CN111818942A - 非病毒dna载体以及其用于产生抗体和融合蛋白的用途 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了一种用于递送和表达转基因的具有线性连续结构的ceDNA载体。ceDNA载体包含两侧是两个ITR序列的表达盒，其中所述表达盒编码转基因。一些ceDNA载体进一步包含顺式调控元件，包括调控开关。本文进一步提供了使用所述ceDNA载体进行可靠的体外、离体和体内基因表达的方法和细胞系。本文提供了包含ceDNA载体的方法和组合物，所述ceDNA载体适用于在细胞、组织或受试者中表达抗体或融合蛋白。此类抗体或融合蛋白能够被表达以用于治疗疾病，或替代地用于在商业背景下产生抗体或融合蛋白。

Description

非病毒DNA载体以及其用于产生抗体和融合蛋白的用途
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年2月14日提交的美国临时申请62/630,670、2018年6月4日提交的美国临时申请62/680,087、2018年2月14日提交的美国临时申请62/630,676和2018年6月4日提交的美国临时申请62/680,092的权益，所述美国临时申请各自的内容以其全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子提交并在此通过全文引用的方式并入。2019年2月13日创建的所述ASCII拷贝命名为080170-091100-WOPT_SL.txt并且具有128,788个字节的大小。
技术领域
本发明涉及基因疗法领域，包括用于在受试者或细胞中表达转基因或经分离的多核苷酸的非病毒载体。本公开还涉及核酸构建体、启动子、载体和宿主细胞，包括多核苷酸以及将外源DNA序列递送至靶细胞、组织、器官或生物体的方法。举例来说，本公开提供了使用非病毒DNA载体从细胞中表达抗体(例如治疗抗体)的方法。本公开还提供了使用非病毒DNA载体从细胞表达融合蛋白(例如治疗性融合蛋白)的方法。所述方法和组合物能够应用于例如生产商业抗体或融合蛋白，或用于治疗疾病的目的，这是通过在有需要的受试者的细胞或组织中表达治疗抗体或融合蛋白来实现。
背景技术
基因疗法旨在改善患有因基因表达谱畸变引起的基因突变或获得性疾病的患者的临床结局。基因疗法包括治疗或预防由能够引起病症、疾病、恶性疾病的缺陷基因或异常调控或表达(例如表达不足或过度表达)所致的医学病状。举例来说，由缺陷基因引起的疾病或病症可以通过向患者递送矫正性遗传物质来治疗、预防或改善，或者可以通过改变或静默患者的缺陷基因(例如使用矫正性遗传物质)、从而使得患者内的遗传物质发生治疗性表达来治疗、预防或改善。
基因疗法的基础是向转录盒提供活性基因产物(有时称为转基因)，例如能够产生正向功能获得效应、负向功能丧失效应或另一结果的活性基因产物。此类结果能够归因于活化抗体或融合蛋白或抑制(中和)抗体或融合蛋白的表达。基因疗法也可以用于治疗由其它因素引起的疾病或恶性疾病。人类单基因病症可以通过将正常基因递送给靶细胞并表达来治疗。矫正基因在患者靶细胞中的递送和表达能够通过多种方法进行，包括使用工程化病毒和病毒基因递送载体。在许多可用的病毒来源载体(例如重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)当中，重组腺相关病毒(rAAV)作为基因疗法中的多用途载体越来越受到欢迎。
腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科，并且更具体地说，组成依赖病毒属。源自于AAV的载体(即重组AAV(rAVV)或AAV载体)对于递送遗传物质具有吸引力，因为(i)它们能够感染(转导)多种多样的非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而减弱了宿主细胞对病毒感染的应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒被认为在人类中是非致病性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV相比，复制缺陷型AAV载体缺乏rep基因，并且通常作为附加体存留，从而限制了插入诱变或基因毒性的风险；以及(v)与其它载体系统相比，AAV载体通常被认为是相对较弱的免疫原，因此不会触发明显的免疫应答(参见ii)，从而获得了载体DNA的持久性以及治疗性转基因的潜在长期表达。
然而，使用AAV颗粒作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关的一个主要缺点是其对异源DNA的约4.5kb的病毒封装容量有限(Dong等人，1996；Athanasopoulos等人，2004；Lai等，2010)，因此AAV载体的使用已限于小于150,000Da蛋白质编码容量。第二个缺点是，由于人群中野生型AAV感染盛行，所以必须筛查rAAV基因疗法候选者中从患者消除该载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳的免疫原性有关，这种免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再次施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的该载体作出应答，刺激免疫系统产生高滴度的抗AAV抗体，从而杜绝了进一步治疗。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAV DNA转化为双链DNA，所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。
另外，通过引入含有AAV基因组、rep基因和cap基因的质粒，产生有衣壳的常规AAV病毒体(Grimm等人,1998)。然而，发现这种衣壳化AAV病毒载体不能有效地转导某些细胞和组织类型，并且衣壳还诱导免疫应答。
相应地，由于单次施用于患者(因患者免疫应答)、适于AAV载体递送的转基因遗传物质的范围因最小病毒封装容量(约4.5kb)而受限，以及AAV介导的基因表达缓慢，因此基因疗法使用腺相关病毒(AAV)载体受到限制。
所属领域中需要一种技术，其容许治疗抗体(例如分泌型抗体或胞内抗体)或融合蛋白(例如受体胞外域-Fc融合体)在细胞、组织或受试者中表达，或替代地，旨在体外或体内产生抗体或融合蛋白用于提纯和/或商业生产。另外，相较于现有或习知方法或载体，改进抗体(例如治疗抗体)和融合蛋白(例如治疗性融合蛋白)的生产对于生产和/或表达特性改进的可控重组DNA载体存在重大的、未满足的需求。
发明内容
本文所述的技术涉及使用具有共价闭合端的无衣壳(例如非病毒)的DNA载体(在本文中称为“闭合端DNA载体”或“ceDNA载体”)表达抗体和融合蛋白(例如治疗抗体和融合蛋白)的方法和组合物。这些ceDNA载体能够用于产生供治疗疾病、治疗恶性疾病、监测和诊断以及商业抗体或融合蛋白生产用的抗体和融合蛋白。一种示例性抗体是抗肿瘤坏死因子抗体或其抗体结合片段，包括(但不限于)使用本文所述的ceDNA载体能够在受试者的细胞或组织中表达的单克隆抗体阿达木单抗(adalimumab)(HumiraTM)。此类治疗抗体能够用于治疗类风湿性关节炎、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎和克罗恩氏病(Crohn's disease)的目的。
相应地，本文所述的本发明涉及一种具有共价闭合端的无衣壳(例如非病毒)DNA载体(在本文中称为“闭合端DNA载体”或“ceDNA载体”)，其包含编码抗体(例如轻链、重链、构架、Fabs'、单链抗体)或其抗原结合片段的异源基因，以容许在细胞内表达抗体，例如分泌型抗体或胞内抗体。本发明还涉及一种ceDNA载体，其包含编码融合蛋白的异源基因，以容许在细胞内表达融合蛋白。待表达的此类抗体或融合蛋白可以是治疗抗体或融合蛋白且/或所用技术能够用于产生供商业目的用的抗体或融合蛋白。具体地说，本文所述的技术涉及使用ceDNA载体的改进的抗体和融合蛋白生产。
如本文所述的抗体和融合蛋白生产用的ceDNA载体是由具有共价闭合端的互补DNA的连续链形成的无衣壳线性双链体DNA分子(线性、连续和非衣壳化结构)，其包含5'反向末端重复(ITR)序列和3'ITR序列，其中5'ITR和3'ITR相对于彼此能够具有相同的对称三维组构(即，对称或大体对称)，或替代地，5'ITR和3'ITR相对于彼此能够具有不同的三维组构(即，不对称ITR)。另外，ITR能够来自相同或不同的血清型。在一些实施方案中，ceDNA载体能够包含ITR序列，所述ITR序列具有对称的三维空间组构，以便其结构在几何空间中呈相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环(即，它们是相同的或相对于彼此呈镜像)。在一些实施方案中，一个ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个ITR可以来自不同的AAV血清型。
相应地，本文所述的技术的一些方面涉及一种用于改进抗体或融合蛋白表达和/或生产的ceDNA载体，其包含选自以下中的任一种的ITR序列：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰的AAV反向末端重复(ITR)(例如不对称修饰的ITR)；(ii)两个经修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组构(例如不对称修饰的ITR)；或(iii)对称或基本对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组构；或(iv)不对称修饰的或基本对称ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构。本文公开的ceDNA载体可以在真核细胞中产生，因此在昆虫细胞中没有原核DNA修饰和细菌内毒素污染。
本文所述的方法和组合物部分地涉及发现具有共价闭合端的非病毒无衣壳DNA载体(ceDNA载体)，其能够用于从细胞中表达至少一种抗体和/或融合蛋白，或超过一种抗体和/或融合蛋白。所述方法和组合物能够应用于例如商业抗体或融合蛋白的生产，或用于通过治疗抗体或融合蛋白治疗疾病的目的。
相应地，本文在一个方面中提供DNA载体(例如ceDNA载体)，其包含：编码至少一种转基因的至少一种异源核酸序列，所述转基因编码抗体或其抗原结合片段或融合蛋白且可操作地连接到位于两个不同AAV反向末端重复序列(ITR)之间的启动子，ITR之一包含功能AAV末端解析位点和Rep结合位点，并且ITR之一相对于另一ITR包含缺失、插入或取代；其中转基因是抗体或其片段(例如其抗原结合片段)或融合蛋白；且其中在非变性凝胶上分析时，DNA当在DNA载体上用具有单一识别位点的限制酶消化时，相较于线性和非连续DNA对照组，存在线性和连续DNA的特征色带。其它方面包括通过如本文所述的ceDNA载体在体内表达治疗抗体或融合蛋白来递送所述治疗抗体或融合蛋白，并且进一步包括使用此类抗体或融合蛋白治疗多种疾病。本文还涵盖包含如本文所述的ceDNA载体的细胞。
本发明的方面涉及产生ceDNA载体的方法，所述ceDNA载体适用于产生抗体或融合蛋白或在如本文所述的细胞中表达抗体或融合蛋白。其它实施方案涉及通过本文提供的方法产生的ceDNA载体。在一个实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的无衣壳(例如非病毒)DNA载体(ceDNA载体)获自包含多核苷酸表达构建体模板的质粒(在本文中称为“ceDNA质粒”)，所述模板以此次序包含：第一5'反向末端重复(例如AAV ITR)；异源核酸序列；和3'ITR(例如AAV ITR)，其中如本文所定义，5'ITR和3'ITR相对于彼此可以是不对称或对称的(例如WT-ITR，或对称修饰的ITR)。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能通过所属领域的普通技术人员在阅读本公开之后已知的多种方式获得。举例来说，用于产生本发明的ceDNA载体的多核苷酸表达构建体模板可以是ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒，和/或ceDNA-杆状病毒。在一个实施方案中，ceDNA-质粒包含可操作地定位于ITR之间的限制克隆位点(例如SEQ ID NO:123和/或124)，在所述限制克隆位点中能够插入表达盒，所述表达盒包含例如可操作地连接到转基因(例如编码抗体或其抗原结合片段或融合蛋白和/或报告基因的核酸)的启动子。在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体是由含有对称或不对称ITR(经修饰的ITR或WT ITR)的多核苷酸模板(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒)产生。
在允许的宿主细胞中，具有至少两个ITR的多核苷酸模板在例如Rep存在下复制而产生ceDNA载体用于产生抗体或融合蛋白。ceDNA载体产生经历两个步骤：第一，通过Rep蛋白从模板主链(例如ceDNA-质粒、ceDNA-穿梭载体、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；和第二，Rep介导复制所切除的ceDNA载体。各种AAV血清型的Rep蛋白和Rep结合位点是本领域普通技术人员众所周知的。普通技术人员了解基于至少一种功能性ITR从血清型中选择结合并复制核酸序列的Rep蛋白。例如，如果有复制能力的ITR来自AAV血清型2，那么相应的Rep将来自与该血清型一起工作的AAV血清型，例如AAV2 ITR与AAV2或AAV4 Rep一起，但不是AAV5 Rep，它不行。复制后，共价闭合端ceDNA载体继续在许可细胞中蓄积，并且ceDNA载体在Rep蛋白存在下在标准复制条件下优选随时间足够稳定，例如，蓄积达至少1pg/细胞、优选至少2pg/细胞、优选至少3pg/细胞、更优选至少4pg/细胞、更加优选至少5pg/细胞的量。
相应地，本发明的一个方面涉及一种产生ceDNA载体的方法，所述载体用于产生抗体或融合蛋白，所述方法包含以下步骤：a)在诱导宿主细胞内产生ceDNA载体的有效条件和充足时间下，在Rep蛋白存在下，培育含有缺乏病毒衣壳编码序列的多核苷酸表达构建体模板(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒，和/或ceDNA-杆状病毒)的宿主细胞群(例如昆虫细胞)，且其中宿主细胞不包含病毒衣壳编码序列；和b)从宿主细胞中收获且分离出ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰的ITR的载体多核苷酸复制，以产生ceDNA载体，以便在宿主细胞中产生抗体或融合蛋白。但是，没有表达病毒颗粒(例如AAV病毒体)。因此，没有病毒体所施加的大小限制。
从宿主细胞中分离出的适用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的存在能够如下得到证实：从宿主细胞中分离出的DNA在ceDNA载体上用具有单一识别位点的限制酶消化，并且在变性和非变性凝胶上分析所消化的DNA物质以证实线性和连续DNA的特征色带的存在(相较于线性和非连续DNA)。
出于本公开的目的，由ceDNA表达的转基因编码抗体或抗体结合片段或融合蛋白。抗体和融合蛋白在所属领域中是众所周知的并且能够结合到所关注的任何蛋白质，包括(但不限于)配体、受体、毒素、激素、酶或细胞表面蛋白，或病原体或病毒蛋白或抗原，以及翻译前和修饰后修饰的蛋白质，例如糖蛋白或类泛素化蛋白质(例如抗SUMO2/3抗体)等。抗体和抗原结合片段还包括结合到任何抗原(包括(但不限于)核酸，例如DNA(例如抗dsDNA抗体)、RNA(例如抗RNA结合抗体))的抗体。在一些实施方案中，通过本文公开的ceDNA载体产生的抗体是中和抗体或其抗原结合片段。所靶向的示例性基因和所关注的蛋白质详细地描述于本文的使用方法和治疗方法章节中。
本文还提供了在细胞或受试者中使用ceDNA载体表达具有治疗用途的抗体或融合蛋白的方法。此类抗体或融合蛋白能够用于治疗疾病。相应地，本文提供了用于治疗疾病的方法，包含向有需要的受试者施用编码治疗抗体或融合蛋白的ceDNA载体。在其它实施方案中，治疗抗体或融合蛋白能够用于靶向恶性细胞、监测特定蛋白质，或用于诊断目的。
在一些实施方案中，本申请可以根据以下段落中的任一段来限定：
1.一种无衣壳闭合端DNA(ceDNA)载体，其包含：
位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一种异源核苷酸序列，其中至少一种异源核苷酸序列编码至少一种抗体和/或融合蛋白。
1.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列编码抗体。
2.根据权利要求2所述的ceDNA载体，其中所述抗体是全长抗体、Fab、Fab'、单域抗体，或单链抗体(scFv)。
3.根据权利要求3所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列编码单域抗体或单链抗体。
4.根据权利要求4所述的ceDNA载体，其中所述至少一种异源核苷酸序列进一步编码位于所述单域抗体或单链抗体上游的分泌性前导序列。
5.根据权利要求1到3中任一项所述的ceDNA载体，其中第一异源核苷酸序列编码重链可变区，而第二异源核苷酸序列编码轻链可变区。
6.根据权利要求4所述的cDNA载体，其中所述第一异源核苷酸序列编码重链可变区和重链恒定区或其一部分，而所述第二异源核苷酸序列编码轻链可变区和轻链恒定区或其一部分。
7.根据权利要求6或权利要求7所述的ceDNA载体，其中所述第一异源核苷酸序列和/或所述第二异源核苷酸序列进一步编码位于所述重链可变区和/或轻链可变区上游的分泌性前导序列。
8.根据权利要求1到8中任一项所述的ceDNA载体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
9.根据权利要求1到9中任一项所述的ceDNA载体，其中所述抗体是IgG、IgA、IgD、IgM或IgE抗体。
10.根据权利要求10所述的ceDNA载体，其中所述抗体是IgG抗体。
11.根据权利要求11所述的ceDNA载体，其中所述IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
12.根据权利要求1到12中任一项所述的ceDNA载体，其中所述抗体结合到至少一种靶标，所述靶标选自表1、2、3A、3B、4和5中列出的靶标。
13.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列编码融合蛋白。
14.根据权利要求14所述的ceDNA载体，其中所述至少一种异源核苷酸序列进一步编码位于所述融合蛋白上游的分泌性前导序列。
15.根据权利要求14或权利要求15所述的ceDNA载体，其中所述融合蛋白包含至少一个与Fc区融合的受体胞外域。
16.根据权利要求16所述的ceDNA载体，其中所述受体胞外域是选自CTLA-4、VEGFR1、VEGFR2、LFA-3、TNFR、IL-1R1、IL-1R1、IL-1RAcP和ACVR2A的受体的胞外域。
17.根据权利要求1到17中任一项所述的ceDNA载体，其中所述抗体或融合蛋白选自表1、2、3A、3B、4或5中的抗体和融合蛋白。
18.根据权利要求1到18中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含一个或多个聚腺苷酸化位点。
19.根据权利要求1到19中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个可操作地连接到至少一种异源核苷酸序列的启动子。
20.根据权利要求1到20中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列是cDNA。
21.根据权利要求1到21中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个ITR包含功能末端解析位点和Rep结合位点。
22.根据权利要求1到22中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个来自病毒，所述病毒选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)。
23.根据权利要求1到23中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称或不对称的。
24.根据权利要求24所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称或基本对称的。
25.根据权利要求24所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是不对称的。
26.根据权利要求1到26中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是野生型，或其中所述ITR中的两个都是野生型。
27.根据权利要求1到27中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自不同病毒血清型。
28.根据权利要求1到28中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自表6中所示的病毒血清型对。
29.根据权利要求1到29中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个包含选自表7中的序列的序列。
30.根据权利要求1到30中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的至少一个是由野生型AAV ITR序列通过影响所述ITR的整体三维构象的缺失、添加或取代而变成。
31.根据权利要求1到31中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个来源于AAV血清型，所述AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
32.根据权利要求1到32中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是合成的。
33.根据权利要求1到33中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个不是野生型ITR，或其中所述ITR中的两个都不是野生型。
34.根据权利要求1到34中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过在选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的至少一个ITR区域中进行缺失、插入和/或取代而经修饰。
35.根据权利要求35所述的ceDNA载体，其中所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述A、A'、B、B'、C或C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
36.根据权利要求1到36中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而经修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
37.根据权利要求1到37中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而经修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
38.根据权利要求1到38中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而经修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的一部分和/或通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的一部分发生缺失。
39.根据权利要求1到39中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。
40.根据权利要求1到40中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。
41.根据权利要求1到41中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。
42.根据权利要求1到42中任一项所述的ceDNA载体，其中两个ITR以使得当所述ITR相对于彼此呈反向时产生整体三维对称性的方式改变。
43.根据权利要求1到43中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个包含选自表7、9A、9B和10中的序列的序列。
44.根据权利要求1到44中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列处于至少一个调控开关的控制下。
45.根据权利要求45所述的ceDNA载体，其中至少一个调控开关是选自二进制调控开关、小分子调控开关、密码调控开关、基于核酸的调控开关、转录后调控开关、辐射控制的或超声波控制的调控开关、低氧介导的调控开关、发炎应答调控开关、剪切活化调控开关，和杀灭开关。
46.一种使抗体或融合蛋白在细胞中表达的方法，包含使所述细胞与根据权利要求1到46中任一项所述的ceDNA载体接触。
47.根据权利要求47所述的方法，其中接触的所述细胞是真核细胞。
48.根据权利要求47或权利要求48所述的方法，其中所述细胞在体外或体内。
49.根据权利要求47到49中任一项所述的方法，其中所述至少一个异源核苷酸序列为了在所述真核细胞中表达而进行密码子优化。
50.根据权利要求47到50中任一项所述的方法，其中所述抗体或融合蛋白从所述细胞中分泌。
51.根据权利要求47到50中任一项所述的方法，其中所述抗体或融合蛋白滞留于所述细胞中。
52.一种用治疗抗体或治疗性融合蛋白治疗受试者的方法，其包含向所述受试者施用根据权利要求1到46中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列编码所述治疗抗体或治疗性融合蛋白。
53.根据权利要求53所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的疾病或病症：癌症、自体免疫疾病、神经退化性病症、高胆固醇血症、急性器官排斥反应、多发性硬化症、绝经后骨质疏松症、皮肤病状、哮喘或血友病。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述癌症选自实体肿瘤、软组织肉瘤、淋巴瘤和白血病。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述自体免疫疾病是选自类风湿性关节炎和克罗恩氏病。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述皮肤病状是选自牛皮癣和异位性皮肤炎。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述神经退化性病症是阿尔兹海默氏病。
58.一种医药组合物，其包含根据权利要求1到46中任一项所述的ceDNA载体。
59.一种细胞，其含有根据权利要求1到46中任一项所述的ceDNA载体。
60.一种组合物，其包含根据权利要求1到46中任一项所述的ceDNA载体和脂质。
61.根据权利要求61所述的组合物，其中所述脂质是脂质纳米颗粒(LNP)。
62.一种试剂盒，其包含根据权利要求1到46中任一项所述的ceDNA载体或根据权利要求61或62所述的组合物或根据权利要求60所述的细胞。
63.一种产生抗体或融合蛋白的方法，其包含在适于产生所述抗体或融合蛋白的条件下培养根据权利要求60所述的细胞。
64.根据权利要求64所述的方法，其进一步包含分离出所述抗体或融合蛋白。
在一些实施方案中，本文所述技术的一个方面涉及一种具有共价闭合端的非病毒无衣壳DNA载体(ceDNA载体)，其中ceDNA载体包含至少一个可操作地定位于两个反向末端重复序列之间的异源核苷酸序列，其中ITR序列可以是不对称的或对称的或基本对称的，这些术语如本文所定义，其中所述ITR中的至少一个包含功能末端解析位点和Rep结合位点，并且任选地，所述异源核酸序列编码转基因(例如抗体或融合蛋白)且其中所述载体不存在于病毒衣壳中。
下面进一步详细描述本发明的这些和其它方面。
附图说明
通过参考在附图中描绘的本公开的说明性实施方案，可以理解上面简要概述并且在下面更详细论述的本公开的实施方案。但是，附图仅示出了本公开的典型实施方案，因此不应视为对范围的限制，因为本公开可以允许其它等效的实施方案。
通过参考在附图中描绘的本公开的说明性实施方案，可以理解上面简要概述并且在下面更详细论述的本公开的实施方案。但是，附图仅示出了本公开的典型实施方案，因此不应视为对范围的限制，因为本公开可以允许其它等效的实施方案。
图1A说明如本文所公开的供抗体或融合蛋白产生用的ceDNA载体的示例性结构，其包含不对称ITR。在这个实施方案中，示例性ceDNA载体包含含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因的开放阅读框架(ORF)，例如编码抗体或融合蛋白的核酸，能够插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点(R3/R4)中。表达盒的两侧是两个反向末端重复序列(ITR)-表达盒上游(5'-端)的野生型AAV2 ITR和下游(3'-端)的修饰ITR，因此位于表达盒两侧的两个ITR彼此不对称。
图1B示出了如本文所公开的供抗体或融合蛋白产生用的ceDNA载体的示例性结构，其包含不对称ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因的开放阅读框架(ORF)，例如编码抗体或融合蛋白的核酸，能够插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒的两侧是两个反向末端重复序列(ITR)-表达盒上游(5'端)的修饰ITR和下游(3'端)的野生型ITR。
图1C示出了如本文所公开的供抗体或融合蛋白产生用的ceDNA载体的示例性结构，其包含不对称ITR以及含有增强子/启动子、转基因、转录后元件(WPRE)和聚腺苷酸信号的表达盒。开放阅读框架(ORF)允许转基因(例如编码抗体或融合蛋白的核酸)插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒的两侧是两个彼此不对称的反向末端重复序列(ITR)；表达盒上游(5'端)的修饰ITR和下游(3'端)的修饰ITR，其中5'ITR和3'ITR都是修饰ITR，但是具有不同的修饰(即，它们不具有相同的修饰)。
图1D示出了如本文所公开的供抗体或融合蛋白产生用的ceDNA载体的示例性结构，其包含如本文所定义的对称修饰的ITR或基本对称修饰的ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因的开放阅读框架(ORF)，例如编码抗体或融合蛋白的核酸，是插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒的两侧是两个修饰的反向末端重复序列(ITR)，其中5'修饰ITR和3'修饰ITR是对称的或基本上对称的。
图1E示出了如本文所公开的供抗体或融合蛋白产生用的ceDNA载体的示例性结构，其包含如本文所定义的对称修饰的ITR或基本对称修饰的ITR以及含有增强子/启动子、转基因、转录后元件(WPRE)和聚腺苷酸信号的表达盒。开放阅读框架(ORF)允许转基因(例如编码抗体或融合蛋白的核酸)插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒的两侧是两个修饰的反向末端重复序列(ITR)，其中5'修饰ITR和3'修饰ITR是对称的或基本上对称的。
图1F示出了如本文所公开的供抗体或融合蛋白产生用的ceDNA载体的示例性结构，其包含如本文所定义的对称WT-ITR或基本对称WT-ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因的开放阅读框架(ORF)，例如编码抗体或融合蛋白的核酸，是插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒的两侧是两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)，其中5'WT-ITR和3'WT ITR是对称的或基本上对称的。
图1G示出了如本文所公开的供抗体或融合蛋白产生用的ceDNA载体的示例性结构，其包含如本文所定义的对称修饰的ITR或基本对称修饰的ITR以及含有增强子/启动子、转基因、转录后元件(WPRE)和聚腺苷酸信号的表达盒。开放阅读框架(ORF)允许转基因(例如编码抗体或融合蛋白的核酸)插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒的两侧是两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)，其中5'WT-ITR和3'WT ITR是对称的或基本上对称的。
图2A提供了AAV2的野生型左ITR(SEQ ID NO:52)的T形茎-环结构，以及A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')的标识，并且还显示了末端解析位点(trs)。RBE含有一连串4个双链体四聚体，它们被认为与Rep 78或Rep 68相互作用。另外，RBE'也被认为与在所述构建体中的野生型ITR或突变ITR上装配的Rep复合物相互作用。D和D'区含有转录因子结合位点和其它保守结构。图2B显示了所提出的Rep催化的在野生型左ITR(SEQID NO:53)中产生的切割和接合活性，所述野生型左ITR包括AAV2的野生型左ITR的T形茎-环结构以及A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')的标识，并且还显示了末端解析位点(trs)以及包含若干转录因子结合位点和另一保守结构的D和D'区域。
图3A提供了野生型左AAV2 ITR(SEQ ID NO:54)的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'臂的一级结构(多核苷酸序列)(左)和二级结构(右)。图3B显示了左ITR的示例性突变ITR(也称为修饰ITR)序列。显示的是示例性突变左ITR(ITR-1，左)(SEQ ID NO:113)的A-A'臂的RBE部分、C臂和B-B'臂的一级结构(左)和预测的二级结构(右)。图3C显示了野生型右AAV2 ITR(SEQ ID NO:55)的A-A'环的含RBE部分以及B-B'和C-C'臂的一级结构(左)和二级结构(右)。图3D显示了示例性右修饰ITR。显示的是示例性突变右ITR(ITR-1，右)(SEQ IDNO:114)的A-A'臂的含RBE部分、B-B'和C臂的一级结构(左)和预测的二级结构(右)。可以如本文所教示，使用左ITR和右ITR的任何组合(例如AAV2 ITR或其它病毒血清型ITR或合成ITR)。图3A-3D的多核苷酸序列中的每一个是指在用于产生如本文所述的ceDNA的质粒或杆粒/杆状病毒基因组中所用的序列。图3A-3D每一个中还包括从质粒或杆粒/杆状病毒基因组中的ceDNA载体构型推断出的相应ceDNA二级结构以及预测的吉布斯自由能(Gibbs freeenergy)值。
图4A是示意图，其示出了制备杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的上游方法，适用于在图4B的示意图所述的方法中产生如本文所公开的供抗体或融合蛋白产生用的ceDNA载体。图4B是ceDNA产生的一种示例性方法的示意图，图4C示出了证实ceDNA载体产生的一种生化方法和过程。图4D和图4E是描述了用于鉴定从在图4B的ceDNA产生过程期间获得的细胞集结粒收获的DNA中ceDNA的存在的过程的示意图。图4D显示未切割或用限制性核酸内切酶消化并然后在天然凝胶或变性凝胶上进行电泳的示例性ceDNA的示意性预期色带。最左边的示意图是天然凝胶，并显示多个色带，表明以其双链体和未切割形式的ceDNA以至少单体和二聚体状态存在，可看到呈迁移较快的较小单体和迁移较慢的二聚体，二聚体的大小是单体的两倍。左起第二个示意图显示，当用限制性核酸内切酶切割ceDNA时，原始色带消失并出现了迁移较快(例如较小)的色带，与裂解后剩余的预期片段大小相对应。在变性条件下，原始双链体DNA是单链的，并且因为互补链是共价连接的，所以作为两倍于天然凝胶上观察到的大小的物种进行迁移。因此，在右起第二个示意图中，经过消化的ceDNA显示出与在天然凝胶上观察到的相似的色带分布，但是所述色带作为其天然凝胶对应物大小的两倍的片段进行迁移。最右边的示意图显示，在变性条件下未切割的ceDNA作为单链开环进行迁移，因此观察到的色带是在不开环的天然条件下观察到的色带大小的两倍。在此图中，“kb”用于指示核苷酸分子的相对大小，取决于背景，其基于核苷酸链长(例如，对于在变性条件下观察到的单链分子)或碱基对数量(例如，对于在天然条件下观察到的双链分子)。图4E显示了具有不连续结构的DNA。ceDNA可以通过在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制性核酸内切酶切割，并在中性和变性两种条件下产生两个大小不同(1kb和2kb)的DNA片段。图4E还显示了具有线性且连续结构的ceDNA。所述ceDNA载体可被限制性核酸内切酶切割，并产生两个DNA片段，所述片段在中性条件下以1kb和2kb迁移，但在变性条件下，链保持连接并产生以2kb和4kb迁移的单链。
图5是ceDNA载体实例跑变性凝胶的示例性图像，所述ceDNA载体用核酸内切酶消化(+)或不消化(-)(ceDNA构建体1和2使用EcoRI；ceDNA构建体3和4使用BamH1；ceDNA构建体5和6使用SpeI；且ceDNA构建体7和8使用XhoI)。构建体1-8描述于国际申请PCT PCT/US18/49996的实例1中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。确定了用星号突出显示的色带的大小，并提供在图片的底部。
图6A-6C显示了用于产生供抗体或融合蛋白产生用的ceDNA载体的示例性构建体和质体，并且显示了用于示例性目的的编码阿杜那单抗(aducanumab)的ceDNA载体。普通技术人员能够容易地用编码不同抗体或融合蛋白的任何其它核酸替换编码阿杜那单抗的核酸。图6A显示了用于产生表达ceDNA载体的阿杜那单抗(完整IgG1)的示例性ceDNA质粒(pFBdual-ceDNA-阿杜那单抗；SEQ ID NO:56)。这种ceDNA质粒包含用于表达阿杜那单抗的已进行密码子优化的核酸序列，所述核酸序列侧接于不对称ITR对(即，WT 5'ITR(wt ITR)与3'mod-ITR(R-asym ITR))之间。这种ITR对能够容易地被如本文所述的另一不对称ITR对或对称ITR对替换。此外，这种质粒按照5'到3'方向包含侧接于ITR对之间的以下各者：SV40增强子(SEQ ID NO:126)、人EF1α启动子(SEQ ID NO:77)或其片段(SEQ ID NO:78)，和VH1-02分泌性前导序列(SEQ ID NO:88)、优化的阿杜那单抗重链(HC)核酸序列(SEQ ID NO:57)、SV40聚腺苷酸化序列(SEQ ID NO:86)；以及位于阿杜那单抗轻链(LC)序列上游的以下各者：CMV增强子(SEQ ID NO:83)、rEF1启动子(SEQ ID NO:85或SEQ ID NO:150)、VK A26前导序列(SEQ ID NO:89)、优化的阿杜那单抗轻链(LC)核酸序列(SEQ ID NO:58)和BGH聚腺苷酸化序列(SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:148)。本文所述抗体的任何其它重链或轻链序列能够容易地被优化的阿杜那单抗重链(HC)序列和优化的阿杜那单抗轻链(LC)核酸序列取代，参见例如本文中的表1-5。图6B是示例性插入片段，其可以作为模块化组分用于插入所期望的ceDNA载体中以产生如图6A中的质粒。图6C是包含用于产生阿杜那单抗的序列的ceDNA-Adu-完整IgG1质粒的区域的线性图。
图7A-7G显示了示例性ceDNA载体，其能够表达如本文所公开的多种不同抗体或抗原结合片段或融合蛋白。示例性ceDNA载体还针对IRES序列、启动子序列、增强子序列、接头序列、聚腺苷酸化序列的使用示出了多种构型。图7A显示了用于产生抗体的ceDNA载体构建体的一个实施方案，其中聚腺苷酸化序列位于重链序列以及轻链核酸序列上游的任选增强子之后。图7B显示了用于产生抗体的ceDNA载体构建体的一个实施方案，其中聚腺苷酸化序列位于重链序列以及轻链核酸序列上游的IRES之后。图7C显示了类似于图7A的用于产生抗体片段(例如抗原结合片段)的ceDNA载体构建体的一个实施方案，包括其中聚腺苷酸化序列位于重链Fab片段序列以及轻链片段核酸序列上游的任选增强子之后。图7D显示了如本文所公开的用于产生抗体的ceDNA载体构建体的一个实施方案，包括其中聚腺苷酸化序列位于轻链序列之后。图7E显示了如本文所公开的用于产生抗体的ceDNA载体构建体的一个实施方案，包括其中聚腺苷酸化序列位于重链序列之后。图7F显示了如本文所公开的用于产生单域抗体(dAb)的ceDNA载体构建体的一个实施方案，包括其中聚腺苷酸化序列位于dAb序列之后。图7G显示了如本文所公开的用于产生抗体片段(例如单链可变片段融合蛋白(scFv)或单链抗体)的ceDNA载体构建体的一个实施方案，包括其中聚腺苷酸化序列位于单链抗体序列的scFv序列之后。如所属领域的技术人员将了解，如本文所述的用于产生抗体的ceDNA载体可以模块化方式使用，使得所期望的调控序列或编码抗体或其片段的异源核酸能够与其它所期望的序列互换。也就是说，ceDNA载体能根据所期望的应用定制。图7A-7G中还显示了如下实施方案：其中可变链(VH和VL)和恒定链(CH和CL)的核酸序列与Fc序列彼此邻近定位，或替代地，Fc能够经由如本文所公开的接头序列与编码VH和VL的序列连接。
图8A-8B显示了在对所表达的蛋白质进行一步提纯之后，对阿杜那单抗(完整IgG1)抗体的表达进行的示例性SDS-Page(图8A)和蛋白质印迹(图8B)分析，所述抗体是由如实例9中所述的ceDNA-IgG1-Adu构建体表达。图8A显示了所表达抗体的SDS-PAGE凝胶影像。泳道如下：M1是蛋白质标志物(Takara目录号3452)，The)，并且提纯的阿杜那单抗是在还原条件(泳道1)和非还原(泳道2)条件下显示。在还原条件下存在两个色带，而在非还原条件下仅存在单个色带，这与所述蛋白质是具有重链和轻链的抗体是一致的，其在非还原条件下以单个色带形式迁移，而在还原条件下作为组成性重链和轻链迁移。图8B显示了经抗人类IgG抗体免疫染色的蛋白质印迹影像。泳道如下：M2是蛋白质标志物(GenScript，目录号M00521)，并且P是阳性对照人IgG1抗体(Sigma)。
图9A-9B显示表达GFP或阿杜那单抗(完整IgG1)抗体的ceDNA的表达，所述抗体是由ceDNA-IgG1-Adu载体表达。图9A提供了如实例8中所述的经ceDNA-GFP质粒(上图)和ceDNA-GFP载体(下图)转染的HEK293T细胞的荧光显微影像。两个影像中均存在丰裕荧光，表明转基因GFP在ceDNA治疗的细胞中发生了显著转染和表达。图9B提供了如实例8中所述的通过SDS-PAGE电泳分离的细胞样品的相同膜转移的两个不同影像。下图是丽春红(Ponceau)染色膜，其显示所有蛋白质含量；上图是蛋白质印迹，其中可见的色带反映了人抗体的存在。在泳道7-10中，抗体重链在约50kDa下迁移，而抗体轻链在约25kDa下迁移；两条链在所有四个泳道中均可见。
图10A-10B显示了ceDNA产生的阿杜那单抗抗体的特征。图10A显示了实例9中所述的HPLC分析的结果，其显示的单峰对应于ceDNA产生的阿杜那单抗。图10B描绘了如实例9中所述的ELISA分析的结果，其评估了经提纯的阿杜那单抗抗体识别所固定的β-淀粉样蛋白(1-42)配体的能力。
图11以图形方式描绘了实例10中所述的实验的结果。经缺乏阿杜那单抗转基因的ceDNA构建体治疗的小鼠的阴性对照样品(标记为ceDNA阴性对照)处于或低于分析中的定量下限。相比之下，经ceDNA-IgG构建体治疗的小鼠的血清在第3天和第7天时间点存在高水平的人类免疫球蛋白。
图12提供了如实例12中所述的通过SDS-PAGE电泳分离的细胞样品的相同膜转移的两种不同时间暴露。上图是在6秒暴露时获取，而下图是在20秒暴露之后获取。在凝胶的顶部发现了对应于完整抗体的色带，(并且分别在约50kDa和约25kDa下迁移的有限量的已还原重链和轻链)在泳道5、7(均为阿杜那单抗)和11(贝伐单抗(bevacizumab))中可见(参见箭头)。在泳道9中，观察到在泳道顶部附近存在Fc融合蛋白，并且未观察到较低分子量的组成性产物，正如所预期。
具体实施方式
本文提供了如本文所述的供产生抗体用的ceDNA载体，其包含一种或多种编码抗体(例如重链、轻链、构架、Fab'、scAb)的异源核酸。本文还提供了如本文所述的供融合蛋白产生用的ceDNA载体，其包含一种或多种编码融合蛋白的异源核酸。此类载体能够通过ceDNA载体的细胞内表达而用于产生商业抗体或融合蛋白，或用于递送如本文所述的治疗抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，抗体或融合蛋白的表达能够包含使抗体或融合蛋白从表达其的细胞中分泌出来，或替代地，在一些实施方案中，所表达的抗体或融合蛋白能够靶向表达其的细胞内的蛋白质(例如，抗体是胞内抗体)。在一些实施方案中，ceDNA载体在受试者的肌肉(例如骨骼肌)中表达抗体或其抗原结合片段或融合蛋白，所述受试者的肌肉能够充当储槽供抗体或融合蛋白产生和分泌到许多全身代谢区。
I.定义
除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域的普通技术人员通常所了解的含义。应了解，本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂等，因此可以变化。本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案，而无意于限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由权利要求书限定。免疫学和分子生物学中常用术语的定义能够在下列文献中找到：《默克诊疗手册(The Merck Manual of Diagnosis andTherapy)》第19版，默克夏普公司(Merck Sharp&Dohme Corp.)出版，2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编辑)，《病毒学领域(Fields Virology)》第6版，Lippincott Williams&Wilkins出版，美国宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,PA,USA)(2013)；Knipe,D.M.和Howley,P.M.(编辑),《分子细胞生物学与分子医学百科全书(TheEncyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine)》，Blackwell科学有限公司出版,1999-2012(ISBN 9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编辑)，《分子生物学与生物技术：综合案头参考(Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensive Desk Reference)》，由VCH Publishers有限公司出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；Werner Luttmann的《免疫学(Immunology)》，由Elsevier出版，2006；《詹韦氏免疫生物学(Janeway's Immunobiology)》，Kenneth Murphy,Allan Mowat,CaseyWeaver(编辑)，Taylor&Francis有限公司，2014(ISBN 0815345305、9780815345305)；《勒温基因XI(Lewin's Genes XI)》，由Jones&Bartlett Publishers出版，2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green和Joseph Sambrook，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，第4版，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，美国纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.,USA)(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人，《分子生物学的基本方法(Basic Methods in MolecularBiology)》，Elsevier科学出版有限公司，美国纽约(2012)(ISBN 044460149X)；《酶学实验室方法：DNA(Laboratory Methods in Enzymology:DNA)》,Jon Lorsch(编辑)Elsevier,2013(ISBN 0124199542)；《分子生物学现代方法(Current Protocols in MolecularBiology，CPMB)》，Frederick M.Ausubel(编辑)，John Wiley and Sons，2014(ISBN047150338X、9780471503385),《蛋白质科学现代方法(Current Protocols inProtein Science，CPPS)》，John E.Coligan(编辑)，John Wiley and Sons,Inc.，2005；以及《免疫学现代方法(Current Protocols in Immunology，CPI)》(John E.Coligan,ADA MKruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe(编辑)John Wiley andSons,Inc.，2003(ISBN 0471142735、9780471142737)，其内容以全文引用的方式并入本文中。
如本文所用，术语“异源核苷酸序列”和“转基因”可互换使用，并且是指并入如本文公开的ceDNA载体中并可以由其递送和表达的感兴趣核酸(编码衣壳多肽的核酸除外)。
如本文所用，术语“表达盒”和“转录盒”可互换使用，并且是指一段线性核酸，其包括与一个或多个启动子或足以引导转基因转录的其它调控序列可操作地连接的转基因，但是不包含衣壳编码序列、其它载体序列或反向末端重复区域。表达盒可以另外包含一个或多个顺式作用序列(例如启动子、增强子或阻遏子)、一个或多个内含子和一个或多个转录后调控元件。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物形式。因此，这个术语包括单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交物、或包括嘌呤和嘧啶碱基或其它天然、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指单链或双链DNA的约5至约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而，出于本公开的目的，寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也称为“寡聚物(oligomer)”或“寡聚物(oligo)”，并且可以从基因中分离出来，或通过本领域已知的方法化学合成。应了解术语“多核苷酸”和“核酸”包括单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸(如果所描述的实施方案适用的话)。
如本文所用，术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其是从天然基因中分离的，或者以自然界中不另外存在或合成的方式进行修饰以含有核酸区段。当核酸构建体包含表达本公开的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。“表达盒”包括可操作地连接至启动子的DNA编码序列。
