CN117729934A - 用于疫苗递送的非病毒dna载体 - Google Patents

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Abstract

本申请描述了包含可用于在细胞、组织或受试者中表达抗原和免疫原性肽的ceDNA载体的方法和组合物，以及治疗和/或预防各种感染性疾病、自身免疫病症和癌症的方法。

Description

用于疫苗递送的非病毒DNA载体
相关申请
本申请要求2021年5月7日提交的美国临时申请第63/185,823号的优先权。前述申请的全部内容明确地以引用方式并入本文。
技术领域
本公开整体涉及针对病原生物体和癌症的免疫原的疫苗。更具体地，本公开涉及用于在受试者或细胞中表达抗原或抗原蛋白的非病毒载体。本公开还涉及包含核酸的核酸构建体、启动子、载体和宿主细胞，以及将编码抗原或抗原蛋白的转基因递送至靶细胞、组织、器官或生物体的方法。
背景技术
现有和新出现的传染性病原体在世界范围内持续引起显著的发病率、死亡率和经济负担。大部分死亡仅由几种病原体引起：在大约1400种公认的人类病原体和寄生虫中，大部分死亡由呼吸疾病、腹泻、HIV/AIDS、TB、疟疾、脑膜炎、百日咳、麻疹、乙型肝炎和性传播疾病(STD)引起(Dye C.After 2015：Infectious diseases in a new era of health anddevelopment.(2014)Philosophical Transactions of the Royal Society ofLondon.Series B,Biological Sciences,369(1645),20130426.doi：10.1098/rstb.2013.0426)。某些疾病被认为是特别重要的，例如，因为它们在出现时具有100％的致死率，例如HIV/AIDS；或者因为传染性病毒病原体导致的疾病超出了主要感染者的范围，例如由寨卡病毒感染引起的出生缺陷的出现。
用于对抗病原体的治疗产品包括预防性免疫，诸如疫苗，以及感染后治疗剂，诸如抗细菌剂和抗病毒剂。疫苗是由致病性微生物病原体或微生物体或病毒体的一种或几种特异性抗原组成的治疗剂，其整个抗原组诱导接受个体的免疫应答和/或病原体自身的细胞应答(Cassone,A.,&Rappuoli,R.(2010).Universal vaccines:shifting to one formany.Bio.1(1),e00042-10.doi:10.1128/mBio.00042-10)。疫苗通过诱导能够快速控制复制病原体或灭活其毒性组分的效应机制来进行保护。
虽然疫苗接种提供了一种经济有效的措施来预防疾病和控制群体水平的感染爆发，但是目前市场上的疫苗具有显著的缺点并且有时会失效。
重组AAV(rAAV)可能是人类基因转移研究最好的载体，数百项临床试验证明转导的安全性。腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科(Parvoviridae family)，并且更具体地说，构成依赖病毒属(Dependoparvovirus genus)。来源于AAV的载体(即，rAVV或AAV载体)对于递送遗传物质是有吸引力的，因为(i)它们能够感染(转导)各种各样的非分裂和分裂细胞类型，包括肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，因此减少宿主细胞对病毒感染的应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒在人类中被认为是非病理性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中的野生型AAV不同，复制缺陷型AAV载体缺乏复制(rep)基因并且通常持续作为附加体，因此限制了插入诱变或基因毒性的风险；并且(v)与其他载体系统相比，AAV载体通常被认为是相对较差的免疫原，因此不会触发显著的免疫应答(参见(ii))，从而获得载体DNA的持久性和治疗性转基因的潜在长期表达。
然而，使用AAV粒子作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关联的一个主要缺点是其病毒包装容量有限，为约4.5kb的异源DNA(Dong等人,1996；Athanasopoulos等人,2004；Lai等人,2010)，因此，AAV载体的用途被限制在小于150,000Da的蛋白质编码容量。特别是与抗体递送有关，AAV的包装限制对形成天然抗体结构的重链和轻链的有效递送提出了重大挑战。第二个缺点是，由于人群中野生型AAV感染盛行，所以必须筛查rAAV基因疗法候选者中从患者消除所述载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳免疫原性有关，该免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的该载体作出反应，以刺激免疫系统生成高滴度的抗AAV抗体，从而杜绝了进一步治疗。预先存在的免疫可能严重限制转导的效率。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAV DNA转化为双链DNA，所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。
已经充分研究了表达未知抗原蛋白的腺病毒载体用于基因和癌症治疗和疫苗。除了广泛的安全性之外，利用腺病毒载体的优点是相对稳定、易于获得高滴度并且能够感染多种细胞系，这归因于其效力。尽管重组腺病毒载体由于其高转导效率和转基因表达而在如今被广泛使用，但是存在针对该载体的预先存在的免疫性的可能性，因为大多数群体已经暴露于腺病毒(Id)。这已经在人免疫缺陷病毒(HIV-1)IIb期疫苗试验中被证明是有害的，在该试验中基于载体的疫苗为HIV-1复制提供了有利的条件(Smaill,F.等人，Sci.Transl.Med.(2013)5:205)。
因此，本领域仍然需要开发改进的疫苗治疗剂。
发明内容
本文所述的技术涉及具有共价封闭端的无衣壳(例如，非病毒)DNA载体(本文称为“封闭端DNA载体”或“ceDNA载体”)，其中ceDNA载体包含编码抗原或免疫原性肽的核酸序列。将表达编码一种或多种抗原或免疫原性肽的一个或多个核酸序列的一种或多种ceDNA载体应用于受试者可用于：治疗、预防或降低受试者的疾病或病症的严重程度，在递送中是微创的，是可重复的和剂量有效的，具有治疗效果的快速起效，和/或导致抗原或免疫原性肽的持续表达。
与离体制造并且可能触发不期望的细胞应答的传统疫苗不同，本文所述的ceDNA疫苗以更天然的方式呈递给细胞系统。通过使用ceDNA载体将编码抗原或免疫原性肽的转基因(例如，核酸序列)递送至细胞或组织，避开了适应性免疫应答，并且在不使用免疫或被动转移的情况下产生了期望的抗体特异性。即，ceDNA载体通过内吞作用进入细胞，然后从内涵体区室逃逸并转运到细胞核。具有转录活性的ceDNA附加体导致抗原的表达，然后该抗原可以从细胞分泌到循环中。因此，ceDNA载体可以使得能够连续、持续和长期递送通过单次注射施用的抗体(例如，本文所述的治疗性抗体或其抗原结合片段)。这在核酸疫苗组合物的背景下是特别有利的，其中与mRNA疫苗相比，DNA疫苗显示出更慢的表达增加和更持续的表达，mRNA疫苗可显示出更多增加的初始表达并且更快地减少。
根据一些方面，本公开提供了一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体，其包含在侧接反向末端(ITR)之间的至少一个核酸序列的，其中所述至少一个核酸序列编码抗原或免疫原性肽。根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽来源于细菌、病毒、真菌或寄生虫感染因子。根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽是肿瘤相关抗原。根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽与自身免疫病症相关联。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，抗原或免疫原性肽选自表1-8中列出的那些中的一种或多种。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA载体包含操作性地连接到至少一个核酸序列的启动子序列。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA载体包含至少一个聚A序列。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA载体包含5'UTR和/或内含子序列。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA载体包含3'UTR序列。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA载体包含增强子序列。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，至少一个ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR来自选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)的病毒。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，侧接ITR相对于彼此对称或不对称。根据一些实施方案，侧接ITR是对称的或基本上对称的。根据一些实施方案，侧接ITR是不对称的。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR是野生型的，或者其中所述ITR中的两个ITR都是野生型ITR。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，侧接ITR来自不同病毒血清型。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，侧接ITR选自表8中示出的任何病毒血清型对。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR包含选自表9中的一个或多个序列的序列。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的至少一个ITR由于影响ITR的整体三维构象的缺失、添加或取代而相对于野生型AAV ITR序列改变。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR来源于选自以下的AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR是合成的。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR不是野生型ITR，或者其中所述ITR中的两个ITR都不是野生型ITR。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR通过选自A、A'、B、B'、C、C'、D和D'的ITR区域中的至少一个ITR区域中的缺失、插入和/或取代而被修饰。根据一些实施方案，所述缺失、插入和/或取代使得通常由A、A'、B、B'、C或C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由B和B'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由C和C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代使得通常由B和B'区域形成的茎-环结构的一部分和/或通常由C和C'区域形成的茎-环结构的一部分发生缺失。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由B和B'区域形成的第一茎-环结构以及由C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，两个ITR以使得当ITR相对于彼此反转时产生整体三维对称性的方式改变。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA载体囊封在脂质纳米粒子(LNP)中。
根据一些方面，如本文的方面和实施方案中所述的ceDNA载体用作疫苗。
根据一些方面，本公开提供了一种在细胞中表达抗原或免疫原性肽的方法，该方法包括使细胞与任何前述方面和实施方案的ceDNA载体接触。根据一些实施方案，细胞在体外或体内。根据一些实施方案，至少一个核酸序列经密码子优化以在细胞中表达。
根据一些方面，本公开提供了一种治疗患有细菌、病毒、寄生虫或真菌感染的受试者的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面和实施方案的ceDNA载体。
根据一些方面，本公开提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面和实施方案的ceDNA载体。
根据一些方面，本公开提供了一种治疗患有自身免疫疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面和实施方案的ceDNA载体。
根据一些方面，本公开提供了一种预防受试者的细菌、病毒、寄生虫或真菌感染的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面和实施方案的ceDNA载体。
根据一些方面，本公开提供了一种预防受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面和实施方案的ceDNA载体。
根据一些方面，本公开提供了一种预防受试者的自身免疫疾病的方法，该方法包括向受试者施用任何前述方面和实施方案的ceDNA载体。
根据前述方面和实施方案的一些实施方案，该方法还包括向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。根据前述方面和实施方案的一些实施方案，ceDNA载体通过静脉内、皮下、瘤内或肌肉内注射施用。
根据一些方面，本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物包含任何前述方面和实施方案的ceDNA载体。根据一些实施方案，药物组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。
根据一些方面，本公开提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包含任何前述方面和实施方案的ceDNA载体。
根据一些方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含任何前述方面和实施方案的ceDNA载体、以及脂质。根据一些实施方案，脂质是脂质纳米粒子(LNP)。根据一些实施方案，组合物是冻干的。
根据一些方面，本公开提供了一种试剂盒，该试剂盒包括任何前述方面和实施方案的ceDNA载体、任何前述方面和实施方案的药物组合物或任何前述方面和实施方案的组合物。
本公开的这些和其他方面在下文中更详细地描述。
附图说明
通过参考在附图中描绘的本公开的说明性实施方案，可以理解上面简要概述并且在下面更详细论述的本公开的实施方案。但是，附图仅示出了本公开的典型实施方案，因此不应视为对范围的限制，因为本公开可以允许其他等效的实施方案。
图1A示出了如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含不对称ITR。在此实施方案中，示例性ceDNA载体包括含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因的开放阅读框(ORF)(例如，编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列)可以插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点(R3/R4)中。表达盒侧接在两个反向末端重复序列(ITR)-表达盒上游(5'端)的野生型AAV2 ITR和下游(3'端)的经修饰ITR，因此侧接表达盒的两个ITR彼此不对称。
图1B示出了如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含不对称ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因的开放阅读框(ORF)(例如，编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列)可以插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。该表达盒侧接两个反向末端重复序列(ITR)-该表达盒上游(5'端)的经修饰ITR和下游(3'端)的野生型ITR。
图1C示出了如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含不对称ITR以及含有增强子/启动子、转基因(例如，编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列)、转录后元件(WPRE)和聚A信号的表达盒。开放阅读框(ORF)允许将转基因插入在CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个彼此不对称的反向末端重复(ITR)；表达盒上游(5'端)的经修饰ITR和下游(3'端)的经修饰ITR，其中5'ITR和3'ITR都是经修饰ITR，但是具有不同的修饰(即，它们不具有相同的修饰)。
图1D示出了如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽(例如，HC或LC)的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含如本文所定义的对称的经修饰ITR或基本上对称的经修饰ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因的开放阅读框(ORF)(例如，编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列)插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个修饰的反向末端重复序列(ITR)，其中5’经修饰ITR和3’经修饰ITR是对称的或基本上对称的。
图1E示出了如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含如本文所定义的对称的经修饰ITR或基本上对称的经修饰ITR以及含有增强子/启动子、转基因、转录后元件(WPRE)和聚A信号的表达盒。开放阅读框(ORF)允许将转基因(例如编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列)插入在CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个修饰的反向末端重复序列(ITR)，其中5’经修饰ITR和3’经修饰ITR是对称的或基本上对称的。
图1F示出了如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含如本文所定义的对称的WT-ITR或基本上对称的WT-ITR以及含有CAG启动子、WPRE和BGHpA的表达盒。编码转基因的开放阅读框(ORF)(例如，编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列)插入CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)，其中5'WT-ITR和3'WT ITR是对称的或基本上对称的。
图1G示出了如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的示例性结构，该ceDNA载体包含如本文所定义的对称的经修饰ITR或基本上对称的经修饰ITR以及含有增强子/启动子、转基因、转录后元件(WPRE)和聚A信号的表达盒。开放阅读框(ORF)能够将转基因插入介于CAG启动子与WPRE之间的克隆位点中。表达盒侧接两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)，其中5'WT-ITR和3'WT ITR是对称的或基本上对称的。
图2A提供了AAV2的野生型左ITR的T形茎-环结构，以及A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')的标识，并且还显示了末端解链位点(trs)。RBE含有一连串4个双链体四聚体，它们被认为与Rep 78或Rep 68相互作用。另外，RBE'也被认为与在该构建体中的野生型ITR或突变的ITR上装配的Rep复合物相互作用。D和D'区含有转录因子结合位点和其它保守结构。图2B显示了所提出的Rep催化的在野生型左ITR中产生的切割和接合活性，该野生型左ITR包括AAV2的野生型左ITR的T形茎-环结构以及A-A'臂、B-B'臂、C-C'臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE')的标识，并且还显示了末端解链位点(trs)以及包含若干转录因子结合位点和另一保守结构的D和D'区域。
图3A提供了野生型左AAV2 ITR的A-A'臂的含RBE部分以及C-C'和B-B'臂的一级结构(多核苷酸序列)(左)和二级结构(右)。图3B显示了左ITR的示例性突变ITR(也称为经修饰ITR)序列。显示的是示例性突变左ITR(ITR-1，左)的A-A'臂的RBE部分、C臂和B-B'臂的一级结构(左)和预测的二级结构(右)。图3C显示了野生型右AAV2 ITR的A-A'环的含RBE部分以及B-B'和C-C'臂的一级结构(左)和二级结构(右)。图3D显示了示例性经修饰右ITR。显示的是示例性突变右ITR(ITR-1，右)的A-A'臂的含RBE部分、B-B'和C臂的一级结构(左)和预测的二级结构(右)。可以如本文所教示，使用左ITR和右ITR的任何组合(例如AAV2 ITR或其它病毒血清型ITR或合成ITR)。图3A至图3D的多核苷酸序列中的每一个是指在用于产生如本文所描述的ceDNA的质粒或杆粒/杆状病毒基因组中所用的序列。图3A至图3D每一个中还包含从质粒或杆粒/杆状病毒基因组中的ceDNA载体构型推断出的相应ceDNA二级结构以及预测的吉布斯自由能(Gibbs free energy)值。
图4A是示出用于制备杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的上游过程的示意图，所述细胞可用于在图4B的示意图中所描述的过程中产生如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性蛋白的ceDNA载体。图4B是ceDNA产生的一种示例性方法的示意图，并且图4C示出了证实ceDNA载体产生的一种生化方法和过程。图4D和图4E是描述了用于鉴定从在图4B的ceDNA产生过程期间获得的细胞团粒收获的DNA中ceDNA的存在的过程的示意图。图4D显示了未切割或用限制性核酸内切酶消化并然后在天然凝胶或变性凝胶上进行电泳的示例性ceDNA的示意性预期色带。最左边的示意图是天然凝胶，并显示多个色带，表明以其双链体和未切割形式的ceDNA以至少单体和二聚体状态存在，可看到呈迁移较快的较小单体和迁移较慢的二聚体，二聚体的大小是单体的两倍。左起第二个示意图展示，当用限制核酸内切酶切割ceDNA时，原始带消失并出现了迁移较快(例如较小)的带，与裂解后剩余的预期片段大小相对应。在变性条件下，原始双链体DNA是单链的，并且因为互补链是共价连接的，所以作为两倍于天然凝胶上观察到的大小的物种进行迁移。因此，在右起第二个示意图中，经过消化的ceDNA显示了与在天然凝胶上观察到的相似的带分布，但该带作为其天然凝胶对应物大小的两倍的片段进行迁移。最右边的示意图显示，在变性条件下未切割的ceDNA作为单链开环进行迁移，因此观察到的色带是在不开环的天然条件下观察到的色带大小的两倍。在这个图中，“kb”用于指示核苷酸分子的相对大小，取决于背景，其基于核苷酸链长(例如，对于在变性条件下观察到的单链分子)或碱基对数目(例如，对于在天然条件下观察到的双链分子)。图4E显示了具有不连续结构的DNA。ceDNA可以通过在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制性核酸内切酶切割，并在中性和变性两种条件下生成两个大小不同(1kb和2kb)的DNA片段。图4E还示出了具有线性和连续结构的ceDNA。所述ceDNA载体可被限制性核酸内切酶切割，并产生两个DNA片段，所述片段在中性条件下以1kb和2kb迁移，但在变性条件下，链保持连接并产生以2kb和4kb迁移的单链。
图5是在用(+)或不用(-)核酸内切酶(对于ceDNA构建体1和2，为EcoRI；对于ceDNA构建体3和4，为BamH1；对于ceDNA构建体5和6，为SpeI；并且对于ceDNA构建体7和8，为XhoI)消化的情况下ceDNA载体的变性凝胶运行示例的示例性图片。构建体1-8描述于国际申请PCT PCT/US18/49996(以全文引用的方式并入本文)的实施例1中。确定了用星号突出显示的色带的大小，并提供在图片的底部。
图6是示出在实施例6所述研究的第29天和第49天测定的刺突蛋白抗体滴度的图。
图7示出了中和测定的结果。
图8是示出在实施例7所述研究的第21天和第41天测定的刺突蛋白抗体滴度的图。
图9示出了展示在实施例8所述的研究的第21天和第49天测定的刺突蛋白抗体滴度的图表。
具体实施方式
根据本公开的实施方案，提供了用于通过ceDNA载体递送一种或多种抗原或免疫原性肽的组合物。
I.定义
除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本公开本领域的技术人员通常所了解的含义。应理解，本公开不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不打算限制仅由权利要求书定义的本公开的范围。免疫学和分子生物学中常用术语的定义可以在以下文献中找到：The Merck Manual of Diagnosis and Therapy，第19版，由Merck Sharp&Dohme Corp.出版(2011)(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编辑),Fields Virology,第6版，由Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,USA出版(2013)；Knipe,D.M.和Howley,P.M.(编辑),The Encyclopedia of Molecular CellBiology and Molecular Medicine，由Blackwell Science Ltd.出版(1999-2012)(ISBN9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference，由VCH Publishers,Inc.出版(1995)(ISBN 1-56081-569-8)；Immunology by Werner Luttmann，由Elsevier出版(2006)；Janeway'sImmunobiology,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编辑),Taylor&FrancisLimited,2014(ISBN 0815345305、9780815345305)；Lewin's Genes XI，由Jones&BartlettPublishers出版(2014)(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green and JosephSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第4版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,USA(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人,Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing,Inc.,NewYork,USA(2012)(ISBN 044460149X)；Laboratory Methods in Enzymology:DNA,JonLorsch(编辑),Elsevier,2013(ISBN 0124199542)；Current Protocols in MolecularBiology(CPMB),Frederick M.Ausubel(编辑),John Wiley and Sons,2014(ISBN047150338X、9780471503385),Current Protocols in Protein Science(CPPS),John E.Coligan(编辑),John Wiley and Sons,Inc.,2005；以及Current Protocols inImmunology(CPI)(John E.Coligan,ADA M Kruisbeek,David H Margulies,Ethan MShevach,Warren Strobe(编辑)John Wiley and Sons,Inc.,2003(ISBN 0471142735、9780471142737)，这些文献的内容均以全文引用的方式并入本文。
如本文所用，术语“免疫”或“主动免疫”是指主动免疫的产生，这意味着由天然获得性感染或有意的疫苗接种(人工主动免疫)产生的免疫。
如本文所用，术语“佐剂”意指当与制剂中的特定免疫原组合使用时将增强或以其他方式改变或修饰所得免疫应答的试剂。免疫应答的修饰包括增强或扩大免疫应答的特异性(例如，抗体和细胞免疫应答中的一者或两者)。免疫应答的修饰还可以指降低或抑制某些抗原特异性免疫应答。
如本文所用，术语“抗原”意指含有一个或多个表位(线性、构象或两者)的分子，该表位将刺激宿主的免疫系统产生体液和/或细胞抗原特异性应答。该术语可与术语“免疫原”互换使用。通常，B细胞表位将包括至少约5个氨基酸，但可以小至3-4个氨基酸。T细胞表位，诸如CTL表位，将包括至少约7-9个氨基酸，并且辅助T细胞表位包括至少约12-20个氨基酸。通常，表位将包括约7至15个氨基酸，包括诸如9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。该术语包括与天然序列相比包括修饰，诸如缺失、添加和取代(本质上通常是保守的)的多肽，只要蛋白质保持引发免疫应答的能力，如本文所定义。这些修饰可以是有意的，如通过定点诱变，或者可以是偶然的，诸如通过产生抗原的宿主的突变。
术语“表位”也可以称为抗原决定簇，是可以通过结合剂、免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的分子决定簇(例如，多肽决定簇)。表位决定簇包括分子的化学活性表面分组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位可以定义为结构的或功能的。功能表位通常是结构表位的亚组，并且具有直接有助于相互作用亲和力的那些残基。表位可以是线性的或构象的，即由非线性氨基酸构成。由抗体或抗体的抗原结合片段识别的表位是与抗体或片段的CDR(例如，互补位点)相互作用的抗原的结构元件。表位可以由几个氨基酸残基的贡献形成，这些氨基酸残基与抗体的CDR相互作用以产生特异性。抗原片段可以含有多于一个表位。在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中识别其靶抗原时，抗体特异性结合抗原。例如，如果抗体交叉竞争(一种抗体阻止另一种抗体的结合或调节作用)，则称抗体“结合至相同表位”。
如本文所用，术语“自身免疫病症”通常是指其中受试者的免疫系统攻击身体自身细胞，从而引起组织破坏的病症。可以使用血液检测、脑脊液分析、肌电图(测量肌肉功能)和脑部磁共振成像来诊断自身免疫病症，但是血液中的自身抗体(或自体抗体)的抗体测试是特别有用的。通常，IgG类抗体与自身免疫疾病相关。
术语“B淋巴细胞”或“B细胞”可互换使用，指广泛类别的淋巴细胞，其是抗体分泌细胞的前体，表达识别特异性抗原表位的克隆多样的细胞表面免疫球蛋白(Ig)受体(BCR)。哺乳动物B细胞发育包括在初级淋巴组织(例如，人胎肝和胎儿/成体骨髓)中开始，随后在次级淋巴组织(例如，人淋巴结和脾)中功能成熟的连续阶段。功能性/保护性终点是终末分化的浆细胞产生抗体。成熟B细胞可通过遇到表达被其细胞表面免疫球蛋白(Ig)识别的表位的抗原而被活化。活化过程可以是直接的，依赖于膜Ig分子通过抗原的交联(交联依赖性B细胞激活)，或者是间接的，在与辅助T细胞的紧密相互作用的情况下最有效地发生(“同源辅助过程”)。(LeBien,TW&TF Tedder,B lymphocytes:how they develop andfunction.Blood(2008)112(5):1570-80)。
如本文所用，术语“癌症”是指其中异常细胞不受控制地分裂并能够侵入其他组织的疾病。有超过100种不同类型的癌症。大多数癌症是以它们所起始的器官或细胞类型命名的，例如，起始于结肠的癌症称为结肠癌；起始于皮肤的黑素细胞的癌症称为黑素瘤。癌症类型可以分组成更广泛的类别。癌症的主要类别包括：恶性肿瘤(意指起始于皮肤或内衬或覆盖内脏器官的组织的癌症，及其亚型，包括腺癌、基底细胞癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)；肉瘤(意指起始于骨、软骨、脂肪、肌肉、血管或其他结缔组织或支持组织的癌症)；白血病(意指起始于血液形成组织(例如，骨髓)并引起大量异常血细胞产生并进入血液的癌症；淋巴瘤和骨髓瘤(意指起始于免疫系统细胞的癌症)；和中枢神经系统(CNS)癌症(意指起始于大脑和脊髓组织的癌症)。术语“骨髓增生异常综合征”是指其中骨髓不能产生足够的健康血细胞(白细胞、红细胞和血小板)并且在血液和/或骨髓中存在异常细胞的一种类型的癌症。骨髓增生异常综合征可以变成急性骨髓性白血病(AML)。在某些实施方案中，癌症选自包括但不限于以下的癌症：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑瘤、乳腺癌、原发性未知的癌症、扩散至骨骼的癌症、扩散至大脑的癌症、扩散至肝脏的癌、扩散至肺的癌症、类癌瘤、宫颈癌、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、妊娠滋养细胞瘤(GTT)、毛细胞白血病、头颈癌、霍奇金淋巴瘤、肾癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑素瘤、皮肤癌、间皮瘤、男性癌症、葡萄胎妊娠、口腔癌和口咽癌、骨髓瘤、鼻和窦癌、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、食管癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、罕见癌症、直肠癌、唾液腺癌、继发性癌症、皮肤癌(非黑素瘤)、软组织肉瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、未知原发性癌、子宫癌、阴道癌和外阴癌。
如本文所用，术语“交叉保护”用于描述针对病毒、细菌、寄生虫或其他病原体的至少两个亚群、亚型、菌株和/或变体的免疫，其中单次接种一个亚群、亚型、菌株和/或变体。
如本文所用，术语“细胞因子”是指由细胞分泌的小可溶性蛋白物质，它对其他细胞具有多种作用。细胞因子介导许多重要的生理功能，包括生长、发育、伤口愈合和免疫应答。它们通过与其位于细胞膜中的细胞特异性受体结合起作用，这允许在细胞中开始不同的信号转导级联，最终将导致靶细胞中的生物化学变化和表型变化。通常，细胞因子局部起作用。它们包括I型细胞因子，其包括许多白介素以及若干造血生长因子；II型细胞因子，其包括干扰素和白介素-10；肿瘤坏死因子(“TNF”)相关分子，其包括TNFα和淋巴毒素；免疫球蛋白超家族成员，其包括白介素1(“IL-1”)；以及趋化因子，其是在多种免疫和炎性功能中起关键作用的分子家族。根据细胞的状态，相同的细胞因子可以对细胞具有不同的作用。细胞因子通常调节其他细胞因子的表达并且触发其他细胞因子的级联。
如本文所用，术语“可检测反应”意指可在测定中检测到的任何信号或反应，所述测定可在有或没有检测试剂的情况下进行。可检测反应包括但不限于放射性衰变和能量(例如，荧光、紫外、红外、可见)发射、吸收、偏振、荧光、磷光、透射、反射或共振转移。可检测反应还包括色谱迁移率、浊度、电泳迁移率、质谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱和x射线衍射。另选地，可检测反应可以是测量生物材料的一种或多种特性(诸如熔点、密度、电导率、表面声波、催化活性或元素组成)的测定结果。“检测试剂”是生成指示感兴趣的物质存在或不存在的可检测反应的任何分子。检测试剂包括多种分子中的任一种分子，诸如抗体、核酸序列和酶。为了便于检测，检测试剂可包含标志物。
如本文所用，术语“效应细胞”是指进行最终应答或发挥作用的细胞。例如，免疫系统的主要效应细胞是活化的淋巴细胞和吞噬细胞。
如本文所用，术语“群体免疫”是指赋予通过为他人接种而产生的群体中未接种个体的保护以及感染的天然库的减少。
如本文所用，术语“异亚型免疫”(“HSI”)是指基于所有病毒株中保守的抗原的免疫识别的免疫。
如本文所用，术语“异型”用于指不同或不常见的类型或形式(例如，病毒、细菌、寄生虫或其他病原体的不同亚群、亚型、株和/或变体)。
如本文所用，术语“同型”用于指相同类型或形式，例如，病毒、细菌、寄生虫或其他病原体的相同亚群、亚型、株和/或变体。
如本文所用，术语“免疫应答”和“免疫介导的”在本文中可互换使用，是指受试者的免疫系统针对外来抗原或自身抗原的任何功能性表达，无论这些反应的结果对受试者是有益的还是有害的。如本文所用，术语对抗原或组合物的“免疫应答”意指在受试者中对存在于感兴趣的组合物中的抗原的体液和/或细胞免疫应答的发展。出于本公开的目的，“体液免疫应答”是指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是由T淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面涉及溶细胞性T细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL对肽抗原具有特异性，所述肽抗原与由主要组织相容性复合体(MHC)编码并在细胞表面表达的蛋白质结合呈递。CTL有助于诱导和促进细胞内微生物的破坏，或被这些微生物感染的细胞的溶解。细胞免疫的另一方面涉及通过辅助T细胞进行的抗原特异性应答。辅助T细胞用于帮助刺激功能，并且将非特异性效应细胞的活性集中于在其表面展示与MHC分子结合的肽抗原的细胞。“细胞免疫应答”还指由活化的T细胞和/或其他白细胞产生的细胞因子、趋化因子和其他此类分子的产生，包括来源于CD4+和CD8+T细胞的那些。因此，免疫应答可包括以下作用中的一种或多种作用：通过B细胞产生抗体；和/或特异性针对存在于感兴趣的组合物或疫苗中的一种或多种抗原的抑制性T细胞和/或γδT细胞的活化。这些应答可用于中和感染性，并且/或者介导抗体-补体，或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以对免疫宿主提供保护。此类应答可使用本领域众所周知的标准免疫测定和中和测定来测定。
如本文所用，术语“免疫表型”或“免疫型”是指各种免疫细胞群体的集合频率以及它们对刺激的功能性应答(细胞信号传导和抗体应答)。(参见Kaczorowski,KJ等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(2017))。
如本文所用，术语“免疫系统”是指身体防御疾病的系统，其包括先天免疫系统和适应性免疫系统。先天免疫系统提供了针对病原体的非特异性第一道防线。它包括物理屏障(例如，皮肤)以及细胞(粒细胞、天然杀伤细胞)和体液(补体系统)防御机制。先天免疫系统的反应是即时的，但与适应性免疫系统不同，它不提供针对病原体的永久免疫。适应性免疫应答是脊椎动物免疫系统对通常产生免疫记忆的特异性抗原的应答。
如本文所用，术语“免疫显性表位”是指大多数抗体针对其而产生或大多数T细胞对其应答的表位。
术语“免疫库”是指位于T细胞和B细胞表面的跨膜抗原受体蛋白的集合。(Benichou,J.等人，Immunology(2011)135:183-191))。负责编码受体的组合机制通过重组遗传密码来实现，具有在人类中产生超过1018种不同T细胞受体(TCR)(Venturi,Y.等人，Nat.Rev.Immunol.(2008)8:231-8)以及更多样的B细胞库的潜力。这些序列继而将被转录，然后翻译成待呈递在细胞表面上的蛋白质。重排基因片段以构建受体的重组过程是免疫应答发展的关键，并且重排受体的正确形成对于它们未来对抗原的结合亲和力很关键。
编码此类分子的肽、寡肽、多肽、蛋白质或多核苷酸是“免疫原性的”，因此如果其能够诱导免疫应答，则是本公开内的免疫原。在本公开中，免疫原性更具体地被定义为诱导CTL介导的应答的能力。因此，免疫原将是能够诱导免疫应答的分子，并且在本公开中，是能够诱导CTL应答的分子。免疫原可具有一种或多种同种型、序列变体或剪接变体，其具有等效的生物学和免疫学活性，并且因此出于本公开的目的，也被认为是原始天然多肽的免疫原性等同物。
