JP2021513999A - 閉端dna(cedna)ベクターを使用した導入遺伝子の制御された発現 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法第119条(e)の下、2018年2月22日に出願された米国仮特許出願第62/633,882号、2018年2月22日に出願された同第62/633,757号、2018年2月22日に出願された同第62/633,795号、2018年10月17日に出願された同第62/746,762号の利益を主張し、各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関して使用される科学的および技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,19th Edition,published by Merck Sharp&Dohme Corp.,2011(ISBN 978−0−911910−19−3)、Robert S.Porter et al.(eds.),Fields Virology,6th Edition,published by Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,USA(2013),Knipe,D.M.and Howley,P.M.(ed.),The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine,published by Blackwell Science Ltd.,1999−2012(ISBN 9783527600908)、およびRobert A.Meyers(ed.),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,published by VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1−56081−569−8)、Immunology by Werner Luttmann,published by Elsevier,2006、Janeway‘s Immunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(eds.),Taylor&Francis Limited,2014(ISBN 0815345305,9780815345305)、Lewin’s Genes XI,published by Jones&Bartlett Publishers,2014(ISBN−1449659055)、Michael Richard Green and Joseph Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN 1936113414)、Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,New York,USA(2012)(ISBN 044460149X)、Laboratory Methods in Enzymology:DNA,Jon Lorsch(ed.)Elsevier,2013(ISBN 0124199542)、Current Protocols in Molecular Biology(CPMB),Frederick M.Ausubel(ed.),John Wiley and Sons,2014(ISBN 047150338X,9780471503385),Current Protocols in Protein Science(CPPS),John E.Coligan(ed.),John Wiley and Sons,Inc.,2005、およびCurrent Protocols in Immunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan M Shevach,Warren Strobe,(eds.)John Wiley and Sons,Inc.,2003(ISBN 0471142735,9780471142737)に見出すことができ、これらの内容はすべて、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書では、(i)所定の期間にわたる導入遺伝子の持続的発現レベル(すなわち、導入遺伝子発現レベルを維持する)、または(ii)用量依存的な様式での導入遺伝子の発現レベルを増加させるかのいずれかを可能にする、インビボまたはインビトロでのceDNAベクターの投与の方法が説明され、この方法は、ceDNAベクターの少なくとも1回(例えば、1回以上)の後続の投与(例えば、「ブースター」または「再用量」投与)を含む。
(i)制御された導入遺伝子発現:ceDNAベクターの再投与による持続的な導入遺伝子発現
本明細書に記載される技術の一態様は、細胞における導入遺伝子の発現レベルを維持または持続させるための方法における、本明細書に開示されるようなceDNAベクターの使用に関し、この方法は、(a)第1の時点で、プライミング用量のceDNAベクターを細胞に投与して、導入遺伝子の発現を達成することと、(b)第1の時点でのceDNAベクター投与後、第2の時点で、ある用量のceDNAベクターを細胞に投与して、導入遺伝子の発現レベルの任意の減少を補償することと、を含む。
発現レベルが経時的に低下した場合に導入遺伝子発現のレベルを単に増加させる(例えば、所望の所定レベルで導入遺伝子発現を継続または維持する)ためのceDNAベクターの再用量投与に加えて、いくつかの実施形態では、ceDNAベクターの再投与の方法および組成物は、用量依存的な様式で導入遺伝子のレベルを増加させることができ、すなわち、規定量のceDNAベクターの再用量投与は、導入遺伝子の発現レベルの規定された増加をもたらし得る。言い換えると、単なる例示の目的で任意の単位を使用して、再用量投与における1単位用量のceDNAは、前のレベルから導入遺伝子発現のレベルの10%増加を達成し、2単位用量のcDNAベクターは、前のレベルから導入遺伝子のレベルの20%増加を達成し、0.5単位用量のceDNAは、前のレベルから導入遺伝子の発現レベルの5%増加を達成する。
本明細書に開示されるようなceDNAベクターからの導入遺伝子の発現レベルは、初回投与後1回以上のceDNAベクターの再投与(すなわち、再用量)によって、前のレベル(0日目の前のプライミング投与または前の再用量から達成された発現レベル)から増加させることができる。典型的には、発現レベルを所望のレベルまたは所望の発現レベル範囲に増加させるための再用量投与は、発現の増加が所望される約7日前、または7日以上前に投与される。例示的な実施例として、導入遺伝子発現レベルの増加が、前の投与(すなわち、プライミングまたは前の再用量投与)の約30日後に望まれる場合、再用量を28日以前に与えることができる。同様に、導入遺伝子発現の増加が、前の投与(すなわち、プライミングまたは前の再用量投与)の約90日(または約3ヶ月)後に望まれる場合、90日またはその付近で導入遺伝子の発現レベルを所望のレベルまたは所望の発現レベル範囲内に増加させるために、再用量を約83日または84日以前に投与することができ、所望のレベルまたは所望の発現レベル範囲は、前の投与で達成された導入遺伝子発現レベルを超える。
いくつかの実施形態では、所望の導入遺伝子発現レベル(所望の発現レベルの範囲もしくは導入遺伝子の所望の発現レベル範囲とも称される)は、疾患の症状を効果的に治療または低減するための治療有効量の導入遺伝子であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、そのような治療有効量の導入遺伝子を達成するために、本明細書に記載されるような1回以上の再用量投与を使用して、本明細書に開示されるように、導入遺伝子の発現レベルを維持し、かつ/または導入遺伝子の発現レベルを増加させて、レベルを導入遺伝子の治療有効量まで増分的に増加させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、所望の発現レベルで、典型的には、低い発現レベル(すなわち、治療有効量以下)で導入遺伝子を発現するプライミング用量のceDNAベクターを対象に投与することができ、1回以上の用量依存的再用量投与を、ある期間にわたって対象に投与して、所望の治療効果が達成されるまで、発現レベルを増加させることができる。そのような戦略により、対象の身体を発現された導入遺伝子のレベルに調整することを可能にし、効果的に、少なくとも1回またはそれ以上の用量依存的再用量投与で(すなわち、少なくとも2つ以上の増分で)導入遺伝子の発現レベルをタイトレーションまたは調整して(この場合は増加させる)、所望の治療目標または効果に到達し、かつ/または導入遺伝子の過剰発現に起因する過剰投薬および/もしくは副作用を予防するのを可能にする。代替として、いくつかの実施形態では、対象が幼児または子供である場合に所望の発現レベル、典型的には低い発現レベルで導入遺伝子を発現するプライミング用量のceDNAベクターを対象に投与することができ、治療効果が維持されるように、対象が成長して発現レベルを増加させるにつれて、1回以上の用量依存的再用量投与を、ある期間にわたって対象に投与することができる。同様に、いくつかの実施形態では、対象において所望の発現レベルで導入遺伝子を発現するプライミング用量のceDNAベクターを対象に投与することができ、治療効果が維持されるように、対象が体重増加等して発現レベルを増加させるにつれて、1回以上の用量依存的再用量投与を、ある期間にわたって対象に投与することができる。
本明細書で論じられるように、本明細書に記載される方法およびceDNAベクターは、導入遺伝子発現レベルを各再用量投与である特定の量だけ増加させるために、再用量を使用して、例えば1回以上の再用量投与により段階的な様式で、個別化された遺伝医学アプローチ、すなわち、導入遺伝子発現のレベルの用量依存的タイトレーションを可能にする。そのようなものとして、再用量を使用して、導入遺伝子の発現レベルを増分でタイトレーションすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、導入遺伝子の発現レベルを毎回既定量(すなわち、各再用量)だけ増加させるために、1、2、3、4、5、もしくは6、または6以上の用量依存的再用量を投与して、前の投与で、またはこの再用量投与の前に達成された発現レベルよりも高い、所望のレベルまたは所望の発現レベル範囲まで増加させることができる。
本発明の実施形態は、本明細書で定義されるように、導入遺伝子を発現することができる、閉端直鎖状二本鎖(ceDNA)ベクターを含む方法および組成物に基づく。本明細書に記載されるceDNAベクターは、サイズによって制限されず、それにより、例えば、単一ベクターからの導入遺伝子の発現に必要なすべての構成成分の発現を可能にする。ceDNAベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である(例えば、ceDNAは、二本鎖環状分子ではない)。ceDNAベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、1時間以上37℃でエキソヌクレアーゼ消化(例えば、エキソヌクレアーゼIまたはエキソヌクレアーゼIII)に対して耐性である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなceDNAベクターは、ceDNAベクターにおける導入遺伝子、例えば、遺伝医学導入遺伝子の発現が起こり得る核に転座される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなceDNAベクターは、導入遺伝子、例えば、2つのITRの間に位置する遺伝医学導入遺伝子の発現が起こり得る核に転座した。
本明細書に開示されているように、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターは、2つの逆位末端反復(ITR)配列の間に位置付けられた導入遺伝子または異種核酸配列を含み、ITR配列は、非対称ITR対または対称もしくは実質的に対称のITR対であり得、これらの用語は本明細書で定義されるとおりである。本明細書に開示されるようなceDNAベクターは、(i)少なくとも1つのWT ITRおよび少なくとも1つの修飾型AAV逆位末端反復(mod−ITR)(例えば、非対称の修飾型ITR)、(ii)mod−ITR対が互いに対して異なる3次元空間構成を有する、2つの修飾型ITR(例えば、非対称の修飾型ITR)、または(iii)各WT−ITRが同じ3次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のWT−WT ITR対、または(iv)各mod−ITRが同じ3次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ITR対のうちのいずれかから選択されるITR配列を含み得、本開示の方法は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるceDNAベクターは、5’から3’方向に、第1のアデノ関連ウイルス(AAV)逆位末端反復(ITR)、関心対象のヌクレオチド配列(例えば、本明細書に記載される発現カセット)、および第2のAAV ITRを含み、第1のITR(5’ITR)および第2のITR(3’ITR)は、互いに対して対称または実質的に対称であり、すなわち、ceDNAベクターは、対称の3次元空間構成を有するITR配列を含み得、それによりそれらの構造は、幾何学的空間で同じ形状であるか、または3次元空間で同じA、C−C’、B−B’ループを有する。そのような実施形態では、対称のITR対、または実質的に対称のITR対は、野生型ITRではない修飾型ITR(例えば、mod−ITR)であり得る。mod−ITR対は、野生型ITRからの1つ以上の修飾を有し、互いに逆相補(逆位)である同じ配列を有し得る。代替実施形態では、修飾型ITR対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ITR対は、異なる配列を有し得るが、対応するまたは同じ対称の3次元形状を有し得る。
