其抗原结合片段(例如,HC或LC)的ceDNA载体的示例性结构,该ceDNA载体包含如本文所定义的对称的经修饰ITR或基本上对称的经修饰ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因的开放阅读框(ORF)(例如,编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列)插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个修饰的反向末端重复序列(ITR),其中5’经修饰ITR和3’经修饰ITR是对称的或基本上对称的。
图1E示出了如本文所公开的用于表达抗体或其抗原结合片段(例如,HC或LC)的ceDNA载体的示例性结构,该ceDNA载体包含如本文所定义的对称的经修饰ITR或基本上对称的经修饰ITR以及含有增强子/启动子、转基因、转录后元件(WPRE)和聚A信号的表达盒。开放阅读框(ORF)允许将转基因(例如编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列)插入在CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个修饰的反向末端重复序列(ITR),其中5’经修饰ITR和3’经修饰ITR是对称的或基本上对称的。
图1F示出了如本文所公开的用于表达抗体或其抗原结合片段(例如,HC或LC)的ceDNA载体的示例性结构,该ceDNA载体包含如本文所定义的对称的WT-ITR或基本上对称的WT-ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因的开放阅读框(ORF)(例如,编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列)插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR),其中5'WT-ITR和3'WT ITR是对称的或基本上对称的。
图1G示出了如本文所公开的用于表达抗体或其抗原结合片段的ceDNA载体的示例性结构,该ceDNA载体包含如本文所定义的对称的经修饰ITR或基本上对称的经修饰ITR以及含有增强子/启动子、转基因、转录后元件(WPRE)和聚A信号的表达盒。开放阅读框(ORF)能够将转基因插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR),其中5'WT-ITR和3'WT ITR是对称的或基本上对称的。
图2A提供了AAV2的野生型左ITR的T形茎-环结构,以及A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')的标识,并且还显示了末端解链位点(trs)。RBE含有一连串4个双链体四聚体,它们被认为与Rep 78或Rep 68相互作用。另外,RBE'也被认为与在该构建体中的野生型ITR或突变的ITR上装配的Rep复合物相互作用。D和D'区含有转录因子结合位点和其它保守结构。图2B显示了所提出的Rep催化的在野生型左ITR中产生的切割和接合活性,该野生型左ITR包括AAV2的野生型左ITR的T形茎-环结构以及A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')的标识,并且还显示了末端解链位点(trs)以及包含若干转录因子结合位点和另一保守结构的D和D'区域。
图3A提供了野生型左AAV2 ITR的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'臂的一级结构(多核苷酸序列)(左)和二级结构(右)。图3B显示了左ITR的示例性突变ITR(也称为经修饰ITR)序列。显示的是示例性突变左ITR(ITR-1,左)的A-A'臂的RBE部分、C臂和B-B'臂的一级结构(左)和预测的二级结构(右)。图3C显示了野生型右AAV2 ITR的A-A'环的含RBE部分以及B-B'和C-C'臂的一级结构(左)和二级结构(右)。图3D显示了示例性经修饰右ITR。显示的是示例性突变右ITR(ITR-1,右)的A-A'臂的含RBE部分、B-B'和C臂的一级结构(左)和预测的二级结构(右)。可以如本文所教示,使用左ITR和右ITR的任何组合(例如AAV2 ITR或其它病毒血清型ITR或合成ITR)。图3A-图3D的多核苷酸序列中的每一个是指在用于产生如本文所描述的ceDNA的质粒或杆粒/杆状病毒基因组中所用的序列。图3A-图3D每一个中还包含从质粒或杆粒/杆状病毒基因组中的ceDNA载体构型推断出的相应ceDNA二级结构以及预测的吉布斯自由能(Gibbs free energy)值。
图4A是说明用于制备杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的上游过程的示意图,所述细胞可用于在图4B的示意图中所描述的过程中产生如本文所公开的用于表达抗体或其抗原结合片段的ceDNA载体。图4B是ceDNA产生的一种示例性方法的示意图,并且图4C示出了证实ceDNA载体产生的一种生化方法和过程。图4D和图4E是描述了用于鉴定从在图4B的ceDNA产生过程期间获得的细胞集结粒收获的DNA中ceDNA的存在的过程的示意图。图4D显示了未切割或用限制性核酸内切酶消化并然后在天然凝胶或变性凝胶上进行电泳的示例性ceDNA的示意性预期色带。最左边的示意图是天然凝胶,并显示多个色带,表明以其双链体和未切割形式的ceDNA以至少单体和二聚体状态存在,可看到呈迁移较快的较小单体和迁移较慢的二聚体,二聚体的大小是单体的两倍。左起第二个示意图展示,当用限制核酸内切酶切割ceDNA时,原始带消失并出现了迁移较快(例如较小)的带,与裂解后剩余的预期片段大小相对应。在变性条件下,原始双链体DNA是单链的,并且因为互补链是共价连接的,所以作为两倍于天然凝胶上观察到的大小的物种进行迁移。因此,在右起第二个示意图中,经过消化的ceDNA显示出与在天然凝胶上观察到的相似的色带分布,但是所述色带作为其天然凝胶对应物大小的两倍的片段进行迁移。最右边的示意图显示,在变性条件下未切割的ceDNA作为单链开环进行迁移,因此观察到的色带是在不开环的天然条件下观察到的色带大小的两倍。在这个图中,“kb”用于指示核苷酸分子的相对大小,取决于背景,其基于核苷酸链长(例如,对于在变性条件下观察到的单链分子)或碱基对数目(例如,对于在天然条件下观察到的双链分子)。图4E显示了具有不连续结构的DNA。ceDNA可以通过在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制性核酸内切酶切割,并在中性和变性两种条件下生成两个大小不同(1kb和2kb)的DNA片段。图4E还示出了具有线性和连续结构的ceDNA。所述ceDNA载体可被限制性核酸内切酶切割,并产生两个DNA片段,所述片段在中性条件下以1kb和2kb迁移,但在变性条件下,链保持连接并产生以2kb和4kb迁移的单链。
图5是在用(+)或不用(-)核酸内切酶(对于ceDNA构建体1和2,为EcoRI;对于ceDNA构建体3和4,为BamH1;对于ceDNA构建体5和6,为SpeI;并且对于ceDNA构建体7和8,为XhoI)消化的情况下ceDNA载体的变性凝胶运行示例的示例性图片。构建体1-8描述于国际申请PCT PCT/US18/49996(以全文引用的方式并入本文)的实施例1中。确定了用星号突出显示的色带的大小,并提供在图片的底部。
图6是显示通过实施例6中测试的ceDNA构建体检测抗体表达的图表。抗刺突人IgG(***)用于检测抗体表达,其在注射ceDNA构建体后直至35天通过ng/ml抗刺突hIgG来定量。如图6所示,当使用在LNP1中共同配制的ceDNA双载体ceDNA-1856(编码LC)和ceDNA-1859(编码HC)时(ceDNA-1:LNP1),在第14天检测到约1ug/mL的针对SARS-CoV-2的单克隆抗体,以及在第35天检测到至多约8ug/mL的抗体。媒介物(V);在LNP制剂1中共同配制的ceDNA双载体构建体1856/1859(ceDNA-1LNP1(1));在LNP制剂2中的ceDNA双载体构建体1856/1859(ceDNA-1LNP2(2));以及在LNP制剂1中配制的单个ceDNA构建体2157(单个ceDNA中的HC和LC的双ORF(“双向单个ceDNA载体”))(ceDNA-2LNP1(3))。
图7A显示了各种ceDNA载体形式的示意图。图7B是显示使用如下的抗体产生水平的图表:双ORF构建体(连接到ORF 1的组成型启动子;和连接到ORF 2的肝特异性启动子;单个ceDNA载体的furing/2A切割设计;和ceDNA-1的双载体设计(ceDNA 1856和1859),均编码抗SARS-CoV-2刺突(S)抗体。双载体设计产生最高表达的构建体。图7C是显示双载体(ceDNA-1;在LNP制剂1中共同配制的“ceDNA双载体构建体1856/1859)的LNP递送与单个ceDNA载体的表达相比,在小鼠中实现了8ug/mL的持久的、治疗相关的抗刺突hIgG浓度(双ORF ceDNA 2157;“ceDNA-2”)的图表。
图8比较了在以流体动力学方式递送后表达HC和LC的ceDNA双载体设计和ceDNA双ORF设计之间抗体表达的剂量依赖性增加。
图9是显示使用具有不同HC:LC摩尔比的ceDNA载体构建体的体外筛选结果的图表。
图10是显示体内使用具有不同HC:LC摩尔比的固定HC或LC的ceDNA载体构建体的结果的图表。
图11A是显示细胞系来源的(重组LS)或ceDNA来源的抗体1(血清纯化的ceDNA来源的LS)和细胞系来源的(重组LS-GAALIE)或ceDNA来源的(血清纯化的ceDNA来源的LS-GAALIE)抗体2在与FcγRIIIa-V受体缔合,然后与FcγRIIIa-V受体解离时的解离常数(KD)值的图表。图11B是显示细胞系来源的(重组LS)或ceDNA来源的(血清纯化的ceDNA来源的LS)抗体1和细胞系来源的(重组LS-GAALIE)或ceDNA来源的(血清纯化的ceDNA来源的LS-GAALIE)抗体2在与FcγRIIIaF受体缔合,然后与FcγRIIIaF受体解离时的解离常数(KD)值的图表。
具体实施方式
根据本公开的实施方案,提供了用于通过ceDNA载体递送抗体或其抗原结合片段的组合物。在一些实施方案中,本文所述的抗体或抗原结合片段可用于治疗目的。根据一些实施方案,本文所述的抗体或其抗原结合片段可用于诊断目的。
I.定义
除非本文另有定义,否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常所了解的含义。应理解,本公开不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等,并且因此可以变化。本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的,并且不打算限制仅由权利要求书定义的本公开的范围。免疫学和分子生物学中常用术语的定义可以在以下文献中找到:The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,第19版,由MerckSharp&Dohme Corp.出版(2011)(ISBN 978-0-911910-19-3);Robert S.Porter等人(编辑),Fields Virology,第6版,由Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,USA出版(2013);Knipe,D.M.和Howley,P.M.(编辑),The Encyclopedia of Molecular CellBiology and Molecular Medicine,由Blackwell Science Ltd.出版(1999-2012)(ISBN9783527600908);以及Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers,Inc.出版(1995)(ISBN 1-56081-569-8);Immunology by Werner Luttmann,由Elsevier出版(2006);Janeway'sImmunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编辑),Taylor&FrancisLimited,2014(ISBN 0815345305、9780815345305);Lewin's Genes XI,由Jones&BartlettPublishers出版(2014)(ISBN-1449659055);Michael Richard Green and JosephSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN 1936113414);Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,NewYork,USA(2012)(ISBN 044460149X);Laboratory Methods in Enzymology:DNA,JonLorsch(编辑),Elsevier,2013(ISBN 0124199542);Current Protocols in MolecularBiology(CPMB),Frederick M.Ausubel(编辑),John Wiley and Sons,2014(ISBN047150338X、9780471503385),Current Protocols in Protein Science(CPPS),John E.Coligan(编辑),John Wiley and Sons,Inc.,2005;以及Current Protocols inImmunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan MShevach,Warren Strobe(编辑)John Wiley and Sons,Inc.,2003(ISBN 0471142735、9780471142737),这些文献的内容均以全文引用的方式并入本文。
如本文所用,术语“抗体”旨在指由四条多肽链、两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白分子,它们通过二硫键相互连接。每个重链包含重链可变区(在此缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区,所述超变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。如本文所用,术语“单克隆抗体”是指基本上同质的抗体群,即构成该群的抗体分子在氨基酸序列上是相同的,除了可能少量存在的可能天然存在的突变以外。组合物中的“多个”此类单克隆抗体和片段是指相同的(即,在氨基酸序列中,除了可能少量存在的可能天然存在的突变以外)抗体和片段的浓度高于例如在宿主生物诸如小鼠或人的血液中天然正常存在的浓度。
如本文所用,术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。重链和轻链的每个可变区中都有三个CDR,对于每个可变区分别被命名为CDR1、CDR2和CDR3。如本文所用,术语“CDR组”是指存在于可以结合抗原的单个可变区中的三个CDR的组。这些CDR的确切边界已根据不同的系统进行了不同的定义。由Kabat(Kabat等人(1987;1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.))描述的系统不仅提供了适用于抗体任何可变区的明确的残基编号系统,还提供了定义三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia及其同事(Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917;和Chothia等人(1989)Nature 342:877-883)发现,尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性,但Kabat CDR内的某些亚部分采用几乎相同的肽主链构象。这些亚部分被命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3,或L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3或H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3,其中“L”和“H”分别表示轻链区和重链区。这些区可以称为Chothia CDR,其边界与Kabat CDR重叠。定义与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已经由Padlan(1995)FASEB J.9:133-139和MacCallum(1996)J.Mol.Biol.262(5):732-45描述。还有其他CDR边界定义可能并不严格遵循本文的系统之一,但仍会与Kabat CDR重叠,然而根据特定残基或残基组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合的预测或实验发现,它们可以缩短或延长(参见例如Lu X等人,MAbs.2019年1月;11(1):45-57)。尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia定义的CDR,但是本文使用的方法可以利用根据这些系统中的任一系统定义的CDR。
如本文所用,术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”(或简称“抗体片段”)是指保留特异性结合抗原的能力的一个或多个抗体片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来执行。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv、单链和单链抗体。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的示例包括(i)Fab片段,由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab')2片段,包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段,(v)dAb片段(Ward等人(1989)Nature 341:544-546),其由VH结构域组成;和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外,尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码,但它们可以使用重组方法通过合成接头连接,使得它们能够被制成单条蛋白质链,其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见例如,Bird等人(1988)Science 242:423-426;和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。还涵盖其他形式的单链抗体,诸如双抗体。双抗体是二价双特异性抗体,其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达,但使用的接头太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对,从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如,Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448;Poljak等人(1994)Structure 2:1121-1123)。本公开的抗体部分在美国专利6,090,382、6,258,562、6,509,015中更详细地描述,该美国专利中的每一者全文以引用方式并入本文。
术语“CL”是指“免疫球蛋白轻链恒定区”或“轻链恒定区”,即来自抗体轻链的恒定区。术语“CH”是指“免疫球蛋白重链恒定区”或“重链恒定区”,其根据抗体同种型可进一步分成CH1、CH2和CH3(IgA、IgD、IgG)或CH1、CH2、CH3和CH4结构域(IgE、IgM)。本文进一步描述了抗体重链的Fc区。在任何目前公开的实施方案中,本公开的抗体或抗原结合片段包含CL、CH1、CH2和CH3中的任一种或多种。应当理解,例如,在哺乳动物细胞系中的生产可以去除抗体重链的一个或多个C末端赖氨酸(参见例如,Liu等人mAbs 6(5):1145-1154(2014))。因此,本公开的抗体或抗原结合片段可包含重链、CH1-CH3、CH3或Fc多肽,其中C末端赖氨酸残基存在或不存在;换句话讲,涵盖其中重链、CH1-CH3或Fc多肽的C末端残基不是赖氨酸的实施方案,以及其中赖氨酸是C末端残基的实施方案。在某些实施方案中,组合物包含多个本公开的抗体和/或抗原结合片段,其中抗体或抗原结合片段在重链、CH1-CH3或Fc多肽的C末端处不包含赖氨酸残基,并且抗体或抗原结合片段在重链、CH1-CH3或Fc多肽的C末端处包含赖氨酸残基。“嵌合抗体”是指其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一些部分与来源于特定物种或属于特定类别的抗体中的对应序列同源,而链的其余节段与来自另一物种的对应序列同源的抗体。
“人源化抗体”是指包含至少一条包含基本上来自人抗体链(称为受体免疫球蛋白或抗体)的可变区框架残基的链和至少一个基本上来自非人抗体(例如,小鼠)的互补决定区(CDR)的抗体。此外,人源化抗体通常发生进一步改变以提高亲和力和/或免疫原性。
术语“多价抗体”是指包含多于一个抗原识别位点的抗体。例如,“二价”抗体具有两个抗原识别位点,而“四价”抗体具有四个抗原识别位点。术语“单特异性”、“双特异性”、“三特异性”、“四特异性”等是指多价抗体中存在的不同抗原识别位点特异性的数量(与抗原识别位点的数量相反)。例如,“单特异性抗体”抗原的抗原识别位点都结合相同的表位。“双特异性”或“双重特异性”抗体具有至少一个结合第一表位的抗原识别位点和至少一个结合不同于第一表位的第二表位的抗原识别位点。“多价单特异性”抗体具有均结合相同表位的多个抗原识别位点。“多价双特异性”抗体具有多个抗原识别位点,其中一些结合第一表位,并且其中一些结合不同于第一表位的第二表位。
如本文所用,术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变),例如在CDR中,以及特别是在CDR3中。然而,如本文所用,术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体。
如本文所用,术语“重组人抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体,诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。
如本文所用,“中和抗体”是可以中和,即预防、抑制、降低、阻止或干扰病原体在宿主中引发和/或维持感染的能力的抗体。这种抑制可以通过测量生物活性(体外或体内)、细胞活化和/或受体结合的一种或多种指标来评估。
如本文所用,术语“抗原”意指含有一个或多个表位(线性、构象或两者)的分子,该表位将刺激宿主的免疫系统产生体液和/或细胞抗原特异性应答。该术语可与术语“免疫原”互换使用。通常,B细胞表位将包括至少约5个氨基酸,但可以小至3-4个氨基酸。T细胞表位,诸如CTL表位,将包括至少约7-9个氨基酸,并且辅助T细胞表位包括至少约12-20个氨基酸。通常,表位将包括约7至15个氨基酸,包括诸如9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。该术语包括与天然序列相比包括修饰,诸如缺失、添加和取代(本质上通常是保守的)的多肽,只要蛋白质保持引发免疫应答的能力,如本文所定义。这些修饰可以是有意的,如通过定点诱变,或者可以是偶然的,诸如通过产生抗原的宿主的突变。
术语“表位”也可以称为抗原决定簇,是可以通过结合剂、免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的分子决定簇(例如,多肽决定簇)。表位决定簇包括分子的化学活性表面分组,诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基,并且在某些实施方案中,可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位可以定义为结构的或功能的。功能表位通常是结构表位的亚组,并且具有直接有助于相互作用亲和力的那些残基。表位可以是线性的或构象的,即由非线性氨基酸构成。由抗体或抗体的抗原结合片段识别的表位是与抗体或片段的CDR(例如,互补位点)相互作用的抗原的结构元件。表位可以由几个氨基酸残基的贡献形成,这些氨基酸残基与抗体的CDR相互作用以产生特异性。抗原片段可以含有多于一个表位。在某些实施方案中,当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中识别其靶抗原时,抗体特异性结合抗原。例如,如果抗体交叉竞争(一种抗体阻止另一种抗体的结合或调节作用),则称抗体“结合至相同表位”。
如本文所用,术语“表面等离子体共振”是指允许例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象。对于进一步的描述,参见美国专利6,258,562的实施例1和等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19;等人(1991)Biotechniques 11:620-627;Johnsson等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125;和Johnnson等人(1991)Anal.Biochem.198:268。
如本文所用,“特异性结合”是指抗体或抗原结合片段以等于或大于105M-1的亲和力或Ka(即,以1/M为单位的特定结合相互作用的平衡缔合常数)(其等于该缔合反应的结合速率[Kon]与解离速率[Koff]的比率)与抗原缔合或结合,而不与样品中的任何其他分子或组分显著缔合或结合。另选地,亲和力可以定义为以M为单位(例如,10-5M至10-13M)的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)。抗体可以分类为“高亲和力”抗体或“低亲和力”抗体。“高亲和力”抗体是指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1或至少1013M-1的那些抗体。“低亲和力”抗体是指Ka为至多107M-1、至多106M-1、至多105M-1的那些抗体。另选地,亲和力可以定义为以M为单位(例如,10-5M至10-13M)的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)。
如本文所用,术语“Koff”旨在指抗体与抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。
如本文所用,术语“Kd”旨在指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。
如本文所用,术语“IC50”旨在指抑制所关注的生物学终点所需的抑制剂的浓度。
如本文所使用,术语“异源核酸序列”和“转基因”可互换使用并且指并入如本文所公开的ceDNA载体中并可以由所述ceDNA载体递送和表达的感兴趣的核酸(除编码衣壳多肽的核酸之外)。根据一些实施方案,术语“异源核酸”打算指不存在于其所接触的细胞或受试者中、由其所接触的细胞或受试者表达或衍生自其所接触的细胞或受试者的核酸(或转基因)。
如本文所用,术语“表达盒”和“转录盒”可互换使用,并且是指一段线性核酸,其包括与一个或多个启动子或足以引导转基因转录的其它调节序列操作性地连接的转基因,但是不包含衣壳编码序列、其它载体序列或反向末端重复区域。表达盒可以另外包含一个或多个顺式作用序列(例如启动子、增强子或阻遏子)、一个或多个内含子和一个或多个转录后调节元件。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式。因此,这个术语包含单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交物、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指单链或双链DNA的约5至约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而,出于本公开的目的,寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也称为“寡聚物(oligomer)”或“oligo”,并且可以从基因中分离出来,或通过所属领域已知的方法化学合成。应理解,在所描述的实施方案适用时,术语“多核苷酸”和“核酸”包括单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸。
DNA可以呈例如反义分子、质粒DNA、DNA-DNA双链体、预缩合DNA、PCR产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合的形式。DNA可以呈小环、质粒、杆粒、小基因、辅助DNA(线性共价封闭DNA载体)、封闭端线性双链体DNA(CELiD或ceDNA)、doggybone(dbDNATM)DNA、哑铃形DNA、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、病毒载体或非病毒载体的形式。RNA可以呈小干扰RNA(siRNA)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)和其组合的形式。核酸包括含有已知核苷酸类似物或经修饰主链残基或键的核酸,它们是合成的、天然存在的和非天然存在的,并且具有与参考核酸相似的结合特性。所述类似物和/或经修饰残基的实例包含(但不限于):硫代磷酸酯、磷酰二胺吗啉代寡聚体(吗啉代)、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、锁核酸(LNATM)和肽核酸(PNA)。除非特别限制,否则所述术语涵盖含有与参考核酸具有类似结合性质的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另外指示,否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰变异体(例如,简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。
如本文所使用的,“核苷酸”含有糖脱氧核苷(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基。核苷酸通过磷酸酯基连接在一起。
“碱基”包括嘌呤和嘧啶,所述嘌呤和嘧啶进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物,以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物,其包括但不限于放置新的反应性基团(诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧化物和烷基卤化物)的修饰。
如本文所使用的,术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子,其是从天然基因中分离的,或者以自然界中不另外存在或合成的方式进行修饰以含有核酸的节段。当核酸构建体包含表达本公开的编码序列所需的控制序列时,术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。“表达盒”包含操作性地连接至启动子的DNA编码序列。
“可杂交的”或“互补的”或“基本上互补的”意指核酸(例如RNA)包括使其能够与另一核酸序列在体外和/或体内适当的温度和溶液离子强度的条件下非共价结合,即形成沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pair)和/或G/U碱基对、“退火”或“杂交”以序列特异性的反向平行方式(即,核酸特异性地结合于互补核酸)的核苷酸序列。如所属领域已知的,标准的沃森-克里克碱基对包含:腺嘌呤(A)与胸苷(T)配对,腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对,以及鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。另外,在所属领域中还已知对于两个RNA分子(例如dsRNA)之间的杂交,鸟嘌呤(G)碱基与尿嘧啶(U)配对。例如,在与mRNA中的密码子进行tRNA反密码子碱基配对的情况下,G/U碱基配对部分负责遗传密码的简并性(即,冗余)。在本公开的上下文中,靶向主题DNA的RNA分子的蛋白结合节段(dsRNA双链体)的鸟嘌呤(G)被认为与尿嘧啶(U)互补,反之亦然。这样,当可以在靶向主题DNA的RNA分子的蛋白结合节段(dsRNA双链体)的给定核苷酸位置形成G/U碱基对时,该位置不被认为是非互补的,而是被认为是互补的。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文可互换使用,是指任何长度的氨基酸的聚合物形式,其可以包含编码和非编码的氨基酸、经过化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有修饰的肽主链的多肽。
“编码”特定抗体或其抗原结合片段的DNA序列是转录成特定RNA和/或蛋白质的DNA核酸序列。DNA多核苷酸可编码被翻译成蛋白的RNA(mRNA),或者DNA多核苷酸可编码未被翻译成蛋白的RNA(例如,tRNA、rRNA或靶向DNA的RNA;也称为“非编码”RNA或“ncRNA”)。
如本文所用,术语“末端重复”或“TR”包括任何包含至少一个最低需要的复制起点和包含回文发夹结构的区域的病毒末端重复或合成序列。Rep结合序列(“RBS”)(也称为RBE(Rep结合元件))和末端解链位点(“TRS”)共同构成“最低需要的复制起点”,并且因此TR包括至少一个RBS和至少一个TRS。在给定的一段多核苷酸序列内彼此是反向互补序列的TR通常各自被称为“反向末端重复”或“ITR”。在病毒的背景下,ITR介导复制、病毒包装、整合和原病毒拯救。如出乎意料地发现,在其全长上不为反向互补序列的TR仍然可以执行ITR的传统功能,并且因此术语ITR在本文中用于指ceDNA基因组或ceDNA载体中能够介导ceDNA载体复制的TR。所属领域的普通技术人员将了解,在复杂的ceDNA载体构型中,可以存在超过两个ITR或不对称的ITR对。ITR可以是AAV ITR或非AAV ITR,或可以来源于AAV ITR或非AAVITR。举例来说,ITR可以衍生自细小病毒科,所述细小病毒科涵盖细小病毒和依赖病毒(例如犬科动物细小病毒、牛科动物细小病毒、小鼠细小病毒、猪科动物细小病毒、人类细小病毒B-19),或可以使用充当SV40复制起点的SV40发夹作为ITR,所述ITR可以通过截短、取代、缺失、插入和/或添加而被进一步修饰。细小病毒科病毒由两个亚科组成:感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)以及感染无脊椎动物的浓病毒亚科(Densovirinae)。依赖病毒属包含腺相关病毒(AAV)的病毒家族,其能够在脊椎动物宿主中复制,该宿主包含但不限于人、灵长类、牛、犬、马和羊物种。本文中为了方便起见,将位于ceDNA载体中表达盒的5’(上游)的ITR称为“5’ITR”或“左ITR”,并将位于ceDNA载体中表达盒的3’(下游)的ITR称为“3’ITR”或“右ITR”。
“野生型ITR”或“WT-ITR”是指AAV或其它依赖病毒中天然存在的ITR序列的序列,其保留例如Rep结合活性和Rep切口能力。由于遗传密码简并或漂移,来自任何AAV血清型的WT-ITR的核酸序列可能与典型的天然存在的序列略有不同,并且因此,本文涵盖的使用的WT-ITR序列包括归因于在产生过程中发生的天然存在的变化(例如复制误差)的WT-ITR序列。
如本文所用,术语“基本上对称的WT-ITR”或“基本上对称的WT-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对WT-ITR,它们都是在整个长度上具有反向互补序列的野生型ITR。例如,ITR即使具有一个或多个偏离典型的天然存在的序列的核苷酸,只要变化并不影响该序列的特性和整体三维结构,该ITR也可以被认为是野生型序列。根据一些方面,偏离的核苷酸代表保守的序列变化。作为一个非限制性示例,序列与典型序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性(例如使用默认设置下的BLAST测量),并且还与另一个WT-ITR具有对称的三维空间组织,以使它们的3D结构在几何空间中具有相同的形状。基本上对称的WT-ITR在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。通过确定具有与合适的Rep蛋白配对的可操作的Rep结合位点(RBE或RBE')和末端解链位点(trs),可以在功能上确认大体上对称的WT-ITR为WT。可以选择测试其它功能,包含在许可条件下的转基因表达。
如本文所使用的,短语“经修饰ITR(modified ITR/mod-ITR)”或“突变ITR”在本文中可互换使用,并且是指与来自相同血清型的WT-ITR相比在至少一个或多个核苷酸中具有突变的ITR。突变可能导致根据ITR中A、C、C'、B、B'区域中的一些或多个发生变化,并且可能导致三维空间组织(即,其几何空间中的3D结构)与相同血清型的WT-ITR的3D空间组织相比发生变化。
如本文所使用的,术语“不对称ITR”也称为“不对称ITR对”,是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内在全长上不反向互补的一对ITR。作为一个非限制性示例,不对称的ITR与其同源ITR不具有对称的三维空间组织,使得其3D结构在几何空间中具有不同的形状。换句话说,不对称的ITR对具有不同的整体几何结构,即它们在3D空间中具有不同的A、C-C'和B-B'环组织(例如,一个ITR与同源ITR相比可能具有短的CC'臂和/或短的BB'臂)。两个ITR之间的序列差异可能是由于一个或多个核苷酸添加、缺失、截短或点突变引起的。根据一些实施方案,不对称ITR对中的一个ITR可以是野生型AAV ITR序列,另一个ITR是如本文定义的经修饰ITR(例如非野生型或合成ITR序列)。在另一个实施方案中,不对称ITR对中的ITR皆不是野生型AAV序列,并且两个ITR是在几何空间中具有不同形状的经修饰ITR(即,不同的整体几何结构)。根据一些实施方案,不对称ITR对中的一个mod-ITR可能具有短的C-C'臂,而另一个ITR可能具有不同的修饰(例如单臂或短的B-B'臂等),使得它们与同源不对称mod-ITR相比具有不同的三维空间组织。
如本文所用,术语“对称ITR”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对ITR,其相对于野生型依赖病毒ITR序列发生突变或修饰并且在其全长上反向互补。这两个ITR都不是野生型ITR AAV2序列(即,它们是经修饰ITR,也称为突变ITR),并且由于核苷酸的添加、缺失、取代、截断或点突变,而在序列上与野生型ITR不同。本文中为了方便起见,将位于ceDNA载体中表达盒的5’(上游)的ITR称为“5’ITR”或“左ITR”,并将位于ceDNA载体中表达盒的3’(下游)的ITR称为“3’ITR”或“右ITR”。
如本文所使用的,术语“基本上对称的经修饰ITR”或“基本上对称的mod-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体中的一对经修饰ITR,它们在其全长上具有反向互补序列。例如,经修饰的ITR即使具有一些偏离反向互补序列的核苷酸序列,但只要变化不影响特性和整体形状,也可以认为其是基本上对称的。作为一个非限制性实例,序列与典型序列具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性(如使用默认设置下的BLAST所测量),并且还与其同源的经修饰ITR具有对称的三维空间组织以使得其3D结构在几何空间中为相同形状。换句话说,基本上对称的经修饰ITR对具有在3D空间中组织的相同的A、C-C'和B-B'环。根据一些实施方案,来自mod-ITR对的ITR可具有不同的反向互补核苷酸序列,但仍具有相同的对称三维空间组织,即两个ITR都具有产生相同的整体3D形状的突变。例如,mod-ITR对中的一个ITR(例如5'ITR)可以来自一种血清型,而另一个ITR(例如3'ITR)可以来自不同血清型,然而,两者均能够具有相同的相应突变(例如,如果5'ITR在C区域中具有缺失,则来自不同血清型的经修饰的同源3'ITR在C'区域中的相应位置具有缺失),使得经修饰ITR对具有相同的对称三维空间组织。在此类实施方案中,经修饰ITR对中的每个ITR可以来自不同血清型(例如,AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12),诸如AAV2与AAV6的组合,其中根据一些ITR的修饰反映在来自不同血清型的同源ITR中的对应位置中。根据一些实施方案,基本上对称的经修饰ITR对是指一对经修饰ITR(mod-ITR),只要ITR之间的核苷酸序列的差异不影响特性或整体形状并且其在3D空间中具有基本上相同的形状即可。作为非限制性实例,如通过所属领域中熟知的标准方法,例如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)或BLASTN所测定,经修饰ITR与典型经修饰ITR具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性,并且还具有对称的三维空间组织以使其3D结构在几何空间中为相同形状。基本上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环,例如,如果基本上对称的mod-ITR对中的经修饰ITR缺失C-C'臂,那么同源经修饰ITR对应缺失C-C'环,并且还具有在其同源mod-ITR的几何空间中呈相同形状的剩余A和B-B’环的类似3D结构。
如本文所用,“内部核糖体进入位点”(IRES)意指允许在mRNA序列中间启动翻译的核苷酸序列(>500个核苷酸)(Kirn,JIT等人,2011.PLoS One 6(4):el 8556;其内容全文以引用方式并入本文)。IRES序列的使用确保了在IRES之前和之后基因的共表达,尽管IRES之后的序列可以以比IRES序列之前的序列更低的水平转录和翻译。
如本文所用,“2A肽”意指来源于病毒诸如口蹄疫病毒(F2A)、猪捷申病毒-1(P2A)、明脉扁刺蛾病毒(osea asigna virus)(T2A)或马鼻炎A病毒(E2A)的小自裂解肽。2A名称具体是指导致2A肽O末端的甘氨酰-脯氨酰键处的核糖体跳跃的小核糖核酸病毒多蛋白的区域(Kim,J.IT.等人,2011.PLoS One 6(4);其内容全文以引用方式并入本文)。这种跳跃导致2A肽与其紧邻的下游肽之间的裂解。
术语“侧接”是指一个核酸序列相对于另一核酸序列的相对位置。通常,在序列ABC中,B的两侧是A和C。这同样适用于布置AxBxC。因此,侧接序列在所侧接的序列之前或之后,但不必与所侧接的序列相邻或紧邻。根据一些实施方案,术语侧接是指在线性双链体ceDNA载体的每个末端处的末端重复序列。
如本文所使用的,术语“ceDNA基因组”是指还并入了至少一个反向末端重复区域的表达盒。ceDNA基因组还可以包括一个或多个间隔区。根据一些实施方案,该ceDNA基因组作为DNA的分子间双链体多核苷酸并入质粒或病毒基因组中。
如本文所使用的,术语“ceDNA间隔区”是指分隔ceDNA载体或ceDNA基因组中的功能元件的间插序列。根据一些实施方案,ceDNA间隔区将两个功能元件保持在对于最优功能性来说所期望的距离上。根据一些实施方案,ceDNA间隔区提供或增加了ceDNA基因组在例如质粒或杆状病毒内的遗传稳定性。根据一些实施方案,ceDNA间隔区通过提供克隆位点等的便利位置,促进ceDNA基因组的就绪遗传操纵。例如,在某些方面,含有若干限制核酸内切酶位点的寡核苷酸“多接头”或设计成不具有已知蛋白质(例如,转录因子)结合位点的非开放阅读框架序列可以定位于ceDNA基因组中以分离顺式作用因子,例如将6聚体、12聚体、18聚体、24聚体、48聚体、86聚体、176聚体等插入末端解链位点与上游转录调控元件之间。类似地,可以在多聚腺苷酸化信号序列和3'-末端解链位点之间并入间隔区。
