BR112021007102A2 - dna com extremidade fechada modificada (cedna) que compreende repetições terminais invertidas modificadas simétricas - Google Patents

Abstract

DNA COM EXTREMIDADE FECHADA MODIFICADA (CEDNA) QUE COMPREENDE REPETIÇÕES TERMINAIS INVERTIDAS MODIFICADAS SIMÉTRICAS. A presente invenção refere-se a vetores de ceDNA com estrutura linear e contínua que podem ser produzidos em altos rendimentos e usados para transferência e expressão eficazes de um transgene. De acordo com algumas modalidades, os vetores de ceDNA compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga operacionalmente posicionada entre duas sequências de repetição terminal invertida simétrica de flanqueamento que não são ITRs de AAV de tipo selvagem, em que toda ou parte da sequência de nucleotídeos heteróloga está sob o controle de pelo menos um interruptor regulador. Alguns vetores de ceDNA fornecidos neste documento compreendem ainda elementos cis-reguladores e fornecem altas eficiências de expressão de genes. Além disso, são fornecidos aqui métodos e linhagens celulares para a produção confiável e eficaz dos vetores de DNA lineares, contínuos e sem capsídeo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DNA COM EXTREMIDADE FECHADA MODIFICADA (CEDNA) QUE COMPREENDE REPETIÇÕES TERMINAIS INVERTIDAS MODIFI- CADAS SIMÉTRICAS".

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade sobre o Pedido Provisório nº U.S. 62/757.872, depositado em 9 de novembro de 2018, e o Pedi- do Provisório nº U.S. 62/757.892, depositado em 9 de novembro de 2018, cujo conteúdo de cada um desses está aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[002] A presente invenção refere-se ao campo da terapia gênica, incluindo a entrega de interruptores reguladores de DNA com extremi- dade fechada para uma célula, tecido, órgão ou organismo-alvo.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[003] A listagem de sequências do presente pedido foi enviada eletronicamente por meio de EFS-Web como uma listagem de se- quências no formato ASCII com um nome de arquivo "05320Sequence_Listing.txt", data de criação de 8 de novembro de 2019 e um tamanho de 204 KB (209.626 bytes). O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada eletronicamente no formato ASCII e é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES

[004] A terapia gênica busca melhorar os resultados clínicos para pacientes que sofrem de mutações genéticas ou doenças adquiridas causadas por uma aberração no perfil de expressão gênica. A terapia gênica inclui o tratamento ou prevenção de condições médicas resul- tantes de genes defeituosos ou regulação ou expressão anormal, por exemplo, subexpressão ou superexpressão, que podem resultar em um distúrbio, doença, malignidade, etc. Por exemplo, uma doença ou distúrbio causado por um gene defeituoso pode ser tratado, prevenido ou melhorado pela entrega de um material genético corretivo a um pa- ciente, resultando na expressão terapêutica do material genético den- tro do paciente. A base da terapia gênica é fornecer um cassete de transcrição com um produto genético ativo (às vezes, chamado de transgene), por exemplo, que pode resultar em um efeito positivo de ganho de função, um efeito negativo de perda de função ou outro re- sultado, como, por exemplo, um efeito oncolítico. A terapia gênica também pode ser usada para tratar uma doença ou malignidade cau- sada por outros fatores. Os distúrbios monogênicos humanos podem ser tratados pela entrega e expressão de um gene normal nas células- alvo. A entrega e expressão de um gene corretivo nas células-alvo do paciente podem ser realizadas através de vários métodos, incluindo o uso de vírus geneticamente modificados e vetores de entrega de ge- nes virais. Entre os muitos vetores derivados de vírus disponíveis (por exemplo, retrovírus recombinante, lentivírus recombinante, adenovírus recombinante e similares), o vírus adenoassociado recombinante (rA- AV) vem ganhando popularidade como um vetor versátil na terapia gênica. No entanto, à medida que a tecnologia melhora e a transferên- cia e expressão de genes de alta eficiência são alcançadas, a capaci- dade de regular tal expressão em nível temporal e espacial torna-se cada vez mais importante.

[005] Os vírus adenoassociados (AAV) pertencem à família par- voviridae e constituem mais especificamente o gênero dependoparvo- vírus. O genoma do AAV é composto por uma molécula de DNA linear de fita simples que contém aproximadamente 4,7 quilobases (kb) e consiste em duas grandes estruturas de leitura aberta (ORFs) que co- dificam as proteínas Rep (replicação) e Cap (capsídeo) não estrutu- rais. Foi identificada uma segunda ORF dentro do gene cap que codifi-

ca a proteína de ativação do conjunto (AAP). Os DNAs que flanqueiam as regiões codificadoras do AAV são duas sequências de repetição terminal invertida (ITR) de ação cis, com aproximadamente 145 nucle- otídeos de comprimento, com sequências palindrômicas interrompidas que podem ser dobradas em estruturas em formato de grampo ener- geticamente estáveis que funcionam como iniciadores de replicação de DNA. Normalmente, as sequências de tipo selvagem são iguais, mas invertidas em relação umas às outras. Além de seu papel na re- plicação do DNA, as sequências ITR demonstraram estar envolvidas na integração do DNA viral no genoma celular, no resgate do genoma ou plasmídeo hospedeiro e na encapsidação do ácido nucleico viral nos vírions maduros (Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158: 97 a 129).

[006] Os vetores derivados do AAV (isto, é, vetores AAV recom- binantes (rAVV) ou AAV) são atraentes para a entrega de material ge- nético porque (i) têm capacidade de infectar (transduzir) uma ampla variedade de tipos de células que não se dividem e se dividem, inclu- indo miócitos e neurônios; (ii) são desprovidos dos genes estruturais do vírus, diminuindo, assim, as respostas das células hospedeiras à infecção pelo vírus, por exemplo, respostas mediadas por interferon; (iii) vírus do tipo selvagem são considerados não patológicos em hu- manos; (iv) em contraste com o AAV do tipo selvagem, com capacida- de de se integrar no genoma da célula hospedeira, os vetores de AAV com deficiência de replicação não possuem o gene rep e geralmente persistem como epissomas, limitando, assim, o risco de mutagênese ou genotoxicidade de inserção; e (v) em comparação com outros sis- temas de vetores, os vetores de AAV são geralmente considerados como imunógenos relativamente ruins e, portanto, não desencadeiam uma resposta imunológica significativa (ver (ii)), ganhando, assim, a persistência do DNA do vetor e potencialmente a expressão a longo prazo dos transgenes terapêuticos. Os vetores de AAV também po- dem ser produzidos e formulados com alta titulação e administrados por meio de injeções intra-arteriais, intravenosas ou intraperitoneais, permitindo a distribuição de vetores e a transferência de genes para regiões musculares significativas por meio de uma única injeção em roedores (Goyenvalle et al., 2004; Fougerousse et al., 2007; Koppanati et al., 2010; Wang et al., 2009) e cães. Em um estudo clínico para tra- tar a distrofia muscular espinhal tipo 1, os vetores de AAV foram admi- nistrados sistemicamente com a intenção de atingir o cérebro, resul- tando em aparentes aprimoramentos clínicos.

[007] No entanto, existem várias deficiências importantes no uso de partículas de AAV como vetor de entrega de genes. Uma grande desvantagem associada ao rAAV é sua capacidade limitada de empa- cotamento viral de cerca de 4,5 kb de DNA heterólogo (Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Lai et al., 2010). Como resultado, o uso de vetores AAV foi limitado a menos de 150.000 Da de capacida- de de codificação da proteína. A segunda desvantagem é que, como resultado da prevalência de infecção por AAV do tipo selvagem na po- pulação, os candidatos à terapia genética com rAAV devem ser rastre- ados quanto à presença de anticorpos neutralizantes que eliminam o vetor do paciente. Uma terceira desvantagem está relacionada à imu- nogenicidade do capsídeo que impede a readministração em pacien- tes que não foram excluídos de um tratamento inicial. O sistema imu- nológico do paciente pode responder ao vetor, que age efetivamente como uma injeção de "reforço" para estimular o sistema imunológico, gerando anticorpos anti-AAV de alta titulação que impedem tratamen- tos futuros. Alguns relatórios recentes indicam preocupações com a imunogenicidade em situações de altas doses. Outra desvantagem notável é que o início da expressão gênica mediada por AAV é relati- vamente lento, dado que o DNA de AAV de fita simples deve ser con-

vertido em DNA de cadeia dupla antes da expressão gênica heterólo- ga. Embora tenham sido feitas tentativas para contornar esse proble- ma através da construção de vetores de DNA de fita dupla, essa estra- tégia limita ainda mais o tamanho do cassete de expressão de trans- gene que pode ser integrado ao vetor AAV (McCarty, 2008; Varenika et al., 2009; Foust et al., 2009).

[008] Adicionalmente, os vírions de AAV convencionais com cap- sídeos são produzidos através da introdução de um plasmídeo ou plasmídeos contendo o genoma de AAV, os genes rep e os genes cap (Grimm et al., 1998). Após a introdução desses plasmídeos auxiliares em trans, o genoma do AAV é "resgatado" (ou seja, liberado e posteri- ormente amplificado) do genoma do hospedeiro e é encapsidado (cap- sídeos virais) para produzir vetores AAV biologicamente ativos. No en- tanto, verificou-se que tais vetores de vírus AAV encapsidados trans- duzem ineficientemente certos tipos de células e tecidos. Os capsí- deos também induzem uma resposta imunológica.

[009] Consequentemente, o uso de vetores de vírus adenoasso- ciado (AAV) para terapia gênica é limitado devido à imunidade existen- te em determinados pacientes, a administração única a pacinetes que ainda não estão imunes (devido à resposta imunológica do paciente desenvolvida), gama limitada de material genético transgênico ade- quado para a entrega em vetores de AAV devido a uma capacidade mínima de empacotamento viral (cerca de 4,5 kb) do capsídeo associ- ado ao AAV, bem como a expressão gênica lenta mediada por AAV. Os pedidos de terapias gênicas clínicas para rAAV são ainda mais onerados pela variabilidade de paciente para paciente não prevista pela resposta à dose em modelos de camundongos singênicos ou em outras espécies de modelos.

[0010] Os vetores de AAV recombinantes livres de capsídeo po- dem ser obtidos como uma molécula linear isolada de ácido nucleico que compreende regiões transgênicas e promotoras expressáveis, flanqueadas por duas sequências de repetição terminal invertidas (ITRs) por AAV do tipo selvagem, incluindo os locais de ligação e reso- lução terminal. Esses vetores AAV recombinantes são desprovidos de sequências codificadoras de proteínas do capsídeo do AAV e podem ser de cadeia simples, cadeia dupla ou duplex com uma ou ambas as extremidades ligadas covalentemente através das duas sequências de palíndromo de ITR do tipo selvagem (por exemplo, WO2012/123430, Patente U.S. 9.598.703). Eles evitam muitos dos problemas da terapia gênica mediada por AAV em que a capacidade do transgene é muito maior, o início da expressão do transgene é rápido e eles não possu- em os atributos dos vetores baseados em AAV que normalmente re- sultam em imunidade e rápida eliminação desses vetores. No entanto, a expressão constante de um transgene pode não ser desejável em todos os casos.

[0011] Permanece uma necessidade importante não atendida de vetores de DNA recombinante controláveis com propriedades de pro- dução e/ou expressão melhoradas.

SUMÁRIO

[0012] A presente divulgação fornece, geralmente, vetores de DNA livres de capsídeo não virais com extremidades covalentemente fe- chadas (referido aqui como um "vetor de DNA com extremidade fe- chada" ou um "vetor ceDNA"). Os vetores ceDNA aqui descritos são moléculas de DNA duplex linear sem capsídeo formadas a partir de uma fita contínua de DNA complementar com extremidades covalen- temente fechadas (estrutura linear, contínua e não encapsidada), que compreendem uma sequência de repetição terminal invertida 5' (ITR) e uma sequência 3' ITR que são iguais, mas em complemento reverso uma da outra, isto é, as sequências são simétricas ou substancialmen- te simétricas. De acordo com algumas modalidades, o vetor ceDNA compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga posicionada operacionalmente entre duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) flanqueadoras, em que toda ou parte da se- quência de nucleotídeos heteróloga está sob o controle de pelo menos um interruptor regulador. Em outras modalidades, a tecnologia aqui descrita se refere a um vetor ceDNA contendo duas sequências de repetição terminal invertida (ITRs) de AAV modificadas, onde as ITRs modificadas são simétricas entre si e flanqueiam um transgene ex- pressável. Os vetores de ceDNA aqui divulgados podem ser produzi- dos em células eucarióticas, desse modo, desprovidas de modifica- ções no DNA procariótico e contaminação bacteriana por endotoxina em células de inseto.

[0013] Em um aspecto, vetores de DNA sem capsídeo não viral com extremidades covalentemente fechadas são de preferência molé- culas duplex lineares e são obtidos a partir de um polinucleotídeo de vetor que codifica um ácido nucleico heterólogo operacionalmente po- sicionado entre duas sequências de repetição terminal invertida modi- ficada simétrica (por exemplo, mod-ITRs) (por exemplo, ITRs de AAV). Ou seja, ambas as ITRs têm a mesma sequência, mas são comple- mentos reversos (inversos) um do outro. Em modalidades alternativas, o par de ITRs modificadas é substancialmente simétrico como aqui definido, ou seja, o par de ITRs modificadas pode ter uma sequência diferente, mas tem a forma tridimensional simétrica correspondente ou igual. Por exemplo, uma ITR modificada pode ser de um sorotipo e a outra ITR modificada pode ser de um sorotipo diferente, mas as mes- mas têm a mesma mutação (por exemplo, inserção, deleção ou substi- tuição de nucleotídeos) na mesma região. Dito de forma diferente, apenas para fins ilustrativos, uma mod-ITR 5' pode ser do AAV2 e tem uma deleção na região C, e a mod-ITR 3' pode ser do AAV5 e tem de- leção correspondente na região C', e desde que a mod-ITR 5' e a mod-

ITR 3' tenham a mesma organização espacial tridimensional ou simé- trica, as mesmas são abrangidas para uso aqui como um par de ITRs modificadas.

[0014] Em algumas modalidades, um par de ITRs modificadas compreende pelo menos uma ou qualquer combinação de uma dele- ção, inserção ou substituição em relação à sequência de ITR de tipo selvagem do mesmo sorotipo de AAV. As adições, deleções ou substi- tuições na ITR simétrica são iguais, mas o complemento reverso uma da outra. Por exemplo, uma inserção de 3 nucleotídeos na região C da ITR 5' seria refletida na inserção de 3 nucleotídeos do complemento reverso na seção correspondente na região C' da ITR 3'. Apenas para fins ilustrativos, se a adição for AACG na ITR 5', a adição será CGTT na ITR 3' no sítio correspondente. Por exemplo, se a cadeia de senso ITR 5' for ATCGATCG com uma adição de AACG entre G e A para resultar na sequência ATCGAACGATCG. A cadeia de senso ITR 3' correspondente é CGATCGAT (o complemento reverso do ATCGATCG) com uma adição de CGTT (isto é, o complemento rever- so do AACG) entre o T e C para resultar na sequência CGATCGTT- CGAT (o complemento reverso de ATCGAACGATCG), isto é, a ima- gem espelhada da modificação de ITR 5'. Em algumas modalidades, as ITRs modificadas compreendem um sítio de resolução terminal e um sítio de ligação à proteína de replicação (RPS) (às vezes referido como um sítio de ligação à proteína replicativa), por exemplo, um sítio de ligação a Rep. Em algumas modalidades, as ITRs modificadas não compreendem um sítio de resolução terminal e/ou um sítio de ligação da proteína de replicação (RPS), por exemplo, um sítio de ligação Rep.

[0015] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende: (1) um cassete de expressão que compreende um elemento cis- regulador, um promotor e pelo menos um transgene; ou (2) um promo-

tor operacionalmente ligado a pelo menos um transgene e (3) duas sequências autocomplementares, por exemplo, ITRs modificadas as- simétricas, flanqueando o dito cassete de expressão, em que o vetor de ceDNA não está associado a uma proteína do capsídeo.

[0016] Em uma modalidade, o vetor de ceDNA compreende com- ponentes adicionais para regular a expressão do transgene, por exemplo, elementos cis-reguladores e/ou interruptores reguladores, que são descritos mais completamente aqui na seção intitulada "Inter- ruptores Reguladores" para controlar e regular a expressão do trans- gene, como um interruptor regulador, por exemplo, um interruptor ex- terminador para habilitar a morte celular controlada de uma célula que compreende um vetor de ceDNA. Os elementos cis-reguladores inclu- em, mas não estão limitados a um promotor, um interruptor de ribos- somo, um isolador, um elemento mir-regulável, um elemento regulador pós-transcricional, um promotor específico de tipo de tecido e célula e um intensificador. Em algumas modalidades, a ITR pode atuar como o promotor para o transgene.

[0017] Em algumas modalidades, as duas sequências autocom- plementares podem ser sequências de ITR modificadas, por exemplo, um dependovírus como o AAV (por exemplo, AAV1-AAV12). Qualquer sorotipo de AAV pode ser usado, incluindo, mas sem limitação, uma sequência de ITR de AAV2 modificada, que retém um sítio de ligação a Rep (RBS), como 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) e um sítio de resolução terminal (trs), além de uma sequência palin- drômica variável que permite a formação de estrutura secundária em formato de grampo. Em algumas modalidades, uma ITR modificada é uma sequência sintética de ITR que pode conter um sítio de ligação a Rep (RBS) funcional como 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) e um sítio de resolução terminal (TRS), além de uma se- quência palindrômica variável, permitindo a formação de estrutura se-

cundária em formato de grampo. Em alguns exemplos, as sequências de ITR modificadas retêm a sequência do RBS, trs e a estrutura e po- sição de um elemento de ligação Rep que forma a porção de alça ter- minal de uma das estruturas secundárias em formato de grampo de ITR da sequência correspondente da ITR de tipo selvagem como AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10, 11 e 12.

[0018] Sequências de ITR modificadas exemplificativas para uso nos vetores de ceDNA compreendendo ITRs modificadas simétricas são mostradas na Tabela 4 aqui, que mostra pares de ITRs (ITR 5' modificada e ITR 3' modificada simétrica). Sequências de ITR modifi- cadas exemplificativas para uso nos vetores de ceDNA são seleciona- das a partir de qualquer um dos pares modificados de ITRs de: SEQ ID NO:484 (ITR-33 esquerda) e SEQ ID NO: 469 (ITR-18, direita); SEQ ID NO: 485 (ITR-34 esquerda) e SEQ ID NO: 95 (ITR-51, direita); SEQ ID NO: 486 (ITR-35 esquerda) e SEQ ID NO: 470 (ITR-19, direi- ta); SEQ ID NO: 487 (ITR-36 esquerda) e SEQ ID NO: 471 (ITR-20, direita); SEQ ID NO: 488 (ITR-37 esquerda) e SEQ ID NO: 472 (ITR- 21, direita); SEQ ID NO: 489 (ITR-38 esquerda) e SEQ ID NO: 473 (ITR-22 direita); SEQ ID NO: 490 (ITR-39 esquerda) e SEQ ID NO: 474 (ITR-23, direita); SEQ ID NO: 491 (ITR-40 esquerda) e SEQ ID NO: 475 (ITR-24, direita); SEQ ID NO: 492 (ITR-41 esquerda) e SEQ ID NO: 476 (ITR-25 direita); SEQ ID NO: 493 (ITR-42 esquerda) e SEQ ID NO: 477 (ITR-26 direita); SEQ ID NO: 494 (ITR-43 esquerda) e SEQ ID NO: 478 (ITR-27 direita); SEQ ID NO: 495 (ITR-44 esquer- da) e SEQ ID NO: 479 (ITR-28 direita); SEQ ID NO:496 (ITR-45 es- querda) e SEQ ID NO:480 (ITR-29, direita); SEQ ID NO:497 (ITR-46 esquerda) e SEQ ID NO: 481 (ITR-30, direita); SEQ ID NO: 498 (ITR- 47, esquerda) e SEQ ID NO: 482 (ITR-31, direita); SEQ ID NO: 499 (ITR-48, esquerda) e SEQ ID NO: 483 (ITR-32 direita).

[0019] Em algumas modalidades, as sequências de ITRs modifi-

cadas exemplificativas para uso nos vetores de ceDNA compreendem as sequências de ITR parciais selecionadas a partir dos pares de se- quências de: SEQ ID NO: 101 e SEQ ID NO: 102; SEQ ID NO: 103 e SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 105 e SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO: 545 e SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 120; SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122; SEQ ID NO: 107 e SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 123 e SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 126; SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 131 e SEQ ID NO: 132; SEQ ID NO: 133 e SEQ ID NO: 134; SEQ ID NO: 547 e SEQ ID NO: 546, também são mostradas nas Figuras 6B a 21B.

[0020] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA pode com- preender ITRs com uma modificação em cada ITR correspondente a qualquer uma das modificações nas sequências de ITR ou sequências parciais de ITR mostradas nas Tabelas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10A a 10B de PCT/US18/49996 depositado em 7 de setembro de 2018, onde a sequência de ITR de flanco é simétrica (por exemplo, complemento inverso) ou substancialmente simétrica, conforme definido neste do- cumento, ou seja, tem organização espacial 3D simétrica.

[0021] Como um exemplo exemplificativo, a presente divulgação fornece um vetor de DNA com extremidade fechada que compreende um promotor operacionalmente ligado a um transgene com ou sem o interruptor regulador, em que o ceDNA é desprovido de proteínas do capsídeo e é: (a) produzido a partir de um plasmídeo de ceDNA (por exemplo, ver as Figuras 1A a 1B) que codifica ITRs simétricas, em que cada ITR modificada com o mesmo número de pares de bases duplex intramolecularmente em sua configuração secundária em formato de grampo (de preferência, excluindo a deleção de qualquer alça terminal AAA ou TTT nesta configuração em comparação a essas sequências de referência), e (b) é identificado como ceDNA utilizando o ensaio pa- ra a identificação de ceDNA por eletroforese em gel de agarose sob gel nativo e condições de desnaturação no Exemplo 1.

[0022] Em uma modalidade, as ITRs modificadas de flanqueamen- to são substancialmente simétricas entre si. Nessa modalidade, a mo- dificação é idêntica - a adição, substituição ou deleção é a mesma, mas as ITRs não são complementos reversos idênticos. Em tal moda- lidade, o par de ITRs modificadas é substancialmente simétrico em que eles têm uma organização espacial tridimensional simétrica, mas não têm sequências de nucleotídeos de complemento reverso idênti- cas. Declarado de forma diferente, em algumas modalidades, as ITRs de um par mod-ITR podem ter diferentes sequências nucleotídicas de complemento reverso, mas ainda têm a mesma organização espacial tridimensional simétrica - ou seja, ambas as ITRs têm mutações que resultam na mesma forma 3D geral. Por exemplo, uma ITR (por exem- plo, ITR 5') em um par mod-ITR pode ser de um sorotipo e a outra ITR (por exemplo, ITR 3') pode ser de um sorotipo diferente, no entanto, ambas podem ter a mesma mutação correspondente (por exemplo, se a ITR 5' tiver uma exclusão na região C, a ITR 3' modificada cognata de um sorotipo diferente tem uma exclusão na posição correspondente na região C'), de modo que o par de ITRs modificadas tenha a mesma organização espacial tridimensional simétrica. Em tais modalidades, cada ITR em um par de ITRs modificadas pode ser de diferentes soro- tipos (por exemplo, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12), como a combinação de AAV2 e AAV6, com a modificação em uma ITR refleti- da na posição correspondente na ITR cognata de um sorotipo diferen- te. Em uma modalidade, um par de ITRs modificadas substancialmen- te simétricas refere-se a um par de ITRs modificadas (ITRs mod), des- de que a diferença nas sequências de nucleotídeos entre as ITRs não afete as propriedades ou a forma geral e tenham substancialmente a mesma forma em 3D espaço. Por exemplo, uma mod-ITR que tem pe- lo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a mod-ITR canônica, conforme determinado por meios padrão bem conhecidos na técnica, como BLAST (Ferramenta Básica de Ali- nhamento Local), BLASTN nas configurações padrão e também tem uma organização espacial tridimensional simétrica, de modo que sua estrutura 3D tenha a mesma forma no espaço geométrico. Um par de mod-ITRs substancialmente simétricas tem as mesmas alças A, C-C' e B-B' no espaço 3D, por exemplo, se uma ITR modificada em um par de mod-ITRs substancialmente simétricas tiver uma deleção de um braço C-C', então, a ITR tem a deleção correspondente da alça C-C' e também tem uma estrutura 3D semelhante das demais alças A e B-B' da mesma forma no espaço geométrico da sua mod-ITR cognata.

[0023] Em algumas modalidades, o elemento estrutural da ITR po- de ser qualquer elemento estrutural envolvido na interação funcional da ITR com uma grande proteína Rep (por exemplo, Rep 78 ou Rep 68). Em certas modalidades, o elemento estrutural fornece seletividade para a interação de uma ITR com uma proteína Rep grande, ou seja, determina pelo menos em parte qual proteína Rep interage funcional- mente com a ITR. Em outras modalidades, o elemento estrutural inte- rage fisicamente com uma proteína Rep grande quando a proteína Rep está ligada à ITR. Cada elemento estrutural pode ser, por exem- plo, uma estrutura secundária da ITR, uma sequência de nucleotídeos da ITR, um espaçamento entre dois ou mais elementos ou uma com- binação de qualquer uma das alternativas acima. Em uma modalidade, os elementos estruturais são selecionados a partir do grupo que con- siste em um braço A e A', um braço B e um B', um braço C e C', um braço D, um sítio de ligação a Rep (RBE) e um RBE' (isto é, sequência RBE complementar) e um sítio de resolução terminal (trs).

[0024] Mais especificamente, a ITR pode ser modificada estrutu-

ralmente. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos do elemento es- trutural pode ser modificada em comparação com a sequência do tipo selvagem da ITR. Em uma modalidade, o elemento estrutural (por exemplo, braço A, braço A', braço B, braço B', braço C, braço C', braço D, RBE, RBE' e trs) de uma ITR pode ser removido e substituído por um elemento estrutural do tipo selvagem de um parvovírus diferente. Por exemplo, a estrutura de substituição pode ser de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 parvovírus de serpente (por exemplo, parvovírus píton real), parvovírus bovino, parvovírus de cabra, parvovírus aviário, par- vovírus canino, parvovírus equino, parvovírus de camarão, parvovírus suíno ou AAV de inseto. Por exemplo, a ITR pode ser uma ITR de AAV2 e o braço A ou A' ou RBE pode ser substituído por um elemento estrutural do AAV5. Em outro exemplo, a ITR pode ser uma ITR de AAV5 e os braços C ou C', o RBE e os trs podem ser substituídos por um elemento estrutural do AAV2. Em outro exemplo, a ITR de AAV pode ser uma ITR de AAV5 com os braços B e B' substituídos pelos braços B e B' de ITR de AAV2.

[0025] Apenas a título de exemplo, a Tabela 3 indica modificações exemplificativas de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma de- leção, inserção e/ou substituição) nas regiões de ITRs modificadas, em que X é indicativo de uma modificação de pelo menos um ácido nucleico (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) nessa seção em relação à ITR de tipo selvagem correspondente. Em algu- mas modalidades, qualquer modificação de pelo menos um nucleotí- deo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) em qual- quer uma das regiões de C e/ou C' e/ou B e/ou B' retém três nucleotí- deos T sequenciais (ou seja, TTT) em pelo menos uma alça terminal. Por exemplo, se a modificação resultar em: uma ITR de braço único (por exemplo, um braço C-C' único ou um braço B-B' único), ou um braço C-B' modificado ou um braço C'-B ou uma ITR de dois braços com pelo menos um braço truncado (por exemplo, um braço C-C' trun- cado e/ou braço B-B' truncado), pelo menos o braço único ou pelo me- nos um dos braços de uma ITR de dois braços (em que um braço po- de ser truncado) retém três nucleotídeos T sequenciais (isto é, TTT) em pelo menos uma alça terminal. Em algumas modalidades, um bra- ço C-C' truncado e/ou um braço B-B' truncado tem três nucleotídeos T sequenciais (isto é, TTT) na alça terminal.

[0026] A tecnologia aqui descrita ainda se refere a um vetor de ceDNA que pode entregar e codificar um ou mais transgenes em uma célula-alvo, por exemplo, onde o vetor de ceDNA compreende uma sequência multicistrônica, ou onde o transgene e seu contexto genô- mico nativo (por exemplo, transgene, íntrons e regiões endógenas não traduzidas) são incorporados ao vetor de ceDNA. Os transgenes po- dem ser transcritos que codificam proteínas, transcritos não codifican- tes ou ambos. O vetor de ceDNA pode compreender múltiplas se- quências de codificação e um sítio de iniciação da tradução não canô- nico ou mais de um promotor para expressar transcritos que codificam proteínas, transcritos não codificantes ou ambos. O transgene pode compreender uma sequência que codifica mais de uma proteína ou pode ser uma sequência de um transcrito não codificante. O cassete de expressão pode compreender, por exemplo, mais de 4.000 nucleo- tídeos, 5.000 nucleotídeos, 10.000 nucleotídeos ou 20.000 nucleotí- deos ou 30.000 nucleotídeos ou 40.000 nucleotídeos ou 50.000 nucle- otídeos, ou qualquer faixa entre cerca de 4.000 a 10.000 nucleotídeos ou 10.000 a 50.000 nucleotídeos ou mais de 50.000 nucleotídeos. Os vetores de ceDNA não têm as limitações de tamanho dos vetores AAV encapsidados, permitindo, assim, a entrega de um cassete de expres- são de tamanho grande para fornecer expressão eficiente de transge- nes. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é desprovido de me-

tilação específica de procarionte.

[0027] O cassete de expressão também pode compreender um sítio interno de entrada do ribossomo (IRES) e/ou um elemento 2A. Os elementos cis-reguladores incluem, mas não estão limitados a um promotor, um interruptor de ribossomo, um isolador, um elemento mir- regulável, um elemento regulador pós-transcricional, um promotor es- pecífico de tipo de tecido e célula e um intensificador. Em algumas modalidades, a ITR pode atuar como o promotor para o transgene. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende componentes adicionais para regular a expressão do transgene. Por exemplo, o componente regulador adicional pode ser um comutador regulador, conforme divulgado neste documento, incluindo, mas não limitado a um comutador de interrupção, que pode matar a célula infectada por ceDNA, se necessário, e outros elementos indutíveis e/ou repressí- veis.

[0028] A tecnologia aqui descrita fornece ainda novos métodos de entrega e expressão eficiente e seletiva de um ou mais transgenes usando os vetores de ceDNA. Um vetor de ceDNA tem capacidade para ser absorvido pelas células hospedeiras, bem como transportado para o núcleo na ausência do capsídeo do AAV. Além disso, os veto- res de ceDNA aqui descritos não possuem um capsídeo e, portanto, evitam a resposta imunológica que pode surgir em resposta a vetores contendo o capsídeo.

[0029] Aspectos da invenção se referem a métodos para produzir os vetores de ceDNA aqui descritos. Outras modalidades referem-se a um vetor de ceDNA produzido pelo método aqui fornecido. Em uma modalidade, o vetor de DNA não viral livre de capsídeo (vetor de ceD- NA) é obtido a partir de um plasmídeo (referido aqui como um "plasmí- deo de ceDNA") compreendendo um modelo de construto de expres- são de polinucleotídeo compreendendo nesta ordem: uma primeira repetição terminal invertida 5' (por exemplo, ITR de AAV); um cassete de expressão; e uma ITR 3' (por exemplo, ITR de AAV), onde as ITRs 5' e 3' são ITRs modificadas em relação a ITRS de tipo selvagem, e onde as modificações são iguais entre si, ou seja, as ITRs são simétri- cas (isto é, imagens de espelho estruturais) em relação umas às ou- tras.

[0030] O vetor de ceDNA divulgado neste documento pode ser ob- tido por vários meios que seriam conhecidos do especialista na técnica depois de ler esta divulgação. Por exemplo, um modelo de construto de expressão de polinucleotídeo usado para gerar os vetores de ceD- NA da presente divulgação pode ser um plasmídeo de ceDNA (por exemplo, consulte a Tabela 7 ou Figura 1B ou 6B), um ceDNA- bacmídeo e/ou um ceDNA-baculovírus. Em uma modalidade, o plas- mídeo de ceDNA compreende um sítio de clonagem de restrição (por exemplo, SEQ ID NO: 7) operacionalmente posicionado entre as ITRs onde um cassete de expressão que compreende, por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um transgene, por exemplo, um gene repórter e/ou um gene terapêutico) pode ser inserido. Em algu- mas modalidades, os vetores ceDNA são produzidos a partir de um modelo de polinucleotídeo (por exemplo, ceDNA-plasmídeo, ceDNA- bacmídeo, ceDNA-baculovírus) contendo ITRs 5' e 3' simétricas modi- ficadas flanqueando o cassete de expressão, onde a modificação é qualquer uma ou mais dentre deleção, inserção e/ou substituição em comparação com as sequências de ITR de AAV2 ou AAV3 de tipo sel- vagem.

[0031] Em uma célula hospedeira permissiva, na presença de, por exemplo, Rep, o modelo de polinucleotídeo que tem pelo menos uma ITR modificada se replica para produzir vetores de ceDNA. A produção do vetor de ceDNA passa por duas etapas: primeiro, excisão ("resga- te") do modelo da cadeia principal de modelo (por exemplo, ceDNA-

plasmídeo, ceDNA-bacmídeo, genoma de ceDNA-baculovírus, etc.) por meio de proteínas Rep e, segundo, replicação mediada por Rep do vetor de ceDNA excisado. As proteínas Rep e os locais de ligação a Rep dos vários sorotipos de AAV são bem conhecidos dos versados na técnica. Um especialista na técnica entende que deve escolher uma proteína Rep a partir de um sorotipo que se liga e replica a sequência de ácidos nucleicos com base em pelo menos uma ITR funcional. Por exemplo, se a ITR modificada competente para replicação for do soro- tipo 2 do AAV, a Rep correspondente seria de um sorotipo AAV que funcione com esse sorotipo, como a ITR de AAV2 com Rep de AAV2 ou AAV4, mas não a Rep de AAV5, que não funciona. Após a replica- ção, o vetor de ceDNA com extremidade covalentemente fechada con- tinua a se acumular nas células permissivas e o vetor de ceDNA é, de preferência, suficientemente estável ao longo do tempo na presença da proteína Rep sob condições padrão de replicação, por exemplo, para se acumular em uma quantidade que é pelo menos 1 pg/célula, preferencialmente, pelo menos 2 pg/célula, preferencialmente, pelo menos 3 pg/célula, mais preferencialmente, pelo menos 4 pg/célula, ainda mais preferencialmente, pelo menos 5 pg/célula.

[0032] Por conseguinte, um aspecto da divulgação se refere a um processo que compreende as etapas de: a) incubação de uma popula- ção de células hospedeiras (por exemplo, células de insetos) que abri- gam o modelo de construto de expressão de polinucleotídeo (por exemplo, um plasmídeo de ceDNA, um ceDNA-bacmídeo e/ou um ce- DNA-baculovírus), desprovido de sequências codificantes do capsídeo viral, na presença de uma proteína Rep sob condições eficazes e por um tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA nas células hospedeiras, e em que as células hospedeiras não compreen- dem sequências codificantes do capsídeo viral; e b) colher e isolar o vetor de ceDNA das células hospedeiras. A presença da proteína Rep induz a replicação do polinucleotídeo do vetor com uma ITR modifica- da para produzir o vetor de ceDNA em uma célula hospedeira. No en- tanto, não são expressas partículas virais (por exemplo, vírions de AAV). Portanto, não há limitação de tamanho imposta por vírus.

[0033] A presença do vetor de ceDNA isolado das células hospe- deiras pode ser confirmada digerindo o DNA isolado da célula hospe- deira com uma enzima de restrição que tem um único sítio de reco- nhecimento no vetor de ceDNA e analisando o material de DNA digeri- do por desnaturação e géis de não desnaturação para confirmar a pre- sença de bandas de característica de DNA linear e contínuo em com- paração com o DNA linear e não contínuo.

[0034] De acordo com um aspecto, a divulgação fornece vetor de DNA sem capsídeo não viral com extremidades covalentemente fe- chadas (vetor de ceDNA), em que o vetor de ceDNA compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga operacionalmente posicionada entre duas sequências de repetição terminal invertida si- métrica flanqueadora (ITRs simétricas), em que as ITRs simétricas não são ITRs de tipo selvagem e cada ITR de flanco tem a mesma modifi- cação simétrica. De acordo com uma modalidade, as sequências ITR simétricas são sintéticas. De acordo com algumas modalidades, as ITRs são selecionadas a partir de qualquer um dos listados na Tabela

4. De acordo com algumas modalidades, cada uma das ITRs simétri- cas é modificada por uma deleção, inserção e/ou substituição em pelo menos uma das regiões ITR selecionadas a partir de A, A', B, B', C, C', D e D'. De acordo com algumas modalidades, a deleção, inserção e/ou substituição resultam na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-alça normalmente formada pelas regiões A, A', B, B' C ou C'. De acordo com algumas modalidades, uma ITR simétrica é modificada por uma deleção, inserção e/ou substituição que resulta na deleção de to- da ou parte de uma estrutura de haste-alça normalmente formada pe-

las regiões B e B'. De acordo com algumas modalidades, uma ITR si- métrica é modificada por uma deleção, inserção e/ou substituição que resulta na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-alça normalmente formada pelas regiões C e C'. De acordo com algumas modalidades, uma ITR simétrica é modificada por uma deleção, inser- ção e/ou substituição que resulta na deleção de parte de uma estrutura de haste-alça normalmente formada pelas regiões B e B' e/ou parte de uma estrutura de haste-alça normalmente formada pelas regiões C e C'. De acordo com algumas modalidades, uma ITR simétrica compre- ende uma única estrutura de haste-alça na região que normalmente compreende uma primeira estrutura de haste-alça formada pelas regi- ões B e B' e uma segunda estrutura de haste-alça formada pelas regi- ões C e C'. De acordo com algumas modalidades, uma ITR simétrica compreende uma única haste e duas alças na região que normalmente compreende uma primeira estrutura de haste-alça formada pelas regi- ões B e B' e uma segunda estrutura de haste-alça formada pelas regi- ões C e C'. De acordo com algumas modalidades, uma ITR simétrica compreende uma única haste e uma única alça na região que normal- mente compreende uma primeira estrutura de haste-alça formada pe- las regiões B e B' e uma segunda estrutura de haste-alça formada pe- las regiões C e C'. De acordo com algumas modalidades, as ITRs si- métricas são ITRs de AAV2 modificadas compreendendo sequências de nucleotídeos selecionadas a partir de: as ITRs nas Figuras 7A a 22B ou na Tabela 4 neste documento, e uma ITR com pelo menos 95% de identidade de sequência com as ITRs listadas na Tabela 4 ou mostradas nas Figuras 7A a 22B. De acordo com algumas modalida- des, toda ou parte da sequência de nucleotídeos heteróloga está sob o controle de pelo menos um interruptor regulador.

[0035] De acordo com outro aspecto, a divulgação fornece um ve- tor de DNA livre de capsídeo não viral com extremidades covalente-

mente fechadas (vetor de ceDNA), em que o vetor de ceDNA compre- ende pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga posicio- nada operacionalmente entre duas sequências de repetição terminal invertida de tipo selvagem de flanqueamento (ITRs de tipo selvagem), em que toda ou parte da sequência de nucleotídeos heteróloga está sob o controle de pelo menos um interruptor regulador.

De acordo com algumas modalidades, as sequências ITR de tipo selvagem são se- quências ITR de tipo selvagem simétricas ou sequências de ITR de tipo selvagem substancialmente simétricas.

De acordo com algumas modalidades, as sequências de ITR de tipo selvagem são seleciona- das a partir de qualquer uma das combinações de ITRs de tipo selva- gem mostradas na Tabela 1. De acordo com algumas modalidades, o ITR de tipo selvagem de flanqueamento tem pelo menos 95% de iden- tidade de sequência com as ITRs listadas na Tabela 1 ou Tabela 2 e todas as substituições são substituições de ácido nucleico conservati- vas que não afetam a estrutura das ITRs de tipo selvagem.

De acordo com algumas modalidades, o pelo menos um interruptor regulador é selecionado a partir de qualquer um ou uma combinação de interrupto- res reguladores listados na Tabela 5 ou na seção intitulada "Interrupto- res reguladores" no presente documento.

De acordo com algumas modalidades, o vetor de ceDNA quando digerido com uma enzima de restrição que tem um único sítio de reconhecimento no vetor de ceD- NA e analisado por eletroforese em gel nativo e desnaturante, exibe bandas características DNA linear e contínuo em comparação com controles lineares e não contínuos.

De acordo com algumas modalida- des, as sequências de ITR são baseadas em sequências de um vírus selecionado de um parvovírus, um dependovírus e um vírus adenoas- sociado (AAV). De acordo com algumas modalidades, as ITRs são ba- seadas em sequências de vírus adenoassociados (AAV). De acordo com algumas modalidades, as ITRs são baseadas em sequências de um sorotipo de AAV selecionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12. De acordo com algumas modalidades, o vetor está em um nanocarreador. De acordo com algumas modalidades, o nanocarreador compreende uma nano- partícula de lipídeo (LNP).

[0036] De acordo com algumas modalidades dos aspectos e mo- dalidades no presente documento, o vetor de ceDNA é obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: (a) incubar uma popu- lação de células de inseto que abrigam um construto de expressão de ceDNA na presença de pelo menos uma proteína Rep, em que o cons- truto de expressão de ceDNA codifica o vetor de ceDNA, sob condi- ções eficazes e por um tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA nas células de inseto; e (b) isolar o vetor de ceDNA das células de inseto. De acordo com algumas modalidades, o cons- truto de expressão de ceDNA é selecionado a partir de um plasmídeo de ceDNA, um ceDNA-bacmídeo e um ceDNA-baculovírus. De acordo com algumas modalidades, a célula de inseto expressa pelo menos uma proteína Rep. De acordo com algumas modalidades, a pelo me- nos uma proteína Rep é de um vírus selecionado a partir de um parvo- vírus, um dependovírus e um vírus adenoassociado (AAV). De acordo com algumas modalidades, a pelo menos uma proteína Rep é de um sorotipo de AAV selecionado a partir de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12.

[0037] De acordo com algumas modalidades, a divulgação fornece um construto de expressão de ceDNA que codifica o vetor de ceDNA de qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento. De acordo com algumas modalidades, o construto é um plasmídeo de ceDNA, ceDNA-bacmídeo ou ceDNA-baculovírus.

[0038] De acordo com algumas modalidades, a divulgação fornece uma célula hospedeira que compreende o construto de expressão de ceDNA de qualquer um dos aspectos ou modalidades no presente do- cumento. De acordo com algumas modalidades, a célula hospedeira expressa pelo menos uma proteína Rep. De acordo com algumas mo- dalidades, a pelo menos uma proteína Rep é de um vírus selecionado a partir de um parvovírus, um dependovírus e um vírus adenoassocia- do (AAV). De acordo com algumas modalidades, a pelo menos uma proteína Rep é de um sorotipo de AAV selecionado a partir de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12. De acordo com algumas modalidades, a célula hos- pedeira é uma célula de inseto. De acordo com algumas modalidades, a célula de inseto é uma célula Sf9.

[0039] De acordo com algumas modalidades, a divulgação fornece um método de produção de um vetor de ceDNA, compreendendo (a) incubar a célula hospedeira de qualquer um dos aspectos e modalida- des no presente documento, sob condições eficazes e por tempo sufi- ciente para induzir a produção do vetor de ceDNA; e (b) isolar o ceD- NA das células hospedeiras.

[0040] De acordo com algumas modalidades, a divulgação fornece um método para tratar, prevenir, melhorar, monitorar ou diagnosticar uma doença ou distúrbio em um indivíduo, em que o método compre- ende: administrar a um indivíduo em necessidade, uma composição compreendendo o vetor de ceDNA de qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento, em que a pelo menos uma se- quência de nucleotídeos heteróloga é selecionada para tratar, preve- nir, melhorar, diagnosticar ou monitorar a doença ou distúrbio. De acordo com algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga, quando transcrita ou traduzida, corrige uma quantidade anormal de uma proteína endógena no indivíduo. De acor- do com algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de nucle- otídeos heteróloga, quando transcrita ou traduzida, corrige uma função ou atividade anormal de uma proteína ou via endógena no indivíduo.

De acordo com algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga codifica ou compreende uma molécula de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em um RNAi, um siR- NA, um miRNA, um lncRNA e um oligo ou polinucleotídeo antissenso.

De acordo com algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga codifica uma proteína.

De acordo com al- gumas modalidades, a proteína é uma proteína marcadora (por exem- plo, uma proteína repórter). De acordo com algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga codifica um agonista ou um antagonista de uma proteína ou via endógena associ- ada à doença ou distúrbio.

De acordo com algumas modalidades, a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga codifica um anticorpo.

De acordo com algumas modalidades, a doença ou distúrbio é selecionado do grupo que consiste em uma doença ou distúrbio me- tabólico, uma doença ou distúrbio do SNC, uma doença ou distúrbio ocular, uma doença ou distúrbio do sangue, uma doença ou distúrbio do fígado, uma doença ou distúrbio imunológico, uma doença infeccio- sa, uma doença ou distúrbio muscular, câncer e uma doença ou dis- túrbio com base em um nível anormal e/ou função de um produto gê- nico.

De acordo com algumas modalidades, a doença ou distúrbio me- tabólico é selecionado do grupo que consiste em diabetes, um distúr- bio de armazenamento lisossomal, um distúrbio de mucopolissacarí- deo, uma doença ou distúrbio do ciclo da ureia e uma doença ou dis- túrbio de armazenamento de glicogênio.

De acordo com algumas mo- dalidades, o distúrbio de armazenamento lisossômico é selecionado do grupo que consiste em doença de Gaucher, doença de Pompe, leucodistrofia metacromática (MLD), fenilcetonúria (PKU) e doença de Fabry.

De acordo com algumas modalidades, a doença ou distúrbio do ciclo da ureia é a deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC). De acordo com algumas modalidades, o distúrbio de mucopolissacarídeo é selecionado do grupo que consiste em síndrome Sly, Síndrome de Hurler, Síndrome de Scheie, Síndrome de Hurler-Scheie, Síndrome de Hunter, Síndrome de Sanfilippo, Síndrome de Morquio e Síndrome de Maroteaux-Lamy.

De acordo com algumas modalidades, a doença ou distúrbio do SNC é selecionado do grupo que consiste em doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Canavan, doença de Leigh, doença de Refsum, síndrome de Tourette, esclerose lateral primária, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscu- lar progressiva, Doença de Pick, distrofia muscular, esclerose múltipla, miastenia gravis, doença de Binswanger, trauma devido à medula es- pinhal ou lesão na cabeça, doença de Tay Sachs, doença de Lesch- Nyan, epilepsia, enfartes cerebrais, distúrbios psiquiátricos, esquizo- frenia, dependência de drogas, neuroses, psicose, demência, para- noia, distúrbio de déficit de atenção, distúrbios do sono, distúrbios da dor, distúrbios alimentares ou de peso e cânceres e tumores do SNC.

De acordo com algumas modalidades, a doença ou distúrbio ocular é selecionado do grupo que consiste em um distúrbio oftálmico envol- vendo a retina, o trato posterior e/ou o nervo óptico.

De acordo com algumas modalidades, o distúrbio oftálmico envolvendo a retina, trato posterior e/ou nervo óptico é selecionado do grupo que consiste em retinopatia diabética, degeneração macular incluindo degeneração macular relacionada à idade, atrofia geográfica e degeneração macu- lar vascular ou "úmida", glaucoma, uveíte, retinite pigmentosa, Star- gardt, Amaurose congênita de Leber (LCA), síndrome de Usher, pseu- doxantoma elástico (PXE), retinite pigmentosa ligada ao X (XLRP), re- tinosquise ligada ao X (XLRS), Coroideremia, neuropatia óptica heredi- tária de Leber, Arquomatopsia, distrofia cone-bastonete, distrofia endo- telial da córnea de Fuchs, edema macular diabético e câncer ocular e tumores.

De acordo com algumas modalidades, a doença ou distúrbio do sangue é selecionado do grupo que consiste em hemofilia A, hemo- filia B, talassemia, anemia e cânceres do sangue. De acordo com al- gumas modalidades, a doença ou distúrbio hepático é selecionado do grupo que consiste em colestase intra-hepática familiar progressiva (PFIC) e câncer de fígado e tumores. De acordo com algumas modali- dades, a doença ou distúrbio é a fibrose cística. De acordo com algu- mas modalidades, o vetor de ceDNA é administrado em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0041] De acordo com algumas modalidades, a divulgação fornece um método para entregar uma proteína terapêutica a um indivíduo, em que o método compreende a administração ao indivíduo de uma com- posição compreendendo o vetor de ceDNA de qualquer um dos aspec- tos e modalidades no presente documento, em que pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga codifica uma proteína terapêuti- ca. De acordo com algumas modalidades, a proteína terapêutica é um anticorpo terapêutico. De acordo com algumas modalidades, a proteí- na terapêutica é selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima, eritropoietina, angiostatina, endostatina, superóxido dismu- tase, globina, leptina, catalase, tirosina hidroxilase, uma citocina, regu- lador de condutância transmembrana de fibrose cística (CFTR), um peptídeo fator de crescimento e um hormônio.

[0042] De acordo com algumas modalidades, a divulgação fornece um kit que compreende um vetor de ceDNA de qualquer um dos as- pectos e modalidades no presente documento, e um nanocarreador, embalado em um recipiente com uma bula.

[0043] De acordo com alguns aspectos, a divulgação fornece um kit para produzir um vetor de ceDNA, em que o kit compreende um construto de expressão compreendendo pelo menos um sítio de restri- ção para inserção de pelo menos uma sequência de nucleotídeos he- teróloga, ou interruptor regulador, ou ambos, o pelo menos um sítio de restrição operacionalmente posicionado entre (i) sequências de repeti- ção terminal invertida simétricas (ITRs simétricas), em que as ITRs simétricas não são ITRs de tipo selvagem ou (ii) duas sequências de repetição terminal invertida de tipo selvagem (ITRs de tipo selvagem). De acordo com algumas modalidades, o kit é adequado para produzir o vetor de ceDNA de qualquer um dos aspectos e modalidades no presente documento. De acordo com algumas modalidades, o kit com- preende ainda uma população de células de inseto que é desprovida de sequências de codificação do capsídeo viral, que na presença da proteína Rep pode induzir a produção do vetor de ceDNA. De acordo com algumas modalidades, o kit compreende ainda um vetor que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica pelo menos uma proteína Rep, em que o vetor é adequado para expressar a pelo menos uma proteína Rep em uma célula de inseto.

[0044] Esses e outros aspectos da divulgação são descritos em maiores detalhes abaixo.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0045] A Figura 1A ilustra uma estrutura exemplificativa de um vetor de ceDNA. Nessa modalidade, o vetor de ceDNA exemplificativo compreende um cassete de expressão contendo o promotor CAG, WPRE e BGHpA. Um quadro de leitura aberta (ORF) que codifica um transgene (por exemplo, luciferase) é inserido no sítio de clonagem (R3/R4) entre o promotor de CAG e WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais invertidas simétricas (ITRs) - isto é, a ITR modificada em 5' e a ITR modificada em 3' que flanquei- am o cassete de expressão são simétricas em relação uma à outra.

[0046] A Figura 1B ilustra uma estrutura exemplificativa de um vetor de ceDNA (ou a sequência correspondente que estaria presente em um plasmídeo ceDNA exemplificativo) com um cassete de expres- são contendo um intensificador/promotor, uma estrutura de leitura aberta (ORF) para a inserção de um transgene, um elemento pós- transcricional (WPRE) e um sinal poliA. Um quadro de leitura aberta (ORF) permite a inserção de um transgene no sítio de clonagem entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais invertidas (ITRs) que são assimétricas uma em relação à outra; uma ITR modificada a montante (extremidade 5') e uma ITR modificada a jusante (extremidade 3') do cassete de expres- são, em que a ITR 5' e a ITR 3' são ambas ITRs modificadas, mas têm modificações (isto é, são imagens de espelho estruturais de cada uma, ou seja, simétricas entre si).

[0047] A Figura 2A ilustra uma estrutura exemplificativa de um vetor de ceDNA. Nessa modalidade, o vetor de ceDNA exemplificativo compreende um cassete de expressão contendo o promotor CAG, WPRE e BGHpA. Um quadro de leitura aberta (ORF) que codifica um transgene (por exemplo, luciferase) é inserido no sítio de clonagem (R3/R4) entre o promotor de CAG e WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais invertidas de tipo selvagem (ITRs de tipo selvagem) - isto é, a ITR 5' de tipo selvagem e a ITR 3' de tipo selvagem que flanqueiam o cassete de expressão.

[0048] A Figura 2B ilustra uma estrutura exemplificativa de um vetor de ceDNA (ou a sequência correspondente que estaria presente em um plasmídeo ceDNA exemplificativo) com um cassete de expres- são contendo um intensificador/promotor, uma estrutura de leitura aberta (ORF) para a inserção de um transgene, um elemento pós- transcricional (WPRE) e um sinal poliA. Um quadro de leitura aberta (ORF) permite a inserção de um transgene no sítio de clonagem entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais invertidas de tipo selvagem (ITRs de tipo selvagem) - isto é, uma ITR de tipo selvagem a montante (extremidade 5') e uma ITR de tipo selvagem a jusante (extremidade 3') do cassete de expressão, onde a ITR 5' de tipo selvagem e a ITR 3' de tipo selva- gem podem ser do mesmo sorotipo ou de diferentes sorotipos.

[0049] A Figura 3A fornece a estrutura de haste-alça em forma de T de uma ITR esquerda do tipo selvagem de AAV2 (SEQ ID NO: 538) com a identificação de braço A-A', braço B-B', braço C-C', dois locais de ligação de Rep (RBE e RBE') e também mostra o sítio de resolução do terminal (trs). O RBE contém uma série de 4 tetrâmeros duplex que, acredita-se, interagem com o Rep 78 ou o Rep 68. Além disso, acredita-se que o RBE' interaja com o complexo Rep montado na ITR de tipo selvagem ou ITR mutada no construto. As regiões D e D' con- têm locais de ligação ao fator de transcrição e outra estrutura conser- vada. A Figura 3B mostra atividades de corte e cruzamento catalisa- das por Rep propostas em uma ITR esquerda do tipo selvagem (SEQ ID NO: 539), incluindo a estrutura de haste-alça em forma de T da ITR esquerda do tipo selvagem da AAV2 com identificação do braço A-A', braço B-B', braço C-C', dois sítios de ligação a Rep (RBE e RBE') e também mostra o sítio de resolução do terminal (trs) e a região D e D' que compreende vários sítios de ligação de fator de transcrição e outra estrutura conservada.

[0050] A Figura 4A fornece a estrutura primária (sequência poli- nucleotídica) (esquerda) e a estrutura secundária (direita) das porções contendo RBE do braço A-A' e o braço C-C' e B-B' da ITR esquerda do tipo selvagem de AAV2 (SEQ ID NO: 540). A Figura 4B mostra uma sequência de ITRs mutadas exemplificativas (também denominada uma ITR modificada) para a ITR esquerda. É mostrada a estrutura primária (esquerda) e a estrutura secundária prevista (direita) da por- ção RBE do braço A-A', braço C e braço B-B' de uma ITR esquerda mutada exemplificativa (ITR-1, esquerda) (SEQ ID NO: 113). A Figura 4C mostra a estrutura primária (esquerda) e a estrutura secundária (direita) da porção contendo RBE da alça A-A' e os braços B-B' e C-C'

da ITR direita do tipo selvagem de AAV2 (SEQ ID NO: 541). A Figura 4D mostra a estrutura primária (esquerda) e a estrutura secundária (direita) da porção contendo RBE da alça A-A' e os braços B-B' e C-C' da ITR direita do tipo selvagem de AAV2 (SEQ ID NO: 541). A Figura 4E mostra uma ITR modificada direita exemplificativa. É mostrada a estrutura primária (esquerda) e a estrutura secundária prevista (direita) da porção contendo RBE do braço A-A', o braço B-B' e o braço C de uma ITR direita mutante exemplificativa (ITR-1, direita) (SEQ ID NO: 114). Qualquer combinação de ITR esquerda e direita (por exemplo, ITRs de AAV2 ou outras ITRs de sorotipo viral ou sintéticas) pode ser usada, desde que a ITR esquerda seja simétrica ou um complemento inverso à ITR direita. Cada uma das sequências de polinucleotídeos das Figuras 3A a 3D se refere à sequência usada no plasmídeo ou genoma de bacmídeo/baculovírus usado para produzir o ceDNA como aqui descrito. Também incluídas em cada uma das Figuras 4A a 4E estão estruturas secundárias de ceDNA correspondentes inferidas a partir das configurações do vetor de ceDNA no plasmídeo ou genoma de bacmídeo/baculovírus e os valores previstos de energia livre de Gibbs.

[0051] A Figura 5A é um esquema que ilustra um processo a montante para produzir células de inseto infectadas com baculovírus (BIICs) que são úteis na produção de ceDNA no processo descrito no esquema na Figura 5B. A Figura 5B é um esquema de um método exemplificativo de produção de ceDNA e a Figura 5C ilustra um méto- do e processo bioquímico para confirmar a produção do vetor de ceD- NA. A Figura 5D e a Figura 5E são ilustrações esquemáticas que descrevem um processo para identificar a presença de ceDNA no DNA colhido a partir de péletes de células obtidos durante os processos de produção de ceDNA na Figura 4B. A Figura 5E mostra DNA que tem uma estrutura não contínua. O ceDNA pode ser cortado por uma en-

donuclease de restrição, tendo um único sítio de reconhecimento no vetor de ceDNA, e gerar dois fragmentos de DNA com tamanhos dife- rentes (1 kb e 2 kb) em condições neutras e desnaturantes.

A Figura 5E também mostra um ceDNA que tem uma estrutura linear e contí- nua.

O vetor de ceDNA pode ser cortado pela endonuclease de restri- ção e gerar dois fragmentos de DNA que migram como 1 kb e 2 kb em condições neutras, mas em condições desnaturantes, as fitas perma- necem conectadas e produzem cadeias únicas que migram como 2 kb e 4 kb.

A Figura 5D mostra bandas esquemáticas esperadas para um ceDNA exemplificativo, deixado sem cortes ou digerido com uma en- donuclease de restrição e, em seguida, submetido à eletroforese em um gel nativo ou em um gel desnaturante.

O esquema mais à esquer- da é um gel nativo e mostra várias bandas sugerindo que, em sua for- ma duplex e sem cortes, o ceDNA existe em pelo menos estados mo- noméricos e diméricos, visíveis como um monômero menor de migra- ção mais rápida e um dímero de migração mais lenta com o dobro do tamanho do monômero.

O segundo esquema da esquerda mostra que quando o ceDNA é cortado com uma endonuclease de restrição, as bandas originais desaparecem e as bandas de migração mais rápida (por exemplo, menores) aparecem, correspondendo aos tamanhos de fragmentos esperados após a clivagem.

Sob condições desnaturantes, o DNA duplex original é de fita simples e migra como espécie duas ve- zes mais que o observado no gel nativo porque as cadeias comple- mentares estão ligadas covalentemente.

Assim, no segundo esquema da direita, o ceDNA digerido mostra uma distribuição de bandas seme- lhante à observada no gel nativo, mas as bandas migram como frag- mentos duas vezes o tamanho de seus equivalentes de gel nativo.

O esquema mais à direita mostra que o ceDNA sem cortes em condições de desnaturação migra como um círculo aberto de fita simples e, por- tanto, as bandas observadas têm o dobro do tamanho daquelas ob-

servadas em condições nativas em que o círculo não está aberto. Nessa figura, "kb" é usado para indicar o tamanho relativo das molécu- las de nucleotídeo com base, dependendo do contexto, no comprimen- to da cadeia de nucleotídeos (por exemplo, para as moléculas de fita simples observadas em condições de desnaturação) ou no número de pares de base (por exemplo, para as moléculas de fita dupla observa- das em condições nativas).

[0052] A Figura 6A é um Rep-bacmídeo exemplificativo no plas- mídeo pFBDLSR que compreende as sequências de ácido nucleico para as proteínas Rep Rep52 e Rep78. Esse Rep-bacmídeo exemplifi- cativo compreende: fragmento de promotor de IE1 (SEQ ID NO:66); sequência de nucleotídeos Rep78, incluindo a sequência Kozak (SEQ ID NO:67), sequência promotora de poliedro para a sequência de nu- cleotídeos Rep52 (SEQ ID NO:68) e Rep58, começando com a se- quência Kozak gccgccacc) (SEQ ID NO:69). A Figura 6B é um es- quema de um plasmídeo de ceDNA exemplificativo, com a ITR es- querda modificada (ITR modificada por L), promotor de CAG, transge- ne de luciferase, sequência de poliadenilação e WPRE e ITR direita modificada (ITR modificada por R), onde ITR modificada por L e a ITR modificada por R são simétricas em relação uma à outra. A Figura 6C é um esquema de um plasmídeo ceDNA exemplificativo, com uma ITR esquerda do tipo selvagem (L-ITR do tipo selvagem), promotor de CAG, transgene de luciferase, sequência de poliadenilação e WPRE e uma ITR direita de tipo selvagem (R-ITR do tipo selvagem).

[0053] A Figura 7A mostra a estrutura de energia mais baixa pre- vista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B- B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-33 (Esquer- da)" SEQ ID NO: 101) e a Figura 7B mostra a ITR direita simétrica cognata (ITR-18, direita), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C'

e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-18 (Direita)" SEQ ID NO: 102). Tanto a ITR-33 (esquerda) quanto a ITR-18 (direita) são previstas para formar uma estrutura com um único braço (ou seja, um único braço C-C').

[0054] A Figura 8A mostra a estrutura de energia mais baixa pre- vista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B- B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-34 (Esquer- da)" SEQ ID NO: 103) e a Figura 8B mostra a ITR direita simétrica cognata (ITR-51, direita), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-51 (Direita)" SEQ ID NO: 96). Tanto a ITR-34 (esquerda) quanto a ITR-51 (direita) são previstas para formar uma estrutura com um único braço, (ou seja, um único braço B-B').

[0055] A Figura 9A mostra a estrutura de energia mais baixa pre- vista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B- B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-35 (esquer- da)" SEQ ID NO: 105) e a Figura 9B mostra a ITR direita simétrica cognata (ITR-19, direita), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-35 (Direita)" SEQ ID NO: 105). Tanto a ITR-35 (esquerda) quanto a ITR-19 (direita) são previstas para formar uma estrutura com um único braço (ou seja, um único braço C-C').

[0056] A Figura 10A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-36 (Es- querda)" SEQ ID NO: 454) e a Figura 10B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-20 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por-

ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-20 (Direita)" SEQ ID NO: 116). Tanto a ITR-36 (esquerda) quan- to a ITR-20 (direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais está truncado (por exemplo, o braço C-C' está truncado).

[0057] A Figura 11A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-37 (Es- querda)" SEQ ID NO: 111) e a Figura 11B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-21 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por- ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-21 (Direita)" SEQ ID NO: 112). Tanto a ITR-37 (esquerda) quan- to a ITR-21 (direita) são previstas para formar uma estrutura com uma única haste (por exemplo, uma única estrutura de haste-alça na região que normalmente compreende uma primeira estrutura de haste-alça formada pelas regiões B e B' e uma segunda estrutura de haste-alça formada pelas regiões C e C').

[0058] A Figura 12A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-38 (Es- querda)" SEQ ID NO: 117) e a Figura 12B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-22 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por- ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-22 (Direita)" SEQ ID NO: 118). Tanto a ITR-38 (esquerda) quan- to a ITR-22 (direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais está truncado (por exemplo, o braço B-B' está truncado).

[0059] A Figura 13A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-39 (Es- querda)" SEQ ID NO: 119) e a Figura 13B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-23 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por- ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-23 (Direita)" SEQ ID NO: 120). Tanto a ITR-39 (esquerda) quan- to a ITR-23 (direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais está truncado (por exemplo, o braço B-B' está truncado).