编码此类分子的肽、寡肽、多肽、蛋白质或多核苷酸是“免疫原性的”，因此如果其能够诱导免疫应答，则是本公开内的免疫原。在本公开中，免疫原性更具体地被定义为诱导CTL介导的应答的能力。因此，免疫原将是能够诱导免疫应答的分子，并且在本公开中，是能够诱导CTL应答的分子。免疫原可具有一种或多种同种型、序列变体或剪接变体，其具有等效的生物学和免疫学活性，并且因此出于本公开的目的，也被认为是原始天然多肽的免疫原性等同物。
如本文所用，术语“特异性结合”是指多肽或多肽复合物识别并体外或体内结合配体而基本上不识别或结合周围环境中的其他分子的能力。在一些实施方案中，特异性结合可通过至少约1×106M或更小的平衡解离常数(例如，更小的平衡解离常数表示更紧密的结合)来表征。用于确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域众所周知的，包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。
如本文所用，术语“表面等离子体共振”是指允许例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)通过检测生物传感器基质内蛋白质浓度改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象。对于进一步的描述，参见美国专利6,258,562的实施例1和等人(1993)Ann.Biol.Clin.51:19；等人(1991)Biotechniques11:620-627；Johnsson等人(1995)J.Mol.Recognit.8:125；和Johnnson等人(1991)Anal.Biochem.198:268。
如本文所使用，术语“异源核酸序列”和“转基因”可互换使用并且指并入如本文所公开的ceDNA载体中并可以由所述ceDNA载体递送和表达的感兴趣的核酸(除编码衣壳多肽的核酸之外)。根据一些实施方案，术语“异源核酸”打算指不存在于其所接触的细胞或受试者中、由其所接触的细胞或受试者表达或衍生自其所接触的细胞或受试者的核酸(或转基因)。
如本文所用，术语“表达盒”和“转录盒”可互换使用，并且是指一段线性核酸，其包括与一个或多个启动子或足以引导转基因转录的其它调节序列操作性地连接的转基因，但是不包含衣壳编码序列、其它载体序列或反向末端重复区域。表达盒可以另外包含一个或多个顺式作用序列(例如启动子、增强子或阻遏子)、一个或多个内含子和一个或多个转录后调节元件。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合物形式。因此，这个术语包含单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交物、或包含嘌呤和嘧啶碱基或其它天然、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基的聚合物。“寡核苷酸”通常是指单链或双链DNA的约5至约100个核苷酸之间的多核苷酸。然而，出于本公开的目的，寡核苷酸的长度没有上限。寡核苷酸也称为“寡聚物(oligomer)”或“oligo”，并且可以从基因中分离出来，或通过本领域已知的方法化学合成。应理解，在所描述的实施方案适用时，术语“多核苷酸”和“核酸”包括单链(例如有义或反义)和双链多核苷酸。
DNA可以呈例如反义分子、质粒DNA、DNA-DNA双链体、预缩合DNA、PCR产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合的形式。DNA可以呈小环、质粒、杆粒、小基因、辅助DNA(线性共价封闭DNA载体)、封闭端线性双链体DNA(CELiD或ceDNA)、doggybone(dbDNATM)DNA、哑铃形DNA、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、病毒载体或非病毒载体的形式。RNA可以呈小干扰RNA(siRNA)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)和其组合的形式。核酸包括含有已知核苷酸类似物或经修饰主链残基或键的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有与参考核酸相似的结合特性。此类类似物和/或经修饰残基的示例包含(但不限于)：硫代磷酸酯、磷酰二胺吗啉代寡聚体(吗啉代)、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、锁核酸(LNATM)和肽核酸(PNA)。除非特别限制，否则所述术语涵盖含有与参考核酸具有类似结合性质的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另外指示，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰变异体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指示的序列。
如本文所使用的，“核苷酸”含有糖脱氧核苷(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基。核苷酸通过磷酸酯基连接在一起。
“碱基”包括嘌呤和嘧啶，所述嘌呤和嘧啶进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于放置新的反应性基团(诸如但不限于胺、醇、硫醇、羧化物和烷基卤化物)的修饰。
如本文所使用的，术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子，其是从天然基因中分离的，或者以自然界中不另外存在或合成的方式进行修饰以含有核酸的节段。当核酸构建体包含表达本公开的编码序列所需的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。“表达盒”包含操作性地连接至启动子的DNA编码序列。
“可杂交的”或“互补的”或“基本上互补的”意指核酸(例如RNA)包括使其能够与另一核酸序列在体外和/或体内适当的温度和溶液离子强度的条件下非共价结合，即形成沃森-克里克碱基对(Watson-Crick base pair)和/或G/U碱基对、“退火”或“杂交”以序列特异性的反向平行方式(即，核酸特异性地结合于互补核酸)的核苷酸序列。如本领域已知的，标准的沃森-克里克碱基对包含：腺嘌呤(A)与胸苷(T)配对，腺嘌呤(A)与尿嘧啶(U)配对，以及鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)配对。另外，在所属领域中还已知对于两个RNA分子(例如dsRNA)之间的杂交，鸟嘌呤(G)碱基与尿嘧啶(U)配对。例如，在与mRNA中的密码子进行tRNA反密码子碱基配对的情况下，G/U碱基配对部分负责遗传密码的简并性(即，冗余)。在本公开的上下文中，靶向主题DNA的RNA分子的蛋白结合节段(dsRNA双链体)的鸟嘌呤(G)被认为与尿嘧啶(U)互补，反之亦然。这样，当可以在靶向主题DNA的RNA分子的蛋白结合节段(dsRNA双链体)的给定核苷酸位置形成G/U碱基对时，该位置不被认为是非互补的，而是被认为是互补的。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸的聚合物形式，其可以包含编码和非编码的氨基酸、经过化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有修饰的肽主链的多肽。
“编码”特定抗原或免疫原性肽的DNA序列是转录到特定RNA和/或蛋白质中的DNA核酸序列。DNA多核苷酸可编码被翻译成蛋白的RNA(mRNA)，或者DNA多核苷酸可编码未被翻译成蛋白的RNA(例如，tRNA、rRNA或靶向DNA的RNA；也称为“非编码”RNA或“ncRNA”)。
如本文所用，术语“末端重复”或“TR”包括任何包含至少一个最低需要的复制起点和包含回文发夹结构的区域的病毒末端重复或合成序列。Rep结合序列(“RBS”)(也称为RBE(Rep结合元件))和末端解链位点(“TRS”)共同构成“最低需要的复制起点”，并且因此TR包括至少一个RBS和至少一个TRS。在给定的一段多核苷酸序列内彼此是反向互补序列的TR通常各自被称为“反向末端重复”或“ITR”。在病毒的背景下，ITR介导复制、病毒包装、整合和原病毒拯救。如出乎意料地发现，在其全长上不为反向互补序列的TR仍然可以执行ITR的传统功能，并且因此术语ITR在本文中用于指ceDNA基因组或ceDNA载体中能够介导ceDNA载体复制的TR。本领域的技术人员将了解，在复杂的ceDNA载体构型中，可以存在超过两个ITR或不对称的ITR对。ITR可以是AAV ITR或非AAV ITR，或可以来源于AAV ITR或非AAV ITR。举例来说，ITR可以衍生自细小病毒科，所述细小病毒科涵盖细小病毒和依赖病毒(例如犬科动物细小病毒、牛科动物细小病毒、小鼠细小病毒、猪科动物细小病毒、人类细小病毒B-19)，或可以使用充当SV40复制起点的SV40发夹作为ITR，所述ITR可以通过截短、取代、缺失、插入和/或添加而被进一步修饰。细小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)以及感染无脊椎动物的浓病毒亚科(Densovirinae)。依赖病毒属包含腺相关病毒(AAV)的病毒家族，其能够在脊椎动物宿主中复制，该宿主包含但不限于人、灵长类、牛、犬、马和羊物种。本文中为了方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5’(上游)的ITR称为“5’ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3’(下游)的ITR称为“3’ITR”或“右ITR”。
“野生型ITR”或“WT-ITR”是指AAV或其它依赖病毒中天然存在的ITR序列的序列，其保留例如Rep结合活性和Rep切口能力。由于遗传密码简并或漂移，来自任何AAV血清型的WT-ITR的核酸序列可能与典型的天然存在的序列略有不同，并且因此，本文涵盖的使用的WT-ITR序列包括归因于在产生过程中发生的天然存在的变化(例如复制误差)的WT-ITR序列。
如本文所用，术语“基本上对称的WT-ITR”或“基本上对称的WT-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对WT-ITR，它们都是在整个长度上具有反向互补序列的野生型ITR。例如，ITR即使具有一个或多个偏离典型的天然存在的序列的核苷酸，只要变化并不影响该序列的特性和整体三维结构，该ITR也可以被认为是野生型序列。根据一些方面，偏离的核苷酸代表保守的序列变化。作为一个非限制性示例，序列与典型序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(例如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与另一个WT-ITR具有对称的三维空间组织，以使它们的3D结构在几何空间中具有相同的形状。基本上对称的WT-ITR在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。通过确定具有与合适的Rep蛋白配对的可操作的Rep结合位点(RBE或RBE')和末端解链位点(trs)，可以在功能上确认大体上对称的WT-ITR为WT。可以选择测试其它功能，包含在许可条件下的转基因表达。
如本文所使用的，短语“经修饰ITR(modified ITR/mod-ITR)”或“突变ITR”在本文中可互换使用，并且是指与来自相同血清型的WT-ITR相比在至少一个或多个核苷酸中具有突变的ITR。突变可能导致根据ITR中A、C、C'、B、B'区域中的一些或多个发生变化，并且可能导致三维空间组织(即，其几何空间中的3D结构)与相同血清型的WT-ITR的3D空间组织相比发生变化。
如本文所使用的，术语“不对称ITR”也称为“不对称ITR对”，是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内在全长上不反向互补的一对ITR。作为一个非限制性示例，不对称的ITR与其同源ITR不具有对称的三维空间组织，使得其3D结构在几何空间中具有不同的形状。换句话说，不对称的ITR对具有不同的整体几何结构，即它们在3D空间中具有不同的A、C-C'和B-B'环组织(例如，一个ITR与同源ITR相比可能具有短的C-C'臂和/或短的B-B'臂)。两个ITR之间的序列差异可能是由于一个或多个核苷酸添加、缺失、截短或点突变引起的。根据一些实施方案，不对称ITR对中的一个ITR可以是野生型AAV ITR序列，另一个ITR是如本文定义的经修饰ITR(例如非野生型或合成ITR序列)。在另一个实施方案中，不对称ITR对中的ITR皆不是野生型AAV序列，并且两个ITR是在几何空间中具有不同形状的经修饰ITR(即，不同的整体几何结构)。根据一些实施方案，不对称ITR对中的一个mod-ITR可能具有短的C-C'臂，而另一个ITR可能具有不同的修饰(例如单臂或短的B-B'臂等)，使得它们与同源不对称mod-ITR相比具有不同的三维空间组织。
如本文所用，术语“对称ITR”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对ITR，其相对于野生型依赖病毒ITR序列发生突变或修饰并且在其全长上反向互补。这两个ITR都不是野生型ITR AAV2序列(即，它们是经修饰ITR，也称为突变ITR)，并且由于核苷酸的添加、缺失、取代、截断或点突变，而在序列上与野生型ITR不同。本文中为了方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5’(上游)的ITR称为“5’ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载体中表达盒的3’(下游)的ITR称为“3’ITR”或“右ITR”。
如本文所使用的，术语“基本上对称的经修饰ITR”或“基本上对称的mod-ITR对”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体中的一对经修饰ITR，它们在其全长上具有反向互补序列。例如，经修饰的ITR即使具有一些偏离反向互补序列的核苷酸序列，但只要变化不影响特性和整体形状，也可以认为其是基本上对称的。作为一个非限制性示例，序列与典型序列具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性(如使用默认设置下的BLAST所测量)，并且还与其同源的经修饰ITR具有对称的三维空间组织以使得其3D结构在几何空间中为相同形状。换句话说，基本上对称的经修饰ITR对具有在3D空间中组织的相同的A、C-C'和B-B'环。根据一些实施方案，来自mod-ITR对的ITR可具有不同的反向互补核苷酸序列，但仍具有相同的对称三维空间组织，即两个ITR都具有产生相同的整体3D形状的突变。例如，mod-ITR对中的一个ITR(例如5'ITR)可以来自一种血清型，而另一个ITR(例如3'ITR)可以来自不同血清型，然而，两者均能够具有相同的相应突变(例如，如果5'ITR在C区域中具有缺失，则来自不同血清型的经修饰的同源3'ITR在C'区域中的相应位置具有缺失)，使得经修饰ITR对具有相同的对称三维空间组织。在此类实施方案中，经修饰ITR对中的每个ITR可以来自不同血清型(例如，AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，诸如AAV2与AAV6的组合，其中根据一些ITR的修饰反映在来自不同血清型的同源ITR中的对应位置中。根据一些实施方案，基本上对称的经修饰ITR对是指一对经修饰ITR(mod-ITR)，只要ITR之间的核苷酸序列的差异不影响特性或整体形状并且其在3D空间中具有基本上相同的形状即可。作为非限制性示例，如通过所属领域中熟知的标准方法，例如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)或BLASTN所测定，经修饰ITR与典型经修饰ITR具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性，并且还具有对称的三维空间组织以使其3D结构在几何空间中为相同形状。基本上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的mod-ITR对中的经修饰ITR缺失C-C'臂，那么同源经修饰ITR对应缺失C-C'环，并且还具有在其同源mod-ITR的几何空间中呈相同形状的剩余A和B-B’环的类似3D结构。
如本文所用，“内部核糖体进入位点”(IRES)意指允许在mRNA序列中间启动翻译的核苷酸序列(>500个核苷酸)(Kirn,JIT等人,2011.PLoS One 6(4):8556；其内容全文以引用方式并入本文)。IRES序列的使用确保了在IRES之前和之后基因的共表达，尽管IRES之后的序列可以以比IRES序列之前的序列更低的水平转录和翻译。
如本文所用，“2A肽”意指来源于病毒诸如口蹄疫病毒(F2A)、猪捷申病毒-1(P2A)、明脉扁刺蛾病毒(osea asigna virus)(T2A)或马鼻炎A病毒(E2A)的小自裂解肽。2A名称具体是指导致2A肽O末端的甘氨酰-脯氨酰键处的核糖体跳跃的小核糖核酸病毒多蛋白的区域(Kim,J.IT.等人,2011.PLoS One 6(4)；其内容全文以引用方式并入本文)。这种跳跃导致2A肽与其紧邻的下游肽之间的裂解。
术语“侧接”是指一个核酸序列相对于另一核酸序列的相对位置。通常，在序列ABC中，B的两侧是A和C。这同样适用于布置AxBxC。因此，侧接序列在所侧接的序列之前或之后，但不必与所侧接的序列相邻或紧邻。根据一些实施方案，术语侧接是指在线性双链体ceDNA载体的每个末端处的末端重复序列。
如本文所使用的，术语“ceDNA基因组”是指还并入了至少一个反向末端重复区域的表达盒。ceDNA基因组还可以包括一个或多个间隔区。根据一些实施方案，该ceDNA基因组作为DNA的分子间双链体多核苷酸并入质粒或病毒基因组中。
如本文所使用的，术语“ceDNA间隔区”是指分隔ceDNA载体或ceDNA基因组中的功能元件的间插序列。根据一些实施方案，ceDNA间隔区将两个功能元件保持在对于最优功能性来说所期望的距离上。根据一些实施方案，ceDNA间隔区提供或增加了ceDNA基因组在例如质粒或杆状病毒内的遗传稳定性。根据一些实施方案，ceDNA间隔区通过提供克隆位点等的便利位置，促进ceDNA基因组的就绪遗传操纵。例如，在某些方面，含有若干限制核酸内切酶位点的寡核苷酸“多接头”或设计成不具有已知蛋白质(例如，转录因子)结合位点的非开放阅读框架序列可以定位于ceDNA基因组中以分离顺式作用因子，例如将6聚体、12聚体、18聚体、24聚体、48聚体、86聚体、176聚体等插入末端解链位点与上游转录调控元件之间。类似地，可以在多聚腺苷酸化信号序列和3'-末端解链位点之间并入间隔区。
如本文所用，术语“Rep结合位点”、“Rep结合元件”、“RBE”和“RBS”可互换使用并且是指Rep蛋白(例如AAV Rep 78或AAV Rep 68)的结合位点，其在Rep蛋白结合后允许Rep蛋白在并入了该RBS的序列上发挥其位点特异性核酸内切酶活性。RBS序列和其反向互补序列一起形成单个RBS。RBS序列是本领域已知的，并且包括例如，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，一种在AAV2中鉴定的RBS序列。在本公开的实施方案中可以使用任何已知的RBS序列，包括其它已知的AAV RBS序列和其它天然已知的或合成的RBS序列。不受理论束缚，认为Rep蛋白的核酸酶结构域结合到双链体核酸序列GCTC，因此两种已知的AAV Rep蛋白直接结合到双链体寡核苷酸5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3'并稳定地装配在其上。另外，可溶性聚集性构象异构体(即，数目未定的相互缔合的Rep蛋白)解离并结合到含有Rep结合位点的寡核苷酸。每个Rep蛋白都与每个链上的含氮碱基和磷酸二酯骨架相互作用。与含氮碱基的相互作用提供序列特异性，而与磷酸二酯主链的相互作用是非序列特异性的或较少序列特异性的，并稳定了蛋白-DNA复合物。
如本文所使用，术语“末端解链位点”和“TRS”在本文可互换使用，并且是指一个区域，在此Rep与5'胸苷形成酪氨酸-磷酸二酯键，产生3'OH，充当通过细胞的DNA聚合酶、例如DNA polδ或DNA polε进行DNA延伸的底物。另选地，Rep-胸苷复合物可以参与配位接合反应。根据一些实施方案，TRS最低限度地涵盖非碱基配对的胸苷。根据一些实施方案，TRS的切口产生效率可以至少部分地由其在同一分子内距RBS的距离来控制。当受体底物是互补ITR时，所产生的产物是分子内双螺旋。TRS序列是本领域已知的，并包含例如5'-GGTTGA-3'，其是在AAV2中鉴定的六核苷酸序列。本公开的实施方案中可使用任何已知的TRS序列，包含其他已知的AAV TRS序列和其他天然已知的或合成的TRS序列，诸如AGTT、GGTTGG、AGTTGG、AGTTGA和其他基序(诸如RRTTRR)。
如本文所使用的，术语“ceDNA”意指用于非病毒基因转移、合成或其它形式的无衣壳封闭式线性双链(ds)双链体DNA。ceDNA的详细描述描述于2017年3月3日提交的PCT/US2017/020828的国际申请中，该申请的全部内容以引用的方式明确地并入本文中。使用基于细胞的方法产生包括各种反向末端重复(ITR)序列和构型的ceDNA的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的实施例1中，该申请中的每一个申请以全文引用的方式并入本文中。用于产生包括各种ITR序列和构型的合成ceDNA载体的某些方法描述于例如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US2019/14122中，该国际申请的全部内容以引用的方式并入本文中。如本文所使用的，术语“ceDNA载体”与“ceDNA”可互换地使用并且指包括至少一个末端回文结构的末端封闭式DNA载体。根据一些实施方案，ceDNA包含两个共价封闭端。
如本文所用，术语“ceDNA-质粒”是指一种包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的质粒。
如本文所使用的，术语“ceDNA-杆粒”是指一种包括作为分子间双链体的ceDNA基因组的感染性杆状病毒基因组，其能够作为质粒在大肠杆菌中增殖，因此可以作为杆状病毒的穿梭载体操作。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒”是指一种在杆状病毒基因组内包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的杆状病毒。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒感染的昆虫细胞”和“ceDNA-BIIC”可互换使用，是指被ceDNA-杆状病毒感染的无脊椎动物宿主细胞(包括但不限于昆虫细胞(例如Sf9细胞))。
如本文所用，术语“封闭端DNA载体”是指具有至少一个共价封闭端的无衣壳DNA载体，其中该载体的至少一部分具有分子内双链体结构。
如本文中所定义，“报告体”是指可用于提供可检测的读出数的蛋白。报告体通常产生可测量的信号，诸如荧光、颜色或发光。报告蛋白编码序列编码在细胞或生物体中的存在易于观察到的蛋白。例如，荧光蛋白当被特定波长的光激发时会导致细胞发荧光，荧光素酶引起细胞催化产生光的反应，以及诸如β-半乳糖苷酶的酶将底物转化为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报告多肽包括但不限于β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)和其它荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其它在所属领域中公知的报告多肽。
如本文所用，术语“效应蛋白”是指一种提供可检测的读出数的多肽，例如作为报告多肽，或更适当地，作为杀伤细胞的多肽，例如毒素，或致使细胞易用所选药剂或因缺乏所选药剂而被杀伤的药剂。效应蛋白包括直接靶向或损害宿主细胞的DNA和/或RNA的任何蛋白或肽。例如，效应蛋白可以包含但不限于：靶向宿主细胞DNA序列(无论是基因组的还是在染色体外元件上的)的限制性核酸内切酶；降解细胞存活所必需的多肽目标的蛋白酶；DNA旋转酶抑制剂；以及核糖核酸酶型毒素。根据一些实施方案，由如本文所描述的合成生物回路控制的效应蛋白表达可作为一个因子参与另一个合成生物回路，从而扩大了生物回路系统反应性的范围和复杂度。
转录调节子是指活化或阻遏转基因(例如，编码如本文所述的抗体或其抗原结合片段的核酸)转录的转录活化子和阻遏子。启动子为引发特定基因转录的核酸区域。转录活化子通常结合至转录启动子附近并且募集RNA聚合酶以直接引发转录。阻遏子与转录启动子结合，并在空间上阻碍RNA聚合酶启动转录。其它转录调节子可取决于它们的结合位置以及细胞和环境条件来充当活化子或阻遏子。转录调节子类别的非限制性示例包括但不限于同源域蛋白、锌指蛋白、翼状螺旋(叉头)蛋白和亮氨酸拉链蛋白。
如本文所使用的，“阻遏蛋白”或“诱导蛋白”是与调节序列元件结合并分别阻遏或活化与调节序列元件操作性连接的序列的转录的蛋白。如本文所描述的优选阻遏和诱导蛋白对至少一种输入剂或环境输入物的存在或不存在敏感。如本文所描述的优选蛋白是模块的形式，包括例如可分离的DNA结合和输入剂结合或反应元件或结构域。
如本文所使用的，“载剂(carrier)”包含任何和所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂、缓冲液、载剂溶液、悬液、胶体等。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是所属领域熟知的。补充性活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用宿主时不会产生毒性、过敏性或类似的不良反应的分子实体和组合物。
如本文所使用的，“输入剂反应结构域”是转录因子的一个结构域，其以致使连接的DNA结合融合结构域对条件或输入剂的存在作出反应的方式与该条件或输入剂结合或以其它方式作出反应。根据一些实施方案，条件或输入剂的存在导致输入剂反应结构域或其融合的蛋白发生构象变化，从而改变转录因子的转录调制活性。
术语“体内”是指在生物体，诸如多细胞动物中或内部进行的分析或过程。根据本文描述的一些方面，当使用单细胞生物例如，细菌时，可以说方法或用途是在“体内”发生的。术语“离体”是指使用在多细胞动物体或植物体之外的具有完整膜的活细胞进行的方法和用途，所述活细胞例如外植体、培养细胞(包括原代细胞和细胞系)、转化的细胞系、以及提取的组织或细胞(包括血细胞)等等。术语“体外”是指不需要存在具有完整膜的细胞的分析和方法，诸如细胞提取物，并且可以指在非细胞系统，诸如不包含细胞或细胞系统的介质，诸如细胞提取物中引入可编程的合成生物回路。
如本文所使用的，术语“启动子”是指通过驱动核酸序列的转录来调节另一核酸序列表达的任何核酸序列，其可以是编码蛋白或RNA的异源目标基因。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性的或其任何组合。启动子是核酸序列的控制区域，在该核酸序列的其余部分的引发和转录速率是受控的。启动子还可以含有可以结合调节蛋白和分子的遗传元件，诸如，RNA聚合酶和其他转录因子。根据本文所述的方面的一些实施方案，启动子可以驱动调节启动子本身的表达的转录因子的表达。在启动子序列内将发现转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合域。真核启动子将经常但并非总是含有“TATA”框和“CAT”框。各种启动子，包括诱导型启动子，可用于驱动本文公开的ceDNA载体中转基因的表达。启动子序列可以在其3'末端以转录起始位点为界并且向上游(5'方向)延伸以包括为了在高于背景的可检测水平上引发转录所必需的最少数目的碱基或元件。根据一些实施方案，本公开的启动子是肝特异性启动子。
如本文所用，术语“增强子”是指结合一种或多种蛋白(例如，活化蛋白或转录因子)以增加核酸序列的转录活化的顺式作用调节序列(例如，10-1,500个碱基对)。增强子可以位于其所调节的基因起始位点上游或基因起始位点下游最多1,000,000个碱基对处。增强子可以位于内含子区域内，或无关基因的外显子区中。
启动子可以被说成驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其转录。短语“操作性地连接”、“操作性地定位”、“操作性地连接”，“在控制下”和“在转录控制下”指示启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和/或取向，以控制该序列的转录启动和/或表达。如本文所用，“反向启动子”是指其中核酸序列处于相反的取向，使得编码链现在成为非编码链的启动子，并且反之亦然。反向启动子序列可以在各种实施方案中用于调节开关的状态。另外，在各种实施方案中，启动子可以与增强子结合使用。
启动子可以是与基因或序列天然相关联的启动子，如可以通过分离位于编码节段上游的5'非编码序列和/或给定基因或序列的外显子所获得。此类启动子可以称为“内源性的”。类似地，根据一些实施方案，增强子可以是与核酸序列天然相关联的增强子，位于该序列的下游或上游。
根据一些实施方案，编码核酸节段定位在“重组启动子”或“异源启动子”的控制下，该启动子均指在其天然环境中通常不与其操作性地连接的编码核酸序列相关联的启动子。重组或异源增强子是指在天然环境中正常不与给定核酸序列相关联的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子；从任何其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子；以及非“天然存在”(即包含不同转录调节区域的不同元件和/或通过本领域已知的遗传工程方法改变表达的突变)的合成启动子或增强子。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以结合本文公开的合成生物回路和模块，使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCR，来产生启动子序列(参见例如美国专利第4,683,202号、美国专利第5,928,906号，各自以引用的方式并入本文)。此外，预期也可以采用指导序列在例如，线粒体、叶绿体等非核细胞器内的转录和/或表达的控制序列。
如本文所描述的，“诱导型启动子”是特征在于当存在诱导物或诱导剂或受其影响或被其接触时，启动或增强转录活性的启动子。如本文所定义的“诱导物”或“诱导剂”可以是内源性的，或是以能够从诱寻型启动子诱导转录活性的方式施用的通常外源性的化合物或蛋白。根据一些实施方案，诱导物或诱导剂，即化学物质、化合物或蛋白，本身可以是核酸序列转录或表达的结果(即诱导物可以是由另一组分或模块表达的诱导蛋白)，转录或表达本身可以处于诱导型启动子的控制下。根据一些实施方案，诱导型启动子是在不存在某些药剂，诸如阻遏子的情况下被诱导的。诱导型启动子的示例包括但不限于四环素、金属硫蛋白、蜕皮素、哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；以及小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR))和其他类固醇反应性启动子、雷帕霉素反应性启动子等。
本文可互换使用的术语“DNA调节序列”、“控制元件”和“调节元件”是指提供和/或调节非编码序列(例如靶向DNA的RNA)或编码序列(例如定点修饰多肽或Cas9/Csn1多肽)的转录和/或调节所编码多肽的转译的转录和转译控制序列，诸如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号等。
如本文所使用，术语“开放阅读框(ORF)”意在指可以转译到肽或蛋白质中的几个核苷酸三联体的序列。开放阅读框优选地在其5’端和通常展现3的倍数的核苷酸的长度的后续区域处含有起始密码子，即通常编码氨基酸甲硫氨酸(ATG)的三个后续核苷酸的组合。ORF优选地通过终止密码子(例如TAA、TAG、TGA)终止。通常，这是开放阅读框的唯一终止密码子。因此，在本公开的上下文中，开放阅读框优选地为由可以除以三的多个核苷酸组成、以起始密码子(例如ATG)开始并且优选地以终止密码子(例如，TAA、TGA或TAG)终止的核苷酸序列。开放阅读框可以被分离，或其可以例如在如本文所描述的ceDNA载体中并入较长的核酸序列中。
“操作性地连接”是指一种并置，其中所描述的组分处于允许它们以预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么该启动子操作性地连接到所述编码序列。“表达盒”包括可操作地连接到启动子或足以引导转基因在ceDNA载体中的转录的其它调节序列的DNA序列。合适的启动子包括例如，组织特异性启动子。启动子也可以是AAV起源的。
如本文所使用，术语“受试者”是指向其提供用本公开的ceDNA载体进行的治疗，包括预防性治疗的人类或动物。如本文所用，术语“受试者”包括人和其他动物。通常，受试者是人。例如，受试者可以是成人、青少年、儿童(2岁至14岁)、婴儿(出生至2岁)或新生儿(至多2个月)。在特定方面，受试者为至多4个月大，或至多6个月大。根据一些方面，成人是约65岁或更老，或约60岁或更老的老年人。根据一些方面，受试者是孕妇或打算怀孕的女性。在其他方面，受试者不是人；例如非人灵长类动物；诸如狒狒、黑猩猩、大猩猩或猕猴。在某些方面，受试者可以是宠物，诸如狗或猫。
如本文所用，术语“宿主细胞”包括易于被本公开的核酸构建体或ceDNA表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。作为非限制性示例，宿主细胞可以是分离的原代细胞、多能干细胞、CD34+细胞、诱导的多能干细胞或许多永生化细胞系(例如HepG2细胞)中的任何一种。可替代地，宿主细胞可以是组织、器官或生物体中的原位或体内细胞。
术语“外源”是指存在于细胞中而非其天然来源的物质。当在本文中使用时，术语“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入诸如细胞或生物体的生物系统中的核酸(例如，编码多肽的核酸)或多肽，通常在该细胞或生物体中未发现该核酸或多肽，并且希望将该核酸或多肽引入此类细胞或生物体中。可替代地，“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入如细胞或生物体的生物系统中的核酸或多肽，在该细胞或生物体中发现核酸或多肽的量相对较低，并且希望增加细胞或生物体中核酸或多肽的量，例如，以产生异位表达或水平。相比之下，术语“内源”是指生物系统或细胞天然存在的物质。
术语“序列同一性”是指两个核苷酸序列之间的相关性。出于本公开的目的，使用如在EMBOSS软件包的Needle程序(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人，2000，同上)，优选版本3.0.0或更高版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度。使用的可选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，并如下计算：(相同的脱氧核糖核苷酸乘以100)/(比对长度-比对空位总数)。比对的长度优选为至少10个核苷酸、优选为至少25个核苷酸、更优选为至少50个核苷酸并且最优选为至少100个核苷酸。
如本文所用，术语“同源性”或“同源”被定义为，在比对序列且必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后，与靶染色体上的相应序列中的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。出于确定核苷酸序列同源性百分比的比对可以用所属技术领域中内的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ClustalW2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域的技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。根据一些实施方案，当同源臂的例如核酸序列(例如DNA序列)与宿主细胞的对应原生或未经编辑的核酸序列(例如基因组序列)具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多同一性时，该序列被视为“同源”。
如本文所用，术语“异源”意指分别在天然核酸或蛋白中未发现的核苷酸或多肽序列。异源核酸序列可以与天然存在的核酸序列(或其变异体)连接(例如通过基因工程)以生成编码嵌合多肽的嵌合核苷酸序列。异源核酸序列可以连接到变异多肽(例如通过基因工程改造)以产生编码融合变异多肽的核酸序列。或者，术语“异源”可以指不天然存在于细胞或受试者中的核酸序列。
“载体”或“表达载体”为可以与另一DNA节段，即“插入片段”附接以便使所附接的节段在细胞中复制的复制子，诸如质粒、杆粒、噬菌体、病毒、病毒粒子或粘质体。载体可以是设计用于递送到宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体在起源和/或最终形式上可以是病毒或非病毒的，但是出于本公开的目的，“载体”通常是指ceDNA载体，如本文所用。术语“载体”涵盖与适当的控制元件相关联时能够复制并且可以将基因序列转移至细胞的任何遗传元件。根据一些实施方案，载体可以是表达载体或重组载体。
如本文所用，术语“表达载体”是指引导RNA或多肽从与载体上的转录调节序列连接的序列的表达的载体。表达的序列通常但不一定与细胞异源。表达载体可以包括其它元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而使其可以在两种生物体中维持，例如，在人类细胞中进行表达，以及在原核宿主中进行克隆和扩增。术语“表达”是指涉及产生RNA和蛋白以及适当时分泌蛋白的细胞过程，在适用时包括但不限于例如转录、转录物加工、转译和蛋白折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过转译从基因转录的mRNA所获得的多肽。术语“基因”意指当与适当的调节序列可操作地连接时在体外或在体内转录为RNA的核酸序列(DNA)。基因可以包括或可以不包括编码区前后的区域，例如5'非转译(5'UTR)或“前导”序列和3'UTR或“尾区”序列，以及单个编码节段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
“重组载体”意指包括能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应了解，根据一些实施方案，本文所述的载体可以与其他合适的组合物和疗法组合。根据一些实施方案，载体是游离型的。合适的游离型载体的使用提供了一种以高拷贝数的染色体外DNA维持受试者中的所关注的核苷酸，从而消除染色体整合的潜在影响的方式。
如本文所使用，术语“施用(administration/administering)”和其变型是指将组合物或药剂(例如本文所描述的ceDNA)引入受试者中并且包括同时和依序引入一种或多种组合物或药剂。“施用”可以指例如，治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂以及实验方法。“施用”还涵盖体外和离体治疗。将组合物或药剂引入受试者中是通过任何适合的途径，包括经口、经肺、经鼻、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、经直肠、淋巴内、瘤内或局部。施用包括自我施用和由另一个人施用。可以通过任何适合的途径进行施用。适合的施用途径使得组合物或药剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或药剂引入受试者的静脉中来施用组合物。
如本文所用，术语“感染”是指病原体最初进入宿主；以及病原体已在宿主细胞或组织中或上建立的病状；此类病状不一定构成或导致疾病。
如本文所用，术语“生物样品”是指从受试者分离的任何类型的生物来源材料，包括例如DNA、RNA、脂质、碳水化合物和蛋白质。术语“生物样品”包括从受试者分离的组织、细胞和生物流体。生物样品包括例如但不限于全血、血浆、血清、精液、唾液、泪液、尿液、粪便、汗液、颊面、皮肤、脑脊液、骨髓、胆汁、毛发、肌肉活组织检查、器官组织或本领域普通技术人员已知的其他生物来源材料。生物样品可以从受试者获得用于诊断或研究，或者可以从健康受试者获得，作为对照或用于基础研究。如本文所用，术语“剂量”是指一次服用或施用于受试者的物质(例如，如本文所述的ceDNA)的量。
如本文所用，术语“给药”是指施用物质(例如，如本文所述的ceDNA)以实现治疗性目的(例如，治疗)。
短语“第一药剂与第二药剂的组合”中的术语“组合”包括第一药剂和第二药剂的共同施用，其例如可以溶解或混合在相同的药学上可接受的载剂中，或者施用第一药剂，随后施用第二药剂，或者施用第二药剂，随后施用第一药剂。因此，本公开包括组合治疗性治疗的方法和组合药物组合物。
短语“伴随治疗性治疗”中的术语“伴随”包括在第二药剂的存在下施用药剂。伴随治疗性治疗方法包括其中共同施用第一药剂、第二药剂、第三药剂或另外的药剂的方法。伴随治疗性治疗方法还包括其中在第二药剂或另外的药剂的存在下施用第一药剂或另外的药剂的方法，其中第二药剂或另外的药剂例如可以先前已经施用。伴随治疗性治疗方法可以由不同的参与者逐步执行。例如，一名参与者可以向受试者施用第一药剂并且第二参与者可以向受试者施用第二药剂，并且施用步骤可以同时，或几乎同时，或在分开的时间执行，只要第一药剂(和另外的药剂)在第二药剂(和另外的药剂)的存在下在施用之后即可。参与者和受试者可以是同一实体(例如，人)。