如本文所用,术语“Rep结合位点”、“Rep结合元件”、“RBE”和“RBS”可互换使用并且是指Rep蛋白(例如AAV Rep 78或AAV Rep 68)的结合位点,其在Rep蛋白结合后允许Rep蛋白在并入了该RBS的序列上发挥其位点特异性核酸内切酶活性。RBS序列和其反向互补序列一起形成单个RBS。RBS序列是本领域已知的,并且包括例如,5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3',一种在AAV2中鉴定的RBS序列。在本公开的实施方案中可以使用任何已知的RBS序列,包括其它已知的AAV RBS序列和其它天然已知的或合成的RBS序列。不受理论束缚,认为Rep蛋白的核酸酶结构域结合到双链体核酸序列GCTC,因此两种已知的AAV Rep蛋白直接结合到双链体寡核苷酸5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'并稳定地装配在其上。另外,可溶性聚集性构象异构体(即,数目未定的相互缔合的Rep蛋白)解离并结合到含有Rep结合位点的寡核苷酸。每个Rep蛋白都与每个链上的含氮碱基和磷酸二酯骨架相互作用。与含氮碱基的相互作用提供序列特异性,而与磷酸二酯主链的相互作用是非序列特异性的或较少序列特异性的,并稳定了蛋白-DNA复合物。
如本文所使用,术语“末端解链位点”和“TRS”在本文可互换使用,并且是指一个区域,在此Rep与5'胸苷形成酪氨酸-磷酸二酯键,产生3'OH,充当通过细胞的DNA聚合酶、例如DNA polδ或DNA polε进行DNA延伸的底物。另选地,Rep-胸苷复合物可以参与配位接合反应。根据一些实施方案,TRS最低限度地涵盖非碱基配对的胸苷。根据一些实施方案,TRS的切口产生效率可以至少部分地由其在同一分子内距RBS的距离来控制。当受体底物是互补ITR时,所产生的产物是分子内双螺旋。TRS序列是本领域已知的,并包含例如5'-GGTTGA-3',其是在AAV2中鉴定的六核苷酸序列。本公开的实施方案中可使用任何已知的TRS序列,包含其他已知的AAV TRS序列和其他天然已知的或合成的TRS序列,诸如AGTT、GGTTGG、AGTTGG、AGTTGA和其他基序(诸如RRTTRR)。
如本文所使用的,术语“ceDNA”意指用于非病毒基因转移、合成或其它形式的无衣壳封闭式线性双链(ds)双链体DNA。ceDNA的详细描述描述于2017年3月3日提交的PCT/US2017/020828的国际申请中,该申请的全部内容以引用的方式明确地并入本文中。使用基于细胞的方法产生包括各种反向末端重复(ITR)序列和构型的ceDNA的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的实施例1中,该申请中的每一个申请以全文引用的方式并入本文中。用于产生包括各种ITR序列和构型的合成ceDNA载体的某些方法描述于例如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US2019/14122中,该国际申请的全部内容以引用的方式并入本文中。如本文所使用的,术语“ceDNA载体”与“ceDNA”可互换地使用并且指包括至少一个末端回文结构的末端封闭式DNA载体。根据一些实施方案,ceDNA包含两个共价封闭端。
如本文所用,术语“ceDNA-质粒”是指一种包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的质粒。
如本文所使用的,术语“ceDNA-杆粒”是指一种包括作为分子间双链体的ceDNA基因组的感染性杆状病毒基因组,其能够作为质粒在大肠杆菌中增殖,因此可以作为杆状病毒的穿梭载体操作。
如本文所用,术语“ceDNA-杆状病毒”是指一种在杆状病毒基因组内包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的杆状病毒。
如本文所用,术语“ceDNA-杆状病毒感染的昆虫细胞”和“ceDNA-BIIC”可互换使用,是指被ceDNA-杆状病毒感染的无脊椎动物宿主细胞(包括但不限于昆虫细胞(例如Sf9细胞))。
如本文所用,术语“封闭端DNA载体”是指具有至少一个共价封闭端的无衣壳DNA载体,其中该载体的至少一部分具有分子内双链体结构。
如本文中所定义,“报告体”是指可用于提供可检测的读出数的蛋白。报告体通常产生可测量的信号,诸如荧光、颜色或发光。报告蛋白编码序列编码在细胞或生物体中的存在易于观察到的蛋白。例如,荧光蛋白当被特定波长的光激发时会导致细胞发荧光,荧光素酶引起细胞催化产生光的反应,以及诸如β-半乳糖苷酶的酶将底物转化为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报告多肽包括但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)和其它荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其它在所属领域中公知的报告多肽。
如本文所用,术语“效应蛋白”是指一种提供可检测的读出数的多肽,例如作为报告多肽,或更适当地,作为杀伤细胞的多肽,例如毒素,或致使细胞易用所选药剂或因缺乏所选药剂而被杀伤的药剂。效应蛋白包括直接靶向或损害宿主细胞的DNA和/或RNA的任何蛋白或肽。例如,效应蛋白可以包含但不限于:靶向宿主细胞DNA序列(无论是基因组的还是在染色体外元件上的)的限制性核酸内切酶;降解细胞存活所必需的多肽目标的蛋白酶;DNA旋转酶抑制剂;以及核糖核酸酶型毒素。根据一些实施方案,由如本文所描述的合成生物回路控制的效应蛋白表达可作为一个因子参与另一个合成生物回路,从而扩大了生物回路系统反应性的范围和复杂度。
转录调节子是指活化或阻遏转基因(例如,编码如本文所述的抗体或其抗原结合片段的核酸)转录的转录活化子和阻遏子。启动子为引发特定基因转录的核酸区域。转录活化子通常结合至转录启动子附近并且募集RNA聚合酶以直接引发转录。阻遏子与转录启动子结合,并在空间上阻碍RNA聚合酶启动转录。其它转录调节子可取决于它们的结合位置以及细胞和环境条件来充当活化子或阻遏子。转录调节子类别的非限制性实施例包括但不限于同源域蛋白、锌指蛋白、翼状螺旋(叉头)蛋白和亮氨酸拉链蛋白。
如本文所使用的,“阻遏蛋白”或“诱导蛋白”是与调节序列元件结合并分别阻遏或活化与调节序列元件操作性连接的序列的转录的蛋白。如本文所描述的优选阻遏和诱导蛋白对至少一种输入剂或环境输入物的存在或不存在敏感。如本文所描述的优选蛋白是模块的形式,包括例如可分离的DNA结合和输入剂结合或反应元件或结构域。
如本文所使用的,“载剂(carrier)”包含任何和所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、缓冲液、载剂溶液、悬液、胶体等。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是所属领域熟知的。补充性活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用宿主时不会产生毒性、过敏性或类似的不良反应的分子实体和组合物。
如本文所使用的,“输入剂反应结构域”是转录因子的一个结构域,其以致使连接的DNA结合融合结构域对条件或输入剂的存在作出反应的方式与该条件或输入剂结合或以其它方式作出反应。根据一些实施方案,条件或输入剂的存在导致输入剂反应结构域或其融合的蛋白发生构象变化,从而改变转录因子的转录调制活性。
术语“体内”是指在生物体,诸如多细胞动物中或内部进行的分析或过程。根据本文描述的一些方面,当使用单细胞生物例如,细菌时,可以说方法或用途是在“体内”发生的。术语“离体”是指使用在多细胞动物体或植物体之外的具有完整膜的活细胞进行的方法和用途,所述活细胞例如外植体、培养细胞(包括原代细胞和细胞系)、转化的细胞系、以及提取的组织或细胞(包括血细胞)等等。术语“体外”是指不需要存在具有完整膜的细胞的分析和方法,诸如细胞提取物,并且可以指在非细胞系统,诸如不包含细胞或细胞系统的介质,诸如细胞提取物中引入可编程的合成生物回路。
如本文所使用的,术语“启动子”是指通过驱动核酸序列的转录来调节另一核酸序列表达的任何核酸序列,其可以是编码蛋白或RNA的异源目标基因。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性的或其任何组合。启动子是核酸序列的控制区域,在该核酸序列的其余部分的引发和转录速率是受控的。启动子还可以含有可以结合调节蛋白和分子的遗传元件,诸如,RNA聚合酶和其他转录因子。根据本文所述的方面的一些实施方案,启动子可以驱动调节启动子本身的表达的转录因子的表达。在启动子序列内将发现转录起始位点,以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合域。真核启动子将经常但并非总是含有“TATA”框和“CAT”框。各种启动子,包括诱导型启动子,可用于驱动本文公开的ceDNA载体中转基因的表达。启动子序列可以在其3'末端以转录起始位点为界并且向上游(5'方向)延伸以包括为了在高于背景的可检测水平上引发转录所必需的最少数目的碱基或元件。根据一些实施方案,本公开的启动子是肝特异性启动子。
如本文所用,术语“增强子”是指结合一种或多种蛋白(例如,活化蛋白或转录因子)以增加核酸序列的转录活化的顺式作用调节序列(例如,10-1,500个碱基对)。增强子可以位于其所调节的基因起始位点上游或基因起始位点下游最多1,000,000个碱基对处。增强子可以位于内含子区域内,或无关基因的外显子区中。
启动子可以被说成驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其转录。短语“操作性地连接”、“操作性地定位”、“操作性地连接”,“在控制下”和“在转录控制下”指示启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和/或取向,以控制该序列的转录启动和/或表达。如本文所用,“反向启动子”是指其中核酸序列处于相反的取向,使得编码链现在成为非编码链的启动子,并且反之亦然。反向启动子序列可以在各种实施方案中用于调节开关的状态。另外,在各种实施方案中,启动子可以与增强子结合使用。
启动子可以是与基因或序列天然结合的启动子,如可以通过分离位于编码节段上游的5'非编码序列和/或给定基因或序列的外显子所获得。此类启动子可以称为“内源性的”。类似地,根据一些实施方案,增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子,位于该序列的下游或上游。
根据一些实施方案,编码核酸节段定位在“重组启动子”或“异源启动子”的控制下,该启动子均指在其天然环境中通常不与其操作性地连接的编码核酸序列关联的启动子。重组或异源增强子是指在天然环境中正常不与给定核酸序列关联的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子;从任何其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子;以及非“天然存在”(即包含不同转录调节区域的不同元件和/或通过本领域已知的遗传工程方法改变表达的突变)的合成启动子或增强子。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列之外,还可以结合本文公开的合成生物回路和模块,使用重组克隆和/或核酸扩增技术,包括PCR,来产生启动子序列(参见例如美国专利第4,683,202号、美国专利第5,928,906号,各自以引用的方式并入本文)。此外,预期也可以采用指导序列在例如,线粒体、叶绿体等非核细胞器内的转录和/或表达的控制序列。
如本文所描述的,“诱导型启动子”是特征在于当存在诱导物或诱导剂或受其影响或被其接触时,启动或增强转录活性的启动子。如本文所定义的“诱导物”或“诱导剂”可以是内源性的,或是以能够从诱寻型启动子诱导转录活性的方式施用的通常外源性的化合物或蛋白。根据一些实施方案,诱导物或诱导剂,即化学物质、化合物或蛋白,本身可以是核酸序列转录或表达的结果(即诱导物可以是由另一组分或模块表达的诱导蛋白),转录或表达本身可以处于诱导型启动子的控制下。根据一些实施方案,诱导型启动子是在不存在某些药剂,诸如阻遏子的情况下被诱导的。诱导型启动子的示例包括但不限于四环素、金属硫蛋白、蜕皮素、哺乳动物病毒(例如,腺病毒晚期启动子;以及小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR))和其他类固醇反应性启动子、雷帕霉素反应性启动子等。
本文可互换使用的术语“DNA调节序列”、“控制元件”和“调节元件”是指提供和/或调节非编码序列(例如靶向DNA的RNA)或编码序列(例如定点修饰多肽或Cas9/Csn1多肽)的转录和/或调节所编码多肽的转译的转录和转译控制序列,诸如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号等。
如本文所使用,术语“开放阅读框(ORF)”意在指可以转译到肽或蛋白质中的几个核苷酸三联体的序列。开放阅读框优选地在其5’端和通常展现3的倍数的核苷酸的长度的后续区域处含有起始密码子,即通常编码氨基酸甲硫氨酸(ATG)的三个后续核苷酸的组合。ORF优选地通过终止密码子(例如TAA、TAG、TGA)终止。通常,这是开放阅读框的唯一终止密码子。因此,在本公开的上下文中,开放阅读框优选地为由可以除以三的多个核苷酸组成、以起始密码子(例如ATG)开始并且优选地以终止密码子(例如,TAA、TGA或TAG)终止的核苷酸序列。开放阅读框可以被分离,或其可以例如在如本文所描述的ceDNA载体中并入较长的核酸序列中。
“操作性地连接”是指一种并置,其中所描述的组分处于允许它们以预期方式起作用的关系中。例如,如果启动子影响编码序列的转录或表达,那么该启动子操作性地连接到所述编码序列。“表达盒”包括可操作地连接到启动子或足以引导转基因在ceDNA载体中的转录的其它调节序列的DNA序列。合适的启动子包括例如,组织特异性启动子。启动子也可以是AAV起源的。
如本文所使用,术语“受试者”是指向其提供用本公开的ceDNA载体进行的治疗,包括预防性治疗的人类或动物。如本文所用,术语“受试者”包括人和其他动物。通常,受试者是人。例如,受试者可以是成人、青少年、儿童(2岁至14岁)、婴儿(出生至2岁)或新生儿(至多2个月)。在特定方面,受试者为至多4个月大,或至多6个月大。根据一些方面,成人是约65岁或更老,或约60岁或更老的老年人。根据一些方面,受试者是孕妇或打算怀孕的女性。在其他方面,受试者不是人;例如非人灵长类动物;诸如狒狒、黑猩猩、大猩猩或猕猴。在某些方面,受试者可以是宠物,诸如狗或猫。
如本文所用,术语“宿主细胞”包括易于被本公开的核酸构建体或ceDNA表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。作为非限制性示例,宿主细胞可以是分离的原代细胞、多能干细胞、CD34+细胞、诱导的多能干细胞或许多永生化细胞系(例如HepG2细胞)中的任何一种。可替代地,宿主细胞可以是组织、器官或生物体中的原位或体内细胞。
术语“外源”是指存在于细胞中而非其天然来源的物质。当在本文中使用时,术语“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入诸如细胞或生物体的生物系统中的核酸(例如,编码多肽的核酸)或多肽,通常在该细胞或生物体中未发现该核酸或多肽,并且希望将该核酸或多肽引入此类细胞或生物体中。可替代地,“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入如细胞或生物体的生物系统中的核酸或多肽,在该细胞或生物体中发现核酸或多肽的量相对较低,并且希望增加细胞或生物体中核酸或多肽的量,例如,以产生异位表达或水平。相比之下,术语“内源”是指生物系统或细胞天然存在的物质。
术语“序列同一性”是指两个核苷酸序列之间的相关性。出于本公开的目的,使用如在EMBOSS软件包的Needle程序(EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件,Rice等人,2000,同上),优选版本3.0.0或更高版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度。使用的可选参数是空位开放罚分10,空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比,并如下计算:(相同的脱氧核糖核苷酸乘以100)/(比对长度-比对空位总数)。比对的长度优选为至少10个核苷酸、优选为至少25个核苷酸、更优选为至少50个核苷酸并且最优选为至少100个核苷酸。
如本文所用,术语“同源性”或“同源”被定义为,在比对序列且必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后,与靶染色体上的相应序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。出于确定核苷酸序列同源性百分比的比对可以用所属技术领域中内的各种方式来实现,例如使用公开可用的计算机软件,诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2或Megalign(DNASTAR)软件。所属领域的技术人员可以确定用于比对序列的合适参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。根据一些实施方案,当同源臂的例如核酸序列(例如DNA序列)与宿主细胞的对应原生或未经编辑的核酸序列(例如基因组序列)具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更多同一性时,该序列被视为“同源”。
如本文所用,术语“异源”意指分别在天然核酸或蛋白中未发现的核苷酸或多肽序列。异源核酸序列可以与天然存在的核酸序列(或其变异体)连接(例如通过基因工程)以生成编码嵌合多肽的嵌合核苷酸序列。异源核酸序列可以连接到变异多肽(例如通过基因工程改造)以产生编码融合变异多肽的核酸序列。或者,术语“异源”可以指不天然存在于细胞或受试者中的核酸序列。
“载体”或“表达载体”为可以与另一DNA节段,即“插入片段”附接以便使所附接的节段在细胞中复制的复制子,诸如质粒、杆粒、噬菌体、病毒、病毒粒子或粘质体。载体可以是设计用于递送到宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用,载体在起源和/或最终形式上可以是病毒或非病毒的,但是出于本公开的目的,“载体”通常是指ceDNA载体,如本文所用。术语“载体”涵盖与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。根据一些实施方案,载体可以是表达载体或重组载体。
如本文所用,术语“表达载体”是指引导RNA或多肽从与载体上的转录调节序列连接的序列的表达的载体。表达的序列通常但不一定与细胞异源。表达载体可以包括其它元件,例如,表达载体可以具有两个复制系统,从而使其可以在两种生物体中维持,例如,在人类细胞中进行表达,以及在原核宿主中进行克隆和扩增。术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白以及适当时分泌蛋白的细胞过程,在适用时包括但不限于例如转录、转录物加工、转译和蛋白折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过转译从基因转录的mRNA所获得的多肽。术语“基因”意指当与适当的调节序列可操作地连接时在体外或在体内转录为RNA的核酸序列(DNA)。基因可以包括或可以不包括编码区前后的区域,例如5'非转译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾区”序列,以及单个编码节段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
“重组载体”意指包括能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应了解,根据一些实施方案,本文所述的载体可以与其他合适的组合物和疗法组合。根据一些实施方案,载体是游离型的。合适的游离型载体的使用提供了一种以高拷贝数的染色体外DNA维持受试者中的所关注的核苷酸,从而消除染色体整合的潜在影响的方式。
如本文所使用,术语“施用(administration/administering)”和其变型是指将组合物或药剂(例如本文所描述的ceDNA)引入受试者中并且包括同时和依序引入一种或多种组合物或药剂。“施用”可以指例如,治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂以及实验方法。“施用”还涵盖体外和离体治疗。将组合物或药剂引入受试者中是通过任何适合的途径,包括经口、经肺、经鼻、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、经直肠、淋巴内、瘤内或局部。施用包括自我施用和由另一个人施用。可以通过任何适合的途径进行施用。适合的施用途径使得组合物或药剂执行其预期功能。例如,如果合适的途径是静脉内,则通过将组合物或药剂引入受试者的静脉中来施用组合物。
如本文所用,术语“感染”是指病原体最初进入宿主;以及病原体已在宿主细胞或组织中或上建立的病状;此类病状不一定构成或导致疾病。
如本文所用,术语“免疫应答”意指受试者的免疫系统针对外来抗原或自身抗原的任何功能性表达,无论这些反应的结果对受试者是有益的还是有害的。
如本文所用,术语“生物样品”是指从受试者分离的任何类型的生物来源材料,包括例如DNA、RNA、脂质、碳水化合物和蛋白质。术语“生物样品”包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体。生物样品包括例如但不限于全血、血浆、血清、精液、唾液、泪液、尿液、粪便、汗液、颊面、皮肤、脑脊液、骨髓、胆汁、毛发、肌肉活组织检查、器官组织或本领域普通技术人员已知的其他生物来源材料。生物样品可以从受试者获得用于诊断或研究,或者可以从健康受试者获得,作为对照或用于基础研究。
如本文所用,术语“癌症”是指其中异常细胞不受控制地分裂并能够侵入其他组织的疾病。有超过100种不同类型的癌症。大多数癌症是以它们所起始的器官或细胞类型命名的,例如,起始于结肠的癌症称为结肠癌;起始于皮肤的黑素细胞的癌症称为黑素瘤。癌症类型可以分组成更广泛的类别。癌症的主要类别包括:恶性肿瘤(意指起始于皮肤或内衬或覆盖内脏器官的组织的癌症,及其亚型,包括腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌);肉瘤(意指起始于骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织的癌症);白血病(意指起始于血液形成组织(例如,骨髓)并引起大量异常血细胞产生并进入血液的癌症;淋巴瘤和骨髓瘤(意指起始于免疫系统细胞的癌症);和中枢神经系统(CNS)癌症(意指起始于大脑和脊髓组织的癌症)。术语“骨髓增生异常综合征”是指其中骨髓不能产生足够的健康血细胞(白细胞、红细胞和血小板)并且在血液和/或骨髓中存在异常细胞的一种类型的癌症。骨髓增生异常综合征可以变成急性骨髓性白血病(AML)。在某些实施方案中,癌症选自包括但不限于以下的癌症:急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑瘤、乳腺癌、原发性未知的癌症、扩散至骨骼的癌症、扩散至大脑的癌症、扩散至肝脏的癌、扩散至肺的癌症、类癌瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、妊娠滋养细胞瘤(GTT)、毛细胞白血病、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、皮肤癌、间皮瘤、男性癌症、葡萄胎妊娠、口腔癌和口咽癌、骨髓瘤、鼻和窦癌、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、罕见癌症、直肠癌、唾液腺癌、继发性癌症、皮肤癌(非黑素瘤)、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、未知原发性癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
如本文所用,术语“剂量”是指一次服用或施用于受试者的物质(例如,如本文所述的ceDNA)的量。
如本文所用,术语“给药”是指施用物质(例如,如本文所述的ceDNA)以实现治疗性目的(例如,治疗)。
短语“第一药剂与第二药剂的组合”中的术语“组合”包括第一药剂和第二药剂的共同施用,其例如可以溶解或混合在相同的药学上可接受的载体中,或者施用第一药剂,随后施用第二药剂,或者施用第二药剂,随后施用第一药剂。因此,本公开包括组合治疗性治疗的方法和组合药物组合物。
短语“伴随治疗性治疗”中的术语“伴随”包括在第二药剂的存在下施用药剂。伴随治疗性治疗方法包括其中共同施用第一药剂、第二药剂、第三药剂或另外的药剂的方法。伴随治疗性治疗方法还包括其中在第二药剂或另外的药剂的存在下施用第一药剂或另外的药剂的方法,其中第二药剂或另外的药剂例如可以先前已经施用。伴随治疗性治疗方法可以由不同的参与者逐步执行。例如,一名参与者可以向受试者施用第一药剂并且第二参与者可以向受试者施用第二药剂,并且施用步骤可以同时,或几乎同时,或在分开的时间执行,只要第一药剂(和另外的药剂)在第二药剂(和另外的药剂)的存在下在施用之后即可。参与者和受试者可以是同一实体(例如,人)。
如本文所用,术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗物质,例如,如本文所述的抗体或抗原结合片段以及另一种药物。其他药物可以与如本文所述的抗体或抗原结合片段的施用同时、在其之前或在其之后施用。
如本文所用,短语“核酸治疗性”、“治疗性核酸”和“TNA”可互换地使用,并且是指使用核酸作为治疗疾病或病症的治疗剂的活性组分的治疗的任何模态。如本文所用,这些短语是指基于RNA的治疗剂和基于DNA的治疗剂。基于RNA的治疗剂的非限制性实例包含mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)。基于DNA的治疗剂的非限制性实例包含小环DNA、小基因、病毒DNA(例如,慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、末端封闭式线性双螺旋DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、doggyboneTMDNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、非病毒迷你串DNA载体(线性-共价封闭的DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。根据一些实施方案,治疗性核酸为ceDNA。
如本文所用,术语“治疗效果”是指治疗的结果,其结果被判定为合乎需要并且有益的。治疗效果可以直接或间接地包括疾病表现的遏制、减少或消除。治疗效果还可以直接或间接地包括疾病表现的进展的遏制减少或消除。
对于本文所描述的任何治疗剂,治疗有效量可以初始地根据初步的体外研究和/或动物模型来确定。治疗有效剂量也可以根据人数据来确定。可以基于相对生物利用度和施用的化合物的效力调节施用剂量。基于上述方法和其他熟知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。下文总结了用于测定治疗有效性的一般原理,其可以在Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版,McGraw-Hill(纽约)(2001)的第1章中找到,该文献以引用的方式并入本文中。
药代动力学原理为修改剂量方案以获得期望程度的治疗功效并且具有最小的不可接受的副作用提供了基础。在可以测量药物的血浆浓度并且与治疗窗口有关的情况下,可以获得针对剂量修改的另外的指导。
如本文所用,“病毒感染”意指病毒在受试者体内的入侵和增殖。
如本文所用,术语“治疗”包括减轻、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展,基本上改善病症的临床症状,或者基本上预防病症的临床症状的出现、获得有益或期望的临床结果。治疗还指完成以下一项或多项:(a)降低病患的严重程度;(b)限制被治疗病患的特征性症状的发展;(c)限制被治疗病患的特征性症状的恶化;(d)限制障碍在先前患有该病患的患者中的复发;以及(e)限制先前对病患无症状的患者的症状复发。
有益或所需的临床结果,诸如药理学和/或生理学作用,包括(但不限于):预防可能易患有疾病、病患或病症但尚未经历或展现疾病的症状的受试者出现该疾病、病患或病症(防治性治疗);缓解该疾病、病患或病症的症状;减轻该疾病、病患或病症的程度;稳定该疾病、病患或病症(即,不恶化);预防该疾病、病患或病症的扩散;延迟或减缓该疾病、病患或病症进展;改善或缓和该疾病、病患或病症;以及其组合,以及与如果不接受治疗所预期的存活期相比,延长存活期。
那些“需要治疗的”包括已经患有疾病或病症、感染或癌症的哺乳动物,诸如人。
如本文所用,术语“增加”、“增强”、“提高”(以及类似术语)通常是指相对于自然条件、预期条件或平均条件、或者相对于对照条件直接地或间接地增加浓度、水平、功能、活性或行为的作用。
如本文所用,术语“遏制”、“减少”、“干扰”、“抑制”和/或“降低”(以及类似术语)通常是指直接或间接地降低相对于自然条件、预期条件或平均条件,或相对控制条件的浓度、水平、功能、活动或行为的行为。
如本文所使用,“对照”意在指参考标准物。根据一些实施方案,对照为从健康患者获得的阴性对照样品。在其它实施方案中,对照为从诊断患有疾病或病症、感染或癌症的患者获得的阳性对照样品。在又其它实施方案中,对照为历史对照或标准参考值或值范围(诸如先前测试的对照样品,或一组代表基线或正常值的样品)。测试样品与对照之间的差异可以为增加或相反地减少。差异可以为定性差异或定量差异,例如统计学上显著的差异。根据一些示例,差异为相对于对照增加或减少至少约5%,诸如至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%、至少约100%、至少约150%、至少约200%、至少约250%、至少约300%、至少约350%、至少约400%、至少约500%或大于500%。
如本文所使用的,术语“包括(comprising/comprises)”在提及组合物、方法以及对该方法或组合物来说必不可少的其相应组分时使用,但对于包括未指明的要素,无论是否必要,仍然是开放的。
如本文所使用的,术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需要的那些要素。该术语允许存在不实质影响该实施方案的一个或多个基本和新颖或功能性特征的要素。“包含”的使用表示包含而不是限制。
术语“由……组成”是指如本文所描述的组合物、方法和其相应组分,其排除在该实施方案的描述中未叙述的任何要素。
如本说明书和所附权利要求书所用,除非上下文另有明确规定,否则单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述”包含多个提及物。因此,举例来说,提及“所述方法”包括一种或多种本文所描述的类型的方法和/或步骤,且/或在阅读本公开后,其将对于所属领域的技术人员而言变得显而易见,等等。类似地,除非上下文另有明确规定,否则单词“或”旨在包含“和”。尽管与本文所描述的方法和材料相似或等效的那些方法和材料可以用于实施或测试本公开,但在下文描述适合的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁文exempligratia,并且在本文中用以指示非限制性示例。因此,缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(forexample)”同义。
除了在操作示例中或在另外指示的情况下,本文所使用的表示成分或反应条件的量的所有数字都应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。术语“约”在结合百分比使用时,可以意指±1%。以下实施例进一步详细解释本公开,但本公开的范围不应限于此。
本文所公开的本公开的替代性要素或实施方案的分组不解释为限制。每个组成员可以单独提及和要求,或呈与该组的其它成员或此处找到的其它要素的任何组合提及和要求。出于方便和/或可专利性的原因,一个组中的一个或多个成员可以包括在一个组中或从中删除。当发生任何这样的包括或删除时,在本文中认为说明书含有修改的组,从而满足所附权利要求书中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。
其它术语在本文中限定于本公开的各个方面的描述内。
本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方案和实施例,但是如相关领域的技术人员将认识到的,在本公开的范围内可以进行各种等效修改。例如,虽然方法步骤或功能以给定的次序呈现,但是另选的实施方案可以以不同的次序执行功能,或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开的教导可以适当地应用于其他程序或方法。本文描述的各种实施方案可以进行组合以提供其他实施方案。如果需要,可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开的又一实施方案。而且,由于生物学功能等效性的考虑,可以在不影响生物学或化学作用的种类或数量的情况下对蛋白结构进行一些改变。可以根据详细描述对本公开进行这些和其他改变。意图所有这些修改包括在所附权利要求书的范围内。
任何前述实施方案的特定要素都可以进行组合或替代其他实施方案中的要素。此外,尽管已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点,但是其他实施方案也可以表现出这样的优点,并且并非所有实施方案都需要为了落入本公开的范围内而表现出这样的优点。
通过以下实施例进一步说明本文所述的技术,这些实施例决不应解释为进一步限制。应理解,本公开不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等,并且因此可以变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的,而无意于限制本公开的范围,本公开的范围仅由权利要求书限定。
II.通过ceDNA载体表达抗体或其抗原结合片段
本文所述的技术大体上涉及抗体或其抗原结合片段通过一个或多个非病毒DNA载体(例如,如本文所述的ceDNA载体)在细胞中的表达和/或产生。用于表达抗体或其抗原结合片段的ceDNA载体描述于本文中的标题为“通用ceDNA载体”的章节中。具体地说,用于表达抗体或其抗原结合部分的ceDNA载体包含一对ITR(例如,对称或不对称的,如本文所述)以及介于所述ITR对之间的如本文所述的可操作地连接到启动子或调节序列的编码抗体重链(HC)和/或抗体轻链(LC)的核酸,或其一部分。用于表达抗体或其抗原结合片段的ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优点为对编码所需HC或LC或HC和LC两者的核酸序列不存在大小约束。本公开的特征是HC和LC可以由相同的ceDNA或由不同的ceDNA表达。
正如将了解的那样,本文所述的ceDNA载体技术能够适合于任何复杂程度或能够以模块化方式使用,其中抗体的不同组分(例如,HC、LC、接头)的表达能够以独立方式控制。例如,预期本文设计的ceDNA载体技术使用单个ceDNA载体来表达抗体、其抗原结合片段的HC和LC两者或其部分,或者可以使用多个ceDNA载体,其中每个载体表达HC或LC或其部分或另一组分,它们各自独立地受相同或不同启动子控制。本文特别涵盖以下实施方案且所属领域的技术人员能够按需要对其进行调适。
根据一些实施方案,单个ceDNA载体可以用于在单个启动子的控制下表达抗体或其抗原结合片段的LC。根据一些实施方案,单个ceDNA载体可以用于在单个启动子的控制下表达抗体或其抗原结合片段的HC。
根据一些实施方案,单个ceDNA载体可以用于在单个启动子(例如,强启动子)的控制下表达抗体或其抗原结合片段的LC和HC,任选地使用IRES序列确保每种组分的适当表达。
在另一个实施方案中,本文还预期包含至少两个插入片段(例如表达HC或LC)的单个ceDNA载体,其中每个插入片段的表达是在其自身启动子的控制下进行。启动子可以包括相同启动子的多个拷贝、多个不同启动子或其任意组合。
本公开的发现是,通常期望以不同的表达水平表达抗体的组分(例如,HC或LC),因此控制所表达的单个组分的化学计量以确保在细胞中的有效组合,如下文更详细地描述。
根据一些方面,本公开提供了一个或多个ceDNA载体,其包含一个或多个编码抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列。本文所述的抗体或抗原结合片段(即,抗原)的靶标可以选自多种病原体,包括例如细菌、病毒、真菌和寄生虫感染剂。合适的靶标还可以包括癌症或癌症相关抗原等。另外其他靶标可以包括自身免疫病状,诸如类风湿性关节炎(RA)或多发性硬化症(MS)。
在某些实施方案中,本公开的抗体或抗原结合片段特异性结合其靶抗原。
如本文所用,“特异性结合”是指抗体或抗原结合片段以等于或大于105M-1的亲和力或Ka(即,以1/M为单位的特定结合相互作用的平衡缔合常数)(其等于该缔合反应的结合速率[Kon]与解离速率[Koff]的比率)与抗原缔合或结合,而不与样品中的任何其他分子或组分显著缔合或结合。另选地,亲和力可以定义为以M为单位(例如,10-5M至10-13M)的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)。
根据一些实施方案,术语“特异性结合”是指对抗原具有至少约10-8M的结合亲和力(以Kd表示)的那些抗原结合蛋白(例如,mAb),如通过实时无标记生物层干涉测定,例如,在25℃或37℃处,例如,HTX生物传感器,或通过表面等离子体共振,例如,BIACORETM,或通过溶液亲和力ELISA所测量。
抗体可以分类为“高亲和力”抗体或“低亲和力”抗体。“高亲和力”抗体是指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1或至少1013M-1的那些抗体。“低亲和力”抗体是指Ka为至多107M-1、至多106M-1、至多105M-1的那些抗体。另选地,亲和力可以定义为以M为单位(例如,10-5M至10-13M)的特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd),如通过实时无标记生物层干涉测定,例如,在25℃或37℃处,例如,HTX生物传感器,或通过表面等离子体共振,例如,BIACORETM,或通过溶液亲和力ELISA所测量。
在某些实施方案中,本公开的抗体能够中和病原体的感染。如本文所用,“中和抗体”是可以中和,即预防、抑制、降低、阻止或干扰病原体在宿主中引发和/或维持感染的能力的抗体。术语“中和抗体”和“中和的抗体(an antibody that neutralizes/antibodiesthat neutralize)”在本文中可互换使用。在任何目前公开的实施方案中,抗体或抗原结合片段能够预防和/或中和体外感染模型和/或体内感染动物模型和/或人中的感染。
ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势是,编码抗体或其抗原结合片段的一个或多个核酸序列不存在大小约束。此外,根据必要的立体化学,可以改变HC和LC(或HCVR或LCVR)的摩尔比,并且可以使用相同或不同的启动子,以实现最佳表达。
根据一些实施方案,用于表达期望的抗体或其抗原结合片段的ceDNA载体包含在第一ceDNA载体中编码抗体或其抗原结合片段的HC的核酸序列和在第二ceDNA载体中编码抗体或其抗原结合片段的LC的核酸序列。根据一些实施方案,编码LC的核酸序列在第一启动子的控制下。根据一些实施方案,编码HC的核酸序列在第二启动子的控制下。根据一些实施方案,第一启动子和第二启动子是相同的。根据一些实施方案,第一启动子和第二启动子是不同的。
根据一些实施方案,将包含编码抗体或其抗原结合片段的HC的核酸序列的第一ceDNA载体和包含编码抗体或其抗原结合片段的LC的核酸序列的第二ceDNA载体以1:10至1:10的(HC:LC)摩尔比混合并共同配制。根据一些实施方案,将包含编码抗体或其抗原结合片段的HC的核酸序列的第一ceDNA载体和包含编码抗体或其抗原结合片段的LC的核酸序列的第二ceDNA载体以3:1至1:1的(HC:LC)摩尔比混合并共同配制。根据一些实施方案,将包含编码抗体或其抗原结合片段的HC的核酸序列的第一ceDNA载体和包含编码抗体或其抗原结合片段的LC的核酸序列的第二ceDNA载体以3:1的(HC:LC)摩尔比混合并共同配制。根据一些实施方案,将包含编码抗体或其抗原结合片段的HC的核酸序列的第一ceDNA载体和包含编码抗体或其抗原结合片段的LC的核酸序列的第二ceDNA载体以2:1的(HC:LC)摩尔比混合并共同配制。根据一些实施方案,将包含编码抗体或其抗原结合片段的HC的核酸序列的第一ceDNA载体和包含编码抗体或其抗原结合片段的LC的核酸序列的第二ceDNA载体以1.5:1的(HC:LC)摩尔比混合并共同配制。根据一些实施方案,将包含编码抗体或其抗原结合片段的HC的核酸序列的第一ceDNA载体和包含编码抗体或其抗原结合片段的LC的核酸序列的第二ceDNA载体以3:1至2:1的(HC:LC)摩尔比混合并共同配制。根据一些实施方案,将包含编码抗体或其抗原结合片段的HC的核酸序列的第一ceDNA载体和包含编码抗体或其抗原结合片段的LC的核酸序列的第二ceDNA载体以选自1:10、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:5或1:10的(HC:LC)摩尔比混合并共同配制。
根据一些实施方案,用于表达如本文所述的抗体或其抗原结合片段的ceDNA载体包含编码抗体或其抗原结合片段的HC的核酸序列和编码抗体或其抗原结合片段的LC的核酸序列。根据一些实施方案,编码抗体或其抗原结合片段的HC的核酸序列包含第一开放阅读框(ORF)并且编码抗体或其抗原结合片段的LC的核酸序列包含第二ORF,其中第一ORF和第二ORF在双顺反子启动子的控制下。
获取例如本文公开的抗体(例如,HC、LC、HV、LV)的已知和/或可公开获得的蛋白质序列以及对cDNA序列进行反向工程改造以编码此类蛋白质充分属于本领域的技术人员的能力范围内。然后可以对cDNA进行密码子优化以与预定的宿主细胞匹配,并且插入如本文所述的ceDNA载体中。
III.通常用于生产抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体
本公开的实施方案基于包含可以表达抗体及其抗原结合片段的封闭端线性双链(ceDNA)载体的方法和组合物。如本文所述,本文所述的抗体或抗原结合片段(即,抗原)的靶标可以选自多种病原体,包括例如细菌、病毒、真菌和寄生虫感染剂。合适的靶标还可以包括癌症或癌症相关抗原等。另外其他靶标可以包括自身免疫病状,诸如类风湿性关节炎(RA)或多发性硬化症(MS)。
根据一些实施方案,转基因是编码抗体或其抗原结合部分的HC和LC的核酸序列。根据一些实施方案,转基因是编码抗体或其抗原结合部分的HC的核酸序列。根据一些实施方案,转基因是编码抗体或其抗原结合部分的LC的核酸序列。ceDNA载体优选地是双链体,例如,相对于分子的至少一部分是自互补的,诸如,表达盒(例如,ceDNA不是双链环状分子)。ceDNA载体具有共价封闭端,因此抵抗核酸外切酶(例如,核酸外切酶I或核酸外切酶III)消化,例如在37℃处超过一个小时。
一般来说,如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体在5'到3'方向上包含:第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核酸序列(例如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR。ITR序列选自以下中的任一种:(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如,不对称的经修饰ITR);(ii)两个经修饰ITR,其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组织(例如,不对称的经修饰ITR),或者(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对,其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组织,或者(iv)对称或基本上对称的经修饰ITR对,其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组织。
本文中涵盖了包含用于产生抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的方法和组合物,其可以进一步包括递送系统,诸如(但不限于)脂质体纳米粒子递送系统。本文公开了涵盖使用的非限制示例性脂质体纳米粒子系统。根据一些方面,本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。例如,2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开了脂质纳米粒子配制物,该配制物经制备并且装载通过所述方法获得的ceDNA载体,该国际申请并入本文中。
