KR20210090619A - 대칭인 변형된 역말단반복을 포함하는 변형된 폐쇄형 DNA(ceDNA) - Google Patents

Abstract

본원에는, 고수율로 생산될 수 있고 전이유전자의 효과적인 전달 및 발현에 사용될 수 있는, 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터가 기재되어 있다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 야생형 AAV ITR이 아닌 2개의 플랭킹 대칭 역말단반복 서열 사이에 작동 가능하게 배치된 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 이종 뉴클레오타이드 서열 중 전부 또는 일부는 적어도 하나의 조절 스위치의 제어 하에 있다. 본원에 제공된 일부 ceDNA 벡터는 시스-조절 요소를 추가로 포함하고, 높은 유전자 발현 효율을 제공한다. 나아가, 본원에는, 선형, 연속 및 캡시드 미함유 DNA 벡터의 신뢰성 있고 효율적인 생산을 위한 방법 및 세포주가 제시되어 있다.

Description

대칭인 변형된 역말단반복을 포함하는 변형된 폐쇄형 DNA(ceDNA)

관련 출원

본 출원은 2018년 11월 9일자 출원된 미국 가출원 제62/757,872호, 및 2018년 11월 9일자 출원된 미국 가출원 제62/757,892호를 우선권 주장하며, 상기 각 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

기술분야

본 발명은, 폐쇄형 DNA 조절 스위치를 표적 세포, 조직, 기관 또는 유기체에 전달하는 것을 포함하는, 유전자 치료 분야에 관한 것이다.

서열목록

본 출원의 서열목록은 2019년 11월 8일자에 204 KB(209,626 bytes) 크기로 생성된 파일명 "05320Sequence_Listing.txt"의 ASCII 형식의 서열목록으로 EFS-Web을 통해 전자문서로 제출되었다. 본 출원은 전자문서로 제출된 서열목록을 포함하며, 이러한 서열목록은 그 전체가 본원에 참조로서 인용된다.

유전자 치료는 유전자 발현 프로파일의 이상으로 인한 유전자 돌연변이 또는 후천성 질환을 앓고 있는 환자의 임상 결과를 개선시키는 것을 목표로 한다. 유전자 치료는 장애, 질환, 악성종양 등을 초래할 수 있는, 결함이 있는 유전자, 또는 비정상적인 조절 또는 발현, 예를 들어 과소발현(underexpression) 또는 과발현으로 인한 의학적 병태의 치료 또는 예방을 포함한다. 예를 들어, 결함이 있는 유전자로 인한 질환 또는 장애는 환자에게 교정(corrective) 유전 물질을 전달하여 환자 내에서 유전 물질의 치료적 발현을 유도하는 방식으로 치료, 예방 또는 개선될 수 있다. 유전자 치료의 기초는, 예를 들어 긍정적인 기능획득 효과, 부정적인 기능손실 효과, 또는 예를 들어 종양세포붕괴 효과와 같은 또 다른 결과를 유도할 수 있는 활성 유전자 산물(때때로 전이유전자(transgene)로 지칭됨)을 전사 카세트에 공급하는 것이다. 유전자 치료는 또한 다른 인자로 인한 질환 또는 악성종양을 치료하는 데 사용될 수 있다. 인간 단일유전 장애는 정상 유전자를 표적세포에 전달하여 발현시키는 방식으로 치료될 수 있다. 교정 유전자를 환자의 표적세포에 전달하여 발현시키는 것은 조작된 바이러스 및 바이러스성 유전자 전달 벡터의 사용을 포함하는 다양한 방법을 통해 수행될 수 있다. 다수의 이용 가능한 바이러스 유래 벡터(예를 들어, 재조합 레트로바이러스, 재조합 렌티바이러스, 재조합 아데노바이러스 등) 중에서, 재조합 아데노관련바이러스(rAAV: recombinant adeno-associated virus)는 유전자 치료에서 다목적 벡터로서 인기를 얻고 있다. 하지만, 기술이 발전하고, 고효율의 유전자 전달 및 발현이 달성됨에 따라, 시간 및 공간 수준에서 이러한 발현을 조절하는 능력이 점점 더 중요해지고 있다.

아데노관련바이러스(AAV: adeno-associated virus)는 파르보바이러스과에 속하며, 더욱 구체적으로는 데펜도파르보바이러스(dependoparvovirus) 속을 구성한다. AAV 게놈은 대략 4.7 킬로베이스(kb)로 함유되어 있고 비(非)구조 Rep(복제) 단백질과 구조 Cap(캡시드) 단백질을 인코딩하는 2개의 주요 오픈리딩프레임(ORF: open reading frame)으로 이루어진, 선형 단일가닥 DNA 분자로 구성되어 있다. 어셈블리 활성화 단백질(AAP: assembly-activating protein)을 인코딩하는 cap 유전자 내 두 번째 ORF가 확인되었다. AAV 코딩 영역을 플랭킹(flanking)하는 DNA는 DNA 복제의 프라이머로서 기능하는 에너지적으로 안정한 헤어핀 구조로 폴딩될 수 있는 회문구조(palindromic) 서열이 개재된, 길이가 대략 145개 뉴클레오타이드인, 2개의 시스 작용 역말단반복(ITR: inverted terminal repeat) 서열이다. 전형적으로, 야생형 서열은 동일하지만 서로에 대해 역상이다. DNA 복제에서의 역할 이외에, ITR 서열은 세포 게놈으로의 바이러스 DNA 통합, 숙주 게놈 또는 플라스미드로부터의 회수(rescue), 및 바이러스 핵산의 성숙 비리온으로의 캡시드화에 관여하는 것으로 나타났다(문헌[Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158:97-129]).

AAV 유래 벡터(즉, 재조합 AAV(rAVV) 또는 AAV 벡터)는 다음과 같은 이유로 유전 물질의 전달에 매력적이다: (i) 이는 근세포와 뉴런을 포함하는 다양한 비(非)분열 및 분열 세포 유형을 감염(형질도입)시킬 수 있는 능력이 있음; (ii) 이는 바이러스 구조 유전자가 없기 때문에, 바이러스 감염에 대한 숙주세포 반응, 예를 들어 인터페론 매개 반응을 감소시킬 수 있음; (iii) 야생형 바이러스는 인간에서 비(非)병적으로 간주됨; (iv) 숙주세포 게놈에 통합될 수 있는 야생형 AAV와 대조적으로, 복제불능 AAV 벡터에는 rep 유전자가 결여되어 있고 일반적으로 에피솜으로 지속되기 때문에, 삽입 돌연변이유발 또는 유전독성의 위험을 제한할 수 있음; 및 (v) 다른 벡터 시스템과 비교하여, AAV 벡터는 일반적으로 면역원이 더 적은 것으로 여겨져 중요한 면역 반응((ii) 참조)을 촉발시키지 않기 때문에, 벡터 DNA의 지속, 및 잠재적으로 치료용 전이유전자의 장기 발현을 얻을 수 있음. AAV 벡터는 또한 높은 역가로 생산 및 제형화될 수 있으며 동맥내, 정맥내 또는 복강내 주사를 통해 전달될 수 있어, 설치류(Goyenvalle 등의 문헌(2004); Fougerousse 등의 문헌(2007); Koppanati 등의 문헌(2010); Wang 등의 문헌(2009)) 및 개에서의 단회 주사를 통해 중요한 근육 영역으로의 벡터 분포 및 유전자 전달을 가능하게 할 수 있다. 제1형 척수성 근디스트로피를 치료하기 위한 임상 연구에서, AAV 벡터는 뇌를 표적으로 하는 의도로 전신으로 전달되어 명백한 임상 개선을 가져왔다.

하지만, 유전자 전달 벡터로서 AAV 입자를 사용하는 데에는 몇 가지 주요 결함이 있다. rAAV와 관련된 하나의 주요 단점은 약 4.5 kb의 이종 DNA의 제한된 바이러스 패키징 용량이다(Dong 등의 문헌(1996); Athanasopoulos 등의 문헌(2004); Lai 등의 문헌(2010)). 그 결과, AAV 벡터의 사용은 150,000 Da 미만의 단백질 코딩 용량으로 제한되었다. 두 번째 단점은, 집단에서 야생형 AAV 감염의 유병률로 인해, rAAV 유전자 치료 후보가 환자에서 벡터를 제거하는 중화 항체의 존재에 대해 스크리닝되어야 한다는 점이다. 세 번째 단점은, 초기 치료에서 제외되지 않았던 환자에게의 재투여를 막는 캡시드 면역원성과 관련이 있다. 환자의 면역계는 향후 치료를 방해하는 높은 역가의 항-AAV 항체를 생성하는 면역계를 자극하기 위해 "부스터(booster)" 주사로서 효과적으로 작용하는 벡터에 반응할 수 있다. 일부 최근 보고서는, 고용량 조건에서 면역원성에 대한 우려를 나타낸다. 또 다른 주목할 만한 단점은, 단일가닥 AAV DNA가 이종 유전자 발현 전 이중가닥 DNA로 전환되어야 한다는 점을 고려할 때, AAV 매개 유전자 발현의 개시가 상대적으로 느리다는 점이다. 이중가닥 DNA 벡터를 구축하여 이러한 문제를 우회하려는 시도가 있었지만, 이러한 전략은 AAV 벡터에 통합될 수 있는 전이유전자 발현 카세트의 크기를 추가로 제한한다(McCarty의 문헌(2008); Varenika 등의 문헌(2009); Foust 등의 문헌(2009)).

또한, 캡시드를 갖는 통상적인 AAV 비리온은 AAV 게놈, rep 유전자 및 cap 유전자를 함유하는 플라스미드 또는 플라스미드들의 도입을 통해 생성된다(Grimm 등의 문헌(1998)). 이러한 헬퍼 플라스미드를 트랜스로 도입 시, AAV 게놈은 숙주 게놈에서 "회수되고"(즉, 방출되고, 후속으로 증폭됨), 추가로 캡시드화되어(바이러스 캡시드), 생물학적으로 활성인 AAV 벡터를 생산한다. 하지만, 이러한 캡시드화된 AAV 바이러스 벡터는 특정 세포 및 조직 유형을 비효율적으로 형질도입하는 것으로 확인되었다. 캡시드는 또한 면역 반응을 유도한다.

따라서, 유전자 치료를 위한 아데노관련바이러스(AAV) 벡터의 사용은, 특정 환자의 기존 면역, (발달된 환자 면역 반응으로 인해) 아직 면역이 되지 않은 환자에게의 단회 투여, 관련 AAV 캡시드의 최소 바이러스 패키징 용량(약 4.5 kb)으로 인해 AAV 벡터에서 전달에 적합한 전이유전자 유전 물질의 제한된 범위, 및 느린 AAV 매개 유전자 발현으로 인해 제한된다. rAAV 임상 유전자 치료를 위한 적용은 동계(syngeneic) 마우스 모델 또는 다른 모델 종에서의 용량 반응에 의해 예측되지 않는 환자-대-환자 가변성에 의해 추가로 방해를 받는다.

재조합 캡시드 미함유 AAV 벡터는 Rep 결합 부위와 말단 분해 부위를 포함하는 2개의 야생형 AAV 역말단반복 서열(ITR)이 플랭킹된 프로모터 영역과 발현 가능한 전이유전자를 포함하는 단리된 선형 핵산 분자로 수득될 수 있다. 이러한 재조합 AAV 벡터에는 AAV 캡시드 단백질 인코딩 서열이 없으며, 이는 2개의 야생형 ITR 회문구조 서열을 통해 공유결합으로 연결된 하나 또는 두 개의 말단을 갖는 단일가닥, 이중가닥 또는 이중체(duplex)일 수 있다(예를 들어, WO2012/123430, 미국 특허 제9,598,703호). 이는, 전이유전자 용량이 훨씬 더 크고, 전이유전자 발현 개시가 신속하고, 전형적으로 이들 벡터의 면역 및 신속한 제거를 유도하는 AAV 기반 벡터의 속성이 결여되어 있다는 점에서, AAV 매개 유전자 치료의 문제 중 다수를 회피한다. 하지만, 전이유전자의 일정한 발현이 모든 경우에 바람직하지 않을 수 있다.

개선된 생산 및/또는 발현 특성을 갖는 제어 가능한 재조합 DNA 벡터에 대한 충족되지 않은 요구가 여전히 존재한다.

본 개시내용은, 일반적으로, 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비(非)바이러스성 캡시드 미함유 DNA 벡터(본원에서 "폐쇄형 DNA 벡터" 또는 "ceDNA 벡터"로 지칭됨)를 제공한다. 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 상보적 DNA의 연속 가닥으로부터 형성된 캡시드 미함유 선형 이중체 DNA 분자(선형, 연속 및 비(非)캡시드화된 구조)로서, 이는 동일하지만 서로 역 보체인, 5' 역말단반복(ITR) 서열과 3' ITR 서열(즉, 상기 서열들은 대칭 또는 실질적으로 대칭임)을 갖는다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 2개의 플랭킹 역말단반복 서열(ITR) 사이에 작동 가능하게 배치된 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 여기서 이종 뉴클레오타이드 서열 중 전부 또는 일부는 적어도 하나의 조절 스위치의 제어 하에 있다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 기술은 2개의 변형된 AAV 역말단반복 서열(ITR)을 함유하는 ceDNA 벡터로서, 여기서 변형된 ITR이 서로 대칭이고 발현 가능한 전이유전자를 플랭킹하는 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 진핵세포에서 생산될 수 있기 때문에, 곤충 세포에는 원핵세포 DNA 변형 및 박테리아 내독소 오염이 없다.

하나의 양태에서, 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 DNA 벡터는 바람직하게는 선형 이중체 분자이며, 이는 2개의 대칭인 변형된 역말단반복 서열(예를 들어, mod-ITR)(예를 들어, AAV ITR) 사이에 작동적으로 배치된 이종 핵산을 인코딩하는 벡터 폴리뉴클레오타이드에서 수득될 수 있다. 즉, 두 개의 ITR은 동일한 서열을 갖지만, 서로 역 보체(역상)이다. 대안적인 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 갖지만, 상응하거나 동일한 대칭인 3차원 형상을 가질 수 있다. 예를 들어, 하나의 변형된 ITR은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 변형된 ITR은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있지만, 동일한 영역에 동일한 돌연변이(예를 들어, 뉴클레오타이드 삽입, 결실 또는 치환)을 가질 수 있다. 달리 말하면, 단지 예시의 목적으로, 5' mod-ITR은 AAV2에 유래할 수 있고 C 영역에 결실을 가질 수 있으며, 3' mod-ITR은 AAV5에서 유래할 수 있고 C' 영역에 상응하는 결실을 가질 수 있으며, 단, 5' mod-ITR과 3' mod-ITR은 동일하거나 대칭인 3차원 공간 구성을 갖고, 이들은 변형된 ITR 쌍으로서 본원에의 사용을 위해 포함된다.

일부 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 동일한 AAV 혈청형의 야생형 ITR 서열에 대한 결실, 삽입 또는 치환 중 적어도 하나 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 대칭인 ITR에서 부가, 결실 또는 치환은 동일하지만, 서로 역 보체이다. 예를 들어, 5' ITR의 C 영역에의 3개의 뉴클레오타이드의 삽입은 3' ITR의 C' 영역 내 상응하는 섹션에의 3개의 역 보체 뉴클레오타이드의 삽입으로 반영될 것이다. 단지 예시의 목적으로, 부가가 5' ITR에의 AACG인 경우, 이러한 부가는 상응하는 부위의 3' ITR에의 CGTT이다. 예를 들어, 5' ITR 센스 가닥이 ATCGATCG인 경우, G와 A 사이에 AACG가 부가되면 ATCG AACG ATCG 서열이 생성된다. 상응하는 3' ITR 센스 가닥은 CGATCGAT(ATCGATCG의 역 보체)이고, T와 C 사이에 CGTT(즉, AACG의 역 보체)가 부가되어, CGAT CGTT CGAT(ATCG AACG ATCG의 역 보체) 서열, 즉, 5' ITR 변형의 거울상이 생성된다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 말단 분해 부위와 복제 단백질 결합 부위(RPS)(때때로 복제성 단백질 결합 부위로 지칭됨), 예를 들어 Rep 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 말단 분해 부위 및/또는 복제 단백질 결합 부위(RPS), 예를 들어 Rep 결합 부위를 포함하지 않는다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 (1) 시스-조절 요소, 프로모터 및 적어도 하나의 전이유전자를 포함하는 발현 카세트; 또는 (2) 적어도 하나의 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터; 및 (3) 상기 발현 카세트를 플랭킹하는 2개의 자가 상보적 대칭 서열, 예를 들어 대칭인 변형된 ITR을 포함하며, 여기서 ceDNA 벡터에는 캡시드 단백질이 결합되어 있지 않다.

하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 조절하기 위한 추가의 구성요소, 예를 들어 시스-조절 요소, 및/또는 전이유전자의 발현을 제어하고 조절하는 조절 스위치, 예를 들어 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 세포 사멸을 제어할 수 있는 사멸 스위치(kill switch)와 같은 조절 스위치(이는 본원의 "조절 스위치"라는 제목의 섹션에 보다 충분히 기재되어 있음)를 포함한다. 시스-조절 요소에는, 비제한적으로, 프로모터, 리보스위치(riboswitch), 절연인자, mir-조절 요소, 전사 후 조절 요소, 조직 및 세포 유형 특이적 프로모터, 및 인핸서가 포함된다. 일부 구현예에서, ITR은 전이유전자를 위한 프로모터로서 작용할 수 있다.

일부 구현예에서, 2개의 자가 상보적 서열은 임의의 공지된 파르보바이러스, 예를 들어 AAV(예를 들어, AAV1 내지 AAV12)와 같은 데펜도바이러스에서 유래한 변형된 ITR 서열일 수 있다. 헤어핀 2차 구조 형성을 가능하게 하는 가변적인 회문구조 서열에 더하여, 비제한적으로, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 531)와 같은 Rep-결합 부위(RBS)와 말단 분해 부위(trs)를 보유하는 변형된 AAV2 ITR 서열을 포함하는, 임의의 AAV 혈청형이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 헤어핀 2차 구조 형성을 가능하게 하는 가변적인 회문구조 서열에 더하여, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 531)와 같은 기능성 Rep-결합 부위(RBS)와 말단 분해 부위(TRS)를 함유할 수 있는 합성 ITR 서열이다. 일부 예에서, 변형된 ITR 서열은 RBS와 trs의 서열, 및 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12와 같은 야생형 ITR의 상응하는 서열로부터 ITR 헤어핀 2차 구조 중 하나의 말단 루프 부분을 형성하는 Rep 결합 요소의 구조 및 위치를 유지한다.

대칭인 변형된 ITR을 포함하는 ceDNA 벡터에 사용하기 위한 변형된 ITR 서열의 예는 본원의 표 4에 제시되어 있으며, 이는 ITR의 쌍(변형된 5' ITR과 대칭인 변형된 3' ITR)으로 나타난다. ceDNA 벡터에 사용하기 위한 변형된 ITR 서열의 예는, 하기 변형된 ITR의 쌍 중 임의의 것에서 선택된다: 서열번호 484(ITR-33 좌측)와 서열번호 469(ITR-18, 우측); 서열번호 485(ITR-34 좌측)와 서열번호 95(ITR-51, 우측); 서열번호 486(ITR-35 좌측)과 서열번호 470(ITR-19, 우측); 서열번호 487(ITR-36 좌측)과 서열번호 471(ITR-20, 우측); 서열번호 488(ITR-37 좌측)과 서열번호 472(ITR-21, 우측); 서열번호 489(ITR-38 좌측)와 서열번호 473(ITR-22 우측); 서열번호 490(ITR-39 좌측)과 서열번호 474(ITR-23, 우측); 서열번호 491(ITR-40 좌측)과 서열번호 475(ITR-24, 우측); 서열번호 492(ITR-41 좌측)와 서열번호 476(ITR-25 우측); 서열번호 493(ITR-42 좌측)과 서열번호 477(ITR-26 우측); 서열번호 494(ITR-43 좌측)와 서열번호 478(ITR-27 우측); 서열번호 495(ITR-44 좌측)와 서열번호 479(ITR-28 우측); 서열번호 496(ITR-45 좌측)과 서열번호 480(ITR-29, 우측); 서열번호 497(ITR-46 좌측)과 서열번호 481(ITR-30, 우측); 서열번호 498(ITR-47, 좌측)과 서열번호 482(ITR-31, 우측); 서열번호 499(ITR-48, 좌측)와 서열번호 483(ITR-32 우측).

일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 사용하기 위한 변형된 ITR 서열의 예는, 하기 서열의 쌍에서 선택되는 부분 ITR 서열을 포함한다: 서열번호 101과 서열번호 102; 서열번호 103과 서열번호 96; 서열번호 105와 서열번호 106; 서열번호 545와 서열번호 116; 서열번호 111과 서열번호 112; 서열번호 117과 서열번호 118; 서열번호 119와 서열번호 120; 서열번호 121과 서열번호 122; 서열번호 107과 서열번호 108; 서열번호 123과 서열번호 124; 서열번호 125와 서열번호 126; 서열번호 127과 서열번호 128; 서열번호 129와 서열번호 130; 서열번호 131과 서열번호 132; 서열번호 133과 서열번호 134; 서열번호 547과 서열번호 546(또한 도 6b 내지 도 21b에 제시됨).

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 2018년 9월 7일자 출원된 PCT/US18/49996의 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 9 또는 표 10a와 표 10b에 제시된 ITR 서열 또는 ITR 부분 서열에서의 임의의 변형에 상응하는 각 ITR에서의 변형을 갖는 ITR을 포함할 수 있으며, 여기서 플랭킹 ITR 서열은 본원에 정의된 바와 같이 이의 대칭(예를 들어, 역 보체임) 또는 실질적으로 대칭이며, 즉, 대칭적인 3D 공간 구성을 갖는다.

예시적인 예로서, 본 개시내용은 조절 스위치의 존재 또는 부재 하에 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 폐쇄형 DNA 벡터로서, 캡시드 단백질이 없으며, (a) 대칭인 ITR을 인코딩하는 ceDNA-플라스미드에서 생산되고(예를 들어, 도 1a 및 도 1b 참조)(여기서 각각의 변형된 ITR은 이의 헤어핀 2차 구성에서 동일한 수의 분자내 이중체화된 염기쌍을 가짐)(바람직하게는 참조 서열과 비교하여 이러한 구성에서 임의의 AAA 또는 TTT 말단 루프의 결실을 배제함), (b) 실시예 1의 미변성 겔 및 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동에 의해 ceDNA를 식별하는 검정을 사용한 경우 ceDNA로서 식별된 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터를 제공한다.

하나의 구현예에서, 플랭킹 변형된 ITR은 서로 실질적으로 대칭이다. 이러한 구현예에서, 변형은 동일하지만(즉, 부가, 치환 또는 결실은 동일하지만), ITR은 동일한 역 보체가 아니다. 이러한 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 대칭인 3차원 공간 구성을 갖지만, 동일한 역 보체 뉴클레오타이드 서열을 갖지 않는다는 점에서 실질적으로 대칭이다. 달리 말하면, 일부 구현예에서, mod-ITR 쌍으로부터의 ITR은 상이한 역 보체 뉴클레오타이드 서열을 갖지만, 여전히 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 가질 수 있으며, 즉, 두 개의 ITR은 동일한 전체 3D 형상을 유도하는 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, mod-ITR 쌍에서 하나의 ITR(예를 들어, 5' ITR)은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 ITR(예를 들어, 3' ITR)은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있지만, 두 가지 모두 동일한 상응하는 돌연변이를 가질 수 있으므로(예를 들어, 5' ITR이 C 영역에 결실을 갖는 경우, 상이한 혈청형으로부터의 동족의 변형된 3' ITR은 C' 영역의 상응하는 위치에 결실을 가짐), 변형된 ITR 쌍은 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 변형된 ITR 쌍의 각각의 ITR은 상이한 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12), 예컨대 AAV2와 AAV6의 조합에서 유래할 수 있으며, 여기서 하나의 ITR에서의 변형은 상이한 혈청형의 동족 ITR 내 상응하는 위치에 반영된다. 하나의 구현예에서, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은, ITR 사이의 뉴클레오타이드 서열 차이가 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고 이들이 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 갖는 한, 변형된 ITR(mod-ITR)의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, mod-ITR은 기본 설정의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(BLASTN)와 같은 당업계에 널리 공지된 표준 수단에 의해 결정된 기본형 mod-ITR과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C' 아암(arm)의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 갖고, 또한 이의 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상으로 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다.

일부 구현예에서, ITR의 구조 요소는 ITR과 큰 Rep 단백질(예를 들어, Rep 78 또는 Rep 68)의 기능적 상호작용에 관여하는 임의의 구조 요소일 수 있다. 특정 구현예에서, 구조 요소는 ITR과 큰 Rep 단백질의 상호작용에 대한 선택성을 제공하며, 즉, 적어도 부분적으로 어느 Rep 단백질이 ITR과 기능적으로 상호작용하는 지를 결정한다. 다른 구현예에서, 구조 요소는, Rep 단백질이 ITR에 결합될 때, 큰 Rep 단백질과 물리적으로 상호작용한다. 각각의 구조 요소는, 예를 들어 ITR의 2차 구조, ITR의 뉴클레오타이드 서열, 둘 이상의 요소 사이의 간격, 또는 상기 중 임의의 것의 조합일 수 있다. 하나의 구현예에서, 구조 요소는 A 및 A' 아암, B 및 B' 아암, C 및 C' 아암, D 아암, Rep 결합 부위(RBE) 및 RBE'(즉, 상보적 RBE 서열), 및 말단 분해 부위(trs)로 이루어지는 군에서 선택된다.

보다 구체적으로, ITR은 구조적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조 요소의 뉴클레오타이드 서열은 ITR의 야생형 서열과 비교하여 변형될 수 있다. 하나의 구현예에서, ITR의 구조 요소(예를 들어, A 아암, A' 아암, B 아암, B' 아암, C 아암, C' 아암, D 아암, RBE, RBE' 및 trs)는 제거되어, 상이한 파르보바이러스의 야생형 구조 요소로 대체될 수 있다. 예를 들어, 대체 구조는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 뱀 파르보바이러스(예를 들어, 공비단뱀(royal python) 파르보바이러스), 소 파르보바이러스, 염소 파르보바이러스, 조류 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 말 파르보바이러스, 새우 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스 또는 곤충 AAV에서 유래할 수 있다. 예를 들어, ITR은 AAV2 ITR일 수 있고, A 또는 A' 아암, 또는 RBE는 AAV5의 구조 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, ITR은 AAV5 ITR일 수 있고, C 또는 C' 아암, RBE, 및 trs는 AAV2의 구조 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, AAV ITR은 B 및 B' 아암이 AAV2 ITR B 및 B' 아암으로 대체된 AAV5 ITR일 수 있다.

단지 예로서, 표 3은 변형된 ITR 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 예시적인 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타내며, 여기서 X는 상응하는 야생형 ITR에 대한 해당 섹션에서의 적어도 하나의 핵산의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타낸다. 일부 구현예에서, C 및/또는 C' 및/또는 B 및/또는 B'의 임의의 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 예를 들어, 변형이 단일 아암 ITR(예를 들어, 단일 C-C' 아암 또는 단일 B-B' 아암), 또는 변형된 C-B' 아암 또는 C'-B 아암, 또는 적어도 하나의 절단된 아암(예를 들어, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암)을 갖는 2개의 아암 ITR 중 임의의 것을 생성하는 경우, 적어도 단일 아암, 또는 2개의 아암 ITR 중 적어도 하나의 아암(여기서 하나의 아암은 절단될 수 있음)은 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 일부 구현예에서, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암은 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 갖는다.

본원에 기재된 기술은 나아가 표적세포에서 하나 이상의 전이유전자를 전달하고 인코딩할 수 있는 ceDNA 벡터로서, 예를 들어 다시스트론성(multicistronic) 서열을 포함하거나, 또는 전이유전자 및 이의 천연 게놈 문맥(예를 들어, 전이유전자, 인트론 및 내인성 미번역 영역)이 ceDNA 벡터에 함께 혼입되는 ceDNA 벡터에 관련된 것이다. 전이유전자는 단백질 인코딩 전사체, 비(非)코딩 전사체 또는 둘 모두일 수 있다. ceDNA 벡터는 다수의 코딩 서열, 및 단백질 인코딩 전사체, 비코딩 전사체 또는 둘 모두를 발현하기 위한 비(非)기본형 번역 개시 부위 또는 하나 초과의 프로모터를 포함할 수 있다. 전이유전자는 하나 초과의 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하거나, 비코딩 전사체의 서열일 수 있다. 발현 카세트는, 예를 들어 4000개 초과의 뉴클레오타이드, 5000개의 뉴클레오타이드, 10,000개의 뉴클레오타이드 또는 20,000개의 뉴클레오타이드, 또는 30,000개의 뉴클레오타이드, 또는 40,000개의 뉴클레오타이드 또는 50,000개의 뉴클레오타이드, 또는 약 4000개 내지 10,000개의 뉴클레오타이드, 또는 10,000개 내지 50,000개의 뉴클레오타이드 사이의 임의의 범위, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 캡시드화된 AAV 벡터의 크기 제한이 없기 때문에, 대형 발현 카세트를 전달하여 전이유전자의 효율적인 발현을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터에는 원핵생물 특이적 메틸화가 없다.

발현 카세트는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및/또는 2A 요소를 포함할 수 있다. 시스-조절 요소에는, 비제한적으로, 프로모터, 리보스위치, 절연인자, mir-조절 요소, 전사 후 조절 요소, 조직 및 세포 유형 특이적 프로모터, 및 인핸서가 포함된다. 일부 구현예에서, ITR은 전이유전자를 위한 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 조절하기 위한 추가적인 구성요소를 포함한다. 예를 들어, 추가적인 조절 구성요소는, 비제한적으로, 필요한 경우, ceDNA 감염된 세포를 사멸시킬 수 있는 사멸 스위치를 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 및 다른 유도성 및/또는 억제성 요소일 수 있다.

본원에 기재된 기술은 나아가 ceDNA 벡터를 사용하여 하나 이상의 전이유전자를 전달하고, 효율적이고 선택적으로 발현하는 신규한 방법을 제공한다. ceDNA 벡터는 숙주세포에 흡수될 수 있을 뿐 아니라, AAV 캡시드의 부재 하에서 핵으로 운반될 수 있는 능력을 갖는다. 또한, 본원에 기재된 ceDNA 벡터에는 캡시드가 결여되어 있기 때문에, 이는 캡시드 함유 벡터에 대한 반응으로 발생할 수 있는 면역 반응을 회피한다.

본 발명의 양태는 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예는 본원에 제공된 방법으로 생산된 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터(ceDNA 벡터)는 첫 번째 5' 역말단반복(예를 들어, AAV ITR); 발현 카세트; 및 3' ITR(예를 들어, AAV ITR)을 이러한 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형을 포함하는 플라스미드(본원에서 "ceDNA-플라스미드"로 지칭됨)에서 수득되며, 여기서 5' 및 3' ITR은 야생형 ITRS에 대해 변형된 ITR이고, 여기서 변형은 서로에 대해 동일하며, 즉, ITR은 서로에 대칭(즉, 구조적 거울상)이다.

본원에 개시된 ceDNA 벡터는 본 개시내용을 읽은 후 당업자에게 공지된 다수의 수단을 통해 수득 가능하다. 예를 들어, 본 개시내용의 ceDNA 벡터를 생성하는 데 사용되는 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형은, ceDNA-플라스미드(예를 들어, 표 7, 또는 도 1b 또는 도 6b 참조), ceDNA-박미드(bacmid), 및/또는 ceDNA-바큐로바이러스(baculovirus)일 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 ITR 사이에 작동 가능하게 배치된 제한 클로닝 부위(예를 들어, 서열번호 7)를 포함하며, 여기에, 예를 들어 전이유전자(예를 들어, 리포터 유전자 및/또는 치료용 유전자)에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 카세트가 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 발현 카세트를 플랭킹하는 변형된 대칭인 5' 및 3' ITR을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스)에서 생산될 수 있으며, 여기서 변형은 야생형 AAV2 또는 AAV3 ITR 서열과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환 중 임의의 하나 이상이다.

허용(permissive) 숙주세포에서, 예를 들어 Rep의 존재 하에서, 적어도 하나의 변형된 ITR을 갖는 폴리뉴클레오타이드 주형은 복제되어 ceDNA 벡터를 생산한다. ceDNA 벡터 생산은 다음과 같은 2단계를 거친다: 첫 번째로, Rep 단백질을 통한 주형 백본(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스 게놈 등)으로부터의 주형의 절제("회수") 단계, 및 두 번째로, 절제된 ceDNA 벡터의 Rep 매개 복제 단계. 다양한 AAV 혈청형의 Rep 단백질 및 Rep 결합 부위는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 당업자는 적어도 하나의 기능성 ITR에 기반하여 핵산 서열에 결합하고 이를 복제하는 혈청형에서 Rep 단백질을 선택하는 것을 이해한다. 예를 들어, 복제 가능한 변형된 ITR이 AAV 혈청형 2에서 유래하는 경우, 상응하는 Rep는 AAV2 또는 AAV4 Rep을 갖는 AAV2 ITR과 같은 해당 혈청형과는 함께 작동하지만, AAV5 Rep과는 함께 작동하지 않는 AAV 혈청형에서 유래할 수 있다. 복제 시, 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 ceDNA 벡터는 허용 세포에 계속 축적되고, ceDNA 벡터는 바람직하게는 표준 복제 조건 하 Rep 단백질 존재 하에서 시간의 경과에 따라 충분히 안정하여, 예를 들어 적어도 1 pg/세포, 바람직하게는 적어도 2 pg/세포, 바람직하게는 적어도 3 pg/세포, 더욱 바람직하게는 적어도 4 pg/세포, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 5 pg/세포의 양으로 축적된다.

따라서, 본 개시내용의 하나의 양태는, 하기 단계를 포함하는 공정에 관한 것이다: a) 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, 및/또는 ceDNA-바큐로바이러스)을 보유하는 숙주세포(예를 들어, 곤충 세포) 집단을, Rep 단백질의 존재 하에서, 숙주세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 숙주세포는 바이러스 캡시드 코딩 서열을 포함하지 않는 단계; 및 b) 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리하는 단계. Rep 단백질의 존재는 변형된 ITR을 갖는 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제를 유도하여, 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 생산한다. 하지만, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 비리온)는 발현되지 않는다. 따라서, 비리온으로 인한 크기 제한이 없다.

숙주세포에서 단리된 ceDNA 벡터의 존재는 숙주세포에서 단리된 DNA를 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 변성 및 미변성 겔 상에서 소화된 DNA 물질을 분석하여, 선형 및 비연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하는 방식으로 확인될 수 있다.

하나의 양태에 따르면, 본 개시내용은 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)로서, 2개의 플랭킹 대칭 역말단반복 서열(대칭인 ITR) 사이에 작동 가능하게 배치된 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 대칭인 ITR은 야생형 ITR이 아니며, 각각의 플랭킹 ITR은 동일한 대칭 변형을 갖는 ceDNA 벡터를 제공한다. 하나의 구현예에 따르면, 상기 대칭인 ITR 서열은 합성이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ITR은 표 4에 열거된 것들 중 임의의 것에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 대칭인 ITR은 각각 A, A', B, B', C, C', D 및 D'에서 선택되는 ITR 영역 중 적어도 하나에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 결실, 삽입 및/또는 치환은 통상적으로 A, A', B, B' C, 또는 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시킨다. 일부 구현예에 따르면, 상기 대칭인 ITR은 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 대칭인 ITR은 통상적으로 C 및 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 대칭인 ITR은 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 일부 및/또는 통상적으로 C 및 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 일부를 결실시키는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 대칭인 ITR은 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템-루프 구조를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 대칭인 ITR은 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템과 2개의 루프를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 대칭인 ITR은 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템과 단일 루프를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 대칭인 ITR은 본원의 도 7a 내지 도 22b 또는 표 4의 ITR, 및 표 4에 열거된 또는 도 7a 내지 도 22b에 제시된 ITR과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 ITR에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 AAV2 ITR이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 이종 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부는 적어도 하나의 조절 스위치의 제어 하에 있다.

또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)로서, 2개의 플랭킹 야생형 역말단반복 서열(WT-ITR) 사이에 작동 가능하게 배치된 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 이종 뉴클레오타이드 서열 중 전부 또는 일부는 적어도 하나의 조절 스위치의 제어 하에 있는 ceDNA 벡터를 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 WT-ITR 서열은 대칭인 WT-ITR 서열 또는 실질적으로 대칭인 WT-ITR 서열이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 WT-ITR 서열은 표 1에 제시된 WT-ITR의 조합 중 임의의 것에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 플랭킹 WT-ITR은 표 1 또는 표 2에 열거된 ITR과 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 모든 치환은 WT-ITR의 구조에 영향을 미치지 않는 보존적 핵산 치환이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 조절 스위치는 표 5 또는 본원의 "조절 스위치"라는 제목의 섹션에 열거된 조절 스위치 중 임의의 것 또는 조절 스위치의 조합에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ceDNA 벡터는, ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화되고 미변성 및 변성 겔 전기영동 둘 모두로 분석될 때, 선형 및 비연속 DNA 대조군과 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드를 나타낸다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ITR 서열은 파르보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노관련바이러스(AAV)에서 선택되는 바이러스의 서열을 기반으로 한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ITR은 아데노관련바이러스(AAV)의 서열을 기반으로 한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ITR은 AAV1, AAV2, AAV3. AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12에서 선택되는 AAV 혈청형의 서열을 기반으로 한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 벡터는 나노담체이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 나노담체는 지질 나노입자(LNP)를 포함한다.

본원의 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 (a) 적어도 하나의 Rep 단백질의 존재 하에서 ceDNA 발현 구조체를 보유하는 곤충 세포 집단을 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 ceDNA 발현 구조체가 곤충 세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 ceDNA 벡터를 인코딩하는 단계; 및 (b) 곤충 세포에서 ceDNA 벡터를 단리하는 단계를 포함하는 공정으로부터 수득된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ceDNA 발현 구조체는 ceDNA 플라스미드, ceDNA 박미드 및 ceDNA 바큐로바이러스에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 곤충 세포는 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 Rep 단백질은 파르보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노관련바이러스(AAV)에서 선택되는 바이러스에서 유래한 것이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 Rep 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12에서 선택되는 AAV 혈청형에서 유래한 것이다.

일부 구현예에 따르면, 본 개시내용은 본원의 임의의 양태 및 구현예의 ceDNA 벡터를 인코딩하는 ceDNA 발현 구조체를 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 구조체는 ceDNA 플라스미드, ceDNA 박미드 또는 ceDNA 바큐로바이러스이다.

일부 구현예에 따르면, 본 개시내용은 본원의 임의의 양태 및 구현예의 ceDNA 발현 구조체를 포함하는 숙주세포를 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 숙주세포는 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 Rep 단백질은 파르보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노관련바이러스(AAV)에서 선택되는 바이러스에서 유래한 것이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 Rep 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12에서 선택되는 AAV 혈청형에서 유래한 것이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 숙주세포는 곤충 세포이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 곤충 세포는 Sf9 세포이다.

일부 구현예에 따르면, 본 개시내용은 ceDNA 벡터를 생산하는 방법으로서, (a) 본원의 임의의 양태 및 구현예의 숙주세포를 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 (b) 숙주세포에서 ceDNA를 단리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

일부 구현예에 따르면, 본 개시내용 대상에서 질환 또는 장애를 치료, 예방, 개선, 모니터링 또는 진단하는 방법으로서, 본원의 임의의 양태 및 구현예의 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열이 질환 또는 장애를 치료, 예방, 개선, 진단 또는 모니터링하기 위해 선택된 것인 방법을 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열은, 전사되거나 번역될 때, 상기 대상에서 내인성 단백질의 비정상적인 양을 교정한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열은, 전사되거나 번역될 때, 상기 대상에서 내인성 단백질 또는 경로의 비정상적인 기능 또는 활성을 교정한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열은 RNAi, siRNA, miRNA, lncRNA, 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 분자를 인코딩하거나 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열은 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 단백질은 마커 단백질(예를 들어, 리포터 단백질)이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열은 상기 질환 또는 장애와 관련된 내인성 단백질 또는 경로의 아고니스트 또는 안타고니스트를 인코딩한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열은 항체를 인코딩한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 질환 또는 장애는 대사 질환 또는 장애, CNS 질환 또는 장애, 안구 질환 또는 장애, 혈액 질환 또는 장애, 간 질환 또는 장애, 면역 질환 또는 장애, 감염성 질환, 근육 질환 또는 장애, 암, 및 유전자 산물의 비정상적인 수준 및/또는 기능에 기반한 질환 또는 장애로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 대사 질환 또는 장애는 당뇨병, 리소좀 축적 장애(lysosomal storage disorder), 점액다당류 장애, 요소회로 질환 또는 장애, 및 글리코겐 축적 질환 또는 장애로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 리소좀 축적 장애는 고셔병(Gaucher's disease), 폼페병(Pompe disease), 이염성 백질디스트로피(MLD: metachromatic leukodystrophy), 페닐케톤뇨증(PKU) 및 파브리병(Fabry disease)으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 요소회로 질환 또는 장애는 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC: ornithine transcarbamylase) 결핍증이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 점액다당류 장애는 슬라이증후군(Sly syndrome), 헐러증후군(Hurler Syndrome), 샤이에증후군(Scheie Syndrome), 헐러-샤이에증후군, 헌터증후군(Hunter's Syndrome), 산필리포증후군(Sanfilippo Syndrome), 모르키오증후군(Morquio Syndrome) 및 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy Syndrome)으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 CNS 질환 또는 장애는 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 카나반병(Canavan disease), 리병(Leigh's disease), 레프숨병(Refsum disease), 뚜렛증후군(Tourette syndrome), 원발성 측삭경화증, 근위축성 측삭경화증, 진행성 근위축증, 픽병(Pick's disease), 근디스트로피, 다발경화증, 중증근무력증, 빈스방거병(Binswanger's disease), 척수 또는 두부 손상으로 인한 외상, 테이-삭스병(Tay Sachs disease), 레쉬-니한병(Lesch-Nyhan disease), 뇌전증, 뇌경색증, 정신과 장애, 조현병, 약물의존, 신경증, 정신병, 치매, 편집증, 주의력결핍장애, 수면장애, 통증장애, 식이 또는 체중 장애, 및 CNS의 암 및 종양으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 안구 질환 또는 장애는 망막, 후방로(posterior tract) 및/또는 시신경과 관련된 안과적 장애로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 망막, 후방로 및/또는 시신경과 관련된 안과적 장애는 당뇨망막병증, 연령관련 황반변성, 지도형위축, 및 혈관 또는 "습윤형" 황반변성을 포함하는 황반변성, 녹내장, 포도막염, 색소성망막염, 스타가르트병(Stargardt), 레베르 선천성 흑암시(LCA: Leber Congenital Amaurosis), 어셔증후군(Usher syndrome), 탄성섬유가황색종(PXE: pseudoxanthoma elasticum), x연관 색소성망막염(XLRP: x-linked retinitis pigmentosa), x연관 망막층간분리(XLRS: x-linked retinoschisis), 범맥락막위축(Choroideremia), 레베르 유전성 시신경병증(LHON: Leber hereditary optic neuropathy), 완전색맹, 추체-간체 디스트로피(cone-rod dystrophy), 푹스각막내피이상증(Fuchs endothelial corneal dystrophy), 당뇨병성 황반부종, 및 안구의 암 및 종양으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 혈액 질환 또는 장애는 A형 혈우병, B형 혈우병, 지중해빈혈, 빈혈 및 혈액암으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 간 질환 또는 장애는 진행성 가족성 간내 담즙정체(PFIC: progressive familial intrahepatic cholestasis), 및 간암 및 간종양으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 상기 질환 또는 장애는 낭성섬유증이이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 ceDNA 벡터는 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합으로 투여된다.

일부 구현예에 따르면, 본 개시내용은 치료용 단백질을 대상에게 전달하는 방법으로서, 본원의 임의의 양태 및 구현예의 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열이 치료용 단백질을 인코딩하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 치료용 단백질은 치료용 항체이다. 일부 구현예에 따르면, 상기 치료용 단백질은 효소, 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 수퍼옥시드 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 글로빈, 렙틴, 카탈라아제, 티로신 히드록실라아제, 사이토카인, 낭성섬유증 막관통 전도 조절제(CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 펩타이드 성장인자 및 호르몬으로 이루어지는 군에서 선택된다.

일부 구현예에 따르면, 본 개시내용은 패킷 삽입물과 함께 용기에 패키징된, 본원의 임의의 양태 및 구현예의 ceDNA 벡터와 나노담체를 포함하는 키트를 제공한다.

일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 ceDNA 벡터 생산용 키트로서, 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열 또는 조절 스위치, 또는 둘 모두의 삽입을 위한 적어도 하나의 제한 부위를 포함하는 발현 구조체를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 제한 부위는 (i) 대칭인 역말단반복 서열(대칭인 ITR)(여기서, 대칭인 ITR은 야생형 ITR이 아님) 또는 (ii) 2개의 야생형 역말단반복 서열(WT-ITR) 사이에 작동적으로 배치되어 있는 키트를 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 키트는 본원의 양태 및 구현예 중 어느 하나의 ceDNA 벡터를 생산하는 데 적합하다. 일부 구현예에 따르면, 상기 키트는 Rep 단백질 존재 하에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도할 수 있는, 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 곤충 세포 집단을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 상기 키트는 적어도 하나의 Rep 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 추가로 포함하며, 여기서 벡터는 곤충 세포에서 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현하는 데 적합하다.

본 개시내용의 이러한 및 다른 양태는 하기에 보다 상세하게 기재되어 있다.

도 1a는, ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 이러한 구현예에서, 예시적인 ceDNA 벡터는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 전이유전자(예를 들어, 루시퍼라아제)를 인코딩하는 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이에 있는 클로닝 부위(R3/R4)에 삽입된다. 발현 카세트에는 2개의 대칭인 역말단반복(ITR)이 플랭킹되어 있으며, 즉, 발현 카세트를 플랭킹하는 5' 변형된 ITR과 3' 변형된 ITR은 서로 대칭이다.
도 1b는, 인핸서/프로모터, 전이유전자의 삽입을 위한 오픈리딩프레임(ORF), 전사 후 요소(WPRE) 및 polyA 신호를 함유하는 발현 카세트를 갖는 ceDNA 벡터(또는 예시적인 ceDNA 플라스미드에 존재할 수 있는 상응하는 서열)의 예시적인 구조를 예시한다. 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이에 있는 클로닝 부위에의 전이유전자의 삽입을 가능하게 한다. 발현 카세트에는 2개의 대칭인 역말단반복(ITR), 즉, 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 변형된 ITR과 다운스트림(3'-말단)에 있는 변형된 ITR이 플랭킹되어 있으며, 여기서 5' ITR과 3' ITR은 모두 변형된 ITR이지만 동일한 변형을 갖는다(즉, 이들은 서로 구조적 거울상이며, 즉, 서로 대칭임).
도 2a는, ceDNA 벡터의 예시적인 구조를 예시한다. 이러한 구현예에서, 예시적인 ceDNA 벡터는 CAG 프로모터, WPRE 및 BGHpA를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 전이유전자(예를 들어, 루시퍼라아제)를 인코딩하는 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이에 있는 클로닝 부위(R3/R4)에 삽입된다. 발현 카세트에는 2개의 야생형 역말단반복(WT-ITR), 즉, 발현 카세트를 플랭킹하는 5' WT-ITR과 3' WT-ITR이 플랭킹되어 있다.
도 2b는, 인핸서/프로모터, 전이유전자의 삽입을 위한 오픈리딩프레임(ORF), 전사 후 요소(WPRE) 및 polyA 신호를 함유하는 발현 카세트를 갖는 ceDNA 벡터(또는 예시적인 ceDNA 플라스미드에 존재할 수 있는 상응하는 서열)의 예시적인 구조를 예시한다. 오픈리딩프레임(ORF)은 CAG 프로모터와 WPRE 사이에 있는 클로닝 부위에의 전이유전자의 삽입을 가능하게 한다. 발현 카세트에는 2개의 WT 역말단반복(WT-ITR), 즉, 발현 카세트의 업스트림(5'-말단)에 있는 WT-ITR과 다운스트림(3'-말단)에 있는 WT-ITR이 플랭킹되어 있으며, 여기서 5' WT-ITR과 3' WT-ITR은 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형에서 유래할 수 있다.
도 3a는, A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위(RBE 및 RBE')가 확인되는 AAV2의 야생형 좌측 ITR(서열번호 538)의 T-형 스템-루프 구조를 제공하고, 또한 말단 분해 부위(trs)를 보여준다. RBE는 Rep 78 또는 Rep 68과 상호작용하는 것으로 여겨지는 일련의 4개의 이중체 사량체를 함유한다. 나아가, RBE'는 또한 구조체 내 야생형 ITR 또는 돌연변이된 ITR 상에 어셈블링된 Rep 복합체와 상호작용하는 것으로 여겨진다. D 및 D' 영역은 전사인자 결합 부위와 다른 보존된 구조를 함유한다. 도 3b는, A-A' 아암, B-B' 아암, C-C' 아암, 2개의 Rep 결합 부위(RBE 및 RBE')가 확인되는 AAV2의 야생형 좌측 ITR의 T-형 스템-루프 구조를 포함하는 야생형 좌측 ITR(서열번호 539)에서의 제안된 Rep 촉매화된 닉킹 및 결찰 활성을 보여주고, 또한 말단 분해 부위(trs), 및 몇몇 전사인자 결합 부위와 다른 보존된 구조를 포함하는 D 및 D' 영역을 보여준다.
도 4a는, 야생형 좌측 AAV2 ITR(서열번호 540)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 아암의 1차 구조(폴리뉴클레오타이드 서열)(좌측)와 2차 구조(우측)를 보여준다. 도 4b는, 좌측 ITR에 대한 예시적인 돌연변이된 ITR(변형된 ITR로도 지칭됨) 서열을 보여준다. 예시적인 돌연변이된 좌측 ITR(ITR-1, 좌측)(서열번호 113)의 A-A' 아암의 RBE 부분과 C 아암 및 B-B' 아암의 1차 구조(좌측)와 예측된 2차 구조(우측)가 제시되어 있다. 도 4c는, 야생형 우측 AAV2 ITR(서열번호 541)의 A-A' 루프의 RBE 함유 부분과 B-B' 및 C-C' 아암의 1차 구조(좌측)와 2차 구조(우측)를 보여준다. 도 4d는, 야생형 우측 AAV2 ITR(서열번호 541)의 A-A' 루프의 RBE 함유 부분과 B-B' 및 C-C' 아암의 1차 구조(좌측)와 2차 구조(우측)를 보여준다. 도 4e는, 예시적인 우측 변형된 ITR을 보여준다. 예시적인 돌연변이 우측 ITR(ITR-1, 우측)(서열번호 114)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 B-B' 및 C 아암의 1차 구조(좌측)와 예측된 2차 구조(우측)가 제시되어 있다. 좌측 및 우측 ITR(예를 들어, AAV2 ITR, 또는 다른 바이러스 혈청형 또는 합성 ITR)의 임의의 조합이 사용될 수 있으며, 단, 좌측 ITR은 우측 ITR에 대칭이거나 역 보체이다. 도 3a 내지 3d 각각에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA를 생산하는 데 사용되는 플라스미드 또는 박미드/바큐로바이러스 게놈에 사용된 서열을 나타낸다. 또한, 도 4a 내지 4e 각각에는, 플라스미드 또는 박미드/바큐로바이러스 게놈의 ceDNA 벡터 구성 및 예측된 깁스 자유 에너지 값에서 추론된 상응하는 ceDNA 2차 구조가 포함되어 있다.
도 5a는, 도 5b의 개략도에 기재된 공정에서 ceDNA의 생산에 유용한 바큐로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 제조하는 업스트림 공정을 예시하는 개략도이다. 도 5b는 예시적인 ceDNA 생산 방법의 개략도이고, 도 5c는 ceDNA 벡터 생산을 확인하기 위한 생화학적 방법 및 공정을 예시한다. 도 5d 및 도 5e는, 도 4b의 ceDNA 생산 공정 동안 수득된 세포 펠릿에서 수거된 DNA에서 ceDNA의 존재를 식별하는 공정을 설명하는 개략도이다. 도 5e는, 비연속 구조를 갖는 DNA를 보여준다. ceDNA는 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되어, 중성 및 변성 조건 모두에서 상이한 크기(1 kb 및 2 kb)를 갖는 2개의 DNA 단편을 생성할 수 있다. 도 5e는, 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA를 또한 보여준다. ceDNA 벡터는 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단되어, 중성 조건에서는 1 kb 및 2 kb로 이동하는 2개의 DNA 단편을 생성할 수 있지만, 변성 조건에서는 가닥이 연결된 채로 유지되어 2 kb 및 4 kb로 이동하는 단일 가닥을 생성할 수 있다. 도 5d는, 절단되지 않은 채로 유지되거나 제한 엔도뉴클레아제로 소화된 후, 미변성 겔 또는 변성 겔 상에서 전기영동에 적용된 예시적인 ceDNA에 대한 개략적인 예상 밴드를 보여준다. 가장 좌측의 개략도는 미변성 겔이며, 이는 이중체 및 절단되지 않은 형태에서 ceDNA가, 더 빠르게 이동하는 더 작은 단량체와 단량체 크기의 2배인 더 느리게 이동하는 이량체로 보이는, 적어도 단량체와 이량체 상태로 존재함을 시사한다. 좌측에서 두 번째 개략도는, ceDNA가 제한 엔도뉴클레아제로 절단되는 경우, 본래 밴드가 사라지고, 절단 후 남아있는 예상 단편 크기에 상응하는 더 빠르게 이동하는(예를 들어, 더 작은) 밴드가 나타남을 보여준다. 변성 조건 하에서, 본래 이중체 DNA는 단일가닥이며, 이는 상보적 가닥이 공유결합으로 연결되어 있기 때문에, 미변성 겔 상에서 관찰된 것 보다 2배 더 큰 종으로 이동한다. 따라서, 우측에서 두 번째 개략도에서, 소화된 ceDNA는 미변성 겔에서 관찰된 것과 유사한 밴딩 분포를 보여주지만, 밴드는 미변성 겔 대응물의 2배 크기의 단편으로 이동한다. 가장 우측의 개략도는, 변성 조건 하에서 절단되지 않은 ceDNA가 단일가닥 개방형 고리로 이동하기 때문에, 관찰된 밴드는 고리가 개방되지 않은 미변성 조건에서 관찰된 것의 2배 크기임을 보여준다. 이러한 도면에서, "kb"는, 문맥에 따라, 뉴클레오타이드 사슬 길이(예를 들어, 변성 조건에서 관찰된 단일가닥 분자의 경우) 또는 염기쌍의 수(예를 들어, 미변성 조건에서 관찰된 이중가닥 분자의 경우)를 기반으로 뉴클레오타이드 분자의 상대적인 크기를 나타내는 데 사용된다.
도 6a는, Rep 단백질인 Rep52 및 Rep78에 대한 핵산 서열을 포함하는 pFBDLSR 플라스미드의 예시적인 Rep-박미드이다. 이러한 예시적인 Rep-박미드는, IE1 프로모터 단편(서열번호 66); Kozak 서열을 포함하는 Rep78 뉴클레오타이드 서열(서열번호 67), Rep52에 대한 다면체 프로모터 서열(서열번호 68) 및 Kozak 서열 gccgccacc로 시작하는 Rep58 뉴클레오타이드 서열(서열번호 69)을 포함한다. 도 6b는, 변형된 좌측 ITR(L-변형된 ITR), CAG 프로모터, 루시퍼라아제 전이유전자, WPRE 및 폴리아데닐화 서열, 및 변형된 우측 ITR(R-변형된 ITR)을 갖고, 여기서 L-변형된 ITR과 R-변형된 ITR이 서로 대칭인, 예시적인 ceDNA-플라스미드의 개략도이다. 도 6c는, WT-좌측 ITR(L-WT-ITR), CAG 프로모터, 루시퍼라아제 전이유전자, WPRE 및 폴리아데닐화 서열, 및 WT-우측 ITR(R-WT ITR)을 갖는 예시적인 ceDNA-플라스미드의 개략도이다.
도 7a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-33(좌측)" 서열번호 101)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 7b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-18(우측)" 서열번호 102)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-18, 우측)을 보여준다. ITR-33(좌측)과 ITR-18(우측)은 모두 단일 아암(즉, 단일 C-C' 아암)을 갖는 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 8a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-34(좌측)" 서열번호 103)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 8b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-51(우측)" 서열번호 96)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-51, 우측)을 보여준다. ITR-34(좌측)와 ITR-51(우측)은 모두 단일 아암(즉, 단일 B-B' 아암)을 갖는 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 9a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-35(좌측)" 서열번호 105)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 9b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-35(우측)" 서열번호 105)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-19, 우측)을 보여준다. ITR-35(좌측)와 ITR-19(우측)는 모두 단일 아암(즉, 단일 C-C' 아암)을 갖는 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 10a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-36(좌측)" 서열번호 454)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 10b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-20(우측)" 서열번호 116)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-20(우측))을 보여준다. ITR-36(좌측)과 ITR-20(우측)은 모두 2개의 아암을 갖고, 이 중 하나가 절단된(예를 들어, C-C' 아암이 절단되어 있음) 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 11a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-37(좌측)" 서열번호 111)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 11b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-21(우측)" 서열번호 112)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-21(우측))을 보여준다. ITR-37(좌측)과 ITR-21(우측)은 모두 단일 스템을 갖는 구조(예를 들어, 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역 내 단일 스템-루프 구조)를 형성할 것으로 예측된다.
도 12a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-38(좌측)" 서열번호 117)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 12b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-22(우측)" 서열번호 118)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-22(우측))을 보여준다. ITR-38(좌측)과 ITR-22(우측)는 모두 2개의 아암을 갖고, 이 중 하나가 절단된(예를 들어, B-B' 아암이 절단되어 있음) 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 13a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-39(좌측)" 서열번호 119)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 13b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-23(우측)" 서열번호 120)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-23(우측))을 보여준다. ITR-39(좌측)와 ITR-23(우측)은 모두 2개의 아암을 갖고, 이 중 하나가 절단된(예를 들어, B-B' 아암이 절단되어 있음) 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 14a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-40(좌측)" 서열번호 121)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 14b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-24(우측)" 서열번호 122)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-24(우측))을 보여준다. ITR-40(좌측)과 ITR-24(우측)는 모두 2개의 아암을 갖고, 이 중 하나가 절단된(예를 들어, B-B' 아암이 절단되어 있음) 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 15a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-41(좌측)" 서열번호 107)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 15b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-25(우측)" 서열번호 108)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-25(우측))을 보여준다. ITR-41(좌측)과 ITR-25(우측)는 모두 2개의 아암을 갖고, 이 중 하나가 절단된(예를 들어, B-B' 아암이 절단되어 있음) 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 16a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-42(좌측)" 서열번호 123)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 16b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-26(우측)" 서열번호 124)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-26(우측))을 보여준다. ITR-42(좌측)와 ITR-26(우측)은 모두 2개의 아암을 갖고, 이 중 하나가 연장된(예를 들어, C-C' 아암이 절단되어 있음) 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 17a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-43(좌측)" 서열번호 125)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 17b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-27(우측)" 서열번호 126)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-27(우측))을 보여준다. ITR-43(좌측)과 ITR-27(우측)은 모두 2개의 아암을 갖고, 이 중 하나가 연장된(예를 들어, C-C' 아암이 절단되어 있음) 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 18a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-44(좌측)" 서열번호 127)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 18b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-28(우측)" 서열번호 128)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-28(우측))을 보여준다. ITR-44(좌측)와 ITR-28(우측)은 모두 2개의 아암을 갖고, 이 중 하나가 절단된(예를 들어, C-C' 아암이 절단되어 있음) 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 19a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-45(좌측)" 서열번호 129)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 19b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-29(우측)" 서열번호 130)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-29(우측))을 보여준다. ITR-45(좌측)와 ITR-29(우측)는 모두 2개의 아암을 갖고, 이 중 하나가 절단된(예를 들어, C-C' 아암이 절단되어 있음) 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 20a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-46(좌측)" 서열번호 131)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 20b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-30(우측)" 서열번호 132)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-30(우측))을 보여준다. ITR-46(좌측)과 ITR-30(우측)은 모두 2개의 아암을 갖고, 이 중 하나가 절단된(예를 들어, C-C' 아암이 절단되어 있음) 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 21a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-47(좌측)" 서열번호 133)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 21b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-31(우측)" 서열번호 134)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-31(우측))을 보여준다. ITR-47(좌측)과 ITR-31(우측)은 모두 2개의 아암을 갖고, 이 중 하나가 절단된(예를 들어, C-C' 아암이 절단되어 있음) 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 22a는, 예시적인 변형된 좌측 ITR("ITR-48(좌측)" 서열번호 547)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주고, 도 22b는, 예시적인 변형된 우측 ITR("ITR-32(우측)" 서열번호 546)의 A-A' 아암의 RBE 함유 부분과 C-C' 및 B-B' 부분의 예측된 최저 에너지 구조를 보여주는 동족의 대칭인 우측 ITR(ITR-32(우측))을 보여준다. ITR-48(좌측)과 ITR-32(우측)는 모두 2개의 아암을 갖고, 이 중 하나가 절단된(예를 들어, C-C' 아암이 절단되어 있음) 구조를 형성할 것으로 예측된다.
도 23은, 표 4(또한 전체 구조체에 대해서는 표 7 참조)의 대칭인 돌연변이 ITR 변이체를 갖는 16개의 ceDNA로 트랜스펙션된 Sf9 GlycoBac 곤충 세포의 루시퍼라아제 활성을 보여준다. ceDNA 벡터는 표 4에서 선택된 대칭인 돌연변이 ITR이 플랭킹된 루시퍼라아제 유전자를 가졌다. "모의" 조건은 공여체 DNA 없이 트랜스펙션 시약 단독이다.
도 24a와 도 24b는, 실시예 4에 기재된 WT/WT ITR 구조체로 트랜스펙션된 Sf9 GlycoBac 곤충 세포의 GFP 활성을 보여준다. ceDNA 벡터는 WT ITR이 플랭킹된 GFP 유전자를 가졌다. 도 24a는, WT/WT ITR GFP ceDNA 벡터로 트랜스펙션되고, 이어서 Rep 바이러스로 감염된 Sf9 세포의 40배 배율로의 형광 현미경을 사용한 이미지를 제공한다. 도 24b는, "도 24a"의 이미지에 도시된 동일한 세포의 40배 배율의 명시야 이미지를 제공한다. 도 24c는, WT/WT ITR로 트랜스펙션되었지만, Rep 바이러스로 감염되지 않은 대조군 세포의 40배 배율의 명시야 이미지를 제공한다. 이러한 세포는 어떠한 형광 신호도 생성하지 못했다.
도 25는, 야생형 ITR을 갖는 것으로 추정되는 ceDNA의 미변성 아가로오스 겔(1% 아가로오스)을 보여준다. 첫 번째 레인은 1 kb Plus DNA ladder를 보여주고, 두 번째 레인은 야생형 ITR 카세트를 함유하는 플라스미드를 사용하여 생성된 ceDNA를 보여준다(둘 모두 동일한 겔에서 취한 것임). GFP ceDNA 단량체 종은 약 4 kb에서 예상되고, 이량체는 약 8 kb에서 예상된다.
도 26은, 야생형 ITR을 함유하는 ceDNA의 변성 겔을 보여준다. 첫 번째 레인은 1 kb Plus DNA ladder를 보여주고, 두 번째 레인은 엔도뉴클레아제로 절단되지 않은 야생형 ceDNA를 보여주고, 세 번째 레인은 제한 엔도뉴클레아제 효소 ClaI로 절단된 동일한 야생형 ceDNA를 보여준다. 모든 샘플은 동일한 겔에서 유래한 것이다.
도 27은, 구조체-388(돌연변이체)과 구조체-393(야생형 AAV2)의 대칭인 ITR의 잠재적인 2차 구조를 보여준다.
도 28은, LNP + polyC(대조군); LNP + 좌측에 WT AAV2 ITR과 우측에 절단된 ITR을 갖는 Sf9에서 생산된 비대칭 ceDNA; LNP + 좌우 양측에 대칭적으로 WT AAV2 ITR을 갖는 합성 ceDNA; LNP + 비대칭인 ITR(좌측에 WT AAV2 ITR과 우측에 절단된 ITR)을 갖는 합성 ceDNA; 좌우 양측에 대칭적으로 돌연변이 ITR을 갖는 Sf9에서 생산된 ceDNA(구조체-388); 및 구조체의 좌우 양측에 대칭적으로 야생형 AAV2 ITR을 함유하는 ceDNA(구조체-393; Sf9에서 생산됨)로 처리된 CD-1 마우스의 체중 변화를 보여준다.
도 29a와 도 29b는, 하기로 처리된 CD-1 마우스에서의 14일차 루시퍼라아제 생체내 발현의 이미지를 도시한 것이다: (1) LNP + polyC(대조군; 좌측 상단); (2) LNP + Sf9에서 생산된, 구조체의 좌우 양측에 대칭적으로 돌연변이 ITR을 갖는 ceDNA(구조체-388)(우측 상단); 및 (3) Sf9에서 생산된 대칭인 야생형 AAV2 ITR을 함유하는 ceDNA(구조체-393; 하단 중간 패널).