如本文所用，术语“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗物质，例如，如本文所述的抗原或免疫原性蛋白以及另一种药物。其他药物可以与如本文所述的抗原或免疫原性蛋白的施用同时、在其之前或在其之后施用。
如本文所用，短语“核酸治疗性”、“治疗性核酸”和“TNA”可互换地使用，并且是指使用核酸作为治疗疾病或病症的治疗剂的活性组分的治疗的任何模态。如本文所用，这些短语是指基于RNA的治疗剂和基于DNA的治疗剂。基于RNA的治疗剂的非限制性示例包含mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)。基于DNA的治疗剂的非限制性示例包含小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、末端封闭式线性双螺旋DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、doggyboneTMDNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、非病毒迷你串DNA载体(线性-共价封闭的DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。根据一些实施方案，治疗性核酸为ceDNA。
如本文所用，术语“治疗效果”是指治疗的结果，其结果被判定为合乎需要并且有益的。治疗效果可以直接或间接地包括疾病表现的遏制、减少或消除。治疗效果还可以直接或间接地包括疾病表现的进展的遏制减少或消除。
对于本文所描述的任何治疗剂，治疗有效量可以初始地根据初步的体外研究和/或动物模型来确定。治疗有效剂量也可以根据人数据来确定。可以基于相对生物利用度和施用的化合物的效力调节施用剂量。基于上述方法和其他熟知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。下文总结了用于测定治疗有效性的一般原理，其可以在Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，第10版，McGraw-Hill(纽约)(2001)的第1章中找到，该文献以引用的方式并入本文中。
药代动力学原理为修改剂量方案以获得期望程度的治疗功效并且具有最小的不可接受的副作用提供了基础。在可以测量药物的血浆浓度并且与治疗窗口有关的情况下，可以获得针对剂量修改的另外的指导。
如本文所用，“病毒感染”意指病毒在受试者体内的入侵和增殖。
如本文所用，术语“治疗”意指(i)如传统疫苗中的感染或再感染的预防，(ii)症状的减轻或消除，以及(iii)所考虑的病原体的基本或完全消除。治疗可以是预防性作用的(感染前)或治疗性作用的(感染后)。治疗还可指完成以下一项或多项：(a)降低病症的严重程度；(b)限制所治疗病症的特征性症状的恶化；(c)限制病症在先前已患该病症的患者中的复发；以及(d)限制先前对于病症无症状的患者的症状复发。
有益或所需的临床结果，诸如药理学和/或生理学作用，包括(但不限于)：预防可能易患有疾病、病患或病症但尚未经历或展现疾病的症状的受试者出现该疾病、病患或病症(防治性治疗)；缓解该疾病、病患或病症的症状；减轻该疾病、病患或病症的程度；稳定该疾病、病患或病症(即，不恶化)；预防该疾病、病患或病症的扩散；延迟或减缓该疾病、病患或病症进展；改善或缓和该疾病、病患或病症；以及其组合，以及与如果不接受治疗所预期的存活期相比，延长存活期。
如本文所用，术语“接种”意指用疫苗治疗。
如本文所用，术语“疫苗接种”意指用疫苗治疗。
如本文所用，术语“疫苗”是指一种制剂，其为能够被施用于脊椎动物的形式并且诱导保护性免疫应答，该保护性免疫应答足以诱导免疫和/或预防和/或改善感染和/或减轻感染的至少一种症状和/或增强另一剂量制剂的功效。通常，疫苗包含常规盐水或缓冲水溶液介质，本公开的组合物悬浮或溶解于其中。在这种形式中，本公开的组合物可便利地用于预防、改善或以其他方式治疗病毒感染。引入宿主后，疫苗能够激发免疫应答，包括但不限于抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突状细胞的活化和/或其他细胞应答。
如本文所用，术语“疫苗疗法”意指使用一种物质或一组物质刺激免疫系统以破坏肿瘤或感染性微生物的一类治疗。
那些“需要治疗的”包括已经患有疾病或病症、感染或癌症的哺乳动物，诸如人。
如本文所用，术语“增加”、“增强”、“提高”(以及类似术语)通常是指相对于自然条件、预期条件或平均条件、或者相对于对照条件直接地或间接地增加浓度、水平、功能、活性或行为的作用。
如本文所用，术语“遏制”、“减少”、“干扰”、“抑制”和/或“降低”(以及类似术语)通常是指直接或间接地降低相对于自然条件、预期条件或平均条件，或相对控制条件的浓度、水平、功能、活动或行为的行为。
如本文所使用，“对照”意在指参考标准物。根据一些实施方案，对照为从健康患者获得的阴性对照样品。在其它实施方案中，对照为从诊断患有疾病或病症、感染或癌症的患者获得的阳性对照样品。在又其它实施方案中，对照为历史对照或标准参考值或值范围(诸如先前测试的对照样品，或一组代表基线或正常值的样品)。测试样品与对照之间的差异可以为增加或相反地减少。差异可以为定性差异或定量差异，例如统计学上显著的差异。根据一些示例，差异为相对于对照增加或减少至少约5％，诸如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约500％或大于500％。
如本文所使用的，术语“包括(comprising/comprises)”在提及组合物、方法以及对该方法或组合物来说必不可少的其相应组分时使用，但对于包括未指明的要素，无论是否必要，仍然是开放的。
如本文所使用的，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需要的那些要素。该术语允许存在不实质影响该实施方案的一个或多个基本和新颖或功能性特征的要素。“包含”的使用表示包含而不是限制。
术语“由……组成”是指如本文所描述的组合物、方法和其相应组分，其排除在该实施方案的描述中未叙述的任何要素。
如本说明书和所附权利要求书所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一种/一个(a/an)”和“所述”包含多个提及物。因此，举例来说，提及“所述方法”包括一种或多种本文所描述的类型的方法和/或步骤，且/或在阅读本公开后，其将对于本领域的技术人员而言变得显而易见，等等。类似地，除非上下文另有明确规定，否则单词“或”旨在包含“和”。尽管与本文所描述的方法和材料相似或等效的那些方法和材料可以用于实施或测试本公开，但在下文描述适合的方法和材料。缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁文exempligratia，并且在本文中用以指示非限制性示例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(forexample)”同义。
除了在操作示例中或在另外指示的情况下，本文所使用的表示成分或反应条件的量的所有数字都应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。术语“约”在结合百分比使用时，可以意指±1％。以下实施例进一步详细解释本公开，但本公开的范围不应限于此。
本文所公开的本公开的替代性要素或实施方案的分组不解释为限制。每个组成员可以单独提及和要求，或呈与该组的其它成员或此处找到的其它要素的任何组合提及和要求。出于方便和/或可专利性的原因，一个组中的一个或多个成员可以包括在一个组中或从中删除。当发生任何这样的包括或删除时，在本文中认为说明书含有修改的组，从而满足所附权利要求书中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。
其它术语在本文中限定于本公开的各个方面的描述内。
本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的次序呈现，但是另选的实施方案可以以不同的次序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开的教导可以适当地应用于其他程序或方法。本文描述的各种实施方案可以进行组合以提供其他实施方案。如果需要，可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开的又一实施方案。而且，由于生物学功能等效性的考虑，可以在不影响生物学或化学作用的种类或数量的情况下对蛋白结构进行一些改变。可以根据详细描述对本公开进行这些和其他改变。意图所有这些修改包括在所附权利要求书的范围内。
任何前述实施方案的特定要素都可以进行组合或替代其他实施方案中的要素。此外，尽管已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可以表现出这样的优点，并且并非所有实施方案都需要为了落入本公开的范围内而表现出这样的优点。
通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，这些实施例决不应解释为进一步限制。应理解，本公开不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而无意于限制本公开的范围，本公开的范围仅由权利要求书限定。
II.免疫系统的细胞
存在构成免疫系统的大量细胞相互作用。这些相互作用通过在两个方向上发信号的特异性受体-配体对发生，使得每个细胞接收基于那些信号的时间和空间分布的指令。
鼠模型在发现免疫调节途径方面非常有用，但这些途径的临床效用并不总是从近交小鼠品系转化为远系繁殖的人类群体，因为远系繁殖的人类群体可能具有不同程度地依赖于个体免疫调节途径的个体。
免疫系统的细胞包括淋巴细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突状细胞、密切相关的朗格汉斯细胞、天然杀伤(NK)细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和髓系细胞的其他成员。此外，一系列特化的上皮和基质细胞通常通过分泌调节免疫系统细胞的生长和/或基因活化的关键因子来提供发生免疫的解剖环境，所述关键因子也在应答的诱导和效应阶段起直接作用。(Paul,W.E.,“第1章：The immune system:an introduction,”Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑，Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999)，第102页)。
免疫系统的细胞存在于周围有组织的组织中，诸如脾、淋巴结、肠的Peyer氏板和扁桃体。淋巴细胞还存在于中枢淋巴器官、胸腺和骨髓中，在此它们经历发育步骤，使它们介导成熟免疫系统的多种应答。淋巴细胞和巨噬细胞的主要部分包括存在于血液和淋巴中的细胞再循环库，从而提供将免疫活性细胞递送至需要它们的位点并使局部产生的免疫得以全身化的手段。(Paul,W.E.,“第1章：The immune system:an introduction,”Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑，Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999)，第102页)。
术语“淋巴细胞”是指在全身的淋巴组织中形成的小白细胞，并且在正常成人中占循环血液中白细胞总数的约22％-28％，其在身体防御疾病方面起重要作用。单个淋巴细胞是特化的，因为它们通过其遗传物质的重组(例如，形成T细胞受体和B细胞受体)而定向应答一组有限的结构相关抗原。这种在免疫系统与给定抗原第一次接触之前存在的定向是通过对淋巴细胞表面膜上的抗原决定簇(表位)具有特异性的受体的存在来表达的。每个淋巴细胞具有独特的受体群体，所有这些受体具有相同的结合位点。淋巴细胞的一个集合或克隆在其受体的结合区域的结构上与另一个克隆不同，因此其可识别的表位也不同。淋巴细胞不仅在其受体的特异性上彼此不同，而且在其功能上也彼此不同。(Paul,W.E.,“第1章：The immune system:an introduction,”Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑，Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999)，第102页)。
识别出两大类淋巴细胞：作为抗体分泌细胞前体的B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。
B淋巴细胞
B淋巴细胞来源于骨髓的造血细胞。成熟B细胞可用表达被其细胞表面识别的表位的抗原活化。活化过程可以是直接的，依赖于膜Ig分子通过抗原的交联(交联依赖性B细胞活化)，或者是间接的，在称为同源辅助的过程中经由与辅助T细胞的相互作用。在许多生理情况下，受体交联刺激和同源辅助协同产生更强烈的B细胞应答(Paul,W.E.,“第1章：Theimmune system:an introduction,”Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
交联依赖性B细胞活化需要抗原表达与细胞表面受体的结合位点互补的表位的多个拷贝，因为每个B细胞表达具有相同可变区的Ig分子。具有重复表位的其他抗原诸如微生物的荚膜多糖或病毒包膜蛋白满足了这种要求。交联依赖性B细胞活化是针对这些微生物的主要保护性免疫应答(Paul,W.E.,“第1章：The immune system:an introduction”,Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
同源辅助允许B细胞发动针对不能交联受体的抗原的应答，并且同时提供共刺激信号，当B细胞被弱交联事件刺激时，所述共刺激信号拯救B细胞，使其免于失活。同源辅助依赖于B细胞的膜免疫球蛋白(Ig)对抗原的结合、抗原的胞吞作用及其在细胞的内体/溶酶体区室内片段化成肽。将一些所得的肽装载到称为II类主要组织相容性复合体(MHC)分子的一组特化细胞表面蛋白的沟槽中。所得的II类/肽复合物在细胞表面表达，并且用作一组称为CD4+T细胞的T细胞的抗原特异性受体的配体。CD4+T细胞在其表面上具有对B细胞的II类/肽复合物具有特异性的受体。B细胞活化不仅取决于T细胞通过其T细胞受体(TCR)的结合，而且这种相互作用还允许T细胞上的活化配体(CD40配体)结合B细胞上的其受体(CD40)，从而发信号通知B细胞活化。此外，T辅助细胞分泌若干种细胞因子，其通过结合B细胞上的细胞因子受体来调节受刺激的B细胞的生长和分化(Paul,W.E.,“第1章：The immunesystem:an introduction,“Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
在抗体产生的同源辅助期间，CD40配体在活化的CD4+T辅助细胞上瞬时表达，并且它结合抗原特异性B细胞上的CD40，从而转导第二共刺激信号。后一信号对于B细胞生长和分化以及通过防止已遇到抗原的生发中心B细胞的凋亡而生成记忆B细胞是必需的。CD40配体在B细胞和T细胞中的超表达与人SLE患者的致病性自身抗体产生有关(Desai-Mehta,A.等人，“Hyperexpression of CD40 ligand by B and T cells in human lupus and itsrole in pathogenic autoantibody production,”J.Clin.Invest.第97卷(9),2063-2073,(1996))。
T淋巴细胞
来源于造血组织中的前体的T淋巴细胞在胸腺中经历分化，然后被接种到外周淋巴组织和淋巴细胞再循环库中。T淋巴细胞或T细胞介导广泛的免疫功能。这些包括帮助B细胞发育成产生抗体的细胞的能力、增加单核细胞/巨噬细胞的杀微生物作用的能力、抑制某些类型的免疫应答、直接杀死靶细胞和动员炎症应答。这些作用取决于特定细胞表面分子的T细胞表达和细胞因子的分泌(Paul,W.E.,“第1章：The immune system:anintroduction”,Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑,Lippicott-RavenPublishers,Philadelphia,(1999))。
T细胞在其抗原识别机制上不同于B细胞。免疫球蛋白、B细胞受体结合可溶性分子上或颗粒表面上的单个表位。B细胞受体发现在天然分子表面上表达的表位。抗体和B细胞受体进化为结合并防御细胞外液中的微生物，而T细胞识别其他细胞表面上的抗原并通过与这些抗原呈递细胞(APC)相互作用并改变它们的行为来介导它们的功能。外周淋巴器官中有三种主要类型的APC可活化T细胞：树突状细胞、巨噬细胞和B细胞。这些细胞中最有效的是树突状细胞，其唯一的功能是向T细胞呈递外来抗原。未成熟树突状细胞位于全身的组织中，包括皮肤、肠道和呼吸道。当它们在这些部位遇到入侵微生物时，它们会内吞病原体及其产物，并且经由淋巴将它们携带至局部淋巴结或肠道相关淋巴器官。遇到病原体会诱导树突状细胞从抗原捕获细胞成熟为可活化T细胞的APC。APC在其表面上展示三类蛋白分子，所述蛋白分子在活化T细胞以变成效应细胞中起作用：(1)MHC蛋白，其向T细胞受体呈递外来抗原；(2)共刺激蛋白，其结合T细胞表面上的互补受体；以及(3)细胞间粘附分子，其使得T细胞能够结合APC足够长的时间以被活化(“第24章：The adaptive immune system,”Molecular Biology of the Cell,Alberts,B.等人，Garland Science,NY,(2002))。
T细胞基于其表达的细胞表面受体被细分为两个不同的类别。大多数T细胞表达由α链和β链组成的T细胞受体(TCR)。一小组T细胞表达由γ链和δ链组成的受体。在α/βT细胞中有两个亚谱系：表达共受体分子CD4的那些(CD4+T细胞)；以及表达CD8的那些(CD8+T细胞)。这些细胞在它们如何识别抗原以及它们的效应和调节功能方面有所不同。
CD4+T细胞是免疫系统的主要调节细胞。它们的调节功能取决于它们的细胞表面分子的表达，诸如当T细胞被活化时其表达被诱导的CD40配体，以及当被活化时它们分泌的大量细胞因子。
T细胞还介导重要的效应子功能，其中一些由它们分泌的细胞因子的模式决定。细胞因子可以对靶细胞具有直接毒性，并且可调动有效的炎性机制。
此外，T细胞、具体地CD8+T细胞可发育成能够有效裂解靶细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，所述靶细胞表达被CTL识别的抗原(Paul,W.E.,“第1章：The immune system:anintroduction,”Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑,Lippicott-RavenPublishers,Philadelphia,(1999))。
T细胞受体(TCR)识别由肽组成的复合物，所述肽通过与II类或I类MHC蛋白的特化沟槽结合的抗原的蛋白水解而衍生。CD4+T细胞仅识别肽/II类复合物，而CD8+T细胞识别肽/I类复合物(Paul,W.E.,“第1章：The immune system:an introduction,”FundamentalImmunology，第4版，Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
TCR的配体(即，肽/MHC蛋白复合物)在APC内形成。一般来讲，II类MHC分子结合来源于已通过内吞过程被APC摄取的蛋白质的肽。然后这些肽负载的II类分子在细胞表面上表达，在此它们可被具有能够识别表达的细胞表面复合物的TCR的CD4+T细胞结合。因此，CD4+T细胞专门与来源于细胞外来源的抗原反应(Paul,W.E.,“第1章：The immune system:an introduction,”Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑,Lippicott-RavenPublishers,Philadelphia,(1999))。
相比之下，I类MHC分子主要负载来源于内部合成的蛋白质(诸如病毒蛋白质)的肽。这些肽是通过蛋白体的蛋白水解由胞质蛋白产生的，并且被易位到糙面内质网中。这些肽通常由九个氨基酸长组成，被结合到I类MHC分子中并且被带到细胞表面，在此它们可以被表达适当受体的CD8+T细胞识别。这使得T细胞系统、具体地CD8+T细胞能够检测表达不同于生物体其余细胞的那些(例如，病毒抗原)或突变抗原(诸如活性致癌基因产物)的蛋白质的细胞，或以比其大得多的量产生蛋白质的细胞，即使这些蛋白质以其完整形式既不在细胞表面表达也不分泌(Paul,W.E.,“第1章：The immune system:an introduction,”Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
T细胞也可基于其以下功能进行分类：作为辅助T细胞；参与诱导细胞免疫的T细胞；抑制性T细胞；细胞毒性T细胞。
辅助T细胞
辅助T细胞是刺激B细胞对蛋白质和其他T细胞依赖性抗原产生抗体应答的T细胞。T细胞依赖性抗原是这样的免疫原，其中单个表位仅出现一次或出现有限次数，使得它们不能与B细胞的膜免疫球蛋白(Ig)交联或低效地交联。B细胞通过其膜Ig结合抗原，并且复合物经历内吞作用。在内体和溶酶体区室内，抗原通过蛋白水解酶被片段化成肽，并且一种或多种所生成的肽被加载到II类MHC分子中，所述II类MHC分子通过该囊泡区室运输。然后将所得的肽/II类MHC复合物输出到B细胞表面膜。具有对肽/II类分子复合物具有特异性的受体的T细胞在B细胞表面识别该复合物。(Paul,W.E.,“第1章：The immune system:anintroduction,”Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑，Lippicott-RavenPublishers,Philadelphia(1999))。
B细胞活化取决于T细胞通过其TCR的结合以及T细胞CD40配体(CD40L)与B细胞上的CD40的相互作用。T细胞不组成性表达CD40L。相反，作为与表达由T细胞的TCR识别的同源抗原和CD80或CD86两者的APC相互作用的结果，诱导CD40L表达。CD80/CD86通常由活化但非静息的B细胞表达，使得涉及活化B细胞和T细胞的辅助相互作用可导致有效的抗体产生。然而，在许多情况下，T细胞上CD40L的初始诱导依赖于它们对组成型表达CD80/86的APC(诸如树突状细胞)表面上的抗原的识别。然后这种活化的辅助T细胞可以有效地与B细胞相互作用并辅助B细胞。膜Ig在B细胞上的交联即使效率低下，也可以与CD40L/CD40相互作用协同产生强烈的B细胞活化。B细胞应答中的后续事件，包括增殖、Ig分泌和所表达的Ig类别的类别转换，取决于T细胞衍生的细胞因子的作用或被其增强(Paul,W.E.,“第1章：The immunesystem:an introduction,”Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
CD4+T细胞倾向于分化成主要分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-6和IL-10的细胞(TH2细胞)或分化成主要产生IL-2、IFN-γ和淋巴毒素的细胞(TH1细胞)。TH2细胞在辅助B细胞发育成产生抗体的细胞方面非常有效，而TH1细胞是细胞免疫应答的有效诱导物，涉及单核细胞和巨噬细胞的杀微生物活性的增强，以及因此在细胞内囊泡区室中裂解微生物的效率增加。尽管具有TH2细胞表型的CD4+T细胞(即，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)是有效的辅助细胞，但TH1细胞也具有作为辅助细胞的能力(Paul,W.E.,“第1章：The immune system:anintroduction,“Fundamental Immunology，第4版，Paul,W.E.编辑,Lippicott-RavenPublishers,Philadelphia,(1999))。
T细胞参与细胞免疫诱导
T细胞还可用于增强单核细胞和巨噬细胞破坏细胞内微生物的能力。具体地，由辅助T细胞产生的干扰素γ(IFN-γ)增强了单核吞噬细胞破坏细胞内细菌和寄生性的若干种机制，包括氧化氮的生成和肿瘤坏死因子(TNF)产生的诱导。TH1细胞能够有效增强杀微生物作用，因为其产生IFN-γ。相比之下，由TH2细胞产生的两种主要细胞因子IL-4和IL-10阻断这些活性(Paul,W.E.,“第1章：The immune system:an introduction,”FundamentalImmunology，第4版，Paul,W.E.编辑,Lippicott-Raven Publishers,Philadelphia,(1999))。
调节性T(Treg)细胞
免疫稳态通过免疫应答的起始和下调之间的受控平衡来维持。凋亡和T细胞无反应性的机制(一种耐受机制，其中T细胞在遇到抗原后被内在地功能性灭活(Scwartz,R.H.,“T cell anergy”,Annu.Rev.Immunol.，第21卷：305-334(2003))有助于免疫应答的下调。第三种机制是通过抑制性或调节性CD4+T(Treg)细胞对活化T细胞的主动抑制作用提供的(综述于Kronenberg,M.等人，“Regulation of immunity by self-reactive T cells”,Nature，第435卷：598-604(2005)中)。组成型表达IL-2受体α(IL-2Rα)链的CD4+Treg(CD4+CD25+)是天然存在的T细胞亚组，其是无反应性的和抑制性的(Taams,L.S.等人，“Humananergic/suppressive CD4+CD25+T cells:a highly differentiated and apoptosis-prone population”,Eur.J.Immunol.第31卷：1122-1131(2001))。CD4+CD25+Treg的耗尽导致小鼠的系统性自身免疫疾病。此外，这些Treg的转移防止自身免疫疾病的发展。与它们的鼠对应物类似，人CD4+CD25+Treg在胸腺内生成，并且其特征在于能够通过细胞间接触依赖性机制抑制应答T细胞增殖、不能产生IL-2和体外无反应性的表型。根据CD25表达水平，可将人CD4+CD25+T细胞分成抑制性(CD25高)和非抑制性(CD25低)细胞。叉头转录因子家族的成员FOXP3已被证明在鼠和人CD4+CD25+Treg中表达，并且似乎是控制CD4+CD25+Treg发育的主基因(Battaglia,M.等人，“Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+Foxp3+regulator T cells of both healthy subjects and type 1diabeticpatients”,J.Immunol.，第177卷：8338-8347,(2006))。
细胞毒性T淋巴细胞
识别来自靶细胞内产生的蛋白质的肽的CD8+T细胞具有细胞毒性，因为其导致靶细胞的裂解。CTL诱导的裂解的机制涉及CTL产生穿孔素，该穿孔素是一种可插入靶细胞膜并促进该细胞裂解的分子。穿孔素介导的裂解被颗粒酶增强，该颗粒酶是由活化的CTL产生的一系列酶。许多活性CTL也在其表面表达大量fas配体。CTL表面上的fas配体与靶细胞表面上的fas的相互作用引发靶细胞的凋亡，导致这些细胞死亡。CTL介导的裂解似乎是破坏病毒感染细胞的主要机制。
淋巴细胞活化
术语“活化”或“淋巴细胞活化”是指通过特异性抗原、非特异性促细胞分裂剂或同种异体细胞刺激淋巴细胞，从而导致RNA、蛋白质和DNA的合成和淋巴因子的产生；随后是各种效应细胞和记忆细胞的增殖和分化。T细胞活化依赖于TCR/CD3复合物与其同源配体(结合在I类或II类MHC分子的沟槽中的肽)的相互作用。通过受体接合而启动的分子事件是复杂的。最早的步骤似乎是酪氨酸激酶的活化，导致一组控制若干种信号传导途径的底物的酪氨酸磷酸化。这些包括将TCR连接至ras途径的一组衔接蛋白、磷脂酶Cγ1(其酪氨酸磷酸化增加其催化活性并参与肌醇磷脂代谢途径，导致细胞内游离钙浓度的升高和蛋白激酶C的活化)以及控制细胞生长和分化的一系列其他酶。除受体结合之外，T细胞的完全响应性还需要辅助细胞递送的共同刺激活性，例如，T细胞上的CD28与APC上的CD80和/或CD86的接合。
T记忆细胞
在通过适应性免疫应答识别和根除病原体后，绝大多数(90％-95％)T细胞经历凋亡，剩余的细胞形成记忆T细胞库，命名为中枢记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)和驻留记忆T细胞(TRM)(Clark,R.A.,“Resident memory T cells in human health anddisease”,Sci.Transl.Med.,7,269rv1,(2015))。CD45RA在初始T细胞以及CD4和CD8中的效应细胞上表达。在抗原经历后，中枢和效应记忆T细胞获得CD45RO的表达并且丢失CD45RA的表达。因此，CD45RA或CD45RO通常用于区分初始群体与记忆群体。CCR7和CD62L是可用于区分中枢记忆T细胞和效应记忆T细胞的两种其他标志物。初始和中枢记忆细胞表达CCR7和CD62L，以便迁移至次级淋巴器官。因此，初始T细胞是CD45RA+CD45RO-CCR7+CD62L+，中枢记忆T细胞是CD45RA-CD45RO+CCR7+CD62L+，并且效应记忆T细胞是CD45RA-CD45RO+CCR7-CD62L-。
与标准T细胞相比，这些记忆T细胞是长寿命的且具有不同的表型，诸如表达特异性表面标志物、快速产生不同的细胞因子谱、直接细胞功能的能力和独特的归巢分布模式。记忆T细胞在再次暴露于其相应的抗原后表现出快速反应，以便消除“冒犯者”的再次感染，从而快速恢复免疫系统的平衡。越来越多的证据证实，自体免疫记忆T细胞阻碍了对于治疗或治愈自体免疫疾病的大多数尝试(Clark,R.A.,“Resident memory T cells in humanhealth and disease”,Sci.Transl.Med.，第7卷，269rv1,(2015))。
III.来自ceDNA载体的抗原或免疫原性肽的表达
本文所述的技术大体上涉及抗原或免疫原性肽通过一个或多个非病毒DNA载体(例如，如本文所述的ceDNA载体)在细胞中的表达和/或产生。用于表达抗原或免疫原性肽抗原的ceDNA载体描述于本文中的标题为“通用ceDNA载体”的章节中。如先前所论述，ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优势是，编码抗原或免疫原性肽的一个或多个核酸序列不存在大小约束。本领域技术人员将理解，基于本文提供的公开内容，一旦拥有本文提供的教导内容，许多抗原或免疫原性肽(即，免疫调节分子)可用于产生几乎无限种类的ceDNA载体。
在具体实施方案中，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体包含一对ITR(例如，对称或不对称的，如本文所述)以及介于所述ITR对之间的如本文所述的编码抗原或免疫原性肽的核酸，所述核酸操作性地连接到启动子或调节序列。用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体相对于传统AAV载体和甚至慢病毒载体的独特优点是对编码所需抗原或免疫原性肽的核酸序列不存在大小约束。
正如将了解的那样，本文所述的ceDNA载体技术可以适于任何复杂程度或可以模块化方式使用，其中可以独立方式控制ceDNA载体的不同组分的表达。本文特别涵盖以下实施方案且本领域的技术人员能够按需要对其进行调适。
根据一些方面，本公开提供了一个或多个ceDNA载体，其包含一个或多个编码抗原或免疫原性肽的核酸序列。根据一些实施方案，所述一个或多个核酸序列编码来自多种病原体的一种或多种抗原或免疫原性肽，所述病原体包括例如细菌、病毒、真菌和寄生虫感染因子。根据一些实施方案，所述一个或多个核酸序列编码一种或多种抗原或免疫原性肽，所述抗原或免疫原性肽是癌症或癌症相关抗原。根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽是肿瘤抗原。根据一些实施方案，所述一个或多个核酸序列编码一种或多种抗原或免疫原性肽，所述抗原或免疫原性肽与自身免疫病症诸如类风湿性关节炎(RA)或多发性硬化症(MS)相关联。根据一些实施方案，抗原是与自身免疫疾病或病症(诸如由感染因子触发的自身免疫疾病)相关的抗原，或与感染性疾病或病原体相关的抗原。
癌症或肿瘤相关抗原
根据一些实施方案，ceDNA包含编码癌症或肿瘤相关抗原的核酸序列。根据一些实施方案，ceDNA包含编码一种或多种选自癌症抗原肽数据库(Cancer Antigenic PeptideDatabase)(可在caped.icp.ucl.ac.be/about公开获得)的抗原的核酸序列。对于所鉴定的每种抗原，该数据库包括肽序列及其在蛋白质序列中的位置。
根据一些实施方案，ceDNA包含编码选自下表1中列出的一种或多种抗原的肿瘤相关抗原的核酸序列：
表1
最近对The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据集的分析已将肿瘤的基因组全景与肿瘤免疫相关联，表明在驱动T细胞应答(Brown等人，Genome Res.2014年5月；24(5):743-50,2014)和鉴定与免疫浸润物相关联的体细胞突变(Rutledge等人，Clin CancerRes.2013年9月15日；19(18):4951-60,2013)中的新抗原负荷。Rooney等人(2015年1月15日；160(1-2):48-61)提出新抗原和病毒可能驱动细胞溶解活性，并揭示了使肿瘤能够抵抗免疫攻击的已知和新型突变。
在一些实施方案中，抗原是从受试者的癌细胞中鉴定的新抗原。在一些实施方案中，新抗原是共有的新抗原。鉴定新抗原的方法是本领域已知的，并且描述于例如美国专利10,055,540中，该专利全文以引用方式并入本文。新抗原多肽和共有的新抗原多肽描述于例如PCT/US2016/033452、美国公布20180055922、Schumacher和Hacohen等人(Curr OpinImmunol.2016年8月；41:98-103)、Gubin,MM等人(Nature.2014年11月27日；515(7528):577-81)、Schumacher和Schreiber(Science.2015年4月3日；348(6230):69-74)、Ott PA.等人，Nature.2017年7月13日；547(7662):217-221中，所有这些文献全文以引用方式并入本文。
因此，在一些实施方案中，抗原是新抗原多肽。在一些实施方案中，抗原是TheComprehensive Tumor-Specific Neoantigen Database(TSNAdb v1.0)中列出的新抗原多肽；可得自biopharm.zju.edu.cn/tsnadb，并且描述于Wu等人，Genomics ProteomicsBioinformatics 16(2018)276-282中。在一些实施方案中，抗原是美国专利10,055,540中所述的新抗原多肽，该专利全文以引用方式并入本文。
自身免疫疾病抗原
根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽与自身免疫疾病相关联。根据一些实施方案，ceDNA包含编码选自下表2中的一种或多种抗原的核酸序列。
表2
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根据一些实施方案，自身免疫疾病由感染因子触发。根据一些实施方案，本公开提供了如本文所述的包含编码一种或多种抗原或免疫原性肽的核酸序列的ceDNA，其用于治疗与感染因子相关联或由感染因子触发的自身免疫疾病或病症。与感染因子相关联或由感染因子触发的示例性自身免疫疾病或病症提供于表3中。
表3
自身免疫疾病 感染因子
变应性脑炎 麻疹病毒
自身免疫性肾病 链球菌感染
恰加斯病 克氏锥虫
慢性自身免疫性肝炎 丙型肝炎病毒
格-巴二氏综合征 空肠弯曲杆菌、巨细胞病毒、寨卡病毒
疱疹性基质角膜炎 单纯疱疹病毒
HTLV相关脊髓病 人T细胞白血病病毒
莱姆关节炎 伯氏疏螺旋体
混合型冷球蛋白血症 丙型肝炎病毒
心肌炎 柯萨奇病毒B3
儿科自身免疫性神经精神障碍 链球菌感染
结节性多动脉炎 乙型肝炎病毒
原发性胆汁性肝硬化 大肠杆菌(Escherichia coli)
反应性关节炎 小肠结肠炎耶尔森菌
赖特综合征 沙眼衣原体、志贺氏杆菌种
风湿热 酿脓链球菌
风湿性心脏病 链球菌
类风湿性关节炎 正常肠道菌群
硬皮病 巨细胞病毒
妥瑞综合征 链球菌感染
1型糖尿病 肠病毒、轮状病毒
1型糖尿病 柯萨奇病毒B4
感染性疾病
根据一些实施方案，本公开提供了如本文所述的包含编码一种或多种抗原或免疫原性肽的核酸序列的ceDNA，其用于治疗感染性疾病。根据一些实施方案，抗原是病原体或感染因子的抗原(其中“病原体”和“感染因子”在本文中可互换使用)，例如病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体或寄生虫病原体。
根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽是病毒抗原或免疫原性肽。根据一些实施方案，本公开提供了如本文所述的包含编码一种或多种病毒抗原或免疫原性肽的核酸序列的ceDNA。
病毒感染包括腺病毒、柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒1型、单纯疱疹病毒2型、人巨细胞病毒、人疱疹病毒8型、水痘带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、乳头瘤病毒、狂犬病病毒和风疹病毒。其他病毒靶标包括副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，肺病毒、麻疹病毒、偏肺病毒、呼吸道病毒或腮腺炎病毒)、腺病毒科(Adenoviridae)(例如，腺病毒)、沙粒病毒科(Arenaviridae)(例如，沙粒病毒，诸如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)、动脉病毒科(Arteriviridae)(例如，猪呼吸与生殖综合征病毒或马动脉炎病毒)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)(例如，白蛉病毒或汉坦病毒)、杯状病毒科(Caliciviridae)(例如，诺沃克病毒)、冠状病毒科(Coronaviridae)(例如，冠状病毒或环曲病毒)、丝状病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉样病毒)、黄病毒科(Flaviviridae)(例如，丙型肝炎病毒或黄病毒)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如，单纯疱疹病毒、水痘病毒、巨细胞病毒、玫瑰疱疹病毒或淋巴隐病毒)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒或托高土病毒)、细小病毒科(Parvoviridae)(例如，细小病毒)、小RNA病毒科(Picomaviridae)(例如，肠病毒或肝病毒)、痘病毒科(Poxviridae)(例如，正痘病毒、禽痘病毒或兔痘病毒)、逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，慢病毒或泡沫病毒)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如，轮状病毒)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，狂犬病毒、弹状病毒或囊泡病毒)和披膜病毒科(Togaviridae)(例如，甲病毒或风疹病毒)。这些病毒的具体示例包括人呼吸道冠状病毒、流感病毒A-C、肝炎病毒A至G和单纯疱疹病毒1-9。
示例性病毒病原体示于下表4中。
表4
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根据一些实施方案，本公开提供了如本文所述的包含编码一种或多种抗原或免疫原性肽的核酸序列的ceDNA，其用于治疗COVID-19。根据一些实施方案，核酸编码SARS-CoV-2刺突蛋白。
刺突蛋白含有促进冠状病毒与细胞表面蛋白结合的S1亚基。因此，刺突蛋白的S1亚基控制哪些细胞被冠状病毒感染。刺突蛋白还含有S2亚基，其是促进病毒和细胞膜融合的跨膜亚基。
严重急性呼吸综合征冠状病毒2分离物的完整基因组如GenBank登录号MN908947.3所示。野生型刺突糖蛋白(S)的氨基酸序列如下面的SEQ ID NO:__所示：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽是稳定化融合前SARS-CoV-2刺突蛋白(SARS-CoV-2S(2P))。
根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽是细菌抗原或免疫原性肽。根据一些实施方案，本公开提供了如本文所述的包含编码一种或多种细菌抗原或免疫原性肽的核酸序列的ceDNA。