如本文所公开的ceDNA载体不存在由病毒衣壳内的有限空间所强加的封装局限。与囊封的AAV基因组相反,ceDNA载体是活真核生物产生的,其代表着原核生物产生的质粒DNA载体的替代方案。这允许插入控制元件,例如本文所公开的调节开关、大的转基因、多个转基因等。
图1A-图1E显示了用于表达抗体及其抗原结合片段的非限制性示例性ceDNA载体或ceDNA质粒的对应序列的示意图。用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体为无衣壳的并且可以获自质粒,该质粒按照此次序编码:第一ITR、包含转基因的表达盒和第二ITR。表达盒可以包括一种或多种允许且/或控制转基因表达的调节序列,例如其中表达盒能够按照此次序包含以下中的一个或多个:增强子/启动子、ORF报告基因(转基因)、转录后调节元件(例如WPRE),以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH聚A)。
表达盒还可包含内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A元件。顺式调节元件包含但不限于启动子、核糖开关、绝缘子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。根据一些实施方案,ITR可以充当转基因的启动子。根据一些实施方案,所述ceDNA载体包括其它组分来调节转基因的表达,例如,调节开关,用于控制和调节抗体及其抗原结合片段的表达,并且如果需要,可以包括作为杀灭开关的调节开关,从而能够使包括ceDNA载体的细胞实现可控的细胞死亡。
表达盒能够包含超过4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸、或30,000个核苷酸、或40,000个核苷酸、或50,000个核苷酸,或在约4000个-10,000个核苷酸或10,000个-50,000个核苷酸之间的任何范围,或超过50,000个核苷酸。根据一些实施方案,表达盒可以包含长度在500个至50,000个核苷酸范围内的转基因。根据一些实施方案,表达盒可以包含长度在500个至75,000个核苷酸范围内的转基因。根据一些实施方案,表达盒可以包含长度在500个至10,000个核苷酸范围内的转基因。根据一些实施方案,表达盒可以包含长度在1000个至10,000个核苷酸范围内的转基因。根据一些实施方案,表达盒可以包含长度在500个至5,000个核苷酸范围内的转基因。ceDNA载体不存在衣壳化AAV载体的大小限制,从而能够递送大大小表达盒以提供有效的转基因表达。根据一些实施方案,ceDNA载体缺乏原核生物特异性甲基化。
在表达盒,即本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的表达构建体中提供的序列可以针对靶宿主细胞进行密码子优化。如本文所用,术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人等所关注的脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在该脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常,密码子优化不会改变原始翻译蛋白的氨基酸序列。优化的密码子可以使用例如Aptagen的GENE 密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen公司,2190Fox Mill Rd.Suite 300,Herndon,Va.20171)或另一公开可用的数据库来测定。根据一些实施方案,核酸被优化以用于人表达。
如本文所公开的由用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体表达的转基因编码抗体及其抗原结合片段。ceDNA载体存在许多不同于基于质粒的表达载体的结构特点。ceDNA载体可以具有以下特点中的一个或多个:缺乏原始(即,非插入)细菌DNA;缺乏原核复制起点;为自给式的,即,其不需要除所述两个ITR之外的任何序列,包括Rep结合和末端解链位点(RBS和TRS)和在所述ITR之间的外源序列;存在形成发夹的ITR序列和不存在细菌型DNA甲基化或实际上被哺乳动物宿主视为异常的任何其它甲基化。一般来说,本公开的载体优选不含有任何原核DNA,但作为非限制性示例,预期可以将一些原核DNA作为外源序列插入启动子或增强子区中。将ceDNA载体与质粒表达载体区分开来的另一个重要特征是,ceDNA载体是具有封闭端的单链线性DNA,而质粒始终是双链DNA。
通过本文所提供的方法产生的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体优选地具有线性和连续结构而非非连续结构,如限制酶消化分析所测定(图4D)。相信线性和连续结构在受到细胞核酸内切酶攻击时更稳定,并且不太可能重组并引起诱变。因此,线性和连续结构的ceDNA载体是优选的实施方案。连续、线性、单链的分子内双链体ceDNA载体可以具有共价结合的末端,而不具有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上不同于质粒(包括本文所描述的ceDNA质粒),该质粒是细菌来源的环状双链体核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离,从而产生两个核酸分子,而相比之下,ceDNA载体虽具有互补链,却是单个DNA分子,并且因此即使变性,也仍保持是单个分子。根据一些实施方案,与质粒不同,如本文所述的ceDNA载体的产生可以没有原核类型的DNA碱基甲基化。因此,在结构方面(特别是线性对比环形)以及还根据用于产生和纯化这些不同物体的方法方面,以及还根据它们的DNA甲基化方面,即ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型,ceDNA载体和ceDNA质粒是不同的。
如本文所述使用ceDNA载体来表达抗体及其抗原结合片段相对于基于质粒的表达载体有几个优点,此类优点包括但不限于:1)质粒含有细菌DNA序列且经受原核特异性甲基化,例如6-甲基腺苷和5-甲基胞嘧啶甲基化,而无衣壳AAV载体序列是真核来源的且不经历原核特异性甲基化;因此,与质粒相比,无衣壳AAV载体不太可能诱导炎性和免疫应答;2)质粒在生产过程中需要抗性基因的存在,而ceDNA载体则不需要;3)环状质粒在引入细胞中时不被递送到细胞核并且需要过载才能绕过细胞核酸酶的降解,而ceDNA载体含有赋予对核酸酶的抗性并且可以被设计为被靶向并被递送到细胞核的病毒顺式元件,即ITR。假设对于ITR功能必不可少的最小限定元件是Rep结合位点(RBS;对于AAV2,5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:__))和末端解链位点(TRS;对于AAV2,5'-AGTTGG-3')加上允许发夹形成的可变回文序列;以及4)ceDNA载体不具有通常在原核生物来源的质粒中发现的CpG二核苷酸的过度呈现,据报道,CpG二核苷酸会结合Toll样受体家族的成员,从而引发T细胞介导的免疫应答。相比之下,用本文公开的无衣壳AAV载体进行的转导可以有效地靶向难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒粒子转导的细胞和组织类型。
A.反向末端重复序列(ITR)
如本文所公开,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体含有位于两个反向末端重复(ITR)序列之间的转基因或核酸序列,其中ITR序列可以为不对称的ITR对或对称或基本上对称的ITR对,当这些术语如本文所定义时。如本文所公开的ceDNA载体可以包含选自以下中的任一种的ITR序列:(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如,不对称的修饰ITR);(ii)两个经修饰ITR,其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组织(例如,不对称的经修饰ITR),或者(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对,其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组织,或者(iv)对称或基本上对称的经修饰ITR对,其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组织,其中本公开的方法还可包括递送系统,诸如但不限于脂质体纳米粒子递送系统。
根据一些实施方案,ITR序列可以来自细小病毒科的病毒,细小病毒科包括两个亚科:感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染昆虫的浓核病毒亚科。细小病毒亚科(称为细小病毒)包含依赖病毒属,所述依赖病毒属的成员在大多数情况下需要与辅助病毒例如腺病毒或疱疹病毒共同感染以用于生产性感染。依赖病毒属包括通常感染人类(例如,血清型2、3A、3B、5和6)或灵长类动物(例如,血清型1和4)的腺相关病毒(AAV)以及感染其它温血动物的相关病毒(例如,牛科动物、犬科动物、马科动物和绵羊科动物腺相关病毒)。细小病毒和细小病毒科的其他成员一般描述于Kenneth I.Berns,“Parvoviridae:The Viruses andTheir Replication,”FIELDS VIROLOGY中的第69章(第3版,1996)。
尽管在说明书和本文的实施例中举例说明的ITR是AAV2 WT-ITR,但是所属领域的普通技术人员知道如上所述,可以使用来自任何已知的细小病毒,例如依赖病毒,诸如AAV(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如,NCBI:NC 002077;NC 001401;NC001729;NC001829;NC006152;NC 006260;NC 006261)、嵌合ITR或来自任何合成AAV的ITR。根据一些实施方案,AAV可以感染温血动物,例如禽类(AAAV)、牛(BAAV)、犬、马和绵羊腺相关病毒。根据一些实施方案,ITR来自B19细小病毒(GenBank登录号:NC 000883)、来自小鼠的微小病毒(MVM)(GenBank登录号:NC 001510);鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701);蛇毒细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。根据一些实施方案,5'WT-ITR可以来自一种血清型,而3'WT-ITR来自不同血清型,如本文所讨论。
普通技术人员知道,ITR序列具有双链霍利迪连结体(Holliday junction)的共同结构,该结构通常是T形或Y形发夹结构(参见例如图2A和图3A),其中每个WT-ITR由两个回文臂或环(B-B'和C-C')嵌入较大的回文臂(A-A')中与单链D序列形成(其中这些回文序列的次序限定了ITR的翻转或翻动取向)。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6)并且描述于以下文献中的ITR的结构分析和序列比较:Grimm等人,J.Virology,2006;80(1);426-439;Yan等人,J.Virology,2005;364-379;Duan等人,Virology 1999;261;8-14。所属领域的技术人员基于本文提供的示例性AAV2 ITR序列,可以容易地确定用于ceDNA载体或ceDNA质粒的来自任何AAV血清型的WT-ITR序列。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6和鸟AAV(AAAV)和牛AAV(BAAV))并且描述于以下文献中的ITR的序列比较:Grimm等人,J.Virology,2006;80(1);426-439;其显示了AAV2的左ITR与来自以下其他血清型的左ITR的同一性%:AAV-1(84%)、AAV-3(86%)、AAV-4(79%)、AAV-5(58%)、AAV-6(左ITR)(100%)和AAV-6(右ITR)(82%)。
(i)对称ITR对
根据一些实施方案,如本文所描述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体在5'到3'方向上包含:第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、感兴趣的核酸序列(例如本文所描述的表达盒)和第二AAV ITR,其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此对称或基本上对称-也就是说,ceDNA载体可以包含具有对称三维空间组织以使得其结构在几何空间中为相同形状或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环的ITR序列。在这样的实施方案中,对称的ITR对或基本上对称的ITR对可以是不是野生型ITR的经修饰ITR(例如,mod-ITR)。一个mod-ITR对可以具有相同的相对于野生型ITR具有一个或多个修饰的序列,并且彼此反向互补(反向)。在另选的实施方案中,经修饰ITR对如本文所定义是基本上对称的,也就是说,经修饰ITR对可以具有不同的序列,但是具有对应或相同的对称的三维形状。
(a)野生型ITR
根据一些实施方案,对称的ITR或基本上对称的ITR是如本文所描述的野生型(WT-ITR)。也就是说,两个ITR都具有野生型序列,但不一定必须为来自相同AAV血清型的WT-ITR。也就是说,根据一些实施方案,一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型,而另一WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中,WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的,即,它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰,同时仍然保留对称的三维空间组织。
因此,如本文所公开,ceDNA载体含有位于两个侧接野生型反向末端重复(WT-ITR)序列之间的转基因或核酸序列,所述WT-ITR序列为彼此的反向互补序列(反向),或者,相对于彼此基本上对称-也就是说,WT-ITR对具有对称的三维空间组织。根据一些实施方案,野生型ITR序列(例如AAV WT-ITR)包含功能Rep结合位点(RBS;例如,对于AAV2,5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3',SEQ ID NO:__)和功能末端解链位点(TRS;例如,5'-AGTT-3')。
根据一些方面,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可从编码可操作地位于两个WT反向末端重复序列(WT-ITR)之间的核酸(例如AAV WT-ITR)的载体多核苷酸获得。也就是说,两个ITR都具有野生型序列,但不一定必须是来自同一AAV血清型的WT-ITR。也就是说,根据一些实施方案,一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型,而另一WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中,WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的,即,它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰,同时仍然保留对称的三维空间组织。根据一些实施方案,5'WT-ITR来自一种AAV血清型,而3'WT-ITR来自相同或不同的AAV血清型。根据一些实施方案,5'WT-ITR和3'WT-ITR是彼此的镜像,即它们是对称的。根据一些实施方案,5'WT-ITR和3'WT-ITR来自相同的AAV血清型。
WT ITR是众所周知的。根据一些实施方案,两个ITR来自相同的AAV2血清型。在某些实施方案中,可以使用来自其它血清型的WT。存在许多同源血清型,例如AAV2、AAV4、AAV6、AAV8。根据一些实施方案,可以使用紧密同源的ITR(例如具有类似环结构的ITR)。在另一个实施方案中,能够使用较多样化的AAV WT ITR,例如AAV2和AAV5,并且在仍另一个实施方案中,能够使用基本上呈WT的ITR,也就是说,其不仅具有WT的基本环结构,而且具有不改变或不影响该特性的一些保守核苷酸变化。当使用来自相同病毒血清型的WT-ITR时,可以进一步使用一种或多种调节序列。在某些实施方案中,调节序列是容许调节ceDNA活性(例如,所编码的抗体及其抗原结合片段的表达)的调节开关。
根据一些实施方案,本文所描述的技术的一个方面涉及用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体,其中所述ceDNA载体包含可操作地位于两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)之间的至少一个编码例如HC和/或LC的核酸序列,其中所述WT-ITR可以来自相同血清型、不同血清型或相对于彼此基本上对称(即,具有对称三维空间组织以使得其结构在几何空间中为相同形状,或在3D空间中具有相同的A、C-C’和B-B’环)。根据一些实施方案,对称的WT-ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点。根据一些实施方案,核酸序列编码转基因,并且其中载体不在病毒衣壳中。
根据一些实施方案,WT-ITR是相同的,但是彼此反向互补。例如,5'ITR中的序列AACG可以是3'ITR中相应位点处的CGTT(即,反向互补)。根据一些示例,5'WT-ITR有义链包含ATCGATCG的序列,而相应的3'WT-ITR有义链包含CGATCGAT(即与ATCGATCG反向互补)。根据一些实施方案,WT-ITR ceDNA还包含末端解链位点和复制蛋白结合位点(RPS)(有时称为复制性蛋白结合位点),例如Rep结合位点。
在用于表达抗体及其抗原结合片段且包含WT-ITR的ceDNA载体中使用的示例性WT-ITR序列在本文的表2中示出,该表示出了成对的WT-ITR(5'WT-ITR和3'WT-ITR)。
作为一个示例性示例,本公开提供了包含操作性地连接到转基因(例如,核酸序列)的启动子、具有或不具有调节开关的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体,其中ceDNA不含衣壳蛋白,并且:(a)由编码WT-ITR的ceDNA质粒(例如,参见图1F-图1G)产生,其中每个WT-ITR的发夹二级构型具有相同数目个分子内双链碱基对(相较于这些参考序列,优选地排除这种构型中的任何AAA或TTT末端环的缺失);和(b)使用用于标识ceDNA的分析通过在实施例1中的天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳标识为ceDNA。
根据一些实施方案,侧接WT-ITR彼此基本上对称。在该实施方案中,5'WT-ITR可以来自AAV的一种血清型,而3'WT-ITR可以来自AAV的另一种血清型,使得WT-ITR不是相同的反向互补序列。例如,5'WT-ITR可以来自AAV2,并且3'WT-ITR来自不同血清型,例如AAV1、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。根据一些实施方案,WT-ITR可以选自从以下中的任一种中选择的两种不同的细小病毒:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。根据一些实施方案,WTITR的这种组合是来自AAV2和AAV6的WT-ITR的组合。根据一些实施方案,当一个相对于另一个ITR反向时,基本上对称的WT-ITR具有至少90%同一性,至少95%同一性,至少96%…97%…98%…99%....99.5%以及其间的所有点的同一性,并具有相同的对称三维空间组织。根据一些实施方案,由于WT-ITR对具有对称的三维空间组织,例如具有A、C-C'、B-B'和D臂的相同3D组织,因此WT-ITR对是基本对称的。根据一些实施方案,基本上对称的WT-ITR对相对于彼此呈反向,并且彼此具有至少95%、至少96%…97%…98%…99%....99.5%同一性和其间的所有点,并且一个WT-ITR保留5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的Rep结合位点(RBS)和末端解析位点(trs)。根据一些实施方案,基本上对称的WT-ITR对相对于彼此呈反向,并且彼此具有至少95%、至少96%…97%…98%…99%....99.5%同一性和其间的所有点,并且一个WT-ITR保留5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:__)的Rep结合位点(RBS)和末端解析位点(trs),此外保留允许发夹二级结构形成的可变回文序列。同源性可以通过所属领域熟知的标准方法来确定,诸如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)、BLASTN。
根据一些实施方案,ITR的结构元件可以是参与ITR与大的Rep蛋白(例如Rep 78或Rep 68)的功能性相互作用的任何结构元件。在某些实施方案中,结构元件为ITR与大的Rep蛋白的相互作用提供了选择性,即,至少部分确定哪种Rep蛋白与ITR功能性相互作用。在其它实施方案中,当Rep蛋白与ITR结合时,结构元件与大的Rep蛋白物理上相互作用。每个结构元件可以为例如ITR的二级结构、ITR的核酸序列、在两个或更多个元件之间的间距或以上中的任一者的组合。根据一些实施方案,结构元件选自由A和A'臂、B和B'臂、C和C'臂、D臂、Rep结合位点(RBE)和RBE'(即互补RBE序列)以及末端解链位点(trs)组成的组。
仅举例而言,表2指示WT-ITR的示例性组合。
表2:来自相同血清型或不同血清型或不同细小病毒的WT-ITR的示例性组合。显示的次序并不表示ITR位置,例如,“AAV1,AAV2”表明ceDNA可以在5'位置包含WT-AAV1 ITR,而在3'位置包含WT-AAV2 ITR,反之亦然,WT-AAV2 ITR位于5'位置,WT-AAV1 ITR位于3'位置。缩写:AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型3(AAV3)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12);AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组(例如,NCBI:NC 002077、NC 001401;NC001729;NC001829;NC006152;NC 006260;NC 006261)、来自温血动物的ITR(禽类AAV(AAAV)、牛AAV(BAAV)、犬、马和绵羊AAV)、来自B19细小病毒的ITR(GenBank登录号:NC 000883)、小鼠微小病毒(MVM)(GenBank登录号NC 001510);鹅:鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701);蛇:蛇细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。
表2:WT-ITR的示范性组合
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仅举例而言,表3显示来自一些不同AAV血清型的示例性WT-ITR的序列。
表3:示例性WT-ITR
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根据一些实施方案,WT-ITR序列的核酸序列可以被修饰(例如,通过修饰1、2、3、4或5个或更多个核苷酸或其中的任何范围),由此该修饰是取代互补核苷酸,例如G取代C(反之亦然)和T取代A(反之亦然)。
在本公开的某些实施方案中,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体不具有由选自SEQ ID NO:1、2、5-14中的任一者的核酸序列组成的WT-ITR。在本公开的替代性实施方案中,如果ceDNA载体具有包含选自SEQ ID NO:1、2、5-14中的任一者的核酸序列的WT-ITR,那么侧接ITR也为WT,并且ceDNA载体包含调节开关,例如本文和国际申请PCT/US18/49996(例如,参见PCT/US18/49996的表11,全文通过引用并入本文中)中所公开。根据一些实施方案,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体包含如本文所公开的调节开关和经选择具有选自由SEQ ID NO:1、2、5-14组成的组中的任一者的核酸序列的WT-ITR。
如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以包括保留可操作的RBE、trs和RBE'部分的WT-ITR结构。出于示例性目的使用野生型ITR,图2A和图2B示出了关于ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的trs位点操作的一种可能机制。根据一些实施方案,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体含有一个或多个功能WT-ITR多核苷酸序列,这些多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS;对于AAV2,5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ IDNO:__))和末端解链位点(TRS;5'-AGTT)。根据一些实施方案,至少一个WT-ITR是功能性的。在另选的实施方案中,其中用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体包含彼此基本上对称的两个WT-ITR,至少一个WT-ITR是功能性的并且至少一个WT-ITR是非功能性的。
B.通常用于包含不对称ITR对或对称ITR对的ceDNA载体的经修饰ITR(mod-ITR)
如本文所讨论,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以包含对称ITR对或不对称ITR对。在两个例子中,ITR中的一个或两个可以是经修饰ITR,差异在于,在第一个例子(即,对称的mod-ITR)中,mod-ITR具有相同的三维空间组织(即,具有相同的A-A'、C-C'和B-B'臂构形),而在第二个例子(即,不对称的mod-ITR)中,mod-ITR具有不同的三维空间组织(即,具有A-A'、C-C'和B-B'臂的不同构形)。
根据一些实施方案,相较于野生型ITR序列(例如AAV ITR),经修饰ITR为通过缺失、插入和/或取代进行修饰的ITR。根据一些实施方案,ceDNA载体中的ITR中的至少一个包含功能性Rep结合位点(RBS;例如,对于AAV2,5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3')和功能末端解链位点(TRS;例如,5'-AGTT-3')。根据一些实施方案,ITR中的至少一个是非功能ITR。根据一些实施方案,不同的或经修饰ITR不是各自来自不同血清型的野生型ITR。
在本文中详细描述了ITR中的特定改变和突变,但是在ITR的情况下,“改变”或“突变”或“修饰”表明相对于野生型、参考或原始ITR序列,插入、缺失和/或取代核苷酸。改变或突变的ITR可以是工程化ITR。如本文所用,“工程化”是指通过人的手进行操纵的方面。例如,当多肽的至少一个方面,例如其序列,通过人的手进行操纵而不同于自然存在的方面时,则认为该多肽是“工程化”的。
根据一些实施方案,mod-ITR可以是合成的。根据一些实施方案,合成的ITR是基于来自一种以上AAV血清型的ITR序列。在另一个实施方案中,合成ITR不包括基于AAV的序列。在又一个实施方案中,合成的ITR尽管仅具有一些或不具有源自AAV的序列,但是保留了上述的ITR结构。根据一些方面,合成的ITR可优先与野生型Rep或特定血清型的Rep相互作用,或者根据一些情况,将不被野生型Rep识别而仅被突变Rep识别。
技术人员可以通过已知手段确定其它血清型的对应序列。例如,确定改变是否在A、A'、B、B'、C、C'或D区域中,并确定另一种血清型中的对应区域。能够在默认状态下使用(基本局部比对搜索工具)或其它同源性比对程序测定对应序列。本公开进一步提供了包含来自不同AAV血清型的组合的mod-ITR的ceDNA载体群体和多个该ceDNA载体-也就是说,一个mod-ITR可以来自一种AAV血清型,而另一个mod-ITR可以来自不同血清型。不希望受理论的束缚,根据一些实施方案,一个ITR可以来自或基于AAV2 ITR序列,而ceDNA载体的另一个ITR可以来自或基于以下中的任一种或多种ITR序列:AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)。
任何细小病毒ITR都可以用作ITR或用于修饰的基础ITR。优选地,细小病毒是依赖病毒。更优选是AAV。选择的血清型可以是基于血清型的组织嗜性。AAV2具有广泛的组织嗜性,AAV1优先靶向神经元和骨骼肌,而AAV5优先靶向神经元、视网膜色素上皮和光感受器。AAV6优先靶向骨骼肌和肺。AAV8优先靶向肝脏、骨骼肌、心脏和胰腺组织。AAV9优先靶向肝脏、骨骼和肺组织。根据一些实施方案,经修饰ITR是基于AAV2 ITR。
更具体地说,可以通过修饰结构元件来改变结构元件与特定的大Rep蛋白功能性相互作用的能力。举例来说,与ITR的野生型序列相比,结构元件的核酸序列可以经修饰。根据一些实施方案,可以去除ITR的结构元件(例如A臂、A'臂、B臂、B'臂、C臂、C'臂、D臂、RBE、RBE'和trs)并用来自不同细小病毒的野生型结构元件替代。例如,替代结构可以来自:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。例如,ITR可以是AAV2 ITR,并且A或A'臂或RBE可以用来自AAV5的结构元件替代。又如,ITR可以是AAV5 ITR,并且C或C'臂、RBE和trs可以用来自AAV2的结构元件替代。在另一个实施方案中,AAV ITR可以是B和B'臂被AAV2 ITR B和B'臂替代的AAV5 ITR。
仅作为示例,表4显示了经修饰ITR的区域中的至少一个核苷酸的示例性修饰(例如,缺失、插入和/或取代),其中X指示该区段中的至少一个核酸相对于对应野生型ITR的修饰(例如,缺失、插入和/或取代)。根据一些实施方案,在C和/或C'和/或B和/或B'的任何区域中的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即,TTT)。例如,如果修饰引起以下任一种:单臂ITR(例如,单个C-C'臂或单个B-B'臂)或经修饰C-B'臂或C'-B臂、或具有至少一个截短臂(例如截短的C-C'臂和/或截短的B-B'臂)的两臂ITR,那么至少该单臂、或两臂ITR(其中一个臂可以是截短的)的至少一个臂在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。根据一些实施方案,截短的C-C'臂和/或截短的B-B'臂在末端环中具有三个连续的T核苷酸(即TTT)。
表4:ITR的不同B-B'和C-C'区域或臂的至少一个核苷酸的修饰的示例性组合(例 如,缺失、插入和/或取代)(X指示核苷酸修饰,例如该区域中的至少一个核苷酸的添加、缺 失或取代)。
根据一些实施方案,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体中的mod-ITR包含如本文所公开的不对称的ITR对或对称的mod-ITR对,可以包含表4中所示的任一种修饰组合,以及选自以下的任一个或多个区域中的至少一种核苷酸的修饰:在A'与C之间、在C与C'之间、在C'与B之间、在B与B'之间以及在B'与A之间。根据一些实施方案,在C或C'区或B或B'区中的至少一种核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)仍然保留了茎-环的末端环。根据一些实施方案,在C和C'和/或B和B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在替代实施方案中,C与C'之间和/或B与B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续A核苷酸(即,AAA)。根据一些实施方案,本文中使用的经修饰ITR可以包含表4中所示的修饰组合中的任一个,并且还包含选自以下的任一个或多个区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代):A'、A和/或D。例如,本文中使用的经修饰ITR可以包含表4中所示的修饰组合中的任一个,并且还包含A区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。根据一些实施方案,本文中使用的经修饰ITR可以包含表4中所示的修饰组合中的任一个,并且还包含A'区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。根据一些实施方案,本文中使用的经修饰ITR可以包含表4中所示的修饰组合中的任一个,并且还包含A和/或A’区中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。根据一些实施方案,本文中使用的经修饰ITR可以包含表4中所示的修饰组合中的任一个,并且还包含D区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。
根据一些实施方案,可以修饰结构元件的核酸序列(例如通过修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或者其中的任何范围),以产生经修饰结构元件。根据一些实施方案,对ITR的特异性修饰例示于本文中(例如,SEQ IDNO:3、4、15-47、101-116或165-187),或示于2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图7A-图7B中(例如PCT/US2018/064242中的SEQ ID No 97-98、101-103、105-108、111-112、117-134、545-54)。根据一些实施方案,可以修饰ITR(例如,通过修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或其中的任何范围)。在其他实施方案中,ITR与SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187的经修饰的ITR之一或SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187的A-A'臂和C-C'和B-B'臂的含RBE区段或国际专利申请PCT/US18/49996的表2-9中所示(即,SEQ ID NO:110-112、115-190、200-468)可具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或更大序列一致性,所述国际专利申请全文以引用方式并入本文。
根据一些实施方案,经修饰ITR可以例如包含特定臂的全部,例如A-A'臂的全部或一部分、或B-B'臂的全部或一部分、或C-C'臂的全部或一部分的去除或缺失,或另选地,形成环的茎的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对的去除,只要对茎(例如单臂)进行加帽的最终环仍然存在即可(例如参见2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图7A中的ITR-21)。根据一些实施方案,经修饰ITR可以包含从B-B'臂去除1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对。根据一些实施方案,经修饰ITR可以包含从C-C'臂去除1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对(参见例如2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图3B中的ITR-1或图7A中的ITR-45)。根据一些实施方案,经修饰ITR可以包含从C-C'臂去除1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对和从B-B'臂去除1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对。设想去除碱基对的任何组合,例如可以在C-C'臂中去除6个碱基对以及在B-B'臂中去除2个碱基对。作为说明性示例,图3B显示了示例性经修饰ITR,其中从C部分和C'部分各缺失至少7个碱基对,C和C'区域之间的环中的核苷酸被取代,以及从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对,使得经修饰ITR包含至少一个臂(例如C-C')截短的两个臂。根据一些实施方案,经修饰ITR还包含从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对,使得臂B-B'相对于WT ITR也截短。
根据一些实施方案,相对于全长野生型ITR序列,经修饰ITR可具有1至50个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)核苷酸缺失。根据一些实施方案,相对于全长WT ITR序列,经修饰ITR可具有1至30个核苷酸缺失。根据一些实施方案,相对于全长野生型ITR序列,经修饰ITR具有2至20个核苷酸缺失。
根据一些实施方案,经修饰ITR在A或A'区域的含RBE部分中不含任何核苷酸缺失,以便不干扰DNA复制(例如,通过Rep蛋白结合到RBE,或在末端解链位点切割)。根据一些实施方案,本文涵盖使用的经修饰ITR在如本文所述的B、B'、C和/或C区域中具有一个或多个缺失。
根据一些实施方案,包含对称ITR对或不对称ITR对的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体包含如本文所公开的调节开关和至少一个经选择具有选自由SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187组成的组中的任一者的核苷酸序列的经修饰ITR。
在另一个实施方案中,结构元件的结构可以为经修饰的。例如,结构元件改变了茎高和/或环中核苷酸的数量。例如,茎高可以是约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个或更多个核苷酸或其中的任何范围。根据一些实施方案,茎高度可以为约5个核苷酸至约9个核苷酸,并且在功能上与Rep相互作用。在另一个实施方案中,茎高度可以为约7个核苷酸,并且在功能上与Rep相互作用。在另一个示例中,环可以具有3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸或其中的任何范围。
在另一个实施方案中,RBE或扩展RBE内GAGY结合位点或GAGY相关结合位点的数量可以增加或减少。根据一些示例,RBE或扩展RBE可以包括1、2、3、4、5或6个或更多个GAGY结合位点或其中的任何范围。每个GAGY结合位点可以独立地是精确的GAGY序列或类似于GAGY的序列,只要该序列足以结合Rep蛋白即可。
在另一个实施方案中,能够改变(例如增加或减少)两个元件(诸如(但不限于)RBE和发夹)之间的间距,以改变与大Rep蛋白的功能相互作用。例如,间距可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个或更多个核苷酸或其中的任何范围。
如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以包括相对于本文公开的野生型AAV2 ITR结构经修饰,但仍保留可操作的RBE、trs和RBE'部分的ITR结构。图2A和图2B显示了用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的trs位点的一种可能的操作机制。根据一些实施方案,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体含有一个或多个功能ITR多核苷酸序列,这些多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS;对于AAV2,5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3')和末端解链位点(TRS;5'-AGTT)。根据一些实施方案,至少一个ITR(wt或经修饰ITR)是功能性的。在另选的实施方案中,其中用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体包含彼此不同或不对称的两个经修饰ITR,至少一个经修饰ITR是功能性的并且至少一个经修饰ITR是非功能性的。
根据一些实施方案,如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的经修饰ITR(例如,左ITR或右ITR)在环臂、截短臂或间隔子内具有修饰。在环臂、截短臂或间隔子内具有修饰的ITR的示例性序列列于国际专利申请PCT/US18/49996(其以全文引用的方式并入本文)的下表中:表2(即,SEQ ID NO:135-190、200-233);表3(例如,SEQ IDNo:234-263);表4(例如,SEQ ID NO:264-293);表5(例如,本文的SEQ ID No:294-318);表6(例如,SEQ ID NO:319-468);以及表7-表9(例如,SEQ ID No:101-110、111-112、115-134)或者表10A或10B(例如,SEQ ID No:9、100、469-483、484-499)。
根据一些实施方案,用于包含不对称的ITR对或对称的经修饰ITR对的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体中的经修饰ITR选自国际专利申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9和10A-10B中所示的那些修饰中的任一个或组合,该国际专利申请以全文引用的方式并入本文中。
用于以上类别中的每一者中的包含不对称的ITR对或对称的mod-ITR对的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体中的额外示例性经修饰ITR提供于表5A和表5B中。表5A中的经修饰的右ITR的预测二级结构示于2018年12月6日提交的国际专利申请第PCT/US2018/064242号的图7A中,并且表5B中的经修饰的左ITR的预测二级结构示于2018年12月6日提交的国际专利申请第PCT/US2018/064242号的图7B中,所述申请的全文通过引用并入本文中。
表5A和表5B列举示例性经修饰的右和左ITR的SEQ ID NO。
表5A:示例性经修饰右ITR。这些示例性经修饰右ITR可包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ 的RBE(ACTGAGGC的间隔子)、间隔子互补序列GCCTCAGT和GAGCGAGCGAGCGCGC的RBE'(即,RBE 的互补序列)。
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表5B:示例性经修饰左ITR。这些示例性经修饰左ITR可包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ 的RBE、ACTGAGGC的间隔子、间隔子互补序列GCCTCAGT和GAGCGAGCGAGCGCGC的RBE互补序列 (RBE')。