“可杂交的”或“互补的”或“基本上互补的”意指核酸(例如RNA)包括使其能够与另一核酸序列在体外和/或体内适当的温度和溶液离子强度的条件下非共价结合，即形成沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pair)和/或G/U碱基对、“退火”或“杂交”以序列特异性的反向平行方式(即，核酸特异性地结合于互补核酸)的核苷酸序列。如本领域已知的，标准的沃森-克里克碱基对包括：腺嘌呤(A)与胸苷(T)配对，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。另外，在本领域中还已知对于两个RNA分子(例如dsRNA)之间的杂交，鸟嘌呤(G)碱基与尿嘧啶(U)配对。例如，在与mRNA中的密码子进行tRNA反密码子碱基配对的情况下，G/U碱基配对部分负责遗传密码的简并性(即，冗余)。在本公开的上下文中，靶向主题DNA的RNA分子的蛋白质结合区段(dsRNA双链体)的鸟嘌呤(G)被认为与尿嘧啶(U)互补，反之亦然。这样，当可以在靶向主题DNA的RNA分子的蛋白质结合区段(dsRNA双链体)的给定核苷酸位置形成G/U碱基对时，该位置不被认为是非互补的，而是被认为是互补的。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可以包括编码和非编码的氨基酸、经过化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有修饰的肽骨架的多肽。
如本文所用，术语“抗体”涵盖了任何抗体或抗体片段(即，功能抗体片段)，或对所期望的抗原或抗原决定基保持抗原结合活性的抗原结合片段。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含免疫球蛋白链或其片段和至少一种免疫球蛋白可变域序列。抗体实例包括(但不限于)scFv、Fab片段、Fab'、F(ab')2、单域抗体(dAb)、重链、轻链、重链和轻链、完整抗体(例如包括Fc、Fab、重链、轻链、可变区等中的每一个)、双特异性抗体、双功能抗体、线性抗体、单链抗体、胞内抗体、单克隆抗体、嵌合抗体，或多聚抗体。另外，抗体能够来源于任何哺乳动物，例如灵长类动物、人、大鼠、小鼠、马、山羊等。在一个实施方案中，抗体是人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，抗体是经修饰的抗体。在一些实施方案中，抗体组分能够分开表达，使得抗体在蛋白质组分表达之后自组装。在一些实施方案中，抗体具有所期望的功能，例如为了治疗疾病或疾病症状的目的，使所期望的蛋白质发生相互作用和抑制。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含构架区或Fc区。抗体片段能够保持完整抗体的活性的10-99％(例如10-90％、10-80％、10-70％、10-60％、10-50％、10-40％、10-30％、10-20％、50-99％、50-90％、50-80％、50-70％、50-60％、20-99％、30-99％、40-99％、60-99％、70-99％、80-99％、90-99％或其间的任何活性)。本文还预期所述功能抗体片段包含的活性大于完整抗体的活性(例如至少2倍或更高)。在另一个实施方案中，抗体片段对其靶标的亲和力基本上类似于完整抗体对相同靶标(例如抗原决定基)的亲和力。抗体能够“活化”，以便其增强靶蛋白的活性；或可以具有“抑制性”(例如中和或阻断抗体)，以便其减少靶蛋白的活性。
如本文所用，术语抗体分子的“抗原结合域”是指抗体分子(例如免疫球蛋白(Ig)分子)的参与抗原结合的一部分。在实施方案中，抗原结合位点是由重链(H)和轻链(L)的可变区(V)的氨基酸残基形成。重链和轻链可变区内的三个高趋异性片段(称为高变区)安置于较保守的侧接片段(称为“构架区”(FR))之间。FR是在免疫球蛋白的高变区之间和邻近处天然发现的氨基酸序列。在实施方案中，在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此安置以形成抗原结合表面，所述抗原结合表面与所结合抗原的三维表面互补。重链和轻链中的每一个的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。构架区和CDR已经定义且描述于例如Kabat,E.A.等人(1991)《免疫学所关注的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》第五版，美国健康和人服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号91-3242，以及Chothia,C.等人(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917。每条可变链(例如可变重链和可变轻链)典型地由三个CDR和四个FR构成，其从氨基末端到羧基末端、按照氨基酸次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。如本文所用，术语“互补决定区”和“CDR”是指抗体可变区内的氨基酸序列，其赋予抗原特异性和结合亲和力。一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)且每个轻链可变区中存在三个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。给定CDR的确切氨基酸序列边界能够使用许多已知方案中的任一种测定，包括以下文献中所述的那些方案：Kabat等人(1991)，《免疫学所关注的蛋白质的序列》第5版，公共卫生服务部(Public Health Service)，美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)，马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Md.)(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人(1997)JMB 273，927-948(“Chothia”编号方案)。如本文所用，根据“Chothia”编号方案定义的CDR有时也被称作“高变环”。举例来说，根据Kabat，重链可变域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且轻链可变域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据Chothia，VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并且VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。每个VH和VL典型地包括三个CDR和四个FR，其从氨基末端到羧基末端、按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
如本文所用，术语“全长抗体”是指免疫球蛋白(Ig)分子(例如IgG、IgE、IgM抗体)，例如天然存在的免疫球蛋白(Ig)分子，且由正常的免疫球蛋白基因片段重组过程形成。
如本文所用，术语“功能抗体片段”或“抗原结合片段”可互换使用且指结合到相同抗原或抗原决定基(如完整(例如全长)抗体所识别)的抗体片段。术语“抗体片段”或“功能片段”还包括由可变区组成的经分离的片段，例如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段；或重组单链多肽分子，其中轻链与重链可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接。在一些实施方案中，抗体片段不包括无抗原结合活性的抗体部分，例如Fc片段或单一氨基酸残基。在一些实施方案中，功能抗体片段保持完整或全长抗体活性的至少20％，例如如通过测量靶蛋白的活化或抑制程度所评估。在其它实施方案中，功能抗体片段保持完整抗体的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或甚至100％(即，基本上相似)活性。本文还预期功能抗体片段相较于完整抗体将包含增强的活性(例如至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍或更多倍)。
如本文所用，“免疫球蛋白可变域序列”是指能够形成免疫球蛋白可变域结构的氨基酸序列。举例来说，所述序列可以包括天然存在的可变域的氨基酸序列的全部或一部分。举例来说，所述序列可以或可以不包括一个、两个或更多个N端或C端氨基酸，或可以包括与蛋白质结构形成相容的其它变化。
如本文所用，“构架”或“构架序列”是指减去CDR的可变区的剩余序列。由于CDR序列的确切定义能够根据不同系统确定，因此构架序列的含义相应地服从于不同解释。在每条链上，六个CDR(轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3以及重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)还将轻链和重链上的构架区分成四个子区域(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1与FR2之间，CDR2位于FR2与FR3之间，且CDR3位于FR3与FR4之间。在未将特定子区指定为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，如其它方式提及的框架区代表天然存在的单一免疫球蛋白链的可变区内的FR组合。如本文所用，FR代表四个子区域之一，且FR代表构成构架区的四个子区域中的两个或更多个。
“编码”特定抗体或抗原结合片段的DNA序列是转录成特定RNA和/或蛋白质的DNA核酸序列。DNA多核苷酸可以编码被翻译成蛋白质的RNA(mRNA)，或者DNA多核苷酸可以编码未被翻译成蛋白质的RNA(例如tRNA、rRNA或靶向DNA的RNA；也称为“非编码”RNA或“ncRNA”)。
如本文所用，如本文所用的术语“融合蛋白”是指包含来自至少两种不同蛋白质的蛋白质域的多肽。举例来说，融合蛋白可以包含(i)抗体或其片段(例如抗体的抗原结合部分或抗原结合片段)或配体结合域和(ii)至少一种非抗体蛋白质。本文中涵盖的融合蛋白包括(但不限于)抗体，或抗体的Fc或抗原结合片段与所关注的蛋白质(例如受体、配体、酶或肽的胞外域)的融合体。作为融合蛋白的一部分的抗体或其抗原结合片段可以是单特异性抗体或双特异性或多特异性抗体。
如本文所用，术语“基因组安全港基因”或“安全港基因”是指可以插入核酸序列以使得该序列可以以可预测的方式整合和起作用(例如表达所关注蛋白质)且对内源基因活性没有明显的负面影响或不促进癌症的基因或基因座。在一些实施方案中，安全港基因也是可有效地表达所插入的核酸序列并且表达水平比非安全港位点高的基因座或基因。
如本文所用，术语“基因递送”意指将外来DNA转移到宿主细胞中以施加基因疗法的方法。
如本文所用，术语“末端重复”或“TR”包括任何包含至少一个最低需要的复制起点和包含回文发夹结构的区域的病毒末端重复或合成序列。Rep结合序列(“RBS”)(也称为RBE(Rep结合元件))和末端解链位点(“TRS”)共同构成“最低需要的复制起点”，因此TR包含至少一个RBS和至少一个TRS。在给定的一段多核苷酸序列内彼此是反向互补序列的TR通常各自被称为“反向末端重复”或“ITR”。在病毒的背景下，ITR介导复制、病毒包装、整合和原病毒拯救。正如在本发明中意外发现的，在全长上不是反向互补序列的TR仍然可以执行ITR的传统功能，因此术语ITR在本文中用于指ceDNA基因组或ceDNA载体中能够介导ceDNA载体复制的TR。本领域普通技术人员将了解，在复杂的ceDNA载体构型中，可以存在超过两个ITR或不对称的ITR对。ITR可以是AAV ITR或非AAV ITR，或可以源自于AAV ITR或非AAV ITR。例如，ITR可以源自于细小病毒科，其涵盖细小病毒和依赖病毒(例如犬细小病毒、牛细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、人细小病毒B-19)，或可以将充当SV40复制起点的SV40发夹用作ITR，其可以通过截断、取代、缺失、插入和/或添加而被进一步修饰。细小病毒科家族病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染无脊椎动物的浓核病毒亚科。依赖病毒属包括腺相关病毒(AAV)的病毒家族，其能够在脊椎动物宿主中复制，所述宿主包括但不限于人、灵长类、牛、犬、马和羊物种。本文中为了方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5'(上游)的ITR称为“5'ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3'(下游)的ITR称为“3'ITR”或“右ITR”。
“野生型ITR”或“WT-ITR”是指AAV或其它依赖病毒中天然存在的ITR序列的序列，其保留例如Rep结合活性和Rep切口能力。由于遗传密码的简并性或漂移，来自任何AAV血清型的WT-ITR的核苷酸序列可能与规范的天然存在的序列略有不同，因此，本文涵盖使用的WT-ITR序列包括由于在产生过程中发生的天然存在的变化(例如复制误差)而产生的WT-ITR序列。
如本文所用，术语“基本上对称的WT-ITR”或“基本上对称的WT-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对WT-ITR，它们都是在整个长度上具有反向互补序列的野生型ITR。例如，ITR即使具有一个或多个偏离规范的天然存在的序列的核苷酸，只要变化不影响ITR的特性和序列的整体三维结构，也可以被认为是野生型序列。在一些方面，偏离的核苷酸代表保守的序列变化。作为一个非限制性实例，序列与规范序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(例如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与另一个WT-ITR具有对称的三维空间组构，以使它们的3D结构在几何空间中具有相同的形状。基本上对称的WT-ITR在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。通过确定具有与合适的Rep蛋白配对的可操作的Rep结合位点(RBE或RBE')和末端解链位点(trs)，可以在功能上确认基本上对称的WT-ITR为WT。可以选择测试其它功能，包括在许可条件下的转基因表达。
如本文所用，短语“修饰ITR”或“mod-ITR”或“突变ITR”在本文中可互换使用，并且是指与来自相同血清型的WT-ITR相比在至少一个或多个核苷酸中具有突变的ITR。所述突变能够引起ITR的A、C、C'、B、B'区域中的一个或多个发生变化，并且能够使得三维空间组构(即，其几何空间中的3D结构)相较于相同血清型的WT-ITR的3D空间组构发生变化。
如本文所用，术语“不对称ITR”也称为“不对称ITR对”，是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内在全长上不反向互补的一对ITR。作为一个非限制性实例，不对称的ITR与其同源ITR不具有对称的三维空间组构，使得其3D结构在几何空间中具有不同的形状。换句话说，不对称的ITR对具有不同的整体几何结构，即它们在3D空间中具有不同的A、C-C'和B-B'环组织(例如，一个ITR与同源ITR相比可能具有短的CC'臂和/或短的BB'臂)。两个ITR之间的序列差异可能是由于一个或多个核苷酸添加、缺失、截断或点突变引起的。在一个实施方案中，不对称ITR对中的一个ITR可以是野生型AAV ITR序列，另一个ITR是如本文定义的修饰ITR(例如非野生型或合成ITR序列)。在另一个实施方案中，不对称ITR对中的ITR皆不是野生型AAV序列，并且两个ITR是在几何空间中具有不同形状的经修饰的ITR(即，不同的整体几何结构)。在一些实施方案中，一个不对称ITR对中的一个mod-ITR能够具有短C-C'臂，而另一个ITR能够具有不同修饰(例如单臂，或短B-B'臂等)，使得它们具有不同于同源不对称mod-ITR的三维空间组构。
如本文所用，术语“对称ITR”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对ITR，其相对于野生型依赖病毒ITR序列发生突变或修饰并且在其全长上反向互补。这两个ITR都不是野生型ITR AAV2序列(即，它们是修饰ITR，也称为突变ITR)，并且由于核苷酸的添加、缺失、取代、截断或点突变，而在序列上与野生型ITR不同。本文中为了方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5'(上游)的ITR称为“5'ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3'(下游)的ITR称为“3'ITR”或“右ITR”。
如本文所用，术语“基本上对称的修饰ITR”或“基本上对称的mod-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体中的一对修饰ITR，它们在其全长上具有反向互补序列。例如，修饰ITR即使具有一些偏离反向互补序列的核苷酸，只要变化不影响特性和整体形状，也可以认为是基本上对称的。作为一个非限制性实例，序列与规范序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(例如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与其同源的修饰ITR具有对称的三维空间组构，以使它们的3D结构在几何空间中具有相同的形状。换句话说，基本上对称的修饰ITR对具有在3D空间中组织的相同的A、C-C'和B-B'环。在一些实施方案中，来自mod-ITR对的ITR可以具有不同的反向互补核苷酸序列，但是仍然具有相同的对称三维空间组构，即两个ITR都具有产生相同的整体3D形状的突变。举例来说，mod-ITR对中的一个ITR(例如5'ITR)可以来自一种血清型，而另一个ITR(例如3'ITR)可以来自不同血清型，然而，两者均能够具有相同的相应突变(例如如果5'ITR在C区域中具有缺失，则来自不同血清型的经修饰的同源3'ITR在C'区域中的相应位置具有缺失)，使得经修饰的ITR对具有相同的对称三维空间组构。在此类实施例中，经修饰的ITR对中的每个ITR能够来自不同血清型(例如AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，例如AAV2与AAV6的组合，其中一个ITR中的修饰在来自不同血清型的同源ITR的相应位置得到反映。在一个实施方案中，基本上对称的修饰ITR对是指一对修饰ITR(mod-ITR)，只要ITR之间核苷酸序列的差异不影响性质或整体形状并且它们在3D空间中具有基本相同的形状即可。作为非限制性实例，如通过本领域公知的标准方法如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)或BLASTN测定，mod-ITR与规范的mod-ITR具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且还具有对称的三维空间组构，以使其3D结构在几何空间中的形状相同。基本上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的mod-ITR对中的修饰ITR缺失C-C'臂，那么同源mod-ITR相应缺失C-C'环，并且在其同源mod-ITR的几何空间呈相同形状下，剩余A和B-B'环具有相似3D结构。
术语“位于两侧”是指一个核酸序列相对于另一核酸序列的相对位置。通常，在序列ABC中，B的两侧是A和C。对于A×B×C排列，情况也是如此。因此，位于两侧的序列在被侧接的序列之前或之后，但不必与被侧接的序列相邻或紧邻。在一个实施方案中，术语位于两侧是指在线性双链体ceDNA载体的每个末端出的末端重复序列。
如本文所用，术语“ceDNA基因组”是指还并入了至少一个反向末端重复区域的表达盒。ceDNA基因组还可以包含一个或多个间隔区。在一些实施方案中，ceDNA基因组作为DNA的分子间双链体多核苷酸并入质粒或病毒基因组中。
如本文所用，术语“ceDNA间隔区”是指分隔ceDNA载体或ceDNA基因组中的功能元件的间插序列。在一些实施方案中，ceDNA间隔区将两个功能元件保持在对于最佳功能性来说所期望的距离上。在一些实施方案中，ceDNA间隔区提供或增加了ceDNA基因组在例如质粒或杆状病毒内的遗传稳定性。在一些实施方案中，ceDNA间隔区通过提供克隆位点等的便利位置，促进ceDNA基因组的就绪遗传操作。举例来说，在某些方面中，含有若干限制性核酸内切酶位点的寡核苷酸“多酶切点接头”或设计成不具有已知蛋白质(例如转录因子)结合位点的非开放阅读框架序列能够定位于ceDNA基因组中以分离顺式作用因子，例如将6聚体、12聚体、18聚体、24聚体、48聚体、86聚体、176聚体等插入末端解析位点与上游转录调控元件之间。类似地，可以在多聚腺苷酸化信号序列和3'-末端解链位点之间并入间隔区。
如本文所用，术语“Rep结合位点”、“Rep结合元件”、“RBE”和“RBS”可互换使用并且是指Rep蛋白(例如AAV Rep 78或AAV Rep 68)的结合位点，其在Rep蛋白结合后允许Rep蛋白在并入了所述RBS的序列上发挥其位点特异性核酸内切酶活性。RBS序列和其反向互补序列一起形成单个RBS。RBS序列在所属领域中是已知的，并且包括例如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)，AAV2中所鉴定的RBS序列。在本发明的实施方案中可以使用任何已知的RBS序列，包括其它已知的AAV RBS序列和其它天然已知的或合成的RBS序列。不受理论束缚，相信Rep蛋白的核酸酶域结合到双链体核苷酸序列GCTC，并且因此，两种已知的AAV Rep蛋白直接结合到双链体寡核苷酸5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'(SEQ ID NO:60)并且在其上稳定组装。另外，可溶性聚集性构象异构体(即，数目未定的相互缔合的Rep蛋白)解离并结合到含有Rep结合位点的寡核苷酸。每个Rep蛋白都与每个链上的含氮碱基和磷酸二酯骨架相互作用。与含氮碱基的相互作用提供了序列特异性，而与磷酸二酯骨架的相互作用是非或较少序列特异性的，并稳定了蛋白质-DNA复合物。
如本文所用，术语“末端解链位点”和“TRS”在本文可互换使用，是指一个区域，在此Rep与5'胸苷形成酪氨酸-磷酸二酯键，产生3'OH，充当通过DNA聚合酶、例如DNA polδ或DNA polε进行DNA延伸的底物。或者，Rep-胸苷复合物可以参与配位连接反应。在一些实施方案中，TRS最低限度地涵盖非碱基配对的胸苷。在一些实施方案中，TRS的切口效率可以至少部分由它在同一分子内距RBS的距离来控制。当受体底物是互补的ITR时，所产生的产物是分子内双链体。TRS序列在所属领域中已知，并且包括例如5'-GGTTGA-3'(SEQ ID NO:61)，AAV2中所鉴定的六核苷酸序列。本发明的实施方案中可以使用任何已知的TRS序列，包括其它已知的AAV TRS序列和其它天然已知或合成的TRS序列，例如AGTT(SEQ ID NO:62)、GGTTGG(SEQ ID NO:63)、AGTTGG(SEQ ID NO:64)、AGTTGA(SEQ ID NO:65)和其它基序，例如RRTTRR(SEQ ID NO:66)。
如本文所用，术语“ceDNA-质粒”是指一种包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的质粒。
如本文所用，术语“ceDNA-杆粒”是指一种包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的感染性杆状病毒基因组，其能够作为质粒在大肠杆菌中增殖，因此可以作为杆状病毒的穿梭载体操作。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒”是指一种在杆状病毒基因组内包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的杆状病毒。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒感染的昆虫细胞”和“ceDNA-BIIC”可互换使用，是指被ceDNA-杆状病毒感染的无脊椎动物宿主细胞(包括但不限于昆虫细胞(例如Sf9细胞))。
如本文所用，术语“闭合端DNA载体”是指具有至少一个共价闭合端的无衣壳DNA载体，其中所述载体的至少一部分具有分子内双链体结构。
如本文所用，术语“ceDNA载体”与“ceDNA”可互换地使用并且指包含至少一个末端回文结构的闭合端DNA载体。在一些实施方案中，ceDNA包含两个共价闭合端。
如本文中所定义，“报告分子”是指可用于提供可检测的读出数的蛋白质。报告分子通常产生可测量的信号，例如荧光、颜色或发光。报告蛋白编码序列编码在细胞或生物中的存在易于观察到的蛋白质。例如，荧光蛋白当被特定波长的光激发时会导致细胞发荧光，荧光素酶引起细胞催化产生光的反应，以及例如β-半乳糖苷酶之类的酶将底物转化为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报告多肽包括但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)和其它荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其它在本领域中公知的报告多肽。
如本文所用，术语“效应蛋白”是指一种提供可检测的读出数的多肽，例如作为报告多肽，或更适当地，作为杀死细胞的多肽，例如毒素，或致使细胞易用所选作用剂或因缺乏所选作用剂而被杀死的作用剂。效应蛋白包括直接靶向或损害宿主细胞的DNA和/或RNA的任何蛋白质或肽。例如，效应蛋白可以包括但不限于，靶向宿主细胞DNA序列(无论是基因组的还是在染色体外元件上的)的限制性核酸内切酶、降解细胞存活所必需的多肽靶标的蛋白酶、DNA回旋酶抑制剂、以及核糖核酸酶型毒素。在一些实施方案中，由如本文所述的合成生物回路控制的效应蛋白表达可作为一个因子参与另一个合成生物回路，从而扩大了生物回路系统应答性的范围和复杂度。
转录调节子是指活化或阻遏所关注基因转录的转录活化因子和阻遏子。启动子是启动特定基因转录的核酸区域。转录活化因子通常在附近与转录启动子结合并募集RNA聚合酶来直接启动转录。阻遏子与转录启动子结合，并在空间上阻碍RNA聚合酶启动转录。其它转录调节子可取决于它们的结合位置以及细胞和环境条件来充当活化子或阻遏子。转录调节子类别的非限制性实例包括但不限于同源域蛋白、锌指蛋白、翼状螺旋(叉头)蛋白和亮氨酸拉链蛋白。
如本文所用，“阻遏蛋白”或“诱导蛋白”是与调控序列元件结合并分别阻遏或活化与调控序列元件可操作连接的序列的转录的蛋白质。如本文所述的优选的阻遏和诱导蛋白对至少一种输入剂或环境输入物的存在或不存在敏感。如本文所述的优选蛋白质是模块的形式，包含例如可分离的DNA结合和输入剂结合或应答元件或结构域。
如本文所用，“载体(carrier)”包括任何和所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬液、胶体等。这样的介质和作用剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。补充的活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不会产生毒性的、过敏性的或类似的不良反应的分子实体和组合物。
如本文所用，“输入剂应答结构域”是转录因子的一个结构域，其以致使连接的DNA结合融合结构域对条件或输入剂的存在作出应答的方式与所述条件或输入剂结合或以其它方式作出应答。在一个实施方案中，条件或输入剂的存在导致输入剂应答结构域或其融合的蛋白质发生构象变化，从而改变转录因子的转录调制活性。
术语“体内”是指在生物体、例如多细胞动物中或内部进行的测定或过程。在本文描述的一些方面中，当使用单细胞生物例如细菌时，可以说方法或用途是在“体内”发生的。术语“离体”是指使用具有完整膜的活细胞进行的方法和用途，所述活细胞在多细胞动物或植物体之外，例如外植体、培养细胞，包括原代细胞和细胞系、转化的细胞系，以及提取的组织或细胞，包括血细胞，等等。术语“体外”是指不需要存在具有完整膜的细胞的测定和方法，例如细胞提取物，并且可以指在非细胞系统、例如不包含细胞或细胞系统的介质、例如细胞提取物中引入可编程的合成生物回路。
如本文所用的术语“启动子”是指通过驱动核酸序列的转录来调节另一核酸序列表达的任何核酸序列，其可以是编码蛋白质或RNA的异源靶基因。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性的或其任何组合。启动子是核酸序列的控制区域，在此核酸序列的其余部分的启动和转录速率是受控的。启动子还可以含有可以结合调节蛋白和分子的遗传元件，例如RNA聚合酶和其它转录因子。在本文所述的方面的一些实施方案中，启动子可以驱动调节启动子本身的表达的转录因子的表达。在启动子序列内将发现转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域。真核启动子将经常但并非总是含有“TATA”框和“CAT”框。各种启动子，包括诱导型启动子，可用于驱动本文公开的ceDNA载体中转基因的表达。启动子序列可以在其3'末端以转录起始位点为界并且向上游延伸(5'方向)以包括为了在高于背景的可检测水平上引发转录所必需的最少数目个碱基或元件。
如本文所用，术语“增强子”是指顺式作用调控序列(例如50-1,500个碱基对)，其结合一种或多种蛋白质(例如活化剂蛋白质或转录因子)以增强核酸序列的转录活化。增强子可以位于其调节的基因起始位点上游或基因起始位点下游最多1,000,000个碱基对处。增强子可以位于内含子区域内，或无关基因的外显子区域中。
启动子可以被说成驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其转录。短语“可操作地连接”、“操作性定位”、“操作性连接”，“在控制下”和“在转录控制下”指示启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和/或取向，以控制该序列的转录启动和/或表达。如本文所用的“反向启动子”是指核酸序列处于相反的取向，使得编码链现在成为非编码链，而非编码链成为编码链的启动子。反向启动子序列可以在各种实施方案中用于调控开关的状态。另外，在各种实施方案中，启动子可以与增强子结合使用。
启动子可以是与基因或序列天然结合的启动子，如能够通过分离位于编码区段上游的5'非编码序列和/或给定基因或序列的外显子所获得。这样的启动子可以被称为“内源性的”。类似地，在一些实施方案中，增强子可以是与核酸序列天然关联的增强子，位于该序列的下游或上游。
在一些实施方案中，编码核酸区段定位在“重组启动子”或“异源启动子”的控制下，两者均指在天然环境中正常不与其可操作地连接的编码核酸序列关联的启动子。重组或异源增强子是指在天然环境中正常不与给定核酸序列关联的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其它基因的启动子或增强子；从任何其它原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子；以及非“天然存在”的合成启动子或增强子，即包含不同转录调节区域的不同元件、和/或通过本领域已知的基因工程方法来改变表达的突变。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以结合本文公开的合成生物回路和模块，使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCR，来产生启动子序列(参见例如美国专利第4,683,202号、美国专利第5,928,906号，各自以引用的方式并入本文)。此外，预期也可以采用指导序列在例如线粒体、叶绿体等非核细胞器内的转录和/或表达的控制序列。
如本文所述，“诱导型启动子”是特征在于当存在诱导物或诱导剂或受其影响或被其接触时，启动或增强转录活性的启动子。如本文所定义的“诱导物”或“诱导剂”可以是内源性的，或是以能够从诱寻型启动子诱导转录活性的方式施用的通常外源性的化合物或蛋白质。在一些实施方案中，诱导物或诱导剂，即化学物质、化合物或蛋白质，本身可以是核酸序列转录或表达的结果(即诱导物可以是由另一组分或模块表达的诱导蛋白)，转录或表达本身可以处于诱导型启动子的控制下。在一些实施方案中，诱导型启动子是在不存在某些剂、例如阻遏蛋白的情况下被诱导的。诱导型启动子的实例包括但不限于：四环素、金属硫蛋白、蜕皮素、哺乳动物病毒(例如腺病毒晚期启动子；以及小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR))和其它类固醇响应性启动子、雷帕霉素响应性启动子等。
本文可互换使用的术语“DNA调控序列”、“控制元件”和“调控元件”是指转录和翻译控制序列，例如启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号等，其提供和/或调节非编码序列(例如靶向DNA的RNA)或编码序列(例如定点修饰多肽或Cas9/Csn1多肽)的转录和/或调节编码的多肽的翻译。
“可操作地连接”是指一种并置，其中所描述的组分处于允许它们以预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么该启动子可操作地连接至编码序列。“表达盒”包括异源DNA序列，其可操作地连接到启动子或足以引导转基因在ceDNA载体中转录的其它调控序列。合适的启动子包括例如组织特异性启动子。启动子也可以是AAV起源的。
如本文所用的术语“受试者”是指向其提供用本发明的ceDNA载体的治疗、包括预防性治疗的人类或动物。通常，动物是脊椎动物，例如但不限于灵长类动物、啮齿动物、家养动物或野生动物。灵长类动物包括但不限于黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家养和野生动物包括但不限于：牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种如家猫、犬科物种如狗、狐狸、狼、禽类物种如鸡、鸸鹋、鸵鸟，以及鱼如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在本文所述方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物或人。受试者可以是雄性或雌性。另外，受试者可以是婴儿或儿童。在一些实施方案中，受试者可以是新生儿或未出生的受试者，例如，受试者还在子宫内。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人类的灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。人以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病和病症的动物模型的受试者。另外，本文所述的方法和组合物可用于家养动物和/或宠物。人类受试者可以是任何年龄、性别、种族或人种群组，例如，高加索人(白人)、亚洲人、非洲人、黑人、非裔美国人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在一些实施方案中，受试者可以是临床环境中的患者或其它受试者。在一些实施方案中，受试者已在进行治疗。在一些实施方案中，受试者是胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。在一些实施方案中，受试者是人类胎儿、人类新生儿、人类婴儿、人类儿童、人类青少年或人类成人。在一些实施方案中，受试者是动物胚胎，或非人类胚胎或非人类灵长类动物胚胎。在一些实施方案中，受试者是人胚胎。
如本文所用，术语“宿主细胞”包括易于被本公开内容的核酸构建体或ceDNA表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。作为非限制性实例，宿主细胞可以是分离的原代细胞、多能干细胞、CD34+细胞、诱导的多能干细胞或许多永生化细胞系(例如HepG2细胞)中的任何一种。或者，宿主细胞可以是组织、器官或生物体中的原位或体内细胞。
术语“外源”是指存在于除天然来源外的细胞中的物质。当在本文中使用时，术语“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入如细胞或生物体等生物系统中的核酸(例如编码多肽的核酸)或多肽，通常在所述细胞或生物体中未发现所述核酸或多肽，并且希望将核酸或多肽引入这种细胞或生物中。可替代地，“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入到如细胞或生物体等生物系统中的核酸或多肽，在所述细胞或生物体中发现核酸或多肽的量相对较低，并且希望增加细胞或生物体中核酸或多肽的量，例如以产生异位表达或水平。与此相反，术语“内源”是指原产于所述生物系统或细胞的物质。
术语“序列同一性”是指两个核苷酸序列之间的相关性。为了本公开的目的，使用在EMBOSS软件包的Needle程序(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件,Rice等人,2000,同上)、优选版本3.0.0或更高版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度。使用的可选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，并按以下方式计算：(相同的脱氧核糖核苷酸乘以100)/(比对长度-比对空位总数)。比对的长度优选为至少10个核苷酸，优选为至少25个核苷酸，更优选为至少50个核苷酸，最优选为至少100个核苷酸。
如本文所用，术语“同源性”或“同源”定义为，在对准序列且必要时引入空位以实现最大序列一致性百分比之后，与靶染色体上的相应序列中的核苷酸残基一致的核苷酸残基的百分比。为了确定核苷酸序列同源性百分比的比对可以用本领域技术范围内的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在一些实施方案中，当同源臂的例如核酸序列(例如DNA序列)与宿主细胞的相应原生或未经编辑的核酸序列(例如基因组序列)至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多一致时，所述序列被视为“同源”。
如本文所用，术语“异源”分别意指在天然核酸或蛋白质中未发现的核苷酸或多肽序列。异源核酸序列可以与天然存在的核酸序列(或其变体)连接(例如通过基因工程)以产生编码嵌合多肽的嵌合核苷酸序列。异源核酸序列可以连接到变异型多肽(例如通过基因工程)，以产生编码融合变异型多肽的核苷酸序列。
“载体”或“表达载体”是复制子，例如质粒、杆粒、噬菌体、病毒、病毒体或粘粒，可连接另一个DNA区段，即“插入物”以实现连接区段在细胞中的复制。载体可以是设计用于递送至宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体在起源和/或最终形式上可以是病毒或非病毒的，但是出于本公开的目的，“载体”通常是指ceDNA载体，如本文所用。术语“载体”涵盖与适当的控制元件结合时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。在一些实施方案中，载体可以是表达载体或重组载体。
如本文所用，术语“表达载体”是指指导RNA或多肽从与载体上的转录调控序列连接的序列的表达的载体。表达的序列通常但不一定与细胞异源。表达载体可以包含其它元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而使其可以在两种生物体中维持，例如在人类细胞中进行表达，以及在原核宿主中进行克隆和扩增。术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，在适用时包括但不限于例如转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过翻译从基因转录的mRNA所获得的多肽。术语“基因”是指当可操作地连接至适当的调控序列时，在体外或体内转录(DNA)为RNA的核酸序列。基因可以包括或可以不包括编码区前后的区域，例如5'非翻译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾随”序列，以及个别编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
“重组载体”意指包括能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应了解，在一些实施方案中，本文所述的载体可以与其它合适的组合物和疗法组合。在一些实施方案中，载体是游离型的。合适的游离型载体的使用提供了一种以高拷贝数的染色体外DNA维持受试者中的所关注核苷酸，从而消除染色体整合的潜在影响的方式。
如本文所用的短语“遗传性疾病”是指部分或完全、直接或间接地由基因组中的一种或多种异常引起的疾病，尤其是从出生起出现的病状。异常可以是突变、插入或缺失。异常可能影响基因的编码序列或其调控序列。遗传疾病可以是(但不限于)DMD、血友病、囊肿性纤维化、亨廷顿氏舞蹈病、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、肝母细胞瘤、威尔逊氏疾病(Wilson's disease)、先天性肝卟啉症(hepatic porphyria)、遗传性肝代谢病症、勒什尼汗综合症(Lesch Nyhan syndrome)、镰状细胞贫血、地中海贫血、着色性干皮病、范克尼氏贫血(Fanconi's anemia)、色素性视网膜炎、共济失调毛细血管扩张症、布鲁氏综合症、视网膜母细胞瘤，和泰伊-萨克斯二氏病(Tay-Sachs disease)。
如本文所用的术语“包含(comprising/comprises)”在提及组合物、方法以及对所述方法或组合物来说必不可少的其相应组分时使用，但对于包括未指明的要素，无论是否必要，仍然是开放的。
如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需要的那些要素。该术语允许存在不实质影响该实施方案的基本和新颖或功能性特征的要素。“包含”的使用表示包含而不是限制。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法和其相应组分，其排除在该实施方案的描述中未叙述的任何要素。
如本说明书和所附权利要求书所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一种(a/an)”和“所述”包括复数提及物。因此，例如，提到“方法”包括本文所述的和/或在阅读本公开等之后对于本领域技术人员而言将变得显而易见的类型的一个或多个方法和/或步骤。类似地，除非上下文中另有明确指示，单词“或”旨在包括“和”。虽然与本文中所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可用于实施或测试本公开，但在下面描述合适的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”源自于拉丁文exempli gratia，在本文中用来指示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”是同义的。
除了在操作例中或在另外指出的情况下，本文中使用的表示成分或反应条件的量的所有数字都应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。术语“约”在结合百分比使用时，可以意指±1％。以下实施例进一步详细解释本发明，但本发明的范围不应限于此。
本文公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独提及和要求，或呈与该组的其它成员或此处找到的其它要素的任何组合提及和要求。出于方便和/或可专利性的原因，一个组中的一个或多个成员可以包括在一个组中或从中删除。当发生任何这样的包括或删除时，在本文中认为说明书含有修改的组，从而满足所附权利要求书中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。
在任何方面的一些实施方案中，本文描述的公开内容不涉及克隆人的方法、用于修饰人的种系遗传身份的方法、用于工业或商业目的的人胚胎的使用、或用于修饰动物的基因身份，可能导致其遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医学益处的方法，以及由这类方法产生的动物。
本文在本发明的各个方面的描述内定义了其它术语。
本申请全文中引用的所有专利和其它出版物，包括参考文献、授权专利、已发布的专利申请和共同待决的专利申请，以引用的方式明确地并入本文中，以描述和公开例如在这些出版物中描述的可以与本文所述的技术结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。关于这一点，任何内容都不应被解释为承认发明者由于在先发明或任何其它原因而无权早于这种公开内容。关于这些文件的日期的所有声明或关于内容的陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不等同于承认这些文件的日期或内容的正确性。
本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的顺序呈现，但是替代实施方案可以以不同的顺序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开的教导可以适当地应用于其它程序或方法。本文描述的各种实施方案可以进行组合以提供其它实施方案。如果需要，可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开的又一实施方案。而且，由于生物学功能等效性的考虑，可以在不影响生物学或化学作用的种类或数量的情况下对蛋白质结构进行一些改变。可以根据详细描述对本公开进行这些和其它改变。意图所有这些修改包括在所附权利要求书的范围内。
任何前述实施方案的特定要素都可以进行组合或替代其它实施方案中的要素。此外，尽管已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其它实施方案也可以表现出这样的优点，并且并非所有实施方案都需要为了落入本公开的范围内而表现出这样的优点。
通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，这些实施例决不应解释为进一步限制。应了解，本发明不限于本文所述的具体方法、方案和试剂等，因此可以变化。本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施方案，而无意于限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由权利要求书限定。
II.从ceDNA载体表达抗体或融合蛋白
本文所述的技术大体上涉及抗体或融合蛋白通过非病毒DNA载体(例如如本文所述的ceDNA载体)在细胞中的表达和/或产生。用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体描述于本文中的标题为“通用ceDNA载体”的章节中。具体地说，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体包含一对ITR(例如对称或不对称的，如本文所述)以及介于所述ITR对之间的如本文所述的编码抗体或融合蛋白的核酸，所述核酸可操作地连接到启动子或调控序列。用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势是，编码所期望蛋白质的异源核酸序列不存在尺寸约束。因此，甚至是包含例如两个重链Fc区、接头和Fab片段的全长抗体也能够从单个ceDNA载体中表达。具体地说，为了表达和/或产生抗体，在其尺寸给定的情况下，ceDNA载体可能有利于传统载体，原因在于易用性和缺乏尺寸约束使得容易以可控方式表达具有不同域结构的抗体(包括多聚体抗体)成为可能。另外，能够进行多次施药，从而允许施用表达不同抗体或融合蛋白的不同ceDNA载体的混合物。因此，本文所述的ceDNA载体能够用于在有需要的受试者中表达治疗抗体或融合蛋白。或者，ceDNA载体能够用于在商业背景下产生抗体或融合蛋白，例如使用生物反应器，或在所期望的宿主中产生。
正如将了解的那样，本文所述的ceDNA载体技术能够适合于任何复杂程度或能够以模块化方式使用，其中抗体或融合蛋白的不同组分的表达能够以独立方式控制。举例来说，特别预期本文中所设计的ceDNA载体技术能够与使用单个ceDNA载体表达单一异源基因序列(例如所期望抗体的重链或轻链)一样简单，或能够与使用多个ceDNA载体一样复杂，其中每个载体表达各自由不同启动子独立地控制的多种抗体或抗体组分。本文特别涵盖以下实施方案且本领域的技术人员能够按需要对其进行调适。
在一个实施方案中，单个ceDNA载体能够用于表达抗体或融合蛋白的单个组分，例如重链或轻链。或者，单个ceDNA载体能够用于在单个启动子(例如强启动子)的控制下表达抗体或融合蛋白的多种组分(例如至少2种)，任选地使用IRES序列确保每种组分的适当表达的
在另一个实施方案中，本文还涵盖了包含至少两个插入片段(例如表达重链或轻链)的单个ceDNA载体，其中每个插入片段的表达是在其自身启动子的控制下进行。启动子可以包括相同启动子的多个拷贝、多个不同启动子或其任意组合。正如本领域技术人员将了解的那样，常常期望以不同的表达水平表达抗体的组分，从而控制所表达的个别组分的化学计量以确保抗体在细胞中的有效折叠和组合。
本领域的技术人员能够设想ceDNA载体技术的其它变化形式或能够使用常规载体、通过抗体产生方法对其进行调适。
A.表达抗体或融合蛋白的异源序列
基本上任何抗体或其抗原结合片段(例如功能片段)或融合蛋白都能够从本文所述的ceDNA载体表达。本领域的技术人员将理解，抗体片段至少包含抗原或抗原决定基结合所必需的氨基酸(例如scAb、Fab、F(ab′)2、dAb和Fv)。举例来说，抗体分子能够包括重链(H)可变域序列(本文中缩写为VH)和轻链(L)可变域序列(本文中缩写为VL)。在一个实施方案中，抗体分子包含重链和轻链或由重链和轻链组成(在本文中称为半抗体)。在另一个实例中，抗体分子包括两个重链(H)可变域序列和两个轻链(L)可变域序列，借此形成两个抗原结合位点，例如Fab、Fab'、F(ab′)2、Fc、Fd、Fd′、Fv、单链抗体(例如scFv)、单可变域抗体、双功能抗体(Dab)(二价和双特异性)，以及嵌合(例如人源化)抗体，其可以通过修饰全抗体或使用重组DNA技术从头合成的那些来产生。此类功能抗体片段保持选择性地结合其相应抗原或抗原决定基和活化或抑制靶蛋白的能力。
本文中还涵盖表达融合蛋白的ceDNA载体。在一些实施方案中，融合蛋白是具有生物功能的融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白适用于捕获技术，例如抗体-配体捕获剂，其中融合蛋白包含抗体(例如单特异性或双特异性抗体)或抗体片段(例如抗原结合片段)与肽或配体结合域或受体域的融合体，所述配体结合域或受体域捕获配体，借此抑制配体活性。相应地，在一些实施方案中，ceDNA载体能够编码和表达在所属领域中称为捕获剂或Y-捕获剂的融合蛋白。在一些实施方案中，如本文所述的ceDNA载体用于表达融合蛋白，例如VEGF-捕获剂融合蛋白、IGF-捕获剂融合蛋白(参见Vaniotis等人，《科学报道(SciRep)》，2018，8(1)，17361)或TGFβ-捕获剂融合蛋白。示例性TGFβ-捕获剂是Y-捕获剂，例如双功能抗体-配体捕获剂(Y-捕获剂)，其包含靶向CTLA-4和/或PD-L1的抗体与TGFβ受体II胞外域序列的融合体，从而使自分泌/旁分泌TGFβ在靶细胞微环境中同时失能(a-CTLA4-TGFβRIIecd和a-PDL1-TGFβRIIecd)(参见例如Ravi等人，《自然·通讯(Nat Comm)》2018，9(1)；741)。在一些实施方案中，预期供本文中使用且由ceDNA载体表达的融合蛋白是抗体-配体捕获剂，其中所述融合蛋白包含抗体或抗体片段(例如抗原结合片段)与捕获配体的配体结合域或受体域(例如细胞外受体域)的融合体，其中所述配体是选自通常已知的任何生长因子或配体，包括(但不限于)IGF、VEGF、TGFβ、TNFα、EGF、NGF、PDGF、LFA-3、CTLA-4、IL-1、TPO。
示例性融合蛋白包括(但不限于)依那西普(Etanercept)
Figure BDA0002629249020000481
其包含肿瘤坏死因子(TNF)受体II的75kDa可溶性胞外域(ECD)与人IgG1 Fc的融合体；阿法西普(Alefacept)
Figure BDA0002629249020000483
其包含淋巴细胞功能相关抗原3(LFA-3)的第一ECD与人IgG1 Fc的融合体；阿巴西普(Abatacept)
Figure BDA0002629249020000482
其包含人细胞毒性T淋巴细胞相关分子-4(CTLA-4)的ECD与人IgG1 Fc的融合体；利纳西普(Rilonacept)
Figure BDA0002629249020000484