[0060] A Figura 14A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-40 (Es- querda)" SEQ ID NO: 121) e a Figura 14B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-24 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por- ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-24 (Direita)" SEQ ID NO: 122). Tanto a ITR-40 (esquerda) quan- to a ITR-24 (direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais está truncado (por exemplo, o braço B-B' está truncado).

[0061] A Figura 15A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-41 (Es- querda)" SEQ ID NO: 107) e a Figura 15B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-25 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por- ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-25 (Direita)" SEQ ID NO: 108). Tanto a ITR-41 (esquerda) quan- to a ITR-25 (direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais está truncado (por exemplo, o braço B-B' está truncado).

[0062] A Figura 16A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-42 (Es- querda)" SEQ ID NO: 123) e a Figura 16B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-26 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por- ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-26 (Direita)" SEQ ID NO: 124). Tanto a ITR-42 (esquerda) quan- to a ITR-26 (direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais é alongado (por exemplo, o braço C-C' está truncado).

[0063] A Figura 17A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-43 (Es- querda)" SEQ ID NO: 125) e a Figura 17B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-27 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por- ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-27 (Direita)" SEQ ID NO: 126). Tanto a ITR-43 (esquerda) quan- to a ITR-27 (direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais é alongado (por exemplo, o braço C-C' está truncado).

[0064] A Figura 18A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-44 (Es- querda)" SEQ ID NO: 127) e a Figura 18B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-28 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por-

ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-28 (Direita)" SEQ ID NO: 128). Tanto a ITR-44 (esquerda) quan- to a ITR-28 (direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais está truncado (por exemplo, o braço C-C' está truncado).

[0065] A Figura 19A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-45 (Es- querda)" SEQ ID NO: 129) e a Figura 19B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-29 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por- ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-29 (Direita)" SEQ ID NO: 130). Tanto a ITR-45 (esquerda) quan- to a ITR-29 (direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais está truncado (por exemplo, o braço C-C' está truncado).

[0066] A Figura 20A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-46 (Es- querda)" SEQ ID NO: 131) e a Figura 20B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-30 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por- ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-30 (Direita)" SEQ ID NO: 132). Tanto a ITR-46 (esquerda) quan- to a ITR-30 (direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais está truncado (por exemplo, o braço C-C' está truncado).

[0067] A Figura 21A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-47 (Es-

querda)" SEQ ID NO: 133) e a Figura 21B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-31 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por- ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-31 (Direita)" SEQ ID NO: 134). Tanto a ITR-47 (esquerda) quan- to a ITR-31 (direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais está truncado (por exemplo, o braço C-C' está truncado).

[0068] A Figura 22A mostra a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as porções de C-C' e B-B' de uma ITR esquerda modificada exemplificativa ("ITR-48 (Es- querda)" SEQ ID NO: 547) e a Figura 22B mostra a ITR direita simé- trica cognata ("ITR-32 (direita)"), mostrando a estrutura de energia mais baixa prevista da porção contendo RBE do braço A-A' e as por- ções de C-C' e B-B' de uma ITR direita modificada exemplificativa ("ITR-32 (Direita)" SEQ ID NO: 546). Tanto a ITR-48 (esquerda) quan- to a ITR-32 (direita) são previstas para formar uma estrutura com dois braços, um dos quais está truncado (por exemplo, o braço C-C' está truncado).

[0069] A Figura 23 mostra a atividade de luciferase de células de inseto Sf9 GlycoBac transfectadas com o ceDNA 16 com a variante ITR mutante simétrica da Tabela 4 (consulte também a Tabela 7 pa- ra construtos completos). O vetor de ceDNA tinha um gene de luci- ferase flanqueado pelas ITRs mutantes simétricas selecionadas da Tabela 4. Condições "simuladas" são apenas reagentes de transfec- ção, sem DNA doador.

[0070] A Figura 24A e Figura 24B mostram a atividade de GFP de células de inseto Sf9 GlycoBac transfectadas com o construto de ITR WT/WT descrito no Exemplo 4. O vetor de ceDNA tinha um gene GFP flanqueado por ITRs do tipo selvagem. A Figura 24A fornece a imagem usando microscopia de fluorescência com ampliação de 40 x das células Sf9 transfectadas com o vetor de cDNA GFP da ITR WT/WT e subsequentemente infectadas com o vírus Rep. A Figura 24B fornece uma imagem de campo claro com ampliação de 40 x das mesmas células representadas na imagem "A". A Figura 24C fornece uma imagem de campo claro a 40 x de células de controle transfecta- das com ITRs WT/WT, mas não infectadas com vírus Rep. Essas célu- las não conseguiram produzir nenhum sinal fluorescente.

[0071] A Figura 25 mostra um gel de agarose nativo (1% de aga- rose) de ceDNA putativo com ITRs de tipo selvagem. A faixa 1 mostra o Plus DNA Ladder de 1 kb e a faixa 2 mostra o ceDNA produzido usando plasmídeo contendo um cassete de ITR de tipo selvagem, am- bos retirados do mesmo gel. As espécies monoméricas de GFP ceD- NA são esperadas a ~4 kb e o dímero é esperado a ~8 kb.

[0072] A Figura 26 mostra um gel desnaturante de ceDNA con- tendo ITRs de tipo selvagem. A faixa 1 mostra o Plus DNA Ladder de 1 kb, a faixa 2 mostra ceDNA de tipo selvagem que não foi cortado com uma endonuclease e a faixa 3 mostra o mesmo ceDNA de tipo selva- gem, mas cortado com a enzima de endonuclease de restrição ClaI. Todas as amostras são do mesmo gel.

[0073] A Figura 27 mostra uma estrutura secundária potencial de ITRs simétricas de construto-388 (mutante) e construto-393 (AAV2 do tipo selvagem).

[0074] A Figura 28 mostra mudanças de peso corporal de camun- dongos CD-1 tratados com LNP + poliC (controle); LNP+ Sf9 produziu ceDNA assimétrico com ITR de AAV2 do tipo selvagem à esquerda e ITR truncada à direita; LNP + ceDNA sintético com ITRs de AAV2 do tipo selvagem simetricamente nos lados esquerdo e direito; LNP + ce- DNA sintético com ITRs assimétricas, ITR de AAV2 do tipo selvagem nos lados esquerdo e direito; Sf9 produziu ceDNA com ITRs mutantes simetricamente em ambos os lados esquerdo e direito (construto-388); e ceDNA contendo ITRs de AAV2 do tipo selvagem simetricamente nos lados esquerdo e direito do construto (construto-393; Sf9 produzi- do).

[0075] As Figuras 29A e 29B representam imagens da expressão de luciferase in vivo no Dia 14 em camundongos CD-1 tratados com: (1) LNP + poliC (controle; canto superior esquerdo); (2) LNP + ceDNA com ITRs mutantes simetricamente nos lados esquerdo e direito do construto (construto-388) produzido a partir de Sf9 (parte superior di- reita); e ceDNA contendo ITRs de AAV2 do tipo selvagem simétricas produzido a partir de Sf9 (construto-393; painel central inferior).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0076] Um dos maiores obstáculos no desenvolvimento de terapi- as, particularmente em doenças raras, é o grande número de condi- ções individuais. Cerca de 350 milhões de pessoas na Terra vivem com doenças raras, definidas pelo National Institutes of Health como uma doença ou condição com menos de 200.000 pessoas diagnosti- cadas. Cerca de 80 por cento dessas doenças raras são de origem genética, e cerca de 95 por cento deles não tem tratamento aprovado pelo FDA.

[0077] Entre as vantagens dos vetores de ceDNA descritos neste documento está o fornecimento de uma abordagem que pode ser rapi- damente adaptada a várias doenças e, particularmente, a doenças monogênicas raras que podem alterar significativamente o estado atu- al dos tratamentos para muitos dos distúrbios ou doenças genéticas. Além disso, os vetores de ceDNA descritos neste documento compre- endem um interruptor regulador, permitindo assim a expressão do ge- ne controlável após a entrega. I. DEFINIÇÕES

[0078] A menos que aqui definido de outra forma, os termos cientí-

ficos e técnicos usados em conjunto com o presente pedido devem ter os significados que são comumente entendidos pelos versados na técnica a que essa divulgação pertence.

Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes es- pecíficos, etc., descritos aqui e, como tal, podem variar.

A terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas modali- dades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definida apenas pelas reivindicações.

As definições de termos comuns em imunologia e biologia molecular podem ser encon- tradas no The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19a Edição, publicado por Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0- 911910-19-3); Robert S.

Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6a Edição, publicado por Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, EUA (2013), Knipe, D.M. e Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecu- lar Cell Biology and Molecular Medicine, publicado por Blackwell Sci- ence Ltd., 1999 a 2012 (ISBN 9783527600908); e Robert A.

Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081- 569-8); Immunology de Werner Luttmann, publicado por Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Ca- sey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, publicado por Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Jo- seph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EUA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, EUA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecu- lar Biology (CPMB), Frederick M.

Ausubel (ed.), John Wiley e Sons,

2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Pro- tein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley e Sons, Inc., 2005; e Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley e Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), cujo conteúdo dos mesmos está todo incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade.

[0079] Tal como aqui utilizado, os termos "administração", "admi- nistrar" e suas variantes se referem à introdução de uma composição ou agente (por exemplo, ácidos nucleicos, em particular ceDNA) em um indivíduo e inclui a introdução simultânea e sequencial de uma ou mais composições ou agentes. "Administração" pode se referir, por exemplo, a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de pesquisa, placebo e experimentais. "Administração" também abrange tratamentos in vitro e ex vivo. A introdução de uma composição ou agente em um indivíduo é por qualquer via adequada, incluindo oral, pulmonar, intranasal, parenteral (intravenosa, intramuscular, intraperi- toneal ou subcutânea), retal, intralinfática, intratumoral ou tópica. A administração inclui autoadministração e administração por outrem. A administração pode ser realizada por qualquer via adequada. Uma via de administração adequada permite que a composição ou o agente desempenhe a função pretendida. Por exemplo, se uma via adequada é intravenosa, a composição é administrada pela introdução da com- posição ou agente na veia do indivíduo.

[0080] Tal como aqui utilizado, o termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpos, incluin- do, mas não se limitando a anticorpos monoclonais, anticorpos policlo- nais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecífi- cos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade de li- gação ao antígeno desejada. Um "fragmento de anticorpo" se refere a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao mesmo antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga.

Em uma modalidade, o anticorpo ou frag- mento de antígeno compreende uma cadeia de imunoglobulina ou fra- gmento de anticorpo e pelo menos uma sequência de domínio variável de imunoglobulina.

Exemplos de anticorpos ou fragmentos dos mes- mos incluem, mas não se limitam a um Fv, um scFv, um fragmento Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fab'-SH, um anticorpo de domínio único (dAb), uma cadeia pesada, uma cadeia leve, uma cadeia pesada e le- ve, um anticorpo completo (por exemplo, inclui cada um dos Fc, Fab, cadeias pesadas, cadeias leves, regiões variáveis, etc.), um anticorpo biespecífico, um diacorpo, um anticorpo linear, um anticorpo de cadeia única, um intracorpo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quiméri- co, um anticorpo multiespecífico ou um anticorpo multimérico.

Um an- ticorpo ou fragmento do mesmo pode ser de qualquer classe, incluin- do, mas não se limitando a IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e de qualquer subclasse dos mesmos, incluindo, mas não se limitando a IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Além disso, um anticorpo pode ser derivado de qualquer mamífero, por exemplo, primatas, humanos, ratos, ca- mundongos, cavalos, cabras, etc.

Em uma modalidade, o anticorpo é humano ou humanizado.

Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo modificado.

Em algumas modalidades, os componentes de um anticorpo podem ser expressos separadamente, de modo que o anticorpo se automonte após a expressão dos componentes da proteí- na.

Em algumas modalidades, o anticorpo é "humanizado" para reduzir as reações imunogênicas em um ser humano.

Em algumas modalida- des, o anticorpo tem uma função desejada, por exemplo, interação e inibição de uma proteína desejada com a finalidade de tratar uma do- ença ou um sintoma de uma doença.

Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região estrutural ou uma região Fc.

[0081] Como usado aqui, o termo "domínio de ligação ao antíge- no" de uma molécula de anticorpo se refere à parte de uma molécula de anticorpo, por exemplo, uma molécula de imunoglobulina (Ig), que participa da ligação ao antígeno. Em modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é formado por resíduos de aminoácidos das regiões variá- veis (V) das cadeias pesada (H) e leve (L). Três trechos altamente di- vergentes nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve, referidos como regiões hipervariáveis, são dispostos entre trechos de flanquea- mento mais conservados, denominados "regiões de estrutura" (FRs). Os FRs são sequências de aminoácidos que são naturalmente encon- tradas entre e adjacentes a regiões hipervariáveis nas imunoglobuli- nas. Nas modalidades, em uma molécula de anticorpo, as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três hipervariáveis de uma ca- deia pesada são dispostas uma em relação à outra no espaço tridi- mensional para formar uma superfície de ligação ao antígeno, que é complementar à superfície tridimensional de um antígeno ligado. As três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesada e leve são denominadas "regiões determinantes da complementaridade" ou "CDRs". A região da estrutura e as CDRs foram definidas e descritas, por exemplo, em Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de Saúde e Ser- viços Humanos dos EUA, Publicação NIH nº 91-3242, e Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 a 917. Cada cadeia variável (por exemplo, cadeia pesada variável e cadeia leve variável) é tipicamente composta de três CDRs e quatro FRs, dispostos a partir do terminal amino ao terminal carbóxi na ordem de aminoácidos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4.

[0082] Tal como aqui utilizado, a frase "resposta imunológica anti- terapêutica ao ácido nucleico", "resposta imunológica do vetor anti-

transferência", "resposta imunológica contra um ácido nucleico tera- pêutico", "resposta imunológica contra um vetor de transferência" ou semelhantes destina-se a se referir a qualquer resposta imunológica indesejada contra um ácido nucleico terapêutico, viral ou não viral em sua origem. Em algumas modalidades, a resposta imunológica indese- jada é uma resposta imunológica específica do antígeno contra o pró- prio vetor de transferência viral. Em algumas modalidades, a resposta imunológica é específica para o vetor de transferência que pode ser DNA de fita dupla, RNA de fita simples ou RNA de fita dupla. Em ou- tras modalidades, a resposta imunológica é específica para uma se- quência do vetor de transferência. Em outras modalidades, a resposta imunológica é específica para o teor de CpG do vetor de transferência.

[0083] Como usado neste documento, "carreador" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, veículos, revestimentos, diluen- tes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retar- dadores de absorção, tampões, soluções carreadoras, suspensões, coloides e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composi- ções. A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades e composições moleculares que não produzem uma reação indesejável tóxica, alérgica ou semelhante quando administradas a um hospedei- ro.

[0084] Tal como aqui utilizado, o termo "ceDNA" destina-se a se referir ao DNA duplex de fita dupla (ds) linear com extremidade fecha- da sem capsídeo para transferência de genes não virais, sintéticos ou de outra forma. A descrição detalhada do ceDNA é descrita no Pedido Internacional de PCT/US2017/020828, depositado em 3 de março de 2017, cujo conteúdo total é expressamente incorporado neste docu- mento a título de referência. Determinados métodos para a produção de ceDNA que compreende várias configurações e sequências de re- petição terminal invertida (ITR) com o uso de métodos baseados em células são descritos no Exemplo 1 dos Pedidos Internacionais PCT/US18/49996, depositado em 7 de setembro de 2018, e PCT/US2018/064242, depositado em 6 de dezembro de 2018, cada um dos quais é incorporado ao presente documento em sua totalidade a título de referência. Certos métodos para a produção de vetores de ceDNA sintéticos compreendendo várias sequências e configurações de ITR são descritos, por exemplo, no Pedido Internacional PCT/US2019/14122, depositado em 18 de janeiro de 2019, cujo con- teúdo total é incorporado neste documento a título de referência. Tal como aqui utilizado, os termos "vetor de ceDNA" e "ceDNA" são usa- dos indistintamente. De acordo com algumas modalidades, o ceDNA é um DNA CELiD duplex linear com extremidade fechada (CELiD). De acordo com algumas modalidades, o ceDNA é um minicírculo baseado em DNA. De acordo com algumas modalidades, o ceDNA é um vetor minimalista de expressão gênica definida imunologicamente (MIDGE). De acordo com algumas modalidades, o ceDNA é um DNA ministra- dor. De acordo com algumas modalidades, o ceDNA é um DNA com extremidade fechada duplex linear em forma de halter que compreen- de duas estruturas em forma de grampo de ITRs nas extremidades 5' e 3' de um cassete de expressão. De acordo com algumas modalida- des, o ceDNA é um DNA doggybone™.

[0085] Como usado aqui, o termo "ceDNA-bacmídeo" refere-se a um genoma de baculovírus infeccioso que compreende um genoma de ceDNA como um duplex intermolecular que tem capacidade de se propagar em E. coli como um plasmídeo e, portanto, pode operar co- mo um vetor shuttle para baculovírus.

[0086] Como usado aqui, o termo "ceDNA-baculovírus" refere-se a um baculovírus que compreende um genoma de ceDNA como um du-

plex intermolecular dentro do genoma de baculovírus.

[0087] Conforme usado aqui, os termos "célula de inseto infectada por ceDNA-baculovírus" e "ceDNA-BIIC" são usados de forma inter- cambiável e se referem a uma célula hospedeira de invertebrado (in- cluindo, mas não se limitando a, uma célula de inseto (por exemplo, uma célula Sf9)) infectada com um ceDNA-baculovírus.

[0088] Como usado aqui, o termo "genoma de ceDNA" refere-se a um cassete de expressão que incorpora ainda pelo menos uma região de repetição terminal invertida. Um genoma de ceDNA pode ainda compreender uma ou mais regiões espaçadoras. Em algumas modali- dades, o genoma de ceDNA é incorporado como um polinucleotídeo duplex intermolecular de DNA em um plasmídeo ou genoma viral.

[0089] Como usado aqui, o termo "ceDNA-plasmídeo" refere-se a um plasmídeo que compreende um genoma de ceDNA como um du- plex intermolecular.

[0090] Conforme usado aqui, os termos "vetor de DNA com extre- midade fechada", "vetor de ceDNA" e "ceDNA" são usados de forma intercambiável e se referem a um vetor de DNA não viral sem capsí- deo com pelo menos uma extremidade covalentemente fechada (isto é, um duplex intramolecular). Em algumas modalidades, o ceDNA compreende duas extremidades fechadas covalentemente.

[0091] Como usado aqui, o termo "região espaçadora de ceDNA" refere-se a uma sequência intermediária que separa elementos funci- onais no vetor de ceDNA ou no genoma ceDNA. Em algumas modali- dades, as regiões espaçadoras de ceDNA mantêm dois elementos funcionais a uma distância desejada para a funcionalidade ideal. Em algumas modalidades, as regiões espaçadoras de ceDNA fornecem ou aumentam a estabilidade genética do genoma de ceDNA dentro, por exemplo, de um plasmídeo ou baculovírus. Em algumas modalidades, as regiões espaçadoras de ceDNA facilitam a manipulação genética pronta do genoma de ceDNA, fornecendo uma localização convenien- te para sítios de clonagem e similares. Por exemplo, em certos aspec- tos, um oligonucleotídeo "poliligante" contendo vários sítios de endo- nuclease de restrição ou uma sequência de quadro de leitura não aberta projetada para não ter nenhum sítio de ligação à proteína co- nhecido (por exemplo, fator de transcrição) pode ser posicionado no genoma do ceDNA para separar os fatores de ação cis, por exemplo, inserção de 6 mer, 12 mer, 18 mer, 24 mer, 48 mer, 86 mer, 176 mer, etc. entre o sítio de resolução do terminal e o elemento regulador da transcrição a montante. Do mesmo modo, o espaçador pode ser incor- porado entre a sequência do sinal de poliadenilação e o sítio de reso- lução do terminal 3'.

[0092] Tal como aqui utilizado, a frase uma "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente ativo ou agente terapêutico, como um ácido nucleico terapêutico, é uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado, por exemplo, inibição da ex- pressão de uma sequência-alvo em comparação com o nível de ex- pressão detectado na ausência de um ácido nucleico terapêutico. En- saios adequados para medir a expressão de um gene ou sequência- alvo incluem, por exemplo, o exame de níveis de proteína ou de RNA usando técnicas conhecidas pelos versados na técnica, como dot blots, Northern blots, hibridização in situ, ELISA, imunoprecipitação, função enzimática, bem como ensaios fenotípicos conhecidos pelos versados na técnica.

[0093] Como aqui usado, o termo "exógeno" refere-se a uma subs- tância presente em uma célula que não seja a sua fonte nativa. O ter- mo "exógeno", quando usado aqui, pode se referir a um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo) ou um polipeptídeo que foi introduzido por um processo que envolve a mão do homem em um sistema biológico, como uma célula ou organismo em que normalmente não é encontrado e se deseja introduzir o ácido nucleico ou polipeptídeo em uma célula ou organismo. Alternativamen- te, "exógeno" pode se referir a um ácido nucleico ou um polipeptídeo que foi introduzido por um processo que envolve a mão do homem em um sistema biológico, como uma célula ou organismo em que é encon- trado em quantidades relativamente baixas e se deseja aumentar a quantidade do ácido nucleico ou polipeptídeo na célula ou organismo, por exemplo, para criar expressão ou níveis ectópicos. Em contraste, como aqui usado, o termo "endógeno" refere-se a uma substância que é nativa ao sistema biológico ou célula.

[0094] Como usado aqui, o termo "proteína efetora" refere-se a um polipeptídeo que fornece uma leitura detectável, como, por exemplo, um polipeptídeo repórter ou, mais apropriadamente, como um polipep- tídeo que mata uma célula, por exemplo, uma toxina ou um agente que torna uma célula suscetível de matar com um agente escolhido ou a falta do mesmo. As proteínas efetoras incluem qualquer proteína ou peptídeo que atinja ou danifique diretamente o DNA e/ou o RNA da célula hospedeira. Por exemplo, proteínas efetoras podem incluir, mas não estão limitadas a uma endonuclease de restrição que tem como alvo uma sequência de DNA da célula hospedeira (seja genômica ou em um elemento extracromossômico), uma protease que degrada um alvo polipeptídico necessário para a sobrevivência celular, um inibidor da DNA girase e uma toxina do tipo ribonuclease. Em algumas moda- lidades, a expressão de uma proteína efetora controlada por um circui- to biológico sintético, como descrito neste documento, pode participar como um fator em outro circuito biológico sintético, expandindo, assim, a faixa e a complexidade da capacidade de resposta de um sistema de circuitos biológicos.

[0095] Como aqui usado, os termos "cassete de expressão" e "cassete de transcrição" são usados de forma intercambiável e se refe-

rem a um trecho linear de ácidos nucleicos que inclui um transgene que está operacionalmente ligado a um ou mais promotores ou outras sequências reguladoras suficientes para direcionar a transcrição do transgene, mas que não compreende sequências que codificam o capsídeo, outras sequências de vetores ou regiões de repetição termi- nal invertida. Um cassete de expressão pode adicionalmente compre- ender uma ou mais sequências de ação cis (por exemplo, promotores, intensificadores ou repressores), um ou mais íntrons e um ou mais elementos reguladores pós-transcricionais.

[0096] O termo "flanqueamento" refere-se a uma posição relativa de uma sequência de ácido nucleico em relação a outra sequência de ácido nucleico. Geralmente, na sequência ABC, B é flanqueada por A e C. O mesmo vale para o arranjo AxBxC. Assim, uma sequência flan- queadora precede ou segue uma sequência flanqueada, mas não pre- cisa ser contígua ou imediatamente adjacente à sequência flanqueada. Em uma modalidade, o termo flanqueamento refere-se a repetições terminais em cada extremidade do vetor de AAV sintético de fita sim- ples linear.

[0097] Como usado aqui, o termo "anticorpo de comprimento total" refere-se a uma molécula de imunoglobulina (Ig) (por exemplo, um an- ticorpo IgG), por exemplo, que ocorre naturalmente e formada por pro- cessos recombinatórios normais de fragmentos de genes de imuno- globulina.

[0098] Como usado aqui, o termo "fragmento de anticorpo funcio- nal" refere-se a um fragmento que se liga ao mesmo antígeno que o reconhecido pelo anticorpo intacto (por exemplo, de comprimento to- tal). Os termos "fragmento de anticorpo" ou "fragmento funcional" tam- bém incluem fragmentos isolados que consistem nas regiões variáveis, como os fragmentos "Fv" que consistem nas regiões variáveis de ca- deias pesada e leve ou moléculas de polipeptídeo recombinante de cadeia única nas quais leves e pesadas regiões variáveis são conec- tadas por um peptídeo ligante ("proteínas scFv"). Em algumas modali- dades, um fragmento de anticorpo não inclui porções de anticorpos sem atividade de ligação ao antígeno, como fragmentos Fc ou resí- duos de aminoácidos únicos.

[0099] Tal como aqui utilizado, os termos "lacuna" e "entalhe" são usados indistintamente e se referem a uma porção descontinuada do vetor de DNA sintético da presente divulgação, criando um trecho de porção de DNA de fita simples em ceDNA de outra forma de fita dupla. A lacuna pode ter 1 par de bases a 100 pares de bases de comprimen- to em uma fita de um DNA duplex. Lacunas típicas, projetadas e cria- das pelos métodos aqui descritos e vetores sintéticos gerados pelos métodos podem ter, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 pb de comprimento. As lacunas exemplificadas na presente divulgação podem ter 1 pb a 10 pb de comprimento, 1 a 20 pb de comprimento, 1 a 30 pb de comprimento.

[00100] Conforme usado neste documento, o termo "gene" é usado amplamente para se referir a qualquer segmento de ácido nucleico as- sociado à expressão de um determinado RNA ou proteína, in vitro ou in vivo. Assim, os genes incluem regiões que codificam RNAs expres- sos (que tipicamente incluem sequências de codificação de polipeptí- deos) e, frequentemente, as sequências reguladoras necessárias para sua expressão. Os genes podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, incluindo a clonagem de uma fonte de interesse ou a sínte- se de informações de sequência conhecidas ou previstas, e podem incluir sequências projetadas para ter parâmetros especificamente de- sejados.

[00101] Como aqui usado, a frase "doença genética" ou "distúrbio genético" refere-se a uma doença, parcial ou completamente, direta ou indiretamente, causada por uma ou mais anormalidades no genoma, inclusive e especialmente uma condição presente desde o nascimento. A anormalidade pode ser uma mutação, uma inserção ou uma deleção em um gene. A anormalidade pode afetar a sequência de codificação do gene ou sua sequência reguladora.

[00102] Como aqui usado, o termo "heterólogo" significa uma se- quência nucleotídica ou polipeptídica que não é encontrada no ácido nucleico ou proteína nativa, respectivamente.

[00103] Como usado aqui, os termos "sequência de nucleotídeos heteróloga" e "transgene" são usados de forma intercambiável e se referem a um ácido nucleico de interesse (que não seja um ácido nu- cleico que codifica um polipeptídeo do capsídeo) que é incorporado e pode ser entregue e expresso por um vetor de ceDNA como aqui di- vulgado. Uma sequência de ácido nucleico heteróloga pode ser ligada a uma sequência de ácido nucleico de ocorrência natural (ou uma va- riante da mesma) (por exemplo, por modificação genética) para gerar uma sequência de nucleotídeo quimérica que codifica um polipeptídeo quimérico. Uma sequência de ácido nucleico heteróloga pode ser liga- da a um polipeptídeo variante (por exemplo, por modificação genética) para gerar uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptí- deo variante de fusão. Transgenes de interesse incluem, mas não es- tão limitados a, ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos, prefe- rencialmente terapêuticos (por exemplo, para uso médico, diagnóstico ou veterinário) ou polipeptídeos imunogênicos (por exemplo, para va- cinas). Em algumas modalidades, ácidos nucleicos de interesse inclu- em ácidos nucleicos que são transcritos no RNA terapêutico. Os transgenes incluídos para uso nos vetores de ceDNA da divulgação incluem, mas não estão limitados a, aqueles que expressam ou codifi- cam um ou mais polipeptídeos, peptídeos, ribozimas, aptâmeros, áci-

dos nucleicos peptídicos, siRNAs, RNAis, miRNAs, lncRNAs, oligo ou polinucleotídeos antissenso, anticorpos, fragmentos de ligação a antí- geno ou qualquer combinação dos mesmos.

[00104] Como usado no presente documento, o termo "homologia" ou "homólogo" é definido como a porcentagem de resíduos de nucleo- tídeos no braço de homologia que são idênticos aos resíduos de nu- cleotídeos na sequência correspondente no cromossomo-alvo, depois de alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência. O alinha- mento para fins de determinação da porcentagem de homologia de sequência de nucleotídeos pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da especialidade na técnica, por exemplo, usando softwa- re de computador disponível publicamente, como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 ou Megalign (DNASTAR). Aqueles ver- sados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para ali- nhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para al- cançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências que são comparadas. Em algumas modalidades, uma se- quência de ácidos nucleicos (por exemplo, sequência de DNA), por exemplo, um braço de homologia de um modelo de reparo, é conside- rada "homóloga" quando a sequência é pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo me- nos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pe- lo menos 99%, ou mais, idêntica à sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, sequência genômica) nativa ou não editada correspondente da célula hospedeira.

[00105] Como aqui utilizado, o termo "célula hospedeira" se refere a qualquer tipo de célula suscetível à transformação, transfecção, trans- dução e afins com a terapia de ácidos nucleicos da presente divulga-

ção. Como exemplos não limitativos, uma célula hospedeira pode ser uma célula primária isolada, células-tronco pluripotentes, células CD34+, células-tronco pluripotentes induzidas ou qualquer uma de vá- rias linhagens celulares imortalizadas (por exemplo, células HepG2). Alternativamente, uma célula hospedeira pode ser uma célula in situ ou in vivo em um tecido, órgão ou organismo. Além disso, uma célula hospedeira pode ser uma célula-alvo de, por exemplo, um indivíduo mamífero (por exemplo, um paciente humano em necessidade de te- rapia genética).

[00106] Como aqui utilizado, uma "sequência de domínio variável de imunoglobulina" refere-se a uma sequência de aminoácidos que pode formar a estrutura de um domínio variável de imunoglobulina. Por exemplo, a sequência pode incluir toda ou parte da sequência de ami- noácidos de um domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, a sequência pode ou não incluir um, dois ou mais aminoácidos N ou C terminais ou pode incluir outras alterações compatíveis com a forma- ção da estrutura da proteína.

[00107] Como aqui descrito, um "promotor induzível" é aquele que é caracterizado por iniciar ou aprimorar a atividade transcricional quando na presença de, influenciado por ou contatado por um indutor ou agen- te indutor. Um "indutor" ou "agente indutor", como aqui definido, pode ser endógeno, ou um composto ou proteína normalmente exógeno que é administrado de modo a ser ativo na indução de atividade transcrici- onal a partir do promotor indutível. Em algumas modalidades, o indutor ou agente indutor, ou seja, um produto químico, um composto ou uma proteína, pode ser o resultado da transcrição ou expressão de uma sequência de ácido nucleico (ou seja, um indutor pode ser uma proteí- na indutora expressa por outro componente ou módulo), que por si só pode estar sob o controle ou um promotor induzível. Em algumas mo- dalidades, um promotor induzível é induzido na ausência de certos agentes, como um repressor. Exemplos de promotores induzíveis in- cluem, entre outros, tetraciclina, metalotionina, ecdisona, vírus de ma- mífero (por exemplo, o promotor tardio dos adenovírus; e repetição terminal longa do vírus do tumor mamário do camundongo (MMTV- LTR)) e outros promotores responsivos aos esteroides, promotores responsivos a rapamicina e afins.

[00108] Como usado aqui, um "domínio responsivo ao agente de entrada" é um domínio de um fator de transcrição que se liga ou res- ponde a uma condição ou agente de entrada de uma maneira que pro- cesse um domínio de fusão de ligação a DNA vinculado à presença dessa condição ou entrada. Em uma modalidade, a presença da con- dição ou entrada resulta em uma alteração conformacional no domínio responsivo do agente de entrada ou em uma proteína à qual o mesmo é fundido, que modifica a atividade de modulação da transcrição do fator de transcrição.

[00109] O termo "in vivo" se refere a ensaios ou processos que ocorrem em ou dentro de um organismo, como um animal multicelular. Em alguns dos aspectos aqui descritos, pode-se dizer que um método ou uso pode ocorrer "in vivo " quando um organismo unicelular, como uma bactéria, é usado. O termo "ex vivo" se refere a métodos e usos que são realizados usando uma célula viva com uma membrana intac- ta que está fora do corpo de um animal ou planta multicelular, por exemplo, explantes, células cultivadas, incluindo células primárias e linhagens celulares, linhagens celulares transformadas e tecido ou cé- lulas extraídas, incluindo células sanguíneas, entre outros.

[00110] O termo "in vitro" se refere a ensaios e métodos que não exigem a presença de uma célula com uma membrana intacta, como extratos celulares, e podem se referir à introdução de um circuito bio- lógico sintético programável em um sistema não celular, como um meio que não compreende células ou sistemas celulares, como extra-

tos celulares.

[00111] Conforme usado neste documento, o termo "entrega local" se refere à entrega de um agente ativo, como um RNA de interferência (por exemplo, siRNA) diretamente a um sítio-alvo dentro de um orga- nismo. Por exemplo, um agente pode ser distribuído localmente por injeção direta em um sítio da doença, como um tumor ou outro sítio- alvo, como um sítio de inflamação ou um órgão-alvo, como o fígado, coração, pâncreas, rim e semelhantes.

[00112] Conforme usado neste documento, as expressões de "ITR modificada" ou "mod-ITR" ou "ITR mutante" são usadas de forma in- tercambiável e se referem a uma ITR que tem uma mutação em pelo menos um ou mais nucleotídeos em comparação com a ITR de tipo selvagem do mesmo sorotipo. A mutação pode resultar em uma alte- ração em uma ou mais das regiões A, C, C', B, B' na ITR e pode resul- tar em uma alteração na organização espacial tridimensional (ou seja, sua estrutura 3D no espaço geométrico) em comparação com a orga- nização espacial 3D de uma ITR de tipo selvagem do mesmo sorotipo.

[00113] Conforme usado neste documento, o termo "neDNA" ou "ceDNA cortado" se refere a um DNA com extremidade fechada com um corte ou um intervalo de 1 a 100 pares de bases em uma região de haste ou região espaçadora 5' a montante de um quadro de leitura aberta (por exemplo, um promotor e transgene a ser expresso).

[00114] Tal como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" pretende referir-se a um polímero contendo pelo menos dois nucleotídeos (ou seja, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos) na forma de fita simples ou dupla e inclui DNA, RNA e seus híbridos. O DNA pode es- tar na forma de, por exemplo, moléculas antissenso, DNA de plasmí- deo, duplexes de DNA-DNA, DNA pré-condensado, produtos de PCR, vetores (P1, PAC, BAC, YAC, cromossomos artificiais), cassetes de expressão, sequências quiméricas, cromossômicas DNA ou derivados e combinações destes grupos. O DNA pode estar na forma de minicír- culo, plasmídeo, bacmídeo, minigene, DNA minifita (vetor de DNA co- valentemente fechado), DNA duplex linear fechado (CELiD ou ceDNA), DNA doggybone™, DNA em forma de haltere, vetor minimalista de ex- pressão de gene definido imunologicamente (MIDGE), vetor viral ou vetores não virais. O RNA pode estar na forma de pequeno RNA inter- ferente (siRNA), dsRNA substrato de Dicer, RNA em forma de grampo curto (shRNA), RNA interferente assimétrico (aiRNA), microRNA (miRNA), mRNA, rRNA, tRNA, RNA viral (vRNA) e suas combinações. Os ácidos nucleicos incluem ácidos nucleicos contendo análogos de nucleotídeos conhecidos ou resíduos de estrutura modificados ou liga- ções, que são sintéticos, de ocorrência natural e de ocorrência não natural, e que têm propriedades de ligação semelhantes às do ácido nucleico de referência. Exemplos de tais análogos e/ou resíduos modi- ficados incluem, sem limitação, fosforotioatos, fosforodiamidato morfo- lino oligômero (morfolino), fosforamidatos, metil fosfonatos, quiral-metil fosfonatos, 2'-O-metil ribonucleotídeos, ácido nucleico bloqueado (LNA™) e ácidos nucleicos de peptídeo (PNAs). A menos que especi- ficamente limitado, o termo abrange ácidos nucleicos contendo análo- gos conhecidos de nucleotídeos naturais que têm propriedades de li- gação semelhantes às do ácido nucleico de referência. A menos que indicado de outra forma, uma sequência de ácido nucleico particular também engloba implicitamente suas variantes modificadas de forma conservadora (por exemplo, substituições de códons degenerados), alelos, ortólogos, SNPs e sequências complementares, bem como a sequência explicitamente indicada.

[00115] Tal como aqui utilizado, "nucleotídeos" contêm um açúcar desoxirribose (DNA) ou ribose (RNA), uma base e um grupo fosfato. Os nucleotídeos estão ligados entre si através dos grupos fosfato.

[00116] Tal como aqui utilizadas, as frases "ácido nucleico terapêu-

tico", "ácido nucleico terapêutico" e "TNA" são usadas indistintamente e referem-se a qualquer modalidade de terapia usando ácidos nuclei- cos como um componente ativo do agente terapêutico para tratar uma doença ou distúrbio. Tal como aqui utilizado, essas frases referem-se à terapia baseada em RNA e terapia baseada em DNA. Exemplos não limitativos de terapia baseada em RNA incluem mRNA, RNA antissen- so e oligonucleotídeos, ribozimas, aptâmeros, RNAs interferentes (RNAi), dsRNA de substrato de Dicer, RNA em grampo pequeno (shRNA), RNA interferente assimétrico (aiRNA), microRNA (miRNA). Exemplos não limitativos de terapia baseada em DNA incluem DNA de minicírculo, minigene, DNA viral (por exemplo, genoma de Lentiviral ou AAV) ou vetores de DNA sintético não viral, DNA duplex linear fechado (ceDNA/CELiD), plasmídeos, bacmídeos, vetores de DNA doggybo- ne™, vetor minimalista de expressão gênica definida imunologicamen- te (MIDGE), vetor de DNA de minifita não viral (vetor de DNA linear covalentemente fechado) ou vetor mínimo de DNA em forma de halte- re ('DNA de haltere").

[00117] O termo "promotor", como usado aqui, refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico que regula a expressão de outra sequên- cia de ácido nucleico, conduzindo a transcrição da sequência de ácido nucleico, que pode ser um gene-alvo heterólogo que codifica uma pro- teína ou um RNA. Os promotores podem ser constitutivos, indutíveis, repressíveis, específicos de tecido ou qualquer combinação dos mes- mos. Um promotor é uma região de controle de uma sequência de áci- do nucleico na qual são controladas a iniciação e a taxa de transcrição do restante de uma sequência de ácido nucleico. Um promotor tam- bém pode conter elementos genéticos nos quais proteínas e moléculas reguladoras podem se ligar, como RNA polimerase e outros fatores de transcrição. Em algumas modalidades dos aspectos aqui descritos, um promotor pode dirigir a expressão de um fator de transcrição que regu-

la a expressão do próprio promotor ou de outro promotor usado em outro componente modular dos circuitos biológicos sintéticos descritos no presente documento. Dentro da sequência do promotor, será en- contrado um sítio de iniciação da transcrição, bem como os domínios de ligação às proteínas responsáveis pela ligação da RNA polimerase. Os promotores eucarióticos contêm frequentemente, mas nem sem- pre, caixas "TATA" e caixas "CAT". Vários promotores, incluindo pro- motores induzíveis, podem ser usados para acionar a expressão de transgenes nos vetores de ceDNA aqui divulgados.

[00118] O termo "intensificador", conforme usado aqui, refere-se a uma sequência reguladora de ação cis (por exemplo, 50 a 1.500 pares de bases) que liga uma ou mais proteínas (por exemplo, proteínas ati- vadoras ou fator de transcrição) para aumentar a ativação transcricio- nal de uma sequência de ácido nucleico. Os intensificadores podem ser posicionados em até 1.000.000 de pares de bases a montante do sítio inicial do gene ou a jusante do sítio inicial do gene que os mes- mos regulam. Um intensificador pode ser posicionado dentro de uma região intrônica ou na região exônica de um gene não relacionado.

[00119] Pode-se dizer que um promotor direciona a expressão ou conduz a transcrição da sequência de ácido nucleico que o mesmo regula. Como usado no presente documento, "operacionalmente liga- do" refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em um relacionamento que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afeta sua transcrição ou expressão. As expressões "operacionalmente ligada", "operacional- mente posicionada", "operacionalmente ligada", "sob controle" e "sob controle transcricional" indicam que um promotor está em um sítio fun- cional correto e/ou orientação em relação a uma sequência de ácido nucleico que regula para controlar a iniciação da transcrição e/ou ex-

pressão dessa sequência. Um "promotor invertido", como usado aqui, refere-se a um promotor no qual a sequência de ácido nucleico está na orientação reversa, de modo que o que era a cadeia de codificação agora é a fita não codificante e vice-versa. Sequências promotoras in- vertidas podem ser usadas em várias modalidades para regular o es- tado de um interruptor. Além disso, em várias modalidades, um promo- tor pode ser usado em conjunto com um intensificador.

[00120] Um promotor pode ser um naturalmente associado a um gene ou sequência, como pode ser obtido isolando as sequências não codificadoras 5' localizadas a montante do segmento de codificação e/ou éxon de um determinado gene ou sequência. Esse promotor pode ser chamado de "endógeno". Da mesma forma, em algumas modali- dades, um intensificador pode ser um naturalmente associado a uma sequência de ácido nucleico, localizada a jusante ou a montante dessa sequência.

[00121] Em algumas modalidades, um segmento de ácido nucleico codificador é posicionado sob o controle de um "promotor recombinan- te" ou "promotor heterólogo", ambos os quais se referem a um promo- tor que normalmente não está associado à sequência de ácido nuclei- co codificada à qual está operacionalmente ligado em seu ambiente natural. Um intensificador recombinante ou heterólogo refere-se a um intensificador que normalmente não está associado a uma dada se- quência de ácido nucleico no seu ambiente natural. Tais promotores ou intensificadores podem incluir promotores ou intensificadores de outros genes; promotores ou intensificadores isolados de qualquer ou- tra célula procariótica, viral ou eucariótica; e promotores ou intensifica- dores sintéticos de "ocorrência não natural", isto é, compreendem dife- rentes elementos de diferentes regiões reguladoras da transcrição e/ou mutações que alteram a expressão por métodos de engenharia genética conhecidos na técnica. Além de produzir sequências de ácido nucleico de promotores e intensificadores sinteticamente, as sequên- cias de promotor podem ser produzidas usando a clonagem recombi- nante e/ou a tecnologia de amplificação de ácido nucleico, incluindo PCR, em conexão com os circuitos e módulos biológicos sintéticos aqui divulgados (consulte, por exemplo, Patente U.S. nº 4.683.202, Patente U.S. nº 5.928.906, cada uma incorporada ao presente docu- mento a título de referência). Além disso, é contemplado que sequên- cias de controle que direcionam a transcrição e/ou expressão de se- quências dentro de organelas não nucleares, como mitocôndrias, clo- roplastos e similares, também podem ser empregadas.

[00122] Como usado aqui, os termos "sítio de ligação a Rep," ele- mento de ligação a Rep, "RBE" e "RBS" são usados de forma inter- cambiável e referem-se a um sítio de ligação para a proteína Rep (por exemplo, AAV Rep 78 ou AAV Rep 68) que, após a ligação por uma proteína Rep permite que a proteína Rep realize sua atividade de en- donuclease sítio-específica na sequência que incorpora o RBS. Uma sequência RBS e seu complemento inverso juntos formam um único RBS. As sequências RBS são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531), uma se- quência RBS identificada no AAV2. Qualquer sequência RBS conheci- da pode ser usada nas modalidades da invenção, incluindo outras se- quências conhecidas de AAV RBS e outras sequências naturalmente conhecidas ou sintéticas de RBS. Sem estar limitado pela teoria, pen- sa-se que o domínio da nuclease de uma proteína Rep se liga à se- quência de nucleotídeos duplex GCTC e, portanto, as duas proteínas AAV Rep conhecidas se ligam diretamente e se montam de forma es- tável no oligonucleotídeo duplex, 5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3' (SEQ ID NO: 531). Além disso, os conformadores agregados solúveis (isto é, número indefinido de proteínas Rep interassociadas) se disso- ciam e se ligam a oligonucleotídeos que contêm sítios de ligação a

Rep. Cada proteína Rep interage com as bases nitrogenadas e a es- trutura principal de fosfodiéster em cada fita. As interações com as ba- ses nitrogenadas fornecem especificidade de sequência, enquanto as interações com a cadeia principal de fosfodiéster apresentam especifi- cidade de sequência menor ou nula e estabilizam o complexo proteí- na-DNA.

[00123] Conforme usado neste documento, o termo "repórter" se refere a uma proteína que pode ser usada para fornecer uma leitura detectável. Os repórteres geralmente produzem um sinal mensurável, como fluorescência, cor ou luminescência. As sequências codificado- ras de proteínas repórter codificam proteínas cuja presença na célula ou organismo é facilmente observada. Por exemplo, proteínas fluores- centes fazem com que a célula fique fluorescente quando excitada com luz de um comprimento de onda específico, as luciferases fazem com que a célula catalise uma reação que produz luz, e enzimas como a β-galactosidase convertem um substrato em um produto colorido. Polipeptídeos repórter exemplificativos úteis para fins experimentais ou de diagnóstico incluem, mas não estão limitados a β-lactamase, β- galactosidase (LacZ), fosfatase alcalina (AP), timidina-quinase (TK), proteína verde fluorescente (GFP) e outras proteínas fluorescentes, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), luciferase e outros bem conheci- dos na técnica.

[00124] Como aqui utilizado, uma "proteína repressora" ou "proteína indutora" é uma proteína que se liga a um elemento de sequência re- guladora e reprime ou ativa, respectivamente, a transcrição de se- quências operacionalmente ligadas ao elemento de sequência regula- dora. As proteínas repressoras e indutoras preferidas, como aqui des- critas, são sensíveis à presença ou ausência de pelo menos um agen- te de entrada ou entrada ambiental. As proteínas preferidas como aqui descritas são de forma modular, que compreende, por exemplo, ele-

mentos ou domínios de ligação separáveis para ligação ao DNA e li- gação ao agente de entrada ou responsivos.

[00125] O termo "identidade de sequência" refere-se à relação entre duas sequências de nucleotídeos. Para os fins da presente divulgação, o grau de identidade de sequência entre duas sequências desoxirribo- nucleotídicas é determinado usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra), conforme implementado no pro- grama Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecu- lar Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferenci- almente versão 3.0.0 ou posterior. Os parâmetros opcionais utilizados são penalidade de abertura de folga de 10, penalidade de extensão de folga de 0,5 e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS do NCBI NUC4.4). A saída da agulha denominada "identidade mais longa" (obtida usando a opção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada da seguinte forma: (Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de La- cunas no Alinhamento). O comprimento do alinhamento é preferenci- almente pelo menos 10 nucleotídeos, preferencialmente pelo menos 25 nucleotídeos mais preferidos pelo menos 50 nucleotídeos e mais preferencialmente pelo menos 100 nucleotídeos.

[00126] Os termos "senso" e "antissenso" no método acima menci- onado se referem à orientação do elemento estrutural no polinucleotí- deo. As versões senso e antissenso de um elemento são o comple- mento inverso uma da outra.

[00127] Conforme usado neste documento, o termo "região espa- çadora" se refere a uma sequência interveniente que separa elemen- tos funcionais em um vetor ou genoma. Em algumas modalidades, as regiões espaçadoras de AAV mantêm dois elementos funcionais a uma distância desejada para a funcionalidade ideal. Em algumas mo- dalidades, as regiões espaçadoras fornecem ou aumentam a estabili-

dade genética do vetor ou genoma. Em algumas modalidades, as re- giões espaçadoras facilitam a manipulação genética pronta do geno- ma, proporcionando uma localização conveniente para sítios de clona- gem e uma lacuna do número de design do par de bases. Por exem- plo, em certos aspectos, um oligonucleotídeo "poliligante" ou "sítio de policlonagem" contendo vários sítios de endonuclease de restrição ou uma sequência de quadro de leitura não aberta projetada para não ter nenhum sítio de ligação de proteína conhecido (por exemplo, fator de transcrição) pode ser posicionado no vetor ou genoma para separar os fatores de ação cis, por exemplo, inserindo um 6 mer, 12 mer, 18 mer, 24 mer, 48 mer, 86 mer, 176 mer, etc.

[00128] O termo "indivíduo", conforme aqui utilizado, refere-se a um ser humano ou animal, a quem é fornecido tratamento, incluindo tra- tamento profilático, com o vetor de ceDNA de acordo com a presente invenção. Geralmente, o animal é um vertebrado como, mas não limi- tado a, primata, roedor, animal doméstico ou animal de caça. Os pri- matas incluem, mas não estão limitados a, chimpanzés, macacos ci- nomólogos, macacos-aranha e macacos, por exemplo, Rhesus. Os roedores incluem camundongos, ratos, marmotas, furões, coelhos e hamsters. Os animais domésticos e de caça incluem, entre outros, va- cas, cavalos, porcos, veados, bisões, búfalos, espécies felinas, por exemplo, gato doméstico, espécies caninas, por exemplo, cachorro, raposa, lobo, espécies aviárias, por exemplo, frango, ema, avestruz e peixe, por exemplo, truta, peixe-gato e salmão. Em certas modalidades dos aspectos aqui descritos, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um primata ou ser um humano. Um indivíduo pode ser homem ou mu- lher. Além disso, um indivíduo pode ser um bebê ou uma criança. Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um recém-nascido ou não nascido, por exemplo, o indivíduo está no útero. De preferência, o indi- víduo é um mamífero. O mamífero pode ser um primata humano, não humano, camundongo, rato, cachorro, gato, cavalo ou vaca, mas não está limitado a esses exemplos. Outros mamíferos que não humanos podem ser utilizados com vantagem como indivíduos que representam modelos animais de doenças e distúrbios. Além disso, os métodos e composições aqui descritos podem ser utilizados para animais domes- ticados e/ou animais de estimação. Um indivíduo humano pode ser de qualquer idade, sexo, raça ou grupo étnico, por exemplo, caucasiano (branco), asiático, africano, preto, afro-americano, africano europeu, hispânico, do oriente médio, etc. Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um paciente ou outro indivíduo em um ambiente clínico. Em algumas modalidades, o indivíduo já está em tratamento.

[00129] Conforme usado aqui, os termos "ITRs modificadas subs- tancialmente simétricas" ou um "par de ITRs modificadas substancial- mente simétricas" refere-se a um par de ITRs modificadas dentro de um único genoma de ceDNA ou vetor de ceDNA que têm uma se- quência de complemento inversa em seu comprimento inteiro. Por exemplo, a ITR modificada pode ser considerada substancialmente simétrica, mesmo que tenha algumas sequências nucleotídicas que se desviam da sequência do complemento inverso, desde que as altera- ções não afetem as propriedades e a forma geral. Como um exemplo não limitativo, uma sequência que tem pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência da sequência ca- nônica (conforme medida usando BLAST nas configurações padrão), e também tem uma organização espacial tridimensional simétrica à ITR modificada cognata, de modo que suas estruturas 3D tenham a mes- ma forma no espaço geométrico. Dito de forma diferente, um par de ITRs modificadas substancialmente simétricas tem as mesmas alças A, C-C' e B-B' organizadas no espaço 3D. Em algumas modalidades, as ITRs de um par de mod-ITRs podem ter diferentes sequências nu- cleotídicas de complemento reverso, mas ainda têm a mesma organi-

zação espacial tridimensional simétrica - ou seja, ambas as ITRs têm mutações que resultam na mesma forma 3D geral.

Por exemplo, uma ITR (por exemplo, ITR 5') em um par mod-ITR pode ser de um sorotipo e a outra ITR (por exemplo, ITR 3') pode ser de um sorotipo diferente, no entanto, ambas podem ter a mesma mutação correspondente (por exemplo, se a ITR 5' tiver uma exclusão na região C, a ITR 3' modifi- cada cognata de um sorotipo diferente tem uma exclusão na posição correspondente na região C'), de modo que o par de ITRs modificadas tenha a mesma organização espacial tridimensional simétrica.

Em tais modalidades, cada ITR em um par de ITRs modificadas pode ser de diferentes sorotipos (por exemplo, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12), como a combinação de AAV2 e AAV6, com a modificação em uma ITR refletida na posição correspondente na ITR cognata de um sorotipo diferente.

Em uma modalidade, um par de ITRs modificadas substancialmente simétricas refere-se a um par de ITRs modificadas (ITRs mod), desde que a diferença nas sequências de nucleotídeos entre as ITRs não afete as propriedades ou a forma geral e tenham substancialmente a mesma forma em 3D espaço.

Como um exemplo não limitativo, uma mod-ITR que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a mod-ITR canônica, conforme determinado por meios padrão bem conhecidos na técnica, como BLAST (Ferramenta Básica de Alinhamento Local) ou BLASTN nas configurações padrão e também tem uma organização espacial tridimensional simétrica, de modo que sua estrutura 3D tenha a mes- ma forma no espaço geométrico.

Um par de mod-ITRs substancial- mente simétricas tem as mesmas alças A, C-C' e B-B' no espaço 3D, por exemplo, se uma ITR modificada em um par de mod-ITRs subs- tancialmente simétricas tiver uma deleção de um braço C-C', então, a ITR tem a deleção correspondente da alça C-C' e também tem uma estrutura 3D semelhante das demais alças A e B-B' da mesma forma no espaço geométrico da sua mod-ITR cognata.

[00130] Conforme usado aqui, o termo "ITRs de tipo selvagem substancialmente simétricas" ou um "par de ITRs de tipo selvagem substancialmente simétricas" refere-se a um par de ITRs de tipo sel- vagem em um único genoma de ceDNA ou vetor de ceDNA que são ambas ITRs de tipo selvagem que têm uma sequência de complemen- tos inversos ao longo de todo o seu comprimento. Por exemplo, uma ITR pode ser considerada uma sequência do tipo selvagem, mesmo que tenha um ou mais nucleotídeos que se desviem da sequência ca- nônica de ocorrência natural, desde que as alterações não afetem as propriedades e a estrutura tridimensional geral da sequência. Em al- guns aspectos, os nucleotídeos divergentes representam alterações conservadoras da sequência. Como um exemplo não limitativo, uma sequência que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de iden- tidade de sequência em relação à sequência canônica (conforme me- dido, por exemplo, usando BLAST nas configurações padrão) e tam- bém tem uma organização espacial tridimensional simétrica para a ou- tra ITR de tipo selvagem, de modo que suas estruturas 3D tenham a mesma forma no espaço geométrico. A ITR de tipo selvagem substan- cialmente simétrica tem as mesmas alças A, C-C' e B-B' no espaço 3D. Uma ITR de tipo selvagem substancialmente simétrica pode ser funcionalmente confirmada como do tipo selvagem, determinando que a mesma tem um sítio de ligação a Rep operacional (RBE ou RBE') e um sítio de resolução terminal (trs) que emparelha com a proteína Rep apropriada. Pode-se opcionalmente testar outras funções, incluindo a expressão do transgene em condições permissivas.

[00131] Conforme usado neste documento, o termo "suprimir", "di- minuir", "interferir", "inibir" e/ou "reduzir" (e termos semelhantes) ge- ralmente se refere ao ato de reduzir, direta ou indiretamente, uma con- centração, nível, função, atividade ou comportamento relativo ao natu-

ral, esperado ou médio, ou relativo a uma condição de controle.

[00132] Como usado aqui, o termo "ITRs simétricas" refere-se a um par de ITRs em um único genoma de ceDNA ou vetor de ceDNA que é mutado ou modificado em relação às sequências de ITR dependovirais do tipo selvagem e são complementos inversos em todo o seu com- primento. Nem as ITRs são sequências de ITR de AAV2 do tipo selva- gem (ou seja, são uma ITR modificada, também conhecida coma uma ITR mutante) e podem ter uma diferença na sequência da ITR do tipo selvagem devido à adição, deleção, substituição, truncamento ou mu- tação pontual do nucleotídeo. Por conveniência, neste documento, uma ITR localizada 5' (a montante) para um cassete de expressão em um vetor de ceDNA é dita como "ITR 5'" ou" ITR esquerda" e uma ITR localizada a 3' (a jusante) para um cassete de expressão em um vetor de ceDNA é dito como "ITR 3'" ou "ITR direita".

[00133] Tal como aqui utilizado, os termos "vetor AAV sintético" e "produção sintética de vetor AAV" referem-se a um vetor AAV e méto- dos de produção sintéticos do mesmo em um ambiente totalmente li- vre de células.

[00134] Como usado aqui, o termo "repetição terminal" ou "TR" in- clui qualquer repetição terminal viral ou sequência sintética que com- preende pelo menos uma origem mínima necessária de replicação e uma região que compreende uma estrutura em formato de grampo palíndroma. Uma sequência de ligação a Rep ("RBS") (também co- nhecida como RBE (elemento de ligação a Rep)) e um sítio de resolu- ção terminal ("TRS") juntos constituem uma "origem mínima necessá- ria de replicação" e, portanto, a TR compreende pelo menos um RBS e pelo menos um TRS. TRs que são o complemento inverso uma da ou- tra dentro de um determinado trecho de sequência polinucleotídica são tipicamente ditas como "repetição terminal invertida" ou "ITR". No con- texto de um vírus, as ITRs mediam replicação, empacotamento de ví-

rus, integração e resgate de vírus. Como foi inesperadamente consta- tado na invenção deste documento, as ITRs que são diferentes das ITRs dependovirais de tipo selvagem ainda podem desempenhar as funções tradicionais das ITRs de tipo selvagem e, portanto, o termo ITR é usado aqui para se referir a uma TR em um genoma ceDNA ou vetor de ceDNA que tem capacidade de mediar a replicação do vetor de ceDNA. Será entendido por um versado na técnica que nas confi- gurações complexas do vetor de ceDNA podem estar presentes mais de duas ITRs ou pares de ITRs assimétricas. A ITR pode ser uma ITR AAV ou uma ITR não AAV ou pode ser derivada de uma ITR AAV ou uma ITR não AAV. Por exemplo, a ITR pode ser derivada da família Parvoviridae, que inclui parvovírus e dependovírus (por exemplo, par- vovírus canino, parvovírus bovino, parvovírus de camundongo, parvo- vírus suíno, parvovírus suíno, parvovírus humano B-19) ou o SV40 em formato de grampo que serve como origem da replicação do SV40 que pode ser usado como uma ITR, que pode ser modificado ainda mais por truncamento, substituição, deleção, inserção e/ou adição. Os vírus da família Parvoviridae consistem em duas subfamílias: Parvovirinae, que infectam vertebrados, e Densovirinae, que infectam invertebrados. Normalmente, essas ITR são cerca de 145 nucleotídeos e na natureza invertidas uma em relação à outra. Os dependoparvovírus incluem a família viral dos vírus adenoassociados (AAV) que têm capacidade de replicação em hospedeiros vertebrados, incluindo, mas não se limitan- do a, espécies humanas, primatas, bovinas, caninas, equinas e ovinas.

[00135] Como usado aqui, os termos "sítio de resolução terminal" e "TRS" são usados de forma intercambiável aqui e se referem a uma região na qual Rep forma uma ligação tirosina-fosfodiéster com a timi- dina 5' gerando um OH 3' que serve como substrato para a extensão de DNA através de um DNA polimerase celular, por exemplo, DNA pol delta ou DNA pol épsilon. Alternativamente, o complexo Rep-timidina pode participar de uma reação de ligação coordenada. Em algumas modalidades, uma TRS abrange minimamente uma timidina não em- parelhada com base. Em algumas modalidades, a eficiência de cru- zamento da TRS pode ser controlada pelo menos em parte por sua distância dentro da mesma molécula do RBS. Quando o substrato aceitador é a ITR complementar, o produto resultante é um duplex in- tramolecular. As sequências TRS são conhecidas na técnica e inclu- em, por exemplo, 5'-GGTTGA-3' (SEQ ID NO: 45), a sequência he- xanucleotídica identificada no AAV2. Qualquer sequência TRS conhe- cida pode ser usada nas modalidades da invenção, incluindo outras sequências de TRS de AAV conhecidas e outras sequências de TRS naturalmente conhecidas ou sintéticas, como AGTT (SEQ ID NO: 46), GGTTGG (SEQ ID NO: 47), AGTTGG (SEQ ID NO: 48), AGTTGA (SEQ ID NO: 49) e outros motivos como RRTTRR (SEQ ID NO: 50).

[00136] Como aqui usado, o termo "regulador transcricional" se re- fere a ativadores e repressores da transcrição que ativam ou reprimem a transcrição de um gene de interesse. Os promotores são regiões do ácido nucleico que iniciam a transcrição de um determinado gene. Os ativadores transcricionais tipicamente se ligam próximo aos promoto- res transcricionais e recrutam a RNA polimerase para iniciar direta- mente a transcrição. Os repressores se ligam aos promotores da transcrição e dificultam estereotipadamente a iniciação da transcrição pela RNA polimerase. Outros reguladores da transcrição podem servir como ativadores ou repressores, dependendo onde os mesmos se li- gam e das condições celulares e ambientais. Exemplos não limitativos de classes reguladoras da transcrição incluem, mas não estão limita- dos a proteínas de domínio doméstico, proteínas de dedos de zinco, proteínas de hélice alada (cabeça de forquilha) e proteínas de zíper de leucina.

[00137] Tal como aqui utilizado, os termos "tratar", "tratando" e/ou

"tratamento" incluem anular, inibir substancialmente, retardar ou rever- ter a progressão de uma condição, melhorar substancialmente os sin- tomas clínicos de uma condição ou prevenir substancialmente o apa- recimento de sintomas clínicos sintomas de uma condição, obtendo resultados clínicos benéficos ou desejados. Tratar ainda se refere a realizar um ou mais dos seguintes: (a) reduzir a gravidade do distúrbio; (b) limitar o desenvolvimento de sintomas característicos das doenças a serem tratadas; (c) limitar o agravamento dos sintomas característi- cos das doenças a serem tratadas; (d) limitar a recorrência do(s) dis- túrbio(s) em pacientes que já tiveram o(s) distúrbio(s); e (e) limitar a recorrência dos sintomas em pacientes que eram previamente assin- tomáticos para o(s) distúrbio(s).

[00138] Resultados clínicos benéficos ou desejados, tais como efei- tos farmacológicos e/ou fisiológicos incluem, mas não estão limitados a, impedir que a doença, distúrbio ou condição ocorra em um indivíduo que pode estar predisposto à doença, distúrbio ou condição, mas ain- da não experimentou ou exibir sintomas da doença (tratamento profilá- tico), alívio dos sintomas da doença, distúrbio ou condição, diminuição da extensão da doença, distúrbio ou condição, estabilização (ou seja, não agravamento) da doença, distúrbio ou condição, evitando a dis- seminação da doença, distúrbio ou condição, retardo ou desacelera- ção da progressão da doença, distúrbio ou condição, melhoria ou pali- ação da doença, distúrbio ou condição e combinações dos mesmos, bem como prolongar a sobrevivência em comparação com a sobrevi- vência esperada se não receber tratamento.

[00139] Tal como aqui utilizado, os termos "quantidade terapêutica", "quantidade terapeuticamente eficaz", uma "quantidade eficaz" ou "quantidade farmaceuticamente eficaz" de um agente ativo (por exem- plo, uma partícula lipídica ceDNA como aqui descrito) são usados in- distintamente para se referir a uma quantidade que é suficiente para fornecer o benefício pretendido do tratamento. No entanto, os níveis de dosagem são baseados em uma variedade de fatores, incluindo o tipo de lesão, idade, peso, sexo, condição médica do paciente, a gra- vidade da condição, a via de administração e o agente ativo particular empregado. Assim, o regime de dosagem pode variar amplamente, mas pode ser determinado rotineiramente por um médico usando mé- todos padrão. Além disso, os termos "quantidade terapêutica", "quanti- dades terapeuticamente eficazes" e "quantidades farmaceuticamente eficazes" incluem quantidades profiláticas ou preventivas das compo- sições da invenção descrita. Em aplicações profiláticas ou preventivas da invenção descrita, composições farmacêuticas ou medicamentos são administrados a um paciente suscetível a, ou de outra forma em risco de, uma doença, distúrbio ou condição em uma quantidade sufi- ciente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade, ou atrasar o início da doença, distúrbio ou condição, incluindo sintomas bioquími- cos, histológicos e/ou comportamentais da doença, distúrbio ou condi- ção, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que se apresentam durante o desenvolvimento da doença, distúrbio ou condi- ção. É geralmente preferencial que seja usada uma dose máxima, ou seja, a dose segura mais elevada de acordo com algum julgamento médico. Os termos "dose" e "dosagem" são usados indistintamente aqui.