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根据一些实施方案,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体在5'到3'方向上包含:第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核酸序列(例如本文所描述的表达盒)和第二AAV ITR,其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此不对称-也就是说,其具有彼此不同的3D空间构型。作为示例性实施方案,第一ITR可以是野生型ITR,并且第二ITR可以是突变的或经修饰的ITR,或反过来,其中第一ITR可以是突变的或经修饰的ITR,并且第二ITR可以是野生型ITR。根据一些实施方案,第一ITR和第二ITR均是mod-ITR,但具有不同序列或具有不同修饰,因此不是相同的经修饰ITR,并且具有不同的3D空间构型。换句话说,具有不对称ITR的ceDNA载体包含这样的ITR:其中根据一些ITR相对于WT-ITR的任何变化不反映在另一个ITR中;或另选地,其中具有经修饰的不对称ITR对的不对称ITR可以具有相对于彼此不同的序列和不同的三维形状。用于表达抗体及其抗原结合片段并且用于生成ceDNA质粒的ceDNA载体中的示例性不对称的ITR在表5A和表5B中示出。
在一个另选的实施方案中,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体包含两个对称的mod-ITR-也就是说,两个ITR都具有相同序列,但为彼此的反向互补序列(反向)。根据一些实施方案,相对于来自相同AAV血清型的野生型ITR序列,对称的mod-ITR对包含缺失、插入或取代中的至少一种或任何组合。对称ITR中的添加、缺失或取代是相同的,但彼此反向互补。例如,在5'ITR的C区中插入3个核苷酸将反映为在3'ITR的C'区中对应部分中插入3个反向互补核苷酸。仅出于说明目的,如果在5'ITR中添加AACG,那么在3'ITR中对应位点处添加CGTT。例如,如果5'ITR有义链是ATCGATCG,在G与A之间添加AACG以产生序列ATCGAACGATCG。相应的3'ITR有义链是CGATCGAT(ATCGATCG的反向互补序列),在T与C之间添加CGTT(即AACG的反向互补序列)以产生序列CGATCGTTCGAT(ATCGAACGATCG的反向互补序列)。
在另选的实施方案中,经修饰ITR对如本文所定义是基本上对称的-也就是说,经修饰ITR对可以具有不同的序列,但是具有对应或相同的对称的三维形状。例如,一个经修饰ITR能够来自一种血清型,而另一个经修饰ITR能够来自不同血清型,但它们在相同区域中具有相同突变(例如核苷酸插入、缺失或取代)。换句话说,仅出于说明目的,5'mod-ITR可以来自AAV2并在C区域有一个缺失,而3'mod-ITR可以来自AAV5并在C'区域中有相应的缺失,并且如果5'mod-ITR和3'mod-ITR具有相同或对称的三维空间组织,那么其作为经修饰ITR对涵盖用于在本文中。
根据一些实施方案,基本上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环,例如,如果基本上对称的mod-ITR对中的修饰ITR缺失C-C'臂,那么同源mod-ITR相应缺失C-C'环,并且在其同源mod-ITR的几何空间呈相同形状下,剩余A和B-B'环具有相似3D结构。仅作为示例,基本上对称的ITR可以具有对称的空间组织,使得它们的结构在几何空间中是相同的形状。例如,当G-C对被修饰为例如C-G对(反之亦然)或者A-T对被修饰为T-A对(反之亦然)时,可能会发生这种情况。因此,使用经修饰5'ITR的上述示例性示例作为ATCGAACGATCG和经修饰3'ITR的上述示例性示例作为CGATCGTTCGAT(即ATCGAACGATCG的反向互补序列),如果例如5'ITR具有序列ATCGAACCATCG,其中添加的G被修饰为C,并且基本上对称的3'ITR具有序列CGATCGTTCGAT,除了a外没有T的对应修饰,则这些经修饰ITR仍将是对称的。根据一些实施方案,这种经修饰ITR对基本上是对称的,因为经修饰ITR对具有对称的立体化学。
表6显示用于用以表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体中的示例性对称的经修饰ITR对(即,经修饰的左ITR和对称的经修饰的右ITR)。序列的黑体(红色)部分标识了部分ITR序列(即A-A'、C-C'和B-B'环的序列),也在图31A-图46B中示出。这些示例性经修饰ITR可包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3'的RBE、ACTGAGGC的间隔子、间隔子互补序列和GAGCGAGCGAGCGCGC的RBE'(即,RBE的互补序列)。
表6:用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体中的示例性对称的经修饰ITR对,
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根据一些实施方案,包含不对称的ITR对的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以包含具有修饰的ITR,所述修饰对应于以下中的任一个修饰:本文表5A-表5B中的任一个或多个中所示的ITR序列或ITR部分序列;或全文并入本文中的2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图7A-图7B中所示或全文以引用方式并入本文中的2018年9月7日提交的国际专利申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9或10A-10B中所公开的序列。
B.示例性ceDNA载体
如上文所描述,本公开涉及重组ceDNA表达载体和编码抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体,该ceDNA载体包含以下中的任一者:如上文所描述的不对称的ITR对、对称的ITR对或基本上对称的ITR对。在某些实施方案中,本公开涉及具有侧接ITR序列和转基因的用于表达抗体及其抗原结合片段的重组ceDNA载体,其中如本文所定义,ITR序列相对于彼此不对称、对称或基本上对称,并且ceDNA进一步包含位于侧接ITR之间的感兴趣的核酸序列(例如包含转基因的核酸的表达盒),其中所述核酸分子不含病毒衣壳蛋白编码序列。
用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA表达载体可以为包括如本文所述的(多个)核酸序列的可以便利地进行重组DNA程序的任何ceDNA载体,前提是改变至少一个ITR。本公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体与其中将引入ceDNA载体的宿主细胞相容。在某些实施方案中,ceDNA载体可以是线性的。在某些实施方案中,ceDNA载体可以作为染色体外实体存在。在某些实施方案中,本公开的ceDNA载体可以含有容许供体序列整合到宿主细胞基因组中的元件。如本文所用,“转基因”、“核酸序列”和“异源核酸序列”同义,并且编码抗体及其抗原结合片段,如本文所述。
现参看图1A-图1G,显示了可用于制造用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的两种非限制性质粒的功能组分的示意图。图1A、图1B、图1D、图1F显示了用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的构建体或ceDNA质粒的对应序列。ceDNA载体为无衣壳的并且可以获自质粒,所述质粒按照此次序编码:第一ITR、可表达的转基因盒和第二ITR,其中如本文所定义,第一ITR序列与第二ITR序列相对于彼此不对称、对称或基本上对称。用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体为无衣壳的并且可以获自质粒,所述质粒按照此次序编码:第一ITR、可表达的转基因(蛋白质或核酸)和第二ITR,其中如本文所定义,第一ITR序列与第二ITR序列相对于彼此不对称、对称或基本上对称。根据一些实施方案,可表达的转基因盒根据需要包括:增强子/启动子、一个或多个同源臂、供体序列、转录后调节元件(例如WPRE,例如SEQ ID NO:67))以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH聚A,例如SEQ ID NO:68)。
图5是使用实施例中所述的方法证实从多个质粒构建体产生ceDNA的凝胶。如以上关于图4A和实施例中所论述,ceDNA由凝胶中的特征色带图案证实。
(i).调节元件
包含如本文所定义的不对称的ITR对或对称的ITR对的如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体还可包含顺式调节元件的特定组合。顺式调节元件包含但不限于启动子、核糖开关、绝缘子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。
根据一些实施方案,各种顺式调节元件的序列可以选自2021年3月24日提交的国际申请PCT/US2021/023891中公开的那些序列中的任一个,该国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
在实施方案中,第二核酸序列包括调节序列和编码核酸酶的核酸序列。在某些实施方案中,基因调节序列可操作地连接到编码核酸酶的核酸序列。在某些实施方案中,调节序列适合于控制核酸酶在宿主细胞中的表达。在某些实施方案中,调节序列包括适合的启动子序列,所述启动子序列能够引导可操作地连接到启动子序列的基因的转录,例如编码本公开的(多种)核酸酶的核酸序列。在某些实施方案中,第二核酸序列包括连接到编码核酸酶的核酸序列的5'端的内含子序列。在某些实施方案中,在启动子的上游提供增强子序列以提高启动子的功效。在某些实施方案中,调节序列包括增强子和启动子,其中第二核酸序列包括编码核酸酶的核酸序列上游的内含子序列,其中内含子包括一个或多个核酸酶裂解位点,并且其中启动子可操作地连接到编码核酸酶的核酸序列。
适合的启动子可以来源于病毒并因此可以称为病毒启动子,或其可以来源于任何生物体,包含原核或真核生物体。适合的启动子可以用于通过任何RNA聚合酶(例如,pol I、pol II、pol III)来驱动表达。示例性启动子包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子;腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP);单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(诸如CMV即刻早期启动子区(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、人类U6小核启动子(U6,例如,SEQ ID NO:80)(Miyagishi等人,Nature Biotechnology20,497-500(2002))、增强的U6启动子(例如,Xia等人,Nucleic Acids Res.2003年9月1日;31(17))、人类H1启动子(H1)(例如,SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:155)、CAG启动子、人类α1-抗胰蛋白酶(HAAT)启动子(例如,SEQ ID NO:82)等。在某些实施方案中,这些启动子在其下游含内含子的末端处被改变以包括一个或多个核酸酶裂解位点。在某些实施方案中,含有核酸酶裂解位点的DNA与启动子DNA是无关的。
根据一些实施方案,启动子还可以是来自人基因的启动子,诸如人泛素C(hUbC)、人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。
根据一些实施方案,启动子是组织特异性启动子。根据进一步的实施方案,组织特异性启动子是肝脏特异性启动子。根据一些实施方案,抗体或其抗原结合片段靶向肝脏和/或由肝脏特异性启动子在肝脏中产生。
本领域已知的任何肝脏特异性启动子都设想用于本公开。根据一些实施方案,肝脏特异性启动子选自但不限于天然或合成的人α1-抗胰蛋白酶(HAAT)。根据一些实施方案,使用内源性ApoE、通过存在于肝细胞表面上的低密度脂蛋白(LDL)受体将包含ceDNA载体的组合物特异性靶向肝细胞可以实现向肝脏的递送。
根据本公开使用的合适启动子的非限制性示例包括但不限于以下中的任一者:CAG启动子、EF1a启动子、IE2启动子和大鼠EF1-α启动子、mEF1启动子或1E1启动子片段。
根据一些实施方案,启动子可以选自2021年3月24日提交的国际申请PCT/US2021/023891中公开的任何启动子序列,该国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
(ii).聚腺苷酸化序列:
编码聚腺苷酸化序列的序列可以包括于用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体中以使由ceDNA载体表达的mRNA稳定并且有助于核输出和转译。根据一些实施方案,ceDNA载体不包括聚腺苷酸化序列。在其它实施方案中,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个腺嘌呤二核苷酸。根据一些实施方案,聚腺苷酸化序列包括约43个核苷酸、约40个-50个核苷酸、约40个-55个核苷酸、约45个-50个核苷酸、约35个-50个核苷酸或它们之间的任何范围。
表达盒可以包含所属领域已知的任何聚腺苷酸化序列或其变体。一些表达盒还可以包括SV40晚期聚A信号上游增强子(USE)序列。根据一些实施方案,USE序列可以与SV40pA或异源聚A信号组合使用。聚A序列位于编码抗体及其抗原结合片段的转基因的3'。
根据一些实施方案,聚腺苷酸化序列可以选自2021年3月24日提交的国际申请PCT/US2021/023891中公开的任何聚腺苷酸化序列,该国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
表达盒还可以包含转录后元件以增加转基因的表达。根据一些实施方案,土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)用于增强转基因的表达。可以使用其它转录后处理元件,诸如来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因或乙型肝炎病毒(HBV)的转录后元件。
根据一些实施方案,转录后调节元件可以选自2021年3月24日提交的国际申请PCT/US2021/023891中公开的任何转录后调节元件序列,该国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
根据一些实施方案,编码抗体或其抗原结合片段的一个或多个核酸序列还可以编码分泌序列,使得蛋白质被引导到高尔基体(Golgi)设备和内质网,并且在其穿过ER并离开细胞时通过伴侣分子折叠成正确构象。示例性分泌序列包括但不限于VH-02和VK-A26和IgK信号序列,以及允许标记的蛋白质从细胞溶质中分泌出来的Gluc分泌信号、将标记的蛋白质引导到高尔基体的TMD-ST分泌序列。
根据一些实施方案,分泌序列可以选自2021年3月24日提交的国际申请PCT/US2021/023891中公开的任何分泌序列,该国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
(iii)核定位序列
根据一些实施方案,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体包含一个或多个核定位序列(NLS),例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个NLS。根据一些实施方案,一个或多个NLS位于氨基末端处或附近、羧基末端处或附近、或这些位置的组合(例如氨基末端的一个或多个NLS和/或羧基末端的一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时,每一个可以彼此独立地选择,使得单个NLS存在于多于一个拷贝中并且/或者与根据一些或多个拷贝存在的一个或多个其他NLS组合存在。
根据一些实施方案,NLS可以选自2021年3月24日提交的国际申请PCT/US2021/023891中公开的任何NLS,该国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
C.示例性ceDNA抗CoV-2S载体
根据一些实施方案,作为包含至少一个包含抗体或其抗原结合片段的核酸序列的示例性无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体,ceDNA构建体选自表7中所示的构建体。
表7
构建体 | 序列标识符 |
ceDNA-1856 | SEQ ID NO:404 |
ceDNA-1859 | SEQ ID NO:405 |
ceDNA-1966 | SEQ ID NO:406 |
ceDNA-1967 | SEQ ID NO:407 |
ceDNA-2157 | SEQ ID NO:408 |
根据一些实施方案,示例性ceDNA载体为包含SEQ ID NO:404的ceDNA-1856,如下所示。
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根据一些实施方案,ceDNA载体与SEQ ID NO:404具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
根据一些实施方案,示例性ceDNA载体为包含SEQ ID NO:405的ceDNA-1859,如下所示。
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根据一些实施方案,ceDNA载体与SEQ ID NO:405具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
根据一些实施方案,示例性ceDNA载体为包含SEQ ID NO:406的ceDNA-1966,如下所示。
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根据一些实施方案,ceDNA载体与SEQ ID NO:406具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
根据一些实施方案,示例性ceDNA载体为包含SEQ ID NO:407的ceDNA-1967,如下所示。
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根据一些实施方案,ceDNA载体与SEQ ID NO:407具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
根据一些实施方案,示例性ceDNA载体为包含SEQ ID NO:408的ceDNA-2157,如下所示。
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根据一些实施方案,ceDNA载体与SEQ ID NO:408具有至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性。
根据一些实施方案,SEQ ID NO:404包含以下组分,其中数字指示核酸残基:
856..921=免疫球蛋白κ可变1D-33信号肽
856..1566=LC1(轻链1)_密码子优化
922..1242=S309_VL(可变轻链)
1243..1563=hIgκ恒定区[P01834]
1243..1563=S309恒定区(人κ)
根据一些实施方案,SEQ ID NO:405包含以下组分,其中数字指示核酸残基:
856..912=人IGHV3-43重链信号肽
856..2286=HC1重链1(HC1)_密码子优化
913..1293=S309_VH(可变重链)
1294..2283=具有GAALIE和LS突变的S309恒定区(hIgG1)
根据一些实施方案,SEQ ID NO:406包含以下组分,其中数字指示核酸残基:
856..912=人IGHV3-43重链信号肽[P0DP04]
856..2286=HC1_密码子优化
913..1293=S309_VH
1294..2283具有GAALIE和LS突变的S309恒定区(hIgG1)
根据一些实施方案,SEQ ID NO:407包含以下组分,其中数字指示核酸残基:
856..921=免疫球蛋白κ可变1D-33信号肽
856..1566=LC1_密码子优化
922..1242=S309_VL
1243..1563=hIgκ恒定区[P01834]
1243..1563=S309恒定区(人κ)
根据一些实施方案,SEQ ID NO:408包含以下组分,其中数字指示核酸残基:
1..141=左-ITR_v1
142..193=间隔子_左-ITR_536
互补序列(194..415)=SV40_polyA
416..810=HBB_3pUTR
互补序列(416..810)=HBBv2_3pUTR
811..818=PacI_位点
互补序列(822..1532)=翻译1532-822
互补序列(822..1532)=LC1_密码子优化
互补序列(825..1145)=hIgκ恒定区[P01834]
互补序列(825..1145)=S309恒定区(人κ)
互补序列(1146..1466)=S309_VL(可变轻链)
互补序列(1467..1532)=免疫球蛋白κ可变1D-33信号肽[P01593.2]
互补序列(1533..1539)=Mod_最小_共同_Kozak
互补序列(1533..1542)=Mod_最小_共同_Kozak_v2
1543..1550=PmeI_位点
互补序列(1551..2822)=CpGmin_hAAT_启动子_组
间隔子互补序列(2823..2832)=10mer_2A
互补序列(2823..3048)3xHNF1-4_ProEnh_10mer
增强子互补序列(2833..2952)=ProEnh
互补序列(2959..2975)=HNF4位点
互补序列(2976..2988)=HNF1位点
互补序列(2989..3005)=HNF4位点
互补序列(3006..3018)=HNF1位点
互补序列(3019..3035)=HNF4位点
互补序列(3036..3048)=HNF1位点
3049..3120=Serpin增强子
3122..3193=Serpin增强子
3195..3266=Serpin增强子
3427..3610=小鼠TTR 5pUTR(NM_013697.5)
3579..3610=EPD实验测定的5'UTR
3590..3610=EPD实验测定的5'UTR
3611..3701=MVM内含子
3703..3709=SexAI_位点
3710..3719=Mod_最小_共同_Kozak_v2
3713..3719=Mod_最小_共同_Kozak
3720..3776=人IGHV3-43重链信号肽[P0DP04]
3720..5150=HC1_密码子优化
3777..4157=S309_VH
4158..5147=具有GAALIE和LS突变的S309恒定区(hIgG1)
5154..5159=AflII_位点
5160..5740=WPRE_3pUTR
5741..5965=bGH
5966..6026=间隔子_右-ITR_v1
6027..6156=右-ITR_v1
V.制备ceDNA载体的方法
A.一般产生
用于产生如本文所定义的包含不对称的ITR对或对称的ITR对的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996的章节IV中,所述申请的全文以引用方式并入本文中。根据一些实施方案,如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以如本文所述使用昆虫细胞产生。在另选的实施方案中,如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以以合成方式产生,并且根据一些实施方案,以无细胞方法产生,如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122所公开,所述申请的全文以引用方式并入本文中。
如本文所述,根据一些实施方案,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以例如通过包括以下步骤的方法获得:a)在有效诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的条件下并持续足以诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的时间,在Rep蛋白的存在下温育具有不含病毒衣壳编码序列的多核苷酸表达构建体模板(例如ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒)的宿主细胞(例如昆虫细胞)群体,并且其中宿主细胞不包含病毒衣壳编码序列;以及b)从宿主细胞中收获并分离ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰ITR的载体多核苷酸复制,从而在宿主细胞中产生ceDNA载体。然而,未表达病毒粒子(例如,AAV病毒粒子)。因此,没有大小限制,诸如在AAV或其它基于病毒的载体中天然强加的大小限制。
可以通过以下来确认从宿主细胞分离的ceDNA载体的存在:用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶来消化从宿主细胞分离的DNA,并在非变性凝胶上分析消化的DNA材料,以与线性和非连续DNA相比确认线性和连续DNA的特征带的存在。
在另一方面,本公开提供了将DNA载体多核苷酸表达模板(ceDNA模板)稳定地整合至其自身基因组中的宿主细胞系用于产生非病毒DNA载体的用途,例如Lee,L.等人(2013)Plos One 8(8):e69879所述。优选地,Rep以约3的MOI加入宿主细胞中。当宿主细胞系是哺乳动物细胞系、例如HEK293细胞时,该细胞系可以具有稳定整合的多核苷酸载体模板,并且可以使用第二载体、诸如疱疹病毒将Rep蛋白引入细胞中,使得在Rep和辅助病毒存在下切除和扩增ceDNA。
根据一些实施方案,用于制造如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的宿主细胞为昆虫细胞,并使用杆状病毒递送编码Rep蛋白的多核苷酸和用于ceDNA的非病毒DNA载体多核苷酸表达构建体模板,例如如图4A-图4C和实施例1中所描述。根据一些实施方案,宿主细胞经工程改造以表达Rep蛋白。
然后从宿主细胞中收获和分离ceDNA载体。从细胞采集和收集本文所描述的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化,以实现高产率地产生ceDNA载体。例如,可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择采集时间。根据一些实施方案,细胞生长并在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体的时间但在大多数细胞因杆状病毒毒性而开始死亡之前进行采集。可以使用质粒纯化试剂盒,诸如,Qiagen Endo-Free Plasmid试剂盒分离DNA载体。为分离质粒而开发的其它方法也适用于DNA载体。通常,可以采用任何核酸纯化方法。
DNA载体可以通过所属领域的技术人员已知用于纯化DNA的任何手段来纯化。根据一些实施方案,ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施方案中,将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。
用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的存在可以通过以下来证实:用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从细胞中分离的载体DNA,并使用凝胶电泳分析被消化和未被消化的DNA物质,以证实与线性和非连续DNA相比线性和连续DNA的特征带的存在。图4C和图4D示出了用于鉴定通过本文的方法产生的封闭端ceDNA载体的存在的一个实施方案。
根据一些实施方案,ceDNA是在游离环境中以合成方式产生的。
B.ceDNA质粒
ceDNA质粒为用于后续产生用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的质粒。根据一些实施方案,ceDNA质粒可以使用已知的技术来构建,以在转录方向上提供至少以下项作为操作性地连接的组分:(1)经修饰5'ITR序列;(2)含有顺式调节元件(例如,启动子、诱导型启动子、调节开关、增强子等)的表达盒;以及(3)经修饰3'ITR序列,其中3'ITR序列相对于5'ITR序列对称。根据一些实施方案,侧接ITR的表达盒包含用于引入外源序列的克隆位点。表达盒替换了AAV基因组的rep和cap编码区。
根据一些方面,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体是从质粒获得,该质粒在本文中称为“ceDNA质粒”,其按照此次序编码:第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、包含转基因的表达盒和经突变或经修饰AAV ITR,其中该ceDNA质粒不含AAV衣壳蛋白编码序列。在另选的实施方案中,ceDNA-质粒按次序编码:第一(或5')经修饰或经突变AAV ITR、包括转基因的表达盒、以及第二(或3')经修饰AAV ITR,其中该ceDNA-质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列,并且其中5'和3'ITR彼此对称。在替代性实施方案中,ceDNA质粒按照此次序编码:第一(或5’)经修饰或突变AAV ITR、包含转基因的表达盒以及第二(或3’)经突变或修饰AAV ITR,其中所述ceDNA质粒不含AAV衣壳蛋白编码序列,并且其中5’经修饰ITR和3’经修饰ITR具有相同修饰(即,其相对于彼此为反向互补序列或为对称的)。
在另一个实施方案中,ceDNA质粒系统不含病毒衣壳蛋白编码序列(即,其不含AAV衣壳基因,并且还不含其它病毒的衣壳基因)。另外,在具体实施方案中,ceDNA-质粒还不含AAV Rep蛋白编码序列。因此,在一个优选实施方案中,ceDNA质粒缺乏AAV2的功能性AAVcap和AAV rep基因GG-3'加上允许发夹形成的可变回文序列。
本公开的ceDNA质粒可以使用所属领域中熟知的任何AAV血清型的基因组的天然核酸序列来产生。根据一些实施方案,ceDNA-质粒主链衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如,NCBI:NC 002077;NC 001401;NC001729;NC001829;NC006152;NC 006260;NC 006261;Kotin and Smith,The Springer Index of Viruses,可在Springer维护的URL上获得(www网址:oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.)(注意:对URL或数据库的引用是指截至本申请生效提交日为止的URL或数据库的内容)。在一个具体实施方案中,ceDNA-质粒主链衍生自AAV2基因组。在另一个具体实施方案中,ceDNA-质粒主链是合成的主链,其经过基因工程改造以在它的5'和3'ITR处包含衍生自这些AAV基因组之一。
ceDNA-质粒可以任选地包括选择性或选择标志物,用于建立产生ceDNA载体的细胞系。根据一些实施方案,选择标志物可以插入3'ITR序列的下游(即3')。在另一个实施方案中,选择标志物可以插入5'ITR序列的上游(即5')。适当的选择标志物包含例如赋予耐药性的那些标志物。选择标志物可以是例如杀稻瘟菌素S抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)等。在优选实施方案中,药物选择标志物是杀稻瘟菌素S抗性基因。
用于表达抗体及其抗原结合片段的示例性ceDNA(例如rAAV0)载体由rAAV质粒产生。一种用于产生rAAV载体的方法可以包括:(a)为宿主细胞提供如上文所描述的rAAV质粒,其中宿主细胞和质粒均不含衣壳蛋白编码基因,(b)在允许产生ceDNA基因组的条件下培养宿主细胞;以及(c)收获细胞并分离从该细胞产生的AAV基因组。
C.从ceDNA质粒制备ceDNA载体的示例性方法
本文还提供了用于制造用于表达抗体及其抗原结合片段的无衣壳ceDNA载体的方法,特别是具有足够高的产量以提供足够的载体用于体内实验的方法。
根据一些实施方案,用于产生用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的方法包含以下步骤:(1)将包含表达盒和两个对称的ITR序列的核酸构建体引入宿主细胞(例如Sf9细胞)中;(2)任选地,例如通过使用质粒上存在的选择标志物建立克隆细胞系;(3)将Rep编码基因引入(通过用携带所述基因的杆状病毒转染或感染)所述昆虫细胞中;以及(4)收取细胞并纯化ceDNA载体。上述用于产生ceDNA载体的包括表达盒和两个ITR序列的核酸构建体可以呈ceDNA质粒的形式,或如下所述用ceDNA质粒生成的杆粒或杆状病毒的形式。可以通过转染、病毒转导、稳定整合或所属领域中已知的其它方法将核酸构建体引入宿主细胞中。
D.细胞系
用于产生用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的宿主细胞系可以包括衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的昆虫细胞系,诸如Sf9 Sf21,或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞,或其它无脊椎动物、脊椎动物或其它真核细胞系,包括哺乳动物细胞。也可以使用普通技术人员已知的其它细胞系,诸如HEK293、Huh-7、HeLa、HepG2、HeplA、911、CHO、COS、MeWo、NIH3T3、A549、HT1 180、单核细胞、以及成熟和不成熟的树突状细胞。可以转染宿主细胞系以稳定表达ceDNA质粒,从而高产率地产生ceDNA载体。
可以使用所属领域已知的试剂(例如脂质体、磷酸钙)或物理手段(例如电穿孔),通过瞬时转染将ceDNA质粒引入Sf9细胞中。另选地,可以建立将ceDNA质粒稳定整合至基因组中的稳定Sf9细胞系。此类稳定细胞系可以通过如上文所描述将选择标志物并入ceDNA-质粒中来建立。如果用于转染细胞系的ceDNA-质粒包含选择标志物,诸如抗生素,那么可以通过向细胞生长培养基中加入抗生素来选择已用ceDNA-质粒转染并将ceDNA-质粒DNA整合到基因组中的细胞。然后可以通过单细胞稀释或集落转移技术来分离细胞的抗性克隆并增殖。
E.分离和纯化ceDNA载体
用于获得和分离ceDNA载体的方法的示例描述于图4A-图4E和下文的具体实施例中。本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以从表达AAV Rep蛋白的生产细胞获得,进一步用ceDNA质粒、ceDNA杆粒或ceDNA杆状病毒转化。可用于产生ceDNA载体的质粒包括编码抗体及其抗原结合片段的质粒或编码一种或多种REP蛋白的质粒。
根据一些方面,多核苷酸编码在质粒(Rep-质粒)、杆粒(Rep-杆粒)或杆状病毒(Rep-杆状病毒)中递送到生产细胞的AAV Rep蛋白(Rep 78或68)。Rep-质粒、Rep-杆粒和Rep-杆状病毒可以通过上文所描述的方法生成。
本文描述了产生用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的方法。用于生成如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的表达构建体可以为质粒(例如ceDNA质粒)、杆粒(例如ceDNA杆粒)和/或杆状病毒(例如ceDNA杆状病毒)。仅举例来说,ceDNA-载体可以由用ceDNA-杆状病毒和Rep-杆状病毒共同感染的细胞生成。由Rep-杆状病毒产生的Rep蛋白可以复制ceDNA-杆状病毒以生成ceDNA-载体。另选地,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以由经构建体稳定转染的细胞生成,该构建体包含编码AAVRep蛋白(Rep78/52)的序列,该AAV Rep蛋白是在Rep质粒、Rep杆粒或Rep杆状病毒中递送。CeDNA-杆状病毒可以瞬时转染到细胞中,通过Rep蛋白复制并产生ceDNA载体。
杆粒(例如ceDNA-杆粒)能够转染到允许的昆虫细胞中,诸如Sf9、Sf21、Tni(粉纹夜蛾)细胞、High Five细胞,并且生成ceDNA-杆状病毒,该杆状病毒是重组杆状病毒,其包括包含对称ITR的序列和表达盒。ceDNA-杆状病毒能够再次感染到昆虫细胞中以获得下一代重组杆状病毒。任选地,该步骤可以重复一次或多次以产生更大量的重组杆状病毒。
从细胞采集和收集如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化以实现ceDNA载体的高产量生产。例如,可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择采集时间。通常,细胞可以在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体(例如ceDNA载体)的时间后但在大多数细胞开始因病毒毒性而死亡之前采集。可以使用质粒纯化试剂盒,例如Qiagen ENDO-FREE试剂盒从Sf9细胞中分离出ceDNA载体。为了分离质粒而开发的其它方法也可以适合于ceDNA载体。一般而言,可以采用所属领域中已知的任何核酸纯化方法,以及可商购的DNA提取试剂盒。
另选地,可以通过对细胞团块进行碱溶解法、离心所得溶解液并进行色谱分离来实施纯化。作为一个非限制性示例,该方法可以如下进行:将上清液装载到保留核酸的离子交换柱(例如,SARTOBIND)上,然后洗脱(例如,用1.2M NaCl溶液),并在凝胶过滤柱(例如,6个快速流动GE)上进行进一步色谱纯化。然后通过例如沉淀来回收无衣壳AAV载体。
根据一些实施方案,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体还可以以外泌体或微米粒子形式纯化。本领域已知许多细胞类型不仅释放出可溶性蛋白质,而且通过膜微囊泡脱落释放出复杂的蛋白质/核酸货物(Cocucci等人,2009;EP 10306226.1)。此类囊泡包括微囊泡(也称为微粒)和外泌体(也称为纳米囊泡),两者均包含蛋白质和RNA作为货物。微囊泡由质膜的直接出芽生成,而外泌体在多囊泡内体与质膜融合后释放到细胞外的环境中。因此,可以从已经用ceDNA-质粒转导的细胞或用ceDNA-质粒生成的杆粒或杆状病毒中分离出含有ceDNA载体的微囊泡和/或外泌体。
微囊泡可以通过对培养基进行过滤或以20,000xg超速离心来分离,并且外泌体可以通过以100,000xg超速离心来分离。超速离心的最佳持续时间可以通过实验确定,并且将取决于从中分离囊泡的特定细胞类型。优选地,首先利用低速离心(例如在2000×g下进行5分钟-20分钟)清除培养基并且使用例如离心柱(Millipore,Watford,UK)进行离心浓缩。微米囊泡和外泌体可以通过使用识别存在于微米囊泡和外泌体上的特定表面抗原的特异性抗体,通过FACS或MACS进一步纯化。其它微囊泡和外泌体纯化方法包括但不限于免疫沉淀、亲和色谱、过滤和涂有特异性抗体或适体的磁珠。纯化后,用例如磷酸盐缓冲盐水洗涤囊泡。使用米囊泡或外泌体递送含ceDNA的囊泡的一个优点是,这些囊泡可通过在它们的膜上包括被相应细胞类型上的特异性受体识别的蛋白而靶向各种细胞类型。(也参见EP 10306226)
本文的本公开的另一个方面涉及从已经将ceDNA构建体稳定整合到其自身基因组中的宿主细胞系中纯化ceDNA载体的方法。根据一些实施方案,ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施方案中,将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。
国际申请PCT/US18/49996的图5显示了凝胶证实ceDNA的产生,该ceDNA使用实施例中所述的方法由多种ceDNA-质粒构建体产生。如实施例中关于图4D所论述,ceDNA通过凝胶中的特征色带图案来证实。
VI.药物组合物
在另一方面,提供了药物组合物。药物组合物包含如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体和药学上可接受的载剂或稀释剂。
如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以并入适于施用于受试者的药物组合物中以体内递送到受试者的细胞、组织或器官。通常,药物组合物包括如本文公开的ceDNA-载体和药学上可接受的载剂。
本文公开的药物制剂包括可以直接施用的液体(例如水性)溶液和可以通过在施用之前添加稀释剂而重构成溶液的冻干粉末。在某些实施方案中,可以使用合适的赋形剂将包含如本文所公开的ceDNA载体的制剂在含有或不含有至少一种另外的治疗剂的情况下配制为冻干物。可以在市售冻干机(例如,VirTis实验室规模冻干机)上使用通用冻干循环进行冻干。
根据一些实施方案,如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以并入适于期望的治疗性施用途径(例如肠胃外施用)的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及例如核内显微注射或胞浆内注射等细胞内注射进行的被动组织转导。用于治疗目的的药物组合物能够配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分之一或组合一起并入适当的缓冲液中、然后进行过滤灭菌来制备。可以配制包括ceDNA载体,以将核酸中的转基因递送到接受者的细胞,使得转基因或供体序列在其中治疗性表达。组合物还可以包括药学上可接受的载剂。
包含用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的药学活性组合物可以被配制成将用于不同目的的转基因递送到细胞,例如受试者的细胞。
用于治疗目的的药物组合物通常必须在制造和存储条件下是无菌的和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起并入适当的缓冲液中,接着进行过滤灭菌来制备。
在某些实施方案中,用于肠胃外施用的制剂可以以冻干形式或溶液形式储存。在某些实施方案中,通常将肠胃外制剂放入具有无菌出入口的容器中,例如具有以皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
在某些实施方案中,一旦已经配制药物制剂,其就可以以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体形式或以脱水或冻干粉末形式储存在无菌小瓶中。在某些实施方案中,此类制剂可以以即用型形式或以在施用之前重构的形式(例如,冻干)储存。
如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以并入适于局部、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋巴管内、腹膜内、皮下、气管、组织内(例如肌肉内、心内、肝内、肾内、脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例如眼眶外、眼眶内、眼眶后、视网膜内、视网膜下、脉络膜、脉络膜下、基质内、眼房内和玻璃体内)、耳蜗内和经粘膜(例如经口、经直肠、经鼻)施用的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。
根据一些方面,本文所提供的方法包括将一种或多种如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体递送到宿主细胞。本文还提供了通过这类方法产生的细胞,以及包含这类细胞或由这类细胞产生的生物体(诸如动物、植物或真菌)。核酸的递送方法可包括脂质转染、核转染、显微注射、生物弹药、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA和药剂增强的DNA吸收。脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355)并且脂质体转染试剂有市售(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。递送可以到细胞(例如,体外或离体施用)或靶组织(例如,体内施用)。
将核酸递送到细胞的各种技术和方法是所属领域中已知的。例如,核酸诸如用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA可以被配制到脂质纳米粒子(LNP)、类脂质(lipidoid)、脂质体、脂质纳米粒子、脂质体复合物(lipoplex)或核壳纳米粒子中。通常,LNP由核酸(例如ceDNA)分子、一种或多种可电离或阳离子脂质(或其盐)、一种或多种非离子或中性脂质(例如磷脂)、防止聚集的分子(例如PEG或PEG-脂质缀合物)以及任选的固醇(例如胆固醇)构成。
