CN101287497B - 涂层脂质复合体和它们的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脂质组合物，所述脂质组合物包含至少一种第一脂质组分、至少一种第一辅助脂质、和一种在体内条件下可以从所述脂质组合物除去的屏蔽化合物。

Description

涂层脂质复合体和它们的用途
本发明涉及阳离子脂质，含有阳离子脂质的组合物及其用途，还涉及用于将化合物传递到细胞中的方法。
分子生物学以及分子医学都严重依赖于将生物学活性化合物到细胞中的引入。这种生物学活性化合物典型分别包含，其中，DNA、RNA以及肽和蛋白质。不得不克服的障碍典型地是具有带负电荷的外表面的脂双层。本领域中，已经开发了许多技术以穿透细胞膜并且因而引入所述生物学活性化合物。然而，为实验室用途设想的一些方法不能用于医疗领域并且更具体而言不适于药物递送。例如，如果无论如何，本领域已知的电穿孔和冲击法将仅容许生物学活性化合物的局部递送。除所述脂双层细胞膜之外也包含转运体系。因此，采用努力以使用该种类的转运体系，以便将所述生物学活性化合物传递穿过所述细胞膜。然而，由于这种转运体系的特异性或交叉反应性，它们的用途不是一般可应用的方法。
在本领域中描述的用于将生物学活性化合物转移到细胞中的更一般可应用的方法是病毒载体的使用。然而，病毒载体仅可以用于将基因有效地转移到一些细胞类型中；但是它们不能用于将化学合成的分子引入到所述细胞中。
一种备选方法是使用所谓的脂质体(Bangham，J.Mol.Biol.13，238-252)。脂质体是两亲的脂质在水中缔合时产生的泡状体。脂质体典型地包含同心排列的磷脂双层。取决于层的数量，脂质体可以分类为小的单薄层状的泡状体、多薄层状的泡状体和大的单薄层状的泡状体。已经证明脂质体是有效的递送剂，因为它们可以将亲水的化合物结合到水中间层中，而将疏水性化合物结合到所述脂质层中。本领域中众所周知，脂质剂型的组成以及它的制备方法对于得到的脂质聚集体的结构和大小并因而对于所述脂质体具有影响。也已知脂质体结合阳离子的脂质。
除了作为脂质体的组分之外，阳离子的脂质也吸引了相当大的关注，因为它们因而可以用于生物聚合物的细胞递送。利用阳离子的脂质，由于静电相互作用，可以基本上将任何阴离子的化合物以定量方式胶囊化。另外，相信阳离子的脂质与带负电荷的细胞膜的相互作用引发细胞膜转运。已经发现，含有阳离子脂质的脂质体剂型的使用或阳离子脂质像这样连同生物学活性化合物的使用需要试探法，因为每个剂型是有限有用的，因为它典型地可以将质粒递送到一些而不是全部细胞类型中，通常不存在血清。
要通过它们转运的脂质和生物学活性化合物的电荷和/或质量的比例，已经证实了是不同类型的所述生物学活性化合物递送中的关键因素。例如，已经显示，大小上包含5,000至10,000个碱基的适于质粒递送的脂质剂型一般对于寡核苷酸诸如合成的核酶或典型包含约10至约50碱基的反义分子的递送不是有效的。另外，最近已经表明，即使在相同的细胞类型中，用于反义寡核苷酸和核酶的最佳递送条件也是不同的。
美国专利6,395,713公开了基于典型由亲脂性基团、连接体和头基团组成的组合物的阳离子脂质，和使用这种组合物用于将生物学活性化合物转移到细胞中。
构成本发明基础的问题是提供将生物学活性化合物引入到细胞优选动物细胞中的方法。构成本发明基础的进一步的问题是提供用于核酸的递送剂，所述核酸特别是小核酸诸如siRNA、siNA和RNAi或适配子和spiegelmers。
构成本发明基础的更进一步的问题是提供具有良好转染和递送特征的递送剂，同时在体内提供长循环时间。
通过结合于此的独立权利要求的主题物质解决这些问题。可以从后附其上的从属权利要求获得优选实施方案。
在第一方面中，通过包含下列物质的脂质组合物，也解决了构成本发明基础的问题
至少一种第一脂质组分，
至少一种第一辅助脂质，和
一种在体内条件下可以从所述脂质组合物除去的屏蔽化合物。
在第一方面的一个实施方案中，所述屏蔽化合物选自包含PEG、HEG、聚羟乙基淀粉(polyHES)和聚丙烯的组。
在第一方面的一个优选实施方案中，所述屏蔽化合物是PEG2000或PEG5000。
在第一方面的一个实施方案中，所述组合物包括另外的组分和/或第二辅助脂质。
在第一方面的一个实施方案中，所述脂质组合物包含核酸，其中这种核酸优选是所述另外的组分。
在第一方面的一个优选实施方案中，所述核酸选自包含RNAi、siRNA、siNA、反义核酸、核酶、适配子和spiegelmers的组。
在第一方面的一个实施方案中，所述屏蔽化合物是PEG和神经酰胺的缀合物。
在第一方面的一个优选实施方案中，所述神经酰胺包含至少一种6至10个碳原子，优选8个碳原子的短碳链取代基。
在第一方面的一个实施方案中，所述神经酰胺是第一辅助脂质。
在第一方面的备选实施方案中，所述神经酰胺是第二辅助脂质。
在第一方面的一个实施方案中，将所述屏蔽化合物结合到所述核酸。
在第一方面的一个优选实施方案中，将所述屏蔽化合物通过连接体部分结合到所述核酸，优选通过连接体部分共价结合到所述核酸。
在第一方面的更优选实施方案中，所述连接体部分选自包含ssRNA、ssDNA、dsRNA、dsDNA、肽、S-S-连接体和pH敏感连接体的组。
在第一方面的一个优选实施方案中，所述核酸选自包含RNAi、siRNA和siNA的组，并且将所述连接体结合到有义链的3’末端。
在第一方面的一个优选实施方案中，所述屏蔽化合物包含pH-敏感连接体或pH-敏感部分。
在第一方面的一个优选实施方案中，所述连接体或部分是阴离子的连接体或阴离子的部分。
在第一方面的一个更优选实施方案中，所述阴离子的连接体或阴离子的部分在酸性环境中是弱阴离子的或中性的，其中优选这种酸性环境是核内体。
在第一方面的一个实施方案中，所述pH-敏感连接体或pH-敏感部分选自包含寡聚(谷氨酸)、低聚酚盐和二亚乙基三胺五乙酸的组。
在第一方面的一个实施方案中，所述第一脂质组分是根据式(I)的化合物，
Figure G2005845081620070629D000041
其中R1和R2各自并且独立地选自包含烷基的组；
n是1和4之间任意整数；
R3是选自包含赖氨酰、鸟氨酰、2，4-二氨基丁酰、组氨酰和根据式(II)的酰基部分的组的酰基，
Figure G2005845081620070629D000042
其中m是1至3的任意整数，其中NH3 +任选是无，和
Y-药物上可接受的阴离子。
在第一方面的一个优选实施方案中，R1和R2各自并且独立选自包含月桂基、肉豆蔻基、棕榈基和油烯基的组。
在第一方面的一个更优选实施方案中，R1是月桂基并且R2是肉豆蔻基；或
R1是棕榈基并且R2是油烯基。
在第一方面的一个更优选实施方案中，m是1或2。
在第一方面的一个更优选实施方案中，所述化合物是阳离子脂质，优选与阴离子Y-缔合。
在第一方面的一个更优选实施方案中，Y-选自包含卤化物、乙酸盐和三氟乙酸盐的组。
在第一方面的一个更优选实施方案中，所述化合物选自包含下列的组：
-β-精氨酰-2，3-氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化物
Figure G2005845081620070629D000051
-β-精氨酰-2，3-氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸化物
Figure G2005845081620070629D000052
和
-ε-精氨酰-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸化物
Figure G2005845081620070629D000053
在第一方面的一个更优选实施方案中，所述组合物包含载体。
在第二方面中通过药物组合物也解决了构成本发明基础的问题，所述药物组合物包含根据第一方面的组合物和药物活性化合物并且优选药物上可接受的载体。
在第二方面的一个实施方案中，所述药物活性化合物和/或另外的组分选自包含肽、蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸和核酸的组。
在第二方面的一个优选实施方案中，所述蛋白质是抗体，优选是单克隆抗体。
在备选的优选实施方案中，所述核酸选自包含DNA、RNA、PNA和LNA的组。
在第二方面的一个优选实施方案中，所述核酸是功能性核酸，其中优选选自包含RNAi、siRNA、siNA、反义核酸、核酶、适配子和spiegelmers的组的功能性核酸。
在第一和第二方面的实施方案中，所述第一辅助脂质和/或第二辅助脂质选自包含磷脂和类固醇的组，优选条件是所述第一和/或第二辅助脂质不同于神经酰胺。
在第一和第二方面的一个优选实施方案中，所述第一和/或第二辅助脂质或辅助脂质组分选自包含1，2-二植烷酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺和1，2-二油烯基-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺的组。
在第一和第二方面的一个更优选实施方案中，所述辅助脂质组分的含量是所述组合物的总脂质含量的约20摩尔％至约80摩尔％。
在第一和第二方面的还更优选实施方案中，所述辅助脂质组分的含量是约35摩尔％至约65摩尔％。
在第一和第二方面的一个实施方案中，所述脂质是β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化物，并且所述辅助脂质是1，2-二植烷酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺。