いくつかの実施形態では、対称のITR、または実質的に対称のITRは、本明細書に記載されるように野生型(WT−ITR)である。すなわち、両方のITRが野生型配列を有するが、必ずしも同じAAV血清型のWT−ITRである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、一方のWT−ITRは、1つのAAV血清型に由来し得、他方のWT−ITRは、異なるAAV血清型に由来し得る。そのような実施形態では、WT−ITR対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な3次元空間構成を維持しながら、1つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。
本明細書で論じられるように、ceDNAベクターは、対称ITR対または非対称ITR対を含み得る。どちらの場合も、一方または両方のITRは修飾型ITRであり得、その違いは、第1の場合(すなわち、対称mod−ITR)では、mod−ITRは、同じ3次元空間構成を有する(すなわち、同じA−A’、C−C’、およびB−B’アーム構成を有する)が、第2の場合(すなわち、非対称mod−ITR)では、mod−ITRは、異なる3次元空間構成を有する(すなわち、A−A’、C−C’、およびB−B’アームの異なる構成を有する)ことである。
(すなわち、
上記のように、本開示は、組み換えceDNA発現ベクター、および上記のような非対称ITR対、対称ITR対、または実質的に対称のITR対のうちのいずれか1つを含む導入遺伝子をコードする制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、隣接するITR配列および導入遺伝子を有する制御された導入遺伝子発現のための組み換えceDNAベクターに関し、ITR配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、または実質的に対称であり、ceDNAは、隣接するITRの間に位置する関心対象のヌクレオチド配列(例えば、導入遺伝子の核酸を含む発現カセット)をさらに含み、当該核酸分子は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている。
本明細書で定義されるような非対称のITR対または対称のITR対を含む、本明細書に記載されるようなceDNAベクターは、シス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、mir調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ITRは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書に記載されるような調節スイッチを含み、導入遺伝子、またはceDNAベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチの発現を調節する。本発明で使用され得る調節スイッチを含む調節エレメントは、国際出願第PCT/US18/49996号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)においてより完全に論じられている。
当業者は、本発明のceDNAベクターで使用されるプロモーターが、それらが促進する特定の配列に対して適切に調整されるべきであることを理解するであろう。例えば、ガイドRNAは、その機能が、未変性DNA上の特定の標的配列と二重鎖を形成して組み換え事象を発生させるため、プロモーターをまったく必要としない場合がある。対照的に、ceDNAベクターによってコードされるヌクレアーゼは、プロモーターから恩恵を受けるため、ベクターから効率的に、かつ任意に調節可能な方法で発現させることができる。
ポリアデニル化配列をコードする配列は、ceDNAベクターから発現されたmRNAを安定化するため、および核輸送および翻訳を助けるために、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクター中に含まれ得る。一実施形態では、ceDNAベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、ベクターは、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも45、少なくとも50、またはそれ以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約43ヌクレオチド、約40〜50ヌクレオチド、約40〜55ヌクレオチド、約45〜50ヌクレオチド、約35〜50ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲を含む。制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターが、例えば、抗体の制御された発現の場合に2つの導入遺伝子を含み得るいくつかの実施形態では、ceDNAベクターは、抗体重鎖(例えば、例示的な重鎖は配列番号57である)をコードする核酸と、抗体軽鎖(例えば、例示的な軽鎖は配列番号58である)をコードする核酸とを含み得、第1の導入遺伝子の3´のポリアデニル化、および第1の導入遺伝子と第2の導入遺伝子との間(例えば、抗体重鎖をコードする核酸と抗体軽鎖をコードする核酸との間)にIRES(例えば、配列番号190)が位置し得る。そのような実施形態では、2つ以上の導入遺伝子(例えば、2つまたは3つ以上)をコードする制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターは、例えば、IRES配列が、ポリアデニル化配列の3´に位置する場合、IRES(内部リボソームエントリー部位)配列(配列番号190)を含み得、それにより最初の導入遺伝子の3´に位置する2番目の導入遺伝子(例えば、抗体または抗原結合断片)が、同じceDNAベクターによって翻訳および発現され、ceDNAベクターが、ceDNAベクターによってコードされる2つ以上の導入遺伝子を発現できるようになる。
いくつかの実施形態では、RNA誘導型エンドヌクレアーゼをコードするベクターは、1つ以上の核局在化配列(NLS)、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のNLSを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のNLSは、アミノ末端またはその近く、カルボキシ末端またはその近く、またはこれらの組み合わせ(例えば、アミノ末端における1つ以上のNLSおよび/またはカルボキシ末端における1つ以上のNLS)に位置する。複数のNLSが存在する場合、各々を他のNLSから独立して選択することができ、それにより、単一のNLSが複数のコピーに、および/または1つ以上のコピーに存在する1つ以上の他のNLSと組み合わせて存在する。NLSの非限定的な例を表6に示す。
本開示のceDNAベクターは、遺伝子発現のための他の構成成分をコードするヌクレオチドを含み得る。例えば、特定の遺伝子標的事象を選択するには、保護shRNAをマイクロRNAに埋め込み、アルブミン遺伝子座などの高活性遺伝子座に部位特異的に統合するように設計された組み換えceDNAベクターに挿入することができる。そのような実施形態は、Nygaard et al.,A universal system to select gene−modified hepatocytes in vivo,Gene Therapy,June 8,2016に記載されているような任意の遺伝的背景における遺伝子修飾肝細胞のインビボ選択および拡大のための系を提供し得る。本開示のceDNAベクターは、形質転換、トランスフェクト、形質導入などされた細胞の選択を可能にする1つ以上の選択可能なマーカーを含み得る。選択可能なマーカーは、その産生物が殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養性、NeoR等を提供する遺伝子である。ある特定の実施形態では、正の選択マーカーが、NeoRなどのドナー配列に組み込まれる。負の選択マーカーは、ドナー配列の下流に組み込むことができ、例えば、負の選択マーカーをコードする核酸配列HSV−tkを、ドナー配列の下流の核酸構築物に組み込むことができる。
分子調節スイッチは、シグナルに反応して、状態の測定可能な変化を生成するものである。そのような調節スイッチは、本明細書に記載されるceDNAベクターと有用に組み合わせて、ceDNAベクターからの導入遺伝子の発現の出力を制御することができる。いくつかの実施形態では、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターは、導入遺伝子の発現を微調整するのに役立つ調節スイッチを含む。例えば、ceDNAベクターの生物学的封じ込め機能として役立ち得る。いくつかの実施形態では、スイッチは、ceDNAベクターにおける関心対象の遺伝子の、制御可能かつ調節可能な発現を開始または停止(すなわち、シャットダウン)するように設計された「オン/オフ」スイッチである。いくつかの実施形態では、スイッチは、一旦スイッチが起動されると、ceDNAベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」を含み得る。制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターでの使用に含まれる例示的な調節スイッチは、導入遺伝子の発現を調節するために使用することができ、国際出願第PCT/US18/49996号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)においてより完全に論じられている。
いくつかの実施形態では、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターは、導入遺伝子の発現を制御可能に調整するのに役立ち得る調節スイッチを含む。例えば、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターのITRの間に位置する発現カセットは、追加として、関心対象の遺伝子に操作可能に連結された調節領域、例えば、プロモーター、シスエレメント、リプレッサー、エンハンサー等を含み得、この調節領域は、1つ以上の共因子または外因性薬剤によって調節される。単なる例として、調節領域は、小分子スイッチまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターによって調節され得る。誘導性プロモーターの非限定例は、ホルモン誘導性または金属誘導性プロモーターである。他の例示的な誘導性プロモーター/エンハンサーエレメントとしては、RU486誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
様々な当該技術分野において既知の小分子系調節スイッチは、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示されるceDNAベクターと組み合わせて、調節スイッチによって制御されるceDNAベクターを形成することができる。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、直交リガンド/核受容体対、例えば、レチノイド受容体変異形/LG335およびGRQCIMFI(Taylor,et al.BMC Biotechnology 10(2010):15に開示されているものなどの、操作可能に連結された導入遺伝子の発現を制御する人工プロモーターとともに);操作されたステロイド受容体、例えば、プロゲステロンに結合することはできないが、RU486(ミフェプリストン)には結合するC末端切断を有する修飾型プロゲステロン受容体(米国特許第5,364,791号);Drosophilaからのエクジソン受容体およびそれらのエクジステロイドリガンド(Saez,et al.,PNAS,97(26)(2000),14512−14517)、またはSando R 3rd;Nat Methods.2013,10(11):1085−8に開示されるような抗生物質トリメトプリム(TMP)によって制御されるスイッチのうちのいずれか1つまたは組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターによって発現される導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第8,771,679号および同第6,339,070号に開示されているものなどのプロドラッグ活性化スイッチである。
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、「パスコードスイッチ」または「パスコード回路」であり得る。パスコードスイッチは、特定の条件が起こったときに、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターからの導入遺伝子の発現の制御の微調整を可能にする、すなわち、導入遺伝子の発現および/または抑制が起こるためには、条件の組み合わせが存在する必要がある。例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも条件AおよびBが起こらなければならない。パスコード調節スイッチは、任意の数の条件であり得、例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも2、または少なくとも3、または少なくとも4、または少なくとも5、または少なくとも6、または少なくとも7、またはそれ以上の条件が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも2つの条件(例えば、A、B条件)が起こる必要があり、いくつかの実施形態では、少なくとも3つの条件が起こる必要がある(例えば、A、B、およびCまたはA、B、およびD)。単なる例として、パスコード「ABC」調節スイッチを有するceDNAからの遺伝子発現が起こるためには、条件A、B、およびCが存在しなければならない。条件A、B、およびCは、以下のとおりであり得る。条件Aは、病態または疾患の存在であり、条件Bは、ホルモン反応であり、条件Cは、導入遺伝子の発現に対する反応である。例えば、導入遺伝子が欠陥EPO遺伝子を編集する場合、条件Aは、慢性腎疾患(CKD)の存在であり、条件Bは、対象が腎臓中に低酸素状態を有する場合に起こり、条件Cは、腎臓中のエリスロポエチン産生細胞(EPC)動員が不全であるか、または代替としてHIF−2活性化が不全である。一旦酸素レベルが増加するか、または所望のEPOレベルに達すると、導入遺伝子は、3つの条件が起こるまで再度オフになり、オンに戻る。