其包含两条链，每条链包含IL-1R辅助蛋白质配体结合区的C端与IL-1RI ECD的N端的融合体，所述IL-1RI ECD与人IgG1 Fc融合；罗米司亭(Romiplostim)
Figure BDA0002629249020000485
其包含肽血小板产生素(TPO)模拟物与去糖基化人IgG1 Fc的C端的融合；贝拉西普(Belatacept)
Figure BDA0002629249020000486
其包含CTLA-4的ECD与人IgG1 Fc的融合体且与阿巴西普不同之处为CTLA-4区域中的两个胺基酸取代(L104E、A29Y)。
抗体和抗体片段能够来自抗体的任何类别，包括(但不限于)IgG、IgA、IgM、IgD和IgE，以及来自抗体的任何亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。抗体可以是单克隆的。使用本文所述方法产生的抗体可以是人抗体、人源化抗体、CDR移植的抗体，或体外产生的抗体。抗体能够具有选自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区。抗体还能够具有选自例如κ或λ的轻链。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与术语“抗体”可互换地使用。通过将此类抗体的编码序列插入ceDNA载体中，几乎能够产生任何抗体。在一个实施方案中，轻链和重链基因处于调控开关的控制下。在相同或替代的实施方案中，轻链和重链基因与IRES序列(例如SEQ ID NO:190)连接。
典型地，抗体或融合蛋白基因还将编码分泌序列，使得抗体被引导到高尔基体和内质网，其中当抗体穿过ER且离开细胞时，抗体将通过伴随蛋白分子折叠成正确的构象。示例性分泌序列包括(但不限于)VH-02(SEQ ID NO:88)和VK-A26(SEQ ID NO:89)和Igκ信号序列(SEQ ID NO:126)，以及允许标记的蛋白质从胞溶质中分泌出来的Gluc分泌信号(SEQID NO:188)、将经标记的蛋白质引导到高尔基体的TMD-ST分泌序列(SEQ ID NO:189)。
当期望胞内抗体时，编码所述抗体的核酸或基因典型地不编码分泌序列。在一些情况下，其不仅能够编码分泌序列，而且具有预定的靶序列，例如(但不限于)使其保留在细胞内的KDEL序列。在其它实施方案中，胞内抗体基因编码另一种细胞内靶序列，例如核定位序列。
调控开关能够用于微调抗体(包括胞内抗体)或融合蛋白的表达，以便按需表达抗体，包括(但不限于)在所期望的表达水平或量下表达抗体或融合蛋白，或替代地，当存在或缺乏特定信号时，包括细胞信号传导事件。举例来说，当出现特定病状时，能够打开或关闭ceDNA载体对抗体或融合蛋白的表达，如本文在标题为调控开关的章节中所述。
举例来说，并且仅出于说明的目的，抗体或融合蛋白能够用于关闭非期望的反应，如抗TNFα抗体(例如阿达木单抗)出现的非期望的反应。在其它情况下，抗体或融合蛋白能够有助于增强免疫反应。举例来说，相对于恶性细胞，例如肿瘤。抗体基因能够含有肿瘤相关标志物以将抗体带到所期望的细胞。但是，在任何一种情况下，都可能希望调控抗体或融合蛋白的表达。ceDNA载体轻松地适应抗体对调控开关的使用。ceDNA载体还允许控制重链和轻链的化学计量。融合蛋白的实例包括(但不限于)VEGF-捕获剂和TGFβ-捕获剂技术。
抗体分子包括完整分子以及其抗原结合片段和功能片段。抗体分子的恒定区能够改变(例如突变)成修改抗体的特性(例如增强或减少以下中的一种或多种：Fc受体结合、半胱氨酸残基数目等)。抗体分子的抗原结合片段的实例包括(但不限于)：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含两个Fab片段的二价片段，所述两个Fab片段在铰链区通过二硫桥连接；(iii)由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH域组成的Fv片段；(v)双功能抗体(dAb)片段，其由VH域组成；(vi)骆驼科或骆驼化可变域；(vii)单链Fv(scFv)，参见例如Bird等人(1988)《科学(Science)》242:423-426；以及Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:5879-5883)；(viii)单域抗体。这些抗体片段是使用ceDNA载体获得并且能够以与完整抗体相同的方式筛选使用。
ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势是，编码所期望蛋白质的异源核酸序列不存在尺寸约束。因此，甚至是包含两个重链Fc区、接头和Fab片段的全长抗体也能够从单个ceDNA载体中表达。另外，根据必需的化学计量，能够表达相同抗体或融合蛋白的多个区段，例如轻链和重链，并且能够使用相同或不同启动子，并且还能够使用调控开关微调每个区域的表达。举例来说，如实例所示，能够使用包含双重启动子系统的ceDNA载体，使得阿杜那单抗抗体的重链和轻链各自使用不同的启动子。使用ceDNA质粒产生抗体或融合蛋白能够包括重链和轻链表达用的启动子的独特组合，从而使重链和轻链的比率适于形成功能抗体或融合蛋白。因此，在一些实施方案中，ceDNA载体能够用于分别表达抗体或融合蛋白的不同区域(例如在不同启动子的控制下)。在一些实施方案中，编码重链的核酸能够可操作地连接到第一启动子或第一调控开关并且编码轻链的核酸能够可操作地连接到第二启动子或第二调控开关，从而能够使重链和轻链彼此独立地实现可控或可调的表达，能够控制用于产生功能抗体或融合蛋白的重链与轻链的比率。
使用一种或多种诱导型或可抑制型启动子能够在空间上和在时间上实现抗体或融合蛋白从ceDNA载体中的表达。
抗体分子也可以是单域抗体。单域抗体能够包括其互补决定区是单域多肽的一部分的抗体。实例包括(但不限于)重链抗体、天然缺乏轻链的抗体、来源于常规4链抗体的单域抗体、工程化抗体，和除来源于抗体的那些之外的单域支架。单域抗体可以是本领域中的任何单域抗体，或未来的任何单域抗体。单域抗体可以来源于任何物种，包括(但不限于)小鼠、人、骆驼、大羊驼、鱼、鲨鱼、山羊、兔和牛。
在一些实施方案中，抗体是多特异性抗体，其包含结合到例如相同靶蛋白上的至少两个不同抗原决定基或同时靶向至少两种不同蛋白质的两个或更多个可变区。也就是说，多特异性抗体识别的抗原决定基能够位于相同或不同靶标上。
在其它实施方案中，抗体是双特异性抗体，其能够识别且结合到至少两种不同抗原决定基或靶标(例如，关于示例性双特异性抗体结构，参见例如Riethmuller,G，《癌症免疫(Cancer Immunity)》(2012)12:12-18；Schaefer w等人，PNAS(2011)108(27):11187-92)。本文所述的方法和组合物还涵盖第二代双特异性抗体，例如“三功能双特异性”抗体。
在某些实施方案中，所提供的抗体是多特异性抗体，包括双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。一种示例性的双特异性抗体是其中结合特异性之一针对Aβ且另一种针对任何其它抗原的双特异性抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合到Aβ的两个不同抗原决定基。双特异性抗体还可以用于将细胞毒性剂定位到细胞。双特异性抗体能够作为全长抗体或抗体片段制备。
在一些实施方案中，用于产生多特异性抗体的ceDNA载体包含具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达(参见Milstein和Cuello，《自然》305:537(1983))、WO 93/08829，和Traunecker等人，《欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)》10:3655(1991))，和“臼包杵”工程(参见例如美国专利第5,731,168号)。多特异性抗体还可以如下制备：工程改造静电操纵效应以便制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004A1)；使两种或更多种抗体或片段发生交联(参见例如美国专利第4,676,980号和Brennan等人，《科学》229:81(1985))；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》148(5):1547-1553(1992))；使用“双功能抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等人，《美国国家科学院院刊》90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等人，《免疫学杂志》152:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如以下文献所述：例如Tutt等人，《免疫学杂志》147:60(1991)。
在一些实施方案中，ceDNA载体编码具有三个或更多个功能抗原结合位点的工程化抗体，包括本文中所包括的“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)。在一些实施方案中，ceDNA载体编码抗体或融合蛋白，所述抗体或融合蛋白是包含抗原结合位点的“双重作用FAb”或“DAF”，其结合到Aβ以及另一种不同抗原(参见例如US 2008/0069820)。
在一个实施方案中，抗体是“抗体变异体”，是指相较于其对应的原生抗体，具有改变的氨基酸序列、组成或结构的抗体。举例来说，抗体变异体能够包含容许抗体从宿主细胞中分泌的非原生分泌信号。
在某些实施方案中，ceDNA载体编码半胱氨酸工程化抗体变异体，例如“thioMAbs”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，被取代的残基存在于抗体的可及位点。通过用半胱氨酸取代那些残基，借此使反应性硫醇基定位于抗体的可及位点处并且可以用于使抗体与其它部分(例如药物部分或接头-药物部分)偶联以产生免疫偶联物，如在本文中进一步描述。在某些实施方案中，以下残基中的任一个或多个可以被半胱氨酸取代：轻链的V205(Kabat编号)；重链的A118(EU编号)；以及重链Fc区域的S400(EU编号)。半胱氨酸工程化抗体可以如例如美国专利第7,521,541号所述产生。
在另一个实施方案中，抗体可以是小型化抗体，其是包含可变轻链、可变重链抗原结合域以及任选存在的一个或多个效应域(例如组织特异性靶标)的单价或二价抗体。虽然本文特别涵盖小型化抗体的使用，但ceDNA载体相对于异源核酸序列而言不受尺寸的限制且因此具有表达甚至全长抗体的优势。
在另一个实施方案中，从ceDNA载体中表达的抗体或融合蛋白进一步包含另一种功能，例如荧光、酶活性、分泌信号或免疫细胞活化因子。
在一些实施方案中，由ceDNA载体编码的抗体包含双功能抗体(双特异性单链抗体)或单功能抗体(缺乏铰链区以降低免疫活化风险的IgG4分子)。
如本文所述用于产生抗体的CeDNA载体还适用于表达融合蛋白或胞内抗体(即，细胞内抗体)，所述融合蛋白或胞内抗体能够靶向影响细胞功能(例如代谢、细胞分裂、转录、翻译等)的细胞内蛋白质。胞内抗体可以是scFv。通过并入信号传导基序(例如C端ER滞留信号(例如KDEL)、线粒体靶向序列、核定位序列等)能够将胞内抗体引导到特定的细胞代谢区。
胞内抗体特别适于治疗与蛋白质折叠异常有关的疾病，例如阿尔兹海默氏病、帕金森氏病、朊病毒疾病、亨廷顿病等。
在一些实施方案中，所述抗体或融合蛋白能够进一步包含例如接头域。如本文所用，“接头域”是指长度为约2到100个氨基酸的寡核苷酸或多肽区域，其使如本文所述的抗体的任何结构域/区域连接在一起。在一些实施方案中，接头能够包括或由柔性残基(例如甘氨酸和丝氨酸)构成，使得相邻蛋白质域相对于彼此自由地移动。当希望确保两个相邻结构域在空间上彼此无干扰时，可以使用较长接头。接头可以是可裂解的或不可裂解的。可裂解接头的实例包括2A接头(例如T2A)、2A样接头或其功能等效物以及其组合。接头可以是来源于明脉扁刺蛾病毒(Thosea asigna virus)的T2A的接头区域。
获取例如融合蛋白、重链、轻链、可变区等的已知和/或可公开获得的蛋白质序列以及对cDNA序列进行反向工程改造以编码此类蛋白质(例如融合蛋白)或抗体充分属于本领域的技术人员的能力范围内。然后能够对cDNA进行密码子优化以与预定的宿主细胞匹配，并且插入如本文所述的ceDNA载体中。
在一个实施方案中，编码抗体的序列能够来源于现有融合瘤细胞系，例如通过对获自融合瘤细胞系的mRNA进行反向转录以及使用PCR扩增所述序列。
B.表达抗体或融合蛋白的ceDNA载体
用于产生抗体或融合蛋白的具有编码所期望抗体的一个或多个序列的ceDNA载体能够包含调控序列，例如启动子、分泌信号、聚腺苷酸化区域和增强子。ceDNA载体至少包含编码抗体或融合蛋白的一个或多个异源序列。用于产生抗体或融合蛋白的示例性ceDNA载体描绘于图7A-7G中。
为了实现高效且准确的抗体或融合蛋白组装，在一些实施方案中特别预期所述抗体、融合蛋白或个别抗体域包含内质网ER前导序列以将其引导到ER，在其中发生蛋白质折叠。举例来说，序列将所表达的蛋白质引导到ER进行折叠。
在一些实施方案中，ceDNA载体中包含细胞或细胞外定位信号(例如分泌信号、核定位信号、线粒体定位信号等)(参见例如图10G)以引导抗体或融合蛋白的分泌或所期望的亚细胞定位，使得抗体或融合蛋白能够结合到细胞内靶标(例如胞内抗体)或细胞外靶标。
在某些实施方案中，用于产生抗体的ceDNA载体能够编码胞内抗体，且在一些实施方案中，胞内抗体可以是全长抗体以及单链。胞内抗体能够用于广泛领域，包括治疗病毒性病症和细胞性疾病性病症，例如癌症，参见例如美国专利第6,004,940号。
在一些实施方案中，如本文所述的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体(参见例如图6A中所示的示例性ceDNA载体)容许所期望的任何抗体或融合蛋白以模块化方式组装和表达。如本文所用，术语“模块化”是指能够轻松地从构建体中去除的ceDNA表达质粒中的元件。举例来说，产生ceDNA的质粒中的模块化元件包含与构建体内的每个元件侧接的独特限制位点对，从而能够排它性地操控个别元件(参见例如图7A-7G)。因此，ceDNA载体平台能够容许所期望的任何抗体或融合蛋白构形实现表达和组装。本文在多个实施方案中提供ceDNA质粒载体，其能够减少和/或最小化为了组装编码抗体或融合蛋白的期望ceDNA载体所必需的操控量。
C.ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白
具体地说，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够编码例如(但不限于)用于治疗、预防和/或改善疾病、功能障碍、损伤和/或病症的一种或多种症状的抗体、抗原结合片段、融合蛋白以及其变异体和/或活性片段。在一个方面中，疾病、功能障碍、外伤、损伤和/或病症是人类疾病、功能障碍、外伤、损伤和/或病症。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体还能够编码能够配合从ceDNA表达的抗体或融合蛋白使用的辅因子或其它多肽、有义或反义寡核苷酸，或RNA(编码或非编码；例如siRNA、shRNA、微RNA，和其反义对应物(例如拮抗MiR))。另外，包含编码抗体或融合蛋白的序列的表达盒还能够包括外源序列，所述外源序列编码用于实验或诊断目的的报告蛋白，例如β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和所属领域中众所周知的其它蛋白质。
在某些实施方案中，使用一个或多个ceDNA载体能够施用多种不同抗体和/或融合蛋白。因此，特别预期能够在细胞、组织或受试者中表达期望数目种抗体和/或融合蛋白的“混合物”。
本文所述的ceDNA载体能够用于递送抗体和融合蛋白用于治疗例如癌症、自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎、克罗恩氏病)、阿尔兹海默氏病、高胆固醇血症、急性器官排斥反应、多发性硬化症、绝经后骨质疏松症、皮肤病状(例如牛皮癣、异位性皮肤炎)、哮喘或血友病。
如本文所述的ceDNA载体能够用于表达所期望的任何治疗抗体或融合蛋白。示例性治疗抗体和融合蛋白包括(但不限于)阿昔单抗(abciximab)、阿巴肽(Abaloparatide)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿达木单抗-atto、阿多-曲妥珠单抗恩他新(ado-trastuzumabemtansine)、阿杜那单抗(aducanumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、艾维路单抗(avelumab)、贝频珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝罗陀单抗(bezlotoxumab)、布林莫单抗(blinatumomab)、布咯索单抗(blosozumab)、博可珠单抗(Bococizumab)、贝伦妥单抗维多汀(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、卡那单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromabpendetide)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、肯斯珠单抗(concizumab)、达利珠单抗(daclizumab)、达土木单抗(daratumumab)、地诺单抗(denosumab)、迪奴图单抗(dinutuximab)、杜匹鲁单抗(dupilumab)、度伐单抗(durvalumab)、艾卡拉肽(ecallantide)、艾库组单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、恩他新(emtansine)、艾密次单抗(emicizumab)、依伏库单抗(evolocumab)、艾文库单抗(evinacumab)、因子IX-Fc抗体、因子VIII-Fc抗体、戈利木单抗(golimumab)、替坦异贝莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、伊达珠单抗(idarucizumab)、英克拉单抗(inclacumab)、英利昔单抗(infliximab)、英利昔单抗-abda、英利昔单抗-dyyb、伊匹单抗(ipilimumab)、伊科奇单抗(ixekizumab)、那纳德单抗(lanadelumab)、罗德珠单抗(lodelcizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、莱西单抗(necitumumab)、尼沃单抗(nivolumab)、奥比昔单抗(obiltoxaximab)、奥比珠单抗(obinutuzumab)、奥克雷珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、奥替库单抗(orticumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、派立珠单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、培克珠单抗(pexelizumab)、拉盘珠单抗(ralpancizumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、雷昔库单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗勒度单抗(roledumab)、罗莫苏单抗(romosozumab)、塞库金单抗(secukinumab)、思图昔单抗(siltuximab)、苏兰珠单抗(solanezumab)、索他赛普(sotatercept)、塔多珠单抗(tadocizumab)、托西利单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、优特金单抗(ustekinumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、沙瑞卢单抗(sarilumab)、利妥昔单抗(rituximab)、鼓赛库单抗(guselkumab)、英妥珠单抗奥唑米星(inotuzumab ozogamicin)、阿达木单抗-adbm、吉妥珠单抗奥唑米星(inotuzumab ozogamicin)、贝伐单抗-awwb、苯纳珠单抗(benralizumab)、艾密次单抗-kxwh、曲妥珠单抗-dkst。
在一个实施方案中，ceDNA载体包含核酸序列以表达具有疾病治疗功能的治疗抗体或融合蛋白。在一个优选实施方案中，治疗抗体或融合蛋白不会引起免疫系统反应，除非期望如此。
在一个实施方案中，抗体是ceDNA载体所表达的治疗抗体或融合蛋白，其靶向免疫检查点抑制因子(例如PDL1)并且能够用于治疗例如癌症(例如实体肿瘤、乳癌、淋巴瘤、肝癌、卵巢癌、肺癌、结肠直肠癌、白血病、血液癌症、皮肤癌、多发性骨髓瘤等)。在一个实施方案中，治疗抗体或融合蛋白靶向检查点抑制因子，例如PDL1、CD47、间皮素、神经节苷脂2(GD2)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、前列腺特异性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、Ron激酶、c-Met、不成熟层粘连蛋白受体、TAG-72、BING-4、钙活化氯离子通道2、周期素-B1、9D7、Ep-CAM、EphA3、Her2/neu、端粒酶、SAP-1、存活素、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、Gp100/pmel17、酪氨酸酶、TRP-1/-2、MC1R、β-索烃素、BRCA1/2、CDK4、CML66、纤维结合蛋白、p53、Ras、TGF-B受体、AFP、ETA、MAGE、MUC-1、CA-125、BAGE、GAGE、NY-ESO-1、β-索烃素、CDK4、CDC27、CD47、α辅肌动蛋白-4、TRP1/gp75、TRP2、gp100、Melan-A/MART1、神经节苷脂、WT1、EphA3、表皮生长因子受体(EGFR)、CD20、MART-2、MART-1、MUC1、MUC2、MUC16、MUM1、MUM2、MUMS、NA88-1、NPM、OA1、OGT、RCC、RUI1、RUI2、SAGE、TRG、TRP1、TSTA、叶酸受体α、L1-CAM、CAIX、EGFRvIII、gpA33、GD3、GM2、VEGFR、整合素(整合素αVβ3、整合素α5β1)、碳水化合物(Le)、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、纤维母细胞活化蛋白酶(FAP)、TGF-β、玻糖醛酸、胶原蛋白(例如胶原蛋白IV、肌腱蛋白C或肌腱蛋白W)、CD19、CD33、CD47、CD123、CD20、CD99、CD30、BCMA、CD38、CD22、SLAMF7或NY-ESO1。
在一个实施方案中，ceDNA载体表达依伏库单抗单克隆抗体并且用于治疗高脂质血症。依伏库单抗抑制前蛋白转化酶9型枯草杆菌蛋白酶/枯草溶菌素(PCSK9)。PCSK9是一种蛋白质，其靶向LDL受体进行降解且借此减小肝脏从血液中去除LDL-C或“坏”胆固醇的能力。依伏库单抗进一步描述于以全文引用的方式并入本文中的US 8,999,341。
如本文所公开的方法和组合物中使用的从ceDNA载体中表达的示例性抗体和融合蛋白可以是本文的表1、表2、表3A、表3B、表4或表5中所列的任何抗体或融合蛋白。
表1：FDA批准的抗体和融合蛋白作为示例性抗体和融合蛋白。
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表2：适用于本文所述的方法和组合物中的ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白。
Figure BDA0002629249020000622
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Figure BDA0002629249020000641
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Figure BDA0002629249020000681
表3A：由ceDNA载体表达的示例性抗体，包括(但不限于)欧盟或美国批准的抗体治疗剂。
Figure BDA0002629249020000682
表3B：由ceDNA载体表达的示例性抗体，包括(但不限于)欧盟或美国监管审核的抗体治疗剂。
Figure BDA0002629249020000691
表4：待由ceDNA载体表达的示例性抗体包括(但不限于)晚期临床研究中用于非癌症适应症的抗体治疗剂。商业上开发或临床上测试抗体的公司如下：1.诺华(Novartis)；2.LFB基团；3.夏尔(Shire)；4.Prothena Therapeutics Ltd.；5.奥美罗斯公司(OmerosCorporation)；6.亚力兄制药有限公司(Alexion Pharmaceuticals Inc.)；7.阿斯利康/医学免疫有限责任公司(AstraZeneca/MedImmune LLC)；8.勃林格殷格翰制药(BoehringerIngelheim Pharmaceuticals),AbbVie；9.基因泰克(Genentech)；10.夏尔；11.R-Pharm；12.中外制药公司/罗氏(Chugai Pharmaceuticals/Roche)；13.NovImmune SA；14.CytoDyn；15.Biogen；16.霍夫曼·拉罗什(Hoffmann-La Roche)；17.奥尔德生物制药(Alder Biopharmaceuticals)；18.再生元制药(Regeneron Pharmaceuticals)；19.辉瑞(Pfizer)；礼来公司(Eli Lilly&Company)，20.美国地平线制药公司(Horizon PharmaUSA)。
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表5：待由ceDNA载体表达的示例性抗体包括(但不限于)晚期临床研究中用于癌症适应症的抗体治疗剂。商业上开发或临床上测试表4中的抗体的公司如下：1.ActiniumPharmaceuticals；2.赛诺菲(Sanofi)；3.TG Therapeutics；5.MorphoSys；6.辉瑞；8.Viventia Bio；10.江苏恒瑞医药股份有限公司；11.MacroGenics；16.吉利德科学(Gilead Sciences)；18.阿斯利康/医学免疫有限责任公司；19.Recombio SL；20.再生元制药；21.信达生物(苏州)有限公司；22.百济神州；24.Biocad；25.诺华；26.Philogen SpA；27.Tracon。
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待由ceDNA载体表达的其它示例性抗体和融合蛋白包括(但不限于)下述那些：
布罗达单抗(
Figure BDA0002629249020000722
AMG-827)是一种人IgG2抗体，其靶向IL-17受体A(IL-17RA)并且阻止IL-17A、IL-17F和IL-17C促炎性细胞因子通过IL-17RA进行的发炎信号传导。布罗达单抗在美国
Figure BDA0002629249020000723
欧盟
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和日本
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已获批准。布罗达单抗指定用于治疗患有中度到重度斑块牛皮癣的成年患者，其是全身疗法或光照疗法的候选者并且尚未出现应答或对其它全身疗法已停止出现应答。
杜匹鲁单抗(
Figure BDA0002629249020000726
REGN668/SAR231893)是人IgG4 mAb，其靶向IL-4受体(IL4R)，从而阻断IL-4和IL-13介导的炎性应答。所述mAb在美国和欧盟中已获准用于异位性皮肤炎患者。
奥克雷珠单抗(Ocrelizumab)
Figure BDA0002629249020000727
是靶向CD20阳性B细胞的人源化IgG1抗体。此类B细胞在髓鞘损伤和多发性硬化症发病机理方面起作用。
奥克雷珠单抗在美国中已获批用于治疗复发多发性硬化症(RMS)和原发渐进性多发性硬化症(PPMS)。
沙瑞卢单抗(
Figure BDA0002629249020000728
SAR153191、REGN88)是靶向IL-6受体(IL-6R)的人IgG1抗体并且在加拿大、美国和欧盟已获批用于中度到重度活动性类风湿性关节炎(RA)患者，所述患者对一种或多种疾病改善性抗风湿药物(DMARD)(例如甲胺喋呤(MTX))的应答不足或不耐受。
苯纳珠单抗(
Figure BDA0002629249020000731
MEDI-563)是靶向嗜伊红血球上所发现的IL-5R的α-亚单元的无岩藻糖基化IgG1 mAb，已获FDA批准用于12岁以及更大年龄的重度哮喘患者的附加维持治疗。
艾密次单抗(
Figure BDA0002629249020000732
艾密次单抗-kxwh、ACE910、RO5534262)是靶向因子IXa和X的双特异性IgG4 mAb，已获FDA批准。所述药物批准用于预防或减少患有A型血友病的成年和儿科患者的出血事件频率，所述患者已产生因子VIII抑制因子。截至2017年12月1日，总共9种抗体治疗剂在美国或欧盟中经历监管审核。其中8种(伊巴珠单抗、布罗苏单抗、替爪奇单抗、卡普拉单抗、俄伦单抗、弗雷曼单抗、家康珠单抗、罗莫苏单抗)然而尚未接受销售批准。莫加珠单抗在日本于2012年3月20日获得首个全球批准。
伊巴珠单抗是靶向CD4的IgG4 mAb，FDA正对其治疗多药耐药性人类免疫缺陷病毒(HIV)感染进行评估。
布罗苏单抗(KRN23)是靶向纤维母细胞生长因子23(FGF23)(调控肾脏排出磷酸盐和肾脏产生活性维生素D的激素)的人IgG1 mAb。
替爪奇单抗(SCH 900222/MK-3222)是靶向IL-23p19的人源化IgG1 mAb。市售替爪奇单抗用于治疗中度到重度斑块牛皮癣的应用已经在欧盟和美国提供。
卡普拉单抗(ALX-0081)是靶向温韦伯氏因子(von Willebrand factor)的二价单域抗体
Figure BDA0002629249020000733
并且作为获得性血栓血小板减少性紫癜(aTTP)(一种罕见、危及生命的凝血病症，其涉及微小血凝块形成，微小血凝块导致aTTP患者的血小板计数降低、组织局部缺血和器官功能异常)的疗法正经历监管审核患者。
俄伦单抗(AIMOVIGTM、AMG 334)是靶向降血钙素基因相关肽(CGRP)的受体的IgG2mAb，所述肽涉及伤害感受性敏感神经元的发展。市售俄伦单抗用于经历每个月四天或更多天偏头痛的患者预防偏头痛的应用已在欧盟和美国提供。
弗雷曼单抗(TEV-48125)是靶向CGRP的IgG2 mAb，其作为偏头痛的预防性疗法正经历监管审核。
家康珠单抗(LY2951742)是靶向CGRP的IgG4 mAb，其对成人的间歇性和慢性偏头痛的预防作用正经历监管审核。
罗莫苏单抗(EVENITYTM、AMG785)是靶向硬骨素的人源化IgG2 mAb，其作为女性和男性的骨质疏松症的疗法正接受评估。
莫加珠单抗(KW-0761，
Figure BDA0002629249020000741
)是靶向CC趋化因子受体4(CCR4)的IgG1无岩藻糖基化人源化mAb，所述趋化因子受体表达于患有皮肤T细胞白血病淋巴瘤(CTCL)(包括蕈样真菌病和塞氏综合症(Sézary syndrome))的患者的肿瘤细胞上。
那纳德单抗(SHP643、DX-2930)是人IgG1 mAb，其靶向血浆激肽释放酶且借此阻止缓激肽产生。
克利珠单抗(SEG101)是靶向P-选择素(又称为CD62)的人源化mAb并且作为镰形细胞相关疼痛危象(SCPC)的疗法正经历评估，所述疼痛危象(SCPC)由镰形细胞病患者的血管阻塞引起。
拉夫珠单抗(ALXN1210)是靶向补体组分5(C5)的人源化mAb，其在患有阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的患者的两个3期研究中正经历评估。
埃丁珠单抗(ALD403)是靶向降血钙素基因相关肽(CGRP)的IgG1 mAb并且就偏头痛预防作用正接受评估。
里森基单抗(ABBV066、BI655066)是靶向IL-23的p19亚单元的IgG1 mAb，其已经涉及牛皮癣的发病机理。
沙曲珠单抗(SA237)是靶向IL-6R的人源化IgG2，其在患有视神经脊髓炎(NMO)或NMO频谱障碍的患者的两个3期研究中正经历评估。
布罗珠单抗(RTH258)是靶向血管内皮生长因子(VEGF)-A的单链可变片段(scFv)。
PRO140是人源化IgG4 mAb，阻断T细胞上的人类免疫缺陷病毒(HIV)共受体CCR5，借此阻止病毒进入。
兰帕单抗(RG7417、FCFD4514S)是人源化抗原结合片段(Fab)，其通过结合补体因子D来抑制替代补体路径的活化和扩增。
罗勒度单抗(LFB-R593)是来源于LFB S.A.的
Figure BDA0002629249020000751
技术平台的人IgG1抗恒河猴(Rh)D mAb，其改变岩藻糖基化，从而使抗体更有效地结合到效应细胞。所述抗体设计成预防一些母胎同种异体免疫病状，即，怀有RhD阳性胎儿的RhD阴性孕妇。
法神单抗(REGN475)是靶向神经生长因子的人IgG4 mAb，其在许多晚期研究中作为髋部或膝的中度到重度骨关节炎疼痛和慢性下背痛的疗法正接受评估。
依托珠单抗(RH7413)是人源化mAb，其结合α4β7和αEβ7整合素异源二聚体的β7亚单元，借此分别抑制与其配体MAdCAM-1和E-钙粘素的相互作用。
NEOD001是靶向可溶性和不溶性轻链聚集体的人源化IgG1 mAb，所述聚集体引起淀粉样蛋白轻链(AL)淀粉样变性，这是一种以蛋白质聚集体在组织和器官(包括心脏、肾脏和肝脏)中过度积聚为特征的病症。
甘替鲁单抗(RO4909832)是靶向原纤维淀粉样蛋白-β的人mAb，其作为阿尔兹海默氏病的疗法正经历调查。
安氟单抗(MEDI-546)是靶向I型干扰素(IFN)受体亚单元1的人IgG1 mAb，其作为SLE的疗法正接受评估。
莫昔土莫单抗帕苏多(Moxetumomab pasudotox，HA22，CAT-8015)是一种重组免疫毒素，其含有绿脓杆菌外毒素A的38kDa细胞毒性部分与靶向CD22的抗体可变片段的融合体。
赛咪单抗(REGN2810、SAR439684)，靶向程序性死亡-1(PD1)的人抗体，作为转移性或不可切除性皮肤鳞状细胞癌(CSCC)的疗法正经历评估。
乌比妥昔单抗(LFB-R603、TGT-1101、TGTX-1101)是靶向CD20的糖工程化嵌合mAb。
曲美单抗(CP-675,206)是靶向细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)的人IgG2抗体。在生理条件下，CD28与B7配体(CD80、CD86)发生相互作用，引起T细胞活化、增殖和CTLA-4上调。CTLA-4以高于CD28的亲和力结合B7配体并且终止T细胞应答。
艾沙妥昔单抗(SAR650984)是抗CD38 IgG1嵌合抗体，其作为患有复发和难治性多发性骨髓瘤(MM)的患者的疗法正接受评估。
BCD-100是靶向程序性细胞死亡-1(PD-1)的人抗体。
卡罗妥昔单抗(TRC105)是嵌合IgG1抗体，其靶向内皮糖蛋白(CD105)，一种高度表达于血管产生和增殖性内皮细胞上的蛋白质。mAb以1-2ng/mL的KD结合增殖性内皮上的人CD105并且诱导人脐静脉内皮细胞产生ADCC。
康勒珠单抗(INCSHR-1210，SHR-1210)是靶向PD-1的IgG4κ人源化抗体。
格雷巴土木单抗维多汀(CDX-011、CR011-vcMMAE)是靶向跨膜糖蛋白非转移基因B(gpNMB)的IgG2人抗体与单甲基奥瑞他汀E(一种细胞毒性药物，其当在癌细胞中释放时，可以引起肿瘤细胞死亡)的偶联物。
米妥昔单抗索拉夫坦辛(IMGN853)是靶向叶酸受体α(FRα)的抗体，其与类美登素药物DM4(抗有丝分裂药剂)的3-4个分子偶联。
奥普珠单抗莫纳妥(VICINIUMTM、VB4-845)是抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)重组人源化抗体scFv片段与绿脓杆菌外毒素A的偶联物。
L19IL2/L19TNF(DAROMUN)是由以下构成的融合蛋白：靶向纤维结合蛋白的外域B的L19抗体的scFv与人IL2或人TNF的融合体。
另外，其它示范性抗体和融合蛋白能够选自以下中的任一个：苯纳珠单抗、MEDI-8968、安氟单抗、MEDI7183、丝法力单抗、MEDI-575、特诺金单抗，得自阿斯利康(AstraZeneca)和医学免疫(MedImmune)；BAN2401，得自Biogen Idec/Eisai有限公司(“Eisai”)/BioArctic Neuroscience AB；CDP7657(抗CD40L单价聚乙二醇化Fab抗体片段)、STX-100(抗avB6 mAb)、BIIB059、抗TWEAK(BIIB023)，和BIIB022，得自Biogen；弗兰努单抗，得自Janssen和Amgen；BI-204/RG7418，得自BioInvent International/基因泰克；BT-062(茚达昔单抗瑞维坦星)，得自Biotest制药公司；XmAb，得自勃林格殷格翰/先科(Xencor)；抗IP10，得自百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)；J 591Lu-177，得自BZL生物有限责任公司；CDX-011(格雷巴土木单抗维多汀)、CDX-0401，得自CelldexTherapeutics；福拉韦单抗，得自库赛尔(Crucell)；替加珠单抗，得自第一三共有限公司(Daiichi Sankyo Company Limited)；MORAb-004、MORAb-009(阿玛西单抗)，得自Eisai；LY2382770，得自礼来公司；DI17E6，得自EMD雪兰诺有限公司(EMD Serono Inc)；扎木单抗，得自Emergent BioSolutions有限公司；FG-3019，得自FibroGen有限公司；卡托莫西单抗，得自Fresenius SE&Co.KGaA；培特珠单抗(pateclizumab)、隆嗒力单抗(rontalizumab)，得自基因泰克；福莱索单抗(fresolimumab)，得自Genzyme和Sanofi；GS-6624(辛图珠单抗)，得自吉利德(Gilead)；CNTO-328、贝频珠单抗(AAB-001)、卡鲁单抗(carlumab)、CNTO-136，得自Janssen；KB003，得自KaloBios制药有限公司；ASKP1240，得自协和公司(Kyowa)；RN-307，得自Labrys生物有限公司；依美昔单抗，得自生命科学制药(Life SciencePharmaceuticals)；LY2495655、LY2928057、LY3015014、LY2951742，得自礼来公司；MBL-HCV1，得自MassBiologics；AME-133v，得自MENTRIK生物技术有限责任公司；阿必珠单抗(abituzumab)，得自默克集团(Merck KGaA)；MM-121，得自Merrimack制药有限公司；MCS110、QAX576、QBX258、QGE031，得自诺华公司(Novartis AG)；HCD122，得自诺华公司和XOMA公司(“XOMA”)；NN8555，得自诺和诺德公司(Novo Nordisk)；巴维昔单抗(bavituximab)、考塔拉(cotara)，得自Peregrine制药有限公司；PSMA-ADC，得自Progenies制药有限公司；奥戈伏单抗，得自Quest Pharmatech有限公司；法神单抗(REGN475)、REGN1033、SAR231893、REGN846，得自再生元(Regeneron)；RG7160、CIM331、RG7745，得自罗氏(Roche)；伊巴珠单抗(TMB-355)，得自TaiMed生物有限公司；TCN-032，得自Theraclone Sciences；TRC105，得自TRACON制药有限公司；UB-421，得自联合生物医学有限公司(United Biomedical Inc.)；VB4-845，得自Viventia生物有限公司；ABT-110，得自AbbVie；卡普拉单抗(Caplacizumab)、奥唑珠单抗(Ozoralizumab)，得自Ablynx；PRO 140，得自CytoDyn有限公司；GS-CDA1、MDX-1388，得自Medarex有限公司；AMG 827、AMG 888，得自Amgen；乌比妥昔单抗，得自TGTherapeutics Inc.；TOL101，得自Tolera Therapeutics,Inc.；huN901-DM1(洛沃珠单抗美坦辛(lorvotuzumab mertansine))，得自ImmunoGen有限公司；依帕珠单抗Y-90/维托珠单抗组合(IMMU-102)，得自Immunomedics有限公司；抗纤维蛋白mAb/3B6/22Tc-99m，得自Agenix有限公司；ALD403，得自Alder生物制药有限公司；RN6G/PF-04382923，得自辉瑞；CG201，得自CG Therapeutics,Inc.；KB001-A，得自KaloBios Pharmaceuticals/Sanofi；KRN-23，得自协和公司；Y-90hPAM 4，得自Immunomedics有限公司；塔瑞图单抗(Tarextumab)，得自Morphosys AG&OncoMed制药有限公司；LFG316，得自Morphosys AG和诺华公司；CNTO3157、CNTO6785，得自Morphosys AG和Jannsen；RG6013，得自罗氏和中外公司；MM-111，得自Merrimack制药有限公司(“Merrimack”)；GSK2862277，得自葛兰素史克(GlaxoSmithKline)；AMG 282、AMG 172、AMG 595、AMG 745、AMG 761，得自Amgen；BVX-20，得自Biocon；CT-P19、CT-P24、CT-P25、CT-P26、CT-P27、CT-P4，得自Celltrion；GSK284933、GSK2398852、GSK2618960、GSK1223249、GSK933776A，得自葛兰素史克；安图单抗瑞维坦星(anetumab ravtansine)，得自Morphosys AG和拜耳公司(Bayer AG)；BI-836845，得自AG和勃林格殷格翰；NOV-7、NOV-8，得自Morphosys AG和诺华公司；MM-302、MM-310、MM-141、MM-131、MM-151，得自Merrimack；RG7882，得自罗氏和Seattle Genetics；RG7841，得自罗氏/基因泰克；PF-06410293、PF-06438179、PF-06439535、PF-04605412、PF-05280586，得自辉瑞；RG7716、RG7936、健肽勒单抗(gentenerumab)、RG7444，得自罗氏；MEDI-547、MEDI-565、MEDI1814、MEDI4920、MEDI8897、MEDI-4212、MEDI-5117、MEDI-7814，得自阿斯利康公司；尤洛库单抗、PCSK9纤连蛋白，得自百时美施贵宝公司；FPA009、FPA145，得自FivePrimeTherapeutics,Inc.；GS-5745，得自吉利德；BIW-8962、KHK4083、KHK6640，得自协和发酵麒麟(Kyowa Hakko Kirin)；MM-141，得自默克集团；REGN1154、REGN1193、REGN1400、REGN1500、REGN1908-1909、REGN2009、REGN2176-3、REGN728，得自再生元；SAR307746，得自Sanofi；SGN-CD70A，得自Seattle Genetics；ALX-0141、ALX-0171，得自Ablynx；米拉珠单抗-DOX、米拉珠单抗、TF2，得自Immunomedics有限公司；MLNO264，得自Millennium；ABT-981，得自AbbVie；AbGn-168H，得自AbGenomics国际有限公司；费拉妥珠单抗，得自AVEO；BI-505，得自BioInvent国际公司；CDX-1127、CDX-301，得自Celldex Therapeutics；CLT-008，得自Cellerant Therapeutics Inc.；VGX-100，得自Circadian；U3-1565，得自第一三共有限公司；DKN-01，得自Dekkun公司；氟兰图单抗(flanvotumab)(TYRP1蛋白)、IL-1β抗体、IMC-CS4，得自礼来公司；VEGFR3 mAb、IMC-TR1(LY3022859)，得自礼来公司和ImClone有限责任公司；安神(Anthim)，得自Elusys Therapeutics Inc.；HuL2G7，得自Galaxy生物技术有限责任公司；IMGB853、IMGN529，得自ImmunoGen Inc.；CNTO-5、CNTO-5825，得自Janssen；KD-247，得自Kaketsuken；KB004，得自KaloBios制药；MGA271、MGAH22，得自MacroGenics有限公司；XmAb5574，得自MorphoSys AG/先科公司；恩土昔单抗(ensituximab)(NPC-1C)，得自Neogenix肿瘤学有限公司；LFA102，得自诺华公司和XOMA；ATI355，得自诺华公司；SAN-300，得自Santarus有限公司；SelG1，得自Selexys；HuM195/rGel，得自Targa Therapeutics公司；VX15，得自Teva制药工业有限公司(“Teva”)和Vaccinex有限公司；TCN-202，得自Theraclone Sciences；XmAb2513、XmAb5872，得自先科公司；XOMA 3AB，得自XOMA和过敏症和感染性疾病国家研究所(National Institute for Allergy and InfectiousDiseases)；神经母细胞瘤抗体疫苗，得自MabVax Therapeutics；赛妥灵(Cytolin)，得自CytoDyn有限公司；Thravixa，得自Emergent BioSolutions有限公司；以及FB 301，得自Cytovance Biologics；狂犬病mAb，得自Janssen和Sanofi；流感mAb，得自Janssen并且部分由美国国家卫生研究院资助；MB-003和ZMapp，得自Mapp生物制药有限公司；以及ZMAb，得自Defyrus IncG。
III.通常用于产生抗体和融合蛋白的ceDNA载体
本发明的实施方案是基于包含闭合端线性双链体(ceDNA)载体的方法和组合物，所述载体能够表达转基因(例如抗体或融合蛋白)。在一些实施方案中，转基因是编码抗体或融合蛋白的序列。如本文所述用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体不受尺寸限制，借此允许例如单一载体表达转基因所必需的组分表达。用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体优选双链体，例如相对于分子的至少一部分自互补，例如表达盒(例如ceDNA不是双链环状分子)。ceDNA载体具有共价闭合端，因此抵抗核酸外切酶(例如核酸外切酶I或核酸外切酶III)消化，例如在37℃下超过一个小时。
一般来说，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体按照5'到3'方向包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR。ITR序列选自以下中的任一个：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰的AAV反向末端重复(mod-ITR)(例如经修饰的不对称ITR)；(ii)两个经修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组构(例如经修饰的不对称ITR)；或(iii)对称或基本对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组构；或(iv)对称或基本对称修饰的ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构。
本文中涵盖了包含用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的方法和组合物，其可以进一步包括递送系统，例如(但不限于)脂质体纳米颗粒递送系统。本文公开了预期使用的非限制示范性脂质体纳米颗粒系统。在一些方面中，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米颗粒。举例来说，2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开了脂质纳米颗粒配制物，所述配制物经制备并且装载通过所述方法获得的ceDNA载体，所述国际申请并入本文中。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体不存在由病毒衣壳内的有限空间所强加的封装局限。与囊封的AAV基因组相反，ceDNA载体是活真核生物产生的，其代表着原核生物产生的质粒DNA载体的替代方案。这允许插入控制元件，例如如本文公开的调控开关、大的转基因、多个转基因等。
图1A-1E显示用于产生抗体或融合蛋白的非限制示范性ceDNA载体的示意图，或ceDNA质粒的相应序列。用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体是无衣壳的并且能够获自质粒，所述质粒按照此次序编码：第一ITR、包含转基因的表达盒，和第二ITR。表达盒可以包括一种或多种允许且/或控制转基因表达的调控序列，例如其中表达盒能够按照此次序包含以下中的一个或多个：增强子/启动子、ORF报告基因(转基因)、转录后调控元件(例如WPRE)，以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH polyA)。
表达盒还可包含内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A元件。顺式调控元件包括但不限于启动子、核糖开关、绝缘子、mir可调控元件、转录后调控元件、组织和细胞类型特异性启动子，和增强子。在一些实施方案中，ITR能够充当用于转基因(例如抗体或融合蛋白)的启动子。在一些实施方案中，ceDNA载体包含调控转基因表达的额外组分，例如调控开关，其描述于本文中的标题为“调控开关”的章节中，用于控制和调控抗体或融合蛋白的表达，并且必要时能够包括作为杀灭开关的调控开关，从而能够使包含ceDNA载体的细胞实现可控的细胞死亡。
表达盒能够包含超过4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸、或30,000个核苷酸、或40,000个核苷酸、或50,000个核苷酸，或在约4000-10,000个核苷酸或10,000-50,000个核苷酸之间的任何范围，或超过50,000个核苷酸。在一些实施方案中，表达盒能够包含长度在500到50,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒能够包含长度在500到75,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒能够包含长度在500到10,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒能够包含长度在1000到10,000个核苷酸范围内的转基因。在一些实施方案中，表达盒能够包含长度在500到5,000个核苷酸范围内的转基因。ceDNA载体不存在衣壳化AAV载体的尺寸限制，从而能够递送大尺寸表达盒以提供有效的转基因表达。在一些实施方案中，ceDNA载体缺乏原核生物特异性甲基化。
ceDNA表达盒能够包括例如所编码的蛋白质在接受的受试者中不存在、无活性或活性不充分的可表达的外源序列(例如开放阅读框架)或转基因，或所编码的蛋白质具有所期望的生物或治疗作用的基因。转基因能够编码能够用以校正缺陷基因或转录物表达的基因产物。原则上，表达盒可包括编码因突变而减少或不存在或在本公开的范围内认为过度表达时会展现治疗益处的蛋白质、多肽或RNA的任何基因。
表达盒能够包含任何转基因(例如编码抗体或融合蛋白)，例如适用于治疗受试者的疾病或病症的抗体或融合蛋白，即，治疗抗体或融合蛋白。ceDNA载体能够单独或与编码多肽的核酸或非编码核酸(例如RNAi、miRs等)以及外源基因和核苷酸序列(包括受试者基因组中的病毒序列，例如HIV病毒序列等等)组合使用，以递送和表达受试者中的所关注的任何抗体或融合蛋白。优选地，本文所公开的ceDNA载体用于治疗目的(例如用于医学、诊断或兽医学用途)或免疫原性多肽。在某些实施方案中，ceDNA载体适用于表达受试者中的所关注的任何基因，包括一种或多种多肽、肽、核糖核酸酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸，或RNA(编码或非编码；例如siRNA、shRNA、微RNA，和其反义对应物(例如拮抗MiR))、抗体、融合蛋白或其任何组合。