[00140] Tal como aqui utilizado, o termo "efeito terapêutico" refere- se a uma consequência do tratamento, cujos resultados são conside- rados desejáveis e benéficos. Um efeito terapêutico pode incluir, direta ou indiretamente, a interrupção, redução ou eliminação de uma mani- festação de doença. Um efeito terapêutico também pode incluir, direta ou indiretamente, a redução da parada ou eliminação da progressão de uma manifestação da doença.

[00141] Para qualquer agente terapêutico aqui descrito, a quantida-

de terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente determinada a partir de estudos preliminares in vitro e/ou modelos animais. Uma dose tera- peuticamente eficaz também pode ser determinada a partir de dados humanos. A dose aplicada pode ser ajustada com base na biodisponi- bilidade relativa e na potência do composto administrado. Ajustar a dose para atingir a eficácia máxima com base nos métodos descritos acima e outros métodos bem conhecidos está dentro das capacidades do especialista na técnica. Os princípios gerais para determinar a efi- cácia terapêutica, que podem ser encontrados no Capítulo 1 de Goo- dman e Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10ª Edi- ção, McGraw-Hill (Nova York) (2001), aqui incorporados por referên- cia, são resumidos abaixo.

[00142] Os princípios farmacocinéticos fornecem uma base para modificar um regime de dosagem para obter um grau desejado de efi- cácia terapêutica com um mínimo de efeitos adversos inaceitáveis. Em situações em que a concentração plasmática do fármaco pode ser medida e relacionada à janela terapêutica, orientações adicionais para modificação da dosagem podem ser obtidas.

[00143] Tal como aqui utilizado, os termos "vetor" ou "vetor de ex- pressão" referem-se a um replicon, tal como plasmídeo, bacmídeo, fago, vírus, vírion ou cosmídeo, ao qual outro segmento de DNA, ou seja, um transgene de "inserção" ou "cassete de expressão", pode ser anexado, de modo a trazer a expressão ou replicação do segmento anexado (" cassete de expressão") em uma célula. Um vetor pode ser um construto de ácido nucleico projetado para entrega a uma célula hospedeira ou para transferência entre diferentes células hospedeiras. Conforme usado neste documento, um vetor pode ser de origem viral ou não viral na forma final. No entanto, para o propósito da presente divulgação, um "vetor" geralmente se refere a um vetor AAV sintético ou um vetor de ceDNA cortado. Consequentemente, o termo "vetor"

abrange qualquer elemento genético que é capaz de replicação quan- do associado aos elementos de controle adequados e que pode trans- ferir sequências de genes para as células. Em algumas modalidades, um vetor pode ser um vetor recombinante ou um vetor de expressão.

[00144] Tal como aqui utilizado, a frase "vetor recombinante" se destina a referir-se a um vetor que inclui uma sequência de ácido nu- cleico heteróloga, ou "transgene" que é capaz de expressão in vivo. Deve ser entendido que os vetores aqui descritos podem, em algumas modalidades, ser combinados com outras composições e terapias adequadas. Em algumas modalidades, o vetor é epissomal. O uso de um vetor epissomal adequado fornece um meio de manter o nucleotí- deo de interesse no indivíduo em um DNA cromossômico extra com alto número de cópias, eliminando, desse modo, possíveis efeitos po- tenciais da integração cromossômica.

[00145] Tal como aqui utilizado, uma "ITR de tipo selvagem" ou "WT-ITR" refere-se à sequência de uma sequência de ITR de ocorrên- cia natural em um AAV ou outro dependovírus que retém, por exem- plo, atividade de ligação a Rep e capacidade de corte de Rep. A se- quência de nucleotídeos de uma ITR de tipo selvagem de qualquer sorotipo AAV pode variar ligeiramente da sequência canônica de ocor- rência natural devido à degeneração do código genético ou à deriva, e, portanto, as sequências ITR de tipo selvagem abrangidas para uso aqui incluem sequências de ITR de tipo selvagem como resultado de mudanças ocorridas durante o processo de produção (por exemplo, um erro de replicação).

[00146] Como aqui utilizado, o termo "que compreende" ou "com- preende" é usado em referência a composições, métodos e respecti- vos componentes, que são essenciais para o método ou composição, mas abertos à inclusão de elementos não especificados, essenciais ou não.

[00147] Como aqui utilizado, o termo "que consiste essencialmente em" refere-se aos elementos necessários para uma determinada mo- dalidade. O termo permite a presença de elementos que não afetam materialmente as características básicas e novas ou funcionais dessa modalidade.

[00148] O termo "que consiste em" refere-se a composições, méto- dos e componentes respectivos, como aqui descrito, que são exclusi- vos de qualquer elemento não recitado nessa descrição da modalida- de.

[00149] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindica- ções anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem refe- rências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrá- rio. Assim, por exemplo, as referências ao "método" incluem um ou mais métodos e/ou etapas do tipo descrito aqui e/ou que se tornarão evidentes para os especialistas na técnica ao ler esta divulgação e as- sim por diante. Da mesma forma, a palavra "ou" deve incluir "e", a me- nos que o contexto indique claramente o contrário. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou no teste desta divulgação, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. A abreviatura "e.g." é derivada de exempli gratia, em latim, e é usada aqui para indicar um exemplo não limitativo. Assim, a abreviação "e.g." é sinônimo do termo "por exem- plo".

[00150] Conforme usado neste documento, os termos "tal como", "por exemplo" e semelhantes se destinam a se referir a modalidades exemplificativas e não a limitar o escopo da presente divulgação.

[00151] A menos que definido de outra forma, todos os termos téc- nicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica à qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais semelhan-

tes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usa- dos na prática para o teste da presente invenção, os materiais e méto- dos preferenciais são descritos neste documento.

[00152] Além dos exemplos operacionais, ou onde indicado de ou- tra forma, todos os números que expressam quantidades de ingredien- tes ou condições de reação aqui utilizados devem ser entendidos co- mo modificados em todas as instâncias pelo termo "cerca de". O termo "cerca de" quando usado em conexão com porcentagens pode signifi- car ± 1%. A presente invenção é ainda explicada em detalhes pelos exemplos a seguir, mas o escopo da invenção não deve ser limitado a eles.

[00153] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes específicos, etc., descritos aqui e, como tal, podem variar. A terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares, e não se des- tina a limitar o escopo da presente invenção, que é definida apenas pelas reivindicações. II. VETORES DE DNA COM EXTREMIDADE FECHADA (CEDNA)

[00154] São fornecidas aqui novas moléculas de ceDNA não virais e sem capsídeos com extremidades fechadas covalentemente (ceD- NA). Os vetores ceDNA divulgados neste documento não têm restri- ções de empacotamento impostas pelo espaço limitante dentro do capsídeo viral. Os vetores ceDNA representam uma alternativa viável produzida por eucariotos aos vetores plasmídeos de DNA produzidos por procariotos, em oposição aos genomas AAV encapsulados. Isso permite a inserção de elementos de controle, por exemplo, interrupto- res reguladores conforme divulgado neste documento, grandes trans- genes, múltiplos transgenes, etc., e a incorporação dos elementos re- guladores genéticos nativos do transgene, se desejado.

[00155] Existem muitos recursos estruturais de vetores de ceDNA que diferem dos vetores de expressão baseados em plasmídeo. Os vetores ceDNA podem possuir uma ou mais das seguintes caracterís- ticas: a falta de DNA bacteriano original (isto é, não inserido), a falta de uma origem de replicação procariótica, sendo autossuficiente, ou seja, os mesmos não necessitam de nenhuma sequência além das duas ITRs, incluindo os locais de ligação Rep e resolução terminal (RBS e TRS), e uma sequência exógena entre as ITRs, a presença de se- quências de ITR que formam grampos, de origem eucariótica (ou seja, são produzidas em células eucarióticas) e a ausência de metilação do DNA do tipo bacteriano ou qualquer outra metilação considerada anormal por um hospedeiro mamífero. Em geral, é preferencial que os presentes vetores não contenham DNA procariótico, mas é contem- plado que algum DNA procariótico possa ser inserido como uma se- quência exógena, como um exemplo não limitativo em uma região promotora ou intensificadora. Outra característica importante que dis- tingue vetores de ceDNA de vetores de expressão de plasmídeo é que os vetores de ceDNA são DNA linear de filamento simples que tem extremidades fechadas, enquanto os plasmídeos são sempre DNA de filamento duplo.

[00156] Existem várias vantagens de usar um vetor de ceDNA co- mo descrito aqui em relação a vetores de expressão à base de plas- mídeo. Tais vantagens incluem, mas não estão limitadas a: 1) plasmí- deos contêm sequências de DNA bacterianas e são submetidos a me- tilação específica de procariota, por exemplo, metilação de 6-metil adenosina e 5-metil citosina, enquanto as sequências de vetor de AAV sem capsídeo são de origem eucariótica e não sofrem metilação espe- cífica para procarióticos; como resultado, os vetores AAV sem capsí- deo são menos propensos a induzir respostas inflamatórias e imunoló- gicas em comparação com os plasmídeos; 2) enquanto os plasmídeos requerem a presença de um gene de resistência durante o processo de produção, os vetores ceDNA não; 3) enquanto um plasmídeo circu- lar não é entregue ao núcleo após a introdução em uma célula e re- quer sobrecarga para contornar a degradação por nucleases celulares, vetores ceDNA contêm elementos cis virais, ou seja, ITRs modifica- das, que conferem resistência a nucleases e podem ser projetadas para serem direcionadas e entregues ao núcleo. É hipotetizado que os elementos definidores mínimos indispensáveis para a função ITR são um sítio de ligação Rep (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) para AAV2) e um sítio de resolução terminal (TRS; 5'- AGTTGG-3' (SEQ ID NO: 48) para AAV2) mais uma sequência palin- drômica variável que permite a formação de grampo de cabelo. Por outro lado, as transduções com vetores de AAV sem capsídeo aqui divulgados podem direcionar eficientemente tipos de células e tecidos que são difíceis de transduzir com vírions de AAV convencionais usando vários reagentes de entrega.

[00157] Os vetores de ceDNA têm preferencialmente uma estrutura linear e contínua em vez de uma estrutura não contínua, conforme de- terminado por ensaio de digestão com enzimas de restrição e análise eletroforética (Figura 5D). Acredita-se que a estrutura linear e contí- nua seja mais estável do ataque por endonucleases celulares, bem como menos provável de ser recombinada e causar mutagênese. As- sim, um vetor de ceDNA de estrutura linear e contínua é uma modali- dade preferida. O vetor de ceDNA duplex intramolecular de fita sim- ples, linear e contínua, pode ter extremidades terminais ligadas cova- lentemente, sem sequências que codificam proteínas do capsídeo AAV. Esses vetores de ceDNA são estruturalmente distintos dos plas- mídeos (incluindo plasmídeos de ceDNA aqui descritos), que são mo- léculas de ácido nucleico duplex circular de origem bacteriana. As fitas complementares de plasmídeos podem ser separadas após a desnatu- ração para produzir duas moléculas de ácido nucleico, enquanto, por outro lado, os vetores de ceDNA, embora tenham fitas complementa- res, são uma única molécula de DNA e, portanto, mesmo se desnatu- rados, permanecem uma única molécula. Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA como aqui descritos podem ser produzidos sem a metilação da base de DNA do tipo procariótico, diferentemente dos plasmídeos. Portanto, os vetores de ceDNA e os plasmídeos de ceD- NA são diferentes tanto em termos de estrutura (em particular, linear versus circular) e também em vista dos métodos usados para produzir e purificar esses diferentes objetos (ver abaixo), e também em vista de sua metilação do DNA que é do tipo procariótica para plasmídeos de ceDNA e do tipo eucariótica para o vetor de ceDNA.

[00158] São fornecidas aqui moléculas de ceDNA não virais, sem capsídeo e com extremidades covalentemente fechadas (ceDNA). Es- sas moléculas de ceDNA livres de capsídeo não viral podem ser pro- duzidas em células hospedeiras permissivas a partir de um construto de expressão (por exemplo, um ceDNA-plasmídeo, um ceDNA- bacmídeo, um ceDNA-baculovírus ou uma linhagem celular integrada) contendo um gene heterólogo (transgene) posicionadas entre duas sequências simétricas de repetição terminal invertida (ITR), em que as ITRs não são ITRs de tipo selvagem e são simétricas em relação umas às outras. Isto é, as ITRs são ITRs modificadas e a sequência da ITR 3' é um complemento inverso da sequência da ITR 5' e vice- versa. Em algumas modalidades, uma ITR é modificada por deleção, inserção e/ou substituição em comparação com a sequência de ITR de tipo selvagem correspondente (por exemplo, ITR de AAV). Em algu- mas modalidades, uma ITR modificada compreende um sítio de reso- lução terminal funcional (trs) e um local de ligação a Rep. O vetor de ceDNA é preferencialmente duplex, por exemplo, autocomplementar, ao longo de pelo menos uma porção da molécula, tal como o cassete de expressão (por exemplo, ceDNA não é uma molécula circular de fita dupla como um plasmídeo). O vetor de ceDNA possui extremida- des covalentemente fechadas e, portanto, é resistente à digestão de exonuclease (por exemplo, exonuclease I ou exonuclease III), por exemplo, por mais de uma hora a 37 ºC.

[00159] Em um aspecto, um vetor de ceDNA compreende, na dire- ção 5' para 3': uma primeira repetição terminal invertida (ITR) de vírus adenoassociado (AAV), uma sequência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, um cassete de expressão como aqui descrito) e uma segunda ITR de AAV. Em uma modalidade, a primeira ITR (ITR 5') e a segunda ITR (ITR 3') são assimétricas entre si - isto é, elas têm uma configuração espacial 3D diferente uma da outra. Como uma modali- dade exemplificativa, a primeira ITR pode ser uma ITR de tipo selva- gem e a segunda ITR pode ser uma ITR mutada ou modificada, ou vi- ce-versa, onde a primeira ITR pode ser uma ITR mutada ou modifica- da e a segunda ITR uma ITR do tipo selvagem. Em uma modalidade, a primeira ITR e a segunda ITR são ambas mutadas ou modificadas, mas são sequências diferentes, ou têm modificações diferentes, ou não são ITRs mutadas ou modificadas idênticas e têm configurações espaciais 3D diferentes. Dito de outra forma, um vetor de ceDNA com ITRs assimétricas tem ITRs em que quaisquer alterações em uma ITR em relação à ITR do tipo selvagem não são refletidas na outra ITR; ou alternativamente, onde as ITRs assimétricas têm um par de ITRs as- simétricas mutadas ou modificados pode ter uma sequência diferente e uma forma tridimensional diferente em relação à outra.

[00160] De acordo com algumas modalidades, um vetor de ceDNA compreende, na direção de 5' para 3': uma primeira repetição terminal invertida (ITR) de vírus adenoassociado (AAV), uma sequência de nu- cleotídeos de interesse (por exemplo, um cassete de expressão como aqui descrito) e uma segunda ITR de AAV, onde a primeira ITR e a segunda ITR são simétricas em relação uma à outra - isto é, eles são a mesma sequência, mas complementam-se inversamente.

Ou seja, um vetor de ceDNA pode compreender sequências de ITR que têm uma organização espacial tridimensional simétrica, de modo que sua estrutura tenha a mesma forma no espaço geométrico, ou tenha as mesmas alças A, C-C 'e B-B' no espaço 3D.

Em tal modalidade, um par de ITR simétrica ou par de ITR substancialmente simétrica pode ser ITRs mutadas ou modificadas que não são ITRs de tipo selvagem.

Como uma modalidade exemplificativa, a primeira ITR pode ser uma ITR de tipo selvagem e a segunda ITR pode ser uma ITR mutada ou modificada, ou vice-versa, onde a primeira ITR pode ser uma ITR mu- tada ou modificada e a segunda ITR uma ITR do tipo selvagem.

Em uma modalidade, a primeira ITR e a segunda ITR podem ser modifica- das, mas são sequências diferentes, ou têm modificações diferentes, ou não são ITRs modificadas idênticas, e têm configurações espaciais 3D diferentes.

Como outra modalidade exemplificativa, a primeira ITR (ou ITR 5') pode ser uma ITR modificada, por exemplo, SEQ ID NO: 484 (ou seja, ITR-33, esquerda) e a segunda ITR (ou ITR 3') pode ser uma ITR mutada ou modificada, por exemplo, SEQ ID NO: 469 (ou se- ja, ITR-18, direita). Em outras palavras, um vetor de ceDNA com ITRs assimétricas compreende ITRs em que quaisquer alterações em uma ITR em relação à ITR de tipo selvagem não são refletidas na outra ITR; ou alternativamente, em que as ITRs assimétricas têm um par de ITRs assimétricas modificadas que podem ter uma sequência diferente e uma forma tridimensional diferente em relação uma à outra.

Um par de ITRs mutadas ou modificadas pode ter a mesma sequência que tem uma ou mais modificações a partir da ITR do tipo selvagem e são complementos reversos (invertidos) de cada uma.

Em uma modalida- de, um par de ITRs modificada é substancialmente simétrico conforme definido neste documento, isto é, o par de ITRs modificadas pode ter uma sequência diferente, mas ter a mesma forma tridimensional simé-

trica ou correspondente. Em algumas modalidades, as ITRs simétricas ou ITRs substancialmente simétricas são do tipo selvagem (ITRs de tipo selvagem), conforme descrito aqui. Ou seja, ambas as ITRs têm uma sequência do tipo selvagem, mas não necessariamente precisam ser ITRs de tipo selvagem do mesmo sorotipo AAV. Em uma modali- dade, uma ITR do tipo selvagem pode ser de um sorotipo AAV, e a outra ITR do tipo selvagem pode ser de um sorotipo AAV diferente. Em tal modalidade, um par de ITRs de tipo selvagem é substancialmente simétrico como aqui definido, ou seja, as mesmas podem ter uma ou mais modificações conservadoras de nucleotídeo, enquanto ainda mantêm a organização espacial tridimensional simétrica.

[00161] De acordo com algumas modalidades, um vetor de ceDNA compreende, na direção 5' para 3': uma primeira repetição terminal invertida (ITR) do vírus adenoassociado (AAV) de tipo selvagem, uma sequência nucleotídica de interesse (por exemplo, um cassete de ex- pressão como aqui descrito) e uma segunda ITR de AAV, onde a pri- meira ITR do tipo selvagem e a segunda ITR do tipo selvagem são do mesmo sorotipo AAV ou de diferentes sorotipos AAV. Como uma mo- dalidade exemplificativa, a primeira ITR do tipo selvagem (ou ITR 5' do tipo selvagem) pode ser de AAV2 e a segunda ITR do tipo selvagem (ou ITR 3' do tipo selvagem) pode ser de AAV6. ITRs do tipo selvagem exemplificativas no vetor de ceDNA e para uso para gerar um plasmí- deo de ceDNA são discutidas abaixo na seção intitulada "ITRs", e na Tabela 1 no presente documento.

[00162] As sequências de ITR do tipo selvagem aqui fornecidas re- presentam sequências de DNA incluídas no construto de expressão (por exemplo, plasmídeo de ceDNA, ceDNA-bacmídeo, ceDNA- baculovírus) para a produção do vetor de ceDNA.

[00163] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA aqui des- crito que compreende o cassete de expressão com um transgene, que pode ser, por exemplo, uma sequência reguladora, uma sequência que codifica um ácido nucleico (por exemplo, como um miR ou uma sequência antissenso) ou uma sequência que codifica um polipeptídeo (por exemplo, como um transgene). Em uma modalidade, o transgene pode estar operacionalmente ligado a uma ou mais sequências regu- ladoras que permitem ou controlam a expressão do transgene. Em uma modalidade, o polinucleotídeo compreende uma primeira sequên- cia de ITR do tipo selvagem e uma segunda sequência ITR do tipo selvagem, em que a sequência nucleotídica de interesse é flanqueada pela primeira e segunda sequências de ITR do tipo selvagem.

[00164] ITRs exemplificativas são discutidas abaixo na seção intitu- lada "ITRs" e nas Tabelas 2 e 5 deste documento, ou nas Tabelas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10A a 10B de PCT/US18/49996 depositado em 7 de setembro de 2018, onde a sequência de ITR de flanqueamento é simétrica (por exemplo, complemento inverso) da mesma ou substan- cialmente simétrica a ela.

[00165] As sequências de ITR fornecidas no presente documento representam sequências de DNA incluídas no construto de expressão (por exemplo, plasmídeo de ceDNA, ceDNA- bacmídeo, ceDNA- baculovírus) para produção do vetor de ceDNA. Assim, as sequências de ITR realmente contidas no vetor de ceDNA produzido a partir do plasmídeo de ceDNA ou outro construto de expressão podem ou não ser idênticas às sequências de ITR fornecidas neste documento como resultado de mudanças de ocorrência natural (incluindo modificações conservativas e não conservativas) ocorrendo durante o processo de produção (por exemplo, erro de replicação).

[00166] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA aqui des- crito compreendendo o cassete de expressão com um transgene que é uma sequência de ácido nucleico terapêutica, pode ser operacional- mente ligado a uma ou mais sequências reguladoras que permitem ou controlam a expressão do transgene. Em uma modalidade, o polinu- cleotídeo compreende uma primeira sequência de ITR e uma segunda sequência de ITR, em que a sequência nucleotídica de interesse é flanqueada pela primeira e segunda sequências de ITR, e a primeira e segunda ITRs são assimétricas uma em relação à outra ou são simé- tricas entre si.

[00167] Em uma modalidade, um cassete de expressão está locali- zado entre duas ITRs compreendidas na seguinte ordem com um ou mais dentre: um promotor operacionalmente ligado a um transgene, um elemento regulador pós-transcricional e um sinal de poliadenilação e terminação. Em uma modalidade, o promotor é regulável - induzível ou repressível. O promotor pode ser qualquer sequência que facilite a transcrição do transgene. Em uma modalidade, o promotor é um pro- motor de CAG (por exemplo, SEQ ID NO: 03) ou uma variação do mesmo. O elemento regulador pós-transcricional é uma sequência que modula a expressão do transgene, como um exemplo não limitativo, qualquer sequência que crie uma estrutura terciária que aumenta a expressão do transgene que é uma sequência de ácido nucleico tera- pêutica.

[00168] Em uma modalidade, o elemento regulador pós- transcricional compreende WPRE (por exemplo, SEQ ID NO: 8). Em uma modalidade, o sinal de poliadenilação e terminação compreende BGHpoliA (por exemplo, SEQ ID NO: 9). Qualquer elemento regulador cis conhecido na técnica, ou combinação dos mesmos, pode ser utili- zado adicionalmente, por exemplo, sequência intensificadora a mon- tante de sinal poliA tardio SV40 (USE) ou outros elementos de proces- samento pós-transcricional, incluindo, mas não se limitando a, o gene da timidina-quinase do vírus herpes simplex ou vírus da hepatite B (HBV). Em uma modalidade, o comprimento do cassete de expressão na direção 5' a 3' é maior que o comprimento máximo conhecido por ser encapsulado em um vírion de AAV. Em uma modalidade, o com- primento é superior a 4,6 kb, ou superior a 5 kb, ou superior a 6 kb, ou superior a 7 kb. Vários cassetes de expressão são aqui exemplifica- dos.

[00169] O cassete de expressão pode compreender mais de 4.000 nucleotídeos, 5.000 nucleotídeos, 10.000 nucleotídeos ou 20.000 nu- cleotídeos, ou 30.000 nucleotídeos, ou 40.000 nucleotídeos ou 50.000 nucleotídeos, ou qualquer faixa entre cerca de 4.000 a 10.000 nucleo- tídeos ou 10.000 a 50.000 nucleotídeos ou mais de 50.000 nucleotí- deos. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode com- preender um transgene (por exemplo, uma sequência de ácidos nu- cleicos terapêuticos) na faixa de 500 a 50.000 nucleotídeos de com- primento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene (por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos terapêuticos) na faixa de 500 a 75.000 nucleotídeos de com- primento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene (por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos terapêuticos) na faixa de 500 a 10.000 nucleotídeos de com- primento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene (por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos terapêuticos) na faixa de 1.000 a 10.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene (por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos terapêuticos) na faixa de 500 a 5.000 nucleotídeos de com- primento. Os vetores de ceDNA não têm as limitações de tamanho dos vetores AAV encapsidados, permitindo, assim, a entrega de um casse- te de expressão de tamanho grande para fornecer expressão eficiente de transgenes. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é despro- vido de metilação específica de procarionte.

[00170] De acordo com algumas modalidades, o cassete de ex-

pressão também pode compreender um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES) e/ou um elemento 2A. Os elementos cis-reguladores incluem, mas não estão limitados a um promotor, um interruptor de ribossomo, um isolador, um elemento mir-regulável, um elemento re- gulador pós-transcricional, um promotor específico de tipo de tecido e célula e um intensificador. Em algumas modalidades, a ITR pode atuar como o promotor para o transgene. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende componentes adicionais para regular a ex- pressão do transgene, por exemplo, um interruptor regulador, descrito neste documento na seção intitulada "Interruptores reguladores", para controlar e regular a expressão do transgene, e pode incluir, se dese- jado, um interruptor regulador que é um interruptor de extermínio para permitir a morte celular controlada de uma célula que compreende um vetor de ceDNA.

[00171] As Figuras 1A a 1B mostram esquemas de vetores de ce- DNAs exemplificativos não limitantes ou a sequência correspondente de plasmídeos de ceDNA. Os vetores de ceDNA são livres de capsí- deo e podem ser obtidos a partir de um plasmídeo que codifica nesta ordem: uma primeira ITR, cassete de transgene expressível e uma se- gunda ITR, onde a primeira e a segunda sequências de ITR são muta- das em relação à sequência de ITR de AAV2 do tipo selvagem corres- pondente, e as mutações são as mesmas (ou seja, as ITRs modifica- das são simétricas). O cassete de transgene expressável inclui prefe- rencialmente um ou mais dentre, nesta ordem: um intensifica- dor/promotor, um repórter ORF (transgene), um elemento regulador pós-transcricional (por exemplo, WPRE) e um sinal de poliadenilação e terminação (por exemplo, poliA BGH).

[00172] As Figuras 2A a 2B mostram esquemas de vetores de ce- DNAs exemplificativos não limitantes ou a sequência correspondente de plasmídeos de ceDNA. Os vetores de ceDNAs não possuem capsí-

deo e podem ser obtidos a partir de um plasmídeo que codifica nesta ordem: uma primeira ITR do tipo selvagem, cassete transgene expres- sível e uma segunda ITR do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de ITR são sequências de ITR de AAV2 de tipo selvagem. Em algumas modalidades, a primeira e a se- gunda sequências de ITR são selecionadas a partir de qualquer com- binação de ITRs do tipo selvagem mostrada na Tabela 1. O cassete de transgene expressável inclui preferencialmente um ou mais de, nesta ordem: um intensificador/promotor ou interruptor regulador, um repórter ORF (transgene), um elemento regulador pós-transcrição (por exemplo, WPRE) e um sinal de poliadenilação e terminação (por exemplo, poliA BGH).

[00173] As Figuras 1A a 1C do Pedido Internacional nº PCT/US2018/050042, depositado em 7 de setembro de 2018 e incor- porado por referência em sua totalidade neste documento, mostra es- quemas de vetores de ceDNAs exemplificativos não limitativos ou a sequência correspondente de plasmídeos ceDNA. Os vetores de ceD- NA são livres de capsídeo e podem ser obtidos a partir de um plasmí- deo que codifica nesta ordem: uma primeira ITR, cassete de transgene expressável e uma segunda ITR, onde pelo menos uma da primeira e/ou segunda sequência de ITR é mutada em relação à sequência de ITR de AAV2 de tipo selvagem correspondente. O cassete de transge- ne expressável inclui preferencialmente um ou mais dentre, nesta or- dem: um intensificador/promotor, um repórter ORF (transgene), um elemento regulador pós-transcrição (por exemplo, WPRE) e um sinal de poliadenilação e terminação (por exemplo, poliA BGH).

ÁCIDOS NUCLEICOS TERAPÊUTICOS

[00174] O cassete de expressão pode compreender qualquer trans- gene de interesse. Os transgenes de interesse incluem, mas não estão limitados a, ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos ou ácidos nucleicos não codificantes (por exemplo, RNAi, miRs, etc.) de prefe- rência polipeptídeos terapêuticos (por exemplo, para uso médico, di- agnóstico ou veterinário) ou imunogênicos (por exemplo, para vaci- nas). Em certas modalidades, os transgenes no cassete de expressão codificam um ou mais polipeptídeos, peptídeos, ribozimas, ácidos nu- cleicos de peptídeos, siRNAs, RNAis, oligonucleotídeos antissenso, polinucleotídeos antissenso, anticorpos, fragmentos de ligação ao an- tígeno ou qualquer combinação dos mesmos.

[00175] Ácidos nucleicos terapêuticos ilustrativos da presente divul- gação podem incluir, mas não estão limitados a, minigenes, plasmí- deos, minicírculos, pequenos RNA interferentes (siRNA), microRNA (miRNA), oligonucleotídeos antissenso (ASO), ribozimas, DNA de ca- deia dupla de extremidade fechada (por exemplo, ceDNA, CELiD, DNA covalentemente fechado linear ("minifita"), DNA doggybone™, DNA de extremidade fechada de protelômero ou DNA linear de haltere), dsR- NA de substrato de dicer, RNA em grampo pequeno (shRNA), RNA de interferência assimétrico (aiRNA), microRNA (miRNA), mRNA, tRNA, rRNA e vetores virais de DNA, vetor de RNA viral e qualquer combina- ção dos mesmos.

[00176] siRNA ou miRNA que pode regular negativamente os níveis intracelulares de proteínas específicas através de um processo deno- minado interferência de RNA (RNAi) também são contemplados pela presente invenção como terapêuticos de ácido nucleico. Depois que o siRNA ou miRNA é introduzido no citoplasma de uma célula hospedei- ra, esses construtos de RNA de fita dupla podem se ligar a uma prote- ína chamada RISC. A fita senso do siRNA ou miRNA é removida pelo complexo RISC. O complexo RISC, quando combinado com o mRNA complementar, cliva o mRNA e libera as fitas cortadas. RNAi é indu- zindo destruição específica de mRNA que resulta na regulação negati- va de uma proteína correspondente.

[00177] Os oligonucleotídeos antissenso (ASO) e ribozimas que ini- bem a tradução do mRNA em proteína podem ser terapêuticas de áci- do nucleico. Para construtos antissenso, esses ácidos desoxinucleicos de fita simples têm uma sequência complementar à sequência do mRNA da proteína-alvo e Watson - capaz de se ligar ao mRNA por emparelhamento de bases de Crick. Essa ligação evita a tradução de um mRNA-alvo e/ou desencadeia a degradação de RNaseH do trans- crito de mRNA. Como resultado, o oligonucleotídeo antissenso tem especificidade de ação aumentada (isto é, regulação negativa de uma proteína relacionada à doença específica).

[00178] Em qualquer um dos métodos fornecidos neste documento, o ácido nucleico terapêutico pode ser um RNA terapêutico. O dito RNA terapêutico pode ser um inibidor da tradução de mRNA, agente de in- terferência de RNA (RNAi), molécula de RNA cataliticamente ativa (ri- bozima), RNA de transferência (tRNA) ou um RNA que se liga a um transcrito de mRNA (ASO), proteína ou outro ligante molecular (aptâ- mero). Em qualquer um dos métodos aqui fornecidos, o agente de RNAi pode ser um RNA de fita dupla, RNA de fita simples, micro RNA, RNA de interferência curto, RNA em gancho curto ou um oligonucleo- tídeo formador de triplex.

[00179] Em algumas modalidades, o transgene é um gene terapêu- tico ou uma proteína marcadora. Em algumas modalidades, o transge- ne é um agonista ou antagonista. Em algumas modalidades, o antago- nista é um mimético ou anticorpo, ou fragmento de anticorpo ou frag- mento de ligação ao antígeno do mesmo, por exemplo, um anticorpo neutralizante ou fragmento de anticorpo e semelhantes. Em algumas modalidades, o transgene codifica um anticorpo, incluindo um anticor- po completo ou fragmento de anticorpo, conforme aqui definido. Em algumas modalidades, o anticorpo é um domínio de ligação a antígeno ou uma sequência de domínio variável da imunoglobulina, como aqui definido. Em particular, o transgene pode codificar um ou mais agentes terapêu- ticos, incluindo, mas não se limitando a, por exemplo, proteína(s), poli- peptídeo(s), peptídeo(s), enzima(s), anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, bem como variantes e/ou fragmentos ativos dos mesmos, para uso no tratamento, profilaxia e/ou melhoria de um ou mais sinto- mas de uma doença, disfunção, lesão e/ou distúrbio. Transgenes exemplificativos são descritos neste documento na seção intitulada "Método de Tratamento". III. REPETIÇÕES TERMINAIS INVERTIDAS (ITRS)

[00180] Conforme descrito neste documento, de acordo com uma modalidade, os vetores de ceDNAs são moléculas de DNA duplex li- neares livres de capsídeo formadas a partir de uma fita contínua de DNA complementar com extremidades covalentemente fechadas (es- trutura linear, contínua e não encapsidada), que compreendem uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) 5' e uma sequência de ITR 3' que são diferentes ou assimétricas entre si. De acordo com al- gumas modalidades, as sequências de ITR são sequências de ITR do tipo selvagem. De acordo com algumas modalidades, as sequências de ITR não são sequências de ITR do tipo selvagem. De acordo com algumas modalidades, as sequências de ITR são sequências de ITR modificadas.

[00181] De acordo com algumas modalidades, os vetores de ceD- NA contêm um gene heterólogo posicionado entre duas sequências de repetição terminal invertida do tipo selvagem (WT-ITR) de flanquea- mento, que são o complemento reverso (invertido) uma da outra, ou, alternativamente, são substancialmente simétricas em relação uma à outra – ou seja, é um par de ITR do tipo selvagem com organização espacial tridimensional simétrica. Em algumas modalidades, uma se- quência de ITR do tipo selvagem (por exemplo, ITR do tipo selvagem de AAV) compreende um sítio de ligação a Rep funcional (RBS; por exemplo, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' para AAV2, SEQ ID NO: 531) e um sítio de resolução terminal funcional (TRS; por exemplo, 5'- AGTT-3', SEQ ID NO: 46).

[00182] De acordo com algumas modalidades, vetores de ceDNA contêm um gene heterólogo posicionado entre duas sequências de repetição terminal invertida modificada flanqueadora (mod-ITR), que são o complemento reverso (invertido) uma da outra, ou são substan- cialmente simétricas conforme definido aqui (ou seja, têm modifica- ções correspondentes), e não são ITRs de tipo selvagem. Essas ITRs complementares inversas são chamadas de ITRs simétricas. As ITRs são modificadas a partir de ITRs parvovirais de tipo selvagem existen- tes (por exemplo, uma ITR de AAV) por deleção, inserção e/ou substi- tuição; e pode compreender um sítio de ligação a Rep funcional (RBS; por exemplo, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' para AAV2, SEQ ID NO: 531) e um sítio de resolução terminal funcional (TRS; por exemplo, 5'- AGTT-3', SEQ ID NO: 46).

[00183] Em algumas modalidades, a sequência de ITRs pode ser de vírus da família Parvoviridae, que inclui duas subfamílias: Parvoviri- nae, que infectam vertebrados, e Densovirinae, que infectam insetos. A subfamília Parvovirinae (denominada parvovírus) inclui o gênero Dependovirus, cujos membros, na maioria das condições, necessitam de coinfecção com um vírus auxiliar, como adenovírus ou vírus do herpes, para infecção produtiva. O gênero Dependovírus inclui vírus adenoassociado (AAV), que normalmente infecta seres humanos (por exemplo, sorotipos 2, 3A, 3B, 5 e 6) ou primatas (por exemplo, soroti- pos 1 e 4) e vírus relacionados que infectam outros vírus animais de sangue quente (por exemplo, vírus adenoassociados bovinos, caninos, equinos e ovinos). Os parvovírus e outros membros da família Parvo- viridae são geralmente descritos em Kenneth I. Berns, "Parvoviridae:

The Viruses and Their Replication", Capítulo 69 em FIELDS VIRO- LOGY (3ª Ed. 1996). Um versado na técnica está ciente de que ITRs de qualquer parvovírus conhecido podem ser empregadas nas compo- sições e métodos descritos neste documento. De acordo com algumas modalidades, as ITRs são de um dependovírus como AAV (por exem- plo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ e genoma de AAV-DJ8. Por exemplo, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), ITRs quiméricas ou ITRs de qualquer AAV sintético. Em algumas modalidades, o AAV po- de infectar animais de sangue quente, por exemplo, vírus adenoasso- ciado a aves (AAAV), bovinos (BAAV), caninos, equinos e ovinos. Em algumas modalidades, a ITR é do parvovírus B19 (nº de acesso ao GenBank: NC 000883), vírus em minutos do mouse (MVM) (nº de acesso ao GenBank NC 001510); parvovírus de ganso (nº de acesso ao GenBank NC 001701); parvovírus de cobra 1 (número de acesso ao GenBank NC 006148).

[00184] De acordo com algumas modalidades, o sorotipo escolhido pode ser baseado no tropismo de tecido do sorotipo. AAV2 tem um amplo tropismo de tecido, AAV1 tem como alvo preferencial os múscu- los neuronais e esqueléticos e AAV5 tem como alvo preferencial os epitélios pigmentados da retina, neuronais e fotorreceptores. AAV6 visa preferencialmente o músculo esquelético e o pulmão. AAV8 tem como alvo preferencial os tecidos do fígado, músculo esquelético, co- ração e pâncreas. AAV9 tem como alvo preferencial o tecido hepático, esquelético e pulmonar. De acordo com algumas modalidades, o soro- tipo é AAV2.

[00185] Um versado na técnica está ciente de que as sequências de ITR têm uma estrutura comum de uma junção de hélice dupla de Holliday, que normalmente é uma estrutura em forma de T ou em for-

ma de gancho de cabelo em Y (ver por exemplo, Figura 3A e Figura 4A), onde cada ITR é formada por dois braços palindrômicos ou alças (B-B' e C-C') embutidos em um braço palindrômico maior (A-A'), e uma sequência D de fita simples, (onde a ordem dessas sequências palin- drômicas define o orientação flip ou flop da ITR) e, portanto, pode-se projetar sequências de ITR modificadas de qualquer sorotipo de AAV para uso em um vetor de ceDNA ou plasmídeo de ceDNA com base nas sequências de ITR de AAV2 exemplificativas fornecidas neste do- cumento. Consulte, por exemplo, análise estrutural e comparação de sequência de ITRs a partir de sorotipos de AAV diferentes (AAV1- AAV6) e descritos em Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426 a 439; Yan et al., J. Virology, 2005; 364 a 379; Duan et al., Virology 1999; 261; 8 a 14.

[00186] Em conformidade, embora as ITRs de AAV2 sejam usadas como ITRs exemplificativas (por exemplo, ITRs do tipo selvagem (WT) ou modificadas) nos vetores de ceDNA aqui divulgados, um vetor de ceDNA aqui divulgado pode ser preparado com ou baseado em ITRs de qualquer sorotipo AAV conhecido, incluindo, por exemplo, sorotipo AAV 1 (AAV1), sorotipo AAV 2 (AAV2), sorotipo AAV 4 (AAV4), soroti- po AAV 5 (AAV5), sorotipo AAV 6 (AAV6), sorotipo AAV 7 (AAV7), so- rotipo AAV 8 (AAV8), sorotipo AAV 9 (AAV9), sorotipo AAV 10 (AAV10), sorotipo AAV 11 (AAV11) ou sorotipo AAV 12 (AAV12). O especialista na técnica pode determinar a sequência correspondente em outros sorotipos por meios conhecidos. A invenção fornece ainda populações e pluralidades de vetores de ceDNA compreendendo ITRs de uma combinação de diferentes sorotipos AAV - isto é, uma ITR (por exemplo, ITR do tipo selvagem (WT) ou modificada) pode ser de um sorotipo AAV e a outra ITR (por exemplo, ITR do tipo selvagem (WT) ou modificada) pode ser de um sorotipo diferente. Se desejar se ater à teoria, em uma modalidade, uma ITR (por exemplo, ITR do tipo selva-

gem (WT) ou modificada) pode ser de ou baseada em uma sequência de ITR de AAV2 e a outra ITR (por exemplo, ITR do tipo selvagem (WT) ou modificada) do vetor de ceDNA pode ser a partir de ou base- ada em qualquer uma ou mais sequências de ITR de sorotipo AAV 1 (AAV1), sorotipo AAV 4 (AAV4), sorotipo AAV 5 (AAV5), sorotipo AAV 6 (AAV6), sorotipo AAV 7 (AAV7), sorotipo AAV 8 (AAV8), sorotipo AAV 9 (AAV9), sorotipo AAV 10 (AAV10), sorotipo AAV 11 (AAV11) ou sorotipo AAV 12 (AAV12).

[00187] Alterações e mutações específicas nas ITRs-WT são des- critas neste documento, de modo que o ceDNA possa incorporar ITRs- WT que são substancialmente simétricas, isto é, elas têm a organiza- ção espacial tridimensional simétrica, de modo que sua estrutura tenha a mesma forma no espaço geométrico. Isso pode ocorrer quando um par G-C é modificado para, por exemplo, um par C-G ou vice-versa, ou um par A-T é modificado para um par T-A, ou vice-versa. Portanto, usando o exemplo exemplificativo acima de ITR do tipo selvagem 5' que compreende a sequência de ATCGATCG, e ITR do tipo selvagem 3' que compreende CGATCGAT (isto é, o complemento reverso de ATCGATCG), essas ITRs-WT poderiam ainda ser substancialmente simétricas se, por exemplo, a ITR do tipo selvagem 5' tiver a sequência de ATCGAACG, onde T é modificado para A, e a ITR do tipo selvagem 3' substancialmente simétrica tem a sequência de GCATCGAT, sem a modificação da A em uma T. Em algumas modalidades, esse par ITR do tipo selvagem é substancialmente simétrico, pois tem organização espacial tridimensional simétrica.

[00188] Alterações e mutações específicas nas ITRs são descritas em detalhes neste documento, mas no contexto das ITRs, "alterada" ou "mutada" ou "modificada" indica que os nucleotídeos foram inseri- dos, deletados e/ou substituídos em relação à sequência e ITR de tipo selvagem ou de ocorrência natural, em que as duas ITRs que flan-

queiam o transgene ou ácido nucleico heterólogo têm as mesmas mo- dificações ou são substancialmente simétricas conforme definido neste documento, ou seja, têm a mesma organização espacial tridimensio- nal, de modo que sua estrutura tenha a mesma forma em espaço ge- ométrico. A ITR alterada ou mutada pode ser uma ITR geneticamente modificada. Como usado aqui, "geneticamente modificada" refere-se ao aspecto de ter sido manipulado pela mão do homem. Por exemplo, um polipeptídeo é considerado "geneticamente modificado" quando pelo menos um aspecto do polipeptídeo, por exemplo, sua sequência, foi manipulado pela mão do homem para diferir do aspecto que existe na natureza.

[00189] Em algumas modalidades, uma ITR (por exemplo, ITR do tipo selvagem (WT) ou modificada) pode ser sintética. Em uma moda- lidade, uma ITR sintética é baseada em sequências de ITR de mais de um sorotipo AAV. Em outra modalidade, uma ITR sintética não inclui sequência baseada em AAV. Em ainda outra modalidade, uma ITR sintética preserva a estrutura da ITR descrita acima, embora possua apenas alguma ou nenhuma sequência originada por AAV. Em alguns aspectos, uma ITR sintética pode interagir preferencialmente com um Rep de tipo selvagem ou um Rep de um sorotipo específico, ou em alguns casos não será reconhecido por um Rep de tipo selvagem e será reconhecido apenas por um Rep mutado. Em algumas modalida- des, a ITR é uma sequência ITR sintética que retém um local de liga- ção Rep funcional (RBS), como 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' e um sítio de resolução terminal (TRS), além de uma sequência palindrômi- ca variável permitindo a formação de estrutura secundária em gancho. Em alguns exemplos, uma sequência de ITR modificada retém a se- quência de RBS, trs e a estrutura e posição de um elemento de liga- ção Rep formando a porção de alça terminal de uma das estruturas secundárias em grampo de ITR da sequência correspondente da ITR de AAV2 do tipo selvagem. Sequências de ITR exemplificativas para uso nos vetores de ceDNA são divulgadas nas Tabelas 2 a 9, 10A e 10B, SEQ ID NO: 2, 52, 101 a 449 e 545 a 547, e as sequências de ITR parciais mostradas nas Figuras 26A a 26B do Pedido PCT nº PCT/US18/49996, depositado em 7 de setembro de 2018. Em algu- mas modalidades, um vetor de ceDNA pode compreender uma ITR com uma modificação na ITR correspondente a qualquer uma das mo- dificações nas sequências de ITR ou sequências parciais de ITR mos- tradas em qualquer uma ou mais das Tabelas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10A e 10B e Pedido PCT nº PCT/US 18/49996, depositado em 7 de setem- bro de 2018.

[00190] Em uma modalidade, as ITRs de flanqueamento (por exemplo, ITRs do tipo selvagem (WT) ou modificadas) são substanci- almente simétricas entre si. Onde as ITRs são ITRs modificadas, a modificação é idêntica – a adição, substituição ou deleção é a mesma, mas as ITRs não são complementos reversos idênticos. Por exemplo, as ITRs (por exemplo, ITRs do tipo selvagem (WT) ou modificadas) podem ser de diferentes sorotipos (por exemplo, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12) como a combinação de AAV2 e AAV6, com a modifi- cação na posição correspondente.

[00191] Em uma modalidade, as ITRs substancialmente simétricas são quando uma é invertida em relação à outra ITR pelo menos 80% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo me- nos 96% idêntica, pelo menos 97% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou pelo menos 99% idêntica, e todos os pontos entre as mesmas. A homologia pode ser determinada por meios padrão bem conhecidos na técnica, como BLAST (Ferramenta de busca básica de alinhamento sítio, Basic Local Alignment Search Tool), BLASTN na configuração padrão. As ITRs são consideradas substancialmente simétricas quan- do a geometria geral das alças A, B e C são semelhantes. Em algu-

mas modalidades, um par de ITRs de tipo selvagem é substancialmen- te simétrico, pois tem organização espacial tridimensional simétrica, por exemplo, tem a mesma organização 3D dos braços A, C-C'. B-B' e D. Em uma modalidade, um par de ITRs de tipo selvagem substanci- almente simétrico é invertido em relação ao outro e é pelo menos 95% idêntico, pelo menos 96%... 97%... 98%... 99%....99,5% e todos os pontos entre as mesmas, entre si, e uma ITR do tipo selvagem retém o sítio de ligação a Rep (RBS) de 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) e um sítio de resolução terminal (trs). Em algumas moda- lidades, um par de ITRs de tipo selvagem substancialmente simétrico é invertido um em relação ao outro e é pelo menos 95% idêntico, pelo menos 96%... 97%... 98%... 99%....99,5% e todos os pontos entre as mesmas, entre si, e uma ITR do tipo selvagem retém o sítio de ligação a Rep (RBS) de 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) e um sítio de resolução terminal (trs) e além de uma sequência palin- drômica variável, permitindo a formação de estrutura secundária em forma de grampo.

[00192] Em uma modalidade, um par de ITRs modificadas substan- cialmente simétricas refere-se a um par de ITRs modificadas (ITRs mod), desde que a diferença nas sequências de nucleotídeos entre as ITRs não afete as propriedades ou a forma geral e tenham substanci- almente a mesma forma em 3D espaço. Por exemplo, uma mod-ITR que tem pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a mod-ITR canônica, conforme determinado por meios padrão bem conhecidos na técnica, como BLAST (Ferramenta Básica de Alinhamento Local), BLASTN nas configurações padrão e também tem uma organização espacial tridimensional simétrica, de modo que sua estrutura 3D tenha a mesma forma no espaço geométrico. Um par de mod-ITRs substancialmente simétricas tem as mesmas alças A, C- C' e B-B' no espaço 3D, por exemplo, se uma ITR modificada em um par de mod-ITRs substancialmente simétricas tiver uma deleção de um braço C-C', então, a ITR tem a deleção correspondente da alça C-C' e também tem uma estrutura 3D semelhante das demais alças A e B-B' da mesma forma no espaço geométrico da sua mod-ITR cognata. Apenas a título de exemplo, as ITRs simétricas de acordeão podem ter uma estereoquímica simétrica, de modo que sua estrutura tenha a mesma forma no espaço geométrico. Isso pode ocorrer, por exemplo, quando um par G-C é modificado, por exemplo, para um par C-G ou vice-versa, ou o par A-T é modificado para um par T-A ou vice-versa. Portanto, usando o exemplo exemplificativo acima de ITR 5' modifica- da como um ATCGAACGATCG, e ITR 3' modificada como CGATCG- TTCGAT (ou seja, o complemento reverso de ATCGAACGATCG), es- sas ITRs modificadas ainda seriam simétricas se, por exemplo, a ITR 5' tivesse a sequência de ATCGAACCATCG, onde G na adição é mo- dificada para C, e a ITR 3' simétrica tem a sequência de CGATCGTT- CGAT, sem a modificação correspondente da T na adição de A. Em algumas modalidades, tal par de ITRs modificada é substancialmente simétrico, pois o par de ITR modificado tem estereoquímica simétrica.

[00193] Em algumas modalidades, as ITRs de um par mod-ITR po- dem ter diferentes sequências nucleotídicas de complemento reverso, mas ainda possuem a mesma organização espacial tridimensional si- métrica - ou seja, ambas as ITRs possuem mutações que resultam na mesma forma 3D bruta. Por exemplo, uma ITR (por exemplo, ITR 5') em um par mod-ITR pode ser de um sorotipo e a outra ITR (por exem- plo, ITR 3') pode ser de um sorotipo diferente, no entanto, ambas po- dem ter a mesma mutação correspondente (por exemplo, se a ITR 5' tiver uma exclusão na região C, a ITR 3' modificada cognata de um sorotipo diferente tem uma exclusão na posição correspondente na região C'), de modo que o par de ITRs modificadas tenha a mesma organização espacial tridimensional simétrica. Um par mod-ITR subs-

tancialmente simétrico tem as mesmas alças A, C-C' e B-B' no espaço 3D. A título de exemplo não limitativo, por exemplo, se uma ITR modi- ficada em um par mod-ITR substancialmente simétrico tem uma dele- ção de um braço C-C', então, a mod-ITR cognata tem a deleção cor- respondente da alça C-C' e também tem uma estrutura 3D semelhante das alças A e B-B' restantes na mesma forma no espaço geométrico de sua mod-ITR cognata. Em outro exemplo, se uma mod-ITR 5' tem uma deleção de um ou mais ácidos nucleicos na região B, então a 3'- ITR cognata modificada tem uma deleção na posição de nucleotídeo correspondente no braço B'.

[00194] É bem conhecido por um versado na técnica que se uma mod-ITR 5' tem uma modificação na região A, a 3' ITR cognata terá uma modificação na posição correspondente na região A'; se uma mod-ITR 5' tiver uma modificação na região C, a ITR 3' cognata terá uma modificação na posição correspondente na região C', ou vice- versa, se uma mod-ITR 5' tiver uma modificação na região C', a ITR 3' cognata terá uma modificação na posição correspondente na região C; se uma mod-ITR 5' tiver uma modificação na região B, a ITR 3' cogna- ta terá uma modificação na posição correspondente na região B', ou vice-versa, se uma mod-ITR 5' tiver uma modificação na região B', a ITR 3' cognata terá uma modificação na posição correspondente na região B; e se uma mod-ITR 5' tiver uma modificação na região A', a mod-ITR 3' cognata terá uma modificação na posição correspondente na região A, de tal modo que as mod-ITRs sejam simétricas ou subs- tancialmente simétricas como definido neste documento, de modo que o par ITR modificado tenha a mesma organização espacial tridimensi- onal simétrica.

[00195] Em algumas modalidades, onde as ITRs modificadas simé- tricas são simétricas, a diferença na sequência nucleotídica da ITR modificada simétrica flanqueadora em relação à outra ITR é que a mu-

dança é uma substituição de um ácido nucleico por um ácido nucleico conservado. Em algumas modalidades, onde as ITRs modificadas si- métricas são simétricas, a diferença na sequência nucleotídica da ITR modificada simétrica flanqueadora em relação à outra ITR é que a mu- dança é uma substituição de um, ou dois ou três ácidos nucleicos por seu ácido nucleico complementar, onde as mudanças podem ser se- quenciais ou, alternativamente, dispersas ou não sequenciais por toda a ITR. Em algumas modalidades onde o par de ITR modificada simé- trica é substancialmente simétrico como definido no presente docu- mento, uma ITR pode ter a substituição de qualquer um de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ácidos nuclei- cos para seus ácidos nucleicos complementares em relação à ITR modificada substancialmente simétrica de flanqueamento, desde que a diferença nas sequências nucleotídicas entre as duas ITRs modifica- das substancialmente simétricas não afete as propriedades ou formato geral e que tenham substancialmente o mesmo formato no espaço 3D.

[00196] Qualquer ITR de parvovírus pode ser usada como uma ITR (por exemplo, ITR do tipo selvagem (WT) ou modificada) ou como uma ITR de base para modificação. De preferência, o parvovírus é um de- pendovírus. Mais preferencialmente, AAV. O sorotipo escolhido pode ser baseado no tropismo tecidual do sorotipo. AAV2 tem um amplo tropismo de tecido, AAV1 tem como alvo preferencial os músculos neuronais e esqueléticos e AAV5 tem como alvo preferencial os epité- lios pigmentados da retina, neuronais e fotorreceptores. AAV6 visa preferencialmente o músculo esquelético e o pulmão. AAV8 tem como alvo preferencial os tecidos do fígado, músculo esquelético, coração e pâncreas. AAV9 tem como alvo preferencial o tecido hepático, esque- lético e pulmonar. Em uma modalidade, a ITR modificada é baseada em uma ITR de AAV2.

[00197] De acordo com algumas modalidades, o polinucleotídeo de vetor compreende um par de ITRs-WT, selecionado a partir do grupo mostrado na Tabela 1. A Tabela 1 mostra combinações exemplificati- vas de ITRs-WT a partir do mesmo sorotipo ou sorotipos diferentes, ou parvovírus diferentes. A ordem mostrada não é indicativa da posição de ITR, por exemplo, "AAV1, AAV2" demonstra que o ceDNA pode compreender uma ITR do tipo selvagem-AAV1 na posição 5' e uma ITR WT-AAV2 na posição 3', ou vice vice-versa, uma ITR WT-AAV2 na posição 5' e uma ITR de WT-AAV1 na posição 3'. Abreviações: soroti- po AAV 1 (AAV1), sorotipo AAV 2 (AAV2), sorotipo AAV 3 (AAV3), so- rotipo AAV 4 (AAV4), sorotipo AAV 5 (AAV5), sorotipo AAV 6 (AAV6), sorotipo AAV 7 (AAV7), sorotipo AAV 8 (AAV8), sorotipo AAV 9 (AAV9), sorotipo AAV 10 (AAV10), sorotipo AAV 11 (AAV11) ou soroti- po AAV 12 (AAV12); AAVrh8, AAVrh10, genoma de AAV-DJ e AAV- DJ8 (por exemplo, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), ITRs de animais de sangue quente (AAV aviário (AAAV), AAV bovino (BAAV), AAV canino, equino e ovino), ITRs de parvovírus B19 (Nº de acesso GenBank: NC 000883), Vírus minuto do camundongo (MVM) (Nº de acesso GenBank NC 001510); ganso: parvovírus de ganso (Nº de acesso GenBank NC 001701); serpente: parvovírus 1 de serpente (Nº de acesso GenBank NC 006148). TABELA 1: COMBINAÇÕES EXEMPLIFICATIVAS DE ITRS DE TIPO

SELVAGEM AAV1, AAV1 AAV2, AAV2 AAV3, AAV3 AAV4, AAV4 AAV5, AAV5 AAV1, AAV2 AAV2, AAV3 AAV3, AAV4 AAV4, AAV5 AAV5, AAV6 AAV1, AAV3 AAV2, AAV4 AAV3, AAV5 AAV4, AAV6 AAV5, AAV7 AAV1, AAV4 AAV2, AAV5 AAV3, AAV6 AAV4, AAV7 AAV5, AAV8 AAV1, AAV5 AAV2, AAV6 AAV3, AAV7 AAV4, AAV8 AAV5, AAV9 AAV1, AAV6 AAV2, AAV7 AAV3, AAV8 AAV4, AAV9 AAV5, AAV10 AAV1, AAV7 AAV2, AAV8 AAV3, AAV9 AAV4, AAV10 AAV5, AAV11 AAV1, AAV8 AAV2, AAV9 AAV3, AAV10 AAV4, AAV11 AAV5, AAV12 AAV1, AAV9 AAV2, AAV10 AAV3, AAV11 AAV4, AAV12 AAV5, AAVRH8

AAV1, AAV10 AAV2, AAV11 AAV3, AAV12 AAV4, AAV5, AAVRH8 AAVRH10 AAV1, AAV11 AAV2, AAV12 AAV3, AAV4, AAV5, AAV13 AAVRH8 AAVRH10 AAV1, AAV12 AAV2, AAV3, AAV4, AAV13 AAV5, AAVDJ AAVRH8 AAVRH10 AAV1, AAV2, AAV3, AAV13 AAV4, AAVDJ AAV5, AAVRH8 AAVRH10 AAVDJ8 AAV1, AAV2, AAV13 AAV3, AAVDJ AAV4, AAV5, AAVRH10 AAVDJ8 AVIÁRIO AAV1, AAV13 AAV2, AAVDJ AAV3, AAV4, AAV5, AAVDJ8 AVIÁRIO BOVINO AAV1, AAVDJ AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAVDJ8 AVIÁRIO BOVINO CANINO AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAVDJ8 AVIÁRIO BOVINO CANINO EQUINO AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, CABRA

AVIÁRIO BOVINO CANINO EQUINO AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, CABRA AAV5,

BOVINO CANINO EQUINO CAMARÃO AAV1, AAV2, AAV3, CABRA AAV4, AAV5,

CANINO EQUINO CAMARÃO PORCINO AAV1, AAV2, CABRA AAV3, AAV4, AAV5,

EQUINO CAMARÃO PORCINO INSETO AAV1, CABRA AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, OVINO

CAMARÃO PORCINO INSETO AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, OVINO AAV5, B19

CAMARÃO PORCINO INSETO AAV1, AAV2, AAV3, OVINO AAV4, B19 AAV5, MVM

PORCINO INSETO AAV1, AAV2, OVINO AAV3, B19 AAV4, MVM AAV5, GANSO

INSETO AAV1, OVINO AAV2, B19 AAV3, MVM AAV4, GANSO AAV5,

SERPENTE AAV1, B19 AAV2, MVM AAV3, GANSO AAV4,

SERPENTE AAV1, MVM AAV2, GANSO AAV3,

SERPENTE AAV1, GANSO AAV2,

SERPENTE AAV1,

SERPENTE AAV6, AAV6 AAV7, AAV7 AAV8, AAV8 AAV9, AAV9 AAV10, AAV10 AAV6, AAV7 AAV7, AAV8 AAV8, AAV9 AAV9, AAV10 AAV10, AAV11 AAV6, AAV8 AAV7, AAV9 AAV8, AAV10 AAV9, AAV11 AAV10, AAV12

AAV6, AAV9 AAV7, AAV10 AAV8, AAV11 AAV9, AAV12 AAV10, AAVRH8 AAV6, AAV10 AAV7, AAV11 AAV8, AAV12 AAV9, AAV10, AAVRH8 AAVRH10 AAV6, AAV11 AAV7, AAV12 AAV8, AAV9, AAV10, AAV13 AAVRH8 AAVRH10 AAV6, AAV12 AAV7, AAV8, AAV9, AAV13 AAV10, AAVRH8 AAVRH10 AAVDJ AAV6, AAV7, AAV8, AAV13 AAV9, AAVDJ AAV10, AAVRH8 AAVRH10 AAVDJ8 AAV6, AAV7, AAV13 AAV8, AAVDJ AAV9, AAV10, AAVRH10 AAVDJ8 AVIÁRIO AAV6, AAV13 AAV7, AAVDJ AAV8, AAV9, AAV10, AAVDJ8 AVIÁRIO BOVINO AAV6, AAVDJ AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVDJ8 AVIÁRIO BOVINO CANINO AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVDJ8 AVIÁRIO BOVINO CANINO EQUINO AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10,

AVIÁRIO BOVINO CANINO EQUINO CABRA AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, CABRA AAV10,

BOVINO CANINO EQUINO CAMARÃO AAV6, AAV7, AAV8, CABRA AAV9, AAV10,

CANINO EQUINO CAMARÃO PORCINO AAV6, AAV7, CABRA AAV8, AAV9, AAV10,

EQUINO CAMARÃO PORCINO INSETO AAV6, CABRA AAV7, AAV8, AAV9, AAV10,

CAMARÃO PORCINO INSETO OVINO AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, OVINO AAV10, B19

CAMARÃO PORCINO INSETO AAV6, AAV7, AAV8, OVINO AAV9, B19 AAV10, MVM

PORCINO INSETO AAV6, AAV7, OVINO AAV8, B19 AAV9, MVM AAV10,

INSETO GANSO AAV6, OVINO AAV7, B19 AAV8, MVM AAV9, GANSO AAV10,

SERPENTE AAV6, B19 AAV7, MVM AAV8, GANSO AAV9,

SERPENTE AAV6, MVM AAV7, GANSO AAV8,

SERPENTE AAV6, GANSO AAV7,

SERPENTE AAV6,

SERPENTE

AAV11, AAV11 AAV12, AAV12 AAVRH8, AAVRH10, AAV13, AAV13 AAVRH8 AAVRH10 AAV11, AAV12 AAV12, AAVRH8, AAVRH10, AAV13, AAVRH8 AAVRH10 AAV13 AAVDJ AAV11, AAV12, AAVRH8, AAVRH10, AAV13, AAVRH8 AAVRH10 AAV13 AAVDJ AAVDJ8 AAV11, AAV12, AAV13 AAVRH8, AAVRH10, AAV13, AAVRH10 AAVDJ AAVDJ8 AVIÁRIO AAV11, AAV13 AAV12, AAVRH8, AAVRH10, AAV13, AAVDJ AAVDJ8 AVIÁRIO BOVINO AAV11, AAV12, AAVRH8, AAVRH10, AAV13, AAVDJ AAVDJ8 AVIÁRIO BOVINO CANINO AAV11, AAV12, AAVRH8, AAVRH10, AAV13, AAVDJ8 AVIÁRIO BOVINO CANINO EQUINO AAV11, AAV12, AAVRH8, AAVRH10, AAV13,

AVIÁRIO BOVINO CANINO EQUINO CABRA AAV11, AAV12, AAVRH8, AAVRH10, AAV13,

BOVINO CANINO EQUINO CABRA CAMARÃO AAV11, AAV12, AAVRH8, AAVRH10, AAV13,

CANINO EQUINO CABRA CAMARÃO PORCINO AAV11, AAV12, AAVRH8, AAVRH10, AAV13,

EQUINO CABRA CAMARÃO PORCINO INSETO AAV11, AAV12, AAVRH8, AAVRH10, AAV13,

CABRA CAMARÃO PORCINO INSETO OVINO AAV11, AAV12, AAVRH8, AAVRH10, AAV13, B19

CAMARÃO PORCINO INSETO OVINO AAV11, AAV12, AAVRH8, AAVRH10, AAV13, MVM PORCINO INSETO OVINO B19 AAV11, AAV12, AAVRH8, B19 AAVRH10, AAV13,