いくつかの実施形態では、ceDNAによって発現された導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、核酸系制御機序に基づく。例示的な核酸制御機序は、当該技術分野において既知であり、使用が想定される。例えば、そのような機序としては、リボスイッチ、例えば、US2009/0305253、US2008/0269258、US2017/0204477、WO2018/026762A1、米国特許第9,222,093号、および欧州特許出願第EP288071号に開示されるもの、またVilla JK et al.,Microbiol Spectr.2018 May;6(3)によるレビューに開示されるものなどが挙げられる。WO2018/075486およびWO2017/147585に開示されるものなどの、代謝物反応性転写バイオセンサーもまた含まれる。使用が想定される他の当該技術分野において既知の機序としては、siRNAまたはRNAi分子(例えば、miR、shRNA)による導入遺伝子のサイレンシングが挙げられる。例えば、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターは、ceDNAベクターによって発現される導入遺伝子に対して相補的であるRNAi分子をコードする調節スイッチを含み得る。導入遺伝子は、ceDNAベクターによって発現されたとしてもそのようなRNAiが発現される場合、相補的RNAi分子によってサイレンシングされ、導入遺伝子がceDNAベクターによって発現されたときにRNAiが発現されない場合、導入遺伝子は、RNAiによってサイレンシングされない。
いくつかの実施形態では、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための調節スイッチは、転写後修飾系である。例えば、そのような調節スイッチは、US2018/0119156、GB2011/07768、WO2001/064956A3、欧州特許第2707487号、およびBeilstein et al.,ACS Synth.Biol.,2015,4(5),pp 526−534、Zhong et al.,Elife.2016 Nov 2;5.pii:e18858に開示されているように、テトラサイクリンまたはテオフィリンに感受性であるアプタザイムリボスイッチであり得る。いくつかの実施形態では、当業者であれば、導入遺伝子、およびリガンド感受性(オフスイッチ)アプタマーを含有し、その最終結果がリガンド感受性オンスイッチである、阻害性siRNAの両方をコードすることができると想定される。
任意の既知の調節スイッチをceDNAベクター中で使用して、環境変化によってトリガーされるものを含む、ceDNAベクターによって発現された導入遺伝子の遺伝子発現を制御することができる。追加の例としては、Suzuki et al.,Scientific Reports 8;10051(2018)のBOC方法、遺伝子コード拡張および非生理的アミノ酸、放射線制御型または超音波制御型オン/オフスイッチが挙げられるが、これらに限定されない(例えば、Scott S et al.,Gene Ther.2000 Jul;7(13):1121−5、米国特許第5,612,318号、同第5,571,797号、同第5,770,581号、同第5,817,636号、およびWO1999/025385A1を参照)。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許第7,840,263号、US2007/0190028A1に開示されている、埋め込み可能な系によって制御され、遺伝子発現は、ceDNAベクター中の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを活性化する電磁エネルギーを含む、1つ以上のエネルギー形態によって制御される。
本発明の他の実施形態は、キルスイッチを含む、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターに関する。本明細書に開示されるキルスイッチは、ceDNAベクターを含む細胞が殺滅されるか、または導入されたceDNAベクターを対象の系から永久に除去する手段としてプログラム細胞死を受けるようにすることができる。本発明のceDNAベクターにおけるキルスイッチの使用が、通常は、対象が許容可能に喪失し得る限定数の細胞、またはアポトーシスが望ましい細胞型(例えば、癌細胞)へのceDNAベクターの標的と結びつけられることは、当業者によって理解されるであろう。すべての態様では、本明細書に開示される「キルスイッチ」は、入力生存シグナルまたは他の指定条件の非存在下でceDNAベクターを含む細胞の急速かつロバストな細胞殺滅をもたらすように設計される。言い換えれば、本明細書においてceDNAベクターによりコードされるキルスイッチは、ceDNAベクターを含む細胞の細胞生存を、特定の入力シグナルによって定義される環境に制限し得る。そのようなキルスイッチは、対象からceDNAベクターを除去すること、またはコードされた導入遺伝子を発現しないことを保証することが望ましいときに、生物学的封じ込め機能として役立つ。
A.一般的な産生
本明細書で定義されるような非対称ITR対または対称ITR対を含む、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターのある特定の産生方法は、2018年9月7日に提出された国際出願第PCT/US18/49996号のセクションIVに記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような方法および組成物で使用するための制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターは、本明細書に記載されるように、昆虫細胞を使用して産生され得る。anterlative実施形態では、本明細書に開示されるような方法または組成物で使用するためのは、2019年1月18日に提出された国際出願第PCT/US19/14122号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に開示されているように、合成的に、またいくつかの実施形態では無細胞法で産生することができる。
ceDNA−プラスミドは、ceDNAベクターの後期産生に使用されるプラスミドである。いくつかの実施形態では、ceDNA−プラスミドは、転写方向の操作可能に連結された構成成分として、少なくとも(1)5’ITR配列、(2)シス調節エレメントを含有する発現カセット、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサー等、および(3)修飾型3’ITR配列(3’ITR配列は、5’ITR配列に対して非対称である)を提供する既知の技法を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、ITRによって隣接された発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、AAVゲノムのrepおよびcapコード領域を置き換える。
カプシド不含ceDNAベクターを作製するための方法、特にインビボ実験に十分なベクターを提供するために十分に高い収率を有する方法もまた、本明細書に提供される。
制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターの産生において使用される宿主細胞株は、Spodoptera frugiperda(Sf9、Sf21など)もしくはTrichoplusia ni細胞に由来する昆虫細胞株、または他の無脊椎動物、脊椎動物、もしくは哺乳類細胞を含む他の真核細胞株を含み得る。熟練者に既知の他の細胞株、例えば、HEK293、Huh−7、HeLa、HepG2、HeplA、911、CHO、COS、MeWo、NIH3T3、A549、HT1 180、単球、ならびに成熟および未成熟樹状細胞を使用することもできる。宿主細胞株は、高収率のceDNAベクター産生のために、ceDNA−プラスミドの安定した発現のためにトランスフェクトされ得る。
ceDNAベクターを入手し、単離するためのプロセスの例は、図4A〜4Eおよび下記の特定の実施例に記載されている。本明細書に開示されるceDNA−ベクターは、AAV Repタンパク質(複数可)を発現するプロデューサー細胞から取得され、ceDNA−プラスミド、ceDNA−バクミド、またはceDNA−バキュロウイルスでさらに形質転換され得る。ceDNAベクターの産生に有用なプラスミドには、1つ以上のRepタンパク質を組み込むプラスミド、およびceDNAベクターを取得するために使用されるプラスミドが含まれる。導入遺伝子の制御された発現のためのceDNAベクターの産生のための例示的なプラスミドは、2018年12月6日に出願された国際出願第PCT/US2018/064242号(その全体が本明細書に組み込まれる)の図6Bに示されるプラスミドである。抗体の制御された発現のためのceDNAベクターの産生のためのceDNAプラスミドは、図6Aに開示されており、アデュカヌマブの産生のための例示的なceDNAプラスミドを開示している2019年2月14日に出願された国際出願第PCT/US19/18016号の配列番号56である。
別の態様では、薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、閉端DNAベクター、例えば本明細書に記載されるような合成プロセスを使用して産生された制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクター、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターは、エキソソームにパッケージ化されることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生したs細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、BおよびTリンパ球、マスト細胞(MC)、ならびに樹状細胞(DC)を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態では、10nm〜1μm、20nm〜500nm、30nm〜250nm、50nm〜100nmの直径を有するエキソソームが、使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、または特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本発明のカプシド不含AAVベクターを含有するエキソソームを産生することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターは、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Tam et al.(2013).Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery.Pharmaceuticals 5(3):498−507によって開示されているイオン化アミノ脂質(例えば、ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート、DLin−MC3−DMA、ホスファチジルコリン(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン、DSPC)、コレステロール、およびコート脂質(ポリエチレングリコール−ジミリストールグリセロール、PEG−DMG)を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるような制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターは、複合される(例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤に共有結合される)。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物(例えば、コレステロール、トコフェロール等)、細胞貫通ペプチド(CPP)(例えば、ペネトラチン、TAT、Syn1B等)、およびポリアミン(例えば、スペルミン)に複合され得る。細胞取り込みを増加させる薬剤のさらなる例は、例えば、Winkler(2013).Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications.Ther.Deliv.4(7);791−809に開示されている。
代替として、本明細書に開示されるような制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターのナノカプセル製剤が使用され得る。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方法で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子(およそ0.1μmのサイズ)は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