在第一和第二方面的优选实施方案中，所述脂质是所述组合物的总脂质含量的50摩尔％并且所述辅助脂质是50摩尔％。
在第一和第二方面的一个实施方案中，所述组合物还包含第二辅助脂质。
在第一和第二方面的一个实施方案中，所述第一和/或第二辅助脂质包括选自包含PEG部分、HEG部分、聚羟乙基淀粉(polyHES)部分和聚丙烯部分的组的基团，其中这种部分优选提供分子量约500至10000Da，更优选约2000至5000Da的分子量。
在第一和第二方面的一个优选实施方案中，包含PEG部分的辅助脂质选自包含1，2-二硬脂酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺和1，2-二烷基-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺的组。
在第一和第二方面的更优选实施方案中，所述辅助脂质的PEG部分具有2,000至5,000Da的分子量，优选2,000Da的分子量。
在第一和第二方面的还更优选实施方案中，所述组合物包括β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化物作为所述脂质组分，1，2-二植烷酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺作为第一辅助脂质和1，2-二硬脂酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺-PEG2000作为第二辅助脂质。
在第一和第二方面的一个实施方案中，第二辅助脂质的含量是约0.05mol％至4.9mol％，优选约1至2摩尔％。
在第一和第二方面的一个实施方案中，所述组合物含有约1至10摩尔％，更优选1至7.5摩尔％并最优选1至5摩尔％的PEG和神经酰胺的缀合物。
在第一和第二方面的一个优选实施方案中，所述神经酰胺是C8m并且PEG是PEG2000，并且其中PEG和神经酰胺的缀合物的含量是约1至7.5摩尔％。
在第一和第二方面的一个备选优选实施方案中，所述神经酰胺是C8m并且PEG是PEG5000，并且其中PEG和神经酰胺的缀合物的含量是约1至5摩尔％。
在第一和第二方面的一个实施方案中，第一脂质组分的含量是约42.5摩尔％至50摩尔％，所述第一辅助脂质的含量是约42.5至50摩尔％，其中第一脂质组分、第一辅助脂质和PEG和神经酰胺的缀合物的含量的总数是100摩尔％。
在第一和第二方面的一个实施方案中，所述功能性核酸是双链的核糖核酸，其中所述组合物还包括核酸，优选功能性核酸，其更优选双链的核糖核酸，并且最优选选自包含RNAi、siRNA、siNA、反义核酸和核酶的组的核酸，其中优选RNAi对于阳离子脂质的摩尔定量是约0至0.075，优选约0.02至0.05并且甚至更优选0.037。
在第一和第二方面的一个实施方案中，所述第一脂质组分和/或所述辅助脂质的至少一种和/或屏蔽化合物在水介质中作为分散体存在。
在第一和第二方面的备选实施方案中，所述第一脂质组分和/或所述辅助脂质的至少一种和/或屏蔽化合物在水可互溶的溶剂中作为溶液存在，其中优选所述溶剂选自包含乙醇和叔丁醇的组。
在第三方面中，通过利用根据第一或第二方面的组合物用于药剂制造，也解决了构成本发明基础的问题。
在第四方面中，通过利用根据第一或第二方面的组合物作为转移剂，也解决了构成本发明基础的问题。
在第四方面的一个实施方案中，所述转移剂将药物活性的组分和/或另外的组分转移到细胞中，所述细胞优选哺乳动物细胞并且更优选人细胞。
在第五方面中，通过将药物活性化合物和/或另外的组分转移到细胞中或穿过膜优选细胞膜的方法，也解决了构成本发明基础的问题，所述方法包含下列步骤：
-提供细胞或膜；
-根据第一或第二方面提供组合物，药物活性化合物和/或另外的组分；和
-将所述细胞或所述膜与根据第一或第二方面的组合物接触。
在第五方面的一个实施方案中，所述方法包括另外的步骤：
-在细胞和/或膜之上(beyond)检测所述药物活性化合物和/或另外的组分。
本发明的发明人已经惊奇地发现，可以通过利用脂质组合物实现核酸的体内施用的非常有效的递送，所述核酸特别是小核酸诸如RNAi、siRNA和siNA，所述组合物包含至少一种第一脂质组分、至少一种第一辅助脂质和屏蔽化合物。所述屏蔽化合物在体内提供更长的循环时间并且因而便于含有脂质组合物的核酸的更好生物分布。通过该机理，可以在人或动物体内定位部位，所述位点离这种脂质组合物的施用部位相对远，因为所述脂质组合物不立即为围绕注射部位的组织所吸收，当进行静脉内施用时，所述注射部位通常是脉管系统的内皮衬里。如这里所用的屏蔽化合物优选是避免所述脂质组合物与血清化合物或其它身体流体或细胞质膜的化合物直接相互作用的化合物，所述细胞质膜优选所述脂质组合物优选施用到其中的脉管系统的内皮衬里的细胞质膜。所述术语屏蔽也指，免疫系统的要素不立即与所述脂质组合物相互作用，再次增加它在有生命的生物体内的循环时间。只要，所述屏蔽化合物作为抗视蛋白化的化合物起作用。不希望受限于任何机理或理论，看起来所述屏蔽化合物形成减少所述脂质组合物表面积的覆盖或涂层，用于与它的环境相互作用，否则其将同时分别导致所述脂质组合物与其它脂质融合或者被人和动物体的因子结合，其对于这种相互作用是太早的，尽管不得不承认，在后来的阶段，即，在所述脂质组合物的施用上的延长时间之后，这种相互作用通常优选至某一程度以便提供所述递送。看来所述屏蔽化合物的观察功效基于的另一个机理是脂质组合物并且特别是含有核酸的脂质组合物的总电荷的屏蔽，所述核酸优选如这里所限定的功能性核酸并且更优选siRNA、siRNA和RNAi。此外，所述脂质组合物的相互作用看来是受影响的，其中从电荷的屏蔽而不是脂质组分的屏蔽而产生效果。与本公开内容相关，应当承认组合物可以仅仅包含一种脂质。
所述屏蔽化合物优选生物学惰性的化合物。更优选，所述屏蔽化合物在它的表面上或者在像这样的分子上不携带任何电荷。特别优选的屏蔽化合物因而是聚乙二醇、羟乙基葡萄糖基聚合物、聚羟乙基淀粉(polyHES)和聚丙烯，其中所述化合物的任一种优选具有约500至10000Da，更优选约2000至5000Da的分子量。
本发明的重要特征是在体内条件下可以从所述脂质组合物除去所述屏蔽化合物。这样的除去将所述脂质组合物另一个组分或其部分暴露到环境，诸如动物和人体，并最终分别容许包含在所述脂质组合物中的化合物诸如核酸的释放和递送。所述术语体内条件优选是指在动物或人体中，优选在任何身体流体诸如血液、间质和细胞内液体中存在的条件，和/或在核内体和/或溶菌体中存在的那些。取决于所述屏蔽化合物的设计，可以以多种方式影响所述除去，如在下面将更详细地描述。
由于屏蔽剂的损失而产生的另外效果，特别是如果所述屏蔽剂是PEG，应归于下列事实，用PEG提供脂质剂型，也称为加入聚乙二醇，经常导致要通过这样的脂质剂型递送到细胞质中的核酸分子的削弱的功能性递送。PEG在所述脂质剂型的大量存在削弱了一般由脂质剂型形成的脂质体的核内体的摄取或者干扰包含于或与脂质组合物有关的核酸的必要核内体脱离。
在一个实施方案中，所述屏蔽化合物选自包含PEG、HEG、聚羟乙基淀粉(polyHES)和聚丙烯，其结合，优选共价结合到神经酰胺。所述神经酰胺与脂质化合物相互作用并且，如果存在，与辅助脂质相互作用。只要，所述神经酰胺可以是第一辅助脂质或第二辅助脂质。优选缀合到PEG的神经酰胺不同于第一辅助脂质。将神经酰胺包埋到所述脂质组合物的脂质级分中，所述脂质组合物优选由第一脂质组分和第一辅助脂质形成并且将由于相对短的烃链而以某一速率释放。当所述神经酰胺因而从脂质组合物释放时，这就是屏蔽剂。因此，在该实施方案中，体外条件允许脂质剂型的分裂并且因而提供所述脂质组合物的延长的体内寿命或循环时间。
在另外的实施方案中，将屏蔽剂结合到包含在脂质组合物或与其缔合的核酸。优选地，将所述屏蔽剂共价结合到所述核酸，最优选地通过连接体。在更优选实施方案中，设计所述连接体以便它在生理条件下分解，所述生理条件即在动物或人的有机体中占优势的条件。在优选实施方案中，仅某一百分比的核酸通过连接体实际拥有这种聚合物。不希望受限于任何理论，看来充分的是，仅仅某一数量的形成部分脂质组合物的核酸分子不得不具有这样一种巨大部分，以便对于所述脂质组合物提供屏蔽效果。优选地，核酸分子的部分0至20％，更优选3至10％，并且甚至更优选6至10％的范围内。具有屏蔽剂(在这里其也称为屏蔽化合物)的核酸的优选含量是约0至3％，3至6％，6至10％和10至20％，其中如果不相反地表明，在该段落和全部本申请中使用的％是摩尔％。
这种连接体可以单链的RNA连接体，更优选包含1至20核苷酸，其将由在体内条件之中或之下存在的RNA内切核酸酶活性裂解。在进一步的实施方案中，所述连接体由单链DNA连接体形成，所述连接体也由存在于体内条件之中或之下的DNA内切核酸酶裂解。在进一步的实施方案中，所述连接体可以由双链RNA或双链DNA形成。由核酸组成连接体的稳定性典型如下：ssRNA＜dsRNA＜ssDNA＜＜dsDNA。这种稳定性多样性分别便于由此修饰的核酸和所述脂质组合物的残留时间的特定设计，包括这种连接体。
在进一步的实施方案中，可以由寡肽、多肽或蛋白质形成所述连接体，将其用存在于体内条件之中或之下的蛋白酶裂解。还进一步的实施方案提供包含对氧化还原条件敏感的S-S-连接的连接体。