另一种用于将核酸诸如用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA递送到细胞的方法为使核酸与被细胞内化的配体缀合。例如,配体可以结合细胞表面上的受体并通过胞吞而被内化。配体可以与核酸中的核苷酸共价连接。用于将核酸递送到细胞中的示例性缀合物描述于例如WO2015/006740、WO2014/025805、WO2012/037254、WO2009/082606、WO2009/073809、WO2009/018332、WO2006/112872、WO2004/090108、WO2004/091515和WO2017/177326中。
核酸诸如用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体还可以通过转染递送到细胞。有用的转染方法包含(但不限于):脂质介导的转染、阳离子聚合物介导的转染或磷酸钙沉淀。转染试剂在所属领域中是熟知的并且包含(但不限于):TurboFect转染试剂(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、Pro-Ject试剂(赛默飞世尔科技)、TRANSPASSTM P蛋白转染试剂(新英格兰生物实验室)、CHARIOTTM蛋白递送试剂(Active Motif)、PROTEOJUICETM蛋白转染试剂(EMD密理博)、293fectin、LIPOFECTAMINETM 2000、LIPOFECTAMINETM 3000(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTINTM(赛默飞世尔科技)、DMRIE-C、CELLFECTINTM(赛默飞世尔科技)、OLIGOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTACETM、FUGENETM(瑞士巴塞尔的罗氏(Roche,Basel,Switzerland))、FUGENETM HD(罗氏)、TRANSFECTAMTM(转染胺,威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,Wis.))、TFX-10TM(普洛麦格公司)、TFX-20TM(普洛麦格公司)、TFX-50TM(普洛麦格公司)、TRANSFECTINTM(加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(BioRad,Hercules,Calif.))、SILENTFECTTM(伯乐公司)、EffecteneTM(加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen,Valencia,Calif.))、DC-chol(阿凡提极性脂质公司(AvantiPolar Lipids))、GENEPORTERTM(加利福尼亚圣地亚哥的基因疗法系统(Gene TherapySystems,San Diego,Calif.))、DHARMAFECT 1TM(科罗拉多州拉斐特的达尔马肯(Dharmacon,Lafayette,Colo.))、DHARMAFECT 2TM(达尔马肯)、DHARMAFECT 3TM(达尔马肯)、DHARMAFECT 4TM(达尔马肯)、ESCORTTM III(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,Mo.))和ESCORTTM IV(西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.))。核酸,如ceDNA,也可以通过所属领域的技术人员已知的微流体方法递送到细胞。
如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体还可以直接施用于生物体以在体内转导细胞。施用是通过正常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径,包含(但不限于):注射、输注、局部施用和电穿孔。合适的施用此类核酸的方法是可获得的并且是本领域的技术人员公知的,并且虽然可以使用超过一种途径来施用特定的组合物,但特定的途径通常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。
根据本公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到受试者的细胞或靶器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下,脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂,尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成,然而这些组合物还可以包括其它脂质。2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中公开了示例性脂质体和脂质体配制物,包括(但不限于)含有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物,参见例如标题为“药物配制物”的章节。
所属领域已知的各种递送方法或其改良方法可用于在体外或体内递送ceDNA载体。例如,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体是通过机械能、电能、超声波能、流体动力能或基于激光的能量使得短暂渗透细胞膜以使得便于DNA进入靶向细胞中来递送。例如,可以通过经过大小限制的通道挤压细胞或通过所属领域中已知的其它手段来瞬时破坏细胞膜来递送ceDNA载体。根据一些实施方案,单独的ceDNA载体作为裸DNA直接注射到以下任一组织中:选自以下的任何一种或多种组织:肺、肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、胃、皮肤、胸腺、心肌或骨骼肌。根据一些实施方案,通过基因枪递送ceDNA载体。涂覆有无衣壳AAV载体的金或钨球形粒子(直径1μm-3μm)可以通过加压气体加速到高速而渗透到靶组织细胞中。
本文特别预期包含用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体和药学上可接受的载剂的组合物。根据一些实施方案,ceDNA载体与脂质递送系统,例如本文所述的脂质体一起配制。根据一些实施方案,此类组合物通过熟练从业人员期望的任何途径来施用。可以通过不同途径,包括经口、肠胃外、舌下、经皮直肠、经粘膜、局部、通过吸入、经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内鞘内和关节内或其组合,向受试者施用组合物。对于兽医用途,可根据正常兽医实践将组合物作为适当可接受的配制物施用。兽医可以很容易地确定最适合具体动物的给药方案和施用途径。可以通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪”或其它物理方法(诸如电穿孔(“EP”)、流体动力学方法或超声波)施用组合物。
根据一些情况,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体是通过流体动力学注射来递送,该流体动力学注射为将任何水溶性化合物和粒子直接细胞内递送到内脏和整个肢体的骨骼肌中的简单且高效的方法。
根据一些实施方案,用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体是通过超声波,通过在膜中制造纳米级孔以便于将DNA粒子细胞内递送到内脏或肿瘤的细胞中来递送,因此质粒DNA的大小和浓度在系统的效率中起重要作用。根据一些实施方案,通过使用磁场的磁转染来递送ceDNA载体,以将含有核酸的粒子集中到靶细胞中。
根据一些实施方案,可以使用化学递送系统,例如通过使用纳米复合物,其包含用属于阳离子脂质体/胶束或阳离子聚合物的聚阳离子纳米粒子来压紧带负电核酸。用于递送方法的阳离子脂质包含但不限于单价阳离子脂质、多价阳离子脂质、含胍化合物、胆固醇衍生化合物、阳离子聚合物、(例如聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白、其它阳离子聚合物)和脂质-聚合物杂化物。
A.外泌体:
根据一些实施方案,如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体是通过包装于外泌体中来递送。外泌体是胞吞来源的小膜囊泡,其在多囊泡体与质膜融合后被释放到细胞外环境中。其表面由来自供体细胞的细胞膜的脂质双层组成,其含有来自产生外泌体的细胞的胞溶质并且在表面上展现来自亲本细胞的膜蛋白。外泌体由包含上皮细胞、B和T淋巴细胞、肥大细胞(MC)以及树突状细胞(DC)在内的各种细胞类型产生。根据一些实施方案,设想使用直径在10nm与1μm之间、20nm与500nm之间、30nm与250nm之间、50nm与100nm之间的外泌体。使用外泌体的供体细胞或通过将特定核酸引入外泌体中,可以分离外泌体以递送到靶细胞中。所属领域中已知的各种方法可以用于产生含有本公开的无衣壳AAV载体的外泌体。
B.微粒/纳米粒子
根据一些实施方案,如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体通过脂质纳米粒子递送。通常,脂质纳米粒子包括可电离氨基脂质(例如,4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯、DLin-MC3-DMA、磷脂酰胆碱(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱,DSPC)、胆固醇和外被脂质(聚乙二醇-二肉豆蔻酰基甘油,PEG-DMG),例如如Tam等人,(2013).Advances in Lipid Nanoparticles for siRNAdelivery.Pharmaceuticals 5(3):498-507所公开的。
根据一些实施方案,脂质纳米粒子具有介于约10nm与约1000nm之间的平均直径。根据一些实施方案,脂质纳米粒子具有小于300nm的直径。根据一些实施方案,脂质纳米粒子具有介于约10nm与约300nm之间的直径。根据一些实施方案,脂质纳米粒子具有小于200nm的直径。根据一些实施方案,脂质纳米粒子具有介于约25nm与约200nm之间的直径。根据一些实施方案,脂质纳米粒子制剂(例如,包含多个脂质纳米粒子的组合物)具有一定的大小分布,其中平均大小(例如,直径)为约70nm至约200nm,并且更通常,平均大小为约100nm或更小。
所属领域中已知的多种脂质纳米粒子可以用于递送如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体。例如,在美国专利号9,404,127、9,006,417和9,518,272中描述了使用脂质纳米粒子的各种递送方法。
C.偶联物
根据一些实施方案,如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体与增强细胞吸收的药剂缀合(例如共价结合)。“增加细胞吸收的药剂”是促进核酸跨脂质膜运输的分子。例如,核酸能够与亲脂性化合物(例如胆固醇、生育酚等)、细胞穿透肽(CPP)(例如穿膜肽、TAT、Syn1B等)和多胺(例如精胺)缀合。增强细胞吸收的药剂的其他示例公开于例如Winkler(2013).Oligonucleotide conjugates for therapeuticapplications.Ther.Deliv.4(7);791-809。
根据一些实施方案,如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体与聚合物(例如聚合分子)或叶酸(folate)分子(例如叶酸(folic acid)分子)缀合。通常,与聚合物缀合的核酸的递送是所属领域中已知的,例如WO2000/34343和WO2008/022309中所描述。根据一些实施方案,如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体与聚(酰胺)聚合物缀合,例如美国专利8,987,377所描述。根据一些实施方案,将本公开所描述的核酸与叶酸分子缀合,如美国专利8,507,455中所描述。
根据一些实施方案,如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体与碳水化合物缀合,例如美国专利8,450,467中所描述。
D.纳米胶囊
另选地,可以使用如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的纳米胶囊配制物。纳米胶囊通常可以呈稳定并且可再现的方式截留物质。为了避免由于细胞内聚合物过载所致的副作用,应使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细粒子(大小约0.1μm)。满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米粒子是预期使用的。
E.脂质体
根据本公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到受试者的细胞或靶器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下,脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂,尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成,然而这些组合物还可以包括其它脂质。
脂质体的形成和使用是所属领域的技术人员通常已知的。已经研发了血清稳定性和循环半衰期有所改善的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外,已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载剂的各种方法(美国专利号5,567,434、5,552,157、5,565,213、5,738,868和5,795,587)。
F.示例性脂质体和脂质纳米粒子(LNP)组合物
根据本公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到细胞,例如需要表达转基因的细胞。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下,脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂,尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成,然而这些组合物还可以包括其它脂质。
包含ceDNA载体的脂质纳米粒子(LNP)公开于全文并入本文中的2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中,并且设想用于针对如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的方法和组合物中。
根据一些方面,本公开提供了一种脂质体配制物,其包含一种或多种具有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物(所谓的“PEG化的化合物”),该聚乙二醇官能团可以降低一种或多种该化合物的免疫原性/抗原性、为其提供亲水性和疏水性并降低剂量频率。或者,脂质体配制物仅包含聚乙二醇(PEG)聚合物作为额外组分。在此类方面,PEG或PEG官能团的分子量可以从62Da至约5,000Da。
根据一些方面,本公开提供了一种脂质体配制物,其将在数小时至数周的时间内以延长释放或受控释放曲线来递送API。根据一些相关的方面,脂质体配制物可以包括以脂质双层结合的水性腔。在其它相关方面,脂质体配制物将API与组分一起囊封起来,该组分在升高的温度下经历物理转变,在数小时到数周的时段内释放API。
根据一些方面,脂质体配制物包括鞘磷脂和一种或多种本文公开的脂质。根据一些方面,脂质体配制物包括光敏体。
根据一些方面,本公开提供了脂质体配制物,其包括选自以下项的一种或多种脂质:N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐、(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、MPEG(甲氧基聚乙二醇)缀合的脂质、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱);PEG(聚乙二醇);DSPE(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺);DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱);DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱);DPPG(二棕榈酰基磷脂酰甘油);EPC(卵磷脂酰胆碱);DOPS(二油酰基磷脂酰丝氨酸);POPC(棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱);SM(鞘磷脂);MPEG(甲氧基聚乙二醇);DMPC(二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱);DMPG(二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油);DSPG(二硬脂酰基磷脂酰甘油);DEPC(二芥酰基磷脂酰胆碱);DOPE(二油酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、胆固醇硫酸酯(CS)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、DOPC(二油酰基-sn-甘油-磷脂酰胆碱)或它们的任何组合。
根据一些方面,本公开提供了一种脂质体配制物,其包括磷脂、胆固醇和PEG化脂质,摩尔比为56:38:5。根据一些方面,脂质体配制物的总脂质含量为2mg/mL-16mg/mL。根据一些方面,本公开提供了一种脂质体配制物,该脂质体配制物包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质。根据一些方面,本公开提供了一种脂质体配制物,该脂质体配制物包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质,摩尔比分别为3:0.015:2。根据一些方面,本公开提供了一种脂质体配制物,该脂质体配制物包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、胆固醇和PEG化脂质。根据一些方面,本公开提供了一种脂质体配制物,该脂质体配制物包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和胆固醇。根据一些方面,PEG化脂质是PEG-2000-DSPE。根据一些方面,本公开提供了一种脂质体配制物,该脂质体配制物包括DPPG、大豆PC、MPEG-DSPE脂质缀合物和胆固醇。
根据一些方面,本公开提供了一种脂质体配制物,该脂质体配制物包括一种或多种含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和一种或多种含有乙醇胺官能团的脂质。根据一些方面,本公开提供了一种脂质体配制物,该脂质体配制物包括以下中的一种或多种:含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和固醇,例如胆固醇。根据一些方面,脂质体配制物包括DOPC/DEPC;和DOPE。
根据一些方面,本公开提供了一种脂质体配制物,该脂质体配制物还包括一种或多种药物赋形剂,例如蔗糖和/或甘氨酸。
根据一些方面,本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质体配制物。根据一些方面,本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或泡沫基粒子的脂质体配制物。根据一些方面,本公开提供了一种相对普通纳米粒子的相对大小更大并且大小为约150nm至250nm的脂质体配制物。根据一些方面,脂质体配制物是冻干粉末。
根据一些方面,本公开提供了一种脂质体配制物,该脂质体配制物通过向在脂质体外部具有分离的ceDNA的混合物中添加弱碱,用本文中公开或描述的ceDNA载体制备并负载该ceDNA载体。这种添加将脂质体外部的pH提高到大致7.3,并驱动API进入脂质体中。根据一些方面,本公开提供了一种脂质体内部pH为酸性的脂质体配制物。在此类情况下,脂质体的内部可以处于pH 4-6.9下,并且更优选pH 6.5。在其它方面,本公开提供了一种通过使用脂质体内药物稳定化技术制备的脂质体配制物。在这样的情况下,利用聚合或非聚合的带高电荷阴离子和脂质体内俘获剂,例如多磷酸盐或蔗糖八硫酸盐。
根据一些方面,本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。例如,通过如2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开的方法获得的ceDNA制备并负载ceDNA的脂质纳米粒子配制物,该申请并入本文中。这可以通过在低pH下将乙醇脂质与ceDNA水溶液高能混合,使可电离脂质质子化并为ceDNA/脂质缔合和粒子成核提供有利的能量来实现。通过水稀释和去除有机溶剂可以进一步稳定粒子。能够将颗粒浓缩至所需水平。
一般来说,脂质纳米粒子是以约10:1到60:1的总脂质:ceDNA(质量或重量)比制备。根据一些实施方案,脂质与ceDNA比率(质量/质量比率;w/w比率)的范围可以是约1:1至约60:1、约1:1至约55:1、约1:1至约50:1、约1:1至约45:1、约1:1至约40:1、约1:1至约35:1、约1:1至约30:1、约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1、约6:1至约9:1、约30:1至约60:1。根据一些实施方案,脂质粒子(例如,脂质纳米粒子)以约60:1的ceDNA(质量或重量)与总脂质比率制备。根据一些实施方案,脂质粒子是以约10:1到30:1的总脂质:ceDNA(质量或重量)比制备。根据一些实施方案,脂质与ceDNA比率(质量/质量比率;w/w比率)可以在约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。能够调节脂质和ceDNA的量以提供所需的N/P比,例如N/P比为3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常,脂质颗粒配制物的总脂质含量能够在约5mg/mL至约30mg/mL的范围内。
可电离脂质通常用于在低pH值下浓缩核酸货物(例如ceDNA)并驱动膜缔合和融合。通常,可电离脂质是包含至少一个氨基的脂质,该氨基在酸性条件下(例如在pH 6.5或更低的条件下)带正电或质子化。可电离脂质在本文中也称为阳离子脂质。
示例性可电离脂质描述于国际PCT专利公开WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO2012/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346和WO2013/086354;以及美国专利公开US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458和US2013/0195920,该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据一些实施方案,可电离脂质为具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3):
脂质DLin-MC3-DMA描述于Jayaraman等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.(2012),51(34):8529-8533,其内容以全文引用的方式并入本文。
根据一些实施方案,可电离脂质是如WO2015/074085中所述的脂质ATX-002,该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据一些实施方案,可电离脂质是如WO2012/040184中所述的(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32),该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据一些实施方案,可电离脂质是如WO2015/199952中所述的化合物6或化合物22,该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
没有限制,可电离脂质可以占脂质纳米粒子中存在的总脂质的20%-90%(mol)。例如,可电离脂质摩尔含量可以为脂质纳米粒子中存在的总脂质的20%-70%(mol)、30%-60%(mol)或40%-50%(mol)。根据一些实施方案,可电离的脂质占脂质纳米粒子中存在的总脂质的约50mol%至约90mol%。
根据一些方面,脂质纳米粒子还可以包含非阳离子脂质。非离子脂质包括两亲脂质、中性脂质和阴离子脂质。因此,非阳离子脂质可以是中性不带电的、两性离子型或阴离子脂质。非阳离子脂质通常用于增强融合性。
设想用于如本文所公开的方法和组合物中的示例性非阳离子脂质描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242中,该国际申请全文并入本文中。示例性非阳离子脂质描述于国际申请公开WO2017/099823和美国专利公开US2018/0028664中,两者的内容以全文引用的方式并入本文中。
非阳离子脂质能够占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0%-30%(mol)。例如,非阳离子脂质含量为脂质纳米粒子中存在的总脂质的5%-20%(mol)或10%-15%(mol)。在各种实施方案中,可电离的脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1。
根据一些实施方案,脂质纳米粒子不包含任何磷脂。根据一些方面,脂质纳米粒子还可以包含诸如固醇等组分,以提供膜完整性。
能够用于脂质纳米粒子的一种示例性固醇是胆固醇和其衍生物。示例性胆固醇衍生物描述于国际申请WO2009/127060和美国专利公开US2010/0130588中,该文献以全文引用的方式并入本文。
提供膜完整性的组分(诸如固醇)能够占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0%-50%(mol)。根据一些实施方案,此类组分占脂质纳米粒子的总脂质含量的20%-50%(mol)、30%-40%(mol)。
根据一些方面,脂质纳米粒子还可以包含聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。通常,这些用于抑制脂质纳米粒子的聚集和/或提供空间稳定。示例性缀合脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、聚唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物以及其混合物。根据一些实施方案,缀合的脂质分子是PEG-脂质缀合物,例如(甲氧基聚乙二醇)缀合的脂质。示例性PEG-脂质缀合物包括(但不限于):PEG-二酰基甘油(DAG)(如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG丁二酸酯二酰基甘油(PEGS-DAG)(如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐,或其混合物。另外的示例性PEG-脂质缀合物描述于例如US5,885,613、US6,287,591、US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224和US2017/0119904中,所有这些文献的内容以全文引用的方式并入本文。
根据一些实施方案,PEG-脂质是如US2018/0028664中定义的化合物,该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据一些实施方案,US20150376115或US2016/0376224中公开了PEG-脂质,该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂酰氧基丙基、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基、PEG-二棕榈酰氧基丙基或PEG-二硬脂酰氧基丙基。PEG-脂质可以是以下中的一种或多种:PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基甘油酰胺、PEG-二硬脂基甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰氨基-3',6'-二氧杂辛基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二(十四烷氧基)苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚),以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。根据一些示例,PEG-脂质可以选自由以下项组成的组:PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。
还能够使用与除PEG之外的分子缀合的脂质替代PEG-脂质。例如,代替PEG-脂质或除PEG-脂质以外,还可以使用聚唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(如ATTA-脂质缀合物)和阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物。示例性的缀合脂质(即,PEG-脂质、(POZ)-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质)描述于WO1996/010392、WO1998/051278、WO2002/087541、WO2005/026372、WO2008/147438、WO2009/086558、WO2012/000104、WO2017/117528、WO2017/099823、WO2015/199952、WO2017/004143、WO2015/095346、WO2012/000104、WO2012/000104和WO2010/006282;美国专利申请公开US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2013/0303587、US2018/0028664、US2015/0376115、US2016/0376224、US2016/0317458、US2013/0303587、US2013/0303587和US20110123453;和US5,885,613、US6,287,591、US6,320,017和US6,586,559,该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据一些实施方案中,一种或多种另外的化合物可以是治疗剂。治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说,治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说,可以根据治疗目的和所需的生物学作用选择治疗剂。
根据一些实施方案,另外的化合物是本文所述的另一种抗体或其抗原结合片段。
根据一些实施方案,另外的药剂是抗病毒药物或疫苗。根据一些实施方案,另外的药剂选自由以下项组成的组:抗炎剂、抗疟疾剂和特异性结合CoV-S的抗体或其抗原结合片段。在进一步的实施方案中,抗疟疾剂是氯喹或羟氯喹。根据一些实施方案,抗炎剂是抗体,例如沙利姆单抗(sarilumab)、托珠单抗(tocilizumab)或瑾司鲁单抗(gimsilumab)。
根据一些实施方案,另外的化合物是免疫刺激剂。本文还提供了包含所产生的经脂质纳米粒子囊封的昆虫细胞或如本文所述的以合成方式产生的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体以及药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。
根据一些方面,本公开提供了一种脂质纳米粒子配制物,该脂质纳米粒子配制物还包含一种或多种药物赋形剂。根据一些实施方案,脂质纳米粒子配制物还包含蔗糖、tris、海藻糖和/或甘氨酸。
ceDNA载体能够与粒子的脂质部分复合或囊封于脂质纳米粒子的脂质位置。根据一些实施方案,可以将ceDNA完全囊封在脂质纳米粒子的脂质位置中,从而保护其免于被核酸酶降解,例如在水溶液中。根据一些实施方案,脂质纳米粒子中的ceDNA在37℃处脂质纳米粒子暴露于核酸酶至少约20分钟、30分钟、45分钟或60分钟后基本上不降解。根据一些实施方案,脂质纳米粒子中的ceDNA在将血清中的粒子在37℃处温育至少约30分钟、45分钟或60分钟或至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时或36小时后基本上不降解。
在某些实施方案中,脂质纳米粒子对受试者,例如对哺乳动物,诸如人基本上是无毒的。根据一些方面,脂质纳米粒子配制物是冻干粉末。
根据一些实施方案,脂质纳米粒子是具有至少一个脂质双层的固体芯粒子。在其它实施方案中,脂质纳米粒子具有非双层结构,即非层状(即非双层)形态。不受限制,非双层形态能够包括例如三维管、棒、对称立方体等。举例来说,使用例如Cryo-TEM分析,能够轻松地评估且表征脂质纳米粒子的形态(片层对非片层),如US2010/0130588中所述,所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据一些其它实施方案,具有非层状形态的脂质纳米粒子是电子致密的。根据一些方面,本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质纳米粒子。根据一些方面,本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或基于泡沫的粒子的脂质纳米粒子配制物。
通过控制脂质组分的组成和浓度,可以控制脂质缀合物从脂质粒子中交换出来的速率,进而可以控制脂质纳米粒子融合的速率。另外,包括例如pH、温度或离子强度的其它变量可以用于改变和/或控制脂质纳米粒子融合的速率。基于本公开,所属领域的普通技术人员将清楚可以用于控制脂质纳米粒子融合的速率的其它方法。同样显而易见,通过控制该脂质缀合物的组合物和浓度,可以控制脂质颗粒的大小。
配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的有效性相关(参见Jayaraman等人,Angewandte Chemie,国际版(2012),51(34),8529-8533;Semple等人,NatureBiotechnology 28,172-176(20l 0),这两篇文献均全文以引用方式并入)。pKa的优选范围是约5到约7。使用基于2-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS)荧光的测定法测定脂质纳米粒子中阳离子脂质的pKa。
VII.治疗方法
如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体还可以用于将所关注的核酸序列递送到靶细胞(例如,宿主细胞)的方法中。具体地说,该方法可以是用于将抗体及其抗原结合片段递送到有需要的受试者的细胞并治疗疾病或病症的方法。
本文所述的抗体或抗原结合片段(即,抗原)的靶标可以选自多种病原体,包括例如细菌、病毒、真菌和寄生虫感染剂。合适的靶标还可以包括癌症或癌症相关抗原等。另外其他靶标可以包括自身免疫病状,诸如类风湿性关节炎(RA)或多发性硬化症(MS)。
此外,本公开提供了将抗体及其抗原结合片段递送到有需要的受试者的细胞的方法,该方法包括多次施用编码所述抗体及其抗原结合片段的本公开的ceDNA载体。由于本公开的ceDNA载体不像对囊封病毒载体通常所观察到那样诱导免疫应答,所以该多次施用策略将可能在基于ceDNA的系统中取得更大的成功。ceDNA载体的施用量足以转染所需组织的细胞,并提供足够水平的基因转移和抗体及其抗原结合片段的表达,而不会产生过度的不利影响。
如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的递送不限于所表达的抗体及其抗原结合片段的递送。例如,常规产生(例如使用基于细胞的产生方法(例如昆虫细胞产生方法))或合成产生的如本文所述的ceDNA载体可以联合为了提供基因疗法的一部分而提供的其他递送系统使用。可以与根据本公开的ceDNA载体组合的系统的一个非限制性示例包括为了使表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体实现有效的基因表达而分别递送一种或多种辅因子或免疫抑制剂的系统。
本文所述的免疫球蛋白构建体的靶标可以选自多种病原体,包括例如细菌、病毒、真菌和寄生虫感染剂。合适的靶标还可以包括癌症或癌症相关抗原等。另外其他靶标可以包括自身免疫病状,诸如类风湿性关节炎(RA)或多发性硬化症(MS)。
病毒靶标的示例包括来自正粘病毒科(orthomyxovirudae family)的流感病毒,其包括:甲型流感、乙型流感和丙型流感。甲型病毒是毒性最强的人类病原体。与流行病相关的甲型流感的血清型包括H1N1,其造成1918年在西班牙发生的流感和2009年的猪流感;H2N2,其造成1957年在亚洲发生的流感;H3N2,其造成1968年在中国香港发生的流感;H5N1,其造成2004年的禽流感;H7N7;H1N2;H9N2;H7N2;H7N3;和H10N7。
已经描述了针对甲型流感的广谱中和抗体。如本文所用,“广谱中和抗体”是指可以中和来自多种亚型的多种品系的中和抗体。例如,CR6261[The Scripps Institute/Crucell]已被描述为结合广泛范围的流感病毒的单克隆抗体,该流感病毒包括1918年“西班牙流感”(SC1918/H1)和2004年在越南从鸡传染给人的H5N1类禽流感(Viet04/H5)。CR6261识别血凝素(流感病毒表面上的主要蛋白质)的膜近端茎中高度保守的螺旋区。该抗体描述于WO 2010/130636中,其以引用方式并入本文。另一种中和抗体F10[XOMA Ltd]已被描述为对H1N1和H5N1有用。[Sui等人,Nature Structural and Molecular Biology(Sui等人,2009,16(3):265-73)]可以选择针对流感的其他抗体,例如,Fab28和Fab49。参见例如WO2010/140114和WO 2009/115972,其以引用方式并入本文。还可以容易地选择其他抗体,诸如在WO 2010/010466、美国公开的专利公开US/2011/076265和WO 2008/156763中描述的那些。
其他靶标病原性病毒包括沙粒病毒(arenaviruses)(包括funin、马休波病毒(machupo)和拉沙病毒(Lassa))、丝状病毒(filoviruses)(包括马堡病毒(Marburg)和埃博拉病毒(Ebola))、汉坦病毒(hantaviruses)、小核糖核酸病毒(picornaviridae)(包括鼻病毒(rhinoviruses)、埃可病毒(echovirus))、冠状病毒(coronaviruses)、副粘病毒(paramyxovirus)、麻疹病毒(morbillivirus)、呼吸道合胞病毒、披膜病毒(togavirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、细小病毒B19、副流感病毒(parainfluenza)、腺病毒、呼肠孤病毒(reoviruses)、来自痘病毒科的天花(variola)(重型天花(天花(Smallpox)))和牛痘(Vaccinia)(牛痘(Cowpox)),和水痘带状疱疹(伪狂犬病)。
病毒性出血热是由沙粒病毒科的成员(拉沙热)(该科还与淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCM)相关)、丝状病毒(埃博拉病毒)和汉坦病毒(普马拉病毒(puremala))引起的。小核糖核酸病毒(鼻病毒亚科)的成员与人的普通感冒有关。冠状病毒科包括许多非人病毒,诸如感染性支气管炎病毒(家禽)、猪传染性胃肠病毒(猪)、猪血凝素脑脊髓炎病毒(猪)、猫感染性腹膜炎病毒(猫)、猫肠道冠状病毒(猫)、犬冠状病毒(狗)。人呼吸道冠状病毒被认为与普通感冒,非甲型、乙型或丙型肝炎以及突发性急性呼吸道综合征(SARS)有关。副粘病毒科包括副流感病毒1型、副流感病毒3型、牛副流感病毒3型、腮腺炎病毒属(rubulavirus)(腮腺炎病毒)、副流感病毒2型、副流感病毒4型、新城疫病毒(鸡)、牛瘟、麻疹病毒(包括麻疹和犬瘟热)和肺病毒(pneumovirus)(包括呼吸道合胞病毒(RSV))。细小病毒科包括猫细小病毒(猫肠炎)、猫泛白细胞减少症病毒(feline panleucopeniavirus)、犬细小病毒和猪细小病毒。腺病毒科包括引起呼吸系统疾病的病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。
还可以选择针对细菌病原体的中和抗体构建体用于本公开。在一个实施方案中,中和抗体构建体针对细菌本身。在另一个实施方案中,中和抗体构建体针对由细菌产生的毒素。空气传播的细菌病原体的示例包括例如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)(脑膜炎)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)(肺炎)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(肺炎)、类鼻疽假单胞菌(Pseudomonas pseudomallei)(肺炎)、鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mallei)(肺炎)、不动杆菌属(Acinetobacter)(肺炎)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、腔隙莫拉氏菌(Moraxella lacunata)、产碱杆菌属(Alkaligenes)、心杆菌属(Cardiobacterium)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(流感)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)(百日咳)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)(肺炎/发热)、肺炎军团菌(Legionella pneumonia)(军团病)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)(肺炎)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)(肺炎)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(结核(TB))、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)(TB)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)(肺炎)、星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)(肺炎)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(肺炎)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(猩红热)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎)、白喉棒状杆菌(Corynebacteria diphtheria)(白喉)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)(肺炎)。