本発明によるceDNAベクターは、対象中の細胞または標的器官への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも1つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物/治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分(API)を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
本発明によるceDNAベクターは、細胞、例えば、導入遺伝子の発現を必要とする細胞への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも1つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物/治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分(API)を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターは、様々な好適な方法によってインビトロまたはインビボで標的細胞に送達され得る。ceDNAベクターは、単独で適用または注入され得る。ceDNAベクターは、トランスフェクション試薬または他の物理的手段の助けなしに細胞に送達され得る。代替として、ceDNAベクターは、細胞へのDNAの進入を促進する任意の当該技術分野において既知のトランスフェクション試薬または他の当該技術分野において既知の物理的手段、例えば、リポソーム、アルコール、高ポリリジン化合物、高アルギニン化合物、リン酸カルシウム、微小胞、マイクロインジェクション、電気穿孔等を使用して送達され得る。
本明細書に記載されるような組成物およびceDNAベクターを使用して、様々な目的で標的遺伝子または導入遺伝子を発現させることができる。いくつかの実施形態では、得られる導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産生物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的RNAをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的RNAをコードする。いくつかの実施形態では、得られる導入遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態または障害の治療、予防、または改善に有用である、1つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。得られる導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象に導入され得る(例えば、発現され得る)。いくつかの実施形態では、得られる導入遺伝子は、発現の増加、遺伝子産物の活性、または遺伝子の不適切な上方調節(得られる導入遺伝子が、その発現を抑制する、または他の方法でその発現を低減させる)に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象において発現され得る。さらに他の実施形態では、得られる導入遺伝子は、未変性遺伝子の欠陥コピーを置換または補足する。導入遺伝子は、それ自体が転写される遺伝子のオープンリーディングフレームでなくてもよいことが当業者によって理解されるであろう。代わりに、それは標的遺伝子のプロモーター領域またはリプレッサー領域であり得、ceDNAベクターは、関心対象の遺伝子の発現をそのように調整する結果でそのような領域を修飾し得る。
本明細書に開示される制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターはまた、関心対象のヌクレオチド配列(例えば、導入遺伝子)を標的細胞(例えば、宿主細胞)に送達するための方法において使用され得る。この方法は、特に導入遺伝子を、それを必要とする対象の細胞に送達するため、および関心対象の疾患を治療するための方法であり得る。本発明は、導入遺伝子の発現の治療効果が生じるように、対象の細胞内のceDNAベクターにコードされる導入遺伝子、例えばタンパク質、抗体、miRNAなどの核酸などのインビボ発現を可能にする。これらの結果は、ceDNAベクター送達のインビボおよびインビトロ両方の形態で見られる。
本明細書に記載される技術はまた、開示されるceDNAベクターを作製するための方法、ならびにそれを様々な方法(例えば、原位置外、インビトロおよびインビボ適用、方法論、診断手順、ならびに/または遺伝子療法レジメン)で使用する方法を実証する。
いくつかの実施形態では、制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターは、対象の宿主細胞に導入遺伝子を送達する。いくつかの実施形態では、対象の宿主細胞は、ヒト宿主細胞であり、例えば、血液細胞、幹細胞、造血細胞、CD34+細胞、肝細胞、癌細胞、血管細胞、筋細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼もしくは網膜細胞、上皮もしくは内皮細胞、樹状細胞、線維芽細胞、または哺乳類起源の任意の他の細胞(無制限に、肝(すなわち、肝臓)細胞、肺細胞、心臓細胞、膵臓細胞、腸細胞、横隔膜細胞、腎(すなわち、腎臓)細胞、ニューロン細胞、血液細胞、骨髄細胞、もしくは遺伝子療法が企図される対象の任意の1つ以上の選択された組織を含む)が挙げられる。一態様では、対象宿主細胞は、ヒト宿主細胞である。
ceDNAベクターはまた、欠陥遺伝子の修正にも役立つ。非限定的な例として、デュシェン型筋ジストロフィーのDMD遺伝子は、本明細書に開示されるようにceDNAベクターを使用して送達することができる。
一般に、上記の説明に従って本明細書に開示されるような制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターを使用して任意の導入遺伝子を送達し、遺伝子発現に関する任意の障害に関連する症状を治療、予防、または改善することができる。例示的な病態としては、嚢胞性線維症(および他の肺の疾患)、血友病A、血友病B、サラセミア、貧血症および他の血液障害、AIDS、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇および他の神経障害、癌、糖尿病、筋ジストロフィー(例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型)、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害、網膜変性疾患(および他の眼の疾患)、ミトコンドリオパチー(例えば、レーベル遺伝性視神経症(LHON)、リー症候群、および亜急性硬化性脳炎)、ミオパチー(例えば、顔面肩甲上腕型ミオパチー(FSHD)および心筋症)、固形臓器(例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓)の疾患等が挙げられるが、これらに限定されない。.いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなceDNAベクターは、代謝障害(例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症)を有する個人の治療において有利に使用され得る。
当該技術分野で周知のアッセイを使用して、ceDNAベクターによる遺伝子送達の効率を試験することができ、インビトロおよびインビボの両方のモデルで実施され得る。ceDNAによる所望の導入遺伝子のノックインまたはノックアウトは、所望の導入遺伝子のmRNAおよびタンパク質レベルを測定することによって(例えば、逆転写PCR、ウエスタンブロット分析、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA))当業者により評価され得る。ceDNAによる核酸変更(例えば、点突然変異、DNA領域の欠失)は、ゲノム標的DNAのディープシーケンシングによって評価することができる。一実施形態では、ceDNAは、例えば、蛍光顕微鏡法または発光プレートリーダーによりレポータータンパク質の発現を調べることによって、所望の導入遺伝子の発現を評価するために使用できるレポータータンパク質を含む。インビボ適用の場合、タンパク質機能アッセイを使用して、所与の遺伝子および/または遺伝子産物の機能を試験して、遺伝子発現が成功したかどうかを判断することができる。例えば、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子遺伝子(CFTR)の点突然変異は、アニオン(例えば、Cl−)をアニオンチャネルを介して移動させるCFTRの能力を阻害し、機能的(すなわち非突然変異型)CFTR遺伝子をceDNAベクターとともに対象に送達することによって訂正され得ることが想定される。ceDNAベクターの投与後、当業者は、アニオンがアニオンチャネルを通って移動する能力を評価して、CFTR遺伝子が送達および発現されたかどうかを決定することができる。当業者は、インビトロまたはインビボでタンパク質の機能性を測定するための最良の試験を決定することができるであろう。
本明細書に開示される制御された導入遺伝子発現のためのceDNAベクターの例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入(例えば、エアロゾルを介した)、頬側(例えば、舌下)、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内(または卵内)、非経口(例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内[骨格、横隔膜、および/または心筋への投与を含む]、胸膜内、脳内、および動脈内)、局所(例えば、気道表面を含む皮膚および粘膜表面への、ならびに経皮投与)、リンパ内等、ならびに直接組織または器官注入(例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜、筋肉、もしくは脳への)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、細胞を対象から除去し、ceDNAベクターをその中に導入した後、細胞を対象に戻す。エクスビボでの治療のために対象から細胞を除去し、続いて対象に戻す方法は、当該技術分野において既知である(例えば、米国特許第5,399,346号を参照されたく、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。代替として、ceDNAベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、または任意の他の好適な源からの細胞中に導入され、これらの細胞は、それを必要とする対象に投与される。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単位剤形で便宜的に提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の1つ以上の投与経路に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、蒸発器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、または舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と複合され得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となる。
本明細書に提供される組成物およびceDNAベクターを使用して、上記のような様々な目的のために導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、タンパク質をコードするか、または機能的RNAであり得、いくつかの実施形態では、研究目的、例えば、1つ以上の突然変異を有する体細胞トランスジェニック動物モデルを創り出すため、例えば、標的遺伝子の機能を研究するために修飾されたタンパク質または機能的RNAであり得る。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを創り出すためにタンパク質または機能的RNAをコードする。
1.以前の発現レベルから導入遺伝子の発現レベルを増加させるために再投与され得るceDNAベクターを含む組成物であって、ceDNAが、プロモーターに操作可能に連結された導入遺伝子ポリヌクレオチド配列に隣接する非対称または対称ITR配列を含み、ITRのうちの少なくとも1つが、複製能を有するITRである、組成物。
2.ceDNAベクターが、少なくとも42日、少なくとも84日、および少なくとも132日から選択される期間にわたって導入遺伝子を発現する、パラグラフ1に記載の組成物。
3.導入遺伝子が、核酸、阻害剤、ペプチドまたはポリペプチド、抗体もしくは抗体断片、融合タンパク質、抗原、アンタゴニスト、アゴニスト、またはRNAi分子のうちのいずれかから選択される遺伝医学である、パラグラフ1に記載の組成物。
4.細胞における導入遺伝子の発現レベルを増加させるための方法であって、方法が、
a.第1の時点でプライミング用量の組成物を細胞に投与して、異種核酸配列の発現を達成することと、
b.第2の時点で、ある用量の組成物を細胞に投与して、異種核酸配列の発現レベルを、第1の時点での組成物の投与後に達成される異種核酸の発現レベルと比較して増加させるか、または異種核酸配列の発現レベルを増加させて、所望の発現レベルを達成することと、を含み、