在甚至更进一步的实施方案中，所述连接体是pH敏感的连接体。pH敏感的连接体的概念存在于脂质组合物的内在化的观察中，其原则上可以是脂复合物(lipoplex)或脂质体，当它对所述脂质组合物进行保护时是明显有利的任何屏蔽剂，之后内在化可以对所述化合物的进一步用途施加限制，由此转移到所述细胞中。如这里所用，将所述屏蔽剂结合到pH敏感的连接体，所述连接体是或者包含在优选实施方案的阴离子部分中。在酸性环境诸如核内体中，改变这种阴离子部分的电荷。因为这个，所述pH敏感的连接体与基于静电学包含在脂质剂型中的阳离子脂质的相互作用也是改变的，通常减少，其导致pH敏感的连接体从包含脂质剂型的阳离子脂质或多或少逐渐释放。因此，所述脂质体成为缺乏屏蔽剂并且可以由此在细胞中发挥影响。该种类的连接体包含两种连接体，它们是本领域中像这样已知的以及该种类即具有该种类特征的新的连接体。优选地，这种连接体是具有容许所述连接体如上所述反应的电荷特性的任何连接体。这种pH敏感的连接体的代表包含，但不限于，寡聚(谷氨酸)、低聚酚盐、以及二亚乙基三胺五乙酸。这种连接体偶联到屏蔽剂，以及这种连接体结合到所述屏蔽剂中然后通常称为所述屏蔽剂的一部分，对于本领域技术人员都是已知的。
在根据本发明的脂质组合物中用作第一脂质组分的化合物，其也在这里称为根据本发明的化合物，如图1中所描述，可以将其看作包含由R1-N-R2部分形成的亲脂性基团、由C(O)-CH(NH3+)(CH2)n-NH部分形成连接体基团以及由R3部分形成的头基团。本发明的发明人已经意外地发现在所述连接体基团显示正电荷的该种类化合物特别适合于将生物学活性化合物转移经过细胞膜，并优选进入细胞，更优选动物细胞。同样，本发明的发明人已经意外地发现，如果所述生物学活性化合物是核酸，更优选siRNA和siNA，则由根据本发明的化合物介导的转移将是特别有效的。
如在这里优选使用，所述术语烷基指含有8至20个碳原子，优选12至18个碳原子的饱和脂肪族基团，或者含有8至30个碳原子的、分别含有至少一个双和三键的单-或多不饱和的脂肪族烃基团。因而，在优选实施方案中，所述术语烷基同样包含链烯基和炔基。烷基指支链的和无支链的，即，非直链的或直链的烷基。优选的直链烷基含有8至30个碳原子。更优选的直链烷基含有12至18个碳原子。优选的支链烷基含有8至30个碳原子，其中8至30个碳原子的数量指形成这种支链烷基骨架的碳原子的数量。支链烷基的骨架含有至少一个烷基作为离开所述骨架的分支，所述烷基如在这里所限定，更优选包含短链烷基的烷基，更优选包含1至6，更优选1至3并且最优选1个C原子的烷基。更优选的是骨架中含有12至18个碳原子的烷基，所述直链烷基如上述中所限定。特别优选的烷基是植烷基。
在另一个实施方案中，所述烷基是如上所限定的不饱和支链或无支链的烷基。更优选地，这种不饱和脂肪族烃基团含有1、2或3或4个双键，其中具有一个双键的基团是特别优选的。最优选的是油烯基，其是C18:1Δ9，即，具有18个C原子的脂肪族烃基团，其中在位置9存在一个顺式配置的双键，而不是将第9号C原子连接到第10号C原子的单键。
如这里所用，n是1和4之间的任何整数，其意味着n可以是1、2、3和4。如这里所用，m是1和3之间的任何整数，其意味着m可以是1、2和3。
应当理解根据本发明的化合物优选是阳离子脂质。更优选，存在于根据本发明的化合物中的任何NH或NH2基团是以质子化形式存在的。典型地，根据本发明的化合物的任何正电荷由阴离子的存在而抵消。这种阴离子可以是一价的或多价的阴离子。优选的阴离子是卤化物、乙酸盐和三氟乙酸盐。如这里所用的卤化物优选是氟化物、氯化物、碘化物和溴化物。最优选的是氯化物。在所述阳离子脂质和要转移到细胞中的生物学活性化合物的缔合上，由优选显示一个或数个阴性电荷的生物学活性化合物置换卤化物阴离子，尽管应当理解所述生物学活性化合物的总电荷不必然是阴性的。
应当理解，任何根据式(I)的化合物包含至少两个不对称的C原子。在本发明范围内的是，这样化合物的任何可能的对映异构体公开在这里，即，特别是R-R；S-S；R-S和S-R对映异构体。
根据本发明的化合物可以形成组合物或组合物的一部分，其中这种组合物包含载体。在这里也称为脂质组合物的这种组合物中，根据本发明的化合物也称为脂质组分。这种载体优选是液体载体。优选的液体载体是水载体和非水载体。优选的水载体是水、水缓冲体系，更优选具有生理性缓冲强度和生理性盐浓度的缓冲体系。优选的非水载体是溶剂，优选有机溶剂诸如乙醇和叔丁醇。不希望受限于任何理论，原则上可以使用任何水可溶混的有机溶剂。应当理解，所述组合物更具体而言是脂质组合物因而可以作为脂质体存在或形成脂质体。
根据本发明的组合物可以包含一种或多种辅助脂质，在这里也称为辅助脂质组分。所述辅助脂质组分优选选自包含磷脂和类固醇的组。磷脂优选是磷酸的二酯和单酯。磷脂的优选成分是磷酸甘油酯和鞘脂。类固醇，如这里所用，是基于部分氢化的环戊[a]菲的天然产生的和合成的化合物。优选地，所述类固醇含有21至30个C原子。特别优选的类固醇是胆固醇。
特别优选的辅助脂质是1，2-二植烷酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺(DPhyPE)和1，2-二油酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺(DOPE)。
根据本发明的特别优选的组合物包含与DPhyPE组合的β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化物[#6]、β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸化物[#11]或ε-精氨酰-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸化物[#15]的任一种，其中DPhyPE的含量是约90至20摩尔％，优选80摩尔％、65摩尔％，50摩尔％和35摩尔％，其中所述术语摩尔％是指组合物的总脂质含量的百分比，即，包括根据本发明的阳离子脂质和任何额外脂质的组合物的脂质含量，所述额外脂质包括，但不限于，任何辅助脂质。
在本发明范围之内的是，根据本发明的组合物优选包括根据本发明的化合物和/或一个或数个如这里所公开的辅助脂质，其中或者根据本发明的化合物，即，所述阳离子脂质，和/或所述辅助脂质组分作为水介质中的分散体存在。备选地，根据本发明的化合物，即，所述阳离子脂质，和/或所述辅助脂质组分作为水可溶混的溶剂中的溶液存在。作为水介质，优选使用如这里所公开的任何水载体。优选的水可溶混的溶剂是与水以任何比例形成均质相的任何溶剂。优选的溶剂是乙醇和叔丁醇。应当理解，所述组合物更具体而言是脂质组合物因而可以作为脂质体存在或形成脂质体。
应当理解，在它的多种实施方案中，根据本发明的组合物是并且也可以从而用作药物组合物。在后面的情况中，所述药物组合物包括药物活性化合物并且任选药学上可接受的载体。优选地，这种药学上可接受的载体可以选自与根据本发明的组合物有关的如这里限定的载体的组。本领域技术人员应当理解，如这里所描述的任何组合物，原则上，也用作药物组合物，只要它的成分及其任何组合是药物上可接受的。药物组合物包括药物活性化合物。这种药物活性化合物可以与根据本发明的组合物的另外的组分相同，其优选是任何生物学活性化合物，更优选如这里所公开的任何生物学活性化合物。所述另外的组分、药物活性化合物和/或生物学活性化合物优选选自包含肽、蛋白质、寡核苷酸、多核苷酸和核酸的组。
优选地，任何这种生物学活性化合物是带负电荷的分子。所述术语带负电荷的分子指的是包括具有至少一个负电荷基团的分子，所述基团可以与根据本发明的阳离子脂质的正电荷基团成离子对，虽然本发明发明人不希望存在受限于任何理论。原则上，在连接体部分的正电荷也可以对像这样的脂质的结构或阳离子脂质和带负电荷分子之间形成的任何络合物，即，生物学活性化合物，具有一些影响。除那之外，引入到根据本发明的脂质中的额外正电荷和美国专利6,395,713中公开的阳离子脂质相比，应当有助于增加该脂质的毒性，如由Xu Y，Szoka FC Jr.；Biochemistry；1996May 07，35(18)：5616-23所教导。与本领域技术人员将从现有技术文件预期的相反，根据本发明的化合物特别适于在这里公开的多种目的并且特别是无任何增加的毒性。
在这里优选使用的肽是由至少两个相互共价连接的，优选通过肽键的氨基酸组成的任何聚合物。更优选，由两个至十个氨基酸组成的肽。所述肽的特别优选实施方案是寡肽，其更优选包括约10至约100个氨基酸。在这里优选使用的蛋白质是由多个相互共价连接的氨基酸组成的聚合物。优选这种蛋白质包含约至少100个氨基酸或氨基酸残基。
可以用于与根据本发明的阳离子脂质和组合物连接的优选的蛋白质是任何抗体，优选任何单克隆抗体。
特别优选的生物学活性化合物，即，药物活性化合物和这种用于与根据本发明的组合物连接的另外组分，是核酸。这种核酸可以是DNA、RNA、PNA或其任何混合物。更优选，所述核酸是功能性核酸。如在这里优选使用的功能性核酸是分别对于肽和蛋白质不是核酸编码的核酸。优选的功能性核酸是本领域全部已知的siRNA、siNA、RNAi、反义核酸、核酶、适配子和spiegelmers。
SiRNA是小的干扰RNA，例如，如国际专利申请PCT/EP 03/08666.中所描述。这些分子一般由双链RNA结构组成，所述双链RNA结构包括15至25个之间的，优选18至23个核苷酸对，其是相互碱基配对的，即，相互基本互补的，一般由Watson-Crick碱基配对介导。该双链RNA分子的一条链基本互补于靶核酸，优选是mRNA，而所述双链RNA分子的第二条链基本等同于所述靶核酸的延伸。所述siRNA分子可以分别在各自侧面和各自延伸的侧面，通过许多另外的寡核苷酸，然而，其不必必须是相互碱基配对的。