细菌感染包括但不限于分枝杆菌(Mycobacteria)、立克次氏体、支原体、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrheoeae)、军团菌、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、白喉棒状杆菌(Corynobacteria diphtheriae)、梭菌属(Clostridium spp.)、产肠毒素大肠杆菌(Eschericia coli)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、立克次氏体、汉氏巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)、衣原体、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、沙门氏菌(Salmonella)；志贺氏菌属(shigella)；小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica)；假结核耶尔森菌(Yersinia pseudotuberculosis)；嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；支原体属(Mycoplasma spp.)；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；霍乱弧菌；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)；炭疽杆菌；苍白密螺旋体(Treponema pallidum)；钩端螺旋体(Leptospira)；包柔氏螺旋体(Borrelia)；白喉棒状杆菌；弗朗西斯菌(Francisella)；马耳他布鲁氏菌(Brucellamelitensis)；空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)；肠杆菌(Enterobacter)；奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)；变形杆菌(Proteus)；以及肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)。
示例性细菌感染示于下表5中。
表5
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根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽是真菌抗原或免疫原性肽。根据一些实施方案，本公开提供了如本文所述的包含编码一种或多种真菌抗原或免疫原性肽的核酸序列的ceDNA。
示例性真菌感染示于下表6中。
表6
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根据一些实施方案，抗原或免疫原性肽是寄生虫抗原或免疫原性肽。根据一些实施方案，本公开提供了如本文所述的包含编码一种或多种真菌抗原或免疫原性肽的核酸序列的ceDNA。
示例性寄生虫感染示于下表7中。
表7
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可以设想用本公开的ceDNA载体治疗的其他疾病和病症。示例包括但不限于心血管疾病和免疫疾病。
本领域的技术人员能够充分采用例如抗原或免疫原性肽的已知和/或公开可用的蛋白质序列并且反向工程改造cDNA序列以编码此类蛋白。
多肽疫苗
根据一些实施方案，本文所述的ceDNA载体包含在包含多种抗原或免疫原性肽的ceDNA载体组合物中。例如，在配制用于治疗癌症的多肽疫苗时，不仅鉴定和表征在感兴趣的癌症上表达的肿瘤相关抗原是重要的，而且鉴定和表征来自肿瘤相关抗原的不同表位的组合也是重要的，所述组合增加了患者对多于一个表位的应答的可能性。为了对抗肿瘤逃避针对其的治疗的能力，本公开在疫苗中利用了多种特异性肽。
根据一些实施方案，来自相同蛋白质的多于一个表位可用于多肽疫苗中。
IV.用于产生抗原的ceDNA载体
本公开的实施方案基于包含可表达抗原或免疫原性肽的封闭端线性双链(ceDNA)载体的方法和组合物。如本文所述，抗原或免疫原性肽可选自多种病原体，包括例如细菌、病毒、真菌和寄生虫感染因子，或者癌症或癌症相关抗原等。另外其他靶标可以包括自身免疫病状，诸如类风湿性关节炎(RA)或多发性硬化症(MS)。
根据一些实施方案，转基因是编码抗原或免疫原性肽的核酸序列。ceDNA载体优选地是双链体，例如，相对于分子的至少一部分是自互补的，诸如，表达盒(例如，ceDNA不是双链环状分子)。ceDNA载体具有共价封闭端，因此抵抗核酸外切酶(例如，核酸外切酶I或核酸外切酶III)消化，例如在37℃超过一个小时。
一般来说，如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺病毒相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、感兴趣的核酸序列(例如，如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR。ITR序列选自以下中的任一种：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如，不对称的经修饰ITR)；(ii)两个经修饰ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组织(例如，不对称的经修饰ITR)，或者(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组织，或者(iv)对称或基本上对称的经修饰ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组织。
本文中涵盖了包含用于产生抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的方法和组合物，其还可包括递送系统，诸如但不限于脂质体纳米粒子递送系统。本文公开了涵盖使用的非限制示例性脂质体纳米粒子系统。根据一些方面，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。例如，2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开了脂质纳米粒子配制物，该配制物经制备并且装载通过所述方法获得的ceDNA载体，该国际申请并入本文中。
如本文所公开的ceDNA载体不存在由病毒衣壳内的有限空间所强加的封装局限。与囊封的AAV基因组相反，ceDNA载体是活真核生物产生的，其代表着原核生物产生的质粒DNA载体的替代方案。这允许插入控制元件，例如本文所公开的调节开关、大的转基因、多个转基因等。
图1A至图1E示出了用于表达抗原或免疫原性肽的非限制性示例性ceDNA载体或ceDNA质粒的对应序列的示意图。用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体是无衣壳的并且可从按以下顺序编码的质粒中获得：第一ITR、包含转基因的表达盒和第二ITR。表达盒可以包括一种或多种允许且/或控制转基因表达的调节序列，例如其中表达盒能够按照此次序包含以下中的一个或多个：增强子/启动子、ORF报告基因(转基因)、转录后调节元件(例如WPRE)，以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH聚A)。
表达盒还可包含内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A元件。顺式调节元件包含但不限于启动子、核糖开关、绝缘子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。根据一些实施方案，ITR可以充当转基因的启动子。根据一些实施方案，ceDNA载体包含其他组分来调节转基因的表达，例如调节开关，用于控制和调节抗原或免疫原性肽的表达，并且如果需要，可包含作为杀灭开关的调节开关，从而能够使包含ceDNA载体的细胞实现受控的细胞死亡。
表达盒能够包含超过4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸、或30,000个核苷酸、或40,000个核苷酸、或50,000个核苷酸，或在约4000个-10,000个核苷酸或10,000个-50,000个核苷酸之间的任何范围，或超过50,000个核苷酸。根据一些实施方案，表达盒可以包含长度在500个至50,000个核苷酸范围内的转基因。根据一些实施方案，表达盒可以包含长度在500个至75,000个核苷酸范围内的转基因。根据一些实施方案，表达盒可以包含长度在500个至10,000个核苷酸范围内的转基因。根据一些实施方案，表达盒可以包含长度在1000个至10,000个核苷酸范围内的转基因。根据一些实施方案，表达盒可以包含长度在500个至5,000个核苷酸范围内的转基因。ceDNA载体不存在衣壳化AAV载体的大小限制，从而能够递送大大小表达盒以提供有效的转基因表达。根据一些实施方案，ceDNA载体缺乏原核生物特异性甲基化。
在表达盒，即本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的表达构建体中提供的序列可以针对靶宿主细胞进行密码子优化。如本文所用，术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人等所关注的脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在该脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白的氨基酸序列。优化的密码子可以使用例如Aptagen的GENE密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen公司,2190Fox Mill Rd.Suite 300,Herndon,Va.20171)或另一公开可用的数据库来测定。根据一些实施方案，核酸被优化以用于人表达。
由如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体表达的转基因编码抗原或免疫原性肽。ceDNA载体存在许多不同于基于质粒的表达载体的结构特点。ceDNA载体可以具有以下特点中的一个或多个：缺乏原始(即，非插入)细菌DNA；缺乏原核复制起点；为自给式的，即，其不需要除所述两个ITR之外的任何序列，包括Rep结合和末端解链位点(RBS和TRS)和在所述ITR之间的外源序列；存在形成发夹的ITR序列和不存在细菌型DNA甲基化或实际上被哺乳动物宿主视为异常的任何其它甲基化。一般来说，本公开的载体优选不含有任何原核DNA，但作为非限制性示例，预期可以将一些原核DNA作为外源序列插入启动子或增强子区中。将ceDNA载体与质粒表达载体区分开来的另一个重要特征是，ceDNA载体是具有封闭端的单链线性DNA，而质粒始终是双链DNA。
通过本文所提供的方法产生的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体优选地具有线性和连续结构而不是非连续结构，如限制酶消化分析所测定(图4D)。相信线性和连续结构在受到细胞核酸内切酶攻击时更稳定，并且不太可能重组并引起诱变。因此，线性和连续结构的ceDNA载体是优选的实施方案。连续、线性、单链的分子内双链体ceDNA载体可以具有共价结合的末端，而不具有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上不同于质粒(包括本文所描述的ceDNA质粒)，该质粒是细菌来源的环状双链体核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离，从而产生两个核酸分子，而相比之下，ceDNA载体虽具有互补链，却是单个DNA分子，并且因此即使变性，也仍保持是单个分子。根据一些实施方案，与质粒不同，如本文所述的ceDNA载体的产生可以没有原核类型的DNA碱基甲基化。因此，在结构方面(特别是线性对比环形)以及还根据用于产生和纯化这些不同物体的方法方面，以及还根据它们的DNA甲基化方面，即ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型，ceDNA载体和ceDNA质粒是不同的。
如本文所述使用ceDNA载体来表达抗原或免疫原性肽相对于基于质粒的表达载体有几个优点，此类优点包括但不限于：1)质粒含有细菌DNA序列并且经受原核特异性甲基化，例如6-甲基腺苷和5-甲基胞嘧啶甲基化，而无衣壳的AAV载体序列是真核来源的并且不经历原核特异性甲基化；因此，与质粒相比，无衣壳AAV载体不太可能诱导炎性和免疫应答；2)质粒在生产过程中需要抗性基因的存在，而ceDNA载体则不需要；3)环状质粒在引入细胞中时不被递送到细胞核并且需要过载才能绕过细胞核酸酶的降解，而ceDNA载体含有赋予对核酸酶的抗性并且可以被设计为被靶向并被递送到细胞核的病毒顺式元件，即ITR。假设对于ITR功能必不可少的最小限定元件是Rep结合位点(RBS；对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:__))和末端解链位点(TRS；对于AAV2，5'-AGTTGG-3'(SEQ ID NO:__))加上允许发夹形成的可变回文序列；以及4)ceDNA载体不具有通常在原核生物来源的质粒中发现的CpG二核苷酸的过度呈现，据报道，CpG二核苷酸会结合Toll样受体家族的成员，从而引发T细胞介导的免疫应答。相比之下，用本文公开的无衣壳AAV载体进行的转导可以有效地靶向难以使用各种递送试剂用常规AAV病毒粒子转导的细胞和组织类型。
反向末端重复序列(ITR)
如本文所公开，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体含有位于两个反向末端重复(ITR)序列之间的转基因或核酸序列，其中ITR序列可以是不对称的ITR对或对称或基本上对称的ITR对，这些术语如本文所定义。如本文所公开的ceDNA载体可以包含选自以下中的任一种的ITR序列：(i)至少一个WT ITR和至少一个经修饰AAV反向末端重复序列(mod-ITR)(例如，不对称的修饰ITR)；(ii)两个经修饰ITR，其中mod-ITR对相对于彼此具有不同的三维空间组织(例如，不对称的经修饰ITR)，或者(iii)对称或基本上对称的WT-WT ITR对，其中每个WT-ITR具有相同的三维空间组织，或者(iv)对称或基本上对称的经修饰ITR对，其中每个mod-ITR具有相同的三维空间组织，其中本公开的方法还可包括递送系统，诸如但不限于脂质体纳米粒子递送系统。
根据一些实施方案，ITR序列可以来自细小病毒科的病毒，细小病毒科包括两个亚科：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染昆虫的浓核病毒亚科。细小病毒亚科(称为细小病毒)包含依赖病毒属，所述依赖病毒属的成员在大多数情况下需要与辅助病毒例如腺病毒或疱疹病毒共同感染以用于生产性感染。依赖病毒属包括通常感染人类(例如，血清型2、3A、3B、5和6)或灵长类动物(例如，血清型1和4)的腺相关病毒(AAV)以及感染其它温血动物的相关病毒(例如，牛科动物、犬科动物、马科动物和绵羊科动物腺相关病毒)。细小病毒和细小病毒科的其他成员一般描述于Kenneth I.Berns,“Parvoviridae:The Viruses andTheir Replication,”FIELDS VIROLOGY中的第69章(第3版，1996)。
尽管在说明书和本文的实施例中举例说明的ITR是AAV2 WT-ITR，但是本领域的技术人员知道如上所述，可以使用来自任何已知的细小病毒，例如依赖病毒，诸如AAV(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如，NCBI：NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261)、嵌合ITR或来自任何合成AAV的ITR。根据一些实施方案，AAV可以感染温血动物，例如禽类(AAAV)、牛(BAAV)、犬、马和绵羊腺相关病毒。根据一些实施方案，ITR来自B19细小病毒(GenBank登录号：NC 000883)、来自小鼠的微小病毒(MVM)(GenBank登录号：NC 001510)；鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701)；蛇毒细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。根据一些实施方案，5'WT-ITR可以来自一种血清型，而3'WT-ITR来自不同血清型，如本文所讨论。
普通技术人员知道，ITR序列具有双链霍利迪连结体(Holliday junction)的共同结构，该结构通常是T形或Y形发夹结构(参见例如图2A和图3A)，其中每个WT-ITR由两个回文臂或环(B-B'和C-C')嵌入较大的回文臂(A-A')中与单链D序列形成(其中这些回文序列的次序限定了ITR的翻转或翻动取向)。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6)并且描述于以下文献中的ITR的结构分析和序列比较：Grimm等人,J.Virology,2006；80(1)；426-439；Yan等人,J.Virology,2005；364-379；Duan等人,Virology 1999；261；8-14。本领域的技术人员基于本文提供的示例性AAV2 ITR序列，可以容易地确定用于ceDNA载体或ceDNA质粒的来自任何AAV血清型的WT-ITR序列。参见例如来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6和鸟AAV(AAAV)和牛AAV(BAAV))并且描述于以下文献中的ITR的序列比较：Grimm等人,J.Virology,2006；80(1)；426-439；其显示了AAV2的左ITR与来自以下其他血清型的左ITR的同一性％：AAV-1(84％)、AAV-3(86％)、AAV-4(79％)、AAV-5(58％)、AAV-6(左ITR)(100％)和AAV-6(右ITR)(82％)。
对称的ITR对
根据一些实施方案，如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、感兴趣的核酸序列(例如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此对称或基本上对称，也就是说，ceDNA载体可包含具有对称三维空间组织以使得其结构在几何空间中为相同形状或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环的ITR序列。在这样的实施方案中，对称的ITR对或基本上对称的ITR对可以是不是野生型ITR的经修饰ITR(例如，mod-ITR)。一个mod-ITR对可以具有相同的相对于野生型ITR具有一个或多个修饰的序列，并且彼此反向互补(反向)。在另选的实施方案中，经修饰ITR对如本文所定义是基本上对称的，也就是说，经修饰ITR对可以具有不同的序列，但是具有对应或相同的对称的三维形状。
(i)野生型ITR
根据一些实施方案，对称的ITR或基本上对称的ITR是如本文所描述的野生型(WT-ITR)。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须为来自相同AAV血清型的WT-ITR。也就是说，根据一些实施方案，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组织。
因此，如本文所公开，ceDNA载体含有位于两个侧接野生型反向末端重复(WT-ITR)序列之间的转基因或核酸序列，所述WT-ITR序列为彼此的反向互补序列(反向)，或者，相对于彼此基本上对称-也就是说，WT-ITR对具有对称的三维空间组织。根据一些实施方案，野生型ITR序列(例如AAV WT-ITR)包含功能Rep结合位点(RBS；例如，对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，SEQ ID NO:__)和功能末端解链位点(TRS；例如，5’-AGTT-3’，SEQID NO:__)。
根据一些方面，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可从编码操作性地位于两个WT反向末端重复序列(WT-ITR)(例如，AAV WT-ITR)之间的核酸的载体多核苷酸获得。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须是来自同一AAV血清型的WT-ITR。也就是说，根据一些实施方案，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组织。根据一些实施方案，5'WT-ITR来自一种AAV血清型，而3'WT-ITR来自相同或不同的AAV血清型。根据一些实施方案，5'WT-ITR和3'WT-ITR是彼此的镜像，即它们是对称的。根据一些实施方案，5'WT-ITR和3'WT-ITR来自相同的AAV血清型。
WT ITR是众所周知的。根据一些实施方案，两个ITR来自相同的AAV2血清型。在某些实施方案中，可以使用来自其它血清型的WT。存在许多同源血清型，例如AAV2、AAV4、AAV6、AAV8。根据一些实施方案，可以使用紧密同源的ITR(例如具有类似环结构的ITR)。在另一个实施方案中，能够使用较多样化的AAV WT ITR，例如AAV2和AAV5，并且在仍另一个实施方案中，能够使用基本上呈WT的ITR，也就是说，其不仅具有WT的基本环结构，而且具有不改变或不影响该特性的一些保守核苷酸变化。当使用来自相同病毒血清型的WT-ITR时，可以进一步使用一种或多种调节序列。在某些实施方案中，调节序列是允许调节ceDNA活性(例如，所编码的抗原或免疫原性肽的表达)的调节开关。
根据一些实施方案，本文所述的技术的一个方面涉及用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体，其中ceDNA载体包含操作性地位于两个野生型反向末端重复序列(WT-ITR)之间的至少一个编码例如HC和/或LC的核酸序列，其中WT-ITR可以来自相同血清型、不同血清型或相对于彼此基本上对称(即，具有对称三维空间组织以使得其结构在几何空间中为相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C’和B-B’环)。根据一些实施方案，对称的WT-ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点。根据一些实施方案，核酸序列编码转基因，并且其中载体不在病毒衣壳中。
根据一些实施方案，WT-ITR是相同的，但是彼此反向互补。例如，5'ITR中的序列AACG可以是3'ITR中相应位点处的CGTT(即，反向互补)。根据一些示例，5'WT-ITR有义链包含ATCGATCG的序列，而相应的3'WT-ITR有义链包含CGATCGAT(即与ATCGATCG反向互补)。根据一些实施方案，WT-ITR ceDNA还包含末端解链位点和复制蛋白结合位点(RPS)(有时称为复制性蛋白结合位点)，例如Rep结合位点。
在用于表达抗原或免疫原性肽并且包含WT-ITR的ceDNA载体中使用的示例性WT-ITR序列示于本文的表2中，该表示出了成对的WT-ITR(5'WT-ITR和3'WT-ITR)。
作为一个示例性示例，本公开提供了包含操作性地连接到转基因(例如，核酸序列)的启动子、具有或不具有调节开关的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体，其中ceDNA不含衣壳蛋白，并且：(a)由编码WT-ITR的ceDNA质粒(例如，参见图1F至图1G)产生，其中每个WT-ITR的发夹二级构型具有相同数目个分子内双链碱基对(相较于这些参考序列，优选地排除这种构型中的任何AAA或TTT末端环的缺失)；以及(b)使用用于鉴定ceDNA的测定通过在实施例1中的天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳鉴定为ceDNA。
根据一些实施方案，侧接WT-ITR彼此基本上对称。在该实施方案中，5'WT-ITR可以来自AAV的一种血清型，而3'WT-ITR可以来自AAV的另一种血清型，使得WT-ITR不是相同的反向互补序列。例如，5'WT-ITR可以来自AAV2，并且3'WT-ITR来自不同血清型，例如AAV1、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12。根据一些实施方案，WT-ITR可以选自从以下中的任一种中选择的两种不同的细小病毒：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。根据一些实施方案，WTITR的这种组合是来自AAV2和AAV6的WT-ITR的组合。根据一些实施方案，当一个相对于另一个ITR反向时，基本上对称的WT-ITR具有至少90％同一性，至少95％同一性，至少96％…97％…98％…99％....99.5％以及其间的所有点的同一性，并具有相同的对称三维空间组织。根据一些实施方案，由于WT-ITR对具有对称的三维空间组织，例如具有A、C-C'、B-B'和D臂的相同3D组织，因此WT-ITR对是基本对称的。根据一些实施方案，基本上对称的WT-ITR对相对于彼此呈反向，并且彼此具有至少95％、至少96％…97％…98％…99％....99.5％同一性和其间的所有点，并且一个WT-ITR保留5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:60)的Rep结合位点(RBS)和末端解析位点(trs)。根据一些实施方案，基本上对称的WT-ITR对相对于彼此呈反向，并且彼此具有至少95％、至少96％…97％…98％…99％....99.5％同一性和其间的所有点，并且一个WT-ITR保留5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:__)的Rep结合位点(RBS)和末端解析位点(trs)，此外保留允许发夹二级结构形成的可变回文序列。同源性可以通过所属领域熟知的标准方法来确定，诸如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)、BLASTN。
根据一些实施方案，ITR的结构元件可以是参与ITR与大的Rep蛋白(例如Rep 78或Rep 68)的功能性相互作用的任何结构元件。在某些实施方案中，结构元件为ITR与大的Rep蛋白的相互作用提供了选择性，即，至少部分确定哪种Rep蛋白与ITR功能性相互作用。在其它实施方案中，当Rep蛋白与ITR结合时，结构元件与大的Rep蛋白物理上相互作用。每个结构元件可以为例如ITR的二级结构、ITR的核酸序列、在两个或更多个元件之间的间距或以上中的任一者的组合。根据一些实施方案，结构元件选自由A和A'臂、B和B'臂、C和C'臂、D臂、Rep结合位点(RBE)和RBE'(即互补RBE序列)以及末端解链位点(trs)组成的组。
仅举例而言，表8指示WT-ITR的示例性组合。
表8：来自相同血清型或不同血清型或不同细小病毒的WT-ITR的示例性组合。显示的次序并不表示ITR位置，例如，“AAV1，AAV2”表明ceDNA可以在5'位置包含WT-AAV1 ITR，而在3'位置包含WT-AAV2 ITR，反之亦然，WT-AAV2 ITR位于5'位置，WT-AAV1 ITR位于3'位置。缩写：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型3(AAV3)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)；AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组(例如，NCBI:NC 002077、NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261)、来自温血动物的ITR(禽类AAV(AAAV)、牛AAV(BAAV)、犬、马和绵羊AAV)、来自B19细小病毒的ITR(GenBank登录号：NC 000883)、小鼠微小病毒(MVM)(GenBank登录号NC 001510)；鹅：鹅细小病毒(GenBank登录号NC 001701)；蛇：蛇细小病毒1(GenBank登录号NC 006148)。
表8：WT-ITR的示例性组合
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仅举例而言，表9示出来自一些不同AAV血清型的示例性WT-ITR的序列。
表9：示例性WT-ITR
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根据一些实施方案，WT-ITR序列的核酸序列可以被修饰(例如，通过修饰1、2、3、4或5个或更多个核苷酸或其中的任何范围)，由此该修饰是取代互补核苷酸，例如G取代C(反之亦然)和T取代A(反之亦然)。
在本公开的某些实施方案中，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体不具有由选自SEQ ID NO:1、2、5-14中的任一者的核酸序列组成的WT-ITR。在本公开的替代性实施方案中，如果ceDNA载体具有包含选自SEQ ID NO:1、2、5-14中的任一者的核酸序列的WT-ITR，那么侧接ITR也为WT，并且ceDNA载体包含调节开关，例如本文和国际申请PCT/US18/49996(例如，参见PCT/US18/49996的表11，全文通过引用并入本文中)中所公开。根据一些实施方案，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体包含如本文所公开的调节开关和经选择具有选自由SEQ ID NO:1、2、5-14组成的组中的任一者的核酸序列的WT-ITR。
如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可包括保留可操作的RBE、trs和RBE'部分的WT-ITR结构。出于示例性目的使用野生型ITR，图2A和图2B示出了关于ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的trs位点操作的一种可能机制。根据一些实施方案，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体含有一个或多个功能WT-ITR多核苷酸序列，这些多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS；对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID NO:__))和末端解链位点(TRS；5'-AGTT(SEQ ID NO:__))。根据一些实施方案，至少一个WT-ITR是功能性的。在另选的实施方案中，其中用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体包含彼此基本上对称的两个WT-ITR，至少一个WT-ITR是功能性的并且至少一个WT-ITR是非功能性的。
通常用于包含不对称ITR对或对称ITR对的ceDNA载体的经修饰ITR(mod-ITR)
如本文所讨论，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可包含对称的ITR对或不对称的ITR对。在两个例子中，ITR中的一个或两个可以是经修饰ITR，差异在于，在第一个例子(即，对称的mod-ITR)中，mod-ITR具有相同的三维空间组织(即，具有相同的A-A'、C-C'和B-B'臂构形)，而在第二个例子(即，不对称的mod-ITR)中，mod-ITR具有不同的三维空间组织(即，具有A-A'、C-C'和B-B'臂的不同构形)。
根据一些实施方案，相较于野生型ITR序列(例如AAV ITR)，经修饰ITR为通过缺失、插入和/或取代进行修饰的ITR。根据一些实施方案，ceDNA载体中的ITR中的至少一个包含功能性Rep结合位点(RBS；例如，对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3')和功能末端解链位点(TRS；例如，5'-AGTT-3')。根据一些实施方案，ITR中的至少一个是非功能ITR。根据一些实施方案，不同的或经修饰ITR不是各自来自不同血清型的野生型ITR。
在本文中详细描述了ITR中的特定改变和突变，但是在ITR的情况下，“改变”或“突变”或“修饰”表明相对于野生型、参考或原始ITR序列，插入、缺失和/或取代核苷酸。改变或突变的ITR可以是工程化ITR。如本文所用，“工程化”是指通过人的手进行操纵的方面。例如，当多肽的至少一个方面，例如其序列，通过人的手进行操纵而不同于自然存在的方面时，则认为该多肽是“工程化”的。
根据一些实施方案，mod-ITR可以是合成的。根据一些实施方案，合成的ITR是基于来自一种以上AAV血清型的ITR序列。在另一个实施方案中，合成ITR不包括基于AAV的序列。在又一个实施方案中，合成的ITR尽管仅具有一些或不具有源自AAV的序列，但是保留了上述的ITR结构。根据一些方面，合成的ITR可优先与野生型Rep或特定血清型的Rep相互作用，或者根据一些情况，将不被野生型Rep识别而仅被突变Rep识别。
技术人员可以通过已知手段确定其它血清型的对应序列。例如，确定改变是否在A、A'、B、B'、C、C'或D区域中，并确定另一种血清型中的对应区域。能够在默认状态下使用(基本局部比对搜索工具)或其它同源性比对程序测定对应序列。本公开进一步提供了包含来自不同AAV血清型的组合的mod-ITR的ceDNA载体群体和多个该ceDNA载体-也就是说，一个mod-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个mod-ITR可以来自不同血清型。不希望受理论的束缚，根据一些实施方案，一个ITR可以来自或基于AAV2 ITR序列，而ceDNA载体的另一个ITR可以来自或基于以下中的任一种或多种ITR序列：AAV血清型1(AAV1)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)、AAV血清型6(AAV6)、AAV血清型7(AAV7)、AAV血清型8(AAV8)、AAV血清型9(AAV9)、AAV血清型10(AAV10)、AAV血清型11(AAV11)或AAV血清型12(AAV12)。
任何细小病毒ITR都可以用作ITR或用于修饰的基础ITR。优选地，细小病毒是依赖病毒。更优选是AAV。选择的血清型可以是基于血清型的组织嗜性。AAV2具有广泛的组织嗜性，AAV1优先靶向神经元和骨骼肌，而AAV5优先靶向神经元、视网膜色素上皮和光感受器。AAV6优先靶向骨骼肌和肺。AAV8优先靶向肝脏、骨骼肌、心脏和胰腺组织。AAV9优先靶向肝脏、骨骼和肺组织。根据一些实施方案，经修饰ITR是基于AAV2ITR。
更具体地说，可以通过修饰结构元件来改变结构元件与特定的大Rep蛋白功能性相互作用的能力。举例来说，与ITR的野生型序列相比，结构元件的核酸序列可以经修饰。根据一些实施方案，可以去除ITR的结构元件(例如A臂、A'臂、B臂、B'臂、C臂、C'臂、D臂、RBE、RBE'和trs)并用来自不同细小病毒的野生型结构元件替代。例如，替代结构可以来自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如巨蟒细小病毒)、牛细小病毒、山羊细小病毒、禽类细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒或昆虫AAV。例如，ITR可以是AAV2 ITR，并且A或A'臂或RBE可以用来自AAV5的结构元件替代。又如，ITR可以是AAV5 ITR，并且C或C'臂、RBE和trs可以用来自AAV2的结构元件替代。在另一个实施方案中，AAV ITR可以是B和B'臂被AAV2 ITR B和B'臂替代的AAV5 ITR。
仅作为示例，表10显示了经修饰ITR的区域中的至少一个核苷酸的示例性修饰(例如，缺失、插入和/或取代)，其中X指示该区段中的至少一个核酸相对于对应野生型ITR的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。根据一些实施方案，在C和/或C'和/或B和/或B'的任何区域中的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即，TTT)。例如，如果修饰引起以下任一种：单臂ITR(例如，单个C-C'臂或单个B-B'臂)或经修饰C-B'臂或C'-B臂、或具有至少一个截短臂(例如截短的C-C'臂和/或截短的B-B'臂)的两臂ITR，那么至少该单臂、或两臂ITR(其中一个臂可以是截短的)的至少一个臂在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。根据一些实施方案，截短的C-C'臂和/或截短的B-B'臂在末端环中具有三个连续的T核苷酸(即TTT)。
表10：ITR的不同B-B'和C-C'区域或臂的至少一个核苷酸的修饰的示例性组合(例 如，缺失、插入和/或取代)(X指示核苷酸修饰，例如该区域中的至少一个核苷酸的添加、缺 失或取代)。
B区 B'区 C区 C'区
X
X
X X
X
X
X X
X X
X X
X X
X X
X X X
X X X
X X X
X X X
X X X X
根据一些实施方案，在用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体中使用的mod-ITR包含如本文所公开的不对称的ITR对或对称的mod-ITR对，可包含表10中所示的任一种修饰组合，以及选自以下的任一个或多个区域中的至少一种核苷酸的修饰：在A'与C之间、在C与C'之间、在C'与B之间、在B与B'之间以及在B'与A之间。根据一些实施方案，在C或C'区域或B或B'区域中的至少一种核苷酸的任何修饰(例如，缺失、插入和/或取代)仍然保留了茎-环的末端环。根据一些实施方案，在C和C'和/或B和B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续的T核苷酸(即TTT)。在替代实施方案中，C与C'之间和/或B与B'之间的至少一个核苷酸的任何修饰(例如缺失、插入和/或取代)在至少一个末端环中保留三个连续A核苷酸(即，AAA)。根据一些实施方案，本文中使用的经修饰ITR可包含表10中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含选自以下的任一个或多个区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)：A'、A和/或D。例如，本文中使用的经修饰ITR可包含表10中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含A区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。根据一些实施方案，本文中使用的经修饰ITR可包含表10中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含A'区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。根据一些实施方案，本文中使用的经修饰ITR可包含表10中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含A和/或A’区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。根据一些实施方案，本文中使用的经修饰ITR可包含表10中所示的修饰组合中的任一个，并且还包含D区域中的至少一个核苷酸的修饰(例如，缺失、插入和/或取代)。
根据一些实施方案，可以修饰结构元件的核酸序列(例如通过修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或者其中的任何范围)，以产生经修饰结构元件。根据一些实施方案，对ITR的特异性修饰例示于本文中(例如，SEQ IDNO:3、4、15-47、101-116或165-187)，或示于2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图7A至图7B中(例如PCT/US2018/064242中的SEQ ID No 97-98、101-103、105-108、111-112、117-134、545-54)。根据一些实施方案，可以修饰ITR(例如，通过修饰1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或其中的任何范围)。在其他实施方案中，ITR与SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187的经修饰的ITR之一或SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187的A-A'臂和C-C'和B-B'臂的含RBE区段或国际专利申请PCT/US18/49996的表2-9中所示(即，SEQ ID NO:110-112、115-190、200-468)可具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列一致性，所述国际专利申请全文以引用方式并入本文。