表达盒还能够编码多肽、有义或反义寡核苷酸，或RNA(编码或非编码；例如siRNA、shRNA、微RNA，和其反义对应物(例如拮抗MiR))。表达盒可包括编码用于实验或诊断目的的报告蛋白的外源序列，所述报告蛋白例如β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其它本领域众所周知的报告蛋白。
本文所述的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的表达盒、表达构建体中所提供的序列能够针对靶宿主细胞进行密码子优化。如本文所用，术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人等所关注脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在所述脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。优化的密码子能够使用例如Aptagen的Gene
Figure BDA0002629249020000831
密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen有限公司，2190 Fox Mill Rd.Suite 300,Herndon,Va.20171)或另一种可公开获得的资料库加以确定。在一些实施方案中，编码抗体或融合蛋白的核酸针对人表达进行优化，且/或是所属领域中已知的人抗体或人源化抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，ceDNA载体表达的抗体或融合蛋白是治疗抗体或融合蛋白，包括治疗性活化抗体或融合蛋白或治疗性中和(例如阻断或抑制性)抗体或融合蛋白。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体所表达的转基因编码抗体或融合蛋白。抗体和融合蛋白在所属领域中是众所周知的并且能够结合到所关注的任何蛋白质，包括(但不限于)配体、受体、毒素、激素、酶或细胞表面蛋白，或病原体或病毒蛋白或抗原，以及翻译前和修饰后修饰的蛋白质，例如糖蛋白或类泛素化蛋白质(例如抗SUMO2/3抗体)等。抗体还包括结合到任何抗原(包括(但不限于)核酸，例如DNA(例如抗dsDNA抗体)、RNA(例如抗RNA结合抗体))的抗体。在一些实施方案中，通过本文公开的ceDNA载体所产生的抗体或融合蛋白是中和抗体或融合蛋白。所靶向的示例性基因和所关注的蛋白质详细地描述于本文的使用方法和治疗方法章节中。本文公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的使用涵盖用于治疗、预防和/或改善疾病、功能异常、损伤和/或病症的一种或多种症状的抗体、融合蛋白以及变异体和/或其活性片段。示例性治疗基因描述于本文中的标题为“治疗方法”的章节中。
用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的许多结构特征不同于基于质粒的表达载体。ceDNA载体可以具有以下特征中的一个或多个：缺乏原始(即，非插入)细菌DNA、缺乏原核复制起点、是自给式，即，它们不需要除所述两个ITR之外的任何序列，包括Rep结合和末端解析位点(RBS和TRS)，和ITR之间的外源序列；存在形成发夹的ITR序列，以及缺乏细菌型DNA甲基化或实际上被哺乳动物宿主视为异常的任何其它甲基化。一般来说，本发明载体优选不含有任何原核DNA，但作为非限制性实例，预期可以将一些原核DNA作为外源序列插入启动子或增强子区域中。将ceDNA载体与质粒表达载体区分开来的另一个重要特征是，ceDNA载体是具有闭合端的单链线性DNA，而质粒始终是双链DNA。
通过本文所提供的方法产生的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体优选具有线性连续结构，而非非连续结构，如限制酶消化分析所测定(图4D)。相信线性连续结构在受到细胞核酸内切酶攻击时更稳定，并且不太可能重组并引起诱变。因此，线性连续结构的ceDNA载体是优选的实施方案。连续、线性、单链的分子内双链体ceDNA载体能够具有共价结合的末端，而没有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上不同于质粒(包括本文所述的ceDNA质粒)，所述质粒是细菌来源的环状双链体核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离，从而产生两个核酸分子，而与此相反，ceDNA载体虽然有互补链，却是单个DNA分子，因此即使变性，也仍然是单个分子。在一些实施方案中，与质粒不同，如本文所述的ceDNA载体的产生可以没有原核类型的DNA碱基甲基化。因此，在结构方面(特别是线性对比环形)以及还根据用于产生和提纯这些不同物体的方法方面，以及还根据它们的DNA甲基化方面，即ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型，ceDNA载体和ceDNA质粒是不同的。
使用如本文所述的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体相对于基于质粒的表达载体具有若干优势，此类优势包括(但不限于)：1)质粒含有细菌DNA序列并且经历原核特异性甲基化，例如6-甲基腺苷和5-甲基胞嘧啶甲基化，而无衣壳AAV载体序列具有真核起源并且未经历原核特异性甲基化；因此，相较于质粒，无衣壳AAV载体不大可能诱导发炎和免疫应答；2)质粒在生产过程期间需要存在抗性基因，而ceDNA载体则不需要；3)环状质粒在引入细胞后不递送到细胞核并且需要过量装载以规避细胞核酸酶的降解作用，而载体含有病毒顺式元件，即ITR，其赋予核酸酶抗性并且能够设计成靶向且递送到细胞核。假设：ITR功能必需的最小限定元件是Rep结合位点(RBS；对于AAV2，为5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQID NO:60))和末端解析位点(TRS；对于AAV2，为5'-AGTTGG-3'(SEQ ID NO:64))，加上允许发夹形成的可变回文序列；且4)ceDNA载体不具有通常在原核生物来源的质粒中发现的CpG二核苷酸过度表达，原核生物来源的质粒据报导结合铎样受体家族成员，诱发T细胞介导的免疫应答。相比之下，用本文公开的无衣壳AAV载体进行的转导能够有效地靶向难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒体转导的细胞和组织类型。
IV.ITR
如本文所公开，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体含有位于两个反向末端重复(ITR)序列之间的转基因或异源核酸序列，其中ITR序列可以是不对称ITR对或对称或基本对称的ITR对，这些术语如本文所定义。如本文所公开的ceDNA载体能够包含选自以下中的任一种的ITR序列：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰的AAV反向末端重复(mod-ITR)(例如不对称修饰的ITR)；(ii)两个经修饰的ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组构(例如不对称修饰的ITR)，或(iii)对称或基本对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组构，或(iv)对称或基本对称修饰的ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组构，其中本公开的方法可以进一步包括递送系统，例如(但不限于)脂质体纳米颗粒递送系统。
在一些实施方案中，ITR序列可以来自细小病毒科的病毒，细小病毒科包括两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科，和感染昆虫的浓核病毒亚科。细小病毒亚科(称为细小病毒)包括依赖病毒属，其成员在大多数情况下需要与例如腺病毒或疱疹病毒等辅助病毒共同感染才能进行生产性感染。依赖病毒属包括通常感染人类(例如血清型2、3A、3B、5和6)或灵长类动物(例如血清型1和4)的腺相关病毒(AAV)，以及感染其它温血动物的相关病毒(例如牛、犬、马和羊的腺相关病毒)。细小病毒和细小病毒科的其它成员大体描述于Kenneth I.Berns,《病毒学领域(FIELDS VIROLOGY)》(第3版，1996)中第69章“细小病毒科：病毒及其复制(Parvoviridae:The Viruses and Their Replication)”。
尽管在说明书和本文的实施例中举例说明的ITR是AAV2 WT-ITR，但是本领域的普通技术人员知道如上所述，可以使用来自任何已知的细小病毒，例如如AAV的依赖病毒(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如NCBI:NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261)的ITR、嵌合ITR或来自任何合成AAV的ITR。在一些实施方案中，AAV可以感染温血动物，例如禽类(AAAV)、牛(BAAV)、犬、马和绵羊腺相关病毒。在一些实施方案中，ITR来自B19细小病毒(GenBank登录号:NC 000883)、来自小鼠的细小病毒(MVM)(GenBank登录号NC 001510)；鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701)；蛇细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。在一些实施方案中，如本文所论述，5'WT-ITR可以来自一种血清型，而3'WT-ITR来自不同血清型。
普通技术人员知道，ITR序列具有双链霍利迪连结体(Holliday junction)的共同结构，该结构典型是T形或Y形发夹结构(参见例如图2A和3A)，其中每个WT-ITR由两个回文臂或环(B-B'和C-C')嵌入较大的回文臂(A-A')中与单链D序列形成(其中这些回文序列的顺序限定了ITR的翻转或翻动取向)。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6)的ITR的结构分析和序列比较，并描述于Grimm等人,《病毒学杂志(J.Virology)》,2006；80(1)；426-439；Yan等人,J.Virology,2005；364-379；Duan等人,《病毒学(Virology)》1999；261；8-14。本领域的技术人员基于本文提供的示例性AAV2 ITR序列，可以容易地确定用于ceDNA载体或ceDNA质粒的来自任何AAV血清型的WT-ITR序列。参见例如Grimm等人,《病毒学杂志》,2006；80(1)；426-439中描述的来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6、禽AAV(AAAV)和牛AAV(BAAV))的ITR的序列比较；其显示了AAV2的左ITR与其它血清型的左ITR的同一性％：AAV-1(84％)、AAV-3(86％)、AAV-4(79％)、AAV-5(58％)、AAV-6(左ITR)(100％)和AAV-6(右ITR)(82％)。
A.对称的ITR对
在一些实施方案中，如本文所述的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体按照5'到3'方向包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)是相对于彼此是对称的或基本对称的，也就是说，ceDNA载体能够包含具有对称三维空间组构的ITR序列，使得其结构在几何空间中具有相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。在这样的实施方案中，对称的ITR对或基本上对称的ITR对可以是不是野生型ITR的修饰ITR(例如mod-ITR)。一个mod-ITR对可以具有相同的相对于野生型ITR具有一个或多个修饰的序列，并且彼此反向互补(反向)。在替代实施方案中，修饰ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，修饰ITR对可以具有不同的序列，但是具有一致或相同的对称的三维形状。
(i)野生型ITR
在一些实施方案中，对称的ITR或基本上对称的ITR是如本文所述的野生型(WT-ITR)。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须是来自同一AAV血清型的WT-ITR。也就是说，在一些实施方案中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组构。
因此，如本文所公开，ceDNA载体含有位于两个侧接野生型反向末端重复(WT-ITR)序列之间的转基因或异源核酸序列，所述两个野生型反向末端重复序列彼此反向互补(逆向)，或替代地，相对于彼此基本对称，即，WT-ITR对具有对称的三维空间组构。在一些实施方案中，野生型ITR序列(例如AAV WT-ITR)包含功能Rep结合位点(RBS；例如AAV2为5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:60)和功能末端解析位点(TRS；例如5'-AGTT-3'，SEQ IDNO:62)
在一个方面中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体获自编码异源核酸的载体多核苷酸，所述异源核酸可操作地位于两个WT反向末端重复序列(WT-ITR)(例如AAV WT-ITR)之间。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须是来自同一AAV血清型的WT-ITR。也就是说，在一些实施方案中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组构。在一些实施方案中，5'WT-ITR来自一种AAV血清型，而3'WT-ITR来自相同或不同的AAV血清型。在一些实施方案中，5'WT-ITR和3'WT-ITR是彼此的镜像，即它们是对称的。在一些实施方案中，5'WT-ITR和3'WT-ITR来自相同的AAV血清型。
WT ITR是众所周知的。在一个实施方案中，两个ITR来自相同的AAV2血清型。在某些实施方案中，可以使用来自其它血清型的WT。有许多同源的血清型，例如AAV2、AAV4、AAV6、AAV8。在一个实施方案中，可以使用紧密同源的ITR(例如具有相似环结构的ITR)。在另一个实施方案中，能够使用较多样化的AAV WT ITR，例如AAV2和AAV5，并且在仍另一个实施方案中，能够使用基本上呈WT的ITR，也就是说，其不仅具有WT的基本环结构，而且具有不改变或不影响所述特性的一些保守核苷酸变化。当使用来自相同病毒血清型的WT-ITR时，可以进一步使用一种或多种调控序列。在某些实施方案中，调控序列是容许调节ceDNA活性(例如所编码抗体或融合蛋白的表达)的调控开关。
在一些实施方案中，本文所述技术的一个方面涉及一种用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体，其中ceDNA载体包含至少一个可操作地位于两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)之间的异源核苷酸序列，其中WT-ITR能够来自相同血清型、不同血清型或相对于彼此是基本对称的(即，具有对称的三维空间组构，使得其结构在几何空间中具有相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环)。在一些实施方案中，对称的WT-ITR包含功能性末端解链位点和Rep结合位点。在一些实施方案中，异源核酸序列编码转基因，并且其中载体不在病毒衣壳中。
在一些实施方案中，WT-ITR是相同的，但是彼此反向互补。例如，5'ITR中的序列AACG可以是3'ITR中相应位点处的CGTT(即，反向互补)。在一个实例中，5'WT-ITR有义链包含ATCGATCG的序列，而相应的3'WT-ITR有义链包含CGATCGAT(即与ATCGATCG反向互补)。在一些实施方案中，WT-ITR ceDNA进一步包含末端解链位点和复制蛋白结合位点(RPS)(有时称为复制蛋白结合位点)，例如Rep结合位点。
用于产生抗体或融合蛋白的包含WT-ITR的ceDNA载体中所用的示例性WT-ITR序列显示于本文的表7中，所述表格显示WT-ITR对(5'WT-ITR和3'WT-ITR)。
作为一个示例性实例，本公开提供了用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体，所述载体包含可操作地连接到转基因(例如异源核酸序列)的启动子，存在或不存在调控开关，其中ceDNA缺乏衣壳蛋白并且：(a)由编码WT-ITR的ceDNA-质粒(参见例如图1F-1G)产生，其中每个WT-ITR的发夹二级构形具有相同数目个分子内双链体碱基对(相较于这些参考序列，优选排除这种构形中的任何AAA或TTT末端环的缺失)；和(b)使用分析鉴定为ceDNA，所述分析是通过琼脂糖凝胶电泳、在实例1中的天然凝胶和变性条件下鉴定ceDNA。
在一些实施方案中，位于两侧的WT-ITR彼此基本上对称。在所述实施方案中，5'WT-ITR可以来自AAV的一种血清型，而3'WT-ITR可以来自AAV的另一种血清型，使得WT-ITR不是相同的反向互补序列。举例来说，5'WT-ITR能够来自AAV2，并且3'WT-ITR来自不同血清型，例如AAV1、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。在一些实施方案中，WT-ITR可以选自从以下中的任一种中选择的两种不同的细小病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。在一些实施方案中，WT ITR的这种组合是来自AAV2和AAV6的WT-ITR的组合。在一个实施方案中，当一个相对于另一个ITR反向时，基本上对称的WT-ITR是至少90％同一，至少95％同一，至少96％...97％...98％...99％......99.5％以及之间的所有点，并具有相同的对称三维空间组构。在一些实施方案中，WT-ITR对由于其具有对称的三维空间组构，例如具有A、C-C'、B-B'和D臂的相同3D组构，因此是基本对称的。在一个实施方案中，基本对称的WT-ITR对相对于彼此呈逆向，并且彼此至少95％一致、至少96％…97％…98％…99％…99.5％和其间的所有点，并且一个WT-ITR保留5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的Rep结合位点(RBS)和末端解析位点(trs)。在一些实施方案中，基本对称的WT-ITR对相对于彼此呈逆向，并且彼此至少95％一致、至少96％…97％…98％…99％…99.5％和其间的所有点，并且一个WT-ITR保留5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的Rep结合位点(RBS)和末端解析位点(trs)，此外保留允许发夹二级结构形成的可变回文序列。同源性可以通过本领域公知的标准方法来确定，例如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)、BLASTN。
在一些实施方案中，ITR的结构元件可以是参与ITR与大的Rep蛋白(例如Rep 78或Rep 68)的功能性相互作用的任何结构元件。在某些实施方案中，结构元件为ITR与大的Rep蛋白的相互作用提供了选择性，即，至少部分确定哪种Rep蛋白与ITR功能性相互作用。在其它实施方案中，当Rep蛋白与ITR结合时，结构元件与大的Rep蛋白物理上相互作用。每个结构元件可以是例如ITR的二级结构、ITR的核苷酸序列、两个或更多个元件之间的间距元件，或上述任一个的组合。在一个实施方案中，结构元件选自由A和A'臂、B和B'臂、C和C'臂、D臂、Rep结合位点(RBE)和RBE'(即互补RBE序列)以及末端解链位点(trs)组成的组。
仅举例而言，表6指出WT-ITR的示例性组合。
表6：来自相同血清型或不同血清型或不同小病毒的WT-ITR的示例性组合显示的顺序并不表示ITR位置，例如，“AAV1，AAV2”表明ceDNA可以在5'位置包含WT-AAV1 ITR，而在3'位置包含WT-AAV2 ITR，反之亦然，WT-AAV2 ITR位于5'位置，WT-AAV1 ITR位于3'位置。缩写：AAV血清型1(AAV1)，AAV血清型2(AAV2)，AAV血清型3(AAV3)，AAV血清型4(AAV4)，AAV血清型5(AAV5)，AAV血清型6(AAV6)，AAV血清型7(AAV7)，AAV血清型8(AAV8)，AAV血清型9(AAV9)，AAV血清型10(AAV10)，AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)；AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组(例如NCBI:NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261)，来自温血动物的ITR(禽AAV(AAAV)，牛AAV(BAAV)，犬、马和绵羊AAV)，来自B19细小病毒的ITR(GenBank登录号:NC 000883)，来自小鼠的细小病毒(MVM)(GenBank登录号NC 001510)；鹅：鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701)；蛇：蛇细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。
表6：
Figure BDA0002629249020000921
Figure BDA0002629249020000931
Figure BDA0002629249020000941
Figure BDA0002629249020000951
仅举例而言，表7显示来自一些不同AAV血清型的示例性WT-ITR的序列。
表7
Figure BDA0002629249020000961
在一些实施方案中，可以修饰WT-ITR序列的核苷酸序列(例如，通过修饰1、2、3、4或5个或更多个核苷酸或其中的任何范围)，其中所述修饰是替代互补核苷酸，例如，G替代C，反之亦然，T替代A，反之亦然。
在本发明的某些实施例中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体不具有由选自以下中的任一个的核苷酸序列组成的WT-ITR：SEQ ID NO:1、2、5-14。在本发明的替代实施例中，如果ceDNA载体具有包含选自以下中的任一个的核苷酸序列的WT-ITR：SEQ ID NO:1、2、5-14，则侧接ITR也是WT并且ceDNA载体包含调控开关，例如如本文和国际申请PCT/US18/49996所公开(例如参见PCT/US18/49996的表11)。在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体包含如本文所公开的调控开关和经选择的WT-ITR，所述WT-ITR具有选自由SEQ ID NO:1、2、5-14组成的群组中的任一个的核苷酸序列。
如本文所述的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够包括保留可操作的RBE、trs和RBE'部分的WT-ITR结构。出于示例性目的使用野生型ITR，图2A和图2B示出了关于ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的trs位点操作的一种可能机制。在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体含有一个或多个功能WT-ITR多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS；对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)和末端解析位点(TRS；5'-AGTT(SEQ ID NO:62))。在一些实施方案中，至少一个WT-ITR是功能性的。在其中用于产生抗体或融合蛋白d ceDNA载体包含彼此间基本对称的两个WT-ITR的替代实施方案中，至少一个WT-ITR是功能性的并且至少一个WT-ITR是非功能性的。
B.通常对于包含不对称ITR对或对称ITR对的ceDNA载体的修饰ITR(mod-ITR)
如本文所论述，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够包含对称ITR对或不对称ITR对。在两个例子中，ITR中的一个或两个可以是经修饰的ITR，差异在于，在第一个例子(即，对称mod-ITR)中，mod-ITR具有相同的三维空间组构(即，具有相同的A-A'、C-C'和B-B'臂构形)，而在第二个例子(即，不对称mod-ITR)中，mod-ITR具有不同的三维空间组构(即，具有A-A'、C-C'和B-B'臂的不同构形)。
在一些实施方案中，相较于野生型ITR序列(例如AAV ITR)，经修饰的ITR是通过缺失、插入和/或取代进行修饰的ITR。在一些实施方案中，ceDNA载体中的至少一个ITR包含功能Rep结合位点(RBS；对于AAV2为例如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:60)和功能末端解析位点(TRS；例如5'-AGTT-3'，SEQ ID NO:62)。在一个实施方案中，ITR中的至少一个是非功能ITR。在一个实施方案中，不同或修饰ITR不是来自不同血清型的每种野生型ITR。
在本文中详细描述了ITR中的特定改变和突变，但是在ITR的情况下，“改变”或“突变”或“修饰”表明相对于野生型、参考或原始ITR序列，插入、缺失和/或取代核苷酸。改变或突变的ITR可以是工程化ITR。如本文所用，“工程化”是指通过人的手进行操纵的方面。例如，当多肽的至少一个方面，例如其序列，通过人的手进行操纵而不同于自然存在的方面时，则认为该多肽是“工程化”的。
在一些实施方案中，mod-ITR可以是合成的。在一个实施方案中，合成的ITR是基于来自一种以上AAV血清型的ITR序列。在另一个实施方案中，合成的ITR不包括基于AAV的序列。在又一个实施方案中，合成的ITR尽管仅具有一些或不具有源自AAV的序列，但是保留了上述的ITR结构。在一些方面，合成的ITR可以优先与野生型Rep或特定血清型的Rep相互作用，或者在某些情况下，野生型Rep将不识别其，而仅突变的Rep可识别其。
技术人员可以通过已知手段确定其它血清型的相应序列。例如，确定改变是否在A、A'、B、B'、C、C'或D区域中，并确定另一种血清型中的相应区域。能够在默认状态下使用
Figure BDA0002629249020000991
(基本局部比对搜索工具)或其它同源性比对程序测定相应序列。本发明进一步提供了包含来自不同AAV血清型的组合的mod-ITR的ceDNA载体群体和多种ceDNA载体，也就是说，一个mod-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个mod-ITR可以来自不同血清型。不希望受理论的束缚，在一个实施方案中，一个ITR可以来自或基于AAV2 ITR序列，而ceDNA载体的另一个ITR可以来自或基于以下中的任一种或多种ITR序列：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)。
任何细小病毒ITR都可以用作ITR或用于修饰的基础ITR。优选地，细小病毒是依赖病毒。更优选是AAV。选择的血清型可以是基于血清型的组织嗜性。AAV2具有广泛的组织嗜性，AAV1优先靶向神经元和骨骼肌，而AAV5优先靶向神经元、视网膜色素上皮和光感受器。AAV6优先靶向骨骼肌和肺。AAV8优先靶向肝脏、骨骼肌、心脏和胰腺组织。AAV9优先靶向肝脏、骨骼和肺组织。在一个实施方案中，修饰ITR是基于AAV2 ITR。
更具体地，可以通过修饰结构元件来改变结构元件与特定的大Rep蛋白功能性相互作用的能力。例如，可以与ITR的野生型序列相比较来修饰结构元件的核苷酸序列。在一个实施方案中，可以除去ITR的结构元件(例如A臂、A'臂、B臂、B'臂、C臂、C'臂、D臂、RBE、RBE'和trs)并用来自不同细小病毒的野生型结构元件替代。例如，替代结构可以来自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。例如，ITR可以是AAV2 ITR，并且A或A'臂或RBE可以用来自AAV5的结构元件替代。在另一个实例中，ITR可以是AAV5 ITR，并且C或C'臂、RBE和trs可以用来自AAV2的结构元件替代。在另一个实例中，AAV ITR可以是B和B'臂被AAV2 ITRB和B'臂替代的AAV5 ITR。
仅举例而言，表8显示经修饰的ITR的区域中的至少一个核苷酸的示例性修饰(例如缺失、插入和/或取代)，其中X表示那个区段中的至少一个核酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)(相对于相应野生型ITR)。在一些实施方案中，在C和/或C'和/或B和/或B'的任何区域中的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即，TTT)。例如，如果修饰引起以下任一种：单臂ITR(例如，单个C-C'臂或单个B-B'臂)或修饰的C-B'臂或C'-B臂、或具有至少一个截断臂(例如截断的C-C'臂和/或截断的B-B'臂)的两臂ITR，那么至少所述单臂、或两臂ITR(其中一个臂可以是截断的)的至少一个臂在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在一些实施方案中，截断的C-C'臂和/或截断的B-B'臂在末端环中具有三个连续的T核苷酸(即TTT)。
表8：ITR的不同B-B'和C-C'区域或臂的至少一个核苷酸的修饰的示例性组合(例如缺失、插入和/或取代)(X表示核苷酸修饰，例如所述区域中的至少一个核苷酸的添加、缺失或取代)。
Figure BDA0002629249020001001
Figure BDA0002629249020001011
在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体中使用的mod-ITR包含不对称ITR对或如本文所公开的对称mod-ITR对，能够包含表8中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含选自以下的任一个或多个区域中的至少一个核苷酸的修饰：A'与C之间、C与C'之间、C'与B之间、B与B'之间以及B'与A之间。在一些实施方案中，C或C'或B或B'区域中的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)仍然保留茎环的末端环。在一些实施方案中，在C和C'和/或B和B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在替代实施方案中，C与C'之间和/或B与B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)使至少一个末端环中保留三个连续A核苷酸(即，AAA)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR能够包含表8中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含选自以下的任一个或多个区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)：A'、A和/或D。举例来说，在一些实施例中，本文中使用的经修饰的ITR能够包含表8中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含A区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR能够包含表8中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含A'区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR能够包含表8中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含A和/或A'区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。在一些实施方案中，本文中使用的经修饰的ITR能够包含表8中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含D区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如缺失、插入和/或取代)。
在一个实施方案中，能够修饰结构元件的核苷酸序列(例如修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或其中的任何范围)，以产生经修饰的结构元件。在一个实施方案中，本文中举例说明了ITR的特定修饰(例如SEQ IDNO:3、4、15-47、101-116或165-187，或2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图7A-7B中所示(例如PCT/US2018/064242中的SEQ ID No 97-98、101-103、105-108、111-112、117-134、545-54)。在一些实施方案中，能够修饰ITR(例如通过修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或其中的任何范围)。在其它实施方案中，ITR与SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187的经修饰的ITR之一或SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187的A-A'臂和C-C'和B-B'臂的含RBE区段或国际申请PCT/US18/49996的表2-9中所示(即，SEQ ID NO:110-112、115-190、200-468)能够具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列一致性，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，经修饰的ITR能够包含例如所有特定臂(例如A-A'臂的全部或一部分，或B-B'臂的全部或一部分，或C-C'臂的全部或一部分)的去除或缺失，或替代地，形成环茎的1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个碱基对的去除，只要对茎(例如单臂)进行封端的最终环仍然存在(参见例如2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图7A中的ITR-21)。在一些实施方案中，修饰ITR可以包含从B-B'臂除去1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对。在一些实施方案中，经修饰的ITR能够包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个碱基对从C-C'臂中的去除(参见例如2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图3B中的ITR-1或图7A中的ITR-45)。在一些实施方案中，修饰ITR可以包含从C-C'臂除去1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对和从B-B'臂除去1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对。设想去除碱基对的任何组合，例如可以在C-C'臂中去除6个碱基对以及在B-B'臂中去除2个碱基对。作为说明性实例，图3B展示了示例性的修饰ITR，其从C部分和C'部分各缺失至少7个碱基对，C和C'区域之间的环中的核苷酸被取代，以及从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对，使得修饰ITR包含至少一个臂(例如C-C')截断的两个臂。在一些实施方案中，修饰ITR还包含从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对，使得臂B-B'相对于WT ITR也截断。
在一些实施方案中，经修饰的ITR相对于野生型全长ITR序列能够具有1到50(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)个核苷酸缺失。在一些实施方案中，相对于全长WT ITR序列，修饰ITR可缺失1和30个之间的核苷酸。在一些实施方案中，相对于全长野生型ITR序列，修饰ITR可缺失2和20个之间的核苷酸。
在一些实施方案中，经修饰的ITR在A或A'区域的含RBE部分中不含任何核苷酸缺失，以便干扰DNA复制(例如通过Rep蛋白结合至RBE，或在末端解析位点切割)。在一些实施方案中，预期用于本文中的经修饰的ITR在如本文所述的B、B'、C和/或C区域中具有一个或多个缺失。
在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的包含对称ITR对或不对称ITR对的ceDNA载体包含如本文所公开的调控开关和至少一个经修饰的ITR，所述ITR经选择而具有选自由以下组成的任一群组的核苷酸序列：SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187。
在另一个实施方案中，结构元件的结构可以进行修饰。例如，结构元件改变了茎高和/或环中核苷酸的数量。例如，茎高可以是约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个或更多个核苷酸或其中的任何范围。在一个实施方案中，茎高可以是约5个核苷酸至约9个核苷酸并与Rep功能性相互作用。在另一个实施方案中，茎高可以是约7个核苷酸并与Rep功能性相互作用。在另一个实例中，环可以具有3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核苷酸或其中的任何范围。
在另一个实施方案中，RBE或扩展RBE内GAGY结合位点或GAGY相关结合位点的数量可以增加或减少。在一个实例中，RBE或扩展RBE可以包含1个、2个、3个、4个、5个或6个或更多个GAGY结合位点或其中的任何范围。每个GAGY结合位点可以独立地是精确的GAGY序列或类似于GAGY的序列，只要该序列足以结合Rep蛋白即可。
在另一个实施方案中，能够改变(例如增加或减少)两个元件(例如(但不限于)RBE和发夹)之间的间距，以改变与大Rep蛋白的功能相互作用。例如，间距可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个或更多个核苷酸或其中的任何范围。
如本文所述的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够包括ITR结构，所述ITR结构相对于本文公开的野生型AAV2 ITR结构已经修饰，但仍然保留可操作的RBE、trs和RBE'部分。图2A和图2B显示用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的trs位点的一种可能的操作机理。在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体含有一个或多个功能ITR多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS；对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)和末端解析位点(TRS；5'-AGTT(SEQ IDNO:62))。在一些实施方案中，至少一个ITR(wt或修饰ITR)是功能性的。在其中用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体包含彼此不同或不对称的两个经修饰的ITR的替代性实施方案中，至少一个经修饰的ITR是功能性的并且至少一个经修饰的ITR是非功能性的。
在一些实施方案中，如本文所述的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的经修饰的ITR(例如左或右ITR)在环臂、截断的臂或间隔子内具有修饰。环臂、截断的臂或间隔子内具有修饰的ITR的示例性序列列举于国际申请PCT/US18/49996的表2(即，SEQ ID NO:135-190、200-233)；表3(例如SEQ ID No:234-263)；表4(例如SEQ ID NO:264-293)；表5(例如本文中的SEQ ID No:294-318)；表6(例如SEQ ID NO:319-468；以及表7-9(例如SEQ IDNo:101-110、111-112、115-134)或表10A或10B(例如SEQ ID No:9、100、469-483、484-499)中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的包含不对称ITR对或对称mod-ITR对的ceDNA载体中使用的经修饰的ITR选自国际申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9和10A-10B中所示的那些修饰的组合，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
用于产生抗体或融合蛋白的包含上述各类别的不对称ITR对或对称mod-ITR对的ceDNA载体中使用的其它示例性修饰ITR提供于表9A和9B中。表9A中的经修饰的右ITR的预测二级结构显示于2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7A中，并且表9B中的经修饰的左ITR的预测二级结构显示于2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7B中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
表9A和表9B显示经修饰的右ITR和左ITR。
表9A：经修饰的示例性右ITR.经修饰的这些示例性右ITR能够包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3′(SEQ ID NO:60)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:69)的间隔子、间隔子补体GCCTCAGT(SEQ ID NO:70)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:71)的RBE'(即，RBE的补体)。
Figure BDA0002629249020001051
Figure BDA0002629249020001061
Figure BDA0002629249020001071
表9B：经修饰的示例性左ITR.经修饰的这些示例性左ITR能够包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:69)的间隔子、间隔子补体GCCTCAGT(SEQ ID NO:70)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:71)的RBE补体(RBE')。
Figure BDA0002629249020001072
Figure BDA0002629249020001081
在一个实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体按照5'到3'方向包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、所关注非核苷酸序列(例如如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此是不对称的，也就是说，它们彼此具有不同的3D空间构形。作为示例性实施方案，第一ITR可以是野生型ITR，并且第二ITR可以是突变或修饰ITR，或反过来，其中第一ITR可以是突变或修饰ITR，第二ITR可以是野生型ITR。在一些实施方案中，第一ITR和第二ITR均是mod-ITR，但具有不同序列或具有不同修饰，因此不是相同的经修饰的ITR，并且具有不同的3D空间构形。换句话说，具有不对称ITR的ceDNA载体包含如下ITR，其中一个ITR相对于WT-ITR的任何变化均未反映于另一个ITR中；或替代地，其中不对称ITR具有、经修饰的不对称ITR对能够具有相对于彼此不同的序列和不同的三维形状。用于产生抗体或融合蛋白和用于产生ceDNA-质粒的ceDNA载体中的示例性不对称ITR显示于表9A和9B中。
在一个替代实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体包含两个对称mod-ITR，也就是说，两个ITR均具有相同序列，但彼此反向的补体(逆向)。在一些实施方案中，相对于来自相同AAV血清型的野生型ITR序列，对称的mod-ITR对包含缺失、插入或取代中的至少一种或任何组合。对称ITR中的添加、缺失或取代是相同的，但彼此反向互补。例如，在5'ITR的C区域中插入3个核苷酸将反映为在3'ITR的C'区域中相应部分中插入3个反向互补核苷酸。仅出于说明目的，如果在5'ITR中添加AACG，那么在3'ITR中相应位点处添加CGTT。举例来说，如果5'ITR有义链是ATCGATCG，则G与A之间添加AACG会产生序列ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:51)。相应的3'ITR有义链是CGATCGAT(ATCGATCG的反向补体)，其中T与C之间添加CGTT(即，AACG的反向补体)会产生序列CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:49)(ATCGAACGATCG的反向补体)(SEQ ID NO:51)。
在替代实施方案中，修饰ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，修饰ITR对可以具有不同的序列，但是具有一致或相同的对称的三维形状。举例来说，一个经修饰的ITR能够来自一种血清型，而另一个经修饰的ITR能够来自不同血清型，但它们在相同区域中具有相同突变(例如核苷酸插入、缺失或取代)。换句话说，仅出于说明目的，5'mod-ITR可以来自AAV2并在C区域有一个缺失，而3'mod-ITR可以来自AAV5并在C'区域中有相应的缺失，并且如果5'mod-ITR和3'mod-ITR具有相同或对称的三维空间组构，那么其作为修饰ITR对涵盖用于在本文中。
在一些实施方案中，基本上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的mod-ITR对中的修饰ITR缺失C-C'臂，那么同源mod-ITR相应缺失C-C'环，并且在其同源mod-ITR的几何空间呈相同形状下，剩余A和B-B'环具有相似3D结构。仅作为示例，基本上对称的ITR可以具有对称的空间组构，使得它们的结构在几何空间中是相同的形状。例如，当将GC对修饰为例如CG对，反之亦然，或者将AT对修饰为TA对，反之亦然时，可能会发生这种情况。因此，如果例如5'ITR具有序列ATCGAACCATCG(SEQ ID NO:50)(其中G另外修饰成C)，并且基本对称的3'ITR具有序列CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:49)(除a之外，T不进行相应修饰)，那么使用上述示例性实例经修饰的5'ITR作为ATCGAACGATCG(SEQ ID NO:51)和经修饰的3'ITR作为CGATCGTTCGAT(SEQ ID NO:49)(即，ATCGAACGATCG的反向补体(SEQ ID NO:51))，这些经修饰的ITR仍然会是对称的。在一些实施方案中，此类经修饰的ITR对是基本对称的，原因是经修饰的ITR对具有对称立体化学构型。
表10显示对称修饰的示例性ITR对(即，经修饰的左ITR和经修饰的对称右ITR)，其用于供产生抗体或融合蛋白用的ceDNA载体中。序列的黑体(红色)部分标识了部分ITR序列(即A-A'、C-C'和B-B'环的序列)，也在图31A-46B中示出。经修饰的这些示例性ITR能够包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的RBE、ACTGAGGC(SEQ ID NO:69)的间隔子、间隔子补体GCCTCAGT(SEQ ID NO:70)和GAGCGAGCGAGCGCGC(SEQ ID NO:71)的RBE'(即，RBE的补体)。
Figure BDA0002629249020001101
Figure BDA0002629249020001111
Figure BDA0002629249020001121
Figure BDA0002629249020001131
在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的包含不对称ITR对的ceDNA载体能够包含具有修饰的ITR，所述修饰对应于以下序列中的任一修饰：本文表9A-9B中的任一个或多个中所示的ITR序列或ITR部分序列；或2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242的图7A-7B中所示的序列，所述国际申请全文并入本文中；或2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9或10A-10B中所公开的序列，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
V.示例性ceDNA载体
如上文所述，本公开涉及用于产生抗体或融合蛋白的重组ceDNA表达载体和编码抗体或融合蛋白的ceDNA载体，所述载体包含以下中的任一个：不对称ITR对、对称ITR对，或基本对称的ITR对，如上文所述。在某些实施方案中，本公开涉及具有侧接ITR序列和转基因、用于产生抗体或融合蛋白的重组ceDNA载体，其中如本文所定义，ITR序列相对于彼此是不对称、对称或基本对称的，并且ceDNA进一步包含位于侧接ITR之间的所关注核苷酸序列(例如包含转基因的核酸的表达盒)，其中所述核酸分子缺乏病毒衣壳蛋白编码序列。
用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA表现载体可以是能够方便地经历重组DNA程序的任何ceDNA载体，其包括如本文所述的核苷酸序列，限制条件是至少一个ITR已改变。本公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体与ceDNA载体待引入其中的宿主细胞相容。在某些实施方案中，ceDNA载体可以是线性的。在某些实施方案中，ceDNA载体可以作为染色体外实体存在。在某些实施方案中，本公开的ceDNA载体可以含有容许供体序列整合到宿主细胞基因组中的元件。如本文所用，“转基因”与“异源核苷酸序列”同义，并且编码抗体或融合蛋白，如本文所述。
现参看图1A-1G，显示了适用于制备供产生抗体或融合蛋白用的ceDNA载体的两个非限制性质粒的功能组分示意图。图1A、1B、1D、1F显示了用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的构建体或ceDNA质粒的相应序列。ceDNA载体是无衣壳的并且能够获自质粒，所述质粒按照此次序编码：第一ITR、可表达的转基因盒，和第二ITR，其中如本文所定义，第一与第二ITR序列相对于彼此是不对称、对称或基本对称的。用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体是无衣壳的并且能够获自质粒，所述质粒按照此次序编码：第一ITR、可表达的转基因(蛋白质或核酸)，和第二ITR，其中如本文所定义，第一与第二ITR序列相对于彼此是不对称、对称或基本对称的。在一些实施方案中，可表达的转基因盒在需要时包括：增强子/启动子、一个或多个同源臂、供体序列、转录后调控元件(例如WPRE，例如SEQ ID NO:67)，以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH polyA，例如SEQ ID NO:68)。
图5是使用实施例中所述的方法证实从多个质粒构建体产生ceDNA的凝胶。如以上关于图4A和实施例中所论述，ceDNA由凝胶中的特征色带图案证实。
A.调控元件.