第1および第2の時点で投与される組成物が、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を含み、ceDNAベクターが、2つの非対称または対称のAAV逆位末端反復配列(ITR)の間に操作可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ITRの一方が、機能的AAV末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRの一方が、他方のITRに対して欠失、挿入、または置換を含み、
ceDNAが、ceDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化されたとき、非変性ゲル上で分析されたときの直鎖状で非連続的なDNA対照と比較して、直鎖状の連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を有する、方法。
5.2つの非対称または対称の逆位末端反復配列(ITR)が、AAV ITRである、パラグラフ4に記載の方法。
6.機能的末端分解部位およびRep結合部位を含むを含むITRが、野生型AAV ITRである、パラグラフ4または5に記載の方法。
7.AAV ITRが、AAV−2 ITRである、パラグラフ4〜6のいずれかに記載の方法。
8.2つの非対称または対称ITRが、(i)配列番号1および配列番号4、ならびに(ii)配列番号3および配列番号2からなる群から選択される一対のITRである、パラグラフ4〜7のいずれかに記載の方法。
9.ceDNAベクターが、薬学的に許容される担体および/または賦形剤と組み合わせて投与される、パラグラフ4〜8のいずれかに記載の方法。
10.第2の時点が、第1の時点後少なくとも30日、または少なくとも60日、または60〜90日、または90〜120日、または約3〜6ヶ月である、パラグラフ4〜9のいずれかに記載の方法。
11.異種核酸配列が、治療用導入遺伝子をコードし、導入遺伝子の所望の発現レベルが、治療有効量である、パラグラフ4〜10のいずれかに記載の方法。
12.ceDNAベクターが、ベクターポリヌクレオチドから得られ、ベクターポリヌクレオチドが、2つの非対称または対称の逆位末端反復配列(ITR)の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードし、ITRのうちの少なくとも1つが、機能的末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRのうちの1つが、他のITRと比較して、欠失、挿入、または置換を含み、Repタンパク質の存在が、昆虫細胞におけるベクターポリヌクレオチドの複製およびDNAベクターの産生を誘導し、DNAベクターが、
a.Repタンパク質の存在下、昆虫細胞内でカプシド不含非ウイルス性DNAベクターの産生を誘導するのに有効な条件下および十分な時間にわたって、ウイルスカプシドコード配列を欠くベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、昆虫細胞が、昆虫細胞内にカプシド不含非ウイルス性DNAの産生を含まない、ステップと、
b.カプシド不含非ウイルス性DNAを昆虫細胞から採取し、分離するステップと、を含むプロセスから取得可能であり、
昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性DNAの存在が、昆虫細胞から単離されたDNAをDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたDNA材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なDNAと比較して特徴的な直鎖状で連続的なDNAのバンドの存在を確認することによって確認され得る、パラグラフ4〜11のいずれかに記載の方法。
13.第2の時点後の1つ以上の時点で、ある用量の組成物を細胞に投与して、異種核酸配列の発現レベルを、第2の時点もしくは以前の時点での組成物の投与後に達成される異種核酸の発現レベルと比較して増加させるか、または異種核酸配列の発現レベルを増加させて、所望の発現レベルを達成することをさらに含み、
第2の時点後の1つ以上の時点で投与される組成物が、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を含み、ceDNAベクターが、2つの非対称または対称のAAV逆位末端反復配列(ITR)の間に操作可能に位置付けられる導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ITRの一方が、機能的AAV末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRの一方が、他方のITRに対して欠失、挿入、または置換を含み、
ceDNAが、ceDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化されたとき、非変性ゲル上で分析されたときの直鎖状で非連続的なDNA対照と比較して、直鎖状の連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を有する、パラグラフ4〜11のいずれかに記載の方法。
14.第1、第2、または任意の後続の時点のうちのいずれかで投与されるceDNAベクターが、薬学的に許容される担体および/または賦形剤と組み合わせて投与される、パラグラフ4〜13のいずれかに記載の方法。
15.第1、第2、または任意の後続の時点で投与されるceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子を含む同じceDNAベクターである、パラグラフ1〜14のいずれかに記載の方法。
16.第1、第2、または任意の後続の時点で投与されるceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子を含む異なるceDNAベクターである、パラグラフ1〜15のいずれかに記載の方法。
17.異なるceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子に操作可能に連結された異なるプロモーターを有する、パラグラフ16に記載の方法。
18.導入遺伝子が、遺伝医学である、パラグラフ1〜17のいずれかに記載の方法。
19.対象における疾患を治療するための方法であって、方法が、
a.第1の時点で、異種核酸配列の発現を達成するために共有結合性閉端(ceDNA)を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクターを含む組成物のプライミング用量を対象に投与することと、
b.第2の時点で、共有結合性閉端(ceDNA)を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクターを含む、ある用量の組成物を対象に投与して、異種核酸配列の発現レベルを、第1の時点での組成物の投与後に達成される異種核酸の発現レベルと比較して増加させるか、または異種核酸配列の発現レベルを増加させて、所望の発現レベルを達成し、それにより対象における疾患を治療することと、を含み、
第1および第2の時点で投与されるceDNAベクターが、2つの非対称または対称のAAV逆位末端反復配列(ITR)の間に操作可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ITRの一方が、機能的AAV末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRの一方が、他方のITRに対して欠失、挿入、または置換を含み、
ceDNAベクターが、ceDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化されたとき、非変性ゲル上で分析されたときの直鎖状で非連続的なDNA対照と比較して、直鎖状の連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を有する、方法。
20.2つの非対称または対称の逆位末端反復配列(ITR)が、AAV ITRである、パラグラフ19に記載の方法。
21.機能的末端分解部位およびRep結合部位を含むITRが、野生型AAV ITRである、パラグラフ19または20に記載の方法。
22.AAV ITRが、AAV−2 ITRである、パラグラフ19〜21のいずれかに記載の方法。
23.2つの非対称ITRが、(i)配列番号1および配列番号4、ならびに(ii)配列番号3および配列番号2からなる群から選択される一対のITRである、パラグラフ19〜22のいずれかに記載の方法。
24.ceDNAベクターが、薬学的に許容される担体および/または賦形剤と組み合わせて投与される、パラグラフ19〜23のいずれかに記載の方法。
25.第2の時点が、第1の時点後少なくとも30日、または少なくとも60日、または60〜90日、または90〜120日、または約3〜6ヶ月である、パラグラフ19〜24のいずれかに記載の方法。
26.第2の時点での組成物の投与後に達成される導入遺伝子の所望の発現レベルが、導入遺伝子の治療有効量である、パラグラフ19〜25のいずれかに記載の方法。
27.第2の時点後の1つ以上の時点で、ceDNAベクターを含むある用量の組成物を対象に投与して、異種核酸配列の発現レベルを、第2の時点もしくは以前の時点での組成物の投与後に達成される異種核酸の発現レベルと比較して増加させるか、または異種核酸配列の発現レベルを所望の発現レベルまで増加させることをさらに含み、
第2の時点後の1つ以上の時点で投与される組成物が、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を含み、ceDNAベクターが、2つの非対称または対称のAAV逆位末端反復配列(ITR)の間に操作可能に位置付けられる導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ITRの一方が、機能的AAV末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRの一方が、他方のITRに対して欠失、挿入、または置換を含み、
ceDNAが、ceDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化されたとき、非変性ゲル上で分析されたときの直鎖状で非連続的なDNA対照と比較して、直鎖状の連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を有する、パラグラフ19〜26のいずれかに記載の方法。
28.第2の時点後の1つ以上の時点での組成物の投与後に達成される導入遺伝子の所望の発現レベルが、導入遺伝子の治療有効量である、パラグラフ19〜27のいずれかに記載の方法。
29.ceDNAベクターが、第1、第2、または任意の後続の時点で投与され、薬学的に許容される担体とともに投与される、パラグラフ19〜28のいずれかに記載の方法。
30.第2の時点後の1つ以上の時点が、先行する時点後少なくとも30日、または少なくとも60日、または60〜90日、または90〜120日、または約3〜6ヶ月である、パラグラフ19〜29のいずれかに記載の方法。
31.第1、第2、または任意の後続の時点で投与されるceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子を含む同じceDNAベクターである、パラグラフ19〜30のいずれかに記載の方法。
32.第1、第2、または任意の後続の時点で投与されるceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子を含む異なるceDNAベクターである、パラグラフ19〜30のいずれかに記載の方法。
33.異なるceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子に操作可能に連結された異なるプロモーターを有する、パラグラフ31に記載の方法。
34.ceDNAベクターが、ベクターポリヌクレオチドから得られ、ベクターポリヌクレオチドが、2つの非対称または対称の逆位末端反復配列(ITR)の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードし、ITRのうちの少なくとも1つが、機能的末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRのうちの1つが、他のITRと比較して、欠失、挿入、または置換を含み、Repタンパク質の存在が、昆虫細胞におけるベクターポリヌクレオチドの複製およびDNAベクターの産生を誘導し、DNAベクターが、
a.Repタンパク質の存在下、昆虫細胞内でカプシド不含非ウイルス性DNAベクターの産生を誘導するのに有効な条件下および十分な時間にわたって、ウイルスカプシドコード配列を欠くベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、昆虫細胞が、昆虫細胞内にカプシド不含非ウイルス性DNAの産生を含まない、ステップと、
b.カプシド不含非ウイルス性DNAを昆虫細胞から採取し、分離するステップと、を含むプロセスから取得可能であり、
昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性DNAの存在が、昆虫細胞から単離されたDNAをDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたDNA材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なDNAと比較して特徴的な直鎖状で連続的なDNAのバンドの存在を確認することによって確認され得る、パラグラフ19または33のいずれかに記載の方法。
35.導入遺伝子が、遺伝医学である、パラグラフ19〜34のいずれかに記載の方法。
36.導入遺伝子の持続的発現レベルを維持するために再投与され得るceDNAベクターを含む組成物であって、ceDNAが、プロモーターに操作可能に連結された導入遺伝子ポリヌクレオチド配列に隣接する非対称または対称ITR配列を含み、ITRのうちの少なくとも1つが、複製能を有するITRである、組成物。
37.ceDNAベクターが、少なくとも42日、少なくとも84日、および少なくとも132日から選択される期間にわたって導入遺伝子を発現する、パラグラフ36に記載の組成物。