根据一些实施方案，经修饰ITR可以例如包含特定臂的全部，例如A-A'臂的全部或一部分、或B-B'臂的全部或一部分、或C-C'臂的全部或一部分的去除或缺失，或另选地，形成环的茎的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对的去除，只要对茎(例如单臂)进行加帽的最终环仍然存在即可(例如参见2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的图7A中的ITR-21)。根据一些实施方案，经修饰ITR可以包含从B-B'臂去除1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对。根据一些实施方案，经修饰ITR可以包含从C-C'臂去除1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对(参见例如2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图3B中的ITR-1或图7A中的ITR-45)。根据一些实施方案，经修饰ITR可以包含从C-C'臂去除1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对和从B-B'臂去除1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或更多个碱基对。设想去除碱基对的任何组合，例如可以在C-C'臂中去除6个碱基对以及在B-B'臂中去除2个碱基对。作为说明性示例，图3B显示了示例性经修饰ITR，其中从C部分和C'部分各缺失至少7个碱基对，C和C'区域之间的环中的核苷酸被取代，以及从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对，使得经修饰ITR包含至少一个臂(例如C-C')截短的两个臂。根据一些实施方案，经修饰ITR还包含从B区域和B'区域各自缺失至少一个碱基对，使得臂B-B'相对于WT ITR也截短。
根据一些实施方案，相对于全长野生型ITR序列，经修饰ITR可具有1至50个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50)核苷酸缺失。根据一些实施方案，相对于全长WT ITR序列，经修饰ITR可具有1至30个核苷酸缺失。根据一些实施方案，相对于全长野生型ITR序列，经修饰ITR具有2至20个核苷酸缺失。
根据一些实施方案，经修饰ITR在A或A'区域的含RBE部分中不含任何核苷酸缺失，以便不干扰DNA复制(例如，通过Rep蛋白结合到RBE，或在末端解链位点切割)。根据一些实施方案，本文涵盖使用的经修饰ITR在如本文所述的B、B'、C和/或C区域中具有一个或多个缺失。
根据一些实施方案，包含对称ITR对或不对称ITR对的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体包含如本文所公开的调节开关和至少一个经选择具有选自由SEQ ID NO:3、4、15-47、101-116或165-187组成的组中的任一者的核苷酸序列的经修饰ITR。
在另一个实施方案中，结构元件的结构可以为经修饰的。例如，结构元件改变了茎高和/或环中核苷酸的数量。例如，茎高可以是约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个或更多个核苷酸或其中的任何范围。根据一些实施方案，茎高度可以为约5个核苷酸至约9个核苷酸，并且在功能上与Rep相互作用。在另一个实施方案中，茎高度可以为约7个核苷酸，并且在功能上与Rep相互作用。在另一个示例中，环可以具有3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个核苷酸或其中的任何范围。
在另一个实施方案中，RBE或扩展RBE内GAGY结合位点或GAGY相关结合位点的数量可以增加或减少。根据一些示例，RBE或扩展RBE可以包括1、2、3、4、5或6个或更多个GAGY结合位点或其中的任何范围。每个GAGY结合位点可以独立地是精确的GAGY序列或类似于GAGY的序列，只要该序列足以结合Rep蛋白即可。
在另一个实施方案中，能够改变(例如增加或减少)两个元件(诸如(但不限于)RBE和发夹)之间的间距，以改变与大Rep蛋白的功能相互作用。例如，间距可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或21个或更多个核苷酸或其中的任何范围。
本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可包含相对于本文公开的野生型AAV2 ITR结构经修饰，但仍保留可操作的RBE、trs和RBE'部分的ITR结构。图2A和图2B示出了用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的野生型ITR结构部分内的trs位点的一种可能的操作机制。根据一些实施方案，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体含有一个或多个功能性ITR多核苷酸序列，这些多核苷酸序列包含Rep结合位点(RBS；对于AAV2，5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3')和末端解链位点(TRS；5'-AGTT)。根据一些实施方案，至少一个ITR(wt或经修饰ITR)是功能性的。在另选的实施方案中，其中用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体包含彼此不同或不对称的两个经修饰ITR，至少一个经修饰ITR是功能性的并且至少一个经修饰ITR是非功能性的。
根据一些实施方案，如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的经修饰ITR(例如，左ITR或右ITR)在环臂、截短臂或间隔子内具有修饰。在环臂、截短臂或间隔子内具有修饰的ITR的示例性序列列于国际专利申请PCT/US18/49996(其以全文引用的方式并入本文)的下表中：表2(即，SEQ ID NO:135-190、200-233)；表3(例如，SEQ ID No:234-263)；表4(例如，SEQ ID NO:264-293)；表5(例如，本文的SEQ ID No:294-318)；表6(例如，SEQ ID NO:319-468)；以及表7-表9(例如，SEQ ID No:101-110、111-112、115-134)或者表10A或10B(例如，SEQ ID No:9、100、469-483、484-499)。
根据一些实施方案，在包含不对称的ITR对或对称的mod-ITR对的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体中使用的经修饰ITR选自国际专利申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9和10A-10B中所示的那些修饰中的任一个或组合，该国际专利申请全文以引用方式并入本文。
在以上类别中的每一者中的包含不对称的ITR对或对称的mod-ITR对的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体中使用的额外示例性经修饰ITR提供于表11A和表11B中。表11A中的经修饰的右ITR的预测二级结构示于2018年12月6日提交的国际专利申请第PCT/US2018/064242号的图7A中，并且表11B中的经修饰的左ITR的预测二级结构示于2018年12月6日提交的国际专利申请第PCT/US2018/064242号的图7B中，所述申请全文以引用方式并入本文。
表11A和表11B列出了示例性经修饰的右ITR和左ITR的SEQ ID NO。
表11A：示例性经修饰右ITR。这些示例性经修饰右ITR可包含GCGCGCTCGCTCGCTC- 3′的RBE(ACTGAGGC的间隔子)、间隔子互补序列GCCTCAGT和GAGCGAGCGAGCGCGC的RBE'(即， RBE的互补序列)。
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表11B：示例性经修饰左ITR。这些示例性经修饰左ITR可包含GCGCGCTCGCTCGCTC- 3′的RBE、ACTGAGGC的间隔子、间隔子互补序列GCCTCAGT和GAGCGAGCGAGCGCGC的RBE互补序 列(RBE')。
/>
根据一些实施方案，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体在5'到3'方向上包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、感兴趣的核酸序列(例如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此不对称，也就是说，它们具有彼此不同的3D空间构型。作为示例性实施方案，第一ITR可以是野生型ITR，并且第二ITR可以是突变的或经修饰的ITR，或反过来，其中第一ITR可以是突变的或经修饰的ITR，并且第二ITR可以是野生型ITR。根据一些实施方案，第一ITR和第二ITR均是mod-ITR，但具有不同序列或具有不同修饰，因此不是相同的经修饰ITR，并且具有不同的3D空间构型。换句话说，具有不对称ITR的ceDNA载体包含这样的ITR：其中根据一些ITR相对于WT-ITR的任何变化不反映在另一个ITR中；或另选地，其中具有经修饰的不对称ITR对的不对称ITR可以具有相对于彼此不同的序列和不同的三维形状。用于表达抗原或免疫原性肽并且用于生成ceDNA质粒的ceDNA载体中的示例性不对称ITR示于表11A和表11B中。
在一个另选的实施方案中，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体包含两个对称的mod-ITR，也就是说，两个ITR都具有相同序列，但为彼此的反向互补序列(反向)。根据一些实施方案，相对于来自相同AAV血清型的野生型ITR序列，对称的mod-ITR对包含缺失、插入或取代中的至少一种或任何组合。对称ITR中的添加、缺失或取代是相同的，但彼此反向互补。例如，在5'ITR的C区中插入3个核苷酸将反映为在3'ITR的C'区中对应部分中插入3个反向互补核苷酸。仅出于说明目的，如果在5'ITR中添加AACG，那么在3'ITR中对应位点处添加CGTT。例如，如果5'ITR有义链是ATCGATCG，在G与A之间添加AACG以产生序列ATCGAACGATCG。相应的3'ITR有义链是CGATCGAT(ATCGATCG的反向互补序列)，在T与C之间添加CGTT(即AACG的反向互补序列)以产生序列CGATCGTTCGAT(ATCGAACGATCG的反向互补序列)。
在另选的实施方案中，经修饰ITR对如本文所定义是基本上对称的-也就是说，经修饰ITR对可以具有不同的序列，但是具有对应或相同的对称的三维形状。例如，一个经修饰ITR能够来自一种血清型，而另一个经修饰ITR能够来自不同血清型，但它们在相同区域中具有相同突变(例如核苷酸插入、缺失或取代)。换句话说，仅出于说明目的，5'mod-ITR可以来自AAV2并在C区域有一个缺失，而3'mod-ITR可以来自AAV5并在C'区域中有相应的缺失，并且如果5'mod-ITR和3'mod-ITR具有相同或对称的三维空间组织，那么其作为经修饰ITR对涵盖用于在本文中。
根据一些实施方案，基本上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的mod-ITR对中的修饰ITR缺失C-C'臂，那么同源mod-ITR相应缺失C-C'环，并且在其同源mod-ITR的几何空间呈相同形状下，剩余A和B-B'环具有相似3D结构。仅作为示例，基本上对称的ITR可以具有对称的空间组织，使得它们的结构在几何空间中是相同的形状。例如，当G-C对被修饰为例如C-G对(反之亦然)或者A-T对被修饰为T-A对(反之亦然)时，可能会发生这种情况。因此，使用经修饰5'ITR的上述示例性示例作为ATCGAACGATCG和经修饰3'ITR的上述示例性示例作为CGATCGTTCGAT(即ATCGAACGATCG的反向互补序列)，如果例如5'ITR具有序列ATCGAACCATCG，其中添加的G被修饰为C，并且基本上对称的3'ITR具有序列CGATCGTTCGAT，除了a外没有T的对应修饰，则这些经修饰ITR仍将是对称的。根据一些实施方案，这种经修饰ITR对基本上是对称的，因为经修饰ITR对具有对称的立体化学。
表12示出了在用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体中使用的示例性对称的经修饰ITR对(即，经修饰的左ITR和经修饰的对称右ITR)。序列的黑体(红色)部分标识了部分ITR序列(即A-A'、C-C'和B-B'环的序列)，也在图31A至图46B中示出。这些示例性经修饰ITR可包含GCGCGCTCGCTCGCTC-3'的RBE、ACTGAGGC的间隔子、间隔子互补序列和GAGCGAGCGAGCGCGC的RBE'(即，RBE的互补序列)。
表12：用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体中的示例性对称的经修饰ITR对。
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在一些实施方案中，包含不对称的ITR对的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可包含具有修饰的ITR，所述修饰对应于以下中的任一个修饰：本文表11A至表11B中的任一个或多个中所示的ITR序列或ITR部分序列；或全文并入本文的2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图7A至图7B所示或全文以引用方式并入本文的2018年9月7日提交的国际专利申请PCT/US18/49996的表2、3、4、5、6、7、8、9或10A-10B中所公开的序列。
示例性ceDNA载体
如上文所述，本公开涉及重组ceDNA表达载体和编码抗原或免疫原性肽的ceDNA载体，其包含以下中的任一者：如上文所述的不对称的ITR对、对称的ITR对或基本上对称的ITR对。在某些实施方案中，本公开涉及具有侧接ITR序列和转基因的用于表达抗原或免疫原性肽的重组ceDNA载体，其中如本文所定义，ITR序列相对于彼此不对称、对称或基本上对称，并且ceDNA还包含位于侧接ITR之间的感兴趣的核酸序列(例如包含转基因的核酸的表达盒)，其中所述核酸分子不含病毒衣壳蛋白编码序列。
用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA表达载体可以是包含如本文所述的核酸序列的可以便利地进行重组DNA程序的任何ceDNA载体，前提是改变至少一个ITR。本公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体与其中将引入ceDNA载体的宿主细胞相容。在某些实施方案中，ceDNA载体可以是线性的。在某些实施方案中，ceDNA载体可以作为染色体外实体存在。在某些实施方案中，本公开的ceDNA载体可以含有容许供体序列整合到宿主细胞基因组中的元件。如本文所用，“转基因”、“核酸序列”和“异源核酸序列”同义，并且编码抗原或免疫原性肽，如本文所述。
现参见图1A至图1G，示出了可用于制备用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的两种非限制性质粒的功能组分的示意图。图1A、图1B、图1D、图1F示出了用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的构建体或ceDNA质粒的对应序列。ceDNA载体是无衣壳的并且可从按以下顺序编码的质粒中获得：第一ITR、可表达的转基因盒和第二ITR，其中如本文所定义，第一ITR序列和第二ITR序列相对于彼此不对称、对称或基本上对称。用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体是无衣壳的并且可从按以下顺序编码的质粒中获得：第一ITR、可表达的转基因(蛋白质或核酸)和第二ITR，其中如本文所定义，第一ITR序列和第二ITR序列相对于彼此不对称、对称或基本上对称。根据一些实施方案，可表达的转基因盒根据需要包括：增强子/启动子、一个或多个同源臂、供体序列、转录后调节元件(例如WPRE，例如SEQ IDNO:67))以及聚腺苷酸化和终止信号(例如BGH聚A，例如SEQ ID NO:68)。
图5是使用实施例中所述的方法证实从多个质粒构建体产生ceDNA的凝胶。如以上关于图4A和实施例中所论述，ceDNA由凝胶中的特征色带图案证实。
调节元件
包含如本文所定义的不对称的ITR对或对称的ITR对的如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体还可包含顺式调节元件的特定组合。顺式调节元件包含但不限于启动子、核糖开关、绝缘子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。
根据一些实施方案，各种顺式调节元件的序列可以选自2021年3月24日提交的国际申请PCT/US2021/023891中公开的那些序列中的任一个，该国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
在实施方案中，第二核酸序列包括调节序列和编码核酸酶的核酸序列。在某些实施方案中，基因调节序列可操作地连接到编码核酸酶的核酸序列。在某些实施方案中，调节序列适合于控制核酸酶在宿主细胞中的表达。在某些实施方案中，调节序列包括适合的启动子序列，所述启动子序列能够引导可操作地连接到启动子序列的基因的转录，例如编码本公开的(多种)核酸酶的核酸序列。在某些实施方案中，第二核酸序列包括连接到编码核酸酶的核酸序列的5'端的内含子序列。在某些实施方案中，在启动子的上游提供增强子序列以提高启动子的功效。在某些实施方案中，调节序列包括增强子和启动子，其中第二核酸序列包括编码核酸酶的核酸序列上游的内含子序列，其中内含子包括一个或多个核酸酶裂解位点，并且其中启动子可操作地连接到编码核酸酶的核酸序列。
适合的启动子可以来源于病毒并因此可以称为病毒启动子，或其可以来源于任何生物体，包含原核或真核生物体。适合的启动子可以用于通过任何RNA聚合酶(例如，pol I、pol II、pol III)来驱动表达。示例性启动子包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(诸如CMV即刻早期启动子区(CMVIE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、人类U6小核启动子(U6，例如，SEQ ID NO:80)(Miyagishi等人，Nature Biotechnology20,497-500(2002))、增强的U6启动子(例如，Xia等人，Nucleic Acids Res.2003年9月1日；31(17))、人类H1启动子(H1)(例如，SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:155)、CAG启动子、人类α1-抗胰蛋白酶(HAAT)启动子(例如，SEQ ID NO:82)等。在某些实施方案中，这些启动子在其下游含内含子的末端处被改变以包括一个或多个核酸酶裂解位点。在某些实施方案中，含有核酸酶裂解位点的DNA与启动子DNA是无关的。
根据一些实施方案，启动子还可以是来自人基因的启动子，诸如人泛素C(hUbC)、人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。
根据一些实施方案，启动子是组织特异性启动子。根据进一步的实施方案，组织特异性启动子是肝脏特异性启动子。根据一些实施方案，抗原或免疫原性蛋白靶向肝脏并且/或者由肝脏特异性启动子在肝脏中产生。
本领域已知的任何肝脏特异性启动子都设想用于本公开。根据一些实施方案，肝脏特异性启动子选自但不限于天然或合成的人α1-抗胰蛋白酶(HAAT)。根据一些实施方案，使用内源性ApoE、通过存在于肝细胞表面上的低密度脂蛋白(LDL)受体将包含ceDNA载体的组合物特异性靶向肝细胞可以实现向肝脏的递送。
根据本公开使用的合适启动子的非限制性示例包括但不限于以下中的任一者：CAG启动子、EF1a启动子、IE2启动子和大鼠EF1-α启动子、mEF1启动子或1E1启动子片段。
根据一些实施方案，启动子可以选自2021年3月24日提交的国际申请PCT/US2021/023891中公开的任何启动子序列，该国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
聚腺苷酸化序列：
编码聚腺苷酸化序列的序列可包含在用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体中，以使由ceDNA载体表达的mRNA稳定并且有助于核输出和转译。根据一些实施方案，ceDNA载体不包括聚腺苷酸化序列。在其他实施方案中，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个腺嘌呤二核苷酸。根据一些实施方案，聚腺苷酸化序列包括约43个核苷酸、约40个-50个核苷酸、约40个-55个核苷酸、约45个-50个核苷酸、约35个-50个核苷酸或它们之间的任何范围。
表达盒可以包含本领域已知的任何聚腺苷酸化序列或其变体。一些表达盒还可以包括SV40晚期聚A信号上游增强子(USE)序列。根据一些实施方案，USE序列可以与SV40pA或异源聚A信号组合使用。聚A序列位于编码抗原或免疫原性肽的转基因的3'。
根据一些实施方案，聚腺苷酸化序列可以选自2021年3月24日提交的国际申请PCT/US2021/023891中公开的任何聚腺苷酸化序列，该国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
表达盒还可以包含转录后元件以增加转基因的表达。根据一些实施方案，土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)用于增强转基因的表达。可以使用其它转录后处理元件，诸如来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因或乙型肝炎病毒(HBV)的转录后元件。
根据一些实施方案，转录后调节元件可以选自2021年3月24日提交的国际申请PCT/US2021/023891中公开的任何转录后调节元件序列，该国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
根据一些实施方案，编码抗原或免疫原性蛋白的一个或多个核酸序列还可以编码分泌序列，使得蛋白质被引导到高尔基体(Golgi)和内质网，并且在其穿过ER并离开细胞时通过伴侣分子折叠成正确构象。示例性分泌序列包括但不限于VH-02和VK-A26和Igκ信号序列，以及允许标记的蛋白质从细胞溶质中分泌出来的Gluc分泌信号、将标记的蛋白质引导到高尔基体的TMD-ST分泌序列。
根据一些实施方案，分泌序列可以选自2021年3月24日提交的国际申请PCT/US2021/023891中公开的任何分泌序列，该国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
核定位序列
根据一些实施方案，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体包含一个或多个核定位序列(NLS)，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个NLS。根据一些实施方案，一个或多个NLS位于氨基末端处或附近、羧基末端处或附近、或这些位置的组合(例如氨基末端的一个或多个NLS和/或羧基末端的一个或多个NLS)。当存在多于一个NLS时，每一个可以彼此独立地选择，使得单个NLS存在于多于一个拷贝中并且/或者与根据一些或多个拷贝存在的一个或多个其他NLS组合存在。
根据一些实施方案，NLS可以选自2021年3月24日提交的国际申请PCT/US2021/023891中公开的任何NLS，该国际申请的内容全文以引用方式并入本文。
V.制备ceDNA载体的方法
通用产生
用于产生如本文所定义的包含不对称的ITR对或对称的ITR对的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US18/49996的章节IV中，该国际申请全文以引用方式并入本文。根据一些实施方案，如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可以如本文所述使用昆虫细胞产生。在另选的实施方案中，如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可以合成方式产生，并且根据一些实施方案，以无细胞方法产生，如2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122所公开，该国际申请全文以引用方式并入本文。
如本文所述，根据一些实施方案，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可以例如通过包括以下步骤的方法获得：a)在能够有效诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的条件下并持续足以诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的时间，在Rep蛋白的存在下温育具有不含病毒衣壳编码序列的多核苷酸表达构建体模板(例如，ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒)的宿主细胞(例如，昆虫细胞)群体，并且其中宿主细胞不包含病毒衣壳编码序列；以及b)从宿主细胞中收获并分离ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰ITR的载体多核苷酸复制，从而在宿主细胞中产生ceDNA载体。然而，未表达病毒粒子(例如，AAV病毒粒子)。因此，没有大小限制，诸如在AAV或其它基于病毒的载体中天然强加的大小限制。
可以通过以下来确认从宿主细胞分离的ceDNA载体的存在：用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶来消化从宿主细胞分离的DNA，并在非变性凝胶上分析消化的DNA材料，以与线性和非连续DNA相比确认线性和连续DNA的特征带的存在。
在另一方面，本公开提供了将DNA载体多核苷酸表达模板(ceDNA模板)稳定地整合至其自身基因组中的宿主细胞系用于产生非病毒DNA载体的用途，例如Lee,L.等人(2013)Plos One 8(8):e69879所述。优选地，Rep以约3的MOI加入宿主细胞中。当宿主细胞系是哺乳动物细胞系、例如HEK293细胞时，该细胞系可以具有稳定整合的多核苷酸载体模板，并且可以使用第二载体、诸如疱疹病毒将Rep蛋白引入细胞中，使得在Rep和辅助病毒存在下切除和扩增ceDNA。
根据一些实施方案，用于制造如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的宿主细胞是昆虫细胞，并且使用杆状病毒递送编码Rep蛋白的多核苷酸和用于ceDNA的非病毒DNA载体多核苷酸表达构建体模板，例如图4A至图4C和实施例1中所述。根据一些实施方案，宿主细胞经工程改造以表达Rep蛋白。
然后从宿主细胞中收获和分离ceDNA载体。从细胞采集和收集本文所描述的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化，以实现高产率地产生ceDNA载体。例如，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择采集时间。根据一些实施方案，细胞生长并在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体的时间但在大多数细胞因杆状病毒毒性而开始死亡之前进行采集。可以使用质粒纯化试剂盒，诸如，Qiagen Endo-Free Plasmid试剂盒分离DNA载体。为分离质粒而开发的其它方法也适用于DNA载体。通常，可以采用任何核酸纯化方法。
DNA载体可以通过本领域的技术人员已知用于纯化DNA的任何手段来纯化。根据一些实施方案，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施方案中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。
用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的存在可以通过以下来证实：用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从细胞中分离的载体DNA，并使用凝胶电泳分析被消化和未被消化的DNA物质，以证实与线性且非连续的DNA相比线性且连续的DNA的特征带的存在。图4C和图4D示出了用于鉴定通过本文的方法产生的封闭端ceDNA载体的存在的一个实施方案。
根据一些实施方案，ceDNA是在游离环境中以合成方式产生的。
ceDNA质粒
ceDNA质粒是用于后续产生如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的质粒。根据一些实施方案，ceDNA质粒可以使用已知的技术来构建，以在转录方向上提供至少以下项作为操作性地连接的组分：(1)经修饰5'ITR序列；(2)含有顺式调节元件(例如，启动子、诱导型启动子、调节开关、增强子等)的表达盒；以及(3)经修饰3'ITR序列，其中3'ITR序列相对于5'ITR序列对称。根据一些实施方案，侧接ITR的表达盒包含用于引入外源序列的克隆位点。表达盒替换了AAV基因组的rep和cap编码区。
根据一些方面，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体从按以下顺序编码的质粒(在本文中称为“ceDNA质粒”)中获得：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、包含转基因的表达盒和经突变或经修饰AAV ITR，其中所述ceDNA质粒不含AAV衣壳蛋白编码序列。在另选的实施方案中，ceDNA-质粒按次序编码：第一(或5')经修饰或经突变AAV ITR、包括转基因的表达盒、以及第二(或3')经修饰AAV ITR，其中该ceDNA-质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'ITR彼此对称。在替代性实施方案中，ceDNA质粒按照此次序编码：第一(或5’)经修饰或突变AAV ITR、包含转基因的表达盒以及第二(或3’)经突变或修饰AAV ITR，其中所述ceDNA质粒不含AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5’经修饰ITR和3’经修饰ITR具有相同修饰(即，其相对于彼此为反向互补序列或为对称的)。
在另一个实施方案中，ceDNA质粒系统不含病毒衣壳蛋白编码序列(即，其不含AAV衣壳基因，并且还不含其它病毒的衣壳基因)。另外，在具体实施方案中，ceDNA-质粒还不含AAV Rep蛋白编码序列。因此，在一个优选实施方案中，ceDNA质粒缺乏AAV2的功能性AAVcap和AAV rep基因GG-3'加上允许发夹形成的可变回文序列。
本公开的ceDNA质粒可以使用所属领域中熟知的任何AAV血清型的基因组的天然核酸序列来产生。根据一些实施方案，ceDNA-质粒主链衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组。例如，NCBI：NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261；Kotin和Smith，The Springer Index of Viruses，可得自由Springer维护的URL(网址为oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp？virID＝42.04)。(注意，对URL或数据库的引用是指到本申请的有效提交日为止的URL或数据库的内容)。在一个具体实施方案中，ceDNA-质粒主链来源于AAV2基因组。在另一个具体实施方案中，ceDNA-质粒主链是合成的主链，其经过基因工程改造以在它的5'和3'ITR处包含衍生自这些AAV基因组之一。
ceDNA-质粒可以任选地包括选择性或选择标志物，用于建立产生ceDNA载体的细胞系。根据一些实施方案，选择标志物可以插入3'ITR序列的下游(即3')。在另一个实施方案中，选择标志物可以插入5'ITR序列的上游(即5')。适当的选择标志物包含例如赋予耐药性的那些标志物。选择标志物可以是例如杀稻瘟菌素S抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)等。在优选实施方案中，药物选择标志物是杀稻瘟菌素S抗性基因。
用于表达抗原或免疫原性肽的示例性ceDNA(例如，rAAV0)载体由rAAV质粒产生。一种用于产生rAAV载体的方法可以包括：(a)为宿主细胞提供如上文所描述的rAAV质粒，其中宿主细胞和质粒均不含衣壳蛋白编码基因，(b)在允许产生ceDNA基因组的条件下培养宿主细胞；以及(c)收获细胞并分离从该细胞产生的AAV基因组。
从ceDNA质粒制备ceDNA载体的示例性方法
本文还提供了用于制造用于表达抗原或免疫原性肽的无衣壳ceDNA载体的方法，特别是具有足够高的产量以提供足够的载体用于体内实验的方法。
根据一些实施方案，用于产生用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的方法包括以下步骤：(1)将包含表达盒和两个对称的ITR序列的核酸构建体引入宿主细胞(例如，Sf9细胞)中；(2)任选地，例如通过使用质粒上存在的选择标志物建立克隆细胞系；(3)将Rep编码基因引入(通过用携带所述基因的杆状病毒转染或感染)所述昆虫细胞中；以及(4)收获细胞并纯化ceDNA载体。上述用于产生ceDNA载体的包括表达盒和两个ITR序列的核酸构建体可以呈ceDNA质粒的形式，或如下所述用ceDNA质粒生成的杆粒或杆状病毒的形式。可以通过转染、病毒转导、稳定整合或所属领域中已知的其它方法将核酸构建体引入宿主细胞中。
细胞系
用于产生用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的宿主细胞系可包括衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的昆虫细胞系，诸如Sf9Sf21，或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞，或其他无脊椎动物、脊椎动物或其他真核细胞系，包括哺乳动物细胞。也可以使用普通技术人员已知的其它细胞系，诸如HEK293、Huh-7、HeLa、HepG2、HeplA、911、CHO、COS、MeWo、NIH3T3、A549、HT1 180、单核细胞、以及成熟和不成熟的树突状细胞。可以转染宿主细胞系以稳定表达ceDNA质粒，从而高产率地产生ceDNA载体。
可以使用本领域已知的试剂(例如脂质体、磷酸钙)或物理手段(例如电穿孔)，通过瞬时转染将ceDNA质粒引入Sf9细胞中。另选地，可以建立将ceDNA质粒稳定整合至基因组中的稳定Sf9细胞系。此类稳定细胞系可通过如上文所述将选择标志物掺入ceDNA-质粒中来建立。如果用于转染细胞系的ceDNA-质粒包含选择标志物，诸如抗生素，那么可以通过向细胞生长培养基中加入抗生素来选择已用ceDNA-质粒转染并将ceDNA-质粒DNA整合到其基因组中的细胞。然后可以通过单细胞稀释或集落转移技术来分离细胞的抗性克隆并增殖。
分离和纯化ceDNA载体
用于获得和分离ceDNA载体的方法的示例描述于图4A至图4E和下文的具体示例中。本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可以从表达AAV Rep蛋白的生产细胞获得，进一步用ceDNA质粒、ceDNA杆粒或ceDNA杆状病毒转化。可用于产生ceDNA载体的质粒包括编码抗原或免疫原性肽的质粒或编码一种或多种REP蛋白的质粒。
根据一些方面，多核苷酸编码在质粒(Rep-质粒)、杆粒(Rep-杆粒)或杆状病毒(Rep-杆状病毒)中递送到生产细胞的AAV Rep蛋白(Rep 78或68)。Rep-质粒、Rep-杆粒和Rep-杆状病毒可以通过上文所描述的方法生成。
产生用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的方法描述于本文中。用于生成如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的表达构建体可以是质粒(例如，ceDNA质粒)、杆粒(例如，ceDNA杆粒)和/或杆状病毒(例如，ceDNA杆状病毒)。仅举例来说，ceDNA-载体可以由用ceDNA-杆状病毒和Rep-杆状病毒共同感染的细胞生成。由Rep-杆状病毒产生的Rep蛋白可以复制ceDNA-杆状病毒以生成ceDNA-载体。另选地，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可以由经构建体稳定转染的细胞生成，该构建体包含编码AAV Rep蛋白(Rep78/52)的序列，该AAV Rep蛋白是在Rep质粒、Rep杆粒或Rep杆状病毒中递送的。CeDNA-杆状病毒可以瞬时转染到细胞中，通过Rep蛋白复制并产生ceDNA载体。
杆粒(例如ceDNA-杆粒)能够转染到允许的昆虫细胞中，诸如Sf9、Sf21、Tni(粉纹夜蛾)细胞、High Five细胞，并且生成ceDNA-杆状病毒，该杆状病毒是重组杆状病毒，其包括包含对称ITR的序列和表达盒。ceDNA-杆状病毒能够再次感染到昆虫细胞中以获得下一代重组杆状病毒。任选地，该步骤可以重复一次或多次以产生更大量的重组杆状病毒。
从细胞收获和收集如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化以实现ceDNA载体的高产量生产。例如，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择采集时间。通常，细胞可以在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体(例如ceDNA载体)的时间后但在大多数细胞开始因病毒毒性而死亡之前采集。可以使用质粒纯化试剂盒，例如Qiagen ENDO-FREE试剂盒从Sf9细胞中分离出ceDNA载体。为了分离质粒而开发的其它方法也可以适合于ceDNA载体。一般而言，可以采用所属领域中已知的任何核酸纯化方法，以及可商购的DNA提取试剂盒。
另选地，可以通过对细胞团块进行碱溶解法、离心所得溶解液并进行色谱分离来实施纯化。作为一个非限制性示例，该方法可以如下进行：将上清液装载到保留核酸的离子交换柱(例如，SARTOBIND)上，然后洗脱(例如，用1.2M NaCl溶液)，并在凝胶过滤柱(例如，6个快速流动GE)上进行进一步色谱纯化。然后通过例如沉淀来回收无衣壳AAV载体。
根据一些实施方案，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体还可以外泌体或微米粒子形式纯化。本领域已知许多细胞类型不仅释放出可溶性蛋白质，而且通过膜微囊泡脱落释放出复杂的蛋白质/核酸货物(Cocucci等人,2009；EP 10306226.1)。此类囊泡包括微囊泡(也称为微粒)和外泌体(也称为纳米囊泡)，两者均包含蛋白质和RNA作为货物。微囊泡由质膜的直接出芽生成，而外泌体在多囊泡内体与质膜融合后释放到细胞外的环境中。因此，可以从已经用ceDNA-质粒转导的细胞或用ceDNA-质粒生成的杆粒或杆状病毒中分离出含有ceDNA载体的微囊泡和/或外泌体。
微囊泡可以通过对培养基进行过滤或以20,000xg超速离心来分离，并且外泌体可以通过以100,000xg超速离心来分离。超速离心的最佳持续时间可以通过实验确定，并且将取决于从中分离囊泡的特定细胞类型。优选地，首先利用低速离心(例如在2000×g下进行5分钟-20分钟)清除培养基并且使用例如离心柱(Millipore,Watford,UK)进行离心浓缩。微米囊泡和外泌体可以通过使用识别存在于微米囊泡和外泌体上的特定表面抗原的特异性抗体，通过FACS或MACS进一步纯化。其它微囊泡和外泌体纯化方法包括但不限于免疫沉淀、亲和色谱、过滤和涂有特异性抗体或适体的磁珠。纯化后，用例如磷酸盐缓冲盐水洗涤囊泡。使用米囊泡或外泌体递送含ceDNA的囊泡的一个优点是，这些囊泡可通过在它们的膜上包括被相应细胞类型上的特异性受体识别的蛋白而靶向各种细胞类型。(也参见EP 10306226)
本文的本公开的另一个方面涉及从已经将ceDNA构建体稳定整合到其自身基因组中的宿主细胞系中纯化ceDNA载体的方法。根据一些实施方案，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施方案中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。
国际申请PCT/US18/49996的图5显示了凝胶证实ceDNA的产生，该ceDNA使用实施例中所述的方法由多种ceDNA-质粒构建体产生。如实施例中关于图4D所论述，ceDNA通过凝胶中的特征色带图案来证实。
VI.药物组合物
在另一方面，提供了药物组合物。药物组合物包含如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体和药学上可接受的载剂或稀释剂。
如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可掺入适于施用于受试者的药物组合物中以体内递送到受试者的细胞、组织或器官。通常，药物组合物包括如本文公开的ceDNA-载体和药学上可接受的载剂。