INSETO OVINO MVM GANSO AAV11, AAV12, B19 AAVRH8, AAVRH10, AAV13,

OVINO MVM GANSO SERPENTE AAV11, B19 AAV12, MVM AAVRH8, AAVRH10,

GANSO SERPENTE AAV11, MVM AAV12, AAVRH8,

GANSO SERPENTE AAV11, AAV12,

GANSO SERPENTE AAV11,

SERPENTE AAVDJ, AAVDJ8, AVIÁRIO, BOVINO, CANINO, AAVDJ AVVDJ8 AVIÁRIO BOVINO CANINO AAVDJ, AAVDJ8, AVIÁRIO, BOVINO, CANINO, AAVDJ8 AVIÁRIO BOVINO CANINO EQUINO

AAVDJ, AAVDJ8, AVIÁRIO, BOVINO, CANINO,

AVIÁRIO BOVINO CANINO EQUINO CABRA AAVDJ, AAVDJ8, AVIÁRIO, BOVINO, CANINO,

BOVINO CANINO EQUINO CABRA CAMARÃO AAVDJ, AAVDJ8, AVIÁRIO, BOVINO, CANINO,

CANINO EQUINO CABRA CAMARÃO PORCINO AAVDJ, AAVDJ8, AVIÁRIO, BOVINO, CANINO,

EQUINO CABRA CAMARÃO PORCINO INSETO AAVDJ, AAVDJ8, AVIÁRIO, BOVINO, CANINO,

CABRA CAMARÃO PORCINO INSETO OVINO AAVDJ, AAVDJ8, AVIÁRIO, BOVINO, CANINO, B19

CAMARÃO PORCINO INSETO OVINO AAVDJ, AAVDJ8, AVIÁRIO, BOVINO, B19 CANINO,

PORCINO INSETO OVINO MVM AAVDJ, AAVDJ8, AVIÁRIO, B19 BOVINO, CANINO,

INSETO OVINO MVM GANSO AAVDJ, AAVDJ8, B19 AVIÁRIO, BOVINO, CANINO,

OVINO MVM GANSO SERPENTE AAVDJ, B19 AAVDJ8, AVIÁRIO, BOVINO,

MVM GANSO SERPENTE AAVDJ, MVM AAVDJ8, AVIÁRIO,

GANSO SERPENTE AAVDJ, AAVDJ8,

GANSO SERPENTE AAVDJ, SERPENTE EQUINO, CABRA, CAMARÃO, PORCINO, INSETO, EQUINO CABRA CAMARÃO PORCINO INSETO EQUINO, CABRA, CAMARÃO, PORCINO, INSETO,

CABRA CAMARÃO PORCINO INSETO OVINO EQUINO, CABRA, CAMARÃO, PORCINO, INSETO, B19

CAMARÃO PORCINO INSETO OVINO EQUINO, CABRA, CAMARÃO, PORCINO, INSETO, PORCINO INSETO OVINO B19 MVM EQUINO, CABRA, CAMARÃO, PORCINO, INSETO, INSETO OVINO B19 MVM GANSO EQUINO, CABRA, B19 CAMARÃO, PORCINO, INSETO,

OVINO MVM GANSO SERPENTE EQUINO, B19 CABRA, MVM CAMARÃO, PORCINO,

GANSO SERPENTE EQUINO, CABRA, CAMARÃO, MVM GANSO SERPENTE EQUINO, CABRA, GANSO SERPENTE EQUINO,

SERPENTE OVINO, B19, B19 MVM, MVM GANSO, SERPENTE,

OVINO GANSO SERPENTE OVINO, B19 B19, MVM MVM, GANSO GANSO,

SERPENTE OVINO, MVM B19, GANSO MVM,

SERPENTE OVINO, B19,

GANSO SERPENTE OVINO, SERPENTE

[00198] De acordo com algumas modalidades, o polinucleotídeo de vetor ou os vetores de DNA livres de capsídeo e não virais com extre- midades covalentemente fechadas compreende um par de ITRs-WT selecionadas a partir de ITRs-WT mostradas na Tabela 2. Apenas a título de exemplo, a Tabela 2 mostra as sequências de ITRs-WT exemplificativas de diferentes sorotipos AAV. TABELA 2: ITRS-WT EXEMPLIFICATIVAS DE DIFERENTES SORO-

TIPOS AAV Sorotipo ITR de tipo selvagem 5' (ES- ITR de tipo selvagem 3' (DI- AAV QUERDA) REITA) AAV1 5'- 5'-

TTGCCCACTCCCTCTCTGC TTACCCTAGTGATGGAGTT GCGCTCGCTCGCTCGGTG GCCCACTCCCTCTCTGCGC GGGCCTGCGGACCAAAGG GCGTCGCTCGCTCGGTGG TCCGCAGACGGCAGAGGT GGCCGGCAGAGGAGACCT CTCCTCTGCCGGCCCCACC CTGCCGTCTGCGGACCTTT GAGCGAGCGACGCGCGCA GGTCCGCAGGCCCCACCG

GAGAGGGAGTGGGCAACT AGCGAGCGAGCGCGCAGA CCATCACTAGGGTAA-3' GAGGGAGTGGGCAA-3' (SEQ ID NO: 558) (SEQ ID NO: 559)

Sorotipo ITR de tipo selvagem 5' (ES- ITR de tipo selvagem 3' (DI- AAV QUERDA) REITA) AAV2 CCTGCAGGCAGCTGCGCG AGGAACCCCTAGTGATGGA

CTCGCTCGCTCACTGAGGC GTTGGCCACTCCCTCTCTG CGCCCGGGCAAAGCCCGG CGCGCTCGCTCGCTCACTG GCGTCGGGCGACCTTTGGT AGGCCGGGCGACCAAAGG CGCCCGGCCTCAGTGAGC TCGCCCGACGCCCGGGCT GAGCGAGCGCGCAGAGAG TTGCCCGGGCGGCCTCAG

GGAGTGGCCAACTCCATCA TGAGCGAGCGAGCGCGCA CTAGGGGTTCCT (SEQ ID GCTGCCTGCAGG (SEQ ID NO: 51) NO: 1) AAV3 5'- 5'-

TTGGCCACTCCCTCTATGC ATACCTCTAGTGATGGAGT GCACTCGCTCGCTCGGTG TGGCCACTCCCTCTATGCG GGGCCTGGCGACCAAAGG CACTCGCTCGCTCGGTGG TCGCCAGACGGACGTGGG GGCCGGACGTGGAAACCC TTTCCACGTCCGGCCCCAC ACGTCCGTCTGGCGACCTT CGAGCGAGCGAGTGCGCA TGGTCGCCAGGCCCCACC

TAGAGGGAGTGGCCAACTC GAGCGAGCGAGTGCGCAT CATCACTAGAGGTAT-3' AGAGGGAGTGGCCAA-3' (SEQ ID NO: 560) (SEQ ID NO: 561) AAV4 5'- 5'-

TTGGCCACTCCCTCTATGC AGTTGGCCACATTAGCTAT GCGCTCGCTCACTCACTCG GCGCGCTCGCTCACTCACT GCCCTGGAGACCAAAGGTC CGGCCCTGGAGACCAAAG TCCAGACTGCCGGCCTCTG GTCTCCAGACTGCCGGCCT GCCGGCAGGGCCGAGTGA CTGGCCGGCAGGGCCGAG

GTGAGCGAGCGCGCATAG TGAGTGAGCGAGCGCGCA AGGGAGTGGCCAACT-3' TAGAGGGAGTGGCCAA-3' (SEQ ID NO: 562) (SEQ ID NO: 563)

Sorotipo ITR de tipo selvagem 5' (ES- ITR de tipo selvagem 3' (DI- AAV QUERDA) REITA) AAV5 5'- 5'-

TCCCCCCTGTCGCGTTCGC CTTACAAAACCCCCTTGCTT TCGCTCGCTGGCTCGTTTG GAGAGTGTGGCACTCTCCC GGGGGGCGACGGCCAGAG CCCTGTCGCGTTCGCTCGC GGCCGTCGTCTGGCAGCT TCGCTGGCTCGTTTGGGGG CTTTGAGCTGCCACCCCCC GGTGGCAGCTCAAAGAGCT CAAACGAGCCAGCGAGCG GCCAGACGACGGCCCTCT AGCGAACGCGACAGGGGG GGCCGTCGCCCCCCCAAA

GAGAGTGCCACACTCTCAA CGAGCCAGCGAGCGAGCG GCAAGGGGGTTTTGTAAG - AACGCGACAGGGGGGA-3' 3' (SEQ ID NO: 564) (SEQ ID NO: 565) AAV6 5'- 5'-

TTGCCCACTCCCTCTAATG ATACCCCTAGTGATGGAGT CGCGCTCGCTCGCTCGGT TGCCCACTCCCTCTATGCG GGGGCCTGCGGACCAAAG CGCTCGCTCGCTCGGTGG GTCCGCAGACGGCAGAGG GGCCGGCAGAGGAGACCT TCTCCTCTGCCGGCCCCAC CTGCCGTCTGCGGACCTTT CGAGCGAGCGAGCGCGCA GGTCCGCAGGCCCCACCG

TAGAGGGAGTGGGCAACTC AGCGAGCGAGCGCGCATT CATCACTAGGGGTAT-3' AGAGGGAGTGGGCAA (SEQ ID NO: 566) (SEQ ID NO: 567)

[00199] Em certas modalidades da presente invenção, o vetor de ceDNA não tem uma ITR do tipo selvagem consistindo na sequência nucleotídica selecionada a partir de qualquer uma das sequências na Tabela 2. De acordo com algumas modalidades, o vetor de ceDNA não possui uma ITR do tipo selvagem consistindo na sequência nucle- otídica selecionada de qualquer uma das seguintes: SEQ ID NOs: 558 a 567, SEQ ID NO:51 ou SEQ ID NO:1.

[00200] Em modalidades alternativas da presente invenção, se um vetor de ceDNA tem uma ITR do tipo selvagem compreendendo a se- quência nucleotídica selecionada de qualquer uma das seguintes: SEQ ID NOs: 558 a 567, SEQ ID NO:51 ou SEQ ID NO:1, então, a ITR flanqueadora também é WT e o cDNA compreende um interruptor re-

gulador, por exemplo, conforme divulgado neste documento. Em al- gumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende um interruptor regulador como divulgado no presente documento e uma ITR do tipo selvagem selecionada tendo a sequência nucleotídica selecionada a partir de qualquer uma do grupo consistindo em: SEQ ID NOs: 558 a 567, SEQ ID NO:51 ou SEQ ID NO:1.

[00201] O vetor de ceDNA aqui descrito pode incluir estruturas de ITR de tipo selvagem que retêm uma porção de RBE, trs e RBE ope- rável. A Figura 3A e a Figura 3B, usando ITRs de tipo selvagem para fins exemplificativos, mostram um mecanismo possível para a opera- ção de um sítio trs dentro de uma porção da estrutura de ITR de tipo selvagem de um vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA contém uma ou mais sequências de polinucleotídeo ITR do tipo selvagem funcionais que compreendem um sítio de ligação a Rep (por exemplo, RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) para AAV2) e um sítio de resolução terminal (TRS; por exemplo, 5'- AGTT (SEQ ID NO: 46)). Em algumas modalidades, pelo menos uma ITR de tipo selvagem é funcional. Em modalidades alternativas, em que um vetor de ceDNA compreende duas ITRs de tipo selvagem que são substancialmente simétricas entre si, pelo menos uma ITR de tipo selvagem é funcional e pelo menos uma ITR de tipo selvagem não é funcional. Em modalidades alternativas, em que um vetor de ceDNA compreende duas ITRs modificadas que são diferentes ou assimétri- cas entre si, pelo menos uma ITR modificada é funcional e pelo menos uma ITR modificada não é funcional. Esses ceDNAs podem compre- ender um interruptor regulador, por exemplo, conforme divulgado nes- te documento e descrito em detalhes na Seção V abaixo.

[00202] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA não possui uma ITR modificada selecionada de qualquer sequência que consiste em, ou consiste essencialmente em: SEQ ID NOs: 500 a 529, confor-

me aqui fornecido. Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA não tem uma ITR que é selecionada a partir de qualquer sequência seleci- onada a partir de SEQ ID NOs: 500 a 529.

[00203] De acordo com algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende um par de ITRs, selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 484 (ITR-33 esquerda) e SEQ ID NO: 469 (ITR-18, direi- ta); SEQ ID NO: 485 (ITR-34 esquerda) e SEQ ID NO: 95 (ITR-51, di- reita); SEQ ID NO: 486 (ITR-35 esquerda) e SEQ ID NO: 470 (ITR-19, direita); SEQ ID NO: 487 (ITR-36 esquerda) e SEQ ID NO: 471 (ITR- 20, direita); SEQ ID NO: 488 (ITR-37 esquerda) e SEQ ID NO: 472 (ITR-21, direita); SEQ ID NO: 489 (ITR-38 esquerda) e SEQ ID NO: 473 (ITR-22 direita); SEQ ID NO: 490 (ITR-39 esquerda) e SEQ ID NO: 474 (ITR-23, direita); SEQ ID NO: 491 (ITR-40 esquerda) e SEQ ID NO: 475 (ITR-24, direita); SEQ ID NO: 492 (ITR-41 esquerda) e SEQ ID NO: 476 (ITR-25 direita); SEQ ID NO: 493 (ITR-42 esquerda) e SEQ ID NO: 477 (ITR-26 direita); SEQ ID NO: 494 (ITR-43 esquer- da) e SEQ ID NO: 478 (ITR-27 direita); SEQ ID NO: 495 (ITR-44 es- querda) e SEQ ID NO: 479 (ITR-28 direita); SEQ ID NO:496 (ITR-45 esquerda) e SEQ ID NO:480 (ITR-29, direita); SEQ ID NO:497 (ITR-46 esquerda) e SEQ ID NO: 481 (ITR-30, direita); SEQ ID NO: 498 (ITR- 47, esquerda) e SEQ ID NO: 482 (ITR-31, direita); SEQ ID NO: 499 (ITR-48, esquerda) e SEQ ID NO: 483 (ITR-32 direita).

[00204] Em uma modalidade de cada um desses aspectos, o vetor de ceDNA ou os vetores de DNA não virais sem capsídeo com extre- midades covalentemente fechadas compreendem um par de ITRs si- métricas selecionadas de ITRs compreendendo sequências de ITR parciais mostradas nas Figuras 6B a 21B, ou selecionadas das combi- nações de: SEQ ID NO: 101 e SEQ ID NO: 102; SEQ ID NO: 103 e SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 105 e SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO: 545 e SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO:

117 e SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 120; SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122; SEQ ID NO: 107 e SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 123 e SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 126; SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 131 e SEQ ID NO: 132; SEQ ID NO: 133 e SEQ ID NO: 134; SEQ ID NO: 547 e SEQ ID NO: 546.

[00205] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA pode com- preender uma ITR com uma modificação na ITR correspondente a qualquer uma das modificações nas sequências de ITR ou sequências parciais de ITR mostradas na Tabela 5, ou as sequências mostradas nas Figuras 7A a 22B aqui, ou nas Tabelas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10A a 10B do PCT/US18/49996 depositado em 7 de setembro de 2018, onde a sequência de ITR de flanqueamento é simétrica (por exemplo, complemento inverso) da mesma ou substancialmente simé- trica.

[00206] Em algumas modalidades, ceDNA pode formar uma estru- tura secundária duplex intramolecular. A título de exemplo apenas, a estrutura secundária da primeira ITR e da segunda ITR simétrica é exemplificada no contexto de ITRs de tipo selvagem (ver, por exemplo, Figuras 2A, 2B, 4C) e/ou estruturas ITR modificadas (ver, por exem- plo, Figuras 7A a 22B). As estruturas secundárias são inferidas ou previstas com base nas sequências de ITR do plasmídeo usado para produzir o vetor de ceDNA. As estruturas secundárias exemplificativas dos pares de ITRs simétricas modificadas nas quais parte da estrutura haste-alça é excluída são mostradas nas Figuras 7A a 22B. Estrutu- ras secundárias exemplificativas das ITRs modificadas compreenden- do uma única haste e duas alças são mostradas nas Figuras 10A a 10B, 12A a 12B, 13A a 13B, 13A a 22B. A estrutura secundária exemplificativa de uma ITR modificada com uma única haste e uma única alça é mostrada nas Figuras 7A a 7B (por exemplo, uma única alça C-C') e Figuras 8A a 8B (por exemplo, uma única alça B-B'). A estrutura secundária exemplificativa de uma ITR modificada com uma única haste no lugar das duas alças é mostrada nas Figuras 11A a 11B.

Em algumas modalidades, a estrutura secundária pode ser inferi- da como mostrado neste documento usando métodos termodinâmicos com base nas regras do vizinho mais próximo que preveem a estabili- dade de uma estrutura quantificada pela mudança de energia livre de dobramento.

Por exemplo, a estrutura pode ser prevista encontrando a estrutura de energia livre mais baixa.

Em algumas modalidades, um algoritmo divulgado em Reuter, J.

S., & Mathews, D.

H. (2010) RNAs- tructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.

BMC Bioinformatics. 11,129 e implementado no software RNAstructure (disponível no endereço da web mundial: "rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/index.html") pode ser usa- do para previsão da estrutura de ITR.

O algoritmo também pode incluir parâmetros de mudança de energia livre a 37 ºC e parâmetros de mu- dança de entalpia derivados da literatura experimental para permitir a previsão da estabilidade da conformação a uma temperatura arbitrária.

Usando o software de estrutura de RNA, algumas das estruturas de ITR modificadas podem ser previstas como estruturas de haste-alça modificadas em forma de T com energia livre de Gibbs estimada (ΔG) de desdobramento sob condições fisiológicas mostradas nas Figuras 7A a 22B.

Usando o software de estrutura de RNA, os três tipos de ITRs modificadas são previstos para ter uma energia livre de Gibbs de desdobramento maior do que uma ITR de tipo selvagem de AAV2 (- 92,9 kcal/mol) e são os seguintes: (a) As ITRs modificadas com uma estrutura de braço único/alça única não pareada fornecida neste do- cumento são previstas para ter uma energia livre de desdobramento de Gibbs que varia entre -85 e -70 kcal/mol. (b) As ITRs modificadas com uma estrutura em grampo único fornecida neste documento são previstas para ter uma energia livre de desdobramento de Gibbs que varia entre -70 e -40 kcal/mol. (c) As ITRs modificadas com uma estru- tura de dois braços fornecida neste documento são previstas para ter uma energia livre de desdobramento de Gibbs que varia entre -90 e - 70 kcal/mol. Sem desejar estar limitado por uma teoria, as estruturas com maior energia livre de Gibbs são mais fáceis de desdobrar para replicação por proteínas de replicação Rep 68 ou Rep 78. Assim, ITRs modificadas com maior energia livre de Gibbs de desdobramento - por exemplo, uma estrutura de um único braço/única alça não pareada, uma estrutura de grampo único, uma estrutura truncada - tendem a ser replicadas de forma mais eficiente do que ITRs de tipo selvagem.

[00207] Em uma modalidade, a ITR esquerda do vetor de ceDNA é modificada ou mutada em relação a uma estrutura de ITR de AAV de tipo selvagem e a ITR direita é simétrica (complemento inverso) com as mesmas mutações. Em uma modalidade, a ITR direita do vetor de ceDNA é modificada em relação a uma estrutura de ITR AAV de tipo selvagem, e a ITR esquerda é uma ITR simétrica (complemento inver- so) com as mesmas mutações. Em tal modalidade, uma modificação da ITR (por exemplo, a ITR esquerda ou direita) pode ser gerada por uma deleção, uma inserção ou substituição de um ou mais nucleotí- deos da ITR de tipo selvagem derivada do genoma de AAV.

[00208] As ITRs usadas aqui podem ser resolvidas e não resolvi- das, e selecionadas para uso nos vetores de ceDNA são de preferên- cia sequências de AAV, com os sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 sen- do preferenciais. ITRs de AAV resolvíveis não requerem uma sequên- cia de ITR de tipo selvagem (por exemplo, a sequência de ITR de AAV endógena ou de tipo selvagem pode ser alterada por inserção, dele- ção, truncamento e/ou mutações sem sentido), desde que a repetição terminal medeie as funções desejadas, por exemplo, replicação, em- pacotamento de vírus, integração e/ou resgate de provírus e seme-

lhantes. Normalmente, mas não necessariamente, as ITRs são do mesmo sorotipo AAV, por exemplo, ambas as sequências de ITR do vetor ceDNA são de AAV2. Conforme discutido acima, em algumas modalidades, um par de ITRs modificadas é substancialmente simétri- co em que elas têm uma organização espacial tridimensional simétri- ca, mas não têm sequências de nucleotídeos de complemento reverso idênticas. Em tais modalidades, cada ITR em um par de ITRs modifi- cadas pode ser de diferentes sorotipos (por exemplo, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12), como a combinação de AAV2 e AAV6, com a modificação em uma ITR refletida na posição correspondente na ITR cognata de um sorotipo diferente. Em algumas modalidades, as ITRs modificadas podem ser sequências sintéticas que funcionam como re- petições terminais invertidas de AAV, como a "sequência D dupla", conforme descrito na Patente nº US 5.478.745 de Samulski et al.

[00209] Em uma modalidade, o ceDNA pode incluir uma estrutura ITR que é mutada em relação a uma das ITRs de tipo selvagem divul- gadas neste documento, mas onde a ITR mutante ou modificada ainda retém um sítio de ligação a Rep operável (RBE ou RBE') e sítio de re- solução terminal (trs). Em uma modalidade, a ITR de ceDNA mutante inclui um sítio de proteína de replicação funcional (RPS-1) e uma pro- teína competente de replicação que se liga ao sítio de RPS-1 é usada na produção.

[00210] Em uma modalidade, pelo menos uma das ITRs é uma ITR defeituosa em relação à ligação de Rep e/ou corte de Rep. Em uma modalidade, o defeito é de pelo menos 30% em relação a uma ITR de tipo selvagem, em outras modalidades é de pelo menos 35%..., 50%..., 65%..., 75%..., 85%..., 90%..., 95%..., 98%..., ou completamente sem função ou qualquer ponto intermediário. As células hospedeiras não expressam proteínas do capsídeo viral e o modelo de vetor polinucleo- tídico é desprovido de quaisquer sequências de codificação do capsí-

deo viral. Em uma modalidade, os modelos de vetor polinucleotídico e células hospedeiras que são desprovidos de genes da capsídeo de AAV e a proteína resultante também não codificam ou expressam ge- nes da capsídeo de outros vírus. Além disso, em uma modalidade es- pecífica, a molécula de ácido nucleico também é desprovida de se- quências de codificação da proteína Rep AAV.

[00211] Em algumas modalidades, o elemento estrutural da ITR po- de ser qualquer elemento estrutural envolvido na interação funcional da ITR com uma grande proteína Rep (por exemplo, Rep 78 ou Rep 68). Em certas modalidades, o elemento estrutural fornece seletividade para a interação de uma ITR com uma proteína Rep grande, ou seja, determina pelo menos em parte qual proteína Rep interage funcional- mente com a ITR. Em outras modalidades, o elemento estrutural inte- rage fisicamente com uma proteína Rep grande quando a proteína Rep está ligada à ITR. Cada elemento estrutural pode ser, por exem- plo, uma estrutura secundária da ITR, uma sequência de nucleotídeos da ITR, um espaçamento entre dois ou mais elementos ou uma com- binação de qualquer uma das alternativas acima. Em uma modalidade, os elementos estruturais são selecionados a partir do grupo que con- siste em um braço A e A', um braço B e um B', um braço C e C', um braço D, um sítio de ligação a Rep (RBE) e um RBE' (isto é, sequência RBE complementar) e um sítio de resolução terminal (trs).

[00212] Mais especificamente, a ITR pode ser modificada estrutu- ralmente. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos do elemento es- trutural pode ser modificada em comparação com a sequência do tipo selvagem da ITR. Em uma modalidade, o elemento estrutural (por exemplo, braço A, braço A', braço B, braço B', braço C, braço C', braço D, RBE, RBE' e trs) de uma ITR pode ser removido e substituído por um elemento estrutural do tipo selvagem de um parvovírus diferente. Por exemplo, a estrutura de substituição pode ser de AAV1, AAV2,

AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13 parvovírus de serpente (por exemplo, parvovírus píton real), parvovírus bovino, parvovírus de cabra, parvovírus aviário, par- vovírus canino, parvovírus equino, parvovírus de camarão, parvovírus suíno ou AAV de inseto. Por exemplo, a ITR pode ser uma ITR de AAV2 e o braço A ou A' ou RBE pode ser substituído por um elemento estrutural do AAV5. Em outro exemplo, a ITR pode ser uma ITR de AAV5 e os braços C ou C', o RBE e os trs podem ser substituídos por um elemento estrutural do AAV2. Em outro exemplo, a ITR de AAV pode ser uma ITR de AAV5 com os braços B e B' substituídos pelos braços B e B' de ITR de AAV2.

[00213] Apenas a título de exemplo, a Tabela 3 indica modificações exemplificativas de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma de- leção, inserção e/ou substituição) nas regiões de ITRs modificadas, em que X é indicativo de uma modificação de pelo menos um ácido nucleico (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) nessa seção em relação à ITR de tipo selvagem correspondente. Em algu- mas modalidades, qualquer modificação de pelo menos um nucleotí- deo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) em qual- quer uma das regiões de C e/ou C' e/ou B e/ou B' retém três nucleotí- deos T sequenciais (ou seja, TTT) em pelo menos uma alça terminal. Por exemplo, se a modificação resultar em: uma ITR de braço único (por exemplo, um braço C-C' único ou um braço B-B' único), ou um braço C-B' modificado ou um braço C'-B ou uma ITR de dois braços com pelo menos um braço truncado (por exemplo, um braço C-C' trun- cado e/ou braço B-B' truncado), pelo menos o braço único ou pelo me- nos um dos braços de uma ITR de dois braços (em que um braço po- de ser truncado) retém três nucleotídeos T sequenciais (isto é, TTT) em pelo menos uma alça terminal. Em algumas modalidades, um bra- ço C-C' truncado e/ou um braço B-B' truncado tem três nucleotídeos T sequenciais (isto é, TTT) na alça terminal.

[00214] A Tabela 3 descreve combinações exemplificativas de mo- dificações de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) em diferentes regiões ou braços BB' e CC' de ITRs (X indica uma modificação de nucleotídeo, por exemplo, adi- ção, deleção ou substituição de pelo menos um nucleotídeo na regi- ão). TABELA 3: COMBINAÇÕES EXEMPLIFICATIVAS DE MODIFICA-

ÇÕES Região B Região B' Região C Região C'

X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X

[00215] Em algumas modalidades, uma mod-ITR para uso neste documento pode compreender qualquer uma das combinações de modificações mostradas na Tabela 3, e também uma modificação de pelo menos um nucleotídeo em qualquer uma ou mais das regiões se- lecionadas de: entre A' e C, entre C e C', entre C' e B, entre B e B' e entre B' e A. Em algumas modalidades, qualquer modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) nas regiões C ou C' ou B ou B' ainda preserva a alça terminal da haste-alça.

Em algumas modalidades, qualquer modifica- ção de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inser- ção e/ou substituição) entre C e C' e/ou B e B' retém três nucleotídeos T sequenciais (ou seja, TTT) em pelo menos uma alça terminal.

Em modalidades alternativas, qualquer modificação de pelo menos um nu- cleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) entre C e C' e/ou B e B' retém três nucleotídeos A sequenciais (ou seja, AAA) em pelo menos uma alça terminal.

Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso aqui pode compreender qualquer uma das combinações de modificações mostradas na Tabela 3, e também uma modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) em qualquer uma ou mais das re- giões selecionadas de: A', A e/ou D.

Por exemplo, em algumas moda- lidades, uma ITR modificada para uso aqui pode compreender qual- quer uma das combinações de modificações mostradas na Tabela 3, e também uma modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exem- plo, uma deleção, inserção e/ou substituição) na região A.

Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso aqui pode compreender qualquer uma das combinações de modificações mostradas na Tabela 3, e também uma modificação de pelo menos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) na região A'. Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso aqui pode com- preender qualquer uma das combinações de modificações mostradas na Tabela 3, e também uma modificação de pelo menos um nucleotí- deo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substituição) na região A e/ou A'. Em algumas modalidades, uma ITR modificada para uso aqui pode compreender qualquer uma das combinações de modifica- ções mostradas na Tabela 3, e também uma modificação de pelo me- nos um nucleotídeo (por exemplo, uma deleção, inserção e/ou substi-

tuição) na região D.

[00216] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos do ele- mento estrutural pode ser modificada (por exemplo, modificando 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais nucleotídeos ou qualquer faixa no mesmo) para produzir um elemento estrutural modificado. Em uma modalidade, as modificações específi- cas para as ITRs simétricas são exemplificadas neste documento (por exemplo, pares de ITRs modificadas simétricas identificadas na Tabe- la 4.

[00217] Em algumas modalidades, uma ITR pode ser modificada (por exemplo, modificando 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais nucleotídeos ou qualquer faixa no mesmo). Em outras modalidades, a ITR pode ter pelo menos 80%, pe- lo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou mais de iden- tidade de sequência em relação a uma das ITRs modificadas na Tabe- la 4 (por exemplo, ou a seção contendo RBE do braço A-A' e braços C-C' e B-B' de pares modificados simétricos selecionados do grupo que consiste em, por exemplo, SEQ ID NO: 101 e SEQ ID NO: 102; SEQ ID NO: 103 e SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 105 e SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO: 545 e SEQ ID NO: 116; SEQ ID NO: 111 e SEQ ID NO: 112; SEQ ID NO: 117 e SEQ ID NO: 118; SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 120; SEQ ID NO: 121 e SEQ ID NO: 122; SEQ ID NO: 107 e SEQ ID NO: 108; SEQ ID NO: 123 e SEQ ID NO: 124; SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 126; SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 128; SEQ ID NO: 129 e SEQ ID NO: 130; SEQ ID NO: 131 e SEQ ID NO: 132; SEQ ID NO: 133 e SEQ ID NO: 134; SEQ ID NO: 547 e SEQ ID NO: 546.

[00218] Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode, por exemplo, compreender a remoção ou deleção de todo um braço espe- cífico, por exemplo, todo ou parte do braço A-A', ou todo ou parte do braço B-B' ou todo ou parte do braço C-C' ou, alternativamente, a re- moção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases que formam a haste da alça, desde que a alça final que cobre a haste (por exemplo, braço único) ainda esteja presente (por exemplo, consulte ITR-6). Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender a re- moção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases do braço B-B'. Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases do braço C- C'. Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases do braço C-C' e a remoção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases do braço B-B'. Está prevista qualquer combinação de remoção de pares de bases, por exemplo, 6 pares de bases podem ser removidos no braço C-C' e 2 pares de bases no braço B-B'. Como um exemplo ilus- trativo, uma ITR modificada exemplificativa com pelo menos 7 pares de bases deletados de cada porção C e porção C', uma substituição de um nucleotídeo na alça entre a região C e C' e pelo menos uma deleção de pares de bases de cada uma dentre a região B e as regi- ões B', de modo que a ITR modificada compreenda dois braços, em que pelo menos um braço (por exemplo, C-C') é truncado. Em algu- mas modalidades, como a ITR modificada compreende pelo menos uma deleção de par de bases de cada uma da região B e regiões B', o braço B-B' também é truncado em relação à ITR do tipo selvagem.

[00219] Em algumas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases complementares são removidos de cada uma da por- ção C e da porção C' do braço C-C', de modo que o braço C-C' seja truncado. Isto é, se uma base for removida na porção C do braço C-C', o par de bases complementares na porção C' é removido, truncando assim o braço C-C'. Em tais modalidades, 2, 4, 6, 8 ou mais pares de bases são removidos do braço C-C', de modo que o braço C-C' seja truncado. Em modalidades alternativas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases são removidos da porção C do braço C-C', de modo que reste apenas a porção C' do braço. Em modalidades alternativas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases são removidos da por- ção C' do braço C-C', de modo que reste apenas a porção C do braço.

[00220] Em algumas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases complementares são removidos de cada uma da por- ção B e da porção B' do braço B-B', de modo que o braço B-B' seja truncado. Isto é, se uma base for removida na porção B do braço B-B', o par de bases complementares na porção B' é removido, truncando assim o braço B-B'. Em tais modalidades, 2, 4, 6, 8 ou mais pares de bases são removidos do braço B-B', de modo que o braço B-B' seja truncado. Em modalidades alternativas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases são removidos da porção B do braço B-B', de modo que reste apenas a porção B' do braço. Em modalidades alternativas, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais pares de bases são removidos da por- ção B' do braço B-B', de modo que reste apenas a porção B do braço.

[00221] Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode ter entre 1 e 50 (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50) de- leções de nucleotídeos em relação a uma sequência de ITR de tipo selvagem de comprimento total. Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode ter entre 1 e 30 deleções de nucleotídeos em relação a uma sequência de ITR de tipo selvagem de comprimento total. Em algumas modalidades, uma ITR modificada tem entre 2 e 20 deleções de nucleotídeos em relação a uma sequência de ITR de tipo selvagem de comprimento total.

[00222] Em algumas modalidades, uma ITR modificada forma duas haste-alça opostas e simétricas no sentido do comprimento, por exemplo, a alça C-C' tem um comprimento diferente para a alça B-B'. Em algumas modalidades, uma das hastes-alças opostas simétricas no sentido do comprimento de uma ITR modificada tem uma porção de haste C-C' e/ou B-B' na faixa de 8 a 10 pares de bases de comprimen- to e uma porção de alça (por exemplo, entre C-C' ou entre B-B') tendo 2 a 5 desoxirribonucleotídeos desemparelhados. Em algumas modali- dades, uma haste-alça simétrica no sentido do comprimento de uma ITR modificada tem uma porção de haste CC' e/ou BB' de menos de 8, ou menos de 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 pares de bases de comprimento e uma porção de alça (por exemplo, entre C-C' ou entre B-B') tendo entre 0 a 5 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma ITR modificada com uma haste-alça assimétrica no sentido do comprimento tem uma por- ção da haste C-C' e/ou B-B' menor que 3 pares de bases de compri- mento.

[00223] Em algumas modalidades, uma ITR modificada não contém deleções nucleotídicas na porção que contém RBE das regiões A ou A', de modo a não interferir na replicação do DNA (por exemplo, liga- ção a um RBE pela proteína Rep ou corte em um sítio de resolução terminal). Em algumas modalidades, uma ITR modificada abrangida para uso aqui tem uma ou mais deleções nas regiões B, B', C e/ou C, conforme descrito aqui. Vários exemplos não limitativos de ITRS modi- ficadas são mostrados nas Figuras 6B a 21B.

[00224] Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode com- preender uma deleção do braço B-B', de modo que o braço C-C' per- maneça, por exemplo, ver ITR-33 (esquerda) e ITR-18 (direita) exem- plificativas mostradas nas Figuras 7A e 7B, ou ITR-35 (esquerda) e ITR-19 (direita) (Figuras 9A e 9B). Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender uma deleção do braço C-C', de modo que o braço B-B' permaneça, por exemplo, ver ITR-34 (esquer- da) e ITR-51 (direita) exemplificativas mostradas nas Figuras 8A a 8B.

Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender uma deleção do braço B-B' e do braço C-C', de modo que uma única haste-alça permaneça, por exemplo, ver ITR-37 (esquerda) e ITR-21 (direita) exemplificativas mostradas nas Figuras 11A a 11B. Em algu- mas modalidades, uma ITR modificada pode compreender uma dele- ção da região C', de modo que uma alça C truncada e braço B-B' per- maneçam, por exemplo, ver ITR-36 (esquerda) e ITR-20 (direita) exemplificativas mostradas nas Figuras 10A a 10B; ITR-42 (esquerda) e ITR-26 (direita) (Figuras 16A a 16B); ITR-43 (esquerda) e ITR-27 (direita) (Figuras 17A a 17B); ITR-44 (esquerda) e ITR-28 (direita) (Figuras 18A a 18B); ITR-45 (esquerda) e ITR-29 (direita) (Figuras 19A a 19B); ITR-46 (esquerda) e ITR-23 (direita) (Figuras 20A a 20B); ITR-47 (esquerda) e ITR-31 (direita) (Figuras 21A a 21B); ITR-48 (es- querda) e ITR-32 (direita) (Figuras 22A a 22B). Da mesma forma, em algumas modalidades, uma ITR modificada pode compreender uma deleção da região B, de modo que uma alça B truncada e um braço C- C' permaneçam, por exemplo, ver ITR-38 (esquerda) e ITR-22 (direita) exemplificativas mostradas nas Figuras 12A a 12B; ITR-39 (esquerda) e ITR-23 (direita) (Figuras 13A a 13B); ITR-40 (esquerda) e ITR-24 (direita) (Figuras 14A a 14B) e ITR-41 (esquerda) e ITR-25 (direita) (Figuras 15A a 15B).

[00225] Em algumas modalidades, uma ITR modificada pode com- preender uma deleção de pares de bases em qualquer uma ou mais dentre: a porção C, a porção C', a porção B ou a porção B', de modo que o emparelhamento de base complementar ocorra entre as porções C-B' e as porções C'-B para produzir um único braço, por exemplo, ver ITR-10 (direita) e ITR-10 (esquerda).

[00226] Em algumas modalidades, além de uma modificação em um ou mais nucleotídeos nas regiões C, C', B e/ou B', uma ITR modifi- cada para uso neste documento pode compreender uma modificação

(por exemplo, deleção, substituição ou adição) de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 nucleotídeos em qualquer uma ou mais das regiões seleciona- das de: entre A' e C, entre C e C', entre C' e B, entre B e B' e entre B' e A. Por exemplo, o nucleotídeo entre B' e C em uma ITR direita modifi- cada pode ser substituído de uma A em uma G, C ou A ou deletado ou um ou mais nucleotídeos adicionados; um nucleotídeo entre C' e B em uma ITR esquerda modificada pode ser alterado de uma T em uma G, C ou A, ou deletado ou um ou mais nucleotídeos adicionados.

[00227] Em certas modalidades da presente invenção, o vetor de ceDNA não possui uma ITR modificada que consiste na sequência de nucleotídeos selecionada de qualquer uma das seguintes: SEQ ID NOs: 550 a 557. Em certas modalidades da presente invenção, o vetor de ceDNA não possui uma ITR modificada que compreende a sequên- cia de nucleotídeos selecionada de qualquer uma das seguintes: SEQ ID NOs: 550 a 557.

[00228] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende um interruptor regulador como aqui divulgado e uma ITR modificada selecionada tendo a sequência de nucleotídeos selecionada de qual- quer uma do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 550 a 557.

[00229] Em outra modalidade, a estrutura do elemento estrutural pode ser modificada. Por exemplo, o elemento estrutural muda a altura da haste e/ou o número de nucleotídeos na alça. Por exemplo, a altura da haste pode ser de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 nucleotídeos ou mais ou qualquer faixa nos mesmos. Em uma modalidade, a altura de haste pode ser de cerca de 5 nucleotídeos a cerca de 9 nucleotídeos e interage funcionalmente com Rep. Em outra modalidade, a altura da haste pode ser de cerca de 7 nucleotídeos e interage funcionalmente com Rep. Em outro exemplo, a alça pode ter 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos ou mais ou qualquer faixa nos mesmos.

[00230] Em outra modalidade, o número de sítios de ligação ao

GAGY ou sítios de ligação relacionados ao GAGY no RBE ou no RBE estendido pode ser aumentado ou diminuído. Em um exemplo, o RBE ou RBE estendido pode compreender 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais sítios de ligação ao GAGY ou qualquer faixa no mesmo. Cada sítio de liga- ção ao GAGY pode ser independentemente uma sequência exata do GAGY ou uma sequência semelhante ao GAGY, desde que a sequên- cia seja suficiente para ligar uma proteína Rep.

[00231] Em outra modalidade, o espaçamento entre dois elementos (como, sem limitação a, o RBE e um grampo) pode ser alterado (por exemplo, aumentado ou diminuído) para alterar a interação funcional com uma grande proteína Rep. Por exemplo, o espaçamento pode ser de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos ou mais ou qualquer faixa nos mesmos.

[00232] A Tabela 4 mostra pares de ITRs modificadas simétricas exemplificativas (ou seja, uma ITR modificada esquerda e a ITR modificada direita simétrica). A porção em negrito (vermelha) das sequências identifica sequências de ITR parciais (isto é, sequências de alças A-A', C-C' e B-B'), também mostradas nas Figuras 7A a 22B. Essas ITRs modificadas exemplificativas podem compreender o RBE de GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531), espaçador de ACTGAGGC (SEQ ID NO: 532), o complemento de espaçador GCCTCAGT (SEQ ID NO: 535) e RBE' (isto é, complemento ao RBE) de GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 536).

TABELA 4: PARES DE ITRS MODIFICADAS SIMÉTRICAS EXEM-

PLIFICATIVOS ITR modificada ESQUERDA ITR modificada DIREITA simétrica (ITR 5' modificada) (ITR 3' modificada) SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 484 (ITR-33 GCGCGCTCGCTCG 469 (ITR-18, GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

CCCGGGAAACCCG CGCTCGCTCGCTC GGCGTGCGCCTCA ACTGAGGCGCACG GTGAGCGAGCGAG CCCGGGTTTCCCG CGCGCAGAGAGGG GGCGGCCTCAGTG AGTGGCCAACTCC AGCGAGCGAGCGC ATCACTAGGGGTTC GCAGCTGCCTGCA

CT GG SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 485 (ITR-34 GCGCGCTCGCTCG 95 (ITR-51, GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

TCGGGCGACCTTT CGCTCGCTCGCTC GGTCGCCCGGCCT ACTGAGGCCGGGC CAGTGAGCGAGCG GACCAAAGGTCGC AGCGCGCAGAGAG CCGACGGCCTCAG GGAGTGGCCAACT TGAGCGAGCGAGC CCATCACTAGGGG GCGCAGCTGCCTG

TTCCT CAGG SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 486 (ITR-35 GCGCGCTCGCTCG 470 (ITR-19, GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

CCCGGGCAAAGCC CGCTCGCTCGCTC CGGGCGTCGGCCT ACTGAGGCCGACG CAGTGAGCGAGCG CCCGGGCTTTGCC AGCGCGCAGAGAG CGGGCGGCCTCAG GGAGTGGCCAACT TGAGCGAGCGAGC CCATCACTAGGGG GCGCAGCTGCCTG TTCCT CAGG

ITR modificada ESQUERDA ITR modificada DIREITA simétrica (ITR 5' modificada) (ITR 3' modificada) SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 487 (ITR-36 GCGCGCTCGCTCG 471 (ITR-20, GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCGC direita) ACTCCCTCTCTGCG

CCGGGCGTCGGGC CGCTCGCTCGCTC GACCTTTGGTCGC ACTGAGGCCGGGC CCGGCCTCAGTGA GACCAAAGGTCGC GCGAGCGAGCGC CCGACGCCCGGGC GCAGAGAGGGAGT GCCTCAGTGAGCG GGCCAACTCCATC AGCGAGCGCGCAG

ACTAGGGGTTCCT CTGCCTGCAGG SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 488 (ITR-37 GCGCGCTCGCTCG 472 (ITR-21, GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCAA direita) ACTCCCTCTCTGCG

AGCCTCAGTGAGC CGCTCGCTCGCTC GAGCGAGCGCGCA ACTGAGGCTTTGC GAGAGGGAGTGGC CTCAGTGAGCGAG CAACTCCATCACTA CGAGCGCGCAGCT

GGGGTTCCT GCCTGCAGG SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 489 (ITR-38 GCGCGCTCGCTCG 473 (ITR-22 GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

CCCGGGCAAAGCC CGCTCGCTCGCTC CGGGCGTCGGGCG ACTGAGGCCGGGC ACTTTGTCGCCCG GACAAAGTCGCCC GCCTCAGTGAGCG GACGCCCGGGCTT AGCGAGCGCGCAG TGCCCGGGCGGCC AGAGGGAGTGGCC TCAGTGAGCGAGC AACTCCATCACTAG GAGCGCGCAGCTG GGGTTCCT CCTGCAGG

ITR modificada ESQUERDA ITR modificada DIREITA simétrica (ITR 5' modificada) (ITR 3' modificada) SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 490 (ITR-39 GCGCGCTCGCTCG 474 (ITR-23, GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

CCCGGGCAAAGCC CGCTCGCTCGCTC CGGGCGTCGGGCG ACTGAGGCCGGGC ATTTTCGCCCGGC GAAAATCGCCCGA CTCAGTGAGCGAG CGCCCGGGCTTTG CGAGCGCGCAGAG CCCGGGCGGCCTC AGGGAGTGGCCAA AGTGAGCGAGCGA CTCCATCACTAGG GCGCGCAGCTGCC

GGTTCCT TGCAGG SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 491 (ITR-40 GCGCGCTCGCTCG 475 (ITR-24, GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

CCCGGGCAAAGCC CGCTCGCTCGCTC CGGGCGTCGGGCG ACTGAGGCCGGGC TTTCGCCCGGCCT GAAACGCCCGACG CAGTGAGCGAGCG CCCGGGCTTTGCC AGCGCGCAGAGAG CGGGCGGCCTCAG GGAGTGGCCAACT TGAGCGAGCGAGC CCATCACTAGGGG GCGCAGCTGCCTG

TTCCT CAGG SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 492 (ITR-41 GCGCGCTCGCTCG 476 (ITR-25 GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

CCCGGGCAAAGCC CGCTCGCTCGCTC CGGGCGTCGGGCT ACTGAGGCCGGGC TTGCCCGGCCTCA AAAGCCCGACGCC GTGAGCGAGCGAG CGGGCTTTGCCCG CGCGCAGAGAGGG GGCGGCCTCAGTG AGTGGCCAACTCC AGCGAGCGAGCGC ATCACTAGGGGTTC GCAGCTGCCTGCA CT GG

ITR modificada ESQUERDA ITR modificada DIREITA simétrica (ITR 5' modificada) (ITR 3' modificada) SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 493 (ITR-42 GCGCGCTCGCTCG 477 (ITR-26 GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

CCCGGGAAACCCG CGCTCGCTCGCTC GGCGTCGGGCGAC ACTGAGGCCGGGC CTTTGGTCGCCCG GACCAAAGGTCGC GCCTCAGTGAGCG CCGACGCCCGGGT AGCGAGCGCGCAG TTCCCGGGCGGCC AGAGGGAGTGGCC TCAGTGAGCGAGC AACTCCATCACTAG GAGCGCGCAGCTG

GGGTTCCT CCTGCAGG SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 494 (ITR-43 GCGCGCTCGCTCG 478 (ITR-27 GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

CCCGGAAACCGGG CGCTCGCTCGCTC CGTCGGGCGACCT ACTGAGGCCGGGC TTGGTCGCCCGGC GACCAAAGGTCGC CTCAGTGAGCGAG CCGACGCCCGGTT CGAGCGCGCAGAG TCCGGGCGGCCTC AGGGAGTGGCCAA AGTGAGCGAGCGA CTCCATCACTAGG GCGCGCAGCTGCC

GGTTCCT TGCAGG SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 495 (ITR-44 GCGCGCTCGCTCG 479 (ITR-28 GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

CCCGAAACGGGCG CGCTCGCTCGCTC TCGGGCGACCTTT ACTGAGGCCGGGC GGTCGCCCGGCCT GACCAAAGGTCGC CAGTGAGCGAGCG CCGACGCCCGTTT AGCGCGCAGAGAG CGGGCGGCCTCAG GGAGTGGCCAACT TGAGCGAGCGAGC CCATCACTAGGGG GCGCAGCTGCCTG TTCCT CAGG

ITR modificada ESQUERDA ITR modificada DIREITA simétrica (ITR 5' modificada) (ITR 3' modificada) SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 496 (ITR-45 GCGCGCTCGCTCG 480 (ITR-29, GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

CCCAAAGGGCGTC CGCTCGCTCGCTC GGGCGACCTTTGG ACTGAGGCCGGGC TCGCCCGGCCTCA GACCAAAGGTCGC GTGAGCGAGCGAG CCGACGCCCTTTG CGCGCAGAGAGGG GGCGGCCTCAGTG AGTGGCCAACTCC AGCGAGCGAGCGC ATCACTAGGGGTTC GCAGCTGCCTGCA

CT GG SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 497 (ITR-46 GCGCGCTCGCTCG 481 (ITR-30, GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

CCAAAGGCGTCGG CGCTCGCTCGCTC GCGACCTTTGGTC ACTGAGGCCGGGC GCCCGGCCTCAGT GACCAAAGGTCGC GAGCGAGCGAGC CCGACGCCTTTGG GCGCAGAGAGGGA CGGCCTCAGTGAG GTGGCCAACTCCA CGAGCGAGCGCGC TCACTAGGGGTTC AGCTGCCTGCAGG

CT SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 498 (ITR-47, GCGCGCTCGCTCG 482 (ITR-31, GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

CAAAGCGTCGGGC CGCTCGCTCGCTC GACCTTTGGTCGC ACTGAGGCCGGGC CCGGCCTCAGTGA GACCAAAGGTCGC GCGAGCGAGCGC CCGACGCTTTGCG GCAGAGAGGGAGT GCCTCAGTGAGCG GGCCAACTCCATC AGCGAGCGCGCAG ACTAGGGGTTCCT CTGCCTGCAGG

ITR modificada ESQUERDA ITR modificada DIREITA simétrica (ITR 5' modificada) (ITR 3' modificada) SEQ ID NO: CCTGCAGGCAGCT SEQ ID NO: AGGAACCCCTAGT 499 (ITR-48, GCGCGCTCGCTCG 483 (ITR-32 GATGGAGTTGGCC esquerda) CTCACTGAGGCCG direita) ACTCCCTCTCTGCG

AAACGTCGGGCGA CGCTCGCTCGCTC CCTTTGGTCGCCC ACTGAGGCCGGGC GGCCTCAGTGAGC GACCAAAGGTCGC GAGCGAGCGCGCA CCGACGTTTCGGC GAGAGGGAGTGGC CTCAGTGAGCGAG CAACTCCATCACTA CGAGCGCGCAGCT GGGGTTCCT GCCTGCAGG

[00233] Em modalidades da presente invenção, o vetor ceDNA di- vulgado neste documento não tem ITRs modificadas com a sequência de nucleotídeos selecionada a partir de qualquer uma do grupo de SEQ ID NOS: 550, 551, 552, 553, 553, 554, 555, 556 e 557. IV. ELEMENTOS REGULADORES

[00234] Os vetores de ceDNA podem ser produzidos a partir de construtos de expressão que compreendem ainda uma combinação específica de elementos cis reguladores. Os elementos cis- reguladores incluem, mas não estão limitados a um promotor, um in- terruptor de ribossomo, um isolador, um elemento mir-regulável, um elemento regulador pós-transcricional, um promotor específico de tipo de tecido e célula e um intensificador. Em algumas modalidades, a ITR pode atuar como o promotor para o transgene. Em algumas modalida- des, o vetor de ceDNA compreende componentes adicionais para re- gular a expressão do transgene, por exemplo, chaves reguladoras, como descrito no presente documento, para regular a expressão do transgene, ou um interruptor de exterminação, que pode exterminar uma célula que compreende o vetor de ceDNA.

[00235] Os vetores de ceDNA podem ser produzidos a partir de construtos de expressão que compreendem ainda uma combinação específica de elementos cis reguladores, como o elemento regulador pós-transcricional WHP (WPRE) (por exemplo, SEQ ID NO: 8) e poliA BGH (SEQ ID NO: 9). Cassetes de expressão adequados para uso em construtos de expressão não são limitados pela restrição de embala- gem imposta pelo capsídeo viral.

[00236] Promotores: Cassetes de expressão da presente invenção incluem um promotor, que pode influenciar os níveis gerais de expres- são, bem como a especificidade celular. Para expressão do transgene, os mesmos podem incluir um promotor precoce imediato derivado de vírus altamente ativo. Os cassetes de expressão podem conter promo- tores eucarióticos específicos de tecido para limitar a expressão de transgene a tipos celulares específicos e reduzir efeitos tóxicos e res- postas imunológicas resultantes de expressão ectópica não regula- mentada.

[00237] Promotores adequados, incluindo os descritos acima, po- dem ser derivados de vírus e, portanto, podem ser ditos como promo- tores virais, ou podem ser derivados de qualquer organismo, incluindo organismos procarióticos ou eucarióticos. Promotores adequados po- dem ser usados para direcionar a expressão por qualquer RNA poli- merase (por exemplo, pol I, pol II, pol III). Promotores exemplificativos incluem, mas não estão limitados ao promotor inicial SV40, promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus do tumor mamário de ca- mundongo; principal promotor tardio de adenovírus (Ad MLP); um promotor do vírus do herpes simplex (HSV), um promotor do citomega- lovírus (CMV), como a região promotora precoce imediata do CMV (CMVIE), um promotor do vírus do sarcoma rous (RSV), um pequeno promotor nuclear U6 humano (U6, por exemplo, SEQ ID NO: 18) (Mi- yagishi et al., Nature Biotechnolog y 20, 497 a 500 (2002)), um promo- tor U6 aprimorado (por exemplo, Xia et al., Nucleic Acids Res. 1 de setembro de 2003; 31 (17)), um promotor H1 humano (H1) (por exem- plo, SEQ ID NO: 19), um promotor CAG, um promotor humano alfa 1-

antitipsina (hAAT) (por exemplo, SEQ ID NO: 21) e semelhantes. Em modalidades, esses promotores são alterados em sua extremidade contendo íntron a jusante para incluir um ou mais sítios de clivagem de nuclease. Em modalidades, o DNA contendo o(s) sítio(s) de clivagem da nuclease é estranho ao DNA do promotor.

[00238] De acordo com algumas modalidades, um promotor pode compreender uma ou mais sequências reguladoras transcricionais es- pecíficas para aumentar ainda mais a expressão e/ou alterar a expres- são espacial e/ou a expressão temporal das mesmas. Um promotor também pode compreender intensificador distal ou elementos repres- sores, que podem estar localizados em até vários milhares de pares de bases a partir do sítio de início da transcrição. Um promotor pode ser derivado de fontes incluindo vírus, bactérias, fungos, plantas, inse- tos e animais. Um promotor pode regular a expressão de um compo- nente do gene constitutivamente, ou diferencialmente em relação à célula, tecido ou órgão em que ocorre a expressão ou, em relação ao estágio de desenvolvimento em que ocorre a expressão, ou em res- posta a estímulos externos, como estresses fisiológicos, patógenos, íons metálicos ou agentes indutores. Exemplos representativos de promotores incluem o promotor do bacteriófago T7, promotor do bacte- riófago T3, promotor SP6, operador-promotor lac, promotor tac, promo- tor tardio SV40, promotor SV40 precoce, promotor RSV-LTR, promotor CMV IE, promotor precoce SV40 ou promotor tardio SV40 e o promo- tor CMV IE, bem como os promotores listados abaixo. Esses promoto- res e/ou intensificadores podem ser usados para a expressão de qual- quer gene de interesse, por exemplo, as moléculas de edição de ge- nes, sequência doadora, proteínas terapêuticas, etc.). Por exemplo, o vetor pode compreender um promotor que está operacionalmente liga- do à sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína terapêu- tica. O promotor operacionalmente ligado à sequência de codificação da proteína terapêutica pode ser um promotor do vírus símio 40 (SV40), um promotor do vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV), um promotor do vírus da imunodeficiência humana (HIV), como o promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus da imuno- deficiência bovina (BIV), um promotor de vírus Moloney, um promotor de vírus de leucose aviária (ALV), um promotor de citomegalovírus (CMV), como o promotor precoce imediato de CMV, promotor de vírus Epstein Barr (EBV) ou um promotor do vírus de sarcoma de Rous (RSV). O promotor também pode ser um promotor de um gene huma- no, como ubiquitina C humana (hUbC), actina humana, miosina huma- na, hemoglobina humana, creatina muscular humana ou metalotioneí- na humana. O promotor também pode ser um promotor específico de tecido, tal como um promotor específico de fígado, tal como alfa 1- antitipsina humana (hAAT), natural ou sintética. Em uma modalidade, a entrega ao fígado pode ser alcançada usando o direcionamento es- pecífico de ApoE endógeno da composição que compreende um vetor de ceDNA para hepatócitos através do receptor de lipoproteína de bai- xa densidade (LDL) presente na superfície do hepatócito.

[00239] Em uma modalidade, o promotor utilizado é o promotor na- tivo do gene que codifica a proteína terapêutica. Os promotores e ou- tras sequências reguladoras para os respectivos genes que codificam as proteínas terapêuticas são conhecidos e foram caracterizados. A região promotora usada pode incluir ainda uma ou mais sequências reguladoras adicionais (por exemplo, nativas), por exemplo, intensifi- cadores (por exemplo, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23).

[00240] Exemplos não limitativos de promotores adequados para uso de acordo com a presente invenção incluem o promotor CAG de, por exemplo (SEQ ID NO: 3), o promotor hAAT (SEQ ID NO: 21), o promotor humano EF1-α (SEQ ID NO: 6) ou um fragmento do promo- tor EF1a (SEQ ID NO: 15), promotor IE2 (por exemplo, SEQ ID NO:

20) e o promotor EF1-α de rato (SEQ ID NO: 24).

[00241] De acordo com algumas modalidades, um cassete de ex- pressão pode conter um elemento regulador sintético, como um pro- motor CAG (SEQ ID NO: 3). O promotor CAG compreende (i) o ele- mento potencializador precoce do citomegalovírus (CMV), (ii) o promo- tor, o primeiro éxon e o primeiro íntron do gene da beta-actina de fran- go e (iii) o aceitador de splice do gene da beta-globina de coelho. Al- ternativamente, um cassete de expressão pode conter um promotor hAAT (SEQ ID NO: 21), promotor alfa-1-antitripsina (AAT) (SEQ ID NO: 4 ou SEQ ID NO: 74), um promotor específico do fígado (LP1) (SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 16), um promotor do fator de alonga- mento-1 alfa humano (EF1α), ou um fragmento do mesmo, (por exem- plo, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 15), um promotor EF1α de rato (SEQ ID NO: 24) ou um promotor IE2 (SEQ ID NO: 20). Em algumas modalidades, o cassete de expressão inclui um ou mais promotores constitutivos, por exemplo, um promotor LTR retroviral do vírus do sar- coma Rous (RSV) (opcionalmente com o intensificador de RSV) ou um promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV) (opcionalmente com o intensificador de CMV, por exemplo, SEQ ID NO: 22). Alternati- vamente, pode ser usado um promotor induzível, um promotor nativo para um transgene, um promotor específico de tecido ou vários promo- tores conhecidos na técnica.

[00242] Sequências de Poliadenilação: Uma sequência que codifica uma sequência de poliadenilação pode ser incluída no vetor de ceDNA para estabilizar o mRNA expresso a partir do vetor de ceDNA e para auxiliar na exportação e tradução nuclear. Em uma modalidade, o ve- tor de ceDNA não inclui uma sequência de poliadenilação. Em outras modalidades, o vetor inclui pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo me- nos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos

45, pelo menos 50 ou mais dinucleotídeos de adenina. Em algumas modalidades, a sequência de poliadenilação compreende cerca de 43 nucleotídeos, cerca de 40 a 50 nucleotídeos, cerca de 40 a 55 nucleo- tídeos, cerca de 45 a 50 nucleotídeos, cerca de 35 a 50 nucleotídeos, ou qualquer faixa entre eles.

[00243] Os cassetes de expressão podem incluir uma sequência de poliadenilação conhecida na técnica ou uma variação da mesma, co- mo uma sequência de ocorrência natural isolada de BGHpA bovino (por exemplo, SEQ ID NO: 74) ou um vírus SV40pA (por exemplo, SEQ ID NO: 10) ou uma sequência sintética (por exemplo, SEQ ID NO: 27). Alguns cassetes de expressão também podem incluir a se- quência de intensificador de sinal tardio poliA SV40 a montante (USE). Em algumas modalidades, o USE pode ser usado em combinação com SV40pA ou sinal poli-A heterólogo.

[00244] Os cassetes de expressão também podem incluir um ele- mento pós-transcricional para aumentar a expressão de um transgene. Em algumas modalidades, o elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite (WPRE) da marmota (WHP) (por exemplo, SEQ ID NO: 8) é usado para aumentar a expressão de um transgene. Podem ser utilizados outros elementos de processamento pós-transcricionais, como o elemento pós-transcricional do gene da timidina-quinase do vírus do herpes simplex ou o vírus da hepatite B (HBV). Sequências secretoras podem ser ligadas aos transgenes, por exemplo, sequên- cias VH-02 e VK-A26, por exemplo, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26.

[00245] Em uma modalidade, as células hospedeiras não expres- sam proteínas do capsídeo viral e o modelo de vetor polinucleotídico é desprovido de quaisquer sequências de codificação do capsídeo viral. Em uma modalidade, o modelo de vetor polinucleotídico é desprovido de genes de capsídeo de AAV, mas também de genes de capsídeo de outros vírus). Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico tam-

bém é desprovida de sequências de codificação da proteína Rep de AAV. Consequentemente, em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico da invenção é desprovida de ambos os genes cap de AAV e rep de AAV funcionais. V. INTERRUPTORES REGULADORES

[00246] Um interruptor regulador molecular é aquele que gera uma mudança mensurável de estado em resposta a um sinal. Tais interrup- tores reguladores podem ser utilmente combinados com os vetores ceDNA aqui descritos para controlar a saída do vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende um interruptor regulador que serve para ajustar a expressão do transgene. Por exemplo, o mesmo pode servir como uma função de biocontenção do vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, o interruptor é um interrup- tor "LIGADO/DESLIGADO" que é projetado para iniciar ou parar (isto é, desativar) a expressão do gene de interesse no ceDNA de uma ma- neira controlável e regulável. Em algumas modalidades, o interruptor pode incluir um "interruptor de extermínio" que pode instruir a célula que compreende o vetor de ceDNA a sofrer morte programada por cé- lula uma vez que o interruptor é ativado. A. INTERRUPTORES REGULADORES BINÁRIOS

[00247] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende um interruptor regulador que pode servir para modular controladamen- te a expressão do transgene. Em tal modalidade, o cassete de expres- são localizado entre as ITRs do vetor de ceDNA pode compreender adicionalmente uma região reguladora, por exemplo, um promotor, elemento cis, repressor, intensificador, etc., que está operacionalmen- te ligado ao gene de interesse, em que a região reguladora é regulada por um ou mais cofatores ou agentes exógenos. Consequentemente, em uma modalidade, apenas quando um ou mais cofatores ou agentes exógenos estão presentes na célula ocorrerá a transcrição e a expres-

são do gene de interesse do vetor de ceDNA. Em outra modalidade, um ou mais cofatores ou agentes exógenos podem ser usados para reprimir a transcrição e expressão do gene de interesse.

[00248] Quaisquer regiões reguladoras de ácido nucleico conheci- das por um versado na técnica podem ser empregadas em um vetor ceDNA projetado para incluir um interruptor regulador. Apenas a título de exemplo, as regiões reguladoras podem ser moduladas por inter- ruptores de pequenas moléculas ou promotores induzíveis ou repres- síveis. Exemplos não limitativos de promotores induzíveis são promo- tores induzíveis a hormônios ou induzíveis a metais. Outros elementos promotores/intensificadores indutíveis exemplificativos incluem, mas não estão limitados a um promotor induzível por RU486, um promotor induzível por ecdisona, um promotor induzível por rapamicina e um promotor de metalotioneína. Os interruptores clássicos à base de te- traciclina ou outros à base de antibióticos são incluídos para uso, inclu- indo aqueles divulgados em (Fussenegger et al., Nature Biotechnol. 18: 1.203 a 1.208 (2000)). B. INTERRUPTORES REGULADORES DE MOLÉCULAS PEQUE-

NAS

[00249] Uma variedade de interruptores reguladores à base de mo- léculas pequenas conhecidos na técnica é conhecida na técnica e po- de ser combinada com os vetores de ceDNA aqui divulgados para formar um vetor de ceDNA controlado por interruptor regulador. Em algumas modalidades, o interruptor regulador pode ser selecionado a partir de qualquer um ou uma combinação de: um par ligante ortogo- nal/receptor nuclear, por exemplo, variante do receptor retinoi- de/LG335 e GRQCIMFI, juntamente com um promotor artificial que controla a expressão do transgene operacionalmente ligado, como o divulgado em Taylor et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15; recepto- res de esteroides geneticamente modificados, por exemplo, receptor de progesterona modificado com um truncamento terminal C que não pode se ligar à progesterona, mas se liga ao RU486 (mifepristona) (Patente nº U.S. 5.364.791); um receptor de ecdisona de Drosophila e os seus ligantes de ecdiesteroide (Saez, et al., PNAS, 97 (26) (2000),

14.512 a 14.517; ou um interruptor controlado pelo antibiótico trimeto- prima (TMP), tal como divulgado em Sando R, 3ª; Nat Methods. 2013, 10(11): 1.085 a 1.088.