如本文所述用于产生抗体或融合蛋白、如本文所定义包含不对称ITR对或对称ITR对的ceDNA载体能够进一步包含顺式调控元件的特定组合。顺式调控元件包括但不限于启动子、核糖开关、绝缘子、mir可调控元件、转录后调控元件、组织和细胞类型特异性启动子，和增强子。在一些实施方案中，ITR能够充当转基因(例如抗体或融合蛋白)的启动子。在一些实施方案中，如本文所述用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体包含调控转基因表达的额外组分，例如如本文所述的调控转基因表达的调控开关，或杀灭开关，其能够杀灭包含编码抗体或其抗原结合片段的ceDNA载体的细胞。国际申请PCT/US18/49996中更充分地论述了本发明中能够使用的调控元件，包括调控开关，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
在实施方案中，第二核苷酸序列包括调控序列和编码核酸酶的核苷酸序列。在某些实施方案中，基因调控序列与编码核酸酶的核苷酸序列可操作地连接。在某些实施方案中，调控序列适合于控制核酸酶在宿主细胞中的表达。在某些实施方案中，调控序列包括适合的启动子序列，其能够引导可操作地连接到启动子序列的基因转录，例如编码本公开的核酸酶的核苷酸序列。在某些实施方案中，第二核苷酸序列包括连接到编码核酸酶的核苷酸序列的5'末端的内含子序列。在某些实施方案中，在启动子的上游提供增强子序列以增加启动子的功效。在某些实施方案中，调控序列包括增强子和启动子，其中第二核苷酸序列包括在编码核酸酶的核苷酸序列上游的内含子序列，其中内含子包括一个或多个核酸酶裂解位点，并且其中启动子与编码核酸酶的核苷酸序列可操作地连接。
以合成方式或使用如本文实例中所述的基于细胞的产生方法产生的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够进一步包含顺式调控元件的特定组合，例如WHP转录后调节元件(WPRE)(例如SEQ ID NO:67)和BGH polyA(SEQ ID NO:68)。适用于表达构建体中的表达盒不受病毒衣壳强加的包装约束的限制。
(i).启动子：
一般技术者应了解，适当时应该根据它们启动的特定序列来定制如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体中所用的启动子。
用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的表达盒能够包括启动子，所述启动子能够影响整体表达水平以及细胞特异性。就转基因表达(例如抗体或抗原结合片段表达)而言，它们能够包括高活性病毒源即刻早期启动子。表达盒可以含有组织特异性的真核启动子，以将转基因表达限制在特定细胞类型，并减少由不受调控的异常表达引起的毒性效应和免疫应答。在一些实施方案中，表达盒能够含有合成调控元件，例如CAG启动子(SEQ IDNO:72)。CAG启动子包含(i)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，(ii)鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及(iii)兔β-球蛋白基因的剪接受体。替代地，表达盒能够含有α-1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子(SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:74)、肝脏特异性(LP1)启动子(SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76)，或人延伸因子-1α(EF1a)启动子(例如SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78)。在一些实施方案中，表达盒包括一个或多个组成型启动子，例如逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)，或细胞巨大病毒(CMV)即刻早期启动子(任选地具有CMV增强子，例如SEQ ID NO:79)。可替代地，可以使用诱导型启动子、转基因的天然启动子、组织特异性启动子或本领域已知的各种启动子。
合适的启动子，包括上述启动子，可以源自于病毒并因此可以称为病毒启动子，或者它们可以源自于任何生物，包括原核或真核生物。合适的启动子可用于通过任何RNA聚合酶(例如pol I、pol II、pol III)来驱动表达。示例性启动子包括(但不限于)SV40早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、细胞巨大病毒(CMV)启动子(例如CMV即刻早期启动子区域(CMVIE))、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、人U6小核启动子(U6，例如SEQ ID NO:80)(Miyagishi等人，《自然·生物技术(Nature Biotechnology)》20，497-500(2002))、增强型U6启动子(例如Xia等人，《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》2003年9月1日；31(17))、人H1启动子(H1)(例如SEQID NO:81或SEQ ID NO:155)、CAG启动子、人α1-抗胰蛋白酶(HAAT)启动子(例如SEQ ID NO:82)等等。在某些实施方案中，这些启动子在其下游含内含子的末端处被改变以包括一个或多个核酸酶裂解位点。在某些实施方案中，含有核酸酶裂解位点的DNA与启动子DNA是无关的。
在一个实施方案中，使用的启动子是编码治疗性蛋白质的基因的天然启动子。编码治疗性蛋白质的相应基因的启动子和其它调控序列是已知的并且已被表征。所用启动子区域可以进一步包括一种或多种额外的调控序列(例如原生)，例如增强子(例如SEQ IDNO:79和SEQ ID NO:83)，包括SV40增强子(SEQ ID NO:126)。
在一些实施方案中，启动子还可以是来自人基因的启动子，例如人泛素C(hUbC)、人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。启动子还可以是组织特异性启动子，例如肝脏特异性启动子，例如天然或合成的人α1-抗胰蛋白酶(HAAT)。在一个实施方案中，使用内源性ApoE、经由存在于肝细胞表面上的低密度脂蛋白(LDL)受体将包含ceDNA载体的组合物特异性靶向肝细胞能够实现向肝脏的递送。
根据本发明使用的适合启动子的非限制性实例包括例如CAG启动子(SEQ ID NO:72)、HAAT启动子(SEQ ID NO:82)、人EF1-α启动子(SEQ ID NO:77)，或EF1a启动子(SEQ IDNO:78)、IE2启动子(例如SEQ ID NO:84)和大鼠EF1-α启动子(SEQ ID NO:85)、mEF1启动子(SEQ ID NO:59)的片段，或1E1启动子片段(SEQ ID NO:125)。
(ii).聚腺苷酸化序列：
用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体中能够包括编码聚腺苷酸化序列的序列，以使从ceDNA载体中表达的mRNA稳定化且有助于核输出和翻译。在一个实施方案中，ceDNA载体不包括多聚腺苷酸化序列。在其它实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少45、至少50个或更多个腺嘌呤二核苷酸。在一些实施方案中，多聚腺苷酸化序列包含约43个核苷酸、约40-50个核苷酸、约40-55个核苷酸、约45-50个核苷酸、约35-50个核苷酸或它们之间的任何范围。如图10A-10G所示，聚腺苷酸化序列能够定位于编码抗体或抗体片段的转基因的3'。在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的编码完整IgG或完整抗体的ceDNA载体能够包含IRES(内部核糖体进入位点)序列(SEQ ID NO:190)，例如其中IRES序列定位于聚腺苷酸化序列的3'，以便定位于第一转基因3'的第二转基因(例如抗体或抗原结合片段)被翻译且被相同ceDNA载体表达，使得ceDNA载体能够表达完整抗体(参见例如图10B)。
表达盒能够包括所属领域中已知的聚腺苷酸化序列或其变异体，例如从牛BGHpA(例如SEQ ID NO:68)或病毒SV40pA(例如SEQ ID NO:86)中分离的天然存在的序列，或合成序列(例如SEQ ID NO:87)。一些表达盒还可以包括SV40晚期多聚A信号上游增强子(USE)序列。在一些实施方案中，USE可以与SV40pA或异源多聚A信号组合使用。
表达盒还可以包括转录后元件以增加转基因的表达。在一些实施方案中，使用土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)(例如SEQ ID NO:67)增强转基因表达。可以使用其它转录后加工元件，例如来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因或乙型肝炎病毒(HBV)的转录后元件。分泌序列能够连接到转基因，例如VH-02和VK-A26序列，例如SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89。
(iii).核定位序列
在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体包含一个或多个核定位序列(NLS)，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个NLS。在一些实施方案中，一个或多个NLS位于氨基端或附近、羧基端或附近，或这些位置的组合(例如氨基端的一个或多个NLS和/或羧基端的一个或多个NLS)。当存在超过一个NLS时，可以彼此独立地选择，使得单个NLS可以呈超过一个拷贝存在和/或与呈一个或多个拷贝存在的一个或多个其它NLS组合存在。NLS的非限制性实例显示于表11中。
表11：核定位信号
Figure BDA0002629249020001191
Figure BDA0002629249020001201
B.ceDNA载体的其它组分
本公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体可以含有编码用于基因表达的其它组分的核苷酸。例如，为了选择特定的基因靶向事件，可以将保护性shRNA嵌入微型RNA中，然后插入被设计成位点特异性地整合至高活性基因座(如白蛋白基因座)中的重组ceDNA载体中。这样的实施方案可以提供用于在任何遗传背景下体内选择和扩增基因修饰的肝细胞的系统，例如在Nygaard等人的《体内选择基因修饰的肝细胞的通用系统(Auniversal system to select gene-modified hepatocytes in vivo)》《基因疗法(GeneTherapy)》,2016年6月8日)中所述。本公开的ceDNA载体可以含有一种或多种选择性标志物，其允许选择转化、转染、转导等的细胞。选择性标志物是产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原营养、NeoR等的基因。在某些实施方案中，将正向选择标志物并入供体序列中，例如NeoR。可以将负向选择标志物并入供体序列的下游，例如可以将编码负向选择标志物的核酸序列HSV-tk并入供体序列下游的核酸构建体中。
C.调控开关
分子调控开关是一种响应信号而产生可测量的状态变化的开关。此类调控开关能够与如本文所述的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体组合使用，以控制抗体或抗原结合片段的表达从ceDNA载体中的输出。在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体包含用于微调抗体或抗原结合片段表达的调控开关。例如，它可以发挥ceDNA载体的生物封存功能。在一些实施方案中，所述开关是“ON/OFF”开关，其设计成以可控和可调方式启动或终止(即，中断)抗体或抗原结合片段在ceDNA载体中的表达。在一些实施方案中，开关可包括“杀伤开关”，一旦该开关被活化，它就可以指令包含ceDNA载体的细胞经历程序性死亡。预期用于供产生抗体或融合蛋白用的ceDNA载体中的示例性调控开关能够用于调控转基因表达，并且更充分地论述于国际申请PCT/US18/49996中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
(i)二进制调控开关
在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体包含能够用于可控地调节抗体或抗原结合片段表达的调控开关。举例来说，位于ceDNA载体的ITR之间的表达盒可以另外包含可操作地连接到抗体或抗原结合片段的调控区域，例如启动子、顺式元件、抑制子、增强子等，其中所述调控区域通过一个或多个辅因子或外源药剂调控。仅作为示例，调节区可以通过小分子开关或者诱导型或阻遏型启动子进行调控。诱导型启动子的非限制性实例是激素诱导型或金属诱导型启动子。其它示例性的诱导型启动子/增强子元件包括但不限于RU486诱导型启动子、蜕皮素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。
(ii)小分子调控开关
所属领域已知的多种基于小分子的调控开关在所属领域中已知并且能够与如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体组合以形成调控开关控制的ceDNA载体。在一些实施方案中，调控开关可以选自以下任一种或组合：正交配体/核受体对，例如类视色素受体变体/LG335和GRQCIMFI，以及控制操作性连接的转基因的表达的人工启动子，例如Taylor等人,《BMC生物技术(BMC Biotechnology)》10(2010):15中公开的人工启动子；工程化的类固醇受体，例如C末端截断的修饰孕激素受体，其不能结合孕激素但结合RU486(米非司酮)(美国专利第5,364,791号)；来自果蝇(Drosophila)的蜕皮素受体和其蜕皮类固醇配体(Saez等人，《美国国家科学院院刊(PNAS)》，97(26)(2000),14512-14517；或由抗生素甲氧苄啶(trimethoprim，TMP)控制的开关，如Sando R；《自然方法》第3版2013，10(11):1085-8中所公开。在一些实施方案中，控制转基因或由ceDNA载体表达的调控开关是前药活化开关，例如美国专利8,771,679和6,339,070中公开的活化开关。
(iii)“密码”调控开关
在一些实施方案中，调控开关可以是“密码开关”或“密码回路”。在发生特定条件时，也就是说，需要存在条件的组合才能发生转基因表达和/或阻遏时，密码开关允许微调对转基因从ceDNA载体的表达的控制。例如，为了发生转基因的表达，至少必须发生条件A和B。密码调控开关可以是任何数量的条件，例如，要存在至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个或更多个条件方能发生转基因表达。在一些实施方案中，需要发生至少2个条件(例如A、B条件)，并且在某些实施方案中，需要发生至少3个条件(例如A、B和C，或A、B和D)。仅作为示例，为了从具有密码“ABC”调控开关的ceDNA发生基因表达，必须存在条件A、B和C。条件A、B和C可以如下：条件A是存在病状或疾病，条件B是激素响应，并且条件C是对转基因表达的响应。举例来说，如果转基因编辑缺陷性EPO基因，那么条件A是存在慢性肾病(CKD)，如果受试者的肾脏中有低氧状况，那么发生条件B，条件C是肾脏中产生促红细胞产生素的细胞(EPC)的募集受损；或可替代地，HIF-2活化受损。一旦氧水平升高或达到期望的EPO水平，转基因就会关闭，直到再次发生3个条件，它重新打开。
在一些实施方案中，涵盖用于ceDNA载体中的密码调控开关或“密码回路”包含杂合转录因子(TF)以扩大用于界定生物封存条件的环境信号的范围和复杂度。与在预定条件存在下触发细胞死亡的致命开关相反，“密码回路”允许在特定“密码”存在下细胞存活或转基因表达，并且只有当存在预定环境条件或密码时，才可以容易地重新编程以允许转基因表达和/或细胞存活。
本文公开的调控开关，例如小分子开关、基于核酸的开关、小分子-核酸杂合开关、转录后转基因调控开关、翻译后调节、辐射控制开关、低氧介导的开关和如本文公开的本领域中普通技术人员已知的其它调控开关中的任何和所有组合均可以用于如本文公开的密码调控开关中。预期使用的调控开关也在综述文章Kis等人,《皇家学会界面杂志(J R SocInterface)》.12:20141000(2015)中论述，并总结在Kis的表1中。在一些实施方案中，用于密码系统中的调控开关能够选自国际专利申请PCT/US18/49996的表11中所公开的任何开关或开关组合，所述专利申请以全文引用的方式并入本文中。
(iv).控制转基因表达的基于核酸的调控开关
在一些实施方案中，控制由ceDNA表达的抗体或抗原结合片段的调控开关是基于以核酸为基础的控制机理。示例性的核酸控制机制是本领域已知的并且是设想使用的。举例来说，此类机理包括核糖开关，例如以下文献中所公开的核糖开关：例如US2009/0305253、US2008/0269258、US2017/0204477、WO2018026762A1、美国专利9,222,093和EP申请EP288071；以及Villa JK等人的评论中所公开的核糖开关，《微生物学光谱(MicrobiolSpectr.)》2018年5月；6(3)。还包括代谢物响应性转录生物传感器，例如WO2018/075486和WO2017/147585中公开的那些。设想使用的其它本领域已知的机制包括用siRNA或RNAi分子(例如miR、shRNA)使转基因沉默。举例来说，ceDNA载体能够包含编码RNAi分子的调控开关，所述RNAi分子与ceDNA载体所表达的转基因的一部分互补。当此类RNAi被表达时，即使转基因(例如抗体或抗原结合片段)被ceDNA载体表达时，其也将被互补RNAi分子静默，并且当RNAi不被表达时，当转基因被ceDNA载体表达时，转基因(例如抗体或抗原结合片段)不被RNAi静默。
在一些实施方案中，调控开关是组织特异性自失活调控开关，例如如US2002/0022018中所公开，其中调控开关在其中转基因表达原本可能不利的位点有意地将转基因(例如抗体或抗原结合片段)表达关闭。在一些实施方案中，调控开关是重组酶可逆基因表达系统，例如如US2014/0127162和美国专利8,324,436中所公开。
(v).转录后和翻译后调控开关
在一些实施方案中，控制ceDNA载体表达抗体或抗原结合片段的调控开关是转录后修饰系统。例如，这样的调控开关可以是对四环素或茶碱敏感的适体酶(aptazyme)核糖开关，如以下中所公开：US2018/0119156、GB201107768、WO2001/064956A3、欧洲专利2707487和Beilstein等人,《ACS合成生物学(ACS Synth.Biol.)》,2015,4(5),第526-534页；Zhong等人,Elife.2016年11月2日；5.pii:e18858。在一些实施方案中，设想本领域普通技术人员可以编码转基因和含有配体敏感性(OFF-开关)适体的抑制性siRNA二者，净结果是配体敏感性ON-开关。
(vi).其它示例性调控开关
任何已知的调控开关能够用于ceDNA载体中，以控制ceDNA载体所表达的抗体或抗原结合片段的基因表达，包括环境变化所触发的那些基因表达。其它实例包括但不限于；Suzuki等人,《科学报告(Scientific Reports)》8；10051(2018)的BOC方法；遗传密码扩展和非生理氨基酸；辐射控制或超声控制的on/off开关(参见例如Scott S等人,《基因疗法(Gene Ther)》.2000年7月；7(13):1121-5；美国专利5,612,318；5,571,797；5,770,581；5,817,636；以及WO1999/025385A1。在一些实施方案中，调控开关是由可植入系统控制，例如如美国专利7,840,263；US2007 0190028A1中所公开，其中基因表达由一种或多种形式的能量控制，包括电磁能，所述能量将可操作地连接到ceDNA载体中的转基因的启动子活化。
在一些实施方案中，设想用于ceDNA载体中的调控开关是低氧介导或应激活化的开关，例如以下文献中所公开的那些：WO1999060142A2、美国专利5,834,306；6,218,179；6,709,858；US2015/0322410；Greco等人(2004)《靶向癌症疗法(Targeted CancerTherapies)》9；S368以及FROG、TOAD和NRSE元件，以及条件诱导型静默元件，包括低氧应答元件(HRE)、发炎应答元件(IRE)和剪切应激活化元件(SSAE)，例如如美国专利9,394,526中所公开。这样的实施方案可用于在缺血后或在缺血组织和/或肿瘤中打开转基因从ceDNA载体的表达。
(iv).杀灭开关
本文所述的其它实施方案涉及如本文所述用于产生抗体或融合蛋白的包含杀灭开关的ceDNA载体。如本文公开的杀伤开关能够使包含ceDNA载体的细胞被杀死或经历程序性细胞死亡，作为从受试者的系统中永久去除引入的ceDNA载体的手段。所属领域的普通技术人员应了解，杀灭开关在用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体中的用途典型地与ceDNA载体靶向受试者能够可接受地失去的有限数目个细胞或靶向期望细胞凋亡的细胞类型(例如癌细胞)关联。在所有方面中，如本文公开的“杀伤开关”被设计成在缺乏输入的存活信号或其它指定条件下提供对包含ceDNA载体的细胞的快速而强大的细胞杀伤。换句话说，如本文所述用于产生抗体或融合蛋白的由ceDNA载体编码的杀灭开关能够使包含ceDNA载体的细胞的细胞存活受特定输入信号所限定的环境限制。如果期望从受试者中去除表达抗体或抗原结合片段的ceDNA载体或确保其不表达所编码的抗体或抗原结合片段，则此类杀灭开关充当生物学生物封存功能。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体中预期使用所属领域的技术人员已知的其它杀灭开关，例如如以下文献中所公开：US2010/0175141；US2013/0009799；US2011/0172826；US2013/0109568；以及以下文献中所公开的杀灭开关：Jusiak等人，《细胞生物学和分子医药评论(Reviews in Cell Biology and molecularMedicine)》；2014；1-56；Kobayashi等人，PNAS,2004；101；8419-9；Marchisio等人，《国际生物化学和细胞生物学杂志(Int.Journal of Biochem and Cell Biol.)》,2011；43；310-319；以及Reinshagen等人，《科学转化医学(Science Translational Medicine)》2018,11。
相应地，在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够包含杀灭开关核酸构建体，其包含编码效应毒素或报告蛋白的核酸，其中效应毒素(例如死亡蛋白质)或报告蛋白的表达受预定条件控制。举例来说，预定条件可以是存在环境试剂，例如外源试剂，在没有所述环境试剂的情况下，细胞将默认表达效应毒素(例如死亡蛋白质)并且被杀灭。在替代性实施方案中，预定条件是存在两种或更多种环境试剂，例如细胞将仅在提供两种或更多种必需的外源试剂时存活，而在其中的任一种不存在的情况下，包含ceDNA载体的细胞被杀灭。
在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体经修饰以并入杀灭开关，从而摧毁包含ceDNA载体的细胞，以有效地终止ceDNA载体正表达的转基因(例如全长抗体、Fab、scAb)的体内表达。具体地说，进一步对ceDNA载体进行基因工程改造以表达在哺乳动物细胞中、在正常生理学条件下不具功能性的开关蛋白质。仅在药物施用后或在特异性靶向这种开关蛋白质的环境条件下，表达开关蛋白质的细胞被摧毁，借此终止治疗蛋白或肽的表达。举例来说，据报导，表达HSV-胸苷激酶的细胞在药物(例如苷昔洛韦(ganciclovir)和胞嘧啶脱氨酶)施用后能够被杀灭。参见例如Dey和Evans，单纯疱疹病毒-1胸苷激酶(HSV-TK)的自杀基因疗法(Suicide Gene Therapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase(HSV-TK))，于You编辑的《基因疗法中的靶标(Targets in GeneTherapy)》(2011)；以及Beltinger等人，《美国国家科学院院刊》96(15):8699-8704(1999)。在一些实施方案中，ceDNA载体能够包含siRNA杀灭开关，称为DISE(存活基因排除所诱导的死亡)(Murmann等人，《肿瘤标靶(Oncotarget)》2017；8:84643-84658.DISE在体内卵巢癌细胞中的诱导(Induction of DISE in ovarian cancer cells in vivo))。
VI.产生ceDNA载体的详细方法
A.通用产生
用于产生抗体或融合蛋白的包含如本文所定义的不对称ITR对或对称ITR对的ceDNA载体的某些产生方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996的章节IV中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够使用如本文所述的昆虫细胞产生。在替代性实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够以合成方式产生并且在一些实施方案中以无细胞方法产生，如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122所公开，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
如本文所述，在一个实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够通过例如包含以下步骤的方法获得：a)在诱导宿主细胞内产生ceDNA载体的有效条件和充足时间下，在Rep蛋白存在下，培育含有缺乏病毒衣壳编码序列的多核苷酸表达构建体模板(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒，和/或ceDNA-杆状病毒)的宿主细胞群(例如昆虫细胞)，且其中宿主细胞不包含病毒衣壳编码序列；和b)从宿主细胞中收获且分离出ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有修饰ITR的载体多核苷酸复制，从而在宿主细胞中产生ceDNA载体。但是，没有表达病毒颗粒(例如AAV病毒体)。因此，没有大小限制，例如在AAV或其它基于病毒的载体中天然强加的大小限制。
可以通过用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从宿主细胞分离的DNA，并在非变性凝胶上分析消化的DNA物质，以与线性和非连续DNA相比较证实线性且连续DNA的特征色带的存在，从而证实从宿主细胞分离的ceDNA载体的存在。
在又一个方面，本发明提供了将DNA载体多核苷酸表达模板(ceDNA模板)稳定地整合至其自身基因组中的宿主细胞系的用途，所述细胞系用于产生非病毒DNA载体，例如如Lee,L.等人(2013)Plos One 8(8):e69879中所述。优选地，Rep以约3的MOI加入宿主细胞中。当宿主细胞系是哺乳动物细胞系、例如HEK293细胞时，所述细胞系可以具有稳定整合的多核苷酸载体模板，并且可以使用第二载体、例如疱疹病毒将Rep蛋白引入细胞中，使得在Rep和辅助病毒存在下切除和扩增ceDNA。
在一个实施方案中，制备如本文所述用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体所用的宿主细胞是昆虫细胞，并且使用杆状病毒递送编码Rep蛋白的多核苷酸和用于ceDNA的非病毒DNA载体多核苷酸表达构建体模板，例如如图4A-4C和实例1中所述。在一些实施方案中，宿主细胞经工程改造以表达Rep蛋白。
然后从宿主细胞中收获和分离ceDNA载体。从细胞收获和收集本文所述的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化，以高产率地产生ceDNA载体。例如，可以根据细胞存活率、细胞形态、细胞生长等选择收获时间。在一个实施方案中，细胞在足以产生ceDNA载体的条件下生长，并在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体但在大多数细胞开始因杆状病毒毒性而死亡之前的时间收获。可以使用质粒提纯试剂盒，例如Qiagen Endo-Free Plasmid试剂盒分离DNA载体。为分离质粒而开发的其它方法也适用于DNA载体。通常，可以采用任何核酸提纯方法。
DNA载体可以通过本领域技术人员已知用于提纯DNA的任何手段来提纯。在一个实施方案中，将ceDNA载体作为DNA分子进行提纯。在另一个实施方案中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行提纯。
用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的存在能够如下证实：使用对DNA载体具有单个识别位点的限制酶消化从细胞中分离出的载体DNA，并且使用凝胶电泳术分析已消化和未消化的DNA物质，从而相较于线性非连续DNA来证实线性连续DNA的特征色带的存在。图4C和图4D示出了用于鉴定通过本文的方法产生的闭合端ceDNA载体的存在的一个实施方案。
B.ceDNA质粒
ceDNA-质粒是随后产生用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体所用的质粒。在一些实施方案中，ceDNA质粒可以使用已知的技术构建，以在转录方向上提供至少下列作为操作性连接的组分：(1)修饰5'ITR序列；(2)含有例如启动子、诱导型启动子、调控开关、增强子等顺式调控元件的表达盒；以及(3)修饰3'ITR序列，其中3'ITR序列相对于5'ITR序列是对称的。在一些实施方案中，侧接ITR的表达盒包含用于引入外源序列的克隆位点。表达盒替换了AAV基因组的rep和cap编码区。
在一个方面中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体获自质粒，在本文中称为“ceDNA-质粒”，其按照此次序编码：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、包含转基因的表达盒，以及突变或经修饰的AAV ITR，其中所述ceDNA-质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列。在替代实施方案中，ceDNA-质粒依次编码：第一(或5')修饰或突变AAV ITR、包含转基因的表达盒、以及第二(或3')修饰AAV ITR，其中所述ceDNA质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'ITR彼此对称。在替代实施方案中，ceDNA质粒依次编码：第一(或5')修饰或突变AAV ITR、包含转基因的表达盒、以及第二(或3')突变或修饰AAV ITR，其中所述ceDNA质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'修饰ITR具有相同的修饰(即彼此反向互补或对称)。
在另一个实施方案中，cDNA-质粒系统缺乏病毒衣壳蛋白编码序列(即，它缺乏AAV衣壳基因，也没有其它病毒的衣壳基因)。另外，在一个特定实施方案中，ceDNA-质粒也缺乏AAV Rep蛋白编码序列。因此，在一个优选实施方案中，ceDNA-质粒缺乏AAV2的功能性AAVcap和AAV rep基因GG-3'加上允许发夹形成的可变回文序列。
本发明的ceDNA-质粒可以使用本领域公知的任何AAV血清型的基因组的天然核苷酸序列来产生。在一个实施方案中，ceDNA-质粒骨架源自于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如NCBI:NC002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261；Kotin和Smith,《Springer病毒索引》(The Springer Index of Viruses)》,在Springer维护的URL上可得(www网址：oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp？virID＝42.04.)(注意-对URL或数据库的引用是指截至本申请生效提交日为止的URL或数据库的内容)。在一个特定实施方案中，ceDNA-质粒骨架源自于AAV2基因组。在另一个特定实施方案中，ceDNA-质粒骨架是合成的骨架，其经过基因工程以在它的5'和3'ITR处包括源自于这些AAV基因组之一。
ceDNA-质粒可以任选地包括选择性或选择标志物，用于建立产生ceDNA载体的细胞系。在一个实施方案中，选择标志物能够插入3'ITR序列的下游(即，3')。在另一个实施方案中，选择标志物能够插入5'ITR序列的上游(即，5')。适当的选择标志物包括例如赋予耐药性的标志物。选择标志物可以是例如杀稻瘟菌素S抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)等。在一个优选实施方案中，药物选择标志是杀稻瘟菌素S抗性基因。
用于产生抗体或融合蛋白的示例性ceDNA(例如rAAV0)载体是由rAAV质粒产生。一种用于产生rAAV载体的方法可以包含：(a)为宿主细胞提供如上所述的rAAV质粒，其中宿主细胞和质粒均缺乏衣壳蛋白编码基因，(b)在允许产生ceDNA基因组的条件下培养宿主细胞；以及(c)收获细胞并分离从所述细胞产生的AAV基因组。
C.从ceDNA质粒制备ceDNA载体的示例性方法
本文还提供了用于制备供产生抗体或融合蛋白用的无衣壳ceDNA载体的方法，尤其是产量高得足以提供足够载体供体内实验用的方法。
在一些实施方案中，用于产生供产生抗体或融合蛋白用的ceDNA载体的方法包含以下步骤：(1)将包含表达盒和两个对称ITR序列的核酸构建体引入宿主细胞(例如Sf9细胞)；(2)任选地建立克隆细胞系，例如使用存在于质粒上的选择标志物来建立；(3)将Rep编码基因引入(通过携带所述基因的杆状病毒转染或感染)所述昆虫细胞中；以及(4)收获所述细胞且提纯ceDNA载体。上述用于产生ceDNA载体的包含表达盒和两个ITR序列的核酸构建体可以呈ceDNA-质粒的形式，或如下所述用ceDNA-质粒产生的杆粒或杆状病毒的形式。可以通过转染、病毒转导、稳定整合或本领域已知的其它方法将核酸构建体引入宿主细胞中。
D.细胞系：
用于产生供产生抗体或融合蛋白用的ceDNA载体的宿主细胞系能够包括来源于草地粘虫(Spodoptera frugiperda)的昆虫细胞系，例如Sf9 Sf21；或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞；或其它无脊椎动物、脊椎动物或其它真核细胞系，包括哺乳动物细胞。也可以使用普通技术人员已知的其它细胞系，例如HEK293、Huh-7、HeLa、HepG2、HeplA、911、CHO、COS、MeWo、NIH3T3、A549、HT1 180、单核细胞、以及成熟和不成熟的树突状细胞。可以转染宿主细胞系以稳定表达ceDNA-质粒，从而高产率地产生ceDNA载体。
可以使用本领域已知的试剂(例如脂质体、磷酸钙)或物理手段(例如电穿孔)，通过瞬时转染将ceDNA-质粒引入Sf9细胞中。可替代地，可以建立将ceDNA-质粒稳定整合至基因组中的稳定Sf9细胞系。这样的稳定细胞系可以通过如上所述将选择标志物并入ceDNA-质粒中来建立。如果用于转染细胞系的ceDNA-质粒包括选择标志物，例如抗生素，那么可以通过向细胞生长培养基中加入抗生素来选择已用ceDNA-质粒转染并将ceDNA-质粒DNA整合至基因组中的细胞。然后可以通过单细胞稀释或集落转移技术来分离细胞的抗性克隆并增殖。
E.分离和提纯ceDNA载体：
用于获得和分离ceDNA载体的方法实例描述于图4A-4E和下述特定实例中。本文公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够获自表达AAV Rep蛋白的生产细胞，所述生产细胞进一步经ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒转化。适用于产生ceDNA载体的质粒包括编码抗体重链和/或抗体轻链的质粒，或编码一种或多种REP蛋白的质粒。示例性ceDNA质粒显示于图6A中，其中编码阿杜那单抗HC的转基因和编码阿杜那单抗LC的转基因能够用所关注抗体或融合蛋白的重链和/或轻链的核酸序列替换，参见例如表1-5。
在一个方面中，多核苷酸编码在质粒(Rep-质粒)、杆粒(Rep-杆粒)或杆状病毒(Rep-杆状病毒)中递送到生产细胞的AAV Rep蛋白(Rep 78或68)。Rep-质粒、Rep-杆粒和Rep-杆状病毒可以通过上述方法产生。
本文中描述了用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的产生方法。用于产生如本文所述的供产生抗体或融合蛋白用的ceDNA载体的表达构建体可以是质粒(例如ceDNA-质粒)、杆粒(例如ceDNA-杆粒)和/或杆状病毒(例如ceDNA-杆状病毒)。仅为了举例，ceDNA-载体可以由用ceDNA-杆状病毒和Rep-杆状病毒共同感染的细胞产生。由Rep-杆状病毒产生的Rep蛋白可以复制ceDNA-杆状病毒以产生ceDNA载体。替代地，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够由经构建体稳定转染的细胞产生，所述构建体包含编码AAV Rep蛋白(Rep78/52)的序列，所述AAV Rep蛋白在Rep-质粒、Rep-杆粒或Rep-杆状病毒中递送。ceDNA-杆状病毒可以瞬时转染到细胞中，通过Rep蛋白复制并产生ceDNA载体。
杆粒(例如ceDNA-杆粒)能够转染到允许的昆虫细胞中，例如Sf9、Sf21、Tni(粉纹夜蛾)细胞、High Five细胞，并且产生ceDNA-杆状病毒，所述杆状病毒是重组杆状病毒，其包括包含对称ITR的序列和表达盒。ceDNA-杆状病毒能够再次感染到昆虫细胞中以获得下一代重组杆状病毒。任选地，该步骤可以重复一次或多次以产生更大量的重组杆状病毒。
从细胞中收获和收集如本文所述用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的时间能够加以选择且优化，以实现ceDNA载体的高产量产生。例如，可以根据细胞存活率、细胞形态、细胞生长等选择收获时间。通常，细胞可在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体(例如ceDNA载体)的时间后但在大多数细胞开始因病毒毒性而死亡之前收获。使用质粒提纯套组，例如Qiagen ENDO-FREE
Figure BDA0002629249020001331
套组，能够从Sf9细胞中分离出ceDNA载体。为了分离质粒而开发的其它方法也可以适用于ceDNA载体。通常，可以采用本领域已知的任何核酸提纯方法，以及可商购的DNA提取试剂盒。
或者，可以通过对细胞集结粒进行碱裂解法、离心所得裂解液并进行色谱分离来实施提纯。作为一个非限制性实例，所述方法能够如下进行：将上清液装载于保留核酸的离子交换柱(例如SARTOBIND
Figure BDA0002629249020001332
)上，然后洗脱(例如使用1.2M NaCl溶液)并且在凝胶过滤柱上进一步进行色谱提纯(例如6个快速流动GE)。然后通过例如沉淀来回收无衣壳的AAV载体。
在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体还能够以外泌体或微颗粒形式提纯。本领域中已知，许多细胞类型不仅释放出可溶性蛋白质，而且通过膜微米囊泡脱落释放出复杂的蛋白质/核酸货物(Cocucci等人,2009；EP 10306226.1)。这样的囊泡包括微米囊泡(也称为微粒)和外泌体(也称为纳米囊泡)，两者均包含蛋白质和RNA作为货物。微米囊泡由质膜的直接出芽产生，而外泌体在多囊泡内体与质膜融合后释放到细胞外的环境中。因此，可以从已经用ceDNA-质粒转导的细胞或用ceDNA-质粒产生的杆粒或杆状病毒中分离出含有ceDNA载体的微米囊泡和/或外泌体。
微米囊泡可以通过对培养基以20,000×g进行过滤或超速离心来分离，而对外泌体为100,000×g。超速离心的最佳持续时间可以通过实验确定，并将取决于从中分离出囊泡的特定细胞类型。优选地，首先利用低速离心(例如在2000×g下进行5-20分钟)清除培养基并且使用例如
Figure BDA0002629249020001333
离心柱(密理博(Millipore)，英国赫特福德郡(Watford,UK))进行离心浓缩。微米囊泡和外泌体可以通过使用识别存在于微米囊泡和外泌体上的特定表面抗原的特异性抗体，通过FACS或MACS进一步提纯。其它微米囊泡和外泌体提纯方法包括但不限于免疫沉淀、亲和色谱、过滤和涂有特异性抗体或适体的磁珠。提纯后，用例如磷酸盐缓冲盐水洗涤囊泡。使用微米囊泡或外泌体递送含ceDNA的囊泡的一个优点是，这些囊泡可通过在它们的膜上包括被相应细胞类型上的特异性受体识别的蛋白质而靶向各种细胞类型。(也参见EP 10306226)
本文中发明的另一方面涉及从已将ceDNA构建体稳定整合至自身基因组中的宿主细胞系中提纯ceDNA载体的方法。在一个实施方案中，将ceDNA载体作为DNA分子进行提纯。在另一个实施方案中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行提纯。
国际申请PCT/US18/49996的图5显示了凝胶证实ceDNA的产生，所述ceDNA使用实例中所述的方法由多种ceDNA-质粒构建体产生。如实例中关于图4D所论述，ceDNA通过凝胶中的特征色带图案来证实。
VII.医药组合物
在另一个方面中，提供了医药组合物。医药组合物包含如本文所述的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体和药学上可接受的载剂或稀释剂。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够并入适于施给受试者的医药组合物中以便体内递送到受试者的细胞、组织或器官。通常，医药组合物包含如本文公开的ceDNA-载体(ceDNA-vector)和药学上可接受的载体(pharmaceuticallyacceptable carrier)。举例来说，如本文所述用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够并入适于所期望的治疗性施药途径(例如肠胃外施药)的医药组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及例如核内显微注射或胞浆内注射等细胞内注射进行的被动组织转导。用于治疗目的的医药组合物能够配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分之一或组合一起并入适当的缓冲液中、然后进行过滤灭菌来制备。可以配制包括ceDNA载体，以将核酸中的转基因递送至接受者的细胞，使得转基因或供体序列在其中治疗性表达。组合物还可包括药学上可接受的载剂。
包含用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的医药活性组合物能够被配制成将多种目的的转基因递送到细胞，例如受试者的细胞。
出于治疗目的的医药组合物在制造和储存条件下典型地须无菌且稳定。组合物能够配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或适合于高ceDNA载体浓度的其它有序结构。无菌注射溶液能够通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分之一或组合一起并入适当的缓冲液中、然后进行过滤灭菌来制备。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够并入适于以下的医药组合物中：体表、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋巴内、腹膜内、皮下、气管、组织内(例如肌肉内、心内、肝内、肾内、脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例如眶外、眶内、眶后、视网膜内、视网膜下、脉络膜、脉络膜下、基质内、前房内和玻璃体内)、耳蜗内和粘膜(例如口腔、直肠、鼻)施药。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及例如核内显微注射或胞浆内注射等细胞内注射进行的被动组织转导。
在一些方面中，本文所提供的方法包含将如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的一种或多种ceDNA载体递送到宿主细胞。本文还提供了通过这类方法产生的细胞，以及包含这类细胞或由这类细胞产生的生物体(例如动物、植物或真菌)。核酸的递送方法可包括脂质转染、核转染、显微注射、生物弹药、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸偶联物、裸DNA和试剂增强的DNA吸收。脂质体转染描述于例如美国专利第5,049,386号、第4,946,787号；和第4,897,355号)并且脂质体转染试剂有市售(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。能够递送至细胞(例如体外或离体施用)或靶组织(例如体内施用)。
将核酸递送至细胞的各种技术和方法是本领域已知的。举例来说，核酸(例如用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA)能够配制成脂质纳米颗粒(LNP)、脂质载体、脂质体、脂质纳米颗粒、脂质复合物或核壳纳米颗粒。通常，LNP由核酸(例如ceDNA)分子、一种或多种可电离或阳离子脂质(或其盐)、一种或多种非离子或中性脂质(例如磷脂)、防止聚集的分子(例如PEG或PEG-脂质偶联物)以及任选的固醇(例如胆固醇)构成。
将核酸(例如用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA)递送到细胞的另一方法是使核酸与被细胞内化的配体偶联。例如，配体能够结合细胞表面上的受体并通过胞吞而被内化。配体能够与核酸中的核苷酸共价连接。用于将核酸递送至细胞中的示例性偶联物描述于例如WO2015/006740、WO2014/025805、WO2012/037254、WO2009/082606、WO2009/073809、WO2009/018332、WO2006/112872、WO2004/090108、WO2004/091515和WO2017/177326中。
核酸(例如用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体)还能够通过转染递送到细胞。有用的转染方法包括但不限于脂质介导的转染、阳离子聚合物介导的转染或磷酸钙沉淀。转染试剂在所属领域中是众所周知的并且包括(但不限于)TurboFect转染试剂(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、Pro-Ject试剂(赛默飞世尔科技)、TRANSPASSTMP蛋白质转染试剂(新英格兰生物实验室(New England Biolabs))、CHARIOTTM蛋白质递送试剂(Active Motif)、PROTEOJUICETM蛋白质转染试剂(EMD密理博)、293转染剂、LIPOFECTAMINETM2000、LIPOFECTAMINETM3000(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTINTM(赛默飞世尔科技)、DMRIE-C、CELLFECTINTM(赛默飞世尔科技)、OLIGOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTACETM、FUGENETM(罗氏，瑞士巴塞尔(Basel,Switzerland)、FUGENETMHD(罗氏)、TRANSFECTAMTM(Transfectam，威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,Wis.)、TFX-10TM(普洛麦格)、TFX-20TM(普洛麦格)、TFX-50TM(普洛麦格)、TRANSFECTINTM(BioRad，加利福尼亚州赫库勒斯(Hercules,Calif.))、SILENTFECTTM(Bio-Rad)、EffecteneTM(Qiagen，加利福尼亚州瓦伦西亚(Valencia,Calif.))、DC-chol(Avanti Polar Lipids)、GENEPORTERTM(Gene Therapy Systems，加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,Calif.))、DHARMAFECT 1TM(Dharmacon，科罗拉多州拉斐特(Lafayette,Colo.))、DHARMAFECT 2TM(Dharmacon)、DHARMAFECT 3TM(Dharmacon)、DHARMAFECT 4TM(达尔马肯)、ESCORTTMIII(西格玛(Sigma)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,Mo.))和ESCORTTMIV(西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.))。核酸，例如ceDNA，也能够通过本领域技术人员已知的微流体方法递送至细胞。
如本文所述的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体也能够直接施用于生物体以在体内转导细胞。施用是通过正常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径，包括但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。适于施用这类核酸的方法可以获得并且是本领域技术人员众所周知的，并且虽然可以使用超过一种途径来施用特定的组合物，但是特定的途径经常可以提供比其它途径更直接和更有效的反应。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的核酸载体ceDNA载体的引入方法可以是递送到造血干细胞中，例如通过如例如美国专利第5,928,638号所述的方法来递送。
能够将根据本发明的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体添加到脂质体中以便递送到受试者的细胞或靶器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药开发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。它们通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于这类递送的脂质体组合物由磷脂、特别是具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中公开了示例性脂质体和脂质体配方，包括(但不限于)含有聚乙二醇(PEG)官能基的化合物，参见例如标题为“医药配方”的章节。
本领域已知的各种递送方法或其修改能够用于体外或体内递送ceDNA载体。举例来说，在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体是通过机械、电、超声波、流体动力学或基于激光的能量在细胞膜中产生瞬时穿透来递送，从而促进DNA进入靶细胞中。例如，可以通过经过尺寸限制的通道挤压细胞或通过本领域已知的其它手段瞬时破坏细胞膜来递送ceDNA载体。在一些情况下，单独的ceDNA载体作为裸DNA直接注射到皮肤、胸腺、心肌、骨骼肌或肝细胞中。在一些情况下，通过基因枪递送ceDNA载体。无衣壳的AAV载体包被的金或钨球形颗粒(直径1-3μm)可以通过加压气体加速至高速而渗透到靶组织细胞中。
本文特别涵盖包含用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体和药学上可接受的载剂的组合物。在一些实施方案中，ceDNA载体与脂质递送系统，例如本文所述的脂质体一起配制。在一些实施方案中，这类组合物通过熟练从业人员期望的任何途径来施用。可以通过不同途径，包括经口、肠胃外、舌下、经皮、经直肠、经粘膜、局部、通过吸入、经颊施用、经胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内鞘内和关节内或其组合，向受试者施用组合物。对于兽医用途，可根据正常兽医实践将组合物作为适当可接受的配制物施用。兽医可以很容易地确定最适合具体动物的给药方案和施用途径。可以通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪”或其它物理方法(例如电穿孔(“EP”)、流体动力学方法或超声波)施用组合物。
在一些情况下，通过流体动力学注射来递送用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体，所述流体动力学注射是一种直接细胞内递送任何水溶性化合物和颗粒到内脏和整个肢体骨骼肌中的简单高效方法。
在一些情况下，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体如下递送：利用超声波在膜中产生纳米级孔隙以促进细胞内递送DNA颗粒到内脏或肿瘤细胞中，因此质粒DNA的尺寸和浓度对系统的效率具有很大作用。在一些情况下，通过使用磁场的磁转染来递送ceDNA载体，以将含有核酸的颗粒集中至靶细胞中。
在一些情况下，可以使用化学递送系统，例如通过使用纳米复合物，其包括用属于阳离子脂质体/胶束或阳离子聚合物的聚阳离子纳米颗粒来压紧带负电荷的核酸。用于递送方法的阳离子脂质包括但不限于单价阳离子脂质、多价阳离子脂质、含胍化合物、胆固醇衍生化合物、阳离子聚合物、(例如聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白、其它阳离子聚合物)和脂质-聚合物杂化物。
A.外泌体：
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体是通过封装于外泌体中递送。外泌体是胞吞来源的小膜囊泡，其在多囊泡体与质膜融合后被释放到细胞外环境中。它们的表面由来自供体细胞的细胞膜的脂质双层组成，它们含有来自产生外泌体的细胞的胞溶质且在表面上展现来自亲本细胞的膜蛋白。外泌体由包括上皮细胞、B和T淋巴细胞、肥大细胞(MC)以及树突状细胞(DC)在内的各种细胞类型产生。一些实施方案设想使用直径在10nm与1μm之间、20nm与500nm之间、30nm与250nm之间、50nm与100nm之间的外泌体。使用外泌体的供体细胞或通过将特定核酸引入外泌体中，可以分离外泌体以递送至靶细胞。本领域已知的各种途径可用于产生含有本发明的无衣壳AAV载体的外泌体。
B.微米颗粒/纳米颗粒：
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体是通过脂质纳米颗粒递送。通常，脂质纳米颗粒包含可电离的氨基脂质(例如4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯、DLin-MC3-DMA、磷脂酰胆碱(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DSPC)、胆固醇和外被脂质(聚乙二醇-二肉豆蔻酰基甘油，PEG-DMG)，例如如Tam等人(2013).《用于递送siRNA的脂质纳米颗粒的进展(Advances in LipidNanoparticles for siRNA delivery)》.《制药(Pharmaceuticals)》5(3):498-507所公开。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的平均直径在约10nm与约1000nm之间。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径小于300nm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径在约10nm与约300nm之间。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径小于200nm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的直径在约25nm与约200nm之间。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒制剂(例如包含多个脂质纳米颗粒的组合物)具有一定的尺寸分布，其中平均尺寸(例如直径)是约70nm至约200nm，且更典型地，平均尺寸是约100nm或更小。