RNAi具有如siRNA基本相同的设计，然而，与siRNA相比，所述分子显著更长。RNAi分子一般分别包含50或更多个核苷酸和碱基对。
基于如siRNA和RNAi相同作用方式是活性的功能性核酸的另外类别是siNA。例如，在国际专利申请PCT/EP 03/074654中描述了siNA。.更具体而言，siNA对应siRNA，由此所述siNA分子不包含任何核苷酸。
反义核酸，如在这里所优选使用，是基于碱基互补性与靶RNA优选mRNA杂交的寡核苷酸，从而活化RNaseH。RNaseH是通过磷酸二酯和硫代磷酸酯-偶联DNA活化的。然而，磷酸二酯-连接的DNA是通过细胞核酸酶快速降解的，例外是硫代磷酸酯-连接的DNA。反义多核苷酸由此仅作为DNA-RNA杂化配合物是有效的。反义核酸的优选长度在16至23个核苷酸的范围内。连同其它，在美国专利5,849,902和美国专利5,989,912中描述了该种类的反义寡核苷酸的实例。
其它组的功能性核酸是作为催化活性核酸的核酶，优选由基本上包含两个部分的RNA组成。第一部分显示催化活性，而第二部分负责与靶核酸的特定相互作用。在靶核酸和所述核酶部分的相互作用时，所述相互作用一般通过杂交和两个杂交链上碱基的基本互补延伸的Watson-Crick碱基对，催化活性部分可以变成活性的，这意味着，它在所述核酶的催化活性是磷酸二酯活性的情况下，分子内或分子间分裂靶核酸。核酶，其用途和设计原则对于本领域技术人员是已知的并且，例如，描述在Doherty和Doudna(Annu.Ref.Biophys.Biomolstruct.2000；30：457-75)中。
仍然另外组的功能性核酸是适配子。适配子是D-核酸，它是单链的或者双链的，与靶分子特定地相互作用。例如，适配子的制造或选择描述在欧洲专利EP 0 533 838中。与RNAi、siRNA、siNA、反义核苷酸和核酶相反，适配子不降解任何靶mRNA，但是与靶化合物诸如蛋白质的二级和三级结构特定地相互作用。在与靶相互作用时，靶一般显示它的生物活性的改变。适配子的长度一般在少至15个到多达80个核苷酸的范围内，并且优选在约20至约50个核苷酸的范围内。
另一组的功能性核酸是spiegelmers，例如，如国际专利申请WO98/08856中所描述。spiegelmers是类似于适配子的分子。然而，与适配子相反，spiegelmers或者完全或者大部分由L-核苷酸而不是D-核苷酸组成。另外，特别是关于spiegelmers的可能长度，相同的施加至spiegelmers，如关于适配子所概述。
如前所述，本发明的发明人意外发现了根据本发明的化合物，并且包含这种化合物的各自组合物在将RNAi并且更具体而言siRNA和siNA转移到细胞中是特别有效的。应当注意，虽然不希望受限于任何理论，由于包含在根据本发明的脂质组合物中的辅助脂质的特定摩尔百分比，其辅助脂质可以是无PEG的辅助脂质或者特别是含PEG的辅助脂质，可以实现意外的效果，更具体而言如果任何该种类辅助脂质的含量包含在这里说明的浓度范围之内。在与此的联系中，特别值得注意的是，如果根据本发明的组合物含有包含PEG部分的辅助脂质，利用这种含有组合物的PEG-来源的辅助脂质的任何递送或转染作用在递送核酸中是特别有效的，所述核酸优选是RNAi分子，最优选是siRNA、siNA、反义核苷酸和核酶。
为此的原因是，本发明的发明人意外发现了含有超过约4％的含PEG的辅助脂质的脂质体不是活性的，而含有小于4％(优选地小于3％但是超过0％)的脂质体介导功能性递送。基本上，本发明的发明人发现了，根据本发明的脂质组合物中的PEG的特定量适于分别提供有效转染和递送。
在另外的方面中，本发明的发明人意外发现了根据本发明的脂质组合物优选作为脂复合物或脂质体，优选显示总阳离子电荷并且由此至少一种正电荷的过量。更优选，所述脂质组合物显示负：正电荷比例从约1∶1.3至1∶5。因此，本发明由此涉及包含至少一种阳离子脂质和一种核酸的任何脂质组合物的另外方面，优选RNAi、siRNA或siNA或任何在这里限定的功能性核酸，具有负：正电荷比例为约1∶1.3至1∶5。所述阳离子脂质优选是任何描述于此的阳离子脂质。在优选实施方案中，脂质组合物包括描述于此的任何辅助脂质或辅助脂质组合。
本发明的发明人也已经发现，特别是，siRNA和阳离子脂质的摩尔比对于根据本发明的脂质组合物的成功应用可以是至关重要的，特别是考虑到上面关于含有脂质剂型的核酸的阳离子总电荷所说的。不希望受限于任何理论，特别是如这里所公开，看起来1摩尔阳离子脂质可以提供每分子最多三个正电荷，而所述核酸，并且具体而言是如这里所公开的siRNA分子，提供每一分子最多40个负电荷。为了达到含有根据本发明的脂质剂型的siRNA的总正电荷，摩尔比可以从0至最大为0.075的范围内。优选的摩尔比范围是从约0.02至0.05，并且甚至并且甚至更优选的是约0.037的摩尔比范围。
在本发明范围之内的是，组合物并且更具体而言是药物组合物可以包含一个或多个上述生物学活性化合物，其可以包含在根据本发明的组合物中，分别作为药物活性化合物和作为另外的组分。本领域技术人员应当理解，原则上，任何化合物可以用作药物活性化合物。这种药物活性化合物一般是针对靶分子定向的，所述靶分子涉及疾病的病理。由于多种生物学活性化合物以及由此的药物活性化合物之下的一般设计原则和作用方式，如关于本发明的任何方面，实际上可以应用于任何靶。因此，根据本发明的化合物和含有相同的各自组合物可以用于治疗或预防利用该种类的生物学活性化合物可以应用、预防和/或治疗的任何疾病或疾病病症。应当理解，除这些的生物学活性化合物之外，任何其它生物学活性化合物也可以是根据本发明任何实施方案的组合物的一部分。优选这种其它的生物学活性化合物包括至少一个负电荷，优选在这种其它生物学活性化合物与根据本发明的化合物相互作用或配合的条件下，更优选根据本发明的化合物作为阳离子脂质存在。
如这里所用，生物学活性化合物优选是生物学活性的任何化合物，优选在生物系统上显示任何生物学的、化学的和/或物理的效果。这种生物系统优选是任何生物化学反应，任何细胞，优选任何动物细胞，更优选任何脊椎动物细胞并且最优选任何哺乳动物细胞，包括，但不限于，任何人细胞、任何组织、任何器官和任何有机体。任何这种有机体优选选自包含小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、羊、猪、山羊、牛、马、家禽、猴和人。
也在本发明之内的是，根据本发明的任何组合物，更具体而言根据本发明的任何药物组合物，可以包含任何另外的药物活性化合物。
根据本发明的组合物，特别是药物组合物，可以用于多种给药形式，其中特别优选局部给药和全身给药。更优选的是选自包含肌肉内、经皮、皮下、静脉内和肺部给药的组的给药路线。如这里所优选使用，局部给药是指将各自组合物以封闭的空间关系分别施用至要分别施用组合物和生物学活性化合物的细胞、组织和器官。如这里所用，全身给药是指不同于局部给药的给药，并且更优选分别给药到体液诸如血液和液体中，其中所述身体液体将组合物分别输送至要将组合物和生物学活性化合物分别递送到的细胞、组织和器官。
如这里所用，分别借助于根据本发明的化合物和组合物跨细胞膜转移生物学活性化合物的细胞优选是真核细胞，更优选脊椎动物细胞并且甚至更优选哺乳动物细胞。最优选所述细胞是人细胞。
可以利用根据本发明的化合物和组合物制造的任何药剂，分别是用于患者的治疗和预防。优选这种患者是脊椎动物，更优选哺乳动物并且甚至更优选这种哺乳动物选自包含小鼠、大鼠、狗、猫、豚鼠、兔、羊、猪、山羊、牛、马、家禽、猴和人的组。在另外的方面中，根据本发明的化合物和组合物可以用作转移试剂，更优选作为转染试剂。
如这里优选使用，转移试剂是适于转移化合物，更优选生物学活性化合物诸如药物活性化合物穿过膜的任何试剂，所述膜优选是细胞膜并且更优选将这种化合物转移到如上描述于此的细胞中。更优选地，这种转移也包括从任何核内体/脂质体释放。
在还另外的方面中，本发明涉及转移的方法，更具体而言用生物学活性化合物转染细胞。在第一步骤中，其中不必限制步骤的顺序，并且特别是不限于在下文中描述的步骤顺序，分别提供细胞以及膜和细胞。在第二步骤中，提供根据本发明的化合物，还有生物学活性化合物诸如药物活性化合物。该反应可以分别与细胞和膜接触，并且由于根据本发明的化合物和组合物的生物物理学特征，生物学活性化合物将从膜的一个侧面转移至另一个侧面，或者在所述膜形成细胞的情况下，从细胞外部转移至细胞之内。在本发明范围之内的是，在分别接触细胞和膜之前，接触根据本发明的生物学活性化合物和化合物，即，所述阳离子脂质，由此优选形成络合物并且这种络合物分别与细胞和膜接触。
在本发明的另外方面中，分别转移生物学活性化合物和药物活性化合物的方法包括分别提供细胞和膜、提供根据本发明的组合物和分别接触组合物以及细胞和膜的步骤。在本发明范围之内的是，可以在与细胞和膜分别接触之前和过程中形成所述组合物。
在如这里所公开的用于转移生物学活性化合物的任何方法的一个实施方案中，所述方法可以包含更多的步骤，优选检测生物学活性化合物是否已经转移的步骤。这种检测反应强烈取决于根据所述方法传递的生物学活性化合物的种类，并且对于本领域技术人员是显而易见的。在本发明范围之内的是，这种方法在描述于此的任何细胞、组织、器官和有机体上进行。
应当理解，在更多的实施方案中，如这里所描述的，将屏蔽剂结合到根据本发明的脂质组合物的脂质组分，优选结合到所述阳离子脂质。
通过参考可以获得本发明的进一步的特征、实施方案和优点的下列附图和实施例，进一步说明本发明。更具体而言，
图1显示根据本发明的阳离子脂质的基础设计；