[00250] Outros interruptores reguladores baseados em moléculas pequenas, conhecidos por um versado na técnica, também são previs- tos para uso para controlar a expressão do transgene do ceDNA e in- cluem, mas não estão limitados a, aqueles divulgados em Buskirk et al., Cell; Chem and Biol., 2005; 12(2); 151 a 161; um interruptor LIGA- DO sensível ao ácido abscísico; tal como o divulgado em Liang, F.-S., et al., (2011) Science Signaling, 4(164); interruptores LIGADOS exó- genos sensíveis à L-arginina, como os divulgados em Hartenbach, et al. Nucleic Acids Research, 35(20), 2007, interruptores LIGADOS sin- téticos sensíveis a ácidos biliares, como os divulgados em Rössger et al., Metab Eng. 2014,21: 81 a 90; interruptores LIGADOS sensíveis à biotina, como os divulgados em Weber et al., Metab. Eng. Março de 2009; 11(2): 117 a 124; interruptores reguladores sensíveis ao benzoa- to/vanilina de aditivo alimentar de entrada dupla, como os divulgados em Xie et al., Nucleic Acids Research, 2014; 42(14); e116; interrupto- res sensíveis ao 4-hidroxitamoxifeno, como os divulgados em Giusep- pe et al., Molecular Therapy, 6 (5), 653 a 663; e interruptores regulado- res sensíveis a flavinoides (floretina), tais como aqueles divulgados em Gitzinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 30 de junho de 2009; 106(26): 10.638 a 10.643.

[00251] Em algumas modalidades, o interruptor regulador para con- trolar o transgene ou expresso pelo vetor de ceDNA é um interruptor de ativação pró-fármaco, como o divulgado nas patentes U.S.

8.771.679 e 6.339.070.

[00252] Interruptores reguladores exemplificativos para uso nos ve- tores de ceDNA incluem, mas não estão limitados àqueles na Tabela

5. C. INTERRUPTORES REGULADORES DE "CÓDIGO DE ACESSO"

[00253] Em algumas modalidades, o interruptor regulador pode ser um "interruptor de código de acesso" ou "circuito de código de aces- so". Os interruptores de código de acesso permitem o ajuste fino do controle da expressão do transgene a partir do vetor de ceDNA quan- do ocorrem condições específicas – isto é, uma combinação de condi- ções precisa estar presente para a expressão e/ou repressão do transgene. Por exemplo, para a expressão de um transgene ocorrer, pelo menos as condições A e B devem ocorrer. Um interruptor regula- dor de código de acesso pode ser qualquer número de condições, por exemplo, pelo menos 2, ou pelo menos 3, ou pelo menos 4, ou pelo menos 5, ou pelo menos 6 ou pelo menos 7 ou mais condições pre- sentes na expressão do transgene para ocorrer. Em algumas modali- dades, pelo menos 2 condições (por exemplo, condições A, B) preci- sam ocorrer e em algumas modalidades, pelo menos 3 condições pre- cisam ocorrer (por exemplo, A, B e C, ou A, B e D). Apenas a título de exemplo, para que ocorra a expressão gênica de um ceDNA que pos- sua um interruptor regulador "ABC" de código de acesso, as condições A, B e C devem estar presentes. As condições A, B e C podem ser as seguintes; a condição A é a presença de uma condição ou doença, a condição B é uma resposta hormonal e a condição C é uma resposta à expressão do transgene. Apenas como um exemplo exemplificativo, se o transgene for insulina, a Condição A ocorre se o indivíduo tem diabe- tes, a Condição B é se o nível de açúcar no sangue é alto e a Condi- ção C é o nível de insulina endógena que não está sendo expressa nas quantidades necessárias. Uma vez que o nível de açúcar diminui ou o nível desejado de insulina é alcançado, o transgene (por exem- plo, insulina) desliga novamente até que as 3 condições ocorram, li- gando-o novamente. Em outro exemplo exemplificativo, se o transgene é EPO, a Condição A é a presença de Doença Renal Crônica (DRC), a Condição B ocorre se o indivíduo tiver condições hipóxicas nos rins, a Condição C é que o recrutamento de células produtoras de eritropoie- tina (CEP) nos rins está comprometido; ou, alternativamente, a ativa- ção do HIF-2 é prejudicada. Quando os níveis de oxigênio aumentam ou o nível desejado de EPO é alcançado, o transgene (por exemplo, EPO) desliga novamente até que ocorram 3 condições, ligando-o no- vamente.

[00254] Os interruptores reguladores de código de acesso são úteis para ajustar a expressão do transgene a partir do vetor de ceDNA. Por exemplo, o interruptor regulador de código de acesso pode ser modu- lar no sentido de que compreende vários interruptores, por exemplo, um promotor induzível específico de tecido que é ativado apenas na presença de um certo nível de um metabólito. Em tal modalidade, para que a expressão do transgene a partir do vetor de ceDNA ocorra, o agente indutível deve estar presente (condição A), no tipo de célula desejado (condição B) e o metabólito está em, ou acima ou abaixo de um certo limite (condição C). Em modalidades alternativas, o interrup- tor regulador de código de acesso pode ser projetado de modo que a expressão do transgene esteja ligada quando as condições A e B esti- verem presentes, mas desligará quando a condição C estiver presen- te. Tal modalidade é útil quando a Condição C ocorre como um resul- tado direto do transgene expresso - isto é, a Condição C serve como um feedback positivo para a alça para desligar a expressão do trans- gene do vetor de ceDNA quando o transgene teve uma quantidade suficiente do efeito do agente terapêutico desejado.

[00255] Em algumas modalidades, um interruptor regulador de có-

digo de acesso englobado para uso no vetor de ceDNA é divulgado no documento WO2017/059245, que descreve um interruptor referido como um "interruptor de código de acesso" ou um "circuito de código de acesso" ou "interruptor de eliminação de código de acesso" que é um circuito biológico sintético que usa fatores de transcrição híbridos (TFs) para construir requisitos ambientais complexos para a sobrevi- vência celular. Os interruptores reguladores de código de acesso des- critos no documento WO2017/059245 são particularmente úteis para uso nos vetores de ceDNA, pois são modulares e personalizáveis, tan- to em termos das condições ambientais que controlam a ativação do circuito quanto nos módulos de saída que controlam o destino da célu- la. Além disso, o circuito de código de acesso tem utilidade particular para ser usado em vetores de ceDNA, uma vez que sem as moléculas de "código de acesso" apropriadas, ele permitirá a expressão do transgene apenas na presença das condições predeterminadas exigi- das. Se algo der errado com uma célula ou nenhuma expressão adici- onal do transgene for desejada por qualquer motivo, o interruptor de eliminação relacionado (ou seja, interruptor em caso de morte) pode ser acionado.

[00256] Em algumas modalidades, um interruptor regulador de có- digo de acesso ou "circuito de código de acesso" abrangido para uso no vetor de ceDNA compreende fatores de transcrição híbridos (TFs) para expandir o alcance e a complexidade dos sinais ambientais utili- zados para definir condições de biocontrole. Ao contrário do interruptor em caso de morte que aciona a morte celular na presença de uma condição predeterminada, o "circuito de código de acesso" permite a sobrevivência da célula ou expressão de transgene na presença de um "código de acesso" específico e pode ser facilmente reprogramado para permitir a expressão de transgene e/ou sobrevivência celular so- mente quando a condição ou código de acesso predeterminado estiver presente.

[00257] Em um aspecto, um sistema de "código de acesso" que restringe o crescimento celular à presença de um conjunto predetermi- nado de pelo menos dois agentes selecionados inclui um ou mais construtos de ácido nucleico que codificam módulos de expressão compreendendo: i) um módulo de expressão de toxina que codifica uma toxina que é tóxico para uma célula hospedeira, em que a se- quência que codifica a toxina está operacionalmente ligada a um pro- motor P1 que é reprimido pela ligação de uma primeira proteína re- pressora híbrida hRP1; ii) um primeiro módulo de expressão de proteí- na repressora híbrida que codifica a primeira proteína repressora hí- brida hRP1, em que a expressão de hRP1 é controlada por um portão AND formado por dois fatores de transcrição híbridos hTF1 e hTF2, cuja ligação ou atividade é responsiva aos agentes A1 e A2, respecti- vamente, de modo que ambos os agentes A1 e A2 são necessários para a expressão de hRP1, em que na ausência de A1 ou A2, a ex- pressão de hRP1 é insuficiente para reprimir o módulo promotor de toxina P1 e a produção de toxina, de modo que a célula hospedeira seja morta. Nesse sistema, os fatores híbridos hTF1, hTF2 e hRP1 compreendem, cada um, um módulo de detecção ambiental de um fa- tor de transcrição e um módulo de reconhecimento de DNA de um fa- tor de transcrição diferente que torna a ligação do respectivo interrup- tor regulador de código de acesso sensível à presença de um agente ambiental A1 ou A2, que é diferente daquele ao qual as respectivas subunidades normalmente se ligariam na natureza.

[00258] Consequentemente, um vetor de ceDNA pode compreender um "circuito regulador de código de acesso" que requer a presença e/ou ausência de moléculas específicas para ativar o módulo de saída. Em algumas modalidades, onde os genes que codificam toxinas celu- lares são colocados no módulo de saída, este circuito regulador de có-

digo de acesso pode não apenas ser usado para regular a expressão do transgene, mas também pode ser usado para criar um mecanismo de interruptor de extermínio, no qual o circuito mata a célula se a célu- la se comporta de maneira indesejada (por exemplo, ele deixa o ambi- ente específico definido pelos domínios do sensor ou se diferencia em um tipo de célula diferente). Em um exemplo não limitativo, a modula- ridade dos fatores de transcrição híbridos, a arquitetura do circuito e o módulo de saída permitem que o circuito seja reconfigurado para de- tectar outros sinais ambientais, reagir aos sinais ambientais de outras maneiras e controlar outras funções na célula, além da morte celular induzida, como é entendido na técnica.

[00259] Qualquer e todas as combinações de interruptores regula- dores aqui divulgados, por exemplo, interruptores de moléculas pe- quenas, interruptores à base de ácidos nucleicos, interruptores híbri- dos de pequenas moléculas-ácidos nucleicos, interruptores de regula- ção de transgene pós-transcricionais, interruptores de regulação pós- traducional controlados por radiação, interruptores mediados por hipó- xia e outros interruptores reguladoras conhecidos por pessoas versa- dos na técnica como divulgados neste documento podem ser usados em um interruptor regulador de código de acesso, conforme divulgado neste documento. Os interruptores reguladores abrangidos para uso também são discutidos no artigo de revisão Kis et al., JR Soc Interfa- ce. 12: 20141000 (2015) e resumidos na Tabela 1 de Kis. Em algumas modalidades, um interruptor regulador para uso em um sistema de có- digo de acesso pode ser selecionado a partir de qualquer um ou de uma combinação dos interruptores na Tabela 5. D. INTERRUPTORES REGULADORES À BASE DE ÁCIDO NUCLEI-

CO PARA CONTROLAR EXPRESSÃO DE TRANSGENE

[00260] Em algumas modalidades, o interruptor regulador para con- trolar o transgene expresso pelo ceDNA é baseado em um mecanismo de controle à base de ácido nucleico.

Mecanismos de controle de áci- do nucleico exemplificativos são conhecidos na técnica e estão previs- tos para uso.

Por exemplo, esses mecanismos incluem interruptores de ribossomo, como os divulgados em, por exemplo, US2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, patente U.S. 9.222.093 e pedido EP EP288071, e também divulgados na revisão por Villa JK et al.

Microbiol Spectr.

Maio de 2018; 6(3). Também estão incluídos os biossensores de transcrição responsivos ao metabolito, como os divulgados nos documentos WO2018/075486 e WO2017/147585. Outros mecanismos conhecidos na técnica previstos para uso incluem o silenciamento do transgene com uma molécula de siRNA ou RNAi (por exemplo, miR, shRNA). Por exemplo, o vetor de ceDNA pode compreender um interruptor regula- dor que codifica uma molécula de RNAi que é complementar ao trans- gene expresso pelo vetor de ceDNA.

Quando esse RNAi é expresso mesmo que o transgene seja expresso pelo vetor de ceDNA, o mesmo será silenciado pela molécula de RNAi complementar, e quando o RNAi não for expresso quando o transgene for expresso pelo vetor de ceDNA, o transgene não será silenciado pelo RNAi.

Tal exemplo de uma molécula de RNAi que controla a expressão gênica, ou como um interruptor regulador, é divulgado no exemplo US2017/0183664. Em algumas modalidades, o interruptor regulador compreende um repres- sor que bloqueia a expressão do transgene do vetor de ceDNA.

Em algumas modalidades, o interruptor liga/desliga é um interruptor à base de RNA pequeno de ativação de transcrição (STAR), por exemplo, tal como o divulgado em Chappell J. et al., Nat Chem Biol.

Março de 2015; 11(3): 214 a 220; e Chappell et al., Microbiol Spectr.

Maio de 2018; 6(3). Em algumas modalidades, o interruptor regulador é um in- terruptor de apoio, como aquele divulgado nos documentos US2009/0191546, US2016/0076083, WO2017/087530,

US2017/0204477, WO2017/075486 e em Green et al, Cell, 2014; 159 (4); 925 a 939.

[00261] Em algumas modalidades, o interruptor regulador é um in- terruptor regulador autoinativador específico de tecido, por exemplo, conforme divulgado em US2002/0022018, em que o interruptor regu- lador desativa deliberadamente a expressão de transgene em um sítio onde a expressão de transgene pode, de outra forma, ser desvantajo- sa. Em algumas modalidades, o interruptor regulador é um sistema de expressão gênica reversível por recombinase, por exemplo, como di- vulgado em US2014/0127162 e Patente U.S. 8.324.436.

[00262] Em algumas modalidades, o interruptor regulador para con- trolar o transgene ou gene de interesse expresso pelo vetor de ceDNA é um híbrido de um mecanismo de controle à base de ácido nucleico e um sistema regulador de pequenas moléculas. Tais sistemas são bem conhecidos pelos indivíduos de conhecimento comum na técnica e são concebidos para uso neste documento. Exemplos de tais interruptores reguladores incluem, mas não estão limitados a, um sistema LTRi ou sistema "Lac-Tet-RNAi", por exemplo, conforme divulgado no docu- mento US2010/0175141 e em Deans T. et al., Cell., 2007, 130(2); 363 a 372, WO2008/051854 e patente US 9.388.425.

[00263] Em algumas modalidades, o interruptor regulador para con- trolar o transgene ou gene de interesse expresso pelo vetor de ceDNA envolve permutação circular, como divulgado na Patente U.S.

8.338.138. Em tal modalidade, o interruptor molecular é multiestável, ou seja, capaz de comutar entre pelo menos dois estados, ou alterna- tivamente, biestável, ou seja, um estado é "LIGADO" ou "DESLIGA- DO", por exemplo, capaz de emitir luz ou não, capaz de se ligar ou não, capaz de catalisar ou não, capaz de transferir elétrons ou não, e assim por diante. Em outro aspecto, o interruptor molecular usa uma molécula de fusão, portanto, o interruptor é capaz de alternar entre mais de dois estados. Por exemplo, em resposta a um estado limite específico exibido por uma sequência de inserção ou sequência acei- tadora, a respectiva outra sequência da fusão pode exibir uma faixa de estados (por exemplo, uma faixa de atividade de ligação, uma faixa de catálise enzimática, etc.). Assim, em vez de mudar de "LIGADO" ou "DESLIGADO", a molécula de fusão pode exibir uma resposta gradua- da a um estímulo.

[00264] Em algumas modalidades, um interruptor regulador com base em ácido nucleico pode ser selecionado a partir de qualquer um ou de uma combinação dos interruptores na Tabela 5. E. INTERRUPTORES REGULADORES PÓS-TRANSCRICIONAIS E PÓS-TRADUCIONAIS.

[00265] Em algumas modalidades, o interruptor regulador para con- trolar o transgene ou gene de interesse expresso pelo vetor de ceDNA é um sistema de modificação pós-transcricional. Por exemplo, esse interruptor regulador pode ser um interruptor de ribossomo de aptazi- ma que é sensível à tetraciclina ou teofilina, conforme divulgado em US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, patente EP 2707487 e Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), páginas 526 a 534; Zhong et al., Elife. 2 de novembro de 2016; 5 pii: e18858. Em al- gumas modalidades, é previsto que uma pessoa versada na técnica possa codificar o transgene e um siRNA inibidor que contém um aptâ- mero sensível ao ligante (interruptor DESLIGADO), em que o resultado líquido é um interruptor LIGADO sensível ao ligante.

[00266] Em algumas modalidades, o interruptor regulador para con- trolar o transgene ou gene de interesse expresso pelo vetor de ceDNA é um sistema de modificação pós-traducional. Em modalidades alter- nativas, o gene de interesse ou proteína é expresso como pró-proteína ou pré-pró-proteína, ou tem um elemento de resposta de sinal (SRE) ou um domínio desestabilizador (DD) ligado à proteína expressa, evi-

tando assim o enovelamento correto da proteína e/ou atividade até que a modificação pós-tradução tenha ocorrido. No caso de um domí- nio desestabilizador (DD) ou SRE, o domínio de desestabilização é clivado pós-tradução na presença de um agente exógeno ou molécula pequena. Um indivíduo de conhecimento comum na técnica pode utili- zar tais métodos de controle divulgados na patente US 8.173.792 e no pedido PCT WO2017180587. Outros interruptores de controle pós- transcricionais previstos para uso no vetor de ceDNA para controlar a atividade de transgene funcional são divulgados em Rakhit et al., Chem Biol. 2014; 21(9): 1.238 a 1.252 e Navarro et al., ACS Chem Bi- ol. 2016; 19; 11(8): 2101 a 2104A.

[00267] Em algumas modalidades, um interruptor regulador para controlar o transgene ou gene de interesse expresso pelo vetor de ce- DNA é um sistema de modificação pós-tradução que incorpora inteí- nas sensíveis ao ligante na sequência de codificação do transgene, de modo que o transgene ou proteína expressa seja inibida antes do spli- cing. Por exemplo, isso foi demonstrado usando 4-hidroxitamoxifeno e hormônio da tireoide (ver, por exemplo, patentes U.S. 7.541.450,

9.200.045; 7.192.739, Buskirk, et al., Proc Natl Acad Sci USA. 20 de julho de 2004; 101(29): 10.505 a 10.510; ACS Synth Biol. 16 de de- zembro de 2016; 5(12): 1.475 a 1.484; e fevereiro de 2005; 14(2): 523 a 532. Em algumas modalidades, um interruptor regulador com base pós-transcricional pode ser selecionado a partir de qualquer um ou de uma combinação dos interruptores na Tabela 5. F. OUTROS INTERRUPTORES REGULADORES EXEMPLIFICATI-

VOS

[00268] Qualquer interruptor regulador conhecido pode ser usado no vetor de ceDNA para controlar a expressão gênica do transgene expressa pelo vetor de ceDNA, incluindo aqueles desencadeados por mudanças ambientais. Exemplos adicionais incluem, mas não estão limitados a; o método BOC de Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018); expansão do código genético e um aminoácido não fisiológico; interruptores de ativação/desativação controlados por radiação ou ul- trassom (consulte, por exemplo, Scott S et al., Gene Ther. Julho de 2000; 7 (13): 1.121 a 1.125; patentes nº U.S. 5.612.318; 5.571.797;

5.770.581; 5.817.636; e WO1999/025385A1. Em algumas modalida- des, o interruptor regulador é controlado por um sistema implantável, por exemplo, conforme divulgado na patente U.S. 7.840.263; US2007/0190028A1, em que a expressão do gene é controlada por uma ou mais formas de energia, incluindo energia eletromagnética, que ativa promotores operacionalmente ligados ao transgene no vetor de ceDNA.

[00269] Em algumas modalidades, um interruptor regulador previsto para uso no vetor de ceDNA é um interruptor mediado por hipóxia ou ativado por estresse, por exemplo, como os divulgados em WO1999060142A2, patente US 5.834.306; 6.218.179; 6.709.858; US2015/0322410; Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368, bem como elementos FROG, TOAD e NRSE e elementos de silêncio condutivamente indutíveis, incluindo elementos de resposta à hipóxia (HREs), elementos de resposta inflamatória (IREs) e elemen- tos ativados por estresse de cisalhamento (SSAEs), por exemplo, co- mo divulgado na Patente nº U.S. 9.394.526. Tal modalidade é útil para ativar a expressão do transgene do vetor de ceDNA após isquemia ou em tecidos isquêmicos e/ou tumores.

[00270] Em algumas modalidades, um interruptor regulador previsto para uso no vetor de ceDNA é um interruptor regulador optogenético (por exemplo, controlado por luz), por exemplo, como um dos interrup- tores revisados em Polesskaya et al., BMC Neurosci. 2018; 19(Suppl 1): 12, e também são previstos para uso neste documento. Em tais modalidades, um vetor de ceDNA pode compreender elementos gené-

ticos que são sensíveis à luz e podem regular a expressão do transge- ne em resposta a comprimentos de onda visíveis (por exemplo, azul, quase IR). Os vetores de ceDNA compreendendo interruptores regula- dores optogenéticos são úteis ao expressar o transgene em locais do corpo que podem receber tais fontes de luz, por exemplo, a pele, olhos, músculo, etc., e também podem ser usados quando os vetores de ceDNA estão expressando transgenes em órgãos internos e teci- dos, onde o sinal de luz pode ser fornecido por um meio adequado (por exemplo, dispositivo implantável como aqui divulgado). Tais inter- ruptores reguladores optogenéticos incluem o uso de elementos res- ponsivos à luz, ou efetor transcricional indutível por luz (LITE) (por exemplo, divulgado em 2014/0287938), um sistema Light-On (por exemplo, divulgado em Wang et al., Nat Methods. 12 de fevereiro de 2012; 9(3): 266 a 269; que relatou permitir o controle in vivo da ex- pressão de um transgene de insulina, o sistema Cry2/CIB1 (por exem- plo, divulgado em Kennedy et al., Nature Methods; 7, 973 a 975 (2010); e o sistema FKF1/GIGANTEA (por exemplo, divulgado em Ya- zawa et al., Nat Biotechnol. Outubro de 2009; 27(10): 941 a 945). G. INTERRUPTORES DE EXTERMÍNIO

[00271] Outras modalidades da invenção referem-se a um vetor de ceDNA que compreende um interruptor de extermínio. Um interruptor de extermínio, como aqui divulgado, permite que uma célula que com- preende o vetor de ceDNA seja morta ou sofra morte celular progra- mada como um meio para remover permanentemente um vetor de ce- DNA introduzido do sistema do indivíduo. Será entendido por um ver- sado na técnica que o uso de interruptores de extermínio nos vetores de ceDNA da invenção seria tipicamente acoplado ao alvejamento do vetor de ceDNA para um número limitado de células que o indivíduo pode perder de maneira aceitável ou para uma célula tipo onde a apo- ptose é desejável (por exemplo, células cancerígenas). Em todos os aspectos, um "interruptor de extermínio", como divulgado neste docu- mento, é projetado para fornecer morte celular rápida e robusta da cé- lula que compreende o vetor de ceDNA na ausência de um sinal de sobrevivência de entrada ou outra condição especificada. Dito de outra maneira, um interruptor de extermínio codificado por um vetor de ceD- NA aqui pode restringir a sobrevivência celular de uma célula que compreende um vetor de ceDNA a um ambiente definido por sinais de entrada específicos. Tais interruptores de extermínio servem como uma função de biocontenção biológica, caso seja desejável remover o vetor de ceDNA de um indivíduo ou garantir que o mesmo não expres- se o transgene codificado. Consequentemente, os interruptores de eliminação são circuitos biológicos sintéticos no vetor de ceDNA que acoplam os sinais ambientais com a sobrevivência condicional da célu- la que compreende o vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, dife- rentes vetores de ceDNA podem ser projetados para ter diferentes in- terruptores de eliminação. Isto permite que se seja capaz de controlar quais células que expressam transgene são mortas se forem usados coquetéis de vetores de ceDNA.

[00272] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA pode com- preender um interruptor de eliminação que é um circuito de contenção biológica modular. Em algumas modalidades, um interruptor de exter- mínio englobado para uso no vetor de ceDNA é divulgado no docu- mento WO2017/059245, que descreve um interruptor referido como "interruptor de extermínio em caso de morte" que compreende um ar- ranjo mutuamente inibitório de pelo menos duas sequências reprimí- veis, de modo que um sinal ambiental reprima a atividade de uma se- gunda molécula no construto (por exemplo, um fator de transcrição de ligação à molécula pequena é usado para produzir um estado de "so- brevivência" devido à repressão da produção de toxina). Em células que compreendem um vetor de ceDNA compreendendo um interruptor de extermínio em caso de morte, após a perda do sinal ambiental, o circuito muda permanentemente para o estado de "morte", onde a to- xina é agora não reprimida, resultando na produção de toxina que ma- ta a célula. Em outra modalidade, é fornecido um circuito biológico sin- tético denominado como um "circuito de código de acesso" ou "inter- ruptor de eliminação de código de acesso" que usa fatores de transcri- ção híbridos (TFs) para construir requisitos ambientais complexos para a sobrevivência celular. Os interruptores de extermínio em caso de morte e de código de acesso descritos no documento WO2017/059245 são particularmente úteis para uso em vetores de ceDNA, uma vez que são modulares e personalizáveis, tanto em termos das condições ambientais que controlam a ativação do circuito quanto nos módulos de saída que controlam o destino da célula. Com a escolha adequada de toxinas, incluindo, mas não se limitando a uma endonuclease, por exemplo, um EcoRI, os circuitos de código de acesso presentes no vetor de ceDNA podem ser usados não apenas para matar a célula hospedeira que compreende o vetor de ceDNA, mas também para de- gradar seu genoma e plasmídeos acompanhantes.

[00273] Outros interruptores de extermínio conhecidos por um indi- víduo de conhecimento comum na técnica são abrangidos para uso no vetor de ceDNA, como divulgado aqui, por exemplo, como divulgado no documento US2010/0175141; US2013/0009799; US2011/0172826; US2013/0109568, bem como interruptores de extermínio divulgados em Jusiak et al., Reviews in Cell Biology and molecular medicine; 2014; 1 a 56; Kobayashi et al., PNAS, 2004; 101; 8419-9; Marchisio et al., Int. Journal of Biochem and Cell Biol., 2011; 43; 310 a 319; e em Reinshagen et al., Science Translational Medicine, 2018, 11.

[00274] Por conseguinte, em algumas modalidades, o vetor de ce- DNA pode compreender um construto de ácido nucleico de interruptor de extermínio, que compreende o ácido nucleico que codifica uma to-

xina efetora ou proteína repórter, em que a expressão da toxina efeto- ra (por exemplo, uma proteína de extermínio) ou a proteína repórter é controlada por uma condição predeterminada. Por exemplo, uma con- dição predeterminada pode ser a presença de um agente ambiental, como, por exemplo, um agente exógeno, sem o qual a célula se torna- rá padrão para a expressão da toxina efetora (por exemplo, uma prote- ína da morte) e será exterminada. Em modalidades alternativas, uma condição predeterminada é a presença de dois ou mais agentes ambi- entais, por exemplo, a célula sobreviverá apenas quando dois ou mais agentes exógenos necessários forem fornecidos, e sem nenhum dos quais, a célula que compreende o vetor de ceDNA é exterminada.

[00275] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é modificado para incorporar um interruptor de extermínio para destruir as células que compreendem o vetor de ceDNA para finalizar eficazmente a ex- pressão in vivo do transgene sendo expresso pelo vetor de ceDNA (por exemplo, gene, proteína ou peptídeo terapêutico, etc.). Especifi- camente, o vetor de ceDNA é geneticamente modificado para expres- sar uma proteína de interruptor que não é funcional em células de mamíferos sob condições fisiológicas normais. Somente após a admi- nistração de um fármaco ou condição ambiental que atinja especifica- mente essa proteína de interruptor, as células que expressam a prote- ína de interruptor serão destruídas, terminando assim a expressão da proteína ou peptídeo terapêutico. Por exemplo, foi relatado que as cé- lulas que expressam HSV-timidina-quinase podem ser exterminadas após a administração de fármacos, como ganciclovir e citosina- desaminase. Consultar, por exemplo, Dey e Evans, Suicide Gene The- rapy by Herpes Simplex Virus-1 Thymidine Kinase (HSV-TK), em Tar- gets in Gene Therapy, editado por You (2011); e Beltinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(15):8.699 a 8.704 (1999). Em algumas moda- lidades, o vetor de ceDNA pode compreender um interruptor de exter-

mínio de siRNA referido como DISE (Extermínio induzido por Elimina- ção de Genes de Sobrevivência) (Murmann et al., Oncotarget. 2017; 8:84.643 a 84.658. Indução de DISE em células de câncer de ovário in vivo).

[00276] Em alguns aspectos, um interruptor de extermínio em caso de morte é um circuito ou sistema biológico que torna uma resposta celular sensível a uma condição predeterminada, como a falta de um agente no ambiente de crescimento celular, por exemplo, um agente exógeno. Tal circuito ou sistema pode compreender um construto de ácido nucleico compreendendo módulos de expressão que formam um circuito regulador em caso de morte sensível à condição predetermi- nada, sendo que o construto compreende módulos de expressão que formam um circuito regulador, em que o construto inclui: i) um primeiro módulo de expressão de proteína repressora, em que a primeira proteína repressora se liga a um primeiro elemento de ligação de ácido nucleico de proteína repressora e reprime a trans- crição de uma sequência de codificação compreendendo o primeiro elemento de ligação de proteína repressora, e em que a atividade de repressão da primeira proteína repressora é sensível à inibição por um primeiro agente exógeno, a presença ou ausência do primeiro agente exógeno estabelecendo uma condição predeterminada; ii) um segundo módulo de expressão de proteína represso- ra, em que a segunda proteína repressora se liga a um segundo ele- mento de ligação de ácido nucleico de proteína repressora e reprime a transcrição de uma sequência de codificação compreendendo o se- gundo elemento de ligação de proteína repressora, em que a segunda proteína repressora é diferente da primeira proteína repressora; e iii) um módulo de expressão efetora, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína efetora, opera- cionalmente ligada a um elemento genético compreendendo um ele-

mento de ligação para a segunda proteína repressora, de modo que a expressão da segunda proteína repressora cause repressão da ex- pressão efetora a partir do módulo de expressão efetora, em que o se- gundo módulo de expressão compreende um primeiro elemento de ligação de ácido nucleico de proteína repressora que permite a repres- são da transcrição da segunda proteína repressora quando o elemento é ligado pela primeira proteína repressora, sendo que os respectivos módulos formam um circuito regulador de modo que, na ausência do primeiro agente exógeno, a primeira proteína repressora seja produzi- da a partir do primeiro módulo de expressão da proteína repressora e reprima a transcrição do segundo módulo de expressão da proteína repressora, de modo que a repressão da expressão efetora pela se- gunda proteína repressora seja aliviada, resultando na expressão da proteína efetora, mas na presença do primeiro agente exógeno, a ati- vidade da primeira proteína repressora seja inibida, permitindo a ex- pressão da segunda proteína repressora, que mantém a expressão da expressão da proteína efetora no estado "desligado", de modo que o primeiro agente exógeno seja exigido pelo circuito para manter a ex- pressão da proteína efetora no estado "desligado", e a remoção ou ausência do primeiro agente exógeno resulte na expressão da proteí- na efetora.

[00277] Em algumas modalidades, o efetor é uma toxina ou uma proteína que induz um programa de morte celular. Qualquer proteína que seja tóxica para a célula hospedeira pode ser usada. Em algumas modalidades, a toxina mata apenas as células nas quais é expressa. Em outras modalidades, a toxina mata outras células do mesmo orga- nismo hospedeiro. Qualquer um de um grande número de produtos que levarão à morte celular pode ser empregado em um interruptor de extermínio em caso de morte. Os agentes que inibem a replicação do DNA, tradução de proteínas ou outros processos ou, por exemplo, que degradam o ácido nucleico da célula hospedeira, são de particular uti- lidade. Para identificar um mecanismo eficiente para matar as células hospedeiras após a ativação do circuito, vários genes de toxinas foram testados que danificam diretamente o DNA ou RNA da célula hospe- deira. A endonuclease ecoRI21, o inibidor da girase de DNA ccdB22 e a toxina do tipo ribonuclease mazF23 foram testados porque são bem caracterizados, são nativos de E. coli e fornecem uma variedade de mecanismos de morte. Para aumentar a robustez do circuito e fornecer um método independente de morte celular dependente do circuito, o sistema pode ser adaptado para expressar, por exemplo, uma pro- tease ou nuclease direcionada que interfere ainda mais no repressor que mantém o gene de morte no estado "desligado". Após a perda ou retirada do sinal de sobrevivência, a repressão do gene da morte é ainda mais eficientemente removida por, por exemplo, degradação ati- va da proteína repressora ou sua mensagem. Como exemplos não li- mitativos, a protease mf -Lon foi usada não apenas para degradar La- cI, mas também direcionar proteínas essenciais para degradação. A etiqueta de degradação mf -Lon pdt nº1 pode ser anexada à extremi- dade 3' de cinco genes essenciais, cujos produtos de proteína são par- ticularmente sensíveis à degradação de mf -Lon20, e viabilidade celular foi medida após a remoção de ATc. Entre os alvos de genes essenci- ais testados, o gene de biossíntese de peptidoglicano murC forneceu o fenótipo de morte celular mais forte e mais rápido (taxa de sobrevivên- cia <1 x 10-4 dentro de 6 horas).

[00278] Conforme usado neste documento, o termo "entrada prede- terminada" se refere a um agente ou condição que influencia a ativida- de de um polipeptídeo de fator de transcrição de uma maneira conhe- cida. Geralmente, esses agentes podem se ligar a e/ou alterar a con- formação do polipeptídeo do fator de transcrição para, desse modo, modificar a atividade do polipeptídeo do fator de transcrição. Exemplos de entradas predeterminadas incluem, mas não estão limitados a, agentes de entrada ambientais que não são necessários para a sobre- vivência de um determinado organismo hospedeiro (ou seja, na au- sência de um circuito biológico sintético, conforme descrito neste do- cumento). As condições que podem fornecer uma entrada predetermi- nada incluem, por exemplo, temperatura, por exemplo, onde a ativida- de de um ou mais fatores é sensível à temperatura, a presença ou au- sência de luz, incluindo luz de um determinado espectro de compri- mentos de onda e a concentração de um gás, sal, metal ou mineral. Os agentes de entrada ambientais incluem, por exemplo, uma peque- na molécula, agentes biológicos, tais como feromônios, hormônios, fatores de crescimento, metabólitos, nutrientes e semelhantes e seus análogos; concentrações de produtos químicos, subprodutos ambien- tais, íons metálicos e outras moléculas ou agentes; níveis de luz; tem- peratura; estresse ou pressão mecânica; ou sinais elétricos, como cor- rentes e tensões.

[00279] Em algumas modalidades, os repórteres são usados para quantificar a força ou atividade do sinal recebido pelos módulos ou cir- cuitos biológicos sintéticos programáveis da invenção. Em algumas modalidades, os repórteres podem ser fundidos em quadro a outras sequências de codificação de proteínas para identificar onde uma pro- teína está localizada em uma célula ou organismo. As luciferases po- dem ser usadas como proteínas efetoras para várias modalidades aqui descritas, por exemplo, medindo baixos níveis de expressão gênica, porque as células tendem a ter pouca ou nenhuma luminescência de fundo na ausência de uma luciferase. Em outras modalidades, as en- zimas que produzem substratos coloridos podem ser quantificadas usando espectrofotômetros ou outros instrumentos que podem fazer medições de absorbância, incluindo leitores de placa. Como as lucife- rases, enzimas como a β-galactosidase podem ser usadas para medir baixos níveis de expressão gênica porque tendem a amplificar sinais baixos. Em algumas modalidades, uma proteína efetora pode ser uma enzima que pode degradar ou de outra forma destruir uma determina- da toxina. Em algumas modalidades, uma proteína efetora pode ser uma enzima odorante que converte um substrato em um produto odo- rífero. Em algumas modalidades, uma proteína efetora pode ser uma enzima que fosforila ou desfosforila pequenas moléculas ou outras proteínas, ou uma enzima que metila ou desmetila outras proteínas ou DNA.

[00280] Em algumas modalidades, uma proteína efetora pode ser um receptor, ligante ou proteína lítica. Receptores tendem a ter três domínios: um domínio extracelular para ligantes de ligação, como pro- teínas, peptídeos ou pequenas moléculas, um domínio transmembra- nar e um domínio intracelular ou citoplasmático que frequentemente pode participar de algum tipo de evento de transdução de sinal, como fosforilação. Em algumas modalidades, as sequências genéticas de transportador, canal ou bomba são usadas como proteínas efetoras. Exemplos não limitativos e sequências de proteínas efetoras para uso com os interruptores de extermínio, conforme descrito neste documen- to, podem ser encontrados no Registry of Standard Biological Parts na rede mundial em parts.igem.org.

[00281] Tal como aqui utilizado, uma "proteína moduladora" é uma proteína que modula a expressão de uma sequência de ácidos nuclei- cos-alvo. As proteínas moduladoras incluem, por exemplo, fatores de transcrição, incluindo ativadores e repressores transcricionais, entre outros, e proteínas que se ligam a ou modificam um fator de transcri- ção e influenciam sua atividade. Em algumas modalidades, uma prote- ína moduladora inclui, por exemplo, uma protease que degrada um fator de proteína envolvido na regulação da expressão de uma se- quência de ácidos nucleicos-alvo. Proteínas moduladoras preferenciais incluem proteínas modulares nas quais, por exemplo, a ligação ao DNA e a ligação ao agente de entrada ou elementos ou domínios res- ponsivos são separáveis e transferíveis, de modo que, por exemplo, a fusão do domínio de ligação ao DNA de uma primeira proteína modu- ladora ao domínio responsivo ao agente de entrada de um segundo resulta em uma nova proteína que se liga à sequência de DNA reco- nhecida pela primeira proteína, mas é sensível ao agente de entrada ao qual a segunda proteína normalmente responde. Consequentemen- te, tal como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo modulador" e o "poli- peptídeo repressor" mais específico incluem, além dos polipeptídeos especificados, por exemplo, "um polipeptídeo LacI (repressor)", varian- tes ou derivados de tais polipeptídeos que respondem a um agente de entrada diferente ou variante. Assim, para um polipeptídeo LacI, estão incluídos mutantes ou variantes de LacI que se ligam a agentes dife- rentes da lactose ou IPTG. Uma vasta gama de tais agentes é conhe- cida na técnica.

[00282] Tabela 5. Interruptores reguladores exemplificativos comu- tabilidade bLIGADA por um efetor; diferente da remoção do efetor que confere o estado DESLIGADO. Comutabilidade cDESLIGADA por um efetor; diferente da remoção do efetor que confere o estado LIGADO. d Um ligante ou outros estímulos físicos (por exemplo, temperatura, ra- diação eletromagnética, eletricidade) que estabiliza o interruptor em seu estado LIGADO ou DESLIGADO. erefere-se ao número de refe- rência citado em Kis et al., JR Soc Interface. 12: 20141000 (2015), em que tanto o artigo quanto as referências nele citadas são aqui incorpo- rados a título de referência.

TABELA 5: INTERRUPTORES REGULADORES EXEMPLIFICATI-

VOS nº nome Interrup- Interrup- origem efetord referên- tor LIGA- tor DES- ciase DOb LIGADOc Interruptores transcricionais 1 ABA sim não Arabidopsis ácido abs- [19] thaliana, císico levedura 2 AIR sim não Aspergillus acetaldeí- [20] nidulans do 3 ART sim não Chlamydia l-arginina [21] pneumoniae 4 BEARON, sim sim Campylo- ácido biliar [22] BEAROFF bacter jejuni 5 BirA-tTA não sim Escherichia biotina (vi- [23] coli tamina H) 6 BIT sim não Escherichia biotina (vi- [24] coli tamina H) 7 Cry2-CIB1 sim não Arabidopsis luz azul [25] thaliana, levedura 8 CTA, CTS sim sim Comamo- aditivos [26] nas testos- alimenta- teroni, Ho- res (ben- mo sapiens zoato, va- nilato) 9 cTA, rcTA sim sim Pseudomo- cumato [27] nas putida 10 Ecdisona sim não Homo sapi- Ecdisona [28] ens, Droso- phila mela- nogaster nº nome Interrup- Interrup- origem efetord referên- tor LIGA- tor DES- ciase DOb LIGADOc 11 EcR:RXR sim não Homo sapi- ecdisona [29] ens, Locus- ta migratoria 12 eletro- sim não Aspergillus eletricida- [30] genético nidulans de, ace- taldeído 13 ER-p65- sim não Homo sapi- 4,4′-di- [31] ZF ens, levedu- hidroxi- ra benzila 14 E.REX sim sim Escherichia eritromici- [32] coli na 15 EthR não sim Mycobacte- 2-feniletil- [33] rium tuber- butirato culosis 16 GAL4-ER sim sim levedura, estrogê- [34] Homo sapi- nio, 4- ens hidroxita- moxifeno 17 GAL4-hPR sim sim levedura, mifepris- [35,36] Homo sapi- tona ens 18 GAL4- sim sim levedura, rapamici- [37] Raps Homo sapi- na e deri- ens vados de rapamici- na 19 GAL4-TR sim não levedura, hormona [38] Homo sapi- da tireoide ens 20 GyrB sim sim Escherichia coumer- [39] coli micina, novobioci- na nº nome Interrup- Interrup- origem efetord referên- tor LIGA- tor DES- ciase DOb LIGADOc 21 HEA-3 sim não Homo sapi- 4- [40] ens hidroxita- moxifeno 22 Intrâmero não sim aptâmeros teofilina [41] sintéticos derivados de SELEX 23 LacI sim não Escherichia IPTG [42–46] coli 24 LAD sim não Arabidopsis luz azul [47] thaliana, levedura 25 LightOn sim não Neurospora luz azul [48] crassa, le- vedura 26 NICE sim sim Arthrobacter 6- [49] nicotinovo- hidroxini- rans cotina 27 PPAR* sim não Homo sapi- rosiglita- [50] ens zona 28 PEACE não sim Pseudomo- flavonoi- [51] nas putida des (por exemplo, floretina) 29 PIT sim sim Strep- pristinami- [12] tomyces cina I, vir- coelicolor giniamici- na 30 REDOX não sim Strep- NADH [52] tomyces coelicolor nº nome Interrup- Interrup- origem efetord referên- tor LIGA- tor DES- ciase DOb LIGADOc 31 QuoRex sim sim Strep- butirolac- [53] tomyces tonas (por coelicolor, exemplo, Strep- SCB1) tomyces pristinaespi- ralis 32 ST-TA sim sim Strep- γ- [54] tomyces butirolac- coelicolor, tona, te- Escherichia traciclina coli, Herpes simplex 33 TIGR não sim Strep- temperatu- [55] tomyces ra albus 34 TraR sim não Agrobacte- N-(3-oxo- [56] rium tume- octa- faciens noil)homo serina lac- tona 35 TET-OFF, sim sim Escherichia tetracicli- [11,57] TET-ON coli, Herpes na, doxici- simplex clina 36 TRT sim não Chlamydia l-triptofano [58] trachomatis 37 UREX sim não Deinococ- ácido úrico [59] cus radiodu- rans 38 VAC sim sim Caulobacter ácido va- [60] crescentus nílico nº nome Interrup- Interrup- origem efetord referên- tor LIGA- tor DES- ciase DOb LIGADOc 39 ZF-ER, sim sim Mus muscu- 4- [61] ZF- lus, Homo hidroxita- RXR/EcR sapiens, moxifeno, Drosophila ponaste- melanogas- rona-A ter 40 ZF-Raps sim não Homo sapi- rapamici- [62] ens na 41 Interrupto- sim não Mus muscu- 4- [63] res ZF lus, Homo hidroxita- sapiens, moxifeno, Drosophila mifepris- melanogas- tona ter 42 ZF(TF)s sim não Xenopus etil-4- [64] laevis, Ho- hidroxi- mo sapiens benzoato, propil-4- hidroxi- benzoato interruptores pós-transcricionais 1 aptâmero sim não aptâmero teofilina [65] de RNAi derivado de SELEX sin- tético 2 aptâmero não sim aptâmero teofilina [66] de RNAi derivado de SELEX sin- tético 3 aptâmero sim não aptâmero teofilina, [67] de RNAi derivado de tetracicli- miRNA SELEX sin- na, hi- tético poxantina nº nome Interrup- Interrup- origem efetord referên- tor LIGA- tor DES- ciase DOb LIGADOc 4 aptâmero sim sim Homo sapi- MS2, p65, [68] Splicing ens, bacte- p50, b- riófago MS2 catenina 5 aptazima não sim aptâmero teofilina [69] derivado de SELEX sin- tético, Schistoso- ma mansoni 6 replicon sim não Vírus Sind- temperatu- [70] CytTS bis ra 7 TET-OFF- sim sim Escherichia doxiciclina [71] shRNA, coli, Herpes TET-ON- simplex, shRNA Homo sapi- ens 8 aptâmero não sim aptâmero teofilina [72] teo derivado de SELEX sin- tético 9 aptazima sim não aptâmeros teofilina, [73] 3′ UTR derivados tetraciclina de SELEX sintético, vírus rings- pot do taba- co 10 aptazima não sim aptâmero teofilina [74] 5′ UTR derivado de SELEX sin- tético, Schistoso- ma mansoni nº nome Interrup- Interrup- origem efetord referên- tor LIGA- tor DES- ciase DOb LIGADOc interruptores traducionais 1 aptâmero não sim sequência corantes [75] Hoechst de RNA sin- de Hoe- tética chst 2 aptâmero não sim Archaeo- L7Ae, [76] H23 globus ful- L7KK gidus 3 aptâmero sim sim Archaeo- L7Ae [77] L7Ae globus ful- gidus 4 aptâmero não sim bacteriófago MS2 [78] MS2 MS2 interruptores pós-traducionais 1 AID não sim Arabidopsis auxinas [79] thaliana, (por Oryza sati- exemplo, va, Gos- IAA) sypium hir- sutum 2 ER DD não sim Homo sapi- CMP8, 4- [80] ens hidroxita- moxifeno 3 FM sim não Homo sapi- AP21998 [81] ens 4 HaloTag não sim Rhodococ- HyT13 [82,83] cus sp.

RHA1 5 HDV- não sim vírus da he- teofilina, [84] aptazima patite delta guanina nº nome Interrup- Interrup- origem efetord referên- tor LIGA- tor DES- ciase DOb LIGADOc 6 PROTAC não sim Homo sapi- proteólise [85] ens visando moléculas quiméricas (PRO- TACS) 7 escudo sim não Homo sapi- escudos [86] DD ens (por exemplo, Shld1) 8 escudo não sim Homo sapi- escudos [87] LID ens (por exemplo, Shld1) 9 TMP DD sim não Escherichia trimeto- [88] coli prima (TMP) VI. PRODUÇÃO DE UM VETOR DE CEDNA A. PRODUÇÃO EM GERAL

[00283] A produção de um vetor de ceDNA é descrita na seção IV do PCT/US18/49996 depositado em 7 de setembro de 2018, que é aqui incorporado em sua totalidade a título de referência. Como des- crito aqui, o vetor de ceDNA pode ser obtido, por exemplo, pelo pro- cesso que compreende as etapas de: a) incubação de uma população de células hospedeiras (por exemplo, células de insetos) que abrigam o modelo de construto de expressão de polinucleotídeo (por exemplo, um plasmídeo de ceDNA, um ceDNA-Bacmídeo e/ou ceDNA- baculovírus), que é desprovido de sequências codificantes do capsí- deo viral, na presença de uma proteína Rep em condições eficazes e por um tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA nas células hospedeiras, e em que as células hospedeiras não com-

preendem sequências codificantes do capsídeo viral; e b) colher e iso- lar o vetor de ceDNA das células hospedeiras. A presença da proteína Rep induz a replicação do polinucleotídeo do vetor com uma ITR modi- ficada para produzir o vetor de ceDNA em uma célula hospedeira. No entanto, não são expressas partículas virais (por exemplo, vírions de AAV). Assim, não há limitação de tamanho como a imposta natural- mente no AAV ou em outros vetores à base de vírus.

[00284] A presença do vetor de ceDNA isolado das células hospe- deiras pode ser confirmada digerindo o DNA isolado da célula hospe- deira com uma enzima de restrição com um único sítio de reconheci- mento no vetor de ceDNA e analisando o material do DNA digerido em um gel não desnaturante para confirmar a presença de bandas carac- terísticas de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.

[00285] De acordo com algumas modalidades, a invenção fornece o uso de linhagens de células hospedeiras que integraram estavelmente o modelo de expressão de polinucleotídeo do vetor de DNA (modelo ceDNA) em seu próprio genoma na produção do vetor de DNA não viral, por exemplo, como descrito em Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879. De preferência, Rep é adicionado às células hospedeiras em um MOI de cerca de 3. Quando a linhagem celular hospedeira é uma linhagem celular de mamífero, por exemplo, células HEK293, as linhagens celulares podem ter o modelo de vetor polinucleotídico inte- grado de forma estável e um segundo vetor como o vírus do herpes pode ser usado para introduzir a proteína Rep nas células, permitindo a excisão e amplificação do ceDNA na presença de Rep e vírus auxili- ar.

[00286] Em uma modalidade, as células hospedeiras usadas para produzir os vetores de ceDNA aqui descritos são células de inseto, e o baculovírus é usado para distribuir o polinucleotídeo que codifica a proteína Rep e o modelo de construto de expressão de polinucleotídeo de vetor de DNA não viral para ceDNA, por exemplo, como descrito nas Figuras 4A a 4C e Exemplo 1. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é geneticamente modificada para expressar proteína Rep.

[00287] O vetor de ceDNA é, então, colhido e isolado das células hospedeiras. O tempo para colher e coletar vetores de ceDNA aqui descritos a partir das células pode ser selecionado e otimizado para alcançar uma produção de alto rendimento dos vetores de ceDNA. Por exemplo, o tempo de colheita pode ser selecionado em vista da viabili- dade celular, morfologia celular, crescimento celular, etc. Em uma mo- dalidade, as células são cultivadas em condições suficientes e colhi- das um tempo suficiente após a infecção baculoviral para produzir ve- tores de ceDNA, mas antes de a maioria das células começar a morrer por causa da toxicidade baculoviral. Os vetores de DNA podem ser isolados usando kits de purificação de plasmídeo, como kits de plas- mídeo Qiagen Endo-Free Plasmid. Outros métodos desenvolvidos pa- ra o isolamento de plasmídeo também podem ser adaptados para ve- tores de DNA. Geralmente, qualquer método de purificação de ácido nucleico pode ser adotado.

[00288] Os vetores de DNA podem ser purificados por qualquer meio conhecido dos versados na técnica para purificação de DNA. Em uma modalidade, os vetores de ceDNA são purificados como molécu- las de DNA. Em outra modalidade, os vetores de ceDNA são purifica- dos como exossomos ou micropartículas.

[00289] A presença do vetor de ceDNA pode ser confirmada dige- rindo o DNA do vetor isolado das células com uma enzima de restrição com um único sítio de reconhecimento no vetor de DNA e analisando o material de DNA digerido e não digerido usando eletroforese em gel para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo. A Figura

4C e a Figura 4D ilustram uma modalidade para identificar a presença dos vetores de ceDNA de extremidade fechada produzidos pelos pro- cessos aqui descritos. B. PLASMÍDEO DE ceDNA

[00290] Um ceDNA-plasmídeo é um plasmídeo usado para produ- ção posterior de um vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, um plasmídeo de ceDNA pode ser construído usando técnicas conhecidas para fornecer pelo menos o seguinte como componentes operacional- mente ligados na direção da transcrição: (1) uma sequência de ITR 5' como aqui descrita (por exemplo, uma sequência de ITR 5' do tipo sel- vagem ou modificada); (2) um cassete de expressão contendo um elemento cis regulador, por exemplo, um promotor, promotor indutível, um interruptor regulador, um intensificador e similares; e (3) uma se- quência ITR 3' como aqui descrita (por exemplo, uma sequência de ITR 3' do tipo selvagem ou modificada), em que a sequência de ITR 3' é simétrica em relação à sequência de ITR 5'. Em algumas modalida- des, o cassete de expressão flanqueado pelas ITRs compreende um sítio de clonagem para a introdução de uma sequência exógena. O cassete de expressão substitui as regiões de codificação rep e cap dos genomas de AAV.

[00291] Em um aspecto, um vetor de ceDNA é obtido a partir de um plasmídeo, aqui dito como um "plasmídeo de ceDNA" que codifica nes- ta ordem: uma primeira repetição terminal invertida (ITR) de vírus ade- noassociado (AAV), um cassete de expressão que compreende pelo menos um transgene e um interruptor regulador, e uma ITR de AAV mutada ou modificada, em que o dito plasmídeo de ceDNA é despro- vido de sequências de codificação da proteína do capsídeo de AAV. Em modalidades alternativas, o plasmídeo de ceDNA codifica nesta ordem: uma primeira ITR (ou 5') de AAV modificada ou mutada, um cassete de expressão que compreende pelo menos um transgene e um interruptor regulador, e uma segunda ITR (ou 3') de AAV modifica- da, em que o dito plasmídeo de ceDNA é desprovido de sequências de codificação da proteína do capsídeo de AAV e em que as ITRs 5' e 3' são simétricas uma em relação à outra. Em modalidades alternativas, o plasmídeo de ceDNA codifica nesta ordem: uma primeira ITR (ou 5') de AAV modificada ou mutada, um cassete de expressão que compre- ende pelo menos um transgene e um interruptor regulador, e uma se- gunda ITR (ou 3') de AAV mutada ou modificada, em que o dito plas- mídeo de ceDNA é desprovido de sequências de codificação da prote- ína do capsídeo de AAV, e em que as ITRs modificadas em 5' e 3' têm as mesmas modificações (isto é, são complementos inversos ou simé- tricas entre si). Em modalidades alternativas, o plasmídeo de ceDNA codifica nesta ordem: uma primeira ITR do tipo selvagem (ou 5') de AAV, um cassete de expressão que compreende pelo menos um transgene e um interruptor regulador, e uma segunda ITR do tipo sel- vagem (ou 3') de AAV, em que o dito plasmídeo de ceDNA é desprovi- do de sequências de codificação da proteína do capsídeo de AAV e em que as ITRs 5' e 3' são simétricas uma em relação à outra. Em modalidades alternativas, o plasmídeo de ceDNA codifica nesta or- dem: uma primeira ITR do tipo selvagem (ou 5') de AAV, um cassete de expressão que compreende pelo menos um transgene e um inter- ruptor regulador, e uma segunda ITR do tipo selvagem (ou 3') de AAV, em que o dito plasmídeo de ceDNA é desprovido de sequências de codificação da proteína do capsídeo de AAV e em que as ITRs 5' e 3' são substancialmente simétricas uma em relação à outra.

[00292] Em uma outra modalidade, o sistema de ceDNA-plasmídeo é desprovido de sequências codificadoras de proteínas do capsídeo viral (isto é, desprovido de genes do capsídeo do AAV, mas também de genes do capsídeo de outros vírus). Além disso, em uma modalida- de específica, o ceDNA-plasmídeo também é desprovido de sequên-

cias de codificação da proteína AAV Rep. Por conseguinte, em uma modalidade preferencial, o plasmídeo de ceDNA é desprovido dos ge- nes funcionais cap de AAV e rep de AAV GG-3' para AAV2) mais uma sequência palindrômica variável que permite a formação em formato de grampo.

[00293] Um plasmídeo de ceDNA da presente invenção pode ser gerado usando sequências nucleotídicas naturais dos genomas de quaisquer sorotipos de AAV bem conhecidos na técnica. Em uma mo- dalidade, o esqueleto do plasmídeo ceDNA é derivado do genoma de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ e AAV-DJ8. Por exemplo, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; Kotin e Smith, The Springer Index of Virus, disponível na URL mantida pela Springer (no endereço da web: oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.)(nota - referências para uma URL ou banco de dados refere-se ao conteúdo da URL ou banco de dados a partir da data efetiva de depósito deste pedido). Em uma modalidade específica, o esqueleto do plasmídeo de ceDNA é derivado do genoma de AAV2. Em outra modalidade particu- lar, a estrutura principal do plasmídeo de ceDNA é uma estrutura prin- cipal sintética geneticamente modificada para incluir em suas ITRs 5' e 3' derivadas de um desses genomas de AAV.

[00294] Um plasmídeo de ceDNA pode opcionalmente incluir um marcador selecionável ou de seleção para uso no estabelecimento de uma linhagem celular produtora de vetor de ceDNA. Em uma modali- dade, o marcador de seleção pode ser inserido a jusante (isto é, 3') da sequência de ITR 3'. Em outra modalidade, o marcador de seleção po- de ser inserido a montante (isto é, 5') da sequência de ITR 5'. Marca- dores de seleção apropriados incluem, por exemplo, aqueles que con-

ferem resistência ao medicamento. Os marcadores de seleção podem ser, por exemplo, um gene de resistência a blasticidina S, canamicina, geneticina e similares. Em uma modalidade preferencial, o marcador de seleção de fármacos é um gene de resistência à blasticidina S.

[00295] Um ceDNA exemplificativo (por exemplo, rAAV0) é produzi- do a partir de um plasmídeo de rAAV. Um método para a produção de um vetor rAAV pode compreender: (a) fornecer uma célula hospedeira com um plasmídeo rAAV como descrito acima, em que a célula hos- pedeira e o plasmídeo são desprovidos de genes que codificam a pro- teína do capsídeo, (b) cultivam o hospedeiro célula sob condições que permitem a produção de um genoma de ceDNA, e (c) colher as células e isolar o genoma de AAV produzido a partir das ditas células. C. MÉTODO EXEMPLIFICATIVO DE PRODUÇÃO DE VETORES DE

CEDNA A PARTIR DE PLASMÍDEOS DE CEDNA

[00296] Os métodos para produzir vetores de ceDNA sem capsídeo também são aqui fornecidos, notadamente um método com um rendi- mento suficientemente alto para fornecer vetor suficiente para experi- ências in vivo.

[00297] Em algumas modalidades, um método para a produção de um vetor de ceDNA compreende as etapas de: (1) introdução da cons- truto de ácido nucleico que compreende um cassete de expressão e duas sequências ITR simétricas em uma célula hospedeira (por exem- plo, células Sf9), (2) opcionalmente, estabelecendo uma linhagem ce- lular clonal, por exemplo, usando um marcador de seleção presente no plasmídeo, (3) introduzindo um gene de codificação Rep (por transfec- ção ou infecção por um baculovírus carregando o dito gene) na dita célula de inseto, e (4) colheita da célula e purificação do vetor de ceD- NA. O construto de ácido nucleico que compreende um cassete de ex- pressão e duas sequências de ITR descritas acima para a produção do vetor AAV sem capsídeo pode estar na forma de um plasmídeo de ceDNA, ou Bacmídeo ou Baculovírus gerado com o plasmídeo de ce- DNA como descrito abaixo. O construto de ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula hospedeira por transfecção, transdução vi- ral, integração estável ou outros métodos conhecidos na técnica. D. LINHAS CELULARES

[00298] As linhagens celulares hospedeiras usadas na produção de um vetor de ceDNA podem incluir linhagens celulares de insetos deri- vadas de Spodoptera frugiperda, como Sf9 Sf21, ou células Trichoplu- sia ni, ou outras linhagens celulares invertebradas, vertebradas ou ou- tras linhagens celulares eucarióticas, incluindo células de mamíferos. Também podem ser utilizadas outras linhagens celulares conhecidas por um versado na técnica, como HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, He- plA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, monócitos e células dendríticas maduras e imaturas. As linhagens celulares hospe- deiras podem ser transfectadas para expressão estável do plasmídeo de ceDNA para produção de vetor de ceDNA de alto rendimento.

[00299] De acordo com algumas modalidades, os plasmídeos de ceDNAs podem ser introduzidos nas células Sf9 por transfecção tran- sitória usando reagentes (por exemplo, fosfato de cálcio, lipossômico) ou meios físicos (por exemplo, eletroporação) conhecidos na técnica. Alternativamente, podem ser estabelecidas linhagens celulares Sf9 estáveis que integraram estavelmente o plasmídeo de ceDNAem seus genomas. Tais linhagens celulares estáveis podem ser estabelecidas incorporando um marcador de seleção no plasmídeo de ceDNA como descrito acima. Se o plasmídeo de ceDNA usado para transfectar a linhagem celular incluir um marcador de seleção, como um antibiótico, as células que foram transfectadas com o plasmídeo de ceDNA e inte- graram o DNA do plasmídeo de ceDNA em seu genoma podem ser selecionadas para a adição do antibiótico para o meio de crescimento celular. Os clones resistentes das células podem então ser isolados por diluição de célula única ou por técnicas de transferência de colô- nias e propagados. E. ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE VETORES DE CEDNA

[00300] Exemplos do processo para obter e isolar vetores de ceD- NA são descritos nas Figuras 4A a 4E e os exemplos específicos abai- xo. Os vetores de ceDNA aqui divulgados podem ser obtidos a partir de uma célula produtora que expressa a proteína (ou proteínas) AAV Rep, posteriormente transformada com um plasmídeo de ceDNA, ce- DNA-bacmídeo ou ceDNA-baculovírus. Os plasmídeos úteis para a produção de vetores de ceDNA incluem plasmídeos mostrados na Fi- gura 9A (útil para produção de Rep BIICs), Figura 9B (plasmídeo usado para obter um vetor de ceDNA).

[00301] De acordo com algumas modalidades, um polinucleotídeo codifica a proteína AAV Rep (Rep 78 ou 68) entregue a uma célula produtora em um plasmídeo (plasmídeo Rep), um bacmídeo (Rep- bacmídeo) ou um baculovírus (Rep-baculovírus). O plasmídeo Rep, bacilo-rep e baculovírus Rep podem ser gerados pelos métodos des- critos acima.

[00302] Os métodos para produzir um vetor de ceDNA, que é um vetor de ceDNA exemplificativo, são descritos aqui. Os construtos de expressão usadas para gerar vetores de ceDNA da presente invenção podem ser um plasmídeo (por exemplo, plasmídeos de ceDNA), um bacmídeo (por exemplo, ceDNA-bacmídeo) e/ou um baculovírus (por exemplo, ceDNA-baculovírus). Apenas a título de exemplo, um vetor de ceDNA pode ser gerado a partir das células coinfectadas com ce- DNA-baculovírus e Rep-baculovírus. As proteínas rep produzidas a partir do baculovírus Rep podem replicar o ceDNA-baculovírus para gerar vetores de ceDNA. Alternativamente, os vetores de ceDNA po- dem ser gerados a partir das células transfectadas de maneira estável com um construto que compreende uma sequência que codifica a pro-

teína Rep AAV (Rep78/52) entregue em plasmídeos Rep, bacilos Rep ou baculovírus Rep. O CeDNA-Baculovírus pode ser transfectado transitoriamente para as células, ser replicado pela proteína Rep e produzir vetores de ceDNA.

[00303] A bacmida (por exemplo, ceDNA-bacmídeo) pode ser trans- fectada para células de inseto permissivas, como a célula Sf9, Sf21, Tni (Trichoplusia ni), célula High Five, e gerar ceDNA-baculovírus, que é um baculovírus recombinante, incluindo as sequências que compre- endem as ITRs simétricas e o cassete de expressão. O ceDNA- baculovírus pode ser novamente infectado nas células de insetos para obter uma próxima geração do baculovírus recombinante. Opcional- mente, a etapa pode ser repetida uma ou várias vezes para produzir o baculovírus recombinante em uma quantidade maior.