所属领域中已知的多种脂质纳米颗粒能够用于递送如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体。例如，美国专利第9,404,127号、第9,006,417号和第9,518,272号中描述了使用脂质纳米颗粒的各种递送方法。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体是通过金纳米颗粒递送。通常，核酸可以与金纳米颗粒共价结合或与金纳米颗粒非共价结合(例如通过电荷-电荷相互作用结合)，例如如Ding等人(2014).《用于核酸递送的金纳米颗粒(Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery)》.《分子疗法(Mol.Ther.)》22(6)；1075-1083所述。在一些实施方案中，使用例如美国专利第6,812,334号中描述的方法产生金纳米颗粒-核酸偶联物。
C.偶联物
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体与增强细胞吸收的试剂偶联(例如共价结合)。“增强细胞吸收的试剂”是促进核酸跨脂质膜运输的分子。例如，核酸能够与亲脂性化合物(例如胆固醇、生育酚等)、细胞穿透肽(CPP)(例如穿膜肽、TAT、Syn1B等)和多胺(例如精胺)偶联。增强细胞吸收的试剂的其它实例公开于例如Winkler(2013).《用于治疗应用的寡核苷酸偶联物(Oligonucleotide conjugates fortherapeutic applications)》.《治疗剂递送(Ther.Deliv.)》4(7)；791-809。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体与聚合物(例如聚合物分子)或叶酸酯分子(例如叶酸分子)偶联。通常，与聚合物偶联的核酸的递送是本领域已知的，例如如WO2000/34343和WO2008/022309中所述。在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体与聚(酰胺)聚合物(例如如美国专利第8,987,377号所述)偶联。在一些实施方案中，如美国专利第8,507,455号中所述，本公开所述的核酸与叶酸分子偶联。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体与碳水化合物(例如如美国专利第8,450,467号中所述)偶联。
D.纳米胶囊
替代地，能够使用如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的纳米胶囊配方。纳米胶囊通常可以稳定且可再现的方式截留物质。为了避免由于细胞内聚合物过载所致的副作用，应该使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细颗粒(尺寸约0.1μm)。满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒是预期使用的。
E.脂质体
能够将根据本发明的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体添加到脂质体中以便递送到受试者的细胞或靶器官中。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药开发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。它们通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于这类递送的脂质体组合物由磷脂、特别是具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。
脂质体的形成和使用是本领域技术人员通常已知的。已经开发了血清稳定性和循环半衰期有所改善的脂质体(美国专利第5,741,516号)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载体的各种方法(美国专利第5,567,434号；第5,552,157号；第5,565,213号；第5,738,868号和第5,795,587号)。
F.示例性脂质体和脂质纳米颗粒(LNP)组合物
能够将根据本发明的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体添加到脂质体中以便递送到细胞，例如需要表达转基因的细胞。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药开发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。它们通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于这类递送的脂质体组合物由磷脂、特别是具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。
2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中公开了包含ceDNA载体的脂质纳米颗粒(LNP)，所述国际申请全文并入本文中并且设想用于如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的方法和组合物中。
在一些方面中，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含一种或多种具有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物(所谓的“PEG化的化合物”)，聚乙二醇官能团能够降低所述化合物的免疫原性/抗原性、为其提供亲水性和疏水性并降低给药频率。或者，脂质体配制物仅包含聚乙二醇(PEG)聚合物作为额外组分。在这些方面中，PEG或PEG官能团的分子量可以从62Da至约5,000Da。
在一些方面中，本公开提供了一种脂质体配制物，其将在数小时至数周的时间内以延长释放或受控释放曲线来递送API。在一些相关的方面中，脂质体配制物可包含以脂质双层为界的水性腔。在其它相关方面，脂质体配制物将API与额外组分一起包封起来，所述额外组分在升高的温度下经历物理转变，在数小时至数周的时间内释放API。
在一些方面中，脂质体配制物包含鞘磷脂和一种或多种本文公开的脂质。在一些方面中，脂质体配制物包含光敏体。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括一种或多种选自以下的脂质：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐、(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、MPEG(甲氧基聚乙二醇)偶联的脂质、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)；PEG(聚乙二醇)；DSPE(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)；DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)；DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)；DPPG(二棕榈酰基磷脂酰甘油)；EPC(绵羊磷脂酰胆碱)；DOPS(二油酰基磷脂酰丝氨酸)；POPC(棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱)；SM(鞘磷脂)；MPEG(甲氧基聚乙二醇)；DMPC(二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱)；DMPG(二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油)；DSPG(二硬脂酰基磷脂酰甘油)；DEPC(二芥酰基磷脂酰胆碱)；DOPE(二油酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、硫酸胆固醇酯(CS)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、DOPC(二油酰基-sn-甘油-磷脂酰胆碱)或其任何组合。
在一些方面中，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含磷脂、胆固醇和PEG化脂质，摩尔比为56:38:5。在一些方面中，脂质体配制物的总脂质含量为2-16mg/mL。在一些方面中，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质。在一些方面中，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质，相应的摩尔比分别为3:0.015:2。在一些方面中，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、胆固醇和PEG化脂质。在一些方面中，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和胆固醇。在一些方面中，聚乙二醇化脂质是PEG-2000-DSPE。在一些方面中，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含DPPG、大豆PC、MPEG-DSPE脂质偶联物和胆固醇。
在一些方面中，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含一种或多种含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和一种或多种含有乙醇胺官能团的脂质。在一些方面中，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含以下中的一种或多种：含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和固醇，例如胆固醇。在一些方面中，脂质体配制物包含DOPC/DEPC；和DOPE。
在一些方面中，本公开提供了一种脂质体配制物，其还包含一种或多种医药赋形剂，例如蔗糖和/或甘氨酸。
在一些方面中，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质体配制物。在一些方面中，本公开提供了一种包含多囊泡颗粒和/或泡沫基颗粒的脂质体配制物。在一些方面中，本公开提供了一种相对普通纳米颗粒的相对尺寸更大并且尺寸为约150至250nm的脂质体配制物。在一些方面中，脂质体配制物是冻干粉末。
在一些方面中，本公开提供了一种脂质体配制物，其通过向在脂质体外部具有分离的ceDNA的混合物中添加弱碱，用本文中公开或描述的ceDNA载体制备并负载所述ceDNA载体。这种添加将脂质体外部的pH提高到大约7.3，并驱动API进入脂质体中。在一些方面中，本公开提供了一种脂质体内部pH为酸性的脂质体配制物。在这样的情况下，脂质体的内部可以为pH 4-6.9，更优选pH 6.5。在其它方面中，本公开提供了一种通过使用脂质体内药物稳定化技术制备的脂质体配制物。在这样的情况下，利用聚合或非聚合的带高电荷阴离子和脂质体内俘获剂，例如多磷酸盐或蔗糖八硫酸盐。
在一些方面中，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米颗粒。例如，通过如2018年9月7日提交的并入本文的国际申请PCT/US2018/050042中公开的方法获得的ceDNA制备并负载ceDNA的脂质纳米颗粒配制物。这能够通过在低pH值下将乙醇脂质与ceDNA水溶液高能混合，使可电离的脂质质子化并为ceDNA/脂质缔合和颗粒成核提供有利的能量来实现。通过水稀释和去除有机溶剂能够进一步稳定颗粒。能够将颗粒浓缩至所需水平。
通常，以约10:1至30:1的总脂质与ceDNA(质量或重量)比率制备脂质颗粒。在一些实施方案中，脂质与ceDNA比率(质量/质量比率；w/w比率)可以在约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1范围内。能够调节脂质和ceDNA的量以提供所需的N/P比，例如N/P比为3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，脂质颗粒配制物的总脂质含量能够在约5mg/ml至约30mg/mL的范围内。
可电离的脂质通常用于在低pH值下浓缩核酸货物(例如ceDNA)并驱动膜缔合和融合。通常，可电离的脂质是包含至少一个氨基的脂质，所述氨基在酸性条件下(例如在pH6.5或更低的条件下)带正电或质子化。可电离的脂质在本文中也称为阳离子脂质。
示例性可电离脂质描述于国际PCT专利公开WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO2012/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346和WO2013/086354；以及美国专利公开US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458和US2013/0195920，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可电离的脂质是具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：
Figure BDA0002629249020001461
脂质DLin-MC3-DMA描述于Jayaraman等人，《应用化学国际版(Angew.Chem.Int.EdEngl.)》(2012),51(34):8529-8533，其内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2015/074085中所述的脂质ATX-002，其内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2012/040184中所述的(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，可电离脂质是如WO2015/199952中所述的化合物6或化合物22，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
没有限制，可电离的脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的20-90％(mol)。例如，可电离的脂质摩尔含量可以为脂质纳米颗粒中存在的总脂质的20-70％(mol)、30-60％(mol)或40-50％(mol)。在一些实施方案中，可电离的脂质占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的约50mol％至约90mol％。
在一些方面中，脂质纳米颗粒可以进一步包含非阳离子脂质。非离子脂质包括两亲脂质、中性脂质和阴离子脂质。因此，非阳离子脂质可以是中性不带电荷的、两性离子型或阴离子脂质。非阳离子脂质通常用于增强融合性。
设想用于如本文所公开的方法和组合物中的示例性非阳离子脂质描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242中，所述国际申请全文并入本文中。示例性非阳离子脂质描述于国际申请公开WO2017/099823和美国专利公开US2018/0028664中，两者的内容以全文引用的方式并入本文中。
非阳离子脂质能够占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0-30％(mol)。例如，非阳离子脂质含量为脂质纳米颗粒中存在的总脂质的5-20％(mol)或10-15％(mol)。在各种实施方案中，可电离的脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒不包含任何磷脂。在一些方面中，脂质纳米颗粒能够进一步包含例如固醇等组分，以提供膜完整性。
能够用于脂质纳米颗粒的一种示例性固醇是胆固醇和其衍生物。示例性胆固醇衍生物描述于国际申请WO2009/127060和美国专利公开US2010/0130588中，所述文献以全文引用的方式并入本文。
提供膜完整性的组分(例如固醇)能够占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0-50％(mol)。在一些实施方案中，这样的组分占脂质纳米颗粒的总脂质含量的20-50％(摩尔)、30-40％(摩尔)。
在一些方面中，脂质纳米颗粒能够进一步包含聚乙二醇(PEG)或偶联的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米颗粒的聚集和/或提供空间稳定。示例性的偶联脂质包括但不限于PEG-脂质偶联物、聚噁唑啉(POZ)-脂质偶联物、聚酰胺-脂质偶联物(如ATTA-脂质偶联物)、阳离子聚合物脂质(CPL)偶联物以及其混合物。在一些实施方案中，偶联的脂质分子是PEG-脂质偶联物，例如(甲氧基聚乙二醇)偶联的脂质。示例性PEG-脂质偶联物包括(但不限于)PEG-二酰基甘油(DAG)(例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG丁二酸酯二酰基甘油(PEGS-DAG)(例如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，或其混合物。另外的示例性PEG-脂质偶联物描述于例如US5,885,613、US6,287,591、US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224和US2017/0119904中，所有这些文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，PEG-脂质是如US2018/0028664中定义的化合物，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，US20150376115或US2016/0376224中公开了PEG-脂质，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
PEG-DAA偶联物可以是例如PEG-二月桂酰氧基丙基、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基、PEG-二棕榈酰氧基丙基或PEG-二硬脂酰氧基丙基。PEG-脂质可以是以下中的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基甘油酰胺、PEG-二硬脂基甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二-十四烷氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些实例中，PEG-脂质可以选自由以下组成的群组：PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。
还能够使用与除PEG之外的分子偶联的脂质替代PEG-脂质。举例来说，替代或除PEG-脂质之外，还能够使用聚噁唑啉(POZ)-脂质偶联物、聚酰胺-脂质偶联物(例如ATTA-脂质偶联物)和阳离子型聚合物脂质(CPL)偶联物。示例性的偶联脂质(即，PEG-脂质、(POZ)-脂质偶联物、ATTA-脂质偶联物和阳离子聚合物-脂质)描述于WO1996/010392、WO1998/051278、WO2002/087541、WO2005/026372、WO2008/147438、WO2009/086558、WO2012/000104、WO2017/117528、WO2017/099823、WO2015/199952、WO2017/004143、WO2015/095346、WO2012/000104、WO2012/000104和WO2010/006282；美国专利申请公开US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2013/0303587、US2018/0028664、US2015/0376115、US2016/0376224、US2016/0317458、US2013/0303587、US2013/0303587和US20110123453；和US5,885,613、US6,287,591、US6,320,017和US6,586,559，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，一种或多种另外的化合物可以是治疗剂。治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，可以根据治疗目的和所需的生物学作用选择治疗剂。举例来说，如果LNP内的ceDNA适用于治疗癌症，则另外的化合物可以是抗癌剂(例如化学治疗剂、靶向癌症疗法(包括(但不限于)小分子一种抗体)。在另一个实例中，如果含有ceDNA的LNP可用于治疗感染，那么另外的化合物可以是抗微生物剂(例如抗生素或抗病毒化合物)。在又一个实例中，如果含有ceDNA的LNP可用于治疗免疫疾病或病症，那么另外的化合物可以是调控免疫应答的化合物(例如免疫抑制剂、免疫刺激化合物或调控一种或多种特异性免疫途径的化合物)。在一些实施方案中，含有例如编码不同蛋白质的ceDNA或例如治疗剂的不同化合物的不同化合物的不同脂质纳米颗粒的不同混合物可以用于本发明的组合物和方法中。
在一些实施方案中，另外的化合物是免疫调控剂。例如，另外的化合物是免疫抑制剂。在一些实施方案中，另外的化合物是免疫刺激剂。本文还提供了一种医药组合物，其包含所产生的经脂质纳米颗粒囊封的昆虫细胞，或如本文所述用于产生抗体或融合蛋白的合成产生的ceDNA载体，和药学上可接受的载剂或赋形剂。
在一些方面中，本公开提供了一种脂质纳米颗粒配制物，其进一步包含一种或多种药物赋形剂。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒配制物还包含蔗糖、tris、海藻糖和/或甘氨酸。
ceDNA载体能够与颗粒的脂质部分复合或囊封于脂质纳米颗粒的脂质位置。在一些实施方案中，可以将ceDNA完全囊封在脂质纳米颗粒的脂质位置中，从而保护其免于被核酸酶降解，例如在水溶液中。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中的ceDNA在37℃下脂质纳米颗粒暴露于核酸酶至少约20分钟、30分钟、45分钟或60分钟后基本上不降解。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中的ceDNA在颗粒在血清中在37℃下培育至少约30分钟、45分钟或60分钟或至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时或36小时后基本上不降解。
在某些实施方案中，脂质纳米颗粒对受试者，例如对哺乳动物，例如人基本上是无毒的。在一些方面，脂质纳米颗粒配制物是冻干粉末。
在一些实施方案中，脂质纳米颗粒是具有至少一个脂质双层的固体芯颗粒。在其它实施方案中，脂质纳米颗粒具有非双层结构，即非层状(即非双层)形态。不受限制，非双层形态能够包括例如三维管、棒、对称立方体等。举例来说，使用例如Cryo-TEM分析，能够轻松地评估且表征脂质纳米颗粒的形态(片层对非片层)，如US2010/0130588中所述，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些其它实施方案中，具有非片层形态的脂质纳米颗粒是电子致密的。在一些方面中，本公开提供了结构上为单层或多层的脂质纳米颗粒。在一些方面中，本公开提供了脂质纳米颗粒配制物，其包含多囊泡颗粒和/或基于泡沫的颗粒。
通过控制脂质组分的组成和浓度，可以控制脂质偶联物从脂质颗粒中交换出来的速率，进而可以控制脂质纳米颗粒融合的速率。另外，包括例如pH值、温度或离子强度等其它变量可用于改变和/或控制脂质纳米颗粒融合的速率。基于本公开，本领域普通技术人员将清楚可用于控制脂质纳米颗粒融合的速率的其它方法。同样显而易见，通过控制脂质偶联物的组成和浓度，可以控制脂质颗粒的大小。
配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的效力相关(参见Jayaraman等人,《应用化学国际版(Angewandte Chemie,International Edition)》(2012),51(34),8529-8533；Semple等人,《自然生物技术》28,172-176(20l0)，均以全文引用的方式并入本文中)。pKa的优选范围是约5至约7。使用基于2-(对甲苯胺基)-6-萘磺酸(TNS)荧光的测定法测定脂质纳米颗粒中阳离子脂质的pKa。
VIII.使用方法
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体还能够用于递送所关注核苷酸序列(例如编码抗体或融合蛋白)到靶细胞(例如宿主细胞)的方法。具体地说，所述方法可以是递送抗体或抗原结合片段到有需要的受试者的细胞和治疗所关注疾病的方法。本发明实现了ceDNA载体中编码的抗体或融合蛋白在受试者细胞中的体内表达，使得抗体或融合蛋白表达的治疗效应发生。在ceDNA载体的体内和体外递送模式中均可以看到这些结果。
另外，本发明提供了在有需要的受试者的细胞中递送抗体或融合蛋白的方法，其包括多次施用编码所述抗体或融合蛋白的本发明的ceDNA载体。由于本发明的ceDNA载体不像对包封病毒载体通常所观察到那样诱发免疫应答，所以这样的多次施用策略将可能在基于ceDNA的系统中取得更大的成功。
ceDNA载体的施用量足以转染所需组织的细胞，并提供足够水平的基因转移和抗体或融合蛋白的表达，而不会产生过度的不利影响。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于静脉内(例如在脂质体配制物中)、直接递送至选定的器官(例如门静脉内递送至肝脏)、肌内和其它胃肠外施用途径。如果需要，可以组合施用途径。
如本文所述用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的递送不限于所表达的抗体或抗原结合片段的递送。举例来说，常规产生(例如使用基于细胞的产生方法(例如昆虫细胞产生方法)或合成产生的如本文所述的ceDNA载体可以联合为了提供基因疗法的一部分而提供的其它递送系统使用。可以与根据本公开的ceDNA载体组合的系统的一个非限制性实例包括为了使表达抗体或融合蛋白的ceDNA载体实现有效的基因表达而分别递送一种或多种辅因子或免疫抑制剂的系统。
本发明还提供了一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包含将治疗有效量的ceDNA载体任选地与药学上可接受的载体一起引入受试者的有需要的靶细胞(特别是肌肉细胞或组织)中。虽然ceDNA载体能够在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所选ceDNA载体包含编码可用于治疗疾病的抗体或融合蛋白的核苷酸序列。具体地说，ceDNA载体可以包含可操作地连接到控制元件的所期望抗体或融合蛋白序列，当引入受试者中时，所述控制元件能够引导由外源DNA序列编码的所期望抗体或融合蛋白转录。ceDNA载体可以通过如上文和本文其它地方提供的任何合适的途径施用。
本文提供的组合物和载体可用于递送抗体或融合蛋白以用于各种目的。在一些实施方案中，转基因编码旨在用于研究目的的抗体或融合蛋白，例如建立具有转基因的体细胞转基因动物模型，例如研究抗体或融合蛋白产物的功能。在另一个实例中，转基因编码旨在用于建立动物疾病模型的抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，编码的抗体或融合蛋白可用于治疗或预防哺乳动物受试者的疾病状态。抗体或融合蛋白能够以足以治疗与基因表达降低，表达缺乏或功能障碍有关的疾病的量转移到患者中(例如在患者中表达)。
原则上，表达盒能够包括被视为属于本发明范围内的核酸或任何转基因，其编码因突变而减少或缺乏或当过度表达时达成治疗益处的抗体或融合蛋白。优选地，在本文提供的ceDNA组合物中不存在未插入的细菌DNA，并且优选地不存在细菌DNA。
ceDNA载体不限于ceDNA载体的一种。因而，在另一个方面中，表达不同抗体或融合蛋白或相同抗体或融合蛋白、可操作地连接到可操作地连接到不同启动子或顺式调控元件的多种ceDNA载体能够同时或依序递送到靶细胞、组织、器官或受试者。因此，这种策略能够使多种抗体和/或融合蛋白的基因治疗或基因递送同时进行。还能够将抗体的不同部分分离成单独的ceDNA载体(例如抗体或抗原结合片段的功能需要不同结构域和/或辅因子)，所述ceDNA载体能够同时或在不同时间施用，并且能够分别可调控，借此增添抗体或融合蛋白表达的额外控制水平。考虑到由于缺乏病毒衣壳而缺乏抗衣壳宿主免疫应答，递送也可以进行多次，并且对于临床环境中的基因疗法来说，重要的是随后增加或减少剂量。可以预期，由于没有衣壳，因此不会发生抗衣壳应答。
本发明还提供了一种治疗受试者的疾病的方法，包含将治疗有效量的如本文所公开的ceDNA载体、任选地与药学上可接受的载剂一起引入受试者的有需要的靶细胞(具体地说，肌肉细胞或组织)。虽然ceDNA载体能够在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。实施的ceDNA载体包含可用于治疗疾病的所关注核苷酸序列。具体地说，ceDNA载体可以包含与控制元件可操作地连接的期望的外源DNA序列，当引入受试者中时，所述控制元件能够指导由外源DNA序列编码的期望的多肽、蛋白质或寡核苷酸的转录。ceDNA载体可以通过如上文和本文其它地方提供的任何合适的途径施用。
IX.递送用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的方法
在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够通过多种适合方法体外或体内递送到靶细胞。能够施用或注射单独的ceDNA载体。CeDNA载体能够在不借助于转染试剂或其它物理方式的情况下递送到细胞。替代地，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够使用本领域已知的任何转染试剂或本领域已知的促进DNA进入细胞的其它物理方式递送，例如脂质体、醇类、富聚赖氨酸化合物、富精氨酸化合物、磷酸钙、微囊泡、显微注射、电穿孔等等。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够有效地靶向使用各种递送试剂、使用常规AAV病毒粒子通常难以转导的细胞和组织类型。
本文描述的技术的一个方面涉及一种将抗体或抗原结合片段递送至细胞的方法。典型地，在体内和体外方法中，可以使用如本文所公开的方法以及所属领域中已知的其它方法将如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体引入细胞中。如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体优选以生物学有效量施用于细胞。如果ceDNA载体体内施用于细胞(例如施用于受试者)，则ceDNA载体的生物学有效量是足以引起抗体或抗原结合片段在靶细胞中转导和表达的量。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的示例性施用模式包括口腔、直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如经由气溶胶)、颊内(例如舌下)、阴道、鞘内、眼内、透皮、内皮内、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如静脉内、皮下、皮内、颅内、肌肉内[包括施用于骨骼、隔膜和/或心肌]、胸膜内、脑内和关节内)、体表(例如皮肤和粘膜表面，包括气管表面，以及透皮施用)、淋巴内等等，以及直接的组织或器官注射(例如(但不限于)肝脏、眼、肌肉，包括骨骼肌、心肌、隔膜肌，或脑)。
可以向受试者的任何部位施用ceDNA载体，包括但不限于选自由以下组成的群组的部位：脑、骨骼肌、平滑肌、心脏、膈膜、气道上皮、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、皮肤和眼睛。ceDNA载体也可以施用于肿瘤(例如肿瘤或淋巴结中或附近)。
在任何给定情况下最合适的途径将取决于所治疗、改善和/或预防的病状的性质和严重程度，以及所使用的特定ceDNA载体的性质。另外，ceDNA容许通过单个载体或多个ceDNA载体(例如ceDNA混合物)施用超过一种抗体。
A.ceDNA载体的肌肉内施用
在一些实施方案中，治疗受试者的疾病的方法包括将治疗有效量的编码抗体或其抗原结合片段的ceDNA载体、任选地与药学上可接受的载剂一起引入受试者的需要其的靶细胞(特别是肌肉细胞或组织)中。在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体施用于受试者的肌肉组织。
在一些实施方案中，ceDNA载体能够施用于受试者的任何部位，包括但不限于选自骨骼肌、平滑肌、心脏、隔膜或眼肌的部位。在一些实施方案中，将本发明的ceDNA载体施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌(例如以治疗、改善和/或预防肌营养不良或心脏病(例如PAD或充血性心力衰竭)。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体向根据本发明的骨骼肌的施用包括(但不限于)施用于肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背、颈、头(例如舌)、胸腔、腹部、骨盘/会阴和/或手指的骨骼肌。如本文公开的ceDNA载体可以通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢体灌注(任选地，腿和/或手臂的隔离肢体灌注；参见例如Arruda等人，(2005)《血液》105:3458-3464)和/或直接肌肉注射而递送至骨骼肌。在特定实施方案中，如本文公开的ceDNA载体通过肢体灌注、任选地隔离肢体灌注(例如静脉内或关节内施用)来施用于受试者(例如患有肌营养不良症如DMD的受试者)的肢体(臂和/或腿)。在实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体能够在不使用“流体动力学”技术的情况下施用。举例来说，常规病毒载体递送到组织(例如递送到肌肉)通常利用流体动力学技术增强(例如大体积的静脉内/静脉内施用)，其增强血管压力并且促进病毒载体穿越内皮细胞屏障的能力。在特定实施方案中，本文所述的ceDNA载体能够在流体动力学技术缺乏的情况下施用，例如大体积输注和/或升高的血管内压力(例如大于正常收缩压，例如小于或等于血管内压力相对于正常收缩压的5％、10％、15％、20％、25％增幅)。这样的方法可以减少或避免与流体动力学技术相关的副作用，例如水肿、神经损伤和/或隔室综合征。
此外，包含如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的施用于骨骼肌的ceDNA载体的组合物能够施用于肢体(例如上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背、颈、头(例如舌)、胸腔、腹部、骨盘/会阴和/或手指的骨骼肌。合适的骨骼肌包括(但不限于)外展小指肌(手)、外展小趾肌(足)、拇展肌(abductor hallucis)、第五趾(指)展肌(abductor ossis metatarsiquinti)、拇短展肌(abductor pollicis brevis)、拇长展肌(abductor pollicislongus)、内收短肌(adductor brevis)、拇收肌(adductor hallucis)、内收长肌(adductorlongus)、內收大肌(adductor magnus)、拇收肌(adductor pollicis)、肘肌(anconeus)、前斜角肌(anterior scalene)、膝关节肌(articularis genus)、肱二头肌(bicepsbrachii)、股二头肌(biceps femoris)、肱肌(brachialis)、肱挠肌(brachioradialis)、颊肌(buccinator)、喙肱肌(coracobrachialis)、皱眉肌(corrugator supercilii)、三角肌(deltoid)、降口角肌(depressor anguli oris)、降下唇肌(depressor labiiinferioris)、二腹肌(digastric)、骨间背侧肌(dorsal interossei)(手)、骨间背侧肌(足)、桡侧腕短伸肌(extensor carpi radialis brevis)、桡侧腕长伸肌(extensor carpiradialis longus)、尺侧伸腕肌(extensor carpi ulnaris)、伸小指肌(extensor digitiminimi)、伸趾肌(extensor digitorum)、伸趾短肌(extensor digitorum brevis)、伸趾长肌(extensor digitorum longus)、伸拇短肌(extensor hallucis brevis)、伸拇长肌(extensor hallucis longus)、伸食指肌(extensor indicis)、伸拇短肌(extensorpollicis brevis)、伸拇长肌(extensor pollicis longus)、桡侧腕屈肌(flexor carpiradialis)、尺侧屈腕肌(flexor carpi ulnaris)、小指短屈肌(flexor digiti minimibrevis)(手)、小趾短屈肌(足)、趾短屈肌(flexor digitorum brevis)、趾长屈肌(flexordigitorum longus)、指深屈肌(flexor digitorum profundus)、指浅屈肌(flexordigitorum superficialis)、拇短屈肌(flexor hallucis brevis)、拇长屈肌(flexorhallucis longus)、拇短屈肌(flexor pollicis brevis)、拇长屈肌(flexor pollicislongus)、额肌(frontalis)、腓肠肌(gastrocnemius)、颏舌骨肌(geniohyoid)、臀大肌(gluteus maximus)、臀中肌(gluteus medius)、臀小肌(gluteus minimus)、股薄肌(gracilis)、颈髂肋肌(iliocostalis cervicis)、腰髂肋肌(iliocostalis lumborum)、胸髂肋肌(iliocostalis thoracis)、髂肌(illiacus)、下孖肌(inferior gemellus)、下斜肌(inferior oblique)、下直肌(inferior rectus)、冈下肌(infraspinatus)、棘间肌(interspinalis)、横突间肌(intertransversi)、翼外肌(lateral pterygoid)、外直肌(lateral rectus)、背阔肌(latissimus dorsi)、提口角肌(levator anguli oris)、提上唇肌(levator labii superioris)、提上唇鼻翼肌(levator labii superioris alaequenasi)、提上睑肌(levator palpebrae superioris)、肩胛提肌(levator scapulae)、长回旋肌(long rotators)、头最长肌(longissimus capitis)、颈最长肌(longissimuscervicis)、胸最长肌(longissimus thoracis)、头长肌(longus capitis)、颈长肌(longuscolli)、蚓状肌(lumbricals)(手)、蚓状肌(足)、咬肌(masseter)、翼内肌(medialpterygoid)、内直肌(medial rectus)、中斜角肌(middle scalene)、多裂肌(multifidus)、下颌舌骨肌(mylohyoid)、头下斜肌(obliquus capitis inferior)、头上斜肌(obliquuscapitis superior)、闭孔外肌(obturator externus)、闭孔内肌(obturator internus)、枕肌(occipitalis)、肩胛舌骨肌(omohyoid)、小指对掌肌(opponens digiti minimi)、拇对掌肌(opponens pollicis)、眼轮匝肌(orbicularis oculi)、口轮匝肌(orbicularisoris)、骨间掌侧肌(palmar interossei)、掌短肌(palmaris brevis)、掌长肌(palmarislongus)、耻骨肌(pectineus)、胸大肌(pectoralis major)、胸小肌(pectoralis minor)、腓短肌(peroneus brevis)、腓长肌(peroneus longus)、第三腓骨肌(peroneus tertius)、梨状肌(piriformis)、跖侧骨间肌(plantar interossei)、跖肌(plantaris)、颈阔肌(platysma)、腘肌(popliteus)、后斜角肌(posterior scalene)、旋前方肌(pronatorquadratus)、旋前圆肌(pronator teres)、腰大肌(psoas major)、股方肌(quadratusfemoris)、跖方肌(quadratus plantae)、头直前肌(rectus capitis anterior)、头侧直肌(rectus capitis lateralis)、头后大直肌(rectus capitis posterior major)、头后小直肌(rectus capitis posterior minor)、股直肌(rectus femoris)、大菱形肌(rhomboidmajor)、小菱形肌(rhomboid minor)、笑肌(risorius)、缝匠肌(sartorius)、小斜角肌(scalenus minimus)、半膜肌(semimembranosus)、头半棘肌(semispinalis capitis)、颈半棘肌(semispinalis cervicis)、胸半棘肌(semispinalis thoracis)、半腱肌(semitendinosus)、前锯肌(serratus anterior)、短回旋肌(short rotators)、比目鱼肌(soleus)、头棘肌(spinalis capitis)、颈棘肌(spinalis cervicis)、胸棘肌(spinalisthoracis)、头夹肌(splenius capitis)、颈夹肌(splenius cervicis)、胸锁乳突肌(sternocleidomastoid)、胸舌骨肌(sternohyoid)、胸骨甲状肌(sternothyroid)、茎突舌骨肌(stylohyoid)、锁骨下肌(subclavius)、锁骨下肌(subscapularis)、上孖肌(superiorgemellus)、上斜肌(superior oblique)、上直肌(superior rectus)、旋后肌(supinator)、冈上肌(supraspinatus)、颞肌(temporalis)、阔筋膜张肌(tensor fascia lata)、大圆肌(teres major)、小圆肌(teres minor)、胸肌(thoracis)、甲状舌骨肌(thyrohyoid)、胫前肌(tibialis anterior)、胫骨后肌(tibialis posterior)、斜方肌(trapezius)、肱三头肌(triceps brachii)、股中间肌(vastus intermedius)、股外侧肌(vastus lateralis)、股内侧肌(vastus medialis)、颧大肌(zygomaticus major)和颧小肌(zygomaticus minor)，以及所属领域中已知的任何其它合适的骨骼肌。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够通过任何合适方法施用到隔膜肌，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。在一些实施方案中，从ceDNA载体表达的转基因递送到靶组织还能够通过递送包含ceDNA载体的合成储槽来实现，其中将包含ceDNA载体的储槽植入骨骼肌、平滑肌、心肌和/或隔膜肌组织，或能够使肌肉组织与包含如本文所述的ceDNA载体的膜或其它基质接触。此类可植入基质或底物描述于美国专利第7,201,898号中。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体施用于心肌包括施用于左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜。如本文所述的ceDNA载体可以通过静脉内施用、动脉内施用、例如主动脉内施用、直接心脏注射(例如注入左心房、右心房、左心室、右心室)和/或冠状动脉灌注而递送到心肌。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体施用于平滑肌能够通过任何合适方法实现，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。在一个实施方案中，可以对存在于平滑肌内、附近和/或平滑肌上的内皮细胞施用。平滑肌的非限制实例包括眼虹膜、肺细支气管、喉肌(声带)、胃肠道的胃、食道、小肠和大肠肌肉层、膀胱的输尿管、逼尿肌肌肉、子宫的子宫肌层、阴茎或前列腺腺体。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体施用于骨骼肌、隔膜肌和/或心肌(例如治疗、改善和/或预防肌肉萎缩症或心脏病(例如PAD或充血性心脏衰竭)。在中代表性实施方案中，根据本发明的ceDNA载体是用于治疗和/或预防骨骼肌、心肌和/或隔膜肌的病症。
具体地说，预期包含如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的组合物能够递送到眼部的一种或多种肌肉(例如外直肌(Lateral rectus)、内直肌(Medialrectus)、上直肌(Superior rectus)、下直肌(Inferior rectus)、上斜肌(Superioroblique)、下斜肌(Inferior oblique))、面部肌肉(例如枕额肌(Occipitofrontalismuscle)、颞下颌肌(Temporoparietalis muscle)、降眉间肌(Procerus muscle)、鼻肌(Nasalis muscle)、降鼻中隔肌(Depressor septi nasi muscle)、眼轮匝肌(Orbicularisoculi muscle)、皱眉肌(Corrugator supercilii muscle)、降眉肌(Depressorsupercilii muscle)、耳廓肌(Auricular muscles)、口轮匝肌(Orbicularis orismuscle)、降口角肌(Depressor anguli oris muscle)、笑肌(Risorius)、颧大肌(Zygomaticus major muscle)、颧小肌(Zygomaticus minor muscle)、提上唇肌(Levatorlabii superioris)、提上唇鼻翼肌(Levator labii superioris alaeque nasi muscle)、降下唇肌(Depressor labii inferioris muscle)、提口角肌(Levator anguli oris)、颊肌(Buccinator muscle)、颏肌(Mentalis))或舌肌(例如颏舌肌(genioglossus)、舌骨舌肌(hyoglossus)、小角舌肌(chondroglossus)、茎舌肌(styloglossus)、腭舌肌(palatoglossus)、舌上纵肌(superior longitudinal muscle)、舌下纵肌(inferiorlongitudinal muscle)、舌直肌(vertical muscle)、舌横肌(transverse muscle))。
(i)肌肉内注射：在一些实施方案中，使用针能够将包含如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的组合物注射到受试者的指定肌肉的一个或多个部位，例如骨骼肌(例如三角肌、股外侧肌、背外侧肌的侧臀肌，或婴儿的前外侧股)。包含ceDNA的组合物能够引入肌肉细胞的其它亚型中。肌肉细胞亚型的非限制性实例包括骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或隔膜肌细胞。
肌内注射的方法是本领域技术人员已知的，因此本文中不再详细描述。然而，当执行肌肉内注射时，应该基于患者的年龄和体型、组合物的粘度以及注射部位来确定适当的针头尺寸。表12提供了示例性注射部位和相应针头尺寸的指南：
表12：人类患者肌内注射指南
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在某些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体按照小体积(例如如表12中针对指定受试者概述的示例性体积)配制。在一些实施方案中，必要时，受试者在注射之前，能够施用全身或局部麻醉剂。如果需要多次注射，或如果注射更深的肌肉，而非上文提及的常见注射部位，这是特别期望的。
在一些实施方案中，能够将肌肉内注射与以下组合：电穿孔、递送压力或使用转染试剂增强ceDNA载体的细胞吸收。
(ii)转染试剂：在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体被配制成包含一种或多种转染试剂的组合物，以促进载体吸收到肌管或肌肉组织中。因此，在一个实施方案中，使用本文中别处所述的方法、通过转染将本文所述的核酸施用于肌肉细胞、肌管或肌肉组织。
(iii)电穿孔：在某些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体在缺乏载剂的情况下施用以促进ceDNA进入细胞中，或在生理学上呈惰性的药学上可接受的载剂中(即，不改进或不增强无衣壳非病毒载体吸收到肌管中的任何载剂)施用。在此类实施例中，通过对细胞或组织进行电穿孔能够促进无衣壳非病毒载体的吸收。
细胞膜天然地抵抗从细胞外传递到细胞的细胞质中。一种用于暂时减小这种抵抗力的方法是“电穿孔”，其中使用电场在细胞中产生孔隙而对细胞不引起持久性损伤。这些孔隙大足以允许DNA载体、医药、DNA和其它极性化合物触及细胞内部。细胞膜中的孔隙闭合并且细胞再次变得不可通透。
电穿孔能够用于体外和体内应用中以将例如外源DNA引入活细胞中。体外应用典型地是将活细胞样品与包含例如DNA的组合物混合。然后将细胞放在电极(例如平行板)之间并且向细胞/组合物混合物施加电场。
体内电穿孔的方法有多种；电极能够以多种配置提供，例如夹持表皮的测径规上覆于待处理的细胞区域上。替代地，可以将针形电极插入组织中，从而更深地触及所定位的细胞。在任一情况下，将包含例如核酸的组合物注射到处理区域之后，电极向所述区域施加电场。在一些电穿孔应用中，这个电场包含约10到60ms持续时间的约100到500V/cm的单一方波脉冲。此类脉冲可以通过例如Genetronics有限公司的分公司BTX制造的ElectroSquare Porator T820的已知应用产生。
典型地，仅当肌肉在施用组合物(例如注射到肌肉中)之后立即或不久加以电刺激时才成功地发生例如核酸的吸收。
在某些实施方案中，使用电场脉冲或使用低电压/长脉冲处理方案(例如使用方波脉冲电穿孔系统)达成电穿孔。能够产生脉冲电场的示例性脉冲发生器包括例如能够产生指数波形的ECM600，和能够产生方波形的ElectroSquarePorator(T820)，两者均获自BTX，Genetronics有限公司的分公司(加利福尼亚州圣地亚哥)。方波电穿孔系统递送可控的电脉冲，其快速地升高到设定电压，在那个水平保持设定的时间长度(脉冲长度)，然而快速地降到零。
在一些实施方案中，施用局部麻醉剂，例如通过在处理部位注射以减少疼痛，所述疼痛可能与组织在包含如本文所述的无衣壳非病毒载体的组合物存在下电穿孔有关。另外，本领域的技术人员将了解，应该选择最小化且/或防止过度组织损伤、以致肌肉发生纤维化、坏死或发炎的组合物剂量。
(iv)递送压力：在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体递送到肌肉组织是通过递送压力促进，其将大体积与快速注射到供应肢体的动脉(例如髂动脉)组合使用。这种施用模式能够通过多种方法达成，包括将包含ceDNA载体的组合物输注到肢体血管中，典型地同时使用血管钳压脉带将肌肉与全身循环分隔。在一种方法中，组合物通过肢体血管循环以容许外渗到细胞中。在另一方法中，提高血管内流体动力学压力以扩展血管床且增强ceDNA载体吸收到肌肉细胞或组织中。在一个实施方案中，将ceDNA组合物施用于动脉。
(v)脂质纳米颗粒组合物：在一些实施方案中，将肌肉内递送用的如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体配制成包含如在本文别处所述的脂质体的组合物。
(vi)靶向肌肉组织的ceDNA载体的全身施用：在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体配制成通过间接递送施用靶向肌肉，其中与肝脏相反，将ceDNA输送到肌肉。相应地，本文所述的技术涵盖将包含如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的组合物间接施用于肌肉组织，例如通过全身施药。此类组合物能够通过体表、静脉内(通过推注或连续输注)、细胞内注射、组织内注射、口服、通过吸入、腹膜内、皮下、腔内施用，并且在必要时能够通过蠕动方式或通过所属领域的技术人员已知的其它方式递送。药剂能够全身性施用，例如通过静脉内输注(如果希望如此)。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体吸收到肌肉细胞/组织内是通过使用优先引导载体到肌肉组织中的靶向药剂或部分来增加。因此，在一些实施方案中，相较于无衣壳ceDNA载体存在于身体的其它细胞或组织中的量，无衣壳ceDNA载体能够在肌肉组织中浓缩。
在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的组合物进一步包含肌肉细胞的靶向部分。在其它实施方案中，所表达的基因产物包含对期望产生作用的组织具有特异性的靶向部分。靶向部分能包括能够靶向细胞或组织的细胞内、细胞表面或细胞外生物标志物、与其相互作用、与其偶联且/或结合至其的任何分子或分子复合物。生物标志物能包括例如细胞蛋白酶、激酶、蛋白质、细胞表面受体、脂质和/或脂肪酸。靶向部分能靶向、相互作用、偶联和/或结合到的生物标志物的其它实例包括与特定疾病有关的分子。举例来说，生物标志物能够包括涉及癌症发展的细胞表面受体，例如表皮生长因子受体和运铁蛋白受体。靶向部分能够包括(但不限于)结合到靶肌肉组织中所表达的分子的合成化合物、天然化合物或产物、巨分子实体、生物工程化分子(例如多肽、脂质、多核苷酸、抗体、抗体片段)以及小实体(例如小分子、神经传递素、底物、配体、激素和元素化合物)。
在某些实施方案中，靶向部分可以进一步包含受体分子，包括例如天然地识别靶细胞中的特定期望分子的受体。此类受体分子包括已经修饰以增强其与靶分子相互作用的特异性的受体、已经修饰以与受体天然不识别的所期望靶分子相互作用的受体，以及此类受体的片段(参见例如Skerra，2000，《分子识别杂志(J.Molecular Recognition)》，13:167-187)。优选的受体是趋化因子受体。示例性趋化因子受体已经描述于例如Lapidot等人，2002，《实验血液学(Exp Hematol)》，30:973-81和Onuffer等人，2002，《制药学趋势(Trends Pharmacol Sci)》，23:459-67。
在其它实施方案中，另外的靶向部分可以包含配体分子，包括例如天然地识别靶细胞的特定期望受体的配体，例如运铁蛋白(Tf)配体。此类配体分子包括已经修饰以增强其与靶受体相互作用的特异性的配体、已经修饰以与配体天然不识别的期望受体相互作用的配体，和此类配体的片段。