38.導入遺伝子が、核酸、阻害剤、ペプチドまたはポリペプチド、抗体もしくは抗体断片、抗原、アンタゴニスト、アゴニスト、またはRNAi分子のうちのいずれかから選択される遺伝医学である、パラグラフ36に記載の組成物。
39.細胞における導入遺伝子の発現レベルを持続させるための方法であって、方法が、
a.第1の時点でプライミング用量の組成物を細胞に投与して、異種核酸配列の発現を達成することと、
b.第2の時点で、ある用量の組成物を細胞に投与して、第1の時点での組成物の投与後の異種核酸配列の発現レベルのいかなる低下も補償することと、を含み、
第1および第2の時点で投与される組成物が、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を含み、ceDNAベクターが、2つの非対称または対称のAAV逆位末端反復配列(ITR)の間に操作可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ITRの一方が、機能的AAV末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRの一方が、他方のITRに対して欠失、挿入、または置換を含み、
ceDNAが、ceDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化されたとき、非変性ゲル上で分析されたときの直鎖状で非連続的なDNA対照と比較して、直鎖状の連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を有する、方法。
40.2つの非対称または対称の逆位末端反復配列(ITR)が、AAV ITRである、パラグラフ39に記載の方法。
41.機能的末端分解部位およびRep結合部位を含むITRが、野生型AAV ITRである、パラグラフ39または40に記載の方法。
42.AAV ITRが、AAV−2 ITRである、パラグラフ39〜41のいずれかに記載の方法。
43.2つの非対称ITRが、(i)配列番号1および配列番号4、ならびに(ii)配列番号3および配列番号2からなる群から選択される一対のITRである、パラグラフ39〜42のいずれかに記載の方法。
44.ceDNAベクターが、薬学的に許容される担体および/または賦形剤と組み合わせて投与される、パラグラフ39〜43のいずれかに記載の方法。
45.第2の時点が、第1の時点後少なくとも30日、または少なくとも60日、または60〜90日、または90〜120日、または約3〜6ヶ月である、パラグラフ39〜44のいずれかに記載の方法。
46.異種核酸配列が、治療用導入遺伝子をコードし、導入遺伝子の持続的発現レベルが治療有効量である、パラグラフ39〜45のいずれかに記載の方法。
47.ceDNAベクターが、ベクターポリヌクレオチドから得られ、ベクターポリヌクレオチドが、2つの非対称逆位末端反復配列(ITR)の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードし、ITRのうちの少なくとも1つが、機能的末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRのうちの1つが、他のITRと比較して、欠失、挿入、または置換を含み、Repタンパク質の存在が、昆虫細胞におけるベクターポリヌクレオチドの複製およびDNAベクターの産生を誘導し、DNAベクターが、
a.Repタンパク質の存在下、昆虫細胞内でカプシド不含非ウイルス性DNAベクターの産生を誘導するのに有効な条件下および十分な時間にわたって、ウイルスカプシドコード配列を欠くベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、昆虫細胞が、昆虫細胞内にカプシド不含非ウイルス性DNAの産生を含まない、ステップと、
b.カプシド不含非ウイルス性DNAを昆虫細胞から採取し、分離するステップと、を含むプロセスから取得可能であり、
昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性DNAの存在が、昆虫細胞から単離されたDNAをDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたDNA材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なDNAと比較して特徴的な直鎖状で連続的なDNAのバンドの存在を確認することによって確認され得る、パラグラフ39〜46のいずれかに記載の方法。
48.第2の時点後の1つ以上の時点で、さらなる用量の組成物を細胞に投与して、異種核酸配列の発現レベルを、第2の時点もしくは以前の時点での組成物の投与後に達成される異種核酸の発現レベルと比較して増加させるか、または異種核酸配列の発現レベルを増加させて、所望の持続的発現レベルを維持することをさらに含み、
第2の時点後の1つ以上の時点で投与される組成物が、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を含み、ceDNAベクターが、2つの非対称または対称のAAV逆位末端反復配列(ITR)の間に操作可能に位置付けられる導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ITRの一方が、機能的AAV末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRの一方が、他方のITRに対して欠失、挿入、または置換を含み、
ceDNAが、ceDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化されたとき、非変性ゲル上で分析されたときの直鎖状で非連続的なDNA対照と比較して、直鎖状の連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を有する、パラグラフ39〜47のいずれかに記載の方法。
49.第1、第2、または任意の後続の時点のうちのいずれかで投与されるceDNAベクターが、薬学的に許容される担体および/または賦形剤と組み合わせて投与される、パラグラフ39〜48のいずれかに記載の方法。
50.第1、第2、または任意の後続の時点で投与されるceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子を含む同じceDNAベクターである、パラグラフ39〜49のいずれかに記載の方法。
51.第1、第2、または任意の後続の時点で投与されるceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子を含む異なるceDNAベクターである、パラグラフ39〜50のいずれかに記載の方法。
52.異なるceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子に操作可能に連結された異なるプロモーターを有する、パラグラフ51に記載の方法。
53.導入遺伝子が、遺伝医学である、パラグラフ1〜52のいずれかに記載の方法。
54.対象における疾患を治療するための方法であって、方法が、
a.第1の時点で、異種核酸配列の発現を達成するために共有結合性閉端(ceDNA)を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクターを含む組成物のプライミング用量を対象に投与することと、
b.第2の時点で、共有結合性閉端(ceDNA)を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクターを含む、ある用量の組成物を対象に投与して、異種核酸配列の発現レベルを、第1の時点での組成物の投与後に達成される異種核酸の発現レベルと比較して、所望の持続レベルで維持し、それにより対象における疾患を治療することと、を含み、
第1および第2の時点で投与されるceDNAベクターが、2つの非対称または対称のAAV逆位末端反復配列(ITR)の間に操作可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ITRの一方が、機能的AAV末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRの一方が、他方のITRに対して欠失、挿入、または置換を含み、
ceDNAベクターが、ceDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化されたとき、非変性ゲル上で分析されたときの直鎖状で非連続的なDNA対照と比較して、直鎖状の連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を有する、方法。
55.2つの非対称または対称の逆位末端反復配列(ITR)が、AAV ITRである、パラグラフ54に記載の方法。
56.機能的末端分解部位およびRep結合部位を含むITRが、野生型AAV ITRである、パラグラフ54または55に記載の方法。
57.AAV ITRが、AAV−2 ITRである、パラグラフ54〜56のいずれかに記載の方法。
58.2つの非対称ITRが、(i)配列番号1および配列番号4、ならびに(ii)配列番号3および配列番号2からなる群から選択される一対のITRである、パラグラフ54〜57のいずれかに記載の方法。
59.ceDNAベクターが、薬学的に許容される担体および/または賦形剤と組み合わせて投与される、パラグラフ54〜58のいずれかに記載の方法。
60.第2の時点が、第1の時点後少なくとも30日、または少なくとも60日、または60〜90日、または90〜120日、または約3〜6ヶ月である、パラグラフ54〜59のいずれかに記載の方法。
61.第2の時点での組成物の投与後に達成される導入遺伝子の所望の発現レベルが、導入遺伝子の治療有効量である、パラグラフ54〜60のいずれかに記載の方法。
62.第2の時点後の1つ以上の時点で、ceDNAベクターを含むある用量の組成物を対象に投与して、異種核酸配列の発現レベルを、第2の時点での組成物の投与後に達成される異種核酸の発現レベルと比較して増加させ、それにより異種核酸の所望の持続的発現レベルを維持することをさらに含み、
第2の時点後の1つ以上の時点で投与される組成物が、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含DNAベクター(ceDNA)を含み、ceDNAベクターが、2つの非対称または対称のAAV逆位末端反復配列(ITR)の間に操作可能に位置付けられる導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含み、ITRの一方が、機能的AAV末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRの一方が、他方のITRに対して欠失、挿入、または置換を含み、
ceDNAが、ceDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化されたとき、非変性ゲル上で分析されたときの直鎖状で非連続的なDNA対照と比較して、直鎖状の連続的なDNAの特徴的なバンドの存在を有する、パラグラフ54〜61のいずれかに記載の方法。
63.第2の時点後の1つ以上の時点での組成物の投与後に達成される導入遺伝子の所望の発現レベルが、導入遺伝子の治療有効量である、パラグラフ54〜62のいずれかに記載の方法。
64.ceDNAベクターが、第1、第2、または任意の後続の時点で投与され、薬学的に許容される担体とともに投与される、パラグラフ54〜63のいずれかに記載の方法。
65.第2の時点後の1つ以上の時点が、先行する時点後少なくとも30日、または少なくとも60日、または60〜90日、または90〜120日、または約3〜6ヶ月である、パラグラフ54〜64のいずれかに記載の方法。
66.第1、第2、または任意の後続の時点で投与されるceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子を含む同じceDNAベクターである、パラグラフ54〜65のいずれかに記載の方法。
67.第1、第2、または任意の後続の時点で投与されるceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子を含む異なるceDNAベクターである、パラグラフ54〜65のいずれかに記載の方法。
68.異なるceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子に操作可能に連結された異なるプロモーターを有する、パラグラフ67に記載の方法。
69.ceDNAベクターが、ベクターポリヌクレオチドから得られ、ベクターポリヌクレオチドが、2つの非対称または対称の逆位末端反復配列(ITR)の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードし、ITRのうちの少なくとも1つが、機能性末端分解部位およびRep結合部位を含み、ITRのうちの1つが、他のITRと比較して、欠失、挿入、または置換を含み、Repタンパク質の存在が、昆虫細胞におけるベクターポリヌクレオチドの複製およびDNAベクターの産生を誘導し、DNAベクターが、
c.Repタンパク質の存在下、昆虫細胞内でカプシド不含非ウイルス性DNAベクターの産生を誘導するのに有効な条件下および十分な時間にわたって、ウイルスカプシドコード配列を欠くベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、昆虫細胞が、昆虫細胞内にカプシド不含非ウイルス性DNAの産生を含まない、ステップと、
d.カプシド不含非ウイルス性DNAを昆虫細胞から採取し、分離するステップと、を含むプロセスから取得可能であり、
昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性DNAの存在が、昆虫細胞から単離されたDNAをDNAベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたDNA材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なDNAと比較して特徴的な直鎖状で連続的なDNAのバンドの存在を確認することによって確認され得る、パラグラフ54〜68のいずれかに記載の方法。