[00304] O tempo para colher e coletar vetores de ceDNA aqui des- critos a partir das células pode ser selecionado e otimizado para al- cançar uma produção de alto rendimento dos vetores de ceDNA. Por exemplo, o tempo de colheita pode ser selecionado em vista da viabili- dade celular, morfologia celular, crescimento celular, etc. Normalmen- te, as células podem ser colhidas após tempo suficiente após a infec- ção baculoviral para produzir vetores de ceDNA (por exemplo, vetores de ceDNA), mas antes da maioria das células começar a morrer por causa da toxicidade viral. Os vetores de ceDNA podem ser isolados das células Sf9 usando kits de purificação de plasmídeos, como os kits Qiagen ENDO-FREE PLASMID®. Outros métodos desenvolvidos para o isolamento de plasmídeo também podem ser adaptados para veto- res de ceDNA. Geralmente, qualquer método de purificação de ácido nucleico conhecido na técnica pode ser adotado, bem como kits de extração de DNA disponíveis comercialmente.

[00305] Alternativamente, a purificação pode ser implementada submetendo um sedimento celular a um processo de lise alcalina, cen-

trifugando o lisado resultante e realizando a separação cromatográfica. Como um exemplo não limitativo, o processo pode ser realizado carre- gando o sobrenadante em uma coluna de troca iônica (por exemplo, SARTOBIND Q®) que retém ácidos nucleicos e eluindo (por exemplo, com uma solução de NaCl 1,2 M) e realizando uma purificação croma- tográfica adicional em uma coluna de filtração em gel (por exemplo, 6 GE de fluxo rápido). O vetor AAV sem capsídeo é, então, recuperado por, por exemplo, precipitação.

[00306] Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA também podem ser purificados na forma de exossomos ou micropartículas. Sa- be-se na técnica que muitos tipos de células liberam não apenas pro- teínas solúveis, mas também cargas complexas de proteínas/ácidos nucleicos via desprendimento de microvesículas de membrana (Co- cucci et al, 2009; EP 10306226,1). Essas vesículas incluem microvesí- culas (também conhecidas como micropartículas) e exossomos (tam- bém chamados de nanovesículas), que compreendem proteínas e RNA como carga. As microvesículas são geradas a partir da brotação direta da membrana plasmática, e os exossomos são liberados no ambiente extracelular mediante a fusão dos endossomos multivesicu- lares com a membrana plasmática. Assim, microvesículas e/ou exos- somos contendo vetores de ceDNA podem ser isolados de células que foram transduzidas com o ceDNA-plasmídeo ou um bacmídeo ou ba- culovírus gerado com o plasmídeo de ceDNA.

[00307] As microvesículas podem ser isoladas submetendo o meio de cultura a filtração ou ultracentrifugação a 20.000 xg e exossomos a

100.000 x g. A duração ideal da ultracentrifugação pode ser determi- nada experimentalmente e dependerá do tipo de célula específico a partir do qual as vesículas são isoladas. Preferencialmente, o meio de cultura é primeiro limpo por centrifugação em baixa velocidade (por exemplo, a 2.000 xg por 5 a 20 minutos) e submetido à concentração de centrifugação utilizando, por exemplo, uma coluna de centrifugação AMICON® (Millipore, Watford, Reino Unido). As microvesículas e exossomos podem ser ainda mais purificados via FACS ou MACS usando anticorpos específicos que reconhecem antígenos de superfí- cie específicos presentes nas microvesículas e exossomos. Outros métodos de purificação de microvesículas e exossomos incluem, mas não estão limitados a, imunoprecipitação, cromatografia de afinidade, filtração e esferas magnéticas revestidas com anticorpos ou aptâmeros específicos. Após a purificação, as vesículas são lavadas com, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato. Uma vantagem do uso de microvesículas ou exossomos para entregar vesículas conten- do ceDNA é que essas vesículas podem ser direcionadas a vários ti- pos de células, incluindo em suas proteínas de membranas reconheci- das por receptores específicos nos respectivos tipos de células. (Con- sulte também EP 10306226)

[00308] Outro aspecto da invenção no presente documento se refe- re a métodos de purificação de vetores de ceDNA de linhagens celula- res hospedeiras que integraram estavelmente um construto de ceDNA em seu próprio genoma. Em uma modalidade, os vetores de ceDNA são purificados como moléculas de DNA. Em outra modalidade, os ve- tores de ceDNA são purificados como exossomos ou micropartículas.

[00309] A Figura 5 do PCT/US18/49996 mostra um gel confirmando a produção de ceDNA a partir de múltiplos construtos de plasmídeo de ceDNA usando o método descrito nos exemplos. O ceDNA é confir- mado por um padrão característico de banda no gel, como aqui discu- tido. VII. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

[00310] Em outro aspecto, são fornecidas composições farmacêuti- cas. A composição farmacêutica compreende um vetor de ceDNA, conforme divulgado no presente documento, e um carreador ou diluen-

te farmaceuticamente aceitável.

[00311] Os vetores de DNA como aqui divulgados podem ser incor- porados em composições farmacêuticas adequadas para administra- ção a um indivíduo para entrega in vivo a células, tecidos ou órgãos do indivíduo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende um vetor de ceDNA como aqui divulgado e um carreador farmaceutica- mente aceitável. Por exemplo, os vetores de ceDNA aqui descritos po- dem ser incorporados em uma composição farmacêutica adequada para uma via desejada de administração terapêutica (por exemplo, administração parentérica). Transdução passiva de tecido por infusão intravenosa ou intra-arterial de alta pressão, bem como injeção intrace- lular, como microinjeção intranuclear ou injeção intracitoplasmática, também são contempladas. As composições farmacêuticas para fins terapêuticos podem ser formuladas como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomas ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de vetor de ceDNA. As soluções injetáveis estéreis po- dem ser preparadas incorporando o composto de vetor de ceDNA na quantidade necessária em um tampão apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada.

[00312] As composições farmaceuticamente ativas que compreen- dem um vetor de ceDNA podem ser formuladas para entregar um transgene no ácido nucleico às células de um receptor, resultando na expressão terapêutica do transgene no mesmo. A composição tam- bém pode incluir um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00313] Um vetor de ceDNA como aqui divulgado pode ser incorpo- rado em uma composição farmacêutica adequada para administração tópica, sistêmica, intra-amniótica, intratecal, intracraniana, intra- arterial, intravenosa, intralinfática, intraperitoneal, subcutânea, tra- queal, intratecidual (por exemplo, intramuscular, intracardíaca, intra-

hepática, intrarrenal, intracerebral), intratecal, intravesical, conjuntival (por exemplo, extraorbital, intraorbital, retro-orbital, intrarretinal, sub- retiniana, coroidal, subcoroidal, intrastromal, intracameral e intravítrea), intracoclear e mucosal (por exemplo, oral, retal, nasal). Transdução passiva de tecido por infusão intravenosa ou intra-arterial de alta pres- são, bem como injeção intracelular, como microinjeção intranuclear ou injeção intracitoplasmática, também são contempladas.

[00314] As composições farmacêuticas para fins terapêuticos nor- malmente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabrica- ção e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomas ou outra estrutura or- denada adequada para alta concentração de vetor de ceDNA. As solu- ções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o com- posto de vetor de ceDNA na quantidade necessária em um tampão apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada.

[00315] Várias técnicas e métodos são conhecidos na técnica para fornecer ácidos nucleicos às células. Por exemplo, ácidos nucleicos, como ceDNA, podem ser formulados em nanopartículas lipídicas (LNPs), lipidoides, lipossomas, nanopartículas lipídicas, lipoplexos ou nanopartículas com núcleo-casca. Normalmente, as LNPs são com- postas de moléculas de ácido nucleico (por exemplo, ceDNA), um ou mais lipídios ionizáveis ou catiônicos (ou seus sais), um ou mais lipí- dios não iônicos ou neutros (por exemplo, um fosfolipídio), uma molé- cula que impede a agregação (por exemplo, PEG ou um conjugado de lipídio PEG) e, opcionalmente, um esterol (por exemplo, colesterol).

[00316] Outro método para fornecer ácidos nucleicos, como o ceD- NA a uma célula, é conjugando o ácido nucleico com um ligante que é internalizado pela célula. Por exemplo, o ligante pode se ligar a um receptor na superfície celular e internalizado via endocitose. O ligando pode ser covalentemente ligado a um nucleotídeo no ácido nucleico. Conjugados exemplificativos para a entrega de ácidos nucleicos em uma célula são descritos, por exemplo, nos documentos WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 e WO2017/177326.

[00317] Ácidos nucleicos, como ceDNA, também podem ser entre- gues a uma célula por transfecção. Métodos de transfecção úteis in- cluem, mas não estão limitados a, transfecção mediada por lipídios, transfecção catiônica mediada por polímero ou precipitação de fosfato de cálcio. Os reagentes de transfecção são bem conhecidos na técni- ca e incluem, mas não estão limitados a, Reagente de Transfecção TurboFect (Thermo Fisher Scientific), Reagente Pro-Ject (Thermo Fis- her Scientific), Reagente de Transfecção de Proteína P TRANS- PASS™ (New England Biolabs), Reagente para entrega de proteínas CHARIOT™ (motivo ativo), Reagente de transfecção de proteínas PROTEOJUICE™ (EMD Millipore), 293fectina, LIPOFECTAMINE™ 2000, LIPOFECTAMINE™ 3000 (Thermo Fisher Scientific), LIPOFEC- TAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), DMRIE-C, CELLFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), OLI- GOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FU- GENE™ (Roche, Basileia, Suíça), FUGENE™ HD (Roche), TRANS- FECTAM™ (Transfectam, Promega, Madison, Wis.), TFX-10™ (Pro- mega), TFX-20™ (Promega), TFX-50™ (Promega), TRANSFECTIN™ (BioRad, Hercules, Califórnia), SILENTFECT™ (Bio-Rad), Effectene™ (Qiagen, Valencia, Califórnia), DC-chol (lipídios polares da Avanti), GENEPORTER™ (Gene Therapy Sy hastes, San Diego, Califórnia), DHARMAFECT 1™ (Dharmacon, Lafayette, Colorado), DHARMA- FECT 2™ (Dharmacon), DHARMAFECT 3™ (Dharmacon), DHARMA-

FECT 4™ (Dharmacon), ESCORT™ III (Sigma, St. Louis, Mo.) e ES- CORT™ IV (Sigma Chemical Co.). Os ácidos nucleicos, como ceDNA, também podem ser entregues a uma célula através de métodos micro- fluídicos conhecidos pelos versados na técnica.

[00318] Métodos de entrega não viral de ácidos nucleicos in vivo ou ex vivo incluem eletroporação, lipofecção (consulte Patente U.S.

5.049.386; 4.946.787 e reagentes disponíveis comercialmente, como Transfectam™ e Lipofectin™), microinjeção, biolística, virossomas, lipossomas (consulte, por exemplo, Crystal, Science 270: 404 a 410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2: 291 a 297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5: 382 a 389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5: 647 a 654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2: 710 a 722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52: 4.817 a 4.820 (1992); Patentes nº U.S. 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054,

4.501.728, 4.774.085, 4.837.028 e 4.946.787), imunolipossomas, mi- crobolhas (Frenkel et al., Ultrasound Med. Biol. (2002) 28(6): 817 a 822; Tsutsui et al., Cardiovasc. Ultrasound (2004) 2:23), conjugados de policátion ou lipídio:ácido nucleico, DNA nu e absorção de DNA aumentada por agente. A sonoporação usando, por exemplo, o siste- ma Sonitron 2000 (Rich-Mar) também pode ser usada para a entrega de ácidos nucleicos.

[00319] Os vetores de ceDNA como aqui descritos também podem ser administrados diretamente a um organismo para a transdução de células in vivo. A administração é realizada por qualquer uma das vias normalmente usadas para introduzir uma molécula no contato final com células sanguíneas ou teciduais, incluindo, entre outras, injeção, infusão, aplicação tópica e eletroporação. Os métodos adequados pa- ra administrar esses ácidos nucleicos estão disponíveis e são bem co- nhecidos dos especialistas na técnica e, embora mais de uma via pos- sa ser usada para administrar uma composição específica, uma via específica pode frequentemente fornecer uma reação mais imediata e mais eficaz do que outra via.

[00320] Os métodos para introdução de um vetor de ceDNA de ve- tor de ácido nucleico, conforme divulgado neste documento, podem ser entregues em células-tronco hematopoiéticas, por exemplo, pelos métodos descritos, por exemplo, na Patente nº U.S. 5.928.638.

[00321] Vários métodos de entrega conhecidos na técnica ou modi- ficação dos mesmos podem ser utilizados para fornecer vetores de ceDNA in vitro ou in vivo. Por exemplo, em algumas modalidades, os vetores de ceDNA são entregues através da penetração transitória na membrana celular por energia mecânica, elétrica, ultrassônica, hidro- dinâmica ou baseada em laser, para facilitar a entrada de DNA nas células-alvo. Por exemplo, um vetor de ceDNA pode ser entregue in- terrompendo-se transitoriamente a membrana celular pressionando-se a célula através de um canal de tamanho restrito ou por outros meios conhecidos na técnica. Em alguns casos, um vetor de ceDNA sozinho é injetado diretamente como DNA nu na pele, timo, músculo cardíaco, músculo esquelético ou células hepáticas.

[00322] Em alguns casos, um vetor de ceDNA é entregue por gene gun. Partículas esféricas de ouro ou tungstênio (1 a 3 μm de diâmetro) revestidas com vetores de AAV sem capsídeo podem ser aceleradas em alta velocidade por gás pressurizado para penetrar nas células do tecido-alvo.

[00323] Em algumas modalidades, a eletroporação é usada para fornecer vetores de ceDNA. A eletroporação causa desestabilização temporária do tecido da célula-alvo da membrana celular através da inserção de um par de eletrodos no tecido, de modo que as moléculas de DNA no meio circundante da membrana desestabilizada possam penetrar no citoplasma e no nucleoplasma da célula. A eletroporação tem sido usada in vivo para muitos tipos de tecidos, como pele, pul-

mão e músculo.

[00324] Em alguns casos, um vetor de ceDNA é entregue por inje- ção hidrodinâmica, que é um método simples e altamente eficiente pa- ra a entrega intracelular direta de quaisquer compostos e partículas solúveis em água em órgãos internos e músculo esquelético em um membro inteiro.

[00325] Em alguns casos, os vetores de ceDNA são entregues por ultrassom, produzindo poros nanoscópicos na membrana para facilitar a entrega intracelular de partículas de DNA nas células de órgãos ou tumores internos, de modo que o tamanho e a concentração do DNA do plasmídeo tenham um grande papel na eficiência do sistema. Em alguns casos, os vetores de ceDNA são entregues por magnetofecção usando campos magnéticos para concentrar partículas contendo ácido nucleico nas células-alvo.

[00326] Em alguns casos, os sistemas de entrega química podem ser utilizados, por exemplo, usando complexos nanoméricos, que in- cluem a compactação de ácido nucleico carregado negativamente por partículas nanoméricas policatiônicas, pertencentes a lipossomos ca- tiônicos/micelas ou polímeros catiônicos. Os lipídios catiônicos usados para o método de entrega incluem, mas não se limitam a, lipídios ca- tiônicos monovalentes, lipídios catiônicos polivalentes, compostos con- tendo guanidina, compostos derivados de colesterol, polímeros catiô- nicos (por exemplo, poli (etilenimina), poli-L-lisina, protamina, outros catiônicos polímeros) e híbrido lipídio-polímero. A. EXOSSOMAS

[00327] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como aqui divulgado é entregue por ser empacotado em um exossomo. Os exos- somos são pequenas vesículas de membrana de origem endocítica que são liberadas no ambiente extracelular após a fusão de corpos multivesiculares com a membrana plasmática. Sua superfície consiste em uma bicamada lipídica da membrana celular da célula doadora, as mesmas contêm citosol da célula que produziu o exossomo e exibem proteínas da membrana da célula parental na superfície. Os exosso- mos são produzidos por vários tipos de células, incluindo células epite- liais, linfócitos B e T, mastócitos (MC) e células dendríticas (DC). Al- gumas modalidades, exossomos com diâmetro entre 10 nm e 1 μm, entre 20 nm e 500 nm, entre 30 nm e 250 nm, entre 50 nm e 100 nm, estão previstas para uso. Os exossomos podem ser isolados para uma entrega às células-alvo usando suas células doadoras ou introduzindo ácidos nucleicos específicos nelas. Várias abordagens conhecidas na técnica podem ser usadas para produzir exossomos contendo vetores de AAV sem capsídeo da presente invenção. B. MICROPARTIÍCULAS/NANOPARTÍCULAS

[00328] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como aqui divulgado é entregue por uma nanopartícula lipídica. De um modo ge- ral, as nanopartículas de lipídios compreendem um amino lípido ioni- zável (por exemplo, heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4- (dimetilamino)butanoato de etila, DLIN-MC3-DMA, uma fosfatidilcolina (1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina, DSPC), colesterol e um lipídio de revestimento (polietileno glicol-dimirristolglicerol, PEG-DMG), por exemplo, conforme divulgado por Tam et al. (2013). Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498 a 507.

[00329] Em algumas modalidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro médio entre cerca de 10 e cerca de 1.000 nm. Em algu- mas modalidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro inferior a 300 nm. Em algumas modalidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro entre cerca de 10 e cerca de 300 nm. Em algumas moda- lidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro inferior a 200 nm. Em algumas modalidades, uma nanopartícula lipídica tem um diâmetro entre cerca de 25 e cerca de 200 nm. Em algumas modalidades, uma preparação de nanopartículas lipídicas (por exemplo, composição que compreende uma pluralidade de nanopartículas lipídicas) tem uma dis- tribuição de tamanho na qual o tamanho médio (por exemplo, diâme- tro) é de cerca de 70 nm a cerca de 200 nm e, mais tipicamente, o ta- manho médio é de cerca de 100 nm ou menos.

[00330] Várias nanopartículas lipídicas conhecidas na técnica po- dem ser usadas para entregar o vetor de ceDNA aqui divulgado. Por exemplo, vários métodos de administração utilizando nanopartículas lipídicas são descritos nas patentes nº U.S. 9.404.127, 9.006.417 e

9.518.272.

[00331] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA divulgado neste documento é entregue por uma nanopartícula de ouro. Geral- mente, um ácido nucleico pode ser ligado covalentemente a uma na- nopartícula de ouro ou não covalentemente a uma nanopartícula de ouro (por exemplo, ligado por uma interação carga-carga), por exem- plo, como descrito por Ding et al. (2014). Gold Nanoparticles for Nu- cleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1.075 a 1.083. Em algumas mo- dalidades, os conjugados de nanopartículas de ácido nucleico de ouro são produzidos usando métodos descritos, por exemplo, na Patente nº U.S. 6.812.334. C. CONJUGADOS

[00332] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como aqui divulgado é conjugado (por exemplo, ligado covalentemente a um agente que aumenta a captação celular. Um "agente que aumenta a captação celular" é uma molécula que facilita o transporte de um ácido nucleico através de uma membrana lipídica. Por exemplo, um ácido nucleico pode ser conjugado com um composto lipofílico (por exemplo, colesterol, tocoferol, etc.), um peptídeo de penetração celular (CPP) (por exemplo, penetratina, TAT, Syn1B, etc.) e poliaminas (por exem- plo, espermina). Outros exemplos de agentes que aumentam a capta-

ção celular são divulgados, por exemplo, em Winkler (2013). Oligonu- cleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791 a

809.

[00333] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como aqui divulgado é conjugado com um polímero (por exemplo, uma molécula polimérica) ou uma molécula de folato (por exemplo, molécula de áci- do fólico). Geralmente, a entrega de ácidos nucleicos conjugados com polímeros é conhecida na técnica, por exemplo, como descrito nos do- cumentos WO2000/34343 e WO2008/022309. Em algumas modalida- des, um vetor de ceDNA como divulgado no presente documento é conjugado com um polímero de poli(amida), por exemplo, como des- crito pela Patente nº US 8.987.377. Em algumas modalidades, um áci- do nucleico descrito pela divulgação é conjugado com uma molécula de ácido fólico como descrito na Patente nº U.S. 8.507.455.

[00334] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como aqui divulgado é conjugado com um carboidrato, por exemplo, como des- crito na Patente nº U.S. 8.450.467. D. NANOCÁPSULA

[00335] Alternativamente, podem ser utilizadas formulações de na- nocápsulas de um vetor de ceDNA como aqui divulgado. As nanocáp- sulas geralmente podem aprisionar substâncias de maneira estável e reproduzível. Para evitar efeitos colaterais devido à sobrecarga polimé- rica intracelular, essas partículas ultrafinas (dimensionadas em torno de 0,1 µm) devem ser projetadas usando polímeros com capacidade de serem degradados in vivo. Nanopartículas de polialquil- cianoacrilato biodegradáveis que atendem a esses requisitos são con- templadas para uso. E. LIPOSSOMAS

[00336] Os vetores de ceDNA de acordo com a presente invenção podem ser adicionados aos lipossomas para entrega a uma célula ou órgão-alvo em um indivíduo. Lipossomas são vesículas que possuem pelo menos uma bicamada lipídica. Os lipossomas são tipicamente utilizados como carreadores para entrega de medicamen- tos/terapêuticos no contexto do desenvolvimento farmacêutico. Os mesmos trabalham fundindo-se com uma membrana celular e reposi- cionando sua estrutura lipídica para fornecer um medicamento ou in- grediente farmacêutico ativo (API). As composições de lipossomas pa- ra essa distribuição são compostas por fosfolipídios, especialmente compostos com um grupo fosfatidilcolina, no entanto, essas composi- ções também podem incluir outros lipídios.

[00337] A formação e utilização de lipossomas é geralmente conhe- cida pelos especialistas na técnica. Os lipossomas foram desenvolvi- dos com melhor estabilidade do soro e circulação por meio de tempos (Patente nº U.S. 5.741.516). Além disso, foram descritos vários méto- dos de preparações de lipossomas e semelhantes a lipossomas como potenciais transportadores de fármacos (Patentes nos U.S. 5.567.434;

5.552.157; 5.565.213; 5.565.213; 5.738.868 e 5.795.587).

[00338] Os lipossomas foram utilizados com sucesso com vários tipos de células que normalmente são resistentes à transfecção por outros procedimentos. Além disso, os lipossomas estão livres das res- trições de comprimento do DNA, típicas dos sistemas de entrega ba- seados em vírus. Os lipossomas foram utilizados eficazmente para in- troduzir genes, drogas, agentes radioterapêuticos, vírus, fatores de transcrição e efetores alostéricos em uma variedade de linhagens ce- lulares e animais cultivados. Além disso, vários ensaios clínicos bem- sucedidos que examinam a eficácia da administração de medicamen- tos mediada por lipossomas foram concluídos.

[00339] Os lipossomas são formados a partir de fosfolipídios dis- persos em meio aquoso e formam espontaneamente vesículas con- cêntricas multilamelares de bicamada (também denominadas vesícu-

las multilamelares (MLVs). Os MLVs geralmente têm diâmetros de 25 nm a 4 µm. A sonicação de MLVs resulta na formação de pequenas vesículas unilamelares (SUVs) com diâmetros na faixa de 200 a 500 ANG, contendo uma solução aquosa no núcleo.

[00340] Em algumas modalidades, um lipossoma compreende lipí- dios catiônicos. O termo "lipídio catiônico" inclui lipídios e lipídios sinté- ticos com domínios polares e não polares e que têm capacidade de serem carregados positivamente no pH fisiológico ou próximo aos mesmos e que se ligam a poliânions, como ácidos nucleicos, e facili- tam a entrega de ácidos nucleicos em células. Em algumas modalida- des, lipídios catiônicos incluem éteres alquílicos e alicíclicos saturados e insaturados e ésteres de aminas, amidas ou seus derivados. Em al- gumas modalidades, os lipídios catiônicos compreendem grupos alqui- la de cadeia linear, alquila ramificados, alquenila ou qualquer combi- nação dos anteriores. Em algumas modalidades, os lipídios catiônicos contêm de 1 a cerca de 25 átomos de carbono (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 átomos de carbono). Em algumas modalidades, lipídios catiônicos contêm mais de 25 átomos de carbono. Em algumas modalidades, os grupos alquila ou alceno de cadeia linear ou ramificada têm seis ou mais átomos de carbono. Um lipídio catiônico também pode compre- ender, em algumas modalidades, um ou mais grupos alicíclicos. Exemplos não limitativos de grupos alicíclicos incluem colesterol e ou- tros grupos esteroides. Em algumas modalidades, os lipídios catiôni- cos são preparados com um ou mais contraíons. Exemplos de contraí- ons (ânions) incluem, mas não estão limitados a, Cl-, Br-, I-, F-, acetato, trifluoroacetato, sulfato, nitrito e nitrato.

[00341] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que inclui um ou mais compostos com um grupo funci- onal de polietilenoglicol (PEG) (os chamados "compostos PEGilados")

que podem reduzir a imunogenicidade/antigenicidade de, fornecer hi- drofilicidade e hidrofobicidade ao composto (ou compostos) e reduza a frequência de dosagem. Ou a formulação de lipossomas simplesmente inclui polímero de polietilenoglicol (PEG) como um componente adicio- nal. Em tais aspectos, o peso molecular do grupo funcional PEG ou PEG pode ser de 62 Da a cerca de 5.000 Da.

[00342] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que fornecerá uma API com perfil de liberação prolon- gada ou liberação controlada durante um período de horas a semanas. Em alguns aspectos relacionados, a formulação de lipossomas pode compreender câmaras aquosas que são ligadas por bicamadas lipídi- cas. Em outros aspectos relacionados, a formulação de lipossomas encapsula uma API com componentes que passam por uma transição física a temperatura elevada que libera a API durante um período de horas a semanas.

[00343] Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas compre- ende esfingomielina e um ou mais lipídios aqui divulgados. Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas compreende optissomas.

[00344] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomo que inclui um ou mais lipídios selecionados a partir de: sal de sódio de N-(carbonil-metoxipolietilenoglicol 2000)-1,2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, (diestearoil-sn-glicerol- fosfoetanolamina), lipídio conjugado com MPEG (metóxi polietileno glicol), HSPC (soja hidrogenada fosfatidilcolina); PEG (polietileno gli- col); DSPE (diestearoil-sn-glicerofosfoetanolamina); DSPC (diestearoil- fosfatidilcolina); DOPC (dioleoilfosfatidilcolina); DPPG (dipalmitoilfosfa- tidilglicerol); EPC (fosfatidilcolina de ovo); DOPS (dioleoilfosfatidilseri- na); POPC (palmitoiloleoilfosfatidilcolina); SM (esfingomielina); MPEG (metóxi polietileno glicol); DMPC (dimiristoil fosfatidilcolina); DMPG (dimiristoil fosfatidilglicerol); DSPG (diestearoilfosfatidilglicerol); DEPC

(dierucoilfosfatidilcolina); DOPE (dioleol-sn-glicerofosfoetanolamina), sulfato de colesteril (CS), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), DOPC (dioleol-sn-glicero-fosfatidilcolina) ou qualquer combinação dos mes- mos.

[00345] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que compreende fosfolipídio, colesterol e um lipídio PEG-ilado em uma razão molar de 56:38:5. Em alguns aspectos, o conteúdo lipídico geral da formulação lipossômica é de 2 a 16 mg/ml. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipos- somo que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfati- dilcolina, um lipídio contendo um grupo funcional etanolamina e um lipídio PEG-ilado. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma for- mulação de lipossomo que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfatidilcolina, um lipídio contendo um grupo funcional eta- nolamina e um lipídio PEG-ilado em uma proporção molar de 3:0,015:2, respectivamente. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomo que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfatidilcolina, colesterol e um lipídio PEG-ilado. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipos- somo que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfati- dilcolina e colesterol. Em alguns aspectos, o lipídio PEG-ilado é PEG- 2000-DSPE. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formula- ção de lipossomas que compreende DPPG, PC de soja, conjugado lipídico MPEG-DSPE e colesterol.

[00346] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que compreende um ou mais lipídios contendo um gru- po funcional fosfatidilcolina e um ou mais lipídios contendo um grupo funcional etanolamina. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que compreende um ou mais: lipídios con- tendo um grupo funcional fosfatidilcolina, lipídios contendo um grupo funcional etanolamina e esteróis, por exemplo, colesterol. Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas compreende DOPC/DEPC; e DOPE.

[00347] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomo que compreende ainda um ou mais excipientes farma- cêuticos, por exemplo, sacarose e/ou glicina.

[00348] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomo que é de estrutura unilamelar ou multilamelar. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que compreende partículas multivesiculares e/ou partículas à base de es- puma. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que são maiores em tamanho relativo às nanopartículas comuns e cerca de 150 a 250 nm em tamanho. Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas é um pó liofilizado.

[00349] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que é feita e carregada com vetores de ceDNA divulga- dos ou descritos neste documento, adicionando uma base fraca a uma mistura com o ceDNA isolado fora do lipossomo. Essa adição aumenta o pH fora dos lipossomos para aproximadamente 7,3 e leva a API aos lipossomas. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formula- ção de lipossomas com um pH ácido no interior dos lipossomas. Nes- ses casos, o interior dos lipossomas pode estar em pH 4 a 6,9 e, mais preferencialmente, em pH 6,5. Em outros aspectos, a divulgação for- nece uma formulação de lipossomas feita usando a tecnologia de es- tabilização de fármaco intralipossômico. Nesses casos, são utilizados ânions poliméricos ou não poliméricos de alta carga e agentes de cap- tura intralipossômicos, por exemplo, polifosfato ou octassulfato de sa- carose.

[00350] Em outros aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que compreende fosfolipídios, lecitina, fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina.

[00351] Exemplos não limitativos de lipídios catiônicos incluem poli- etilenimina, dendrímeros de explosão em estrela de poliamidoamina (PAMAM), lipofectina (uma combinação de DOTMA e DOPE), lipofec- tase, LIPOFECTAMINE™ (por exemplo, LIPOFECTAMINE™ 2000), DOPE, citofectina (Gilead Sciences, Foster City, Califórnia.), e Eufec- tins (JBL, San Luis Obispo, Califórnia). Lipossomas catiônicos exempli- ficativos podem ser produzidos a partir de cloreto de N-[1-(2,3- dioleoloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamônia (DOTMA), metilssulfato de N- [1-(2,3-dioleoloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamônia (DOTAP), 3β-[N-(N′, N′- dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol), 2,3,-dioliloxi-N- [2(esperminecarboxamido)trifluoroacetato de etil]-N,N-dimetil-1- propanamina (DOSPA), brometo de 1,2-dimiriloxipropil-3-dimetil- hidroxietil amônia; e brometo de dimetildioctadecilamônia (DDAB). Os ácidos nucleicos (por exemplo, CELiD) também podem ser complexos com, por exemplo, poli(L-lisina) ou avidina e lipídios podem, ou não podem, ser incluídos nessa mistura, por exemplo, esteril-poli (L-lisina).

[00352] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA como aqui divulgado é entregue usando um lipídio catiônico descrito na Patente nº U.S. 8.158.601, ou um composto ou lipídio de poliamina como des- crito na Patente nº U.S. 8.034.376. F. COMPOSIÇÕES DE LIPOSSOMAS E NANOPARTÍCULAS LIPÍDI- CAS (LNP) EXEMPLIFICATIVAS

[00353] Os vetores de ceDNA de acordo com a presente invenção podem ser adicionados aos lipossomas para entrega a uma célula que necessita de edição de genes, por exemplo, que precisa de uma se- quência de doadores. Lipossomas são vesículas que possuem pelo menos uma bicamada lipídica. Os lipossomas são tipicamente utiliza- dos como carreadores para entrega de medicamentos/terapêuticos no contexto do desenvolvimento farmacêutico. Os mesmos trabalham fundindo-se com uma membrana celular e reposicionando sua estrutu- ra lipídica para fornecer um medicamento ou ingrediente farmacêutico ativo (API). As composições de lipossomas para essa distribuição são compostas por fosfolipídios, especialmente compostos com um grupo fosfatidilcolina, no entanto, essas composições também podem incluir outros lipídios.

[00354] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que inclui um ou mais compostos com um grupo funci- onal de polietilenoglicol (PEG) (os chamados "compostos PEGilados") que podem reduzir a imunogenicidade/antigenicidade de, fornecer hi- drofilicidade e hidrofobicidade ao composto (ou compostos) e reduza a frequência de dosagem. Ou a formulação de lipossomas simplesmente inclui polímero de polietilenoglicol (PEG) como um componente adicio- nal. Em tais aspectos, o peso molecular do grupo funcional PEG ou PEG pode ser de 62 Da a cerca de 5.000 Da.

[00355] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que fornecerá uma API com perfil de liberação prolon- gada ou liberação controlada durante um período de horas a semanas. Em alguns aspectos relacionados, a formulação de lipossomas pode compreender câmaras aquosas que são ligadas por bicamadas lipídi- cas. Em outros aspectos relacionados, a formulação de lipossomas encapsula uma API com componentes que passam por uma transição física a temperatura elevada que libera a API durante um período de horas a semanas.

[00356] Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas compre- ende esfingomielina e um ou mais lipídios aqui divulgados. Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas compreende optissomas.

[00357] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomo que inclui um ou mais lipídios selecionados a partir de: sal de sódio de N-(carbonil-metoxipolietilenoglicol 2000)-1,2-

diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, (diestearoil-sn-glicerol- fosfoetanolamina), lipídio conjugado com MPEG (metóxi polietileno glicol), HSPC (soja hidrogenada fosfatidilcolina); PEG (polietileno gli- col); DSPE (diestearoil-sn-glicerofosfoetanolamina); DSPC (diestearoil- fosfatidilcolina); DOPC (dioleoilfosfatidilcolina); DPPG (dipalmitoilfosfa- tidilglicerol); EPC (fosfatidilcolina de ovo); DOPS (dioleoilfosfatidilseri- na); POPC (palmitoiloleoilfosfatidilcolina); SM (esfingomielina); MPEG (metóxi polietileno glicol); DMPC (dimiristoil fosfatidilcolina); DMPG (dimiristoil fosfatidilglicerol); DSPG (diestearoilfosfatidilglicerol); DEPC (dierucoilfosfatidilcolina); DOPE (dioleol-sn-glicerofosfoetanolamina), sulfato de colesteril (CS), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), DOPC (dioleol-sn-glicero-fosfatidilcolina) ou qualquer combinação dos mes- mos.

[00358] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que compreende fosfolipídio, colesterol e um lipídio PEG-ilado em uma razão molar de 56:38:5. Em alguns aspectos, o conteúdo lipídico geral da formulação lipossômica é de 2 a 16 mg/ml. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipos- somo que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfati- dilcolina, um lipídio contendo um grupo funcional etanolamina e um lipídio PEG-ilado. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma for- mulação de lipossomo que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfatidilcolina, um lipídio contendo um grupo funcional eta- nolamina e um lipídio PEG-ilado em uma proporção molar de 3:0,015:2, respectivamente. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomo que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfatidilcolina, colesterol e um lipídio PEG-ilado. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipos- somo que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfati- dilcolina e colesterol. Em alguns aspectos, o lipídio PEG-ilado é PEG-

2000-DSPE. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formula- ção de lipossomas que compreende DPPG, PC de soja, conjugado lipídico MPEG-DSPE e colesterol.

[00359] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que compreende um ou mais lipídios contendo um gru- po funcional fosfatidilcolina e um ou mais lipídios contendo um grupo funcional etanolamina. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que compreende um ou mais: lipídios con- tendo um grupo funcional fosfatidilcolina, lipídios contendo um grupo funcional etanolamina e esteróis, por exemplo, colesterol. Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas compreende DOPC/DEPC; e DOPE.

[00360] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomo que compreende ainda um ou mais excipientes farma- cêuticos, por exemplo, sacarose e/ou glicina.

[00361] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que é de estrutura unilamelar ou multilamelar. Em al- guns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que compreende partículas multivesiculares e/ou partículas à base de espuma. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que são maiores em tamanho relativo às nanopartículas comuns e cerca de 150 a 250 nm em tamanho. Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas é um pó liofilizado.

[00362] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que é feita e carregada com vetores de ceDNA divulga- dos ou descritos neste documento, adicionando uma base fraca a uma mistura com o ceDNA isolado fora do lipossomo. Essa adição aumenta o pH fora dos lipossomos para aproximadamente 7,3 e leva a API aos lipossomas. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formula- ção de lipossomas com um pH ácido no interior dos lipossomas. Nes-

ses casos, o interior dos lipossomas pode estar em pH 4 a 6,9 e, mais preferencialmente, em pH 6,5. Em outros aspectos, a divulgação for- nece uma formulação de lipossomas feita usando a tecnologia de es- tabilização de fármaco intralipossômico. Nesses casos, são utilizados ânions poliméricos ou não poliméricos de alta carga e agentes de cap- tura intralipossômicos, por exemplo, polifosfato ou octassulfato de sa- carose.

[00363] Em outros aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que compreende fosfolipídios, lecitina, fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina. Em algumas modalidades, a formulação lipos- sômica é uma formulação descrita na Tabela 6 a seguir. TABELA 6: FORMULAÇÕES LIPOSSÔMICAS EXEMPLIFICATIVAS. Composição pH Composição pH MPEG-DSPE (3,19 mg/ml) 6,5 DSPC (28,16 mg/ml) 4,9 a HSPC (9,58 mg/ml) Colesterol (6,72 mg/ml) 6,0 Colesterol (3,19 mg/ml) DOPC (5,7 mg/ml) 5,5 a Fosfatidilcolina do ovo:colesterol (ra- 7,8 Colesterol (4,4 mg/ml) 8,5 zão molar de 55:45) [reconstit. do liofi- Trioleína (1,2 mg/ml) lizado em tampão de carbonato de só- dio] DPPG (1,0 mg/ml) DOPS:POPC (razão molar 4,5 a Esfingomielina (2,37 mg/ml, 73,5 7,2 a de 3:7) 7,0 mg/31 ml) 7,6 1 g de lipídio/frasco total Colesterol (0,95 mg/ml, [reconstit. de liofilizado 29,5 mg/31 ml) [reconstit. do liofilizado NaCl a 09%] em sol. de fosfato de sódio] DSPC (6,81 mg/ml) 6,8 a DMPC (3,4 mg/ml) 5,0 a Colesterol (2,22 mg/ml) 7,6 DMPG (1,5 mg/ml) 7,0 MPEG-2000-DSPE (0,12 em uma razão molar de 7:3 mg/ml) HSPC (17,75 mg/ml, 5,0 a Colesteril sulfato de sódio (2,64 mg/ml) 213 mg/12 ml) 6,0 [reconstituição. do liofilizado em água Colesterol (4,33 mg/ml, estéril] 52 mg/12 ml) DSPG (7,0 mg/ml, 84 mg/12 ml) [reconstit. do liofilizado em água estéril]

Composição pH Composição pH DMPC e EPG DOPC (4,2 mg/ml) 5,0 a (Razão molar de 1:8) [re- Colesterol (3,3 mg/ml) 8,0 constit. do liofilizado em DPPG (0,9 mg/ml) água estéril] Tricaprilina (0,3 mg/ml) Trioleína (0,1 mg/ml) Colesterol (4,7 mg/ml) 5,8 a DOPC:DOPE DPPG (0,9 mg/ml) 7,4 (Razão molar de 75:25) Tricaprilina (2,0 mg/ml) DEPC (8,2 mg/ml)

[00364] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma nanopartí- cula lipídica que compreende ceDNA e um lipídio ionizável. Por exem- plo, uma formulação de nanopartículas lipídicas que é feita e carrega- da com ceDNA obtida pelo processo conforme divulgado no Pedido Internacional PCT/US2018/050042, depositado em 7 de setembro de 2018, que é incorporado aqui. Isso pode ser conseguido através da mistura de alta energia de lipídios etanólicos com ceDNA aquoso a pH baixo, que protona o lipídio ionizável e fornece energia favorável para a associação de ceDNA/lipídio e nucleação de partículas. As partículas podem ser ainda mais estabilizadas através de diluição aquosa e re- moção do solvente orgânico. As partículas podem ser concentradas no nível desejado.

[00365] Geralmente, as partículas lipídicas são preparadas na ra- zão total entre lipídios e ceDNA (massa ou peso) de cerca de 10:1 a 30:1. Em algumas modalidades, a razão de lipídio para ceDNA (razão de massa/massa; razão de peso/peso) pode estar na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 25:1, de cerca de 10:1 a cerca de 14:1, de cerca de 3:1 a cerca de 15:1, de cerca de 4:1 a cerca de 10:1, de cerca de 5:1 a cerca de 9:1 ou cerca de 6:1 a cerca de 9:1. As quantidades de lipídios e ceDNA podem ser ajustadas para fornecer uma razão N/P desejada, por exemplo, razão N/P de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou superior. Geral- mente, o teor lipídico geral da formulação de partículas lipídicas pode variar de cerca de 5 mg/ml a cerca de 30 mg/ml.

[00366] O lipídio ionizável é tipicamente empregado para condensar a carga de ácido nucleico, por exemplo, ceDNA, a pH baixo e conduzir a associação e fusogenicidade de membrana. Geralmente, lipídios io- nizáveis são lipídios que compreendem pelo menos um grupo amino que é carregado positivamente ou se torna protonado sob condições ácidas, por exemplo, a pH de 6,5 ou menos. Os lipídios ionizáveis são também aqui ditos como lipídios catiônicos.

[00367] Lipídios ionizáveis exemplificativos são descritos nos pedi- dos de patente PCT WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346, e WO2013/086354, e pedidos de patente U.S. US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541,

US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458 e US2013/0195920, cujo conteúdo dos mesmos é incorporado ao presente documento a título de referência em sua tota- lidade.

[00368] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il-4- (dimetilamino)butanoato (DLin-MC3-DMA ou MC3) com a seguinte es- trutura: .

[00369] O lipídio DLin-MC3-DMA é descrito em Jayaraman et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8.529 a 8.533, cujo conte- údo é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[00370] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é o lipídio ATX-002 que tem a seguinte estrutura:

.

[00371] O lipídio ATX-002 é descrito no documento WO2015/074085, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referên- cia em sua totalidade.

[00372] Em algumas modalidades, o lípido ionizável é (13Z,16Z)- N,N-dimetil-3-nonildocosa-13,16-dien-1-amina (Composto 32) que tem a seguinte estrutura: .

[00373] O composto 32 é descrito em WO2012/040184, cujo conte- údo é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[00374] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é o composto 6 ou o composto 22 que tem a seguinte estrutura:

[00375] Os compostos 6 e 22 são descritos no documento WO2015/199952, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referên- cia em sua totalidade.

[00376] Sem limitações, o lipídio ionizável pode compreender 20 a 90% (mol) do lipídio total presente na nanopartícula lipídica. Por exemplo, o conteúdo molar lipídico ionizável pode ser 20 a 70% (mol), 30 a 60% (mol) ou 40 a 50% (mol) do lipídio total presente na nanopar- tícula lipídica. Em algumas modalidades, o lipídio ionizável compreen- de de cerca de 50% em mol a cerca de 90% em mol do lipídio total presente na nanopartícula lipídica.

[00377] Em alguns aspectos, a nanopartícula lipídica pode ainda compreender um lipídio não catiônico. Os lipídios não iônicos incluem lipídios anfipáticos, lipídios neutros e lipídios aniônicos. Por conseguin- te, o lipídio não catiônico pode ser um lipídio neutro não carregado, zwitteriônico ou aniônico. Lipídios não catiônicos são tipicamente em- pregados para aumentar a fusogenicidade.

[00378] Lipídios não catiônicos exemplificativos incluem, porém, sem limitação, diestearoil-sn-glicero-fosfoetanolamina, diestearoilfosfa- tidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidil- colina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilgli- cerol (DPPG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfos- fatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), diole- oil-fosfatidiletanolamina 4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-1- carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), di- miristoilfosfoetanolamina (DMPE), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), monometil-fosfatidiletanolamina (como 16-O-monometil PE), dimetil-fosfatidiletanolamina (como 16-O-dimetil PE), 18-1-trans PE, 1- estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), soja fosfatidilcolina hi- drogenada (HSPC), ovo de fosfatidilcolina (EPC), dioleoilfosfatidilseri- na (DOPS), esfingomielina (SM), dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG), diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG), dierucoilfosfatidilcolina (DEPC), palmitoiloleiolfosfatidilglicerol (POPG), dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE), lecitina, fosfatidiletanolamina,

lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, ovo de esfingomielian (ESM), cefalina, cardiolipina, fos- fatídeo, cerebrosidas, dicetilfosfato, lisofosfatidilcolina, dilinoleoilfosfa- tidilcolina, ou misturas dos mesmos. Entende-se que outros fosfolipí- dios diacilfosfatidilcolina e diacilfosfatidiletanolamina também podem ser usados. Os grupos acila destes lipídios são, de preferência, grupos acila derivados de ácidos graxos que têm C10-C24 cadeias de carbono, por exemplo, lauroíla, miristoíla, palmitoíla, estearoíla ou oleoíla.

[00379] Outros exemplos de lipídios não catiônicos adequados para uso nas nanopartículas lipídicas incluem lipídios não fosforosos, como, por exemplo, estearilamina, dodecilamina, hexadecilamina, acetil pal- mitato, glicerolricinoleato, hexadecil estereato, isopropil miristato, polí- meros anfotéricos de acrilato, trietilanol, alquilterotil-amina amidas de ácidos graxos polietiloxilados de sulfato de arila, brometo de dioctade- cildimetil amônio, ceramida, esfingomielina e semelhantes.

[00380] Em algumas modalidades, o lipídio não catiônico é um fos- folipídio. Em algumas modalidades, o lipídio não catiônico é seleciona- do dentre DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOC e SM. Em algu- mas modalidades preferenciais, o lipídio não catiônico é DPSC.

[00381] Os lipídios não catiônicos exemplificativos são descritos na publicação PCT WO2017/099823 e no pedido de patente nº U.S. US2018/0028664, cujo conteúdo de ambos é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade. Em alguns exemplos, o lipídio não catiônico é ácido oleico ou um composto de Fórmula (I), , Fórmula (II) ou Fórmula (IV), , conforme definido em US2018/0028664, cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.

[00382] O lipídio não catiônico pode compreender 0 a 30% (mol) do lipídio total presente na nanopartícula lipídica. Por exemplo, o teor lipí- dico não catiônico é de 5 a 20% (mol) ou 10 a 15% (mol) do lipídio to- tal presente na nanopartícula lipídica. Em várias modalidades, a razão molar de lipídio ionizável para lipídio neutro está na faixa de cerca de 2:1 a cerca de 8:1.

[00383] Em algumas modalidades, as nanopartículas lipídicas não compreendem fosfolipídios.

[00384] Em alguns aspectos, a nanopartícula lipídica pode ainda compreender um componente, como um esterol, para fornecer integri- dade à membrana.

[00385] Um esterol exemplificativo que pode ser usado na nanopar- tícula lipídica é o colesterol e seus derivados. Exemplos não limitativos de derivados do colesterol incluem análogos polares como 5α- colestanol, 5β-coprostanol, éter de colesteril-(2′-hidroxi)-etila, éter de colesteril-(4′-hidroxi)-butila e 6-cetocolestanol; análogos não polares, como 5α-colestano, colestenona, 5α-colestanona, 5β-colestanona e decanoato de colesteril; e suas misturas. Em algumas modalidades, o derivado do colesterol é um análogo polar, como éter colesteril-(4'- hidroxi)-butílico.

[00386] Exemplos de derivados de colesterol são descritos na pu- blicação PCT WO2009/127060 e no pedido de patente U.S. US2010/0130588, cujo conteúdo de ambos é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[00387] O componente que fornece integridade da membrana, co- mo um esterol, pode compreender 0 a 50% (mol) do lipídio total pre- sente na nanopartícula lipídica. Em algumas modalidades, esse com- ponente é 20 a 50% (mol) 30 a 40% (mol) do conteúdo lipídico total da nanopartícula lipídica.

[00388] Em alguns aspectos, a nanopartícula lipídica pode ainda compreender um polietilenoglicol (PEG) ou uma molécula lipídica con- jugada. Geralmente, os mesmos são utilizados para inibir a agregação de nanopartículas lipídicas e/ou proporcionar estabilização estérica. Os lipídios conjugados exemplificativos incluem, mas não estão limita- dos a, conjugados de PEG-lipídicos, conjugados de (POZ)-lipídio poli- oxazolina, conjugados de poliamida-lipídios (como conjugados ATTA- lipídicos), conjugados de lipídio catiônico-polímero (CPL), e suas mis- turas. Em algumas modalidades, a molécula lipídica conjugada é um conjugado de PEG-lipídio, por exemplo, um lipídio conjugado com (metóxi polietilenoglicol).

[00389] Conjugados de PEG-lipídio exemplificativos incluem, mas não estão limitados a, PEG-diacilglicerol (DAG) (como 1-(monometóxi- polietilenoglicol)-2,3-dimiristoilglicerol (PEG-DMG)), PEG- dialquiloxipropil (DAA), PEG fosfolipídico, PEG-ceramida (Cer), uma fosfatidiletanoloamina peguilada (PEG-PE), succinato diacilglicerol de PEG (PEGS-DAG) (como 4-O-(2',3'-di(tetradecanoiloxi)propil-1-O-(w- metóxi(polietóxi)etil)butanodioato (PEG-S-DMG)), PEG dialcoxipropil- carbam, sal de sódio N-(carbonil-metoxipolietilenoglicol 2000)-1,2- diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, ou uma mistura dos mes- mos. Conjugados de PEG-lipídios exemplificativos adicionais são des- critos, por exemplo, em US5.885.613, US6.287.591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224 e US2017/0119904, cujo conteúdo dos mesmos é incorporado ao pre- sente documento a título de referência em sua totalidade.

[00390] Em algumas modalidades, um PEG-lipídio é um composto de Fórmula (III), , Fórmula (III-a-I), , Fórmula (III-a-2),

, Fórmula (III-b-1), , Fórmula (III-b-2), ou Fórmula (V), , con- forme definido em US2018/0028664, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[00391] Em algumas modalidades, um PEG-lipídio é de Fórmula (II), , conforme definido em US20150376115 ou em US2016/0376224, cujo conteúdo de ambos é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.

[00392] O conjugado PEG-DAA pode ser, por exemplo, PEG- dilauriloxipropila, PEG-dimiristiloxipropila, PEG-dipalmitiloxipropila ou PEG-diesteariloxipropila. O PEG-lipídio pode ser um ou mais dentre PEG-DMG, PEG-dilaurilglicerol, PEG-dipalmitoilglicerol, PEG- diesterilglicerol, PEG-dilaurilglicamida, PEG-dimirristilglicamida, PEG- dipalmitoilglicamida, PEG-colesterol ((1-[8'-(Colest-5-en-3[beta]- óxi)carboxamido-3',6'-dioxaoctanil]carbamoil-[ômega]-metil- poli(etilenoglicol), PEG-DMB (3,4-Ditetradecoxilbenzil-[ômega]-metil- poli(etilenoglicol)éter) e 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metóxi(polietilenoglicol)-2000]. Em alguns exemplos, o PEG-lipídio pode ser selecionado do grupo que consiste em PEG-DMG, 1,2- dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metóxi(polietilenoglicol)- 2000],

, , ,e .

[00393] Os lipídios conjugados com uma molécula que não seja um PEG também podem ser usados no lugar do PEG-lipídio. Por exemplo, os conjugados de (POZ)-lípido polioxazolina, conjugados de poliamida- lípido (como conjugados ATTA-lípido) e conjugados catiônicos de po- límero-lípido (CPL) podem ser utilizados no lugar ou em adição ao PEG-lipídio.

[00394] Lipídios conjugados exemplificativos, isto é, PEG-lipídios, conjugados de (POZ)-lipídios, conjugados ATTA-lipídios e polímeros- lipídios catiônicos são descritos nas publicações de pedido de patente WO1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104, e WO2010/006282, Publicações de Pedido de Patente U.S. US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587, e US20110123453, e patentes nº U.S. 5.885.613, U.S. 6.287.591, U.S.

6.320.017, e U.S. 6.586.559, cujo conteúdo dos mesmos é incorpora- do ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[00395] O PEG ou o lipídio conjugado pode compreender 0 a 20% (mol) do lipídio total presente na nanopartícula lipídica. Em algumas modalidades, o PEG ou o conteúdo lipídico conjugado é de 0,5 a 10% ou 2 a 5% (mol) do lipídio total presente na nanopartícula lipídica.

[00396] As razões molares do lipídio ionizável, lipídio não catiônico, esterol e PEG/lipídio conjugado podem variar conforme necessário. Por exemplo, a partícula lipídica pode compreender 30 a 70% de lipí- dios ionizáveis em mol ou em peso total da composição, 0 a 60% de colesterol em mol ou em peso total da composição, 0 a 30% de lipídios não catiônicos em mol ou em peso total da composição e 1 a 10% de lipídio conjugado em mol ou em peso total da composição. De prefe- rência, a composição compreende 30 a 40% de lipídios ionizáveis em mol ou em peso total da composição, 40 a 50% de colesterol em mol ou em peso total da composição e 10 a 20% de lipídios não catiônicos em mol ou por peso total da composição. Em algumas outras modali- dades, a composição é 50 a 75% de lipídios ionizáveis em mol ou pelo peso total da composição, 20 a 40% de colesterol em mol ou pelo pe- so total da composição e 5 a 10% de lipídios não catiônicos, em mol ou em peso total da composição e 1 a 10% de lipídio conjugado em mol ou em peso total da composição. A composição pode conter 60 a 70% de lipídios ionizáveis em mol ou em peso total da composição, 25 a 35% de colesterol em mol ou pelo peso total da composição e 5 a 10% de lipídios não catiônicos em mol ou por total peso da composi- ção. A composição também pode conter até 90% de lipídios ionizáveis em mol ou em peso total da composição e 2 a 15% de lipídios não ca- tiônicos em mol ou em peso total da composição. A formulação tam- bém pode ser uma formulação de nanopartículas lipídicas, por exem- plo que compreende 8 a 30% de lipídios ionizáveis em mol ou por pe-

so total da composição, 5 a 30% de lipídios não catiônicos em mol ou por peso total da composição e 0 a 20% em mol de colesterol ou em peso total da composição; 4 a 25% de lipídio ionizável em mol ou em peso total da composição, 4 a 25% de lipídio não catiônico em mol ou em peso total da composição, 2 a 25% de colesterol em mol ou em peso total da composição, 10 a 35% de lipídio conjugado em mol ou em peso total da composição e 5% de colesterol em mol ou em peso total da composição; ou 2 a 30% de lipídio ionizável em mol ou em pe- so total da composição, 2 a 30% de lipídio não catiônico em mol ou em peso total da composição, 1 a 15% de colesterol em mol ou em peso total da composição, 2 a 35% de lipídio conjugado em mol ou em peso total da composição e 1 a 20% de colesterol em mol ou em peso total da composição; ou mesmo até 90% de lipídios ionizáveis em mol ou em peso total da composição e 2 a 10% de lipídios não catiônicos em mol ou em peso total da composição, ou mesmo 100% de lipídio catiô- nico em mol ou em peso total de composição. Em algumas modalida- des, a formulação de partículas lipídicas compreende lipídios ionizá- veis, fosfolipídios, colesterol e um lipídio PEG-ilado em uma razão mo- lar de 50:10:38,5:1,5. Em algumas outras modalidades, a formulação de partículas lipídicas compreende lipídios ionizáveis, colesterol e um lipídio PEG-ilado em uma razão molar de 60:38,5:1,5.

[00397] Em algumas modalidades, a partícula lipídica compreende lipídio ionizável, lipídio não catiônico (por exemplo, fosfolipídio), um esterol (por exemplo, colesterol) e um lipídio PEG-ilado, em que a ra- zão molar de lipídios está na faixa de 20 a 70% em mols para o lipídio ionizável, com uma meta de 40 a 60, a porcentagem molar de lipídios não catiônicos está na faixa de 0 a 30, com uma meta de 0 a 15, a porcentagem molar de esterol está na faixa de 20 a 70, com uma meta de 30 a 50, e a porcentagem molar de lipídios PEG-ilados está na fai- xa de 1 a 6, com uma meta de 2 a 5.

[00398] Nanopartículas lipídicas (LNPs) que compreendem ceDNA são divulgadas no Pedido Internacional PCT/US2018/050042, deposi- tado em 7 de setembro de 2018, que é incorporado aqui em sua totali- dade e previsto para uso nos métodos e composições aqui divulgados.

[00399] O tamanho de partícula de nanopartículas lipídicas pode ser determinado por espalhamento de luz quase elástico usando um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, Reino Unido) e tem aproxima- damente 50 a 150 nm de diâmetro, aproximadamente 55 a 95 nm de diâmetro ou aproximadamente 70 a 90 nm de diâmetro.

[00400] O pKa de lipídios catiônicos formulados pode ser correlaci- onado com a eficácia dos LNPs na entrega de ácidos nucleicos (con- sulte Jayaraman et al., Angewandte Chemie, Edição Internacional (2012), 51(34), 8.529 a 8.533; Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172 a 176 (2010), os quais são incorporados a título de referência em sua totalidade). A faixa preferencial de pKa é de ~5 a ~7. O pKa de cada lipídio catiônico é determinado em nanopartículas lipídicas usan- do um ensaio baseado na fluorescência do ácido 2-(p-toluidino)-6- naftaleno sulfônico (TNS). Nanopartículas lipídicas que compreende lipídio catiônico/DSPC/colesterol/lipídio PEG (50/10/38,5/1,5% em mol) em PBS a uma concentração de lipídio total de 0,4 mM podem ser preparadas usando o processo em linha como descrito aqui e em ou- tros lugares. O TNS pode ser preparado como uma solução-mãe de 100 μM em água destilada. As vesículas podem ser diluídas para 24 μM de lipídio em 2 ml de soluções tamponadas contendo HEPES 10 mM, MES 10 mM, acetato de amônio 10 mM, NaCl 130 mM, em que o pH está na faixa de 2,5 a 11. Uma alíquota da solução TNS pode ser adicionada para obter uma concentração final de 1 μM e a intensidade da fluorescência da mistura após vórtice é medida à temperatura am- biente em um espectrofotômetro de luminescência SLM Aminco série 2 usando espectros de excitação e emissão de 321 nm e 445 nm. Uma análise sigmoidal de melhor ajuste pode ser aplicada aos dados de fluorescência e o pKa é medido como o pH, dando origem a uma in- tensidade de fluorescência semimáxima.

[00401] A atividade relativa pode ser determinada medindo a ex- pressão da luciferase no fígado 4 horas após a administração via inje- ção na veia da cauda. A atividade é comparada na dose de 0,3 e 1,0 mg de ceDNA/kg e expressa como ng luciferase/g fígado medido 4 ho- ras após a administração.

[00402] Sem limitações, uma nanopartícula de lipídios da invenção inclui uma formulação de lipídios que podem ser utilizados para entre- gar um vetor de DNA sem capsídeo não viral para um sítio-alvo de in- teresse (por exemplo, célula, tecido, órgão e similares). Geralmente, o lipídio de nanopartículas compreende vetor de DNA sem capsídeos não viral e um lipídio ionizável ou um sal do mesmo.

[00403] Em algumas modalidades, a partícula lipídica compreende lipídio ionizável/lipídio não catiônico/esterol/lipídio conjugado em uma razão molar de aproximadamente 50:10:38,5:1,5.

[00404] Em algumas modalidades, a partícula lipídica compreende lipídio ionizável/lipídio não catiônico/esterol/lipídio conjugado em uma razão molar de aproximadamente 50,0:7,0:40,0:3,0.

[00405] Em outros aspectos, a divulgação fornece uma formulação de nanopartículas lipídicas que compreende fosfolipídios, lecitina, fos- fatidilcolina e fosfatidiletanolamina.

[00406] Em algumas modalidades, um ou mais compostos adicio- nais também podem ser incluídos. Esses compostos podem ser admi- nistrados separadamente ou os compostos adicionais podem ser inclu- ídos nas nanopartículas lipídicas da invenção. Em outras palavras, as nanopartículas lipídicas podem conter outros compostos além do ce- DNA ou pelo menos um segundo ceDNA, diferente do primeiro. Sem limitações, outros compostos adicionais podem ser selecionados do grupo que consiste em moléculas orgânicas ou inorgânicas pequenas ou grandes, monossacarídeos, dissacarídeos, trissacarídeos, oligos- sacarídeos, polissacarídeos, peptídeos, proteínas, análogos peptídicos e seus derivados, peptidomiméticos, ácidos nucleicos, análogos de ácidos nucleicos e derivados, um extrato feito de materiais biológicos ou qualquer combinação dos mesmos.

[00407] Em algumas modalidades, o um ou mais compostos adicio- nais podem ser um agente terapêutico. O agente terapêutico pode ser selecionado de qualquer classe adequada para o objetivo terapêutico. Em outras palavras, o agente terapêutico pode ser selecionado de qualquer classe adequada ao objetivo terapêutico. Em outras palavras, o agente terapêutico pode ser selecionado de acordo com o objetivo do tratamento e a ação biológica desejada. Por exemplo, se o ceDNA no LNP for útil para o tratamento de câncer, o composto adicional po- de ser um agente anticâncer (por exemplo, um agente quimioterapêu- tico, uma terapia de câncer direcionada (incluindo, mas sem limitação, uma molécula pequena, um anticorpo ou um conjugado de anticorpo- fármaco)). Em outro exemplo, se o LNP contendo o ceDNA for útil no tratamento de uma infecção, o composto adicional pode ser um agente antimicrobiano (por exemplo, um composto antibiótico ou antiviral). Em ainda outro exemplo, se o LNP que contém o ceDNA é útil no trata- mento de uma doença ou distúrbio imunológico, o composto adicional pode ser um composto que modula uma resposta imunológica (por exemplo, um imunossupressor, composto imunoestimulador ou com- posto que modula uma ou mais vias de anticorpos imunológicos espe- cíficas). Em algumas modalidades, coquetéis diferentes de nanopartí- culas lipídicas diferentes contendo compostos diferentes, como um ceDNA que codifica uma proteína diferente ou um composto diferente, como um terapêutico, podem ser utilizados nas composições e méto- dos da invenção.

[00408] Em algumas modalidades, o composto adicional é um agente modulador imunológico. Por exemplo, o composto adicional é um imunossupressor. Em algumas modalidades, o composto adicional é imunoestimulador.

[00409] Também é aqui fornecida uma composição farmacêutica que compreende a nanopartícula lipídica e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[00410] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de nanopartículas lipídicas que compreende ainda um ou mais excipi- entes farmacêuticos. Em algumas modalidades, a formulação de na- nopartículas lipídicas compreende ainda sacarose, tris, trealose e/ou glicina.

[00411] Geralmente, as nanopartículas lipídicas da invenção têm um diâmetro médio selecionado para fornecer um efeito terapêutico pretendido. Por conseguinte, em alguns aspectos, a nanopartícula de lipídio tem um diâmetro médio de cerca de 30 nm para cerca de 150 nm, mais tipicamente de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, mais tipi- camente cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, mais tipicamente cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, mais tipicamente cerca de 85 nm a cerca de 105 nm, e de preferência cerca de 100 nm. Em alguns aspectos, a divulgação fornece partículas lipídicas que são maiores em tamanho relativo às nanopartículas comuns e cerca de 150 a 250 nm em tama- nho. O tamanho das partículas de nanopartículas lipídicas pode ser determinado por espalhamento de luz quase elástico usando, por exemplo, um sistema Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, Reino Uni- do).

[00412] Dependendo do uso pretendido das partículas lipídicas, as proporções dos componentes podem ser variadas e a eficiência de entrega de uma formulação específica pode ser medida usando, por exemplo, um ensaio de parâmetro de liberação endossômica (ERP).

[00413] O ceDNA pode ser complexado com a porção lipídica da partícula ou encapsulado na posição lipídica das nanopartículas de lipídios. Em algumas modalidades, o ceDNA pode ser totalmente en- capsulado na posição lipídica da nanopartícula lipídica, protegendo-o, desse modo, da degradação por uma nuclease, por exemplo, em uma solução aquosa. Em algumas modalidades, o ceDNA na nanopartícula lipídica não é substancialmente degradado após a exposição da nano- partícula lipídica a uma nuclease a 37 ºC por pelo menos cerca de 20, 30, 45 ou 60 minutos. Em algumas modalidades, o ceDNA na nano- partícula lipídica não é substancialmente degradado após a incubação da partícula no soro a 37 ºC por pelo menos cerca de 30, 45 ou 60 mi- nutos ou pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ou 36 horas.