图2显示N-油烯基-棕榈基胺的合成，其作为根据本发明的化合物的合成的可能原材料，其中这样的合成是根据如US 6,395,713中描述的现有技术的一种；
图3描述了N-油烯基-棕榈基胺的合成，其作为根据本发明的重要的原材料；
图4-9描述了β-精氨酰-2，3-氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化物、β-精氨酰-2，3-氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸化物和ε-精氨酰-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸化物的合成；
图10描述了备选的阳离子头基团的合成，其作为根据本发明的阳离子脂质合成用的备选组分；
图11描述了β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化物合成的备选合成路线；
图12A和12B分别描述了根据本发明的脂质剂型的大小分布和挤出和高压匀浆的影响；和
图13A和13B描述了Western Blot分析的结果和不同浓度的PEG取代的脂质的影响。
实施例1：根据现有技术的N-油烯基-棕榈基胺的合成
N-油烯基-棕榈基胺是根据本发明的化合物的重要原材料。N-油烯基-棕榈基胺可以原则上如US 6,395,713中所描述而合成。各自的合成方案描述在图2中。然而，原材料是工业级的油烯基酰胺，由例如Fluka提供。通过气相色谱分析该原材料显示纯度≥70％，其中30％的原料由具有不同链长的酰胺组成。对于此的原因可以是像这样的原料是从植物来源获得的。在100至120℃将原材料反应30分钟后，将油烯基胺和1-溴鲸蜡烷的化合(棕榈基溴化物)得到N-油烯基-棕榈基胺。收率约为83％。
实施例2：根据本发明的N-棕榈基-油烯基胺的合成
关于根据本发明的化合物，已经由本发明的发明人认识到一种新的合成(图3)。该新的反应方案基于本发明的发明人的发现，高量的杂质影响着基于该原材料制备的转移试剂的品质。因此，所述反应利用如气相色谱所示的纯度为99％的油酸开始，并与氯甲酸乙酯、TEA和CH2C12反应并且所述反应由此获得与再次具有如气相色谱所示纯度为≥99％的十六胺(棕榈基胺)混合的羧酸-碳酸酐。将反应产物N-棕榈基-油酰酰胺[#1]接着与LiAlH4(在THF中)反应，得到85％的N-棕榈基-油烯基胺[#2]，其作为无色结晶固体出现。
将更详细的反应条件概述在下面。
N-棕榈基-油酰酰胺[#1]的合成
将2.62ml(27.5mmol)氯甲酸乙酯在氩气惰性气体下溶于250ml根据Schlenk的氮气烧瓶中的30ml无水二氯甲烷中并冷却至0℃。将7.93ml(25mmol)油酸和4.16ml(30mmol)三乙胺在40ml无水二氯甲烷中的溶液在控制(steering)下在20分钟内逐滴加入。在冰浴上控制30分钟后，将50ml的CHCl3中的6.64g(27.5mmol)棕榈基胺溶液快速逐滴加入并在室温下将所述混合物控制2小时。随后，将溶液用40ml水各自洗涤三次，将有机相在Na2SO4上干燥并利用旋转蒸发器除去溶剂。将残渣从100ml丙酮再结晶。获得了对应于收率为89％的11.25g(22.3mmol)无色固体。
N-棕榈基-油烯基胺[#2]的合成
在氩气惰性气体下将20ml醚中的1M的LiAlH4提供在250ml的三颈烧瓶中，所述烧瓶具有滴液漏斗和回流冷凝器，并且随后将80ml的THF中的7.59g(15mmol)棕榈基油酰酰胺的溶液在20分钟内逐滴加入。将所述混合物回流2.5小时，然后加入另外的5ml醚中的1M的LiAlH4并回流另外2.5小时。在冰浴冷却下利用6M NaOH分解过量的氢化物并滤去沉淀物。将沉淀物用40ml的热MtBE各自萃取两次，将合并的有机相在Na2SO4上干燥并利用旋转蒸发器除去溶剂。将残渣在-20℃从100ml的MtBE结晶。获得了对应于85％收率的6.23g(12.7mmol)的无色结晶固体。
实施例3：Boc-Dap(Fmoc)-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺[#3]的合成
将10ml无水二氯甲烷中的521mg(1.06mmol)的N-油烯基-棕榈基胺溶解在50ml圆底烧瓶中并加入289mg(1.17mmol)EEDQ。随后，在控制下加入500mg(1.17mmol)Boc-Dap(Fmoc)-OH并将混合物在室温下控制20小时。将所述溶液用80ml二氯甲烷转移到分离漏斗中并用20ml的0.1N HCl各自洗涤三次并用20ml饱和NaHCO3溶液洗涤一次。在Na2SO4上干燥以后，利用旋转蒸发器除去溶剂(图4)。获得淡黄色的粘性油，将其进一步纯化。在薄层色谱中利用1∶1的己烷/乙酸乙酯，观察到Rf为0.70。
实施例4：Boc-Dap-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺[#4]的合成
将1g的Boc-Dap(Fmoc)-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺粗产物溶解在50ml圆底烧瓶中的8ml无水二氯甲烷中。加入3ml二乙胺并在室温控制(图4)。所述反应的薄层色谱对照显示，在4.5小时后，出发产物的反应完成。通过旋转蒸发器除去易挥发组分，并利用40g硅胶60(Merck)利用5∶1的己烷/乙酸乙酯色谱纯化残渣。利用阶段梯度洗脱所述产物，所述阶段梯度由乙酸乙酯、4∶1的乙酸乙酯/甲醇和4∶1二氯甲烷/甲醇组成。获得作为黄色粘性油的576mg(0.85mmol)Boc-Dap-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺。
实施例5：四-Boc-[β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺][#5] 的合成
将576mg(0.85mmol)Boc-Dap-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺溶解在100ml圆底烧瓶中的10ml无水二氯甲烷中，并在控制下加入210mg(0.85mmol)EEDQ和403mg(0.85mmol)Boc-Arg(Boc)2-OH(图5)。将所述混合物在室温下在氩气气氛下控制20小时。接着，通过旋转蒸发器除去二氯甲烷并将100ml MtBE中的残渣转移到分离漏斗中。将有机相用0.1NHCl、1N NaOH和饱和NaHCO3溶液彻底洗涤，在Na2SO4上干燥并通过旋转蒸发器除去溶剂。随后将粗产物用快速色谱(Combiflash Retrieve；IscoInc.)纯化，利用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液。获得694mg(0.61mmol)对应于收率为72％的无色粘性油。
实施例6：β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化物 [#6]的合成
在氩气气氛下将694mg(0.61mmol)充分干燥的四-Boc-[β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺]提供在25ml根据Schlenk的氮气烧瓶中并加入8ml二噁烷中的4N HCl(图5)。将所述混合物在氩气惰性气体下在室温控制24小时，其中在约6至8小时后，作为无定形并部分作为蜡状固体的产物从溶液沉淀出。在反应(利用65∶25∶4的CHCl3/MeOH/NH4OH的薄层对照)完成后，在高真空下除去任何易挥发组分。获得了作为三盐酸化物的489mg(0.58mmol)β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺。
实施例7：N-月桂基-肉豆蔻基酰胺[#7]的合成
将18.54g(100mmol)十二烷基胺(月桂胺)、6.36g(60mmol)Na2CO3和50mg四丁基碘化铵(TBAI)悬浮在500ml具有回流冷凝器和滴液漏斗的3-颈烧瓶中的100ml无水DMF中。在100℃经过110分钟，逐滴加入100ml无水二噁烷中的16.4ml(60mmol)1-溴十四烷溶液并将混合物在100℃胶棒另外3.5小时(图6)。将溶液在尽可能高的温度过滤。在4℃过夜沉淀，除去结晶的固体并用少量的冷甲醇洗涤。接着，将所述固体从200ml甲醇再结晶。获得了从100ml MtBE再结晶的9g无色叶状晶体。将在-18℃沉淀的晶体从冷却的玻璃料吸干，并用冷MtBE洗涤。获得7.94g(21mmol)无色的结晶固体，对应于收率为35％。
实施例8：Boc-Dap(Fmoc)-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺[#8]的合成
将715mg(1.68mmol)Boc-Dap(Fmoc)-OH溶解在50ml圆底烧瓶中的15ml无水二氯甲烷中并加入420mg(1.7mmol)EEDQ。将混合物在室温控制45分钟并随后在60分钟内缓慢逐滴加入25ml无水二氯甲烷中的641mg(1.68mmol)N-月桂基-肉豆蔻基胺的溶液(图6)。在20小时的反应时间后，用旋转蒸发器除去溶剂并用100ml MtBE将残渣转移到分离漏斗中。将所述溶液用0.1N HCl和饱和NaHCO3溶液充分洗涤，经过Na2SO4干燥有机相并用旋转蒸发器除去溶剂。利用己烷/乙酸乙酯作为溶剂通过快速色谱(Combiflash Retrieve；Isco Inc.)纯化，获得1.02g粗产物。获得了作为无色的、非常粘的油的607mg纯产物。利用1∶1的己烷/乙酸乙酯的薄层色谱提供Rf为0.58。