특히 희귀 질환의 치료제 개발에 있어서 가장 큰 장애물 중 하나는, 많은 수의 개별 병태이다. 지구 상에서 대략 3억 5천만명의 사람들이, 진단받은 사람이 200,000명 미만인 장애 또는 병태로 미국국립보건원(National Institutes of Health)에서 정의한, 희귀 장애를 갖고 살고 있다. 이러한 희귀 장애 중 약 80%는 유전적 기원이며, 이 중 약 95%는 FDA가 승인한 치료법이 없다.

본원에 기재된 ceDNA 벡터의 이점 중 하나는, 다수의 유전적 장애 또는 질환을 위한 치료의 현재 상태를 유의미하게 변경시킬 수 있는, 다수의 질환, 특히 희귀 단일유전자 질환에 신속하게 적용될 수 있는 접근법을 제공하는 것이다. 나아가, 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 조절 스위치를 포함하기 때문에, 전달 후 제어 가능한 유전자 발현을 가능하게 한다.

I. 정의

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 본 개시내용이 속하는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 면역학 및 분자생물학에서의 상용 용어 정의는, 하기 문헌에서 확인할 수 있다: 문헌[The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)]; 문헌[Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6^th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013)]; 문헌[Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)]; 문헌[Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]; 문헌[Immunology by Werner Luttmann, Elsevier, 2006]; 문헌[Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)]; 문헌[Lewin's Genes XI, Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055)]; 문헌[Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)]; 문헌[Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)]; 문헌[Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385)]; 문헌[Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005]; 및 문헌[Current Protocols in Immunology (CPI), John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)](상기 문헌들의 내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨).

본원에 사용된 "투여", "투여하는"이라는 용어 및 이의 변형은, 대상에게 조성물 또는 작용제(예를 들어, 핵산, 특히 ceDNA)를 도입하는 것을 나타내며, 하나 이상의 조성물 또는 작용제의 동시 및 순차적 도입을 포함한다. "투여"는, 예를 들어 치료, 약동학, 진단, 연구, 위약 및 실험 방법을 나타낼 수 있다. "투여"는 또한 시험관내 및 생체외 처리를 포함한다. 대상으로의 조성물 또는 작용제의 도입은, 경구, 폐, 비강, 비경구(정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하), 직장, 림프내, 종양내 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 경로로 이루어진다. 투여는 자가 투여와 다른 이에 의한 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로로 수행될 수 있다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 작용제가 이의 의도된 기능을 수행하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물은 조성물 또는 작용제를 대상의 정맥에 도입하는 방식으로 투여된다.

본원에 사용된 "항체"라는 용어는, 가장 넓은 의미로 사용되며, 이는 다양한 항체 구조, 비제한적으로, 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다. "항체 단편"은, 온전한 항체에 결합하는 동일한 항원과 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 나타낸다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 면역글로불린 사슬 또는 항체 단편 및 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함한다. 항체 또는 이의 단편의 예에는, 비제한적으로, Fv, scFv, Fab 단편, Fab', F(ab')₂, Fab'-SH, 단일 도메인 항체(dAb), 중쇄, 경쇄, 중쇄 및 경쇄, 전장 항체(예를 들어, Fc, Fab, 중쇄, 경쇄, 가변 영역 등을 각각 포함함), 이중특이적 항체, 디아바디, 선형 항체, 단일 사슬 항체, 인트라바디, 단클론 항체, 키메라 항체, 다중특이적 항체 또는 다량체 항체가 포함된다. 항체 또는 이의 단편은, 비제한적으로, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함하는 임의의 클래스, 및 비제한적으로 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2를 포함하는 임의의 서브클래스에 속할 수 있다. 또한, 항체는 임의의 포유류, 예를 들어 영장류, 인간, 래트, 마우스, 말, 염소 등에서 유도될 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 변형된 항체이다. 일부 구현예에서, 항체의 구성요소는 항체가 단백질 구성요소의 발현 후 자가 어셈블링되도록 별도로 발현될 수 있다. 일부 구현예에서, 항체는 인간에서 면역원성 반응을 감소시키기 위해 "인간화"된다. 일부 구현예에서, 항체는 목적하는 기능, 예를 들어 질환 또는 질환의 증상을 치료할 목적으로 목적하는 단백질의 상호작용 및 저해를 갖는다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 프레임워크 영역 또는 F_c 영역을 포함한다.

본원에 사용된 항체 분자의 "항원-결합 도메인"이라는 용어는, 항원 결합에 참여하는 항체 분자, 예를 들어 면역글로불린(Ig) 분자의 일부를 나타낸다. 구현예에서, 항원 결합 부위는 중쇄(H)와 경쇄(L)의 가변(V) 영역의 아미노산 잔기로 형성된다. 초가변 영역으로 지칭되는, 중쇄와 경쇄의 가변 영역 내 3개의 고도로 분기된 스트레치는, "프레임워크 영역"(FR)으로 불리는 보다 보존된 플랭킹 스트레치 사이에 배치되어 있다. FR은 면역글로불린의 초가변 영역 사이 및 이에 인접한 곳에서 자연적으로 발견되는 아미노산 서열이다. 구현예에서, 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역과 중쇄의 3개의 초가변 영역은 3차원 공간에서 서로 상대적으로 배치되어, 결합된 항원의 3차원 표면에 상보적인 항원-결합 표면을 형성한다. 중쇄와 경쇄 각각의 3개의 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로 지칭된다. 프레임워크 영역과 CDR은, 예를 들어 문헌[Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 및 문헌[Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]에 정의 및 기재되어 있다. 각각의 가변 사슬(예를 들어, 가변 중쇄와 가변 경쇄)은 전형적으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 아미노산 순서로 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성된다.

본원에 사용된 "항-치료용 핵산 면역 반응", "항-전달 벡터 면역 반응", "치료용 핵산에 대한 면역 반응", "전달 벡터에 대한 면역 반응" 등의 구절은, 바이러스 또는 비바이러스 기원의 치료용 핵산에 대한 임의의 목적하지 않는 면역 반응을 나타낸다. 일부 구현예에서, 목적하지 않는 면역 반응은 바이러스성 전달 벡터 자체에 대한 항원 특이적 면역 반응이다. 일부 구현예에서, 면역 반응은 이중가닥 DNA, 단일가닥 RNA 또는 이중가닥 RNA일 수 있는 전달 벡터에 특이적이다. 다른 구현예에서, 면역 반응은 전달 벡터의 서열에 특이적이다. 다른 구현예에서, 면역 반응은 전달 벡터의 CpG 함량에 특이적이다.

본원에 사용된 "담체"에는, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등이 포함된다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. "약학적으로 허용 가능한"이라는 구절은, 숙주에게 투여될 때 독성, 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 나타낸다.

본원에 사용된 "ceDNA"라는 용어는, 합성 또는 그 이외의 다른 비바이러스성 유전자 전달을 위한 캡시드 미함유 폐쇄형 선형 이중가닥(ds) 이중체 DNA를 나타낸다. ceDNA에 대한 상세한 설명은, 2017년 3월 3일자 출원된 국제 출원 PCT/US2017/020828에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 명백하게 본원에 참조로서 인용된다. 세포 기반 방법을 사용하여 다양한 역말단반복(ITR) 서열 및 구성을 포함하는 ceDNA의 생산을 위한 특정 방법은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 출원 PCT/US18/49996 및 2018년 12월 6일자 출원된 PCT/US2018/064242의 실시예 1에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 다양한 ITR 서열 및 구성을 포함하는 합성 ceDNA 벡터의 생산을 위한 특정 방법은, 예를 들어 2019년 1월 18일자 출원된 국제 출원 PCT/US2019/14122에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로서 인용된다. 본원에 사용된 "ceDNA 벡터" 및 "ceDNA"라는 용어는 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 폐쇄형 선형 이중체(CELiD) CELiD DNA이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 DNA 기반 미니서클(minicircle)이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE: minimalistic immunological-defined gene expression) 벡터이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 미니스트링 DNA이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 발현 카세트의 5' 및 3' 말단에 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 doggybone™ DNA이다.

본원에 사용된 "ceDNA-박미드"라는 용어는, 플라스미드로서 대장균에서 증식할 수 있고, 따라서 바큐로바이러스에 대한 셔틀 벡터로서 작용할 수 있는 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 감염성 바큐로바이러스 게놈을 나타낸다.

본원에 사용된 "ceDNA-바큐로바이러스"라는 용어는, 바큐로바이러스 게놈 내에 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 바큐로바이러스를 나타낸다.

본원에 사용된 "ceDNA-바큐로바이러스 감염된 곤충 세포" 및 "ceDNA-BIIC"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, ceDNA-바큐로바이러스로 감염된 무척추동물 숙주세포(비제한적으로, 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포) 포함)를 나타낸다.

본원에 사용된 "ceDNA 게놈"이라는 용어는, 적어도 하나의 역말단반복 영역을 추가로 포함하는 발현 카세트를 나타낸다. ceDNA 게놈은 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 게놈은 DNA의 분자간 이중체 폴리뉴클레오타이드로서 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 혼입된다.

본원에 사용된 "ceDNA-플라스미드"라는 용어는, 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 플라스미드를 나타내다.

본원에 사용된 "폐쇄형 DNA 벡터", "ceDNA 벡터" 및 "ceDNA"라는 용어는 상호 교환적으로 사용되며, 적어도 하나의 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 DNA 벡터(즉, 분자내 이중체)를 나타낸다. 일부 구현예에서, ceDNA는 2개의 공유결합으로 폐쇄된 말단을 포함한다.

본원에 사용된 "ceDNA 스페이서 영역"이라는 용어는, ceDNA 벡터 또는 ceDNA 게놈에서 기능성 요소를 분리하는 개재 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은 최적의 기능을 위해 2개의 기능성 요소를 목적하는 거리로 유지시킨다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은, 예를 들어 플라스미드 또는 바큐로바이러스 내에 ceDNA 게놈의 유전적 안정성을 제공하거나 부가한다. 일부 구현예에서, ceDNA 스페이서 영역은, 클로닝 부위 등에 대한 편리한 위치를 제공하는 방식으로, ceDNA 게놈의 준비된 유전자 조작을 용이하게 한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 몇몇 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 "폴리링커", 또는 공지된 단백질(예를 들어, 전사인자) 결합 부위를 갖지 않도록 설계된 비(非)오픈리딩프레임 서열은, 시스-작용 인자를 분리하기 위해, 예를 들어 말단 분해 부위와 업스트림 전사 조절 요소 사이에 6량체, 12량체, 18량체, 24량체, 48량체, 86량체, 176량체 등을 삽입하는 방식으로, ceDNA 게놈에 배치될 수 있다. 유사하게, 스페이서는 폴리아데닐화 신호 서열과 3'-말단 분해 부위 사이에 혼입될 수 있다.

본원에 사용된 활성제 또는 치료제, 예컨대 치료용 핵산의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"이라는 구절은, 목적하는 효과, 예를 들어 치료용 핵산의 부재 하에서 검출된 발현 수준과 비교하여 표적 서열의 발현 저해를 생성하는 데 충분한 양이다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현을 측정하는 데 적합한 검정에는, 예를 들어 도트 블롯(dot blot), 노던 블롯(northern blot), 제자리 혼성화, ELISA, 면역침강, 효소 기능과 같은 당업자에게 공지된 기술뿐 아니라, 당업자에게 공지된 표현형 검정을 사용하는 단백질 또는 RNA 수준의 검사가 포함된다.

본원에 사용된 "외인성"라는 용어는, 천연 공급원 이외의 세포에 존재하는 물질을 나타낸다. 본원에 사용된 "외인성"이라는 용어는, 인간의 손이 관여하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템에 도입된 핵산(예를 들어, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산) 또는 폴리펩타이드로서, 통상적으로 발견되지 않으며 인간이 이러한 세포 또는 유기체에 도입하고자 하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 대안적으로, "외인성"은, 인간의 손이 관여하는 과정에 의해 세포 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템에 도입된 핵산 또는 폴리펩타이드로서, 비교적 낮은 수준으로 발견되며, 인간이, 예를 들어 이소성(ectopic) 발현 또는 수준을 생성하도록 이러한 세포 또는 유기체 내 핵산 또는 폴리펩타이드의 양을 증가시키기 위해 도입하고자 하는 핵산 또는 폴리펩타이드를 나타낼 수 있다. 대조적으로, 본원에 사용된 "내인성"이라는 용어는, 생물학적 시스템 또는 세포에 고유한 물질을 나타낸다.

본원에 사용된 "이펙터(effector) 단백질"이라는 용어는, 예를 들어 리포터 폴리펩타이드, 또는 보다 적절하게는, 세포를 사멸시키는 폴리펩타이드, 예를 들어 독소, 또는 세포가 선택된 작용제 또는 이의 결여로 인해 사멸하기 쉽게 만드는 작용제로서 검출 가능한 판독물을 제공하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 이펙터 단백질에는, 숙주세포의 DNA 및/또는 RNA를 직접 표적으로 하거나 이를 손상시키는 임의의 단백질 또는 펩타이드가 포함된다. 예를 들어, 이펙터 단백질은, 비제한적으로, 숙주세포 DNA 서열(게놈 요소인지 또는 염색체외 요소인지에 관계없이)을 표적으로 하는 제한 엔도뉴클레아제, 세포 생존에 필요한 폴리펩타이드 표적을 분해하는 프로테아제, DNA 자이라아제(gyrase) 저해제 및 리보뉴클레아제 유형 독소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 합성 생물학적 회로에 의해 제어되는 이펙터 단백질의 발현은, 또 다른 합성 생물학적 회로에 인자로 참여하여, 생물학적 회로 시스템의 반응성의 범위 및 복잡성을 확장시킬 수 있다.

본원에 사용된 "발현 카세트" 및 "전사 카세트"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 하나 이상의 프로모터, 또는 전이유전자의 전사를 지시하는 데 충분한 다른 조절 서열에 작동 가능하게 연결되어 있는 전이유전자를 포함하지만, 캡시드 인코딩 서열, 다른 벡터 서열 또는 역말단반복 영역을 포함하지 않는 핵산의 선형 스트레치를 나타낸다. 발현 카세트는 하나 이상의 시스-작용 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 또는 억제제), 하나 이상의 인트론 및 하나 이상의 전사 후 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "플랭킹"이라는 용어는, 또 다른 핵산 서열에 대한 하나의 핵산 서열의 상대적인 위치를 나타낸다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B에는 A와 C가 플랭킹되어 있다. 이는 배열 AxBxC에 대해서도 동일하게 적용된다. 따라서, 플랭킹 서열은 플랭킹된 서열의 앞에 있거나 뒤에 있지만, 플랭킹된 서열에 인접하거나 바로 근접할 필요는 없다. 하나의 구현예에서, 플랭킹이라는 용어는, 선형 단일가닥 합성 AAV 벡터의 각 말단에 있는 말단반복을 나타낸다.

본원에 사용된 "전장 항체"이라는 용어는, 예를 들어 자연적으로 발생되며, 정상적인 면역글로불린 유전자 단편 재조합 과정에 의해 형성되는, 면역글로불린(Ig) 분자(예를 들어, IgG 항체)를 나타낸다.

본원에 사용된 "기능성 항체 단편"라는 용어는, 온전한(예를 들어, 전장) 항체에 의해 인식되는 것과 동일한 항원에 결합하는 단편을 나타낸다. "항체 단편" 또는 "기능성 단편"이라는 용어는 또한, 가변 영역으로 이루어진 단리된 단편, 예컨대 중쇄와 경쇄의 가변 영역으로 이루어진 "Fv" 단편, 또는 중쇄와 경쇄의 가변 영역이 펩타이드 링커에 의해 연결되어 있는 재조합 단일 사슬 폴리펩타이드 분자("scFv 단백질")를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 Fc 단편 또는 단일 아미노산 잔기와 같은 항원 결합 활성이 없는 항체의 부분을 포함하지 않는다.

본원에 사용된 "갭(gap)" 및 "닉(nick)"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 본 개시내용의 합성 DNA 벡터의 중단된 부분으로, 다르게는 이중가닥 ceDNA에서 단일가닥 DNA 부분의 스트레치를 형성하는 중단된 부분을 나타낸다. 갭은 이중체 DNA의 하나의 가닥에서 1개 염기쌍 내지 100개 염기쌍 길이일 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 설계되고 형성된 전형적인 갭, 및 이러한 방법에 의해 생성된 합성 벡터는, 예를 들어 길이가 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 11 bp, 12 bp, 13 bp, 14 bp, 15 bp, 16 bp, 17 bp, 18 bp, 19 bp, 20 bp, 21 bp, 22 bp, 23 bp, 24 bp, 25 bp, 26 bp, 27 bp, 28 bp, 29 bp, 30 bp, 31 bp, 32 bp, 33 bp, 34 bp, 35 bp, 36 bp, 37 bp, 38 bp, 39 bp, 40 bp, 41 bp, 42 bp, 43 bp, 44 bp, 45 bp, 46 bp, 47 bp, 48 bp, 49 bp, 50 bp, 51 bp, 52 bp, 53 bp, 54 bp, 55 bp, 56 bp, 57 bp, 58 bp, 59 bp 또는 60 bp일 수 있다. 본 개시내용에 예시된 갭은 길이가 1 bp 내지 10 bp, 1 bp 내지 20 bp, 1 bp 내지 30 bp일 수 있다.

본원에 사용된 "유전자"라는 용어는, 시험관내 또는 생체내에서 주어진 RNA 또는 단백질의 발현과 관련된 핵산의 임의의 분절을 나타내는 것으로 광범위하게 사용된다. 따라서, 유전자는 발현된 RNA를 인코딩하는 영역(전형적으로 폴리펩타이드 코딩 서열을 포함함), 및 종종 이의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. 유전자는 관심 공급원으로부터의 클로닝, 또는 공지되거나 예측된 서열 정보로부터의 합성을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있으며, 구체적으로 목적하는 매개변수를 갖도록 설계된 서열을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "유전 질환" 또는 "유전 장애"라는 구절은, 부분적으로 또는 완전히, 직접적으로 또는 간접적으로, 게놈 내 하나 이상의 비정상에 의해 유발된 질환으로, 특히 출생 시부터 존재한 병태를 포함하는 질환을 나타낸다. 비정상은 유전자에서의 돌연변이, 삽입 또는 결실일 수 있다. 비정상은 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 미칠 수 있다.

본원에 사용된 "이종"이라는 용어는, 각각, 천연 핵산 또는 단백질에서 발견되지 않는 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 나타낸다.

본원에 사용된 "이종 뉴클레오타이드 서열" 및 "전이유전자"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 혼입되고, 이에 의해 전달 및 발현될 수 있는 (캡시드 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 이외의) 관심 핵산을 나타낸다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전자 조작에 의해) 자연 발생 핵산 서열(또는 이의 변이체)에 연결되어, 키메라 폴리펩타이드를 인코딩하는 키메라 뉴클레오타이드 서열을 생성할 수 있다. 이종 핵산 서열은 (예를 들어, 유전자 조작에 의해) 변이형 폴리펩타이드에 연결되어, 융합 변이형 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 생성할 수 있다. 관심 전이유전자에는, 비제한적으로, 폴리펩타이드, 바람직하게는 치료용(예를 들어, 의료용, 진단용 또는 수의학용) 또는 면역원성 폴리펩타이드(예를 들어, 백신용)를 인코딩하는 핵산이 포함된다. 일부 구현예에서, 관심 핵산에는 치료용 RNA로 전사되는 핵산이 포함된다. 본 개시내용의 ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포함된 전이유전자에는, 비제한적으로, 하나 이상의 폴리펩타이드, 펩타이드, 리보자임, 압타머, 펩타이드 핵산, siRNA, RNAi, miRNA, lncRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 항체, 항원 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합을 발현하거나 인코딩하는 것들이 포함된다.

본원에 사용된 "상동성" 또는 "상동"이라는 용어는, 서열의 정렬, 및 필요한 경우, 최대 서열 동일성%를 달성하기 위한 갭의 도입 후, 표적 염색체 상의 상응하는 서열의 뉴클레오타이드 잔기와 동일한 상동성 아암의 뉴클레오타이드 잔기의 백분율을 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열 상동성%를 결정하기 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여, 당업계의 기술 내에서 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 예를 들어 수복 주형(repair template)의 상동성 아암의 핵산 서열(예를 들어, DNA 서열)은, 서열이 숙주세포의 상응하는 천연 또는 미편집된 핵산 서열(예를 들어, 게놈 서열)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상 동일한 경우, "상동"인 것으로 간주된다.

본원에 사용된 "숙주세포"라는 용어는, 본 개시내용의 핵산 치료제를 이용한 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입 등에 민감한 임의의 세포 유형을 나타낸다. 비제한적인 예로서, 숙주세포는 단리된 1차 세포, 다능성줄기세포, CD34⁺ 세포, 유도된 다능성줄기세포, 또는 다수의 불멸화된 세포주 중 임의의 것(예를 들어, HepG2 세포)일 수 있다. 대안적으로, 숙주세포는 조직, 기관 또는 유기체의 제자리 또는 생체내 세포일 수 있다. 나아가, 숙주세포는, 예를 들어 포유류 대상(예를 들어, 유전자 치료를 필요로 하는 인간 환자)의 표적세포일 수 있다.

본원에 사용된 "면역글로불린 가변 도메인 서열"은, 면역글로불린 가변 도메인의 구조를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 나타낸다. 예를 들어, 상기 서열은 자연 발생 가변 도메인의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 서열은 1개, 2개 또는 그 이상의 N-말단 또는 C-말단 아미노산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있거나, 또는 단백질 구조의 형성에 적합한 다른 변경을 포함할 수 있다.

본원에 기재된 "유도성 프로모터"는, 유도제 또는 유도 작용제의 존재 하에 있거나, 이에 의해 영향을 받거나 또는 이에 의해 방해를 받을 때 전사 활성을 개시하거나 증강시키는 것을 특징으로 하는 것이다. 본원에 정의된 "유도제" 또는 "유도 작용제"는, 유도성 프로모터로부터 전사 활성을 유도하는 데 활성이 되는 방식으로 투여되는, 내인성, 또는 통상적으로 외인성 화합물 또는 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 유도제 또는 유도 작용제, 즉, 화학물질, 화합물 또는 단백질은, 그 자체가 핵산 서열의 전사 또는 발현 결과일 수 있으며(즉, 유도제는 또 다른 구성요소 또는 모듈에 의해 발현된 유도제 단백질일 수 있음), 이는 유도성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 억제제와 같은 특정 작용제의 부재 하에서 유도된다. 유도성 프로모터의 예에는, 비제한적으로, 테트라시클린(tetracycline), 메탈로티오닌(metallothionine), 엑디손(ecdysone), 포유류 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 및 마우스 유선종양바이러스 말단반복(MMTV-LTR)), 및 다른 스테로이드 반응성 프로모터, 라파마이신(rapamycin) 반응성 프로모터 등이 포함된다.

본원에 사용된 "입력물질 반응성 도메인"은, 연결된 DNA 결합 융합 도메인을 해당 조건 또는 입력의 존재에 대해 반응성으로 만드는 방식으로 조건 또는 입력물질에 결합하거나 다르게는 이에 반응하는 전사인자의 도메인이다. 하나의 구현예에서, 조건 또는 입력의 존재는 입력물질 반응성 도메인 또는 이와 융합되는 단백질에서 입체형태 변화를 유도하여, 전사인자의 전사 조절 활성을 변형시킨다.

"생체내"라는 용어는, 다세포 동물과 같은 유기체에서 또는 유기체 내에서 일어나는 검정 또는 과정을 나타낸다. 본원에 기재된 일부 양태에서, 방법 또는 용도는, 박테리아와 같은 단세포 유기체가 사용될 때, "생체내"에서 일어난다고 할 수 있다. "생체외"라는 용어는, 다세포 동물 또는 식물의 체외, 예를 들어 특히 외식편, 배양된 세포(1차 세포 및 세포주 포함), 형질전환된 세포주 및 추출된 조직 또는 세포(혈액 세포 포함)에 있는 온전한 막을 갖는 살아있는 세포를 사용하여 수행되는 방법 및 용도를 나타낸다.

"시험관내"라는 용어는, 세포 추출물과 같은 온전한 막을 갖는 세포의 존재를 필요로 하지 않는 검정 및 방법을 나타내며, 세포를 포함하지 않는 배지와 같은 비(非)세포 시스템, 또는 세포 추출물과 같은 세포 시스템에 프로그래밍 가능한 합성 생물학적 회로를 도입하는 것을 나타낼 수 있다.

본원에 사용된 "국소 전달"이라는 용어는, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)와 같은 활성제를 유기체 내 표적 부위에 직접 전달하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 작용제는 종양과 같은 질환 부위 또는 염증 부위와 같은 다른 표적 부위, 또는 간, 심장, 췌장, 신장 등과 같은 표적 기관에 직접 주사하는 방식으로 국소적으로 전달될 수 있다.

본원에 사용된 "변형된 ITR" 또는 "mod-ITR" 또는 "돌연변이 ITR"이라는 구절은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 동일한 혈청형의 WT-ITR과 비교하여 적어도 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 돌연변이를 갖는 ITR을 나타낸다. 돌연변이는 ITR 내 A 영역, C 영역, C' 영역, B 영역, B' 영역 중 하나 이상을 변경시킬 수 있으며, 동일한 혈청형의 WT-ITR의 3D 공간 구성과 비교하여 3차원 공간 구성(즉, 기하학적 공간에서의 3D 구조)을 변경시킬 수 있다.

본원에 사용된 "neDNA" 또는 "닉킹된(nicked) ceDNA"라는 용어는, 오픈리딩프레임(예를 들어, 발현시키고자 하는 프로모터와 전이유전자)의 스템 영역 또는 스페이서 영역 5' 업스트림에 1개 내지 100개 염기쌍의 닉 또는 갭을 갖는 폐쇄형 DNA를 나타낸다.

본원에 사용된 "핵산"이라는 용어는, 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 함유하는 중합체(즉, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드)를 나타내며, 이에는 DNA, RNA 및 이의 하이브리드가 포함된다. DNA는, 예를 들어 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, DNA-DNA 이중체, 사전 축합된 DNA, PCR 산물, 벡터(P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라 서열, 염색체 DNA, 또는 이러한 그룹의 유도체 및 조합의 형태일 수 있다. DNA는 미니서클, 플라스미드, 박미드, 미니유전자, 미니스트링 DNA(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터), 폐쇄형 선형 이중체 DNA(CELiD 또는 ceDNA), doggybone™ DNA, 덤벨형 DNA, 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터의 형태일 수 있다. RNA는 소형 간섭 RNA(siRNA), 다이서-기질(Dicer-substrate) dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, rRNA, tRNA, 바이러스성 RNA(vRNA) 및 이들의 조합의 형태일 수 있다. 핵산에는, 합성, 자연 발생 및 비자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는, 공지된 뉴클레오타이드 유사체, 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산이 포함된다. 이러한 유사체 및/또는 변형된 잔기의 예에는, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(모르폴리노), 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 잠금 핵산(LNA™) 및 펩타이드 핵산(PNA)이 포함된다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 퇴화 코돈 치환), 대립유전자, 동원체(ortholog), SNP 및 상보적 서열뿐 아니라, 명백하게 제시된 서열을 암시적으로 포함한다.

본원에 사용된 "뉴클레오타이드"는, 당 옥시리보오스(DNA) 또는 리보오스(RNA), 염기 및 포스페이트기를 함유한다. 뉴클레오타이드는 포스페이트기를 통해 함께 연결된다.

본원에 사용된 "핵산 치료제", "치료용 핵산" 및 "TNA"라는 구절은 상호교환적으로 사용되며, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제의 활성 성분으로서 핵산을 사용하는 임의의 치료 양식을 나타낸다. 본원에 사용된 이러한 구절은 RNA 기반 치료제와 DNA 기반 치료제를 나타낸다. RNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA)가 포함된다. DNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 합성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone™ DNA 벡터, 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터) 또는 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA")가 포함된다.

본원에 사용된 "프로모터"라는 용어는, 단백질 또는 RNA를 인코딩하는 이종 표적 유전자일 수 있는 핵산 서열의 전사를 유도하는 방식으로 또 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 임의의 핵산 서열을 나타낸다. 프로모터는 구성적, 유도성, 억제성, 조직 특이적 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 프로모터는 핵산 서열의 나머지 부분의 전사 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 제어 영역이다. 프로모터는 또한 RNA 폴리머라아제 및 다른 전사인자와 같은, 조절 단백질 및 분자에 결합할 수 있는 유전 요소를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 양태의 일부 구현예에서, 프로모터는 프로모터 자체, 또는 본원에 기재된 합성 생물학적 회로의 또 다른 모듈 구성요소에 사용되는 또 다른 프로모터의 발현을 조절하는 전사인자의 발현을 유도할 수 있다. 프로모터 서열 내에는 전사 개시 부위뿐 아니라, RNA 폴리머라아제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인이 발견될 것이다. 진핵생물 프로모터는 종종, 항상은 아니지만, "TATA" 박스와 "CAT" 박스를 함유할 것이다. 유도성 프로모터를 비롯한 다양한 프로모터는, 본원에 개시된 ceDNA 벡터의 전이유전자의 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다.

본원에 사용된 "인핸서"라는 용어는, 핵산 서열의 전사 활성화를 증가시키기 위해 하나 이상의 단백질(예를 들어, 활성화 단백질 또는 전사인자)과 결합하는 시스-작용 조절 서열(예를 들어, 50개 내지 1,500개 염기쌍)을 나타낸다. 인핸서는 이들이 조절하는 유전자 시작 부위의 업스트림 또는 유전자 시작 부위의 다운스트림에 최대 1,000,000개 염기쌍으로 배치될 수 있다. 인핸서는 인트론 영역 내, 또는 관련없는 유전자의 엑손 영역에 배치될 수 있다.

프로모터는 이것이 조절하는 핵산 서열의 발현을 유도하거나 전사를 유도한다고 할 수 있다. 본원에 사용된 "작동 가능하게 연결된"이란, 기재된 바와 같은 구성요소가 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 하는 관계에 있는 근접부위(juxtaposition)를 나타낸다. 예를 들어, 프로모터가 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. "작동 가능하게 연결된", "작동적으로 배치된", "작동적으로 연결된", "제어 하에 있는" 및 "전사 제어 하에 있는"이라는 구절은, 프로모터가 해당 서열의 전사 개시 및/또는 발현을 제어하기 위해 조절하는 핵산 서열에 대해 정확한 기능적 위치 및/또는 배향으로 존재한다는 것을 나타낸다. 본원에 사용된 "역 프로모터"는, 코딩 가닥이 비코딩 가닥이 되고, 그 반대로도 되도록, 핵산 서열이 역 배향으로 존재하는 프로모터를 나타낸다. 역 프로모터 서열은 다양한 구현예에서 스위치의 상태를 조절하는 데 사용될 수 있다. 또한, 다양한 구현예에서, 프로모터는 인핸서와 함께 사용될 수 있다.

프로모터는 주어진 유전자 또는 서열의 코딩 분절 및/또는 엑손의 업스트림에 위치한 5' 비코딩 서열을 단리하여 얻을 수 있는 바와 같이 유전자 또는 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 "내인성"으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 일부 구현예에서, 인핸서는 해당 서열의 다운스트림 또는 업스트림에 위치한, 핵산 서열과 자연적으로 연관된 것일 수 있다.

일부 구현예에서, 코딩 핵산 분절은 "재조합 프로모터" 또는 "이종 프로모터"의 제어 하에 배치되며, 여기서 두 가지 프로모터는 모두 자연 환경에서 작동 가능하게 연결된 인코딩된 핵산 서열과 통상적으로 연관되지 않은 프로모터를 나타낸다. 재조합 또는 이종 인핸서는, 자연 환경에서 주어진 핵산 서열과 통상적으로 연관되지 않은 인핸서를 나타낸다. 이러한 프로모터 또는 인핸서는, 다른 유전자의 프로모터 또는 인핸서; 임의의 다른 원핵생물, 바이러스 또는 진핵생물 세포에서 단리된 프로모터 또는 인핸서; 및 "자연 발생"이 아닌, 즉, 상이한 전사조절 영역의 상이한 요소, 및/또는 당업계에 공지된 유전자 조작 방법을 통해 발현을 변경시키는 돌연변이를 포함하는 합성 프로모터 또는 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터와 인핸서의 핵산 서열을 합성적으로 생성하는 것에 더하여, 프로모터 서열은 본원에 개시된 합성 생물학적 회로 및 모듈과 관련하여, 재조합 클로닝 및/또는 핵산 증폭 기술(PCR 포함)을 사용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제4,683,202호, 미국 특허 제5,928,906호(이들은 각각 본원에 참조로서 인용됨) 참조). 나아가, 미토콘드리아, 엽록체 등과 같은 비(非)핵 세포소기관 내 서열의 전사 및/또는 발현을 지시하는 제어 서열이 또한 이용될 수 있다고 고려된다.

본원에 사용된 "Rep 결합 부위", "Rep 결합 요소", "RBE" 및 "RBS"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, Rep 단백질에 의해 결합될 때, Rep 단백질이 RBS를 포함하는 서열에서 이의 부위 특이적 엔도뉴클레아제 활성을 수행할 수 있게 하는 Rep 단백질(예를 들어, AAV Rep 78 또는 AAV Rep 68)에 대한 결합 부위를 나타낸다. RBS 서열과 이의 역 보체는 함께 단일 RBS를 형성한다. RBS 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 AAV2에서 식별된 RBS 서열인 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3′(서열번호 531)를 포함한다. 다른 공지된 AAV RBS 서열, 및 다른 자연적으로 공지된 또는 합성 RBS 서열을 포함하는, 임의의 공지된 RBS 서열이 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, Rep 단백질의 뉴클레아제 도메인은 이중체 뉴클레오타이드 서열 GCTC에 결합하기 때문에, 2개의 공지된 AAV Rep 단백질이 이중체 올리고뉴클레오타이드인 5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'(서열번호 531) 상에 직접 결합하여 안정적으로 어셈블링된다고 여겨진다. 또한, 가용성 응집된 이형태체(conformer)(즉, 정의되지 않은 수의 상호연관된 Rep 단백질)는 해리되어, Rep 결합 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드에 결합한다. 각각의 Rep 단백질은 각 가닥에서 질소성 염기 및 포스포디에스테르 백본과 상호작용한다. 질소성 염기와의 상호작용은 서열 특이성을 제공하지만, 포스포디에스테르 백본과의 상호작용은 비(非)서열 특이적 또는 덜 서열 특이적이며, 단백질-DNA 복합체를 안정화시킨다.

본원에 사용된 "리포터"라는 용어는, 검출 가능한 판독물을 제공하는 데 사용될 수 있는 단백질을 나타낸다. 리포터는 일반적으로 형광, 색상 또는 발광과 같은 측정 가능한 신호를 생성한다. 리포터 단백질 코딩 서열은 세포 또는 유기체에서의 존재가 용이하게 관찰되는 단백질을 인코딩한다. 예를 들어, 형광 단백질은 특정 파장의 빛으로 여기될 때 세포가 형광을 나타내게 하고, 루시퍼라아제는 세포가 빛을 생성하는 반응을 촉진시키게 하며, β-갈락토시다아제와 같은 효소는 기질을 착색된 산물로 전환시킨다. 실험 또는 진단 목적에 유용한 예시적인 리포터 폴리펩타이드에는, 비제한적으로 β-락타마아제, β -갈락토시다아제(LacZ), 알칼리성 포스파타아제(AP), 티미딘 키나아제(TK), 녹색 형광 단백질(GFP) 및 다른 형광 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시퍼라아제, 및 당업계에 널리 공지된 다른 것들이 포함된다.

본원에 사용된 "억제 단백질" 또는 "유도 단백질"은, 조절 서열 요소에 결합하여, 조절 서열 요소에 작동적으로 연결된 서열의 전사를, 각각, 억제 또는 활성화시키는 단백질이다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 억제 및 유도 단백질은 적어도 하나의 입력물질 또는 환경 입력의 존재 또는 부재에 민감하다. 본원에 기재된 바와 같은 바람직한 단백질은, 예를 들어 분리 가능한 DNA-결합 및 입력물질-결합, 또는 반응성 요소 또는 도메인을 포함하는 형태의 모듈이다.

본원에 사용된 "서열 동일성"이라는 용어는, 2개의 뉴클레오타이드 서열 사이의 관련성을 나타낸다. 본 개시내용의 목적을 위해, 2개의 데옥시리보뉴클레오타이드 서열 사이의 서열 동일성 정도는 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 상기 Rice 등의 문헌(2000) 참조)의 니들(Needle) 프로그램(바람직하게는 버전 3.0.0 이상)에서 구현된 바와 같이 니들만 브니쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘(상기 Needleman 및 Wunsch의 문헌(1970) 참조)을 사용하여 결정된다. 사용되는 선택적 매개변수는 갭 오픈 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. 니들 표지된 "최장 동일성"의 출력(-nobrief 옵션을 사용하여 수득됨)은 동일성%로 사용되며, 이는 다음과 같이 계산된다: (동일한 데옥시뉴클레오타이드 x 100)/(정렬 길이 - 정렬의 총 갭 수). 정렬의 길이는 바람직하게는 적어도 10개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 25개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 적어도 50개 뉴클레오타이드 및 가장 바람직하게는 적어도 100개 뉴클레오타이드이다.

본원에 사용된 "센스" 및 "안티센스"라는 용어는, 폴리뉴클레오타이드에서의 구조 요소의 배향을 나타낸다. 요소의 센스 및 안티센스 버전은 서로 역 보체이다.

본원에 사용된 "스페이서 영역"이라는 용어는, 벡터 또는 게놈에서 기능성 요소를 분리하는 개재 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, AAV 스페이서 영역은 최적의 기능을 위해 2개의 기능성 요소를 목적하는 거리로 유지시킨다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 벡터 또는 게놈의 유전적 안정성을 제공하거나 부가한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 클로닝 부위를 위한 편리한 위치 및 염기쌍의 디자인 수의 갭을 제공하여 게놈의 준비된 유전자 조작을 용이하게 한다. 예를 들어, 특정 양태에서, 몇몇 제한 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 올리고뉴클레오타이드 "폴리링커" 또는 "다중클로닝 부위", 또는 공지된 단백질(예를 들어, 전사인자) 결합 부위를 갖지 않도록 설계된 비오픈리딩프레임 서열은, 시스-작용 인자를 분리하기 위해, 예를 들어 6량체, 12량체, 18량체, 24량체, 48량체, 86량체, 176량체 등을 삽입하는 방식으로, 벡터 또는 게놈에 배치될 수 있다.

본원에 사용된 "대상"이라는 용어는, 본 발명에 따른 ceDNA 벡터로 치료(예방적 치료 포함)가 제공되는 인간 또는 동물을 나타낸다. 통상적으로, 동물은, 비제한적으로, 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물과 같은 척추동물이다. 영장류에는, 비제한적으로, 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 스파이더 원숭이 및 마카크(macaque), 예를 들어 레서스(Rhesus)가 포함된다. 설치류에는, 마우스, 래트, 마멋(woodchuck), 페럿(ferret), 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 사냥감 동물에는, 비제한적으로, 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과 종류(예를 들어, 집고양이), 갯과 종류(예를 들어, 개, 여우, 늑대), 조류(예를 들어, 닭, 에뮤, 타조) 및 어류(송어, 메기 및 연어)가 포함된다. 본원에 기재된 양태의 특정 구현예에서, 대상은 포유류, 예를 들어 영장류 또는 인간이다. 대상은 남성 또는 여성일 수 있다. 또한, 대상은 유아 또는 어린이일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 신생아 또는 태어나지 않은 대상, 예를 들어 자궁에 있는 대상일 수 있다. 바람직하게는, 대상은 포유류이다. 포유류는 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이러한 예에 제한되지 않는다. 인간 이외의 포유류는 질환 및 장애의 동물 모델을 나타내는 대상으로 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 가축 및/또는 애완동물에 대해 사용될 수 있다. 인간 대상은 임의의 연령, 성별, 인종 또는 민족, 예를 들어 코카시안(백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카계 유럽인, 히스패닉계, 중동인 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 임상 설정에서의 환자 또는 다른 대상일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 이미 치료를 받고 있다.

본원에 사용된 "실질적으로 대칭인 변형된 ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍"이라는 용어는, 둘 모두 이의 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 변형된 ITR의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, 변형된 ITR은, 역 보체 서열에서 벗어난 일부 뉴클레오타이드 서열을 갖더라도, 변화가 특성 및 전체 형상에 영향을 미치지 않는 한, 실질적으로 대칭인 것으로 간주될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 동족 변형된 ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 달리 말하면, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은 3D 공간에 구성된 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 일부 구현예에서, mod-ITR 쌍으로부터의 ITR은 상이한 역 보체 뉴클레오타이드 서열을 갖지만, 여전히 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 가질 수 있으며, 즉, 두 개의 ITR은 동일한 전체 3D 형상을 생성하는 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, mod-ITR 쌍에서 하나의 ITR(예를 들어, 5' ITR)은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 ITR(예를 들어, 3' ITR)은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있지만, 두 가지 모두 동일한 상응하는 돌연변이를 가질 수 있으므로(예를 들어, 5' ITR이 C 영역에 결실을 갖는 경우, 상이한 혈청형으로부터의 동족의 변형된 3' ITR은 C' 영역의 상응하는 위치에 결실을 가짐), 변형된 ITR 쌍은 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 변형된 ITR 쌍의 각각의 ITR은 상이한 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12), 예컨대 AAV2와 AAV6의 조합에서 유래할 수 있으며, 여기서 하나의 ITR에서의 변형은 상이한 혈청형의 동족 ITR 내 상응하는 위치에 반영된다. 하나의 구현예에서, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은, ITR 사이의 뉴클레오타이드 서열 차이가 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고 이들이 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 갖는 한, 변형된 ITR(mod-ITR)의 쌍을 나타낸다. 비제한적인 예로서, mod-ITR은 기본 설정의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(BLASTN)와 같은 당업계에 널리 공지된 표준 수단에 의해 측정 시 기본형 mod-ITR과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 갖고, 또한 이의 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상으로 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다.

본원에 사용된 "실질적으로 대칭인 WT-ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍"이라는 용어는, 둘 모두 이의 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 야생형 ITR인, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 WT-ITR의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, ITR은, 기본형 자연 발생 서열에서 벗어난 하나 이상의 뉴클레오타이드를 갖더라도, 변화가 서열의 특성 및 전체 3차원 구조에 영향을 미치지 않는 한, 야생형 서열인 것으로 간주될 수 있다. 일부 양태에서, 벗어난 뉴클레오타이드는 보존적 서열 변화를 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 다른 WT-ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 3D 공간에 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은, 이것이 적절한 Rep 단백질과 쌍을 이루는 작동 가능한 Rep 결합 부위(RBE 또는 RBE')와 말단 분해 부위(trs)를 가지고 있음을 결정하는 방식으로 WT로서 기능적으로 확인될 수 있다. 선택적으로, 허용 조건 하에서의 전이유전자 발현을 포함하는 다른 기능을 시험할 수 있다.

본원에 사용된 "억제하다", "감소시키다", "방해하다", "저해하다" 및/또는 "줄이다" (및 유사 용어)라는 용어는, 일반적으로, 본래 값, 예측 값 또는 평균 값에 비해, 또는 대조군 조건에 비해, 농도, 수준, 기능, 활성 또는 거동을, 직접적으로 또는 간접적으로, 감소시키는 작용을 나타낸다.

본원에 사용된 "대칭 ITR"이라는 용어는, 야생형 데펜도바이러스 ITR 서열에 비해 돌연변이되거나 변형되고 전체 길이에 걸쳐 역 보체인, 단일 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 ITR의 쌍을 나타낸다. ITR 중 어느 것도 야생형 ITR AAV2 서열이 아니며(즉, 이는 변형된 ITR이며, 돌연변이 ITR로도 지칭됨), 뉴클레오타이드 부가, 결실, 치환, 절단 또는 점 돌연변이로 인해 야생형 ITR의 서열과 차이가 있을 수 있다. 본원에서 편의를 위해, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 업스트림) 5'에 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, ceDNA 벡터 내 발현 카세트(의 다운스트림) 3'에 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는"우측 ITR"로 지칭된다.

본원에 사용된 "합성 AAV 벡터" 및 "AAV 벡터의 합성 생산"이라는 용어는, 완전한 무세포 환경에서의 AAV 벡터 및 이의 합성 생산 방법을 나타낸다.

본원에 사용된 "말단반복" 또는 "TR"이라는 용어는, 적어도 하나의 최소 필수 복제 기점과 회문 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는, 임의의 바이러스 말단반복 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열("RBS")(RBE(Rep-결합 요소)로도 지칭됨)과 말단 분해 부위("TRS")는 함께 "최소 필수 복제 기점"을 구성하기 때문에, TR은 적어도 하나의 RBS와 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 주어진 스트레치 내에서 서로 역 보체인 TR은, 전형적으로 "역말단반복" 또는 "ITR"로 지칭된다. 바이러스의 맥락에서, ITR은 복제, 바이러스 패키징, 통합 및 프로바이러스 회수를 매개한다. 본원의 발명에서 예상치 못하게 발견된 바와 같이, 야생형 데펜도바이러스 ITR과 상이한 ITR은 여전히 야생형 ITR의 전형적인 기능을 수행할 수 있기 때문에, 본원에 사용된 ITR이라는 용어는 ceDNA 벡터의 복제를 매개할 수 있는 ceDNA 게놈 또는 ceDNA 벡터 내 TR을 나타낸다. 당업자는, 복잡한 ceDNA 벡터 구성에서, 2개 초과의 ITR 또는 대칭 ITR 쌍이 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. ITR은 AAV ITR 또는 비(非)AAV ITR일 수 있거나, AAV ITR 또는 비AAV ITR에서 유도될 수 있다. 예를 들어, ITR은 파르보바이러스 및 데펜도바이러스(예를 들어, 개 파르보바이러스, 소 파르보바이러스, 마우스 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스, 인간 파르보바이러스 B-19)를 포함하는 파르보바이러스과에서 유도될 수 있거나, 또는 SV40 복제 기점으로 작용하는 SV40 헤어핀(이는 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의해 추가로 변형될 수 있음)이 ITR로서 사용될 수 있다. 파르보바이러스과 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파르보바이러스아과(Parvovirinae)와 무척추동물을 감염시키는 덴소바이러스아과(Densovirinae)의 2개의 아과로 이루어진다. 전형적으로, 이러한 ITR은 약 145개 뉴클레오타이드이며, 본질적으로 다른 하나에 대해 역상이다. 데펜도파르보바이러스에는, 비제한적으로, 인간, 영장류, 소, 개, 말 및 양 종을 포함하는 척추동물 숙주에서 복제 가능한 아데노관련바이러스(AAV)의 바이러스과가 포함된다.

본원에 사용된 "말단 분해 부위" 및 "TRS"는 상호교환적으로 사용되며, Rep가 5' 티미딘과 티로신-포스포디에스테르 결합을 형성하여, 세포 DNA 폴리머라아제, 예를 들어 DNA pol 델타 또는 DNA pol 엡실론을 통해 DNA 연장을 위한 기질로서 작용하는 3' OH를 생성하는 영역을 나타낸다. 대안적으로, Rep-티미딘 복합체는 조정된 결찰 반응에 참여할 수 있다. 일부 구현예에서, TRS는 염기쌍을 이루지 않은 티미딘을 최소한으로 포함한다. 일부 구현예에서, TRS의 닉킹 효율은 RBS로부터의 동일한 분자 내 거리에 의해 적어도 부분적으로 제어될 수 있다. 수용체 기질이 상보적 ITR인 경우, 생성되는 산물은 분자내 이중체이다. TRS 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 AAV2로 식별된 헥사뉴클레오타이드 서열인 5'-GGTTGA-3'(서열번호 45)를 포함한다. 다른 공지된 AAV TRS 서열 및 다른 자연적으로 알려진 또는 합성 TRS 서열, 예컨대 AGTT(서열번호 46), GGTTGG(서열번호 47), AGTTGG(서열번호 48), AGTTGA(서열번호 49), 및 RRTTRR(서열번호 50)과 같은 다른 모티프를 포함하는, 임의의 공지된 TRS 서열이 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있다.

본원에 사용된 "전사 조절인자"라는 용어는, 관심 유전자의 전사를 활성화시키거나 억제하는 전사 활성화제 및 억제제를 나타낸다. 프로모터는 특정 유전자의 전사를 개시하는 핵산의 영역이다. 전사 활성화제는 전형적으로 전사 프로모터 근처에 결합하고 RNA 폴리머라아제를 동원하여, 직접 전사를 개시한다. 억제제는 전사 프로모터에 결합하여, RNA 폴리머라아제에 의한 전사 개시를 입체적으로 방해한다. 다른 전사 조절인자는 이들의 결합하는 위치, 및 세포 및 환경 조건에 따라 활성화제 또는 억제제로 작용할 수 있다. 전사 조절인자 부류의 비제한적인 예에는, 비제한적으로, 호메오도메인(homeodomain) 단백질, 아연-핑거 단백질, 날개있는 나선형(winged-helix)(포크헤드(forkhead)) 단백질 및 류신-지퍼 단백질이 포함된다.