炭疽的病原体是由炭疽杆菌产生的毒素。已经描述了针对保护剂(PA)(形成类毒素的三种肽之一)的中和抗体。另外两种多肽由致死因子(LF)和水肿因子(EF)组成。已经描述了抗PA中和抗体在针对炭疽的被动免疫中是有效的。参见例如美国专利7,442,373;R.Sawada-Hirai等人,J Immune Based Ther Vaccines.2004;2:5.(2004年5月12日在线)。另外已经描述和/或可产生其他抗炭疽毒素中和抗体。类似地,针对其他细菌和/或细菌毒素的中和抗体可用于产生如本文所述的AAV递送的抗病原体构建体。
其它感染性疾病可以由空气传播的真菌引起,该真菌包括例如曲霉属(Aspergillus species)物种、伞状犁头霉(Absidia corymbifera)、匍枝根霉(Rhixpusstolonifer)、毛霉(Mucor plumbeaus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasm capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、青霉菌(Penicillium)物种、干草小多孢菌(Micropolysporafaeni)、普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)、交替链格孢(Alternariaalternate)、枝孢属(Cladosporium)物种、长蠕孢属(Helminthosporium)和葡萄穗霉属(Stachybotrys)物种。
此外,被动免疫还可用于预防真菌感染(例如,脚癣)、癣,或病毒、细菌、寄生虫、真菌和其他可通过直接接触传播的病原体。此外,还有多种影响家庭宠物、牛和其他家畜以及其他动物的状况。例如,在狗身上,由犬鼻窦曲霉病引起的上呼吸道感染导致严重的疾病。在猫身上,如果不进行治疗,则源于鼻子的上呼吸道疾病或猫呼吸系统疾病综合征会导致发病和死亡。牛易于被感染性牛鼻气管炎(通常称为IBR或红鼻)感染,这是牛的急性、传染性病毒疾病。此外,牛易患牛呼吸道合胞病毒(BRSV),该病毒导致轻度至重度呼吸道疾病并可能损害对其他疾病的抵抗力。另外其他病原体和疾病对于本领域技术人员来说是显而易见的。参见例如美国专利5,811,524,其描述了抗呼吸道合胞病毒(RSV)中和抗体的产生。其中描述的技术适用于其他病原体。此类抗体可以完整使用或其序列(支架)经修饰以产生人工或重组中和抗体构建体。已经描述此类方法[参见例如WO 2010/13036;WO 2009/115972;WO 2010/140114]。
如本文所述的抗肿瘤免疫球蛋白可以靶向人表皮生长因子受体(HER),诸如HER2。例如,曲妥珠单抗(trastuzumab)是重组IgG1κ人源化单克隆抗体,其在基于细胞的测定中以高亲和力(Kd=5nM)选择性结合人表皮生长因子受体蛋白的细胞外结构域。市售产品在CHO细胞培养物中生产。参见例如www.drugbank.ca/drugs/DB00072。曲妥珠单抗轻链1和2以及重链1和2的氨基酸序列以及从曲妥珠单抗的x-射线结构研究获得的序列在该数据库中以登录号DB00072提供,该序列以引用方式并入本文。也参见212-Pb-TCMC-曲妥珠单抗[Areva Med,Bethesda,Md.]。另一种所关注的抗体包括例如帕妥珠单抗(pertuzumab),一种靶向人表皮生长因子受体2蛋白(HER2)的细胞外二聚化结构域(亚结构域II)的重组人源化单克隆抗体。其由分别具有448个和214个残基的两条重链和两条轻链组成。FDA于2012年6月8日批准。其重链和轻链的氨基酸序列例如在该数据库中以登录号DB06366的www.drugbank.ca/drugs/DB06366(同义词包括2C4、MOAB 2C4、单克隆抗体2C4和rhuMAb-2C4)中提供。除了HER2之外,可以选择其他HER靶标。
例如,MM-121/SAR256212是靶向HER3受体的全人单克隆抗体[Merrimack'sNetwork Biology],并且已报道其可用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌和卵巢癌。SAR256212是靶向HER3(ErbB3)受体的研究性全人单克隆抗体[Sanofi Oncology]。另一种抗Her3/EGFR抗体是描述为可用于头颈癌的RG7597[Genentech]。也可以使用另一种抗体,玛格妥昔单抗(margetuximab)(或MGAH22),靶向HER[MacroGenics]的下一代Fc优化的单克隆抗体(mAb)。
另选地,可以靶向其他人上皮细胞表面标志物和/或其他肿瘤受体或抗原。其他细胞表面标志物靶标的示例包括例如5T4、CA-125、CEA(例如,由拉贝珠单抗(labetuzumab)靶向)、CD3、CD19、CD20(例如,由利妥昔单抗(rituximab)靶向)、CD22(例如,由依帕珠单抗(epratuzumab)或维妥珠单抗(veltuzumab)靶向)、CD30、CD33、CD40、CD44、CD51(也是整联蛋白αvβ3)、CD133(例如,成胶质细胞瘤细胞)、CTLA-4(例如,用于治疗例如成神经细胞瘤的伊匹木单抗(Ipilimumab))、趋化因子(C-X-C基序)受体2(CXCR2)(在大脑的不同区域中表达;例如抗CXCR2(细胞外)抗体#ACR-012(Alomene Labs));EpCAM,成纤维细胞活化蛋白(FAP)[参见例如,WO 2012020006 A2,脑癌]、叶酸受体α(例如,儿童室管膜脑瘤、头颈癌)、成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)(参见等人,讨论用抗FGFR1抗体治疗癌症的WO2012125124A1)、FGFR2(参见例如,在WO2013076186A和WO2011143318A2中描述的抗体)、FGFR3(参见例如,在美国专利8,187,601和WO2010111367A1中描述的抗体)、FGFR4(参见例如,在WO2012138975A1中描述的抗FGFR4抗体)、肝细胞生长因子(HGF)(参见例如,WO2010119991A3中的抗体)、整联蛋白α5β1、IGF-1受体、神经节苷脂GD2(参见例如,在WO2011160119A2中描述的抗体)、神经节苷脂GD3、跨膜糖蛋白NMB(GPNMB)(与神经胶质瘤有关)等等以及抗体格巴妥木单抗(glembatumumab)(CR011)、粘蛋白、MUC1、磷脂酰丝氨酸(例如,由巴维昔单抗(bavituximab)靶向,Peregrine Pharmaceuticals,Inc])、前列腺癌细胞、PD-L1(例如,纳武单抗(nivolumab)(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538)、全人gG4例如,转移性黑素瘤]、血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)或CD140、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、腱生蛋白C、肿瘤坏死因子(TNF)受体(TRAIL-R2)、血管内皮生长因子(VEGF)-A(例如,由贝伐单抗(bevacizumab)靶向)和VEGFR2(例如,由雷莫芦单抗(ramucirumab)靶向)的靶标。
其他抗体及其靶标包括例如APN301(hu14.19-IL2),一种单克隆抗体[儿童恶性黑素瘤和成神经细胞瘤,Apeiron Biolgics,Vienna,Austria]。还参见例如单克隆抗体8H9,其已被描述为可用于治疗实体瘤,包括转移性脑癌。单克隆抗体8H9是对B7H3抗原具有特异性的小鼠IgG1抗体[United Therapeutics Corporation]。该小鼠抗体可以是人源化的。本文还可以使用靶向B7-H3和/或B7-H4抗原的其他免疫球蛋白构建体。另一种抗体是S58(抗GD2,成神经细胞瘤)。CotaraTM[Perregrince Pharmaceuticals]是描述用于治疗复发性成胶质细胞瘤的单克隆抗体。其他抗体可包括例如阿瓦斯汀(avastin)、非拉妥组单抗(ficlatuzumab)、medi-575和奥拉单抗(olaratumab)。还可以选择其他免疫球蛋白构建体或单克隆抗体用于本文。参见例如,Medicines in Development Biologics,2013年报告,第1-87页,PhRMA's Communications&Public Affairs Department.(202)835-3460的出版物,其以引用方式并入本文。
例如,免疫原可以选自多种病毒家族。需要针对其进行免疫应答的病毒家族的示例包括小核糖核酸病毒科,其包括导致约50%的普通感冒病例的鼻病毒属;肠道病毒属,其包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒和人肠道病毒诸如甲型肝炎病毒;以及口疮病毒属,其主要在非人动物中引起口蹄疫。在病毒的小核糖核酸病毒科中,靶抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4和VPG。另一个病毒家族包括杯状病毒科,其涵盖诺瓦克群病毒,该病毒是流行性胃肠炎的重要病原体。期望用于靶向抗原以在人类和非人类动物中诱导免疫应答的另一病毒家族是披膜病毒科,其包括α病毒属,其包括辛德比斯病毒(Sindbis viruses)、罗斯河病毒(RossRiver virus)以及委内瑞拉、东方和西方马脑炎,和风疹病毒属(rubivirus),包括风疹病毒。黄病毒科包括登革热病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒和蜱传脑炎病毒。其他靶抗原可以由丙型肝炎或冠状病毒科产生,其包括许多非人病毒,诸如感染性支气管炎病毒(家禽)、猪传染性胃肠病毒(猪)、猪凝血性脑脊髓炎病毒(猪)、猫感染性腹膜炎病毒(猫)、猫肠道冠状病毒(猫)、犬冠状病毒(狗),和人呼吸道冠状病毒,其可以引起普通感冒和/或非甲型、乙型或丙型肝炎。在冠状病毒科中,靶抗原包括E1(也称为M蛋白或基质蛋白)、E2(也称为S蛋白或刺突蛋白)、E3(也称为HE或血凝素-elterose)糖蛋白(不存在于所有冠状病毒中)或N(核衣壳)。还有其他抗原可以靶向棒状病毒科,其包括水泡病毒属(例如,水泡性口炎病毒)和狂犬病毒属(例如,狂犬病)。
在棒状病毒科中,合适的抗原可以来源于G蛋白或N蛋白。丝状病毒科(包括出血热病毒,诸如马堡病毒和埃博拉病毒)可以是合适的抗原来源。副粘病毒科包括副流感病毒1型、副流感病毒3型、牛副流感病毒3型、腮腺炎病毒属(腮腺炎病毒)、副流感病毒2型、副流感病毒4型、新城疫病毒(鸡)、牛瘟、麻疹病毒(包括麻疹和犬瘟热)和肺病毒(包括呼吸道合胞病毒)。流感病毒分类属于正粘病毒科,并且是合适的抗原来源(例如,HA蛋白、N1蛋白)。布尼亚病毒科包括布尼亚病毒属(加利福尼亚脑炎、拉克罗斯脑炎(La Crosse))、白蛉病毒属(立夫特山谷热)、汉坦病毒属(普马拉(puremala)是出血热病毒)、纳伊罗病毒属(nairovirus)(内罗毕羊病)和各种未命名的布尼亚病毒。沙拉病毒科提供了针对LCM和拉沙热病毒的抗原来源。呼肠弧病毒科包括呼肠弧病毒属、轮状病毒属(其引起儿童急性胃肠炎)、环状病毒属和科罗拉多蜱热病毒属(cultivirus)(科罗拉多蜱传热,莱邦博病(Lebombo)(人类)、马器质性脑病、蓝舌症)。
逆转录病毒科包括致癌病毒(oncorivirinal)亚科,该亚科涵盖此类人类和兽类疾病,如猫白血病病毒、HTLVI和HTLVII、慢病毒(包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马感染性贫血病毒和泡沫病毒)。在慢病毒属中,许多合适的抗原已经被描述并且可以容易地被选择作为靶标。合适的HIV和SIV抗原的示例包括但不限于gag、pol、Vif、Vpx、VPR、Env、Tat、Nef和Rev蛋白,以及它们的各种片段。例如,合适的Env蛋白片段可包括其长度例如为至少约8个氨基酸的任何亚基,诸如gp120、gp160、gp41或其更小片段。类似地,可以选择tat蛋白的片段。[参见美国专利5,891,994和6,193,981]。还参见D.H.Barouch等人,J.Virol.,75(5):2462-2467(2001年3月)和R.R.Amara等人,Science,292:69-74(2001年4月6日)中描述的HIV和SIV蛋白。在另一个示例中,HIV和/或SIV免疫原性蛋白或肽可以用于形成融合蛋白或其他免疫原性分子。参见例如,2001年8月2日公布的WO 01/54719和1999年4月8日公布的WO 99/16884中描述的HIV-1Tat和/或Nef融合蛋白和免疫方案。本公开不限于本文所述的HIV和/或SIV免疫原性蛋白或肽。此外,对这些蛋白质的多种修饰已经被描述或可以由本领域技术人员容易地进行。参见例如,在美国专利号5,972,596中描述的修饰的gag蛋白。
乳多空病毒科包括多瘤病毒亚科(BKU和JCU病毒)和乳头瘤病毒亚科(与癌症或乳头瘤的恶性进展有关)。腺病毒科包括引起呼吸系统疾病和/或肠炎的病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。细小病毒科包括猫细小病毒(猫肠炎)、猫泛白细胞减少症病毒(felinepanleucopeniavirus)、犬细小病毒和猪细小病毒。疱疹病毒科包括α疱疹病毒亚科,其涵盖单纯疱疹病毒属(HSVI、HSVII)、水痘病毒属(伪狂犬病、水痘带状疱疹),以及β疱疹病毒亚科,其包括巨细胞病毒属(HCMV、鼠巨细胞病毒),以及γ疱疹病毒亚科,其包括淋巴隐病毒属、EBV(伯基特淋巴瘤)、感染性鼻气管炎、马立克氏病(Marek's disease)病毒和蛛猴病毒属(rhadinovirus)。痘病毒科包括脊椎动物痘病毒亚科,其涵盖正痘病毒属(天花属(天花)和牛痘属(牛痘))、副痘病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒、兔痘病毒、猪痘病毒和昆虫痘病毒亚科。肝DNA病毒科包括乙肝病毒。一种可以作为合适抗原来源的未分类病毒是丁型肝炎病毒。其他病毒来源可以包括禽传染性法氏囊病病毒和猪呼吸道生殖道综合征病毒。α病毒科包括马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
抗体的其他病原性靶标可以包括例如感染人类和非人类脊椎动物或来自癌细胞或肿瘤细胞的细菌、真菌、寄生性微生物或多细胞寄生虫。细菌病原体的示例包括病原性革兰氏阳性球菌(pathogenic gram-positive cocci),包括肺炎球菌(pneumococci);葡萄球菌(staphylococci);和链球菌(streptococci)。病原性革兰氏阴性球菌(Pathogenicgram-negative cocci)包括脑膜炎球菌(meningococcus);淋球菌(gonococcus)。病原性肠道革兰氏阴性杆菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae);假单胞菌属(pseudomonas)、不动杆菌属(acinetobacteria)和艾肯菌属(eikenella);类鼻疽菌属(melioidosis);沙门氏菌属(salmonella);志贺氏菌属(shigella);嗜血杆菌属(haemophilus);莫拉氏菌属(moraxella);杜克嗜血杆菌(H.ducreyi)(其引起软下疳);布鲁氏菌属(brucella);土拉热弗朗西丝菌(Franisella tularensis)(其引起兔热病);耶尔森菌属(yersinia)(巴斯德菌属(pasteurella));念珠状链杆菌(streptobacillus moniliformis)和螺菌属(spirillum);革兰氏阳性杆菌包括单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes);红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae);白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)(白喉);霍乱菌;炭疽杆菌(B.anthracis)(炭疽);杜诺凡病菌(donovanosis)(腹股沟肉芽肿);和巴尔通体病菌(bartonellosis)。由病原性厌氧细菌引起的疾病包括破伤风;肉毒杆菌中毒(botulism);其他梭状芽孢杆菌病(clostridia);结核病;麻风病;和其他分枝杆菌病。病原性螺旋体病包括梅毒;密螺旋体病(treponematoses):雅司病(yaws)、品他病(pinta)和地方性梅毒;和钩端螺旋体病。由高等病原体细菌和病原性真菌引起的其他感染包括放线菌病(actinomycosis);诺卡氏菌病(nocardiosis);隐球菌病(cryptococcosis)、芽生菌病(blastomycosis)、组织胞浆菌病(histoplasmosis)和球孢子菌病(coccidioidomycosis);念珠菌病(candidiasis)、曲霉菌病(aspergillosis)和毛霉菌病(mucormycosis);孢子丝菌病(sporotrichosis);副球孢子菌病(paracoccidiodomycosis)、霉样真菌病(petriellidiosis)、球拟酵母病(torulopsosis)、足分枝菌病(mycetoma)和着色真菌病(chromomycosis);和皮真菌病(dermatophytosis)。立克次氏体(Rickettsial)感染包括斑疹伤寒、洛矶山斑疹热(Rocky Mountain spottedfever)、Q热和立克次氏体痘(Rickettsialpox)。支原体和衣原体感染的示例包括:肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae);性病性淋巴肉芽肿;鹦鹉热;和围产期衣原体感染。病原性真核生物包括病原性原生动物和蠕虫并且由其产生的感染包括:阿米巴病(amebiasis);疟疾;利什曼病;锥虫病;弓形虫病;卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii);倒睫症(Trichans);刚地弓形虫病(Toxoplasma gondii);巴贝虫病(babesiosis);贾第鞭毛虫病(giardiasis);旋毛虫症(trichinosis);丝虫病(filariasis);血吸虫病(schistosomiasis);线虫病(nematode);吸虫(trematode)或吸虫(fluke)病;和绦虫(cestode)(绦虫(tapeworm))感染。
许多这些生物体和/或由其产生的毒素已经通过疾病控制中心(Centers forDisease Control)[(CDC),美国健康与人类服务部门(Department of Health and HumanServices,USA)]鉴定为具有用于生物侵袭的可能性的药剂。例如,这些生物药剂中的一些包括炭疽杆菌(炭疽)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)及其毒素(肉毒杆菌中毒)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)、重型天花(天花)、土拉弗朗西斯菌(兔热病),和病毒性出血热[丝状病毒(例如,埃博拉病毒、马堡病毒],和沙粒病毒[例如,拉沙病毒、马休波病毒]),所有这些生物药剂目前均分类为A类药剂;贝氏柯克斯体(Coxiella burnetti)(Q热);布鲁氏菌属物种(布鲁氏菌病(brucellosis))、鼻疽伯克氏菌(Burkholderia mallei)(鼻疽)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)(类鼻疽)、蓖麻及其毒素(蓖麻毒素)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)及其毒素(ε毒素)、葡萄球菌属物种及其毒素(肠毒素B)、鹦鹉热衣原体(鹦鹉热)、水安全性威胁(例如,霍乱弧菌(Vibriocholerae)、小球隐孢子虫(Crytosporidium parvum))、斑疹伤寒(普氏立克氏体(Richettsia powazekii)),和病毒性脑炎(α病毒,例如委内瑞拉马脑炎;东方马脑炎;西方马脑炎);所有这些目前均分类为B类药剂;和立百病毒(Nipan virus)和汉坦病毒,它们目前被分类为C类药剂。此外,在未来可以出于此类目的鉴定和/或使用如此分类或不同分类的其他生物体。将容易理解的是,本文所述的病毒载体和其他构建体可用于靶向来自这些生物体、病毒、它们的毒素或其他副产物的抗原,这将预防和/或治疗感染或用这些生物药剂的其他不良反应。
如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段、用于治疗或预防病毒感染的ceDNA载体的有效或治疗有效剂量是指如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的量,该量足以减轻所治疗的受试者的感染的一种或多种体征和/或症状,无论是通过诱导此类体征和/或症状的消退或消除,还是通过抑制此类体征和/或症状的进展。剂量可以根据待施用的受试者的年龄和体型、目标疾病、病状、施用途径等而变化。在本公开的一个实施方案中,用于治疗或预防例如成年人类受试者的病毒感染的本公开的抗体或其抗原结合片段的有效或治疗有效剂量为约0.01mg/kg至约200mg/kg,例如,至多约150mg/kg。在本公开的一个实施方案中,剂量为至多约10.8克或11克(例如,约1克、2克、3克、4克、5克、6克、7克、8克、9克、10克或11克)。根据疾病或感染的严重程度,可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施方案中,如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以以初始剂量,随后以一个或多个二次剂量施用。在某些实施方案中,初始剂量之后可以施用第二剂量或多个后续剂量的抗体或其抗原结合片段,其量可以与初始剂量的量大致相同或更少,其中后续剂量间隔至少1天至3天;至少一周、至少2周;至少3周;至少4周;至少5周;至少6周;至少7周;至少8周;至少9周;至少10周;至少12周;或至少14周。
施用ceDNA载体的受试者可能患有病毒感染,例如流感感染,或倾向于发生感染。倾向于发生感染的受试者或可能处于感染(例如,冠状病毒或流感病毒)的风险较高的受试者包括由于自身免疫疾病而免疫系统受损的受试者、接受免疫抑制疗法的受试者(例如,在器官移植后)、患有人免疫缺陷综合征(HIV)或获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的受试者、具有消耗或破坏白细胞的贫血症形式的受试者、接受放射或化学疗法的受试者或患有炎性病症的受试者。另外,非常年轻(例如,5岁或更小)或年老(例如,65岁或更老)的受试者的风险增加。此外,受试者可能由于接近疾病的爆发而处于感染病毒感染的风险中,例如,受试者居住在人口稠密的城市中或非常接近已确诊或疑似感染病毒的受试者,或就业选择,例如,医院工作者、药物研究人员、前往感染地区的旅行者或飞行常客。
本公开还涵盖向处于疾病或病症例如病毒感染风险的受试者预防性施用如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体,以便预防此类感染。“预防(Prevent/preventing)”意指向受试者施用如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体,以抑制受试者体内的疾病或感染(例如,病毒感染)的表现,其中如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体在以有效或治疗有效量或剂量施用于受试者时是有效的。
根据一些实施方案,受试者中病毒感染的体征或症状是受试者体内病毒的存活或增殖,例如,如通过病毒滴度测定(例如,含胚鸡蛋中的冠状病毒增殖或冠状病毒刺突蛋白测定)所确定。本文讨论了病毒感染的其他体征和症状。
如上所述,根据一些实施方案,受试者可以是非人动物,并且本文讨论的抗体和抗原结合片段可以在兽医背景下用于治疗和/或预防非人动物(例如,猫、狗、猪、牛、马、山羊、兔、绵羊等)的疾病。
本公开提供了一种用于治疗或预防有需要的受试者(例如,人)的病毒感染(例如,冠状病毒感染)或用于诱导病毒感染的至少一种体征或症状的消退或消除或抑制其进展的方法,该体征或症状诸如:发烧或感觉发烧/发冷;咳嗽;喉咙痛;流鼻涕或鼻塞;打喷嚏;肌肉或身体疼痛;头痛;疲劳(疲倦);呕吐;腹泻;呼吸道感染;胸部不适;呼吸急促;支气管炎;和/或肺炎,该体征或症状继发于病毒感染,该方法通过向受试者施用治疗有效量的如本文所述的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体来进行。
A.离体治疗
根据一些实施方案,从受试者去除细胞,将如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体引入其中,并且然后将细胞替换回到受试者中。从受试者取出细胞进行离体处理、然后再引回到受试者中的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号5,399,346;其公开内容全文并入本文)。另选地,将ceDNA载体引入另一个受试者的细胞,引入培养细胞中,或引入任何其它适合来源的细胞中,并将细胞施用于有需要的受试者。
经如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体转导的细胞优选地以“治疗有效量”与药物载剂组合施用于受试者。所属领域的技术人员将了解,治疗效果不必是完全的或治愈的,只要给受试者提供了一些益处即可。
根据一些实施方案,如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以编码如本文所述的将在细胞中体外、离体或体内产生的抗体及其抗原结合片段。例如,与本文所述的ceDNA载体在如本文所讨论的治疗方法中的使用形成相比,根据一些实施方案,可以将用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体引入经培养细胞中并从细胞分离所表达的抗体及其抗原结合片段,例如用于产生抗体和融合蛋白。根据一些实施方案,包含如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的培养细胞可以用于商业上生产抗体或融合蛋白,例如充当小规模或大规模生物制造抗体或融合蛋白的细胞源。在另选的实施方案中,将如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体引入宿主非人类受试者的细胞中,用于体内产生抗体或融合蛋白,包括小规模生产以及商业大规模抗体及其抗原结合片段生产。
如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以用于兽医学与医学应用中。如上所述的离体基因递送方法的合适受试者包括禽类(例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和野鸡)和哺乳动物(例如人、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬和兔),以哺乳动物为优选。人类受试者是最优选的。人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年和成人。
B.剂量范围
本文提供了治疗方法,该方法包括向受试者施用有效量的包含如本文所述的编码抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的组合物。
可以任选地采用体内和/或体外分析来帮助鉴定使用的最优剂量范围。配制物中准备采用的精确剂量还将取决于施用途径和病状严重度,并应根据所属领域的普通技术人员的判断和每个受试者的情况来决定。有效剂量可以从衍生自体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线外推。
如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体是以足以转染期望组织的细胞和足以提供足够水平的基因转移和表达而无不当副作用的量施用。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于上文在“施用”部分中所述的那些途径,例如直接递送至选定的器官(例如门静脉内递送至肝脏)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、肿瘤内和其它肠胃外施用途径。如果需要,施用途径可以组合。
实现特定“治疗效果”所需的如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的剂量将基于若干因素而变化,该因素包括但不限于:核酸施用途径、实现治疗效果所需的基因或RNA表达水平、所治疗的特定疾病或病患以及基因、RNA产物或所产生的所表达的蛋白的稳定性。所属领域的技术人员可以基于前述的因素以及所属领域中熟知的其它因素容易地确定治疗患有特定疾病或病患的患者的ceDNA载体剂量范围。
剂量方案可以调整,以提供最优的治疗应答。例如,可以重复施用寡核苷酸,例如可以每天施用若干剂,或者可以根据治疗情况的紧急程度的指示,按比例减少剂量。所属领域的普通技术人员将能够容易地确定主题寡核苷酸的适当剂量和施用计划,无论所述寡核苷酸是将施用于细胞还是受试者。
临床使用的“治疗有效剂量”将落在相对较宽的范围内,该范围可以通过临床试验确定并将取决于特定应用(例如,神经细胞将需要很少的量,而全身性注射将需要大量)。例如,对于体内直接注射到人类受试者的骨骼肌或心肌中,治疗有效剂量将为约1μg至100g左右的ceDNA载体。如果使用外泌体或微粒来递送ceDNA载体,那么可以通过实验确定治疗有效剂量,但预计递送1μg至约100g的载体。此外,治疗有效剂量是表达足量的转基因、从而对受试者起作用的ceDNA载体的量,其使得疾病的根据一些或多种症状减少,但不产生显著的脱靶或显著的不良副作用。根据一些实施方案,“治疗有效量”是所表达的抗体及其抗原结合片段的量,该量足以使指定疾病症状的减轻产生统计显著的可测量变化。指定的ceDNA载体组合物的此类有效量能够在临床试验以及动物研究中加以调整。
对于体外转染,递送到细胞(1×106个细胞)的如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的有效量将为约0.1μg到100μg、优选1μg到20μg并且更优选1μg到15μg或8μg到10μg ceDNA载体。ceDNA载体越大,需要的剂量越高。如果使用外泌体或微粒,那么可以通过实验确定有效的体外剂量,但意图递送大致相同量的ceDNA载体。
根据一些实施方案,递送到受试者细胞的抗体或其抗原结合片段的量在1μg-10μg之间,例如,在1μg-9μg、1μg-8μg、1μg-7μg、1μg-6μg、1μg-5μg、2μg-9μg、2μg-8μg、2μg-7μg、2μg-6μg、2μg-5μg、3μg-9μg、3μg-8μg、3μg-7μg、3μg-6μg、3μg-5μg、4μg-9μg、4μg-8μg、4μg-7μg、4μg-6μg、4μg-5μg、5μg-10μg、5μg-9μg、5μg-8μg、5μg-7μg、5μg-6μg、6μg-10μg、6μg-9μg、6μg-8μg、6μg-7μg、7μg-10μg、7μg-9μg、7μg-8μg、8μg-10μg、8μg-9μg、9μg-10μg之间或10μg或更多μg。
治疗可以涉及施用单次剂量或多次剂量。根据一些实施方案,可以向受试者施用超过一个剂量;实际上,可以根据需要施用多个剂量,因为ceDNA载体由于没有病毒衣壳而不会引发抗衣壳的宿主免疫应答。因此,所属领域的技术人员可以容易地确定适当剂量次数。施用的剂数可以例如1剂-100剂,优选地2剂-20剂的量级。
在不希望受任何特定理论束缚的情况下,缺乏通过施用如本公开所描述的ceDNA载体引发的典型抗病毒免疫应答(即,不存在衣壳组分)允许用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体在多种场合施用于宿主。根据一些实施方案,将核酸递送到受试者的次数在2次至10次的范围内(例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次)。根据一些实施方案,向受试者递送ceDNA载体超过10次。
根据一些实施方案,每个日历天(例如24小时时间段)向受试者施用一剂量的如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体不超过一次。根据一些实施方案,每2个、3个、4个、5个、6个或7个日历日向受试者施用一剂量ceDNA载体不超过一次。根据一些实施方案,每个日历周(例如7个日历天)向受试者施用一剂量的如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体不超过一次。根据一些实施方案,ceDNA载体的剂量施用于受试者,每两周不超过一次(例如两个日历周时间段为一次)。根据一些实施方案,每日历月向受试者施用一剂量的ceDNA载体不超过一次(例如30个日历日为一次)。根据一些实施方案,每六个日历月向受试者施用一剂量的ceDNA载体不超过一次。根据一些实施方案,每个日历年(例如365天或闰年366天)向受试者施用一剂量的ceDNA载体不超过一次。
根据一些实施方案,在第0天施用一剂量的ceDNA载体。在第0天进行初始治疗后,可以在用ceDNA载体进行初始治疗后约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周或约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年、约12年、约13年、约14年、约15年、约16年、约17年、约18年、约19年、约20年、约21年、约22年、约23年、约24年、约25年、约26年、约27年、约28年、约29年、约30年、约31年、约32年、约33年、约34年、约35年、约36年、约37年、约38年、约39年、约40年、约41年、约42年、约43年、约44年、约45年、约46年、约47年、约48年、约49年或约50年内执行第二次给药(重新给药)。
根据一些实施方案,重新给药治疗性核酸引起治疗性核酸的表达增加。根据一些实施方案,与第一剂量之后治疗性核酸的表达相比,在重新给药之后治疗性核酸的表达在重新给药治疗性核酸之后增加高于约0.5倍到约10倍、约1倍到约5倍、约1倍到约2倍、或约0.5倍、约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍。
在具体实施方案中,超过一次施用(例如两次、三次、四次或更多次施用)如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以用于在不同间隔期内,例如每天、每周、每月、每年等实现所期望的抗体表达水平。
根据一些实施方案,由如本文所公开的ceDNA载体编码的治疗抗体及其抗原结合片段可以通过调节开关、可诱导或可抑制型启动子进行调节以使得其在受试者中表达至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少12个月/一年、至少2年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年、至少30年、至少40年、至少50年或更长时间。根据一些实施方案,通过在预定或期望的间隔时间反复施用本文所述的ceDNA载体能够实现表达。
如本文所描述,根据一些实施方案,表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体可以与额外化合物组合施用。
C.单位剂型
根据一些实施方案,包含如本文所公开的用于表达抗体及其抗原结合片段的ceDNA载体的药物组合物可以便利地以单位剂型呈现。单位剂量通常将适于药物组合物的一种或多种特定施用途径。根据一些实施方案,单位剂量适合于静脉内、肌肉内或皮下施用。根据一些实施方案,单位剂量适合于通过吸入施用。根据一些实施方案,单位剂量适合于通过气化器施用。根据一些实施方案,单位剂量适合于通过喷雾器施用。根据一些实施方案,单位剂量适合于通过气雾器施用。根据一些实施方案,单位剂量适合于口服施用、经颊施用或舌下施用。
D.使用ceDNA载体测试成功的基因表达
所属领域中众所周知的测定可以用于测试ceDNA载体对抗体及其抗原结合片段的基因递送的效率,该测试可以在体外和体内模型中进行。所属领域的技术人员可以通过测量抗体及其抗原结合片段的mRNA和蛋白质水平(例如逆转录PCR、蛋白质印迹分析,和酶联免疫吸附测定(ELISA))来评估ceDNA对抗体及其抗原结合片段的表达水平。根据一些实施方案,ceDNA包含可以用于评估抗体及其抗原结合片段表达的报告蛋白,例如通过利用荧光显微术或发光读盘器检查报告蛋白的表达。对于体内应用,蛋白质功能测定可以用于测试既定抗体及其抗原结合片段的功能性以确定基因表达是否成功进行。熟练的技术人员能够确定最佳的测试来体外或体内测量ceDNA载体所表达的抗体及其抗原结合片段的功能性。
本文预期在细胞或受试者中ceDNA载体对抗体及其抗原结合片段的基因表达的效应可以持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少四个月、至少5个月、至少六个月、至少10个月、至少12个月、至少18个月、至少2年、至少5年、至少10年、至少20年,或可以永久。
本申请全文中引用的所有专利和其他出版物(包括参考文献、授权的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)以引用的方式明确地并入本文,以描述和公开例如在此类出版物中描述的可以与本文所述的技术结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。关于这一点,任何内容都不应被解释为承认发明者无权借助先前公开或出于任何其它原因而提前所述公开。关于这些文件的日期的所有声明或关于内容的陈述都是基于申请人可获得的信息,并且不等同于承认这些文件的日期或内容的正确性。
实施例
通过说明而非限制的方式提供了以下实施例。所属领域的普通技术人员将了解,可以从本文所述的任何野生型或修饰ITR中构建ceDNA载体,并且以下示例性方法可以用于构建和评估这类ceDNA载体的活性。虽然这些方法以某些ceDNA载体为例,但它们适用于符合描述的任何ceDNA载体。
实施例1:使用基于昆虫细胞的方法构建ceDNA载体
使用多核苷酸构建体模板生产ceDNA载体描述于PCT/US18/49996的实施例1中,其通过引用整体并入本文。例如,用于生成本公开的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以为ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒。不受理论的限制,在许可宿主细胞中,在存在例如Rep存在下,具有两个对称ITR和表达构建体的多核苷酸构建体模板进行复制以产生ceDNA载体,其中该ITR中的至少一个ITR相对于野生型ITR序列被修饰。ceDNA载体产生经历两个步骤:首先,经由Rep蛋白从模板主链(例如,ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板;以及其次,切除的ceDNA载体的Rep介导的复制。
产生ceDNA载体的一种示例性方法是从如本文所描述的ceDNA-质粒产生。参照图1A和1B,每个ceDNA质粒的多核苷酸构建体包括经修饰左ITR和经修饰右ITR,在ITR序列之间有以下序列:(i)增强子/启动子;(ii)转基因的克隆位点;(iii)转录后应答元件(例如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE));以及(iv)多腺苷酰化信号(例如来自牛生长激素基因(BGHpA))。在每个组分之间还引入了独特的限制性核酸内切酶识别位点(R1-R6)(图1A和图1B中所示),以便于将新的遗传组分引入构建体中的特定位点。将R3(PmeI)GTTTAAAC(SEQID NO:123)和R4(PacI)TTAATTAA(SEQ ID NO:124)酶位点工程改造成克隆位点以引入转基因的开放阅读框。将这些序列克隆到从ThermoFisher Scientific获得的pFastBac HT B质粒中。
ceDNA-杆粒的产生:
依循根据制造商说明书的方案,用测试或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞,赛默飞世尔)。诱导DH10Bac细胞中质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组,以生成重组ceDNA-杆粒。通过以下方法来选择重组杆粒:在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上利用抗生素基于大肠杆菌中的蓝白筛选来筛选阳性选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补),以选择转化体并维持杆粒和转座酶质粒。挑选出由破坏β-半乳糖苷指示基因的易位所造成的白色菌落,并在10ml培养基中进行培养。
从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒,并使用FugeneHD将其转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在25℃处在T25烧瓶内的50ml培养基中进行培养。四天后,从细胞去除培养基(含有P0病毒),将培养基通过0.45μm过滤器过滤,从细胞或细胞碎片中分离出感染性杆状病毒粒子。
任选地,第一代杆状病毒(P0)通过在50ml到500ml培养基中感染原初Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞在回转式振荡温育箱的悬浮培养液中、在130rpm下、在25℃处维持,监测细胞直径和存活率,直到细胞达到18nm-19nm直径(从14nm-15nm的原初直径)和约4.0E+6个细胞/mL的密度。感染后第3天到第8天,利用离心去除细胞和残骸、然后通过0.45μm过滤器过滤来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。
收集包括测试构建体的ceDNA-杆状病毒,并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体地说,用P1杆状病毒按下列稀释度治疗4×20ml 2.5E+6个细胞/ml的Sf9细胞培养物:1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000,并且在25℃-27℃下温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及持续4天到5天的每天的细胞活力的变化来测定感染性。
如PCT/US18/49996的图8A中所公开的“Rep质粒”(所述文献以全文引用的方式并入本文中)在pFASTBACTM-Dual表达载体(赛默飞世尔)中产生,所述表达载体包含Rep78(SEQID NO:131或133)和Rep52(SEQ ID NO:132)或Rep68(SEQ ID NO:130)和Rep40(SEQ ID NO:129)。依循制造商提供的方案,将Rep-质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞(赛默飞世尔))中。诱导DH10Bac细胞中Rep-质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组,以生成重组杆粒(“Rep-杆粒”)。通过阳性选择来选择重组杆粒,该阳性选择包括在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上在大肠杆菌中进行蓝白筛选(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)。挑选分离的白色菌落,并接种到10ml选择培养基(含卡那霉素、庆大霉素(gentamicin)、四环素的LB培养液)中。从大肠杆菌中分离出重组杆粒(Rep-杆粒),并将Rep-杆粒转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中,以产生感染性杆状病毒。