本文公开的药物制剂包括可以直接施用的液体(例如水性)溶液和可以通过在施用之前添加稀释剂而重构成溶液的冻干粉末。在某些实施方案中，可以使用合适的赋形剂将包含如本文所公开的ceDNA载体的制剂在含有或不含有至少一种另外的治疗剂的情况下配制为冻干物。可以在市售冻干机(例如，VirTis实验室规模冻干机)上使用通用冻干循环进行冻干。
根据一些实施方案，如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可掺入适于期望的治疗性施用途径(例如，肠胃外施用)的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及例如核内显微注射或胞浆内注射等细胞内注射进行的被动组织转导。用于治疗目的的药物组合物能够配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分之一或组合一起并入适当的缓冲液中、然后进行过滤灭菌来制备。可以配制包括ceDNA载体，以将核酸中的转基因递送到接受者的细胞，使得转基因或供体序列在其中治疗性表达。组合物还可以包括药学上可接受的载剂。
包含用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的药学活性组合物可被配制成将用于不同目的的转基因递送到细胞，例如受试者的细胞。
用于治疗目的的药物组合物通常必须在制造和存储条件下是无菌的和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起并入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。
在某些实施方案中，用于肠胃外施用的制剂可以以冻干形式或溶液形式储存。在某些实施方案中，通常将肠胃外制剂放入具有无菌出入口的容器中，例如具有以皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
在某些实施方案中，一旦已经配制药物制剂，其就可以以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体形式或以脱水或冻干粉末形式储存在无菌小瓶中。在某些实施方案中，此类制剂可以以即用型形式或以在施用之前重构的形式(例如，冻干)储存。
如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可掺入适于局部、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋巴管内、腹膜内、皮下、气管、组织内(例如肌肉内、心内、肝内、肾内、脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例如眼眶外、眼眶内、眼眶后、视网膜内、视网膜下、脉络膜、脉络膜下、基质内、眼房内和玻璃体内)、耳蜗内和经粘膜(例如经口、经直肠、经鼻)施用的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。
根据一些方面，本文所提供的方法包括将一种或多种如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体递送到宿主细胞。本文还提供了通过这类方法产生的细胞，以及包含这类细胞或由这类细胞产生的生物体(诸如动物、植物或真菌)。核酸的递送方法可包括脂质转染、核转染、显微注射、生物弹药、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物、裸DNA和药剂增强的DNA吸收。脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355)并且脂质体转染试剂有市售(例如TransfectamTM和LipofectinTM)。递送可以到细胞(例如，体外或离体施用)或靶组织(例如，体内施用)。
将核酸递送到细胞的各种技术和方法是所属领域中已知的。例如，核酸诸如用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA可被配制到脂质纳米粒子(LNP)、类脂质(lipidoid)、脂质体、脂质纳米粒子、脂质体复合物(lipoplex)或核壳纳米粒子中。通常，LNP由核酸(例如ceDNA)分子、一种或多种可电离或阳离子脂质(或其盐)、一种或多种非离子或中性脂质(例如磷脂)、防止聚集的分子(例如PEG或PEG-脂质缀合物)以及任选的固醇(例如胆固醇)构成。
另一种用于将核酸诸如用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA递送到细胞的方法是使核酸与被细胞内化的配体缀合。例如，配体可以结合细胞表面上的受体并通过胞吞而被内化。配体可以与核酸中的核苷酸共价连接。用于将核酸递送到细胞中的示例性缀合物描述于例如WO2015/006740、WO2014/025805、WO2012/037254、WO2009/082606、WO2009/073809、WO2009/018332、WO2006/112872、WO2004/090108、WO2004/091515和WO2017/177326中。
核酸诸如用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体还可以通过转染递送到细胞。有用的转染方法包含(但不限于)：脂质介导的转染、阳离子聚合物介导的转染或磷酸钙沉淀。转染试剂在所属领域中是熟知的并且包含(但不限于)：TurboFect转染试剂(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific))、Pro-Ject试剂(赛默飞世尔科技)、TRANSPASSTMP蛋白转染试剂(新英格兰生物实验室)、CHARIOTTM蛋白递送试剂(Active Motif)、PROTEOJUICETM蛋白转染试剂(EMD密理博)、293fectin、LIPOFECTAMINETM2000、LIPOFECTAMINETM3000(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTINTM(赛默飞世尔科技)、DMRIE-C、CELLFECTINTM(赛默飞世尔科技)、OLIGOFECTAMINETM(赛默飞世尔科技)、LIPOFECTACETM、FUGENETM(瑞士巴塞尔的罗氏(Roche,Basel,Switzerland))、FUGENETMHD(罗氏)、TRANSFECTAMTM(转染胺，威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,Wis.))、TFX-10TM(普洛麦格公司)、TFX-20TM(普洛麦格公司)、TFX-50TM(普洛麦格公司)、TRANSFECTINTM(加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(BioRad,Hercules,Calif.))、SILENTFECTTM(伯乐公司)、EffecteneTM(加利福尼亚州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen,Valencia,Calif.))、DC-chol(阿凡提极性脂质公司(AvantiPolar Lipids))、GENEPORTERTM(加利福尼亚圣地亚哥的基因疗法系统(Gene TherapySystems,San Diego,Calif.))、DHARMAFECT 1TM(科罗拉多州拉斐特的达尔马肯(Dharmacon,Lafayette,Colo.))、DHARMAFECT 2TM(达尔马肯)、DHARMAFECT 3TM(达尔马肯)、DHARMAFECT 4TM(达尔马肯)、ESCORTTMIII(密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma,St.Louis,Mo.))和ESCORTTMIV(西格玛化学品公司(Sigma Chemical Co.))。核酸，如ceDNA，也可以通过本领域的技术人员已知的微流体方法递送到细胞。
如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体还可以直接施用于生物体以在体内转导细胞。施用是通过正常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径，包含(但不限于)：注射、输注、局部施用和电穿孔。合适的施用此类核酸的方法是可获得的并且是本领域的技术人员公知的，并且虽然可以使用超过一种途径来施用特定的组合物，但特定的途径通常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。
根据本公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到受试者的细胞或靶器官。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242中公开了示例性脂质体和脂质体配制物，包括(但不限于)含有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物，参见例如标题为“药物配制物”的章节。
本领域已知的各种递送方法或其改良方法可用于在体外或体内递送ceDNA载体。根据一些实施方案，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体是通过机械能、电能、超声波能、流体动力能或基于激光的能量使得短暂渗透细胞膜以使得便于DNA进入靶向细胞中来递送。例如，可以通过经过大小限制的通道挤压细胞或通过所属领域中已知的其它手段来瞬时破坏细胞膜来递送ceDNA载体。根据一些实施方案，单独的ceDNA载体作为裸DNA直接注射到以下任一组织中：选自以下的任何一种或多种组织：肺、肝脏、肾脏、胆囊、前列腺、肾上腺、心脏、肠、胃、皮肤、胸腺、心肌或骨骼肌。根据一些实施方案，通过基因枪递送ceDNA载体。涂覆有无衣壳AAV载体的金或钨球形粒子(直径1μm-3μm)可以通过加压气体加速到高速而渗透到靶组织细胞中。
本文具体设想了包含用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体和药学上可接受的载剂的组合物。根据一些实施方案，ceDNA载体与脂质递送系统，例如本文所述的脂质体一起配制。根据一些实施方案，此类组合物通过熟练从业人员期望的任何途径来施用。可以通过不同途径，包括经口、肠胃外、舌下、经皮直肠、经粘膜、局部、通过吸入、经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内鞘内和关节内或其组合，向受试者施用组合物。对于兽医用途，可根据正常兽医实践将组合物作为适当可接受的配制物施用。兽医可以很容易地确定最适合具体动物的给药方案和施用途径。可以通过传统注射器、无针注射装置、“微弹轰击基因枪”或其它物理方法(诸如电穿孔(“EP”)、流体动力学方法或超声波)施用组合物。
根据一些情况，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体是通过流体动力学注射来递送，该流体动力学注射是将任何水溶性化合物和粒子直接细胞内递送到内脏和整个肢体的骨骼肌中的简单且高效的方法。
根据一些实施方案，用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体是通过超声波，通过在膜中制造纳米级孔以便于将DNA粒子细胞内递送到内脏或肿瘤的细胞中来递送，因此质粒DNA的大小和浓度在系统的效率中起重要作用。根据一些实施方案，通过使用磁场的磁转染来递送ceDNA载体，以将含有核酸的粒子集中到靶细胞中。
根据一些实施方案，可以使用化学递送系统，例如通过使用纳米复合物，其包含用属于阳离子脂质体/胶束或阳离子聚合物的聚阳离子纳米粒子来压紧带负电核酸。用于递送方法的阳离子脂质包含但不限于单价阳离子脂质、多价阳离子脂质、含胍化合物、胆固醇衍生化合物、阳离子聚合物、(例如聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、鱼精蛋白、其它阳离子聚合物)和脂质-聚合物杂化物。
A.外泌体：
根据一些实施方案，如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体是通过包装于外泌体中来递送。外泌体是胞吞来源的小膜囊泡，其在多囊泡体与质膜融合后被释放到细胞外环境中。其表面由来自供体细胞的细胞膜的脂质双层组成，其含有来自产生外泌体的细胞的胞溶质并且在表面上展现来自亲本细胞的膜蛋白。外泌体由包含上皮细胞、B和T淋巴细胞、肥大细胞(MC)以及树突状细胞(DC)在内的各种细胞类型产生。根据一些实施方案，设想使用直径在10nm与1μm之间、20nm与500nm之间、30nm与250nm之间、50nm与100nm之间的外泌体。使用外泌体的供体细胞或通过将特定核酸引入外泌体中，可以分离外泌体以递送到靶细胞中。所属领域中已知的各种方法可以用于产生含有本公开的无衣壳AAV载体的外泌体。
微粒/纳米粒子
根据一些实施方案，如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体通过脂质纳米粒子递送。通常，脂质纳米粒子包括可电离氨基脂质(例如，4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯、DLin-MC3-DMA、磷脂酰胆碱(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，DSPC)、胆固醇和外被脂质(聚乙二醇-二肉豆蔻酰基甘油，PEG-DMG)，例如如Tam等人，(2013).Advances in Lipid Nanoparticles for siRNAdelivery.Pharmaceuticals 5(3):498-507所公开的。
根据一些实施方案，脂质纳米粒子具有介于约10nm与约1000nm之间的平均直径。根据一些实施方案，脂质纳米粒子具有小于300nm的直径。根据一些实施方案，脂质纳米粒子具有介于约10nm与约300nm之间的直径。根据一些实施方案，脂质纳米粒子具有小于200nm的直径。根据一些实施方案，脂质纳米粒子具有介于约25nm与约200nm之间的直径。根据一些实施方案，脂质纳米粒子制剂(例如，包含多个脂质纳米粒子的组合物)具有一定的大小分布，其中平均大小(例如，直径)为约70nm至约200nm，并且更通常，平均大小为约100nm或更小。
所属领域中已知的多种脂质纳米粒子可用于递送如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体。例如，在美国专利号9,404,127、9,006,417和9,518,272中描述了使用脂质纳米粒子的各种递送方法。
偶联物
根据一些实施方案，如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体与增强细胞吸收的药剂缀合(例如，共价结合)。“增加细胞吸收的药剂”是促进核酸跨脂质膜运输的分子。例如，核酸能够与亲脂性化合物(例如胆固醇、生育酚等)、细胞穿透肽(CPP)(例如穿膜肽、TAT、Syn1B等)和多胺(例如精胺)缀合。增强细胞吸收的药剂的其他示例公开于例如Winkler(2013).Oligonucleotide conjugates for therapeuticapplications.Ther.Deliv.4(7)；791-809。
根据一些实施方案，如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体与聚合物(例如聚合分子)或叶酸(folate)分子(例如叶酸(folic acid)分子)缀合。通常，与聚合物缀合的核酸的递送是所属领域中已知的，例如WO2000/34343和WO2008/022309中所描述。根据一些实施方案，如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体与聚(酰胺)聚合物缀合，例如美国专利8,987,377所述。根据一些实施方案，将本公开所描述的核酸与叶酸分子缀合，如美国专利8,507,455中所描述。
根据一些实施方案，如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体与碳水化合物缀合，例如美国专利8,450,467所述。
纳米胶囊
另选地，可以使用如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的纳米胶囊配制物。纳米胶囊通常可以呈稳定并且可再现的方式截留物质。为了避免由于细胞内聚合物过载所致的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计此类超细粒子(大小约0.1μm)。满足这些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米粒子是预期使用的。
脂质体
根据本公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到受试者的细胞或靶器官。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。
脂质体的形成和使用是本领域的技术人员通常已知的。已经研发了血清稳定性和循环半衰期有所改善的脂质体(美国专利号5,741,516)。此外，已经描述了脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载剂的各种方法(美国专利号5,567,434、5,552,157、5,565,213、5,738,868和5,795,587)。
示例性脂质体和脂质纳米粒子(LNP)组合物
根据本公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可以被添加到脂质体中以递送到细胞，例如需要表达转基因的细胞。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。
包含ceDNA载体的脂类纳米粒子(LNP)公开于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042；2018年12月6日提交的国际申请PCT/US2018/064242；以及2022年4月20日提交的国际申请PCT/US2022/025455，所述申请全文并入本文并被设想用于如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的方法和组合物。
根据一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包含一种或多种具有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物(所谓的“PEG化的化合物”)，该聚乙二醇官能团可以降低一种或多种该化合物的免疫原性/抗原性、为其提供亲水性和疏水性并降低剂量频率。或者，脂质体配制物仅包含聚乙二醇(PEG)聚合物作为额外组分。在此类方面，PEG或PEG官能团的分子量可以从62Da至约5,000Da。
根据一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其将在数小时至数周的时间内以延长释放或受控释放曲线来递送API。根据一些相关的方面，脂质体配制物可以包括以脂质双层结合的水性腔。在其它相关方面，脂质体配制物将API与组分一起囊封起来，该组分在升高的温度下经历物理转变，在数小时到数周的时段内释放API。
根据一些方面，脂质体配制物包括鞘磷脂和一种或多种本文公开的脂质。根据一些方面，脂质体配制物包括光敏体。
根据一些方面，本公开提供了脂质体配制物，其包括选自以下项的一种或多种脂质：N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐、(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、MPEG(甲氧基聚乙二醇)缀合的脂质、HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)；PEG(聚乙二醇)；DSPE(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)；DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)；DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)；DPPG(二棕榈酰基磷脂酰甘油)；EPC(卵磷脂酰胆碱)；DOPS(二油酰基磷脂酰丝氨酸)；POPC(棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱)；SM(鞘磷脂)；MPEG(甲氧基聚乙二醇)；DMPC(二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱)；DMPG(二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油)；DSPG(二硬脂酰基磷脂酰甘油)；DEPC(二芥酰基磷脂酰胆碱)；DOPE(二油酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)、胆固醇硫酸酯(CS)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、DOPC(二油酰基-sn-甘油-磷脂酰胆碱)或它们的任何组合。
根据一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，其包括磷脂、胆固醇和PEG化脂质，摩尔比为56:38:5。根据一些方面，脂质体配制物的总脂质含量为2mg/mL-16mg/mL。根据一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质。根据一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质，摩尔比分别为3:0.015:2。根据一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、胆固醇和PEG化脂质。根据一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和胆固醇。根据一些方面，PEG化脂质是PEG-2000-DSPE。根据一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括DPPG、大豆PC、MPEG-DSPE脂质缀合物和胆固醇。
根据一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括一种或多种含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和一种或多种含有乙醇胺官能团的脂质。根据一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物包括以下中的一种或多种：含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和固醇，例如胆固醇。根据一些方面，脂质体配制物包括DOPC/DEPC；和DOPE。
根据一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物还包括一种或多种药物赋形剂，例如蔗糖和/或甘氨酸。
根据一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质体配制物。根据一些方面，本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或泡沫基粒子的脂质体配制物。根据一些方面，本公开提供了一种相对普通纳米粒子的相对大小更大并且大小为约150nm至250nm的脂质体配制物。根据一些方面，脂质体配制物是冻干粉末。
根据一些方面，本公开提供了一种脂质体配制物，该脂质体配制物通过向在脂质体外部具有分离的ceDNA的混合物中添加弱碱，用本文中公开或描述的ceDNA载体制备并负载该ceDNA载体。这种添加将脂质体外部的pH提高到大致7.3，并驱动API进入脂质体中。根据一些方面，本公开提供了一种脂质体内部pH为酸性的脂质体配制物。在此类情况下，脂质体的内部可以处于pH 4-6.9下，并且更优选pH 6.5。在其它方面，本公开提供了一种通过使用脂质体内药物稳定化技术制备的脂质体配制物。在这样的情况下，利用聚合或非聚合的带高电荷阴离子和脂质体内俘获剂，例如多磷酸盐或蔗糖八硫酸盐。
根据一些方面，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。例如，通过如2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042中公开的方法获得的ceDNA制备并负载ceDNA的脂质纳米粒子配制物，该申请并入本文中。这可以通过在低pH下将乙醇脂质与ceDNA水溶液高能混合，使可电离脂质质子化并为ceDNA/脂质缔合和粒子成核提供有利的能量来实现。通过水稀释和去除有机溶剂可以进一步稳定粒子。能够将颗粒浓缩至所需水平。
一般来说，脂质纳米粒子是以约10:1到60:1的总脂质:ceDNA(质量或重量)比制备。根据一些实施方案，脂质与ceDNA比率(质量/质量比率；w/w比率)的范围可以是约1:1至约60:1、约1:1至约55:1、约1:1至约50:1、约1:1至约45:1、约1:1至约40:1、约1:1至约35:1、约1:1至约30:1、约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1、约6:1至约9:1、约30:1至约60:1。根据一些实施方案，脂质粒子(例如，脂质纳米粒子)以约60:1的ceDNA(质量或重量)与总脂质比率制备。根据一些实施方案，脂质粒子是以约10:1到30:1的总脂质:ceDNA(质量或重量)比制备。根据一些实施方案，脂质与ceDNA比率(质量/质量比率；w/w比率)可以在约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。能够调节脂质和ceDNA的量以提供所需的N/P比，例如N/P比为3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，脂质颗粒配制物的总脂质含量能够在约5mg/mL至约30mg/mL的范围内。
可电离脂质通常用于在低pH值下浓缩核酸货物(例如ceDNA)并驱动膜缔合和融合。通常，可电离脂质是包含至少一个氨基的脂质，该氨基在酸性条件下(例如在pH 6.5或更低的条件下)带正电或质子化。可电离脂质在本文中也称为阳离子脂质。
示例性可电离脂质描述于国际PCT专利公开WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO2012/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346和WO2013/086354；以及美国专利公开US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458和US2013/0195920，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据一些实施方案，可电离脂质为具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：
脂质DLin-MC3-DMA描述于Jayaraman等人,Angew.Chem.Int.Ed Engl.(2012),51(34):8529-8533，其内容以全文引用的方式并入本文。
根据一些实施方案，可电离脂质是如WO2015/074085中所述的脂质ATX-002，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据一些实施方案，可电离脂质是如WO2012/040184中所述的(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据一些实施方案，可电离脂质是如WO2015/199952中所述的化合物6或化合物22，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据一些实施方案，可电离脂质选自如PCT/US2022/025455所述的脂质1到脂质25，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据一些实施方案，可电离脂质选自由以下项组成的组：
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以及
没有限制，可电离脂质可以占脂质纳米粒子中存在的总脂质的20％-90％(mol)。例如，可电离脂质摩尔含量可以为脂质纳米粒子中存在的总脂质的20％-70％(mol)、30％-60％(mol)或40％-50％(mol)。根据一些实施方案，可电离的脂质占脂质纳米粒子中存在的总脂质的约50mol％至约90mol％。
根据一些方面，脂质纳米粒子还可以包含非阳离子脂质。非离子脂质包括两亲脂质、中性脂质和阴离子脂质。因此，非阳离子脂质可以是中性不带电的、两性离子型或阴离子脂质。非阳离子脂质通常用于增强融合性。
设想用于如本文所公开的方法和组合物中的示例性非阳离子脂质描述于2018年9月7日提交的国际申请PCT/US2018/050042和2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242中，该国际申请全文并入本文中。示例性非阳离子脂质描述于国际申请公开WO2017/099823和美国专利公开US2018/0028664中，两者的内容以全文引用的方式并入本文中。
非阳离子脂质能够占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0％-30％(mol)。例如，非阳离子脂质含量为脂质纳米粒子中存在的总脂质的5％-20％(mol)或10％-15％(mol)。在各种实施方案中，可电离的脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1。
根据一些实施方案，脂质纳米粒子不包含任何磷脂。根据一些方面，脂质纳米粒子还可以包含诸如固醇等组分，以提供膜完整性。
能够用于脂质纳米粒子的一种示例性固醇是胆固醇和其衍生物。示例性胆固醇衍生物描述于国际申请WO2009/127060和美国专利公开US2010/0130588中，该文献以全文引用的方式并入本文。
提供膜完整性的组分(诸如固醇)能够占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0％-50％(mol)。根据一些实施方案，此类组分占脂质纳米粒子的总脂质含量的20％-50％(mol)、30％-40％(mol)。
根据一些方面，脂质纳米粒子还可以包含聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米粒子的聚集和/或提供空间稳定。示例性缀合脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物以及其混合物。根据一些实施方案，缀合的脂质分子是PEG-脂质缀合物，例如(甲氧基聚乙二醇)缀合的脂质。示例性PEG-脂质缀合物包括(但不限于)：PEG-二酰基甘油(DAG)(如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG丁二酸酯二酰基甘油(PEGS-DAG)(如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，或其混合物。另外的示例性PEG-脂质缀合物描述于例如US5,885,613、US6,287,591、US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224和US2017/0119904中，所有这些文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据一些实施方案，PEG-脂质是如US2018/0028664中定义的化合物，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。根据一些实施方案，US20150376115或US2016/0376224中公开了PEG-脂质，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
PEG-DAA缀合物可以是例如PEG-二月桂酰氧基丙基、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基、PEG-二棕榈酰氧基丙基或PEG-二硬脂酰氧基丙基。PEG-脂质可以是以下中的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂基甘油、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂基甘油、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基甘油酰胺、PEG-二硬脂基甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰氨基-3',6'-二氧杂辛基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二(十四烷氧基)苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)，以及1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。根据一些示例，PEG-脂质可以选自由以下项组成的组：PEG-DMG、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。
还能够使用与除PEG之外的分子缀合的脂质替代PEG-脂质。例如，代替PEG-脂质或除PEG-脂质以外，还可以使用聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(如ATTA-脂质缀合物)和阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物。示例性的缀合脂质(即，PEG-脂质、(POZ)-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质)描述于WO1996/010392、WO1998/051278、WO2002/087541、WO2005/026372、WO2008/147438、WO2009/086558、WO2012/000104、WO2017/117528、WO2017/099823、WO2015/199952、WO2017/004143、WO2015/095346、WO2012/000104、WO2012/000104和WO2010/006282；美国专利申请公开US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2013/0303587、US2018/0028664、US2015/0376115、US2016/0376224、US2016/0317458、US2013/0303587、US2013/0303587和US20110123453；和US5,885,613、US6,287,591、US6,320,017和US6,586,559，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
组合
根据一些实施方案，ceDNA载体与一种或多种另外的治疗剂例如抗癌治疗剂、自身免疫治疗剂、感染性疾病治疗剂组合施用。根据一些实施方案，药剂是如本文所述的第二抗原或免疫原性肽。在一些实施方案中，ceDNA和另外的药剂的作用是协同的。术语“协同的”或“协同”是指两种或更多种药剂的组合与它们的单独效应相比具有超过累加的效应。在一些实施方案中，当第一药剂产生可检测水平的输出X，第二药剂产生可检测水平的输出X，并且第一药剂和第二药剂一起产生超过累加水平的输出X时，存在协同活性。
一些人类肿瘤可被患者的免疫系统消除。例如，施用靶向免疫“检查点”分子的单克隆抗体可导致完全应答和肿瘤缓解。此类抗体的作用模式是通过抑制肿瘤选定的逃避抗肿瘤免疫应答的免疫调节分子来实现的。通过抑制这些“检查点”分子(例如，用拮抗抗体)，可允许患者的CD8+T细胞增殖并破坏肿瘤细胞。例如，施用靶向例如但不限于CTLA-4或PD-1的单克隆抗体可导致完全应答和肿瘤缓解。此类抗体的作用模式是通过抑制肿瘤选定的逃避抗肿瘤免疫应答的CTLA-4或PD-1来实现的。通过抑制这些“检查点”分子(例如，用拮抗抗体)，可允许患者的CD8+T细胞增殖并破坏肿瘤细胞。
因此，本文提供的包含编码一种或多种肿瘤相关抗原的核酸序列的ceDNA载体可与一种或多种靶向免疫“检查点”分子的阻断抗体组合使用。例如，在一些实施方案中，本文提供的组合物可与一种或多种靶向诸如CTLA-4或PD-1的分子的阻断抗体组合使用。
根据一些实施方案，ceDNA组合物与佐剂一起施用。佐剂包括但不限于弗氏佐剂、GM-CSF、Montanide(例如，Montanide IMS1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V和Montanide ISA-51)、1018ISS、铝盐、AS15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、鞭毛蛋白或来源于鞭毛蛋白的TLR5配体、FLT3配体、IC30、IC31、咪喹莫特瑞喹莫德、ImuFact IMP321、白介素如IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21、IL-23、干扰素α或β、或其聚乙二醇化衍生物、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、ISCOMs、JuvImmune、LipoVac、MALP2、MF59、单磷酰脂A、油包水型和水包油型乳剂、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、OspA、/>载体系统、聚(丙交酯-共-乙交酯)[PLG]基和葡萄聚糖微粒、talactoferrin SRL172、病毒体和其他病毒样颗粒、YF-17D、VEGF捕获剂、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Aquila's QS21刺激剂、分枝杆菌提取物和合成细菌细胞壁模拟物、Ribi's Detox、Quil、Superfos、环磷酰胺、舒尼替尼、贝伐单抗、塞来昔布、NCX-4016、西地那非、他达拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、坦罗莫司、XL-999、CP-547632、帕唑帕尼、VEGF捕获剂、ZD2171、AZD2171和抗CTLA4抗体。CpG免疫刺激性寡核苷酸可用于增强疫苗环境中佐剂的效应。
根据一些实施方案，ceDNA载体的核酸序列还包含编码佐剂的序列。
本文还提供了包含所产生的经脂质纳米粒子囊封的昆虫细胞或如本文所述的以合成方式产生的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体以及药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。
根据一些方面，本公开提供了一种脂质纳米粒子配制物，该脂质纳米粒子配制物还包含一种或多种药物赋形剂。根据一些实施方案，脂质纳米粒子配制物还包含蔗糖、tris、海藻糖和/或甘氨酸。
ceDNA载体能够与粒子的脂质部分复合或囊封于脂质纳米粒子的脂质位置。根据一些实施方案，可以将ceDNA完全囊封在脂质纳米粒子的脂质位置中，从而保护其免于被核酸酶降解，例如在水溶液中。根据一些实施方案，脂质纳米粒子中的ceDNA在37℃脂质纳米粒子暴露于核酸酶至少约20分钟、30分钟、45分钟或60分钟后基本上不降解。根据一些实施方案，脂质纳米粒子中的ceDNA在将血清中的粒子在37℃温育至少约30分钟、45分钟或60分钟或至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时或36小时后基本上不降解。
在某些实施方案中，脂质纳米粒子对受试者，例如对哺乳动物，诸如人基本上是无毒的。根据一些方面，脂质纳米粒子配制物是冻干粉末。
根据一些实施方案，脂质纳米粒子是具有至少一个脂质双层的固体芯粒子。在其它实施方案中，脂质纳米粒子具有非双层结构，即非层状(即非双层)形态。不受限制，非双层形态能够包括例如三维管、棒、对称立方体等。举例来说，使用例如Cryo-TEM分析，能够轻松地评估且表征脂质纳米粒子的形态(片层对非片层)，如US2010/0130588中所述，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
根据一些其它实施方案，具有非层状形态的脂质纳米粒子是电子致密的。根据一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质纳米粒子。根据一些方面，本公开提供了一种包含多囊泡粒子和/或基于泡沫的粒子的脂质纳米粒子配制物。
通过控制脂质组分的组成和浓度，可以控制脂质缀合物从脂质粒子中交换出来的速率，进而可以控制脂质纳米粒子融合的速率。另外，包括例如pH、温度或离子强度的其它变量可以用于改变和/或控制脂质纳米粒子融合的速率。基于本公开，本领域的技术人员将清楚可以用于控制脂质纳米粒子融合的速率的其它方法。同样显而易见，通过控制该脂质缀合物的组合物和浓度，可以控制脂质颗粒的大小。