본원에 사용된 "치료하다", "치료하는" 및/또는 "치료"라는 용어는, 병태의 진행을 중단시키거나, 실질적으로 저해하거나, 느리게 하거나 또는 역전시키는 것; 병태의 임상 증상을 실질적으로 개선하는 것; 또는 병태의 임상 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 통해 유익하거나 목적하는 임상 결과를 수득하는 것을 포함한다. 치료는 나아가 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 나타낸다: (a) 장애의 중증도를 감소시키는 것; (b) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 발달을 제한하는 것; (c) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화를 제한하는 것; (d) 이전에 장애(들)를 앓았던 환자에서 장애(들)의 재발을 제한하는 것; 및 (e) 장애(들)에 대해 이전에 증상이 없었던 환자에서 증상의 재발을 제한하는 것.

약리학적 및/또는 생리학적 효과와 같은 유익하거나 목적하는 임상 결과에는, 비제한적으로, 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만, 질환의 증상을 아직 경험하지 않았거나 나타내지 않은 대상에서 질환, 장애 또는 병태의 발생을 예방하는 것(예방적 치료), 질환, 장애 또는 병태의 증상 경감, 질환, 장애 또는 병태의 정도 감소, 질환, 장애 또는 병태의 안정화(즉, 악화시키지 않음), 질환, 장애 또는 병태의 확산 예방, 질환, 장애 또는 병태 진행의 지연 또는 늦추기, 질환, 장애 또는 병태의 개선 또는 완화, 및 이들의 조합뿐 아니라, 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존기간에 비해 생존기간을 연장시키는 것.

본원에 사용된 활성제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 지질 입자)의 "치료량", "치료적 유효량", "유효량" 또는 "약학적 유효량"이라는 용어는, 치료의 의도된 유익을 제공하는 데 충분한 양을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 하지만, 투여량 수준은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태, 병태의 중증도, 투여 경로, 및 이용되는 특정 활성제를 포함하는 다양한 인자를 기반으로 한다. 따라서, 투여 요법은 광범위하게 달라질 수 있으나, 의사가 표준 방법을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 또한, "치료량", "치료적 유효량" 및 "약학적 유효량"이라는 용어는, 상기 기재된 발명의 조성물의 예방적 또는 예방용 양을 포함한다. 상기 기재된 발명의 예방적 또는 예방용 적용에서, 약학적 조성물 또는 약제는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽거나 다르게는 이의 위험이 있는 환자에게, 질환, 장애 또는 병태, 이의 합병증, 및 질환, 장애 또는 병태의 발달 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상을 포함하는, 질환, 장애 또는 병태의 위험을 제거 또는 감소시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 또는 이의 발병을 지연시키는 데 충분한 양으로 투여된다. 최대 용량, 즉, 일부 의학적 판단에 따라 가장 안전한 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. "용량" 및 "투여량"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 "치료 효과"라는 용어는, 바람직하고 유익한 것으로 판단되는 치료 결과를 나타낸다. 치료 효과는, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다. 치료 효과는 또한, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현 진행의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다.

본원에 기재된 임의의 치료제의 경우, 치료적 유효량은 초기에 예비 시험관내 연구 및/또는 동물 모델에서 결정될 수 있다. 치료적 유효 용량은 또한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용되는 용량은 투여된 화합물의 상대적인 생체이용률 및 효능을 기반으로 조정될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 다른 널리 공지된 방법을 기반으로 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은, 당업자의 능력에 속한다. 문헌[Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw-Hill (New York) (2001)](상기 문헌은 본원에 참조로서 인용됨)의 챕터 1에서 확인할 수 있는 치료 효과를 결정하는 일반 원리가 하기에 요약되어 있다.

약동학적 원리는, 허용 가능하지 않은 부작용을 최소화하면서 목적하는 정도의 치료 효능을 얻기 위해 투여 요법을 변경하는 기반을 제공한다. 약물의 혈장 농도가 측정될 수 있고 이것이 치료 범위와 관련이 있는 상황에서, 투여량 변경을 위한 추가 지침을 얻을 수 있다.

본원에 사용된 "벡터" 또는 "발현 벡터"라는 용어는, 세포 내 부착된 분절("발현 카세트")의 발현 또는 복제를 야기하도록, 또 다른 DNA 분절, 즉, "곤충", "전이유전자" 또는 "발현 카세트"에 부착될 수 있는, 플라스미드, 박미드, 파지, 바이러스, 비리온 또는 코스미드(cosmid)와 같은 레플리콘을 나타낸다. 벡터는 숙주세포로의 전달, 또는 상이한 숙주세포 사이에서의 전달을 위해 설계된 핵산 구조체일 수 있다. 본원에 사용된 벡터는 최종 형태의 기원에서 바이러스성 또는 비바이러스성일 수 있다. 하지만, 본 개시내용의 목적을 위해, "벡터"는 일반적으로 합성 AAV 벡터 또는 닉킹된 ceDNA 벡터를 나타낸다. 따라서, "벡터"라는 용어는, 적절한 제어 요소와 결합될 때 복제 가능하고, 유전자 서열을 세포에 전달할 수 있는 임의의 유전 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 벡터 또는 발현 벡터일 수 있다.

본원에 사용된 "재조합 벡터"라는 구절은, 이종 핵산 서열, 또는 생체내에서 발현 가능한 "전이유전자"를 포함하는 벡터를 나타낸다. 본원에 기재된 벡터가, 일부 구현예에서, 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 일부 구현예에서, 벡터는 에피솜 상태이다. 적합한 에피솜 벡터의 사용은 대상에서 관심 뉴클레오타이드를 염색체외 DNA에 높은 카피수로 유지하여, 염색체 통합의 잠재적인 영향을 제거하는 수단을 제공한다.

본원에 사용된 "야생형 ITR" 또는 "WT-ITR"은, 예를 들어 Rep 결합 활성 및 Rep 닉킹 능력을 보유하는, AAV 또는 다른 데펜도바이러스 내 자연 발생 ITR 서열의 서열을 나타낸다. 임의의 AAV 혈청형의 WT-ITR의 뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드 또는 드리프트의 축퇴로 인해 기본형 자연 발생 서열에서 약간 달라질 수 있기 때문에, 본원에의 사용을 위해 포함된 WT-ITR 서열은 생산 과정 동안 일어나는 자연적으로 발생하는 변화(예를 들어, 복제 오류)의 결과로서의 WT-ITR 서열을 포함한다.

본원에 사용된 "포함하는" 또는 "포함하다"라는 용어는, 방법 또는 조성물에 필수적이지만, 필수적인지 여부에 관계없이 명시되지 않은 요소를 포함할 수도 있는, 조성물, 방법, 및 이의 각 구성요소(들)에 관하여 사용된다.

본원에 사용된 "~로 본질적으로 이루어진"이라는 용어는, 주어진 구현예에 필요한 요소를 나타낸다. 상기 용어는, 해당 구현예의 기본적인 및 신규한 또는 기능적인 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 요소의 존재를 허용한다.

"~로 이루어진"이라는 용어는, 구현예의 설명에 언급되지 않은 임의의 요소를 배제하는, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 이의 각 구성요소를 나타낸다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 표현은, 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 본원에 기재된 및/또는 본 개시내용 등을 읽을 때 당업자에게 명백해질 수 있는 유형의 하나 이상의 방법 및/또는 단계를 포함한다. 유사하게, "또는"이라는 단어는, 문맥에서 달리 명백하게 지시되지 않는 한, "및"을 포함한다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재된다. "e.g."라는 약어는, 라틴어 예를 들어(exempli gratia)에서 유도된 것이며, 이는 본원에서 비제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, "e.g."라는 약어는, "예를 들어"라는 용어와 동의어이다.

본원에 사용된 "예컨대", "예를 들어" 등과 같은 용어는, 예시적인 구현예를 나타내기 위해 의도된 것으로, 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명과 관련된 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 하기에 기재된다.

실시예 이외에 또는 달리 지시된 경우에, 본원에 사용된 성분 또는 반응 조건의 양을 표현하는 모든 수치는, 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 변형되는 것으로 이해해야 한다. 백분율과 관련하여 사용될 때 "약"은, 평균 ±1%일 수 있다. 본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 상세하게 설명되지만, 본 발명의 범위는 이에 제한되지 않는다.

본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

II. 폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터

공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 신규한 비바이러스성 캡시드 미함유 ceDNA 분자(ceDNA)가 본원에 제공된다. 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드 내 제한적인 공간에 의해 부과되는 패키징 제약이 없다. ceDNA 벡터는, 캡슐화된 AAV 게놈과 대조적으로, 원핵생물에서 생산된 플라스미드 DNA 벡터에 대한 실행 가능한 진핵생물에서 생산된 대안을 나타낸다. 이는, 제어 요소, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 대형 전이유전자, 다중 전이유전자 등의 삽입, 및 목적하는 경우, 전이유전자의 천연 유전자 조절 요소의 혼입을 가능하게 한다.

플라스미드 기반 발현 벡터와 상이한 ceDNA 벡터의 다수의 구조적 특징이 있다. ceDNA 벡터는 다음 특징 중 하나 이상을 보유할 수 있다: 본래(즉, 삽입되지 않은) 박테리아 DNA의 결여; 원핵생물 복제 기점의 결여; 자가 함유, 즉, 이들은 Rep 결합 부위와 말단 분해 부위(RBS 및 TRS)를 포함하는 2개의 ITR 이외의 임의의 서열, 및 ITR 사이의 외인성 서열을 필요로 하지 않음; 진핵생물 기원의 헤어핀을 형성하는 ITR 서열의 존재(즉, 이들은 진핵세포에서 생성됨); 및 박테리아 유형 DNA 메틸화 또는 실제로 포유류 숙주에 의해 비정상적인 것으로 간주되는 임의의 다른 메틸화의 부재. 일반적으로, 본 발명의 벡터는 임의의 원핵생물 DNA를 함유하지 않는 것이 바람직하지만, 일부 원핵생물 DNA가, 비제한적인 예로서, 프로모터 또는 인핸서 영역에 외인성 서열로서 삽입될 수 있다고 고려된다. ceDNA 벡터를 플라스미드 발현 벡터와 구별하는 또 다른 중요한 특징은, ceDNA 벡터는 폐쇄형 말단을 갖는 단일가닥 선형 DNA이지만, 플라스미드는 항상 이중가닥 DNA라는 점이다.

플라스미드 기반 발현 벡터에 비해 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터를 사용하는 몇 가지 이점이 존재한다. 이러한 이점에는, 비제한적으로, 다음이 포함된다: 1) 플라스미드는 박테리아 DNA 서열을 함유하고 원핵생물 특이적 메틸화, 예를 들어 6-메틸 아데노신 및 5-메틸 시토신 메틸화에 적용되지만, 캡시드 미함유 AAV 벡터 서열은 진핵생물 기원으로 원핵생물 특이적 메틸화를 거치지 않으며; 그 결과, 캡시드 미함유 AAV 벡터는 플라스미드에 비해 염증 및 면역 반응을 유도할 가능성이 적음; 2) 플라스미드는 생산 과정 동안 내성 유전자의 존재를 필요로 하지만, ceDNA 벡터는 그렇지 않음; 3) 원형 플라스미드는 세포에의 도입 시 핵으로 전달되지 않고 세포 뉴클레아제에 의한 분해를 우회하기 위해서는 과부하가 필요하지만, ceDNA 벡터는 뉴클레아제에 대한 내성을 부여하는 바이러스성 시스-요소, 즉, 변형된 ITR을 함유하고, 핵을 표적으로 하여 이에 전달되도록 설계될 수 있음. ITR 기능에 없어서는 안 될 최소 정의 요소가 Rep-결합 부위(RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 531))와 말단 분해 부위(TRS; AAV2의 경우 5'-AGTTGG-3'(서열번호 48)), 그리고 헤어핀 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열이라고 가정하였다. 대조적으로, 본원에 개시된 캡시드 미함유 AAV 벡터로의 형질도입은, 다양한 전달 시약을 사용하여 통상적인 AAV 비리온으로 형질도입하기 곤란한 세포 및 조직 유형을 효율적으로 표적화할 수 있다.

ceDNA 벡터는 바람직하게는 제한 효소 소화 검정 및 전기영동 분석으로 측정 시, 비연속 구조라기보다는 선형 및 연속 구조이다(도 5d). 선형 및 연속 구조는 세포 엔도뉴클레아제에 의한 공격으로부터 보다 안정적일 뿐 아니라, 재조합되어 돌연변이를 유발할 가능성이 적은 것으로 여겨진다. 따라서, 선형 및 연속 구조의 ceDNA 벡터가 바람직한 구현예이다. 연속, 선형, 단일가닥 분자내 이중체 ceDNA 벡터는, AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열 없이, 공유결합으로 결합된 말단을 가질 수 있다. 이러한 ceDNA 벡터는 박테리아 기원의 원형 이중체 핵산 분자인 플라스미드(본원에 기재된 ceDNA 플라스미드 포함)와 구조적으로 구별된다. 플라스미드의 상보적 가닥은 변성 후 분리되어 2개의 핵산 분자를 생성하지만, 대조적으로, 상보적 가닥을 갖는 ceDNA 벡터는, 단일 DNA 분자이기 때문에, 변성되더라도 단일 분자로 남아있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는, 플라스미드와 달리, 원핵생물 유형의 DNA 염기 메틸화 없이 생산될 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터와 ceDNA-플라스미드는 구조(특히, 선형 대 원형)의 측면에서, 또한 이러한 상이한 대상을 생산하고 정제하는 데 사용되는 방법(하기 참조)의 측면에서, 또한 ceDNA-플라스미드의 경우 원핵생물 유형이고 ceDNA 벡터의 경우 진핵생물 유형인 이의 DNA 메틸화의 측면에서 모두 상이하다.

공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 ceDNA 분자(ceDNA)가 본원에 제공된다. 이러한 비바이러스성 캡시드 미함유 ceDNA 분자는 2개의 대칭인 역말단반복(ITR) 서열 사이에 배치된 이종 유전자(전이유전자)를 함유하는 발현 구조체(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스, 또는 통합된 세포주)로부터의 허용 숙주세포에서 생산될 수 있으며, 여기서 ITR은 야생형 ITR이 아니고 서로 대칭이다. 즉, ITR은 변형된 ITR이고, 3' ITR의 서열은 5' ITR의 서열의 역 보체이며, 그 반대이기도 하다. 일부 구현예에서, ITR은 상응하는 야생형 ITR 서열(예를 들어, AAV ITR)과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 기능성 말단 분해 부위(trs)와 Rep 결합 부위를 포함한다. ceDNA 벡터는 바람직하게는 이중체, 예를 들어 발현 카세트와 같은 분자의 적어도 일부에 걸쳐 자가 상보적이다(예를 들어, ceDNA는 플라스미드와 같은 이중가닥 원형 분자가 아님). ceDNA 벡터는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖기 때문에, 예를 들어 37℃에서 1시간 초과 동안 엑소뉴클레아제 소화(예를 들어, 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 III)에 대한 내성이 있다.

하나의 양태에서, ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노관련바이러스(AAV) 역말단반복(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함한다. 하나의 구현예에서, 제1 ITR(5' ITR)과 제2 ITR(3' ITR)은 서로 비대칭이며, 즉, 서로 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 예시적인 구현예로서, 제1 ITR은 야생형 ITR이고, 제2 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있거나, 또는 그 반대로 제1 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR이고, 제2 ITR은 야생형 ITR일 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 ITR과 제2 ITR은 모두 돌연변이되거나 변형된 것이지만 상이한 서열이거나, 상이한 변형을 갖거나, 또는 동일한 돌연변이되거나 변형된 ITR이 아니며, 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 달리 말하면, 비대칭인 ITR을 갖는 ceDNA 벡터는, WT-ITR에 대한 하나의 ITR에서의 임의의 변화가 다른 하나의 ITR에 반영되지 않거나; 또는 대안적으로, 비대칭인 ITR이 돌연변이되거나 변형된 비대칭 ITR 쌍을 갖고 서로에 대해 상이한 서열과 상이한 3차원 형상을 가질 수 있는 ITR을 갖는다.

일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노관련바이러스(AAV) 역말단반복(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하고, 여기서 제1 ITR과 제2 ITR은 서로 대칭이며, 즉, 이들은 동일한 서열이지만 서로 역 보체이다. 즉, ceDNA 벡터는 기하학적 공간에서의 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖거나, 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는 ITR 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 대칭인 ITR 쌍 또는 실질적으로 대칭인 ITR 쌍은, 야생형 ITR이 아닌 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있다. 예시적인 구현예로서, 제1 ITR은 야생형 ITR이고, 제2 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있거나, 또는 그 반대로 제1 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR이고, 제2 ITR은 야생형 ITR일 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 ITR과 제2 ITR은 모두 변경되었으며 상이한 서열이거나, 또는 상이한 변형을 갖거나, 또는 동일한 변형된 ITR이 아니며, 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 또 다른 예시적인 구현예로서, 제1 ITR(또는 5' ITR)은 변형된 ITR, 예를 들어 서열번호 484(즉, ITR-33, 좌측)일 수 있고, 제2 ITR(또는 3' ITR)은 돌연변이되거나 변형된 ITR, 예를 들어 서열번호 469(즉, ITR-18, 우측)일 수 있다. 달리 말하면, 비대칭인 ITR을 갖는 ceDNA 벡터는, WT-ITR에 대한 하나의 ITR에서의 임의의 변화가 다른 하나의 ITR에 반영되지 않거나; 또는 대안적으로, 비대칭인 ITR이 변형된 비대칭 ITR 쌍을 갖고 서로에 대해 상이한 서열과 상이한 3차원 형상을 가질 수 있는 ITR을 포함한다. 돌연변이되거나 변형된 ITR 쌍은 야생형 ITR로부터 하나 이상의 변형을 갖고, 서로 역 보체(역상)인 동일한 서열을 가질 수 있다. 하나의 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 갖지만, 상응하거나 동일한 대칭인 3차원 형상을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 대칭인 ITR 또는 실질적으로 대칭인 ITR은 본원에 기재된 바와 같은 야생형(WT-ITR)이다. 즉, 2개의 ITR은 야생형 서열을 갖지만, 반드시 동일한 AAV 혈청형의 WT-ITR일 필요는 없다. 하나의 구현예에서, 하나의 WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나는 WT-ITR은 상이한 AAV 혈청형에서 유래할 수 있다. 이러한 구현예에서, WT-ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 이들은 대칭인 3차원 공간 구성을 여전히 유지하면서, 하나 이상의 보존적 뉴클레오타이드 변형을 가질 수 있다.

일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 야생형 아데노관련바이러스(AAV) 역말단반복(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하며, 여기서 제1 WT-ITR과 제2 WT-ITR은 동일한 AAV 혈청형에서 유래하거나 상이한 AAV 혈청형에서 유래한 것이다. 예시적인 구현예로서, 제1 WT-ITR(또는 5' WT-ITR)은 AAV2에서 유래할 수 있고, 제2 WT-ITR(또는 3' WT-ITR)은 AAV6에서 유래할 수 있다. ceDNA 벡터에서 및 ceDNA-플라스미드를 생성하는 데 사용하기 위한 예시적인 WT-ITR은, 하기 "ITR"이라는 제목의 섹션, 및 본원의 표 1에 논의되어 있다.

본원에 제공된 야생형 ITR 서열은 ceDNA 벡터의 생산을 위한 발현 구조체(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA 박미드, ceDNA-바큐로바이러스)에 포함된 DNA 서열을 나타낸다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터는, 예를 들어 조절 서열, 핵산을 인코딩하는 서열(예를 들어, miR 또는 안티센스 서열) 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 서열(예를 들어, 전이유전자)일 수 있는 전이유전자를 갖는 발현 카세트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 전이유전자는 전이유전자의 발현을 가능하게 하거나 제어하는 하나 이상의 조절 서열(들)에 작동적으로 연결될 수 있다. 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 제1 WT-ITR 서열과 제2 WT-ITR 서열을 포함하며, 여기서 관심 뉴클레오타이드 서열에는 제1 WT-ITR 서열과 제2 WT-ITR 서열이 플랭킹되어 있다.

예시적인 ITR은 하기 본원의 "ITR"이라는 제목의 섹션과 도 2 및 도 5, 또는 2018년 9월 7일자 출원된 PCT/US18/49996의 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 9 또는 표 10a와 표 10b에 논의되어 있으며, 여기서 플랭킹 ITR 서열은 이의 대칭(예를 들어, 역 보체)이거나 이에 실질적으로 대칭이다.

본원에 제공된 ITR 서열은 ceDNA 벡터의 생산을 위한 발현 구조체(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스)에 포함된 DNA 서열을 나타낸다. 따라서, ceDNA-플라스미드 또는 다른 발현 구조체에서 생산된 ceDNA 벡터에 실제로 함유된 ITR 서열은, 생산 과정 동안 일어나는 자연 발생적인(보존적 또는 비보존적 변형 포함) 변화(예를 들어, 복제 오류)의 결과로, 본원에 제공된 ITR 서열과 동일하거나 동일하지 않을 수 있다.

일부 구현예에서, 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 갖는 발현 카세트를 포함하는 본원에 기재된 ceDNA 벡터는, 전이유전자의 발현을 가능하게 하거나 제어하는 하나 이상의 조절 서열(들)에 작동적으로 연결될 수 있다. 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열을 포함하고, 여기서 관심 뉴클레오타이드 서열에는 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열이 플랭킹되어 있으며, 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열은 서로 비대칭이거나 서로 대칭이다.

하나의 구현예에서, 발현 카세트는 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 전사 후 조절 요소, 및 폴리아데닐화 및 종결 신호 중 하나 이상을 이러한 순서로 포함하는 2개의 ITR 사이에 위치한다. 하나의 구현예에서, 프로모터는 조절 가능하며, 즉 유도성 또는 억제성이다. 프로모터는 전이유전자의 전사를 용이하게 하는 임의의 서열일 수 있다. 하나의 구현예에서, 프로모터는 CAG 프로모터(예를 들어, 서열번호 03) 또는 이의 변이체이다. 전사 후 조절 요소는 전이유전자의 발현을 조절하는 서열, 비제한적인 예로서, 치료용 핵산 서열인 전이유전자의 발현을 증강시키는 3차 구조를 형성하는 임의의 서열이다.

하나의 구현예에서, 전사 후 조절 요소는 WPRE(예를 들어, 서열번호 8)를 포함한다. 하나의 구현예에서, 폴리아데닐화 및 종열 신호는 BGHpolyA(예를 들어, 서열번호 9)를 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 시스 조절 요소 또는 이의 조합, 예를 들어 SV40 후기 polyA 신호 업스트림 인핸서 서열(USE), 또는 비제한적으로, 단순헤르페스바이러스의 티미딘 키나아제 유전자, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)를 포함하는 다른 전사 후 처리 요소가 추가로 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 5'→3' 방향으로의 발현 카세트 길이는, AAV 비리온에 캡시드화되는 것으로 공지된 최대 길이보다 더 크다. 하나의 구현예에서, 상기 길이는 4.6 kb 초과, 또는 5 kb 초과, 또는 6 kb 초과, 또는 7 kb 초과이다. 다양한 발현 카세트가 본원에 예시된다.

발현 카세트는 4000개 초과의 뉴클레오타이드, 5000개 뉴클레오타이드, 10,000개 뉴클레오타이드 또는 20,000개 뉴클레오타이드, 또는 30,000 뉴클레오타이드, 또는 40,000개 뉴클레오타이드 또는 50,000개 뉴클레오타이드, 또는 약 4000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드, 또는 10,000개 내지 50,000개 뉴클레오타이드 사이의 임의의 범위, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 50,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자(예를 들어, 치료용 핵산 서열)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 75,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자(예를 들어, 치료용 핵산 서열)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자(예를 들어, 치료용 핵산 서열)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 1,000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자(예를 들어, 치료용 핵산 서열)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 5,000개 뉴클레오타이드 범위인 전이유전자(예를 들어, 치료용 핵산 서열)를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 캡시드화된 AAV 벡터의 크기 제한이 없기 때문에, 대형 발현 카세트를 전달하여 전이유전자의 효율적인 발현을 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터에는 원핵생물 특이적 메틸화가 없다.

일부 구현예에 따르면, 발현 카세트는 또한 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 및/또는 2A 요소를 포함할 수 있다. 시스-조절 요소에는, 비제한적으로, 프로모터, 리보스위치, 절연인자, mir-조절 요소, 전사 후 조절 요소, 조직 및 세포 유형 특이적 프로모터, 및 인핸서가 포함된다. 일부 구현예에서, ITR은 전이유전자를 위한 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 조절하기 위한 추가의 구성요소, 예를 들어 전이유전자의 발현을 제어하고 조절하기 위한 "조절 스위치"라는 제목의 섹션에 본원에 기재된 조절 스위치를 포함하며, 목적하는 경우, ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 제어된 세포 사멸을 가능하게 하는 사멸 스위치인 조절 스위치를 포함할 수 있다.

도 1a와 도 1b는, 비제한적이며 예시적인 ceDNA 벡터, 또는 ceDNA 플라스미드의 상응하는 서열의 개략도를 보여준다. ceDNA 벡터는 캡시드를 함유하지 않고, 제1 ITR, 발현 가능한 전이유전자 카세트 및 제2 ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 플라스미드에서 수득될 수 있으며, 여기서 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열은 상응하는 야생형 AAV2 ITR 서열에 대해 돌연변이된 것이고, 돌연변이는 동일하다(즉, 변형된 ITR은 대칭임). 발현 가능한 전이유전자 카세트는 바람직하게는 인핸서/프로모터, ORF 리포터(전이유전자), 전사 후 조절 요소(예를 들어, WPRE), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호(예를 들어, BGH polyA) 중 하나 이상을 이러한 순서로 포함한다.

도 2a와 도 2b는, 비제한적이며 예시적인 ceDNA 벡터, 또는 ceDNA 플라스미드의 상응하는 서열의 개략도를 보여준다. ceDNA 벡터는 캡시드를 함유하지 않으며, 제1 WT-ITR, 발현 가능한 전이유전자 카세트 및 제2 WT-ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 플라스미드에서 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열은 야생형 AAV2 ITR 서열이다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열은 표 1에 제시된 WT-ITR의 조합 중 임의의 것에서 선택된다. 발현 가능한 전이유전자 카세트는 바람직하게는 인핸서/프로모터 또는 조절 스위치, ORF 리포터(전이유전자), 전사 후 조절 요소(예를 들어, WPRE), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호(예를 들어, BGH polyA) 중 하나 이상을 이러한 순서로 포함한다.

2018년 9월 7일자 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042(이는 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨)의 도 1a 내지 도 1c는, 비제한적이며 예시적인 ceDNA 벡터, 또는 ceDNA 플라스미드의 상응하는 서열의 개략도를 보여준다. ceDNA 벡터는 캡시드를 함유하지 않고, 제1 ITR, 발현 가능한 전이유전자 카세트 및 제2 ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 플라스미드에서 수득될 수 있으며, 여기서 제1 ITR 서열 및/또는 제2 ITR 서열 중 적어도 하나는 상응하는 야생형 AAV2 ITR 서열에 대해 돌연변이된 것이다. 발현 가능한 전이유전자 카세트는 바람직하게는 인핸서/프로모터, ORF 리포터(전이유전자), 전사 후 조절 요소(예를 들어, WPRE), 및 폴리아데닐화 및 종결 신호(예를 들어, BGH polyA) 중 하나 이상을 이러한 순서로 포함한다.

치료용 핵산

발현 카세트는 임의의 관심 전이유전자를 포함할 수 있다. 관심 전이유전자에는, 비제한적으로, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 또는 비코딩 핵산(예를 들어, RNAi, miR 등), 바람직하게는 치료용(예를 들어, 의료용, 진단용 또는 수의학용) 또는 면역원성(예를 들어, 백신용) 폴리펩타이드가 포함된다. 특정 구현예에서, 발현 카세트 내 전이유전자는 하나 이상의 폴리펩타이드, 펩타이드, 리보자임, 펩타이드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 항체, 항원 결합 단편 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩한다.

본 개시내용의 예시적인 치료용 핵산은, 비제한적으로, 미니유전자, 플라스미드, 미니서클, 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, 폐쇄형 이중가닥 DNA(예를 들어, ceDNA, CELiD, 선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA("미니스트링"), doggybone™ DNA, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, 및 DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

RNA 간섭(RNAi)으로 불리는 과정을 통해 특정 단백질의 세포내 수준을 하향조절할 수 있는 siRNA 또는 miRNA가 또한 본 발명에서 핵산 치료제로 고려된다. siRNA 또는 miRNA가 숙주세포의 세포질에 도입된 후, 이러한 이중가닥 RNA 구조체는 RISC로 불리는 단백질에 결합할 수 있다. siRNA 또는 miRNA의 센스 가닥은 RISC 복합체에 의해 제거된다. RISC 복합체는, 상보적 mRNA와 조합될 때, mRNA를 절단하고 절단된 가닥을 방출한다. RNAi는 mRNA의 특이적 파괴를 유도하여, 상응하는 단백질을 하향조절한다.

단백질로의 mRNA 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)와 리보자임은, 핵산 치료제일 수 있다. 안티센스 구조체의 경우, 이러한 단일가닥 데옥시핵산은 표적 단백질 mRNA의 서열에 상보적인 서열, 및 mRNA에 결합할 수 있는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 갖는다. 이러한 결합은 표적 mRNA의 번역을 방지하고/하거나 mRNA 전사체의 RNaseH 분해를 촉발시킨다. 그 결과, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 작용의 특이성(즉, 특정 질환 관련 단백질의 하향조절)이 증가했다.

본원에 제공된 임의의 방법에서, 치료용 핵산은 치료용 RNA일 수 있다. 상기 치료용 RNA는 mRNA 번역의 저해제, RNA 간섭(RNAi) 작용제, 촉매 활성 RNA 분자(리보자임), 전달 RNA(tRNA) 또는 mRNA 전사체에 결합하는 RNA(ASO), 단백질 또는 다른 분자 리간드(압타머)일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 방법에서, RNAi 작용제는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 마이크로RNA, 짧은 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA 또는 삼중체 형성 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.

일부 구현예에서, 전이유전자는 치료용 유전자 또는 마커 단백질이다. 일부 구현예에서, 전이유전자는 아고니스트 또는 안타고니스트이다. 일부 구현예에서, 안타고니스트는 모방체 또는 항체, 또는 항체 단편 또는 이의 항원-결합 단편, 예를 들어 중화 항체 또는 항체 단편 등이다. 일부 구현예에서, 전이유전자는 본원에 정의된 바와 같은 전장 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 항체는 본원에 정의된 바와 같은 항원-결합 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열이다.

특히, 질환, 기능장애, 부상 및/또는 장애의 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위한 전이유전자는, 비제한적으로, 예를 들어 단백질(들), 폴리펩타이드(들), 펩타이드(들), 효소(들), 항체, 항원 결합 단편뿐 아니라, 변이체 및/또는 이의 활성 단편을 포함하는 하나 이상의 치료제(들)을 인코딩할 수 있다. 예시적인 전이유전자는 본원의 "치료 방법"이라는 제목의 섹션에 기재되어 있다.

III. 역말단반복(ITR)

본원에 기재된 바와 같이, 하나의 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 상보적 DNA의 연속 가닥으로부터 형성된 캡시드 미함유 선형 이중체 DNA 분자(선형, 연속 및 비캡시드화된 구조)로서, 이는 서로 상이하고 서로 비대칭인 5' 역말단반복(ITR) 서열과 3' ITR 서열을 포함한다. 일부 구현예에 따르면, ITR 서열은 야생형 ITR 서열이다. 일부 구현예에 따르면, ITR 서열은 야생형 ITR 서열이 아니다. 일부 구현예에 따르면, ITR 서열은 변형된 ITR 서열이다.

일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 서로 역 보체(역상)이거나, 또는 대안적으로, 서로 실질적으로 대칭이며, 즉, WT-ITR 쌍이 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는, 2개의 플랭킹 야생형 역말단반복(WT-ITR) 서열 사이에 배치된 이종 유전자를 함유한다. 일부 구현예에서, 야생형 ITR 서열(예를 들어, AAV WT-ITR)은 기능성 Rep 결합 부위(RBS; 예를 들어 AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', 서열번호 531)와 기능성 말단 분해 부위(TRS; 예를 들어 5'-AGTT-3', 서열번호 46)를 포함한다.

일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 본원에 정의된 바와 같이 서로 역 보체(역상)이거나 실질적으로 대칭이며(즉, 상응하는 변형을 가짐) 야생형 ITR이 아닌, 2개의 플랭킹 변형된 역말단반복(mod-ITR) 서열 사이에 배치된 이종 유전자를 함유한다. 이러한 역 상보적 ITR은 대칭 ITR로 지칭된다. ITR은 기존 자연 발생 파르보바이러스 야생형 ITR(예를 들어, AAV ITR)에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것이며; 기능성 Rep 결합 부위(RBS; 예를 들어 AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3', 서열번호 531)와 기능성 말단 분해 부위(TRS; 예를 들어 5'-AGTT-3', 서열번호 46)를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, ITR 서열은 척추동물을 감염시키는 파르보바이러스아과와 곤충을 감염시키는 덴소바이러스아과의 2개의 아과를 포함하는 파르보바이러스과의 바이러스에서 유래할 수 있다. 파르보바이러스아과(파르보바이러스로 지칭됨)에는, 대부분의 조건 하에서, 생산적인 감염을 위해 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스와 같은 헬퍼 바이러스로의 동시감염을 필요로 하는 구성원인 데펜도바이러스속이 포함된다. 데펜도바이러스속에는, 통상적으로 인간(예를 들어, 혈청형 2, 3A, 3B, 5 및 6) 또는 영장류(예를 들어, 혈청형 1 및 4)를 감염시키는 아데노관련바이러스(AAV), 및 다른 온혈동물을 감염시키는 관련 바이러스(예를 들어, 소, 개, 말 및 양 아데노관련바이러스)가 포함된다. 파르보바이러스 및 파르보바이러스과의 다른 구성원은 일반적으로 문헌[Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in FIELDS VIROLOGY (3d Ed. 1996)]에 기재되어 있다. 당업자는, 임의의 공지된 파르보바이러스 유래의 ITR이 본원에 기재된 바와 같은 조성물 및 방법에 이용될 수 있다는 것을 알고 있다. 일부 구현예에 따르면, ITR은 AAV(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3. AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈, 예를 들어 NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261)와 같은 데펜도바이러스, 키메라 ITR, 또는 임의의 합성 AAV 유래의 ITR에서 유래한 것이다. 일부 구현예에서, AAV는 온혈동물, 예를 들어 조류(AAAV), 소(BAAV), 개, 말 및 양 아데노관련바이러스를 감염시킬 수 있다. 일부 구현예에서, ITR은 B19 파르보바이러스(GenBank 수탁번호: NC 000883), 마우스 유래 미세생쥐바이러스(MVM: Minute Virus from Mouse)(GenBank 수탁번호. NC 001510); 거위 파르보바이러스(GenBank 수탁번호: NC 001701); 뱀 파르보바이러스 1(GenBank 수탁번호. NC 006148)에서 유래한 것이다.

일부 구현예에 따르면, 선택된 혈청형은 혈청형의 조직 친화성을 기반으로 할 수 있다. AAV2는 폭넓은 조직 친화성을 갖고, AAV1은 뉴런 및 골격근을 우선적으로 표적화하고, AAV5는 뉴런, 망막색소상피세포 및 광수용체를 우선적으로 표적화한다. AAV6은 골격근 및 폐를 우선적으로 표적화한다. AAV8은 간, 골격근, 심장 및 췌장 조직을 우선적으로 표적화한다. AAV9는 간, 골격 및 폐 조직을 우선적으로 표적화한다. 일부 구현예에 따르면, 혈청형은 AAV2이다.

당업자는, ITR 서열이 전형적으로 T-형 또는 Y-형 헤어핀 구조(예를 들어, 도 3a 및 도 4a 참조)인 이중가닥 홀리데이(Holliday) 접합의 공통 구조를 갖고, 여기서 각각의 ITR은 보다 큰 회문구조 아암(A-A')에 포매된 2개의 회문구조 아암 또는 루프(B-B' 및 C-C'), 및 단일가닥 D 서열로 형성되기 때문에(여기서, 이러한 회문구조 서열의 순서는 ITR의 플립 또는 플립 배향을 정의함), 본원에 제공된 예시적인 AAV2 ITR 서열을 기반으로 ceDNA 벡터 또는 ceDNA-플라스미드에 사용하기 위한 임의의 AAV 혈청형의 변형된 ITR 서열을 조작할 수 있다는 것을 알고 있다. 예를 들어, 상이한 AAV 혈청형(AAV1 내지 AAV6) 유래의 ITR의 구조 분석 및 서열 비교는 문헌[Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439]; 문헌[Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379]; 문헌[Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14]에 기재된 것을 참조한다.

따라서, AAV2 ITR이 본원에 개시된 ceDNA 벡터에서 예시적인 ITR(예를 들어, 야생형(WT) 또는 변형된 ITR)로서 사용되지만, 본원에 개시된 ceDNA 벡터는, 예를 들어 AAV 혈청형1(AAV1), AAV 혈청형 2(AAV2), AAV 혈청형 4(AAV4), AAV 혈청형 5(AAV5), AAV 혈청형 6(AAV6), AAV 혈청형 7(AAV7), AAV 혈청형 8(AAV8), AAV 혈청형 9(AAV9), AAV 혈청형 10(AAV10), AAV 혈청형 11(AAV11) 또는 AAV 혈청형 12(AAV12)를 포함하는 임의의 공지된 AAV 혈청형의 ITR을 이용하거나 이를 기반으로 제조될 수 있다. 당업자는 공지된 수단을 통해 다른 혈청형에서 상응하는 서열을 결정할 수 있다. 본 발명은 나아가 상이한 AAV 혈청형의 조합으로부터의 ITR, 즉, 하나의 ITR(예를 들어, 야생형(WT) 또는 변형된 ITR)은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고 다른 하나의 ITR(예를 들어, 야생형(WT) 또는 변형된 ITR)은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있는 ITR을 포함하는 ceDNA 벡터의 집단 및 복수의 ceDNA 벡터를 제공한다. 이론에 구애됨 없이, 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터의 하나의 ITR(예를 들어, 야생형(WT) 또는 변형된 ITR)은 AAV2 ITR 서열에서 유래하거나 이를 기반으로 할 수 있고, 다른 하나의 ITR(예를 들어, 야생형(WT) 또는 변형된 ITR)은 AAV 혈청형1(AAV1), AAV 혈청형 4(AAV4), AAV 혈청형 5(AAV5), AAV 혈청형 6(AAV6), AAV 혈청형 7(AAV7), AAV 혈청형 8(AAV8), AAV 혈청형 9(AAV9), AAV 혈청형 10(AAV10), AAV 혈청형 11(AAV11) 또는 AAV 혈청형 12(AAV12)의 임의의 하나 이상의 ITR 서열에서 유래하거나 이를 기반으로 할 수 있다.

ceDNA가 실질적으로 대칭인 WT-ITR을 포함할 수 있도록 하는 WT-ITR의 특정 변경 및 돌연변이가 본원에 기재되어 있으며, 즉, 이들은 기하학적 공간에서의 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 이는, G-C 쌍이, 예를 들어 C-G 쌍으로, 또는 그 반대로 변형되거나, A-T 쌍이 T-A 쌍으로, 또는 그 반대로 변형되는 경우에 일어날 수 있다. 따라서, ATCGATCG의 서열을 포함하는 5' WT-ITR과 CGATCGAT를 포함하는 3' WT-ITR(즉, ATCGATCG의 역 보체)의 상기 예시적인 예를 사용하면, 예를 들어 5' WT ITR이 ATCGA A CG의 서열(여기서 T는 A로 변형됨)을 갖고, 실질적으로 대칭인 3' WT-ITR이 A에서 T로의 변형 없이 GCATCGAT의 서열을 갖는 경우, 이러한 WT-ITR은 여전히 실질적으로 대칭일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 WT-ITR 쌍은 대칭인 3차원 공간 구성을 갖기 때문에 실질적으로 대칭이다.

ITR의 특정 변경 및 돌연변이가 본원에 상세하게 설명되어 있지만, ITR의 맥락에서, "변경된" 또는 "돌연변이된" 또는 "변형된"은, 뉴클레오타이드가 야생형 또는 자연 발생 ITR 서열에 대해 삽입, 결실 및/또는 치환된 것을 나타내고, 여기서 전이유전자 또는 이종 핵산을 플랭킹하는 2개의 ITR은 본원에 정의된 바와 같이 동일한 변형을 갖거나 실질적으로 대칭이며, 즉, 기하학적 공간에서의 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 변경된 또는 돌연변이된 ITR은 조작된 ITR일 수 있다. 본원에 사용된 "조작된"은, 인간의 손에 의해 조작된 양태를 나타낸다. 예를 들어, 폴리펩타이드는, 폴리펩타이드의 적어도 하나의 양태, 예를 들어 이의 서열이, 자연에 존재하는 양태와 상이하도록 인간의 손에 의해 조작된 경우, "조작된" 것으로 간주된다.

일부 구현예에서, ITR(예를 들어, 야생형(WT) 또는 변형된 ITR)은 합성일 수 있다. 하나의 구현예에서, 합성 ITR은 하나 초과의 AAV 혈청형에서 유래한 ITR 서열을 기반으로 한다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV 기반 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 구현예에서, 합성 ITR은 AAV 유래 서열을 갖지 않거나 일부만 갖지만, 상기 기재된 ITR 구조를 보존한다. 일부 양태에서, 합성 ITR은 야생형 Rep 또는 특정 혈청형의 Rep와 우선적으로 상호작용할 수 있거나, 또는 일부 경우에, 야생형 Rep에 의해 인식되지 않고 돌연변이된 Rep에 의해서만 인식될 수 있다. 일부 구현예에서, ITR은 헤어핀 2차 구조 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열에 더하여, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'와 같은 기능성 Rep-결합 부위(RBS)와 말단 분해 부위(TRS)를 보유하는 합성 ITR 서열이다. 일부 예에서, 변형된 ITR 서열은 RBS와 trs의 서열, 및 야생형 AAV2 ITR의 상응하는 서열에서 유래한 ITR 헤어핀 2차 구조 중 하나의 말단 루프 부분을 형성하는 Rep 결합 요소의 구조 및 위치를 보유한다. ceDNA 벡터에 사용하기 위한 예시적인 ITR 서열은, 2018년 9월 7일자 출원된 PCT 출원 PCT/US 18/49996의 표 2 내지 표 9, 표 10a와 표 10b, 서열번호 2, 서열번호 52, 서열번호 101 내지 서열번호 449, 및 서열번호 545 내지 서열번호 547에 개시되어 있으며, 부분 ITR 서열은 도 26a 및 도 26b에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 2018년 9월 7일자 출원된 PCT 출원 PCT/US 18/49996의 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 9, 표 10a와 표 10b 중 임의의 하나 이상에 제시된 ITR 서열 또는 ITR 부분 서열에서의 임의의 변형에 상응하는 ITR에서의 변형을 갖는 ITR을 포함할 수 있다.

하나의 구현예에서, 플랭킹 ITR(예를 들어, 야생형(WT) 또는 변형된 ITR)은 서로 실질적으로 대칭이다. ITR이 변형된 ITR인 경우, 변형은 동일하지만(즉, 부가, 치환 또는 결실은 동일하지만), ITR은 동일한 역 보체가 아니다. 예를 들어, ITR(예를 들어, 야생형(WT) 또는 변형된 ITR은)은 상이한 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12), 예컨대 AAV2와 AAV6의 조합에서 유래할 수 있으며, 상응하는 위치의 변형을 가질 수 있다.

하나의 구현예에서, 실질적으로 대칭인 ITR은, 하나가 다른 하나의 ITR에 대해 역상인 경우, 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 적어도 95% 동일, 적어도 96% 동일, 적어도 97% 동일, 적어도 98% 동일 또는 적어도 99% 동일하다(이러한 동일성% 사이의 모든 지점 포함). 상동성은 기본 설정의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(BLASTN)와 같은 당업계에 널리 공지된 표준 수단에 의해 결정될 수 있다. ITR은 A, B 및 C 루프의 전체 기하구조가 유사한 경우, 실질적으로 대칭인 것으로 간주된다. 일부 구현예에서, WT-ITR 쌍은 대칭인 3차원 공간 구성, 예를 들어 A, C-C', B-B' 및 D 아암의 동일한 3D 구성을 갖기 때문에 실질적으로 대칭이다. 하나의 구현예에서, 실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍은 다른 하나에 대해 역상이며, 서로 적어도 95% 동일, 적어도 96%...97%... 98%... 99%....99.5% 동일(이러한 동일성% 사이의 모든 지점 포함)하고, 하나의 WT-ITR은 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 531)의 Rep-결합 부위(RBS)와 말단 분해 부위(trs)를 보유한다. 일부 구현예에서, 실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍은 서로 역상이며, 서로 적어도 95% 동일, 적어도 96%...97%... 98%... 99%....99.5% 동일(이러한 동일성% 사이의 모든 지점 포함)하고, 하나의 WT-ITR은 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 531)의 Rep-결합 부위(RBS)와 말단 분해 부위(trs) 및 헤어핀 2차 구조 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열을 보유한다.

하나의 구현예에서, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은, ITR 사이의 뉴클레오타이드 서열 차이가 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고 이들이 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 갖는 한, 변형된 ITR(mod-ITR)의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, mod-ITR은 기본 설정의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(BLASTN)와 같은 당업계에 널리 공지된 표준 수단에 의해 결정된 기본형 mod-ITR과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고, 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 갖고, 또한 이의 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상으로 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다. 단지 예로서, 실질적으로 대칭인 ITR은 기하학적 공간에서 동일한 형상이 되도록 대칭인 입체화학을 가질 수 있다. 이는, G-C 쌍이, 예를 들어 C-G 쌍으로, 또는 그 반대로 변형되거나, A-T 쌍이 T-A 쌍으로, 또는 그 반대로 변형되는 경우에 일어날 수 있다. 따라서, ATCG AACG ATCG로서의 변형된 5' ITR과 CGAT CGTT CGAT로서의 변형된 3' ITR(즉, ATCG AACG ATCG의 역 보체)의 상기 예시적인 예를 사용하면, 이러한 변형된 ITR은, 예를 들어 5' ITR이 ATCG AAC C ATCG의 서열(여기서, 추가의 G가 C로 변형됨)을 갖고, 실질적으로 대칭인 3' ITR이 A에 더하여 T의 상응하는 변형 없이 CGAT CGTT CGAT의 서열을 갖는 경우, 여전히 대칭일 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 변형된 ITR 쌍은 대칭인 입체화학을 갖기 때문에 실질적으로 대칭이다.

일부 구현예에서, mod-ITR 쌍으로부터의 ITR은 상이한 역 보체 뉴클레오타이드 서열을 갖지만, 여전히 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 가질 수 있으며, 즉, 두 개의 ITR은 동일한 전체 3D 형상을 생성하는 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, mod-ITR 쌍에서 하나의 ITR(예를 들어, 5' ITR)은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 ITR(예를 들어, 3' ITR)은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있지만, 두 가지 모두 동일한 상응하는 돌연변이를 가질 수 있으므로(예를 들어, 5' ITR이 C 영역에 결실을 갖는 경우, 상이한 혈청형으로부터의 동족의 변형된 3' ITR은 C' 영역의 상응하는 위치에 결실을 가짐), 변형된 ITR 쌍은 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 비제한적인 예로서, 예를 들어 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 갖고, 또한 이의 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상으로 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다. 또 다른 예에서, 5' mod-ITR이 B 영역에서 하나 이상의 핵산의 결실을 갖는 경우, 동족 변형된 3'-ITR은 B' 아암에서 상응하는 뉴클레오타이드 위치에 결실을 갖는다.

변형된 ITR 쌍이 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 갖도록, mod-ITR이 본원에 정의된 바와 같이 대칭이거나 실질적으로 대칭이 되도록, 5' mod-ITR이 A 영역에서 변형을 갖는 경우, 동족 3' ITR은 A' 영역에서 상응하는 위치에 변형을 가질 것이고; 5' mod-ITR이 C 영역에서 변형을 갖는 경우, 동족 3' ITR은 C' 영역에서 상응하는 위치에 변형을 갖거나, 또는 그 반대로, 5' mod-ITR이 C' 영역에서 변형을 갖는 경우, 동족 3' ITR은 C 영역에서 상응하는 위치에 변형을 가질 것이고; 5' mod-ITR이 B 영역에서 변형을 갖는 경우, 동족 3' ITR은 B' 영역에서 상응하는 위치에 변형을 갖거나, 또는 그 반대로, 5' mod-ITR이 B' 영역에서 변형을 갖는 경우, 동족 3' ITR은 B 영역에서 상응하는 위치에 변형을 가질 것이고; 5' mod-ITR이 A' 영역에서 변형을 갖는 경우, 동족 3' mod-ITR은 A 영역에서 상응하는 위치에 변형을 가질 것이라는 것은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

일부 구현예에서, 대칭인 변형된 ITR이 실질적으로 대칭인 경우, 다른 하나의 ITR과 비교하여 플랭킹하는 대칭인 변형된 ITR의 뉴클레오타이드 서열의 차이는, 변화가 보존된 핵산에 대한 하나의 핵산 치환이라는 점이다. 일부 구현예에서, 대칭인 변형된 ITR이 실질적으로 대칭인 경우, 다른 하나의 ITR과 비교하여 플랭킹하는 대칭인 변형된 ITR의 뉴클레오타이드 서열의 차이는, 변화가 상보적 핵산에 대한 1개, 2개 또는 3개의 핵산 치환이라는 것이며, 여기서 변화는 ITR 전체에 걸쳐 순차적이거나, 또는 대안적으로, 분산되어 있거나 비(非)순차적일 수 있다. 일부 구현예에서, 대칭인 변형된 ITR 쌍이 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭인 경우, ITR은 플랭킹하는 실질적으로 대칭인 변형된 ITR과 비교하여, 이의 상보적 핵산에 대한 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 중 임의의 개수의 핵산 치환을 가질 수 있으며, 단, 2개의 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 사이의 뉴클레오타이드 서열의 차이는 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고, 이들은 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 갖는다.

임의의 파르보바이러스 ITR은 ITR(예를 들어, 야생형(WT) 또는 변형된 ITR) 또는 변형을 위한 기본 ITR로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 파르보바이러스는 데펜도바이러스이다. 더욱 바람직하게는, AAV이다. 선택된 혈청형은 혈청형의 조직 친화성을 기반으로 할 수 있다. AAV2는 폭넓은 조직 친화성을 갖고, AAV1은 뉴런 및 골격근을 우선적으로 표적화하고, AAV5는 뉴런, 망막색소상피세포 및 광수용체를 우선적으로 표적화한다. AAV6은 골격근 및 폐를 우선적으로 표적화한다. AAV8은 간, 골격근, 심장 및 췌장 조직을 우선적으로 표적화한다. AAV9는 간, 골격 및 폐 조직을 우선적으로 표적화한다. 하나의 구현예에서, 변형된 ITR은 AAV2 ITR을 기반으로 한다.

일부 구현예에 따르면, 벡터 폴리뉴클레오타이드는 표 1에 제시된 군에서 선택되는 WT-IT의 쌍을 포함한다. 표 1은, 동일한 혈청형 또는 상이한 혈청형, 또는 상이한 파르보바이러스 유래의 WT-ITR의 예시적인 조합을 보여준다. 표시된 순서는 ITR 위치의 위치를 나타내지 않으며, 예를 들어 "AAV1, AAV2"는, ceDNA가 5' 위치에 WT-AAV1 ITR을 3' 위치에 WT-AAV2 ITR을 포함할 수 있거나, 그 반대로, 5' 위치에 WT-AAV2 ITR을 3' 위치WT-AAV1 ITR을 포함할 수 있음을 나타낸다. 약어: AAV 혈청형 1(AAV1), AAV 혈청형 2(AAV2), AAV 혈청형 3(AAV3), AAV 혈청형 4(AAV4), AAV 혈청형 5(AAV5), AAV 혈청형 6(AAV6), AAV 혈청형 7(AAV7), AAV 혈청형 8(AAV8), AAV 혈청형 9(AAV9), AAV 혈청형 10(AAV10), AAV 혈청형 11(AAV11) 또는 AAV 혈청형 12(AAV12); AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈(예를 들어, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), 온혈동물 유래의 ITR(조류 AAV(AAAV), 소 AAV(BAAV), 개, 말 및 양 AAV), B19 파르보바이러스 유래의 ITR(GenBank 수탁번호: NC 000883), 마우스 유래 미세생쥐바이러스(MVM)(GenBank 수탁번호. NC 001510); 거위: 거위 파르보바이러스 (GenBank 수탁번호: NC 001701); 뱀: 뱀 파르보바이러스 1(GenBank 수탁번호: NC 006148).

일부 구현예에 따르면, 벡터 폴리뉴클레오타이드 또는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 DNA 벡터는 표 2에 제시된 WT-ITR에서 선택되는 WT-IT의 쌍을 포함한다. 단지 예로서, 표 2는 상이한 AAV 혈청형의 예시적인 WT-ITR의 서열을 보여준다.

본 발명의 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 표 2의 임의의 서열에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 WT-ITR을 갖지 않는다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 서열번호 558 내지 서열번호 567, 서열번호 51 또는 서열번호 1 중 임의의 것에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 WT-ITR을 갖지 않는다.

본 발명의 대안적인 구현예에서, ceDNA 벡터가 서열번호 558 내지 서열번호 567, 서열번호 51 또는 서열번호 1 중 임의의 것에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 WT-ITR을 갖는 경우, 플랭킹 ITR은 또한 WT이고, cDNA는, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치와, 서열번호 558 내지 서열번호 567, 서열번호 51 또는 서열번호 1 중 임의의 것에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것으로 선택된 WT-ITR을 포함한다.

본원에 기재된 ceDNA 벡터는 작동 가능한 RBE, trs 및 RBE' 부분을 보유하는 WT-ITR 구조를 포함할 수 있다. 도 3a와 도 3b는, 예시 목적으로 야생형 ITR을 사용하여, ceDNA 벡터의 야생형 ITR 구조 부분 내에서 trs 부위의 작동을 위한 하나의 가능한 메커니즘을 보여준다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 Rep-결합 부위(예를 들어, RBS; AAV2의 경우 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 531))와 말단 분해 부위(TRS; 예를 들어, 5'-AGTT(서열번호 46))를 포함하는 하나 이상의 기능성 WT-ITR 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 WT-ITR은 기능성이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA 벡터가 서로 실질적으로 대칭인 2개의 WT-ITR을 포함하는 경우, 적어도 하나의 WT-ITR은 기능성이고, 적어도 하나의 WT-ITR은 비(非)기능성이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA 벡터가 서로 대칭인 2개의 변형된 ITR을 포함하는 경우, 적어도 하나의 변형된 ITR은 기능성이고, 적어도 하나의 변형된 ITR은 비기능성이다. 이러한 ceDNA는, 예를 들어 본원에 개시되고 추가로 하기 섹션 V에 상세하게 기재되는 조절 스위치를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원에 제공된 바와 같은, 서열번호 500 내지 서열번호 529로 이루어지거나 이로 본질적으로 이루어진 임의의 서열에서 선택되는 변형된 ITR을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열번호 500 내지 서열번호 529에서 선택되는 임의의 서열에서 선택된 ITR을 갖지 않는다.

일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는 하기로 이루어지는 군에서 선택되는 ITR의 쌍을 포함한다: 서열번호 484(ITR-33 좌측)와 서열번호 469(ITR-18, 우측); 서열번호 485(ITR-34 좌측)와 서열번호 95(ITR-51, 우측); 서열번호 486(ITR-35 좌측)과 서열번호 470(ITR-19, 우측); 서열번호 487(ITR-36 좌측)과 서열번호 471(ITR-20, 우측); 서열번호 488(ITR-37 좌측)과 서열번호 472(ITR-21, 우측); 서열번호 489(ITR-38 좌측)와 서열번호 473(ITR-22 우측); 서열번호 490(ITR-39 좌측)과 서열번호 474(ITR-23, 우측); 서열번호 491(ITR-40 좌측)과 서열번호 475(ITR-24, 우측); 서열번호 492(ITR-41 좌측)와 서열번호 476(ITR-25 우측); 서열번호 493(ITR-42 좌측)과 서열번호 477(ITR-26 우측); 서열번호 494(ITR-43 좌측)와 서열번호 478(ITR-27 우측); 서열번호 495(ITR-44 좌측)와 서열번호 479(ITR-28 우측); 서열번호 496(ITR-45 좌측)과 서열번호 480(ITR-29, 우측); 서열번호 497(ITR-46 좌측)과 서열번호 481(ITR-30, 우측); 서열번호 498(ITR-47, 좌측)과 서열번호 482(ITR-31, 우측); 서열번호 499(ITR-48, 좌측)와 서열번호 483(ITR-32 우측).