[00414] Em certas modalidades, as nanopartículas lipídicas são substancialmente não tóxicas para um indivíduo, por exemplo, para um mamífero como um humano.

[00415] Em alguns aspectos, a formulação de nanopartículas lipídi- cas é um pó liofilizado.

[00416] Em algumas modalidades, nanopartículas lipídicas são par- tículas de núcleo sólido que possuem pelo menos uma bicamada lipí- dica. Em outras modalidades, as nanopartículas lipídicas têm uma es- trutura não bicamada, isto é, uma morfologia não lamelar (isto é, não bicamada). Sem limitações, a morfologia não bicamada pode incluir, por exemplo, tubos tridimensionais, varas, simetrias cúbicas, etc. A morfologia não lamelar (ou seja, estrutura não bicamada) das partícu- las lipídicas pode ser determinada usando técnicas analíticas conheci- das por e usado por aqueles versados na técnica. Tais técnicas inclu- em, mas não estão limitadas a, microscopia eletrônica de transmissão criogênica ("Cryo-TEM"), calorimetria de varredura diferencial ("DSC"), difração de raios X e similares. Por exemplo, a morfologia das nano-

partículas de lipídios (lamelar versus não lamelar) pode ser pronta- mente avaliada e caracterizada utilizando, por exemplo, análise Cryo- TEM como descrito em US2010/0130588, cujo conteúdo é aqui incor- porado a título de referência em sua totalidade.

[00417] Em algumas modalidades adicionais, as nanopartículas li- pídicas com uma morfologia não lamelar são densas em elétrons.

[00418] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma nanopartí- cula lipídica que é de estrutura unilamelar ou multilamelar. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de nanopartículas lipí- dicas que compreende partículas multivesiculares e/ou partículas à base de espuma.

[00419] Controlando a composição e a concentração dos compo- nentes lipídicos, pode-se controlar a taxa na qual o conjugado lipídico troca da partícula lipídica e, por sua vez, a taxa na qual a nanopartícu- la lipídica se torna fusogênica. Além disso, outras variáveis, incluindo, por exemplo, pH, temperatura ou força iônica, podem ser usadas para variar e/ou controlar a taxa na qual a nanopartícula lipídica se torna fusogênica. Outros métodos que podem ser utilizados para controlar a taxa na qual a nanopartícula lipídica se torna fusogênica serão eviden- tes para os versados na técnica com base nesta divulgação. Também será evidente que, controlando a composição e a concentração do conjugado lipídico, pode-se controlar o tamanho das partículas lipídi- cas.

[00420] O pKa de lipídios catiônicos formulados pode ser correlaci- onado com a eficácia dos LNPs na entrega de ácidos nucleicos (con- sulte Jayaraman et al., Angewandte Chemie, Edição Internacional (2012), 51(34), 8.529 a 8.533; Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172 a 176 (2010), os quais são incorporados a título de referência em sua totalidade). A faixa preferencial de pKa é de ~5 a ~7. O pKa do lipídio catiônico pode ser determinado em nanopartículas lipídicas usando um ensaio baseado na fluorescência do ácido 2-(p-toluidino)-6- naftaleno sulfônico (TNS).

[00421] O encapsulamento de ceDNA em partículas de lipídio pode ser determinado através da realização de um ensaio de exclusão com o corante fluorescente de membrana impermeável, que utiliza um co- rante que tem reforçado fluorescência quando relacionado com ácido nucleico, por exemplo, um ensaio Oligreen® ou ensaio de PicoGreen®. Geralmente, o encapsulamento é determinado adicionando o corante à formulação de partículas lipídicas, medindo a fluorescência resultante e comparando-a com a fluorescência observada após a adição de uma pequena quantidade de detergente não iônico. A interrupção mediada por detergente da bicamada lipídica libera o ceDNA encapsulado, permitindo que o mesmo interaja com o corante impermeável à mem- brana. A encapsulação de ceDNA pode ser calculado como E= (I0 - I)/I0, em que I e I0 referem-se às intensidades de fluorescência antes e após a adição de detergente. VIII. MÉTODOS DE ENTREGA DE VETORES DE ceDNA

[00422] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA pode ser entregue a uma célula-alvo in vitro ou in vivo por vários métodos ade- quados. Os vetores de ceDNA sozinhos podem ser aplicados ou inje- tados. Os vetores de ceDNA podem ser entregues a uma célula sem a ajuda de um reagente de transfecção ou outros meios físicos. Como alternativa, os vetores de ceDNA podem ser entregues usando qual- quer reagente de transfecção conhecido na técnica ou outro meio físi- co conhecido na técnica que facilite a entrada de DNA na célula, por exemplo, lipossomas, álcoois, compostos ricos em polilisina, compos- tos ricos em arginina, fosfato de cálcio, microvesículas, microinjeção, eletroporação e similares.

[00423] Por outro lado, as transduções com vetores de AAV sem capsídeo aqui divulgados podem direcionar eficientemente tipos de células e tecidos que são difíceis de transduzir com vírions de AAV convencionais usando vários reagentes de entrega.

[00424] Em outra modalidade, um vetor de ceDNA é administrado ao SNC (por exemplo, ao cérebro ou ao olho). O vetor de ceDNA pode ser introduzido na medula espinhal, tronco cerebral (medula oblonga- da, ponte), mesencéfalo (hipotálamo, tálamo, epitálamo, glândula pitui- tária, substância negra, glândula pineal), cerebelo, telencéfalo (corpo estriado, cérebro incluindo occipital, temporal, lobos parietais e fron- tais, córtex, gânglios da base, hipocampo e porta-amígdala), sistema límbico, neocórtex, corpo estriado, cérebro e colículo inferior. O vetor de ceDNA também pode ser administrado em diferentes regiões do olho, como retina, córnea e/ou nervo óptico. O vetor de ceDNA pode ser entregue no líquido cefalorraquidiano (por exemplo, por punção lombar). O vetor de ceDNA pode ainda ser administrado por via intra- vascular ao SNC em situações em que a barreira hematoencefálica foi perturbada (por exemplo, tumor cerebral ou infarto cerebral).

[00425] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode ser ad- ministrado à região (ou regiões) desejada do SNC por qualquer via co- nhecida na técnica, incluindo, mas não se limitando a, intratecal, intra- ocular, intracerebral, intraventricular, intravenosa (por exemplo, na presença de açúcar, como manitol), entrega intranasal, intra-aural, in- traocular (por exemplo, intravítrea, subretiniana, câmara anterior) e periocular (por exemplo, região sub-Tenon), bem como entrega intra- muscular com entrega retrógrada aos neurônios motores.

[00426] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é administra- do em uma formulação líquida por injeção direta (por exemplo, injeção estereotática) na região ou compartimento desejado no SNC. Em ou- tras modalidades, o vetor de ceDNA pode ser fornecido por aplicação tópica na região desejada ou por administração intranasal de uma for- mulação de aerossol. A administração ocular pode ser por aplicação tópica de gotículas de líquido. Como alternativa adicional, o vetor de ceDNA pode ser administrado como uma formulação sólida de libera- ção lenta (consulte, por exemplo, Patente nº U.S. 7.201.898). Em mo- dalidades ainda adicionais, o vetor de ceDNA pode ser usado para transporte retrógrado para tratar, melhorar e/ou prevenir doenças e distúrbios envolvendo neurônios motores (por exemplo, esclerose late- ral amiotrófica (ALS); atrofia muscular espinhal (SMA), etc.). Por exemplo, o vetor de ceDNA pode ser entregue ao tecido muscular a partir do qual pode migrar para os neurônios. IX. USOS ADICIONAIS DOS VETORES DE ceDNA

[00427] As composições e vetores de ceDNA aqui fornecidos po- dem ser utilizados para entregar um transgene para vários propósitos. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para fins de pesquisa, por exem- plo, para criar um modelo animal transgênico somático que abriga o transgene, por exemplo, para estudar a função do produto transgene. Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcio- nal que se destina a ser usado para criar um modelo animal de doen- ça. Em algumas modalidades, o transgene codifica um ou mais peptí- deos, polipeptídeos ou proteínas, que são úteis para o tratamento, prevenção ou melhoria de estados ou distúrbios de doenças em um indivíduo mamífero. O transgene resultante pode ser transferido (por exemplo, expresso em) para um indivíduo em uma quantidade sufici- ente para tratar uma doença associada à expressão reduzida, falta de expressão ou disfunção do gene. Em algumas modalidades, o trans- gene pode ser transferido para (por exemplo, expresso em) um indiví- duo em quantidade suficiente para tratar uma doença associada ao aumento da expressão, atividade do produto do gene ou regulação positiva inadequada de um gene que o transgene resultante suprime ou, de outro modo, causa a expressão do qual a ser reduzido. Em al-

gumas modalidades, o transgene é usado para eliminar um gene en- dógeno. X. MÉTODOS DE USO

[00428] O vetor de ceDNA da invenção também pode ser usado em um método para a entrega de uma sequência de nucleotídeos de inte- resse a uma célula-alvo. O método pode, em particular, ser um método para entregar um transgene terapêutico de interesse a uma célula de um indivíduo em necessidade do mesmo. A invenção permite a ex- pressão in vivo de um polipeptídeo, proteína ou oligonucleotídeo codi- ficado por uma sequência de DNA exógena terapêutica em células em um indivíduo, de modo que os níveis terapêuticos do polipeptídeo, pro- teína ou oligonucleotídeo sejam expressos. Esses resultados são vis- tos com os modos in vivo e in vitro da entrega do vetor de ceDNA.

[00429] Um método para a entrega de um ácido nucleico de inte- resse em uma célula de um indivíduo pode compreender a administra- ção ao dito indivíduo de um vetor de ceDNA da invenção compreen- dendo o dito ácido nucleico de interesse. Além disso, a invenção for- nece um método para a entrega de um ácido nucleico de interesse em uma célula de um indivíduo em necessidade, que compreende múlti- plas administrações do vetor de ceDNA da invenção que compreende o dito ácido nucleico de interesse. Uma vez que o vetor de ceDNA da invenção não induz uma resposta imunológica, tal estratégia de admi- nistração múltipla não será prejudicada pela resposta do sistema imu- nológico do hospedeiro contra o vetor de ceDNA da invenção, ao con- trário do que é observado com vetores encapsidados.

[00430] Os ácidos nucleicos do vetor de ceDNA são administrados em quantidades suficientes para transfectar as células de um tecido desejado e fornecer níveis suficientes de transferência e expressão gênica sem efeitos adversos indevidos. As vias de administração con- vencionais e farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitadas a, intravenosa (por exemplo, em uma formulação de lipos- somas), entrega direta ao órgão selecionado (por exemplo, entrega intraportal ao fígado), intramuscular e outras vias de administração pa- rentais. As vias de administração podem ser combinadas, se desejado.

[00431] A entrega do vetor de ceDNA não se limita a uma espécie de vetor de ceDNA. Como tal, em outro aspecto, vários vetores de ce- DNA que compreendem diferentes sequências de DNA exógeno po- dem ser entregues simultaneamente ou sequencialmente à célula, te- cido, órgão ou indivíduo-alvo. Portanto, essa estratégia pode permitir a expressão de múltiplos genes. A entrega também pode ser realizada várias vezes e, principalmente para a terapia de genes no cenário clí- nico, em doses subsequentes crescentes ou decrescentes, dada a fal- ta de uma resposta imunológica do hospedeiro anticapsídeo devido à ausência de um capsídeo viral.

[00432] A invenção também fornece um método de tratamento de uma doença em um indivíduo que compreende introduzir em uma cé- lula-alvo em necessidade (em particular, uma célula muscular ou teci- do) do indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz um vetor de ceDNA, opcionalmente com um carreador farmaceuticamente aceitá- vel. Embora o vetor de ceDNA possa ser introduzido na presença de um transportador, esse transportador não é necessário. O vetor de ceDNA implementado compreende uma sequência de nucleotídeos de interesse útil no tratamento da doença. Em particular, o vetor de ceD- NA pode compreender uma sequência de DNA exógena desejada operacionalmente ligada a elementos de controle capazes de direcio- nar a transcrição do polipeptídeo, proteína ou oligonucleotídeo deseja- do codificado pela sequência de DNA exógena quando introduzido no indivíduo. O vetor de ceDNA pode ser administrado por qualquer via adequada, como fornecido acima, e em outras partes deste documen- to.

XI. MÉTODOS DE TRATAMENTO

[00433] A tecnologia aqui descrita também demonstra métodos pa- ra a fabricação, bem como métodos de uso dos vetores de ceDNA di- vulgados de várias maneiras, incluindo, por exemplo, aplicações ex situ, in vitro e in vivo, metodologias, procedimentos de diagnóstico e/ou esquemas de terapia genética.

[00434] É fornecido aqui um método de tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo que compreende a introdução em uma célula-alvo que do mesmo necessite (por exemplo, uma célula ou teci- do muscular ou outro tipo de célula afetada) do indivíduo uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de uma edição de genes de vetor de ceDNA, opcionalmente com um carreador farmaceuticamente aceitá- vel. Embora o vetor de ceDNA possa ser introduzido na presença de um transportador, esse transportador não é necessário. O vetor de ceDNA implementado compreende uma sequência de nucleotídeos de interesse útil no tratamento da doença. Em particular, o vetor de ceD- NA pode compreender uma sequência de DNA exógena desejada operacionalmente ligada a elementos de controle capazes de direcio- nar a transcrição do polipeptídeo, proteína ou oligonucleotídeo deseja- do codificado pela sequência de DNA exógena quando introduzido no indivíduo. O vetor de ceDNA pode ser administrado por qualquer via adequada, como fornecido acima, e em outras partes deste documen- to.

[00435] Qualquer transgene pode ser entregue pelos vetores de ceDNA conforme divulgado neste documento. Os transgenes de inte- resse incluem ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos ou ácidos nucleicos não codificadores (por exemplo, RNAi, miRs, etc.), de prefe- rência, polipeptídeos terapêuticos (por exemplo, para uso médico, di- agnóstico ou veterinário) ou polipeptídeos imunogênicos (por exemplo, para vacinas).

[00436] Em certas modalidades, os transgenes a serem expressos pelos vetores de ceDNA, conforme descrito aqui, irão expressar ou codificar um ou mais polipeptídeos, peptídeos, ribozimas, ácidos nu- cleicos peptídicos, siRNAs, RNAis, oligonucleotídeos antissenso, poli- nucleotídeos antissenso, anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno ou qualquer combinação dos mesmos.

[00437] Em particular, o transgene pode codificar um ou mais agen- tes terapêuticos, incluindo, mas não limitado a, por exemplo, proteí- na(s), polipeptídeo(s), peptídeo(s), enzima(s), anticorpos, fragmentos de ligação a antígeno, bem como variantes e/ou fragmentos ativos dos mesmos, para uso no tratamento, profilaxia e/ou melhoria de um ou mais sintomas de uma doença, disfunção, lesão e/ou distúrbio. Em um aspecto, a doença, disfunção, trauma, lesão e/ou distúrbio é uma do- ença, disfunção, trauma, lesão e/ou distúrbio humano.

[00438] Conforme observado no presente documento, o transgene pode codificar uma proteína ou peptídeo terapêutico, ou sequência de ácidos nucleicos terapêuticos ou agente terapêutico, incluindo, mas sem limitação a, um ou mais agonistas, antagonistas, fatores antiapop- tose, inibidores, receptores, citocinas, citotoxinas, agentes eritropoiéti- cos, glicoproteínas, fatores de crescimento, receptores de fatores de crescimento, hormônios, receptores hormonais, interferons, interleuci- nas, receptores de interleucina, fatores de crescimento de nervos, pep- tídeos neuroativos, receptores de peptídeos neuroativos, proteases, inibidores de protease, proteínas descarboxilases, proteínas quinases, proteínas inibidoras de quinase, enzimas, proteínas de ligação a re- ceptores, proteínas de transporte ou um ou mais inibidores dos mes- mos, receptores de serotonina ou um ou mais inibidores de captação dos mesmos, serpinas, receptores de serpinas, supressores de tumo- res, moléculas de diagnóstico, agentes quimioterapêuticos, citotoxinas ou qualquer combinação dos mesmos.

[00439] Em algumas modalidades, um transgene no cassete de ex- pressão, construto de expressão ou vetor de ceDNA aqui descrito po- de ser otimizado por códon para a célula hospedeira. Conforme usado neste documento, o termo "otimização de códon" ou "otimização de códon" refere-se ao processo de modificação de uma sequência de ácido nucleico para expressão aprimorada nas células do vertebrado de interesse, por exemplo, camundongo ou humano (por exemplo, humanizado), substituindo pelo menos um, mais de um ou um número significativo de códons da sequência nativa (por exemplo, uma se- quência procariótica) com códons que são mais frequentemente ou mais frequentemente usados nos genes desse vertebrado. Várias es- pécies exibem viés particular para certos códons de um aminoácido particular. Tipicamente, a otimização do códon não altera a sequência de aminoácidos da proteína traduzida original. Os códons otimizados podem ser determinados usando, por exemplo, a plataforma de otimi- zação de códons Gene Forge® da Aptagen e síntese genética perso- nalizada (Aptagen, Inc.) ou outro banco de dados disponível publica- mente.

[00440] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA expressa o transgene em uma célula hospedeira em questão. Em algumas moda- lidades, a célula hospedeira em questão é uma célula hospedeira hu- mana, incluindo, por exemplo, células sanguíneas, células-tronco, cé- lulas hematopoiéticas, células CD34+, células hepáticas, células can- cerígenas, células vasculares, células musculares, células pancreáti- cas, células neurais, células oculares ou da retina, células epiteliais ou endoteliais, células dendríticas, fibroblastos ou qualquer outra célula de origem mamífera, incluindo, sem limitação, células hepáticas (isto é, fígado), células pulmonares, células cardíacas, células pancreáticas, células intestinais, células diafragmáticas, células renais (isto é, rim), células neurais, células sanguíneas, células da medula óssea ou qual-

quer um ou mais tecidos selecionados de um indivíduo para o qual a terapia gênica é contemplada. Em um aspecto, a célula hospedeira do indivíduo é uma célula hospedeira humana.

[00441] São divulgadas aqui composições e formulações de vetores de ceDNA que incluem um ou mais dos vetores de ceDNA da presente invenção, juntamente com um ou mais tampões, diluentes ou excipien- tes farmaceuticamente aceitáveis. Tais composições podem ser incluí- das em um ou mais kits de diagnóstico ou terapêuticos, para diagnos- ticar, prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas de uma doen- ça, lesão, distúrbio, trauma ou disfunção. Em um aspecto, a doença, lesão, distúrbio, trauma ou disfunção é uma doença, lesão, distúrbio, trauma ou disfunção humana.

[00442] Outro aspecto da tecnologia descrita neste documento for- nece um método para fornecer a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade diagnóstica ou terapeuticamente eficaz de um vetor de ceDNA, em que o método compreende o fornecimento a uma célula, tecido ou órgão de um indivíduo em necessidade do mesmo, uma quantidade de vetor de ceDNA como aqui divulgado; e por um tempo eficaz para permitir a expressão do transgene a partir do vetor de ceDNA, fornecendo, assim, ao indivíduo uma quantidade diagnósti- ca ou terapeuticamente eficaz da proteína, peptídeo, ácido nucleico expresso pelo vetor de ceDNA. Em outro aspecto, o indivíduo é um ser humano.

[00443] Outro aspecto da tecnologia descrita neste documento for- nece um método para diagnosticar, prevenir, tratar ou melhorar pelo menos um ou mais sintomas de uma doença, distúrbio, disfunção, le- são, condição anormal ou trauma de um indivíduo. Em um sentido ge- ral e, geralmente, o método inclui pelo menos a etapa de administrar a um indivíduo em necessidade um ou mais dos vetores de ceDNA di- vulgados, em uma quantidade e por um tempo suficiente para diagnos-

ticar, prevenir, tratar ou melhorar um ou mais sintomas da doença, dis- túrbio, disfunção, lesão, condição anormal ou trauma no indivíduo. Em outro aspecto, o indivíduo é um ser humano.

[00444] Outro aspecto é o uso do vetor de ceDNA como uma ferra- menta para tratar ou reduzir um ou mais sintomas de uma doença ou estados de doença. Existem várias doenças hereditárias nas quais os genes defeituosos são conhecidos e geralmente se enquadram em duas classes: estados de deficiência, geralmente de enzimas, que ge- ralmente são herdadas de maneira recessiva e estados desequilibra- dos, que podem envolver proteínas reguladoras ou estruturais, e que são tipicamente, mas nem sempre, herdados de maneira dominante. Para doenças em estado de deficiência, os vetores de ceDNA podem ser usados para entregar transgenes para trazer um gene normal aos tecidos afetados para terapia de substituição, bem como, em algumas modalidades, para criar modelos animais para a doença usando muta- ções antissenso. Para estados de doença desequilibrados, os vetores de ceDNA podem ser usados para criar um estado de doença em um sistema modelo, que pode ser usado em esforços para combater o es- tado de doença. Assim, os vetores e métodos de ceDNA aqui divulga- dos permitem o tratamento de doenças genéticas. Como aqui utilizado, um estado de doença é tratado por remediar parcial ou totalmente a deficiência ou desequilíbrio que causa a doença ou a torna mais grave.

[00445] Em geral, o vetor de ceDNA como aqui divulgado pode ser usado para entregar qualquer transgene para tratar, prevenir ou me- lhorar os sintomas associados a qualquer distúrbio relacionado à ex- pressão gênica. Os estados ilustrativos de doenças incluem, mas não se limitam a: fibrose cística (e outras doenças pulmonares), hemofilia A, hemofilia B, talassemia, anemia e outras doenças do sangue, AIDS, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose amiotrófica lateral, epilepsia e outros distúrbios neurológi-

cos, câncer, diabetes mellitus, distrofias musculares (por exemplo, Du- chenne, Becker), doença de Hurler, deficiência de adenosina desami- nase, defeitos metabólicos, doenças degenerativas da retina (e outras doenças oculares), mitocondriopatias (por exemplo, Neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON), síndrome de Leigh e encefalopatia escle- rosante subaguda), miopatias (por exemplo, miopatia facioescapulo- umeral (FSHD) e cardiomiopatias), doenças de órgãos sólidos (por exemplo, cérebro, fígado, rim, coração) e similares. Em algumas mo- dalidades, os vetores de ceDNA como aqui divulgados podem ser utili- zados com vantagem no tratamento de indivíduos com distúrbios me- tabólicos (por exemplo, deficiência de omitina transcarbamilase).

[00446] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA aqui descrito pode ser usado para tratar, melhorar e/ou prevenir uma doença ou dis- túrbio causado por mutação em um gene ou produto genético. Doen- ças ou distúrbios exemplificativos que podem ser tratados com vetores de ceDNA incluem, mas não estão limitados a, doenças ou distúrbios metabólicos (por exemplo, doença de Fabry, doença de Gaucher, fe- nilcetonúria (PKU), doença de armazenamento de glicogênio); doen- ças ou distúrbios do ciclo da ureia (por exemplo, deficiência de ornitina transcarbamilase (OTC)); doenças ou distúrbios do armazenamento lisossômico (por exemplo, leucodistrofia metacromática (DLM), muco- polissacaridose tipo II (MPSII; síndrome de Hunter)); doenças ou dis- túrbios hepáticos (por exemplo, colestase intra-hepática familiar pro- gressiva (PFIC); doenças ou distúrbios no sangue (por exemplo, he- mofilia (A e B), talassemia e anemia); cânceres e tumores e doenças ou distúrbios genéticos (por exemplo, fibrose cística).

[00447] Como ainda um outro aspecto, um vetor de ceDNA como aqui divulgado pode ser empregado para fornecer uma sequência de nucleotídeos heteróloga em situações nas quais é desejável regular o nível de expressão do transgene (por exemplo, transgenes que codifi-

cam hormônios ou fatores de crescimento, como aqui descrito). Como um exemplo, o transgene pode inibir uma via que controla a expressão ou atividade de um gene-alvo. Como outro exemplo, o transgene pode aumentar a atividade de uma via que controla a expressão ou ativida- de de um gene-alvo.

[00448] Por conseguinte, em algumas modalidades, o vetor de ce- DNA aqui descrito pode ser usado para corrigir um nível anormal e/ou função de um produto genético (por exemplo, uma ausência ou defeito em uma proteína) que resulta na doença ou distúrbio. O vetor de ceD- NA pode produzir uma proteína funcional e/ou modificar os níveis da proteína para aliviar ou reduzir os sintomas resultantes de, ou conferir benefícios a, uma doença ou distúrbio específico causado pela ausên- cia ou defeito na proteína. Por exemplo, o tratamento da deficiência de OTC pode ser alcançado através da produção de enzima OTC funcio- nal; o tratamento da hemofilia A e B pode ser alcançado modificando os níveis do fator VIII, fator IX e fator X; o tratamento de PKU pode ser alcançado modificando os níveis da enzima fenilalanina hidroxilase; o tratamento da doença de Fabry ou Gaucher pode ser alcançado atra- vés da produção de alfa galactosidase funcional ou beta glucocerebro- sidase, respectivamente; o tratamento de MLD ou MPSII pode ser al- cançado produzindo arilsulfatase A funcional ou iduronato-2-sulfatase, respectivamente; o tratamento da fibrose cística pode ser alcançado através da produção de um regulador de condutância transmembrana funcional da fibrose cística; o tratamento da doença de armazenamen- to de glicogênio pode ser alcançado restaurando a função funcional da enzima G6Pase; e o tratamento de PFIC pode ser alcançado através da produção dos genes funcionais ATP8B1, ABCB11, ABCB4 ou TJP2.

[00449] Em modalidades alternativas, os vetores de ceDNA como aqui divulgados podem ser usados para fornecer um ácido nucleico antissenso a uma célula in vitro ou in vivo. Por exemplo, onde o trans- gene é uma molécula de RNAi, a expressão do ácido nucleico antis- senso ou RNAi na célula-alvo diminui a expressão de uma proteína específica pela célula. Por conseguinte, os transgenes que são molé- culas de RNAi ou ácidos nucleicos antissenso podem ser administra- dos para diminuir a expressão de uma proteína específica em um indi- víduo em necessidade. Os ácidos nucleicos antissenso também po- dem ser administrados às células in vitro para regular a fisiologia celu- lar, por exemplo, para otimizar os sistemas de cultura de células ou tecidos.

[00450] Em algumas modalidades, transgenes exemplificativos co- dificados pelo vetor de ceDNA incluem, mas não estão limitados a: en- zimas lisossômicas (por exemplo, hexosaminidase A, associada à do- ença de Tay-Sachs ou iduronato sulfatase, associada à síndrome de Hunter/MPS II), eritropoietina, angiostatina, endostatina, superóxido dismutase, globina, leptina, catalase, tirosina hidroxilase, bem como citocinas (por exemplo, um interferon, β-interferon, interferon-γ, inter- leucina-2, interleucina-4, interleucina-12, fator estimulador de colônias de granulócito-macrófago, linfotoxina e similares), fatores de cresci- mento de peptídeos e hormônios (por exemplo, somatotropina, insuli- na, fatores de crescimento semelhantes à insulina 1 e 2, fator de cres- cimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento epidérmi- co (EGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de cresci- mento nervoso (NGF), fator neurotrófico 3 e 4, fator neurotrófico deri- vado do cérebro (BDNF), fator de crescimento derivado da glia (GDNF), fator de crescimento transformador-α e -β e similares), recep- tores (por exemplo, receptor do fator de necrose tumoral). Em algumas modalidades exemplificativas, o transgene codifica um anticorpo mo- noclonal específico para um ou mais alvos desejados. Em algumas modalidades exemplificativas, mais de um transgene é codificado pelo vetor de ceDNA. Em algumas modalidades exemplificativas, o trans- gene codifica uma proteína de fusão que compreende dois polipeptí- deos diferentes de interesse. Em algumas modalidades, o transgene codifica um anticorpo, incluindo um anticorpo completo ou fragmento de anticorpo, conforme aqui definido. Em algumas modalidades, o an- ticorpo é um domínio de ligação a antígeno ou uma sequência de do- mínio variável da imunoglobulina, como aqui definido. Outras sequên- cias transgênicas ilustrativas codificam produtos de genes suicidas (tindina-quinase, citosina-desaminase, toxina da difteria, citocromo P450, desoxicitidina-quinase e fator de necrose tumoral), proteínas que conferem resistência a um medicamento usado na terapia do cân- cer e produtos de genes supressores de tumores.

[00451] Em uma modalidade representativa, o transgene expresso pelo vetor de ceDNA pode ser usado para o tratamento de distrofia muscular em um indivíduo em necessidade, em que o método com- preende: administrar uma quantidade eficaz de tratamento, melhoria ou prevenção do vetor de ceDNA aqui descrito, em que o vetor de ce- DNA compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica distrofina, uma mini-distrofina, uma micro-distrofina, propeptídeo de miostatina, folistatina, receptor solúvel de ativina tipo II, IGF-1, polipeptídeos anti- inflamatórios, como o mutante Ikappa B, sarcospana, utrofina, uma micro-distrofina, laminina-α2, α-sarcoglicano, β-sarcoglicano, γ- sarcoglicano, δ-sarcoglicano, IGF-1, um anticorpo ou fragmento de an- ticorpo contra miostatina ou miostatina e/ou RNAi contra miostatina. Em modalidades particulares, o vetor de ceDNA pode ser administrado ao músculo esquelético, diafragma e/ou cardíaco, como aqui descrito em outra parte.

[00452] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode ser usa- do para entregar um transgene ao músculo esquelético, cardíaco ou diafragma, para produção de um polipeptídeo (por exemplo, uma en-

zima) ou RNA funcional (por exemplo, RNAi, microRNA, RNA antis- senso) que normalmente circula no sangue ou entrega sistêmica a ou- tros tecidos para tratar, melhorar e/ou prevenir um distúrbio (por exemplo, um distúrbio metabólico, como diabetes (por exemplo, insuli- na), hemofilia (por exemplo, VIII), um distúrbio de mucopolissacarídeo (por exemplo, síndrome Sly, síndrome de Hurler, síndrome de Scheie, síndrome de Hurler-Scheie, síndrome de Hunter, síndrome de Sanfilip- po A, B, C, D, síndrome de Morquio, síndrome de Maroteaux-Lamy, etc.) ou um distúrbio de armazenamento lisossômico (como a doença de Gaucher [glicocerebrosidase], Doença de Pompe [ácido lisossômi- co α-glicosidase] ou doença de Fabry [α-galactosidase A]) ou um dis- túrbio de armazenamento de glicogênio (como a doença de Pompe [ácido lisossômico a glicosidase]). Outras proteínas adequadas para o tratamento, melhoria e/ou prevenção de distúrbios metabólicos estão descritas acima.

[00453] Em outras modalidades, o vetor de ceDNA como aqui di- vulgado pode ser usado para entregar um transgene em um método de tratamento, melhoria e/ou prevenção de um distúrbio metabólico em um indivíduo em necessidade do mesmo. Distúrbios metabólicos ilustrativos e transgenes que codificam polipeptídeos são descritos aqui. Opcionalmente, o polipeptídeo é secretado (por exemplo, um po- lipeptídeo que é um polipeptídeo secretado em seu estado nativo ou que foi projetado para ser secretado, por exemplo, por associação operável com uma sequência de sinal secretora, como é conhecido na técnica).

[00454] Outro aspecto da invenção refere-se a um método de tra- tamento, melhoria e/ou prevenção de insuficiência cardíaca congênita ou DAP em um indivíduo em necessidade, em que o método compre- ende a administração de um vetor de ceDNA, conforme descrito aqui, a um indivíduo mamífero, em que o vetor de ceDNA compreende um transgene que codifica, por exemplo, um endoreticulum sarcoplasmáti- co Ca2+-ATPase (SERCA2a), um fator angiogênico, inibidor da fosfa- tase I (I-1), RNAi contra fosfolambano; uma molécula inibidora de fos- folambano ou dominante negativa, como fosfolambano S16E, uma proteína de dedo de zinco que regula o gene fosfolambano, receptor β2-adrenérgico, receptor beta-2-adrenérgico quinase (BARK), PI3 qui- nase, calsarcan, a. inibidor do receptor adrenérgico de quinase (βARKct), inibidor 1 da proteína fosfatase 1, S100A1, parvalbumina, adenilil ciclase tipo 6, uma molécula que afeta a knockdown do recep- tor quinase tipo 2 acoplado à proteína G, como um βARKct constituti- vamente ativo truncado, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, ca- licreína, HIF, timosina-β4, mir-1, mir-133, mir-206 e/ou mir-208.

[00455] Os vetores de ceDNA como aqui divulgados podem ser administrados aos pulmões de um indivíduo por qualquer meio ade- quado, opcionalmente, através da administração de uma suspensão de aerossol de partículas respiráveis que compreende os vetores de ceDNA, que o indivíduo inala. As partículas respiráveis podem ser lí- quidas ou sólidas. Aerossóis de partículas líquidas que compreende os vetores de ceDNA podem ser produzidos por qualquer meio adequa- do, como com um nebulizador de aerossol acionado por pressão ou um nebulizador ultrassônico, como é conhecido pelos especialistas na técnica. Consulte, por exemplo, Patente nº U.S. 4.501.729. Aerossóis de partículas sólidas que compreende os vetores de ceDNA também podem ser produzidos com qualquer gerador de aerossóis de medi- camentos em partículas sólidas, por técnicas conhecidas na técnica farmacêutica.

[00456] Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA podem ser administrados aos tecidos do SNC (por exemplo, cérebro, olho). Em modalidades particulares, os vetores de ceDNA aqui divulgados po- dem ser administrados para tratar, melhorar ou prevenir doenças do

SNC, incluindo distúrbios genéticos, distúrbios neurodegenerativos, distúrbios psiquiátricos e tumores. As doenças ilustrativas do SNC in- cluem, mas não se limitam a, doença de Alzheimer, doença de Parkin- son, doença de Huntington, doença de Canavan, doença de Leigh, doença de Refsum, síndrome de Tourette, esclerose lateral primária, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular progressiva, doença de Pick, distrofia muscular, esclerose múltipla, miastenia grave, doença de Binswanger, traumatismo por lesão medular ou na cabeça, doença de Tay Sachs, doença de Lesch-Nyan, epilepsia, infartos cerebrais, distúrbios psiquiátricos, incluindo distúrbios de humor (por exemplo, depressão, transtorno afetivo bipolar, transtorno afetivo persistente, transtorno de humor secundário), esquizofrenia, dependência de dro- gas (por exemplo, alcoolismo e outras dependências de substâncias), neuroses (por exemplo, ansiedade, transtorno obsessivo, distúrbio somatoforme, distúrbio dissociativo, luto, depressão pós-parto), psico- se (por exemplo, alucinações e delírios), demência, paranoia, distúrbio de déficit de atenção, distúrbios psicossexuais, distúrbios do sono, dis- túrbios da dor, e distúrbios alimentares ou de peso (por exemplo, obe- sidade, caquexia, anorexia nervosa e bulimia) e câncer e tumores (por exemplo, tumores da hipófise) do SNC.

[00457] Os distúrbios oculares que podem ser tratados, melhorados ou prevenidos com os vetores de ceDNA da invenção incluem distúr- bios oftálmicos envolvendo a retina, trato posterior e nervo óptico (por exemplo, retinite pigmentosa, retinopatia diabética e outras doenças degenerativas da retina, uveíte, doenças relacionadas à idade degene- ração macular, glaucoma). Muitas doenças e distúrbios oftálmicos es- tão associados a um ou mais dos três tipos de indicações: (1) angio- gênese, (2) inflamação e (3) degeneração. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA como aqui divulgado pode ser empregado para for- necer fatores antiangiogênicos; fatores anti-inflamatórios; fatores que retardam a degeneração celular, promovem a economia de células ou promovem o crescimento e combinações das células anteriores. A re- tinopatia diabética, por exemplo, é caracterizada pela angiogênese. A retinopatia diabética pode ser tratada pela administração de um ou mais fatores antiangiogênicos, intraocularmente (por exemplo, no ví- treo) ou periocularmente (por exemplo, na região do sub-Tenon). Um ou mais fatores neurotróficos também podem ser coentregues, intrao- cularmente (por exemplo, intravítrea) ou periocularmente. As doenças oculares adicionais que podem ser tratadas, melhoradas ou preveni- das com os vetores de ceDNA da invenção incluem atrofia geográfica, degeneração macular vascular ou "úmida", doença de Stargardt, Amaurose congênita de Leber (LCA), síndrome de Usher, pseudoxan- toma elástico (PXE), retinite pigmentar ligada ao x (XLRP), retinosqui- se ligada ao x (XLRS), coroideremia, neuropatia óptica hereditária de Leber (LHON), arquomatopsia, distrofia de cone-haste, distrofia da córnea endotelial de Fuchs, distrofia endotelial da córnea de Fuchs, edema macular diabético e câncer ocular e tumores.

[00458] Em algumas modalidades, doenças ou distúrbios oculares inflamatórios (por exemplo, uveíte) podem ser tratados, melhorados ou impedidos pelos vetores de ceDNA da invenção. Um ou mais fatores anti-inflamatórios podem ser expressos pela administração intraocular (por exemplo, vítreo ou câmara anterior) do vetor de ceDNA, conforme divulgado aqui. Em outras modalidades, doenças ou distúrbios ocula- res caracterizados por degeneração da retina (por exemplo, retinite pigmentosa) podem ser tratados, melhorados ou prevenidos pelos ve- tores de ceDNA da invenção. A administração intraocular (por exem- plo, administração vítrea) do vetor de ceDNA, como aqui divulgado, codificando um ou mais fatores neurotróficos, pode ser usada para tra- tar essas doenças baseadas em degeneração da retina. Em algumas modalidades, doenças ou distúrbios que envolvem angiogênese e de-

generação da retina (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade) podem ser tratados com os vetores de ceDNA da invenção. A degeneração macular relacionada à idade pode ser tratada pela admi- nistração do vetor de ceDNA, conforme divulgado aqui, que codifica um ou mais fatores neurotróficos intraocularmente (por exemplo, ví- treo) e/ou um ou mais fatores antiangiogênicos intraocularmente ou periocularmente (por exemplo, na região do sub-Tenon). O glaucoma é caracterizado por aumento da pressão ocular e perda de células gan- glionares da retina. Os tratamentos para o glaucoma incluem a admi- nistração de um ou mais agentes neuroprotetores que protegem as células contra danos excitotóxicos usando o vetor de ceDNA, como aqui divulgado. Por conseguinte, esses agentes incluem antagonistas de N-metil-D-aspartato (NMDA), citocinas e fatores neurotróficos, po- dem ser entregues intraocularmente, opcionalmente intravitreamente usando o vetor de ceDNA, como aqui divulgado.

[00459] Em outras modalidades, o vetor de ceDNA como aqui di- vulgado pode ser usado para tratar convulsões, por exemplo, para re- duzir o início, a incidência ou a gravidade das convulsões. A eficácia de um tratamento terapêutico para convulsões pode ser avaliada por meios comportamentais (por exemplo, tremores, tremores do olho ou da boca) e/ou eletrográficos (a maioria das convulsões tem anormali- dades eletrográficas marcadas). Assim, o vetor de ceDNA como aqui divulgado também pode ser usado para tratar epilepsia, que é marca- da por múltiplas convulsões ao longo do tempo. Em uma modalidade representativa, a somatostatina (ou um fragmento ativo do mesmo) é administrada ao cérebro usando o vetor de ceDNA como aqui divulga- do para tratar um tumor da hipófise. De acordo com esta modalidade, o vetor de ceDNA como aqui divulgado codificando somatostatina (ou um fragmento ativo do mesmo) é administrado por microinfusão na hipófise. Da mesma forma, esse tratamento pode ser usado para tratar a acromegalia (secreção anormal do hormônio do crescimento da hi- pófise). O ácido nucleico (por exemplo, número de acesso GenBank J00306) e o aminoácido (por exemplo, número de acesso GenBank P01166; contém peptídeos ativos processados somatostatina-28 e somatostatina-14) sequências de somatostatinas, como são conheci- das na técnica. Em modalidades particulares, o vetor de ceDNA pode codificar um transgene que compreende um sinal secretório como descrito na Patente U.S. 7.071.172.

[00460] Outro aspecto da invenção refere-se ao uso de um vetor de ceDNA como aqui descrito para produzir RNA antissenso, RNAi ou outro RNA funcional (por exemplo, uma ribozima) para entrega sistê- mica a um indivíduo in vivo. Por conseguinte, em algumas modalida- des, o vetor de ceDNA pode compreender um transgene que codifica um ácido nucleico antissenso, uma ribozima (por exemplo, conforme descrito na Patente nº U.S. 5.877.022), RNAs que afetam a trans- splicing mediada por spliceossomo (consulte Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246; U.S. 6.013.487; U.S. 6.083.702), RNAs interfe- rentes (RNAi) que medeiam o silenciamento de genes (consulte Sharp et al., (2000) Science 287: 2.431) ou outros RNAs não traduzidos, co- mo RNAs-"guia" (Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:

4.929; Patente U.S. 5.869.248 de Yuan et al.), e similar.

[00461] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA também pode compreender um transgene que codifica um polipeptídeo repórter (por exemplo, uma enzima como a Green Fluorescent Protein, ou fosfatase alcalina). Em algumas modalidades, um transgene que codifica uma proteína repórter útil para fins experimentais ou de diagnóstico é sele- cionado de qualquer uma das seguintes opções: β-lactamase, β- galactosidase (LacZ), fosfatase alcalina, timidina quinase, proteína flu- orescente verde (GFP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), lucifera- se e outros bem conhecidos na técnica. Em alguns aspectos, os veto-

res de ceDNA que compreendem um transgene que codifica um poli- peptídeo repórter podem ser utilizados para fins de diagnóstico ou co- mo marcadores da atividade do vetor de ceDNA no indivíduo ao qual são administrados.

[00462] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode compre- ender um transgene ou uma sequência de nucleotídeos heteróloga que compartilha homologia com, e se recombina com um locus no cromossomo hospedeiro. Essa abordagem pode ser utilizada para cor- rigir um defeito genético na célula hospedeira.

[00463] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode compre- ender um transgene que pode ser usado para expressar um polipeptí- deo imunogênico em um indivíduo, por exemplo, para vacinação. O transgene pode codificar qualquer imunógeno de interesse conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, imunogênicos do vírus da imunodeficiência humana, vírus da influenza, proteínas gag, antígenos tumorais, antígenos de câncer, antígenos bacterianos, antígenos virais e similares. XII. ADMINISTRAÇÃO

[00464] Em modalidades particulares, mais de uma administração (por exemplo, duas, três, quatro ou mais administrações) pode ser empregada para atingir o nível desejado de expressão gênica durante um período de vários intervalos, por exemplo, diário, semanal, mensal, anual, etc.

[00465] Exemplos de modos de administração do vetor de ceDNA aqui divulgados incluem oral, retal, transmucosa, intranasal, inalação (por exemplo, via aerossol), bucal (por exemplo, sublingual), vaginal, intratecal, intraocular, transdérmica, intraendotelial, no útero (ou em ovo), parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intracraniana, intramuscular [incluindo administração ao músculo es- quelético, diafragma e/ou cardíaco], intrapleural, intracerebral e intra-

articular), tópico (por exemplo, tanto na pele como nas superfícies mu- cosas, incluindo superfícies das vias aéreas e administração trans- dérmica), intralinfática e similares, bem como injeção direta de tecido ou órgão (por exemplo, fígado, olho, músculo esquelético, músculo cardíaco, músculo diafragma ou cérebro).

[00466] A administração do vetor de ceDNA pode ser em qualquer sítio de um indivíduo, incluindo, sem limitação, um sítio selecionado do grupo que consiste no cérebro, em um músculo esquelético, em um músculo liso, no coração, no diafragma, no epitélio das vias aéreas, no fígado, no rim, no baço, no pâncreas, na pele e nos olhos. A adminis- tração do vetor de ceDNA também pode ser em um tumor (por exem- plo, em um tumor ou em um linfonodo ou próximo ao mesmo). A via mais adequada em qualquer caso dependerá da natureza e da gravi- dade da condição a ser tratada, melhorada e/ou prevenida e da natu- reza do vetor de ceDNA específico que está sendo usado. Além disso, o ceDNA permite administrar mais de um transgene em um único vetor ou vários vetores de ceDNA (por exemplo, um coquetel de ceDNA).

[00467] A administração do vetor de ceDNA divulgada neste docu- mento ao músculo esquelético de acordo com a presente invenção in- clui, mas não está limitada à administração no músculo esquelético dos membros (por exemplo, braço, braço, perna e/ou perna), costas, pescoço, cabeça (por exemplo, língua), tórax, abdômen, pelve/períneo e/ou dígitos. O vetor de ceDNA, como divulgado no presente docu- mento, pode ser entregue ao músculo esquelético por administração intravenosa, administração intra-arterial, administração intraperitoneal, perfusão de membro (opcionalmente, perfusão de membro isolada de uma perna e/ou braço; consulte, por exemplo, Arruda et al., (2005) Blood 105:3.458 a 3.464) e/ou injeção intramuscular direta. Em moda- lidades particulares, o vetor de ceDNA conforme divulgado neste do- cumento é administrado a um membro (braço e/ou perna) de um indi-

víduo (por exemplo, um indivíduo com distrofia muscular como DMD) por perfusão de membro, perfusão de membro opcionalmente isolada (por exemplo, por via intravenosa ou administração intra-articular). Nas modalidades, o vetor de ceDNA como aqui divulgado pode ser admi- nistrado sem o emprego de técnicas "hidrodinâmicas".

[00468] A administração do vetor de ceDNA como aqui divulgado ao músculo cardíaco inclui administração no átrio esquerdo, átrio direi- to, ventrículo esquerdo, ventrículo direito e/ou septo. O vetor de ceD- NA, conforme descrito aqui, pode ser entregue ao músculo cardíaco por administração intravenosa, administração intra-arterial como admi- nistração intra-aórtica, injeção cardíaca direta (por exemplo, no átrio esquerdo, átrio direito, ventrículo esquerdo, ventrículo direito) e/ou per- fusão da artéria coronária. A administração ao músculo diafragma po- de ser por qualquer método adequado, incluindo administração intra- venosa, administração intra-arterial e/ou administração intraperitoneal. A administração ao músculo liso pode ser por qualquer método ade- quado, incluindo administração intravenosa, administração intra- arterial e/ou administração intraperitoneal. Em uma modalidade, a ad- ministração pode ser em células endoteliais presentes no, próximo a e/ou dentro do músculo liso.

[00469] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA de acordo com a presente invenção é administrado ao músculo esquelético, músculo diafragma e/ou músculo cardíaco (por exemplo, para tratar, melhorar e/ou prevenir distrofia muscular ou doença cardíaca (por exemplo, DAP ou insuficiência cardíaca congestiva). A. TRATAMENTO EX VIVO

[00470] Em algumas modalidades, as células são removidas de um indivíduo, um vetor de ceDNA é introduzido no mesmo e as células são, então, substituídas novamente no indivíduo. Os métodos de re- moção de células do indivíduo para tratamento ex vivo, seguidos de introdução no indivíduo, são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Patente nº U.S. 5.399.346; cuja divulgação é aqui incorpora- da na sua totalidade). Alternativamente, um vetor de ceDNA é introdu- zido em células de outro indivíduo, em células cultivadas ou em célu- las de qualquer outra fonte adequada, e as células são administradas a um indivíduo em necessidade.

[00471] As células transduzidas com um vetor de ceDNA são prefe- rencialmente administradas ao indivíduo em uma "quantidade terapeu- ticamente eficaz" em combinação com um carreador farmacêutico. Os versados na técnica compreenderão que os efeitos terapêuticos não precisam ser completos ou curativos, desde que seja fornecido algum benefício ao indivíduo.

[00472] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode codificar um transgene (às vezes, chamado de sequência de nucleotídeos hete- róloga) que é qualquer polipeptídeo que é desejavelmente produzido em uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Por exemplo, em contraste com o uso dos vetores de ceDNA em um método de tratamento discu- tido aqui, em algumas modalidades, os vetores de ceDNA podem ser introduzidos em células cultivadas e o produto genético expresso iso- lado a partir dos mesmos, por exemplo, para a produção de antígenos ou vacinas.

[00473] Os vetores de ceDNA podem ser usados em aplicações veterinárias e médicas. Os indivíduos adequados para os métodos de entrega de genes ex vivo, conforme descrito acima, incluem tanto aves (por exemplo, galinhas, patos, gansos, codornas, perus e faisões) quanto mamíferos (por exemplo, seres humanos, bovinos, ovinos, ca- prinos, equinos, felinos, caninos e lagomorfos), sendo preferenciais os mamíferos. Os indivíduos humanos são preferenciais. Os indivíduos humanos incluem recém-nascidos, bebês, jovens e adultos.

[00474] Um aspecto da tecnologia aqui descrita refere-se a um mé-

todo de entrega de um transgene a uma célula. Tipicamente, para mé- todos in vitro, o vetor de ceDNA pode ser introduzido na célula usando os métodos como aqui divulgados, bem como outros métodos conhe- cidos na técnica. Os vetores de ceDNA aqui divulgados são preferen- cialmente administrados à célula em uma quantidade biologicamente eficaz. Se o vetor de ceDNA for administrado a uma célula in vivo (por exemplo, a um indivíduo), uma quantidade biologicamente eficaz do vetor de ceDNA é uma quantidade que é suficiente para resultar na transdução e expressão do transgene em uma célula-alvo. B. FAIXAS DE DOSES

[00475] Ensaios in vivo e/ou in vitro podem opcionalmente ser em- pregados para ajudar a identificar faixas de dosagem ideais para uso. A dose precisa a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da afecção, e deve ser decidida de acordo com o julgamento da pessoa de conhecimento comum na técnica e com as circunstâncias de cada indivíduo. As doses efetivas podem ser extrapoladas a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal.

[00476] Um vetor de ceDNA é administrado em quantidades sufici- entes para transfectar as células de um tecido desejado e fornecer ní- veis suficientes de transferência e expressão gênica sem efeitos ad- versos indevidos. As vias de administração convencionais e farmaceu- ticamente aceitáveis incluem, entre outras, as descritas acima na se- ção "Administração", como entrega direta ao órgão selecionado (por exemplo, entrega intraportal ao fígado), oral, inalação (incluindo intra- nasal e administração intratraqueal), intraocular, intravenosa, intra- muscular, subcutânea, intradérmica, intratumoral e outras vias de ad- ministração parentais. As vias de administração podem ser combina- das, se desejado.

[00477] A dose da quantidade de um vetor de ceDNA necessária para obter um "efeito terapêutico" específico variará com base em vá- rios fatores, incluindo, entre outros: a via de administração de ácido nucleico, o nível de expressão de gene ou RNA necessário para obter um efeito terapêutico, a doença ou distúrbio específico a ser tratado e a estabilidade do gene(s), produto(s) de RNA ou proteína(s) expres- sa(s) resultante(s). Um especialista na técnica pode determinar pron- tamente uma faixa de dose do vetor de ceDNA para tratar um paciente com uma doença ou distúrbio específico com base nos fatores menci- onados acima, bem como em outros fatores que são bem conhecidos na técnica.

[00478] O regime de dosagem pode ser ajustado para fornecer a resposta terapêutica ideal. Por exemplo, o oligonucleotídeo pode ser administrado repetidamente, por exemplo, várias doses podem ser administradas diariamente ou a dose pode ser proporcionalmente re- duzida conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. Um versado na técnica será capaz de determinar prontamente doses e esquemas de administração apropriados dos oligonucleotídeos indiví- duos, se os oligonucleotídeos devem ser administrados às células ou aos indivíduos.

[00479] Uma "dose terapeuticamente eficaz" será abrangida em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de ensaios clínicos e dependerá da aplicação específica (as células neu- rais exigirão quantidades muito pequenas, enquanto a injeção sistêmi- ca exigiria grandes quantidades). Por exemplo, para injeção direta in vivo no músculo esquelético ou cardíaco de um indivíduo humano, uma dose terapeuticamente eficaz será da ordem de cerca de 1 µg a 100 g do vetor de ceDNA. Se exossomos ou micropartículas forem usadas para fornecer o vetor de ceDNA, então, uma dose terapeuti- camente eficaz pode ser determinada experimentalmente, mas é espe- rado que entregue de 1 μg a cerca de 100 g de vetor.

[00480] A formulação de excipientes e soluções carreadoras farma- ceuticamente aceitáveis é bem conhecida dos versados na técnica, assim como o desenvolvimento de regimes de dosagem e tratamento adequados para usar as composições particulares descritas aqui em uma variedade de regimes de tratamento.

[00481] Para transfecção in vitro, uma quantidade eficaz de um ve- tor de ceDNA a ser entregue às células (1x106 células) será da ordem de 0,1 a 100 μg de vetor de ceDNA, preferencialmente, de 1 a 20 μg e, mais preferencialmente, de 1 a 15 μg ou 8 a 10 μg. Vetores maiores de ceDNA exigirão doses mais altas. Se forem utilizados exossomos ou micropartículas, uma dose eficaz in vitro pode ser determinada expe- rimentalmente, mas se destinaria a fornecer geralmente a mesma quantidade do vetor de ceDNA.

[00482] O tratamento pode envolver a administração de uma dose única ou de várias doses. Em algumas modalidades, mais de uma do- se pode ser administrada a um indivíduo; de fato, doses múltiplas po- dem ser administradas conforme necessário, porque o vetor de ceDNA desencadeia não provoca uma resposta imunológica do hospedeiro anticapsídeo devido à ausência de um capsídeo viral. Como tal, um especialista na técnica pode determinar rapidamente um número apropriado de doses. O número de doses administradas pode, por exemplo, ser da ordem de 1 a 100, de preferência, 2 a 20 doses.

[00483] Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria em particu- lar, a falta de resposta imunológica antiviral típica provocada pela ad- ministração de um vetor de ceDNA conforme descrito na divulgação (isto é, a ausência de componentes do capsídeo) permite que o vetor de ceDNA seja administrado a um hospedeiro em várias ocasiões. Em algumas modalidades, o número de ocasiões em que um ácido nuclei- co heterólogo é entregue a um indivíduo está na faixa de 2 a 10 vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes). Em algumas modali-

dades, um vetor de ceDNA é entregue a um indivíduo mais de 10 ve- zes.

[00484] Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceD- NA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez por dia do calendário (por exemplo, um período de 24 horas). Em algumas moda- lidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indiví- duo não mais que uma vez a cada 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias corridos. Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administra- da a um indivíduo não mais que uma vez por semana civil (por exem- plo, 7 dias corridos). Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais que duas vezes por semana (por exemplo, uma vez em um período de duas semanas ci- vis). Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez por mês civil (por exemplo, uma vez em 30 dias corridos). Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez a cada seis meses. Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez por ano civil (por exemplo, 365 dias ou 366 dias em um ano bissexto). C. FORMAS DE DOSAGEM UNITÁRIA

[00485] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária. Uma forma de dosagem unitária será tipicamente adaptada a uma ou mais vias de administração específicas da composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para adminis- tração por inalação. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por um vaporizador. Em algu- mas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para ad- ministração por um nebulizador. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por um aerossoliza- dor. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adapta- da para administração oral, para administração bucal ou para adminis- tração sublingual. Em algumas modalidades, a forma de dosagem uni- tária é adaptada para administração intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração intratecal ou intracerebroventricular. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para administração tópica. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade do composto que pro- duz um efeito terapêutico. XIII. VÁRIAS APLICAÇÕES

[00486] Os vetores e composições de ceDNA como aqui descritos podem ser usados para introduzir uma sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos terapêutica) em uma célula hospedeira. De acordo com algumas modalidades, os veto- res e composições de ceDNA, conforme descrito neste documento, podem ser usados para introduzir uma sequência de ácido nucleico (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico terapêutica) em uma célula hospedeira, em que a expressão da sequência de ácido nuclei- co terapêutica está sob o controle de um interruptor regulável. Em uma modalidade, a introdução de uma sequência de ácido nucleico em uma célula hospedeira usando os vetores de ceDNA como aqui descritos pode ser monitorada com biomarcadores apropriados de pacientes tratados para avaliar a expressão gênica.

[00487] De acordo com algumas modalidades, os vetores de ceD- NA podem ser usados de uma variedade de maneiras, incluindo, por exemplo, aplicações ex situ, in vitro e in vivo, metodologias, procedi- mentos de diagnóstico e/ou regimes de terapia gênica.

[00488] De acordo com algumas modalidades, as composições e vetores de ceDNA aqui fornecidos podem ser utilizados para entregar um transgene para vários propósitos, como descrito acima. Em algu- mas modalidades, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para fins de pesquisa, por exemplo, para criar um modelo animal transgênico somático que abriga o transgene, por exemplo, para estudar a função do produto transgene. Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para criar um modelo animal de doença.

[00489] Em algumas modalidades, o transgene codifica um ou mais peptídeos, polipeptídeos ou proteínas, que são úteis para o tratamen- to, melhoria ou prevenção de estados de doença em um indivíduo mamífero. O transgene pode ser transferido (por exemplo, expresso em) para um paciente em quantidade suficiente para tratar uma doen- ça associada à expressão reduzida, falta de expressão ou disfunção do gene.

[00490] Em algumas modalidades, os vetores de ceDNA são previs- tos para uso em métodos de diagnóstico e triagem, nos quais um transgene é expresso de forma transitória ou estável em um sistema de cultura de células ou, alternativamente, em um modelo animal transgênico.

[00491] Outro aspecto da tecnologia aqui descrita fornece um mé- todo de transdução de uma população de células de mamíferos. Em um sentido geral e, geralmente, o método inclui pelo menos a etapa de introdução em uma ou mais células da população, uma composição que compreende uma quantidade eficaz de um ou mais dos ceDNAs aqui divulgados.

[00492] Além disso, a presente invenção fornece composições, bem como kits terapêuticos e/ou de diagnóstico, que incluem um ou mais vetores de ceDNA ou composições de ceDNA divulgados, formulados com um ou mais ingredientes adicionais ou preparados com uma ou mais instruções para a sua utilização.

[00493] De acordo com algumas modalidades, uma célula em que o vetor de ceDNA deve ser administrado, conforme divulgado neste do- cumento, pode ser de qualquer tipo, incluindo, mas não se limitando a células neurais (incluindo células do sistema nervoso periférico e cen- tral, em particular, células cerebrais), células pulmonares, células da retina, células epiteliais (por exemplo, células epiteliais respiratórias e do intestino), células musculares, células dendríticas, células pancreá- ticas (incluindo células de ilhotas), células hepáticas, células do mio- cárdio, células ósseas (por exemplo, células-tronco da medula óssea), células-tronco hematopoiéticas, células do baço, queratinócitos, fi- broblastos, células endoteliais, células da próstata, células germinati- vas e semelhantes. Alternativamente, a célula pode ser qualquer célu- la progenitora. Como alternativa adicional, a célula pode ser uma célu- la-tronco (por exemplo, célula-tronco neural, célula-tronco hepática). Como ainda uma alternativa adicional, a célula pode ser uma célula de câncer ou tumor. Além disso, as células podem ser de qualquer espé- cie de origem, como indicado acima.

EXEMPLOS

[00494] Os exemplos a seguir são fornecidos a título ilustrativo, não limitativo. EXEMPLO 1: CONSTRUÇÃO DE VETORES DE ceDNA

[00495] A produção dos vetores de ceDNA usando um modelo de construto de polinucleotídeo é descrita no Exemplo 1 de PCT/US18/49996. Por exemplo, um modelo de construto de polinucle- otídeo usado para gerar os vetores de ceDNA da presente invenção pode ser um ceDNA-plasmídeo, um ceDNA-bacmídeo e/ou um ceD- NA-baculovírus. Sem se limitar à teoria, em uma célula hospedeira permissiva, na presença de, por exemplo, Rep, o modelo de construto de polinucleotídeo com duas ITRs simétricas e um construto de ex- pressão, em que pelo menos uma das ITRs é modificada em relação a uma sequência de ITR de tipo selvagem, replica para produzir vetores de ceDNA. A produção do vetor de ceDNA passa por duas etapas: primeiro, excisão ("resgate") do gabarito da cadeia principal modelo (por exemplo, plasmídeo de ceDNA, ceDNA-bacmídeo, genoma de ceDNA-bacliovírus, etc.) por meio de proteínas Rep e segunda replica- ção mediada por Rep do vetor de ceDNA excisado.

[00496] Um método exemplificativo para produzir vetores de ceDNA é de um ceDNA-plasmídeo como aqui descrito. Com referência às Fi- guras 1A e 1B, o modelo de construto polinucleotídico de cada um dos plasmídeos ceDNA inclui uma ITR modificada esquerda e uma ITR modificada direita com o seguinte entre as sequências de ITR: (i) um intensificador/promotor; (ii) um sítio de clonagem para um transge- ne; (iii) um elemento de resposta pós-transcricional (por exemplo, o elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite por marmo- ta) (WPRE); e (iv) um sinal de poliadenilação (por exemplo, do gene do hormônio do crescimento bovino (BGHpA). Os sítios de reconheci- mento de endonucleases de restrição únicos (R1-R6) (mostrados na Figura 1A e na Figura 1B) também foram introduzidos entre cada componente para facilitar a introdução de novos componentes genéti- cos nos sítios específicos no construto. Os sítios das enzimas R3 (PmeI) GTTTAAAC (SEQ ID NO: 7) e R4 (PacI) TTAATTAA (SEQ ID NO: 542) são projetados no sítio de clonagem para introduzir um qua- dro de leitura aberto de um transgene. Essas sequências foram clona- das em um plasmídeo pFastBac HT B obtido junto à ThermoFisher Scientific.

[00497] Em suma, uma série de vetores ceDNA foi obtida a partir das construções de plasmídeo de ceDNA mostradas na Tabela 7, usando o processo mostrado nas Figuras 5A a 5C e sequências de

ITR mostradas na Tabela 4. A Tabela 7 indica o número da sequência polinucleotídica correspondente para cada componente, incluindo se- quências ativas como local de proteína de replicação (RPS) (por exemplo, local de ligação de Rep) em qualquer extremidade de um promotor operacionalmente ligado a um transgene.

Os números na Tabela 7 referem-se às SEQ ID NOs neste documento, corresponden- tes às sequências de cada componente.

Os plasmídeos na Tabela 7 foram construídos com o WPRE que compreende SEQ ID NO: 8 se- guido por BGHpA que compreende SEQ ID NO: 9 na região 3' não tra- duzida entre o transgene e a ITR direita.