将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天,并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地,第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染原生Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增并且在50ml到500ml培养基中培养。在感染后3天与8天之间,通过离心或过滤或其它分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体地说,用P1杆状病毒按下列稀释度治疗四个20mL的2.5x106个细胞/mL的Sf9细胞培养物:1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000,并温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4天到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
ceDNA载体产生和表征
参考图4B,然后将含有以下项中任一种的Sf9昆虫细胞培养基分别以1:1000和1:10,000的比率添加到新鲜的Sf9细胞培养物(2.5E+6个细胞/ml,20ml)中:(1)含有ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒的样品和(2)上述Rep杆状病毒。然后将细胞在25℃处以130rpm培养。共同感染4天到5天后,检测细胞直径和活力。当细胞直径达到18nm-20nm并且活力为约70%-80%时,将细胞培养物离心,去除培养基,并收集细胞团粒。首先将细胞团粒悬浮于适量的水性介质,即水或缓冲液中。使用凯杰(Qiagen)MIDIPLUSTM纯化方案(凯杰,每个柱处理0.2mg细胞团粒质量)从细胞中分离并纯化ceDNA载体。
初始基于260nm下的UV吸光度,测定从Sf9昆虫细胞产生和纯化的ceDNA载体的产量。
可以通过如图4D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体,其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后,对比天然凝胶,变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带;以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
通过用限制性核酸内切酶消化从共同感染的Sf9细胞(如本文所述)获得的DNA,进一步分析分离的ceDNA载体的结构,该限制性核酸内切酶是针对以下条件选择的:a)在ceDNA载体内仅存在单个切割位点;和b)所得到的片段足够大,以便在0.8%变性琼脂糖凝胶上进行分级分离时被清楚看到(>800bp)。如图4D和图4E所示,具有非连续结构的线性DNA载体以及具有线性和连续结构的ceDNA载体可以通过它们反应产物的大小来区分-例如,预计具有非连续结构的DNA载体将产生1kb和2kb片段,而具有连续结构的非衣壳化载体预计产生2kb和4kb片段。
因此,为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价封闭端的,将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化,优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后,线性、非共价封闭的DNA将以1000bp和2000bp大小分解,而共价封闭的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp),这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外,由于多聚体DNA载体的端对端连接,对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图4D)。
如本文所用,短语“通过在天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA载体的分析”是指一种通过执行限制性核酸内切酶消化、随后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA封闭端的分析。后面是一种这样的示例性分析,尽管所属领域的普通技术人员将了解,对这个实施例可以进行许多所属领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶,其将生成DNA载体长度的大致1/3x和2/3x的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的色带解析。变性之前,重要的是从样品中去除缓冲液。Qiagen PCR清洁试剂盒或脱盐“离心柱”,例如GE HEALTHCARE ILUSTRATM MICROSPINTM G-25柱,是核酸内切酶消化的一些本领域已知的选项。该分析包括例如:i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA;2)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒,用蒸馏水洗脱;iii)添加10x变性溶液(10x=0.5MNaOH、10mM EDTA),添加10X染料,不进行缓冲,并与通过添加10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起,在预先与1mM EDTA和200mM NaOH一起培育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8%-1.0%凝胶上进行分析,并在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑动凝胶。所属领域的普通技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后,将凝胶排出并在1x TBE或TAE中进行中和,并转移到蒸馏水或含1x SYBR金的1x TBE/TAE中。然后,可以用例如赛默飞世尔的金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000×浓缩液)和辐射荧光(蓝色)或UV(312nm)使带可视化。
生成的ceDNA载体的纯度可以使用任何所属领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法,通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较,能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。例如,如果基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带,那么存在1μg ceDNA载体,且ceDNA载体是总UV吸收材料的25%。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入作图-例如,如果总ceDNA载体是8kb,而切下的比较带为2kb,那么带强度将按总输入的25%绘制,在这种情况下,对于1.0μg输入,将为.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线,然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量,然后可以用于测定ceDNA载体所表示的总输入的百分比或纯度百分比。
出于比较的目的,实例1描述了使用基于昆虫细胞的方法和多核苷酸构建体模板生产ceDNA载体,并且还描述在PCT/US18/49996的实例1中,其通过引用整体并入本文。例如,用于根据实施例1生成本公开的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以为ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒。不受理论的限制,在许可宿主细胞中,在存在例如Rep存在下,具有两个对称ITR和表达构建体的多核苷酸构建体模板进行复制以产生ceDNA载体,其中该ITR中的至少一个ITR相对于野生型ITR序列被修饰。ceDNA载体产生经历两个步骤:首先,经由Rep蛋白从模板主链(例如,ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板;以及其次,切除的ceDNA载体的Rep介导的复制。
在使用昆虫细胞的方法中产生ceDNA载体的示例性方法是通过如本文所述的ceDNA-质粒。参照图1A和1B,每个ceDNA质粒的多核苷酸构建体包括经修饰左ITR和经修饰右ITR,在ITR序列之间有以下序列:(i)增强子/启动子;(ii)转基因的克隆位点;(iii)转录后应答元件(例如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE));以及(iv)多腺苷酰化信号(例如来自牛生长激素基因(BGHpA))。在每个组分之间还引入了独特的限制性核酸内切酶识别位点(R1-R6)(图1A和图1B中所示),以便于将新的遗传组分引入构建体中的特定位点。将R3(PmeI)GTTTAAAC(SEQ ID NO:123)和R4(PacI)TTAATTAA(SEQ ID NO:124)酶位点工程改造成克隆位点以引入转基因的开放阅读框。将这些序列克隆到从ThermoFisher Scientific获得的pFastBac HT B质粒中。
ceDNA-杆粒的产生:
依循根据制造商说明书的方案,用测试或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞,赛默飞世尔)。诱导DH10Bac细胞中质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组,以生成重组ceDNA-杆粒。通过以下方法来选择重组杆粒:在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上利用抗生素基于大肠杆菌中的蓝白筛选来筛选阳性选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补),以选择转化体并维持杆粒和转座酶质粒。挑选出由破坏β-半乳糖苷指示基因的易位所造成的白色菌落,并在10ml培养基中进行培养。
从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒,并使用FugeneHD将其转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在25℃处在T25烧瓶内的50ml培养基中进行培养。四天后,从细胞去除培养基(含有P0病毒),将培养基通过0.45μm过滤器过滤,从细胞或细胞碎片中分离出感染性杆状病毒粒子。
任选地,第一代杆状病毒(P0)通过在50ml到500ml培养基中感染原初Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞在回转式振荡温育箱的悬浮培养液中、在130rpm下、在25℃处维持,监测细胞直径和存活率,直到细胞达到18nm-19nm直径(从14nm-15nm的原初直径)和约4.0E+6个细胞/mL的密度。感染后第3天到第8天,利用离心去除细胞和残骸、然后通过0.45μm过滤器过滤来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。
收集包括测试构建体的ceDNA-杆状病毒,并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体地说,用P1杆状病毒按下列稀释度治疗4×20ml 2.5E+6个细胞/ml的Sf9细胞培养物:1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000,并且在25℃-27℃下温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4天到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
使“Rep质粒”在pFASTBACTM-Dual表达载体(赛默飞世尔)中产生,所述表达载体包含Rep78(SEQ ID NO:131或133)或Rep68(SEQ ID NO:130)和Rep52(SEQ ID NO:132)或Rep40(SEQ ID NO:129)。依循制造商提供的方案,将Rep-质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞(赛默飞世尔))中。诱导DH10Bac细胞中Rep-质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组,以生成重组杆粒(“Rep-杆粒”)。通过阳性选择来选择重组杆粒,该阳性选择包括在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上在大肠杆菌中进行蓝白筛选(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)。挑选分离的白色菌落,并接种到10ml选择培养基(含卡那霉素、庆大霉素(gentamicin)、四环素的LB培养液)中。从大肠杆菌中分离出重组杆粒(Rep-杆粒),并将Rep-杆粒转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中,以产生感染性杆状病毒。
将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天,并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地,第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染原生Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增并且在50ml到500ml培养基中培养。在感染后3天与8天之间,通过离心或过滤或其它分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体地说,用P1杆状病毒按下列稀释度治疗四个20mL的2.5×106个细胞/mL的Sf9细胞培养物:1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000,并温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4天到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
ceDNA载体产生和表征
然后将Sf9昆虫细胞培养基分别按照1:1000和1:10,000的比率添加到新制的Sf9细胞培养基(2.5E+6个细胞/毫升,20ml)中,该昆虫细胞培养基含有:(1)含有ceDNA杆粒或ceDNA杆状病毒的样品;和(2)上述Rep杆状病毒。然后将细胞在25℃处以130rpm培养。共同感染4天到5天后,检测细胞直径和活力。当细胞直径达到18nm-20nm并且活力为约70%-80%时,将细胞培养物离心,去除培养基,并收集细胞团粒。首先将细胞团粒悬浮于适量的水性介质,即水或缓冲液中。使用凯杰(Qiagen)MIDI PLUSTM纯化方案(凯杰,每个柱处理0.2mg细胞团粒质量)从细胞中分离并纯化ceDNA载体。
初始基于260nm下的UV吸光度,测定从Sf9昆虫细胞产生和纯化的ceDNA载体的产量。使用实施例5中所述的电泳方法能够评估所纯化的ceDNA载体的正确封闭端构型。
实施例2:通过从双链DNA分子中切除来产生合成ceDNA
ceDNA载体的合成产生描述于2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122的实施例2-实施例6中,该国际申请通过引用整体并入本文。使用合成方法产生ceDNA载体的一种示例性方法涉及切除双链DNA分子。简而言之,可以使用双链DNA构建体产生ceDNA载体,例如,参见PCT/US19/14122的图7A-8E。根据一些实施方案,双链DNA构建体是ceDNA质粒,例如参见例如2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图6)。
根据一些实施方案,制备ceDNA载体的构建体包含如本文所述的调节开关。
出于说明的目的,实施例2描述了ceDNA载体的产生,该ceDNA载体是使用此方法生成的示例性封闭端DNA载体。然而,虽然这个实例中以ceDNA载体为例来说明产生封闭端DNA载体的体外合成产生方法,所述方法通过如本文所描述,切除包含ITR和表达盒(例如核酸序列)的双链多核苷酸、接着将游离3'和5'端接合来进行,但所属领域的普通技术人员了解,人们可以如上所说明修饰双链DNA多核苷酸分子以使得产生任何所期望的封闭端DNA载体,包括但不限于狗骨状DNA、哑铃状DNA等等。能够利用实施例2中所述的合成产生方法产生的用于产生抗体或融合蛋白的示例性ceDNA载体论述于标题为“III.通用ceDNA载体”的章节中。由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白描述于标题为“IIC.由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白”的章节中。
该方法包括(i)从双链DNA构建体中切除编码表达盒的序列和(ii)在一个或多个ITR处形成发夹和(iii)通过接合(例如通过T4 DNA连接酶)将自由的5'与3'端连接。
双链DNA构建体按5'到3'的次序包含:第一限制性核酸内切酶位点;上游ITR;表达盒;下游ITR;和第二限制性核酸内切酶位点。然后使双链DNA构建体与一种或多种限制性核酸内切酶接触以在两个限制性核酸内切酶位点处生成双链断裂。一种核酸内切酶可以靶向两个位点,或者每个位点可以被不同的核酸内切酶靶向,只要限制性位点不存在于ceDNA载体模板中。这从双链DNA构建体的其余部分切除了限制性核酸内切酶位点之间的序列(参见PCT/US19/14122的图9)。接合后,形成封闭端DNA载体。
该方法中使用的一个或两个ITR可以是野生型ITR。也可以使用经修饰的ITR,其中所述修饰能够包括形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中的野生型ITR中的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代(参见例如PCT/US19/14122的图6-8和10;图11B),并且可以具有两个或更多个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图6-8;图11B)或单个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图10A-10B、图11B)。通过对现有寡核苷酸进行基因修饰或通过重新生物学和/或化学合成能够生成发夹环经修饰ITR。
在一个非限制性实施例中,左和右ITR-6(SEQ ID NO:111和112)在B-B'和C-C'臂中包括来自AAV2的野生型ITR的40个核苷酸的缺失。经修饰ITR中剩余的核苷酸预测可形成单个发夹结构。展开结构的吉布斯自由能(Gibbs free energy)是约-54.4千卡/摩尔。还可以对ITR产生其他修饰,包括功能Rep结合位点或Trs位点的任选缺失。
实例3:通过寡核苷酸构建来产生ceDNA
使用涉及组装不同寡核苷酸的合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实施例3中,其中ceDNA载体是通过合成5'寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸并且将ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合来产生。PCT/US19/14122的图11B显示了将5'ITR寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合的示例性方法。
如本文所公开,ITR寡核苷酸能够包含WT-ITR(参见例如图3A、图3C),或经修饰的ITR(参见例如图3B和图3D)。(还参见例如PCT/US19/14122的图6A、图6B、图7A和图7B,该文献全文并入本文中)。示例性ITR寡核苷酸包括但不限于SEQ ID NO:134-145(参见例如PCT/US19/14122的表7)。经修饰ITR可以包含形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中相对于野生型ITR的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代。用于无细胞合成的包括如本文所述的WT-ITR或mod-ITR的ITR寡核苷酸可通过遗传修饰或生物学和/或化学合成生成。如本文所讨论的,实施例2和实施例3中的ITR寡核苷酸可以包括如本文所讨论的对称或非对称构型的WT-ITR或经修饰ITR(mod-ITR)。
实施例4:经由单链DNA分子产生ceDNA
PCT/US19/14122的实例4中提供了使用合成方法产生ceDNA载体的另一个示例性方法,所述方法使用包括两个有义ITR的单链线性DNA,所述有义ITR侧接于有义表达盒序列并共价连接到两个反义ITR,所述反义ITR侧接于反义表达盒,然后将其单链线性DNA的末端接合,以形成封闭端单链分子。一个非限制性实施例包含合成和/或产生单链DNA分子、使该分子的各部分退火以形成具有二级结构的一个或多个碱基对区域的单一线性DNA分子,然后使自由的5'与3'端彼此接合以形成封闭的单链分子。
用于产生ceDNA载体的示范性单链DNA分子从5'至3'包括:
第一有义ITR;
有义表达盒序列;
第二有义ITR;
第二反义ITR;
反义表达盒序列;以及
第一反义ITR。
用于实施例4的示例性方法的单链DNA分子可以通过本文所描述的任何DNA合成方法形成,例如体外DNA合成,或通过用核酸酶使DNA构建体(例如质粒)裂解并将所得的dsDNA片段解链以提供ssDNA片段来提供。
通过将温度降低到低于有义和反义序列对的所计算的解链温度可以实现退火。解链温度取决于特定核苷酸碱基含量和所用溶液的特征,例如盐浓度。任何给定序列的解链温度和溶液组合容易由所属领域的普通技术人员计算出。
退火分子的游离5'和3'端可以彼此接合,或接合到发夹分子上以形成ceDNA载体。适合的示例性接合方法和发夹分子描述于实施例2和实施例3中。
实施例5:ceDNA的纯化和/或产生证实
通过本文所述方法(例如,包括实施例1中所述的基于昆虫细胞的产生方法或者实施例2-实施例4中所述的合成产生方法)产生的任何DNA载体产物可以使用技术人员通常已知的方法加以纯化,例如以去除杂质、未使用的组分或副产物;并且/或者可以加以分析,以确认所产生的DNA载体(在这种情况下是ceDNA载体)是期望的分子。用于纯化DNA载体(例如ceDNA)的示例性方法是使用Qiagen Midi Plus纯化方案(Qiagen)和/或凝胶纯化。
以下是用于确认ceDNA载体身份的示例性方法。
可以通过如图4D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体,其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后,对比天然凝胶,变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带;以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
分离出的ceDNA载体的结构进一步如下分析:用根据以下所选的限制核酸内切酶消化经纯化的DNA:a)ceDNA载体内仅存在单个切割位点;和b)所得片段当在0.8%变性琼脂糖凝胶上分级分离时大得足以清晰可见(>800bp)。如图4C和4D中所说明,具有非连续结构的线性DNA载体和具有线性和连续结构的ceDNA载体能够根据其反应产物的大小区分,例如,具有非连续结构的DNA载体预期产生1kb和2kb片段,而具有连续结构的ceDNA载体预期产生2kb和4kb片段。
因此,为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价封闭端的,将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化,优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后,线性、非共价封闭的DNA将以1000bp和2000bp大小分解,而共价封闭的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp),这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外,由于多聚体DNA载体的端对端连接,对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图4E)。
如本文所用,短语“通过在天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA载体的分析”是指一种通过执行限制性核酸内切酶消化、随后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA封闭端的分析。后面是一种这样的示例性分析,尽管所属领域的普通技术人员将了解,对这个实施例可以进行许多所属领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶,其将生成DNA载体长度的大致1/3x和2/3x的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的色带解析。变性之前,重要的是从样品中去除缓冲液。Qiagen PCR清洁试剂盒或脱盐“离心柱”,例如GE HEALTHCARE ILUSTRATM MICROSPINTM G-25柱,是核酸内切酶消化的一些本领域已知的选项。该分析包括例如:i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA;2)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒,用蒸馏水洗脱;iii)添加10x变性溶液(10x=0.5MNaOH、10mM EDTA),添加10X染料,不进行缓冲,并与通过添加10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起,在预先与1mM EDTA和200mM NaOH一起培育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8%-1.0%凝胶上进行分析,并在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑动凝胶。所属领域的普通技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后,将凝胶排出并在1x TBE或TAE中进行中和,并转移到蒸馏水或含1x SYBR金的1x TBE/TAE中。然后,可以用例如赛默飞世尔的金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000×浓缩液)和辐射荧光(蓝色)或UV(312nm)使带可视化。前述基于凝胶的方法通过从凝胶色带中分离出ceDNA载体且允许其复性而能够根据纯化目的调整。
生成的ceDNA载体的纯度可以使用任何所属领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法,通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较,能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。例如,如果基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带,那么存在1μg ceDNA载体,且ceDNA载体是总UV吸收材料的25%。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入作图-例如,如果总ceDNA载体是8kb,而切下的比较带为2kb,那么带强度将按总输入的25%绘制,在这种情况下,对于1.0μg输入,将为.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线,然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量,然后可以用于测定ceDNA载体所表示的总输入的百分比或纯度百分比。
实施例6:在雄性Rag2小鼠中经由静脉内递送筛选CovidAb构建体的研究。
根据上述实施例1中所述的方法制备ceDNA载体。
本研究的目的是确定经由LNP和芦可替尼(ruxolitinib)(一种Janus相关激酶(JAK)抑制剂)作为免疫抑制剂TKI静脉内递送配制的ceDNA后的蛋白质表达,并且比较单独表达抗体HC、单独表达抗体LC或同时表达抗体HC和LC的各种ceDNA构建体中的蛋白质表达。将包含编码抗SARS-CoV-2Ab的重链(HC)的核酸的ceDNA和包含编码抗SARS-CoV-2Ab的轻链(LC)的核酸的ceDNA与免疫抑制剂TKI(例如,芦可替尼)组合给予小鼠(n=5)。如下文所阐述进行研究设计和细节。
研究设计
表8阐述研究的激酶抑制剂施用组分的设计。如表8中所示,以10mL/kg的剂量体积向四组雄性Rag2小鼠(n=5)经口(PO)施用芦可替尼(300mg/kg)或不给药。对于给药的动物,在第0天、给药前30分钟和给药后5小时进行给药。
表8:激酶抑制剂施用的研究设计
No.=数目;PO=经口管饲;ROA=施用途径;min=分钟;hrs=小时。给药和抑制剂制备的媒介物=0.5%甲基纤维素
表9阐述研究的测试材料施用组分的设计。如表9中所示,在第0天,以2mg/kg的剂量水平和5mL/kg的剂量体积向四组Rag2小鼠(n=5)静脉内施用媒介物(第1组)或测试化合物(第2组-第4组)。第35天为研究的终末时间点。第1组是媒介物对照。在第2组中,ceDNA-1856(编码LC)和ceDNA-1859(编码HC)构建体中HC与LC的摩尔比为3:2(HC:LC),并且在LNP1中配制双ceDNA载体。第3组中的单个载体ceDNA-2157ceDNA构建体是在LNP1中配制的双ORF、双向构建体。在第4组中,ceDNA1856(LC)和ceDNA1859(HC)构建体中HC与LC的摩尔比为3:2(HC:LC),并且双ceDNA载体在不同于LNP1的LNP2中配制。用于研究中的ceDNA构建体和/或ORF的序列在上表7中示出。
表9:测试材料施用
No.=数目;IV=静脉内;ROA=施用途径
测试系统
测试系统如下:
物种:小家鼠(Mus musculus)
品系:Rag2(B6.129S6-Rag2<tm1Fwa>)
雄性数目:25加2只备用
年龄:到达时5周龄
来源:Taconic
住所:动物被分组安置在透明的聚碳酸酯笼中,在手术室中放置接触式寝具。
食物和水:随意向动物提供小鼠饮食5058,并用1N HCl将过滤自来水酸化至目标pH 2.5-3.0。
测试材料
化合物类别:重组DNA载体:ceDNA
剂量配方:测试制品以准备给药等分试样的形式供应。在接收时记录测试制品浓度。
将原液温热至室温并在使用前根据需要即刻用提供的PBS稀释。如果不立即给药,则将制备好的材料储存在约4℃处。
抑制剂以每日准备给药等分试样的形式供应。在0.5%甲基纤维素中配制经口管饲剂量溶液。在施用前混合(移液)和/或超声处理经口管饲制剂以分布经口管饲混悬液的颗粒。
抑制剂施用:按照上述表8在第0天通过PO施用(经口管饲)以10mL/kg给药抑制剂。在第0天ceDNA施用前30分钟(±5分钟)和给药后5小时(±10分钟)给药抑制剂。
测试材料施用:在第0天通过静脉内给药将一定剂量的测试材料施用到外侧尾静脉中。剂量以5mL/kg的剂量体积施用。将剂量四舍五入到最接近的0.01mL。
剩余材料:将所有剩余的开放原液放置在冰箱中,并在研究的生命周期部分完成后丢弃。制备的给药材料在给药完成时被丢弃。
生活中的观察和测量
笼侧观察(动物健康检查):每天将至少执行一次笼侧动物健康检查以检查一般健康状况、死亡率和垂死率。
临床观察:在第0天(给药后60-120分钟和工作日结束时(给药后3-6小时))和第1天(第0天测试材料给药后22-26小时)进行临床观察。每个例外都进行了额外的观察。
体重:在第0、1、2、3、7、14、21、29和35天记录所有动物的体重。根据需要记录额外的体重。将体重四舍五入到最接近的0.1g。
血液收集
根据下文示出的表10,第1组-第5组中的所有动物在第3、7、14、21和29天收集中期血液。
表10:血液收集(中期):
采血后,动物接受0.5mL–1.0mL乳酸林格氏液;皮下注射。
通过尾静脉切口、大隐静脉或眶窦穿刺在吸入异氟醚下收集用于血清的全血。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中,并处理成两(2)份25μL血清。
将所有样品在标称-70℃下储存,直到装运到干冰上。
麻醉恢复:在适用的情况下,在麻醉下、恢复期间和移动之前,对动物进行持续监测。
终末程序和收集
表11:终末收集
MOV=最大可获得体积
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中
终末血液:将来自血清的全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中,并处理成每个设施SOP两(2)份50μL血清和一(1)份残余物。将所有样品在标称-70℃下储存,直到装运到干冰上。
结果
抗刺突人IgG(***)用于检测如本文所述的抗体表达,其通过在注射ceDNA构建体后3、7、14、21、29和35天检测到的ng/ml抗刺突hIgG来定量。如图6所示,当使用具有ceDNA-1856(编码LC)和ceDNA-1859(编码HC)载体的摩尔比为1.5:1(HC:LC)的双ceDNA构建体时,在第14天检测到约1ug/ml的抗刺突hIgG,并且抗体水平持续上升至第35天,达到约8ug/ml。
实施例7:ceDNA载体优化
在下文的实验中使用如上所述的在LNP1中共同配制的包含ceDNA-1856(编码LC)和ceDNA-1859(编码HC)的双ceDNA载体构建体。
研究的目的是使用表达HC和LC的各种载体设计来确定抗体表达:双顺反子盒(IRES或含有ceDNA的弗林蛋白酶/2A切割位点)、双ORF盒(双向)和双载体。该设计的示意图在图7A中示出。图7B示出了比较以流体动力学方式递送后测量的载体设计之间的抗体表达(通过检测抗刺突huIgG ug/mL)的实验结果。如图7B所示,以1:1的HC:LC摩尔比使用肝特异性双ORF和双载体设计产生高抗体表达。数据还表明,当载体以流体动力学方式递送时,对于含有HC-LC的抗体的最佳表达,双载体方法优于单载体设计(图7B)。在另一个实验中,以ceDNA双载体形式在LNP制剂(“LNP 1”)(ceDNA-1;双载体LNP 1或LNP 2)(如图6所示)或双ORF(ceDNA-2;双ORF-LNP 1)中递送HC和LC在35天研究期间通过测定这些ceDNA形式和LNP制剂之间的抗体表达(通过检测抗刺突huIgG ug/mL作为实施例)来比较。图7C显示了囊封ceDNA-1856(编码LC)和ceDNA-1859(编码HC)(“双载体”形式)递送以及导致抗刺突huIgG直至第35天的稳健表达的LNP的结果。如图7C所示,双载体的LNP递送在第35天达到约8ug/mL的抗刺突hIgG浓度。因此,具有囊封两个ceDNA构建体(ceDNA1856(LC)和ceDNA1859(HC);图7C,“ceDNA-1”)的LNP的双载体设计的表达与单个双ORF ceDNA形式(图7C,“ceDNA-2”)相比可以体内递送到肝细胞并且使得能够有额外的自由度来优化mAb表达。
图8比较了在第7天以流体动力学方式递送后表达HC和LC的摩尔比为1.5:1(HC:LC)的ceDNA双载体设计(“ceDNA-1”)和ceDNA双ORF设计(“ceDNA-2”)之间抗体表达的剂量依赖性增加。如图8所示,1856(LC)和1859(HC)双载体(1.5:1;HC:LC)的ceDNA形式和双ORF设计均显示表达的剂量依赖性增加,最佳双载体设计相对于双ORF设计产生高5倍-10倍的活性。
通常,通过ELISA测定抗刺突hIgG浓度的血清水平。简而言之,将纯化的SARS-CoV-2刺突蛋白(目录号46328)以2μg/mL在DPBS/>中涂覆在96孔测定板(Greiner/>目录号655085)上,并且将板在4℃处温育过夜。然后使用300μL的SuperBlock(PBS)封闭缓冲液(/>目录号37515)在室温处封闭板2小时以实现非特异性结合。将这些板用每孔300μL的1X PBST/>洗涤三次。样品和参考标准稀释液在通用血清稀释液(Immuno Chemistry/>目录号649)中制备并且将100μL的这些稀释液一式两份地添加到每个孔中。将板在室温处在以500rpm轻轻摇动的情况下温育60min。将板用PBST洗涤3次并在吸水纸上轻拍以除去过量液体。将山羊抗人IgG(H+L)HRP酶缀合的二抗(/>目录号31410)在通用血清稀释液中以1:5000稀释,并且向每个孔中添加100μL。将板在室温处在以500rpm摇动的情况下温育60分钟,然后用PBST洗涤3次。最后,将100μL的底物溶液(KPLSUREBLUETM TMB微孔底物,目录号5120-0077)添加到每个孔中,并且将板在室温处温育15min。将100μL的终止液(/>目录号5150-0020)添加到每个孔中,并且在450nm处测量吸光度。根据标准曲线对结果进行插值。
体外转染实施例
在HC和LC的不同摩尔比下测试包含ceDNA-1856(编码LC)和ceDNA-1859(编码HC)的双重形式的ceDNA载体构建体,以确定是否存在用于表达的HC:LC的最佳摩尔比。该测定使用用总共10ng的编码重链和轻链的ceDNA转染的HepG2细胞。72小时后收集上清液并且通过ELISA测量抗刺突hIgG的浓度。
将人肝癌HepG2细胞(ATCC,目录号HB-8065)在DMEM培养基(目录号10569010)中培养,该培养基补充有10%热灭活的胎牛血清(/>目录号16140071)和1%青霉素-链霉素(/>目录号15140163)。将细胞在含有95%空气和5% CO2的饱和湿度气氛中维持在37℃处。将细胞(3×104个细胞/孔)接种到96孔板(目录号354650)中,并在补充有10% FBS的100μL/孔的DMEM培养基中培养24h,以在转染前达到约70%-80%汇合。24小时后,根据制造商的方案,每个孔用总量为100ng的DNA瞬时转染HepG2细胞,其中ceDNA量为10ng,其余为载体DNA(/>目录号E4882),其使用Lipofectamine 3000试剂(/>目录号L3000015)进行。简而言之,为了转染,在单独的管中,将所需量的Lipofectamine 3000试剂、不同重链与轻链摩尔比的DNA各自稀释在Opti-MEM减少血清培养基(/>目录号31985-062)中;然后将P3000试剂添加到稀释的DNA中。将用P3000试剂稀释的DNA添加到稀释的Lipofectamine3000试剂中,并在室温处温育15分钟。然后将10μL的所得复合物添加到新鲜补充的完全培养基中的细胞中,并且将转染板在37℃和5% CO2处温育。在转染后72小时后在转染上清液中测量抗体滴度。如图9所示,其说明了HC:LC的摩尔比的体外筛选,用ceDNA的肝IgG表达用1.5:1至2:1范围内的更高HC:LC摩尔比增强。如图9所示,3:2HC与LC的摩尔比(1.5:1)对于双载体ceDNA构建体对是最佳的。
体内流体动力学实施例
接下来,使用具有不同摩尔比的HC和LC的ceDNA载体构建体进行体内筛选。一组使用包含固定剂量的编码HC的ceDNA的制剂,其中编码LC的ceDNA剂量变化。简而言之,将ceDNA经由流体动力学方式静脉内(IV)注射递送到C57Bl/6小鼠(6周龄;JacksonLaboratories)。将ceDNA稀释到PBS中,并在5秒内以固定体积(90mL/g-100mL/g)快速注射到外侧尾静脉中。将编码重链(ceDNA 1859)和轻链(ceDNA 1856)的ceDNA预混合,并以指定摩尔比递送。用固定剂量的重链或轻链和增加剂量的同源链对动物给药。在给药后第3天收集血清样品用于测试。
如图10所示,在固定剂量的编码LC或HC的ceDNA下,增加HC的剂量改善表达,而增加LC剂量的效果有限。该结果与体外结果一致,并表明HC:LC>1:2是优选的。
总之,本文报道的结果提供了对构建体设计的重要见解,以及进一步优化ceDNA载体设计和HC:LC摩尔比以向受试者递送抗体治疗剂或诊断的机会。结果表明,在LNP中用双载体的功能性表达能够获得优化mAb表达的额外自由度。此外,结果表明,常见的表达盒可用于HC和LC,并可能免除用单个、双ORF或F/2A载体优化表达的要求。
实施例8:由细胞系产生的重组抗SARS-Cov2S抗体与由用ceDNA双载体(HC/LC)治 疗的小鼠产生并纯化的抗SARS-Cov2 S抗体的体外效应子功能比较性研究。
本研究的目的是比较质粒来源的和ceDNA来源的抗SARS-CoV2抗体的结合亲和力。将CHO(中国仓鼠卵巢)细胞用表达抗SARS-CoV2 HC和LC的质粒瞬时共转染,其使用如Stettler等人(Science,2016,353(6301):823-826)中所述的方法进行,从而产生质粒来源的单克隆抗体。通过将如本文所述的编码抗SARS-CoV2 HC或LC的裸ceDNA以流体动力学方式IV注射到C57/Bl6小鼠的尾静脉中来产生ceDNA来源的抗SARS-CoV2抗体。通过该方法递送DNA导致外源DNA主要在肝脏中的有效体内转染(参见例如,Kim&Ahituv,Methods MolBiol.2013;1015:279–289)。因此,由小鼠的肝脏产生抗体,然后从血清中收集和纯化,得到ceDNA产生的抗体。
抗体1和抗体2是来源于从2003SARS-CoV幸存者中鉴定的亲本抗体的修饰抗体。抗体1和抗体2的可变区已被开发为具有延长的半衰期,其中抗体1用单个“LS”突变进行工程改造,并且抗体2用双“LS”和“GAALIE”修饰进行工程改造。具体地,两种抗体都具有如本文所定义的Fc“LS”突变,其通过结合至新生儿Fc受体而赋予延长的半衰期。除了如本文所定义的对Fc的额外的“GAALIE”修饰外,抗体2与抗体1相同。“GAALIE”修饰已在体外显示尤其增强与FcγRIIIa受体的结合,并在体内病毒呼吸道感染的情况下激发保护性CD8+T细胞。
测试了以下抗体:抗体1(细胞系衍生的),一种单个“LS”突变体,由转染的CHO细胞在体外重组产生;ceDNA抗体1,一种单个“LS”突变体,经由流体动力学方式IV注射在用ceDNA(如本文所述的HC和LC)治疗的小鼠中产生并在注射后3天从治疗的小鼠的血清中纯化;具有双“LS”和“GAALIE”修饰的抗体2,由CHO细胞在体外重组产生;具有双“LS”和“GAALIE”修饰的ceDNA抗体2,经由流体动力学方式IV注射在用如本文所述的ceDNA HC/LC双载体治疗的小鼠中产生并在以流体动力学方式注射后3天从治疗的小鼠的血清中纯化。为了测量解离常数(KD),FAB2G生物传感器的基线首先在含有(0.02% BSA、0.004% Tween-20的PBS溶液)的2x缓冲液中校准60秒。然后,将抗体样品以30nM加载300秒。在如上所述的相同类型的缓冲液中再次对生物传感器进行基线测定。然后将不同浓度(约3nM至约300nM并且应用该范围内的4-7个不同浓度)的FcγRIIIa受体(指定为“V”的多晶型物或指定为“F”的多晶型物)与所测试的抗体缔合480秒,然后解离480秒,并且通过生物传感器测量解离常数(KD)值并使用软件/>Analysis Studio进行计算。
解离常数(KD)值在表12以及图11A(对于FcγRIIIa-V)和图11B(对于FcγRIIIa-F)中示出。表12还表明,所有测量和计算的KD值具有>0.95的统计回归值(R2),从而表明所有测量的数据非常好地拟合回归模型。
表12
较低的KD值表明较高的结合亲和力。如在表12以及图11A和图11B中可见,与重组产生的抗体(“细胞系”)相比,当由以流体动力学方式注射ceDNA的小鼠产生抗体时,抗体与受体(FcγRIIIa-V和FcγRIIIa-F)的结合亲和力显著增加。如所预期的,抗体2,无论是细胞系来源的还是ceDNA来源的,以及无论是FcγRIIIa-V还是FcγRIIIa-F,都表现出比它们各自的抗体1对应物更高的结合亲和力。然而,与由传统哺乳动物细胞系重组产生的单克隆抗体相比,ceDNA来源的抗体(如本文所述的ceDNA HC/LC双载体)的体内肝表达实现了高得多的结合效力。不希望受理论束缚,这可能是由于由肝脏产生的ceDNA来源的抗体的岩藻糖基化水平升高,其中预期不存在岩藻糖基转移酶(将L-岩藻糖从GDP-岩藻糖供体底物转移到受体底物的酶)。这反过来可能导致效应子功能水平的增加,因为当抗体被岩藻糖基化时,抗体依赖性细胞毒性(ADCC)也增加。
总之,这些结果表明,将ceDNA递送到肝脏以产生ceDNA来源的抗体导致对FcγRIIIa具有增强的亲和力的抗体的产生,并且代表用于体内治疗性抗体产生的新的和改进的平台。
实施例9:细胞系来源的和ceDNA来源的抗VEGF抗体的体外效应子功能比较性研究