在仍其它实施方案中，靶向部分可以包含适体。适体是经选择可特异性结合到靶细胞的期望分子结构的寡核苷酸。适体典型地是类似于噬菌体呈现亲和力选择(又称为体外分子进化)的亲和力选择方法的产物。所述方法涉及执行亲和力分离的若干次串联迭代，例如使用致病免疫原所结合的固体载体执行；随后执行聚合酶链反应(PCR)以扩增结合到免疫原的核酸。每一轮亲和力分离由此从核酸群体中富集成功地结合期望免疫原的分子。以这种方式，可以“培育”随机核酸池，从而产生特异性结合靶分子的适体。适体典型地是RNA，但可以是DNA或其类似物或衍生物，例如(不限于)肽核酸(PNA)和硫代磷酸酯核酸。
在一些实施方案中，靶向部分能够包含光可降解配体(即，‘笼状’配体)，所述配体通过例如聚焦光束释放，从而使无衣壳非病毒载体或基因产物靶向特定组织。
本文还预期组合物递送到受试者的一种或多种肌肉的多个部位。也就是说，能够在至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100个注射部位中进行注射。此类部位相对于单一肌肉的区域能够扩展或能够在多种肌肉之间分布。
B.用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体施用于非肌肉位置
在另一个实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体施用于CNS(例如脑或眼)。可以将ceDNA载体引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、垂体腺、黑质、松果腺)、小脑、端脑(纹状体、包括枕骨、颞叶、顶叶和额叶的大脑、皮质、基底神经节、海马和杏仁核(portaamygdala))、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。也可以将ceDNA载体施用于眼睛的不同区域，例如视网膜、角膜和/或视神经。ceDNA载体可以被递送到脑脊髓液中(例如通过腰椎穿刺)。在血脑屏障已被扰乱的情形(例如脑肿瘤或大脑梗塞)中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体可以进一步通过血管内施用于CNS。
在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够通过所属领域中已知的任何途径施用于期望区域，包括(但不限于)鞘内、眼内、脑内、脑室内、静脉内(例如在糖(例如甘露糖醇)存在下)、鼻内、耳内、眼内(例如玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如眼球筋膜囊下区域)递送以及肌肉内递送与逆行递送到运动神经元。
在一些实施方案中，用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体于液体调配物中通过直接注射(例如立体定位注射)施用于CNS的期望区域或隔室。在其它实施方案中，可以通过局部施加至期望区域或通过鼻内施用气雾剂配制物来提供ceDNA载体。可以通过局部施加液滴来施用至眼睛。作为另一替代方案，ceDNA载体能够作为固体、缓释型配制物施用(参见例如美国专利第7,201,898号)。在另外的实施方案中，ceDNA载体可用于逆行转运，以治疗、改善和/或预防涉及运动神经元的疾病和病症(例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)；脊髓性肌萎缩(SMA)等)。例如，可以将ceDNA载体递送至肌肉组织，它可以从肌肉组织迁移到神经元中。
C.离体治疗
在一些实施方案中，从受试者中去除细胞，将如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体引入其中，然后将细胞替换回到受试者中。从受试者取出细胞进行离体处理、然后再引回到受试者中的方法是本领域已知的(参见例如美国专利第5,399,346号；其公开内容整体并入本文中)。可替代地，将ceDNA载体引入另一个受试者的细胞，引入培养细胞中，或引入任何其它合适来源的细胞中，并将细胞施用于有需要的受试者。
经如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体转导的细胞优选以“治疗有效量”与医药载剂组合施用于受试者。本领域技术人员将了解，治疗效果不必是完全的或治愈的，只要给受试者提供了一些益处即可。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够编码如本文所述的抗体或融合蛋白(有时称为转基因或异源核苷酸序列)，所述抗体或融合蛋白是体外、离体或体内细胞中产生。举例来说，与在如本文所论述的治疗方法中使用本文所述的ceDNA载体相比，在一些实施方案中，可以将用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体引入所培养细胞中并且从细胞中分离出所表达的抗体或融合蛋白，例如产生抗体和融合蛋白。在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的所培养细胞能够用于商业上生产抗体或融合蛋白，例如充当小或大规模生物制造抗体或融合蛋白的细胞源。在替代性实施方案中，将如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体引入宿主非人类受试者的细胞中，用于体内产生抗体或融合蛋白，包括小规模生产以及商业上大规模生产抗体或融合蛋白。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够用于兽医学与医学应用中。如上所述的离体基因递送方法的合适受试者包括禽类(例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和野鸡)和哺乳动物(例如人、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬和兔)，以哺乳动物为优选。人类受试者是最优选的。人类受试者包括新生儿、婴儿、少年和成人。
D.剂量范围
本文提供了治疗方法，包含向受试者施用有效量的包含如本文所述的编码抗体或融合蛋白的ceDNA载体的组合物。如熟练的从业者将了解，术语“有效量”是指ceDNA组合物的施用量，引起抗体或融合蛋白以治疗疾病的“治疗有效量”表达。
可以任选地采用体内和/或体外测定法来帮助鉴定使用的最佳剂量范围。配制物中使用的精确剂量还取决于施用途径和病状的严重程度，并且应该根据所属领域的技术人员的判断和每个受试者的情形来决定。有效剂量能够从源自于体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线推断。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体是以足转染所期望组织的细胞且提供足够的基因转移和表达水平而无不当副作用的量施用。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于上文在“施用”部分中所述的那些途径，例如直接递送至选定的器官(例如门静脉内递送至肝脏)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、肿瘤内和其它胃肠外施用途径。如果需要，施用途径可以组合。
为了实现特定“治疗效应”所必需的如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的剂量或量将基于若干因素而改变，包括(但不限于)：核酸施用途径、为了实现治疗效应所必需的基因或RNA表达水平、所治疗的特定疾病或病症，以及基因、RNA产物或所得经表达的蛋白质的稳定性。本领域技术人员可以基于前述的因素以及本领域众所周知的其它因素容易地确定治疗患有特定疾病或病症的患者的ceDNA载体剂量范围。
剂量方案可以调整，以提供最佳的治疗反应。例如，可以重复施用寡核苷酸，例如可以每天施用若干剂，或者可以根据治疗情况的紧急程度的指示，按比例减少剂量。本领域普通技术人员将能够容易地确定主题寡核苷酸的适当剂量和施用计划，无论所述寡核苷酸是将施用于细胞还是受试者。
“治疗有效剂量”将落在相对较宽的范围内，该范围可以通过临床试验确定并将取决于特定应用(神经细胞将需要很少的量，而全身性注射将需要大量)。例如，对于体内直接注射到人类受试者的骨骼肌或心肌中，治疗有效剂量将为约1μg至100g左右的ceDNA载体。如果使用外泌体或微粒来递送ceDNA载体，那么可以通过实验确定治疗有效剂量，但预计递送1μg至约100g的载体。此外，治疗有效剂量是表达足量的转基因、从而对受试者起作用的ceDNA载体的量，其使得疾病的一种或多种症状减少，但不产生显著的脱靶或显著的不良副作用。在一个实施方案中，“治疗有效量”是所表达的抗体或融合蛋白的量，所述量足以使疾病生物标志物的表达产生统计显著的可测量变化或使指定疾病症状产生统计显著的可测量减轻。指定的ceDNA载体组合物的此类有效量能够在临床试验以及动物研究中加以调整。
药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员众所周知的，开发在多种治疗方案中使用本文所述的特定组合物的合适的剂量和治疗方案也是本领域技术人员众所周知的。
对于体外转染来说，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体递送到细胞(1x106个细胞)的有效量将是约0.1到100μg ceDNA载体，优选1到20μg且更优选1到15μg或8到10μg。ceDNA载体越大，需要的剂量越高。如果使用外泌体或微粒，那么可以通过实验确定有效的体外剂量，但意图递送大致相同量的ceDNA载体。
治疗疾病时，如本文所公开的表达抗体或融合蛋白的ceDNA载体的适当剂量将取决于待治疗的疾病的特定类型、抗体类型、疾病的严重度和病程、此前疗法、患者的临床史和对抗体的应答，以及主治医师的判断。一次或经过一系列治疗将抗体适当地施用于患者。本文涵盖了各种给药方案，包括(但不限于)单次施药或在不同时间点上的多次施药、推注施药和脉冲输注。
视疾病的类型和严重度而定，ceDNA载体通过一次或多次分开施用或通过连续输注来施用，施用的量使得所编码的抗体或融合蛋白以约0.3mg/kg到100mg/kg(例如15mg/kg-100mg/kg，或所述范围内的任何剂量)表达。ceDNA载体的一种典型日剂量足以引起所编码的抗体或融合蛋白在约15mg/kg到100mg/kg或更大值范围内表达，此视上文提及的因素而定。ceDNA载体的一种示例性剂量是足以引起如本文所公开的经编码的抗体或融合蛋白在约10mg/kg至约50mg/kg范围内表达的量。因此，量足以引起所编码的抗体或融合蛋白表达以约0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、3mg/kg、4.0mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg(或其任何组合)的ceDNA载体的一种或多种剂量可以施用于患者。在一些实施方案中，ceDNA载体是足以引起所编码抗体或融合蛋白按照50mg到2500mg范围内的总剂量表达的量。ceDNA载体的示例性剂量是足以引起所编码的抗体或融合蛋白的总表达为50mg、约100mg,200mg,300mg,400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约720mg、约1000mg、约1050mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2050mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg或约2500mg(或其任何组合)的量。由于抗体或融合蛋白从ceDNA载体中的表达能够小心地通过本文中的调控开关或替代地通过施用于受试者的ceDNA载体的多种剂量控制，因此抗体或融合蛋白从ceDNA载体中的表达能够以使得所表达的抗体或融合蛋白的剂量可以间歇性地(例如每周、每两周、每三周、每四周、每个月、每两个月、每三个月或每六个月)从ceDNA载体中施用的方式加以控制。通过常规技术和分析能够监测此疗法的进展。
在某些实施方案中，ceDNA载体的施用量足以引起所编码的抗体或融合蛋白以15mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、60mg/kg或均一剂量(例如300mg、500mg、700mg、800mg或更高)的剂量表达。在一些实施方案中，抗体或融合蛋白从ceDNA载体中的表达受到控制，以使得抗体或融合蛋白在一段时间内每天、每隔一天、每周、每2周或每4周表达。在一些实施方案中，抗体或融合蛋白从ceDNA载体中的表达受到控制，以使得抗体或融合蛋白在一段时间内每2周或每4周表达。在某些实施方案中，时间段是6个月、一年、十八个月、两年、五年、十年、15年、20年或患者一生。
治疗可以涉及施用单次剂量或多次剂量。在一些实施方案中，能够向受试者施用超过一次剂量；实际上，在需要时能够施用多次剂量，原因是ceDNA载体因缺乏病毒衣壳而诱发/不诱发抗衣壳宿主免疫应答。因此，本领域技术人员可以容易地确定适当剂量次数。施用的剂量次数可以是例如约1-100次剂量，优选2-20次剂量。
不希望受任何特定理论束缚，缺乏通过施用如本公开所述的ceDNA载体(即，缺乏衣壳组分)所诱发的典型抗病毒免疫应答允许用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体施用于多种场合下的宿主。在一些实施方案中，将异源核酸递送至受试者的次数在2至10次的范围内(例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次)。在一些实施方案中，向受试者递送ceDNA载体超过10次。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的剂量施用于受试者每个日历日(例如24小时时间段)不超过一次。在一些实施方案中，载体ceDNA的剂量施用于受试者，每2、3、4、5、6或7个日历日不超过一次。在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的剂量施用于受试者，每个日历周(例如7个日历日)不超过一次。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每两周不超过一次(例如两个日历周时间段为一次)。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每个日历月不超过一次(例如30个日历日为一次)。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每六个日历月不超过一次。在一些实施方案中，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每个日历年(例如365天或闰年366天)不超过一次。
在特定实施方案中，超过一次施用(例如两次、三次、四次或更多次施用)如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体可以用于在不同间隔期(例如每日、每周、每月、每年等)内实现所期望的基因表达水平。
在一些实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体所编码的治疗抗体能够通过调控开关、诱导型或可抑制型启动子调控，使得其在受试者中表达至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少12个月/一年、至少2年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年、至少30年、至少40年、至少50年或更长。在一个实施方案中，通过在预定或期望的间隔时间反复施用本文所述的ceDNA载体能够达成表达。替代地，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够进一步包含基因编辑系统的组分(例如CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸内切酶等)以容许一种或多种核酸序列插入，所述一或多种核酸序列编码用于基本上持久治疗或“治愈”疾病的抗体。包含基因编辑组分的此类ceDNA载体公开于国际申请PCT/US18/64242中，并且能够包括5'和3'同源臂(例如SEQID NO:151-154，或与其具有至少40％、50％、60％、70％或80％同源性的序列)以便将编码抗体的核酸插入安全港区域，例如但不包括白蛋白基因或CCR5基因。
治疗持续时间视受试者的临床进展和对治疗的应答而定。初始较高治疗剂量之后，预期为连续的相对较低维持剂量。
E.单位剂型
在一些实施方案中，包含如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的医药组合物能够方便地以单位剂型呈递。单位剂型通常将适于医药组合物的一种或多种特定施用途径。在一些实施方案中，单位剂型适于通过吸入施用。在一些实施方案中，单位剂型适于通过汽化器施用。在一些实施方案中，单位剂型适于通过喷雾器施用。在一些实施方案中，单位剂型适于通过气雾器施用。在一些实施方案中，单位剂型适于口服施用、经颊施用或舌下施用。在一些实施方案中，单位剂型适于静脉内、肌内或皮下施用。在一些实施方案中，单位剂型适合鞘内或脑室内施用。在一些实施方案中，配制医药组合物以供局部施用。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是化合物产生治疗效果的量。
X.治疗方法
本文所述的技术还通过多种方式(包括例如离体、非原位、体外和体内应用、方法、诊断程序和/或基因治疗方案)展现了用于制备所公开的供产生抗体或融合蛋白用的ceDNA载体的方法以及使用所公开的ceDNA载体的方法。
在一个实施方案中，从如本文所公开的ceDNA载体中表达的经表达的治疗抗体具有治疗疾病的功能。在一个优选实施方案中，治疗抗体不引起免疫系统反应，除非期望如此。
本文提供了一种治疗受试者的疾病或病症的方法，包含将治疗有效量的如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体、任选地与药学上可接受的载剂一起引入有需要的靶细胞(例如肌肉细胞或组织，或其它受影响的细胞类型)。虽然ceDNA载体能够在载剂存在下引入，但此类载剂不是必需的。所建构的ceDNA载体包含编码如本文所述的适用于治疗疾病的抗体或抗原结合片段的核苷酸序列。具体地说，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体可以包含可操作地连接到控制元件的所期望抗体或抗原结合片段DNA序列，当引入受试者中时，所述控制元件能够引导由外源DNA序列编码的所期望抗体或抗原结合片段转录。如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够经由如上文和本文中别处所提供的任何适合途径施用。
本文公开了如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体组合物和配制物，其包括本发明的一种或多种ceDNA载体以及药学上可接受的一种或多种缓冲液、稀释剂或赋形剂。这样的组合物可以包括在一种或多种诊断或治疗药剂盒中，用于诊断、预防、治疗或改善疾病、损伤、病症、创伤或功能障碍的一种或多种症状。在一个方面中，疾病、损伤、病症、创伤或功能障碍是人类疾病、损伤、病症、创伤或功能障碍。
本文所述技术的另一方面提供了一种向有需要的受试者提供诊断或治疗有效量的如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的方法，所述方法包含向有需要的受试者的细胞、组织或器官提供一定量的如本文所公开的ceDNA载体以及维持有效实现ceDNA载体表达抗体或抗原结合片段的时间，借此向所述受试者提供诊断或治疗有效量的由ceDNA载体表达的抗体或抗原结合片段。在另一方面中，受试者是人。
本文描述的技术的另一个方面提供了一种用于诊断、预防、治疗或改善受试者的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常病状或创伤的至少一种或多种症状的方法。就整体和一般意义而言，所述方法至少包括以足以诊断、预防、治疗或改善受试者的疾病、病症、功能异常、损伤、异常病状或创伤的一种或多种症状的量和时间向有需要的受试者施用一种或多种所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的步骤。在此类实施方案中，能够评估抗体/抗原结合片段对受试者的功效，或替代地，能够检测到受试者的特定蛋白质或组织位置(包括细胞和亚细胞位置)的抗原或抗原结合片段。因而，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够用作体内诊断工具，例如用于检测癌症或其它适应症。在另一方面中，受试者是人。
另一方面是如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体用作治疗或减轻疾病的一种或多种症状或疾病状态的工具的用途。有许多遗传性疾病中的缺陷基因是已知的，通常分为两类：缺陷状态，通常是酶的，一般以隐性方式遗传；和不平衡状态，其可涉及调节蛋白或结构蛋白，通常但不总是以显性方式遗传。就缺陷状态的疾病而言，作为替代疗法，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够用于递送抗体或融合蛋白，所述抗体或融合蛋白将引起正常基因表达增强的路径中的蛋白质中和，以及在一些实施方案中，能够用于建立动物疾病模型，所述模型使用表达中和抗体或融合蛋白的ceDNA载体。就不均衡的疾病状态而言，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够用于在模型系统中建立疾病状态，然后能够利用所述模型系统尝试抵消疾病状态。因此，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体容许治疗遗传疾病。如本文中所用，通过部分或完全拯救导致疾病或使其更严重的缺陷或不平衡，可以治疗疾病状态。
在一个实施方案中，本文预期肌肉中的抗体转基因的肌肉内递送和表达能够用于治疗肌肉特异性疾病或替代地充当用于产生蛋白质的储槽以便治疗性转基因产物对远端部位发挥作用。本文所述的ceDNA载体能够用于表达肌肉中的抗体或融合蛋白。在一些实施方案中，基因产物增强靶基因的表达和/或活性。在其它实施方案中，基因产物减少靶基因的表达和/或活性。
A.宿主细胞：
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体将抗体或抗原结合片段转基因递送到受试者的宿主细胞中。在一些实施方案中，受试者的宿主细胞是人宿主细胞，包括例如血细胞、干细胞、造血细胞、CD34+细胞、肝细胞、癌细胞、血管细胞、肌肉细胞、胰腺细胞、神经细胞、视觉或视网膜细胞、上皮或内皮细胞、树突状细胞、成纤维细胞或任何其它哺乳动物来源的细胞，包括但不限于肝(即肝)细胞、肺细胞、心脏细胞、胰腺细胞、肠细胞、隔膜细胞、肾(即肾)细胞、神经细胞、血细胞、骨髓细胞或预期进行基因治疗的受试者的任何一种或多种选定的组织。在一方面中，受试者的宿主细胞是人宿主细胞。
本公开还涉及如上文所提及的重组宿主细胞，其包括如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体。因此，对于技术人员而言显而易见的是，可以根据目的使用多种宿主细胞。将如本文所公开的包括供体序列的用于产生抗体或融合蛋白的构建体或ceDNA载体引入宿主细胞中，使得供体序列作为染色体整合体维持，如早先所描述。术语宿主细胞涵盖由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于供体序列和其来源。
宿主细胞还可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是人细胞(例如原代细胞、干细胞或永生化细胞系)。在一些实施方案中，能够将如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体离体施用于宿主细胞，然后在基因疗法事件之后，递送到受试者。宿主细胞可以是任何细胞类型，例如体细胞或干细胞、诱导型多能干细胞或血细胞，例如T细胞或B细胞，或骨髓细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是同种异体细胞。例如，T细胞基因组工程可用于癌症免疫疗法、如HIV疗法的疾病调节(例如受体敲除，如CXCR4和CCR5)和免疫缺陷疗法。可靶向B细胞上的MHC受体进行免疫治疗。在一些实施方案中，能够将基因经修饰的宿主细胞(例如骨髓干细胞，例如CD34+细胞，或诱导多能干细胞)移植回到患者中用于表达治疗蛋白。
C.基因治疗的其它疾病：
一般来说，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够用于递送根据上述说明的任何抗体或抗原结合片段以治疗、预防或改善与任何病症有关的症状，所述病症与受试者的异常蛋白质表达或基因表达有关。说明性疾病状态包括(但不限于)：囊肿性纤维化(和肺的其它疾病)、A型血友病、B型血友病、地中海贫血、贫血和其它血液病症、AIDS、阿尔兹海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、癫痫症和其它神经病症、癌症、糖尿病、肌营养不良(例如杜兴氏(Duchenne)、贝克尔(Becker))、赫尔勒氏病(Hurler's disease)、腺苷脱氨酶缺陷、代谢障碍、视网膜变性疾病(和眼部的其它疾病)、线粒体病(例如莱博氏遗传性视神经病变(Leber's hereditary optic neuropathy，LHON)、李氏综合症(Leigh syndrome)和亚急性硬化性脑病变)、肌病(例如颜面肩胛肱骨型肌病(FSHD)和心肌病)、实体器官(例如脑、肝脏、肾脏、心脏)的疾病等等。在一些实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体能够有利地用于治疗患有代谢病症(例如鸟氨酸转氨甲酰酶缺陷)的个体。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够用于治疗、改善和/或预防由基因或基因产物中的突变引起的疾病或病症。能够用ceDNA载体治疗的示例性疾病或病症包括但不限于：代谢性疾病或病症(例如法布里病(Fabrydisease)、戈谢病(Gaucher disease)、苯丙酮尿症(PKU)、糖原贮积病)；尿素循环疾病或病症(例如鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)缺乏症)；溶酶体贮积性疾病或病症(例如异染性脑白质营养不良(MLD)、II型粘多糖贮积病(MPSII；亨特综合征(Hunter syndrome)))；肝脏疾病或病症(例如进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC)；血液疾病或病症(例如血友病(甲型和乙型)、地中海贫血和贫血)；癌症和肿瘤以及遗传性疾病或病症(例如囊性纤维化)。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够用于将抗体或融合蛋白递送到骨骼肌、心肌或隔膜肌，产生抗体或融合蛋白分泌到血液中且循环，或全身递送到其它组织以治疗、改善和/或预防病症(例如代谢病症，例如糖尿病(例如胰岛素)、血友病(例如VIII)、粘多糖病症(例如斯赖综合症(Sly syndrome)、赫尔勒综合症(Hurler Syndrome)、谢氏综合症(Scheie Syndrome)、贺-谢二氏综合症(Hurler-Scheie Syndrome)、亨特氏综合症(Hunter's Syndrome)、沙费利波综合症A、B、C、D、莫基奥综合症(Morquio Syndrome)、马-兰二氏综合症(Maroteaux-Lamy Syndrome)等)或溶酶体贮积病(例如高雪氏疾病(Gaucher's disease)[葡糖脑苷脂酶]、庞贝病(Pompe disease)[溶酶体酸α-葡糖苷酶]或法布里病(Fabry disease)[.α.-半乳糖苷酶A])或肝糖贮积病症(例如庞贝病[溶酶体酸a葡糖苷酶])。适用于治疗、改善和/或预防代谢病症的其它蛋白质在上文描述。
在其它实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够用于在治疗、改善和/或预防有需要的受试者的代谢病症的方法中递送抗体或抗原结合片段。本文中描述了说明性代谢病症和抗体或抗原结合片段。任选地，多肽是分泌的(例如多肽为呈天然状态分泌的多肽，或例如如本领域已知，通过与分泌信号序列可操作地结合，已被工程化成分泌的多肽)。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够通过任何适合方式，任选地通过施用受试者所吸入的包含ceDNA载体的可吸入颗粒的气雾剂悬浮液施用于受试者的肺。可吸入颗粒可以是液体或固体。包含ceDNA载体的液体颗粒的气雾剂可以通过任何合适的手段产生，例如用压力驱动的气雾剂喷雾器或超声喷雾器，如本领域技术人员所知。参见例如美国专利第4,501,729号。包含ceDNA载体的固体颗粒的气雾剂也可以通过制药领域已知的技术，用任何固体颗粒药物气雾剂发生器产生。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够施用于CNS组织(例如脑、眼)。在特定实施方案中，可以施用如本文公开的ceDNA载体以治疗、改善或预防CNS的疾病，包括遗传性病症、神经变性病症、精神病症和肿瘤。CNS的说明性疾病包括(但不限于)阿尔兹海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、卡纳万疾病(Canavandisease)、李氏疾病(Leigh's disease)、雷夫苏姆氏病(Refsum disease)、妥瑞综合症(Tourette syndrome)、原发侧向硬化症、肌肉萎缩性侧索硬化、渐进性肌肉萎缩、皮克氏疾病(Pick's disease)、肌肉萎缩症、多发性硬化症、重症肌无力、宾斯万格氏疾病(Binswanger's disease)、由于脊髓或头损伤所致的创伤、泰萨克斯疾病(Tay Sachsdisease)、勒什-纳阳疾病(Lesch-Nyan disease)、癫痫症、大脑梗死；精神病症，包括情绪障碍(例如抑郁、双极性情感障碍、持续性情感障碍、继发性情绪障碍)、精神分裂症、药物依赖性(例如酗酒和其它物质依赖性)、神经官能症(例如焦虑症、强迫症、类躯体化症精神障碍、分离性障碍、哀伤、分娩后抑郁)、精神病(例如幻觉和错觉)、痴呆症、偏执狂、注意缺陷障碍、性心理障碍、睡眠障碍、疼痛病症、饮食或体重失调(例如肥胖症、恶病质、神经性厌食症和贪食症)，以及CNS的癌症和肿瘤(例如垂体肿瘤)。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体可以治疗、改善或预防的眼病包括涉及视网膜、后束和视神经的眼科病症(例如色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病变和其它视网膜变性疾病、葡萄膜炎、年龄相关黄斑变性、青光眼)。许多眼科疾病和病症与以下三种类型适应症中的一种或多种有关：(1)血管产生、(2)炎症和(3)变性。在一些实施方案中，如本文公开的ceDNA载体可以用于递送抗血管产生因子；抗炎因子；延缓细胞变性、促进细胞免毒或促进细胞生长的因子以及前述的组合。例如，糖尿病性视网膜病的特征是血管产生。通过眼内(例如玻璃体内)或眼周(例如眼球筋膜囊下区域)递送一种或多种抗血管产生抗体或融合蛋白能够治疗糖尿病性视网膜病变。可用本发明的ceDNA载体治疗、改善或预防的其它眼病包括：地图样萎缩、血管性或“湿性”黄斑变性、斯塔氏病(Stargardtdisease)、莱伯先天性黑朦(LCA)、亚瑟综合征(Usher syndrome)、弹性假黄瘤(PXE)、x-连锁色素性视网膜炎(XLRP)、x-连锁视网膜劈裂症(XLRS)、无脉络膜症、莱伯遗传性视神经病变(LHON)、色盲、锥杆细胞营养不良、福斯角膜内皮营养不良(Fuchs endothelial cornealdystrophy)、糖尿病性黄斑水肿以及眼部癌症和肿瘤。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够治疗、改善或预防炎性眼疾病或病症(例如葡萄膜炎)。通过眼内(例如玻璃体或前房)施用如本文所公开的ceDNA载体能够表达一种或多种消炎抗体或融合蛋白。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够编码与转基因有关的抗体或抗原结合片段，所述转基因编码报告子多肽(例如酶，例如绿色荧光蛋白，或碱性磷酸酶)。在一些实施方案中，编码可用于实验或诊断目的的报告蛋白的转基因选自下列中的任何一种：β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和本领域众所周知的其它转基因。在一些方面中，表达连接到报告子多肽的抗体或抗原结合片段的ceDNA载体可以用于诊断目的，以及测定ceDNA载体在其所施用的受试者中的功效或用作ceDNA载体在所述受试者中的活性标志物。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够表达特异性结合至受试者中的免疫原性多肽或免疫原的抗体或抗原结合片段。所述抗体或抗原结合片段能够特异性结合至所属领域中已知的任何所关注免疫原，包括(但不限于)人免疫缺陷病毒、流感病毒、gag蛋白、肿瘤抗原、癌症抗原、细菌抗原、病毒抗原等的免疫原。
D.使用ceDNA载体测试成功的基因表达
所属领域中众所周知的分析能够用于测试通过ceDNA载体对抗体或抗原结合片段进行基因递送的效率，能够在体外与体内模型中进行。所属领域的技术人员通过测量抗体或抗原结合片段的mRNA和蛋白质水平(例如逆转录PCR、蛋白质印迹分析，和酶联免疫吸附分析(ELISA))能够评估ceDNA对抗体或抗原结合片段的表达水平。在一个实施方案中，ceDNA包含能够用于评估抗体或抗原结合片段表达的报告蛋白，例如通过荧光显微术或发光读盘器检查报告蛋白的表达。对于体内应用来说，蛋白质功能分析能够用于测试所指定的抗体或抗原结合片段的功能，以确定基因表达是否已经成功地发生。熟练的技术人员能够确定最佳的测试来体外或体内测量ceDNA载体所表达的抗体或抗原结合片段的功能。
本文中预期抗体或抗原结合片段在细胞或受试者中从ceDNA载体的基因表达的效应能够持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少10个月、至少12个月、至少18个月、至少2年、至少5年、至少10年、至少20年，或能够持久存在。
在一些实施方案中，本文所述的表达盒、表达构建体或ceDNA载体中的抗体或抗原结合片段能够针对宿主细胞进行密码子优化。如本文所用，术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人(例如人源化)等所关注脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在所述脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白质的氨基酸序列。优化的密码子能够使用例如Aptagen的Gene
Figure BDA0002629249020001811
密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen有限公司)或其它可公开获得的数据库确定。
E.通过评估抗体从ceDNA载体中的表达来确定功效
所属领域中已知用于测定蛋白质表达的基本上任何方法能够用于分析所期望抗体从ceDNA载体中的表达。此类方法/分析的非限制性实例包括酶联免疫分析(ELISA)、亲和力ELISA、ELISPOT、连续稀释、流式细胞术、表面等离子体共振分析、动力学排除分析、质谱学、蛋白质印迹、免疫沉淀和PCR。
为了评估体内抗体表达，可以从受试者获得生物样品进行分析。示例性生物样品包括生物流体样品、体液样品、血液(包括全血)、血清、血浆、尿液、唾液、切片和/或组织样品等。生物样品或组织样品还可以指从个体中分离出的组织或流体样品，包括(但不限于)肿瘤切片、粪便、脊髓液、胸膜液、乳头抽出物、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外部切片、泪液、唾液、母乳、细胞(包括(但不限于)血细胞)、肿瘤、器官，以及体外细胞培养液成分的样品。术语还包括上述样品的混合物。术语“样品”还包括未处理或预处理(或预处理)的生物样品。在一些实施方案中，用于本文描述的分析和方法的样品包含从待测受试者收集的血清样品。
F.通过临床参数测定所表达抗体的功效
熟练的临床医师能够测定ceDNA载体所表达(即，功能表达)的指定抗体或抗原结合片段对指定的疾病(例如类风湿性关节炎或癌症(包括(但不限于)乳癌、黑色素瘤等))的功效。然而，在如本文所述的编码治疗抗体的ceDNA载体治疗之后，如果癌症的任一种或所有征象或症状以有益方式改变或临床上接受的其它症状或疾病标志物改良或改善例如至少10％，则治疗在所述术语在本文使用时被视为“有效治疗”。还能够根据个体未发生恶化来测量功效，如根据疾病的稳定或对医疗干预的需求所评估(即，疾病的进展停止或至少减缓)。测量这些指标的方法是本领域技术人员已知的和/或描述于本文中。治疗包括对个体或动物(一些非限制性实例包括人或哺乳动物)的疾病的任何治疗且包括：(1)抑制(例如遏制)疾病或减缓疾病(例如关节炎、癌症)进展；或(2)缓解疾病，例如引起症状消退；和(3)预防或减小疾病发展的可能性，或预防与疾病有关的继发疾病/病症(例如类风湿性关节炎所致的手变形，或癌症转移)。
治疗疾病的有效量是指当施用于有需要的哺乳动物时足以产生对该疾病有效治疗的量，所述术语如本文所定义。药剂功效能够通过评估指定疾病所特有的身体指标来测定。举例来说，癌症的身体指标包括(但不限于)疼痛、肿瘤尺寸、肿瘤生长速率、血细胞计数等。
XI.表达抗体或融合蛋白的ceDNA载体的各种应用
如本文所公开，如本文所述用于产生抗体或融合蛋白的组合物和ceDNA载体能够用于表达用于一系列目的的抗体或融合蛋白。在一个实施方案中，表达抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够用于建立含有转基因的体细胞转基因动物模型，例如研究抗体或融合蛋白靶标的功能。在一些实施方案中，表达抗体或融合蛋白的ceDNA载体适用于治疗、预防或改善哺乳动物受试者的疾病状态或病症。
在一些实施方案中，抗体或融合蛋白在受试者中能够以足以治疗与基因产物的表达增强、活性提高或基因的不当上调有关的疾病的量从ceDNA载体中表达。在此类实施方案中，经表达的抗体或融合蛋白可以是阻断或中和抗体或融合蛋白，其作用是抑制或遏制或以其它方式减少作为靶标的或抗体或融合蛋白所特异性结合的蛋白质或基因产物的活性。
在一些实施方案中，抗体或融合蛋白在受试者中能够以足以治疗与蛋白质的表达减少、表达缺乏或功能异常有关的疾病的量从ceDNA载体中表达。举例来说，所表达的抗体或融合蛋白是活化抗体或融合蛋白，且能够增强蛋白质在受试者中的活性或功能，同时减少表达和/或活性，例如通过促进蛋白质或抑制蛋白质抑制因子。
所属领域的普通技术人员应了解，转基因可以不是自身转录的基因的开放阅读框架，相反，其可以是靶基因的启动子区域或抑制子区域，并且ceDNA载体可以修饰此类区域，结果使如此调节所关注基因的表达。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的组合物和ceDNA载体能够用于递送用于上述各种目的的抗体或抗原结合片段。
在一些实施方案中，转基因编码一种或多种抗体或融合蛋白，所述抗体或融合蛋白适用于治疗、改善或预防哺乳动物受试者的疾病状态。ceDNA载体所表达的抗体或融合蛋白以足以治疗与异常基因序列有关的疾病的量施用于患者，从而能够产生以下中的任何一种或多种：增强的蛋白质表达、蛋白质的过度活性、靶基因或蛋白质的表达减少、表达缺乏或功能异常。
在一些实施方案中，如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体设想用于诊断和筛选方法中，其中抗体或抗原结合片段在细胞培养系统中或替代地在转基因动物模型中短暂地或稳定地表达。
本文所述技术的另一方面提供了一种用如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体转导哺乳动物细胞群的方法。就整体和一般意义而言，所述方法至少包括将包含有效量的如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的一种或多种ceDNA载体的组合物引入群体的一个或多个细胞中的步骤。
另外，本发明提供了包括如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的一种或多种所公开ceDNA载体的组合物以及治疗和/或诊断试剂盒，或与一种或多种额外成分一起配制或根据其一种或多种使用说明书制备的ceDNA组合物。
如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体所施用的细胞可以是任何类型，包括(但不限于)神经细胞(包括末梢和中枢神经系统的细胞，具体地说，脑细胞)、肺细胞、视网膜细胞、上皮细胞(例如肠道和呼吸道上皮细胞)、肌肉细胞、树突状细胞、胰脏细胞(包括胰岛细胞)、肝细胞、心肌细胞、骨细胞(例如骨髓干细胞)、造血干细胞、脾细胞、角质细胞、纤维母细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等等。可替代地，细胞可以是任何祖细胞。作为另一个替代方案，细胞可以是干细胞(例如神经干细胞、肝干细胞)。作为又一个替代方案，细胞可以是癌细胞或肿瘤细胞。此外，如上文指出，细胞可以来自任何物种来源。
A.用于产生商业抗体或融合蛋白的ceDNA载体
在一些实施方案中，如本文所公开的ceDNA载体能够用于在商业背景下产生抗体或融合蛋白，例如使用生物反应器或在期望的宿主中产生。
举例来说，包含如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体的细胞能够用于商业上生产抗体或融合蛋白，例如充当小或大规模生物制造抗体或融合蛋白的细胞源。在替代性实施方案中，将如本文所公开的用于产生抗体或融合蛋白的ceDNA载体引入宿主非人类受试者的细胞中，用于体内产生抗体或融合蛋白，包括小规模生产以及商业上大规模生产抗体或融合蛋白。举例来说，在一些实施方案中，本文所述的ceDNA载体能够用于通过使用腹水肿瘤在体内(例如在大鼠、小鼠、马、山羊等中)产生抗体或融合蛋白。
在一些实施方案中，编码抗体或融合蛋白的ceDNA载体能够用于产生嵌合抗原受体(CAR)，然后能够使用所述嵌合抗原受体产生CAR T细胞。CAR是来自特异性单克隆抗体的所选单链可变片段与一个或多个T细胞受体细胞内信号传导域的融合蛋白。这种T细胞遗传修饰可以使用如本文所述的ceDNA载体进行。因此，本文特别预期表达嵌合抗原受体的ceDNA载体能够施用于例如离体T细胞，以对治疗癌症(例如(但不限于)白血病、乳癌、肺癌、卵巢癌等等)用的CAR T细胞进行工程改造。
B.抗体或融合蛋白的产生与提纯
本文公开的ceDNA载体将用于在体外或体内产生抗体或融合蛋白。以这种方式产生的抗体或融合蛋白能够分离出来，针对期望的功能加以测试，并且经过提纯以便进一步用于研究或治疗性治疗。每种抗体或融合蛋白产生系统具有其自身的优点/缺点。虽然体外产生的抗体或融合蛋白能够轻松地提纯且能够在短时间内产生抗体或融合蛋白，但体内产生的抗体或融合蛋白能够具有翻译后修饰，例如糖基化。
通过使用ceDNA替代传统载体(例如质粒、病毒等)编码抗体或抗体组分能够调整用于产生抗体的常规技术，例如免疫接种和库呈现(例如噬菌体呈现)。另外，如本文所述的ceDNA载体能够替换传统载体而用于生物反应器中(生物反应器产生)或在期望的宿主、细胞、组织或器官中产生抗体。此类技术为所属领域的技术人员已知且在本文中不进行详细描述。
本文所述的ceDNA载体能够用于在融合瘤细胞系中表达期望的抗体。用于产生融合瘤细胞系的方法在所属领域中已知。为了大规模生产抗体，能够使融合瘤细胞在静态或搅拌式细胞悬浮培养液、滚瓶培养液中或在生物反应器(例如中空纤维生物反应器)中生长。也能够使用基于膜的培养系统体外产生抗体，其中借助于增强氧气和气体转移的专门充气膜将细胞培养液与营养物分离。替代地，基于基质的培养系统，其中融合瘤细胞固定在基质上且连续供应有新鲜培养基。
使用所属领域的技术人员已知的任何方法(例如离子交换色谱、亲和层析、沉淀或电泳)能够将使用ceDNA载体产生的抗体提纯。
能够测试通过本文所述的方法和组合物产生的抗体对所期望的靶蛋白的结合。
XIII.各种其它实施例
在一些实施方案中，本申请可以根据以下段落中的任一段来限定：
1.一种DNA载体，其包含编码其至少一个转基因的至少一个异源核酸序列，所述异源核酸序列可操作地连接到位于两个AAV反向末端重复序列(ITR)之间的启动子，其中所述ITR任选地可以是相同或不同ITR，并且其中它们是不同ITR，所述ITR之一包含功能AAV末端解析位点和Rep结合位点，并且所述ITR之一相对于另一ITR包含缺失、插入或取代；其中所述转基因是抗体或其片段或融合蛋白；且其中所述DNA当用对所述DNA载体具有单个识别位点的限制酶消化时，当在非变性凝胶上分析时，相较于线性非连续DNA对照组，存在线性连续DNA的特征色带。
2.根据段落1所述的载体，其中所述抗体是全长抗体或其片段。
3.根据段落2所述的载体，其中所述抗体是单克隆抗体、单链抗体、Fab'片段或单域抗体(dAb)。
4.根据段落1到3中任一段所述的载体，其中所述DNA载体含有可操作地连接到编码分泌序列和重链蛋白质的第一转基因的启动子以及可操作地连接到编码轻链蛋白质的第二转基因的第二启动子。
5.根据段落1到4中任一段所述的载体，其中所述转基因编码融合蛋白，其中所述融合蛋白是单链可变片段(scFv)。
6.根据段落1到5中任一段所述的载体，其中所述抗体是选自表1-5的抗体。
7.根据段落1到6中任一段所述的载体，其中包含功能末端解析位点和Rep结合位点的所述ITR是野生型AAV ITR，或其中所述两个ITR是对称或基本对称的，或其中所述两个ITR是不对称的或其中所述两个ITR选自表7、9A、9B和10中列出的任一个。
8.根据段落1所述的载体，其中所述抗体是阿杜那单抗。
9.根据前述段落中任一段所述的载体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
10.根据前述段落中任一段所述的载体，其中所述抗体是IgG、IgA、IgD、IgM或IgE抗体。
11.一种用于在细胞或其群体中表达抗体的方法，包含将有效量的根据段落1到10所述的DNA载体施用于所述细胞或其群体以及在所述细胞表达所述抗体的条件下培养所述细胞或其群体。
12.根据段落11所述的方法，其中所述DNA载体或ceDNA载体与药学上可接受的载剂组合施用。
13.根据段落11或12所述的方法，其中所述抗体或其片段从所述细胞中分泌。
14.根据段落11到13中任一段所述的方法，其中所述抗体或其片段以胞内抗体形式滞留于细胞内。
15.根据段落11到14中任一段所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
16.根据段落15所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
17.根据段落15所述的方法，其中从所述细胞中分离出所述抗体且提纯。
18.一种向受试者递送治疗抗体的方法，所述方法包含：向受试者施用包含根据段落1到10所述的DNA载体的组合物。
19.一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包含：向受试者施用包含根据段落1到10所述的ceDNA载体的组合物，借此使所述治疗抗体在所述受试者中表达并且治疗所述疾病。
20.根据段落18或19所述的方法，其中所述ceDNA载体与药学上可接受的载剂组合施用。
21.根据段落18到20中任一段所述的方法，其中所述治疗抗体从表达其的细胞中分泌。
22.根据段落18到22中任一段所述的方法，其中所述治疗抗体滞留于表达其的细胞中。
23.根据段落11到17中任一段所述的方法，其中所述细胞或其群体是在生物反应器中培养。
24.一种组合物，其包含根据段落1到10中任一段所述的载体以用于治疗受试者的疾病。
25.一种包含根据段落1到10中任一段所述的载体的组合物的用途，其用于治疗受试者的疾病。
26.一种包含根据段落1到10中任一段所述的载体的组合物的用途，其用于制备供治疗受试者的疾病用的药剂。
实例
以下实例是为了说明而非限制而提供。本领域普通技术人员将了解，可以从本文所述的任何野生型或修饰ITR中构建ceDNA载体，并且以下示例性方法可以用于构建和评估这类ceDNA载体的活性。。尽管所述方法以某些ceDNA载体为例，但与描述一致，它们可应用于任何ceDNA载体。
实例1：使用基于昆虫细胞的方法构建ceDNA载体
PCT/US18/49996的实例1中描述了使用多核苷酸构建体模板产生ceDNA载体，所述文献以全文引用的方式并入本文中。例如，用于产生本发明的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以是ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒和/或ceDNA-杆状病毒。不受理论束缚，在容许的宿主细胞中，在例如Rep存在下，具有两个对称ITR(其中至少一个ITR相对于野生型ITR序列经修饰)和表达构建体的多核苷酸构建体模板复制而产生ceDNA载体。ceDNA载体产生经历两个步骤：第一，通过Rep蛋白从模板主链(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；以及第二，Rep介导所切除的ceDNA载体复制。
产生ceDNA载体的一种示例性方法是从如本文所述的ceDNA-质粒产生。参考图1A和1B，每种ceDNA-质粒的多核苷酸构建体模板均包括左修饰ITR和右修饰ITR，在ITR序列之间具有以下：(i)增强子/启动子；(ii)转基因的克隆位点；(iii)转录后反应元件(例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE))；和(iv)多聚腺苷酸化信号(例如来自牛生长激素基因(BGHpA))。在每个组分之间还引入了独特的限制性核酸内切酶识别位点(R1-R6)(图1A和图1B中所示)，以便于将新的遗传组分引入构建体中的特定位点。将R3(PmeI)GTTTAAAC(SEQID NO:123)和R4(PacI)TTAATTAA(SEQ ID NO:124)酶位点工程改造成克隆位点以引入转基因的开放阅读框架。将这些序列克隆到从ThermoFisher Scientific获得的pFastBac HT B质粒中。
ceDNA-杆粒的产生：
依循根据制造商说明书的方案，用测试或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAX
Figure BDA0002629249020001891
DH10BacTM感受态细胞，赛默飞世尔)。诱导DH10Bac细胞中质粒与杆状病毒穿梭载体之间重组，以产生重组ceDNA-杆粒。通过在含有X-gal和IPTG，利用抗生素选择转化体并维持杆粒和转座酶质粒的细菌琼脂平板上大肠杆菌(E.coli)中基于蓝白筛选来筛选正向选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)来选择重组杆粒。挑选由转座产生的破坏β-半乳糖苷指示基因的白色群落且在10ml培养基中培养。
从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒，并使用FugeneHD将其转染至Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在T25烧瓶内的50ml培养基中于25℃下培养。四天后，从细胞中去除培养基(含有P0病毒)，通过0.45μm过滤器过滤，从细胞或细胞残骸中分离出感染性杆状病毒颗粒。
任选地，第一代杆状病毒(P0)通过在50到500ml培养基中感染初始Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞在回转式振荡培育箱的悬浮培养液中、在130rpm下、在25℃下维持，监测细胞直径和存活率，直到细胞达到18-19nm直径(从14-15nm的初始直径)和～4.0E+6个细胞/毫升的密度。感染后第3天到第8天，利用离心去除细胞和残骸来收集培养基中的P1杆状病毒颗粒，然后通过0.45μm过滤器过滤。
收集包含测试构建体的ceDNA-杆状病毒，并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体来说，用P1杆状病毒按下列稀释度处理4×20ml 2.5E+6个细胞/毫升的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并且在25-27℃下培育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4至5天中每天细胞存活率的变化来测定感染性。
如PCT/US18/49996的图8A中所公开的“Rep-质粒”(所述文献以全文引用的方式并入本文中)在pFASTBACTM-Dual表达载体(赛默飞世尔)中产生，所述表达载体包含Rep78(SEQID NO:131或133)和Rep52(SEQ ID NO:132)或Rep68(SEQ ID NO:130)和Rep40(SEQ ID NO:129)。依循制造商提供的方案，将Rep-质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAX
Figure BDA0002629249020001901
DH10BacTM感受态细胞(赛默飞世尔))中。诱导DH10Bac细胞中Rep-质粒与杆状病毒穿梭载体之间重组，以产生重组杆粒(“Rep-杆粒”)。通过在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上大肠杆菌中包括蓝白筛选的正向选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)来选择重组杆粒。挑选分离的白色菌落，并接种到10ml选择培养基(含卡那霉素、遗传霉素(gentamicin)、四环素的LB肉汤)中。从大肠杆菌中分离出重组杆粒(Rep杆粒)，并将Rep-杆粒转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中，以产生感染性杆状病毒。
将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天，并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地，第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染初始Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增且在50到500ml培养基中培养。在感染后第3天至第8天，通过离心或过滤或其它分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒颗粒。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体来说，用P1杆状病毒按下列稀释度处理4×20ml 2.5×106个细胞/毫升的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并培育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4至5天中每天细胞存活率的变化来测定感染性。
ceDNA载体产生和表征
参考图4B，然后将含有(1)含有ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒的样品和(2)上述Rep-杆状病毒二者之一的Sf9昆虫细胞培养基分别以1:1000和1:10,000的比率加入到新鲜的Sf9细胞培养物(2.5E+6个细胞/毫升，20ml)中。然后将细胞在25℃下以130rpm培养。共同感染4-5天后，检测细胞直径和存活率。当细胞直径达到18-20nm且存活率为约70-80％时，将细胞培养物离心，去除培养基，并收集细胞集结粒。首先将细胞集结粒悬浮于适量的水性介质，即水或缓冲液中。使用Qiagen MIDI PLUSTM提纯方案(Qiagen，每个柱处理0.2mg细胞集结粒质量)从细胞中分离且提纯ceDNA载体。
初始基于260nm下的UV吸光度，测定从Sf9昆虫细胞产生和提纯的ceDNA载体的产量。
可以通过如图4D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