配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的有效性相关(参见Jayaraman等人，Angewandte Chemie，国际版(2012),51(34),8529-8533；Semple等人，NatureBiotechnology 28,172-176(20l 0)，这两篇文献均全文以引用方式并入)。pKa的优选范围是约5到约7。使用基于2-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS)荧光的测定法测定脂质纳米粒子中阳离子脂质的pKa。
VII.治疗方法
如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体还可用于将感兴趣的核酸序列递送到靶细胞(例如，宿主细胞)的方法中。具体地，该方法可以是用于将抗原和免疫原性肽递送到对其有需要的受试者的细胞并治疗疾病或病症的方法。
本文所述的抗体或抗原结合片段(即，抗原)的靶标可以选自多种病原体，包括例如细菌、病毒、真菌和寄生虫感染剂。合适的靶标还可以包括癌症或癌症相关抗原等。另外其他靶标可以包括自身免疫病状，诸如类风湿性关节炎(RA)或多发性硬化症(MS)。
另外，本公开提供了用于将抗原和免疫原性肽递送到对其有需要的受试者的细胞的方法，该方法包括多次施用编码所述抗原和免疫原性肽的本公开的ceDNA载体。由于本公开的ceDNA载体不像对囊封病毒载体通常所观察到那样诱导免疫应答，所以该多次施用策略将可能在基于ceDNA的系统中取得更大的成功。ceDNA载体是以足以转染期望组织的细胞和提供足够的基因转移和抗原和免疫原性肽表达水平而无不当副作用的量施用。
如本文所述的用于表达抗原和免疫原性肽的ceDNA载体的递送不限于所表达的抗原或免疫原性肽的递送。例如，常规产生(例如使用基于细胞的产生方法(例如昆虫细胞产生方法))或合成产生的如本文所述的ceDNA载体可以联合为了提供基因疗法的一部分而提供的其他递送系统使用。可以与根据本公开的ceDNA载体组合的系统的一个非限制性示例包括为了使表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体实现有效的基因表达而分别递送一种或多种辅因子或免疫抑制剂的系统。
本文所述的免疫球蛋白构建体的靶标可以选自多种病原体，包括例如细菌、病毒、真菌和寄生虫感染剂。合适的靶标还可以包括癌症或癌症相关抗原等。另外其他靶标可以包括自身免疫病状，诸如类风湿性关节炎(RA)或多发性硬化症(MS)。
病毒靶标的示例包括来自正粘病毒科(orthomyxovirudae family)的流感病毒，其包括：甲型流感、乙型流感和丙型流感。甲型病毒是毒性最强的人类病原体。与流行病相关联的甲型流感的血清型包括H1N1，其造成1918年的西班牙流感和2009年的猪流感；H2N2，其造成1957年的亚洲流感；H3N2，其造成1968年的中国香港流感；H5N1，其造成2004年的禽流感；H7N7；H1N2；H9N2；H7N2；H7N3；和H10N7。
已经描述了针对甲型流感的广谱中和抗体。如本文所用，“广谱中和抗体”是指可以中和来自多种亚型的多种品系的中和抗体。例如，CR6261[The Scripps Institute/Crucell]已被描述为结合广泛范围的流感病毒的单克隆抗体，该流感病毒包括1918年“西班牙流感”(SC1918/H1)和2004年在越南从鸡传染给人的H5N1类禽流感(Viet04/H5)。CR6261识别血凝素(流感病毒表面上的主要蛋白质)的膜近端茎中高度保守的螺旋区。该抗体描述于WO 2010/130636中，其以引用方式并入本文。另一种中和抗体F10[XOMA Ltd]已被描述为对H1N1和H5N1有用。[Sui等人,Nature Structural and Molecular Biology(Sui等人,2009,16(3):265-73)]可以选择针对流感的其他抗体，例如，Fab28和Fab49。参见例如WO2010/140114和WO 2009/115972，其以引用方式并入本文。还可以容易地选择其他抗体，诸如在WO 2010/010466、美国公开的专利公开US/2011/076265和WO 2008/156763中描述的那些。
其他靶标病原性病毒包括沙粒病毒(arenaviruses)(包括funin、马休波病毒(machupo)和拉沙病毒(Lassa))、丝状病毒(filoviruses)(包括马堡病毒(Marburg)和埃博拉病毒(Ebola))、汉坦病毒(hantaviruses)、小核糖核酸病毒(picornaviridae)(包括鼻病毒(rhinoviruses)、埃可病毒(echovirus))、冠状病毒(coronaviruses)、副粘病毒(paramyxovirus)、麻疹病毒(morbillivirus)、呼吸道合胞病毒、披膜病毒(togavirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、细小病毒B19、副流感病毒(parainfluenza)、腺病毒、呼肠孤病毒(reoviruses)、来自痘病毒科的天花(variola)(重型天花(天花(Smallpox)))和牛痘(Vaccinia)(牛痘(Cowpox))，和水痘带状疱疹(伪狂犬病)。
病毒性出血热是由沙粒病毒科的成员(拉沙热)(该科还与淋巴细胞性脉络丛脑膜炎(LCM)相关联)、丝状病毒(埃博拉病毒)和汉坦病毒(普马拉病毒(puremala))引起的。小核糖核酸病毒(鼻病毒亚科)的成员与人的普通感冒有关。冠状病毒科包括许多非人病毒，诸如感染性支气管炎病毒(家禽)、猪传染性胃肠病毒(猪)、猪血凝素脑脊髓炎病毒(猪)、猫感染性腹膜炎病毒(猫)、猫肠道冠状病毒(猫)、犬冠状病毒(狗)。人呼吸道冠状病毒被认为与普通感冒，非甲型、乙型或丙型肝炎以及突发性急性呼吸道综合征(SARS)有关。副粘病毒科包括副流感病毒1型、副流感病毒3型、牛副流感病毒3型、腮腺炎病毒属(rubulavirus)(腮腺炎病毒)、副流感病毒2型、副流感病毒4型、新城疫病毒(鸡)、牛瘟、麻疹病毒(包括麻疹和犬瘟热)和肺病毒(pneumovirus)(包括呼吸道合胞病毒(RSV))。细小病毒科包括猫细小病毒(猫肠炎)、猫泛白细胞减少症病毒(feline panleucopeniavirus)、犬细小病毒和猪细小病毒。腺病毒科包括引起呼吸系统疾病的病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。
还可以选择针对细菌病原体的中和抗体构建体用于本公开。在一个实施方案中，中和抗体构建体针对细菌本身。在另一个实施方案中，中和抗体构建体针对由细菌产生的毒素。空气传播的细菌病原体的示例包括例如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)(脑膜炎)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)(肺炎)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(肺炎)、类鼻疽假单胞菌(Pseudomonas pseudomallei)(肺炎)、鼻疽假单胞菌(Pseudomonas mallei)(肺炎)、不动杆菌属(Acinetobacter)(肺炎)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、腔隙莫拉氏菌(Moraxella lacunata)、产碱杆菌属(Alkaligenes)、心杆菌属(Cardiobacterium)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)(流感)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)(百日咳)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)(肺炎/发热)、肺炎军团菌(Legionella pneumonia)(军团病)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)(肺炎)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)(肺炎)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(结核(TB))、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)(TB)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)(肺炎)、星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)(肺炎)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)(炭疽)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(肺炎)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(猩红热)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(肺炎)、白喉棒状杆菌(Corynebacteria diphtheria)(白喉)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)(肺炎)。
炭疽的病原体是由炭疽杆菌产生的毒素。已经描述了针对保护剂(PA)(形成类毒素的三种肽之一)的中和抗体。另外两种多肽由致死因子(LF)和水肿因子(EF)组成。已经描述了抗PA中和抗体在针对炭疽的被动免疫中是有效的。参见例如美国专利7,442,373；R.Sawada-Hirai等人，J Immune Based Ther Vaccines.2004；2:5.(2004年5月12日在线)。另外已经描述和/或可产生其他抗炭疽毒素中和抗体。类似地，针对其他细菌和/或细菌毒素的中和抗体可用于产生如本文所述的AAV递送的抗病原体构建体。
其它感染性疾病可以由空气传播的真菌引起，该真菌包括例如曲霉属(Aspergillus species)物种、伞状犁头霉(Absidia corymbifera)、匍枝根霉(Rhixpusstolonifer)、毛霉(Mucor plumbeaus)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasm capsulatum)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、青霉菌(Penicillium)物种、干草小多孢菌(Micropolysporafaeni)、普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris)、交替链格孢(Alternariaalternate)、枝孢属(Cladosporium)物种、长蠕孢属(Helminthosporium)和葡萄穗霉属(Stachybotrys)物种。
此外，被动免疫还可用于预防真菌感染(例如，脚癣)、癣，或病毒、细菌、寄生虫、真菌和其他可通过直接接触传播的病原体。此外，还有多种影响家庭宠物、牛和其他家畜以及其他动物的状况。例如，在狗身上，由犬鼻窦曲霉病引起的上呼吸道感染导致严重的疾病。在猫身上，如果不进行治疗，则源于鼻子的上呼吸道疾病或猫呼吸系统疾病综合征会导致发病和死亡。牛易于被感染性牛鼻气管炎(通常称为IBR或红鼻)感染，这是牛的急性、传染性病毒疾病。此外，牛易患牛呼吸道合胞病毒(BRSV)，该病毒导致轻度至重度呼吸道疾病并可能损害对其他疾病的抵抗力。另外其他病原体和疾病对于本领域技术人员来说是显而易见的。参见例如美国专利5,811,524，其描述了抗呼吸道合胞病毒(RSV)中和抗体的产生。其中描述的技术适用于其他病原体。此类抗体可以完整使用或其序列(支架)经修饰以产生人工或重组中和抗体构建体。已经描述此类方法[参见例如WO 2010/13036；WO 2009/115972；WO 2010/140114]。
如本文所述的抗肿瘤免疫球蛋白可以靶向人表皮生长因子受体(HER)，诸如HER2。例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)是重组IgG1κ人源化单克隆抗体，其在基于细胞的测定中以高亲和力(Kd＝5nM)选择性结合人表皮生长因子受体蛋白的细胞外结构域。市售产品在CHO细胞培养物中生产。参见例如www.drugbank.ca/drugs/DB00072。曲妥珠单抗轻链1和2以及重链1和2的氨基酸序列以及从曲妥珠单抗的x-射线结构研究获得的序列在该数据库中以登录号DB00072提供，该序列以引用方式并入本文。也参见212-Pb-TCMC-曲妥珠单抗[Areva Med,Bethesda,Md.]。另一种所关注的抗体包括例如帕妥珠单抗(pertuzumab)，一种靶向人表皮生长因子受体2蛋白(HER2)的细胞外二聚化结构域(亚结构域II)的重组人源化单克隆抗体。其由分别具有448个和214个残基的两条重链和两条轻链组成。FDA于2012年6月8日批准。其重链和轻链的氨基酸序列例如在该数据库中以登录号DB06366的www.drugbank.ca/drugs/DB06366(同义词包括2C4、MOAB 2C4、单克隆抗体2C4和rhuMAb-2C4)中提供。除了HER2之外，可以选择其他HER靶标。
例如，MM-121/SAR256212是靶向HER3受体的全人单克隆抗体[Merrimack'sNetwork Biology]，并且已报道其可用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌和卵巢癌。SAR256212是靶向HER3(ErbB3)受体的研究性全人单克隆抗体[Sanofi Oncology]。另一种抗Her3/EGFR抗体是描述为可用于头颈癌的RG7597[Genentech]。也可以使用另一种抗体，玛格妥昔单抗(margetuximab)(或MGAH22)，靶向HER[MacroGenics]的下一代Fc优化的单克隆抗体(mAb)。
另选地，可以靶向其他人上皮细胞表面标志物和/或其他肿瘤受体或抗原。其他细胞表面标志物靶标的示例包括例如5T4、CA-125、CEA(例如，由拉贝珠单抗(labetuzumab)靶向)、CD3、CD19、CD20(例如，由利妥昔单抗(rituximab)靶向)、CD22(例如，由依帕珠单抗(epratuzumab)或维妥珠单抗(veltuzumab)靶向)、CD30、CD33、CD40、CD44、CD51(也是整联蛋白αvβ3)、CD133(例如，成胶质细胞瘤细胞)、CTLA-4(例如，用于治疗例如成神经细胞瘤的伊匹木单抗(Ipilimumab))、趋化因子(C-X-C基序)受体2(CXCR2)(在大脑的不同区域中表达；例如抗CXCR2(细胞外)抗体#ACR-012(Alomene Labs))；EpCAM，成纤维细胞活化蛋白(FAP)[参见例如，WO 2012020006 A2，脑癌]、叶酸受体α(例如，儿童室管膜脑瘤、头颈癌)、成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)(参见等人，讨论用抗FGFR1抗体治疗癌症的WO2012125124A1)、FGFR2(参见例如，在WO2013076186A和WO2011143318A2中描述的抗体)、FGFR3(参见例如，在美国专利8,187,601和WO2010111367A1中描述的抗体)、FGFR4(参见例如，在WO2012138975A1中描述的抗FGFR4抗体)、肝细胞生长因子(HGF)(参见例如，WO2010119991A3中的抗体)、整联蛋白α5β1、IGF-1受体、神经节苷脂GD2(参见例如，在WO2011160119A2中描述的抗体)、神经节苷脂GD3、跨膜糖蛋白NMB(GPNMB)(与神经胶质瘤有关)等等以及抗体格巴妥木单抗(glembatumumab)(CR011)、粘蛋白、MUC1、磷脂酰丝氨酸(例如，由巴维昔单抗(bavituximab)靶向，Peregrine Pharmaceuticals,Inc])、前列腺癌细胞、PD-L1(例如，纳武单抗(nivolumab)(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538)、全人gG4例如，转移性黑素瘤]、血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)或CD140、肿瘤相关糖蛋白72(TAG-72)、腱生蛋白C、肿瘤坏死因子(TNF)受体(TRAIL-R2)、血管内皮生长因子(VEGF)-A(例如，由贝伐单抗(bevacizumab)靶向)和VEGFR2(例如，由雷莫芦单抗(ramucirumab)靶向)的靶标。
其他抗体及其靶标包括例如APN301(hu14.19-IL2)，一种单克隆抗体[儿童恶性黑素瘤和成神经细胞瘤，Apeiron Biolgics,Vienna,Austria]。还参见例如单克隆抗体8H9，其已被描述为可用于治疗实体瘤，包括转移性脑癌。单克隆抗体8H9是对B7H3抗原具有特异性的小鼠IgG1抗体[United Therapeutics Corporation]。该小鼠抗体可以是人源化的。本文还可以使用靶向B7-H3和/或B7-H4抗原的其他免疫球蛋白构建体。另一种抗体是S58(抗GD2，成神经细胞瘤)。CotaraTM[Perregrince Pharmaceuticals]是描述用于治疗复发性成胶质细胞瘤的单克隆抗体。其他抗体可包括例如阿瓦斯汀(avastin)、非拉妥组单抗(ficlatuzumab)、medi-575和奥拉单抗(olaratumab)。还可以选择其他免疫球蛋白构建体或单克隆抗体用于本文。参见例如，Medicines in Development Biologics,2013年报告，第1-87页，PhRMA's Communications&Public Affairs Department.(202)835-3460的出版物，其以引用方式并入本文。
例如，免疫原可以选自多种病毒家族。需要针对其进行免疫应答的病毒家族的示例包括小核糖核酸病毒科，其包括导致约50％的普通感冒病例的鼻病毒属；肠道病毒属，其包括脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒和人肠道病毒诸如甲型肝炎病毒；以及口疮病毒属，其主要在非人动物中引起口蹄疫。在病毒的小核糖核酸病毒科中，靶抗原包括VP1、VP2、VP3、VP4和VPG。另一个病毒家族包括杯状病毒科，其涵盖诺瓦克群病毒，该病毒是流行性胃肠炎的重要病原体。期望用于靶向抗原以在人类和非人类动物中诱导免疫应答的另一病毒家族是披膜病毒科，其包括α病毒属，其包括辛德比斯病毒(Sindbis viruses)、罗斯河病毒(RossRiver virus)以及委内瑞拉、东方和西方马脑炎，和风疹病毒属(rubivirus)，包括风疹病毒。黄病毒科包括登革热病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒和蜱传脑炎病毒。其他靶抗原可以由丙型肝炎或冠状病毒科产生，其包括许多非人病毒，诸如感染性支气管炎病毒(家禽)、猪传染性胃肠病毒(猪)、猪凝血性脑脊髓炎病毒(猪)、猫感染性腹膜炎病毒(猫)、猫肠道冠状病毒(猫)、犬冠状病毒(狗)，和人呼吸道冠状病毒，其可以引起普通感冒和/或非甲型、乙型或丙型肝炎。在冠状病毒科中，靶抗原包括E1(也称为M蛋白或基质蛋白)、E2(也称为S蛋白或刺突蛋白)、E3(也称为HE或血凝素-elterose)糖蛋白(不存在于所有冠状病毒中)或N(核衣壳)。还有其他抗原可以靶向棒状病毒科，其包括水泡病毒属(例如，水泡性口炎病毒)和狂犬病毒属(例如，狂犬病)。
在棒状病毒科中，合适的抗原可以来源于G蛋白或N蛋白。丝状病毒科(包括出血热病毒，诸如马堡病毒和埃博拉病毒)可以是合适的抗原来源。副粘病毒科包括副流感病毒1型、副流感病毒3型、牛副流感病毒3型、腮腺炎病毒属(腮腺炎病毒)、副流感病毒2型、副流感病毒4型、新城疫病毒(鸡)、牛瘟、麻疹病毒(包括麻疹和犬瘟热)和肺病毒(包括呼吸道合胞病毒)。流感病毒分类属于正粘病毒科，并且是合适的抗原来源(例如，HA蛋白、N1蛋白)。布尼亚病毒科包括布尼亚病毒属(加利福尼亚脑炎、拉克罗斯脑炎(La Crosse))、白蛉病毒属(立夫特山谷热)、汉坦病毒属(普马拉(puremala)是出血热病毒)、纳伊罗病毒属(nairovirus)(内罗毕羊病)和各种未命名的布尼亚病毒。沙拉病毒科提供了针对LCM和拉沙热病毒的抗原来源。呼肠弧病毒科包括呼肠弧病毒属、轮状病毒属(其引起儿童急性胃肠炎)、环状病毒属和科罗拉多蜱热病毒属(cultivirus)(科罗拉多蜱传热，莱邦博病(Lebombo)(人类)、马器质性脑病、蓝舌症)。
逆转录病毒科包括致癌病毒(oncorivirinal)亚科，该亚科涵盖此类人类和兽类疾病，如猫白血病病毒、HTLVI和HTLVII、慢病毒(包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马感染性贫血病毒和泡沫病毒)。在慢病毒属中，许多合适的抗原已经被描述并且可以容易地被选择作为靶标。合适的HIV和SIV抗原的示例包括但不限于gag、pol、Vif、Vpx、VPR、Env、Tat、Nef和Rev蛋白，以及它们的各种片段。例如，合适的Env蛋白片段可包括其长度例如为至少约8个氨基酸的任何亚基，诸如gp120、gp160、gp41或其更小片段。类似地，可以选择tat蛋白的片段。[参见美国专利5,891,994和6,193,981]。还参见D.H.Barouch等人，J.Virol.,75(5):2462-2467(2001年3月)和R.R.Amara等人，Science,292:69-74(2001年4月6日)中描述的HIV和SIV蛋白。在另一个示例中，HIV和/或SIV免疫原性蛋白或肽可以用于形成融合蛋白或其他免疫原性分子。参见例如，2001年8月2日公布的WO 01/54719和1999年4月8日公布的WO 99/16884中描述的HIV-1Tat和/或Nef融合蛋白和免疫方案。本公开不限于本文所述的HIV和/或SIV免疫原性蛋白或肽。此外，对这些蛋白质的多种修饰已经被描述或可以由本领域技术人员容易地进行。参见例如，在美国专利号5,972,596中描述的修饰的gag蛋白。
乳多空病毒科包括多瘤病毒亚科(BKU和JCU病毒)和乳头瘤病毒亚科(与癌症或乳头瘤的恶性进展有关)。腺病毒科包括引起呼吸系统疾病和/或肠炎的病毒(EX、AD7、ARD、O.B.)。细小病毒科包括猫细小病毒(猫肠炎)、猫泛白细胞减少症病毒(felinepanleucopeniavirus)、犬细小病毒和猪细小病毒。疱疹病毒科包括α疱疹病毒亚科，其涵盖单纯疱疹病毒属(HSVI、HSVII)、水痘病毒属(伪狂犬病、水痘带状疱疹)，以及β疱疹病毒亚科，其包括巨细胞病毒属(HCMV、鼠巨细胞病毒)，以及γ疱疹病毒亚科，其包括淋巴隐病毒属、EBV(伯基特淋巴瘤)、感染性鼻气管炎、马立克氏病(Marek's disease)病毒和蛛猴病毒属(rhadinovirus)。痘病毒科包括脊椎动物痘病毒亚科，其涵盖正痘病毒属(天花属(天花)和牛痘属(牛痘))、副痘病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒、兔痘病毒、猪痘病毒和昆虫痘病毒亚科。肝DNA病毒科包括乙肝病毒。一种可以作为合适抗原来源的未分类病毒是丁型肝炎病毒。其他病毒来源可以包括禽传染性法氏囊病病毒和猪呼吸道生殖道综合征病毒。α病毒科包括马动脉炎病毒和各种脑炎病毒。
抗体的其他病原性靶标可以包括例如感染人类和非人类脊椎动物或来自癌细胞或肿瘤细胞的细菌、真菌、寄生性微生物或多细胞寄生虫。细菌病原体的示例包括病原性革兰氏阳性球菌(pathogenic gram-positive cocci)，包括肺炎球菌(pneumococci)；葡萄球菌(staphylococci)；和链球菌(streptococci)。病原性革兰氏阴性球菌(Pathogenicgram-negative cocci)包括脑膜炎球菌(meningococcus)；淋球菌(gonococcus)。病原性肠道革兰氏阴性杆菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)；假单胞菌属(pseudomonas)、不动杆菌属(acinetobacteria)和艾肯菌属(eikenella)；类鼻疽菌属(melioidosis)；沙门氏菌属(salmonella)；志贺氏菌属(shigella)；嗜血杆菌属(haemophilus)；莫拉氏菌属(moraxella)；杜克嗜血杆菌(H.ducreyi)(其引起软下疳)；布鲁氏菌属(brucella)；土拉热弗朗西丝菌(Franisella tularensis)(其引起兔热病)；耶尔森菌属(yersinia)(巴斯德菌属(pasteurella))；念珠状链杆菌(streptobacillus moniliformis)和螺菌属(spirillum)；革兰氏阳性杆菌包括单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)；白喉棒杆菌(Corynebacteriumdiphtheria)(白喉)；霍乱菌；炭疽杆菌(B.anthracis)(炭疽)；杜诺凡病菌(donovanosis)(腹股沟肉芽肿)；和巴尔通体病菌(bartonellosis)。由病原性厌氧细菌引起的疾病包括破伤风；肉毒杆菌中毒(botulism)；其他梭状芽孢杆菌病(clostridia)；结核病；麻风病；和其他分枝杆菌病。病原性螺旋体病包括梅毒；密螺旋体病(treponematoses)：雅司病(yaws)、品他病(pinta)和地方性梅毒；和钩端螺旋体病。由高等病原体细菌和病原性真菌引起的其他感染包括放线菌病(actinomycosis)；诺卡氏菌病(nocardiosis)；隐球菌病(cryptococcosis)、芽生菌病(blastomycosis)、组织胞浆菌病(histoplasmosis)和球孢子菌病(coccidioidomycosis)；念珠菌病(candidiasis)、曲霉菌病(aspergillosis)和毛霉菌病(mucormycosis)；孢子丝菌病(sporotrichosis)；副球孢子菌病(paracoccidiodomycosis)、霉样真菌病(petriellidiosis)、球拟酵母病(torulopsosis)、足分枝菌病(mycetoma)和着色真菌病(chromomycosis)；和皮真菌病(dermatophytosis)。立克次氏体(Rickettsial)感染包括斑疹伤寒、洛矶山斑疹热(Rocky Mountain spottedfever)、Q热和立克次氏体痘(Rickettsialpox)。支原体和衣原体感染的示例包括：肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)；性病性淋巴肉芽肿；鹦鹉热；和围产期衣原体感染。病原性真核生物包括病原性原生动物和蠕虫并且由其产生的感染包括：阿米巴病(amebiasis)；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形虫病；卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)；倒睫症(Trichans)；刚地弓形虫病(Toxoplasma gondii)；巴贝虫病(babesiosis)；贾第鞭毛虫病(giardiasis)；旋毛虫症(trichinosis)；丝虫病(filariasis)；血吸虫病(schistosomiasis)；线虫病(nematode)；吸虫(trematode)或吸虫(fluke)病；和绦虫(cestode)(绦虫(tapeworm))感染。
许多这些生物体和/或由其产生的毒素已经通过疾病控制中心(Centers forDisease Control)[(CDC)，美国健康与人类服务部门(Department of Health and HumanServices,USA)]鉴定为具有用于生物侵袭的可能性的药剂。例如，这些生物药剂中的一些包括炭疽杆菌(炭疽)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)及其毒素(肉毒杆菌中毒)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(鼠疫)、重型天花(天花)、土拉弗朗西斯菌(兔热病)，和病毒性出血热[丝状病毒(例如，埃博拉病毒、马堡病毒]，和沙粒病毒[例如，拉沙病毒、马休波病毒])，所有这些生物药剂目前均分类为A类药剂；贝氏柯克斯体(Coxiella burnetti)(Q热)；布鲁氏菌属物种(布鲁氏菌病(brucellosis))、鼻疽伯克氏菌(Burkholderia mallei)(鼻疽)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)(类鼻疽)、蓖麻及其毒素(蓖麻毒素)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)及其毒素(ε毒素)、葡萄球菌属物种及其毒素(肠毒素B)、鹦鹉热衣原体(鹦鹉热)、水安全性威胁(例如，霍乱弧菌(Vibriocholerae)、小球隐孢子虫(Crytosporidium parvum))、斑疹伤寒(普氏立克氏体(Richettsia powazekii))，和病毒性脑炎(α病毒，例如委内瑞拉马脑炎；东方马脑炎；西方马脑炎)；所有这些目前均分类为B类药剂；和立百病毒(Nipan virus)和汉坦病毒，它们目前被分类为C类药剂。此外，在未来可以出于此类目的鉴定和/或使用如此分类或不同分类的其他生物体。将容易理解的是，本文所述的病毒载体和其他构建体可用于靶向来自这些生物体、病毒、它们的毒素或其他副产物的抗原，这将预防和/或治疗感染或用这些生物药剂的其他不良反应。
如本文所述的用于表达抗原和免疫原性肽、用于治疗或预防病毒感染的ceDNA载体的有效或治疗有效剂量是指如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的量，该量足以减轻所治疗的受试者的感染的一种或多种体征和/或症状，无论是通过诱导此类体征和/或症状的消退或消除，还是通过抑制此类体征和/或症状的进展。剂量可以根据待施用的受试者的年龄和体型、目标疾病、病状、施用途径等而变化。在本公开的一个实施方案中，用于治疗或预防例如成年人类受试者的病毒感染的本公开的抗体或其抗原结合片段的有效或治疗有效剂量为约0.01mg/kg至约200mg/kg，例如，至多约150mg/kg。在本公开的一个实施方案中，剂量为至多约10.8克或11克(例如，约1克、2克、3克、4克、5克、6克、7克、8克、9克、10克或11克)。根据疾病或感染的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。在某些实施方案中，如本文所述的用于表达抗原和免疫原性肽的ceDNA载体可以初始剂量，随后以一个或多个二次剂量施用。在某些实施方案中，初始剂量之后可以施用第二剂量或多个后续剂量的抗原，其量可以与初始剂量的量大致相同或更少，其中后续剂量间隔至少1天至3天；至少一周、至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周。
施用ceDNA载体的受试者可能患有病毒感染，例如流感感染，或倾向于发生感染。倾向于发生感染的受试者或可能处于感染(例如，冠状病毒或流感病毒)的风险较高的受试者包括由于自身免疫疾病而免疫系统受损的受试者、接受免疫抑制疗法的受试者(例如，在器官移植后)、患有人免疫缺陷综合征(HIV)或获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的受试者、具有消耗或破坏白细胞的贫血症形式的受试者、接受放射或化学疗法的受试者或患有炎性病症的受试者。另外，非常年轻(例如，5岁或更小)或年老(例如，65岁或更老)的受试者的风险增加。此外，受试者可能由于接近疾病的爆发而处于感染病毒感染的风险中，例如，受试者居住在人口稠密的城市中或非常接近已确诊或疑似感染病毒的受试者，或就业选择，例如，医院工作者、药物研究人员、前往感染地区的旅行者或飞行常客。
本公开还涵盖向处于疾病或病症例如病毒感染风险的受试者预防性施用如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体，以便预防此类感染。“预防(Prevent/preventing)”意指向受试者施用如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体，以抑制受试者体内的疾病或感染(例如，病毒感染)的表现，其中如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体在以有效或治疗有效量或剂量施用于受试者时是有效的。
根据一些实施方案，受试者中病毒感染的体征或症状是受试者体内病毒的存活或增殖，例如，如通过病毒滴度测定(例如，含胚鸡蛋中的冠状病毒增殖或冠状病毒刺突蛋白测定)所确定。本文讨论了病毒感染的其他体征和症状。
如上所述，根据一些实施方案，受试者可以是非人动物，并且本文讨论的抗体和抗原结合片段可以在兽医背景下用于治疗和/或预防非人动物(例如，猫、狗、猪、牛、马、山羊、兔、绵羊等)的疾病。
本公开提供了一种用于治疗或预防有需要的受试者(例如，人)的病毒感染(例如，冠状病毒感染)或用于诱导病毒感染的至少一种体征或症状的消退或消除或抑制其进展的方法，该体征或症状诸如：发烧或感觉发烧/发冷；咳嗽；喉咙痛；流鼻涕或鼻塞；打喷嚏；肌肉或身体疼痛；头痛；疲劳(疲倦)；呕吐；腹泻；呼吸道感染；胸部不适；呼吸急促；支气管炎；和/或肺炎，该体征或症状继发于病毒感染，该方法通过向受试者施用治疗有效量的如本文所述的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体来进行。
离体治疗
根据一些实施方案，从受试者去除细胞，将如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体引入其中，并且然后将细胞替换回到受试者中。从受试者取出细胞进行离体处理、然后再引回到受试者中的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号5,399,346；其公开内容全文并入本文)。另选地，将ceDNA载体引入另一个受试者的细胞，引入培养细胞中，或引入任何其它适合来源的细胞中，并将细胞施用于有需要的受试者。
经如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体转导的细胞优选地以“治疗有效量”与药物载剂组合施用于受试者。本领域的技术人员将了解，治疗效果不必是完全的或治愈的，只要给受试者提供了一些益处即可。
根据一些实施方案，如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可以编码如本文所述的将在细胞中体外、离体或体内产生的抗体及其抗原结合片段。例如，与本文所述的ceDNA载体在如本文所讨论的治疗方法中的使用形成相比，根据一些实施方案，可以将用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体引入经培养细胞中并从细胞分离所表达的抗原或免疫原性肽，例如用于产生抗体和融合蛋白。根据一些实施方案，包含如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的培养细胞可用于商业上生产抗体或融合蛋白，例如充当小规模或大规模生物制造抗体或融合蛋白的细胞源。在另选的实施方案中，将如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体引入宿主非人类受试者的细胞中，用于体内生产抗体或融合蛋白，包括小规模生产以及商业大规模抗原或免疫原性肽生产。
如本文所公开的用于表达抗原和免疫原性肽的ceDNA载体可用于兽医学与医学应用中。如上所述的离体基因递送方法的合适受试者包括禽类(例如鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和野鸡)和哺乳动物(例如人、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬和兔)，以哺乳动物为优选。人类受试者是最优选的。人类受试者包括新生儿、婴儿、青少年和成人。
剂量范围
本文提供了治疗方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含如本文所述的编码抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的组合物。
可以任选地采用体内和/或体外分析来帮助鉴定使用的最优剂量范围。配制物中准备采用的精确剂量还将取决于施用途径和病状严重度，并应根据本领域的技术人员的判断和每个受试者的情况来决定。有效剂量可以从衍生自体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线外推。
如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体是以足以转染期望组织的细胞和足以提供足够水平的基因转移和表达而无不当副作用的量施用。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于上文在“施用”部分中所述的那些途径，例如直接递送至选定的器官(例如门静脉内递送至肝脏)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、肿瘤内和其它肠胃外施用途径。如果需要，施用途径可以组合。
实现特定“治疗效果”所需的如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的剂量将基于若干因素而变化，所述因素包括但不限于：核酸施用途径、实现治疗效果所需的基因或RNA表达水平、所治疗的特定疾病或病症以及基因、RNA产物或所得的所表达的蛋白质的稳定性。本领域的技术人员可以基于前述的因素以及所属领域中熟知的其它因素容易地确定治疗患有特定疾病或病患的患者的ceDNA载体剂量范围。
剂量方案可以调整，以提供最优的治疗应答。例如，可以重复施用寡核苷酸，例如可以每天施用若干剂，或者可以根据治疗情况的紧急程度的指示，按比例减少剂量。本领域的技术人员将能够容易地确定主题寡核苷酸的适当剂量和施用计划，无论所述寡核苷酸是将施用于细胞还是受试者。
临床使用的“治疗有效剂量”将落在相对较宽的范围内，该范围可以通过临床试验确定并将取决于特定应用(例如，神经细胞将需要很少的量，而全身性注射将需要大量)。例如，对于体内直接注射到人类受试者的骨骼肌或心肌中，治疗有效剂量将为约1μg至100g左右的ceDNA载体。如果使用外泌体或微粒来递送ceDNA载体，那么可以通过实验确定治疗有效剂量，但预计递送1μg至约100g的载体。此外，治疗有效剂量是表达足量的转基因、从而对受试者起作用的ceDNA载体的量，其使得疾病的根据一些或多种症状减少，但不产生显著的脱靶或显著的不良副作用。根据一些实施方案，“治疗有效量”是所表达的抗原或免疫原性肽的量，该量足以使给定疾病症状的减轻产生统计显著的可测量变化。指定的ceDNA载体组合物的此类有效量能够在临床试验以及动物研究中加以调整。
对于体外转染，递送到细胞(1×106个细胞)的如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的有效量将为约0.1μg至100μg、优选地1μg至20μg并且更优选地1μg至15μg或8μg至10μg ceDNA载体。ceDNA载体越大，需要的剂量越高。如果使用外泌体或微粒，那么可以通过实验确定有效的体外剂量，但意图递送大致相同量的ceDNA载体。
治疗可以涉及施用单次剂量或多次剂量。根据一些实施方案，可以向受试者施用超过一个剂量；实际上，可以根据需要施用多个剂量，因为ceDNA载体由于没有病毒衣壳而不会引发抗衣壳的宿主免疫应答。因此，本领域的技术人员可以容易地确定适当剂量次数。根据一些实施方案，剂量以初始剂量给药方案施用。
不希望受任何特定理论的束缚，缺乏通过施用如本公开所述的ceDNA载体引发的典型抗病毒免疫应答(即，不存在衣壳组分)允许用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体在多种场合施用于宿主。根据一些实施方案，将核酸递送到受试者的次数在2次至10次的范围内(例如2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次)。根据一些实施方案，向受试者递送ceDNA载体超过5次。根据一些实施方案，向受试者递送ceDNA载体超过3次。根据一些实施方案，向受试者递送ceDNA载体超过2次。
根据一些实施方案，每个日历天(例如，24小时时间段)向受试者施用一剂量的如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体不超过一次。根据一些实施方案，每2个、3个、4个、5个、6个或7个日历日向受试者施用一剂量ceDNA载体不超过一次。根据一些实施方案，每个日历周(例如，7个日历天)向受试者施用一剂量的如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体不超过一次。根据一些实施方案，ceDNA载体的剂量施用于受试者，每两周不超过一次(例如两个日历周时间段为一次)。根据一些实施方案，每日历月向受试者施用一剂量的ceDNA载体不超过一次(例如30个日历日为一次)。根据一些实施方案，每六个日历月向受试者施用一剂量的ceDNA载体不超过一次。根据一些实施方案，每个日历年(例如365天或闰年366天)向受试者施用一剂量的ceDNA载体不超过一次。