이러한 양태의 각각의 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터 또는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 DNA 벡터는, 도 6b 내지 도 21b에 제시되어 있거나, 하기의 조합에서 선택되는 부분 ITR 서열을 포함하는 ITR에서 선택되는 대칭 ITR의 쌍을 포함한다: 서열번호 101과 서열번호 102; 서열번호 103과 서열번호 96; 서열번호 105와 서열번호 106; 서열번호 545와 서열번호 116; 서열번호 111과 서열번호 112; 서열번호 117과 서열번호 118; 서열번호 119와 서열번호 120; 서열번호 121과 서열번호 122; 서열번호 107과 서열번호 108; 서열번호 123과 서열번호 124; 서열번호 125와 서열번호 126; 서열번호 127과 서열번호 128; 서열번호 129와 서열번호 130; 서열번호 131과 서열번호 132; 서열번호 133과 서열번호 134; 서열번호 547과 서열번호 546.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 표 5에 제시된 ITR 서열 또는 ITR 부분 서열, 또는 본원의 도 7a 내지 도 22b, 또는 2018년 9월 7일자 출원된 PCT/US18/49996의 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 9 또는 표 10a와 표 10b에 제시된 서열에서의 임의의 변형에 상응하는 ITR에서의 변형을 갖는 ITR을 포함할 수 있으며, 여기서 플랭킹 ITR 서열은 이의 대칭(예를 들어, 역 보체)이거나 실질적으로 대칭이다.

일부 구현예에서, ceDNA는 분자내 이중체 2차 구조를 형성할 수 있다. 단지 예로서, 제1 ITR과 대칭인 제2 ITR의 2차 구조는 야생형 ITR(예를 들어, 도 2a, 도 2b, 도 4c 참조) 및/또는 변형된 ITR 구조(예를 들어, 도 7a 내지 도 22b 참조)의 맥락에서 예시된다. 2차 구조는 ceDNA 벡터를 생산하는 데 사용되는 플라스미드의 ITR 서열을 기반으로 추론되거나 예측된다. 스템-루프 구조의 일부가 결실된 변형된 대칭인 ITR 쌍의 예시적인 2차 구조는 도 7a 내지 도 22b에 제시되어 있다. 단일 스템과 2개의 루프를 포함하는 변형된 ITR의 예시적인 2차 구조는 도 10a와 도 10b, 도 12a와 도 12b, 도 13a와 도 13b, 도 13a와 도 22b에 제시되어 있다. 단일 스템과 단일 루프를 포함하는 변형된 ITR의 예시적인 2차 구조는 도 7a와 도 7b(예를 들어, 단일 C-C' 루프) 및 도 8a와 도 8b(예를 들어, 단일 B-B' 루프)에 제시되어 있다. 2개의 루프 대신 단일 스템을 갖는 변형된 ITR의 예시적인 2차 구조는 도 11a와 도 11b에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, 2차 구조는 자유 에너지 변화를 폴딩하는 방식으로 정량화되는 구조의 안정성을 예측하는 가장 가까운 이웃 규칙을 기반으로 한 열역학적 방법을 사용하여 본원에 제시된 바와 같이 추론될 수 있다. 예를 들어, 구조는 최저 자유 에너지 구조를 찾는 방식으로 예측될 수 있다. 일부 구현예에서, 문헌[Reuter, J. S., & Mathews, D. H. (2010) RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11,129]에 개시되어 있고, RNA구조 소프트웨어(다음의 인터넷 웹 주소에서 이용 가능함: "rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/index.html")로 구현되는 알고리즘이 ITR 구조 예측에 사용될 수 있다. 상기 알고리즘은 또한 37℃에서의 자유 에너지 변화 매개변수와 실험 문헌에서 유도된 엔탈피 변화 매개변수를 포함하여, 주위 온도에서 형태 안정성을 예측할 수 있다. RNA 구조 소프트웨어를 사용하면, 변형된 ITR 구조의 일부가 도 7a 내지 도 22b에 제시된 생리학적 조건 하에서 추정된 언폴딩 깁스 자유 에너지(ΔG)를 갖는 변형된 T-형 스템-루프 구조로 예측될 수 있다. RNA 구조 소프트웨어를 사용하면, 3가지 유형의 변형된 ITR이 AAV2의 야생형 ITR보다 높은 언폴딩 깁스 자유 에너지(-92.9 kcal/mol)를 갖는 것으로 예측되며, 이는 다음과 같다: (a) 본원에 제공된 단일-아암/단일-짝지어지지 않은-루프 구조를 갖는 변형된 ITR은 -85 내지 -70 kcal/mol 범위의 언폴딩 깁스 자유 에너지를 갖는 것으로 예측됨. (b) 본원에 제공된 단일-헤어핀 구조를 갖는 변형된 ITR은 -70 내지 -40 kcal/mol 범위의 언폴딩 깁스 자유 에너지를 갖는 것으로 예측됨. (c) 본원에 제공된 2개의 아암 구조를 갖는 변형된 ITR은 -90 내지 -70 kcal/mol 범위의 언폴딩 깁스 자유 에너지를 갖는 것으로 예측됨. 이론에 구애됨 없이, 더 높은 깁스 자유 에너지를 갖는 구조는 Rep 68 또는 Rep 78 복제 단백질에 의한 복제를 위해 언폴딩하는 게 더 용이하다. 따라서, 더 높은 언폴딩 깁스 자유 에너지를 갖는 변형된 ITR, 예를 들어 단일-아암/단일-짝지어지지 않은-루프 구조, 단일-헤어핀 구조, 절단된 구조는, 야생형 ITR보다 더 효율적으로 복제되는 경향이 있다.

하나의 구현예에서, ceDNA 벡터의 좌측 ITR은 야생형 AAV ITR 구조에 대해 변형되거나 돌연변이되고, 우측 ITR은 동일한 돌연변이를 갖는 대칭(역 보체)이다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터의 우측 ITR은 야생형 AAV ITR 구조에 대해 변형되고, 좌측 ITR은 동일한 돌연변이를 갖는 대칭(역 보체)이다. 이러한 구현예에서, ITR(예를 들어, 좌측 또는 우측 ITR)의 변형은 AAV 게놈에서 유도된 야생형 ITR의 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환에 의해 생성될 수 있다.

본원에 사용되는 ITR은 분해 가능 및 분해 불가능일 수 있고, 바람직하게는 AAV 서열이 ceDNA 벡터에의 사용을 위해 선택되며, 이때 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9가 바람직하다. 분해 가능한 AAV ITR은, 말단반복이 목적하는 기능, 예를 들어 복제, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 회수 등을 매개하는 한, 야생형 ITR 서열을 필요로 하지 않는다(예를 들어, 내인성 또는 야생형 AAV ITR 서열은 삽입, 결실, 절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있음). 전형적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, ITR은 동일한 AAV 혈청형 유래이며, 예를 들어ceDNA 벡터의 2개의 ITR 서열은 모두 AAV2에서 유래한 것이다. 상기 논의된 바와 같이, 일부 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 대칭인 3차원 공간 구성을 갖지만, 동일한 역 보체 뉴클레오타이드 서열을 갖지 않는다는 점에서 실질적으로 대칭이다. 이러한 구현예에서, 변형된 ITR 쌍의 각각의 ITR은 상이한 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12), 예컨대 AAV2와 AAV6의 조합에서 유래할 수 있으며, 여기서 하나의 ITR에서의 변형은 상이한 혈청형의 동족 ITR 내 상응하는 위치에 반영된다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 AAV 역말단반복으로 기능하는 합성 서열, 예컨대 미국 특허 제5,478,745호(Samulski et al.)에 기재된 바와 같은 "이중-D 서열(double-D sequence)"일 수 있다.

하나의 구현예에서, ceDNA는 본원에 개시된 야생형 ITR 중 하나에 대해 돌연변이되어 있지만, 여기서 돌연변이 또는 변형된 ITR이 여전히 작동 가능한 Rep 결합 부위(RBE 또는 RBE')와 말단 분해 부위(trs)를 보유하는 ITR 구조를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 돌연변이 ceDNA ITR은 기능성 복제 단백질 부위(RPS-1)를 포함하고, RPS-1 부위에 결합하는 복제 가능 단백질이 생산에 사용된다.

하나의 구현예에서, ITR 중 적어도 하나는 Rep 결합 및/또는 Rep 닉킹에 대해 결함이 있는 ITR이다. 하나의 구현예에서, 상기 결함은 야생형 ITR에 비해 적어도 30%이며, 다른 구현예에서, 이는 적어도 35%..., 50%..., 65%..., 75%..., 85%..., 90%..., 95%..., 98%..., 또는 기능의 완전한 결여 또는 상기 백분율 범위 사이의 임의의 지점이다. 숙주세포는 바이러스 캡시드 단백질을 발현하지 않으며, 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형에는 임의의 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없다. 하나의 구현예에서, AAV 캡시드 유전자가 없는 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형과 숙주세포, 및 생성되는 단백질은 또한 다른 바이러스의 캡시드 유전자를 인코딩하거나 발현하지 않는다. 또한, 특정 구현예에서, 핵산 분자에는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 없다.

일부 구현예에서, ITR의 구조 요소는 ITR과 큰 Rep 단백질(예를 들어, Rep 78 또는 Rep 68)의 기능적 상호작용에 관여하는 임의의 구조 요소일 수 있다. 특정 구현예에서, 구조 요소는 ITR과 큰 Rep 단백질의 상호작용에 대한 선택성을 제공하며, 즉, 적어도 부분적으로 어느 Rep 단백질이 ITR과 기능적으로 상호작용하는 지를 결정한다. 다른 구현예에서, 구조 요소는, Rep 단백질이 ITR에 결합될 때, 큰 Rep 단백질과 물리적으로 상호작용한다. 각각의 구조 요소는, 예를 들어 ITR의 2차 구조, ITR의 뉴클레오타이드 서열, 둘 이상의 요소 사이의 간격, 또는 상기 중 임의의 것의 조합일 수 있다. 하나의 구현예에서, 구조 요소는 A 및 A' 아암, B 및 B' 아암, C 및 C' 아암, D 아암, Rep 결합 부위(RBE) 및 RBE'(즉, 상보적 RBE 서열), 및 말단 분해 부위(trs)로 이루어지는 군에서 선택된다.

보다 구체적으로, ITR은 구조적으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조 요소의 뉴클레오타이드 서열은 ITR의 야생형 서열과 비교하여 변형될 수 있다. 하나의 구현예에서, ITR의 구조 요소(예를 들어, A 아암, A' 아암, B 아암, B' 아암, C 아암, C' 아암, D 아암, RBE, RBE' 및 trs)는 제거되어, 상이한 파르보바이러스의 야생형 구조 요소로 대체될 수 있다. 예를 들어, 대체 구조는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, 뱀 파르보바이러스(예를 들어, 공비단뱀 파르보바이러스), 소 파르보바이러스, 염소 파르보바이러스, 조류 파르보바이러스, 개 파르보바이러스, 말 파르보바이러스, 새우 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스 또는 곤충 AAV에서 유래할 수 있다. 예를 들어, ITR은 AAV2 ITR일 수 있고, A 또는 A' 아암, 또는 RBE는 AAV5의 구조 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, ITR은 AAV5 ITR일 수 있고, C 또는 C' 아암, RBE, 및 trs는 AAV2의 구조 요소로 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, AAV ITR은 B 및 B' 아암이 AAV2 ITR B 및 B' 아암으로 대체된 AAV5 ITR일 수 있다.

단지 예로서, 표 3은 변형된 ITR 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 예시적인 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타내며, 여기서 X는 상응하는 야생형 ITR에 대한 해당 섹션에서의 적어도 하나의 핵산의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 나타낸다. 일부 구현예에서, C 및/또는 C' 및/또는 B 및/또는 B'의 임의의 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 예를 들어, 변형이 단일 아암 ITR(예를 들어, 단일 C-C' 아암 또는 단일 B-B' 아암), 또는 변형된 C-B' 아암 또는 C'-B 아암, 또는 적어도 하나의 절단된 아암(예를 들어, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암)을 갖는 2개의 아암 ITR 중 임의의 것을 생성하는 경우, 적어도 단일 아암, 또는 2개의 아암 ITR 중 적어도 하나의 아암(여기서 하나의 아암은 절단될 수 있음)은 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 일부 구현예에서, 절단된 C-C' 아암 및/또는 절단된 B-B' 아암은 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 갖는다.

표 3은, ITR의 상이한 B-B' 및 C-C' 영역 또는 아암에 대한 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)의 예시적인 조합을 나타낸다(X는 뉴클레오타이드 변형, 예를 들어 해당 영역에서 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 부가, 결실 또는 치환을 나타냄).

일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A'와 C 사이, C와 C' 사이, C'와 B 사이, B와 B' 사이, 및 B'와 A 사이에서 선택되는 영역 중 임의의 하나 이상에서의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, C 또는 C' 또는 B 또는 B' 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 여전히 스템-루프의 말단 루프를 보존한다. 일부 구현예에서, C 및 C' 및/또는 B 및 B' 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 T 뉴클레오타이드(즉, TTT)를 보유한다. 대안적인 구현예에서, C와 C' 사이 및/또는 B와 B' 사이의 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 임의의 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)은, 적어도 하나의 말단 루프에 3개의 순차적 A 뉴클레오타이드(즉, AAA)를 보유한다. 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A', A 및/또는 D에서 선택되는 영역 중 임의의 하나 이상에서의 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A' 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 A 및/또는 A' 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 표 3에 제시된 변형의 조합 중 어느 하나, 및 또한 D 영역 내 적어도 하나의 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 결실, 삽입 및/또는 치환)을 포함할 수 있다.

하나의 구현예에서, 구조 요소의 뉴클레오타이드 서열을 변형시켜(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상(또는 상기 제시된 개수 내 임의의 범위)의 뉴클레오타이드를 변형시켜) 변형된 구조 요소를 생성할 수 있다. 하나의 구현예에서, 대칭인 ITR에 대한 특정 변형이 본원에 예시된다(예를 들어, 표 4에서 확인된 대칭인 변형된 ITR의 쌍).

일부 구현예에서, ITR을 변형시킬 수 있다(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개 이상(또는 상기 제시된 개수 내 임의의 범위)의 뉴클레오타이드를 변형시킴). 다른 구현예에서, ITR은 표 4의 변형된 ITR 중 하나(예를 들어, 또는 A-A' 아암의 RBE 함유 섹션, 및 서열번호 101과 서열번호 102; 서열번호 103과 서열번호 96; 서열번호 105와 서열번호 106; 서열번호 545와 서열번호 116; 서열번호 111과 서열번호 112; 서열번호 117과 서열번호 118; 서열번호 119와 서열번호 120; 서열번호 121과 서열번호 122; 서열번호 107과 서열번호 108; 서열번호 123과 서열번호 124; 서열번호 125와 서열번호 126; 서열번호 127과 서열번호 128; 서열번호 129와 서열번호 130; 서열번호 131과 서열번호 132; 서열번호 133과 서열번호 134; 서열번호 547과 서열번호 546으로 이루어지는 군에서 선택되는 대칭인 변형된 쌍의 C-C' 아암과 B-B' 아암)와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.

일부 구현예에서, 변형된 ITR은, 예를 들어 특정 아암의 전부, 예를 들어 A-A' 아암의 전부 또는 일부, 또는 B-B' 아암의 전부 또는 일부, 또는 C-C' 아암의 전부 또는 일부의 제거 또는 결실, 또는 대안적으로, 스템(예를 들어, 단일 아암)을 캡핑하는 최종 루프가 여전히 존재하는 한, 루프의 스템을 형성하는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다(예를 들어, ITR-6 참조). 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 B-B' 아암으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거, 및 B-B' 아암으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍의 제거를 포함할 수 있다. 염기쌍의 제거의 임의의 조합이 고려되며, 예를 들어 C-C' 아암에서 6개의 염기쌍이 제거되고 B-B' 아암에서 2개의 염기쌍이 제거될 수 있다. 예시적인 예로서, C 부분 및 C' 부분 각각에서 적어도 7개의 염기쌍 결실, C 영역과 C' 영역 사이의 루프에서 뉴클레오타이드의 치환, 및 변형된 ITR이 적어도 하나의 아암(예를 들어, C-C')이 절단된 2개의 아암을 포함하도록 B 영역 및 B' 영역 각각에서의 적어도 하나의 염기쌍 결실을 갖는 예시적인 변형된 ITR. 이러한 예에서, 변형된 ITR은 B 영역 및 B' 영역 각각에서 적어도 하나의 염기쌍 결실을 포함하기 때문에, 아암 B-B'가 또한 WT ITR에 비해 절단되어 있다는 점에 유의해야 한다.

일부 구현예에서, C-C' 아암이 절단되도록, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 상보적 염기쌍이 C-C' 아암의 C 부분 및 C' 부분 각각에서 제거된다. 즉, 염기가 C-C' 아암의 C 부분에서 제거되는 경우, C' 부분의 상보적 염기쌍이 제거되어 C-C' 아암이 절단된다. 이러한 구현예에서, C-C' 아암이 절단되도록, 2개, 4개, 6개, 8개 또는 그 이상의 염기쌍이 C-C' 아암에서 제거된다. 대안적인 구현예에서, 아암의 C' 부분만 남아있도록, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 C-C' 아암의 C 부분에서 제거된다. 대안적인 구현예에서, 아암의 C 부분만 남아있도록, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 C-C' 아암의 C' 부분에서 제거된다.

일부 구현예에서, B-B' 아암이 절단되도록, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 B-B' 아암의 B 부분 및 B' 부분 각각에서 제거된다. 즉, 염기가 B-B' 아암의 B 부분에서 제거되는 경우, B' 부분의 상보적 염기쌍이 제거되어 B-B' 아암이 절단된다. 이러한 구현예에서, B-B' 아암이 절단되도록, 2개, 4개, 6개, 8개 또는 그 이상의 염기쌍이 B-B' 아암에서 제거된다. 대안적인 구현예에서, 아암의 B' 부분만 남아있도록, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 B-B' 아암의 B 부분에서 제거된다. 대안적인 구현예에서, 아암의 B 부분만 남아있도록, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 염기쌍이 B-B' 아암의 B' 부분에서 제거된다.

일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 야생형 ITR 서열에 비해 1개 내지 50개(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개 또는 50개)의 뉴클레오타이드 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 WT ITR 서열에 비해 1개 내지 30개의 뉴클레오타이드 결실을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 전장 야생형 ITR 서열에 비해 2개 내지 20개의 뉴클레오타이드 결실을 갖는다.

일부 구현예에서, 변형된 ITR은 2개의 대향하는 길이방향(lengthwise) 대칭인 스템-루프를 형성하며, 예를 들어 C-C' 루프는 B-B' 루프와 길이가 상이하다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR의 대향하는 길이방향 대칭인 스템-루프 중 하나는, 길이가 8개 내지 10개 염기쌍 범위인 C-C' 및/또는 B-B' 스템 부분과, (예를 들어, C-C' 사이 또는 B-B' 사이에) 2개 내지 5개의 짝지어지지 않은 데옥시리보뉴클레오타이드를 갖는 루프 부분을 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 ITR의 하나의 길이방향 대칭인 스템-루프는, 길이가 8개 미만, 또는 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개, 1개 미만의 염기쌍인 C-C' 및/또는 B-B' 스템 부분과, (예를 들어, C-C' 사이 또는 B-B' 사이에) 0개 내지 5개 뉴클레오타이드를 갖는 루프 부분을 갖는다. 일부 구현예에서, 길이방향 대칭인 스템-루프를 갖는 변형된 ITR은, 길이가 3개 미만의 염기쌍인 C-C' 및/또는 B-B' 스템 부분을 갖는다.

일부 구현예에서, 변형된 ITR은, DNA 복제(예를 들어, Rep 단백질에 의한 RBE에의 결합, 또는 말단 분해 부위에서의 닉킹)를 방해하지 않도록, A 또는 A' 영역의 RBE 함유 부분에서 임의의 뉴클레오타이드 결실을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에의 사용을 위해 포함된 변형된 ITR은 본원에 기재된 바와 같은 B, B', C, 및/또는 C 영역에 하나 이상의 결실을 갖는다. 변형된 ITR의 몇 가지 비제한적인 예는 도 6b 내지 도 21b에 제시되어 있다.

일부 구현예에서, 변형된 ITR은 C-C' 아암이 남아있도록 B-B' 아암의 결실을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 7a와 도 7b에 제시된 예시적인 ITR-33(좌측)과 ITR-18(우측), 또는 ITR-35(좌측)와 ITR-19(우측)(도 9a와 도 9b) 참조). 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 B-B' 아암이 남아있도록 C-C' 아암의 결실을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 8a와 도 8b에 제시된 예시적인 ITR-34(좌측)와 ITR-51(우측) 참조). 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 단일 스템-루프가 남아있도록 B-B' 아암과 C-C' 아암의 결실을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 11a와 도 11b에 제시된 예시적인 ITR-37(좌측)과 ITR-21(우측) 참조). 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 절단된 C-루프 및 B-B' 아암이 남아있도록 C' 영역의 결실을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 10a와 도 10b에 제시된 예시적인 ITR-36(좌측)과 ITR-20(우측); ITR-42(좌측)와 ITR-26(우측)(도 16a와 도 16b); ITR-43(좌측)과 ITR-27(우측)(도 17a와 도 17b); ITR-44(좌측)와 ITR-28(우측)(도 18a와 도 18b); ITR-45(좌측)와 ITR-29(우측)(도 19a와 도 19b); ITR-46(좌측)과 ITR-23(우측)(도 20a와 도 20b); ITR-47(좌측)과 ITR-31(우측)(도 21a와 도 21b); ITR-48(좌측)과 ITR-32(우측)(도 22a와 도 22b) 참조). 유사하게, 일부 구현예에서, 변형된 ITR은 절단된 B-루프와 C-C' 아암이 남아있도록 B 영역의 결실을 포함할 수 있다(예를 들어, 도 12a와 도 12b에 제시된 예시적인 ITR-38(좌측)과 ITR-22(우측); ITR-39(좌측)와 ITR-23(우측)(도 13a와 도 13b); ITR-40(좌측)과 ITR-24(우측)(도 14a와 도 14b); 및 ITR-41(좌측)과 ITR-25(우측)(도 15a와 도 15b) 참조).

일부 구현예에서, 변형된 ITR은, 상보적 염기 짝짓기가 C-B' 부분 사이 및 C'-B 부분 사이에서 일어나, 단일 아암, 예를 들어 ITR-10(우측)과 ITR-10(좌측)을 생성하도록, C 부분, C' 부분, B 부분 또는 B' 부분 중 임의의 하나 이상에서 염기쌍의 결실을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, C, C', B 및/또는 B' 영역 내 하나 이상의 뉴클레오타이드의 변형에 더하여, 본원에 사용하기 위한 변형된 ITR은 A'와 C 사이, C와 C' 사이, C'와 B 사이, B와 B' 사이, 및 B'와 A 사이에서 선택되는 영역 중 임의의 하나 이상에서 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 뉴클레오타이드의 변형(예를 들어, 결실, 치환 또는 부가)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변형된 우측 ITR에서 B'와 C 사이의 뉴클레오타이드는 A에서 G, C 또는 A로 치환되거나, 결실되거나 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 부가될 수 있으며; 변형된 좌측 ITR에서 C'와 B 사이의 뉴클레오타이드는 T에서 G, C 또는 A로 변경되거나, 결실되거나 또는 하나 이상의 뉴클레오타이드가 부가될 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열번호 550 내지 서열번호 557 중 어느 하나에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 변형된 ITR을 갖지 않는다. 본 발명의 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 서열번호 550 내지 서열번호 557 중 어느 하나에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 ITR을 갖지 않는다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 및 서열번호 550 내지 서열번호 557 중 어느 하나에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것으로 선택되는 변형된 ITR을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 구조 요소의 구조는 변형될 수 있다. 예를 들어, 구조 요소는 스템의 높이 및/또는 루프 내 뉴클레오티드 수가 변경된다. 예를 들어, 스템의 높이는 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 또는 상기 개수 내 임의의 범위의 뉴클레오타이드일 수 있다. 하나의 구현예에서, 스템의 높이는 약 5개 뉴클레오타이드 내지 약 9개 뉴클레오타이드일 수 있으며, Rep와 기능적으로 상호작용한다. 또 다른 구현예에서, 스템의 높이는 약 7개 뉴클레오타이드일 수 있으며, Rep와 기능적으로 상호작용한다. 또 다른 예에서, 루프는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 또는 상기 개수 내 임의의 범위의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.

또 다른 구현예에서, RBE 또는 연장된 RBE 내 GAGY 결합 부위 또는 GAGY 관련 결합 부위의 수가 증가 또는 감소할 수 있다. 하나의 예에서, RBE 또는 연장된 RBE는, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개, 또는 그 이상의 GAGY 결합 부위, 또는 상기 개수 내 임의의 범위의 GAGY 결합 부위를 포함할 수 있다. 각각의 GAGY 결합 부위는, 서열이 Rep 단백질에 결합하는 데 충분하다면, 독립적으로 정확한 GAGY 서열 또는 GAGY에 유사한 서열일 수 있다.

또 다른 구현예에서, 2개의 요소(예컨대, 비제한적으로, RBE와 헤어핀) 사이의 간격을 변경시켜(예를 들어, 증가 또는 감소시켜), 큰 Rep 단백질과의 기능적 상호작용을 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 간격은 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 21개 뉴클레오타이드 또는 그 이상, 또는 상기 개수 내 임의의 범위의 뉴클레오타이드일 수 있다.

표 4는, 예시적인 대칭인 변형된 ITR 쌍(즉, 좌측 변형된 ITR과 대칭인 우측 변형된 ITR)을 보여준다. 서열의 볼드체(적색) 부분은, 또한 도 7a 내지 도 22b에 제시된, 부분 ITR 서열(즉, A-A', C-C' 및 B-B' 루프의 서열)을 식별한다. 이러한 예시적인 변형된 ITR은 GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(서열번호 531)의 RBE, ACTGAGGC(서열번호 532)의 스페이서, 스페이서 보체 GCCTCAGT(서열번호 535) 및 GAGCGAGCGAGCGCGC(서열번호 536)의 RBE'(즉, RBE에 대한 보체)를 포함할 수 있다.

본 발명의 구현예에서, 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 서열번호 550, 서열번호 551, 서열번호 552, 서열번호 553, 서열번호 553, 서열번호 554, 서열번호 555, 서열번호 556 및 서열번호 557로 이루어지는 군 중 임의의 것에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 변형된 ITR을 갖지 않는다.

IV. 조절 요소

ceDNA 벡터는 시스-조절 요소의 특정 조합을 추가로 포함하는 발현 구조체에서 생산될 수 있다. 시스-조절 요소에는, 비제한적으로, 프로모터, 리보스위치, 절연인자, mir-조절 요소, 전사 후 조절 요소, 조직 및 세포 유형 특이적 프로모터, 및 인핸서가 포함된다. 일부 구현예에서, ITR은 전이유전자를 위한 프로모터로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 조절하는 추가 구성요소, 예를 들어 전이유전자의 발현을 조절하는 본원에 기재된 바와 같은 조절 스위치, 또는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 사멸시킬 수 있는 사멸 스위치를 포함한다.

ceDNA 벡터는 전사 후 조절 요소(WPRE)(예를 들어, 서열번호 8) 및 BGH polyA(서열번호 9)와 같은 시스-조절 요소의 특정 조합을 추가로 포함하는 발현 구조체에서 생산될 수 있다. 발현 구조체에 사용하기에 적합한 발현 카세트는 바이러스 캡시드에 의해 부과된 패키징 제약에 의해 제한되지 않는다.

프로모터: 본 발명의 발현 카세트는 전체 발현 수준 및 세포 특이성에 영향을 미칠 수 있는 프로모터를 포함한다. 전이유전자 발현을 위해, 이는 고도로 활성인 바이러스 유래의 극초기 프로모터를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 특정 세포 유형에 대한 전이유전자 발현을 제한하고, 조절되지 않은 이소성 발현으로 인한 독성 효과 및 면역 반응을 감소시키기 위해 조직 특이적 진핵생물 프로모터를 함유할 수 있다.

상기 기재된 것들을 포함하는 적합한 프로모터는, 바이러스에서 유도될 수 있고, 따라서 바이러스 프로모터로 지칭될 수 있거나, 원핵생물 또는 진핵생물 유기체를 포함하는 임의의 유기체에서 유도될 수 있다. 적합한 프로모터는 임의의 RNA 폴리머라아제(예를 들어, pol I, pol II, pol III)에 의한 발현을 유도하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 프로모터에는, 비제한적으로, SV40 초기 프로모터, 마우스 유선종양바이러스 긴말단반복(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순헤르페스바이러스(HSV) 프로모터, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 극초기 프로모터 영역(CMVIE), 라우스육종(rous sarcoma)바이러스(RSV) 프로모터, 인간 U6 소형 핵 프로모터(U6, 예를 들어, 서열번호 18)(문헌[Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)]), 증강된 U6 프로모터(예를 들어, 문헌[Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31(17))], 인간 H1 프로모터(H1)(예를 들어, 서열번호 19), CAG 프로모터, 인간 알파 1-항트립신(hAAT) 프로모터(예를 들어, 서열번호 21) 등이 포함된다. 구현예에서, 이러한 프로모터는 하나 이상의 뉴클레아제 절단 부위를 포함하도록 이의 다운스트림 인트론 함유 말단에서 변경된다. 구현예에서, 뉴클레아제 절단 부위(들)을 함유하는 DNA는 프로모터 DNA에 대해 이질적이다.

일부 구현예에 따르면, 프로모터는 발현을 추가로 증강시키고/시키거나 이의 공간적 발현 및/또는 시간적 발현을 변경시키기 위해 하나 이상의 특정 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 전사 시작 부위에서 수천 개 염기쌍 만큼 위치할 수 있는 원위 인핸서 또는 억제제 요소를 포함할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원에서 유도될 수 있다. 프로모터는 유전자 구성요소의 발현을 구성적으로, 또는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 발현이 일어나는 발달 단계에 대해, 또는 생리학적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제와 같은 외부 자극에 반응하여 차별적으로 조절할 수 있다. 프로모터의 대표적인 예에는, 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 작동자 프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터뿐 아니라, 하기에 열거된 프로모터가 포함된다. 이러한 프로모터 및/또는 인핸서는 임의의 관심 유전자(예를 들어, 유전자 편집 분자, 공여체 서열, 치료용 단백질 등)의 발현에 사용될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 치료용 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 치료용 단백질 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는, 원숭이바이러스 40(SV40)으로부터의 프로모터, 마우스 유선종양바이러스(MMTV) 프로모터, 소 면역결핍바이러스(BIV) 긴말단반복(LTR) 프로모터와 같은 인간 면역결핍바이러스(HIV) 프로모터, 몰로니(Moloney) 바이러스 프로모터, 조류백혈병바이러스(ALV) 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 극초기 프로모터와 같은 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인바(Epstein Barr) 바이러스(EBV) 프로모터, 또는 라우스육종 바이러스(RSV) 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 인간 유비퀴틴 C(hUbC), 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인과 같은 인간 유전자 유래의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 조직 특이적 프로모터, 예컨대 천연 또는 합성의 인간 알파 1-항트립신(hAAT)과 같은 간 특이적 프로모터일 수 있다. 하나의 구현예에서, 간으로의 전달은, 간세포 표면에 존재하는 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체를 통해, 간세포에 대한 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물의 내인성 ApoE 특이적 표적화를 사용하여 달성될 수 있다.

하나의 구현예에서, 사용된 프로모터는 치료용 단백질을 인코딩하는 유전자의 천연 프로모터이다. 치료용 단백질을 인코딩하는 각각의 유전자에 대한 프로모터 및 다른 조절 서열은 공지되어 있고 특징분석되어 있다. 사용되는 프로모터 영역은 하나 이상의 추가 조절 서열(예를 들어, 천연), 예를 들어 인핸서(예를 들어, 서열번호 22 및 서열번호 23)를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기에 적합한 프로모터의 비제한적인 예에는, 예를 들어 CAG 프로모터(서열번호 3), hAAT 프로모터(서열번호 21), 인간 EF1-α 프로모터(서열번호 6) 또는 EF1a 프로모터의 단편(서열번호 15), IE2 프로모터(예를 들어, 서열번호 20) 및 래트 EF1-α 프로모터(서열번호 24)가 포함된다.

일부 구현예에 따르면, 발현 카세트는 CAG 프로모터(서열번호 3)와 같은 합성 조절 요소를 함유할 수 있다. CAG 프로모터는 (i) 시토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소, (ii) 닭 베타-액틴 유전자의 프로모터, 제1엑손 및 제1 인트론, 및 (iii) 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 포함한다. 대안적으로, 발현 카세트는 hAAT 프로모터(서열번호 21), 알파-1-항트립신(AAT) 프로모터(서열번호 4 또는 서열번호 74), 간 특이적(LP1) 프로모터(서열번호 5 또는 서열번호 16), 인간 신장인자-1 알파(EF1α) 프로모터 또는 이의 단편(예를 들어, 서열번호 6 또는 서열번호 15), 래트 EF1α 프로모터(서열번호 24) 또는 IE2 프로모터(서열번호 20)를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트에는, 하나 이상의 구성적 프로모터, 예를 들어 레트로바이러스 라우스육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 또는 시토메갈로바이러스(CMV) 극초기 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐, 예를 들어 서열번호 22)가 포함된다. 대안적으로, 유도성 프로모터, 전이유전자에 대한 천연 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 당업계에 공지된 다양한 프로모터가 사용될 수 있다.

폴리아데닐화 서열: ceDNA 벡터에서 발현되는 mRNA를 안정화시키고, 핵 방출 및 번역을 돕기 위해, 폴리아데닐화 서열을 인코딩하는 서열이 ceDNA 벡터에 포함될 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 폴리아데닐화 서열을 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 상기 벡터는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 45개, 적어도 50개 또는 그 이상의 아데닌 또는 디뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 서열은 약 43개의 뉴클레오타이드, 약 40 내지 50개의 뉴클레오타이드, 약 40개 내지 55개의 뉴클레오타이드, 약 45개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 약 35개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 또는 상기 개시된 범위 사이의 임의의 범위의 뉴클레오타이드를 포함한다.

발현 카세트는 당업계에 공지된 폴리아데닐화 서열 또는 이의 변이체, 예컨대 소 BGHpA(예를 들어, 서열번호 74) 또는 바이러스 SV40pA(예를 들어, 서열번호 10)에서 단리된 자연 발생 서열, 또는 합성 서열(예를 들어, 서열번호 27)을 포함할 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 polyA 신호 업스트림 인핸서(USE) 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, USE는 SV40pA 또는 이종 polyA 신호와 조합으로 사용될 수 있다.

발현 카세트는 또한 전이유전자의 발현을 증가시키기 위해 전사 후 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 우드척 간염바이러스(WHP: Woodchuck Hepatitis Virus) 전사 후 조절 요소(WPRE)(예를 들어, 서열번호 8)가 전이유전자의 발현을 증가시키기 위해 사용된다. 단순헤르페스바이러스의 티미딘 키나아제 유전자, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)로부터의 전사 후 요소와 같은 다른 전사 후 처리 요소가 사용될 수 있다. 분비 서열은 전이유전자, 예를 들어 VH-02 및 VK-A26 서열, 예를 들어 서열번호 25 및 서열번호 26에 연결될 수 있다.

하나의 구현예에서, 숙주세포는 바이러스 캡시드 단백질을 발현하지 않고, 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형에는 임의의 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없다. 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형에는 AAV 캡시드 유전자뿐 아니라 다른 바이러스의 캡시드 유전자도 없다. 하나의 구현예에서, 핵산 분자에는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 없다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자에는 기능성 AAV cap 유전자와 AAV rep 유전자 둘 모두가 없다.

V. 조절 스위치

분자 조절 스위치는 신호에 반응하여 측정 가능한 상태 변화를 생성하는 스위치이다. 이러한 조절 스위치는 ceDNA 벡터의 출력을 제어하기 위해 본원에 기재된 ceDNA 벡터와 유용하게 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 미세조정하는 역할을 하는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, 이는 ceDNA 벡터의 생물학적 봉쇄(biocontainment) 기능으로 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 스위치는 제어 가능하고 조절 가능한 방식으로 ceDNA에서 관심 유전자의 발현을 개시 또는 중단(즉, 셧다운)하도록 설계된 "ON/OFF" 스위치이다. 일부 구현예에서, 상기 스위치는 스위치가 활성화되면 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 세포의 프로그래밍된 사멸을 거치도록 지시할 수 있는 "사멸 스위치"를 포함할 수 있다.

A. 이원 조절 스위치

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 제어 가능하게 조절하는 역할을 할 수 있는 조절 수위치를 포함한다. 이러한 구현예에서, ceDNA 벡터의 ITR 사이에 위치한 발현 카세트는 관심 유전자에 작동적으로 연결된 조절 영역, 예를 들어 프로모터, 시스-요소, 억제제, 인핸서 등을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 조절 영역은 하나 이상의 보조인자 또는 외인성 작용제에 의해 조절된다. 따라서, 하나의 구현예에서, 하나 이상의 보조인자(들) 또는 외인성 작용제가 세포에 존재하는 경우에만, ceDNA 벡터로부터 관심 유전자의 전사 및 발현이 일어날 것이다. 또 다른 구현예에서, 하나 이상의 보조인자(들) 또는 외인성 작용제는 관심 유전자의 전사 및 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다.

당업자에게 공지된 임의의 핵산 조절 영역이 조절 스위치를 포함하도록 설계된 ceDNA 벡터에 이용될 수 있다. 단지 예로서, 조절 영역은 소분자 스위치, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 비제한적인 예는, 호르몬 유도성 또는 금속 유도성 프로모터이다. 다른 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소에는, 비제한적으로, RU486-유도성 프로모터, 엑디손-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터가 포함된다. 문헌[Fussenegger et al., Nature Biotechnol. 18: 1203-1208 (2000)]에 개시된 것을 포함하여, 전형적인 테트라시클린 기반 또는 다른 항생제 기반 스위치가 사용을 위해 포함된다.

B. 소분자 조절 스위치

다양한 업계 공지 소분자 기반 조절 스위치가 당업계에 공지되어 있으며, 이는 본원에 개시된 ceDNA 벡터와 조합되어 조절 스위치 제어된 ceDNA 벡터를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 문헌[Taylor, et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15]에 개시된 바와 같은 작동적으로 연결된 전이유전자의 발현을 제어하는 인공 프로모터와 함께인, 직교 리간드/핵 수용체 쌍, 예를 들어 레티노이드 수용체 변이체/LG335 및 GRQCIMFI; 조작된 스테로이드 수용체, 예를 들어 프로게스테론에 결합할 수 없지만 RU486(미페프리스톤(mifepristone))에 결합하는 C-말단 절단을 갖는 변형된 프로게스테론 수용체(미국 특허 제5,364,791호); 초파리의 엑디손 수용체 및 이의 엑디스테로이드 리간드(문헌[Saez, et al., PNAS, 97(26)(2000), 14512―14517]); 또는 문헌[Sando R 3^rd; Nat Methods. 2013, 10(11):1085-8]에 개시된 바와 같은 항생제 트리메토프림(TMP: trimethoprim)에 의해 제어되는 스위치 중 어느 하나 또는 이들의 조합에서 선택될 수 있다.

당업자에게 공지된 다른 소분자 기반 조절 스위치는 또한 ceDNA의 전이유전자 발현을 제어하는 데 사용하기 위한 것으로 고려되며, 이에는, 비제한적으로, 문헌[Buskirk et al., Cell; Chem and Biol., 2005; 12(2); 151-161]에 개시된 것들; 문헌[Liang, F.-S., et al., (2011) Science Signaling, 4(164)]에 개시된 것들과 같은 아브시스산 민감성 ON-스위치; 문헌[Hartenbach, et al. Nucleic Acids Research, 35(20), 2007]에 개시된 것들과 같은 외인성 L-아르기닌 민감성 ON-스위치; 문헌[Rossger et al., Metab Eng. 2014,21: 81―90]에 개시된 것들과 같은 합성 담즙산 민감성 ON-스위치; 문헌[Weber et al., Metab. Eng. 2009 Mar; 11(2): 117―124]에 개시된 것들과 같은 비오틴 민감성 ON-스위치; 문헌[Xie et al., Nucleic Acids Research, 2014; 42(14);e116]에 개시된 것들과 같은 이중 입력 식품 첨가제 벤조에이트/바닐린 민감성 조절 스위치; 문헌[Giuseppe et al., Molecular Therapy, 6(5), 653 ― 663]에 개시된 것들과 같은 4-히드록시타목시펜 민감성 스위치; 및 문헌[Gitzinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2009 Jun 30; 106(26): 10638―10643]에 개시된 것들과 같은 플라보노이드(플로레틴) 민감성 조절 스위치가 포함된다.

일부 구현예에서, 전이유전자를 제어하거나 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 조절 스위치는, 미국 특허 제8,771,679호 및 제6,339,070호에 개시된 것들과 같은 전구약물 활성화 스위치이다.

ceDNA 벡터에 사용하기 위한 예시적인 조절 스위치에는, 비제한적으로, 표 5에 열거된 것들이 포함된다.

C. "패스코드 (Passcode)" 조절 스위치

일부 구현예에서, 조절 스위치는 "패스코드 스위치" 또는 "패스코드 회로"일 수 있다. 패스코드 스위치는, 특정 조건이 발생하는 경우에 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자 발현 제어를 미세 조정하는 것을 가능하게 하며, 즉, 전이유전자 발현 및/또는 억제가 일어나기 위해서는 조건의 조합이 존재해야 한다. 예를 들어, 전이유전자의 발현이 일어나기 위해서는, 적어도 조건 A 및 B가 발생해야 한다. 패스코드 조절 스위치는, 전이유전자의 발현이 일어나기 위해 존재하는 임의의 수의 조건, 예를 들어 적어도 2개, 또는 적어도 3개, 또는 적어도 4개, 또는 적어도 5개, 또는 적어도 6개, 또는 적어도 7개, 또는 그 이상의 조건일 수 있다. 일부 구현예에서는, 적어도 2개의 조건(예를 들어, 조건 A, B)이 발생해야 하고, 일부 구현예에서는, 적어도 3개의 조건(예를 들어, A, B 및 C, 또는 A, B 및 D)이 발생해야 한다. 단지 예로서, 패스코드 "ABC" 조절 스위치를 갖는 ceDNA에서 유전자 발현이 일어나기 위해서는, 조건 A, B 및 C가 존재해야 한다. 조건 A, B 및 C는 다음과 같을 수 있다: 조건 A는 병태 또는 질환의 존재이고, 조건 B는 호르몬 반응이고, 조건 C는 전이유전자 발현에 대한 반응이다. 단지 예시적인 예로서, 전이유전자가 인슐린인 경우, 조건 A는 대상이 당뇨병을 앓고 있는 경우에 발생하고, 조건 B는 혈당 수준이 높은 경우이고, 조건 C는 요구되는 양으로 발현되지 않는 내인성 인슐린 수준이다. 당 수준이 감소하거나 목적하는 인슐린 수준에 도달하면, 전이유전자(예를 들어, 인슐린)는 다시 3가지 조건이 발생할 때까지 꺼지고, 다시 켜지게 된다. 또 다른 예시적인 예에서, 전이유전자가 EPO인 경우, 조건 A는 만성신장질환(CKD)의 존재이고, 조건 B는 대상의 신장이 저산소 상태인 경우에 발생하고, 조건 C는 신장에서 에리트로포이에틴 생산 세포(EPC) 동원이 손상되거나; 또는 대안적으로, HIF-2 활성화가 손상되는 경우이다. 산소 수준이 증가하거나 목적하는 EPO 수준에 도달하는 경우, 전이유전자(예를 들어, EPO)는 다시 3가지 조건이 발생할 때까지 꺼지고, 다시 켜지게 된다.

패스코드 조절 스위치는 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자의 발현을 미세 조정하는 데 유용하다. 예를 들어, 패스코드 조절 스위치는, 다중 스위치, 예를 들어 특정 수준의 대사산물의 존재 하에서만 켜지는 조직 특이적 유도성 프로모터를 포함한다는 점에서 모듈식일 수 있다. 이러한 구현예에서, ceDNA 벡터로부터 전이유전자 발현이 일어나게 하기 위해서는, 유도제가 목적하는 세포 유형(조건 B)에서 존재해야 하며(조건 A), 대사산물은 특정 역치 수준이거나, 그 보다 높거나 낮다(조건 C). 대안적인 구현예에서, 패스코드 조절 스위치는, 전이유전자 발현이 조건 A와 B가 존재하는 경우에는 켜지지만, 조건 C가 존재하는 경우에는 꺼지도록 설계될 수 있다. 이러한 구현예는 조건 C가 발현된 전이유전자의 직접 결과로서 발생하는 경우에 유용하며, 즉, 조건 C는, 전이유전자가 충분한 양의 목적하는 치료 효과를 갖는 경우에, ceDNA 벡터로부터의 전이유전자 발현을 끄도록 하는 루프에 대한 양성 피드백의 역할을 한다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터에의 사용을 위해 포함된 패스코드 조절 스위치는 WO2017/059245에 개시되어 있으며, 상기 문헌에는, 하이브리드 전사인자(TF)를 사용하여 세포 생존을 위한 복잡한 환경 요건을 구축하는 합성 생물학적 회로인, "패스코드 스위치" 또는 "패스코드 회로" 또는 "패스코드 사멸 스위치"로 지칭되는 스위치가 기재되어 있다. WO2017/059245에 기재된 패스코드 조절 스위치는, 회로 활성화를 제어하는 환경 조건 및 세포 운명을 제어하는 출력 모듈의 두 가지 측면에서, 모듈식이고 맞춤형이기 때문에, ceDNA 벡터에 사용하기에 특히 유용하다. 또한, 패스코드 회로는, 적절한 "패스코드" 분자 없이 필요한 선결된 조건의 존재 하에서만 전이유전자 발현을 가능하게 하기 때문에, ceDNA 벡터에 사용되는 데 있어 특정한 유용성을 갖는다. 세포에 문제가 발생하거나 어떤 이유에서든 추가의 전이유전자 발현이 필요하지 않은 경우, 관련 사멸 스위치(즉, 데드맨(deadman) 스위치)가 촉발될 수 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터에의 사용을 위해 포함된 패스코드 조절 스위치 또는 "패스코드 회로"는, 생물학적 봉쇄 조건을 정의하는 데 사용되는 환경 신호의 범위 및 복잡성을 확장시키기 위해 하이브리드 전사인자(TF)를 포함한다. 선결된 조건의 존재 하에서 세포 사멸을 촉발시키는 데드맨 스위치와 반대로, "패스코드 회로"는 특정 "패스코드"의 존재 하에서 세포 생존 또는 전이유전자 발현을 가능하게 하며, 선결된 환경 조건 또는 패스코드가 존재하는 경우에만 전이유전자 발현 및/또는 세포 생존을 가능하게 하도록 용이하게 재프로그래밍될 수 있다.

하나의 양태에서, 세포 성장을 적어도 2개의 선택된 작용제의 선결된 세트의 존재로 제한하는 "패스코드" 시스템은, 다음을 포함하는 발현 모듈을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 구조체를 포함한다: i) 숙주세포에 독성인 독소를 인코딩하는 독소 발현 모듈로서, 여기서 독소를 인코딩하는 서열이 제1 하이브리드 억제 단백질 hRP1의 결합에 의해 억제되는 프로모터 P1에 작동 가능하게 연결되어 있는, 독소 발현 모듈; ii) 제1 하이브리드 억제 단백질 hRP1을 인코딩하는 제1 하이브리드 억제 단백질 발현 모듈로서, 여기서 hRP1의 발현이 2개의 하이브리드 전사인자 hTF1 및 hTF2로 형성된 AND 게이트에 의해 제어되고, 이의 결합 또는 활성이 각각 작용제 A1 및 A2에 대한 반응으로, 작용제 A1 및 A2가 모두 hRP1의 발현에 필요하며, A1 또는 A2의 부재 하에서, hRP1 발현은 독소 프로모터 모듈 P1 및 독소 생산을 억제하기에 불충분하여 숙주세포가 사멸되는, 제1 하이브리드 억제 단백질 발현 모듈. 이러한 시스템에서, 하이브리드 인자 hTF1, hTF2 및 hRP1은 각각 하나의 전사인자로부터의 환경 감지 모듈과, 각각의 서브유닛이 전형적으로 자연에서 결합하는 것과 상이한, 환경 작용제 A1 또는 A2의 존재에 민감한 각각의 패스코드 조절 스위치의 결합을 제공하는 상이한 전사인자로부터의 DNA 인식 모듈을 포함한다.

따라서, ceDNA 벡터는 출력 모듈을 활성화시키는 데 특정 분자의 존재 및/또는 부재를 필요로 하는 "패스코드 조절 회로"를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 독소를 인코딩하는 유전자가 출력 모듈에 배치되는 경우, 이러한 패스코드 조절 회로는 전이유전자 발현을 조절하는 데 사용될 뿐 아니라, 세포가 바람직하지 않은 방식으로 거동하는 경우(예를 들어, 센서 도메인에 의해 정의된 특정 환경을 벗어나거나, 상이한 세포 유형으로 분화됨) 회로가 세포를 사멸시키는 사멸 스위치 메커니즘을 형성하는 데 사용될 수도 있다. 하나의 비제한적인 예에서, 하이브리드 전사인자, 회로 구성 및 출력 모듈의 모듈성은, 회로가 다른 환경 신호를 감지하고, 환경 신호에 다른 방식으로 반응하고, 당업계에서 이해되는 바와 같이, 유도된 세포 사멸에 더하여 세포에서 다른 기능을 제어하는 것을 가능하게 한다.

본원에 개시된 조절 스위치의 임의의 및 모든 조합, 예를 들어 소분자 스위치, 핵산 기반 스위치, 소분자-핵산 하이브리드 스위치, 전사 후 전이유전자 조절 스위치, 번역 후 조절, 방사선 제어 스위치, 저산소증 매개 스위치, 및 본원에 개시된 바와 같은 당업자에게 공지된 다른 조절 스위치가, 본원에 개시된 바와 같은 패스코드 조절 스위치에 사용될 수 있다. 사용을 위해 포함된 조절 스위치는 또한 리뷰 논문인 문헌[Kis et al., J R Soc Interface. 12: 20141000 (2015)]에 논의되어 있고, Kis의 표 1에 요약되어 있다. 일부 구현예에서, 패스코드 시스템에 사용하기 위한 조절 스위치는 표 5의 스위치 중 임의의 것 또는 스위치의 조합에서 선택될 수 있다.

D. 전이유전자 발현을 제어하는 핵산 기반 조절 스위치

일부 구현예에서, ceDNA에 의해 발현된 전이유전자를 제어하는 조절 스위치는 핵산 기반 제어 메커니즘을 기반으로 한다. 예시적인 핵산 제어 메커니즘은 당업계에 공지되어 있으며, 사용을 위해 고려된다. 예를 들어, 이러한 메커니즘은, 예를 들어 US2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, 미국 특허 제9,222,093호 및 EP 출원 EP288071에 개시된 것들, 및 문헌[Villa JK et al., Microbiol Spectr. 2018 May;6(3)]에 개시된 것과 같은 리보스위치를 포함한다. WO2018/075486 및 WO2017/147585에 개시된 것들과 같은 대사산물 반응성 전사 바이오센서가 또한 포함된다. 사용을 위해 고려되는 다른 업계 공지 메커니즘에는, siRNA 또는 RNAi 분자(예를 들어, miR, shRNA)를 이용한 전이유전자의 침묵(silencing)이 포함된다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터에 의해 발현된 전이유전자에 상보적인 RNAi 분자를 인코딩하는 조절 스위치를 포함할 수 있다. 전이유전자가 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 경우라도 이러한 RNAi가 발현되면, 상보적 RNAi 분자에 의해 침묵하게 되고, 전이유전자가 ceDNA 벡터에 의해 발현될 때 RNAi가 발현되지 않으면, 전이유전자는 RNAi에 의해 침묵하게 되지 않는다. 유전자 발현을 제어하거나 조절 스위치로서의 RNAi 분자의 이러한 예는, US2017/0183664에 개시되어 있다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자의 발현을 차단하는 억제제를 포함한다. 일부 구현예에서, 온/오프(on/off) 스위치는, 예를 들어 문헌[Chappell J. et al., Nat Chem Biol. 2015 Mar;11(3):214-20]; 및 문헌[Chappell et al., Microbiol Spectr. 2018 May;6(3)]에 개시된 것들과 같은 소형 전사 활성화 RNA(STAR) 기반 스위치이다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는 US2009/0191546, US2016/0076083, WO2017/087530, US2017/0204477, WO2017/075486 및 문헌[Green et al, Cell, 2014; 159(4); 925-939]에 개시된 것들과 같은 발판 스위치(toehold switch)이다.

일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 US2002/0022018에 개시된 바와 같은 조직 특이적 자가 불활성화 조절 스위치이며, 이에 의해 조절 스위치는 전이유전자 발현이 달리 불리할 수 있는 부위에서 전이유전자 발현을 의도적으로 차단한다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 US2014/0127162 및 미국 특허 제8,324,436호에 개시된 바와 같은 재조합효소 가역적 유전자 발현 시스템이다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현된 전이유전자 또는 관심 유전자를 제어하는 조절 스위치는, 핵산 기반 제어 메커니즘과 소분자 조절 시스템의 하이브리드이다. 이러한 시스템은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 본원에의 사용을 위해 고려된다. 이러한 조절 스위치의 예에는, 비제한적으로, LTRi 시스템 또는 "Lac-Tet-RNAi" 시스템, 예를 들어 US2010/0175141, 문헌[Deans T. et al., Cell., 2007, 130(2); 363-372], WO2008/051854 및 미국 특허 제9,388,425호에 개시된 것들이 포함된다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현된 전이유전자 또는 관심 유전자를 제어하는 조절 스위치는, 미국 특허 제8,338,138호에 개시된 바와 같은 순환 순열(circular permutation)을 포함한다. 이러한 구현예에서, 분자 스위치는 다중 안정성, 즉, 적어도 2개의 상태 사이에서 전환 가능하거나, 또는 대안적으로, 이중 안정성, 즉, 상태는 "ON" 또는 "OFF", 예를 들어 발광할 수 있거나 없거나, 결합할 수 있거나 없거나, 촉진시킬 수 있거나 없거나, 전자를 전달할 수 있거나 없거나 등이다. 또 다른 양태에서, 분자 스위치는 융합 분자를 사용하기 때문에, 2개 초과의 상태 사이에서 전환 가능하다. 예를 들어, 삽입 서열 또는 수용 서열에 의해 나타나는 특정 역치 상태에 대한 반응으로, 융합체의 각각의 다른 서열은 상태의 범위(예를 들어, 결합 활성의 범위, 효소 촉매작용의 범위 등)를 나타낼 수 있다. 따라서, "ON" 또는 "OFF"로의 전환 대신, 융합 분자는 자극에 대한 등급화된 반응을 나타낼 수 있다.

일부 구현예에서, 핵산 기반 조절 스위치는 표 5의 스위치 중 임의의 것 또는 스위치의 조합에서 선택될 수 있다.

E. 전사 후 및 번역 후 조절 스위치.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현된 전이유전자 또는 관심 유전자를 제어하는 조절 스위치는, 전사 후 변형 시스템이다. 예를 들어, 이러한 조절 스위치는 US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, EP 특허 제2707487호 및 문헌[Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp 526―534]; 문헌[Zhong et al., Elife. 2016 Nov 2;5. pii: e18858]에 개시된 바와 같은, 테트라시클린 또는 테로필린에 민감한 압타자임(aptazyme) 리보스위치일 수 있다. 일부 구현예에서, 당업자는 리간드 민감성(OFF-스위치) 압타머를 함유하는 저해성 siRNA와 전이유전자를 모두 인코딩할 수 있으며, 최종 결과는 리간드 민감성 ON-스위치가 되는 것으로 예상된다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현된 전이유전자 또는 관심 유전자를 제어하는 조절 스위치는, 번역 후 변형 시스템이다. 대안적인 구현예에서, 관심 유전자 또는 단백질은 프로단백질(pro-protein) 또는 프리프로단백질(pre-proprotein)로 발현되거나, 신호 반응 요소(SRE) 또는 발현된 단백질에 부착된 불안정화 도메인(DD)을 갖기 때문에, 번역 후 변형이 일어날 때까지 정확한 단백질 폴딩 및/또는 활성을 방지한다. 불안정화 도메인(DD) 또는 SRE의 경우, 불안정화 도메인은 외인성 작용제 또는 소분자의 존재 하에서 변역 후 절단된다. 당업자는, 미국 특허 제8,173,792호 및 PCT 출원 WO2017180587에 개시된 바와 같은 이러한 제어 방법을 이용할 수 있다. 기능성 전이유전자 활성을 제어하기 위해 ceDNA 벡터에서의 사용에 고려되는 다른 전사 후 제어 스위치는, 문헌[Rakhit et al., Chem Biol. 2014;21(9):1238-52] 및 문헌[Navarro et al., ACS Chem Biol. 2016; 19; 11(8): 2101―2104A]에 개시되어 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현된 전이유전자 또는 관심 유전자를 제어하는 조절 스위치는, 리간드 민감성 인테인을 전이유전자 코딩 서열에 혼입하여, 전이유전자 또는 발현된 단백질이 스플라이싱 전에 저해되도록 하는 번역 후 변형 시스템이다. 예를 들어, 이는 4-히드록시타목시펜 및 갑상선 호르몬 두 가지를 사용하여 입증되었다(예를 들어, 미국 특허 제7,541,450호, 제9,200,045호, 제7,192,739호, 문헌[Buskirk, et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jul 20; 101(29): 10505―10510]; 문헌[ACS Synth Biol. 2016 Dec 16; 5(12): 1475―1484]; 및 [ACS Synth Biol. 2005 Feb; 14(2): 523―532] 참조). 일부 구현예에서, 전사 후 기반 조절 스위치는 표 5의 스위치 중 임의의 것 또는 스위치의 조합에서 선택될 수 있다.