70.導入遺伝子が、遺伝医学である、パラグラフ54〜69のいずれかに記載の方法。
ポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用したceDNAベクターの産生は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、PCT/US18/49996の実施例1に記載されている。例えば、本発明のceDNAベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ceDNA−プラスミド、ceDNA−バクミド、および/またはceDNA−バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Repの存在下、2つの対称ITR(ITRのうちの少なくとも1つが、野生型ITR配列に対して修飾されている)および発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ceDNAベクターを産生するように複合する。ceDNAベクター産生は、第1の、テンプレート骨格(例えば、ceDNA−プラスミド、ceDNA−バクミド、ceDNA−バキュロウイルスゲノムなど)からのテンプレートの切除(「レスキュー」)、および第2の、切除したceDNAベクターのRep媒介型複製の2つのステップを経る。
DH10Bacコンピテント細胞(MAX EFFICIENCY(登録商標)DH10Bac(商標)コンピテント細胞、Thermo Fisher)を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミドまたは制御プラスミドのいずれかで形質転換した。DH10Bac細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えceDNA−バクミドを生成した。バクミドおよびトランスポサーゼプラスミドの形質転換体および維持のために選択する抗生物質とともに、X−galおよびIPTGを含有する細菌寒天平板上のE.coli中の青白スクリーニングに基づいて(Φ80dlacZΔM15マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する)正の選択をスクリーニングすることによって、組み換えバクミドを選択した。β−ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、10mLの培地中で培養した。
図4Bを参照して、次に、(1)ceDNA−バクミドを含有する試料またはceDNA−バキュロウイルス、および(2)上記のRep−バキュロウイルスのいずれかを含有するSf9昆虫細胞培養培地を、Sf9細胞(2.5E+6細胞/mL、20mL)の新鮮な培養物に、それぞれ1:1000および1:10,000の比で添加した。次いで、細胞を25℃、130rpmで培養した。同時感染の4〜5日後に、細胞の直径および生存率が検出される。細胞直径が18〜20nmに到達し、生存性が約70〜80%であったとき、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを収集した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地(水または緩衝液のいずれか)に再懸濁する。ceDNAベクターを単離し、Qiagen MIDI PLUS(商標)精製プロトコル(Qiagen、カラムあたり0.2mgの処理された細胞ペレット質量)を使用して、細胞から精製した。
DH10Bacコンピテント細胞(MAX EFFICIENCY(登録商標)DH10Bac(商標)コンピテント細胞、Thermo Fisher)を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミドまたは制御プラスミドのいずれかで形質転換した。DH10Bac細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えceDNA−バクミドを生成した。バクミドおよびトランスポサーゼプラスミドの形質転換体および維持のために選択する抗生物質とともに、X−galおよびIPTGを含有する細菌寒天平板上のE.coli中の青白スクリーニングに基づいて(Φ80dlacZΔM15マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する)正の選択をスクリーニングすることによって、組み換えバクミドを選択した。β−ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、10mLの培地中で培養した。
次いで、(1)ceDNA−バクミドまたはceDNA−バキュロウイルスを含有する試料、および(2)上記のRep−バキュロウイルスのいずれかを含有するSf9昆虫細胞培養培地を、Sf9細胞(2.5E+6細胞/mL、20mL)の新鮮な培養物に、それぞれ1:1000および1:10,000の比で添加した。次いで、細胞を25℃、130rpmで培養した。同時感染の4〜5日後に、細胞の直径および生存率が検出される。細胞直径が18〜20nmに到達し、生存性が約70〜80%であったとき、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを収集した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地(水または緩衝液のいずれか)に再懸濁する。ceDNAベクターを単離し、Qiagen MIDI PLUS(商標)精製プロトコル(Qiagen、カラムあたり0.2mgの処理された細胞ペレット質量)を使用して、細胞から精製した。
ceDNAベクターの合成産生は、2019年1月18日に出願された国際出願第PCT/US19/14122号(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)の実施例2〜6に記載されている。二本鎖DNA分子の切除を伴う合成方法を使用してceDNAベクターを産生する1つの例示的な方法。手短に言えば、ceDNAベクターは、二本鎖DNA構築物を使用して生成され得る。例えば、PCT/US19/14122の図7A〜8Eを参照されたい。いくつかの実施形態では、二本鎖DNA構築物はceDNAプラスミドであり、例えば、2018年12月6日に出願された国際特許出願第PCT/US2018/064242号の図6を参照されたい)。
様々なオリゴヌクレオチドの集成を伴う合成方法を使用してceDNAベクターを産生する別の例示的な方法は、PCT/US19/14122の実施例3に提供されており、ceDNAベクターは、5´オリゴヌクレオチドおよび3´ITRオリゴヌクレオチドを合成し、ITRオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。PCT/US19/14122の図11Bは、5´ITRオリゴヌクレオチドおよび3´ITRオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする例示的な方法を示す。
合成方法を使用してceDNAベクターを産生する別の例示的な方法は、PCT/US19/14122の実施例4において提供され、センス発現カセット配列に隣接する2つのセンスITRを含む一本鎖DNAを使用し、アンチセンス発現カセットに隣接する2つのアンチセンスITRに共有結合し、次いで、この一本鎖の直鎖状DNAの末端をライゲーションして、閉端一本鎖分子を形成する。非限定的な一例は、一本鎖DNA分子を合成および/または産生し、分子の一部をアニーリングして、二次構造の1つ以上の塩基対合領域を有する単一の直鎖状DNA分子を形成し、次いで遊離5´および3´末端を互いにライゲーションして、閉じた一本鎖分子を形成する。
センス第1のITR、
センス発現カセット配列、
センス第2のITR、
アンチセンス第2のITR、
アンチセンス発現カセット配列、および
アンチセンス第1のITRを含む。
例えば、実施例1に記載される昆虫細胞ベースの産生方法、または実施例2〜4に記載される合成産生方法を含む、本明細書に記載される方法によって産生されたDNAベクター産物のいずれも、例えば、熟練者に一般に知られている方法を使用して、不純物、未使用成分、または副産物を除去するために精製することができ、かつ/または分析して、産生されたDNAベクター(この例では、ceDNAベクター)が所望の分子であることを確認することができる。DNAベクター、例えばceDNAの精製のための例示的な方法は、Qiagen Midi Plus精製プロトコル(Qiagen)を使用することおよび/またはゲル精製によるものである。
ceDNAベクターは、CAGプロモーター(配列番号72)および非対称ITR(例えば、5´WT−ITR(配列番号2)および3´mod−ITR(配列番号3)の間に隣接したルシフェラーゼ導入遺伝子(配列番号56)を含むceDNAプラスミドを使用して、上記の実施例1に記載される方法により産生され、異なる治療パラグラムにおいてインビボで評価された。このceDNAベクターは、実施例6〜10に記載されているすべての後続の実験で使用された。実施例6では、ceDNAベクターを精製し、脂質ナノ粒子(LNP ceDNA)で製剤化し、各CD−1(登録商標)IGSマウスの尾静脈に注入した。リポソームは、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、コレステロール、およびPEG脂質を含む脂質ナノ粒子(LNP)リポソームを形成するための4つの構成成分を含む適切な脂質ブレンドで製剤化された。
異なる脂質ナノ粒子を用いた実施例6の結果の再現性を、マウスにおいてインビボで評価した。0日目に、実施例6で使用したものとは異なるLNPに封入されたCAGプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ導入遺伝子を含むceDNAベクター、またはポリCを含むがceDNAまたはルシフェラーゼ遺伝子を欠いている同じLNPのいずれかをマウスに投与した。具体的には、およそ4週齢の雄CD−1(登録商標)マウスを、0.5mg/kgのLNP−TTX−ルシフェラーゼまたは対照LNP−ポリCの単回注入で治療し、0日目に側尾静脈から静脈内投与した。14日目に動物にルシフェリン150mg/kgを2.5mL/kgの腹腔内注入により全身投与した。ルシフェリン投与後およそ15分で、各動物をインビボ撮像システム(「IVIS」)を使用して撮像した。
別の実験では、治療された動物の肝臓内のLNP送達されたceDNAの局在を評価した。関心対象の機能的導入遺伝子を含むceDNAベクターを、実施例7で使用したものと同じLNPに封入し、静脈内注入により0.5mg/kgの用量レベルでインビボでマウスに投与した。6時間後、マウスを終了させ、肝臓試料を採取し、標準的なプロトコルを使用してホルマリン固定し、パラフィン包埋した。RNAscope(登録商標)in situハイブリダイゼーションアッセイを実施して、ceDNA導入遺伝子に特異的なプローブを使用して、組織内のceDNAベクターを可視化し、発色反応およびヘマトキシリン染色(Advanced Cell Diagnostics)を使用して検出した。図8は結果を示し、ceDNAが肝細胞に存在することを示す。
肝臓以外の組織でのceDNAベクター導入遺伝子発現の持続可能性を評価して、インビボでの眼内投与後のceDNAベクターの耐性および発現を決定した。0日目に、およそ9週齢の雄のSpraque Dawleyラットに、5μLのjetPEI(登録商標)トランスフェクション試薬(Polyplus)で製剤化されたルシフェラーゼ導入遺伝子を含むceDNAベクターまたはJetPEI(登録商標)で製剤化されたルシフェラーゼをコードするプラスミドDNAのいずれかを、いずれも0.25μg/μLの濃度で網膜下注入した。各群において4匹のラットを試験した。動物を鎮静させ、33ゲージ針を使用して、被験物質を右眼に網膜下注入した。各動物の左眼は未治療であった。注入直後、網膜下ブレブの存在を確認するために、光干渉トモグラフィーまたは眼底撮像で眼を確認した。標準的な手順に従って、ラットをブプレノルフィンおよび局所抗生物質軟膏で治療した。
ceDNAベクターの遺伝子発現カセットにコードされている導入遺伝子のうちの1つ以上が、発現したタンパク質が外来であると認識される宿主環境(例えば、細胞または対象)で発現される状況では、宿主が発現産物の望ましくない枯渇をもたらし得る適応免疫反応を開始する可能性が存在し、これは、発現の欠如と混同される可能性がある。場合によっては、これは、通常の宿主環境に対して異種であるレポーター分子で起こり得る。したがって、ceDNAベクター導入遺伝子の発現は、B細胞およびT細胞を欠くRag2マウスモデルにおいてインビボで評価されたため、ルシフェラーゼなどの非天然マウスタンパク質に対する適応免疫反応を開始しない。簡単に言うと、0日目に、c57bl/6およびRag2ノックアウトマウスに、0.5mg/kgの、ルシフェラーゼを発現するLNP封入されたceDNAベクターまたはポリC対照を尾静脈注入により静脈内投与し、21日目に、ある特定のマウスに同じLNP封入されたceDNAベクターを同じ用量レベルで再投与した。すべての試験群は、各々4匹のマウスで構成された。実施例9に記載されているように、ルシフェリン注入後に週間隔でIVIS撮像を実施した。