TABELA 7: CONSTRUTOS DE CEDNA EXEMPLIFICATIVOS Plasmídeo ITR modificada 5' Transgene ITR modificada 3' (si- métrica em relação à ITR 5') Construto - SEQ ID NO:484 Luciferase SEQ ID NO: 469 (ITR-18, 375 (ITR-33 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO: 485 Luciferase SEQ ID NO: 95 (ITR-51, 376 (ITR-34 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO: 486 Luciferase SEQ ID NO: 470 (ITR-19, 377 (ITR-35 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO: 487 Luciferase SEQ ID NO: 471 (ITR-20, 378 (ITR-36 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO: 488 Luciferase SEQ ID NO: 472 (ITR-21, 379 (ITR-37 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO: 489 Luciferase SEQ ID NO: 473 (ITR-22, 380 (ITR-38 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO: 490 Luciferase SEQ ID NO: 474 (ITR-23, 381 (ITR-39 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO: 491 Luciferase SEQ ID NO: 475 (ITR-24, 382 (ITR-40 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO: 492 Luciferase SEQ ID NO: 476 (ITR-25, 383 (ITR-41 esquerda) direita)

Plasmídeo ITR modificada 5' Transgene ITR modificada 3' (si- métrica em relação à ITR 5') Construto - SEQ ID NO: 493 Luciferase SEQ ID NO: 477 (ITR-26, 384 (ITR-42 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO: 494 Luciferase SEQ ID NO: 478 (ITR-27, 385 (ITR-43 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO: 495 Luciferase SEQ ID NO: 479 (ITR-28, 386 (ITR-44 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO:496 Luciferase SEQ ID NO:480 (ITR-29, 387 (ITR-45 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO:497 Luciferase SEQ ID NO: 481 (ITR-30, 388 (ITR-46 esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO: 498 Luciferase SEQ ID NO: 482 (ITR-31, 389 (ITR-47, esquerda) direita) Construto - SEQ ID NO: 499 Luciferase SEQ ID NO: 483 (ITR-32, 390 (ITR-48, esquerda) direita)

[00498] Em outras modalidades, uma série de vetores de ceDNA foi obtida a partir dos construtos de plasmídeo de ceDNA compreendendo ITRs-WT de 5' e 3' de AAV2 usando o processo mostrado nas Figuras 5A a 5C. Em algumas modalidades, um construto para produzir veto- res de ceDNA compreende um promotor que é um interruptor regula- dor, como aqui descrito, por exemplo, um promotor indutível. PRODUÇÃO DE ceDNA-BACMÍDEOS

[00499] Com referência à Figura 5A, as células competentes DH10Bac (células competentes MAX EFFICIENCY® DH10Bac™, Thermo Fisher) foram transformadas com plasmídeos de teste ou con- trole, seguindo um protocolo de acordo com as instruções do fabrican- te. A recombinação entre o plasmídeo e um vetor shuttle de baculoví- rus nas células DH10Bac foi induzida para gerar ceDNA-bacmídeos recombinantes. Os bacmídeos recombinantes foram selecionados por triagem de uma seleção positiva baseada na triagem azul-branca em E. coli (o marcador Φ80dlacZΔM15 fornece a complementação α do gene de β-galactosidase do vetor de bacmídeo) em uma placa de ágar bacteriana que contém X-gal e IPTG com antibióticos para selecionar transformantes e manutenção dos plasmídeos de bacmídeos e trans- posases. Colônias brancas causadas por transposição que rompe o gene indicador de -galactosídeo foram colhidas e cultivadas em 10 ml de meios.

[00500] Os ceDNA-bacmídeos recombinantes foram isolados a par- tir de E. coli e transfectados para células de inseto Sf9 ou Sf21 com o uso de FugeneHD para produzir baculovírus infeccioso. As células de inseto aderentes Sf9 ou Sf21 foram cultivadas em 50 ml de meio em balões T25 a 25 ºC. Quatro dias depois, o meio de cultura (contendo o vírus P0) foi removido das células, filtrado através de um filtro de 0,45 µm, separando as partículas infecciosas de baculovírus das células ou detritos celulares.

[00501] Opcionalmente, a primeira geração do baculovírus (P0) foi amplificada através da infecção de células de inseto Sf9 ou Sf21 vir- gens em 50 a 500 ml de meio. As células foram mantidas em culturas em suspensão em uma incubadora agitadora orbital a 130 rpm a 25 ºC, monitorando o diâmetro e a viabilidade das células, até as células atingirem um diâmetro de 18 a 19 nm (a partir de um diâmetro ingênuo de 14 a 15 nm) e uma densidade de ~4,0E + 6 células/ml. Entre 3 e 8 dias após a infecção, as partículas de baculovírus P1 no meio foram coletadas após centrifugação para remover células e detritos e filtra- ção através de um filtro de 0,45 µm.

[00502] Os ceDNA-baculovírus que compreendem os construtos de teste foram coletados e a atividade infecciosa, ou titulação, do baculo- vírus foi determinada. Especificamente, quatro x 20 ml de culturas de células Sf9 a 2,5E+6 células/ml foram tratadas com baculovírus P1 nas seguintes diluições: 1/1.000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000 e incuba- das a 25 a 27 ºC. A infectividade foi determinada pela taxa de aumento do diâmetro celular e parada do ciclo celular, e alteração na viabilidade celular todos os dias, durante 4 a 5 dias.

[00503] Com referência à Figura 5A, um "plasmídeo Rep" de acor- do com, por exemplo, a Figura 9A foi produzido em um vetor de ex- pressão pFASTBACTM-Dual (ThermoFisher) que compreende Rep78 (SEQ ID NO: 13) ou Rep68 (SEQ ID NO: 12) e Rep52 (SEQ ID NO: 14) ou Rep40 (SEQ ID NO: 11).

[00504] O plasmídeo Rep foi transformado nas células competentes DH10Bac (células competentes MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ (Thermo Fisher) seguindo um protocolo fornecido pelo fabricante. A recombinação entre o plasmídeo Rep e um vetor shuttle de baculoví- rus nas células DH10Bac foi induzida para gerar bacmídeos recombi- nantes ("Rep-bacmídeos"). Os bacmídeos recombinantes foram sele- cionados por uma seleção positiva que incluiu triagem azul-branca em E. coli (marcador Φ80dlacZΔM15 fornece a complementação α do ge- ne da β-galactosidase do vetor bacmídeo) em uma placa de ágar bac- teriana contendo X-gal e IPTG. Colônias brancas isoladas foram colhi- das e inoculadas em 10 ml de meio de seleção (canamicina, gentami- cina, tetraciclina em caldo LB). Os bacmídeos recombinantes (Rep- bacmids) foram isolados a partir de E. coli e os Rep-bacmids foram transfectados em células de inseto Sf9 ou Sf21 para produzir baculoví- rus infeccioso.

[00505] As células de inseto Sf9 ou Sf21 foram cultivadas em 50 ml de meio por 4 dias e os baculovírus recombinantes infecciosos ("Rep- baculovírus") foram isolados da cultura. Opcionalmente, a Rep- baculovírus de primeira geração (P0) foi amplificada através da infec- ção de células virgens de inseto Sf9 ou Sf21 e cultivada em 50 a 500 ml de meio. Entre 3 e 8 dias após a infecção, as partículas de baculo- vírus P1 no meio foram coletadas por separação de células por centri- fugação ou filtração ou outro processo de fracionamento. Os Rep-

baculovírus foram coletados e a atividade infecciosa do baculovírus foi determinada. Especificamente, quatro x 20 ml de culturas de células Sf9 a 2,5x106 células/ml foram tratadas com baculovírus P1 nas se- guintes diluições, 1/1.000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000 e incubadas. A infectividade foi determinada pela taxa de aumento do diâmetro celu- lar e parada do ciclo celular, e alteração na viabilidade celular todos os dias, durante 4 a 5 dias.

GERAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO VETOR DE CEDNA

[00506] Com referência à Figura 5B, meios de cultura de células de inseto Sf9 contendo (1) uma amostra contendo um ceDNA-bacmídeo ou um ceDNA-baculovírus e (2) rep-baculovírus descritos acima foram, então, adicionados a uma nova cultura de células Sf9 (2,5E + 6 célu- las/ml, 20 ml) em uma razão de 1:1.000 e 1:10.000, respectivamente. As células foram, então, cultivadas a 130 rpm a 25 ºC. 4 a 5 dias após a coinfecção, o diâmetro e a viabilidade celular são detectados. Quan- do os diâmetros celulares atingiram 18 a 20 nm com uma viabilidade de ~70 a 80%, as culturas celulares foram centrifugadas, o meio foi removido e os péletes celulares foram coletados. Os sedimentos celu- lares são, primeiro, novamente suspensos em um volume adequado de meio aquoso, água ou tampão. O vetor de ceDNA foi isolado e puri- ficado das células usando o protocolo de purificação Qiagen MIDI PLUS™ (Qiagen, 0,2 mg de massa de grânulos de células processa- das por coluna).

[00507] Os rendimentos dos vetores de ceDNA produzidos e purifi- cados a partir das células de inseto Sf9 foram inicialmente determina- dos com base na absorvância de UV a 260 nm.

[00508] Os vetores de ceDNA podem ser avaliados por identifica- dos por eletroforese em gel de agarose em condições nativas ou des- naturantes, como ilustrado na Figura 5D, em que (a) a presença de bandas características migrando com o dobro do tamanho em géis desnaturantes versus géis nativos após a clivagem por endonuclease e a análise eletroforética em gel e (b) a presença de bandas de mo- nômero e dímero (2x) em géis desnaturantes para material não clivado é característico da presença do vetor de ceDNA.

[00509] As estruturas dos vetores de ceDNA isolados foram poste- riormente analisadas pela digestão do DNA obtido a partir de células Sf9 coinfectadas (como descrito aqui) com endonucleases de restrição selecionadas para a) presença de apenas um único sítio de corte nos vetores de ceDNA e b) fragmentos resultantes que eram grandes o suficiente para serem vistos claramente quando fracionados em um gel de agarose desnaturante a 0,8% (>800 pb). Como ilustrado nas Figuras 5D e 5E, os vetores lineares de DNA com uma estrutura não contínua e o vetor de ceDNA com a estrutura linear e contínua podem ser distinguidos pelos tamanhos de seus produtos de reação - por exemplo, espera-se que um vetor de DNA com uma estrutura não con- tínua produza fragmentos de 1 kb e 2 kb, enquanto se espera que um vetor sem capsídeo com a estrutura contínua produza fragmentos de 2 kb e 4 kb.

[00510] Portanto, para demonstrar de maneira qualitativa que os vetores de ceDNA isolados são covalentemente fechados, como é exi- gido por definição, as amostras foram digeridas com uma endonu- clease de restrição identificada no contexto da sequência específica do vetor de DNA como tendo um único sítio de restrição, de preferência, resultando em dois produtos de clivagem de tamanho desigual (por exemplo, 1.000 pb e 2.000 pb). Após digestão e eletroforese em um gel desnaturante (que separa as duas fitas complementares de DNA), um DNA linear e não covalentemente fechado será resolvido nos ta- manhos de 1.000 pb e 2.000 pb, enquanto um DNA covalentemente fechado (ou seja, um vetor de ceDNA) será resolvido em tamanhos 2x (2.000 pb e 4.000 pb), uma vez que as duas fitas de DNA estão liga-

das e agora são desdobradas e duas vezes o comprimento (embora de fita simples). Além disso, a digestão das formas monoméricas, di- méricas e n-méricas dos vetores de DNA será resolvida como frag- mentos do mesmo tamanho devido à ligação de ponta a ponta dos ve- tores de DNA multiméricos (consulte a Figura 5D).

[00511] Tal como utilizado aqui, o "ensaio para a identificação de vetores de DNA por eletroforese em gel de agarose sob gel nativo e condições desnaturantes" refere-se a um ensaio para avaliar a proxi- midade do ceDNA, realizando digestão com endonucleases de restri- ção seguida de avaliação eletroforética dos produtos digeridos. Um desses ensaios exemplificativos segue, embora um versado na técnica compreenda que muitas variações conhecidas na técnica nesse exemplo são possíveis. A endonuclease de restrição é selecionada para ser uma enzima de corte único para o vetor de ceDNA de interes- se que irá gerar produtos com aproximadamente 1/3x e 2/3x do com- primento do vetor de DNA. Isso resolve as bandas em géis nativos e desnaturantes. Antes da desnaturação, é importante remover o tam- pão da amostra. O kit de limpeza Qiagen PCR ou a dessalinização de "colunas giratórias", por exemplo, colunas GE HEALTHCARE ILUS- TRA, MICROSPIN e G-25, são algumas opções conhecidas na téc- nica para a digestão de endonucleases. O ensaio inclui, por exemplo, i) digerir o DNA com endonuclease (ou endonucleases) de restrição apropriado, 2) aplicar, por exemplo, a um kit de limpeza Qiagen PCR, eluir com água destilada, iii) adicionar 10x de solução desnaturante (10x = 0,5 M NaOH, 10 mM de EDTA), adicionar 10x de corante, não tamponado, e analisar, juntamente com as escadas de DNA prepara- das adicionando 10X de solução desnaturante a 4x, em um gel de 0,8 a 1,0% previamente incubado com 1 mM de EDTA e 200 mM de Na- OH para garantir que a concentração de NaOH seja uniforme na caixa de gel e no gel, e correr o gel na presença de uma solução desnatu-

rante 1 x (NaOH 50 mM, EDTA 1 mM). Um versado na técnica apreci- ará qual voltagem usar para executar a eletroforese com base no ta- manho e no tempo desejado dos resultados. Após a eletroforese, os géis são drenados e neutralizados em 1x TBE ou TAE e transferidos para água destilada ou 1x TBE/TAE com 1x SYBR Gold. As bandas podem, então, ser visualizadas com, por exemplo, Thermo Fisher, mancha de gel de ácido nucleico SYBR® Gold (10.000X concentrado em DMSO) e luz epifluorescente (azul) ou UV (312 nm).

[00512] A pureza do vetor de ceDNA gerado pode ser avaliada usando qualquer método conhecido na técnica. Como um método exemplificativo e não limitativo, a contribuição do plasmídeo de ceDNA para a absorvância total de UV de uma amostra pode ser estimada comparando a intensidade fluorescente do vetor de ceDNA com um padrão. Por exemplo, se com base na absorvância UV, 4 µg do vetor de ceDNA foram carregados no gel, e a intensidade fluorescente do vetor de ceDNA é equivalente a uma banda de 2 kb que é conhecida por 1 µg, então, há 1 µg do vetor de ceDNA e o vetor de ceDNA é 25% do total de material absorvente de UV. A intensidade da banda no gel é plotada contra a entrada calculada que a banda representa - por exemplo, se o vetor de ceDNA total for 8 kb e a banda comparativa excisada for 2 kb, a intensidade da banda será plotada como 25% da entrada total que, neste caso, seria 0,25 µg para 1,0 µg de entrada. Usando a titulação do plasmídeo do vetor de ceDNA para plotar uma curva padrão, uma equação de linha de regressão é, então, usada pa- ra calcular a quantidade da banda do vetor de ceDNA, que pode ser usada para determinar a porcentagem da entrada total representada pelo vetor de ceDNA ou a porcentagem de pureza. PRODUÇÃO DE ceDNA-BACMÍDEOS

[00513] As células competentes DH10Bac (Células Competentes MAX EFFICIENCY® DH10Bac™, Thermo Fisher) foram transformadas com plasmídeos de teste ou controle, seguindo um protocolo de acor- do com as instruções do fabricante. A recombinação entre o plasmídeo e um vetor shuttle de baculovírus nas células DH10Bac foi induzida para gerar ceDNA-bacmídeos recombinantes. Os bacmídeos recombi- nantes foram selecionados por triagem de uma seleção positiva base- ada na triagem azul-branca em E. coli (o marcador Φ80dlacZΔM15 fornece a complementação α do gene de β-galactosidase do vetor de bacmídeo) em uma placa de ágar bacteriana que contém X-gal e IPTG com antibióticos para selecionar transformantes e manutenção dos plasmídeos de bacmídeos e transposases. As colônias brancas cau- sadas por transposição que interrompe o gene indicador de b- galactosídeo foram colhidas e cultivadas em 10 ml de meio.

[00514] Os ceDNA-bacmídeos recombinantes foram isolados a par- tir de E. coli e transfectados para células de inseto Sf9 ou Sf21 com o uso de FugeneHD para produzir baculovírus infeccioso. As células de inseto aderentes Sf9 ou Sf21 foram cultivadas em 50 ml de meio em balões T25 a 25 ºC. Quatro dias depois, o meio de cultura (contendo o vírus P0) foi removido das células, filtrado através de um filtro de 0,45 µm, separando as partículas infecciosas de baculovírus das células ou detritos celulares.

[00515] Opcionalmente, a primeira geração do baculovírus (P0) foi amplificada através da infecção de células de inseto Sf9 ou Sf21 vir- gens em 50 a 500 ml de meio. As células foram mantidas em culturas em suspensão em uma incubadora agitadora orbital a 130 rpm a 25 ºC, monitorando o diâmetro e a viabilidade das células, até as células atingirem um diâmetro de 18 a 19 nm (a partir de um diâmetro ingênuo de 14 a 15 nm) e uma densidade de ~4,0E + 6 células/ml. Entre 3 e 8 dias após a infecção, as partículas de baculovírus P1 no meio foram coletadas após centrifugação para remover células e detritos e filtra- ção através de um filtro de 0,45 µm.

[00516] Os ceDNA-baculovírus que compreendem os construtos de teste foram coletados e a atividade infecciosa, ou titulação, do baculo- vírus foi determinada. Especificamente, quatro x 20 ml de culturas de células Sf9 a 2,5E+6 células/ml foram tratadas com baculovírus P1 nas seguintes diluições: 1/1.000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000 e incuba- das a 25 a 27 ºC. A infectividade foi determinada pela taxa de aumento do diâmetro celular e parada do ciclo celular, e alteração na viabilidade celular todos os dias, durante 4 a 5 dias.

[00517] Um "plasmídeo Rep" foi produzido em um vetor de expres- são pFASTBACTM-Dual (ThermoFisher) compreendendo Rep78 ou Rep68 e Rep52 ou Rep40. O plasmídeo Rep foi transformado nas cé- lulas competentes DH10Bac (células competentes MAX EFFICIEN- CY® DH10Bac™ (Thermo Fisher) seguindo um protocolo fornecido pelo fabricante. A recombinação entre o plasmídeo Rep e um vetor shuttle de baculovírus nas células DH10Bac foi induzida para gerar bacmídeos recombinantes ("Rep-bacmídeos"). Os bacmídeos recom- binantes foram selecionados por uma seleção positiva que incluiu tria- gem azul-branca em E. coli (marcador Φ80dlacZΔM15 fornece a com- plementação α do gene da β-galactosidase do vetor bacmídeo) em uma placa de ágar bacteriana contendo X-gal e IPTG. Colônias bran- cas isoladas foram colhidas e inoculadas em 10 ml de meio de seleção (canamicina, gentamicina, tetraciclina em caldo LB). Os bacmídeos recombinantes (Rep-bacmids) foram isolados a partir de E. coli e os Rep-bacmids foram transfectados em células de inseto Sf9 ou Sf21 para produzir baculovírus infeccioso.

[00518] As células de inseto Sf9 ou Sf21 foram cultivadas em 50 ml de meio por 4 dias e os baculovírus recombinantes infecciosos ("Rep- baculovírus") foram isolados da cultura. Opcionalmente, a Rep- baculovírus de primeira geração (P0) foi amplificada através da infec- ção de células virgens de inseto Sf9 ou Sf21 e cultivada em 50 a 500 ml de meio. Entre 3 e 8 dias após a infecção, as partículas de baculo- vírus P1 no meio foram coletadas por separação de células por centri- fugação ou filtração ou outro processo de fracionamento. Os Rep- baculovírus foram coletados e a atividade infecciosa do baculovírus foi determinada. Especificamente, quatro x 20 ml de culturas de células Sf9 a 2,5x106 células/ml foram tratadas com baculovírus P1 nas se- guintes diluições, 1/1.000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000 e incubadas. A infectividade foi determinada pela taxa de aumento do diâmetro celu- lar e parada do ciclo celular, e alteração na viabilidade celular todos os dias, durante 4 a 5 dias. EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE ceDNA SINTÉTICO POR EXCISÃO DE

UMA MOLÉCULA DE DNA DE FITA DUPLA

[00519] A produção sintética dos vetores de ceDNA é descrita nos Exemplos 2 a 6 do Pedido Internacional PCT/US19/14122, depositado em 18 de janeiro de 2019, que é aqui incorporado na sua totalidade a título de referência. Um método exemplar de produção de um vetor de ceDNA usando um método sintético que envolve a excisão de uma molécula de DNA de fita dupla. Em resumo, um vetor de ceDNA pode ser gerado usando um construto de DNA de fita dupla, por exemplo, ver Figuras 7A a 8E de PCT/US19/14122. Em algumas modalidades, o construto de DNA de fita dupla é um plasmídeo de ceDNA, por exem- plo, ver, por exemplo, a Figura 6 no pedido de patente internacional PCT/US2018/064242, depositado em 6 de dezembro de 2018.

[00520] Em algumas modalidades, um construto para produzir um vetor de ceDNA compreende um interruptor regulador, como descrito no presente documento.

[00521] Para fins ilustrativos, o Exemplo 1 descreve a produção de vetores de ceDNA como vetores de DNA com extremidade fechada exemplares gerados usando este método. No entanto, embora os ve- tores de ceDNA sejam exemplificados neste exemplo para ilustrar mé-

todos de produção sintética in vitro para gerar um vetor de DNA de ex- tremidade fechada por excisão de um polinucleotídeo de fita dupla compreendendo as ITRs e o cassete de expressão (por exemplo, se- quência heteróloga de ácido nucleico) seguida de ligação das extremi- dades 3' e 5' livres, como descrito aqui, um indivíduo de conhecimento comum na técnica está ciente de que é possível, como ilustrado aci- ma, modificar a molécula de polinucleotídeo de DNA de fita dupla, de modo que seja gerado qualquer vetor de DNA de extremidade fechada desejado, incluindo mas não limitado a, DNA de minifitas, DNA doggybone™, DNA em forma de halteres e similares. Vetores de ceD- NA exemplificativos para a produção de transgenes e proteínas tera- pêuticas podem ser produzidos pelo método de produção sintético descrito no Exemplo 2.

[00522] O método envolve (i) extirpar uma sequência que codifica o cassete de expressão de um construto de DNA de fita dupla e (ii) for- mar estruturas em grampo em uma ou mais das ITRs e (iii) unir as ex- tremidades 5' e 3' livres por ligação, por exemplo, pela ligase de DNA T4.

[00523] O construto de DNA de fita dupla compreende, na ordem 5' a 3': um primeiro sítio de endonuclease de restrição; um ITR a montan- te; um cassete de expressão; uma ITR a jusante; e um segundo sítio de endonuclease de restrição. O construto de DNA de fita dupla é en- tão contatado com uma ou mais endonucleases de restrição para ge- rar quebras de fita dupla em ambos os sítios de endonuclease de res- trição. Uma endonuclease pode ter como alvo os dois locais ou cada sítio pode ser direcionado por uma endonuclease diferente, desde que os sítios de restrição não estejam presentes no modelo de vetor de ceDNA. Isto extrai a sequência entre os locais de endonuclease de restrição do resto do construto de DNA de cadeia dupla (consultar Fi- gura 9 do documento PCT/US19/14122). Após a ligação, um vetor de

DNA fechado é formado.

[00524] Uma ou ambas as ITRs usadas no método podem ser ITRs do tipo selvagem. As ITRs modificadas também podem ser usadas, em que a modificação pode incluir deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos da ITR de tipo selvagem nas sequências que formam o braço B e B' e/ou o braço C e C' (consultar, por exem- plo, Figuras 6 a 8 e 10, Figura 11B do documento PCT/US19/14122), e pode ter duas ou mais alças em formato de grampo (consultar, por exemplo, Figuras 6 a 8, Figura 11B do documento PCT/US19/14122) ou uma única alça em formato de grampo (consultar, por exemplo, Fi- gura 10A a 10B, Figura 11B do documento PCT/US19/14122). A ITR modificada com alça em grampo pode ser gerada por modificação ge- nética de um oligo existente ou por síntese biológica e/ou química de novo. EXEMPLO 3: PRODUÇÃO DE ceDNA POR MEIO DE CONSTRUÇÃO

DE OLIGONUCLEOTÍDEOS

[00525] Outro método exemplar de produção de um vetor de ceD- NA usando um método sintético que envolve a montagem de vários oligonucleotídeos é fornecido no Exemplo 3 do documento PCT/US19/14122, em que um vetor de ceDNA é produzido sintetizan- do um oligonucleotídeo 5' e um oligonucleotídeo de ITR 3' e ligar os oligonucleotídeos de ITR a um polinucleotídeo de fita dupla compreen- dendo um cassete de expressão. A Figura 11B do documento PCT/US19/14122 mostra um método exemplificativo de ligação de um oligonucleotídeo de ITR 5' e um oligonucleotídeo de ITR 3' a um poli- nucleotídeo de fita dupla compreendendo um cassete de expressão.

[00526] Em algumas modalidades, um construto para produzir um vetor de ceDNA compreende um interruptor regulador, como descrito no presente documento.

[00527] Os oligonucleotídeos de ITR podem compreender ITRs-WT como aqui descrito, ou podem compreender ITRs modificadas como aqui descrito. As ITRs modificadas podem incluir deleção, inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos da ITR de tipo selvagem nas sequências que formam o braço B e B' e/ou o braço C e C'. Os oligo- nucleotídeos de ITR, que compreendem ITRs de tipo selvagem ou mod-ITRs como aqui descrito, para serem utilizados na síntese livre de células, podem ser gerados por modificação genética ou síntese bioló- gica e/ou química. Como discutido aqui, os oligonucleotídeos de ITR nos Exemplos 2 e 3 podem compreender ITRs de tipo selvagem ou ITRs modificadas (mod-ITRs) em configurações simétricas ou assimé- tricas, conforme discutido aqui. EXEMPLO 4: PRODUÇÃO DE ceDNA ATRAVÉS DE UMA MOLÉCU-

LA DE DNA DE FITA SIMPLES

[00528] Outro método exemplar de produção de um vetor de ceD- NA usando um método sintético é fornecido no Exemplo 4 do docu- mento PCT/US19/14122, e usa um DNA linear de fita simples que compreende duas ITRs sensoriais que flanqueiam uma sequência de cassete de expressão sensorial e são ligados covalentemente a duas ITRs antissenso que flanqueiam um cassete de expressão antissenso, cujas extremidades são DNA linear de fita simples são então ligadas para formar uma molécula de fita simples de extremidade fechada. Um exemplo não limitativo compreende sintetizar e/ou produzir uma molé- cula de DNA de fita simples, emparelhar partes da molécula para for- mar uma única molécula de DNA linear que tem uma ou mais regiões emparelhadas em bases da estrutura secundária e depois ligar as ex- tremidades 5' e 3' livres uma na outra para formar uma molécula fe- chada de fita simples.

[00529] Em algumas modalidades, um construto para produzir um vetor de ceDNA compreende um interruptor regulador, como descrito no presente documento.

[00530] Os oligonucleotídeos de ITR podem compreender ITRs-WT como aqui descrito, ou podem compreender ITRs modificadas como aqui descrito.

[00531] Uma molécula de DNA de fita simples exemplificativa para a produção de um vetor de ceDNA compreende, de 5' a 3': uma pri- meira ITR de sentido; uma sequência de cassete de expressão de sentido; uma segunda ITR de sentido; uma segunda ITR antissenso; uma sequência de cassete de expressão antissenso; e uma primeira ITR antissenso.

[00532] Uma molécula de DNA de fita simples para uso no método exemplificativo do Exemplo 4 pode ser formada por qualquer metodo- logia de síntese de DNA aqui descrita, por exemplo, síntese de DNA in vitro, ou fornecida pela clivagem de um construto de DNA (por exem- plo, um plasmídeo) com nucleases e fusão dos fragmentos de dsDNA resultantes para fornecer fragmentos de ssDNA.

[00533] O anelamento pode ser realizado abaixando a temperatura abaixo das temperaturas de fusão calculadas dos pares de sequência senso e antissenso. A temperatura de fusão depende do teor específi- co da base de nucleotídeos e das características da solução utilizada, por exemplo, a concentração de sal. As temperaturas de fusão para qualquer combinação de sequência e solução são prontamente calcu- ladas por um versado na técnica.

[00534] As extremidades 5' e 3' livres da molécula emparelhada po- dem ser ligadas uma à outra ou ligadas a uma molécula em grampo para formar o vetor de ceDNA. Metodologias de ligação exemplares adequadas e moléculas em grampo são descritas nos Exemplos 2 e 3. EXEMPLO 5: VETORES DE CEDNA EXPRESSAM O TRANSGENE

DA LUCIFERASE IN VITRO

[00535] Os construtos foram gerados através da introdução de um quadro de leitura aberto que codifica o gene repórter da Luciferase no local de clonagem dos construtos do plasmídeo de ceDNA: construto- 15-30 (consulte acima na Tabela 7), ou construtos que compreendem as ITRs-WT de AAV2 incluindo a sequência de codificação da Lucife- rase. As células HEK293 foram cultivadas e transfectadas com 100 ng, 200 ng ou 400 ng dos construtos de plasmídeo 15-30, usando FUGE- NE® (Promega Corp.) como agente de transfecção. A expressão de luciferase de cada um dos plasmídeos foi determinada com base na atividade da luciferase em cada cultura de células, confirmando que a atividade da luciferase resultou da expressão gênica dos plasmídeos. EXEMPLO 6: EXPRESSÃO PROTEICA IN VIVO DO TRANSGENE DA LUCIFERASE A PARTIR DE VETORES DE ceDNA.

[00536] A expressão proteica in vivo de um transgene a partir de vetores de ceDNA produzidos a partir dos construtos descritos acima é avaliada em camundongos. Os vetores de ceDNA obtidos dos constru- tos de plasmídeo de ceDNA foram testados e demonstraram expres- são do transgene de luciferase sustentada e durável em um modelo de camundongo após injeção hidrodinâmica do construto de ceDNA sem lipossomo, redose (no dia 28) e durabilidade (até o dia 42) do ceDNA de luciferase de vagalume exógena. Em diferentes experimentos, a expressão de luciferase de vetores ceDNA selecionados é avaliada in vivo, onde os vetores ceDNA compreendem o transgene de luciferase e: i) uma ITR 5' modificada e a ITR 3' modificada simétrica selecionada de qualquer par simétrico mostrado na Tabela 4, ou os pares de ITR modificados mostrados nas Figuras 7A a 22B, ou ii) uma ITR do tipo selvagem 5' DE AAV2 e a ITR do tipo selvagem 3' de AAV2.

[00537] A expressão proteica in vivo de um transgene a partir de vetores de ceDNA produzidos a partir dos construtos com as ITRs-WT de AAV2 como descrito acima é avaliada em camundongos. O vetor de ceDNA obtido dos construtos de plasmídeo de ceDNA foi testado e demonstrou expressão do transgene de luciferase sustentada e durá-

vel em um modelo de camundongo após injeção hidrodinâmica do construto de ceDNA sem lipossomo, redose (no dia 28) e durabilidade (até o dia 42) do ceDNA de luciferase de vagalume exógena. Em dife- rentes experimentos, a expressão de luciferase de vetores de ceDNA selecionados é avaliada in vivo, onde os vetores de ceDNA compreen- dem o transgene de luciferase e uma ITR do tipo selvagem 5' de AAV2 e a ITR do tipo selvagem 3' de AAV2.

[00538] Expressão in vivo da luciferase: camundongos machos CD- 1 IGS de 5 a 7 semanas (Charles River Laboratories) são administra- dos 0,35 mg/kg de vetor de ceDNA expressando luciferase em 1,2 ml de volume via administração hidrodinâmica i.v. na veia da cauda no Dia 0. A expressão da luciferase é avaliada por imagem IVIS nos dias 3, 4, 7, 14, 21, 28, 31, 35 e 42. Resumidamente, os camundongos são injetados intraperitonealmente com 150 mg/kg de substrato de luciferi- na e a luminescência do corpo inteiro foi avaliada por meio de image- amento IVIS®.

[00539] O imageamento IVIS é realizado no dia 3, dia 4, dia 7, dia 14, dia 21, dia 28, dia 31, dia 35 e dia 42, e os órgãos coletados são fotografados ex vivo após o sacrifício no dia 42.

[00540] Durante o curso do estudo, os animais são pesados e moni- torados diariamente quanto à saúde e bem-estar geral. No sacrifício, o sangue é coletado de cada animal pelo bastão cardíaco terminal e di- vidido em duas porções e processado em 1) plasma e 2) soro, com plasma congelado rapidamente e soro usado no painel de enzimas hepáticas e subsequentemente congelado. Além disso, fígados, baços, rins e linfonodos inguinais (LNs) são coletados e gerados por imagem ex vivo pelo IVIS.

[00541] A expressão da luciferase é avaliada nos fígados pelo en- saio MAXDISCOVERY® Luciferase ELISA (BIOO Scienti- fic/PerkinElmer), qPCR para luciferase de amostras de fígado, histopa-

tologia de amostras de fígado e/ou um painel de enzimas hepáticas séricas (VetScanVS2; Abaxis Preventative Care Profile Plus). EXEMPLO 7: FORMAÇÃO E ANÁLISE DE ceDNA WT/WT

[00542] As ITRs de AAV tipo II de tipo selvagem foram usadas para examinar a formação de ceDNA e a capacidade de expressar o trans- gene codificado por ceDNA. A construção do vetor, o ensaio da forma- ção de ceDNA e a avaliação da expressão do transgene de ceDNA em cultura de células humanas são descritos em mais detalhes abaixo. CONSTRUÇÃO DE ITR WT/WT

[00543] Um plasmídeo com um cassete de ITR de AAV tipo II de tipo selvagem foi projetado in silico e posteriormente avaliado em célu- las de inseto Sf9. O cassete continha um gene repórter de proteína fluorescente verde (GFP) conduzido por uma sequência promotora p10 para expressão em células de inseto.

[00544] As culturas em suspensão Sf9 foram mantidas em meio Sf900 III (Gibco) em frascos de cultura de tecidos ventilados de 200 ml. As culturas foram passadas a cada 48 horas e as contagens de células e métricas de crescimento foram medidas antes de cada pas- sagem usando um contador ViCell (Beckman Coulter). As culturas fo- ram mantidas sob condições de agitação (órbita de 1", 130 rpm) a 27 ºC.

[00545] Os vetores de ceDNA foram gerados e construídos confor- me descrito no Exemplo 1 acima. Em resumo, referindo-se à Figura 4B, as células Sf9 transduzidas com o construto de plasmídeo foram deixadas crescer aderentemente por 24 horas sob condições estacio- nárias a 27 ºC. Após 24 horas, as células Sf9 transfectadas foram in- fectadas com o vetor Rep via células de inseto infectadas com baculo- vírus (BIICs). Os BIICs foram previamente testados para caracterizar a infectividade e foram usados na diluição final de 1:2.000. BIICs diluí- dos 1:100 em meio de células de inseto Sf900 foram adicionados a cada poço de célula previamente transfectada. BIICs de vetor não Rep foram adicionados a um subconjunto de poços como um controle ne- gativo. As placas foram misturadas balançando suavemente em um balancim de placas durante 2 minutos. As células foram então cultiva- das por mais 48 horas a 27 ºC em condições estacionárias. Todos os construtos experimentais e controles foram ensaiados em triplicado.

[00546] Após 48 horas, a placa de 96 poços foi removida da incu- badora, brevemente equilibrada à temperatura ambiente e examinada visualmente quanto à expressão de GFP usando microscopia de fluo- rescência. Imagens fluorescentes e de campo claro foram capturadas com ampliação de 40x. Como esperado, o controle negativo (amostra que foi processada na ausência de células de baculovírus contendo Rep) não mostrou expressão significativa de GFP. Expressão robusta de GFP foi observada na amostra de vetor GFP de ITR WT/WT, indi- cando que o transgene codificado por ceDNA foi transfectado com su- cesso. Os resultados são mostrados nas Figuras 24A a 24B. Como esperado, o controle negativo (amostra que foi processada na ausên- cia de células de baculovírus contendo Rep) não mostrou expressão significativa de GFP. A expressão robusta de GFP foi observada na amostra de tipo selvagem, indicando que o transgene codificado por ceDNA foi transfectado e expresso com sucesso. ENSAIO DE FORMAÇÃO DE ceDNA

[00547] Para garantir que o ceDNA gerado no estudo anterior tinha a estrutura fechada esperada, foram realizados experimentos para produzir quantidades suficientes de ceDNA que poderiam ser posteri- ormente testadas quanto à estrutura adequada. Resumidamente, cul- turas em suspensão Sf9 foram transfectadas com o DNA de ITR WT/WT. As culturas foram semeadas a 1,25x106 células/ml em frascos de cultura Erlenmeyer com troca gasosa limitada. Os complexos de transfecção DNA: lipídeo foram preparados usando o reagente de transfecção FuGene® de acordo com as instruções do fabricante.

Mis- turas complexas foram preparadas e incubadas da mesma maneira que anteriormente descrita para o ensaio de placa, com volumes au- mentados proporcionais ao número de células sendo transfectadas.

Tal como acontece com o ensaio do gene repórter, foi usada uma pro- porção de 4,5:1 (volume de reagente/massa de DNA). Simulador (rea- gentes de transfecção apenas) e controles de crescimento não trata- dos foram preparados em paralelo com culturas experimentais.

Após a adição de reagentes de transfecção, as culturas foram deixadas a re- cuperar durante 10 a 15 minutos à temperatura ambiente com agitação suave antes de serem transferidas para uma incubadora com agitação a 27 ºC.

Após 24 horas de incubação em condições de agitação, as contagens de células e métricas de crescimento para todos os frascos (experimental e controle) foram medidos usando um contador ViCell (Beckman Coulter). Todos os frascos (exceto controle de crescimento) foram infectados com BIICs contendo vetor Rep a uma diluição final de 1:5.000. Um controle positivo usando o procedimento de infecção du- pla BIIC estabelecido para a produção de ceDNA também foi prepara- do.

A cultura de infecção dupla foi semeada com o número de células igual à contagem média de células viáveis de todas as culturas expe- rimentais.

Um controle de infecção duplo foi infectado com Rep e gene repórter BIICs em uma diluição final de 1:5.000 para cada amostra, respectivamente.

Após a infecção, as culturas foram colocadas de vol- ta na incubadora sob condições de agitação previamente descritas.

Contagens de células, crescimento e métricas de viabilidade foram medidos diariamente para todos os frascos por 3 dias após a infecção.

As medições de ponto de tempo T = 0 foram tomadas após as culturas recém-infectadas terem se recuperado por ~2 horas em condições de incubação com agitação.

Após 3 dias, as células foram colhidas por centrifugação durante 15 minutos.

O sobrenadante foi descartado, a massa dos péletes foi registrada e os péletes foram congelados -80 ºC até a extração do DNA.

[00548] O ceDNA bruto putativo foi extraído de todos os frascos (experimental e controle) usando o kit Qiagen Plasmid Plus Midi Purifi- cation (Qiagen) de acordo com o protocolo de "alto rendimento" do fa- bricante. Os eluatos foram quantificados usando medições de densi- dade óptica obtidas de um NanoDrop OneC (ThermoFisher). Os extra- tos de ceDNA resultantes foram armazenados a 4 ºC.

[00549] Os extratos de ceDNA anteriores foram executados em um gel de agarose nativa (agarose 1%, tampão TAE 1x) preparado com diluição 1:10.000 de SYBR Safe Gel Stain (ThermoFisher Scientific), ao lado da escada de DNA TrackIt 1 kb Plus. O gel foi subsequente- mente visualizado usando um Gbox Mini Imager sob luz UV/azul. Con- forme descrito anteriormente, duas bandas primárias são esperadas em amostras de ceDNA executadas em géis nativos: uma banda de ~4.000 pb representando uma espécie monomérica e uma banda de ~8.000 pb correspondendo a uma espécie dimérica. A amostra de tipo selvagem foi testada e exibida as bandas de monômero e dímero es- peradas em um gel de agarose nativo. Os resultados para uma amos- tra representativa dos construtos são mostrados na Figura 25. O ce- DNA bruto putativo e os extratos de controle da produção em pequena escala foram posteriormente testados usando uma digestão de restri- ção acoplada e gel de agarose desnaturante para confirmar um diag- nóstico de estrutura de DNA de fita dupla de ceDNA. Espera-se que o ceDNA de tipo selvagem tenha um único local de restrição ClaI e, por- tanto, se for formado corretamente, produza dois fragmentos caracte- rísticos após a digestão ClaI. Endonuclease de restrição de alta fideli- dade ClaI (New England Biolabs) foi usada para digerir extrato de ce- DNA putativo de acordo com as instruções do fabricante. Os extratos dos controles simulados e de crescimento não foram ensaiados por-

que a quantificação espectrofotométrica usando NanoDrop (Thermo- Fisher), bem como a análise de gel de agarose nativa, revelou não ha- ver nenhum produto semelhante a ceDNA/plasmídeo detectável nos eluatos. O material digerido foi purificado usando Qiagen PCR Clean- up Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante, com a ex- ceção de que o material digerido purificado foi eluído em água sem nuclease em vez de tampão de eluição Qiagen. Um gel de agarose alcalina (agarose alcalina 0,8%) foi equilibrado em Tampão de Equilí- brio (EDTA 1 mM, NaOH 200 mM) durante a noite a 4 ºC. Solução desnaturante 10x (NaOH 50 mM, EDTA 1 mM) foi adicionada às amostras dos ceDNA purificados digeridos e ceDNA não digerido cor- respondente (1 ug no total) e as amostras foram aquecidas a 65 ºC durante 10 minutos. Corante de carregamento 10x (azul de bromofe- nol, glicerol a 50%) foi adicionado a cada amostra desnaturada e mis- turado. A escada de DNA TrackIt 1 kb Plus (ThermoFisher Scientific) também foi carregada no gel como referência. O gel foi corrido, duran- te ~18 horas a 4 ºC e de tensão constante (25 V), seguido de enxa- guamento com desionizada H2O e neutralização em 1xTAE (Tris- acetato, EDTA), pH 7,6, durante 20 minutos com suave agitação. O gel foi então transferido para solução 1x TAE/1x SYBR Gold durante ~1 hora sob agitação suave. O gel foi então visualizado usando um Gbox Mini Imager (Syngene) sob luz UV/azul. Esperava-se que as amostras desnaturadas não cortadas migrassem a ~ 9.000 pb e as amostras tratadas com ClaI deveriam ter duas bandas, uma a ~2.000 pb e outra a ~6.000 pb.

[00550] Duas bandas significativas eram visíveis em cada faixa de amostra nas amostras tratadas com ClaI, migrando no gel desnaturan- te nos tamanhos esperados, em nítido contraste com a amostra não digerida, que migrou no tamanho esperado de ~9.000 pb. A Figura 26 mostra os resultados para uma amostra representativa, onde duas bandas acima do fundo são vistas para a amostra digerida, em compa- ração com a única banda visível na amostra não digerida. Assim, a amostra parecia formar corretamente o ceDNA.

EXPRESSÃO FUNCIONAL EM CULTURA DE CÉLULAS HUMANAS

[00551] Para avaliar a funcionalidade do ceDNA de ITR WT/WT produzido pelo processo de produção em pequena escala, as células HEK293 são transfectadas com as amostras de ceDNA WT/WT. As células HEK293 em divisão ativa são semeadas em placas de microti- tulação de 96 poços a 3x106 células por poço (confluência de 80%) e incubadas por 24 horas em condições previamente descritas para cul- turas HEK293 aderentes. Após 24 horas, 200 ng no total de ceDNA bruto de pequena escala é transfectado usando Lipofectamine (Invitro- gen, TheromoFisher Scientific). Os complexos de transfecção são pre- parados de acordo com as instruções do fabricante e um volume total de 10 µl de complexo de transfecção é usado para transfectar células HEK293 previamente plaqueadas. Todos os construtos experimentais e controles são testados em triplicado. As células transfectadas são incubadas nas condições previamente descritas durante 72 horas. Após 72 horas, a placa de 96 poços é removida da incubadora e dei- xada a equilibrar brevemente à temperatura ambiente. O ensaio para a expressão de GFP é realizado conforme descrito acima. A lumines- cência total é medida usando um leitor de microplacas SpectraMax M Series. As réplicas são calculadas em média. A expressão de GFP em cultura de células humanas indica que ceDNA foi corretamente forma- do e expresso para cada amostra no contexto de células humanas. EXEMPLO 8: TRIAGEM DE MUTANTE SIMÉTRICO DE ITR WALK

[00552] Foram realizadas análises adicionais da relação da estrutu- ra de ITR com a formação de ceDNA. Uma série de mutantes foi cons- truída para questionar o impacto de alterações estruturais específicas na formação de ceDNA e na capacidade de expressar o transgene co-

dificado em ceDNA. A construção de mutantes, o ensaio de formação de ceDNA e a avaliação da expressão do transgene de ceDNA em cul- tura de células humanas foram realizados de maneiras semelhantes aos métodos descritos em detalhes acima.

CONSTRUÇÃO DE ITR MUTANTE

[00553] Uma biblioteca de 16 plasmídeos com cassetes mutantes ITR de AAV tipo II simétricas únicas foi projetada in silico e posterior- mente avaliada em células de inseto Sf9 e células renais embrionárias humanas (HEK293). Cada cassete ITR continha um gene repórter de luciferase (LUC) ou proteína fluorescente verde (GFP) conduzido por uma sequência promotora p10 para expressão em células de inseto e uma sequência promotora CAG para expressão em células de mamí- feros. Mutações na sequência de ITR foram criadas simetricamente nas regiões ITR direita e esquerda. A biblioteca continha 16 mutantes duplos do lado direito, conforme divulgado na Tabela 4 aqui, onde as estruturas previstas são mostradas nas Figuras 7A a 22B.

[00554] As culturas em suspensão Sf9 foram mantidas em meio Sf900 III (Gibco) em frascos de cultura de tecidos ventilados de 200 ml. As culturas foram passadas a cada 48 horas e as contagens de células e métricas de crescimento foram medidas antes de cada pas- sagem usando um contador ViCell (Beckman Coulter). As culturas fo- ram mantidas sob condições de agitação (órbita de 1", 130 rpm) a 27 ºC. Culturas aderentes de células HEK293 foram mantidas em Gluti- Max DMEM (meio Eagle modificado de Dulbecco, Gibco) com 1% de soro fetal bovino e 0,1% de PenStrep em frascos de cultura de 250 ml a 37 ºC com 5% de CO2. As culturas foram tripsinizadas e passadas a cada 96 horas. Uma diluição de 1:10 de um frasco confluente de 90 a 100% foi usada para semear cada passagem.

[00555] Os vetores de ceDNA foram gerados e construídos confor- me descrito no Exemplo 1 acima. Em resumo, referindo-se à Figura

5B, células Sf9 transduzidas com construções de plasmídeo foram deixadas crescer de forma aderente por 24 horas sob condições esta- cionárias a 27 ºC. Após 24 horas, as células Sf9 transfectadas foram infectadas com o vetor Rep via células de inseto infectadas com bacu- lovírus (BIICs). Os BIICs foram previamente testados para caracterizar a infectividade e foram usados na diluição final de 1:2.000. BIICs diluí- dos 1:100 em meio de células de inseto Sf900 foram adicionados a cada poço de célula previamente transfectada. BIICs de vetor não Rep foram adicionados a um subconjunto de poços como um controle ne- gativo. As placas foram misturadas balançando suavemente em um balancim de placas durante 2 minutos. As células foram então cultiva- das por mais 48 horas a 27 ºC em condições estacionárias. Todos os construtos experimentais e controles foram ensaiados em triplicado.

[00556] Após 48 horas, a placa de 96 poços foi removida da incu- badora, brevemente equilibrada à temperatura ambiente e testada quanto à expressão de luciferase (OneGlo Luciferase Assay (Promega Corporation)). A luminescência total foi medida usando um leitor de microplacas SpectraMax M Series. As réplicas foram calculadas em média. A atividade de luciferase de construtos mutantes de ITR simé- trica da Tabela 7 é mostrada na Figura 23. Como esperado, os três controles negativos (apenas meio, transfecção simulada sem DNA do doador e amostra que foi processada na ausência de células de bacu- lovírus contendo Rep) não mostraram expressão significativa de lucife- rase. Foi observada expressão robusta de luciferase em cada uma das amostras mutantes, indicando que para cada amostra o transgene co- dificado por ceDNA foi transfectado com sucesso e expresso indepen- dentemente da mutação. EXEMPLO 9: AVALIAÇÃO IN VIVO DA EXPRESSÃO DE LUCIFERA- SE A PARTIR DE UM CONSTRUTO DE CEDNA COM ITRS MUTAN-

TES SIMÉTRICAS

[00557] Camundongos CD-1 (N = 30, machos, cerca de 4 semanas de idade) foram tratados com vários tipos de ceDNA produzidos a par- tir de Sf9, bem como as abordagens sintéticas descritas acima. Parti- cularmente, um construto de ceDNA tendo ITRs mutantes em ambos os lados esquerdo e direito em uma configuração simétrica (Construto- 388) (ver Figura 27; painel esquerdo) e um construto de ceDNA tendo ITRs de AAV de tipo selvagem em ambos os lados esquerdo e direito (Construto-393) (ver Figura 27; painel direito) foram comparados quanto à sua expressão in vivo. Esses construtos foram produzidos a partir de células Sf9 conforme descrito acima e formuladas em LNPs. Além disso, um ceDNA produzido por Sf9 com configuração assimétri- ca de ITRs, uma ITR de tipo selvagem de AAV2 à esquerda e uma ITR mutante truncada do lado direito do construto, também foi formulado em LNPs e usado como controle. Além disso, ceDNAs produzidos sin- teticamente com configurações ITR simétricas ou assimétricas tam- bém foram testados quanto aos seus níveis de expressão.

[00558] As observações do lado da gaiola foram realizadas diaria- mente; e as observações clínicas foram realizadas 1, 6 e 24 horas após a dose. Os pesos corporais de todos os animais foram registra- dos nos pontos de tempo indicados (ver Figura 28).

[00559] ceDNAs foram dosados a 5 ml/kg no Dia 0 por administra- ção IV via veia da cauda leteral. Os animais foram dosados com lucife- rina a 150 mg/kg (60 mg/ml) via injeção interaperitoneal (IP) a 2,5 ml/kg. Dentro de 15 minutos após a administração da luciferina, todos os animais tiveram uma sessão de imagem e medição IVIS. Como mostrado na Figura 28, a alteração percentual do peso corporal nos animais dosados com Construto-388 foi semelhante à dos animais tra- tados com Construto-393 no Dia 6 (Figura 28). O resultado das medi- ções IVIS que correspondem aos níveis de expressão da luciferase são mostrados na Figura 29A e Figura 29B. Surpreendentemente, a expressão in vivo de ceDNA tendo ITRs mutantes nos lados esquerdo e direito do construto (isto é, Construto-388) foi observada em níveis que são semelhantes aos níveis observados em um construto de ce- DNA possuindo ITRs de AAV de tipo selvagem tanto nos lados es- querdo e direito do construto (isto é, Construto-393) (ver Figuras 29A e 29B). Estes dados sugerem que uma ITR intacta pode não ser neces- sária para localização e expressão funcional de ceDNA. Além disso, o ceDNA sintético produzido por métodos livres de células descritos nes- te documento também exibiu níveis de expressão robustos, conforme esperado (ver Figura 29A).

REFERÊNCIAS

[00560] Todas as referências listadas e divulgadas no relatório des- critivo e nos Exemplos, incluindo patentes, pedidos de patentes, pedi- dos de patentes internacionais e publicações são incorporados aqui em sua totalidade a título de referência.

Claims (66)

REIVINDICAÇÕES

1. Vetor de DNA sem capsídeo não viral com extremidades covalentemente fechadas (vetor de ceDNA), caracterizado pelo fato de que o vetor de ceDNA compreende pelo menos uma sequência de nu- cleotídeos heteróloga operacionalmente posicionada entre duas se- quências de repetição terminal invertida simétrica flanqueadora (ITRs simétricas), em que as ITRs simétricas não são ITRs de tipo selvagem e cada ITR de flanqueamento tem a mesma modificação simétrica.

2. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizado pelo fato de que as sequências de ITRs simétricas são sintéti- cas.

3. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as ITRs são selecionadas a partir de qualquer uma das listadas na Tabela 4.

4. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que cada uma das ITRs simétricas é modificada por uma deleção, inserção e/ou substitui- ção em pelo menos uma das regiões de ITR selecionadas a partir de A, A', B, B', C, C', D e D'.

5. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 4, carac- terizado pelo fato de que a deleção, inserção e/ou substituição resul- tam na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-alça nor- malmente formada pelas regiões A, A', B, B' C ou C'.

6. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que uma ITR simétrica é modificada por uma deleção, inserção e/ou substituição que resulta na deleção de to- da ou parte de uma estrutura de haste-laço normalmente formada pe- las regiões B e B'.

7. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que uma ITR simétrica é modificada por uma deleção, inserção e/ou substituição que resultam na deleção de toda ou parte de uma estrutura de haste-alça normal- mente formada pelas regiões C e C'.

8. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que uma ITR simétrica é modificada por uma deleção, inserção e/ou substituição que resultam na deleção de parte de uma estrutura de haste-laço normalmente formada pelas re- giões B e B' e/ou parte de uma estrutura de haste-laço normalmente formada pelas regiões C e C'.

9. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que uma ITR simétrica compreende uma única estrutura de haste-alça na região que normal- mente compreende uma primeira estrutura de haste-alça formada pe- las regiões B e B' e uma segunda estrutura de haste-alça formada pe- las regiões C e C'.

10. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 9, ca- racterizado pelo fato de que uma ITR simétrica compreende uma única haste e duas alças na região que normalmente compreende uma pri- meira estrutura de haste-alça formada pelas regiões B e B' e uma se- gunda estrutura de haste-alça formada pelas regiões C e C'.

11. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que uma ITR simétrica compreende uma única haste e duas alças na região que normalmente compreende uma primeira estrutura de haste-alça formada pelas regiões B e B' e uma segunda estrutura de haste-alça formada pelas regiões C e C'.

12. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que as ITRs simétricas são ITRs de AAV2 modificadas que compreendem sequências de nu- cleotídeos selecionadas a partir de: as ITRs nas Figuras 7A a 22B ou na Tabela 4 no presente documento, e uma ITR com pelo menos 95%

de identidade de sequência em relação às ITRs listadas na Tabela 4 ou mostradas nas Figuras 7A a 22B.

13. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que toda ou parte da sequência nucleotídica heteróloga está sob o controle de pelo menos um interruptor regulador.

14. Vetor de DNA sem capsídeo não viral com extremida- des covalentemente fechadas (vetor de ceDNA), caracterizado pelo fato de que o vetor de ceDNA compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga operacionalmente posicionada entre duas sequências de repetição terminal invertida de tipo selvagem flanquea- doras (ITRs de tipo selvagem), em que toda ou parte da sequência de nucleotídeos heteróloga está sob o controle de pelo menos um inter- ruptor regulador.

15. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 14, ca- racterizado pelo fato de que as sequências de ITR de tipo selvagem são sequências de ITR de tipo selvagem simétricas ou sequências de ITR de tipo selvagem substancialmente simétricas.

16. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que as sequências de ITR de tipo selva- gem são selecionadas a partir de qualquer uma das combinações de ITRs de tipo selvagem mostradas na Tabela 1.

17. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que a ITR de tipo sel- vagem flanqueadora tem pelo menos 95% de identidade de sequência em relação às ITRs listadas na Tabela 1 ou Tabela 2 e todas as subs- tituições são substituições de ácido nucleico conservativas que não afetam a estrutura das ITRs de tipo selvagem.

18. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 13 a 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos um interruptor regulador é selecionado a partir de qualquer um ou uma combinação de interruptores reguladores listados na Tabela 5 ou na seção intitulada "Interruptores reguladores" no presente documento.

19. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que, quando dige- rido com uma enzima de restrição que tem um único sítio de reconhe- cimento no vetor de ceDNA e analisado por eletroforese em gel nativo e desnaturante, exibe bandas características de DNA linear e contínuo quando comparado com controles de DNA linear e não contínuo.

20. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as sequên- cias de ITR são baseadas em sequências de um vírus selecionado de um parvovírus, um dependovírus e um vírus adenoassociado (AAV).

21. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 20, ca- racterizado pelo fato de que as ITRs são baseadas em sequências de vírus adenoassociados (AAV).

22. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 21, ca- racterizado pelo fato de que as ITRs são baseadas em sequências de um sorotipo de AAV selecionado a partir de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12.

23. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o vetor está em um nanocarreador.

24. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 23, ca- racterizado pelo fato de que o nanocarreador compreende uma nano- partícula lipídica (LNP).

25. Vetor de ceDNA, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: (a) incubar uma população de células de inseto que abrigam um construto de expres-

são de ceDNA na presença de pelo menos uma proteína Rep, em que o construto de expressão de ceDNA codifica o vetor de ceDNA, sob condições eficazes e por um tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA nas células de inseto; e (b) isolar o vetor de ceDNA das células de inseto.

26. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 25, ca- racterizado pelo fato de que o construto de expressão de ceDNA é se- lecionada a partir de um plasmídeo de ceDNA, um ceDNA-bacmídeo e um ceDNA-baculovírus.

27. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que a célula de inseto expressa pelo menos uma proteína Rep.

28. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 27, ca- racterizado pelo fato de que a pelo menos uma proteína Rep é de um vírus selecionado a partir de um parvovírus, um dependovírus e um vírus adenoassociado (AAV).

29. Vetor de ceDNA, de acordo com a reivindicação 28, ca- racterizado pelo fato de que a pelo menos uma proteína Rep é de um sorotipo AAV selecionado a partir de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12.

30. Construto de expressão de ceDNA, caracterizado pelo fato de que codifica o vetor de ceDNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29.

31. Construto de expressão de ceDNA, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que é um plasmídeo de ceDNA, ceDNA-bacmídeo ou ceDNA-baculovírus.

32. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que com- preende o construto de expressão de ceDNA, como definido na reivin- dicação 30 ou 31.

33. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 32,

caracterizada pelo fato de que expressa pelo menos uma proteína Rep.

34. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma proteína Rep é de um vírus selecionado a partir de um parvovírus, um dependovírus e um vírus adenoassociado (AAV).

35. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma proteína Rep é de um sorotipo AAV selecionado a partir de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e AAV12.

36. Célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 35, caracterizada pelo fato de que é uma célula de inseto.

37. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que a célula de inseto é uma célula Sf9.

38. Método para produzir um vetor de ceDNA, caracteriza- do pelo fato de que compreende: (a) incubar a célula hospedeira, co- mo definida em qualquer uma das reivindicações 32 a 37, sob condi- ções eficazes e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA; e (b) isolar o ceDNA das células hospedeiras.

39. Método para tratar, prevenir, melhorar, monitorar ou di- agnosticar uma doença ou distúrbio em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a um indivíduo em necessi- dade, uma composição compreendendo o vetor de ceDNA, como defi- nido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, em que a pelo me- nos uma sequência de nucleotídeos heteróloga é selecionada para tratar, prevenir, melhorar, diagnosticar ou monitorar a doença ou dis- túrbio.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracteriza- do pelo fato de que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos he-

teróloga, quando transcrita ou traduzida, corrige uma quantidade anormal de uma proteína endógena no indivíduo.

41. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracteriza- do pelo fato de que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos he- teróloga, quando transcrita ou traduzida, corrige uma função ou ativi- dade anormal de uma proteína ou via endógena no indivíduo.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 39 a 41, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma se- quência de nucleotídeos heteróloga codifica ou compreende uma mo- lécula de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em um RNAi, um siRNA, um miRNA, um lncRNA e um oligo ou polinucleo- tídeo antissenso.

43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 39 a 41, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma se- quência de nucleotídeos heteróloga codifica uma proteína.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracteriza- do pelo fato de que a proteína é uma proteína marcadora (por exem- plo, uma proteína repórter).

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 39 a 44, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma se- quência de nucleotídeos heteróloga codifica um agonista ou um anta- gonista de uma proteína endógena ou via associada à doença ou dis- túrbio.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 39 a 45, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma se- quência de nucleotídeos heteróloga codifica um anticorpo.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 39 a 46, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é selecionado a partir do grupo que consiste em: uma doença ou distúr- bio metabólico, uma doença ou distúrbio do SNC, uma doença ou dis-

túrbio ocular, uma doença ou distúrbio do sangue, um doença ou dis- túrbio do fígado, uma doença ou distúrbio imunológico, uma doença infecciosa, uma doença ou distúrbio muscular, câncer e uma doença ou distúrbio com base em um nível anormal e/ou função de um produ- to gênico.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio metabólico é selecionado a partir do grupo que consiste em diabetes, um distúrbio de armazena- mento lisossomal, um distúrbio de mucopolissacarídeo, uma doença ou distúrbio do ciclo da ureia e uma doença ou distúrbio de armaze- namento de glicogênio.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que o distúrbio de armazenamento lisossomal é seleci- onado a partir do grupo que consiste em doença de Gaucher, doença de Pompe, leucodistrofia metacromática (MLD), fenilcetonúria (PKU) e doença de Fabry.

50. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio do ciclo da ureia é a defici- ência de ornitina transcarbamilase (OTC).

51. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracteriza- do pelo fato de que o distúrbio de mucopolissacarídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em síndrome de Sly, Síndrome de Hurler, Síndrome de Scheie, Síndrome de Hurler-Scheie, Síndrome de Hunter, Síndrome de Sanfilippo, Síndrome de Morquio e Síndrome de Marote- aux-Lamy.

52. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio do SNC é selecionado a par- tir do grupo que consiste em doença de Alzheimer, doença de Parkin- son, doença de Huntington, doença de Canavan, doença de Leigh, doença de Refsum, síndrome de Tourette, esclerose lateral primária,

esclerose lateral amiotrófica, esclerose lateral amiotrófica, atrofia mus- cular progressiva, doença de Pick, distrofia muscular, esclerose múlti- pla, miastenia grave, doença de Binswanger, trauma devido à medula espinhal ou lesão na cabeça, doença de Tay Sachs, doença de Lesch- Nyan, epilepsia, infartos cerebrais, distúrbios psiquiátricos, esquizofre- nia, dependência de drogas, neuroses, psicose, demência, paranoia, distúrbio de déficit de atenção, distúrbios do sono, distúrbios da dor, distúrbios alimentares ou de peso e cânceres e tumores do SNC.

53. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio ocular é selecionado a partir do grupo que consiste em um distúrbio oftálmico envolvendo a retina, o trato posterior e/ou o nervo óptico.

54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracteriza- do pelo fato de que o distúrbio oftálmico envolvendo a retina, trato pos- terior e/ou nervo óptico é selecionado a partir do grupo que consiste em retinopatia diabética, degeneração macular incluindo degeneração macular relacionada à idade, atrofia geográfica e vascular ou degene- ração macular "úmida", glaucoma, uveíte, retinite pigmentosa, Star- gardt, Amaurose congênita de Leber (LCA), síndrome de Usher, pseu- doxantoma elástico (PXE), retinite pigmentosa ligada ao X (XLRP), re- tinosquise ligada ao X (XLRS), Coroideremia, neuropatia óptica heredi- tária de Leber (LHON), Arquomatopsia, distrofia de cones-bastonetes, distrofia endotelial da córnea de Fuchs, edema macular diabético e câncer ocular e tumores.

55. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio do sangue é selecionado a partir do grupo que consiste em hemofilia A, hemofilia B, talassemia, anemia e cânceres do sangue.

56. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio hepático é selecionado a partir do grupo que consiste em colestase intra-hepática familiar pro- gressiva (PFIC) e câncer de fígado e tumores.

57. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou distúrbio é fibrose cística.

58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 39 a 57, caracterizado pelo fato de que o vetor de ceDNA é ad- ministrado em combinação com um carreador farmaceuticamente acei- tável.

59. Método para entregar uma proteína terapêutica a um indivíduo, é caracterizado pelo fato de que compreende a administra- ção ao indivíduo de uma composição compreendendo o vetor de ceD- NA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, em que a pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga codifica uma proteína terapêutica.

60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que a proteína terapêutica é um anticorpo terapêutico.

61. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracteriza- do pelo fato de que a proteína terapêutica é selecionada a partir do grupo que consiste em uma enzima, eritropoietina, angiostatina, en- dostatina, superóxido dismutase, globina, leptina, catalase, tirosina hi- droxilase, uma citocina, regulador de condutância transmembrana de fibrose cística (CFTR), um fator de crescimento de peptídeo e um hormônio.

62. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um ve- tor de ceDNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29, e um nanocarreador, embalado em um recipiente com uma bula.

63. Kit para a produção de um vetor de ceDNA, caracteri- zado pelo fato de que compreende um construto de expressão com- preendendo pelo menos um sítio de restrição para inserção de pelo menos uma sequência de nucleotídeos heteróloga, ou interruptor regu-

lador, ou ambos, o pelo menos um sítio de restrição operacionalmente posicionado entre (i) sequências simétricas de repetição terminal inver- tida (ITRs simétricas), em que as ITRs simétricas não são ITRs do tipo selvagem ou (ii) duas sequências de repetição terminal invertidas do tipo selvagem (ITRs do tipo selvagem).

64. Kit, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que é adequado para produzir o vetor de ceDNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

65. Kit, de acordo com a reivindicação 63 ou 64, caracteri- zado pelo fato de que compreende ainda uma população de células de inseto que é desprovida de sequências de codificação de capsídeo viral, que na presença da proteína Rep pode induzir a produção do ve- tor de ceDNA.

66. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 65, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um vetor que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica pelo menos uma proteína Rep, em que o vetor é adequado para expressar a pelo menos uma proteína Rep em uma célula de inseto.