F. 다른 예시적인 조절 스위치

환경 변화에 의해 촉발되는 것들을 포함하는 임의의 공지된 조절 스위치가, ceDNA 벡터에 의해 발현된 전이유전자의 유전자 발현을 제어하기 위해 ceDNA 벡터에 사용될 수 있다. 추가의 예에는, 비제한적으로, 문헌[Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018)]의 BOC 방법; 유전 코드 확장 및 비(非)생리학적 아미노산; 방사선 제어 또는 초음파 제어 온/오프 스위치(예를 들어, 문헌[Scott S et al., Gene Ther. 2000 Jul;7(13):1121-5]; 미국 특허 제5,612,318호; 제5,571,797호; 제5,770,581호; 제5,817,636호; 및 WO1999/025385A1 참조)가 포함된다. 일부 구현예에서, 조절 스위치는, 예를 들어 미국 특허 제7,840,263호; US2007/0190028A1에 개시된 바와 같은 이식 가능한 시스템에 의해 제어되며, 여기서 유전자 발현은 ceDNA 벡터 내 전이유전자에 작동적으로 연결된 프로모터를 활성화시키는 전자기 에너지를 포함하는 하나 이상의 에너지 형태에 의해 제어된다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터에의 사용을 위해 고려되는 조절 스위치는, 저산소증 매개 또는 스트레스 활성화 스위치, 예를 들어 WO1999060142A2, 미국 특허 제5,834,306호; 제6,218,179호; 제6,709,858호; US2015/0322410; 문헌[Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368]에 개시된 바와 같은 것들뿐 아니라, 예를 들어 미국 특허 제9,394,526호에 개시된 바와 같은, FROG, TOAD 및 NRSE 요소, 및 조건부 유도성 침묵 요소(저산소증 반응 요소(HRE), 염증 반응 요소(IRE) 및 전단 응력 활성화 요소(SSAE) 포함)이다. 이러한 구현예는, 허혈 후, 허혈 조직 및/또는 종양에서 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자의 발현을 조정하는 데 유용하다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터에의 사용을 위해 고려되는 조절 스위치는, 문헌[Polesskaya et al., BMC Neurosci. 2018; 19(Suppl 1): 12]에 검토된 스위치 중 하나와 같은 광유전학적(예를 들어, 광 제어) 조절 스위치이며, 이는 본원에의 사용을 위해 고려된다. 이러한 구현예에서, ceDNA 벡터는 유전 요소를 포함하고, 광 민감성이며, 가시 파장(예를 들어, 청색, 근적외선)에 대한 반응으로 전이유전자 발현을 조절할 수 있다. 광유전학적 조절 스위치를 포함하는ceDNA 벡터는 이러한 광원을 받을 수 있는 신체의 위치, 예를 들어 피부, 눈, 근육 등에서 전이유전자를 발현할 때 유용하며, 또한 광 신호가 적합한 수단(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 이식 가능한 장치)에 의해 제공될 수 있는 내부 기관 및 조직에서 ceDNA 벡터가 전이유전자를 발현할 때 사용될 수 있다. 이러한 광유전학 조절 스위치는, 광 반응성 요소 또는 광 유도성 전사 이펙터(LITE)(예를 들어, 2014/0287938에 개시되어 있음), 인슐린 전이유전자의 발현의 생체내 제어를 가능하게 하는 것으로 보고된 Light-On 시스템(예를 들어, 문헌[Wang et al., Nat Methods. 2012 Feb 12;9(3):266-9]에 개시되어 있음), Cry2/CIB1 시스템(예를 들어, 문헌[Kennedy et al., Nature Methods; 7, 973―975 (2010)]에 개시되어 있음); 및 FKF1/GIGANTEA 시스템(예를 들어, 문헌[Yazawa et al., Nat Biotechnol. 2009 Oct;27(10):941-5]에 개시되어 있음)의 사용을 포함한다.

G. 사멸 스위치

본 발명의 하나의 구현예는 사멸 스위치를 포함하는 ceDNA 벡터에 관한 것이다. 본원에 개시된 바와 같은 사멸 스위치는, 대상의 시스템으로부터 도입된 ceDNA 벡터를 영구적으로 제거하는 수단으로서, ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 사멸시키거나 프로그래밍된 세포 사멸에 거치게 할 수 있다. 당업자는, 본 발명의 ceDNA 벡터에서의 사멸 스위치의 사용이, 전형적으로 대상이 수용 가능하게 손실할 수 있는 제한된 수의 세포, 또는 세포자멸사가 바람직한 세포 유형(예를 들어, 암 세포)에 대한 ceDNA 벡터의 표적화와 결합될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 모든 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 "사멸 스위치"는, 입력 생존 신호 또는 다른 명시된 조건의 부재 하에서 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 신속하고 강력한 세포 사멸을 제공하도록 설계된다. 달리 말하면, 본원에서 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 사멸 스위치는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 세포 생존을 특정한 입력 신호에 의해 정의된 환경으로 제한할 수 있다. 이러한 사멸 스위치는, 대상에서 ceDNA 벡터를 제거하거나, 인코딩된 전이유전자를 발현하지 않는 것을 보장하는 것이 바람직한 경우에 생물학적 봉쇄 기능으로 작용한다. 따라서, 사멸 스위치는 환경 신호를 ceDNA 벡터를 포함하는 세포의 조건부 생존과 결합하는 ceDNA 벡터의 합성 생물학적 회로이다. 일부 구현예에서, 상이한 ceDNA 벡터는 상이한 사멸 스위치를 갖도록 설계될 수 있다. 이는, ceDNA 벡터의 칵테일이 사용되는 경우, 전이유전자 발현 세포가 사멸되는 것을 제어할 수 있게 한다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 모듈식 생물학적 봉쇄 회로인 사멸 스위치를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터에의 사용을 위해 포함된 사멸 스위치는 WO2017/059245에 개시되어 있으며, 상기 문헌에는 적어도 2개의 억제성 서열의 상호 저해 배열을 포함하여, 환경 신호가 구조체 내 제2 분자의 활성을 억제하게 하는(예를 들어, 소분자-결합 전사인자는 독소 생성의 억제로 인해 '생존' 상태를 생성하는 데 사용됨) "데드맨 사멸 스위치"로 지칭되는 스위치가 기재되어 있다. 데드맨 사멸 스위치를 포함하는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포에서, 환경 신호의 손실 시, 회로는 영구적으로 '사멸' 상태로 전환되며, 여기서 독소가 탈억제되어, 세포를 사멸시키는 독소가 생성된다. 또 다른 구현예에서, 세포 생존을 위한 복잡한 환경 요건을 구성하는 하이브리드 전사인자(TF)를 사용하는 "패스코드 회로" 또는 "패스코드 사멸 스위치"로 지칭되는 합성 생물학적 회로가 제공된다. WO2017/059245에 기재된 데드맨 및 패스코드 사멸 스위치는, 회로 활성화를 제어하는 환경 조건 및 세포 운명을 제어하는 출력 모듈의 두 가지 측면에서, 모듈식이고 맞춤형이기 때문에, ceDNA 벡터에 사용하기에 특히 유용하다. 비제한적으로, 엔도뉴클레아제, 예를 들어 EcoRI를 포함하는 독소의 적절한 선택으로, ceDNA 벡터에 존재하는 패스코드 회로는 ceDNA 벡터를 포함하는 숙주세포를 사멸시킬 뿐 아니라, 이의 게놈 및 수반되는 플라스미드를 분해하는 데 사용될 수 있다.

당업자에게 공지된 다른 사멸 스위치, 예를 들어 US2010/0175141; US2013/0009799; US2011/0172826; US2013/0109568에 개시된 것뿐 아니라, 문헌[Jusiak et al, Reviews in Cell Biology and molecular Medicine; 2014; 1-56]; 문헌[Kobayashi et al., PNAS, 2004; 101; 8419-9]; 문헌[Marchisio et al., Int. Journal of Biochem and Cell Biol., 2011; 43; 310-319]; 및 문헌[Reinshagen et al., Science Translational Medicine, 2018, 11]에 개시된 사멸 스위치가, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에의 사용을 위해 포함된다.

따라서, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 이펙터 독소 또는 리포터 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 사멸 스위치 핵산 구조체를 포함할 수 있으며, 여기서 이펙터 독소(예를 들어, 사멸 단백질) 또는 리포터 단백질의 발현은 선결된 조건에 의해 제어된다. 예를 들어, 선결된 조건은 환경 작용제, 예를 들어 외인성 작용제의 존재일 수 있으며, 그렇지 않으면 세포는 이펙터 독소(예를 들어, 사멸 단백질)의 발현이 기본 설정이 되어 사멸되게 된다. 대안적인 구현예에서, 선결된 조건은 2개 이상의 환경 작용제의 존재이며, 예를 들어 세포는 2개 이상의 필요한 외인성 작용제가 공급되는 경우에만 생존할 것이고, 둘 중 어느 하나가 없는 경우에, 세포는 사멸된다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 전이유전자(예를 들어, 치료용 유전자, 단백질 또는 펩타이드 등)의 생체내 발현을 효과적으로 종결시키는 ceDNA 벡터를 포함하는 세포를 파괴하기 위해 사멸 스위치를 혼입하도록 변형된다. 구체적으로, ceDNA 벡터는 정상적인 생리학적 조건 하의 포유류 세포에서 기능성이 아닌 스위치-단백질을 발현하도록 추가로 유전자 조작된다. 이러한 스위치-단백질을 특이적으로 표적화하는 환경 조건 또는 약물의 투여 시에만, 스위치-단백질을 발현하는 세포가 파괴되어 치료용 단백질 또는 펩타이드의 발현이 종결될 것이다. 예를 들어, HSV-티미딘 키나아제를 발현하는 세포는 간시클로버(ganciclovir) 및 시토신 데아미나아제와 같은 약물의 투여 시 사멸될 수 있다고 보고되었다. 예를 들어 문헌[Dey and Evans, Suicide Gene Therapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase (HSV-TK), in Targets in Gene Therapy, edited by You (2011)]; 및 문헌[Beltinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(15):8699-8704 (1999)] 참조. 일부 구현예에서 ceDNA 벡터는 DISE(생존 유전자 제거로 인해 유도된 사멸(Death Induced by Survival gene Elimination))로 지칭되는 siRNA 사멸 스위치를 포함할 수 있다(문헌[Murmann et al., Oncotarget. 2017; 8:84643-84658, Induction of DISE in ovarian cancer cells in vivo]).

일부 양태에서, 데드맨 사멸 스위치는 세포 성장 환경에서 작용제, 예를 들어 외인성 작용제의 결여와 같은 선결된 조건에 민감한 세포 반응을 제공하는 생물학적 회로 또는 시스템이다. 이러한 회로 또는 시스템은 선결된 조건에 민감한 데드맨 조절 회로를 형성하는 발현 모듈을 포함하는 핵산 구조체를 포함할 수 있으며, 상기 구조체는 조절 회로를 형성하는 발현 모듈을 포함하고, 하기를 포함한다:

i) 제1 억제 단백질 발현 모듈로서, 여기서 제1 억제 단백질은 제1 억제 단백질 핵산 결합 요소에 결합하고 제1 억제 단백질 결합 요소를 포함하는 코딩 서열로부터의 전사를 억제하며, 여기서 제1 억제 단백질의 억제 활성은 제1 외인성 작용제의 저해에 민감하고, 제1 외인성 작용제의 존재 또는 부재는 선결된 조건을 확립하는, 제1 억제 단백질 발현 모듈;

ii) 제2 억제 단백질 발현 모듈로서, 여기서 제2 억제 단백질은 제2 억제 단백질 핵산 결합 요소에 결합하고 제2 억제 단백질 결합 요소를 포함하는 코딩 서열로부터의 전사를 억제하며, 여기서 제2 억제 단백질은 제1 억제 단백질과 상이한, 제2 억제 단백질 발현 모듈; 및

iii) 제2 억제 단백질에 대한 결합 요소를 포함하는 유전 요소에 작동 가능하게 연결된 이펙터 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하여, 제2 억제 단백질의 발현이 이펙터 발현 모듈로부터의 이펙터 발현을 억제하도록 하는 이펙터 발현 모듈로서, 여기서 제2 발현 모듈은 요소가 제1 억제 단백질에 의해 결합되는 경우 제2 억제 단백질의 전사 억제를 가능하게 하는 제1 억제 단백질 핵산 결합 요소를 포함하고, 각각의 모듈은 조절 회로를 형성하여, 제1 외인성 작용제의 부재 하에서는, 제1 억제 단백질이 제1 억제 단백질 발현 모듈에서 생성되고 제2 억제 단백질 발현 모듈로부터의 전사를 억제하여, 제2 억제 단백질에 의한 이펙터 발현의 억제가 완화되어 이펙터 단백질의 발현이 유도되지만, 제1 외인성 작용제의 존재 하에서는, 제1 억제 단백질의 활성이 저해되어, 제2 억제 단백질의 발현이 가능해지고, 이는 이펙터 단백질 발현의 발현을 "오프" 상태로 유지시켜, 회로에서 이펙터 단백질 발현을 "오프" 상태로 유지시키기 위해 제1 외인성 작용제를 필요로 하며, 제1 외인성 작용제의 제거 또는 부재는 이펙터 단백질의 발현을 기본 설정으로 만드는, 이펙터 발현 모듈.

일부 구현예에서, 이펙터는 세포 사멸 프로그램을 유도하는 독소 또는 단백질이다. 숙주세포에 독성인 임의의 단백질이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 독소는 독소가 발현되는 세포만을 사멸시킨다. 다른 구현예에서, 독소는 동일한 숙주 유기체의 다른 세포를 사멸시킨다. 세포 사멸로 이어지는 수많은 산물 중 임의의 것이 데드맨 사멸 스위치에 이용될 수 있다. DNA 복제, 단백질 번역 또는 다른 과정을 저해하거나, 예를 들어 숙주세포의 핵산을 분해하는 작용제가 특히 유용하다. 회로 활성화 시 숙주세포를 사멸시키는 효율적인 메커니즘을 확인하기 위해, 숙주세포의 DNA 또는 RNA를 직접 손상시키는 몇 가지 독소 유전자를 시험하였다. 엔도뉴클레아제 ecoRI ²¹, DNA 자이라아제 저해제 ccdB ²² 및 리보뉴클레아제 유형 독소 mazF ²³가 잘 특징분석되어 있고, 대장균에 고유하며, 다양한 사멸 메커니즘을 제공하기 때문에, 이들을 시험하였다. 회로의 견고성을 증가시키고, 회로 의존적 세포 사멸의 독립적 방법을 제공하기 위해, 시스템은, 예를 들어 사멸 유전자를 "오프" 상태로 유지하는 억제제를 추가로 방해하는 표적화된 프로테아제 또는 뉴클레아제를 발현하도록 추가로 조정될 수 있다. 생존 신호의 손실 또는 회수 시, 사멸 유전자 억제는, 예를 들어 억제 단백질 또는 이의 메시지의 활성 분해에 의해 훨씬 더 효율적으로 제거된다. 비제한적인 예로서, mf-Lon 프로테아제를 사용하여, LacI를 분해할 뿐 아니라, 분해를 위한 필수 단백질을 표적화하였다. 단백질 산물이 특히 mf-Lon 분해²⁰에 민감한 5개의 필수 유전자의 3' 말단에 mf-Lon 분해 태그 pdt#1을 부착시키고, ATc의 제거 후 세포 생존력을 측정하였다. 시험된 필수 유전자 표적 중에서, 펩티도글리칸 생합성 유전자 murC가 가장 강력하고 가장 빠른 세포 사멸 표현형을 제공하였다(6시간 내 생존율 < 1 x 10^-4).

본원에 사용된 "선결된 입력"라는 용어는, 공지된 방식으로 전사인자 폴리펩타이드의 활성에 영향을 미치는 작용제 또는 조건을 나타낸다. 일반적으로, 이러한 작용제는 전사인자 폴리펩타이드에 결합하고/하거나 이의 형태를 변화시켜, 전사인자 폴리펩타이드의 활성을 변경시킬 수 있다. 선결된 입력의 예에는, 비제한적으로, 주어진 숙주 유기체의 생존에 필요하지 않은(즉, 본원에 기재된 바와 같은 합성 생물학적 회로의 부재 하에서) 환경적 입력물질이 포함된다. 선결된 입력을 제공할 수 있는 조건에는, 예를 들어 하나 이상의 인자의 활성이 온도 민감성인 경우, 주어진 파장 스펙트럼의 빛을 포함하는 빛의 존재 또는 부재, 및 가스, 염, 금속 또는 무기물질의 농도가 포함된다. 환경적 입력물질에는, 예를 들어 소분자, 페로몬, 호르몬, 성장인자, 대사산물, 영양소 등과 같은 생물학적 작용제, 및 이들의 유사체; 화학물질, 환경 부산물, 금속 이온 및 다른 이러한 분자 또는 작용제의 농도; 조도; 온도; 기계적 스트레스 또는 압력; 또는 전류 및 전압과 같은 전기 신호가 포함된다.

일부 구현예에서, 리포터는 본 발명의 모듈 또는 프로그래밍 가능한 합성 생물학적 회로에 의해 수신된 신호의 강도 또는 활성을 정량화하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 리포터는 단백질이 세포 또는 유기체에서 어디에 위치하는 지를 확인하기 위해 다른 단백질 코딩 서열에 인프레임(in-frame) 융합될 수 있다. 세포는 루시퍼라아제의 부재 하에서 배경 발광이 없거나 거의 없는 경향이 있기 때문에, 루시퍼라아제는 본원에 기재된 다양한 구현예를 위한, 예를 들어 낮은 수준의 유전자 발현을 측정하기 위한 이펙터 단백질로서 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 착색된 기질을 생성하는 효소는 분광광도계, 또는 흡광도 측정을 수행할 수 있는 다른 기기(플레이트 판독기 포함)를 사용하여 정량화될 수 있다. 루시퍼라아제와 마찬가지로, β-갈락토시다아제와 같은 효소는 낮은 신호를 증폭시키는 경향이 있기 때문에, 낮은 수준의 유전자 발현을 측정하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터 단백질은 주어진 독소를 분해하거나 달리 파괴할 수 있는 효소일 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터 단백질은 기질을 취기성(odorant) 산물로 전환시키는 취기성 효소일 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터 단백질은 소분자 또는 다른 단백질을 인산화 또는 탈인산화하는 효소, 또는 다른 단백질 또는 DNA를 메틸화 또는 탈메틸화하는 효소일 수 있다.

일부 구현예에서, 이펙터 단백질은 수용체, 리간드 또는 용해성 단백질일 수 있다. 수용체는 단백질, 펩타이드 또는 소분자와 같은 결합 리간드에 대한 세포외 도메인, 막관통 도메인, 및 인산화와 같은 일종의 신호 전달 사건에 흔히 참여할 수 있는 세포내 또는 세포질 도메인의 3개의 도메인을 갖는 경향이 있다. 일부 구현예에서, 수송체, 채널 또는 펌프 유전자 서열이 이펙터 단백질로서 사용된다. 본원에 기재된 바와 같은 사멸 스위치와 함께 사용하기 위한 이펙터 단백질의 비제한적인 예 및 서열은, 웹사이트 parts.igem.org의 Registry of Standard Biological Parts에서 확인할 수 있다.

본원에 사용된 "조절 단백질"은, 표적 핵산 서열로부터의 발현을 조절하는 단백질이다. 조절 단백질에는, 예를 들어 특히 전사 활성화제 및 억제제를 포함하는 전사인자, 및 전사인자에 결합하거나 이를 변형시켜 이의 활성에 영향을 미치는 단백질이 포함된다. 일부 구현예에서, 조절 단백질에는, 예를 들어 표적 핵산 서열로부터의 발현의 조절에 관여하는 단백질 인자를 분해하는 프로테아제가 포함된다. 바람직한 조절 단백질에는, 예를 들어 DNA-결합 및 입력물질-결합 또는 반응성 요소 또는 도메인이 분리 가능하고 전달 가능하기 때문에, 예를 들어 제1 조절 단백질의 DNA 결합 도메인이 제2 입력물질 반응성 도메인에 융합하면, 제1 단백질에 의해 인식된 DNA 서열에 결합하지만, 제2 단백질에 통상적으로 반응하는 입력물질에 민감한 새로운 단백질을 생성하는, 모듈식 단백질이 포함된다. 따라서, 본원에 사용된 "조절 폴리펩타이드" 및 보다 구체적으로 "억제 폴리펩타이드"라는 용어는, 명시된 폴리펩타이드, 예를 들어 "LacI(억제) 폴리펩타이드"에 더하여, 상이하거나 변형된 입력물질에 반응하는 이러한 폴리펩타이드의 변이체 또는 유도체를 포함한다. 따라서, LacI 폴리펩타이드의 경우, 락토오스 또는 IPTG 이외의 작용제에 결합하는 LacI 돌연변이체 또는 변이체가 포함된다. 광범위한 이러한 작용제가 당업계에 공지되어 있다.

표 5. 예시적인 조절 스위치. ^b이펙터에 의한 ON 전환 가능성; OFF 상태를 부여하는 이펙터를 제거하는 것이 아님. ^c이펙터에 의한 OFF 전환 가능성; ON 상태를 부여하는 이펙터를 제거하는 것이 아님. ^d스위치를 ON 또는 OFF 상태에서 안정화시키는 리간드 또는 다른 물리적 자극(예를 들어, 온도, 전자기 방사선, 전기). ^e문헌[Kis et al., J R Soc Interface. 12:20141000 (2015)]에 인용된 참고문헌 번호를 나타냄(상기 문헌 및 그 안에 인용된 참고문헌은 모두 본원에 참조로서 인용됨).

VI. ceDNA 벡터의 생산

A. 생산 전반

ceDNA 벡터의 생산은 2018년 9월 7일자 출원된 PCT/US18/49996의 섹션 IV에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참조로서 인용된다. 본원에 기재된 바와 같이, ceDNA 벡터는 하기 단계를 포함하는 공정에 따라 수득될 수 있다: a) 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큐로바이러스)을 보유하는 숙주세포(예를 들어, 곤충 세포) 집단을, Rep 단백질의 존재 하에서, 숙주세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 숙주세포는 바이러스 캡시드 코딩 서열을 포함하지 않는 단계; 및 b) 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리하는 단계. Rep 단백질의 존재는 변형된 ITR을 갖는 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제를 유도하여, 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 생산한다. 하지만, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 비리온)는 발현되지 않는다. 따라서, AAV 또는 다른 바이러스 기반 벡터에 자연적으로 부과되는 것과 같은 크기 제한이 없다.

숙주세포에서 단리된 ceDNA 벡터의 존재는, 숙주세포에서 단리된 DNA를 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 소화된 DNA 물질을 미변성 겔 상에서 분석하여, 선형 및 비연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하는 방식으로 확인될 수 있다.

일부 구현예에 따르면, 본 발명은, 예를 들어 문헌[Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879]에 기재된 바와 같이, 비바이러스성 DNA 벡터의 생산에서 DNA 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 주형(ceDNA 주형)을 이의 자체 게놈에 안정적으로 통합시킨 숙주 세포주의 용도를 제공한다. 바람직하게는, Rep는 약 3의 MOI에서 숙주 세포에 첨가된다. 숙주 세포주가 포유류 세포주, 예를 들어 HEK293 세포인 경우, 상기 세포주는 안정적으로 통합된 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형을 가질 수 있고, 헤르페스바이러스와 같은 제2 벡터를 사용하여 Rep 단백질을 세포에 도입하여, Rep 및 헬퍼 바이러스의 존재 하에서 ceDNA의 절제 및 증폭을 가능하게 할 수 있다.

하나의 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 제조하는 데 사용되는 숙주세포는 곤충 세포이고, 바큐로바이러스는 Rep 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 예를 들어 도 4a 내지 도 4c 및 실시예 1에 기재된 바와 같은 ceDNA에 대한 비바이러스성 DNA 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형을 전달하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 숙주세포는 Rep 단백질을 발현하도록 조작된다.

이어서, 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리한다. 상기 세포에서 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 수거하고 수집하는 시간은, ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하기 위해 선택 및 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존력, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포를 충분한 조건 하에서 성장시키고, ceDNA 벡터를 생산하기 위한 바큐로바이러스 감염 후, 하지만 바큐로바이러스 독성으로 인해 세포의 대부분이 사멸되기 시작하기 전에 충분한 시간 동안 수거한다. DNA 벡터는 Qiagen Endo-Free Plasmid 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법이 또한 DNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.

DNA 벡터는 DNA의 정제에 대해 당업자에게 공지된 임의의 수단을 통해 정제될 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 마이크로입자로 정제된다.

ceDNA 벡터의 존재는, 세포에서 단리된 벡터 DNA를 DNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화시키고, 소화 및 미소화된 DNA 물질을 겔 전기영동을 사용하여 분석하여, 선형 및 비연속 DNA와 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드의 존재를 확인하는 방식으로 확인될 수 있다. 도 4c와 도 4d는, 본원의 공정에 의해 생산된 폐쇄형 ceDNA 벡터의 존재를 확인하는 하나의 구현예를 예시한다.

B. ceDNA 플라스미드

ceDNA-플라스미드는 ceDNA 벡터의 이후의 생산에 사용되는 플라스미드이다. 일부 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 적어도 다음과 같은 요소를 전사 방향으로 작동적으로 연결된 구성요소로서 제공하기 위해 공지된 기술을 사용하여 구축될 수 있다: (1) 본원에 기재된 바와 같은 5' ITR 서열(예를 들어, 야생형 또는 변형된 5' ITR 서열); (2) 시스-조절 요소를 함유하는 발현 카세트, 예를 들어 프로모터, 유도성 프로모터, 조절 스위치, 인핸서 등; 및 (3) 본원에 기재된 바와 같은 3' ITR 서열(예를 들어, 변형된 3' ITR 서열의 야생형)(여기서, 3' ITR 서열은 5' ITR 서열에 대칭임). 일부 구현예에서, ITR이 플랭킹된 발현 카세트는 외인성 서열을 도입하기 위한 클로닝 부위를 포함한다. 발현 카세트는 AAV 게놈의 rep 및 cap 코딩 영역을 대체한다.

하나의 양태에서, ceDNA 벡터는 제1 아데노관련바이러스(AAV) 역말단반복(ITR), 적어도 전이유전자와 조절 스위치를 포함하는 발현 카세트, 및 돌연변이되거나 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 "ceDNA-플라스미드"로 본원에 지칭되는 플라스미드로부터 수득되며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') 변형되거나 돌연변이된 AAV ITR, 적어도 전이유전자와 조절 스위치를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' 및 3' ITR은 서로 대칭이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') 변형되거나 돌연변이된 AAV ITR, 적어도 전이유전자와 조절 스위치를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') 돌연변이되거나 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' 및 3' 변형된 ITR은 동일한 변형을 갖는다(즉, 이들은 서로에 대해 역 보체 또는 대칭임). 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') WT AAV ITR, 적어도 전이유전자와 조절 스위치를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') WT AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' 및 3' ITR은 서로 대칭이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') WT AAV ITR, 적어도 전이유전자와 조절 스위치를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') WT AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' 및 3' ITR은 서로 실질적으로 대칭이다.

추가의 구현예에서, ceDNA-플라스미드 시스템에는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다(즉, AAV 캡시드 유전자뿐 아니라 다른 바이러스의 캡시드 유전자가 없음). 또한, 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드에는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 없다. 따라서, 바람직한 구현예에서, ceDNA-플라스미드에는 AAV2에 대한 기능성 AAV cap 및 AAV rep 유전자 GG-3′, 및 헤어핀 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열이 없다.

본 발명의 ceDNA-플라스미드는 당업계에 널리 공지된 임의의 AAV 혈청형의 게놈의 천연 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 생성될 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈에서 유도된다. 예를 들어, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; Kotin and Smith, The Springer Index of Viruses(Springer가 유지 관리하는 URL에서 이용 가능함)(www 웹 주소: oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.)(참고: URL 또는 데이터베이스에 대한 참조는 현재 본 출원의 유효 출원일자의 URL 또는 데이터베이스의 내용을 나타냄). 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV2 게놈에서 유도된다. 또 다른 특정 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 이러한 AAV 게놈 중 하나에서 유도된 5' 및 3' ITR을 포함하도록 유전자 조작된 합성 백본이다.

ceDNA-플라스미드는 선택적으로 ceDNA 벡터 생산 세포주의 확립에 사용하기 위한 선별 가능한 또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 선별 마커는 3' ITR 서열의 다운스트림(즉, 3')에 삽입될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 선별 마커는 5' ITR 서열의 업스트림(즉, 5')에 삽입될 수 있다. 적절한 선별 마커에는, 예를 들어 약물 내성을 부여하는 것들이 포함된다. 선별 마커, 예를 들어 블라스티시딘(blasticidin) S 내성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 제네티신(geneticin) 등일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 약물 선별 마커는 블라스티시딘 S 내성 유전자이다.

예시적인 ceDNA(예를 들어, rAAV0)는 rAAV 플라스미드에서 생성된다. rAAV 벡터의 생산 방법은 (a) 상기 기재된 바와 같은 rAAV 플라스미드를 갖는 숙주세포를 제공하는 단계로서, 여기서 숙주세포와 플라스미드에는 모두 캡시드 단백질 인코딩 유전자가 없는 단계, (b) ceDNA 게놈의 생성을 가능하게 하는 조건 하에서 숙주세포를 배양하는 단계, 및 (c) 세포를 수거하고 상기 세포에서 생산된 AAV 게놈을 단리하는 단계를 포함할 수 있다.

C. ceDNA 플라스미드로부터 ceDNA 벡터를 제조하는 예시적인 방법

캡시드 미함유 ceDNA 벡터를 제조하는 방법, 특히 생체내 실험에 충분한 벡터를 충분히 고수율로 제공하는 방법이 또한 본원에 제공된다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 생산 방법은 (1) 발현 카세트와 2개의 대칭 ITR 서열을 포함하는 핵산 구조체를 숙주세포(예를 들어, Sf9 세포)에 도입하는 단계, (2) 선택적으로, 예를 들어 플라스미드 상에 존재하는 선별 마커를 사용하여 클론 세포주를 확립하는 단계, (3)Rep 코딩 유전자를 (상기 유전자를 운반하는 바큐로바이러스로 트랜스펙션 또는 감염시켜) 상기 곤충 세포에 도입하는 단계, 및 (4) 세포를 수거하고 ceDNA 벡터를 정제하는 단계를 포함한다. 캡시드 미함유 AAV 벡터의 생산을 위한, 상기 기재된 발현 카세트와 2개의 ITR 서열을 포함하는 핵산 구조체는, cfAAV-플라스미드, 또는 하기 기재된 바와 같은 cfAAV-플라스미드를 이용하여 생성된 박미드 또는 바큐로바이러스의 형태일 수 있다. 핵산 구조체는 트랜스펙션, 바이러스 형질도입, 안정적인 통합 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 숙주세포에 도입될 수 있다.

D. 세포주

ceDNA 벡터의 생산에 사용되는 숙주 세포주는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(예컨대, Sf9, Sf21) 또는 트리코풀시아 니(Trichoplusia ni) 세포에서 유도된 곤충 세포주, 또는 다른 무척추동물, 척추동물 또는 다른 진핵생물 세포주(포유류 세포 포함)를 포함할 수 있다. HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, 단핵구 및 성숙 및 미성숙 수지상세포와 같은 당업자에게 공지된 다른 세포주가 또한 사용될 수 있다. 숙주 세포주는 고수율 ceDNA 벡터 생산을 위한 ceDBA-플라스미드의 안정적인 발현을 위해 트랜스펙션될 수 있다.

일부 구현예에 따르면, ceDNA-플라스미드는 당업계에 공지된 시약(예를 들어, 리포좀, 인산칼슘) 또는 물리적 수단(예를 들어, 전기천공)을 사용하여 일시적 트랜스펙션에 의해 Sf9 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, ceDNA-플라스미드를 게놈에 안정적으로 통합시킨 안정한 Sf9 세포주가 확립될 수 있다. 이러한 안정적인 세포주는 선별 마커를 상기 기재된 바와 같은 ceDNA 플라스미드에 혼입시키는 방식으로 확립될 수 있다. 세포주를 트랜스펙션시키는 데 사용되는 ceDNA 플라스미드가 항생제와 같은 선별 마커를 포함하는 경우, ceDNA-플라스미드로 트랜스펙션시키고 ceDNA-플라스미드 DNA를 게놈에 통합시킨 세포는 세포 성장 배지에 항생제를 첨가하여 선별할 수 있다. 이어서, 세포의 내성 클론을 단일 세포 희석 또는 집락 전달 기술로 단리하고, 증식시킬 수 있다.

E. ceDNA 벡터의 단리 및 정제

ceDNA 벡터를 수득하고 단리하는 공정의 예는, 도 4a 내지 도 4e, 및 하기 특정예에 기재되어 있다. 본원에 개시된 ceDNA-벡터는 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 또는 ceDNA-바큐로바이러스로 추가로 형질전환된, AAV Rep 단백질(들)을 발현하는 생산 세포로부터 수득될 수 있다. ceDNA 벡터의 생산에 유용한 플라스미드에는, 도 9a(Rep BIIC 생산에 유용함), 도 9b(ceDNA 벡터를 수득하는 데 사용되는 플라스미드)에 제시된 플라스미드가 포함된다.

일부 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오타이드는 플라스미드(Rep-플라스미드), 박미드(Rep-박미드) 또는 바큐로바이러스(Rep-바큐로바이러스)에서 생산 세포에 전달된 AAV Rep 단백질(Rep 78 또는 68)을 인코딩한다. Rep-플라스미드, Rep-박미드 및 Rep-바큐로바이러스는 상기 기재된 방법에 의해 생성될 수 있다.

예시적인 ceDNA 벡터인 ceDNA-벡터를 생산하는 방법이, 본원에 기재되어 있다. 본 발명의 ceDNA 벡터를 생성하는 데 사용되는 발현 구조체는 플라스미드(예를 들어, ceDNA-플라스미드), 박미드(예를 들어, ceDNA-박미드) 및/또는 바큐로바이러스(예를 들어, ceDNA-바큐로바이러스)일 수 있다. 단지 예시로서, ceDNA-벡터는 ceDNA-바큐로바이러스 및 Rep-바큐로바이러스로 동시 감염된 세포에서 생성될 수 있다. Rep-바큐로바이러스에서 생성된 Rep 단백질은 ceDNA-바큐로바이러스를 복제하여 ceDNA-벡터를 생성할 수 있다. 대안적으로, ceDNA 벡터는 Rep-플라스미드, Rep-박미드 또는 Rep-바큐로바이러스에 전달된 AAV Rep 단백질(Rep78/52)을 인코딩하는 서열을 포함하는 구조체로 안정적으로 트랜스펙션된 세포에서 생성될 수 있다. ceDNA-바큐로바이러스를 세포에 일시적으로 트랜스펙션시키고, Rep 단백질을 통해 복제하여, ceDNA 벡터를 생산할 수 있다.

박미드(예를 들어, ceDNA-박미드)를 Sf9, Sf21, Tni(트리코플시아 니) 세포, High Five 세포와 같은 허용 곤충 세포에 트랜스펙션시켜, 대칭 ITR과 발현 카세트를 포함하는 서열을 포함하는 재조합 바큐로바이러스인 ceDNA-바큐로바이러스를 생성할 수 있다. ceDNA-바큐로바이러스를 다시 곤충 세포에 감염시켜, 차세대 재조합 바큐로바이러스를 수득할 수 있다. 선택적으로, 상기 단계를 1회 또는 다회 반복하여 재조합 바큐로바이러스를 보다 많은 양으로 생산할 수 있다.

상기 세포에서 본원에 기재된 ceDNA 벡터를 수거하고 수집하는 시간은, ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하기 위해 선택 및 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존력, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 통상적으로, 세포는 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 벡터)를 생산하기 위한 바큐로바이러스 감염 후 충분한 시간 후에, 하지만 바이러스 독성으로 인해 세포의 대부분이 사멸되기 시작하기 전에 수거될 수 있다. ceDNA-벡터는 Qiagen ENDO-FREE PLASMID® 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 Sf9 세포에서 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법이 또한 ceDNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 업계 공지 핵산 정제 방법뿐 아니라, 상업적으로 입수 가능한 DNA 추출 키트가 채택될 수 있다.

대안적으로, 정제는 세포 펠릿을 알칼리성 용해 과정에 적용하고, 생성된 용해물을 원심분리하고, 크로마토그래피 분리를 수행하는 방식으로 구현될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 상기 공정은 핵산을 보유하는 이온 교환 컬럼(예를 들어, SARTOBIND Q®) 상에 상청액을 로딩한 후, 용리(예를 들어, 1.2 M NaCl 용액을 이용하여)하고, 겔 여과 컬럼(예를 들어, 6 fast flow GE) 상에서 추가로 크로마토그래피 정제를 수행하는 방식으로 수행될 수 있다. 이어서, 캡시드 미함유 AAV 벡터를, 예를 들어 침전으로 회수한다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 또한 엑소좀 또는 미세입자 형태로 정제될 수 있다. 다수의 세포 유형이 가용성 단백질뿐 아니라, 복합 단백질/핵산 카고를 막 미세소포 배출을 통해 방출하는 것으로 공지되어 있다(Cocucci 등의 문헌(2009); EP 10306226.1) 이러한 소포에는 미세소포(마이크로입자로도 지칭됨) 및 엑소좀(나노소포로도 지칭됨)이 포함되며, 이 둘 모두 카고로서 단백질과 RNA를 포함한다. 미세소포는 원형질막의 직접 버딩(budding)으로부터 생성되고, 엑소좀은 다소포성 엔도좀과 원형질막의 융합 시 세포외 환경으로 방출된다. 따라서, ceDNA 벡터 함유 미세소포 및/또는 엑소좀은 ceDNA-플라스미드, 또는 ceDNA-플라스미드를 이용하여 생성된 박미드 또는 바큐로바이러스로 형질도입된 세포에서 단리될 수 있다.

배양 배지를 여과 또는 20,000 x g에서의 초원심분리에 적용하여 미세소포를 단리하고, 100,000 x g에서의 초원심분리하여 엑소좀을 단리할 수 있다. 초원심분리의 최적 기간은 실험적으로 결정될 수 있고, 소포가 단리되는 특정 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 배양 배지를 먼저 저속 원심분리(예를 들어, 2000 x g에서 5 내지 20분 동안)로 정제하고, 예를 들어 AMICON® 스핀 컬럼(Millipore, Watford, UK)을 사용하여 스핀 농축에 적용한다. 미세소포와 엑소좀은 미세소포와 엑소좀 상에 존재하는 특정 표면 항원을 인식하는 특정 항체를 사용하여 FACS 또는 MACS를 통해 추가로 정제될 수 있다. 다른 미세소포 및 엑소좀 정제 방법에는, 비제한적으로, 면역침강, 친화성 크로마토그래피, 여과, 및 특정 항체 또는 압타머가 코팅된 자성 비드가 포함된다. 정제 시, 소포를, 예를 들어 인산염 완충 염수로 세척한다. ceDNA 함유 소포를 전달하는 데 미세소포 또는 엑소좀을 사용하는 하나의 이점은, 이러한 소포가 각각의 세포 유형에 대한 특정 수용체에 의해 인식되는 막 단백질을 포함하기 때문에 다양한 세포 유형에 대해 표적화될 수 있다는 점이다. (또한 EP 10306226 참조)

본원의 발명의 또 다른 양태는, ceDNA 구조체가 그 자체의 게놈에 안정적으로 통합된 숙주 세포주로부터 ceDNA 벡터를 정제하는 방법에 관한 것이다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 마이크로입자로 정제된다.

PCT/US18/49996의 도 5는, 실시예에 기재된 방법을 사용하여 다수의 ceDNA-플라스미드 구조체로부터 ceDNA의 생산을 확인시켜 주는 겔을 보여준다. ceDNA는, 본원에 논의된 바와 같이, 겔에서의 특징적인 밴드 패턴에 의해 확인된다.

VII. 약학적 조성물

또 다른 양태에서, 약학적 조성물이 제공된다. 약학적 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터와, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함한다.

본원에 개시된 DNA 벡터는 대상의 세포, 조직 또는 기관으로의 생체내 전달을 위해 대상에게의 투여에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약학적 조성물은 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 치료용 투여(예를 들어, 비경구 투여)의 목적하는 경로에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 전달이 또한 고려된다. 치료 목적의 약학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은, 필요한 경우 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 ceDNA 벡터 화합물을 혼입시킨 후, 여과 멸균하는 방식으로 제조될 수 있다.

ceDNA 벡터를 포함하는 약학적 활성 조성물은 핵산의 전이유전자를 수용체의 세포에 전달하여, 그 안에서 전이유전자의 치료적 발현을 유도하도록 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 국소, 전신, 양막내, 경막내, 두개내, 동맥내, 정맥내, 림프내, 복강내, 피하, 기관, 조직내(예를 들어, 근육내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 경막내, 방광내, 결막(예를 들어, 안와외, 안와내, 안와후방, 망막내, 망막하, 맥락막, 맥락막하, 간질내, 전방내 및 유리체내), 달팽이관내 및 점막(예를 들어, 구강, 설하, 비강) 투여에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 전달이 또한 고려된다.

치료 목적을 위한 약학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀, 또는 높은 ceDNA 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은, 필요한 경우 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 ceDNA 벡터 화합물을 혼입시킨 후, 여과 멸균하는 방식으로 제조될 수 있다.

핵산을 세포에 전달하는 다양한 기술 및 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, ceDNA와 같은 핵산은 지질 나노입자(LNP), 리피도이드, 리포좀, 지질 나노입자, 리포플렉스 또는 코어-쉘 나노입자로 제형화될 수 있다. 전형적으로, LNP는 핵산(예를 들어, ceDNA) 분자, 하나 이상의 이온화 가능하거나 양이온성인 지질(또는 이의 염), 하나 이상의 비이온성 또는 중성 지질(예를 들어, 인지질), 응집을 방지하는 분자(예를 들어, PEG 또는 PEG-지질 접합체), 및 선택적으로 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)로 구성된다.

ceDNA와 같은 핵산을 세포에 전달하는 또 다른 방법은, 핵산을 세포에 의해 내재화된 리간드와 접합시키는 것이다. 예를 들어, 리간드는 세포 표면 상의 수용체에 결합하여 세포내이입을 통해 내재화될 수 있다. 리간드는 핵산의 뉴클레오타이드에 공유결합으로 연결될 수 있다. 핵산을 세포에 전달하기 위한 예시적인 접합체는, 예를 들어 WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 및 WO2017/177326에 기재되어 있다.

ceDNA와 같은 핵산은, 또한 트랜스펙션에 의해 세포에 전달될 수 있다. 유용한 트랜스펙션 방법에는, 비제한적으로, 지질 매개 트랜스펙션, 양이온성 중합체 매개 트랜스펙션 또는 인산칼슘 침전이 포함된다. 트랜스펙션 시약은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 이에는, 비제한적으로, TurboFect 트랜스펙션 시약(Thermo Fisher Scientific), Pro-Ject 시약(Thermo Fisher Scientific), TRANSPASS™ P 단백질 트랜스펙션 시약(New England Biolabs), CHARIOT™ 단백질 전달 시약(Active Motif), PROTEOJUICE™ 단백질 트랜스펙션 시약(EMD Millipore), 293fectin, LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTAMINE™ 3000(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTAMINE™(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTIN™(Thermo Fisher Scientific), DMRIE-C, CELLFECTIN™(Thermo Fisher Scientific), OLIGOFECTAMINE™(Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FUGENE™(Roche, Basel, Switzerland), FUGENE™ HD(Roche), TRANSFECTAM™(Transfectam, Promega, Madison, Wis.), TFX-10™(Promega), TFX-20™(Promega), TFX-50™(Promega), TRANSFECTIN™(BioRad, Hercules, Calif.), SILENTFECT™(Bio-Rad), Effectene™(Qiagen, Valencia, Calif.), DC-chol(Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™(Gene Therapy Systems, San Diego, Calif.), DHARMAFECT 1™(Dharmacon, Lafayette, Colo.), DHARMAFECT 2™(Dharmacon), DHARMAFECT 3™(Dharmacon), DHARMAFECT 4™(Dharmacon), ESCORT™ III(Sigma, St. Louis, Mo.) 및 ESCORT™ IV(Sigma Chemical Co.)가 포함된다. ceDNA와 같은 핵산은, 또한 당업자에게 공지된 미세유체 방법을 통해 세포에 전달될 수 있다.

생체내 또는 생체외 핵산의 비바이러스성 전달 방법에는, 전기천공, 리포펙틴(미국 특허 제5,049,386호; 제4,946,787호 참조, Transfectam™ 및 Lipofectin™와 같은 상업적으로 입수 가능한 시약), 미세주사, 유전자 총(biolistic), 비로좀, 리포좀(예를 들어, 문헌[Crystal, Science 270:404-410 (1995)]; 문헌[Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995)]; 문헌[Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)]; 문헌[Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994)]; 문헌[Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995)]; 문헌[Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)]; 미국 특허 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호 및 제4,946,787호), 면역리포좀, 미세기포(문헌[Frenkel et al., Ultrasound Med. Biol. (2002) 28(6): 817-22]; 문헌[Tsutsui et al., Cardiovasc. Ultrasound (2004) 2:23]), 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 및 작용제 강화된 DNA 흡수가 포함된다. 예를 들어 Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용한 소노포레이션(sonoporation)이 또한 핵산의 전달에 사용될 수 있다.

본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 또한 생체내 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 투여는, 비제한적으로, 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하는, 분자를 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적 접촉에 도입하는 데 통상적으로 사용되는 경로 중 임의의 것에 의해 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용 가능하고 당업자에 널리 공지되어 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.

핵산 벡터의 도입 방법에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는, 예를 들어 미국 특허 제5,928,638호에 기재된 방법에 따라 조혈줄기세포에 전달될 수 있다.

당업계에 공지된 다양한 전달 방법 또는 이의 변형을 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 ceDNA 벡터를 전달할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는, 표적화된 세포로의 DNA 유입이 용이하도록 기계적, 전기적, 초음파, 유체역학적 또는 레이저 기반 에너지에 의해 세포막에 일시적으로 침투하는 방식으로 전달된다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 세포막을 일시적으로 파괴하거나, 크기 제한 채널을 통해 세포를 밀어넣거나, 또는 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 전달될 수 있다. 일부 경우에, ceDNA 벡터만 네이키드 DNA로서 피부, 흉선, 심근, 골격근 또는 간세포에 직접 주사된다.

일부 경우에, ceDNA 벡터는 유전자 총에 의해 전달된다. 캡시드 미함유 AAV 벡터로 코팅된 금 또는 텅스텐 구형 입자(직경 1 μm 내지 3 μm)는 가압 가스에 의해 고속으로 가속화되어 표적 조직세포에 침투할 수 있다.

일부 구현예에서, 전기천공이 ceDNA 벡터를 전달하는 데 사용된다. 전기천공은 한 쌍의 전극을 조직에 삽입하여 세포막 표적세포 조직의 일시적 탈안정화를 유발함으로써, 탈안정화된 막의 주변 배지에 있는 DNA 분자가 세포의 세포질 및 핵질에 침투할 수 있게 한다. 전기천공은 피부, 폐 및 근육과 같은 다수의 유형의 조직에 대해 생체내에서 사용되어 왔다.

일부 경우에, ceDNA 벡터는 유체역학적 주사에 의해 전달되는데, 이는 임의의 수용성 화합물 및 입자를 사지 전체의 내부 기관 및 골격근에 직접 세포내 전달하기 위한 간단하고 매우 효율적인 방법이다.

일부 경우에, ceDNA 벡터는 DNA 입자의 내부 기관 또는 종양 세포로의 세포내 전달을 용이하게 하기 위해 막 내에 나노범위 공극을 만들어 초음파를 통해 전달되므로, 플라스미드 DNA의 크기 및 농도는 상기 시스템의 효율에 큰 역할을 한다. 일부 경우에, ceDNA 벡터는 핵산을 함유하는 입자를 표적세포 내로 농축시키기 위해 자기장을 사용하는 자기주입법(magnetofection)을 통해 전달된다.

일부 경우에, 양이온성 리포좀/미셀 또는 양이온성 중합체에 속하는 다가양이온성 나노머 입자에 의한 음으로 하전된 핵산의 압축을 포함하는, 예를 들어 나노머 복합체를 사용하는 화학적 전달 시스템이 사용될 수 있다. 전달 방법에 사용되는 양이온성 지질에는, 비제한적으로, 1가 양이온성 지질, 다가 양이온성 지질, 구아닌 함유 화합물, 콜레스테롤 유도체 화합물, 양이온성 중합체(예를 들어, 폴리(에틸렌이민), 폴리-L-리신, 프로타민, 다른 양이온성 중합체) 및 지질-중합체 하이브리드가 포함된다.

A. 엑소좀

일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 엑소좀에 패키징되는 방식으로 전달된다. 엑소좀은 다소포체와 원형질막의 융합 후 세포외 환경으로 방출되는 세포내이입 기원의 작은 막 소포이다. 이의 표면은 공여체 세포의 세포막 유래의 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 엑소좀을 생산한 세포의 세포질을 함유하고, 표면에 모세포(parental cell)의 막 단백질을 나타낸다. 엑소좀은 내피세포, B 및 T 림프구, 비만세포(MC)뿐 아니라, 수지상세포(DC)를 포함하는 다양한 세포 유형에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 직경이 10 nm 내지 1 μm, 20 nm 내지 500 nm, 30 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 100 nm인 엑소좀이 사용을 위해 고려된다. 엑소좀은 이의 공여체 세포를 사용하거나 특정 핵산을 도입하는 방식으로 표적세포로의 전달을 위해 단리될 수 있다. 당업계에 공지된 다양한 접근법을 사용하여 본 발명의 캡시드 미함유 AAV 벡터를 함유하는 엑소좀을 생성할 수 있다.

B. 미세입자/나노입자

일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 지질 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 지질 나노입자는, 예를 들어 문헌[Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507]에 개시된 바와 같은, 이온화 가능한 아미노 지질(예를 들어, 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트, DLin-MC3-DMA, 포스파티딜콜린(1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, DSPC), 콜레스테롤 및 코트 지질(폴리에틸렌 글리콜-디미리스톨글리세롤, PEG-DMG)을 포함한다.

일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 약 10 nm 내지 약 1000 nm이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 300 nm 미만이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 약 10 nm 내지 약 300 nm이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 200 nm 미만이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자의 평균 직경은 약 25 nm 내지 약 200 nm이다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 제제(예를 들어, 다수의 지질 나노입자를 포함하는 조성물)는, 평균 크기(예를 들어, 직경)가 약 70 nm 내지 약 200 nm이고, 전형적으로 평균 크기가 약 100 nm 이하인 크기 분포를 갖는다.

당업계에 공지된 다양한 지질 나노입자를 사용하여 본원에 개시된 ceDNA 벡터를 전달할 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자를 사용하는 다양한 전달 방법은 미국 특허 제9,404,127호, 제9,006,417호 및 제9,518,272호에 기재되어 있다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 금 나노입자에 의해 전달된다. 일반적으로, 핵산은, 예를 들어 문헌[Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083]에 기재된 바와 같이, 금 나노입자에 공유결합으로 결합되거나, 금 나노입자에 비공유결합으로 결합될 수 있다(예를 들어, 전하-전하 상호작용에 의해 결합됨). 일부 구현예에서, 금 나노입자-핵산 접합체는, 예를 들어 미국 특허 제6,812,334호에 기재된 방법을 사용하여 생성된다.

C. 접합체

일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 세포 흡수를 증가시키는 작용제에 접합된다(예를 들어, 공유결합으로 결합됨). "세포 흡수를 증가시키는 작용제"는 지질 막을 통한 핵산의 수송을 용이하게 하는 분자이다. 예를 들어, 핵산은 친유성 화합물(예를 들어, 콜레스테롤, 토코페롤 등), 세포 침투 펩타이드(CPP)(예를 들어, 페네트라틴(penetratin), TAT, Syn1B, 등) 및 폴리아민(예를 들어, 스페르민(spermine))에 접합될 수 있다. 세포 흡수를 증가시키는 작용제의 추가 예는, 예를 들어 문헌[Winkler (2013). Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809]에 개시되어 있다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 중합체(예를 들어, 중합체 분자) 또는 폴레이트 분자(예를 들어, 엽산 분자)에 접합된다. 일반적으로, 중합체에 접합된 핵산의 전달은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 WO2000/34343 및 WO2008/022309에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 미국 특허 제8,987,377호에 기재된 바와 같이 폴리(아미드) 중합체에 접합된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 기재된 핵산은 미국 특허 제8,507,455호에 기재된 바와 같이 엽산 분자에 접합된다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는, 예를 들어 미국 특허 제8,450,467호 기재된 바와 같이 탄수화물에 접합된다.

D. 나노캡슐

대안적으로, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 나노캡슐 제형이 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정적이고 재현 가능한 방식으로 물질을 포획할 수 있다. 세포내 중합체 과부하로 인한 부작용을 회피하기 위해, 이러한 초미세 입자(크기 약 0.1 μm)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 설계되어야 한다. 이러한 요건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 사용을 위해 고려된다.

E. 리포좀

본 발명에 따른 ceDNA 벡터는 대상의 세포 또는 표적 기관으로의 전달을 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포좀은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료체 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약학 성분(API)을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다.

리포좀의 형성 및 사용은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 리포좀은 개선된 혈청 안정성 및 순환 반감기를 갖도록 개발되었다(미국 특허 제5,741,516호). 나아가, 잠재적인 약물 담체로서의 리포좀 및 리포좀 유사 제제의 다양한 방법이 기재되어 있다(미국 특허 제5,567,434호; 제5,552,157호; 제5,565,213호; 제5,738,868호 및 제5,795,587호).

리포좀은 다른 절차에 의한 트랜스펙션에는 통상적으로 저항성인 다수의 세포 유형과 함께 성공적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀은 바이러스 기반 전달 시스템에 전형적인 DNA 길이 제약이 없다. 리포좀은 유전자, 약물, 방사선치료제, 바이러스, 전사인자 및 알로스테릭(allosteric) 이펙터를 다수의 배양된 세포주 및 동물에 도입하는 데 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀 매개 약물 전달의 효과를 조사한 몇몇 성공적인 임상 시험이 완료되었다.

리포좀은 수성 매질에 분산되어 있고 다중라멜라 동심 이중층 소포(다중라멜라 소포(MLV)로도 지칭됨)를 자발적으로 형성하는 인지질로부터 형성된다. MLV의 직경은 일반적으로 25 nm 내지 4 μm이다. MLV를 초음파처리하면, 코어에 수용액을 함유하는 직경이 200 ANG 내지 500 ANG 범위인 작은 단일라멜라 소포(SUV)가 형성된다.

일부 구현예에서, 리포좀은 양이온성 지질을 포함한다. "양이온성 지질"이라는 용어에는, 극성 및 비극성 도메인을 모두 갖고, 생리학적 pH 또는 생리학적 pH 근처에서 양으로 하전될 수 있으며, 핵산과 같은 다가음이온에 결합하고, 세포로의 핵산의 전달의 용이하게 하는 지질 및 합성 지질이 포함된다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질에는, 아민, 아미드 또는 이의 유도체의 포화 및 불포화 알킬 및 지환족 에테르 및 에스테르가 포함된다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 직쇄, 분지형 알킬, 알케닐기, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 1개 내지 약 25개의 탄소 원자(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개의 탄소 원자)를 함유한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 25개 초과의 탄소 원자를 함유한다. 일부 구현예에서, 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알켄기는 6개 이상의 탄소 원자를 갖는다. 양이온성 지질은 또한, 일부 구현예에서, 하나 이상의 지환족 기를 포함할 수 있다. 지환족 기의 비제한적인 예에는, 콜레스테롤 및 다른 스테로이드 기가 포함된다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 하나 이상의 반대이온을 이용하여 제조된다. 반대이온(음이온)의 예에는, 비제한적으로, Cl^―, Br^―, I^―, F^―, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 설페이트, 니트라이트 및 니트레이트가 포함된다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 면역원성/항원성을 감소시키고, 화합물(들)에 친수성 및 소수성을 제공하고, 투여 빈도를 감소시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관능기(소위 "PEG화 화합물")를 갖는 하나 이상의 화합물을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 또는, 리포좀 제형은 단순히 추가 구성요소로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 포함한다. 이러한 양태에서, PEG 또는 PEG 관능기의 분자량은 62 Da 내지 약 5,000 Da일 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 수시간 내지 수주의 기간에 걸쳐 연장 방출 또는 제어 방출 프로파일로 API를 전달하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 관련 양태에서, 리포좀 제형은 지질 이중층에 의해 결합된 수성 챔버를 포함할 수 있다. 다른 관련 양태에서, 리포좀 제형은 수시간 내지 수주의 기간에 걸쳐 API를 방출하는 승온에서 물리적 전이를 거치는 구성요소로 API를 캡슐화한다.