実施例10に記載されているように、望ましくない宿主免疫反応は、場合によっては、導入されたceDNAベクターからの1つ以上の所望の導入遺伝子の持続的発現であるものを人工的に弱めることがある。ceDNAベクターからの持続的発現に対する潜在的な宿主免疫反応の回避および/または抑制の影響を評価するために、2つのアプローチが取られた。第1に、前の実施例で使用されたceDNA−Lucベクターは構成的CAGプロモーターの制御下にあったため、肝臓特異的プロモーター(hAAT)または異なる構成的プロモーター(hEF−1)を使用して同様の構築物を作製して、骨髄細胞または非肝臓組織への長期曝露を回避することで、観察された免疫効果が低減したかどうかを判断した。第2に、ある特定のceDNA−ルシフェラーゼ構築物は、宿主免疫反応の既知のトリガーであるCpG含有量が低減するように操作された。そのような操作され、プロモーターが切り替えられたceDNAベクターをマウスに投与した際のceDNAコード化ルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した。
特許および特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書および本明細書の実施例で引用されるすべての刊行物および参考文献は、あたかも個々の刊行物または参考文献が、完全に記載されるように参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、それら全体が参照により組み込まれる。この出願が優先権を主張する任意の特許出願もまた、刊行物および参考文献について上述した方法で、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (53)
- 対象における導入遺伝子の発現を調節する方法であって、
a.測定可能なレベルの前記導入遺伝子を発現させるために、隣接する逆位末端反復(ITR)間のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも1つの導入遺伝子を含む核酸カセットを含む、十分な量のキャプシド不含閉端DNA(ceDNA)ベクターを対象に投与することであって、前記導入遺伝子が、疾患を治療するための所望のタンパク質をコードする、投与することと、
b.隣接するITR間に少なくとも1つの導入遺伝子を含む前記ceDNAベクターの少なくとも第2の用量を前記対象に投与して、所定の時間にわたって所定のレベルで前記所望のタンパク質の前記導入遺伝子発現を得るか、または前記所望のタンパク質の前記導入遺伝子発現を所定のレベルまで増加させることによって、前記ceDNAベクターをタイトレーションすることと、を含む、方法。 - 前記対象をステップ(a)後に評価して、前記タイトレーションの用量を決定する、請求項1に記載の方法。
- 前記評価が、ステップ(a)後の病態または前記対象において発現される所望のタンパク質のレベルを決定することである、請求項2に記載の方法。
- 対象における導入遺伝子の発現を調節する方法であって、
a.測定可能なレベルの前記導入遺伝子を発現させるために、隣接する逆位末端反復(ITR)間のプロモーターに操作可能に連結された少なくとも1つの導入遺伝子を含む核酸カセットを含む、十分な量のキャプシド不含閉端DNA(ceDNA)ベクターを前記対象に投与することであって、前記導入遺伝子が、所望のタンパク質をコードする、投与することと、
b.隣接するITR間に少なくとも1つの導入遺伝子を含む前記ceDNAベクターの少なくとも第2の用量を前記対象に投与して、(i)所定の時間にわたって所定のレベルで前記所望のタンパク質の発現を継続させるか、または(ii)前記所望のタンパク質の発現を所定のレベルに調整することと、を含む、方法。 - 前記ceDNAベクターの2回目の投与が、前記所望のタンパク質の前記所定のレベルの発現を得るのを妨げるのに十分な免疫反応を生じない、請求項4に記載の方法。
- 前記ceDNAベクターが、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記2回目の投与が、前記導入遺伝子の前記発現レベルが所望のレベルから減少したときに行われる、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記2回目の投与が、1回目の投与の少なくとも90日後である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、治療用タンパク質をコードし、前記導入遺伝子の前記所望の発現レベルが、前記治療用タンパク質の治療有効量である、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記ceDNAベクターの少なくとも3回の投与があり、前記投与のいずれもが、前記所望のタンパク質の前記所定の発現レベルを達成するのを妨げる前記ceDNAベクターに対する免疫反応を生じない、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記投与が、定期的なスケジュールで行われる、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記2回目の投与が、前記所望のタンパク質の前記発現レベルを増加させるためである、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記2回目の投与が、前記所望のタンパク質の前記発現を所定の発現レベルで延長するためである、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記所望のタンパク質が、阻害タンパク質である、請求項1〜13のいずれかに記載の方法。
- 前記阻害タンパク質が、抗体または融合タンパク質である、請求項1〜14のいずれかに記載の方法。
- 前記所望のタンパク質が、欠陥のあるタンパク質または発現されていないタンパク質に取って代わる、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- 前記プロモーターが、誘導性または抑制性プロモーターである、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、調節スイッチの制御下にある、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 第1、第2、または任意の後続の時点で投与される前記ceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子を含む同じタイプのceDNAベクターである、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- 前記第2のceDNAベクターが、同じ導入遺伝子または修飾された導入遺伝子に操作可能に連結された異なるプロモーターを有する、請求項1〜194のいずれかに記載の方法。
- 前記2つの逆位末端反復配列(ITR)が、AAV ITRである、請求項1〜20のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも1つのITRが、機能性末端分解部位およびRep結合部位を含む、請求項1〜21のいずれかに記載の方法。
- 前記AAV ITRが、AAV−2 ITRである、請求項22に記載の方法。
- 前記隣接するITRが、対称または非対称である、請求項1〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記隣接するITRが、対称または実質的に対称である、請求項1〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記隣接するITRが、非対称である、請求項1〜23のいずれかに記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が野生型であるか、または前記ITRの両方が野生型である、請求項1〜26のいずれかに記載の方法。
- 前記隣接するITRが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項1〜27のいずれかに記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、表2、4A、4B、または5の配列から選択される配列を含む、請求項1〜285のいずれかに記載の方法。
- 前記ITRの少なくとも一方が、野生型AAV ITR配列から、前記ITRの全体的な3次元コンフォメーションに影響を与える欠失、付加、または置換によって変更されている、請求項1〜29のいずれかに記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、およびAAV12から選択されるAAV血清型に由来する、請求項1〜30のいずれかに記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、合成のものである、請求項1〜31のいずれかに記載の方法。
- 前記ITRの一方もしくは両方が野生型ITRでないか、または前記ITRの両方が野生型でない、請求項1〜32のいずれかに記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、A、A’、B、B’、C、C’、D、およびD’から選択される前記ITR領域のうちの少なくとも1つにおける欠失、挿入、および/または置換によって修飾されている、請求項1〜33のいずれかに記載の方法。
- 前記欠失、挿入、および/または置換が、通常は前記A、A’、B、B’C、またはC’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、請求項1〜34のいずれかに記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および/または置換によって修飾されている、請求項1〜34のいずれかに記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記CおよびC’領域によって形成されるステムループ構造の全部または一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および/または置換によって修飾されている、請求項1〜36のいずれかに記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成されるステムループ構造の一部、ならびに/または通常は前記CおよびC’領域によって形成されるステムループ構造の一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、および/または置換によって修飾されている、請求項1〜37のいずれかに記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成される第1のステムループ構造と、前記CおよびC’領域によって形成される第2のステムループ構造とを含む領域に、単一のステムループ構造を含む、請求項1〜38のいずれかに記載の方法。
- 前記ITRの一方または両方が、通常は前記BおよびB’領域によって形成される第1のステムループ構造と、前記CおよびC’領域によって形成される第2のステムループ構造とを含む領域に、単一のステムおよび2つのループを含む、請求項1〜39のいずれかに記載の方法。
- 両方のITRが、前記ITRが互いに対して反転されたときに全体的な3次元対称性をもたらすような様式で変更されている、請求項1〜40のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも1つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも1つの調節スイッチの制御下にある、請求項1〜41のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも1つの調節スイッチが、バイナリ調節スイッチ、小分子調節スイッチ、パスコード調節スイッチ、核酸ベース調節スイッチ、転写後調節スイッチ、放射線制御または超音波制御の調節スイッチ、低酸素媒介調節スイッチ、炎症反応調節スイッチ、剪断活性化調節スイッチ、およびキルスイッチから選択される、請求項42に記載の方法。
- 前記対象が、癌、自己免疫疾患、神経変性障害、高コレステロール血症、急性臓器拒絶、多発性硬化症、閉経後骨粗しょう症、皮膚状態、喘息、または血友病から選択される疾患または障害を有する、請求項1〜43のいずれかに記載の方法。
- 前記癌が、固形腫瘍、軟部組織肉腫、リンパ腫、および白血病から選択される、請求項44に記載の方法。
- 前記自己免疫疾患が、関節リウマチおよびクローン病から選択される、請求項44に記載の方法。
- 前記皮膚状態が、乾癬およびアトピー性皮膚炎から選択される、請求項44に記載の方法。
- 前記神経変性障害が、アルツハイマー病である、請求項44に記載の方法。
- 第2の時点後の1つ以上の時点で、ある用量の前記組成物を前記対象に投与して、前記異種核酸配列の前記発現レベルを、第2の時点もしくは以前の時点での前記組成物の投与後に達成される前記異種核酸の前記発現レベルと比較して増加させるか、または前記異種核酸配列の前記発現レベルを増加させて、所望の発現レベルを達成することをさらに含む、請求項44に記載の方法。
- 前記導入遺伝子が、核酸、阻害剤、ペプチドまたはポリペプチド、抗体または抗体断片、融合タンパク質、抗原、アンタゴニスト、アゴニスト、RNAi分子等のいずれかから選択される遺伝医学である、請求項1〜49のいずれかに記載の方法。
- 前記第2の時点または任意の後続の時点で投与される前記組成物の前記所定の用量が、前記第1の時点で投与される前記組成物の前記用量の2倍〜10倍の量である、請求項1〜50のいずれかに記載の方法。
- 前記第2の時点または任意の後続の時点で投与される前記組成物の前記所定の用量が、前記導入遺伝子の前記発現を、前記第1の時点での前記組成物の投与後の前記導入遺伝子の前記発現と比較して、少なくとも3倍、または少なくとも5倍、または少なくとも10倍、または2〜15倍、または2〜20倍増加させる量である、請求項1〜51のいずれかに記載の方法。
- 前記第2の時点で投与される前記ceDNAベクターの前記所定の用量が、前記細胞における前記導入遺伝子の前記所望の発現レベルを達成するために、前記ceDNAベクターの用量依存関係を使用して決定される、請求項1〜52のいずれかに記載の方法。
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