实施例9：Boc-Dap-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺[#9]的合成
将607mg Boc-Dap(Fmoc)-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺溶解在50ml圆底烧瓶中的8ml无水二氯甲烷中(图6)。加入3ml二乙胺并在室温将所述反应控制4.5小时。利用旋转蒸发器除去易挥发组分，并用色谱利用40g硅胶60(Merck)用5∶1的己烷/乙酸乙酯纯化残渣。用阶段梯度洗脱产物，所述阶段梯度由乙酸乙酯、二氯甲烷和3∶1的二氯甲烷/甲醇组成。获得了作为浅黄色的粘性油的372mg(0.655mmol)Boc-Dap-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺。
实施例10：四-Boc-[β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺] [#10]的合成
将372mg(0.655mmol)Boc-Dap-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺溶解在50ml圆底烧瓶中的8ml无水二氯甲烷中并在控制下加入162mg(0.655mmol)EEDQ和311mg(0.655mmol)Boc-Arg-(Boc)2-OH(图7)。将混合物在室温控制20小时。随后，利用旋转蒸发器除去二氯甲烷并用80ml MtBE将残渣转移到分离漏斗中。将有机相用0.1N HCl、1N NaOH和饱和NaHCO3溶液充分洗涤，经过Na2SO4干燥并用旋转蒸发器除去溶剂。利用己烷/乙酸乙酯的阶段梯度通过快速色谱(Combiflash Retrieve；Isco Inc.)纯化粗产物。获得了500mg(0.5mmol)无色粘性油，对应于收率为76％。
实施例11：β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺三盐酸化 物[#11]的合成
将511mg(0.5mmol)充分干燥的四-Boc-[β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺]在氩气下提供在25ml根据Schlenk的氩气烧瓶中并加入二噁烷中的10ml 4N HCl(图7)。将所述混合物在室温在氩气惰性气体下控制24小时，其中在6至8小时后，产物作为部分无定形的、部分蜡状的固体从溶液沉淀。在反应完成(利用65∶25∶4的CHCl3/MeOH/NH4OH的薄层色谱对照)时，在高真空下除去全部挥发性组分。获得了323mg(0.5mmol)三盐酸化物形式的β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺。
实施例12：Boc-Lys(Fmoc)-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺[#12]的合成
将937mg(2mmol)Boc-Lys(Fmoc)-OH溶解在50ml圆底烧瓶中的10ml无水二氯甲烷中并加入495mg(2mmol)EEDQ(图8)。将混合物在室温控制60分钟并随后在120分钟内以逐滴方式缓慢加入30ml无水二氯甲烷中的764mg(2mmol)N-月桂基-肉豆蔻基胺的溶液。在20小时的反应时间后，用旋转蒸发器除去溶剂并用100ml MtBE将残渣转移到分离漏斗中。将所述溶液用0.1N HCl和饱和NaHCO3溶液充分洗涤，经过Na2SO4干燥有机相并用旋转蒸发器除去溶剂。利用快速色谱(Combiflash Retrieve；IscoInc.)用4∶1的己烷/乙酸乙酯作为溶剂纯化，获得1.757g粗产物。获得了作为无色的、非常粘的油的1.377g纯产物。利用1∶1的己烷/乙酸乙酯的薄层色谱提供Rf为0.57。
实施例13：Boc-Lys-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺[#13]的合成
将1.377g Boc-Lys(Fmoc)-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺溶解在50ml圆底烧瓶中的16ml无水二氯甲烷中。加入6ml二乙胺并在室温将所述混合物控制5小时(图8)。利用旋转蒸发器除去挥发性组分并用色谱利用40g硅胶60(Merck)用5∶1的己烷/乙酸乙酯纯化所述残渣。利用阶段梯度洗脱所述产物，所述阶段梯度由乙酸乙酯、二氯甲烷和3∶1的二氯甲烷/甲醇组成。获得作为浅黄色粘性油的556mg(0.911mmol)Boc-Lys-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺还有119mg混合的级分。
实施例14：四-Boc-[ε-精氨酰-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺][#14]的 合成
将556mg(0.911mmol)Boc-Lys-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺溶解在40ml无水二氯甲烷中并在控制下加入226mg(0.911mmol)EEDQ和433mg(0.911mmol)Boc-Arg(Boc)2-OH(图9)。将所述混合物在室温控制20小时。随后，利用旋转蒸发器除去二氯甲烷，并用80ml MtBE将残渣转移到分离漏斗中。用0.1N HCl和饱和NaHCO3溶液充分洗涤有机相，经过Na2SO4干燥并利用旋转蒸发器除去溶剂。随后将粗产物用快速色谱(CombiflashRetrieve；Isco Inc.)利用乙烷/乙酸乙酯阶段梯度纯化。以对应于75％的730mg(0.684mmol)的收率获得了无色粘性油。
实施例15：ε-精氨酰-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺三盐酸化物[#15] 的合成
将730mg(0.684mmol)充分干燥的四-Boc-[ε-精氨酰-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺]在氩气下提供在25ml根据Schlenk的氩气烧瓶中并加入二噁烷中的10ml 4N HCl(图9)。将混合物在氩气惰性气体下在室温控制24小时，在其上，在约8小时后，产物从溶液作为无定形的部分蜡状的固体从所述溶液沉淀。在例如由利用65∶25∶4的CHCl3/MeOH/NH4OH薄层色谱控制的反应完成时，在高真空下除去全部易挥发组分。获得491mg(0.633mmol)作为三盐酸化物的ε-精氨酰-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基酰胺。
实施例16：三-Boc-γ-脲基-α，γ-二氨基丁酸[#16]的合成
将1.31g(6mmol)Boc-Dab-OH提供在100ml圆底烧瓶中的15ml乙腈中并加入12mmol二异丙基乙基胺(DIPEA)(图10)。随后逐滴加入水直到一部分Boc-Dab-OH溶解并随后加入1.96g(5mmol)1，3-二-Boc-2-(三氟甲磺酰)胍。将混合物在室温控制12小时，在其上，利用旋转蒸发器除去乙腈。用5ml水稀释水残渣并加入50ml二氯甲烷。通过在控制下加入2N HCl将反应酸化至pH2并随后是有机相的分离。将水相用50ml二氯甲烷萃取并随后将合并的有机相用一些稀释的HCl和饱和NaCl溶液洗涤。经过Na2SO4干燥有机相并利用旋转蒸发器除去溶剂。利用色谱在硅胶60上利用2∶1的己烷/乙酸乙酯纯化所述残渣。获得对应于50％收率的1.138g(2.47mmol)无色无定形固体。
实施例17：β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-M-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化 物[##6]的合成
将15ml完全CH2Cl2中的1.225g(6mmole)BOC-Dap-OH在氩气气氛下悬浮在250ml的包含漏斗的Schlenk烧瓶中并加入1.72ml三甲胺。在剧烈搅拌下，在室温在15至20分钟内逐滴加入30ml完全CH2Cl2中的1.52ml(12mmole)TMSCI溶液。同时，将941mg(5.8mmole)羰基二咪唑在氩气气氛下溶解在100ml Schlenk烧瓶中的8ml完全CH2Cl2中。在室温并在搅拌下在15至20分钟内逐滴加入25ml完全CH2Cl2中的2.66g(5.6mmole)Boc-Arg(Boc)2-OH溶液。在室温将两种反应溶液搅拌4h。随后，在氩气气氛下在室温将832μl(6mmole)三乙胺加入到第一溶液并将第二溶液在15至20分钟内通过滴液漏斗逐滴加入。在15至20分钟后，加入30ml水，剧烈搅拌45分钟并将溶液调节到pH为2。分离有机相并用CH2Cl2萃取数次。将合并的有机相用NaCl和硫酸钠的饱和溶液干燥并利用旋转蒸发器除去溶剂。利用快速色谱在硅胶上利用二氯甲烷作为洗脱液纯化玻璃状的残渣。获得2.74g(4.15mmole；74％)无色的无定形固体[化合物17]。