일부 양태에서, 리포좀 제형은 스핑고미엘린과, 본원에 개시된 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 옵티좀(optisome)을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 소듐 염, (디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합된 지질, HSPC(수소첨가된 대두 포스파티딜콜린); PEG(폴리에틸렌 글리콜); DSPE(디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민); DSPC(디스테아로일포스파티딜콜린); DOPC(디올레오일포스파티딜콜린); DPPG(디팔미토일포스파티딜글리세롤); EPC(달걀 포스파티딜콜린); DOPS(디올레오일포스파티딜세린); POPC(팔미토일올레오일포스파티딜콜린); SM(스핑고미엘린); MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜); DMPC(디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG(디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DSPG(디스테아로일포스파티딜글리세롤); DEPC(디에루코일포스파티딜콜린); DOPE(디올레오일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), 콜레스테릴 설페이트(CS), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), DOPC(디올레오일-sn-글리세로-포스파티딜콜린) 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 56:38:5의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형의 전체 지질 함량은 2 mg/mL 내지 16 mg/mL이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질 및 PEG화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질 및 PEG화 지질을, 각각, 3:0.015:2의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질과 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, PEG화 지질은 PEG-2000-DSPE이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 DPPG, 대두 PC, MPEG-DSPE 지질 접합체 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 하나 이상의 지질과 에탄올아민 관능기를 함유하는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질, 및 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤 중 하나 이상을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 DOPC/ DEPC; 및 DOPE를 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 약학적 부형제, 예를 들어 수크로오스 및/또는 글리신을 추가로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 단일라멜라 또는 단중라멜라 구조의 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 통상의 나노입자에 비해 크기가 크고, 크기가 약 150 nm 내지 250 nm인 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 동결건조된 분말이다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 리포좀 외부에 단리된 ceDNA를 갖는 혼합물에 약염기를 첨가하여, 본원에 개시 또는 기재된 ceDNA 벡터로 제조되고 로딩되는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 첨가는 리포좀 외부의 pH를 대략 7.3으로 증가시키고, API를 리포좀으로 유도한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 리포좀 내부에서 산성인 pH를 갖는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 리포좀의 내부는 pH 4 내지 6.9, 더욱 바람직하게는 pH 6.5일 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 리포좀내 약물 안정화 기술을 사용하여 제조된 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 중합체성 또는 비중합체성의 고도로 하전된 음이온과, 리포좀내 포획제, 예를 들어 폴리포스페이트 또는 수크로오스 옥타설페이트가 이용된다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.

양이온성 지질의 비제한적인 예에는, 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민(PAMAM) 별모양(starburst) 덴드리머, 리포펙틴(Lipofectin)(DOTMA와 DOPE의 조합물), 리포펙타아제(Lipofectase), LIPOFECTAMINE™(예를 들어, LIPOFECTAMINE™ 2000), DOPE, 사이토펙틴(Cytofectin)(Gilead Sciences, Foster City, Calif.) 및 유펙틴(Eufectin)(JBL, San Luis Obispo, Calif.)이 포함된다. 예시적인 양이온성 리포좀은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N-[1-(2,3-디올레오일옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸설페이트(DOTAP), 3β-[N-(N′,N′-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤(DC-Chol), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 암모늄 브로마이드; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB)로부터 제조될 수 있다. 핵산(예를 들어, CELiD)은 또한, 예를 들어 폴리(L-리신) 또는 아비딘과 복합체화될 수 있으며, 지질은 이러한 혼합물, 예를 들어 스테릴-폴리(L-리신)에 포함되거나 포함되지 않을 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 미국 특허 제8,158,601호 기재된 양이온성 지질, 또는 미국 특허 제8,034,376호 기재된 바와 같은 폴리아민 화합물 또는 지질을 사용하여 전달된다.

F. 예시적인 리포좀 및 지질 나노입자(LNP) 조성물

본 발명에 따른 ceDNA 벡터는 유전자 편집이 필요한, 예를 들어 공여 서열이 필요한 세포로의 전달을 위해 리포좀에 첨가될 수 있다. 리포좀은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포좀은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료체 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약학 성분(API)을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포좀 조성물은 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 면역원성/항원성을 감소시키고, 화합물(들)에 친수성 및 소수성을 제공하고, 투여 빈도를 감소시킬 수 있는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관능기(소위 "PEG화 화합물")를 갖는 하나 이상의 화합물을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 또는, 리포좀 제형은 단순히 추가 구성요소로서 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체를 포함한다. 이러한 양태에서, PEG 또는 PEG 관능기의 분자량은 62 Da 내지 약 5,000 Da일 수 있다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 수시간 내지 수주의 기간에 걸쳐 연장 방출 또는 제어 방출 프로파일로 API를 전달하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 관련 양태에서, 리포좀 제형은 지질 이중층에 의해 결합된 수성 챔버를 포함할 수 있다. 다른 관련 양태에서, 리포좀 제형은 수시간 내지 수주의 기간에 걸쳐 API를 방출하는 승온에서 물리적 전이를 거치는 구성요소로 API를 캡슐화한다.

일부 양태에서, 리포좀 제형은 스핑고미엘린과, 본원에 개시된 하나 이상의 지질을 포함한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 옵티좀을 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 소듐 염, (디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합된 지질, HSPC(수소첨가된 대두 포스파티딜콜린); PEG(폴리에틸렌 글리콜); DSPE(디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민); DSPC(디스테아로일포스파티딜콜린); DOPC(디올레오일포스파티딜콜린); DPPG(디팔미토일포스파티딜글리세롤); EPC(달걀 포스파티딜콜린); DOPS(디올레오일포스파티딜세린); POPC(팔미토일올레오일포스파티딜콜린); SM(스핑고미엘린); MPEG(메톡시 폴리에틸렌 글리콜); DMPC(디미리스토일 포스파티딜콜린); DMPG(디미리스토일 포스파티딜글리세롤); DSPG(디스테아로일포스파티딜글리세롤); DEPC(디에루코일포스파티딜콜린); DOPE(디올레오일-sn-글리세로-포스포에탄올아민), 콜레스테릴 설페이트(CS), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), DOPC(디올레오일-sn-글리세로-포스파티딜콜린) 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 56:38:5의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형의 전체 지질 함량은 2 mg/mL 내지 16 mg/mL이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질 및 PEG화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질 및 PEG화 지질을, 각각, 3:0.015:2의 몰비로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질과 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, PEG화 지질은 PEG-2000-DSPE이다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 DPPG, 대두 PC, MPEG-DSPE 지질 접합체 및 콜레스테롤을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 하나 이상의 지질과 에탄올아민 관능기를 함유하는 하나 이상의 지질을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 포스파티딜콜린 관능기를 함유하는 지질, 에탄올아민 관능기를 함유하는 지질, 및 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤 중 하나 이상을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 DOPC/ DEPC; 및 DOPE를 포함한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 약학적 부형제, 예를 들어 수크로오스 및/또는 글리신을 추가로 포함하는 리포좀 제형을 제공한다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 단일라멜라 또는 단중라멜라 구조의 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 통상의 나노입자에 비해 크기가 크고, 크기가 약 150 nm 내지 250 nm인 리포좀 제형을 제공한다. 일부 양태에서, 리포좀 제형은 동결건조된 분말이다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 리포좀 외부에 단리된 ceDNA를 갖는 혼합물에 약염기를 첨가하여, 본원에 개시 또는 기재된 ceDNA 벡터로 제조되고 로딩되는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 첨가는 리포좀 외부의 pH를 대략 7.3으로 증가시키고, API를 리포좀으로 유도한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 리포좀 내부에서 산성인 pH를 갖는 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 리포좀의 내부는 pH 4 내지 6.9, 더욱 바람직하게는 pH 6.5일 수 있다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 리포좀내 약물 안정화 기술을 사용하여 제조된 리포좀 제형을 제공한다. 이러한 경우에, 중합체성 또는 비중합체성의 고도로 하전된 음이온과, 리포좀내 포획제, 예를 들어 폴리포스페이트 또는 수크로오스 옥타설페이트가 이용된다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 리포좀 제형을 제공한다. 일부 구현예에서, 리포좀 제형은 하기 표 6에 기재된 제형이다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 ceDNA와 이온화 가능한 지질을 포함하는 지질 나노입자를 제공한다. 예를 들어, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허 PCT/US2018/050042(이는 본원에 참조로서 인용됨)에 기재된 바와 같은 방법으로 수득된 ceDNA로 제조되고 로딩되는 지질 나노입자 제형. 이는, 이온화 가능한 지질을 양성자화하고 ceDNA/지질 회합 및 입자의 핵형성에 유용한 에너지를 제공하는, 낮은 pH에서의 에탄올성 지질과 수성 ceDNA의 고에너지 혼합에 의해 달성될 수 있다. 상기 입자는 수성 희석 및 유기 용매의 제거를 통해 추가로 안정화될 수 있다. 상기 입자는 목적하는 수준으로 농축될 수 있다.

일반적으로, 지질 입자는 약 10:1 내지 30:1의 총 지질 대 ceDNA의 (질량 또는 중량)비로 제조된다. 일부 구현예에서, 지질 대 ceDNA 비(질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 수 있다. 지질과 ceDNA의 양은 목적하는 N/P 비, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 N/P 비를 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 지질 입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL 범위일 수 있다.

이온화 가능한 지질은 전형적으로 낮은 pH에서 핵산 카고, 예를 들어 ceDNA를 응축시키고, 막 회합과 푸소겐성(fusogenicity)을 유도하는 데 이용된다. 일반적으로, 이온화 가능한 지질은 산성 조건 하에서, 예를 들어 6.5 이하의 pH에서 양으로 하전되거나 양성자화되는 적어도 하나의 아미노기를 포함하는 지질이다. 이온화 가능한 지질은 또한 본원에서 양이온성 지질로 지칭된다.

예시적인 이온화 가능한 지질은 PCT 특허 출원 WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346 및 WO2013/086354, 및 미국 특허 공보 US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458 및 US2013/0195920에 기재되어 있으며, 모든 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조를 갖는 MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다:

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지질 DLin-MC3-DMA는 문헌[Jayaraman et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533]에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조를 갖는 지질 ATX-002이다:

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지질 ATX-002는 WO2015/074085에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조를 갖는 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)이다:

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화합물 32는 WO2012/040184에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조를 갖는 화합물 6 또는 화합물 22이다:

화합물 6과 화합물 22는 WO2015/199952에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

비제한적으로, 이온화 가능한 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20% 내지 90%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 이온화 가능한 지질 몰 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 20% 내지 70%(몰), 30% 내지 60%(몰) 또는 40% 내지 50%(몰)일 수 있다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 약 50 mol% 내지 약 90 mol%를 차지한다.

일부 양태에서, 지질 나노입자는 비양이온성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 비이온성 지질에는, 양친매성 지질, 중성 지질 및 음이온성 지질이 포함된다. 따라서, 비양이온성 지질은 중성의 하전되지 않은 지질, 쯔비터이온성(zwitterionic) 지질 또는 음이온성 지질일 수 있다. 비양이온성 지질은 전형적으로 푸소겐성을 증강시키는 데 이용된다.

예시적인 비양이온성 지질에는, 비제한적으로, 디스테아로일-sn-글리세로-포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸-포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일 포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민(DEPE), 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 달걀 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 다른 디아실포스파티딜콜린과 디아실포스파티딜에탄올아민 인지질도 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 지질 내 아실기는 바람직하게는 C₁₀-C₂₄ 탄소 사슬을 갖는 지방산, 예를 들어 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 또는 올레오일에서 유도된 아실기이다.

지질 나노입자에 사용하기에 적합한 비양이온성 지질의 다른 예에는, 예를 들어 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤리시놀레에이트, 헥사데실 스테아레이트, 이소프로필 미리스테이트, 양쪽성 아크릴계 중합체, 트리에탄올아민-라우릴 설페이트, 알킬-아릴 설페이트 폴리에틸옥실화 지방산 아미드, 디옥사데실디메틸 암모늄 브로마이드, 세라미드, 스핑고미엘린 등과 같은 인을 함유하지 않는 지질이 포함된다.

일부 구현예에서, 비양이온성 지질은 인지질이다. 일부 구현예에서, 비양이온성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM에서 선택된다. 일부 바람직한 구현예에서, 비양이온성 지질은 DPSC이다.

예시적인 비양이온성 지질은 PCT 공보 WO2017/099823 및 미국 특허 공보 US2018/0028664에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 일부 예에서, 비양이온성 지질은 올레산, 또는 US2018/0028664에 정의된 바와 같은 화학식 (I)

, 화학식 (II)

또는 화학식 (IV)

의 화합물이며, 상기 문헌의 내용은 모두 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

비양이온성 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0 내지 30%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 비양이온성 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 5% 내지 20%(몰) 또는 10% 내지 15%(몰)이다. 다양한 구현예에서, 이온화 가능한 지질 대 중성 지질의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1 범위이다.

일부 구현예에서, 지질 나노입자는 임의의 인지질을 포함하지 않는다.

일부 양태에서, 지질 나노입자는 막 온전성을 제공하기 위해 스테롤과 같은 구성요소를 추가로 포함할 수 있다.

지질 나노입자에 사용될 수 있는 하나의 예시적인 스테롤은 콜레스테롤 및 이의 유도체이다. 콜레스테롤 유도체의 비제한적인 예에는, 5α-콜레스탄올, 5β-코프로스탄올, 콜레스테릴-(2′-히드록시)-에틸 에테르, 콜레스테릴-(4′-히드록시)-부틸 에테르 및 6-케토콜레스탄올과 같은 극성 유사체; 5α-콜레스탄, 콜레스테논, 5α-콜레스타논, 5β-콜레스타논 및 콜레스테릴 데카노에이트와 같은 비극성 유사체; 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 구현예에서, 콜레스테롤 유도체는 콜레스테릴-(4′-히드록시)-부틸 에테르와 같은 극성 유사체이다.

예시적인 콜레스테롤 유도체는 PCT 공보 WO2009/127060 및 미국 특허 공보 US2010/0130588에 기재되어 있으며, 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

스테롤과 같은 막 온전성을 제공하는 구성요소는, 지질 나노입자에 존재하는 지질의 0 내지 50%(몰)를 차지할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 구성요소는 지질 나노입자의 총 지질 함량의 20% 내지 50%(몰) 또는 30% 내지 40%(몰)이다.

일부 양태에서, 지질 나노입자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 접합된 지질 분자를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들은 지질 나노입자의 응집을 저해하고/하거나 입체 안정화를 제공하기 위해 사용된다. 예시적인 접합된 지질에는, 비제한적으로, PEG-지질 접합체, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체), 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 구현예에서, 접합된 지질 분자는 PEG-지질 접합체, 예를 들어 (메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-접합된 지질이다.

예시적인 PEG-지질 접합체에는, 비제한적으로, PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대, 1-(모노메톡시-폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), peg화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대, 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(w-메톡시(폴리에톡시)에틸) 부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카르밤, N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 소듐 염, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 추가의 예시적인 PEG-지질 접합체는, 예를 들어 US5,885,613, US6,287,591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224 및 US2017/0119904에 기재되어 있으며, 모든 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

일부 구현예에서, PEG-지질은 US2018/0028664에 정의된 바와 같은 화학식 (III)

, 화학식 (III-a-I)

, 화학식 (III-a-2)

, 화학식 (III-b-1)

, 화학식 (III-b-2)

또는 화학식 (V)

의 화합물이며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

일부 구현예에서, PEG-지질은 US20150376115 또는US2016/0376224에 정의된 바와 같은 화학식 (II)

이며, 상기 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

PEG-DAA 접합체는, 예를 들어 PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필일 수 있다. PEG-지질은 PEG-DMG, PEG-디라우릴글리세롤, PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테릴글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글리카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕시벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르) 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 중 하나 이상일 수 있다. 일부 예에서, PEG-지질은 PEG-DMG, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000],

,

,

및

로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.

PEG 이외의 분자와 접합된 지질이 또한 PEG-지질 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체) 및 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체가 PEG-지질 대신 또는 이에 더하여 사용될 수 있다.

예시적인 접합된 지질, 즉, PEG-지질, (POZ)-지질 접합체, ATTA-지질 접합체 및 양이온성 중합체-지질은, PCT 특허 출원 공보 WO1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104 및 WO2010/006282; 미국 특허 출원 공보 US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587 및 US20110123453; 및 US 특허 US5,885,613, US6,287,591, US6,320,017 및 US6,586,559에 기재되어 있으며, 상기 모든 문헌들의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

PEG 또는 접합된 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0 내지 20%(몰)를 차지할 수 있다. 일부 구현예에서, PEG 또는 접합된 지질 함량은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0.5% 내지 10%(몰) 또는 2% 내지 5%(몰)이다.

이온화 가능한 지질, 비양이온성 지질, 스테롤 및 PEG/접합된 지질의 몰비는 필요에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 지질 입자는 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 30% 내지 70%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 0 내지 60%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 0 내지 30%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 1% 내지 10%의 접합된 지질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 조성물은 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 30% 내지 40%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 40% 내지 50%의 콜레스테롤, 및 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 10% 내지 20%의 비양이온성 지질을 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 조성물은 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 50% 내지 75%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 20% 내지 40%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 5% 내지 10%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 1% 내지 10%의 접합된 지질이다. 조성물은 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 60% 내지 70%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 25% 내지 35%의 콜레스테롤, 및 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 5% 내지 10%의 비양이온성 지질을 함유할 수 있다. 조성물은 또한 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 최대 90%의 이온화 가능한 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 2% 내지 15%의 비양이온성 지질을 함유할 수 있다. 제형은 또한, 예를 들어 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 8% 내지 30%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 5% 내지 30%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 0 내지 20%의 콜레스테롤; 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 4% 내지 25%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 4% 내지 25%의 비양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 2% 내지 25%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 10% 내지 35%의 접합된 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 5%의 콜레스테롤; 또는 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 2% 내지 30%의 이온화 가능한 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 2% 내지 30%의 비양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 1% 내지 15%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 2% 내지 35%의 접합된 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 1% 내지 20%의 콜레스테롤; 또는 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 최대 90%의 이온화 가능한 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 2% 내지 10%의 비양이온성 지질; 또는 심지어 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 100%의 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노입자 제형일 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 입자 제형은 이온화 가능한 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 50:10:38.5:1.5의 몰비로 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 지질 입자 제형은 이온화 가능한 지질, 콜레스테롤 및 PEG화 지질을 60:38.5:1.5의 몰비로 포함한다.

일부 구현예에서, 지질 입자는 이온화 가능한 지질, 비양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 PEG화 지질을 포함하며, 여기서 지질의 몰비는 이온화 가능한 지질의 경우 20 몰% 내지 70 몰% 범위(여기서, 목표는 40 몰% 내지 60 몰%임)이고, 비양이온성 지질의 몰%는 0 내지 30몰% 범위(여기서, 목표는 0 내지 15몰%임)이고, 스테롤의 몰%는 20 몰% 내지 70 몰% 범위(여기서, 목표는 30 몰% 내지 50 몰%임)이고, PEG화 지질의 몰%는 1 몰% 내지 6 몰% 범위(여기서, 목표는 2 몰% 내지 5 몰%임)이다.

ceDNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)는 2018년 9월 7일자 출원된 국제 출원 PCT/US2018/050042에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용되고, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에의 사용을 위해 고려된다.

지질 나노입자 입자 크기는 Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern, UK)을 사용하여 준탄성 광산란(quasi-elastic light scattering)에 의해 결정될 수 있으며, 직경은 대략 50 nm 내지 150 nm, 대략 55 nm 내지 95 nm, 또는 대략 70 nm 내지 90 nm이다.

제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관관계가 있을 수 있다(문헌[Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; 문헌[Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)] 참조, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨). pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 각각의 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 검정을 사용하여 지질 나노입자에서 결정된다. PBS 중에 총 지질 농도 0.4 mM로 양이온성 지질/DSPC/콜레스테롤/PEG-지질(50/10/38.5/1.5(mol%))을 포함하는 지질 나노입자는, 본원 및 다른 곳에 기재된 바와 같은 인라인(in-line) 공정을 사용하여 제조될 수 있다. TNS는 증류수 중에 100 μM 스톡 용액으로 제조될 수 있다. 소포는 10 mM HEPES, 10 mM MES, 10 mM 암모늄 아세테이트, 130 mM NaCl을 함유하는 완충액 2 mL 중에 24 μM 지질로 희석될 수 있으며, 여기서 pH는 2.5 내지 11 범위이다. TNS 용액의 분취액을 첨가하여 최종 농도 1 μM을 제공하고, 볼텍싱 혼합 후, 실온에서 SLM Aminco 시리즈 2 발광 분광광도계로 321 nm 및 445 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 형광 광도를 측정한다. 시그모이드 최적합(sigmoidal best fit) 분석을 형광 데이터에 적용할 수 있으며, pKa는 최대 형광 강도의 절반이 되는 pH로 측정한다.

상대 활성은 꼬리 정맥 주사를 통한 투여 4시간 후 간에서의 루시퍼라아제 발현을 측정하여 결정할 수 있다. 활성을 0.3 및 1.0 mg ceDNA/kg 용량에서 비교하고, 투여 4시간 후에 측정된 루시퍼라아제 ng/간 g으로 표시한다.

비제한적으로, 본 발명의 지질 나노입자는 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터를 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는 데 사용될 수 있는 지질 제형을 포함한다. 일반적으로, 지질 나노입자는 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터와, 이온화 가능한 지질 또는 이의 염을 포함한다.

일부 구현예에서, 지질 입자는 이온화 가능한 지질/비양이온성 지질/스테롤/접합된 지질을 대략 50:10:38.5:1.5의 몰비로 포함한다.

일부 구현예에서, 지질 입자는 이온화 가능한 지질/비양이온성 지질/스테롤/접합된 지질을 대략 50.0:7.0:40.0:3.0의 몰비로 포함한다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 화합물이 또한 포함될 수 있다. 이러한 화합물은 별도로 투여될 수 있거나, 추가 화합물은 본 발명의 지질 나노입자에 포함될 수 있다. 다시 말해서, 지질 나노입자는 ceDNA 이외의 다른 화합물, 또는 적어도 제1 ceDNA와 상이한 제2 ceDNA를 함유할 수 있다. 비제한적으로, 다른 추가 화합물은 소형 또는 대형 유기 또는 무기 분자, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 다당류, 펩타이드, 단백질, 펩타이드 유사체 및 이의 유도체, 펩타이드 모방체, 핵산, 핵산 유사체 및 유도체, 생물학적 물질로 제조된 추출물, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.

일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 화합물은 치료제일 수 있다. 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 다시 말해서, 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 다시 말해서, 치료제는 치료 목적 및 목적하는 생물학적 작용에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, LNP 내 ceDNA가 암 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항암제(예를 들어, 화학요법제, 표적화 암치료(비제한적으로, 소분자, 항체, 또는 항체-약물 접합체 포함)일 수 있다. 또 다른 예에서, ceDNA를 함유하는 LNP이 감염의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항미생물제(예를 들어, 항생제 또는 항바이러스 화합물)일 수 있다. 또 다른 예에서, ceDNA를 함유하는 LNP이 면역 질환 또는 장애의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 면역 반응을 조절하는 화합물(예를 들어, 면역억제제, 면역자극 화합물 또는 하나 이상의 특정 면역 경로를 조절하는 화합물)일 수 있다. 일부 구현예에서, 상이한 단백질 또는 상이한 화합물, 예컨대 치료제를 인코딩하는 ceDNA와 같은 상이한 화합물을 함유하는 상이한 지질 나노입자의 상이한 칵테일이, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 추가 화합물은 면역 조절제이다. 예를 들어, 추가 화합물은 면역억제제이다. 일부 구현예에서, 추가 화합물은 면역자극제이다.

지질 나노입자와, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 본원에 제공된다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 약학적 부형제를 추가로 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 제형은 수크로오스, 트리스, 트레할로오스 및/또는 글리신을 추가로 포함한다.

일반적으로, 본 발명의 지질 나노입자는 의도된 치료 효과를 제공하도록 선택된 평균 직경을 갖는다. 따라서, 일부 양태에서, 지질 나노입자는 약 30 nm 내지 약 150 nm, 보다 전형적으로 약 50 nm 내지 약 150 nm, 보다 전형적으로 약 60 nm 내지 약 130 nm, 보다 전형적으로 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 전형적으로 약 85 nm 내지 약 105 nm, 및 바람직하게는 약 100 nm의 평균 직경을 갖는다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 일반적인 나노입자에 비해 크기가 크고 크기가 약 150 내지 250 nm인 지질 입자를 제공한다. 지질 나노입자 입자 크기는 Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern, UK) 시스템을 사용하여 준탄성 광산란에 의해 결정될 수 있다.

지질 입자의 의도된 용도에 따라, 구성요소의 비율이 달라질 수 있으며, 특정 제형의 전달 효율은, 예를 들어 엔도좀 방출 매개변수(ERP) 검정을 사용하여 측정될 수 있다.

ceDNA는 입자의 지질 부분과 복합체화되거나, 지질 나노입자의 지질 위치에서 캡슐화될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA는 지질 나노입자의 지질 위치에서 완전히 캡슐화되어, 예를 들어 수용액에서 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호될 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 내 ceDNA는 지질 나노입자를 37℃에서 적어도 약 20분, 30분, 45분 또는 60분 동안 뉴클레아제에 노출시킨 후 실질적으로 분해되지 않는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 내 ceDNA는 상기 입자를 혈청에서 37^oC에서 적어도 약 30분, 45분 또는 60분, 또는 적어도 약 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간 또는 36시간 동안 인큐베이션한 후 실질적으로 분해되지 않는다.

특정 구현예에서, 지질 나노입자는 대상, 예를 들어 인간과 같은 포유류에 실질적으로 비독성이다.

일부 양태에서, 지질 나노입자 제형은 동결건조된 분말이다.

일부 구현예에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 고체 코어 입자이다. 다른 구현예에서, 지질 나노입자는 비(非)이중층 구조, 즉, 비(非)라멜라(즉, 비이중층) 형태를 갖는다. 비제한적으로, 비이중층 형태는, 예를 들어 3차원 튜브, 막대, 입방 대칭 등을 포함할 수 있다. 지질 입자의 비라멜라 형태(즉, 비이중층 구조)는 당업자에게 공지되어 있고 당업자에 의해 사용되는 분석 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 기술에는, 비제한적으로, 저온 투과 전자 현미경법(Cryo-Transmission Electron Microscopy)("Cryo-TEM"), 시차 주사 열량측정법("DSC"), X-선 회절 등이 포함된다. 예를 들어, 지질 나노입자의 형태(라멜라 대 비라멜라)는, 예를 들어 US2010/0130588에 기재된 바와 같은 Cryo-TEM 분석을 사용하여 용이하게 평가 및 특징분석될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

일부 추가의 구현예에서, 비라멜라 형태를 갖는 지질 나노입자는 전자 밀도가 높다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 단일라멜라 또는 단중라멜라 구조의 지질 나노입자를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.

지질 구성요소의 조성 및 농도를 제어하는 방식으로, 지질 접합체가 지질 입자로부터 교환되는 속도, 및 결국, 지질 나노입자가 푸소겐성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 또한, 예를 들어 pH, 온도 또는 이온 강도를 포함하는 다른 변수를 사용하여, 지질 나노입자가 푸소겐성이 되는 속도를 변화시키고/시키거나 제어할 수 있다. 지질 나노입자가 푸소겐성이 되는 속도를 제어하는 데 사용될 수 있는 다른 방법이, 본 개시내용을 기반으로 당업자에게 명백할 것이다. 지질 접합체의 조성 및 농도를 제어하여 지질 입자 크기를 제어할 수 있다는 것이 또한 명백할 것이다.

제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관관계가 있을 수 있다(문헌[Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; 문헌[Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)] 참조, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨). pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 검정을 사용하여 지질 나노입자에서 결정될 수 있다.

지질 입자에서의 ceDNA의 캡슐화는, 핵산과 회합될 때 형광이 증강되는 염료를 사용하는 막 불투과성 형광 염료 배제 검정, 예를 들어 Oligreen^® 검정 또는 PicoGreen^® 검정을 수행하는 방식으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 캡슐화는 염료를 지질 입자 제형에 첨가하고, 생성된 형광을 측정하고, 소량의 비이온성 세제의 첨가 시 관찰된 형광과 비교하는 방식으로 결정된다. 지질 이중층의 세제 매개 파괴는 캡슐화된 ceDNA를 방출하여, 막 불투과성 염료와의 상호작용을 가능하게 한다. ceDNA의 캡슐화는 다음과 같이 계산될 수 있다: E= (I₀ - I)/I₀(여기서, I 및 I₀는 세제 첨가 전후의 형광 강도를 나타냄).

VIII. ceDNA 벡터의 전달 방법

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 다양한 적합한 방법에 의해 시험관내 또는 생체내 표적세포에 전달될 수 있다. ceDNA 벡터만 적용되거나 주사될 수 있다. CeDNA 벡터는 트랜스펙션 시약 또는 다른 물리적 수단의 도움 없이 세포에 전달될 수 있다. 대안적으로, ceDNA 벡터는 DNA의 세포에의 진입을 용이하게 하는 임의의 업계 공지 트랜스펙션 시약 또는 다른 업계 공지 물리적 수단, 예를 들어 리포좀, 알코올, 폴리리신 풍부 화합물, 아르기닌 풍부 화합물, 인산칼슘, 미세소포, 미세주사, 전기천공 등을 사용하여 전달될 수 있다.

대조적으로, 본원에 개시된 캡시드 미함유 AAV 벡터를 이용한 형질도입은, 다양한 전달 시약을 사용하여 통상적인 AAV 비리온을 형질도입하기 곤란한 세포 및 조직 유형을 효율적으로 표적화할 수 있다.

또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 CNS(예를 들어, 뇌 또는 눈)에 투여된다. ceDNA 벡터는 척수, 뇌간(연수, 교뇌), 중뇌(시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑색질, 송과체), 소뇌, 종뇌(선조체, 후두엽, 측두엽, 두정엽 및 전두엽을 포함하는 대뇌, 피질, 기저핵, 해마 및 편도체), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌 및 하구에 도입될 수 있다. ceDNA 벡터는 망막, 각막 및/또는 시신경과 같은 눈의 다양한 영역에 투여될 수 있다. ceDNA 벡터는 (예를 들어, 요추천자에 의해) 뇌척수액에 전달될 수 있다. ceDNA 벡터는 나아가 혈액-뇌 장벽이 교란된 상황(예를 들어, 뇌종양 또는 뇌경색)에서 CNS에 혈관내 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는, 비제한적으로, 경막내, 안구내, 뇌내, 심실내, 정맥내(예를 들어, 만니톨과 같은 당의 존재 하에서), 비강내, 이내, 안구내(예를 들어, 유리체내, 망막하, 전방) 및 안구주위(예를 들어, 테논낭하(sub-Tenon's region)) 전달뿐 아니라, 운동 뉴런으로의 역행 전달을 통한 근육내 전달을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 경로를 통해 CNS의 목적하는 영역(들)에 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 직접 주사(예를 들어, 정위주사)를 통해 액체 제형으로 CNS 내 목적하는 영역 또는 구획에 투여된다. 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 목적하는 영역에의 국소 적용 또는 에어로졸 제형의 비강내 투여를 통해 제공될 수 있다. 눈에의 투여는 액체 방울의 국소 적용을 통해 이루어질 수 있다. 추가의 대안으로서, ceDNA 벡터는 고체 서방형 제형으로 투여될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,201,898호 참조). 추가의 구현예에서, ceDNA 벡터는 운동 뉴런과 관련된 질환 및 장애(예를 들어, 근위축성 측삭경화증(ALS); 척수성근위축(SMA) 등)를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 역행 수송에 사용될 수 있다. 예를 들어, ceDNA 벡터는 뉴런으로 이동할 수 있는 근육 조직에 전달될 수 있다.

IX. ceDNA 벡터의 추가 용도

본원에 제공된 조성물 및 ceDNA 벡터는 다양한 목적을 위해 전이유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이유전자는, 예를 들어 전이유전자 산물의 기능을 연구하기 위해, 예를 들어 전이유전자를 보유하는 체세포 유전자도입 동물 모델을 생성하기 위해, 연구 목적으로 사용하기 위한 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 또 다른 예에서, 전이유전자는 질환의 동물 모델을 생성하는 데 사용하기 위한 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 전이유전자는 포유류 대상에서 질환 상태 또는 장애의 치료, 예방 또는 개선에 유용한 하나 이상의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩한다. 전이유전자는 유전자의 발현 감소, 발현 결여 또는 기능장애와 연관된 질환을 치료하는 데 충분한 양으로 대상에게 전달(예를 들어, 대상에서 발현)될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이유전자는 유전자 산물의 발현, 활성의 증가, 또는 전이유전자를 억제하거나 다르게는 이의 발현을 감소시키는 유전자의 부적절한 상향조절과 연관된 질환을 치료하는 데 충분한 양으로 대상에게 전달(예를 들어, 대상에서 발현)될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이유전자는 내인성 유전자를 녹아웃시키는 데 사용된다.

X. 사용 방법

본 발명의 ceDNA 벡터는 또한 관심 뉴클레오타이드 서열을 표적세포에 전달하는 방법에 사용될 수 있다. 상기 방법은 특히 관심 치료용 유전자를 이를 필요로 하는 대상의 세포에 전달하는 방법일 수 있다. 본 발명은 폴리펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드의 치료 수준이 발현되도록, 치료용 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드의 생체내 발현을 가능하게 한다. 이러한 결과는 ceDNA 벡터 전달의 생체내 및 시험관내 모델 모두에서 확인되었다.

대상의 세포에 관심 핵산을 전달하는 방법은, 상기 관심 핵산을 포함하는 본 발명의 ceDNA 벡터를 상기 대상에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 관심 핵산을 이를 필요로 하는 대상의 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 관심 핵산을 포함하는 본 발명의 ceDNA 벡터의 다회투여를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 ceDNA 벡터는 면역 반응을 유도하지 않기 때문에, 이러한 다회투여 전략은, 캡시드화된 벡터를 이용하여 관찰된 것과 대조적으로, 본 발명의 ceDNA 벡터에 대한 숙주 면역계 반응에 의해 손상되지 않을 것이다.

ceDNA 벡터 핵산(들)은 목적하는 조직의 세포를 트랜스펙션시키고, 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하는 데 충분한 양으로 투여된다. 전형적인 및 약학적으로 허용 가능한 투여 경로에는, 비제한적으로, 정맥내(예를 들어, 리포좀 제형), 선택된 기관으로의 직접 전달(예를 들어, 간으로의 문맥내 전달), 근육내 및 다른 비경구 투여 경로가 포함된다. 투여 경로는, 목적하는 경우, 조합될 수 있다.

ceDNA 벡터 전달은 한 종의 ceDNA 벡터에 제한되지 않는다. 이와 같이, 또 다른 양태에서, 상이한 외인성 DNA 서열을 포함하는 다수의 ceDNA 벡터가 표적 세포, 조직, 기관 또는 대상에 동시에 또는 순차적으로 전달될 수 있다. 따라서, 이러한 전략은 다수의 유전자의 발현을 가능하게 할 수 있다. 바이러스 캡시드의 부재로 인한 항캡시드 숙주 면역 반응의 결여를 고려할 때, 전달은 또한 중요하게는, 임상 설정에서 유전자 치료를 위해, 후속으로 용량을 증가시키거나 감소시키면서 다회 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 대상에서 질환을 치료하는 방법으로서, 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료적 유효량의 ceDNA 벡터를, 대상의 이를 필요로 하는 표적세포(특히, 근육 세포 또는 조직)에 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. ceDNA 벡터는 담체의 존재 하에서 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 구현된 ceDNA 벡터는 질환을 치료하는 데 유용한 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는, 대상에게 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 목적하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 목적하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 상기 및 본원의 다른 곳에 제공된 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다.

XI. 치료 방법

본원에 기재된 기술은 또한 상기 개시된 ceDNA 벡터를 제조하는 방법뿐 아니라, 예를 들어 현장외, 시험관내 및 생체내 적용, 방법론, 진단 절차 및/또는 유전자 치료 요법을 포함하는 다양한 방식으로 사용하는 방법을 나타낸다.

대상에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료적 유효량의 ceDNA 벡터를, 대상의 이를 필요로 하는 표적세포(예를 들어, 근육 세포 또는 조직, 다른 병든 세포 유형)에 도입하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. ceDNA 벡터는 담체의 존재 하에서 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 구현된 ceDNA 벡터는 질환을 치료하는 데 유용한 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는, 대상에게 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 목적하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 목적하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 상기 및 본원의 다른 곳에 제공된 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다.

임의의 전이유전자는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터에 의해 전달될 수 있다. 관심 전이유전자에는, 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산, 또는 비코딩 핵산(예를 들어, RNAi, miR 등), 바람직하게는 치료용(예를 들어, 의료용, 진단용 또는 수의학용) 또는 면역원성(예를 들어, 백신용) 폴리펩타이드가 포함된다.

특정 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터에 의해 발현되는 전이유전자는 하나 이상의 폴리펩타이드, 펩타이드, 리보자임, 펩타이드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 항체, 항원 결합 단편 또는 이들의 임의의 조합을 발현하거나 인코딩할 것이다.

특히, 질환, 기능장애, 부상 및/또는 장애의 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및/또는 개선에 사용하기 위한 전이유전자는, 비제한적으로, 예를 들어 단백질(들), 폴리펩타이드(들), 펩타이드(들), 효소(들), 항체, 항원 결합 단편뿐 아니라, 변이체 및/또는 이의 활성 단편, 아고니스트, 안타고니스트, 모방체를 포함하는 하나 이상의 치료제(들)을 인코딩할 수 있다. 하나의 양태에서, 질환, 기능장애, 외상, 손상 및/또는 장애는 인간의 질환, 기능장애, 외상, 손상 및/또는 장애이다.

본원에 제시된 바와 같이, 전이유전자는 치료용 단백질 또는 펩타이드, 또는 치료용 핵산 서열 또는 치료제, 비제한적으로 하나 이상의 아고니스트, 안타고니스트, 항세포사멸 인자, 저해제, 수용체, 사이토카인, 세포독소, 에리트로포이에틴제, 당단백질, 성장인자, 성장인자 수용체, 호르몬, 호르몬 수용체, 인터페론, 인터루킨, 인터루킨 수용체, 신경 성장인자, 신경활성 펩타이드, 신경활성 펩타이드 수용체, 프로테아제, 프로테아제 저해제, 단백질 데카르복실라아제, 단백질 키나아제, 단백질 키나아제 저해제, 효소, 수용체 결합 단백질, 수송 단백질 또는 이의 하나 이상의 저해제, 세로토닌 수용체, 또는 이의 하나 이상의 흡수 저해제, 세르핀, 세르핀 수용체, 종양 억제제, 진단용 분자, 화학요법제, 세포독소, 또는 이들의 임의의 조합을 인코딩할 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 발현 카세트, 발현 구조체 또는 ceDNA 벡터 내 전이유전자는 숙주세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다. 본원에 사용된 "코돈 최적화된" 또는 "코돈 최적화"라는 용어는, 관심 척추동물, 예를 들어 마우스 또는 인간(예를 들어, 인간화)의 세포에서 발현 증강을 위해 핵산 서열을 변경하는 과정으로서, 천연 서열(예를 들어, 원핵생물 서열) 중 적어도 하나, 하나 초과 또는 유의한 수의 코돈을, 해당 척추동물의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하는 과정을 나타낸다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 전형적으로, 코돈 최적화는 원래 번역된 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 최적화된 코돈은, 예를 들어 Aptagen's Gene Forge® 코돈 최적화 및 맞춤형 유전자 합성 플랫폼(Aptagen, Inc.), 또는 또 다른 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스를 사용하여 결정될 수 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 대상 숙주세포에서 전이유전자를 발현한다. 일부 구현예에서, 대상 숙주세포는, 예를 들어 혈액세포, 줄기세포, 조혈세포, CD34⁺ 세포, 간세포, 암세포, 혈관세포, 근육세포, 췌장세포, 신경세포, 안구 또는 망막 세포, 상피 또는 내피 세포, 수지상세포, 섬유아세포를 포함하는 인간 숙주세포, 또는 비제한적으로, 간의(hepatic)(즉, 간) 세포, 폐세포, 심장세포, 췌장세포, 장세포, 횡격막세포, 신장의(renal)(즉, 신장) 세포, 신경세포, 혈액세포, 골수세포, 또는 유전자 치료가 고려되는 대상의 임의의 하나 이상의 선택된 조직세포를 포함하는 포유류 기원의 임의의 다른 세포이다. 하나의 양태에서, 대상 숙주세포는 인간 숙주세포이다.

하나 이상의 본 발명의 ceDNA 벡터를, 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 완충제, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 ceDNA 벡터 조성물이 본원에 개시된다. 이러한 조성물은 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능장애의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선시키기 위한, 하나 이상의 진단용 또는 치료용 키트에 포함될 수 있다. 하나의 양태에서, 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능장애는 인간의 질환, 손상, 장애, 외상 또는 기능장애이다.

본원에 기재된 기술의 또 다른 양태는, 진단적 또는 치료적 유효량의 ceDNA 벡터를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하는 방법으로서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 양을 이를 필요로 하는 대상의 세포, 조직 또는 기관에; ceDNA 벡터로부터 전이유전자의 발현을 가능하게 하는 데 효과적인 시간 동안 제공하여, 대상에게 ceDNA 벡터에 의해 발현된 진단적 또는 치료적 유효량의 단백질, 펩타이드, 핵산을 제공하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 추가의 양태에서, 대상은 인간이다.

본원에 기재된 기술의 또 다른 양태는, 대상에서 질환, 장애, 기능장애, 손상, 비정상적인 병태 또는 외상의 적어도 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 전반적이고 일반적인 의미에서, 상기 방법은 적어도, 하나 이상의 상기 개시된 ceDNA 벡터를, 이를 필요로 하는 대상에게, 대상에서 질환, 장애, 기능장애, 손상, 비정상적인 병태 또는 외상의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하는 데 충분한 양으로 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 적어도 포함한다. 추가의 양태에서, 대상은 인간이다.

또 다른 양태는 질환 또는 질환 상태의 하나 이상의 증상을 치료하거나 감소시키는 도구로서의 ceDNA 벡터의 용도이다. 결함이 있는 유전자가 공지된 다수의 유전병이 존재하며, 이는 전형적으로 2개의 부류로 분류된다: 일반적으로 열성 방식으로 유전되는 효소의 결핍 상태, 및 조절 또는 구조 단백질이 관여할 수 있으며, 전형적으로 우성 방식으로 유전되지만, 항상 우성 방식으로 유전되는 것은 아닌 불균형 상태. 결핍 상태 질환의 경우, ceDNA 벡터는 대체 요법을 위해 병든 조직에 정상 유전자를 가져오기 위해, 일부 구현예에서는, 안티센스 돌연변이를 사용하여 질환에 대한 동물 모델을 생성하기 위해 전이유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 불균형 질환 상태의 경우, ceDNA 벡터는 모델 시스템에서 질환 상태를 생성하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 질환 상태에 대응하기 위한 노력으로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 ceDNA 벡터 및 방법은 유전 질환의 치료를 가능하게 한다. 본원에 사용된 질환 상태는, 질환을 유발하거나 이를 더 중증으로 만드는 결핍 또는 불균형을 부분적으로 또는 전체적으로 개선하는 방식으로 치료된다.

일반적으로, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 유전자 발현과 관련된 임의의 장애와 연관된 증상을 치료, 예방 또는 개선시키기 위해 임의의 전이유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 상태에는, 비제한적으로, 낭성섬유증(및 다른 폐의 질환), A형 혈우병, B형 혈우병, 지중해빈혈, 빈혈 및 다른 혈액 장애, AIDS, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증, 뇌전증, 및 다른 신경계 장애, 암, 진성 당뇨병, 근디스트로피(예를 들어, 뒤시엔느(Duchenne)형, 베커(Becker)형), 헐러병(Hurler's disease), 아데노신 데아미나아제 결핍증, 대사 결함, 망막 퇴행성 질환(및 다른 눈의 질환), 미토콘드리아병증(예를 들어, 레버 유전성 시신경 위축증(LHON: Leber's hereditary optic neuropathy), 리증후군(Leigh syndrome), 및 아급성 경화성 뇌병증), 근병증(예를 들어, 안면견갑상완 근병증(FSHD) 및 심근병증), 고형 기관(예를 들어, 뇌, 간, 신장, 심장)의 질환 등이 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 대사장애(예를 들어, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍증)을 앓고 있는 개체의 치료에 유리하게 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 유전자 또는 유전자 산물에서 돌연변이에 의해 유발되는 질환 또는 장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다. ceDNA 벡터로 치료될 수 있는 예시적인 질환 또는 장애에는, 비제한적으로, 대사 질환 또는 장애(예를 들어, 파브리병(Fabry disease), 고셔병(Gaucher disease), 페닐케톤뇨증(PKU), 글리코겐 축적 질환); 요소회로 질환 또는 장애(예를 들어, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증); 리소좀 축적 질환 또는 장애(예를 들어, 이염성 백질디스트로피(MLD), 제2형 점액다당류증(MPSII; 헌터증후군(Hunter syndrome))); 간 질환 또는 장애(예를 들어, 진행성 가족성 간내 담즙정체(PFIC); 혈액 질환 또는 장애(예를 들어, 혈우병(A형 및 B형), 지중해빈혈 및 빈혈); 암 및 종양, 및 유전 질환 또는 장애(예를 들어, 낭성섬유증)가 포함된다.

추가의 양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 전이유전자 발현 수준(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 호르몬 또는 성장인자를 인코딩하는 전이유전자)을 조절하는 것이 바람직한 상황에 이종 뉴클레오타이드 서열을 전달하는 데 이용될 수 있다. 하나의 예로서, 전이유전자는 표적 유전자의 발현 또는 활성을 제어하는 경로를 저해할 수 있다. 또 다른 예로서, 전이유전자는 표적 유전자의 발현 또는 활성을 제어하는 경로의 활성을 증강시킬 수 있다.

따라서, 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA 벡터는 질환 또는 장애를 초래하는 유전자 산물의 비정상적인 수준 및/또는 기능(예를 들어, 단백질의 부재 또는 이의 결함)을 교정하는 데 사용될 수 있다. ceDNA 벡터는 기능성 단백질을 생성하고/하거나 단백질 수준을 변경시켜, 단백질의 부재 또는 결함에 의해 유발되는 특정 질환 또는 장애로 인해 발생한 증상을 완화 또는 감소시키거나, 이에 유익을 부여할 수 있다. 예를 들어, OTC 결핍증의 치료는 기능성 OTC 효소를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; A형 및 B형 혈우병의 치료는 인자 VIII, 인자 IX 및 인자 X의 수준을 변경하는 방식으로 달성될 수 있고; PKU의 치료는 페닐알라닌 히드록실라아제 효소의 수준을 변경하는 방식으로 달성될 수 있고; 파브리병 또는 고셔병의 치료는, 각각, 기능성 알파 갈락토시다아제 또는 베타 글루코세레브로시다아제를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; MLD 또는 MPSII의 치료는, 각각, 기능성 아릴설파타아제 A 또는 이두로네이트-2-설파타아제를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; 낭성섬유증의 치료는 기능성 낭성섬유증 막관통 전도 조절제를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; 글리코겐 축적 질환의 치료는 기능성 G6Pase 효소 기능을 회복시키는 방식으로 달성될 수 있고; PFIC의 치료는 기능성 ATP8B1, ABCB11, ABCB4 또는 TJP2 유전자를 생성하는 방식으로 달성될 수 있다.

대안적인 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 안티센스 핵산을 시험관내 또는 생체내 세포에 제공하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자가 RNAi 분자인 경우, 표적세포 내 안티센스 핵산 또는 RNAi의 발현은 세포에 의한 특정 단백질의 발현을 감소시킨다. 따라서, RNAi 분자 또는 안티센스 핵산인 전이유전자는 이를 필요로 하는 대상에서 특정 단백질의 발현을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 안티센스 핵산은 또한 세포 생리학을 조절하기 위해, 예를 들어 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하기 위해 시험관내 세포에 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 인코딩된 예시적인 전이유전자에는, 비제한적으로, 리소좀 효소(예를 들어, 테이-삭스병(Tay-Sachs disease)과 연관된 헥소사미니다아제 A, 또는 헌터증후군/MPS II와 연관된 이두로네이트 설파타아제), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 수퍼옥시드 디스뮤타아제, 글로빈, 렙틴, 카탈라아제, 티로신 히드록실라아제뿐 아니라, 사이토카인(예를 들어, 인터페론, β-인터페론, 인터페론-γ, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 인터루킨 12, 과립구-대식세포 집락자극인자, 림프독소 등), 펩타이드 성장인자 및 호르몬(예를 들어, 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린 유사 성장인자 1 및 2, 혈소판유래 성장인자(PDGF), 표피성장인자(EGF), 섬유아세포성장인자(FGF), 신경성장인자(NGF), 신경영양인자-3 및 4, 뇌유래신경영양인자(BDNF), 신경교유래성장인자(GDNF), 형질전환성장인자-α 및 -β, 등), 수용체(예를 들어, 종양괴사인자 수용체)가 포함된다. 일부 예시적인 구현예에서, 전이유전자는 하나 이상의 목적하는 표적에 특이적인 단클론 항체를 인코딩한다. 일부 예시적인 구현예에서, 하나 초과의 전이유전자가 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 예시적인 구현예에서, 전이유전자는 2개의 상이한 관심 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 전이유전자는 본원에 정의된 바와 같은 전장 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 항체는 본원에 정의된 바와 같은 항원-결합 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열이다. 다른 예시적인 전이유전자 서열은 자살 유전자 산물(티미딘 키나아제, 시토신 데아미나아제, 디프테리아 독소, 시토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나아제 및 종양괴사인자), 암 치료에 사용되는 약물에 내성을 부여하는 단백질, 및 종양 억제 유전자 산물을 인코딩한다.

대표적인 구현예에서, ceDNA 벡터에 의해 발현되는 전이유전자는 이를 필요로 하는 대상에서 근디스트로피를 치료하는 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 본원에 기재된 ceDNA 벡터의 치료, 개선 또는 예방적 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 ceDNA 벡터는 디스트로핀, 미니-디스트로핀, 마이크로-디스트로핀, 미오스타틴 프로펩타이드, 폴리스타틴, 액티빈 II형 가용성 수용체, IGF-1, 항염증성 폴리펩타이드, 예컨대 I카파 B 우성 돌연변이체, 사르코스판(sarcospan), 우트로핀(utrophin), 마이크로-디스트로핀, 라미닌-α2, α-사르코글리칸(sarcoglycan), β-사르코글리칸, γ-사르코글리칸, δ-사르코글리칸, IGF-1, 미오스타틴 또는 미오스타틴 프로펩타이드에 대한 항체 또는 항체 단편, 및/또는 미오스타틴에 대한 RNAi를 인코딩하는 이종 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는, 통상적으로 혈액에서 순환하는 폴리펩타이드(예를 들어, 효소) 또는 기능성 RNA(예를 들어, RNAi, microRNA, 안티센스 RNA)의 생산을 위해, 또는 장애(예를 들어, 당뇨병(예를 들어, 인슐린), 혈우병(예를 들어, VIII), 점액다당류 장애(예를 들어, 슬라이증후군, 헐러증후군, 샤이에증후군, 헐러-샤이에증후군, 헌터증후군, 산필리포증후군 A, B, C, D, 모르키오증후군, 마로토-라미증후군 등) 또는 리소좀 축적 장애(예컨대, 고셔병[글루코세레브로시다아제], 폼페병[리소좀 산 α-글루코시다아제] 또는 파브리병[α-갈락토시다아제 A]) 또는 글리코겐 축적 장애(예컨대, 폼페병[리소좀 산 α-글루코시다아제]와 같은 대사장애)를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해 다른 조직으로의 전신 전달을 위해, 골격, 심장 및/또는 횡격막 근육에 전이유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 대사장애를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 다른 적합한 단백질은 상기 기재되어 있다.

다른 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 이를 필요로 하는 대상에서의 대사장애를 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법에서 전이유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 대사장애 및 폴리펩타이드를 인코딩하는 전이유전자는 본원에 기재되어 있다. 선택적으로, 폴리펩타이드가 분비된다(예를 들어, 천연 상태의 분비된 폴리펩타이드이거나, 예를 들어 당업계에 공지된 바와 같은 분비 신호 서열과 작동 가능한 결합에 의해 분비되도록 조작된 폴리펩타이드).

본 발명의 또 다른 양태는, 선천성 심부전 또는 PAD의 치료를 필요로 하는 대상에서 이를 치료, 개선 및/또는 예방하는 방법으로서, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터를 포유류 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 ceDNA 벡터는, 예를 들어 근육세포질 내부세망(sarcoplasmic endoreticulum) Ca²⁺-ATPase(SERCA2a), 혈관형성인자, 포스파타아제 저해제 I(I-1), 포스포람반(phospholamban)에 대한 RNAi; 포스포람반 저해 또는 우성-음성 분자, 예컨대 포스포람반 S16E, 포스포람반 유전자를 조절하는 아연 핑거 단백질, β2-아드레날린 수용체, .베타.2-아드레날린 수용체 키나아제(BARK), PI3 키나아제, 칼사르칸(calsarcan), .베타.-아드레날린 수용체 키나아제 저해제(βARKct), 단백질 포스파타아제 1의 저해제 1, S100A1, 파르브알부민(parvalbumin), 아데닐릴 시클라아제 6형, G-단백질 결합 수용체 키나아제 2형 녹다운에 영향을 미치는 분자, 예컨대 절단된 구성적으로 활성인 βARKct, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, 칼리크레인(kallikrein), HIF, 티모신(thymosin)-β4, mir-1, mir-133, mir-206 및/또는 mir-208을 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 임의의 적합한 수단에 의해, 선택적으로 대상이 흡입하는 ceDNA 벡터를 포함하는 호흡 가능한 입자의 에어로졸 현탁액을 투여하는 방식으로 대상의 폐에 투여될 수 있다. 호흡 가능한 입자는 액체 또는 고체일 수 있다. ceDNA 벡터를 포함하는 액체 입자의 에어로졸은 당업자에게 공지된 바와 같은 압력 구동 에어로졸 분무기 또는 초음파 분무기와 같은 임의의 적합한 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,501,729호 참조. ceDNA 벡터를 포함하는 고체 입자의 에어로졸은 마찬가지로 약학 분야에 공지된 기술에 의해 임의의 고체 미립자 약제 에어로졸 생성기를 이용하여 생성될 수 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 CNS의 조직(예를 들어, 뇌, 눈)에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터 유전적 장애, 신경변성장애, 정신과 장애 및 종양을 포함하는 CNS의 질환을 치료, 개선 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. 예시적인 CNS 질환에는, 비제한적으로, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 카나반병, 리병, 레프숨병, 뚜렛증후군, 원발성 측삭경화증, 근위축성 측삭경화증, 진행성 근위축증, 픽병, 근디스트로피, 다발경화증, 중증근무력증, 빈스방거병, 척수 또는 두부 손상으로 인한 외상, 테이-삭스병, 레쉬-니한병, 뇌전증, 뇌경색증, 기분장애(예를 들어, 우울증, 양극성 정동장애, 지속성 정동장애, 2차 기분장애), 조현병, 약물의존(예를 들어, 알코올중독 및 다른 물질 의존증), 신경증(예를 들어, 불안, 강박장애, 신체형장애, 해리장애, 슬픔, 산후우울증), 정신병(예를 들어, 환각 및 망상), 치매, 편집증, 주의력결핍장애, 정신성적장애, 수면장애, 통증장애, 섭식 또는 체중 장애(예를 들어, 비만, 악액질, 신경성식욕부진증 및 신경성거식증)를 포함하는 정신과 장애, 및 CNS의 암 및 종양(예를 들어, 뇌하수체 종양)이 포함된다.

본 발명의 ceDNA 벡터로 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 안구 장애에는, 망막, 후방로 및/또는 시신경과 관련된 안과적 장애(예를 들어, 색소성망막염, 당뇨망막병증 및 다른 망막변성질환, 포도막염, 연령관련 황반변성, 녹내장)가 포함된다. 다수의 안과적 질환 및 장애는 (1) 혈관형성, (2) 염증, 및 (3) 변성의 3가지 유형의 징후 중 하나 이상과 연관이 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 항혈관형성 인자; 항염증 인자; 세포 변성을 지연시키거나, 세포 감축을 촉진시키거나, 세포 성장을 촉진시키는 인자, 및 이들의 조합을 전달하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, 당뇨망막병증은 혈관형성을 특징으로 한다. 당뇨망막병증은 하나 이상의 항혈관형성 인자를 안구내로(예를 들어, 유리체에) 또는 안구주위로(예를 들어, 테논낭하에) 전달하는 방식으로 치료될 수 있다. 하나 이상의 신경영양인자가 또한 안구내로(예를 들어, 유리체내로) 또는 안구주위로 공동 전달될 수 있다. 본 발명의 ceDNA 벡터로 치료, 개선 또는 예방될 수 있는 추가의 안구 질환에는, 지도형위축, 혈관 또는 "습윤형" 황반변성, 스타가르트병, 레베르 선천성 흑암시(LCA), 어셔증후군, 탄성섬유가황색종(PXE), x연관 색소성망막염(XLRP), x연관 망막층간분리(XLRS), 범맥락막위축, 레베르 유전성 시신경병증(LHON), 완전색맹, 추체-간체 디스트로피, 푹스각막내피이상증, 당뇨병성 황반부종, 및 안구의 암 및 종양이 포함된다.