通过用限制性核酸内切酶消化从共同感染的Sf9细胞(如本文所述)获得的DNA，进一步分析分离的ceDNA载体的结构，所述限制性核酸内切酶是针对以下条件选择的：a)在ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得到的片段足够大，以便在0.8％变性琼脂糖凝胶上进行分级分离时被清楚看到(>800bp)。如图4D和图4E所示，具有非连续结构的线性DNA载体以及具有线性且连续结构的ceDNA载体可以通过它们反应产物的大小来区分-例如，预计具有非连续结构的DNA载体将产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的非衣壳化载体预计产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价闭合端的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价闭合的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价闭合的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外，由于多聚体DNA载体的端对端连接，对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图4D)。
如本文中所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下的琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA载体的分析法”是指通过进行限制性核酸内切酶消化、然后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA闭合端的分析法。后面是一种这样的示例性分析，尽管本领域普通技术人员将了解，对这个实例可以进行许多本领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注ceDNA载体的单切酶，其将产生DNA载体长度的大约1/3x和2/3x的产物。由此使原生凝胶与变性凝胶上的色带解析。变性之前，重要的是从样品中除去缓冲液。Qiagen PCR清洁试剂盒或脱盐“离心柱”，例如GE HEALTHCARE ILUSTRATMMICROSPINTMG-25柱，是核酸内切酶消化的一些本领域已知的选项。所述测定包括例如：i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA；2)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒，用蒸馏水洗脱；iii)加入10x变性溶液(10x＝0.5M NaOH、10mMEDTA)，加入10X染料，不进行缓冲，并与通过添加入10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起，在预先与1mM EDTA和200mM NaOH一起培育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8-1.0％凝胶上进行分析，并在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑动凝胶。本领域普通技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后，将凝胶排出并在1x TBE或TAE中中和，并转移至含1x SYBR金的蒸馏水或1x TBE/TAE。然后使用例如赛默飞世尔
Figure BDA0002629249020001931
金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000X浓缩液)和落射荧光(蓝色)或UV(312nm)使色带可视化。
产生的ceDNA载体的纯度可以使用任何本领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法，通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较，能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。举例来说，若基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带，则存在1μg ceDNA载体，且ceDNA载体是总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的色带强度相对于色带所代表的输入计算值作图，举例来说，如果总ceDNA载体是8kb，并且所切除的比较色带是2kb，则色带强度将按照总输入的25％作图，在此情况下，对于1.0μg输入，色带强度是0.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量，然后可用于测定ceDNA载体所占的总输入的百分比或纯度百分比。
出于比较目的，实例1描述了使用基于昆虫细胞的方法和多核苷酸构建体模板产生ceDNA载体，并且还描述于PCT/US18/49996的实例1中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。举例来说，根据实例1用于产生本发明的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以是ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒，和/或ceDNA-杆状病毒。不受理论束缚，在容许的宿主细胞中，在例如Rep存在下，具有两个对称ITR(其中至少一个ITR相对于野生型ITR序列经修饰)和表达构建体的多核苷酸构建体模板复制而产生ceDNA载体。ceDNA载体产生经历两个步骤：第一，通过Rep蛋白从模板主链(例如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；以及第二，Rep介导所切除的ceDNA载体复制。
在使用昆虫细胞的方法中产生ceDNA载体的示例性方法是通过如本文所述的ceDNA-质粒。参考图1A和1B，每种ceDNA-质粒的多核苷酸构建体模板均包括左修饰ITR和右修饰ITR，在ITR序列之间具有以下：(i)增强子/启动子；(ii)转基因的克隆位点；(iii)转录后反应元件(例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE))；和(iv)多聚腺苷酸化信号(例如来自牛生长激素基因(BGHpA))。在每个组分之间还引入了独特的限制性核酸内切酶识别位点(R1-R6)(图1A和图1B中所示)，以便于将新的遗传组分引入构建体中的特定位点。将R3(PmeI)GTTTAAAC(SEQ ID NO:123)和R4(PacI)TTAATTAA(SEQ ID NO:124)酶位点工程改造成克隆位点以引入转基因的开放阅读框架。将这些序列克隆到从ThermoFisherScientific获得的pFastBac HT B质粒中。
ceDNA-杆粒的产生：
依循根据制造商说明书的方案，用测试或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAX
Figure BDA0002629249020001941
DH10BacTM感受态细胞，赛默飞世尔)。诱导DH10Bac细胞中质粒与杆状病毒穿梭载体之间重组，以产生重组ceDNA-杆粒。通过在含有X-gal和IPTG，利用抗生素选择转化体并维持杆粒和转座酶质粒的细菌琼脂平板上大肠杆菌(E.coli)中基于蓝白筛选来筛选正向选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)来选择重组杆粒。挑选由转座产生的破坏β-半乳糖苷指示基因的白色群落且在10ml培养基中培养。
从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒，并使用FugeneHD将其转染至Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在T25烧瓶内的50ml培养基中于25℃下培养。四天后，从细胞中去除培养基(含有P0病毒)，通过0.45μm过滤器过滤，从细胞或细胞残骸中分离出感染性杆状病毒颗粒。
任选地，第一代杆状病毒(P0)通过在50到500ml培养基中感染初始Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞在回转式振荡培育箱的悬浮培养液中、在130rpm下、在25℃下维持，监测细胞直径和存活率，直到细胞达到18-19nm直径(从14-15nm的初始直径)和～4.0E+6个细胞/毫升的密度。感染后第3天到第8天，利用离心去除细胞和残骸来收集培养基中的P1杆状病毒颗粒，然后通过0.45μm过滤器过滤。
收集包含测试构建体的ceDNA-杆状病毒，并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体来说，用P1杆状病毒按下列稀释度处理4×20ml 2.5E+6个细胞/毫升的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并且在25-27℃下培育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4至5天中每天细胞存活率的变化来测定感染性。
使“Rep-质粒”在pFASTBACTM-Dual表达载体(赛默飞世尔)中产生，所述表达载体包含Rep78(SEQ ID NO:131或133)或Rep68(SEQ ID NO:130)和Rep52(SEQ ID NO:132)或Rep40(SEQ ID NO:129)。依循制造商提供的方案，将Rep-质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAX
Figure BDA0002629249020001951
DH10BacTM感受态细胞(赛默飞世尔))中。诱导DH10Bac细胞中Rep-质粒与杆状病毒穿梭载体之间重组，以产生重组杆粒(“Rep-杆粒”)。通过在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上大肠杆菌中包括蓝白筛选的正向选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)来选择重组杆粒。挑选分离的白色菌落，并接种到10ml选择培养基(含卡那霉素、遗传霉素(gentamicin)、四环素的LB肉汤)中。从大肠杆菌中分离出重组杆粒(Rep-杆粒)，并将Rep-杆粒转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中，以产生感染性杆状病毒。
将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天，并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地，第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染初始Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增且在50到500ml培养基中培养。在感染后第3天至第8天，通过离心或过滤或其它分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒颗粒。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体来说，用P1杆状病毒按下列稀释度处理4×20ml 2.5×106个细胞/毫升的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并培育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4至5天中每天细胞存活率的变化来测定感染性。
ceDNA载体产生和表征
然后将Sf9昆虫细胞培养基分别按照1:1000和1:10,000的比率添加到新制的Sf9细胞培养基(2.5E+6个细胞/毫升，20ml)中，所述昆虫细胞培养基含有：(1)含有ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒的样品；和(2)上述Rep-杆状病毒。然后将细胞在25℃下以130rpm培养。共同感染4-5天后，检测细胞直径和存活率。当细胞直径达到18-20nm且存活率为约70-80％时，将细胞培养物离心，去除培养基，并收集细胞集结粒。首先将细胞集结粒悬浮于适量的水性介质，即水或缓冲液中。使用Qiagen MIDI PLUSTM提纯方案(Qiagen，每个柱处理0.2mg细胞集结粒质量)从细胞中分离且提纯ceDNA载体。
初始基于260nm下的UV吸光度，测定从Sf9昆虫细胞产生和提纯的ceDNA载体的产量。使用实例5中所述的电泳方法能够评估所提纯的ceDNA载体的正确闭合端构形。
实例2：通过切除从双链DNA分子产生合成的ceDNA
ceDNA载体的合成产生描述于2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122的实例2到6中，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。一种使用合成方法产生ceDNA载体的示例性方法，所述合成方法涉及切除双链DNA分子。简单来说，使用双链DNA构建体能够产生ceDNA载体，参见例如PCT/US19/14122的图7A-8E。在一些实施方案中，双链DNA构建体是ceDNA质粒，例如参见例如2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图6)。
在一些实施方案中，制备ceDNA载体的构建体包含如本文所述的调控开关。
出于说明的目的，实例2描述了ceDNA载体的产生，所述ceDNA载体是使用此方法产生的示例性闭合端DNA载体。然而，虽然这个实例中以ceDNA载体为例来说明产生闭合端DNA载体的体外合成产生方法，其通过切除包含ITR和表达盒(例如异源核酸序列)的双链多核苷酸、随后如本文所述将自由的3'和5'端接合来实现，但所属领域的普通技术人员了解，能够如上所说明修饰双链DNA多核苷酸分子，以便产生任何所期望的闭合端DNA载体，包括(但不限于)狗骨状DNA、哑铃状DNA等等。能够利用实例2中所述的合成产生方法产生的用于产生抗体或融合蛋白的示例性ceDNA载体论述于标题为“III.通用ceDNA载体”的章节中。由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白描述于标题为“IIC.由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白”的章节中。
所述方法包括(i)从双链DNA构建体中切除编码表达盒的序列和(ii)在一个或多个ITR处形成发夹和(iii)通过接合(例如通过T4 DNA连接酶)将自由的5'与3'端连接。
双链DNA构建体按照5'到3'次序包含：第一限制性核酸内切酶位点；上游ITR；表达盒；下游ITR；和第二限制性核酸内切酶位点。然后使双链DNA构建体与一种或多种限制核酸内切酶接触，以在两个限制性核酸内切酶位点处均产生双链断裂。一种内切核酸酶能够靶向两个位点，或不同内切核酸酶能够靶向每个位点，只要ceDNA载体模板中不存在限制位点即可。由此将限制性核酸内切酶位点之间的序列从双链DNA构建体的其余部分中切除(参见PCT/US19/14122的图9)。接合后，形成闭合端DNA载体。
所述方法中使用的一个或两个ITR可以是野生型ITR。也可以使用经修饰的ITR，其中所述修饰能够包括形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中的野生型ITR中的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代(参见例如PCT/US19/14122的图6-8和10；图11B)，并且可以具有两个或更多个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图6-8；图11B)或单个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图10A-10B、图11B)。通过对现有寡核苷酸进行基因修饰或通过重新生物学和/或化学合成能够产生发夹环经修饰的ITR。
在一个非限制性实例中，左和右ITR-6(SEQ ID NO:111和112)在来自AAV2的野生型ITR的B-B'和C-C'臂中包括40个核苷酸缺失。经修饰的ITR中剩余的核苷酸预测可形成单个发夹结构。展开结构的吉布斯自由能(Gibbs free energy)是约-54.4千卡/摩尔。还可以对ITR产生其它修饰，包括功能Rep结合位点或Trs位点的任选缺失。
实例3：经由寡核苷酸构建来产生ceDNA
使用涉及组装不同寡核苷酸的合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实例3中，其中ceDNA载体是通过合成5'寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸并且将ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合来产生。PCT/US19/14122的图11B显示了将5'ITR寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合的示例性方法。
如本文所公开，ITR寡核苷酸能够包含WT-ITR(参见例如图3A、图3C)，或经修饰的ITR(参见例如图3B和图3D)。(还参见例如PCT/US19/14122的图6A、6B、7A和7B，所述文献全文并入本文中)。示例性ITR寡核苷酸包括(但不限于)SEQ ID NO:134-145(参见例如PCT/US19/14122的表7)。经修饰的ITR能够包括形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中的野生型ITR中的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代。通过基因修饰或生物学和/或化学合成能够产生用于无细胞合成的ITR寡核苷酸，所述ITR寡核苷酸包含如本文所述的WT-ITR或mod-ITR。如本文所论述，实例2和3中的ITR寡核苷酸能够包含WT-ITR，或呈对称或不对称构型的经修饰的ITR(mod-ITR)，如本文所论述。
实例4：经由单链DNA分子产生ceDNA
使用合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实例4中，并且其使用包含两个有义ITR的单链线性DNA，所述两个有义ITR侧接有义表达盒序列并且共价连接到与反义表达盒侧接的两个反义ITR，然后将所述单链线性DNA的末端接合以形成闭合端单链分子。一个非限制性实例包含合成和/或产生单链DNA分子、使所述分子的各部分粘接以形成具有二级结构的一个或多个碱基对区域的单一线性DNA分子，然后使自由的5'与3'端彼此接合以形成闭合的单链分子。
用于产生ceDNA载体的示例性单链DNA分子从5'至3'包括：
第一有义ITR；
有义表达盒序列；
第二有义ITR；
第二反义ITR；
反义表达盒序列；和
第一反义ITR。
实例4的示例性方法中使用的单链DNA分子能够通过本文所述的任何DNA合成方法形成，例如体外DNA合成，或如下提供：用核酸酶使DNA构建体(例如质粒)裂解且使所得dsDNA片段解链以得到ssDNA片段。
通过将温度降低到低于有义和反义序列对的解链温度计算值能够实现粘接。解链温度依赖于特定核苷酸碱基含量和所用溶液的特征，例如盐浓度。任何指定序列的解链温度和溶液组合容易由所属领域的普通技术人员计算而得。
所粘接分子的自由5'和3'端能够彼此接合，或与发夹分子接合而形成ceDNA载体。适合的示例性接合方法和发夹分子描述于实例2和3中。
实例5：ceDNA的提纯和/或产生确认
通过本文所述方法(包括例如实例1中所述的基于昆虫细胞的产生方法或实例2到4中所述的合成产生方法)产生的任一种DNA载体产物能够使用所属领域的技术人员通常已知的方法加以提纯，例如去除杂质、未使用的组分或副产物；且/或能够加以分析，从而确认所产生的DNA载体(在此情况下是ceDNA载体)是所期望的分子。用于提纯DNA载体(例如ceDNA)的示例性方法是使用Qiagen Midi Plus提纯方案(Qiagen)和/或凝胶提纯。
以下是用于确认ceDNA载体身份的示例性方法。
可以通过如图4D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
分离出的ceDNA载体的结构进一步如下分析：用根据以下所选的限制核酸内切酶消化经提纯的DNA：a)ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得片段当在0.8％变性琼脂糖凝胶上分级分离时大得足以清晰可见(>800bp)。如图4C和4D中所说明，具有非连续结构的线性DNA载体和具有线性连续结构的ceDNA载体能够根据其反应产物的尺寸区分，举例来说，具有非连续结构的DNA载体预期产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的ceDNA载体预期产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价闭合端的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价闭合的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价闭合的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。另外，由于多聚体DNA载体存在端对端连接，因此DNA载体的单体、二聚和n聚形式的消化都将解析为相同尺寸的片段(参见图4E)。
如本文所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA载体的分析”是指一种通过执行限制性核酸内切酶消化、随后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA闭合端的分析。后面是一种这样的示例性分析，尽管本领域普通技术人员将了解，对这个实例可以进行许多本领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注ceDNA载体的单切酶，其将产生DNA载体长度的大约1/3x和2/3x的产物。由此使原生凝胶与变性凝胶上的色带解析。变性之前，重要的是从样品中除去缓冲液。Qiagen PCR纯化试剂盒或脱盐“离心柱”(例如GE HEALTHCARE ILUSTRATMMICROSPINTMG-25柱)是本领域中已知用于内切核酸酶消化的一些选项。分析包括例如：i)用适当限制性核酸内切酶消化DNA；2)施加于例如Qiagen PCR纯化试剂盒，用蒸馏水洗脱；iii)添加10x变性溶液(10x＝0.5M NaOH、10mMEDTA)，添加10X染料，不缓冲，且分析，且通过在预先用1mM EDTA和200mM NaOH培育的0.8-1.0％凝胶上添加10X变性溶液直至4x来制备DNA梯，以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均一；以及在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑凝胶。本领域普通技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后，将凝胶排出并在1xTBE或TAE中中和，并转移至含1x SYBR金的蒸馏水或1x TBE/TAE。然后使用例如赛默飞世尔
Figure BDA0002629249020002011
金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000X浓缩液)和落射荧光(蓝色)或UV(312nm)能够使色带可视化。前述基于凝胶的方法通过从凝胶色带中分离出ceDNA载体且允许其复性而能够根据提纯目的调整。
产生的ceDNA载体的纯度可以使用任何本领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法，通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较，能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。举例来说，若基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带，则存在1μg ceDNA载体，且ceDNA载体是总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的色带强度相对于色带所代表的输入计算值作图，举例来说，如果总ceDNA载体是8kb，并且所切除的比较色带是2kb，则色带强度将按照总输入的25％作图，在此情况下，对于1.0μg输入，色带强度是0.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量，然后可用于测定ceDNA载体所占的总输入的百分比或纯度百分比。
实例6：从ceDNA质粒产生抗体或融合蛋白
为了证明ceDNA载体表达抗体的能力，产生编码单克隆抗体阿杜那单抗的ceDNA质粒。
阿杜那单抗是正在研究的通过靶向β-淀粉样蛋白的聚集形式而用于治疗阿尔兹海默氏病的人单克隆抗体。图6A显示了所产生的示例性质粒，其被确定为表达全长阿杜那单抗。图6B是ceDNA载体的示意图，所述ceDNA载体能够使用图6A的ceDNA质粒获得。图6B的表达盒显示了双重启动子系统，其中阿杜那单抗抗体的重链和轻链各自使用不同启动子。用于产生阿杜那单抗抗体的ceDNA质粒包括用于表达重链和轻链的启动子的独特组合，其使得重链和轻链达成正确的比率以形成功能抗体。所属领域的普通技术人员将了解如何选择所期望抗体的轻链和重链中的每一个的启动子以使得所表达的重链和/或轻链产生期望的比率，从而促进完整抗体的有效形成。
如实例1中所述制备ceDNA质粒，称为“pFBdual-ceDNA-阿杜那单抗质粒”或“ceDNA-IgG-质粒”(如图6A中所示)，且用于293细胞的瞬时转染。使293-6E细胞在无血清FreeStyleTM293表达培养基(生命技术公司(Life Technologies)，美国加州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA,USA))中生长。使细胞在锥形烧瓶(康宁有限公司(Corning Inc.)，马萨诸塞州阿克顿(Acton,MA))中、在回转式振荡器(VWR科学公司(VWR Scientific)，宾夕法尼亚州切斯特(Chester,PA))上、在37℃下、在5％CO2下维持。转染之前的一天，将细胞以适当密度接种于康宁锥形烧瓶中。转染当天，将DNA和转染试剂以最优比率混合，然后添加到含有准备转染的细胞的烧瓶中。将编码靶蛋白的重组质粒短暂转染到悬浮的293-6E细胞培养物中。转染后第2天、第4天和第5天的细胞密度和存活率列举于表13中。第2天、第4天和第5天收集的细胞培养上清液样品用于蛋白质表达评估。转染后第6天收获的细胞培养上清液用于提纯。
表13：293-6E细胞中的ceTTX-IgG1-Adu的细胞密度和存活率
样品 密度(x10<sup>6</sup>个细胞/mL) 存活率(％)
U8948CK300-1，第2天 1.80 95.36
U8948CK300-1，第4天 2.36 83.98
U8948CK300-1，第5天 2.20 72.28
抗体的表达和提纯：为估计蛋白质表达水平，在转染后第2、4和5天收集细胞培养上清液，并通过SDS-PAGE和蛋白质印迹法加以分析(数据未显示)。为了提纯蛋白质，将细胞培养液离心并过滤上清液。将过滤的上清液以1.0ml/min装载于Monofinity A树脂预堆积柱1ml(GenScript)上，随后用适当缓冲液洗涤和洗脱。合并洗脱的洗脱份，并且将缓冲液更换为pH7.2的PBS。通过SDS-PAGE(图8A)、蛋白质印迹(图8B)和SEC-HPLC(数据未示出)，使用测量分子量、产量和纯度的标准方案来分析提纯的蛋白质。
总之，在悬浮培养液中生长的293-6E细胞中，由pFBdual-ceDNA-阿杜那单抗质粒产生的ceDNA载体表达阿杜那单抗。抗体的表达水平能够使用SDS-PAGE分析辨别(图8A)。一步提纯之后，使用约55kDa和约25kDa的估计分子量、在还原条件下，且使用约150kDa的估计分子量、在非还原条件下检测抗体(图8B)。这些数据表示抗体的重链和轻链在这种系统中自组装成完整抗体。
实例7：体外大规模生产重组抗体
包含编码阿杜那单抗重链和轻链的序列的ceDNA质粒能够如前面的实例1和5所述产生并且转染到例如FreeStyleTM 293-F细胞(R790-07，生命技术公司)的大规模悬浮培养物中，所述细胞已经适于在无血清条件下生长。使适于悬浮液和无血清的FreeStyleTM293-F细胞(生命技术公司)在FreeStyleTM293表达培养基(生命技术公司)中、在具有通风帽的125mL无菌锥形烧瓶(西格玛)中、在以135rpm旋转的回转式振荡平台上、以1×105-5×105个活细胞/mL的密度培养。根据制造商说明书，含有30mL细胞(1×106个活细胞/mL)的每个125mL烧瓶用ceDNA Fugene6转染试剂(3:1Fugene6:ceDNA)转染。转染后24小时，将选择剂(50mg/mL)添加到细胞中并且使细胞以2×105-5×105个活细胞/mL之间的密度在选择剂下维持2周，随后在1L振荡烧瓶(西格玛)、1L旋转瓶(西格玛)或5L WAVE生物反应器(通用电气医疗集团(GE Healthcare))中扩增。每48小时收集样品并且通过抗人IgG ELISA测定IgG表达水平。在峰值表达下，收获培养的上清液，以1000X g离心15分钟，通过0.45mm过滤器(Sartorius)并且在0.1％叠氮化钠(西格玛)存在下在4℃下储存直到使用为止。抗体能够通过使用5mL HiTrap蛋白质-G HP柱(通用电气医疗集团)的亲和层析、使用
Figure BDA0002629249020002041
Prime系统(通用电气医疗集团)和0.2μm过滤缓冲液来提纯。举例来说，柱用10个柱体积(CV)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤缓冲液(pH 7.0)平衡并且以2mL/min的流量装载上清液，随后装载10CV的洗涤缓冲液。抗体用0.2M甘氨酸缓冲液(pH 2.3)洗脱并且收集2.5mL洗脱份置于含有用于中和的0.5mL 1M Tris-HCl pH 8.6的管中。
实例8：体外制备表达全长阿杜那单抗的ceDNA载体和表达抗体的ceDNA
表达阿杜那单抗或GFP的ceDNA质粒或ceDNA载体如实例1和5中所述、使用如实例1中制备的ceDNA Adu-完整IgG1质粒(pFBdual-ceDNA-阿杜那单抗质粒或ceDNA-IgG-质粒)(图6A)制备。基于260nm UV吸光度测定所产生且经提纯的ceDNA载体(称为“ceDNA IgG”)或ceDNA质粒的产量。使用LipofectamineTM3000转染试剂(英杰公司(Invitrogen))，根据制造商说明书将ceDNA载体或ceDNA质粒转染到HEK293T细胞中。72小时之后，将细胞溶解于RIPA缓冲液中，收集全细胞上清液且使用过滤器(Amicon)浓缩。通过蛋白质印迹检查所得抗体的产生。使细胞上清液和溶胞物样品的浓度归一化，以便装载等量的蛋白质。使所制备的样品在加热块中在70℃下沸腾10分钟，然后放在冰上。使样品在SDS-PAGE凝胶上、在200V下跑电泳32分钟，然后使用标准技术转移到硝酸纤维膜上。使用市售的人IgG作为阳性对照(Abcam，西格玛)。膜室温下用阻断缓冲液(Odyssey)阻断30分钟。通过用丽春红S染色剂将膜染色5分钟而使蛋白质色带可视化，随后用蒸馏水洗涤且用TBST脱色。然后在4℃、在轻缓搅拌下，用初级抗人IgG抗体(Genscript)与辣根过氧化酶的偶联物探测膜整夜，在阻断缓冲液中1:5000稀释。然后将印迹用TBST洗涤三次，每次5分钟，且用ECL试剂盒(SuperSignalWest Femto Substrate)显影并且使用凝胶成像系统(Syngene Box Mini)成像。
通过检查经ceDNA-GFP质粒(图9A，上图)或ceDNA-GFP载体(图9A，下图)转染的293T细胞的荧光来评估LipofectamineTM3000转染程序的转染效率。如图9A中所示，两个样品均具有显著的荧光，表明在两种情况下，转染成功。尽管每个样品中存在显著的蛋白质含量(图9B，下图)，但仅在来自经ceDNA-IgG质粒或ceDNA-IgG构建体转染的细胞的样品中检测到所表达的阿杜那单抗的存在(图9B，上图，其中重链和轻链均观察到)。这表明ceDNA载体在293T细胞中表达阿杜那单抗。
实例9：确认所表达的抗体的身份
制备包含编码阿杜那单抗的所关注核酸的质粒以便在人胚肾细胞(HEK293-6E)细胞中表达。使HEK293-6E细胞在无血清培养基(FreeStyleTM293表达培养基，赛默飞世尔科技)中生长。使细胞在锥形烧瓶中、在37℃、5％CO2下、在回转式振荡器上维持。转染之前的一天，将细胞以适当密度接种于锥形烧瓶中。转染当天，将DNA和转染试剂以最优比率混合，然后添加到含有准备转染的细胞的烧瓶中。将编码靶蛋白的重组质粒短暂转染到悬浮的HEK293-6E细胞培养物中。在第6天收集的细胞培养上清液用于提纯。
将细胞培养液离心，过滤并且以适当的流量装载到亲和纯化柱(Monofinity AResinTM预堆积柱，GenScript)上。洗涤和洗脱之后，将洗脱的洗脱份混合板蓝根且将缓冲液更换为最终的配制缓冲液。经提纯的蛋白质如下分析：(a)在还原和非还原条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(b)利用化学发光检测，使用山羊抗人IgG-HRP(GenScript)和山羊抗人κ-HRP作为初级抗体进行蛋白质印迹法；和(c)使用TSKgel G3000SWxl(东曹生物科学(Tosoh Bioscience))高效液相色谱，进行尺寸排阻色谱以测定分子量和纯度。利用A260/280吸光值测定蛋白质浓度。结果示于图10A中。HPLC分析显示单个峰(图10A)。当这种蛋白质的样品在SDS-PAGE凝胶上跑电泳(图8A)时，在非还原条件下，明显出现单个色带(泳道2)，而样品经历还原条件时，看见两个色带(泳道1)。这与蛋白质是抗体一致，其中轻链和重链亚单元在非还原条件下保持二硫键结合状态并且以单个色带形式迁移，但在还原条件下分离成其各别亚单元，所述各别亚单元以两个色带形式迁移。蛋白质印迹显示了色带图案相似(图8B)，且进一步确认了抗体的存在，原因是检测是通过对人IgG和人κ轻链具有特异性的初级抗体。
通过ELISA评估经提纯的阿杜那单抗识别其配体β-淀粉样蛋白(1-42)(“Aβ”)的能力。淀粉样蛋白在体外聚集且粘附到培养盘，随后以各种浓度和时间暴露于阿杜那单抗或对照抗体，然后进行比色暴露。合成Aβ1-42肽(AnaSpec，美国加利福尼亚州弗里蒙特(Fremont,California,USA)以1mg/ml的浓度在六氟异丙醇中复原，风干且真空浓缩以形成膜。将膜溶解于DMSO和AB42寡聚物中且通过将DMSO复原的单体在PBS中稀释成100μg/mL的浓度且在37℃下分别培育至少3天和1周来制备AB42原纤维。ELISA培养盘用聚集性淀粉样蛋白涂布。
简单来说，制备Aβ且根据Stine等人，《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》(2011)670：13-32所述的方法跑蛋白质印迹且染色。Aβ在凝胶上，在泳道3、4和5中的每一个中跑电泳的量相等。转移到硝化纤维素之后，分离每个泳道且用如下不同初级抗体探测：在泳道3中使用本文所述的经提纯的阿杜那单抗；在泳道4中使用经提纯的抗β-淀粉样蛋白(17-24)(生物联想公司(BioLegend)，纯系4G8)；且在泳道5中使用经提纯的抗β-淀粉样蛋白(1-16)(生物联想公司，纯系6E10)。洗涤之后，使用山羊抗人IgG-HRP(泳道3)(GenScript)或山羊抗小鼠IgG-HRP(泳道4和5)(GenScript)作为二级抗体探测每个泳道且使用HRP底物显影。结果示于图10B中。质粒表达的阿杜那单抗结合到硝化纤维素固定的Aβ单体，其它两种抗Aβ抗体也结合到硝化纤维素固定的Aβ单体，表明经提纯的阿杜那单抗能够识别其配体，正如所预期的那样。
实例10：抗体在野生型小鼠中的体内表达
制备具有野生型左ITR和截断的突变型右ITR且具有编码阿杜那单抗重链和轻链的转基因区域的ceDNA载体并且如上文在实例1和5中所述加以提纯(“ceDNA IgG载体”)，所述ITR各自处于其自身EF1启动子的控制下。将包含处于肝脏特异性hAAT启动子控制下的荧光素酶转基因的ceDNA IgG载体或ceDNA对照载体施用于约6周龄的雄性C57bl/6J小鼠。未囊封的ceDNA载体经由外侧尾静脉、通过流体动力学静脉内注射、以2.2mL的体积、以每个动物(每组4个动物)0.005mg给予。在第3天、第7天、第14天、第21天以及末尾第28天，从每个经处理的动物收集血液样品。使用市售Discovery人/NHP IgG试剂盒中的识别具有任何特异性的人抗体的多克隆抗人免疫球蛋白抗体，依循制造商说明书(Meso Scale Discovery)，通过ELISA测量经表达的阿杜那单抗在血清样品中的存在。
如图11中所示，在经ceDNA IgG载体处理的小鼠的第3天和第7天血清样品中容易检测到人抗体，但在经表达荧光素酶而非人抗体的ceDNA处理的小鼠中则未观察到。在此两个时间点针对这种特定载体观察到的最大血清表达水平是约500ng/mL。
实例11：抗体在阿尔兹海默病小鼠模型中的体内表达
具有编码阿杜那单抗重链和轻链的序列的ceDNA载体能够如前面的实例1和5中所述产生。ceDNA载体将用脂质纳米颗粒配制且施用于Tg2576小鼠(Kawarabayashi等人，《神经科学杂志(J.Neurosci)》21(2):372-381(2001))和正常小鼠。LNP-ceDNA载体以1.2mL的体积、以0.3与5mg/kg之间的剂量施用于相应小鼠。每次剂量经由静脉内流体动力学施用方式施用，或通过例如腹膜内注射来施用。正常小鼠施用充当对照并且还能够用于检测阿杜那单抗mAb的存在和数量。如本文和实例6中所述，分别进行体外与离体结合分析(使用聚集性淀粉样蛋白的ELISA和脑切片IHC)。
急性给药(例如单次剂量的LNP-TTX-Adu ceDNA)之后，在不同时间点，例如在10、20、30、40、50、1000和200天或更长时间，通过ELISA测定血浆和脑浓度。具体地说，将冷冻的脑在10个体积(10mL/g的湿组织)的含有50mM NaCl、0.2％二乙胺(DEA)和蛋白酶抑制剂的溶液中均质化并且在冰上声波处理约15-20秒。样品在4℃下以100,000g离心30分钟并且上清液作为DEA萃取的可溶性Αβ洗脱份保留。将剩余集结粒再悬浮于10个体积的5M胍盐酸盐(Gu-HCl)中，声波处理且如上所述进行离心。所得上清液作为胍萃取的不溶性Αβ洗脱份保留，并且丢弃剩余的集结粒。对于血浆和脑中的抗体浓度来说，96孔微量培养盘(NuncMaxisorp，Corning Costar)在4℃下用5ug/mL浓度的存在于冷涂布缓冲液中的Αβ(1-42)肽(Αβ42)涂布整夜。将血浆或DEA萃取(即，不含洗涤剂)的脑匀浆样品稀释到最终的工作浓度并且在室温下培育2小时。使用报告子抗体，例如与辣根过氧化酶(HRP)偶联的山羊抗人多克隆抗体(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))，测定结合，随后使用底物TMB测量HRP活性。通过与使用经提纯的抗体所产生的标准曲线进行比较来测定浓度。替代地，如所述使用蛋白质印迹法确认血浆中的Ab。
单次剂量之后，抗体对Tg2576小鼠中的Αβ沉积物的体内结合还能够使用生物素标记的抗人二级抗体测定，并且能够与针对连续切片离体进行的泛Αβ抗体5F3染色(作为阳性对照)进行比较。组织用福马林固定的石蜡包埋，按照5μm切片，脱蜡且能够使用基于EDTA-硼酸盐的热诱导式抗原决定基修复(Ventana CC1)。随后，能够将山羊抗人二级抗体按照1:500稀释度施加于组织并且使用苏木精将组织染色。
预期全身性施用的LNP-TTX-Adu ceDNA将在血浆和脑中表达且以高亲和力结合到实质淀粉样蛋白斑。
实例12：给予ceDNA后，关于淀粉样蛋白负荷减少的分析
长期给予Tg2576转基因小鼠之后，评估ceDNA表达的阿杜那单抗在减少淀粉样蛋白负荷方面的功效。举例来说，在指定的时间段(例如每周或每月)施用0.3、1、3、10到30mg/kg等范围内的剂量或PBS。如上文在实例8中所述，通过ELISA测量血浆和脑药物水平。最终剂量后24小时到72小时收集血浆样品，并测量抗体水平以确定剂量应答。
免疫组织化学将揭示皮质和海马体中的总脑淀粉样蛋白负荷。具体而言，将大脑解剖并且通过浸没于10％中性福尔马林缓冲液中48至72小时来固定。然后处理固定的大脑并且按照水平取向嵌埋。将每个块切片，直到鉴定出海马体为止，在此处获得300个连续5μm切片(每个载玻片3个切片)。对于6E10和硫代黄素-染色来说，每14个载玻片染色(每225μm约1个切片)。界定脑淀粉样蛋白的免疫组织化学将使用例如1:750稀释的小鼠抗Αβ1-16单克隆抗体(纯系6E10，新泽西州普林斯顿科文斯(Covance,Princeton,NJ))作为初级抗体，且使用Ultramap抗小鼠碱性磷酸酶试剂盒(Ventana Medical Systems，亚利桑那州土桑(Tucson,AZ))，且使用
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软体如本文所述进行定量。载玻片用88％甲酸溶液预处理，随后放在Ventana Discovery XT免疫染色仪上。载玻片用Ventana苏木精(Ventana Medical Systems，亚利桑那州土桑)进行对比染色，盖上盖玻片且风干整夜。
6E10免疫染色之后，使用Aperio XT(Aperio技术有限公司，加州维斯塔(Vista,CA))全载玻片成像系统，依循制造商说明书，以20x放大率扫描载玻片。然后能够评审数字影像，并且按照各别的掩码进行人工标注，然后使用VISIOPHARM'^软件编写的算法进行分析。所述算法在lOx虚拟放大率下测定出所标注的海马体或皮层的面积以及实质和血管淀粉样蛋白在这些解剖区域中的面积。例如针对一组50个载玻片来训练软体。载玻片还用硫代黄素-S(Thio-S)染色，如(Bussiere等人，《美国病理学杂志(Am J Pathol)》165:987-995(2004))中所述；并且在
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封片剂和DAPI(Vector实验室，加州伯林盖姆(Burlingame,CA))存在下盖上盖玻片。硫代黄素-S染色之后，对载玻片进行电子评审且用成像系统(例如Aperio FL(Aperio技术有限公司，加州维斯塔)荧光全载玻片成像系统)，依循制造商说明书，在20x放大率下扫描。如同6E10，海马体或皮层作为各别的掩码进行人工标注，然后使用
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软件编写的算法进行分析，且针对荧光进行调整。所述算法在1Ox虚拟放大率下测定出海马体和皮层的面积以及实质和血管淀粉样蛋白在这些解剖区域中的面积。能够针对一组10个载玻片训练软件。预期染色的沉积物所占的总面积相较于PBS对照显著减少。
实例13：体外对抗体和Fc-融合蛋白的基于ceDNA的表达
为了评估ceDNA表达除了阿杜那单抗之外的其它抗体和免疫球蛋白样分子的能力，使用两种另外的ceDNA构建体重复进行实例8中的实验：一种构建体编码基因盒中的贝伐单抗(特异性结合到血管内皮生长因子(“VEGF”)的抗体)的轻链和重链，且一种编码Fc融合蛋白阿柏西普(人IgG1 Fc与人VEGF受体1和2的胞外域的VEGF结合部分的融合体)。非还原样品的蛋白质印迹结果显示于图12中(显示了相同印迹以及6秒和12秒的不同暴露时间的两个影像)。阿杜那单抗再次在ceDNA-Adu-质粒和经ceDNA-Adu载体转染的细胞中表达，如此前已经在实例8中所发现(泳道5和7)。贝伐单抗在经ceDNA-贝伐单抗载体转染的细胞中受到类似的表达(泳道11)。阿柏西普还表达于经ceDNA-阿柏西普载体转染的细胞中(泳道9)。这表明能实现ceDNA构建体在细胞中对各种IgG和免疫球蛋白样分子的表达。
参考资料
在本说明书和本文的实施例中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，都以全文引用的方式并入本文中，如同每个单独的出版物或参考文献被明确且单独地指出像充分阐述一样，以引用的方式并入本文中一般。本申请要求优先权的任何专利申请也以上述针对出版物和参考文献的方式通过引用并入本文中。
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Claims (65)

1.一种无衣壳闭合端DNA(ceDNA)载体，其包含：
位于侧接反向末端重复序列(ITR)之间的至少一种异源核苷酸序列，其中至少一种异源核苷酸序列编码至少一种抗体和/或融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列编码抗体。
3.根据权利要求2所述的ceDNA载体，其中所述抗体是全长抗体、Fab、Fab'、单域抗体，或单链抗体(scFv)。
4.根据权利要求3所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列编码单域抗体或单链抗体。
5.根据权利要求4所述的ceDNA载体，其中所述至少一种异源核苷酸序列进一步编码位于所述单域抗体或单链抗体上游的分泌性前导序列。
6.根据权利要求1到3中任一项所述的ceDNA载体，其中第一异源核苷酸序列编码重链可变区，而第二异源核苷酸序列编码轻链可变区。
7.根据权利要求4所述的cDNA载体，其中所述第一异源核苷酸序列编码重链可变区和重链恒定区或其一部分，而所述第二异源核苷酸序列编码轻链可变区和轻链恒定区或其一部分。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的ceDNA载体，其中所述第一异源核苷酸序列和/或所述第二异源核苷酸序列进一步编码位于所述重链可变区和/或轻链可变区上游的分泌性前导序列。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的ceDNA载体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的ceDNA载体，其中所述抗体是IgG、IgA、IgD、IgM或IgE抗体。
11.根据权利要求10所述的ceDNA载体，其中所述抗体是IgG抗体。
12.根据权利要求11所述的ceDNA载体，其中所述IgG抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的ceDNA载体，其中所述抗体结合到至少一种靶标，所述靶标选自表2、3A、3B、4和5中列出的靶标。
14.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列编码融合蛋白。
15.根据权利要求14所述的ceDNA载体，其中所述至少一种异源核苷酸序列进一步编码位于所述融合蛋白上游的分泌性前导序列。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的ceDNA载体，其中所述融合蛋白包含至少一个与Fc区融合的受体胞外域。
17.根据权利要求16所述的ceDNA载体，其中所述受体胞外域是选自CTLA-4、VEGFR1、VEGFR2、LFA-3、TNFR、IL-1R1、IL-1R1、IL-1RAcP和ACVR2A的受体的胞外域。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的ceDNA载体，其中所述抗体或融合蛋白选自表1、2、3A、3B、4或5中的抗体和融合蛋白。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含一个或多个聚腺苷酸化位点。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个可操作地连接到至少一种异源核苷酸序列的启动子。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列是cDNA。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个ITR包含功能末端解析位点和Rep结合位点。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个来自病毒，所述病毒选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)。
24.根据权利要求1到23中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称或不对称的。
25.根据权利要求24所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称或基本对称的。
26.根据权利要求24所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是不对称的。
27.根据权利要求1到26中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是野生型，或其中所述ITR中的两个都是野生型。
28.根据权利要求1到27中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自不同病毒血清型。
29.根据权利要求1到28中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自表6中所示的病毒血清型对。
30.根据权利要求1到29中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个包含选自表7中的序列的序列。
31.根据权利要求1到30中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的至少一个是由野生型AAV ITR序列通过影响所述ITR的整体三维构象的缺失、添加或取代而变成。
32.根据权利要求1到31中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个来源于AAV血清型，所述AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
33.根据权利要求1到32中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是合成的。
34.根据权利要求1到33中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个不是野生型ITR，或其中所述ITR中的两个都不是野生型。
35.根据权利要求1到34中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过在选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的至少一个ITR区域中进行缺失、插入和/或取代而经修饰。
36.根据权利要求35所述的ceDNA载体，其中所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述A、A'、B、B'、C或C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
37.根据权利要求1到36中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而经修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
38.根据权利要求1到37中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而经修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
39.根据权利要求1到38中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个是通过缺失、插入和/或取代而经修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的一部分和/或通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的一部分发生缺失。
40.根据权利要求1到39中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。
41.根据权利要求1到40中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。
42.根据权利要求1到41中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。
43.根据权利要求1到42中任一项所述的ceDNA载体，其中两个ITR以使得当所述ITR相对于彼此呈反向时产生整体三维对称性的方式改变。
44.根据权利要求1到43中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个包含选自表7、9A、9B和10中的序列的序列。
45.根据权利要求1到44中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列处于至少一个调控开关的控制下。
46.根据权利要求45所述的ceDNA载体，其中至少一个调控开关是选自二进制调控开关、小分子调控开关、密码调控开关、基于核酸的调控开关、转录后调控开关、辐射控制的或超声波控制的调控开关、低氧介导的调控开关、发炎应答调控开关、剪切活化调控开关，和杀灭开关。
47.一种使抗体或融合蛋白在细胞中表达的方法，包含使所述细胞与根据权利要求1到46中任一项所述的ceDNA载体接触。
48.根据权利要求47所述的方法，其中接触的所述细胞是真核细胞。
49.根据权利要求47或权利要求48所述的方法，其中所述细胞在体外或体内。
50.根据权利要求47到49中任一项所述的方法，其中所述至少一个异源核苷酸序列为了在所述真核细胞中表达而进行密码子优化。
51.根据权利要求47到50中任一项所述的方法，其中所述抗体或融合蛋白从所述细胞中分泌。
52.根据权利要求47到50中任一项所述的方法，其中所述抗体或融合蛋白滞留于所述细胞中。
53.一种用治疗抗体或治疗性融合蛋白治疗受试者的方法，其包含向所述受试者施用根据权利要求1到46中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一种异源核苷酸序列编码所述治疗抗体或治疗性融合蛋白。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的疾病或病症：癌症、自体免疫疾病、神经退化性病症、高胆固醇血症、急性器官排斥反应、多发性硬化症、绝经后骨质疏松症、皮肤病状、哮喘或血友病。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述癌症选自实体肿瘤、软组织肉瘤、淋巴瘤和白血病。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述自体免疫疾病是选自类风湿性关节炎和克罗恩氏病。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述皮肤病状是选自牛皮癣和异位性皮肤炎。
58.根据权利要求53所述的方法，其中所述神经退化性病症是阿尔兹海默氏病。
59.一种医药组合物，其包含根据权利要求1到46中任一项所述的ceDNA载体。
60.一种细胞，其含有根据权利要求1到46中任一项所述的ceDNA载体。
61.一种组合物，其包含根据权利要求1到46中任一项所述的ceDNA载体和脂质。
62.根据权利要求61所述的组合物，其中所述脂质是脂质纳米颗粒(LNP)。
63.一种试剂盒，其包含根据权利要求1到46中任一项所述的ceDNA载体或根据权利要求61或62所述的组合物或根据权利要求60所述的细胞。
64.一种产生抗体或融合蛋白的方法，其包含在适于产生所述抗体或融合蛋白的条件下培养根据权利要求60所述的细胞。
65.根据权利要求64所述的方法，其进一步包含分离出所述抗体或融合蛋白。
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