将该固体与油烯基棕榈基胺[#2]在基本类似于实施例10的条件下反应，其中将温度设定成35至40℃(收率72％)。在如实施例11中所述裂开Boc保护基时，获得了预定的终产物β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化物[#6]。由此获得的产物可以利用快速色谱在RP-18硅胶上利用MeOH/水作为洗脱液进一步纯化。
实施例18：由阳离子脂质体和siRNA(脂复合物)组成的复合物的制造
利用本领域已知的标准技术制造由阳离子脂质体和siRNA组成的脂复合物，诸如脂质膜/饼、乙醇注入程序、反相蒸发和洗涤剂透析程序[参考Liposomes as Tools in Basic Research and Industry；Jean R.Philippot andFrancis Schuber；CRC Press January 1995和Liposome Technology：Preparation of Liposomes：001 Gregory Gregoriadis CRC Press I Llc.April1984]。
由此获得的脂质体，在这里也称为脂复合物，包含作为脂质的β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化物和另外的或者1，2-二植烷酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺或1，2-二油烯基-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺，其中优选使用1，2-二植烷酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺。这种脂质体和脂复合体的脂质级分分别是50摩尔％β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化物和或者50摩尔％的1，2-二植烷酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺或50摩尔％的1，2-二油烯基-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺。
50摩尔％的β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化物和50摩尔％的1，2-二植烷酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺的化合在这里也称为atuFect。
应当理解，原则上，在这里公开的任何其它脂质和脂质组合物可以利用上述技术还有进一步的加工步骤制造。
将脂质体和脂复合物分别进行进一步的加工步骤，以便将它们根据大小、多分散性和层的设计而调整。这些特征可以用声处理、例如通过多孔膜的挤出、和匀浆来调整，优选高压匀浆。
将由此形成的脂质体用具有Beckman-Coulter N 5亚微米粒子分析仪的光子关联能谱法表征，并且将或者由挤出或者由高压匀浆定尺寸的这种脂质体分别描述在图12A和12B中。
从图12A可以得到，可以利用具有不同尺寸排阻的不同膜修饰脂质体的大小分布，在本情况中分别是1,000nm和400nm。在两种情况中，将挤出步骤重复21次。然而，在本发明之内的是，所述尺寸排阻可以从约50至5000nm，并且可以将挤出步骤重复10至50次。
可以从图12B得到，高压匀浆也是适合的方法，以修饰脂质体的大小分布，其中在应用这样的高压匀浆时，脂质体的大小取决于所述脂质体进行匀浆周期的数目。典型的压力是在100-2500巴的范围内，其中在本情况中，施加的压力是1,500巴。
实施例19：脂质组合物和PEG含量
为了测试PEG对转染功效的影响和脂质组合物的递送，根据这里公开的方法产生了下列剂型，所述脂质组合物分别包含β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈基-N-油烯基-酰胺三盐酸化物(阳离子脂质)作为第一脂质组分，1，2-二植烷酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺(DPhyPE)作为第一辅助脂质和缀合到PEG2000(C8mPEG2000)和PEG5000(C8mPEG5000)的神经酰胺：
A1-A5剂型：
  阳离子脂质[摩尔％]   DPhyPE[摩尔％]   C8mPEG2000[摩尔％]
  A1   50摩尔％   49   1
  A2   50摩尔％   47.5   2.5
  A3   50摩尔％   45.0   5.0
  A4   50摩尔％   42.5   7.5
  A5   50摩尔％   40.0   10
B1-B5剂型
  Cationic lipid[摩尔％]   DPhyPE[摩尔％]   C8mPEG2000[摩尔％]
  B1   49   50摩尔％   1
  B2   47.5   50摩尔％   2.5
  B3   45.0   50摩尔％   5.0
  B4   42.5   50摩尔％   7.5
  B5   40   50摩尔％   10.0
对于任何上述剂型，脂质浓度是1.445mg/ml，siRNA浓度是300mM蔗糖中的15μM。浓缩的所形成的储存复合物的稀释在细胞培养基中产生20、10、5nM的siRNA终浓度。
将包含在所述剂型中的RNAi分子针对PTEN定向并且序列如下：具有下列序列的第一链：u
Figure G2005845081620070629D000291
a
Figure G2005845081620070629D000292
u
Figure G2005845081620070629D000293
c
Figure G2005845081620070629D000294
a
Figure G2005845081620070629D000295
c
Figure G2005845081620070629D000296
gg
Figure G2005845081620070629D000298
u
Figure G2005845081620070629D000299
g-P；具有序列c
Figure G2005845081620070629D0002910
a
Figure G2005845081620070629D0002911
c
Figure G2005845081620070629D0002912
c
Figure G2005845081620070629D0002913
g
Figure G2005845081620070629D0002914
u
Figure G2005845081620070629D0002915
g
Figure G2005845081620070629D0002916
a
Figure G2005845081620070629D0002917
u
Figure G2005845081620070629D0002918
a-P的第二链，其中修改型式是，粗体印刷的核苷酸是2’-对-甲基核苷酸；在任何链，3’末端以磷酸盐或酯开始，如上述序列中由P所描述。
将脂质剂型施用到包含在各自含有40,000细胞/孔的6孔板的HeLa细胞。对于细胞分析PTEN的表达并且所述结果描述在图13中作为WesternBlots。将p110a表达用作加载对照并用抗体检测。从描述在图13A和13B中的任何Western Blots可以得到，PEG化合物即屏蔽化合物的含量可以增加达到5和7.5mol％，其中在PEG2000相比于使用的PEG5000的情况下，浓度可以更高或者可以在该范围的更高端。
与含有组合物的那些PEG相比，在那里PEG不可从脂质组合物除去，这是一个清楚的优点。在1至5摩尔％的范围中包含1，2-二硬脂酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000)而不是神经酰胺PEG缀合物的类似组合物的脂质剂型仅可以引入1至2摩尔％，以便提供有效的击倒(knockdown)。
在说明书、权利要求和/或附图中公开的本发明的特征可以单独地并且以其任何组合的方式作为以其多种形式方式实现本发明的材料。
Figure IYZ000001940723600011

Claims (65)

1.一种脂质组合物，所述脂质组合物包含
至少一种第一脂质组分，
至少一种第一辅助脂质，和
一种在体内条件下可以从所述脂质组合物除去的屏蔽化合物，其中所述第一脂质组分是根据式(I)的化合物，
Figure FDA00002389639500011
其中R1和R2各自并独立选自包含烷基和含有8至30个碳原子的链烯基的组；
n是1和4之间的任何整数；
R3是选自包含赖氨酰、鸟氨酰、2，4-二氨基丁酰、组氨酰和根据式(II)的酰基部分的组的酰基，
其中m是1至3的任何整数，其中在式(II)中的NH3 +任选是不存在的，和
Y-是药物上可接受的阴离子，
其中所述屏蔽化合物是PEG，并且其中所述屏蔽化合物结合到神经酰胺，其中所述神经酰胺包含至少一个6至10个碳原子的短碳链取代基。
2.根据权利要求1的脂质组合物，其中所述神经酰胺共价结合到所述屏蔽化合物。
3.根据权利要求2的脂质组合物，其中所述屏蔽化合物是PEG2000或PEG5000。
4.根据权利要求1的脂质组合物，其中所述组合物包含另外的组分和/或第二辅助脂质，其中所述另外的组分选自包含肽和核酸的组。
5.根据权利要求1的脂质组合物，其中所述组合物包含另外的组分和/或第二辅助脂质，其中所述另外的组分选自包含蛋白质、寡核苷酸和多核苷酸的组。