일부 구현예에서, 염증성 안구 질환 또는 장애(예를 들어, 포도막염)가 본 발명의 ceDNA 벡터에 의해 치료, 개선 또는 예방될 수 있다. 하나 이상의 항염증 인자는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 안구내(예를 들어, 유리체 또는 전방) 투여에 의해 발현될 수 있다. 다른 구현예에서, 망막변성을 특징으로 하는 안구 질환 또는 장애(예를 들어, 색소성망막염)가 본 발명의 ceDNA 벡터에 의해 치료, 개선 또는 예방될 수 있다. 하나 이상의 신경영양인자를 인코딩하는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 안구내 투여(예를 들어, 유리체 투여)가 이러한 망막변성을 기반으로 하는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈관형성 및 망막변성 둘 모두가 관여하는 질환 또는 장애(예를 들어, 연령관련 황반변성)가 본 발명의 ceDNA 벡터로 치료될 수 있다. 연령관련 황반변성은 하나 이상의 신경영양인자를 인코딩하는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 안구내로(예를 들어, 유리체에) 투여하고/하거나 하나 이상의 항혈관형성인자를 인코딩하는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 안구내로 또는 안구주위로(예를 들어, 테논낭하에) 투여하는 방식으로 치료될 수 있다. 녹내장은 안압 증가와 망막 신경절 세포의 손실을 특징으로 한다. 녹내장의 치료는, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 사용하여 세포를 흥분독성 손상으로부터 보호하는 하나 이상의 신경보호제의 투여를 포함한다. 따라서, 이러한 작용제에는 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA) 안타고니스트, 사이토카인 및 신경영양인자가 포함되며, 이는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 사용하여 안구내로, 선택적으로 유리체내로 전달될 수 있다.

다른 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 발작을 치료하기 위해, 예를 들어 발작의 개시, 발병 또는 중증도를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 발작의 치료적 치료의 효능은 거동(예를 들어, 오한, 눈 또는 입의 틱) 및/또는 전위기록 수단(electrographic mean)(대부분의 발작은 특정한 전위기록상 비정상을 나타냄)에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 또한 시간의 경과에 따른 다발성 발작으로 표시되는 뇌전증을 치료하는 데 사용될 수 있다. 하나의 대표적인 구현예에서, 소마토스타틴(또는 이의 활성 단편)이 뇌하수체 종양을 치료하기 위해 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터를 사용하여 뇌에 투여된다. 이러한 구현예에 따르면, 소마토스타틴(또는 이의 활성 단편)을 인코딩하는 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 미세주입에 의해 뇌하수체에 투여된다. 마찬가지로, 이러한 치료는 말단비대증(뇌하수체로부터의 비정상적인 성장호르몬 분비)을 치료하는 데 사용될 수 있다. 소마토스타틴의 핵산(예를 들어, GenBank 수탁번호 J00306) 및 아미노산(예를 들어, GenBank 수탁번호 P01166; 처리된 활성 펩타이드인 소마토스타틴-28 및 소마토스타틴-14를 함유함) 서열은 당업계에 공지되어 있다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 미국 특허 제7,071,172호에 기재된 바와 같은 분비 신호를 포함하는 전이유전자를 인코딩할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 대상의 생체내로의 전신 전달을 위해 안티센스 RNA, RNAi 또는 다른 기능성 RNA(예를 들어, 리보자임)를 생성하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터의 용도에 관한 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 안티센스 핵산, 리보자임(예를 들어, 미국 특허 제5,877,022호에 기재된 바와 같음), 스플라이소좀(spliceosome) 매개 트랜스-스플라이싱에 영향을 미치는 RNA(문헌[Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246]; 미국 특허 제6,013,487호; 미국 특허 제6,083,702호 참조), 유전자 침묵을 매개하는 간섭 RNA(RNAi)(문헌[Sharp et al., (2000) Science 287:2431] 참조) 또는 다른 미번역 RNA, 예컨대 "가이드" RNA(문헌[Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929]; 미국 특허 제5,869,248호(Yuan et al.)) 등을 인코딩하는 전이유전자를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 리포터 폴리펩타이드(예를 들어, 녹색 형광 단백질 또는 알칼리성 포스파타아제와 같은 효소)를 인코딩하는 전이유전자를 또한 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 실험 또는 진단 목적에 유용한 리포터 단백질을 인코딩하는 전이유전자는, β-락타마아제, β-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리성 포스파타아제, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시퍼라아제 및 당업계에 널리 공지된 다른 것들 중 임의의 것에서 선택된다. 일부 양태에서, 리포터 폴리펩타이드를 인코딩하는 전이유전자를 포함하는 ceDNA 벡터는 진단 목적으로, 또는 이것이 투여되는 대상에서 ceDNA 벡터 활성의 마커로서 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는, 숙주 염색체 상의 유전자좌와 상동성을 공유하고 이와 재조합되는, 전이유전자 또는 이종 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 접근법은 숙주세포에서 유전자 결함을 교정하는 데 이용될 수 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 대상에서 면역원성 폴리펩타이드를 발현하는 데 사용될 수 있는, 예를 들어 백신접종을 위한 전이유전자를 포함할 수 있다. 전이유전자는, 비제한적으로, 인간면역결핍바이러스, 인플루엔자바이러스, gag 단백질, 종양 항원, 암 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원 등으로부터의 면역원을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 관심 면역원을 인코딩할 수 있다.

XII. 투여

특정 구현예에서, 다양한 간격의 기간, 예를 들어 매일, 매주, 매월, 매년 등에 걸쳐 목적하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 1회 초과의 투여(예를 들어, 2회, 3회, 4회 또는 그 이상의 투여)가 이용될 수 있다.

본원에 개시된 ceDNA 벡터의 예시적인 투여 방식에는, 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측(예를 들어, 설하), 질, 경막내, 안구내, 경피, 내피내, 자궁내(또는 알내(in ovo)), 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 두개내, 근육내[골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에의 투여 포함], 흉막내, 뇌내 및 관절내), 국소(예를 들어, 기도 표면을 포함한 피부 및 점막 표면, 및 경피 투여), 림프내 등뿐 아니라, (예를 들어, 간, 눈, 골격근, 심장근, 횡격막근 또는 뇌에의) 직접적인 조직 또는 기관 주사가 포함된다.

ceDNA 벡터의 투여는, 비제한적으로, 뇌, 골격근, 평활근, 심장, 횡격막, 기도 상피, 간, 신장, 비장, 췌장, 피부 및 눈으로 이루어지는 군에서 선택되는 부위를 포함하는 대상의 임의의 부위에 이루어질 수 있다. ceDNA 벡터의 투여는 또한 종양에(예를 들어, 종양 또는 림프절에 또는 근처에) 이루어질 수 있다. 임의의 주어진 경우에서 가장 적합한 경로는 치료, 개선 및/또는 예방하고자 하는 병태의 특성 및 중증도에 따라, 및 사용되는 특정 ceDNA 벡터의 특성에 따라 달라질 것이다. 또한, ceDNA는 하나 초과의 전이유전자를 단일 벡터 또는 다수의 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 칵테일)로 투여하는 것을 가능하게 한다.

본 발명에 따른 골격근에의 본원에 개시된 ceDNA 벡터의 투여는, 비제한적으로, 사지(예를 들어, 상완(upper arm), 하완(lower arm), 상각(upper leg) 및/또는 하각(lower leg)), 등, 목, 머리(예를 들어, 혀), 흉곽, 복부, 골반/회음 및/또는 손(발)가락의 골격근에의 투여를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 사지 관류(선택적으로, 다리 및/또는 팔의 격리된 사지 관류; 예를 들어[Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464] 참조), 및/또는 직접 근육내 주사에 의해 골격근에 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 사지 관류, 선택적으로 격리된 사지 관류에 의해(예를 들어, 정맥내 또는 관절내 투여에 의해), 대상(예를 들어, DMD와 같은 근디스트로피를 앓고 있는 대상)의 사지(팔 및/또는 다리)에 투여된다. 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 "유체역학적" 기술을 이용하지 않고 투여될 수 있다.

심장근에의 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터의 투여는, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실 및/또는 격막에의 투여를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 정맥내 투여, 대동맥내 투여와 같은 동맥내 투여, 직접 심장 주사(예를 들어, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실에) 및/또는 관상동맥 관류에 의해 심장근에 전달될 수 있다. 횡격막근에의 투여는, 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복강내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 평활근에의 투여는, 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복강내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여는 평활근에, 근처에 및/또는 위에 존재하는 내피세포에 이루어질 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 ceDNA 벡터는 (예를 들어, 근디스트로피 또는 심장질환(예를 들어, PAD 또는 울혈성 심부전)을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해) 골격근, 횡격막근 및/또는 심장근에 투여된다.

A. 생체외 치료

일부 구현예에서, 대상에서 세포가 제거되고, ceDNA 벡터가 그 안에 도입된 후, 세포가 다시 대상에 배치된다. 생체외 치료를 위해 대상에서 세포를 제거한 후, 다시 대상에게 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호; 상기 문헌의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 대안적으로, ceDNA 벡터는 또 다른 대상의 세포, 배양된 세포 또는 임의의 다른 적합한 공급원의 세포에 도입되며, 세포는 이를 필요로 하는 대상에게 투여된다.

ceDNA 벡터로 형질도입된 세포는 바람직하게는 약학적 담체와 조합으로 "치료적 유효량"으로 대상에게 투여된다. 당업자는, 일부 유익이 대상에게 제공되는 한, 치료 효과가 완전하거나 치유적일 필요가 없다는 것을 이해할 것이다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 바람직하게는 시험관내, 생체외, 또는 생체내 세포에서 생성되는 임의의 폴리펩타이드인 전이유전자(때때로 이종 뉴클레오타이드 서열로 지칭됨)를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 본원에 논의된 치료 방법에서의 ceDNA 벡터의 사용과 대조적으로, 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는, 예를 들어 항원 또는 백신의 생산을 위해 배양된 세포 및 이로부터 단리된 발현된 유전자 산물에 도입될 수 있다.

ceDNA 벡터는 수의학적 및 의학적 적용에 모두 사용될 수 있다. 상기 기재된 바와 같은 생체외 유전자 전달 방법에 적합한 대상에는, 조류(예를 들어, 닭, 오리, 거위, 메추라기, 칠면조 및 꿩) 및 포유류(예를 들어, 인간, 소, 양, 염소, 말, 고양이, 개 및 토끼)가 모두 포함되며, 이 중 포유류가 바람직하다. 인간 대상이 가장 바람직하다. 인간 대상에는, 신생아, 유아, 청소년 및 성인이 포함된다.

본원에 기재된 기술의 하나의 양태는, 전이유전자를 세포에 전달하는 방법에 관한 것이다. 전형적으로, 시험관내 방법의 경우, ceDNA 벡터는 본원에 개시된 바와 같은 방법뿐 아니라, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 바람직하게는 생물학적 유효량으로 세포에 투여된다. ceDNA 벡터가 생체내 세포(예를 들어, 대상)에게 투여되는 경우, ceDNA 벡터의 생물학적 유효량은 표적세포에서 전이유전자의 형질도입 및 발현을 유도하는 데 충분한 양이다.

B. 용량 범위

생체내 및/또는 시험관내 검정은 선택적으로 사용을 위한 최적 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 이용될 수 있다. 제형에 이용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 병태의 중증도에 따라 달라질 것이며, 당업자의 판단 및 각 대상의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 유도된 용량 반응 곡선에서 추론될 수 있다.

ceDNA 벡터는 목적하는 조직의 세포를 트랜스펙션시키고, 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하는 데 충분한 양으로 투여된다. 통상적이고 약학적으로 허용 가능한 투여 경로에는, 비제한적으로, 선택된 기관에의 직접 전달(예를 들어, 간에의 문맥내 전달), 경구, 흡입(비강내 및 기관내 전달 포함), 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 종양내 및 다른 비경구 투여 경로와 같은 "투여" 섹션에 상기 기재된 것들이 포함된다. 투여 경로는, 목적하는 경우, 조합될 수 있다.

특정 "치료 효과"를 달성하는 데 필요한 ceDNA 벡터의 양의 용량은, 비제한적으로, 핵산 투여 경로, 치료 효과를 달성하는 데 필요한 유전자 또는 RNA 발현 수준, 치료하고자 하는 특정 질환 또는 장애, 및 유전자(들), RNA 산물(들) 또는 생성되는 발현된 단백질(들)의 안정성을 포함하는 몇 가지 인자에 기반하여 달라질 것이다. 당업자는, 상기 언급된 인자뿐 아니라, 당업계에 널리 공지된 다른 인자를 기반으로, 특정 질환 또는 장애를 앓고 있는 환자를 치료하기 위한 ceDNA 벡터 용량 범위를 용이하게 결정할 수 있다.

투여 요법은 최적 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 반복적으로 투여될 수 있으며, 예를 들어 수회 용량이 매일 투여될 수 있거나, 용량이 치료 상황의 긴급성에 따라 지시된 바와 같이 비례적으로 감소될 수 있다. 당업자는 올리고뉴클레오티드가 세포에 투여되는지 대상에 투여되는지에 관계없이, 대상 올리고뉴클레오티드의 적절한 용량 및 투여 스케줄을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.

"치료적 유효 용량"은 임상 시험을 통해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위에 속할 것이며, 특정 적용에 따라 달라질 것이다(신경세포는 매우 소량을 필요로 하지만, 전신 주사는 많은 양을 필요로 할 수 있음). 예를 들어, 인간 대상의 골격 또는 심장 근육에의 직접 생체내 주사의 경우, 치료적 유효 용량은 약 1 μg 내지 100 g의 ceDNA 벡터 정도일 것이다. 엑소좀 또는 미세입자가 ceDNA 벡터를 전달하는 데 사용되는 경우, 치료적 유효 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 1 μg 내지 약 100 g의 벡터를 전달할 것으로 예상된다.

약학적으로 허용 가능한 부형제와 담체 용액의 제형은, 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하는 적합한 투여 및 치료 요법의 개발과 마찬가지로, 당업자에게 널리 공지되어 있다.

시험관내 트랜스펙션의 경우, 세포(1x10⁶개의 세포)에 전달되는 ceDNA 벡터의 유효량은, 0.1 μg 내지 100 μg, 바람직하게는 1 μg 내지 20 μg, 더욱 바람직하게는 1 μg 내지 15 μg 또는 8 μg 내지 10 μg 정도의 ceDNA 벡터일 것이다. ceDNA 벡터가 클수록 더 높은 용량이 필요할 것이다. 엑소좀 또는 미세입자가 사용되는 경우, 효과적인 시험관내 용량은 실험적으로 결정될 수 있지만, 일반적으로 동일한 양의 ceDNA 벡터를 전달하도록 의도될 것이다.

치료는 단회투여 또는 다회투여를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 1회 초과의 용량이 대상에게 투여될 수 있으며; ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드의 부재로 인해 항캡시드 숙주 면역 반응을 일으키지 않기 때문에, 사실 필요한 경우 다회 용량이 투여될 수 있다. 이와 같이, 당업자는 적절한 용량의 횟수를 용이하게 결정할 수 있다. 투여되는 용량의 횟수는, 예를 들어 1회 내지 100회, 바람직하게는 2회 내지 20회 용량 정도일 수 있다.

임의의 특정 이론에 구애됨 없이, 본 개시내용에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터의 투여에 의해 유발된 전형적인 항바이러스 면역 반응의 결여는(즉, 캡시드 구성요소의 부재)는, ceDNA 벡터가 숙주에 여러 차례 투여되는 것을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 이종 핵산이 대상에게 전달되는 경우의 횟수는, 2회 내지 10회 범위(예를 들어, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회)이다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 대상에게 10회 초과로 전달된다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 달력일(calendar day)(예를 들어, 24시간 기간)당 1회 이하로 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 2달력일, 3달력일, 4달력일, 5달력일, 6달력일 또는 7달력일당 1회 이하로 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 달력주(calendar week)(예를 들어, 7달력일)당 1회 이하로 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 2주에 1회(예를 들어, 2달력주 기간 중 1회) 이하로 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 달력달(calendar month)당 1회(예를 들어, 30달력일 중 1회) 이하로 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 6달력달당 1회 이하로 투여된다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터의 용량은 대상에게 달력년(예를 들어, 365일 또는 윤년의 경우 366일)당 1회 이하로 투여된다.

C. 단위 투여 형태

일부 구현예에서, 약학적 조성물은 단위 투여 형태로 존재할 수 있다. 단위 투여 형태는 전형적으로 약학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 맞게 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 흡입에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 기화기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 분무기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 에어로졸 생성기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경구 투여, 협측 투여 또는 설하 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경막내 또는 뇌실내 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 수 있다.

XIII. 다양한 적용

본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 및 조성물은 숙주세포에 핵산 서열(예를 들어, 치료용 핵산 서열)을 도입하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 및 조성물은 숙주세포에 핵산 서열(예를 들어, 치료용 핵산 서열)을 도입하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 치료용 핵산 서열의 발현은 조절 가능한 스위치의 제어 하에 있다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터를 사용한 숙주세포에의 핵산 서열의 도입은, 유전자 발현을 평가하기 위해 치료된 환자로부터의 적절한 바이오마커를 이용하여 모니터링될 수 있다.

일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터는, 예를 들어 현장외, 시험관내 및 생체내 적용, 방법론, 진단 절차 및/또는 유전자 치료 요법을 포함하는 다양한 방식으로 사용될 수 있다.

일부 구현예에 따르면, 본원에 제공된 조성물 및 ceDNA 벡터는 상기 기재된 바와 같은 다양한 목적을 위해 전이유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전이유전자는, 예를 들어 전이유전자 산물의 기능을 연구하기 위해, 예를 들어 전이유전자를 보유하는 체세포 유전자도입 동물 모델을 생성하기 위해, 연구 목적으로 사용하기 위한 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다. 또 다른 예에서, 전이유전자는 질환의 동물 모델을 생성하는 데 사용하기 위한 단백질 또는 기능성 RNA를 인코딩한다.

일부 구현예에서, 전이유전자는 포유류 대상에서 질환 상태의 치료, 개선 또는 예방에 유용한 하나 이상의 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩한다. 전이유전자는 유전자의 발현 감소, 발현 결여 또는 기능장애와 연관된 질환을 치료하는 데 충분한 양으로 환자에게 전달(예를 들어, 환자에서 발현)될 수 있다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터는, 전이유전자가 세포 배양 시스템, 또는 대안적으로, 유전자도입 동물 모델에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현되는, 진단 및 스크리닝 방법에서의 사용이 고려된다.

본원에 기재된 기술의 또 다른 양태는 포유류 세포 집단을 형질도입시키는 방법을 제공한다. 전반적이고 일반적인 의미에서, 상기 방법은 적어도, 집단의 하나 이상의 세포에, 본원에 개시된 ceDNA 중 하나 이상의 유효량을 포함하는 조성물을 도입하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 추가 성분과 함께 제형화되거나, 이의 사용을 위한 하나 이상의 설명서와 함께 준비된, 하나 이상의 상기 개시된 ceDNA 벡터 또는 ceDNA 조성물을 포함하는 조성물뿐 아니라, 치료용 및/또는 진단용 키트를 제공한다.

일부 구현예에 따르면, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터가 투여되는 세포는, 비제한적으로, 신경세포(말초 및 중추 신경계의 세포, 특히 뇌세포 포함), 폐세포, 망막세포, 내피세포(예를 들어, 장 및 호흡기 상피세포), 근육세포, 수지상세포, 췌장세포(섬세포 포함), 간세포, 심근세포, 골세포(예를 들어, 골수줄기세포), 조혈줄기세포, 비장세포, 각질세포, 섬유아세포, 내피세포, 전립선세포, 생식세포 등을 포함하는 임의의 유형일 수 있다. 대안적으로, 세포는 임의의 전구세포일 수 있다. 추가의 대안으로서, 세포는 줄기세포(예를 들어, 신경줄기세포, 간줄기세포)일 수 있다. 또 다른 추가의 대안으로서, 세포는 암 또는 종양 세포일 수 있다. 나아가, 세포는 상기 제시된 바와 같은 임의의 종에서 유래할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다.

실시예 1: ceDNA 벡터의 구축

폴리뉴클레오타이드 구조체 주형을 사용한 ceDNA 벡터의 생산은 PCT/US18/49996의 실시예 1에 기재되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 ceDNA 벡터를 생성하는 데 사용되는 폴리뉴클레오타이드 구조체 주형은 ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큐로바이러스일 수 있다. 이론에 제한됨 없이, 허용 숙주세포에서, 예를 들어 Rep의 존재 하에서, 2개의 대칭 ITR과 발현 구조체를 갖는 폴리뉴클레오타이드 구조체 주형(여기서, ITR 중 적어도 하나는 야생형 ITR 서열에 대해 변형됨)을 복제하여 ceDNA 벡터를 생산한다. ceDNA 벡터 생산은 다음과 같은 2단계를 거친다: 첫 번째로, Rep 단백질을 통한 주형 백본(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스 게놈 등)으로부터의 주형의 절제("회수") 단계, 및 두 번째로, 절제된 ceDNA 벡터의 Rep 매개 복제 단계.

ceDNA 벡터를 생산하는 예시적인 방법은, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA-플라스미드에서 시작하는 방법이다. 도 1a와 도 1b를 참조하면, 각각의 ceDNA-플라스미드의 폴리뉴클레오타이드 구조체 주형은 좌측 변형된 ITR과 우측 변형된 ITR을 포함하고, 상기 ITR 서열 사이에 다음을 갖는다: (i) 인핸서/프로모터; (ii) 전이유전자의 클로닝 부위; (iii) 전사 후 반응 요소(예를 들어, 우드척 간염바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE)); 및 (iv) 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 소 성장호르몬 유전자(BGHpA) 유래). 구조체의 특정 부위에 새로운 유전 구성요소의 도입을 용이하게 하기 위해, 고유한 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위(R1 내지 R6)(도 1a와 도 1b에 제시됨)를 또한 각 구성요소 사이에 도입하였다. R3(PmeI) GTTTAAAC(서열번호 7) 및 R4 (PacI) TTAATTAA(서열번호 542) 효소 부위를 클로닝 부위로 조작하여, 전이유전자의 오픈리딩프레임을 도입하였다. 이러한 서열을 ThermoFisher Scientific에서 입수한 pFastBac HT B 플라스미드에 클로닝하였다.

간략하게, 도 5a 내지 도 5c에 제시된 공정과 표 4에 제시된 ITR 서열을 사용하여, 표 7에 제시된 ceDNA-플라스미드 구조체에서 일련의 ceDNA 벡터를 수득하였다. 표 7은, 전이유전자에 작동적으로 연결된 프로모터의 어느 하나의 말단에 복제 단백질 부위(RPS)(예를 들어, Rep 결합 부위)로서 활성인 서열을 포함하여, 각 구성요소에 상응하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 수를 나타낸다. 표 7에서의 숫자는, 각 구성요소의 서열에 해당하는, 본 문헌의 서열번호를 나타낸다. 표 7에서의 플라스미드는, 전이유전자와 우측 ITR 사이 3' 미번역 영역에, 서열번호 9를 포함하는 BGHpA가 뒤따르는 서열번호 8을 포함하는 WPRE로 구축되었다.

다른 구현예에서, 도 5a 내지 도 5c에 제시된 공정을 사용하여, AAV2 5' 및 3' WT-ITR을 포함하는 ceDNA-플라스미드 구조체로부터 일련의 ceDNA 벡터를 수득하였다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터 제조용 구조체는 본원에 기재된 바와 같은 조절 스위치인 프로모터, 예를 들어 유도성 프로모터를 포함한다.

ceDNA-박미드의 생산

도 5a를 참조하여, DH10Bac 적격세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells, Thermo Fisher)를 제조업체의 설명서에 따른 프로토콜에 따라 시험 또는 대조군 플라스미드로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 플라스미드와 바큐로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 ceDNA-박미드를 생성하였다. 박미드와 트랜스포사아제 플라스미드의 형질전환체 및 유지를 위해 선택한 항생제와 함께 X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상에서, 대장균(E. coli)에서의 청백색 스크리닝을 기반으로 하는 양성 선별을 스크리닝하여 재조합 박미드를 선별하였다(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다아제 유전자의 α-상보성을 제공함). β-갈락토시드 지표 유전자를 파괴하는 전위에 의해 야기된 백색 집락을 선별하고, 10 ml 배지에서 배양하였다.

재조합 ceDNA-박미드를 대장균에서 단리하고, FugeneHD를 사용하여 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 트랜스펙션시켜, 감염성 바큐로바이러스를 생산하였다. 부착성 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 25℃에서 T25 플라스크 내 50 ml 배지에서 배양하였다. 4일 후, 배양 배지(P0 바이러스 함유)에서 세포를 꺼내고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하여, 세포 또는 세포 잔해물로부터 감염성 바큐로바이러스 입자를 분리하였다.

선택적으로, 50 ml 내지 500 ml 배지에서 나이브(naive) Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 바큐로바이러스(P0)를 증폭시켰다. 세포의 직경이 18 nm 내지 19 nm(본래 직경 14 nm 내지 15 nm), 밀도가 약 4.0E+6개의 세포/mL에 도달할 때까지, 세포 직경 및 생존력을 모니터링하면서, 25℃에서 130 rpm으로 오비탈 진탕기 인큐베이터에서 현탁 배양으로 세포를 유지시켰다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 원심분리한 후 배지 중 P1 바큐로바이러스 입자를 수집하여 세포와 잔해물을 제거하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.

시험 구조체를 포함하는 ceDNA-바큐로바이러스를 수집하고, 바큐로바이러스의 감염 활성 또는 역가를 측정하였다. 구체적으로, 4개 x 20 ml Sf9 세포 배양물(2.5E+6개의 세포/ml)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큐로바이러스로 처리하고, 25℃ 내지 27℃에서 인큐베이션하였다. 4일 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가율과 세포주기 정지율, 및 세포 생존력의 변화로 감염성을 측정하였다.

도 5a를 참조하여, 예를 들어 도 9a에 따른 "Rep-플라스미드"를 Rep78(서열번호 13) 또는 Rep68(서열번호 12)과 Rep52(서열번호 14) 또는 Rep40(서열번호 11)을 포함하는 pFASTBAC^TM-이중발현 벡터(ThermoFisher)에서 생산하였다.

Rep-플라스미드를 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 DH10Bac 적격세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells)(Thermo Fisher)로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 Rep-플라스미드와 바큐로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 박미드("Rep-박미드")를 생성하였다. X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상에서 대장균에서의 청백색 스크리닝을 포함하는 양성 선별을 통해 재조합 박미드를 선별하였다(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다아제 유전자의 α-상보성을 제공함). 단리된 백색 집락을 선별하고, 10 ml의 선택된 배지(LB 브로쓰 중의 카나마이신, 겐타마이신, 테트라시클린)에 접종하였다. 재조합 박미드(Rep-박미드)를 대장균에서 단리하고, Rep-박미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 트랜스펙션시켜, 감염성 바큐로바이러스를 생산하였다.

Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 50 ml 배지에서 4일 동안 배양하고, 감염성 재조합 바큐로바이러스("Rep-바큐로바이러스")를 배양물에서 단리하였다. 선택적으로, 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 바큐로바이러스(P0)를 증폭시키고, 50 ml 내지 500 ml 배지에서 배양하였다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 원심분리 또는 여과 또는 또 다른 분별 과정을 통해 세포를 분리하여, 배지 내 P1 바큐로바이러스 입자를 수집하였다. ceDNA-바큐로바이러스를 수집하고, 바큐로바이러스의 감염 활성을 측정하였다. 구체적으로, 4개 x 20 mL Sf9 세포 배양물(2.5x10⁶개의 세포/mL)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큐로바이러스로 처리하고, 인큐베이션하였다. 4일 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가율과 세포주기 정지율, 및 세포 생존력의 변화로 감염성을 측정하였다.

ceDNA 벡터 생성 및 특징분석

도 5b를 참조하여, (1) ceDNA-박미드 또는 ceDNA-바큐로바이러스를 함유하는 샘플, 및 (2) 상기 기재된 Rep-바큐로바이러스를 함유하는 Sf9 곤충 세포 배양 배지를, 각각, 1:1000 및 1:10,000의 비로, Sf9 세포의 새로운 배양물(2.5E+6개의 세포/ml, 20 ml)에 첨가하였다. 이어서, 세포를 25℃에서 130 rpm으로 배양하였다. 공동 감염 4일 내지 5일 후, 세포 직경과 생존력을 검출하였다. 세포 직경이 18 nm 내지 20 nm에 도달하고, 생존력이 약 70% 내지 80%에 도달하면, 세포 배양물을 원심분리하고, 배지를 제거하고, 세포 펠릿을 수집하였다. 세포 펠릿을 먼저 적절한 부피의 물 또는 완충액인 수성 배지에 재현탁시켰다. Qiagen MIDI PLUS™ 정제 프로토콜(Qiagen, 컬럼당 처리되는 세포 펠릿 질량 0.2 mg)을 사용하여, 세포에서 ceDNA 벡터를 단리하고 정제하였다.

Sf9 곤충 세포에서 생산되고 정제된 ceDNA 벡터의 수율을 초기에 260 nm에서의 UV 흡광도를 기반으로 측정하였다.

ceDNA 벡터는 도 5d에 예시된 미변성 또는 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동으로 확인하여 평가할 수 있으며, 여기서 (a) 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 겔 전기영동 분석 후 미변성 겔에 비해 변성 겔에서 2배 크기로 이동하는 특징적인 밴드의 존재, 및 (b) 절단되지 않은 물질의 경우 미변성 겔에서 단량체 및 이량체(2x) 밴드의 존재가, ceDNA 벡터 존재의 특징이다.

공동 감염된 Sf9 세포(본원에 기재된 바와 같음)에서 수득된 DNA를, a) ceDNA 벡터 내 오로지 단일 절단 부위만 존재, 및 b) 0.8% 변성 아가로오스 겔 상에서 분별 시 명확하게 확인할 수 있을 만큼 큰 생성된 단편(>800 bp)에 대해 선별된 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜, 단리된 ceDNA 벡터의 구조를 추가로 분석하였다. 도 5d와 도 5e에 예시된 바와 같이, 비연속 구조를 갖는 선형 DNA 벡터와 선형 및 연속 구조를 갖는 ceDNA 벡터를 이의 반응 생성물의 크기로 구별할 수 있다: 예를 들어 비연속 구조를 갖는 DNA 벡터는 1 kb 및 2 kb 단편을 생성할 것으로 예상되고, 연속 구조를 갖는 비캡시드화된 벡터는 2 kb 및 4 kb 단편을 생성할 것으로 예상된다.

따라서, 단리된 ceDNA 벡터가 정의에 따라 공유결합으로 폐쇄되어 있다는 것을 정성적으로 입증하기 위해, 샘플을 단일 제한 부위를 갖는 특정 DNA 벡터 서열의 맥락에서 확인된 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켜, 바람직하게는 동일하지 않은 크기의 2개의 절단 산물(예를 들어, 1000 bp 및 2000 bp)을 수득하였다. 소화 및 변성 겔 상에서의 전기영동(이는 2개의 상보적 DNA 가닥을 분리함) 후, 선형의 비공유결합으로 폐쇄된 DNA는 1000 bp 및 2000 bp의 크기로 분리될 것이지만, 공유결합으로 폐쇄된 DNA(즉, ceDNA 벡터)는 2개의 DNA 가닥이 연결되고 언폴딩되어 (단일가닥이지만) 길이가 2배가 됨으로써, 2배 크기(2000 bp 및 4000 bp)로 분리될 것이다. 나아가, 단량체, 이량체 및 n량체 형태의 DNA 벡터의 소화는 모두 다량체 DNA 벡터의 말단 대 말단 연결로 인해 동일한 크기의 단편으로 분리될 것이다(도 5d 참조).

본원에 사용된 "미변성 겔 및 변성 조건 하에서 아가로오스 겔 전기영동에 의한 DNA 벡터의 식별을 위한 검정"이라는 구절은, 제한 엔도뉴클레아제 소화, 이어서 소화 산물의 전기영동을 수행하는 방식으로 ceDNA의 폐쇄형 말단을 평가하는 검정을 나타낸다. 하나의 이러한 예시적인 검정이 하기에 이어지지만, 당업자는 이러한 예에 대한 다수의 업계 공지 변형이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 제한 엔도뉴클레아제는 DNA 벡터 길이의 대략 1/3x 및 2/3x인 산물을 생성하게 되는 관심 ceDNA 벡터에 대한 단일 절단 효소인 것으로 선택된다. 이는, 미변성 및 변성 겔 모두에 대한 밴드를 분리한다. 변성 전, 샘플에서 완충액을 제거하는 것이 중요하다. Qiagen PCR 클린업 키트(clean-up kit) 또는 탈염 "스핀 컬럼", 예를 들어 GE HEALTHCARE ILUSTRA™ MICROSPIN™ G-25 컬럼이 엔도뉴클레아제 소화에 대한 일부 업계 공지 옵션이다. 상기 검정은, 예를 들어 i) 적절한 제한 엔도뉴클레아제(들)를 이용하여 DNA를 소화시키는 단계, ii) 예를 들어 Qiagen PCR 클린업 키트에 적용하고, 증류수로 용리하는 단계, iii) 10x 변성 용액(10x = 0.5 M NaOH, 10 mM EDTA)을 첨가하고, 완충되지 않은 10X 염료를 첨가하고, NaOH 농도가 겔과 겔 박스에서 균일하도록 보장하기 위해 1 mM EDTA 및 200 mM NaOH와 함께 이전에 인큐베이션한 0.8% 내지 1.0% 겔 상에 10X 변성 용액을 4배로 첨가하여 제조된 DNA ladder와 함께 분석하고, 1x 변성 용액(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)의 존재 하에서 겔을 작동시키는 단계를 포함한다. 당업자는, 크기 및 목적하는 결과 타이밍을 기반으로 전기영동을 수행하는 데 어떤 전압을 사용해야 하는 지를 이해할 것이다. 전기영동 후, 겔을 배수하고, 1x TBE 또는 TAE에서 중화시키고, 1x SYBR Gold을 함유한 1x TBE/TAE 또는 증류수로 옮겼다. 이어서, 밴드를, 예를 들어 Thermo Fisher, SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain(DMSO 중 10,000X 농축물) 및 에피형광(epifluorescent light)(청색) 또는 UV(312 nm)를 이용하여 가시화할 수 있다.

생성된 ceDNA 벡터의 순도는 임의의 업계 공지 방법을 사용하여 평가할 수 있다. 하나의 예시적이고 비제한적인 방법으로서, ceDNA 벡터의 형광 강도를 표준과 비교하여 샘플의 전체 UV 흡광도에 대한 ceDNA-플라스미드의 기여를 추정할 수 있다. 예를 들어, UV 흡광도에 기반하여, 4μg의 ceDNA 벡터가 겔 상에 로딩되고, ceDNA 벡터 형광 강도가 1μg인 것으로 공지된 2 kb 밴드와 동등한 경우, 1μg의 ceDNA 벡터가 존재하며, ceDNA 벡터는 총 UV 흡수 물질의 25%이다. 이어서, 겔 상의 밴드 강도를 밴드가 나타내는 계산된 입력에 대해 플롯팅한다: 예를 들어 총 ceDNA 벡터가 8 kb이고, 절제된 비교용 밴드가 2 kb인 경우, 밴드 강도는 총 입력의 25%로서 플롯팅될 것이며, 이러한 경우 1.0μg 입력에 대한 값은 0.25μg일 것이다. ceDNA 벡터 플라스미드 적정을 사용하여 표준 곡선을 플롯팅한 후, 회귀선 방정식을 사용하여 ceDNA 벡터 밴드의 양을 계산한 다음, 이를 사용하여 ceDNA 벡터로 표시되는 총 입력의 % 또는 순도%를 결정할 수 있다.

ceDNA-박미드의 생산

DH10Bac 적격세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells, Thermo Fisher)를 제조업체의 설명서에 따른 프로토콜에 따라 시험 또는 대조군 플라스미드로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 플라스미드와 바큐로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 ceDNA-박미드를 생성하였다. 박미드와 트랜스포사아제 플라스미드의 형질전환체 및 유지를 위해 선택한 항생제와 함께 X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상에서, 대장균에서의 청백색 스크리닝을 기반으로 하는 양성 선별을 스크리닝하여 재조합 박미드를 선별하였다(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다아제 유전자의 α-상보성을 제공함). β-갈락토시드 지표 유전자를 파괴하는 전위에 의해 야기된 백색 집락을 선별하고, 10 mL 배지에서 배양하였다.

재조합 ceDNA-박미드를 대장균에서 단리하고, FugeneHD를 사용하여 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 트랜스펙션시켜, 감염성 바큐로바이러스를 생산하였다. 부착성 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 25℃에서 T25 플라스크 내 50 mL 배지에서 배양하였다. 4일 후, 배양 배지(P0 바이러스 함유)에서 세포를 꺼내고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하여, 세포 또는 세포 잔해물로부터 감염성 바큐로바이러스 입자를 분리하였다.

선택적으로, 50 ml 내지 500 mL 배지에서 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 바큐로바이러스(P0)를 증폭시켰다. 세포의 직경이 18 nm 내지 19 nm(본래 직경 14 nm 내지 15 nm), 밀도가 약 4.0E+6개의 세포/mL에 도달할 때까지, 세포 직경 및 생존력을 모니터링하면서, 25℃에서 130 rpm으로 오비탈 진탕기 인큐베이터에서 현탁 배양으로 세포를 유지시켰다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 원심분리한 후 배지 중 P1 바큐로바이러스 입자를 수집하여 세포와 잔해물을 제거하고, 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다.

시험 구조체를 포함하는 ceDNA-바큐로바이러스를 수집하고, 바큐로바이러스의 감염 활성 또는 역가를 측정하였다. 구체적으로, 4개 x 20 ml Sf9 세포 배양물(2.5E+6개의 세포/ml)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큐로바이러스로 처리하고, 25℃ 내지 27℃에서 인큐베이션하였다. 4일 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가율과 세포주기 정지율, 및 세포 생존력의 변화로 감염성을 측정하였다.

"Rep-플라스미드"를 Rep78 또는 Rep68과 Rep52 또는 Rep40을 포함하는 pFASTBAC^TM-이중 발현 벡터(ThermoFisher)에서 생산하였다. Rep-플라스미드를 제조업체가 제공한 프로토콜에 따라 DH10Bac 적격세포(MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells)(Thermo Fisher)로 형질전환시켰다. DH10Bac 세포에서 Rep-플라스미드와 바큐로바이러스 셔틀 벡터 사이의 재조합을 유도하여, 재조합 박미드("Rep-박미드")를 생성하였다. X-gal 및 IPTG를 함유하는 박테리아 한천 플레이트 상에서 대장균에서의 청백색 스크리닝을 포함하는 양성 선별을 통해 재조합 박미드를 선별하였다(Φ80dlacZΔM15 마커는 박미드 벡터로부터의 β-갈락토시다아제 유전자의 α-상보성을 제공함). 단리된 백색 집락을 선별하고, 10 ml의 선택된 배지(LB 브로쓰 중의 카나마이신, 겐타마이신, 테트라시클린)에 접종하였다. 재조합 박미드(Rep-박미드)를 대장균에서 단리하고, Rep-박미드를 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포에 트랜스펙션시켜, 감염성 바큐로바이러스를 생산하였다.

Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 50 mL 배지에서 4일 동안 배양하고, 감염성 재조합 바큐로바이러스("Rep-바큐로바이러스")를 배양물에서 단리하였다. 선택적으로, 나이브 Sf9 또는 Sf21 곤충 세포를 감염시켜 제1세대 바큐로바이러스(P0)를 증폭시키고, 50 mL 내지 500 mL 배지에서 배양하였다. 감염 후 3일 내지 8일 사이에, 원심분리 또는 여과 또는 또 다른 분별 과정을 통해 세포를 분리하여, 배지 내 P1 바큐로바이러스 입자를 수집하였다. ceDNA-바큐로바이러스를 수집하고, 바큐로바이러스의 감염 활성을 측정하였다. 구체적으로, 4개 x 20 mL Sf9 세포 배양물(2.5x10⁶개의 세포/mL)을 1/1000, 1/10,000, 1/50,000, 1/100,000로 희석된 P1 바큐로바이러스로 처리하고, 인큐베이션하였다. 4일 내지 5일 동안 매일 세포 직경 증가율과 세포주기 정지율, 및 세포 생존력의 변화로 감염성을 측정하였다.

실시예 2: 이중가닥 DNA 분자로부터의 절제를 통한 합성 ceDNA 생산

ceDNA 벡터의 합성 생산은 2019년 1월 18일자 출원된 국제 출원 PCT/US19/14122의 실시예 2 내지 실시예 6에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다. 이중가닥 DNA 분자의 절제를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 하나의 예시적인 방법. 간략하게, ceDNA 벡터는 이중가닥 DNA 구조체를 사용하여 생성할 수 있다(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 7a 내지 도 8e 참조). 일부 구현예에서, 이중가닥 DNA 구조체는 ceDNA 플라스미드이다(예를 들어, 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/064242의 도 6 참조).

일부 구현예에서, ceDNA 벡터 제조용 구조체는 본원에 기재된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다.

예시 목적으로, 실시예 1은 이러한 방법을 사용하여 생성된 예시적인 폐쇄형 DNA 벡터로서의 ceDNA 벡터의 생산을 설명한다. ITR과 발현 카세트(예를 들어, 이종 핵산 서열)를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드의 절제, 이어서 본원에 기재된 바와 같은 유리된 3' 및 5' 말단의 결찰에 의해 폐쇄형 DNA 벡터를 생성하는 시험관내 합성 생산 방법을 설명하는 상기 실시예에 ceDNA 벡터가 예시되어 있지만, 당업자는, 상기 예시된 바와 같이, 비제한적으로, 미니스트링 DNA, doggybone™ DNA, 덤벨형 DNA 등을 포함하는 임의의 목적하는 폐쇄형 DNA 벡터가 생성되도록, 이중가닥 DNA 폴리뉴클레오타이드 분자를 변형시킬 수 있다는 것을 알고 있다. 전이유전자 및 치료용 단백질의 생산을 위한 예시적인 ceDNA 벡터는 실시예 2에 기재된 합성 생산 방법에 따라 생산할 수 있다.

상기 방법은 (i) 이중가닥 DNA 구조체로부터 발현 카세트를 인코딩하는 서열을 절제하는 단계, (ii) ITR 중 하나 이상에서 헤어핀 구조를 형성하는 단계, 및 (iii) 유리된 5' 및 3' 말단을 결찰, 예를 들어 T4 DNA 리가아제에 의해 결합하는 단계를 포함한다.

이중가닥 DNA 구조체는, 5'→3' 순서로, 제1 제한 엔도뉴클레아제 부위; 업스트림 ITR; 발현 카세트; 다운스트림 ITR; 및 제2 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다. 이어서, 이중가닥 DNA 구조체를 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉시켜, 양쪽 제한 엔도뉴클레아제 부위에 이중가닥 절단물을 생성한다. 하나의 엔도뉴클레아제는 2개의 부위를 모두 표적화할 수 있거나, 제한 부위가 ceDNA 벡터 주형에 존재하지 않는 한 각각의 부위는 상이한 엔도뉴클레아제에 의해 표적화될 수 있다. 이는 나머지 이중가닥 DNA 구조체로부터 제한 엔도뉴클레아제 부위 사이의 서열을 절제한다(PCT/US19/14122의 도 9 참조). 결찰시켜, 폐쇄형 DNA 벡터를 형성한다.

상기 방법에 사용되는 ITR 중 하나 또는 둘 모두는 야생형 ITR일 수 있다. 변형된 ITR을 또한 사용할 수 있으며, 여기서 변형은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하거나(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 6 내지 도 8, 도 10 및 도 11b 참조), 2개 이상의 헤어핀 루프(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 6 내지 도 8 및 도 11b 참조) 또는 단일 헤어핀 루프(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 10a, 도 10b 및 도 11b 참조)를 가질 수 있다. 헤어핀 루프 변형된 ITR은 기존 올리고의 유전적 변형 또는 새로운(de novo) 생물학적 및/또는 화학적 합성으로 생성할 수 있다.

실시예 3: 올리고뉴클레오타이드 구축을 통한 ceDNA 생산

다양한 올리고뉴클레오타이드의 어셈블리를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 또 다른 예시적인 방법이, PCT/US19/14122의 실시예 3에 제공되어 있으며, 여기서 ceDNA 벡터는 5' 올리고뉴클레오타이드와 3' ITR 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계, 및 ITR 올리고뉴클레오타이드를 발현 카세트를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드에 결찰시키는 단계를 통해 생산된다. PCT/US19/14122의 도 11b는, 5' ITR 올리고뉴클레오타이드와 3' ITR 올리고뉴클레오타이드를 발현 카세트를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드에 결찰시키는 예시적인 방법을 보여준다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터 제조용 구조체는 본원에 기재된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다.

ITR 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같은 WT-ITR을 포함하거나, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 ITR을 포함할 수 있다. 변형된 ITR은 B 및 B' 아암 및/또는 C 및 C' 아암을 형성하는 서열에서 야생형 ITR로부터 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 삽입 또는 치환을 포함할 수 있다. 무세포 합성에 사용되는 본원에 기재된 바와 같은 WT-ITR 또는 mod-ITR을 포함하는 ITR 올리고뉴클레오타이드는, 유전적 변형, 또는 생물학적 및/또는 화학적 합성으로 생성할 수 있다. 본원에 논의된 바와 같이, 실시예 2와 실시예 3의 ITR 올리고뉴클레오타이드는 WT-ITR, 또는 본원에 논의된 바와 같은 대칭 또는 비대칭 구성의 변형된 ITR(mod-ITR)을 포함할 수 있다.

실시예 4: 단일가닥 DNA 분자를 통한 ceDNA 생산

합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 또 다른 예시적인 방법이 PCT/US19/14122의 실시예 4에 제공되어 있으며, 이는 센스 발현 카세트 서열을 플랭킹하고, 안티센스 발현 카세트를 플랭킹하는 2개의 안티센스 ITR에 공유결합으로 부착된 2개의 센스 ITR을 포함하는 단일가닥 선형 DNA를 사용하며, 이러한 단일가닥 선형 DNA의 말단을 결찰시켜 폐쇄형 단일가닥 분자를 형성한다. 하나의 비제한적인 예는, 단일가닥 DNA 분자를 합성 및/또는 생산하는 단계, 분자의 일부를 어닐링하여 하나 이상의 2차 구조 염기쌍 영역을 갖는 단일 선형 DNA 분자를 형성하는 단계, 및 유리된 5' 및 3' 말단을 서로 결찰시켜 폐쇄형 단일가닥 분자를 형성하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, ceDNA 벡터 제조용 구조체는 본원에 기재된 바와 같은 조절 스위치를 포함한다.

ITR 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기재된 바와 같은 WT-ITR을 포함하거나, 본원에 기재된 바와 같은 변형된 ITR을 포함할 수 있다.

ceDNA 벡터 생산을 위한 예시적인 단일가닥 DNA 분자는, 5'→3' 방향으로, 센스 제1 ITR; 센스 발현 카세트 서열; 센스 제2 ITR; 안티센스 제2 ITR; 안티센스 발현 카세트 서열; 및 안티센스 제1 ITR을 포함한다.

실시예 4의 예시적인 방법에 사용되는 단일가닥 DNA 분자는 본원에 기재된 임의의 DNA 합성 방법, 예를 들어 시험관내 DNA 합성으로 형성하거나, 뉴클레아제를 이용하여 DNA 구조체(예를 들어, 플라스미드)를 절단하고 생성된 dsDNA 단편을 용융시켜 ssDNA 단편을 제공하는 방식으로 제공할 수 있다.

센스 및 안티센스 서열 쌍의 계산된 용융 온도 미만으로 온도를 저하시켜 어닐링을 달성할 수 있다. 용융 온도는 특정 뉴클레오타이드 염기 함량과, 사용되는 용액의 특징, 예를 들어 염 농도에 따라 달라진다. 당업자는 임의의 주어진 서열 및 용액 조합에 대한 용융 온도를 쉽게 계산할 수 있다.

어닐링된 분자의 유리된 5' 및 3' 말단을 서로 결찰시키거나 헤어핀 분자에 결찰시켜, ceDNA 벡터를 형성할 수 있다. 적합한 예시적인 결찰 방법 및 헤어핀 분자는 실시예 2 및 실시예 3에 기재되어 있다.

실시예 5: ceDNA 벡터는 시험관내에서 루시퍼라아제 전이유전자를 발현시킴

루시퍼라아제 리포터 유전자를 인코딩하는 오픈리딩프레임을 ceDNA-플라스미드 구조체, 즉, 구조체-15 내지 구조체-30(상기 표 7 참조) 또는 AAV2 WT-ITR을 포함하는 구조체의 클로닝 부위에 도입하여, 루시퍼라아제 코딩 서열을 포함하는 구조체를 생성하였다. HEK293 세포를 배양하고, 트랜스펙션제로서 FUGENE®(Promega Corp.)을 사용하여 100 ng, 200 ng 또는 400 ng의 플라스미드 구조체-15 내지 구조체-30으로 트랜스펙션시켰다. 각각의 세포 배양물에서의 루시퍼라아제 활성을 기반으로 각각의 플라스미드로부터의 루시퍼라아제의 발현을 측정하여, 루시퍼라아제 활성이 플라스미드로부터의 유전자 발현에서 기인하였음을 확인하였다.

실시예 6: ceDNA 벡터로부터의 루시퍼라아제 전이유전자의 생체내 단백질 발현.

상기 기재된 구조체에서 생산된 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자의 생체내 단백질 발현을 마우스에서 평가하였다. ceDNA-플라스미드 구조체에서 수득한 ceDNA 벡터를 시험하고, 리포좀 미함유 ceDNA 구조체의 유체역학적 주사 후 마우스 모델에서 일관되고 지속적인 루시퍼라아제 전이유전자 발현을 입증하고, 재투여(28일차)하고, 외인성 초파리 루시퍼라아제 ceDNA의 지속성(최대 42일차까지)을 확인하였다. 상이한 실험에서, 선택된 ceDNA 벡터의 루시퍼라아제 발현을 생체내에서 평가하였으며, 여기서 ceDNA 벡터는 루시퍼라아제 전이유전자와, i) 표 4에 제시된 임의의 대칭 쌍에서 선택된 변형된 5' ITR과 대칭인 변형된 3' ITR, 또는 도 7a 내지 도 22b에 제시된 변형된 ITR 쌍, 또는 ii) AAV2 5' WT-ITR 및 AAV2 3' WT-ITR을 포함하였다.

상기 기재된 바와 같은 AAV2 WT-ITR을 갖는 구조체에서 생산된 ceDNA 벡터로부터의 전이유전자의 생체내 단백질 발현을 마우스에서 평가하였다. ceDNA-플라스미드 구조체에서 수득한 ceDNA 벡터를 시험하고, 리포좀 미함유 ceDNA 구조체의 유체역학적 주사 후 마우스 모델에서 일관되고 지속적인 루시퍼라아제 전이유전자 발현을 입증하고, 재투여(28일차)하고, 외인성 초파리 루시퍼라아제 ceDNA의 지속성(최대 42일차까지)을 확인하였다. 상이한 실험에서, 선택된 ceDNA 벡터의 루시퍼라아제 발현을 생체내에서 평가하였으며, 여기서 ceDNA 벡터는 루시퍼라아제 전이유전자와, AAV2 5' WT-ITR 및 AAV2 3' WT-ITR을 포함하였다.

생체내 루시퍼라아제 발현: 5 내지 7주령 수컷 CD-1 IGS 마우스(Charles River Laboratories)에게 루시퍼라아제를 발현하는 ceDNA 벡터 0.35 mg/kg을 1.2 mL 부피로 i.v. 유체역학적 투여를 통해 0일차에 꼬리 정맥에 투여하였다. 루시퍼라아제 발현을 IVIS 영상화로 3일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일, 31일, 35일 및 42일차에 평가하였다. 간략하게, 마우스에게 150 mg/kg의 루시페린 기질을 복강내 주사한 후, IVIS® 영상화를 통해 전신 발광을 평가하였다.

3일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일, 31일, 35일 및 42일차에 IVIS 영상화를 수행하고, 42일차에 희생시킨 후 채취한 기관을 생체외 영상화하였다.

연구 기간 동안, 매일 동물의 체중을 측정하고 일반적인 건강과 웰빙을 모니터링하였다. 희생 시, 말단 심장천자를 통해 각 동물에서 혈액을 채취하고, 2개의 부분으로 나누어, 1) 혈장 및 2) 혈청으로 처리하고, 이때 스냅 동결된(snap-frozen)혈장 및 혈청을 간 효소 패널에 사용하고, 이어서 스냅 동결시켰다. 또한, 간, 비장, 신장 및 서해부 림프절(LN)을 수집하고, IVIS를 통해 생체외 영상화하였다.

MAXDISCOVERY® 루시퍼라아제 ELISA 검정(BIOO Scientific/PerkinElmer), 간 샘플의 루시퍼라아제에 대한 qPCR, 간 샘플의 조직병리학 및/또는 혈청 간 효소 패널(VetScanVS2; Abaxis Preventative Care Profile Plus)을 통해 간에서의 루시퍼라아제 발현을 평가하였다.

실시예 7: WT/WT ceDNA 형성 및 분석

야생형 AAV II형 ITR을 사용하여, ceDNA 형성 및 ceDNA 인코딩된 전이유전자를 발현하는 능력을 조사하였다. 벡터 구축, ceDNA 형성의 검정, 및 인간 세포 배양에서의 ceDNA 전이유전자 발현의 평가를 하기에 보다 상세하게 기재한다.

WT/WT ITR 구축

야생형 AAV II형 ITR 카세트를 갖는 플라스미드를 가상으로(in silico) 설계하고, 이어서 Sf9 곤충 세포에서 평가하였다. 상기 카세트에는 곤충 세포에서의 발현을 위한 p10 프로모터 서열에 의해 구동되는 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터 유전자가 함유되어 있었다.

Sf9 현탁 배양물을 벤트가 있는 200 mL 조직 배양 플라스크 내 Sf900 III 배지(Gibco) 중에 유지시켰다. 배양물을 48시간마다 계대하고, ViCell 계수기(Beckman Coulter)를 사용하여 각 계대 전 세포수 및 성장 매트릭스를 측정하였다. 배양물을 27℃에서 진탕 조건(1" 궤도, 130 rpm) 하에서 유지시켰다.

ceDNA 벡터를 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하고 구축하였다. 간략하게, 도 4b를 참조하여, 플라스미드 구조체로 형질도입된 Sf9 세포를 27℃에서 고정 조건 하에서 24시간 동안 부착 성장시켰다. 24시간 후, 트랜스펙션된 Sf9 세포를 바큐로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 통해 Rep 벡터로 감염시켰다. BIIC는 감염성을 특징분석하기 위해 이전에 분석된 것으로, 1:2000의 최종 희석으로 사용하였다. Sf900 곤충 세포 배지에 1:100로 희석된 BIIC를 각각의 이전에 트랜스펙션된 세포 웰에 첨가하였다. 비(非)Rep 벡터 BIIC를 음성 대조군으로서 웰의 서브세트에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 로커에서 약하게 진탕시키면서 2분 동안 혼합하였다. 이어서, 세포를 27℃ 고정 조건 하에서 추가 48시간 동안 성장시켰다. 모든 실험 구조체와 대조군은 3중으로 검정하였다.

48시간 후, 96-웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고, 간단하게 실온까지 평형화시킨 후, 형광 현미경을 사용하여 GFP 발현에 대해 육안으로 검사하였다. 형광 및 명시야 이미지를 40x 배율로 캡처하였다. 예상한 바와 같이, 음성 대조군(Rep 함유 바큐로바이러스 세포의 부재 하에서 처리된 샘플)은 유의한 GFP 발현을 나타내지 않았다. WT/WT ITR GFP 벡터 샘플에서 강력한 GFP 발현이 관찰되었으며, 이는 ceDNA 인코딩된 전이유전자가 성공적으로 트랜스펙션되었음을 나타낸다. 결과는 도 24a와 도 24b에 제시되어 있다. 예상한 바와 같이, 음성 대조군(Rep 함유 바큐로바이러스 세포의 부재 하에서 처리된 샘플)은 유의한 GFP 발현을 나타내지 않았다. 야생형 샘플에서 강력한 GFP 발현이 관찰되었으며, 이는 ceDNA 인코딩된 전이유전자가 성공적으로 트랜스펙션되고 발현되었음을 나타낸다.

ceDNA 형성의 검정

상기 연구에서 생성된 ceDNA가 예상되는 폐쇄형 구조를 갖는 지를 확인하기 위해, 적절한 구조에 대해 후속으로 시험될 수 있는 충분한 양의 ceDNA를 생산하는 실험을 수행하였다. 간략하게, Sf9 현탁 배양물을 WT/WT ITR DNA로 트랜스펙션시켰다. 배양물을 제한된 가스 교환을 갖는 Erlenmeyer 배양 플라스크에 내에 1 mL당 1.25x10⁶개의 세포로 씨딩하였다. 제조업체의 설명서에 따라 FuGene® 트랜스펙션 시약을 사용하여 DNA:지질 트랜스펙션 복합체를 제조하였다. 플레이트 검정에 대해 상기 기재된 바와 동일한 방식으로, 트랜스펙션되는 세포의 수에 비례하여 부피를 증가시키면서, 복합체 믹스를 제조하고 인큐베이션하였다. 리포터 유전자 검정과 마찬가지로, 4.5:1(시약 부피/DNA 질량)의 비를 사용하였다. 실험 배양물과 함께 모의군(트랜스펙션 시약만) 및 미처리 성장 대조군을 준비하였다. 트랜스펙션 시약의 첨가 후, 27℃ 진탕 인큐베이터로 옮기기 전에, 배양물을 실온에서 10분 내지 15분 동안 약하게 흔들면서 회복시켰다. 진탕 조건 하에서 24시간 인큐베이션 후, ViCell 계수기(Beckman Coulter)를 사용하여 모든 플라스크(실험군 및 대조군)에 대한 세포수와 성장 매트릭스를 측정하였다. 모든 플라스크(성장 대조군 제외)를 1:5,000의 최종 희석으로 Rep-벡터 함유 BIIC로 감염시켰다. ceDNA 생산을 위해 확립된 BIIC 이중 감염 절차를 사용하는 양성 대조군도 준비하였다. 이중 감염 배양물을 모든 실험 배양물의 평균 생존 세포수와 동일한 수의 세포로 씨딩하였다. 이중 감염 대조군을, 각각, 각각의 샘플에 대해 1:5,000의 최종 희석으로, Rep 및 리포터 유전자 BIIC로 감염시켰다. 감염 후, 배양물을 상기 기재된 진탕 조건 하의 인큐베이터에 다시 넣었다. 세포수, 성장 및 생존력 매트릭스를 감염 후 3일 동안 모든 플라스크에 대해 매일 측정하였다. 새롭게 감염된 배양물이 진탕 인큐베이션 조건 하에서 약 2시간 동안 회복되도록 한 후에, T=0 시점 측정치를 취하였다. 3일 후, 15분 동안 원심분리하여 세포를 수거하였다. 상청액을 제거하고, 펠릿의 질량을 기록하고, DNA 추출 시까지 펠릿을 -80℃에서 동결시켰다.