本研究的目的是比较细胞系来源的和ceDNA来源的抗VEGF抗体的结合亲和力。将使用VEGF单克隆抗体贝伐单抗和雷珠单抗(ranibizumab)。
CHO(中国仓鼠卵巢)细胞用表达贝伐单抗(Fab重链:登录号7V5N_F;Fab轻链:登录号7V5N_E)或雷珠单抗(重链AB片段:登录号:QWX93388.1;轻链Ab片段:登录号QWX93389.1)的质粒瞬时共转染,其使用如Stettler等人(Science,2016,353(6301):823-826)中所述的方法进行,从而产生细胞系来源的单克隆抗体。在如本文所述的单载体或双载体系统中,通过将编码贝伐单抗和雷珠单抗的裸ceDNA以流体动力学方式IV注射到C57/Bl6小鼠的尾静脉中来产生ceDNA来源的贝伐单抗和雷珠单抗。通过该方法递送ceDNA导致ceDNA主要在肝脏中的有效体内转染(参见例如,Kim&Ahituv,Methods Mol Biol.2013;1015:279–289)。因此,与由CHO细胞产生的它们的对应物相比,由小鼠肝脏产生,然后从血清中收集和纯化的所得抗VEGF抗体将表现出对FcγRIIIa更高的结合亲和力和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)水平升高。
这也表明人们可以有效地实施ceDNA作为有效的治疗剂以从需要用对FcγRIIIa具有更高结合亲和力的抗体治疗的人类受试者的肝脏中产生对FcγRIIIa的结合亲和力水平增加的抗体。
参考文献
在本说明书和本文的实施例中引用的所有出版物和参考文献,包括但不限于专利和专利申请,都以全文引用的方式并入本文中,如同每个单独的出版物或参考文献被明确且单独地指出像充分阐述一样,以引用的方式并入本文中一般。本申请要求优先权的任何专利申请也以上述针对出版物和参考文献的方式以引用方式并入本文中。
Claims (62)
1.一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体组合物,其包含含有在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个核酸序列的ceDNA载体,其中所述至少一个核酸序列编码抗体或其抗原结合片段的重链(HC)和/或轻链(LC)。
2.根据权利要求1所述的ceDNA载体组合物,其中所述至少一个核酸序列编码所述抗体或所述其抗原结合片段的所述HC。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述至少一个核酸序列编码所述抗体或所述其抗原结合片段的所述LC。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述至少一个核酸序列编码所述抗体或所述其抗原结合片段的所述HC和LC两者。
5.一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体组合物,其包含:
第一ceDNA载体,其包含在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个核酸序列,其中所述至少一个核酸序列编码抗体或其抗原结合片段的重链(HC);以及
第二ceDNA载体,其包含在侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一个核酸序列,其中所述至少一个核酸序列编码抗体或其抗原结合片段的轻链(LC)。
6.根据权利要求5所述的ceDNA载体组合物,其中所述HC和所述LC以1:10或10:1,优选1:3至3:1,最优选1.5:1(HC:LC)的摩尔比存在。
7.根据权利要求5或权利要求6所述的ceDNA载体组合物,其中所述HC和所述LC以1:1至2.5:1(HC:LC)之间的摩尔比存在。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述HC和所述LC以1.5:1至2.5:1(HC:LC)之间的摩尔比存在。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述HC和所述LC以约1.5:1(HC:LC)的摩尔比存在。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述HC和所述LC以约2.0:1(HC:LC)的摩尔比存在。
11.根据权利要求5至10中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述HC和所述LC以约2.5:1(HC:LC)的摩尔比存在。
12.根据权利要求5至11中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述第一ceDNA和所述第二ceDNA一起表达至少1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL或10μg/mL的包含HC和LC的抗体。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述至少一个核酸包含双ORF,所述双ORF包含在所述侧接反向末端(ITR)之间的第一ORF和第二ORG,其中所述第一ORF编码HC并且第二ORF编码抗体的LC并且所述第一ORF和所述第二ORF不重叠。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述双ORF是双向的。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的ceDNA载体,或根据权利要求5所述的ceDNA载体组合物,其中所述ceDNA载体包含可操作地连接到所述至少一个核酸序列的启动子序列、增强子序列。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ceDNA载体包含至少一个聚A序列。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的ceDNA载体组合物,或根据权利要求5所述的ceDNA载体组合物,其中所述ceDNA载体包含5'UTR和/或内含子序列。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ceDNA载体包含3'UTR序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ceDNA载体包含增强子序列。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中至少一个ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR来自选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)的病毒。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述侧接ITR相对于彼此对称或不对称。
23.根据权利要求22所述的ceDNA载体组合物,其中所述侧接ITR是对称的或基本上对称的。
24.根据权利要求22所述的ceDNA载体组合物,其中所述侧接ITR是不对称的。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR是野生型的,或者其中所述ITR中的两个ITR都是野生型ITR。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述侧接ITR来自不同病毒血清型。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述侧接ITR选自表2中示出的任何病毒血清型对。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR包含选自表3中的一个或多个序列的序列。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的至少一个ITR由于影响所述ITR的整体三维构象的缺失、添加或取代而相对于野生型AAV ITR序列改变。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR来源于选自以下的AAV血清型:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR是合成的。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR不是野生型ITR,或者其中所述ITR中的两个ITR都不是野生型ITR。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR通过选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的ITR区域中的至少一个ITR区域中的缺失、插入和/或取代而被修饰。
34.根据权利要求33所述的ceDNA组合物,其中所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述A、A'、B、B'、C或C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰,所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰,所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰,所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的一部分和/或通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的一部分发生缺失。
38.根据权利要求1至37中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。
39.根据权利要求1至38中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。
40.根据权利要求1至39中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。
41.根据权利要求1至40中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中两个ITR以使得当所述ITR相对于彼此反转时产生整体三维对称性的方式改变。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的ceDNA载体组合物,其中所述载体组合物囊封在脂质纳米粒子(LNP)中。
43.一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体,其包含选自表7的核酸序列。
44.一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体,其包含与SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQID NO:406、SEQ ID NO:407或SEQID NO:408具有至少85%同一性的核酸序列。
45.一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体,其由选自由以下组成的组的核酸序列组成:SEQ ID NO:404、SEQ ID NO:405、SEQ ID NO:406、SEQ ID NO:407或SEQ ID NO:408。
46.一种在细胞中表达抗体或其抗原结合片段的方法,其包括使所述细胞与根据权利要求1至42中任一项所述的ceDNA载体组合物接触。
47.根据权利要求46所述的方法,其中所述细胞在体外或在体内。
48.根据权利要求46或权利要求47所述的方法,其中所述至少一个核酸序列经密码子优化以在所述细胞中表达。
49.一种用细菌、病毒、寄生虫或真菌感染治疗受试者的方法,其包括向所述受试者施用根据权利要求1至42中任一项所述的ceDNA载体组合物或根据权利要求43至45所述的ceDNA载体。
50.一种治疗患有癌症的受试者的方法,其包括向所述受试者施用根据权利要求1至42中任一项所述的ceDNA载体组合物或根据权利要求43至45所述的ceDNA载体。
51.一种治疗患有自身免疫疾病或病症的受试者的方法,其包括向所述受试者施用根据权利要求1至42中任一项所述的ceDNA载体组合物或根据权利要求43至45所述的ceDNA载体。
52.一种预防受试者的细菌、病毒、寄生虫或真菌感染的方法,其包括向所述受试者施用根据权利要求1至42中任一项所述的ceDNA载体组合物或根据权利要求43至45所述的ceDNA载体。
53.一种预防受试者的癌症的方法,其包括向所述受试者施用根据权利要求1至42中任一项所述的ceDNA载体组合物或根据权利要求43至45所述的ceDNA载体。
54.一种预防受试者的自身免疫疾病的方法,其包括向所述受试者施用根据权利要求1至42中任一项所述的ceDNA载体组合物或根据权利要求43至45所述的ceDNA载体。
55.根据权利要求49至54中任一项所述的方法,其中由所述ceDNA载体编码并在所述受试者的肝脏中表达的抗体或其抗原结合片段与由表达岩藻糖基转移酶的哺乳动物细胞系产生的其对应物相比对FcγRIIIa具有更高的结合亲和力。
56.根据权利要求49至54中任一项所述的方法,其中所述ceDNA载体或ceDNA载体组合物通过静脉内、皮下、瘤内或肌肉内注射施用。
57.根据权利要求49至54中任一项所述的方法,其还包括向所述受试者施用免疫调节剂。
58.一种药物组合物,其包含根据权利要求1至42中任一项所述的ceDNA载体组合物或根据权利要求43至45所述的ceDNA载体。
59.根据权利要求50所述的药物组合物,其还包含一种或多种另外的治疗剂。
60.一种组合物,其包含根据权利要求1至42中任一项所述的ceDNA载体组合物或根据权利要求43至45所述的ceDNA载体以及脂质。
61.根据权利要求60所述的组合物,其中所述脂质是脂质纳米粒子(LNP)。
62.一种试剂盒,其包含根据权利要求1所述的ceDNA载体、根据权利要求58所述的药物组合物或根据权利要求60所述的组合物以及使用说明。
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US4897355A (en) | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US5549910A (en) | 1989-03-31 | 1996-08-27 | The Regents Of The University Of California | Preparation of liposome and lipid complex compositions |
US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
JP3218637B2 (ja) | 1990-07-26 | 2001-10-15 | 大正製薬株式会社 | 安定なリポソーム水懸濁液 |
JP2958076B2 (ja) | 1990-08-27 | 1999-10-06 | 株式会社ビタミン研究所 | 遺伝子導入用多重膜リポソーム及び遺伝子捕捉多重膜リポソーム製剤並びにその製法 |
US6174666B1 (en) | 1992-03-27 | 2001-01-16 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of eliminating inhibitory/instability regions from mRNA |
US5741516A (en) | 1994-06-20 | 1998-04-21 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Sphingosomes for enhanced drug delivery |
US5885613A (en) | 1994-09-30 | 1999-03-23 | The University Of British Columbia | Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes |
US5795587A (en) | 1995-01-23 | 1998-08-18 | University Of Pittsburgh | Stable lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production |
US5811524A (en) | 1995-06-07 | 1998-09-22 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof |
US5738868A (en) | 1995-07-18 | 1998-04-14 | Lipogenics Ltd. | Liposome compositions and kits therefor |
US6090382A (en) | 1996-02-09 | 2000-07-18 | Basf Aktiengesellschaft | Human antibodies that bind human TNFα |
CN103275221B (zh) | 1996-02-09 | 2016-08-17 | 艾伯维生物技术有限公司 | 结合人TNFα的人抗体 |
US5928906A (en) | 1996-05-09 | 1999-07-27 | Sequenom, Inc. | Process for direct sequencing during template amplification |
WO1998051278A2 (en) | 1997-05-14 | 1998-11-19 | Inex Pharmaceuticals Corporation | High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles |
US5891994A (en) | 1997-07-11 | 1999-04-06 | Thymon L.L.C. | Methods and compositions for impairing multiplication of HIV-1 |
GB9720585D0 (en) | 1997-09-26 | 1997-11-26 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
US6320017B1 (en) | 1997-12-23 | 2001-11-20 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Polyamide oligomers |
WO2000034343A1 (en) | 1998-12-04 | 2000-06-15 | Mosaic Technologies, Inc. | Method for the immobilization of oligonucleotides |
IL150756A0 (en) | 2000-01-31 | 2003-02-12 | Smithkline Beecham Biolog | Novel use of hiv proteins |
US20030077829A1 (en) | 2001-04-30 | 2003-04-24 | Protiva Biotherapeutics Inc.. | Lipid-based formulations |
FR2824431A1 (fr) | 2001-05-03 | 2002-11-08 | Mitsubishi Electric Inf Tech | Methode et dispositif de reception de signal |
JP2006522158A (ja) | 2003-04-03 | 2006-09-28 | アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | iRNA複合体 |
WO2004091515A2 (en) | 2003-04-09 | 2004-10-28 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | iRNA CONJUGATES |
US7803397B2 (en) | 2003-09-15 | 2010-09-28 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Polyethyleneglycol-modified lipid compounds and uses thereof |
US20060246079A1 (en) | 2003-11-14 | 2006-11-02 | Morrow Phillip R | Neutralizing human antibodies to anthrax toxin |
WO2005120152A2 (en) | 2004-06-07 | 2005-12-22 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods of use |
ATE536418T1 (de) | 2004-06-07 | 2011-12-15 | Protiva Biotherapeutics Inc | Lipidverkapselte interferenz-rna |
WO2006007712A1 (en) | 2004-07-19 | 2006-01-26 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents |
WO2006112872A2 (en) | 2004-08-04 | 2006-10-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase |
CN101287497B (zh) | 2004-12-27 | 2013-03-06 | 赛伦斯治疗公司 | 涂层脂质复合体和它们的用途 |
US7404969B2 (en) | 2005-02-14 | 2008-07-29 | Sirna Therapeutics, Inc. | Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules |
AU2007285782B2 (en) | 2006-08-18 | 2010-06-24 | Arrowhead Research Corporation | Polyconjugates for in vivo delivery of polynucleotides |
EP3192788A1 (en) | 2006-10-03 | 2017-07-19 | Arbutus Biopharma Corporation | Lipid containing formulations |
WO2008156763A2 (en) | 2007-06-15 | 2008-12-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Human neutralizing monoclonal antibodies to h5n1 influenza a virus |
WO2009018332A1 (en) | 2007-08-01 | 2009-02-05 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a metal-chelating ligand |
CA2708171C (en) | 2007-12-04 | 2018-02-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Folate conjugates |
EP3156077B1 (en) | 2007-12-04 | 2022-03-09 | Arbutus Biopharma Corporation | Targeting lipids |
CA2709875C (en) | 2008-01-02 | 2019-07-16 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
ITTO20080204A1 (it) | 2008-03-17 | 2009-09-18 | Pomona Biotechnologies Llc | Anticorpi monoclonali atti a reagire con una pluralita di sottotipi del virus influenzale a |
HUE034483T2 (en) | 2008-04-15 | 2018-02-28 | Protiva Biotherapeutics Inc | New lipid preparations for introducing a nucleic acid |
WO2009132131A1 (en) | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Amino lipid based improved lipid formulation |
ITTO20080398A1 (it) | 2008-05-27 | 2009-11-28 | Pomona Biotechnologies Llc | Anticorpi monoclonali aventi proprieta' di cross-neutralizzazione omosubtipica per virus influenzali di tipo a sottotipo h1 |
WO2010002862A2 (en) | 2008-07-01 | 2010-01-07 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Fibroblast growth factor receptor 3 (fgfr3) binding proteins |
US8883211B2 (en) | 2008-07-10 | 2014-11-11 | Serina Therapeutics, Inc. | Polyoxazolines with inert terminating groups, polyoxazolines prepared from protected initiating groups and related compounds |
RU2553325C2 (ru) | 2008-07-25 | 2015-06-10 | Институт Фо Ресёч Ин Биомедицин | Нейтрализующие антитела против вируса гриппа а и их использование |
GB0813784D0 (en) | 2008-07-28 | 2008-09-03 | Ct Integrated Photonics Ltd | Optical intergration system |
CA2984026C (en) | 2008-10-09 | 2020-02-11 | Arbutus Biopharma Corporation | Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids |
WO2010048536A2 (en) | 2008-10-23 | 2010-04-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Processes for preparing lipids |
US8722082B2 (en) | 2008-11-10 | 2014-05-13 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Lipids and compositions for the delivery of therapeutics |
JP5747282B2 (ja) | 2008-11-10 | 2015-07-15 | テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイションTekmira Pharmaceuticals Corporation | 治療薬を送達するための新規な脂質及び組成物 |
EP3243504A1 (en) | 2009-01-29 | 2017-11-15 | Arbutus Biopharma Corporation | Improved lipid formulation |
LT3702371T (lt) | 2009-03-25 | 2023-01-10 | Genentech, Inc. | Anti-fgfr3 antikūnai ir jų panaudojimo būdai |
WO2010119991A2 (en) | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Novel method of treating cancer |
CN105903022A (zh) | 2009-05-05 | 2016-08-31 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 脂质组合物 |
CA2761648C (en) | 2009-05-11 | 2019-03-12 | Crucell Holland B.V. | Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus h3n2 and uses thereof |
IT1395961B1 (it) | 2009-06-01 | 2012-11-02 | Pomona Biotechnologies Llc | Anticorpi monoclonali come medicamento per il trattamento terapeutico e/o profilattico delle infezioni da virus influenzale a (h1n1) di origine suina (s-oiv) |
PT3431076T (pt) | 2009-06-10 | 2021-10-26 | Arbutus Biopharma Corp | Formulação lipídica melhorada |
US8569256B2 (en) | 2009-07-01 | 2013-10-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents |
IL292615B2 (en) | 2009-07-01 | 2023-11-01 | Protiva Biotherapeutics Inc | Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses |
EP3072881A1 (en) | 2009-08-20 | 2016-09-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | Novel cationic lipids with various head groups for oligonucleotide delivery |
US9222086B2 (en) | 2009-09-23 | 2015-12-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing genes expressed in cancer |
EP2506879A4 (en) | 2009-12-01 | 2014-03-19 | Protiva Biotherapeutics Inc | PREPARATIONS OF SNALP CONTAINING ANTIOXIDANTS |
US9687550B2 (en) | 2009-12-07 | 2017-06-27 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions for nucleic acid delivery |
WO2011090965A1 (en) | 2010-01-22 | 2011-07-28 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Novel cationic lipids for oligonucleotide delivery |
AU2011253101A1 (en) | 2010-05-11 | 2013-01-10 | Aveo Pharmaceuticals, Inc. | Anti-FGFR2 antibodies |
WO2011141704A1 (en) | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Protiva Biotherapeutics, Inc | Novel cyclic cationic lipids and methods of use |
CA2799091A1 (en) | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Cationic lipids and methods of use thereof |
DK2575767T3 (en) | 2010-06-04 | 2017-03-13 | Sirna Therapeutics Inc | HOWEVER UNKNOWN LOW MOLECULAR CATIONIC LIPIDS TO PROCESS OIGONUCLEOTIDES |
ES2961381T3 (es) | 2010-06-19 | 2024-03-11 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Anticuerpos anti-GD2 |
WO2012000104A1 (en) | 2010-06-30 | 2012-01-05 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Non-liposomal systems for nucleic acid delivery |
WO2012016184A2 (en) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
PT2603530T (pt) | 2010-08-13 | 2018-01-09 | Roche Glycart Ag | Anticorpos anti-fap e métodos de utilização |
HUE060524T2 (hu) | 2010-08-31 | 2023-03-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Pegilált liposzómák immunogén kódoló RNS beszállítására |
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EP3144015B1 (en) | 2010-09-20 | 2021-06-02 | Sirna Therapeutics, Inc. | Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery |
JP2013545723A (ja) | 2010-09-30 | 2013-12-26 | メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション | オリゴヌクレオチドの送達のための低分子量カチオン性脂質 |
CA2813024A1 (en) | 2010-10-21 | 2012-04-26 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Novel low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery |
WO2012068187A1 (en) | 2010-11-19 | 2012-05-24 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Poly(amide) polymers for the delivery of oligonucleotides |
CA2824526C (en) | 2011-01-11 | 2020-07-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Pegylated lipids and their use for drug delivery |
SG185832A1 (en) | 2011-05-10 | 2012-12-28 | Agency Science Tech & Res | Fgfr1 antibodies and treatment of cancer |
WO2012138975A1 (en) | 2011-04-07 | 2012-10-11 | Genentech, Inc. | Anti-fgfr4 antibodies and methods of use |
WO2012162210A1 (en) | 2011-05-26 | 2012-11-29 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Ring constrained cationic lipids for oligonucleotide delivery |
RU2014104090A (ru) | 2011-07-06 | 2015-08-20 | Новартис Аг | Липосомы с эффективным соотношением n:p для доставки молекул phk |
WO2013016058A1 (en) | 2011-07-22 | 2013-01-31 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Novel bis-nitrogen containing cationic lipids for oligonucleotide delivery |
CA2846043A1 (en) | 2011-08-31 | 2013-03-07 | Novartis Ag | Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna |
CA2849476A1 (en) | 2011-09-27 | 2013-04-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Di-aliphatic substituted pegylated lipids |
AR088941A1 (es) | 2011-11-23 | 2014-07-16 | Bayer Ip Gmbh | Anticuerpos anti-fgfr2 y sus usos |
CA3165769A1 (en) | 2011-12-07 | 2013-06-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Biodegradable lipids for the delivery of active agents |
CA3170051A1 (en) | 2011-12-07 | 2013-06-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Branched alkyl and cycloalkyl terminated biodegradable lipids for the delivery of active agents |
US20140308304A1 (en) | 2011-12-07 | 2014-10-16 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Lipids for the delivery of active agents |
US9839616B2 (en) | 2011-12-12 | 2017-12-12 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Lipid nano particles comprising cationic lipid for drug delivery system |
WO2013116126A1 (en) | 2012-02-01 | 2013-08-08 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Novel low molecular weight, biodegradable cationic lipids for oligonucleotide delivery |
PT2817287T (pt) | 2012-02-24 | 2018-12-28 | Arbutus Biopharma Corp | Lípidos catiónicos trialquílicos e seus métodos de utilização |
US9446132B2 (en) | 2012-03-27 | 2016-09-20 | Sima Therapeutics, Inc. | Diether based biodegradable cationic lipids for siRNA delivery |
WO2014025805A1 (en) | 2012-08-06 | 2014-02-13 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Carbohydrate conjugated rna agents and process for their preparation |
AU2014287002A1 (en) | 2013-07-11 | 2016-02-11 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide-ligand conjugates and process for their preparation |
CA2919226A1 (en) | 2013-07-23 | 2015-01-29 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivering messenger rna |
CN112656954A (zh) | 2013-10-22 | 2021-04-16 | 夏尔人类遗传性治疗公司 | 用于递送信使rna的脂质制剂 |
CA2930602C (en) | 2013-11-18 | 2019-05-28 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Ionizable cationic lipid for rna delivery |
US9365610B2 (en) | 2013-11-18 | 2016-06-14 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Asymmetric ionizable cationic lipid for RNA delivery |
PL3083556T3 (pl) | 2013-12-19 | 2020-06-29 | Novartis Ag | Lipidy i kompozycje lipidowe dla dostarczania środków czynnych |
US10426737B2 (en) | 2013-12-19 | 2019-10-01 | Novartis Ag | Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents |
EP3160938B1 (en) | 2014-06-25 | 2020-09-16 | Acuitas Therapeutics Inc. | Novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids |
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EP3386484B1 (en) | 2015-12-10 | 2022-03-30 | ModernaTX, Inc. | Compositions and methods for delivery of therapeutic agents |
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