6.根据权利要求4的脂质组合物，其中所述脂质组合物包含核酸作为另外的组分。
7.根据权利要求6的脂质组合物，其中所述核酸选自包含RNAi、siRNA、siNA、反义核酸、核酶、适配子和spiegelmers的组，其中所述RNAi具有如siRNA相同的设计并且包含50或更多个核苷酸或碱基对。
8.根据权利要求1的脂质组合物，其中所述神经酰胺包含8个碳原子。
9.根据权利要求4的脂质组合物，其中所述神经酰胺是所述第一辅助脂质。
10.根据权利要求4的脂质组合物，其中所述神经酰胺是所述第二辅助脂质。
11.根据权利要求1的脂质组合物，其中R1和R2各自并独立选自包含月桂基、肉豆蔻基、棕榈酰和油烯基的组。
12.根据权利要求1的脂质组合物，其中R1是月桂基并且R2是肉豆蔻基；或R1是棕榈酰并且R2是油烯基。
13.根据权利要求1的脂质组合物，其中m是1或2。
14.根据权利要求1的脂质组合物，其中所述化合物是阳离子脂质。
15.根据权利要求14的脂质组合物，其中所述化合物与阴离子Y-缔合。
16.根据权利要求1的脂质组合物，其中Y-选自包含卤化物、乙酸盐和三氟乙酸盐的组。
17.根据权利要求1的脂质组合物，其中所述根据式(I)的化合物选自包含下列化合物的组：
-β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈酰-N-油烯基-酰胺三盐酸化物
-β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸化物
和
-ε-精氨酰-赖氨酸-N-月桂基-N-肉豆蔻基-酰胺三盐酸化物
Figure FDA00002389639500033
18.根据权利要求1的脂质组合物，其中所述组合物包括载体。
19.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1的组合物和药物活性化合物。
20.药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求4的组合物和药物活性化合物。
21.根据权利要求19和20任一项的药物组合物，其中所述药物组合物包含药学上可接受的载体。
22.根据权利要求20的组合物，其中所述药物活性化合物和/或所述另外的组分选自包含肽和核酸的组。
23.根据权利要求20的组合物，其中所述药物活性化合物和/或所述另外的组分选自包含蛋白质、寡核苷酸和多核苷酸的组。
24.根据权利要求23的组合物，其中所述蛋白质是抗体。
25.根据权利要求23的组合物，其中所述蛋白质是单克隆抗体。
26.根据权利要求22的组合物，其中所述核酸选自包含DNA、RNA、PNA和LNA的组。
27.根据权利要求22的组合物，其中所述核酸是功能性核酸，所述功能性核酸选自包含RNAi、siRNA、siNA、反义核酸、核酶、适配子和spiegelmers的组。
28.根据权利要求4的组合物，其中所述第一辅助脂质和/或第二辅助脂质选自包含磷脂和类固醇的组。
29.根据权利要求28的组合物，其中第一和/或第二辅助脂质选自包含1，2-二植烷酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺和1，2-二油烯基-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺的组。
30.根据权利要求28的组合物，其中第一和/或第二辅助脂质的含量是所述组合物总脂质含量的20摩尔％至80摩尔％。
31.根据权利要求30的组合物，其中第一和/或第二辅助脂质的含量是35摩尔％至65摩尔％。
32.根据权利要求29的组合物，其中所述第一脂质组分是β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈酰-N-油烯基-酰胺三盐酸化物，并且所述第一和/或第二辅助脂质是1，2-二植烷酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺。
33.根据权利要求32的组合物，其中所述第一脂质组分是所述组合物总脂质含量的50摩尔％并且所述第一和/或第二辅助脂质是所述组合物总脂质含量的50摩尔％。
34.根据权利要求4的组合物，其中所述第一和/或第二辅助脂质包括选自包含PEG部分、HEG部分、聚羟乙基淀粉(polyHES)部分和聚丙烯部分的基团。
35.根据权利要求34的组合物，其中这种部分提供约500至10000Da的分子量。
36.根据权利要求34的组合物，其中这种部分提供约2000至5000Da的分子量。
37.根据权利要求34的组合物，其中包含PEG部分的辅助脂质选自包含1，2-二硬脂酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺和1，2-二烷基-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺的组。
38.根据权利要求37的组合物，其中所述辅助脂质的PEG部分具有2,000至5,000Da的分子量。
39.根据权利要求38的组合物，其中所述组合物包括β-精氨酰-2，3-二氨基丙酸-N-棕榈酰-N-油烯基-酰胺三盐酸化物作为所述脂质组分，1，2-二植烷酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺作为第一辅助脂质和1，2-二硬脂酰-sn-丙三氧基-3-二氧磷基乙醇胺-PEG 2000作为第二辅助脂质。
40.根据权利要求38的组合物，其中第二辅助脂质的含量是约0.05摩尔％至4.9摩尔％。
41.根据权利要求40的组合物，其中第二辅助脂质的含量是约1至2摩尔％。
42.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物含有约1至10摩尔％的PEG和神经酰胺的缀合物。
43.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物含有1至7.5摩尔％的PEG和神经酰胺的缀合物。
44.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物含有1至5摩尔％的PEG和神经酰胺的缀合物。
45.根据权利要求42的组合物，其中所述神经酰胺是C8并且PEG是PEG 2000并且其中PEG和神经酰胺的缀合物的含量是约1至7.5摩尔％。
46.根据权利要求42的组合物，其中所述神经酰胺是C8并且PEG是PEG 5000并且其中PEG和神经酰胺的缀合物的含量是约1至5摩尔％。
47.根据权利要求1的组合物，其中所述第一脂质组分的含量是约42.5摩尔％至50摩尔％，所述第一辅助脂质的含量是约42.5至50摩尔％，其中所述第一脂质组分的、所述第一辅助脂质和PEG和神经酰胺的缀合物的含量总和是100摩尔％。
48.根据权利要求27的组合物，其中所述功能性核酸是双链核糖核酸。
49.根据权利要求20的组合物，其中所述组合物还包括核酸，其中所述核酸选自包含RNAi、siRNA、siNA、反义核酸和核酶的组。
50.根据权利要求14的组合物，其中所述组合物还包括核酸，其中所述核酸是RNAi，其中RNAi对阳离子脂质的摩尔比是约0至0.075。
51.根据权利要求14的组合物，其中所述组合物还包括核酸，其中所述核酸是RNAi，其中RNAi对阳离子脂质的摩尔比是约0.02至0.05。
52.根据权利要求14的组合物，其中所述组合物还包括核酸，其中所述核酸是RNAi，其中RNAi对阳离子脂质的摩尔比是约0.02至0.037。
53.根据权利要求1和4任一项的组合物，其中第一脂质组分和/或至少一种辅助脂质和/或屏蔽化合物是作为水介质中的分散体存在。
54.根据权利要求1和4任一项的组合物，其中第一脂质组分和/或至少一种辅助脂质和/或所述屏蔽化合物作为水可溶混的溶剂中的溶液存在。
55.根据权利要求54的组合物，其中所述溶剂选自包含乙醇和叔丁醇的组。
56.根据权利要求1至55任一项的组合物用于药剂的制造的用途。
57.根据权利要求1至55任一项的组合物用于制备转移试剂的用途。
58.根据权利要求57的用途，其中所述转移试剂将药物活性组分和/或另外的组分转移到细胞中。
59.根据权利要求58的用途，其中所述细胞是哺乳动物细胞或人细胞。
60.根据权利要求1至55任一项的组合物在制备用于将药物活性化合物和/或另外组分转移进入提供的细胞或穿过提供的膜的试剂中的应用，其中所述组合物包括药物活性化合物和/或另外的组分；并且根据权利要求1至55任一项的组合物用于与所述细胞或所述膜接触。
61.根据权利要求60的应用，其中所述药物活性化合物和/或另外的组分能够在所述细胞中和/或所述膜上被检测。
62.用于将药物活性化合物和/或另外组分转移进入细胞或穿过膜的体外方法，所述方法包含下列步骤：
-提供所述细胞或所述膜；
-提供根据权利要求1至55任一项的组合物，其中所述组合物包括药物活性化合物和/或另外的组分；和
-将所述细胞或所述膜与根据权利要求1至55任一项的组合物接触。
63.根据权利要求62的方法，其中所述膜为细胞膜。
64.根据权利要求62的方法，其中所述方法包括另外的步骤：
在所述细胞中和/或所述膜上检测所述药物活性化合物和/或另外的组分。
65.一种脂复合物，所述脂复合物包含根据权利要求1至55任一项的脂质组合物；和siRNA。
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