제조업체의 "고수율" 프로토콜에 따라 Qiagen Plasmid Plus Midi Purification kit(Qiagen)을 사용하여 모든 플라스크(실험군 및 대조군)에서 추정되는 미정제 ceDNA를 추출하였다. NanoDrop OneC(ThermoFisher)에서 입수한 광학 밀도 측정을 사용하여 용출액을 정량화하였다. 수득한 ceDNA 추출물을 4℃에서 보관하였다.

상기 ceDNA 추출물을 TrackIt 1 kb Plus DNA ladder와 함께, SYBR Safe Gel Stain(ThermoFisher Scientific)의 1:10,000 희석으로 준비된 미변성 아가로오스(1% 아가로오스, 1x TAE 완충액) 겔 상에 실행시켰다. 이어서, UV/청색 조명 하에서 Gbox Mini Imager를 사용하여 겔을 가시화하였다. 상기 기재된 바와 같이, 미변성 겔 상에서 실행된 ceDNA 샘플에서 2개의 주요 밴드가 예상되었다: 단량체 종을 나타내는 약 4,000 bp 밴드와 이량체 종에 해당하는 약 8,000 bp 밴드. 야생형 샘플을 시험하고, 미변성 아가로오스 겔 상에서 예상되는 단량체 및 이량체 밴드를 표시하였다. 구조체의 대표적인 샘플에 대한 결과는 도 25에 제시되어 있다. 소규모 생산의 추정되는 미정제 ceDNA 및 대조군 추출물을 결합된 제한 소화 및 변성 아가로오스 겔을 사용하여 추가로 검정하여, ceDNA의 이중가닥 DNA 구조 진단을 확인하였다. 야생형 ceDNA는 단일 ClaI 제한 부위를 갖는 것으로 예상되며, 따라서, 적절하게 형성되는 경우, ClaI 소화 시 2개의 특징적인 단편을 생성한다. 고충실도 제한 엔도뉴클레아제 ClaI(New England Biolabs)를 사용하여 제조업체의 설명서에 따라 추정되는ceDNA 추출물을 소화시켰다. 모의군 및 성장 대조군으로부터의 추출물은, NanoDrop (ThermoFisher)을 사용하는 분광광도법적 정량화 및 미변성 아가로오스 겔 분석 시 용출액에서 검출 가능한 ceDNA/플라스미드 유사 산물이 없다고 밝혀졌기 때문에, 검정하지 않았다. 정제되고 소화된 물질을 Qiagen 용리 완충액 대신 뉴클레아제 미함유 물에서 용리한 것을 제외하고는, 제조업체의 설명서에 따라 Qiagen PCR Clean-up Kit(Qiagen)를 사용하여 소화된 물질을 정제하였다. 알칼리성 아가로오스 겔(0.8% 알칼리성 아가로오스)을 평형 완충액(1 mM EDTA, 200 mM NaOH)에서 4℃에서 밤새 평형화시켰다. 10x 변성 용액(50 mM NaOH, 1 mM EDTA)을 정제된 ceDNA 소화물 및 상응하는 소화되지 않은 ceDNA(총 1 ug)의 샘플에 첨가하고, 및 상기 샘플을 65℃에서 10분 동안 가열하였다. 10x 로딩 염료(브로모페놀 블루, 50% 글리세롤)를 각각의 변성된 샘플에 첨가하고, 혼합하였다. TrackIt 1 kb Plus DNA ladder(ThermoFisher Scientific)를 또한 참조로서 겔 상에 로딩하였다. 겔을 4℃ 및 정전압(25 V)에서 약 18시간 동안 실행시킨 후, 탈이온화된 H₂O로 세척하고, 1xTAE(트리스-아세테이트, EDTA) 완충액(pH 7.6)에서 약한 교반 하에서 20분 동안 중화시켰다. 이어서, 겔을 약한 교반 하에 약 1시간 동안 1x TAE/1x SYBR Gold 용액으로 옮겼다. 이어서, UV/청색 조명 하에서 Gbox Mini Imager(Syngene)를 사용하여 겔을 가시화하였다. 절제되지 않은 변성된 샘플은 약 9,000 bp에서 이동할 것으로 예상되었으며, ClaI 처리된 샘플은 약 2,000 bp에서 하나와 약 6,000 bp에서 하나의 2개의 밴드를 가질 것으로 예상되었다.

ClaI 처리된 샘플에서 각각의 샘플 레인에는, 예상되는 약 9,000 bp의 크기로 이동하였던 소화되지 않은 샘플과 뚜렷한 대조를 이루며, 예상되는 크기로 변성 겔 상에서 이동하는 2개의 유의한 밴드가 보였다. 도 26은, 대표적인 샘플에 대한 결과를 보여주며, 여기서 소화되지 않은 샘플에서 보이는 단일 밴드와 비교하여, 소화된 샘플의 경우에는 배경 위에 2개의 밴드가 확인되었다. 따라서, 샘플은 ceDNA를 정확하게 형성하는 것으로 보였다.

인간 세포 배양에서의 기능성 발현

소규모 생산 과정에 의해 생산된 WT/WT ITR ceDNA의 기능성을 평가하기 위해, HEK293 세포를 WT/WT ceDNA 샘플로 트랜스펙션시켰다. 능동적으로 분할되는 HEK293 세포를 96-웰 마이크로티터 플레이트에 웰당 3x10⁶개의 세포(80% 컨플루언시(confluency))로 플레이팅하고, 부착성 HEK293 배양물에 대해 상기 기재된 조건에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 후, 총 200 ng의 미정제 소규모 ceDNA를 리포펙타민(Invitrogen, TheromoFisher Scientific)을 사용하여 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 복합체를 제조업체의 설명서에 따라 준비하고, 총 부피10 μL의 트랜스펙션 복합체를 사용하여 상기 플레이팅된 HEK293 세포를 트랜스펙션시켰다. 모든 실험 구조체와 대조군은 3중으로 검정하였다. 트랜스펙션 세포를 상기 기재된 조건에서 72시간 동안 인큐베이션하였다. 72시간 후, 96-웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고, 간단하게 실온으로 평형화시켰다. GFP 발현에 대한 검정은 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. SpectraMax M Series 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 총 발광을 측정하였다. 반복 측정 값의 평균을 내었다. 인간 세포 배양에서 GFP의 발현은, ceDNA가 인간 세포의 맥락에서 각각의 샘플에 대해 정확하게 형성되고 발현되었음을 나타낸다.

실시예 8: ITR 보행 대칭 돌연변이 스크리닝

ceDNA 형성에 대한 ITR 구조의 관계에 대해 추가 분석을 수행하였다. ceDNA 형성 및 ceDNA 인코딩된 전이유전자를 발현하는 능력에 대한 특정 구조 변화의 영향을 알아보기 위해 일련의 돌연변이체를 구축하였다. 돌연변이체 구축, ceDNA 형성의 검정, 및 인간 세포 배양에서의 ceDNA 전이유전자 발현의 평가는 상기에 상세하게 기재된 방법과 유사한 방식으로 수행하였다.

돌연변이 ITR 구축

고유한 대칭 AAV II형 ITR 돌연변이 카세트를 갖는 16개 플라스미드의 라이브러리를 가상으로 설계하고, 이어서 Sf9 곤충 세포 및 인간 배아신장세포(HEK293)에서 평가하였다. 각각의 ITR 카세트에는 곤충 세포에서의 발현을 위한 p10 프로모터 서열에 의해 구동되는 루시퍼라아제(LUC) 또는 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터 유전자, 및 포유류 세포에서의 발현을 위한 CAG 프로모터 서열이 함유되어 있었다. ITR 서열에 대한 돌연변이를 우측 및 좌측 ITR 영역 모두에 대칭으로 형성하였다. 상기 라이브러리에는 본원의 표 4에 개시된 바와 같은 16개의 우측 이중 돌연변이체가 함유되어 있었으며, 예상되는 구조는 도 7a 내지 도 22b에 제시되어 있다.

Sf9 현탁 배양물을 벤트가 있는 200 mL 조직 배양 플라스크 내 Sf900 III 배지(Gibco) 중에 유지시켰다. 배양물을 48시간마다 계대하고, ViCell 계수기(Beckman Coulter)를 사용하여 각 계대 전 세포수 및 성장 매트릭스를 측정하였다. 배양물을 27℃에서 진탕 조건(1" 궤도, 130 rpm) 하에서 유지시켰다. HEK293 세포의 부착성 배양물을 37℃ 및 5% CO₂에서, 250 mL 배양 플라스크 내 1% 태아소혈청 및 0.1% PenStrep가 포함된 GlutiMax DMEM(둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium), Gibco)에서 유지시켰다. 배양물을 트립신처리하고, 96시간마다 계대하였다. 90% 내지 100% 컨플루언트 플라스크의 1:10 희석을 사용하여 각각의 계대를 씨딩하였다.

ceDNA 벡터를 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 생성하고 구축하였다. 간략하게, 도 5b를 참조하여, 플라스미드 구조체로 형질도입된 Sf9 세포를 27℃에서 고정 조건 하에서 24시간 동안 부착 성장시켰다. 24시간 후, 트랜스펙션된 Sf9 세포를 바큐로바이러스 감염된 곤충 세포(BIIC)를 통해 Rep 벡터로 감염시켰다. BIIC는 감염성을 특징분석하기 위해 이전에 분석된 것으로, 1:2000의 최종 희석으로 사용하였다. Sf900 곤충 세포 배지에 1:100로 희석된 BIIC를 각각의 이전에 트랜스펙션된 세포 웰에 첨가하였다. 비Rep 벡터 BIIC를 음성 대조군으로서 웰의 서브세트에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 로커에서 약하게 진탕시키면서 2분 동안 혼합하였다. 이어서, 세포를 27℃ 고정 조건 하에서 추가 48시간 동안 성장시켰다. 모든 실험 구조체와 대조군은 3중으로 검정하였다.

48시간 후, 96-웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내고, 간단하게 실온까지 평형화시킨 후, 루시퍼라아제 발현(OneGlo Luciferase Assay(Promega Corporation))에 대해 검정하였다. SpectraMax M Series 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 총 발광을 측정하였다. 반복 측정 값의 평균을 내었다. 표 7의 대칭 ITR 돌연변이 구조체의 루시퍼라아제 활성은 도 23에 제시되어 있다. 예상한 바와 같이, 3개의 음성 대조군(배지만, 공여체 DNA가 결여된 모의 트랜스펙션, 및 Rep 함유 바큐로바이러스 세포의 부재 하에서 처리된 샘플)은 유의한 루시퍼라아제 발현을 나타내지 않았다. 각각의 돌연변이체 샘플에서 강력한 GFP 발현이 관찰되었으며, 이는 각각의 샘플에 대해 ceDNA 인코딩된 전이유전자가 돌연변이와 관계없이 성공적으로 트랜스펙션되고 발현되었음을 나타낸다.

실시예 9: 대칭인 돌연변이 ITR을 갖는 ceDNA 구조체로부터의 루시퍼라아제 발현의 생체내 평가

CD-1 마우스(N=30, 수컷, 약 4주령)를 Sf9에서 생산된 다양한 유형의 ceDNA 및 상기 기재된 합성 접근법을 이용하여 처리하였다. 특히, 좌측 및 우측 모두에 대칭 구성으로 돌연변이 ITR을 갖는 ceDNA 구조체(구조체-388)(도 27; 좌측 패널 참조)와, 좌측 및 우측 모두에 야생형 AAV ITR을 갖는ceDNA 구조체(구조체-393)(도 27; 우측 패널 참조)를 생체내 발현에 대해 비교하였다. 이러한 구조체는 상기 기재된 바와 같이 Sf9 세포에서 생산하여, LNP으로 제형화한 것이었다. 또한, 구조체의 좌측에 야생형 AAV2 ITR과 우측에 절단된 돌연변이 ITR을 갖는, ITR의 비대칭 구성을 갖는 Sf9에서 생산된 ceDNA를 또한 LNP로 제형화하고, 대조군으로 사용하였다. 나아가, 대칭 또는 비대칭 ITR 구성을 갖는 합성적으로 생산된 ceDNA를 발현 수준에 대해서도 시험하였다.

케이지 측면의 관찰은 매일 수행하고; 임상 관찰은 투여 1시간, 6시간 및 24시간 후에 수행하였다. 모든 동물의 체중을 표시된 시점에서 기록하였다(도 28 참조).

ceDNA를 측면 꼬리 정맥을 통한 IV 투여로 0일차에 5 mL/kg로 투여하였다. 동물에게 2.5 mL/kg의 복강내(IP) 주사를 통해 150 mg/kg(60 mg/mL)의 루시페린을 투여하였다. 루시페린 투여 후 15분 이내에, 모든 동물은 IVIS 영상화 및 측정 세션을 거쳤다. 도 28에 제시된 바와 같이, 구조체-388가 투여된 동물에서 체중 변화율은, 6일차에 구조체-393로 처리된 동물과 유사하였다(도 28). 루시퍼라아제 발현 수준에 해당하는 IVIS 측정 결과는 도 29a와 도 29b에 제시되어 있다. 놀랍게도, 구조체의 좌측 및 우측에 돌연변이 ITR을 갖는 ceDNA 구조체(즉, 구조체-388)의 생체내 발현은, 구조체의 좌측 및 우측에 모두 야생형 AAV ITR을 갖는 ceDNA 구조체(즉, 구조체-393)에서 확인된 수준과 유사한 수준으로 관찰되었다(도 29a 및 도 29b). 이러한 데이터는, 기능성 ceDNA 국부화 및 발현에 온전한 ITR이 필요하지 않을 수 있음을 시사한다. 나아가, 본원에 기재된 무세포 방법에 의해 생산된 합성 ceDNA는 또한 예상된 바와 같이 강력한 발현 수준을 나타냈다(도 29a 참조).

참고문헌

특허, 특허 출원, 국제 특허 출원 및 간행물을 포함하여, 명세서 및 실시예에 열거되고 개시된 모든 참고문헌은, 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> GENERATION BIO CO. <120> MODIFIED CLOSED-ENDED DNA (CEDNA) COMPRISING SYMMETRICAL MODIFIED INVERTED TERMINAL REPEATS <130> 131698-05320 <140> PCT/US2019/060395 <141> 2019-11-08 <150> 62/757,872 <151> 2018-11-09 <150> 62/757,892 <151> 2018-11-09 <160> 574 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 2 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 2 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 120 tgcctgcagg 130 <210> 3 <211> 1923 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg 540 cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta 600 attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg 660 gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg 720 cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg 780 aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac gctgccttcg ccccgtgccc 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 5 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180 gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240 gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300 gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360 gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420 ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa 480 gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg 540 gaactga 547 <210> 6 <211> 1179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 6 ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg 60 ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt 120 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tgtgctctgt gtttgctgac 420 gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480 ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540 ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c 581 <210> 9 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 9 tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60 ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 120 gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 180 ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 225 <210> 10 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 10 taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta 60 tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag 120 ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt 180 tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gta 213 <210> 11 <211> 1260 <212> DNA <213> Adeno-associated virus - 2 <400> 11 atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag 60 gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag 120 gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg 180 gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta 240 aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc 300 ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg 360 gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt 420 cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc 480 aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa 540 tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg 600 tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg 660 atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag 720 gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc 780 tacgtcaaaa 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Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg 60 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240 tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300 caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 360 tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 420 cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480 gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 540 cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 600 gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 660 atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 720 ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 780 caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 17 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 18 <211> 241 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60 ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120 aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180 atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240 c 241 <210> 19 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 19 gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa 60 cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc 120 tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg 180 gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac 215 <210> 20 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 ataaacgata acgccgttgg tggcgtgagg catgtaaaag gttacatcat tatcttgttc 60 gccatccggt tggtataaat agacgttcat gttggttttt gtttcagttg caagttggct 120 gcggcgcgcg cagcaccttt gcggccatct 150 <210> 21 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc 60 tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc 120 cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag 180 gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 240 gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 300 gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 360 gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 420 ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa 480 gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg 540 gaactg 546 <210> 22 <211> 317 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 60 agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 120 tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 180 ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 240 aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 300 gcctaggctt ttgcaaa 317 <210> 23 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa 60 cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata 120 atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag 180 tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc 240 cctattgacg 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attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc taattcaaag caa 1313 <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 25 Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His Ser <210> 26 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 26 Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala 1 5 10 15 Ser Arg Gly <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 27 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 28 <400> 28 000 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <400> 30 000 <210> 31 <400> 31 000 <210> 32 <400> 32 000 <210> 33 <400> 33 000 <210> 34 <400> 34 000 <210> 35 <400> 35 000 <210> 36 <400> 36 000 <210> 37 <400> 37 000 <210> 38 <400> 38 000 <210> 39 <400> 39 000 <210> 40 <400> 40 000 <210> 41 <400> 41 000 <210> 42 <400> 42 000 <210> 43 <400> 43 000 <210> 44 <400> 44 000 <210> 45 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 ggttga 6 <210> 46 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 46 agtt 4 <210> 47 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 47 ggttgg 6 <210> 48 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 agttgg 6 <210> 49 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 49 agttga 6 <210> 50 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 50 rrttrr 6 <210> 51 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 51 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 52 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 52 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 53 <211> 3123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 53 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcc 60 cgggcgcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg 120 gttcctgaac agagaaacag gagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc 180 ctgccccggc tcagggccaa gaacagttgg aacagcagaa tatgggccaa acaggatatc 240 tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc 300 ccgccctcag cagtttctag 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cgtgagattc tcgcatgcca gagatcctat 1200 ttttggcaat caaatcattc cggatactgc gattttaagt gttgttccat tccatcacgg 1260 ttttggaatg tttactacac tcggatattt gatatgtgga tttcgagtcg tcttaatgta 1320 tagatttgaa gaagagctgt ttctgaggag ccttcaggat tacaagattc aaagtgcgct 1380 gctggtgcca accctattct ccttcttcgc caaaagcact ctgattgaca aatacgattt 1440 atctaattta cacgaaattg cttctggtgg cgctcccctc tctaaggaag tcggggaagc 1500 ggttgccaag aggttccatc tgccaggtat caggcaagga tatgggctca ctgagactac 1560 atcagctatt ctgattacac ccgaggggga tgataaaccg ggcgcggtcg gtaaagttgt 1620 tccatttttt gaagcgaagg ttgtggatct ggataccggg aaaacgctgg gcgttaatca 1680 aagaggcgaa ctgtgtgtga gaggtcctat gattatgtcc ggttatgtaa acaatccgga 1740 agcgaccaac gccttgattg acaaggatgg atggctacat tctggagaca tagcttactg 1800 ggacgaagac gaacacttct tcatcgttga ccgcctgaag tctctgatta agtacaaagg 1860 ctatcaggtg gctcccgctg aattggaatc catcttgctc caacacccca acatcttcga 1920 cgcaggtgtc gcaggtcttc ccgacgatga cgccggtgaa cttcccgccg ccgttgttgt 1980 tttggagcac ggaaagacga tgacggaaaa 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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 58 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tggctcagag gctcagaggc acacaggagt ttctgggctc 180 accctgcccc cttccaaccc ctcagttccc atcctccagc agctgtttgt gtgctgcctc 240 tgaagtccac actgaacaaa cttcagccta ctcatgtccc taaaatgggc aaacattgca 300 agcagcaaac agcaaacaca cagccctccc tgcctgctga ccttggagct ggggcagagg 360 tcagagacct ctctgggccc atgccacctc caacatccac tcgacccctt ggaatttcgg 420 tggagaggag cagaggttgt cctggcgtgg tttaggtagt gtgagagggt ccgggttcaa 480 aaccacttgc tgggtgggga gtcgtcagta agtggctatg ccccgacccc gaagcctgtt 540 tccccatctg tacaatggaa atgataaaga cgcccatctg atagggtttt tgtggcaaat 600 aaacatttgg tttttttgtt ttgttttgtt ttgttttttg agatggaggt ttgctctgtc 660 gcccaggctg gagtgcagtg acacaatctc atctcaccac aaccttcccc tgcctcagcc 720 tcccaagtag ctgggattac aagcatgtgc caccacacct ggctaatttt ctatttttag 780 tagagacggg tttctccatg ttggtcagcc tcagcctccc aagtaactgg gattacaggc 840 ctgtgccacc acacccggct aattttttct atttttgaca gggacggggt ttcaccatgt 900 tggtcaggct ggtctagagg taccggatct tgctaccagt ggaacagcca ctaaggattc 960 tgcagtgaga gcagagggcc agctaagtgg tactctccca gagactgtct gactcacgcc 1020 accccctcca ccttggacac aggacgctgt ggtttctgag ccaggtacaa tgactccttt 1080 cggtaagtgc agtggaagct gtacactgcc caggcaaagc gtccgggcag cgtaggcggg 1140 cgactcagat cccagccagt ggacttagcc cctgtttgct cctccgataa ctggggtgac 1200 cttggttaat attcaccagc agcctccccc gttgcccctc tggatccact gcttaaatac 1260 ggacgaggac agggccctgt ctcctcagct tcaggcacca ccactgacct gggacagtgc 1320 cgccaccatg gaagacgcca aaaacataaa gaaaggcccg gcgccattct atccgctgga 1380 agatggaacc gctggagagc aactgcataa ggctatgaag agatacgccc tggttcctgg 1440 aacaattgct tttacagatg cacatatcga ggtggacatc acttacgctg agtacttcga 1500 aatgtccgtt cggttggcag aagctatgaa acgatatggg ctgaatacaa atcacagaat 1560 cgtcgtatgc agtgaaaact ctcttcaatt ctttatgccg gtgttgggcg 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ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcc 60 cgggcgcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg 120 gttcct 126 <210> 64 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 64 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgcccggga aacccgggcg tgcgcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 120 <210> 65 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 65 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 66 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 66 aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt 60 cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc 120 tgcggcgcgc gcagcacctt t 141 <210> 67 <211> 1876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 67 cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga 60 gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt 120 gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga 180 gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct 240 tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac 300 caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat 360 tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac 420 cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt 480 gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag 540 cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc 600 gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag 660 atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac 720 ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc 780 caactcgcgg tcccaaatca 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tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc 1680 aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc 1740 tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat 1800 gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg 1860 catctttgaa caataa 1876 <210> 68 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 68 atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc 60 gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca 120 tcgggcgcg 129 <210> 69 <211> 1203 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 69 gccgccacca tggagttggt gggctggctc gtggacaaag gcattacttc ggaaaagcag 60 tggattcagg aggatcaggc atcttacatc tcattcaacg ctgccagtaa ctcgaggtcc 120 cagatcaagg cagcgctgga caacgcggga aagattatga gtctgaccaa aactgctcca 180 gactacctcg ttggtcagca accggtggaa gatatctcca gcaacaggat ctacaagatt 240 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ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat 60 ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt 120 actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc 180 tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt 240 aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct 300 attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 360 ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac 420 gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct 480 ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 540 ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c 581 <210> 73 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 73 tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 60 ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 120 gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 180 ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc 225 <210> 74 <211> 1177 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 74 ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc 60 tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac 120 ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac 180 agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca 240 tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc 300 ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag 360 tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa 420 tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt 480 tgttttgttt tgttttttga gatggaggtt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga 540 cacaatctca tctcaccaca accttcccct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca 600 agcatgtgcc accacacctg gctaattttc tatttttagt agagacgggt ttctccatgt 660 tggtcagcct cagcctccca agtaactggg attacaggcc tgtgccacca cacccggcta 720 attttttcta tttttgacag ggacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctagaggt 780 accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca 840 gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca 900 ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg 960 tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg 1020 gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca 1080 gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc 1140 tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt 1177 <210> 75 <400> 75 000 <210> 76 <400> 76 000 <210> 77 <400> 77 000 <210> 78 <400> 78 000 <210> 79 <400> 79 000 <210> 80 <400> 80 000 <210> 81 <400> 81 000 <210> 82 <400> 82 000 <210> 83 <400> 83 000 <210> 84 <400> 84 000 <210> 85 <400> 85 000 <210> 86 <400> 86 000 <210> 87 <400> 87 000 <210> 88 <400> 88 000 <210> 89 <400> 89 000 <210> 90 <400> 90 000 <210> 91 <400> 91 000 <210> 92 <400> 92 000 <210> 93 <400> 93 000 <210> 94 <400> 94 000 <210> 95 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 95 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 96 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 96 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60 aagcgagcgc gc 72 <210> 97 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 97 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 98 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 98 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 99 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 99 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca 120 gg 122 <210> 100 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 100 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc 120 tgcctgcagg 130 <210> 101 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 101 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtgcgcct cagtgagcga 60 gcgagcgcgc 70 <210> 102 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 102 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcacgc ccgggtttcc cgggcggcct cagtgagcga 60 gcgagcgcgc 70 <210> 103 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 103 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 104 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 104 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 105 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 105 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 106 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 106 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc 60 gagcgagcgc gc 72 <210> 107 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 107 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg ctttgcccgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 108 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 108 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca aagcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 60 cctcagtgag cgagcgagcg cgc 83 <210> 109 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 109 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaac gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag 60 tgagcgagcg agcgcgc 77 <210> 110 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 110 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgtt tcggcctcag 60 tgagcgagcg agcgcgc 77 <210> 111 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 111 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcaaagcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51 <210> 112 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 112 gcgcgctcgc tcgctcactg aggctttgcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 51 <210> 113 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 113 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 114 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 114 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 115 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 115 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgc 77 <210> 116 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 116 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 117 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 117 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgactttgtc 60 gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89 <210> 118 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaagtcgc ccgacgcccg ggctttgccc 60 gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89 <210> 119 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 119 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgattttcgc 60 ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 120 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 120 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaaatcgccc gacgcccggg ctttgcccgg 60 gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 121 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 121 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgtttcgccc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 122 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 122 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaacgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 123 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 123 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtcgggcg acctttggtc 60 gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89 <210> 124 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 124 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggtttccc 60 gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 89 <210> 125 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg gaaaccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc 60 ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 126 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cggtttccgg 60 gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 87 <210> 127 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg aaacgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc 60 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 85 <210> 128 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg 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<220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac cggtcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 138 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgca cgtgcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 139 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 140 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagac cggtctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 141 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaca cgtgtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 142 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 143 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 143 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca cgtgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 144 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 144 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaacc cgggttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 145 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 145 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg 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150 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaac cggtttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 151 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagaa cgttctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 152 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 153 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaaa cgtttggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 154 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa atttcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 155 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 155 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 156 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 156 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaacc atggttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 157 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 157 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaac atgttggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 158 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 158 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagac atgtctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 159 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 159 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaca attgtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 160 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaaa cgttttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 161 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 161 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaac atgtttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 162 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 162 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaca attgttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 163 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 163 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaagaa atttctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 164 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 164 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacaaa attttggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 165 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 165 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgaaaaa atttttgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 166 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 166 gcgcgctcgc tcgctcgctg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 167 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 gcgcgctcgc tcgctcaatg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 168 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 gcgcgctcgc tcgctcaccg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cggtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 169 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 170 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 gcgcgctcgc tcgctcactg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 171 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 gcgcgctcgc tcgctcactg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 172 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 172 gcgcgctcgc tcgctcactg agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 173 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 173 gcgcgctcgc tcgctcgatg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 174 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 174 gcgcgctcgc tcgctcgcgg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 175 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 175 gcgcgctcgc tcgctcgcta aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 176 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 176 gcgcgctcgc tcgctcgctg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 cagcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 177 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 177 gcgcgctcgc tcgctcgctg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt 60 cagcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 178 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 178 gcgcgctcgc tcgctcgctg agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtct 60 cagcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 179 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 179 gcgcgctcgc tcgctcgagg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 180 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 180 gcgcgctcgc tcgctcgata aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 tatcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 181 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 181 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 182 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 182 gcgcgctcgc tcgctcgatg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 183 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 183 gcgcgctcgc tcgctcgatg agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 184 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 184 gcgcgctcgc tcgctcgaga aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 185 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 185 gcgcgctcgc tcgctcgagg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 cctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 186 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 186 gcgcgctcgc tcgctcgagg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt 60 cctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 187 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 187 gcgcgctcgc tcgctcgagg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 cctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 188 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 188 gcgcgctcgc tcgctcgagg aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt 60 cctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 189 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 gcgcgctcgc tcgctcgagg agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtct 60 cctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 190 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 190 gcgcgctcgc tcgctcgaga gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 191 <400> 191 000 <210> 192 <400> 192 000 <210> 193 <400> 193 000 <210> 194 <400> 194 000 <210> 195 <400> 195 000 <210> 196 <400> 196 000 <210> 197 <400> 197 000 <210> 198 <400> 198 000 <210> 199 <400> 199 000 <210> 200 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 gcgcgctcgc tcgctcgaga aagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctt 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 201 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 gcgcgctcgc tcgctcgaga agaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 202 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 gcgcgctcgc tcgctcgaga gagccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggctc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 203 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 gcgcgctcgc tcgctcgaga ggaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggtcc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 204 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 205 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 gcgcgctcgc tcgctcaaga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc 60 tcttgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 206 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 gcgcgctcgc tcgctcacga gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc 60 tcgtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 207 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 gcgcgctcgc tcgctcacta gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 208 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 gcgcgctcgc tcgctcactg gaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttc 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 209 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 gcgcgctcgc tcgctcactg aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttt 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 210 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 211 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 212 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 213 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgagcg accaaaggtc gctcgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 214 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccggacg accaaaggtc gtccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 215 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggag accaaaggtc tcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 216 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca accaaaggtt gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 217 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 218 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aacaaagttc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 219 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 220 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaagcg accaaaggtc gcttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 221 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaacg accaaaggtc gtttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 222 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaag accaaaggtc ttttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 223 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa accaaaggtt ttttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 224 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa gccaaaggct ttttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 225 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa gacaaagtct ttttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 226 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa gaaaaattct ttttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 227 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 228 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaaa aaaaaatttt tttcgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 229 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccggaaa gaaaaattct ttccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 230 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 230 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggaa gaaaaattct tcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 231 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 232 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 232 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gaaaaattcc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 233 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 233 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaaaaatttc gcccgacgcc cgggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 234 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 234 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 235 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 235 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 236 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 236 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 237 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 237 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 238 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 238 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 239 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 239 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 240 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 240 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 241 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 241 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 242 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 242 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 243 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 243 gcgcgctcgc tcgctcactg 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 269 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc cgggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 270 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 270 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 271 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 271 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 272 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 272 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc cgggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 273 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 273 gcgcgctcgc tcgctcgatg 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 299 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 300 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 300 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 301 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 301 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgac atgtcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 302 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 302 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 303 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 303 gcgcgctcgc tcgctcgatg 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 312 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgacgaa cgttcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 313 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 313 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg accaaaggtc gcccgaagca attgctgccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 314 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 314 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacacc cgggtggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 315 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 315 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc atggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 316 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 329 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 330 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 330 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 331 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 331 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 332 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 332 gcgcgctcgc tcgctcacta aggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggcct 60 tagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 333 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 333 gcgcgctcgc tcgctcacta 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 359 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 360 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 360 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 361 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 361 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 362 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 362 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 363 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 363 gcgcgctcgc tcgctcgatg 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<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 372 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgacgaa cgttcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 373 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 373 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccaaaaa aaaaaatttt ttttgaagca attgctgcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 374 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 374 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacacc cgggtggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 375 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 375 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgcc atggcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 376 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 376 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 377 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 377 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 378 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 378 gcgcgctcgc tcgctcgatg gggccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgcct 60 catcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 379 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 379 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 380 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 380 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 389 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 390 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 390 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 391 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 391 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 392 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 392 gcgcgctcgc tcgctcgaga gaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggttc 60 tctcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 393 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 393 gcgcgctcgc tcgctcgaga 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 419 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 420 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 420 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 421 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 421 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 422 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 422 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 423 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 423 gcgcgctcgc tcgctcgcgg 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<400> 436 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgac atgtcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 437 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 437 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgacgaa cgttcggccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 438 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 438 gcgcgctcgc tcgctcgcgg gggccgggca gaaaaattct gcccgaagca attgctgccc 60 ccgcgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 439 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 439 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacacc cgggtggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 440 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 440 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgcc atggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 441 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 441 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgac atgtcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 442 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 442 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgacgaa cgttcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 443 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 443 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccaggcg accaaaggtc gcctgaagca attgctgttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 444 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 444 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacacc cgggtggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 445 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 445 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgcc atggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 446 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 446 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgac atgtcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 447 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 447 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgacgaa cgttcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 448 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 448 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg gccaaaggcc gcccgaagca attgctgttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 449 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 449 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacacc cgggtggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 450 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 450 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgcc atggcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 451 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 451 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgac atgtcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 452 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 452 gcgcgctcgc tcgctcaata aaaccgggcg acaaaatgtc gcccgacgaa cgttcggttt 60 tattgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 453 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 453 gcgcgctcgc tcgctcaata 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polynucleotide <400> 477 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gtttcccggg cggcctcagt gagcgagcga 120 gcgcgcagct gcctgcagg 139 <210> 478 <211> 137 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 478 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg tttccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 120 gcgcagctgc ctgcagg 137 <210> 479 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 479 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgt ttcgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 120 gcagctgcct gcagg 135 <210> 480 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 480 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 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<400> 494 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccggaaaccg ggcgtcgggc 60 gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 120 catcactagg ggttcct 137 <210> 495 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 495 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgaaacggg cgtcgggcga 60 cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca 120 tcactagggg ttcct 135 <210> 496 <211> 133 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 496 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccaaagggcg tcgggcgacc 60 tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc 120 actaggggtt cct 133 <210> 497 <211> 131 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 497 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc caaaggcgtc gggcgacctt 60 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac 120 taggggttcc t 131 <210> 498 <211> 129 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 498 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc aaagcgtcgg gcgacctttg 60 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 120 ggggttcct 129 <210> 499 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 499 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccga aacgtcgggc gacctttggt 60 cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg 120 ggttcct 127 <210> 500 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 500 gcccgctggt ttccagcggg ctgcgggccc gaaacgggcc cgc 43 <210> 501 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 501 cgggcccgtg cgggcccaaa gggcccgc 28 <210> 502 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 502 gcccgggcac gcccgggttt cccgggcg 28 <210> 503 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 503 cgtgcgggcc caaagggccc gc 22 <210> 504 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 504 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 505 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 505 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 506 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 506 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gc 42 <210> 507 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 507 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 508 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 508 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 509 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 509 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg cggc 34 <210> 510 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 510 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 511 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 511 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 512 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 512 cggggcccga cgcccgggct ttgcccgggc 30 <210> 513 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 513 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 514 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 514 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 515 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 515 cgggcccgac gcccgggctt tgcccgggc 29 <210> 516 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 516 cgggcgacca aaggtcgccc g 21 <210> 517 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 517 cgcccgggct ttgcccgggc 20 <210> 518 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 518 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 519 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 519 cgggcgacct ttggtcgccc g 21 <210> 520 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 520 gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cg 42 <210> 521 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 521 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 522 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 522 gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc g 31 <210> 523 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 523 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 524 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 524 cgggcgacct ttggtcgccc g 21 <210> 525 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 525 gccgcccggg cgacgggcga cctttggtcg cccg 34 <210> 526 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 526 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 527 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 527 cgggcgacct ttggtcgccc g 21 <210> 528 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 528 gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc g 31 <210> 529 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 529 cgggcgacct ttggtcgccc g 21 <210> 530 <211> 1653 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 530 atgccgccac cccggaccgg ccgaggcctt ctctggctgg gtctggttct gagctccgtc 60 tgcgtcgccc tcggatccga aacgcaggcc aactcgacca cagatgctct gaacgttctt 120 ctcatcatcg tggatgacct gcgcccctcc ctgggctgtt atggggataa gctggtgagg 180 tccccaaata ttgaccaact ggcatcccac agcctcctct tccagaatgc ctttgcgcag 240 caagcagtgt gcgccccgag ccgcgtttct ttcctcactg gcaggagacc tgacaccacc 300 cgcctgtacg acttcaactc ctactggagg gtgcacgctg gaaacttctc caccatcccc 360 cagtacttca aggagaatgg ctatgtgacc atgtcggtgg gaaaagtctt tcaccctggg 420 atatcttcta accataccga tgattctccg tatagctggt cttttccacc ttatcatcct 480 tcctctgaga agtatgaaaa cactaagaca tgtcgagggc cagatggaga actccatgcc 540 aacctgcttt gccctgtgga tgtgctggat gttcccgagg gcaccttgcc tgacaaacag 600 agcactgagc aagccataca gttgttggaa aagatgaaaa cgtcagccag tcctttcttc 660 ctggccgttg ggtatcataa gccacacatc cccttcagat accccaagga atttcagaag 720 ttgtatccct tggagaacat caccctggcc cccgatcccg aggtccctga tggcctaccc 780 cctgtggcct acaacccctg gatggacatc aggcaacggg aagacgtcca agccttaaac 840 atcagtgtgc cgtatggtcc aattcctgtg gactttcagc ggaaaatccg ccagagctac 900 tttgcctctg tgtcatattt ggatacacag gtcggccgcc tcttgagtgc tttggacgat 960 cttcagctgg ccaacagcac catcattgca tttacctcgg atcatgggtg ggctctaggt 1020 gaacatggag aatgggccaa atacagcaat tttgatgttg ctacccatgt tcccctgata 1080 ttctatgttc ctggaaggac ggcttcactt ccggaggcag gcgagaagct tttcccttac 1140 ctcgaccctt ttgattccgc ctcacagttg atggagccag gcaggcaatc catggacctt 1200 gtggaacttg tgtctctttt tcccacgctg gctggacttg caggactgca ggttccacct 1260 cgctgccccg ttccttcatt tcacgttgag ctgtgcagag aaggcaagaa ccttctgaag 1320 cattttcgat tccgtgactt ggaagaggat ccgtacctcc ctggtaatcc ccgtgaactg 1380 attgcctata gccagtatcc ccggccttca gacatccctc agtggaattc tgacaagccg 1440 agtttaaaag atataaagat catgggctat tccatacgca ccatagacta taggtatact 1500 gtgtgggttg gcttcaatcc tgatgaattt ctagctaact tttctgacat ccatgcaggg 1560 gaactgtatt ttgtggattc tgacccattg caggatcaca atatgtataa tgattcccaa 1620 ggtggagatc ttttccagtt gttgatgcct tga 1653 <210> 531 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 531 gcgcgctcgc tcgctc 16 <210> 532 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 532 actgaggc 8 <210> 533 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 533 cgggcgacca aaggtcgccc ga 22 <210> 534 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 534 cgcccgggcg 10 <210> 535 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 535 gcctcagt 8 <210> 536 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 536 gagcgagcga gcgcgc 16 <210> 537 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 537 gcccgggcaa agcccgggcg 20 <210> 538 <211> 165 <212> 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gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 60 ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c 91 <210> 542 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 542 ttaattaa 8 <210> 543 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 543 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct 60 cagtgagcga gcgagcgcgc 80 <210> 544 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 544 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcctttgc ctcagtgagc gagcgagcgc gc 52 <210> 545 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 545 gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgc 79 <210> 546 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 546 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg tttcggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgca g 81 <210> 547 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 547 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgaa acgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc 60 agtgagcgag cgagcgcgca g 81 <210> 548 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 548 cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gc 42 <210> 549 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 549 gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cg 42 <210> 550 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 550 aggaacccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60 cgcccgggca aagcccgggc 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 556 cgcccgggaa acccgggcgt gcccgggc 28 <210> 557 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 557 gggccgcccg ggaaacccgg gcgtgccc 28 <210> 558 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 558 ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60 agacggcaga ggtctcctct gccggcccca ccgagcgagc gacgcgcgca gagagggagt 120 gggcaactcc atcactaggg taa 143 <210> 559 <211> 143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 559 ttaccctagt gatggagttg cccactccct ctctgcgcgc gtcgctcgct cggtggggcc 60 ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga 120 gcgcgcagag agggagtggg caa 143 <210> 560 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 560 ttggccactc cctctatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc 60 agacggacgt gggtttccac gtccggcccc accgagcgag cgagtgcgca tagagggagt 120 ggccaactcc atcactagag gtat 144 <210> 561 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 561 atacctctag tgatggagtt ggccactccc tctatgcgca ctcgctcgct cggtggggcc 60 ggacgtggaa acccacgtcc gtctggcgac ctttggtcgc caggccccac cgagcgagcg 120 agtgcgcata gagggagtgg ccaa 144 <210> 562 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 562 ttggccactc cctctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60 agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagggagtg 120 gccaact 127 <210> 563 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 563 agttggccac attagctatg cgcgctcgct cactcactcg gccctggaga ccaaaggtct 60 ccagactgcc ggcctctggc cggcagggcc gagtgagtga gcgagcgcgc atagagggag 120 tggccaa 127 <210> 564 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 564 tcccccctgt cgcgttcgct cgctcgctgg ctcgtttggg ggggcgacgg ccagagggcc 60 gtcgtctggc agctctttga gctgccaccc ccccaaacga gccagcgagc gagcgaacgc 120 gacagggggg agagtgccac actctcaagc aagggggttt tgtaag 166 <210> 565 <211> 166 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 565 cttacaaaac ccccttgctt gagagtgtgg cactctcccc cctgtcgcgt tcgctcgctc 60 gctggctcgt ttgggggggt ggcagctcaa agagctgcca gacgacggcc ctctggccgt 120 cgccccccca aacgagccag cgagcgagcg aacgcgacag ggggga 166 <210> 566 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 566 ttgcccactc cctctaatgc gcgctcgctc gctcggtggg gcctgcggac caaaggtccg 60 cagacggcag aggtctcctc tgccggcccc accgagcgag cgagcgcgca tagagggagt 120 gggcaactcc atcactaggg gtat 144 <210> 567 <211> 144 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 567 atacccctag tgatggagtt gcccactccc tctatgcgcg ctcgctcgct cggtggggcc 60 ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga 120 gcgcgcatta gagggagtgg gcaa 144 <210> 568 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 568 atcgaacgat cg 12 <210> 569 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 569 cgatcgttcg at 12 <210> 570 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 570 atcgaaccat cg 12 <210> 571 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 571 ggccgccaaa ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcc 39 <210> 572 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 572 ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgcct ttggcggcc 39 <210> 573 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 573 gccgcccggg caaagcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggc 47 <210> 574 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 574 gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggc 47

Claims (66)

1. 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비(非)바이러스성 캡시드 미함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)로서, 2개의 플랭킹(flanking) 대칭 역말단반복(inverted terminal repeat) 서열(대칭 ITR) 사이에 작동 가능하게 배치된 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 대칭 ITR은 야생형 ITR이 아니며, 각각의 플랭킹 ITR은 동일한 대칭 변형을 갖는, ceDNA 벡터.
2. 제1항에 있어서, 상기 대칭 ITR 서열이 합성한 것인, ceDNA 벡터.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 ITR이 표 4에 열거된 것들 중 임의의 것에서 선택되는, ceDNA 벡터.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대칭 ITR이 각각 A, A', B, B', C, C', D 및 D'에서 선택되는 ITR 영역 중 적어도 하나에서 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되는, ceDNA 벡터.
5. 제4항에 있어서, 상기 결실, 삽입 및/또는 치환이 통상적으로 A, A', B, B' C 또는 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조(stem-loop structure)의 전부 또는 일부를 결실시키는, ceDNA 벡터.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 대칭 ITR이 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되는, ceDNA 벡터.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대칭 ITR이 통상적으로 C 및 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 전부 또는 일부를 결실시키는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되는, ceDNA 벡터.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 대칭 ITR이 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 일부 및/또는 통상적으로 C 및 C' 영역으로 형성된 스템-루프 구조의 일부를 결실시키는 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형되는, ceDNA 벡터.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대칭 ITR이 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템-루프 구조를 포함하는, ceDNA 벡터.
10. 제9항에 있어서, 상기 대칭 ITR이 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템과 2개의 루프를 포함하는, ceDNA 벡터.
11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 대칭 ITR이 통상적으로 B 및 B' 영역으로 형성된 제1 스템-루프 구조와 C 및 C' 영역으로 형성된 제2 스템-루프 구조를 포함하는 영역에 단일 스템과 단일 루프를 포함하는, ceDNA 벡터.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대칭 ITR이 본원의 도 7a 내지 도 22b 또는 표 4의 ITR, 및 표 4에 열거된 또는 도 7a 내지 도 22b에 제시된 ITR과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 ITR에서 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 변형된 AAV2 ITR인, ceDNA 벡터.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부가 적어도 하나의 조절 스위치의 제어 하에 있는, ceDNA 벡터.
14. 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 DNA 벡터(ceDNA 벡터)로서, 2개의 플랭킹 야생형 역말단반복 서열(WT-ITR) 사이에 작동 가능하게 배치된 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 여기서 이종 뉴클레오타이드 서열 중 전부 또는 일부는 적어도 하나의 조절 스위치의 제어 하에 있는, ceDNA 벡터.
15. 제14항에 있어서, 상기 WT-ITR 서열이 대칭인 WT-ITR 서열 또는 실질적으로 대칭인 WT-ITR 서열인, ceDNA 벡터.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 WT-ITR 서열이 표 1에 제시된 WT-ITR의 조합 중 임의의 것에서 선택되는, ceDNA 벡터.
17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 플랭킹 WT-ITR이 표 1 또는 표 2에 열거된 ITR과 적어도 95% 서열 동일성을 갖고, 모든 치환이 WT-ITR의 구조에 영향을 미치지 않는 보존적 핵산 치환인, ceDNA 벡터.
18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조절 스위치가 표 5 또는 본원의 "조절 스위치"라는 제목의 섹션에 열거된 조절 스위치 중 임의의 것 또는 조절 스위치의 조합에서 선택되는, ceDNA 벡터.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터 상에 단일 인식 부위를 갖는 제한 효소로 소화되고 미변성 및 변성 겔 전기영동 둘 모두로 분석될 때, 선형 및 비(非)연속 DNA 대조군과 비교하여 선형 및 연속 DNA의 특징적인 밴드를 나타내는, ceDNA 벡터.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ITR 서열이 파르보바이러스(parvovirus), 데펜도바이러스(dependovirus) 및 아데노관련바이러스(AAV: adeno-associated virus)에서 선택되는 바이러스의 서열을 기반으로 하는, ceDNA 벡터.
21. 제20항에 있어서, 상기 ITR이 아데노관련바이러스(AAV)의 서열을 기반으로 하는, ceDNA 벡터.
22. 제21항에 있어서, 상기 ITR이 AAV1, AAV2, AAV3. AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12에서 선택되는 AAV 혈청형의 서열을 기반으로 하는, ceDNA 벡터.
23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 나노담체 내에 존재하는, ceDNA 벡터.
24. 제23항에 있어서, 상기 나노담체가 지질 나노입자(LNP)를 포함하는, ceDNA 벡터.
25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 적어도 하나의 Rep 단백질의 존재 하에서 ceDNA 발현 구조체를 보유하는 곤충 세포 집단을 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 ceDNA 발현 구조체가 곤충 세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 ceDNA 벡터를 인코딩하는 단계; 및 (b) 곤충 세포에서 ceDNA 벡터를 단리하는 단계를 포함하는 공정에서 수득되는, ceDNA 벡터.
26. 제25항에 있어서, 상기 ceDNA 발현 구조체가 ceDNA 플라스미드, ceDNA 박미드(bacmid) 및 ceDNA 바큐로바이러스(baculovirus)에서 선택되는, ceDNA 벡터.
27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 곤충 세포가 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현하는, ceDNA 벡터.
28. 제27항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Rep 단백질이 파르보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노관련바이러스(AAV)에서 선택되는 바이러스에서 유래한 것인, ceDNA 벡터.
29. 제28항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Rep 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12에서 선택되는 AAV 혈청형에서 유래한 것인, ceDNA 벡터.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 ceDNA 벡터를 인코딩하는 ceDNA 발현 구조체.
31. 제30항에 있어서, ceDNA 플라스미드, ceDNA 박미드 또는 ceDNA 바큐로바이러스인, ceDNA 발현 구조체.
32. 제30항 또는 제31항의 ceDNA 발현 구조체를 포함하는 숙주세포.
33. 제32항에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현하는, 숙주세포.
34. 제33항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Rep 단백질이 파르보바이러스, 데펜도바이러스 및 아데노관련바이러스(AAV)에서 선택되는 바이러스에서 유래한 것인, 숙주세포.
35. 제34항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Rep 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12에서 선택되는 AAV 혈청형에서 유래한 것인, 숙주세포.
36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 곤충 세포인, 숙주세포.
37. 제36항에 있어서, 상기 곤충 세포가 Sf9 세포인, 숙주세포.
38. ceDNA 벡터를 생산하는 방법으로서, (a) 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 숙주세포를 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계; 및 (b) 숙주세포에서 ceDNA를 단리하는 단계를 포함하는, ceDNA 벡터를 생산하는 방법.
39. 대상에서 질환 또는 장애를 치료, 예방, 개선, 모니터링 또는 진단하는 방법으로서, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열이 질환 또는 장애를 치료, 예방, 개선, 진단 또는 모니터링하기 위해 선택된 것인, 대상에서 질환 또는 장애를 치료, 예방, 개선, 모니터링 또는 진단하는 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열이, 전사되거나 번역될 때, 상기 대상에서 내인성 단백질의 비정상적인 양을 교정하는, 방법.
41. 제39항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열이, 전사되거나 번역될 때, 상기 대상에서 내인성 단백질 또는 경로의 비정상적인 기능 또는 활성을 교정하는, 방법.
42. 제39항 내제 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열이 RNAi, siRNA, miRNA, lncRNA, 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오타이드 분자를 인코딩하거나 포함하는, 방법.
43. 제39항 내제 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열이 단백질을 인코딩하는, 방법.
44. 제43항에 있어서, 상기 단백질이 마커 단백질(예를 들어, 리포터 단백질)인, 방법.
45. 제39항 내제 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열이 상기 질환 또는 장애와 관련된 내인성 단백질 또는 경로의 아고니스트 또는 안타고니스트를 인코딩하는, 방법.
46. 제39항 내제 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열이 항체를 인코딩하는, 방법.
47. 제39항 내제 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 대사 질환 또는 장애, CNS 질환 또는 장애, 안구 질환 또는 장애, 혈액 질환 또는 장애, 간 질환 또는 장애, 면역 질환 또는 장애, 감염성 질환, 근육 질환 또는 장애, 암, 및 유전자 산물의 비정상적인 수준 및/또는 기능에 기반한 질환 또는 장애로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
48. 제47항에 있어서, 상기 대사 질환 또는 장애가 당뇨병, 리소좀 축적 장애(lysosomal storage disorder), 점액다당류 장애, 요소회로 질환 또는 장애, 및 글리코겐 축적 질환 또는 장애로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
49. 제48항에 있어서, 상기 리소좀 축적 장애가 고셔병(Gaucher's disease), 폼페병(Pompe disease), 이염성 백질디스트로피(MLD: metachromatic leukodystrophy), 페닐케톤뇨증(PKU) 및 파브리병(Fabry disease)으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
50. 제48항에 있어서, 상기 요소회로 질환 또는 장애가 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC: ornithine transcarbamylase) 결핍증인, 방법.
51. 제48항에 있어서, 상기 점액다당류 장애가 슬라이증후군(Sly syndrome), 헐러증후군(Hurler Syndrome), 샤이에증후군(Scheie Syndrome), 헐러-샤이에증후군, 헌터증후군(Hunter's Syndrome), 산필리포증후군(Sanfilippo Syndrome), 모르키오증후군(Morquio Syndrome) 및 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy Syndrome)으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
52. 제47항에 있어서, 상기 CNS 질환 또는 장애가 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 카나반병(Canavan disease), 리병(Leigh's disease), 레프숨병(Refsum disease), 뚜렛증후군(Tourette syndrome), 원발성 측삭경화증, 근위축성 측삭경화증, 진행성 근위축증, 픽병(Pick's disease), 근디스트로피, 다발경화증, 중증근무력증, 빈스방거병(Binswanger's disease), 척수 또는 두부 손상으로 인한 외상, 테이-삭스병(Tay Sachs disease), 레쉬-니한병(Lesch-Nyhan disease), 뇌전증, 뇌경색증, 정신과 장애, 조현병, 약물의존, 신경증, 정신병, 치매, 편집증, 주의력결핍장애, 수면장애, 통증장애, 식이 또는 체중 장애, 및 CNS의 암 및 종양으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
53. 제47항에 있어서, 상기 안구 질환 또는 장애가 망막, 후방로(posterior tract) 및/또는 시신경과 관련된 안과적 장애로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 망막, 후방로 및/또는 시신경과 관련된 안과적 장애가 당뇨망막병증, 연령관련 황반변성, 지도형위축, 및 혈관 또는 "습윤형" 황반변성을 포함하는 황반변성, 녹내장, 포도막염, 색소성망막염, 스타가르트병(Stargardt), 레베르 선천성 흑암시(LCA: Leber Congenital Amaurosis), 어셔증후군(Usher syndrome), 탄성섬유가황색종(PXE: pseudoxanthoma elasticum), x연관 색소성망막염(XLRP: x-linked retinitis pigmentosa), x연관 망막층간분리(XLRS: x-linked retinoschisis), 범맥락막위축(Choroideremia), 레베르 유전성 시신경병증(LHON: Leber hereditary optic neuropathy), 완전색맹, 추체-간체 디스트로피(cone-rod dystrophy), 푹스각막내피이상증(Fuchs endothelial corneal dystrophy), 당뇨병성 황반부종, 및 안구의 암 및 종양으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
55. 제47항에 있어서, 상기 혈액 질환 또는 장애가 A형 혈우병, B형 혈우병, 지중해빈혈, 빈혈 및 혈액암으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
56. 제47항에 있어서, 상기 간 질환 또는 장애가 진행성 가족성 간내 담즙정체(PFIC: progressive familial intrahepatic cholestasis), 및 간암 및 간종양으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
57. 제39항에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 낭성섬유증인, 방법.
58. 제39항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ceDNA 벡터가 약학적으로 허용 가능한 담체와 조합으로 투여되는, 방법.
59. 치료용 단백질을 대상에게 전달하는 방법으로서, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 ceDNA 벡터를 포함하는 조성물을 상기 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열이 치료용 단백질을 인코딩하는, 치료용 단백질을 대상에게 전달하는 방법.
60. 제59항에 있어서, 상기 치료용 단백질이 치료용 항체인, 방법.
61. 제59항에 있어서, 상기 치료용 단백질이 효소, 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 수퍼옥시드 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 글로빈, 렙틴, 카탈라아제, 티로신 히드록실라아제, 사이토카인, 낭성섬유증 막관통 전도 조절제(CFTR: cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 펩타이드 성장인자 및 호르몬으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
62. 패킷 삽입물과 함께 용기에 패키징된, 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 ceDNA 벡터와 나노담체를 포함하는 키트.
63. ceDNA 벡터 생산용 키트로서, 적어도 하나의 이종 뉴클레오타이드 서열 또는 조절 스위치, 또는 둘 모두의 삽입을 위한 적어도 하나의 제한 부위를 포함하는 발현 구조체를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 제한 부위는 (i) 대칭 역말단반복 서열(대칭 ITR)(여기서, 대칭 ITR은 야생형 ITR이 아님) 또는 (ii) 2개의 야생형 역말단반복 서열(WT-ITR) 사이에 작동적으로 배치되어 있는, ceDNA 벡터 생산용 키트.
64. 제63항에 있어서, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 ceDNA 벡터를 생산하는 데 적합한, 키트.
65. 제63항 또는 제64항에 있어서, Rep 단백질 존재 하에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도할 수 있는, 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 곤충 세포 집단을 추가로 포함하는, 키트.
66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 Rep 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 추가로 포함하며, 여기서 벡터는 곤충 세포에서 적어도 하나의 Rep 단백질을 발현하는 데 적합한 것인, 키트.

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