根据一些实施方案，在第0天施用一剂量的ceDNA载体。在第0天进行初始治疗后，可以在用ceDNA载体进行初始治疗后约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周或约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年、约12年、约13年、约14年、约15年、约16年、约17年、约18年、约19年、约20年、约21年、约22年、约23年、约24年、约25年、约26年、约27年、约28年、约29年、约30年、约31年、约32年、约33年、约34年、约35年、约36年、约37年、约38年、约39年、约40年、约41年、约42年、约43年、约44年、约45年、约46年、约47年、约48年、约49年或约50年内执行第二次给药(重新给药)。
根据一些实施方案，重新给药治疗性核酸引起治疗性核酸的表达增加。根据一些实施方案，与第一剂量之后治疗性核酸的表达相比，在重新给药之后治疗性核酸的表达在重新给药治疗性核酸之后增加高于约0.5倍到约10倍、约1倍到约5倍、约1倍到约2倍、或约0.5倍、约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍。
在具体实施方案中，超过一次施用(例如，两次、三次、四次或更多次施用)如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可以用于在不同间隔期内，例如每天、每周、每月、每年等实现所期望的抗体表达水平。
根据一些实施方案，由如本文所公开的ceDNA载体编码的治疗抗原或免疫原性肽可通过调节开关、可诱导或可抑制型启动子进行调节以使得其在受试者中表达至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少36小时、至少48小时、至少72小时、至少1周、至少2周、至少1个月、至少2个月、至少6个月、至少12个月/一年、至少2年、至少5年、至少10年、至少15年、至少20年、至少30年、至少40年、至少50年或更长时间。根据一些实施方案，通过在预定或期望的间隔时间反复施用本文所述的ceDNA载体能够实现表达。
如本文所述，根据一些实施方案，表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体可以与另外的化合物组合施用。
单位剂型
根据一些实施方案，包含如本文所公开的用于表达抗原或免疫原性肽的ceDNA载体的药物组合物可以便利地以单位剂型呈现。单位剂量通常将适于药物组合物的一种或多种特定施用途径。根据一些实施方案，单位剂量适合于静脉内、肌肉内或皮下施用。根据一些实施方案，单位剂量适合于通过吸入施用。根据一些实施方案，单位剂量适合于通过气化器施用。根据一些实施方案，单位剂量适合于通过喷雾器施用。根据一些实施方案，单位剂量适合于通过气雾器施用。根据一些实施方案，单位剂量适合于口服施用、经颊施用或舌下施用。
使用ceDNA载体测试成功的基因表达
所属领域中众所周知的测定可用于测试ceDNA载体对抗原或免疫原性肽的基因递送的效率，该测试可以在体外和体内模型中执行。本领域的技术人员通过测量抗原或免疫原性肽的mRNA和蛋白质水平(例如，逆转录PCR、蛋白质印迹分析和酶联免疫吸附测定(ELISA))能够评估ceDNA对抗原或免疫原性肽的表达水平。根据一些实施方案，ceDNA包含可以用于评估抗体及其抗原结合片段表达的报告蛋白，例如通过利用荧光显微术或发光读盘器检查报告蛋白的表达。对于体内应用，蛋白质功能测定可用于测试给定抗原或免疫原性肽的功能性以确定基因表达是否成功进行。熟练的技术人员能够确定用于测量由ceDNA载体体外或体内表达的抗原或免疫原性肽的功能性的最佳测试。
本文预期在细胞或受试者中ceDNA载体对抗原或免疫原性肽的基因表达的效应可以持续至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少四个月、至少5个月、至少六个月、至少10个月、至少12个月、至少18个月、至少2年、至少5年、至少10年、至少20年，或可以永久。
本申请全文中引用的所有专利和其他出版物(包括参考文献、授权的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)以引用的方式明确地并入本文，以描述和公开例如在此类出版物中描述的可以与本文所述的技术结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。关于这一点，任何内容都不应被解释为承认发明者无权借助先前公开或出于任何其它原因而提前所述公开。关于这些文件的日期的所有声明或关于内容的陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不等同于承认这些文件的日期或内容的正确性。
实施例
通过说明而非限制的方式提供了以下实施例。本领域的技术人员将了解，可以从本文所述的任何野生型或修饰ITR中构建ceDNA载体，并且以下示例性方法可以用于构建和评估这类ceDNA载体的活性。虽然这些方法以某些ceDNA载体为例，但它们适用于符合描述的任何ceDNA载体。
实施例1：使用基于昆虫细胞的方法构建ceDNA载体
使用多核苷酸构建体模板生产ceDNA载体描述于PCT/US18/49996的实施例1中，其通过引用整体并入本文。例如，用于生成本公开的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以为ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒。不受理论的限制，在许可宿主细胞中，在存在例如Rep存在下，具有两个对称ITR和表达构建体的多核苷酸构建体模板进行复制以产生ceDNA载体，其中该ITR中的至少一个ITR相对于野生型ITR序列被修饰。ceDNA载体产生经历两个步骤：首先，经由Rep蛋白从模板主链(例如，ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；以及其次，切除的ceDNA载体的Rep介导的复制。
产生ceDNA载体的一种示例性方法是从如本文所描述的ceDNA-质粒产生。参照图1A和图1B，每个ceDNA质粒的多核苷酸构建体包括经修饰左ITR和经修饰右ITR，在ITR序列之间有以下序列：(i)增强子/启动子；(ii)转基因的克隆位点；(iii)转录后应答元件(例如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE))；以及(iv)多腺苷酰化信号(例如来自牛生长激素基因(BGHpA))。在每个组分之间还引入了独特的限制性核酸内切酶识别位点(R1-R6)(图1A和图1B中所示)，以便于将新的遗传组分引入构建体中的特定位点。将R3(PmeI)GTTTAAAC(SEQ ID NO:123)和R4(PacI)TTAATTAA(SEQ ID NO:124)酶位点工程改造成克隆位点以引入转基因的开放阅读框。将这些序列克隆到从ThermoFisher Scientific获得的pFastBacHT B质粒中。
ceDNA-杆粒的产生：
依循根据制造商说明书的方案，用测试或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞，赛默飞世尔)。诱导DH10Bac细胞中质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以生成重组ceDNA-杆粒。通过以下方法来选择重组杆粒：在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上利用抗生素基于大肠杆菌中的蓝白筛选来筛选阳性选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)，以选择转化体并维持杆粒和转座酶质粒。挑选出由破坏β-半乳糖苷指示基因的易位所造成的白色菌落，并在10ml培养基中进行培养。
从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒，并使用FugeneHD将其转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在25℃在T25烧瓶内的50ml培养基中进行培养。四天后，从细胞去除培养基(含有P0病毒)，将培养基通过0.45μm过滤器过滤，从细胞或细胞碎片中分离出感染性杆状病毒粒子。
任选地，第一代杆状病毒(P0)通过在50ml到500ml培养基中感染原初Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞在回转式振荡温育箱的悬浮培养液中、在130rpm下、在25℃维持，监测细胞直径和存活率，直到细胞达到18nm-19nm直径(从14nm-15nm的原初直径)和约4.0E+6个细胞/mL的密度。感染后第3天到第8天，利用离心去除细胞和残骸、然后通过0.45μm过滤器过滤来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。
收集包括测试构建体的ceDNA-杆状病毒，并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体地说，用P1杆状病毒按下列稀释度治疗4×20ml 2.5E+6个细胞/ml的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并且在25℃-27℃温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及持续4天到5天的每天的细胞活力的变化来测定感染性。
如PCT/US18/49996的图8A中所公开的“Rep质粒”(所述文献以全文引用的方式并入本文中)在pFASTBACTM-Dual表达载体(赛默飞世尔)中产生，所述表达载体包含Rep78(SEQID NO:131或133)和Rep52(SEQ ID NO:132)或Rep68(SEQ ID NO:130)和Rep40(SEQ ID NO:129)。依循制造商提供的方案，将Rep-质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞(赛默飞世尔))中。诱导DH10Bac细胞中Rep-质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以生成重组杆粒(“Rep-杆粒”)。通过阳性选择来选择重组杆粒，该阳性选择包括在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上在大肠杆菌中进行蓝白筛选(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)。挑选分离的白色菌落，并接种到10ml选择培养基(含卡那霉素、庆大霉素(gentamicin)、四环素的LB培养液)中。从大肠杆菌中分离出重组杆粒(Rep-杆粒)，并将Rep-杆粒转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中，以产生感染性杆状病毒。
将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天，并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地，第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染原生Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增并且在50ml到500ml培养基中培养。在感染后3天与8天之间，通过离心或过滤或其它分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体地说，用P1杆状病毒按下列稀释度治疗四个20mL的2.5x106个细胞/mL的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4天到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
ceDNA载体产生和表征
参考图4B，然后将含有以下项中任一种的Sf9昆虫细胞培养基分别以1:1000和1:10,000的比率添加到新鲜的Sf9细胞培养物(2.5E+6个细胞/ml，20ml)中：(1)含有ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒的样品和(2)上述Rep杆状病毒。然后将细胞在25℃以130rpm培养。共同感染4天到5天后，检测细胞直径和活力。当细胞直径达到18nm-20nm并且活力为约70％-80％时，将细胞培养物离心，去除培养基，并收集细胞团粒。首先将细胞团粒悬浮于适量的水性介质，即水或缓冲液中。使用凯杰(Qiagen)MIDIPLUSTM纯化方案(凯杰，每个柱处理0.2mg细胞团粒质量)从细胞中分离并纯化ceDNA载体。
初始基于260nm下的UV吸光度，测定从Sf9昆虫细胞产生和纯化的ceDNA载体的产量。
可以通过如图4D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
通过用限制性核酸内切酶消化从共同感染的Sf9细胞(如本文所述)获得的DNA，进一步分析分离的ceDNA载体的结构，该限制性核酸内切酶是针对以下条件选择的：a)在ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得到的片段足够大，以便在0.8％变性琼脂糖凝胶上进行分级分离时被清楚看到(>800bp)。如图4D和图4E所示，具有非连续结构的线性DNA载体以及具有线性和连续结构的ceDNA载体可以通过它们反应产物的大小来区分-例如，预计具有非连续结构的DNA载体将产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的非衣壳化载体预计产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价封闭端的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价封闭的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价封闭的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外，由于多聚体DNA载体的端对端连接，对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图4D)。
如本文所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA载体的分析”是指一种通过执行限制性核酸内切酶消化、随后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA封闭端的分析。后面是一种这样的示例性分析，尽管本领域的技术人员将了解，对这个实施例可以进行许多本领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶，其将生成DNA载体长度的大致1/3x和2/3x的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的色带解析。变性之前，重要的是从样品中去除缓冲液。Qiagen PCR清洁试剂盒或脱盐“离心柱”，例如GE HEALTHCARE ILUSTRAMICROSPINTMG-25柱，是核酸内切酶消化的一些本领域已知的选项。该分析包括例如：i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA；2)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒，用蒸馏水洗脱；iii)添加10x变性溶液(10x＝0.5M NaOH、10mMEDTA)，添加10X染料，不进行缓冲，并与通过添加10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起，在预先与1mM EDTA和200mM NaOH一起培育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8％-1.0％凝胶上进行分析，并在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑动凝胶。本领域的技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后，将凝胶排出并在1x TBE或TAE中进行中和，并转移到蒸馏水或含1x SYBR金的1x TBE/TAE中。然后，可以用例如赛默飞世尔的金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000×浓缩液)和辐射荧光(蓝色)或UV(312nm)使带可视化。
生成的ceDNA载体的纯度可以使用任何本领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法，通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较，能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。例如，如果基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带，那么存在1μg ceDNA载体，且ceDNA载体是总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入作图-例如，如果总ceDNA载体是8kb，而切下的比较带为2kb，那么带强度将按总输入的25％绘制，在这种情况下，对于1.0μg输入，将为.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量，然后可以用于测定ceDNA载体所表示的总输入的百分比或纯度百分比。
出于比较的目的，实施例1描述了使用基于昆虫细胞的方法和多核苷酸构建体模板生产ceDNA载体，并且还描述在PCT/US18/49996的实施例1中，其通过引用整体并入本文。例如，用于根据实施例1生成本公开的ceDNA载体的多核苷酸构建体模板可以为ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒。不受理论的限制，在许可宿主细胞中，在存在例如Rep存在下，具有两个对称ITR和表达构建体的多核苷酸构建体模板进行复制以产生ceDNA载体，其中该ITR中的至少一个ITR相对于野生型ITR序列被修饰。ceDNA载体产生经历两个步骤：首先，经由Rep蛋白从模板主链(例如，ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒基因组等)中切除(“拯救”)模板；以及其次，切除的ceDNA载体的Rep介导的复制。
在使用昆虫细胞的方法中产生ceDNA载体的示例性方法是通过如本文所述的ceDNA-质粒。参照图1A和图1B，每个ceDNA质粒的多核苷酸构建体包括经修饰左ITR和经修饰右ITR，在ITR序列之间有以下序列：(i)增强子/启动子；(ii)转基因的克隆位点；(iii)转录后应答元件(例如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE))；以及(iv)多腺苷酰化信号(例如来自牛生长激素基因(BGHpA))。在每个组分之间还引入了独特的限制性核酸内切酶识别位点(R1-R6)(图1A和图1B中所示)，以便于将新的遗传组分引入构建体中的特定位点。将R3(PmeI)GTTTAAAC(SEQ ID NO:123)和R4(PacI)TTAATTAA(SEQ ID NO:124)酶位点工程改造成克隆位点以引入转基因的开放阅读框。将这些序列克隆到从ThermoFisherScientific获得的pFastBac HT B质粒中。
ceDNA-杆粒的产生：
依循根据制造商说明书的方案，用测试或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞，赛默飞世尔)。诱导DH10Bac细胞中质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以生成重组ceDNA-杆粒。通过以下方法来选择重组杆粒：在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上利用抗生素基于大肠杆菌中的蓝白筛选来筛选阳性选择(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)，以选择转化体并维持杆粒和转座酶质粒。挑选出由破坏β-半乳糖苷指示基因的易位所造成的白色菌落，并在10ml培养基中进行培养。
从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒，并使用FugeneHD将其转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在25℃在T25烧瓶内的50ml培养基中进行培养。四天后，从细胞去除培养基(含有P0病毒)，将培养基通过0.45μm过滤器过滤，从细胞或细胞碎片中分离出感染性杆状病毒粒子。
任选地，第一代杆状病毒(P0)通过在50ml到500ml培养基中感染原初Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增。将细胞在回转式振荡温育箱的悬浮培养液中、在130rpm下、在25℃维持，监测细胞直径和存活率，直到细胞达到18nm-19nm直径(从14nm-15nm的原初直径)和约4.0E+6个细胞/mL的密度。感染后第3天到第8天，利用离心去除细胞和残骸、然后通过0.45μm过滤器过滤来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。
收集包括测试构建体的ceDNA-杆状病毒，并测定杆状病毒的感染活性或滴度。具体地说，用P1杆状病毒按下列稀释度治疗4×20ml 2.5E+6个细胞/ml的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并且在25℃-27℃温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4天到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
使“Rep质粒”在pFASTBACTM-Dual表达载体(赛默飞世尔)中产生，所述表达载体包含Rep78(SEQ ID NO:131或133)或Rep68(SEQ ID NO:130)和Rep52(SEQ ID NO:132)或Rep40(SEQ ID NO:129)。依循制造商提供的方案，将Rep-质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAXDH10BacTM感受态细胞(赛默飞世尔))中。诱导DH10Bac细胞中Rep-质粒与杆状病毒穿梭载体之间的重组，以生成重组杆粒(“Rep-杆粒”)。通过阳性选择来选择重组杆粒，该阳性选择包括在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上在大肠杆菌中进行蓝白筛选(Φ80dlacZΔM15标志物提供了来自杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)。挑选分离的白色菌落，并接种到10ml选择培养基(含卡那霉素、庆大霉素(gentamicin)、四环素的LB培养液)中。从大肠杆菌中分离出重组杆粒(Rep-杆粒)，并将Rep-杆粒转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中，以产生感染性杆状病毒。
将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天，并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆状病毒”)。任选地，第一代Rep-杆状病毒(P0)通过感染原生Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增并且在50ml到500ml培养基中培养。在感染后3天与8天之间，通过离心或过滤或其它分级分离方法分离细胞来收集培养基中的P1杆状病毒粒子。收集Rep-杆状病毒并测定杆状病毒的感染活性。具体地说，用P1杆状病毒按下列稀释度治疗四个20mL的2.5x106个细胞/mL的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4天到5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
ceDNA载体产生和表征
然后将Sf9昆虫细胞培养基分别按照1:1000和1:10,000的比率添加到新制的Sf9细胞培养基(2.5E+6个细胞/毫升，20ml)中，该昆虫细胞培养基含有：(1)含有ceDNA杆粒或ceDNA杆状病毒的样品；和(2)上述Rep杆状病毒。然后将细胞在25℃以130rpm培养。共同感染4天到5天后，检测细胞直径和活力。当细胞直径达到18nm-20nm并且活力为约70％-80％时，将细胞培养物离心，去除培养基，并收集细胞团粒。首先将细胞团粒悬浮于适量的水性介质，即水或缓冲液中。使用凯杰(Qiagen)MIDI PLUSTM纯化方案(凯杰，每个柱处理0.2mg细胞团粒质量)从细胞中分离并纯化ceDNA载体。
初始基于260nm下的UV吸光度，测定从Sf9昆虫细胞产生和纯化的ceDNA载体的产量。使用实施例5中所述的电泳方法能够评估所纯化的ceDNA载体的正确封闭端构型。
实施例2：通过从双链DNA分子中切除来产生合成ceDNA
ceDNA载体的合成产生描述于2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122的实施例2-实施例6中，该国际申请通过引用整体并入本文。使用合成方法产生ceDNA载体的一种示例性方法涉及切除双链DNA分子。简而言之，可以使用双链DNA构建体产生ceDNA载体，例如，参见PCT/US19/14122的图7A至图8E。根据一些实施方案，双链DNA构建体是ceDNA质粒，例如参见例如2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图6)。
根据一些实施方案，制备ceDNA载体的构建体包含如本文所述的调节开关。
出于说明的目的，实施例2描述了ceDNA载体的产生，该ceDNA载体是使用此方法生成的示例性封闭端DNA载体。然而，虽然这个实施例中以ceDNA载体为例来说明产生封闭端DNA载体的体外合成产生方法，所述方法通过如本文所描述，切除包含ITR和表达盒(例如核酸序列)的双链多核苷酸、接着将游离3'和5'端接合来进行，但本领域的技术人员了解，人们可以如上所说明修饰双链DNA多核苷酸分子以使得产生任何所期望的封闭端DNA载体，包括但不限于狗骨状DNA、哑铃状DNA等等。能够利用实施例2中所述的合成产生方法产生的用于产生抗体或融合蛋白的示例性ceDNA载体论述于标题为“III.通用ceDNA载体”的章节中。由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白描述于标题为“IIC.由ceDNA载体表达的示例性抗体和融合蛋白”的章节中。
该方法包括(i)从双链DNA构建体中切除编码表达盒的序列和(ii)在一个或多个ITR处形成发夹和(iii)通过接合(例如通过T4 DNA连接酶)将自由的5'与3'端连接。
双链DNA构建体按5'到3'的次序包含：第一限制性核酸内切酶位点；上游ITR；表达盒；下游ITR；和第二限制性核酸内切酶位点。然后使双链DNA构建体与一种或多种限制性核酸内切酶接触以在两个限制性核酸内切酶位点处生成双链断裂。一种核酸内切酶可以靶向两个位点，或者每个位点可以被不同的核酸内切酶靶向，只要限制性位点不存在于ceDNA载体模板中。这从双链DNA构建体的其余部分切除了限制性核酸内切酶位点之间的序列(参见PCT/US19/14122的图9)。接合后，形成封闭端DNA载体。
该方法中使用的一个或两个ITR可以是野生型ITR。也可以使用经修饰的ITR，其中所述修饰能够包括形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中的野生型ITR中的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代(参见例如PCT/US19/14122的图6至图8和图10；图11B)，并且可以具有两个或更多个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图6至图8；图11B)或单个发夹环(参见例如PCT/US19/14122的图10A至图10B、图11B)。通过对现有寡核苷酸进行基因修饰或通过重新生物学和/或化学合成能够生成发夹环经修饰ITR。
在一个非限制性示例中，左和右ITR-6(SEQ ID NO:111和112)在B-B'和C-C'臂中包括来自AAV2的野生型ITR的40个核苷酸的缺失。经修饰ITR中剩余的核苷酸预测可形成单个发夹结构。展开结构的吉布斯自由能(Gibbs free energy)是约-54.4千卡/摩尔。还可以对ITR产生其他修饰，包括功能Rep结合位点或Trs位点的任选缺失。
实施例3：通过寡核苷酸构建来产生ceDNA
使用涉及组装不同寡核苷酸的合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实施例3中，其中ceDNA载体是通过合成5'寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸并且将ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合来产生。PCT/US19/14122的图11B显示了将5'ITR寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸与包含表达盒的双链多核苷酸接合的示例性方法。
如本文所公开，ITR寡核苷酸能够包含WT-ITR(参见例如图3A、图3C)，或经修饰的ITR(参见例如图3B和图3D)。(还参见例如PCT/US19/14122的图6A、图6B、图7A和图7B，该文献全文并入本文中)。示例性ITR寡核苷酸包括但不限于SEQ ID NO:134-145(参见例如PCT/US19/14122的表7)。经修饰ITR可以包含形成B和B'臂和/或C和C'臂的序列中相对于野生型ITR的一个或多个核苷酸的缺失、插入或取代。用于无细胞合成的包括如本文所述的WT-ITR或mod-ITR的ITR寡核苷酸可通过遗传修饰或生物学和/或化学合成生成。如本文所讨论的，实施例2和实施例3中的ITR寡核苷酸可以包括如本文所讨论的对称或非对称构型的WT-ITR或经修饰ITR(mod-ITR)。
实施例4：经由单链DNA分子产生ceDNA
PCT/US19/14122的实施例4中提供了使用合成方法产生ceDNA载体的另一个示例性方法，所述方法使用包括两个有义ITR的单链线性DNA，所述有义ITR侧接于有义表达盒序列并共价连接到两个反义ITR，所述反义ITR侧接于反义表达盒，然后将其单链线性DNA的末端接合，以形成封闭端单链分子。一个非限制性示例包含合成和/或产生单链DNA分子、使该分子的各部分退火以形成具有二级结构的一个或多个碱基对区域的单一线性DNA分子，然后使自由的5'与3'端彼此接合以形成封闭的单链分子。
用于产生ceDNA载体的示范性单链DNA分子从5'至3'包括：
第一有义ITR；
有义表达盒序列；
第二有义ITR；
第二反义ITR；
反义表达盒序列；以及
第一反义ITR。
用于实施例4的示例性方法的单链DNA分子可以通过本文所描述的任何DNA合成方法形成，例如体外DNA合成，或通过用核酸酶使DNA构建体(例如质粒)裂解并将所得的dsDNA片段解链以提供ssDNA片段来提供。
通过将温度降低到低于有义和反义序列对的所计算的解链温度可以实现退火。解链温度取决于特定核苷酸碱基含量和所用溶液的特征，例如盐浓度。任何给定序列的解链温度和溶液组合容易由本领域的技术人员计算出。
退火分子的游离5'和3'端可以彼此接合，或接合到发夹分子上以形成ceDNA载体。适合的示例性接合方法和发夹分子描述于实施例2和实施例3中。
实施例5：ceDNA的纯化和/或产生证实
通过本文所述方法(例如，包括实施例1中所述的基于昆虫细胞的产生方法或者实施例2-实施例4中所述的合成产生方法)产生的任何DNA载体产物可以使用技术人员通常已知的方法加以纯化，例如以去除杂质、未使用的组分或副产物；并且/或者可以加以分析，以确认所产生的DNA载体(在这种情况下是ceDNA载体)是期望的分子。用于纯化DNA载体(例如ceDNA)的示例性方法是使用Qiagen Midi Plus纯化方案(Qiagen)和/或凝胶纯化。
以下是用于确认ceDNA载体身份的示例性方法。
可以通过如图4D所示在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定来评估ceDNA载体，其中(a)在限制性核酸内切酶裂解和凝胶电泳分析后，对比天然凝胶，变性凝胶上存在以两倍大小迁移的特征色带；以及(b)在未裂解物质的变性凝胶上存在单体和二聚体(2x)色带是ceDNA载体存在的特征。
分离出的ceDNA载体的结构进一步如下分析：用根据以下所选的限制核酸内切酶消化经纯化的DNA：a)ceDNA载体内仅存在单个切割位点；和b)所得片段当在0.8％变性琼脂糖凝胶上分级分离时大得足以清晰可见(>800bp)。如图4C和图4D中所说明，具有非连续结构的线性DNA载体和具有线性和连续结构的ceDNA载体能够根据其反应产物的大小区分，例如，具有非连续结构的DNA载体预期产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的ceDNA载体预期产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义所要求那样共价封闭端的，将样品用在特定DNA载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性核酸内切酶消化，优选产生两个大小不等的裂解产物(例如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价封闭的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价封闭的DNA(即ceDNA载体)将以2倍大小分解(2000bp和4000bp)，这是因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外，由于多聚体DNA载体的端对端连接，对单体、二聚体和n聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图4E)。
如本文所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下进行琼脂糖凝胶电泳来鉴定DNA载体的分析”是指一种通过执行限制性核酸内切酶消化、随后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA封闭端的分析。后面是一种这样的示例性分析，尽管本领域的技术人员将了解，对这个实施例可以进行许多本领域已知的变化。选择限制性核酸内切酶作为所关注的ceDNA载体的单切酶，其将生成DNA载体长度的大致1/3x和2/3x的产物。由此使天然凝胶和变性凝胶上的色带解析。变性之前，重要的是从样品中去除缓冲液。Qiagen PCR清洁试剂盒或脱盐“离心柱”，例如GE HEALTHCARE ILUSTRATMMICROSPINTMG-25柱，是核酸内切酶消化的一些本领域已知的选项。该分析包括例如：i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA；2)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒，用蒸馏水洗脱；iii)添加10x变性溶液(10x＝0.5M NaOH、10mM EDTA)，添加10X染料，不进行缓冲，并与通过添加10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起，在预先与1mM EDTA和200mM NaOH一起培育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8％-1.0％凝胶上进行分析，并在1x变性溶液(50mM NaOH、1mM EDTA)存在下跑动凝胶。本领域的技术人员将了解基于所得物的大小和期望的计时使用什么电压来跑动电泳。电泳后，将凝胶排出并在1x TBE或TAE中进行中和，并转移到蒸馏水或含1x SYBR金的1x TBE/TAE中。然后，可以用例如赛默飞世尔的金核酸凝胶染色剂(DMSO中的10,000×浓缩液)和辐射荧光(蓝色)或UV(312nm)使带可视化。前述基于凝胶的方法通过从凝胶色带中分离出ceDNA载体且允许其复性而能够根据纯化目的调整。
生成的ceDNA载体的纯度可以使用任何本领域已知的方法来评估。作为一个示例性和非限制性方法，通过对ceDNA载体的荧光强度与标准进行比较，能够估计ceDNA-质粒对样品的总体UV吸光度的贡献。例如，如果基于UV吸光度将4μg ceDNA载体装载于凝胶上并且ceDNA载体荧光强度等效于已知是1μg的2kb色带，那么存在1μg ceDNA载体，且ceDNA载体是总UV吸收材料的25％。然后将凝胶上的带强度相对于带表示的计算输入作图-例如，如果总ceDNA载体是8kb，而切下的比较带为2kb，那么带强度将按总输入的25％绘制，在这种情况下，对于1.0μg输入，将为.25μg。使用ceDNA载体质粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体色带的量，然后可以用于测定ceDNA载体所表示的总输入的百分比或纯度百分比。
实施例6：在雌性BALB/c小鼠中肌肉内(IM)施用LNP:DNA制剂后评价抗刺突抗体应 答的研究
该研究的目的是评价肌肉内(IM)注射LNP:DNA制剂后的抗刺突蛋白抗体应答。如下文所阐述进行研究设计和细节。
研究设计
表13列出了研究的设计。SARS-CoV-2刺突蛋白抗原以ceDNA载体、质粒DNA或mRNA形式递送。在10组小鼠(n＝5)中，以30μl/只动物的剂量体积、3μg或10g的剂量水平给予测试材料。第1组和第12组用作对照。通过IM注射进行给药，如下表所示。第49天是研究的终末时间点。
表13
No.＝数目；an＝动物；IM＝肌肉内；ROA＝施用途径
测试系统
测试系统如下：
物种：小家鼠(Mus musculus)
品系：Balb/c小鼠
雌性数目：60，加3只备用
年龄：到达时7周龄
来源：Charles River Laboratories
住所：动物被分组安置在透明的聚碳酸酯笼中，在手术室中放置接触式寝具。
食物和水：随意向动物提供小鼠饮食5058，并用1N HCl将过滤自来水酸化至目标pH 2.5-3.0。
测试材料
化合物类别：重组DNA载体：ceDNA；基于核酸的生物制品(合成)：pDNA和mRNA。
给药配制物：测试制品以浓缩原液形式供应。在接收时记录测试制品浓度。
将原液温热至室温并在使用前根据需要即刻用提供的PBS稀释。如果不立即给药，则将制备好的材料储存在约4℃。
测试材料施用：对于第1、3、4、5、8-12组，在第0天和第28天，以每只动物30μL的剂量给予测试和对照制品，对于第2、6和7组，仅在第28天给药，均通过肌肉内施用到左腓肠肌中。用吸入异氟醚麻醉动物，以进行给药程序。
剩余材料：保留所有剩余的开放储液用于将来的给药，冷藏。稀释的给药材料在剂量施用完成后丢弃。
生活中的观察和测量
笼侧观察(动物健康检查)：每天将至少执行一次笼侧动物健康检查以检查一般健康状况、死亡率和垂死率。
临床观察：在第0天和第28天测试材料给药后的约1小时、约5-6小时和约24小时、2天和3天进行临床观察以及注射部位观察。
体重：在第0、1、2、3、7、11、14、21、28、29、30、31、35、39、42和49天(在安乐死前)记录所有动物的体重。根据需要记录额外的体重。
存活期成像：在第4、11、21、39和49天，通过腹膜内(IP)注射以2.5mL/kg向第10-12组中的动物给药150mg/kg(60mg/mL)的荧光素。每次荧光素给药后≤15分钟；所有动物具有如本文所述的IVIS成像期。当肝脏是靶器官时，将动物背卧位进行成像。
麻醉和恢复：在麻醉状态下、恢复期间和直到移动时，根据测试设施SOP，连续监测动物。
血液收集
第1、3、4、5、8-12组中的所有动物在第11、21和39天收集中期血液，第2、6和7组中的动物在第39天收集中期血液，如下表14所示。
全部动物具有用于血清收集的全血。
通过眼眶或尾部收集来收集用于血清的全血。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP一(1)份血清。
将所有样品在标称-70℃储存，直到装运到干冰上。
表14：血液收集(中期)
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中
每次采血后，动物接受0.5mL-1.0mL乳酸林格氏液；皮下注射。
通过隐静脉收集用于血清的全血。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成一份血清。
将所有样品在标称-70℃储存，直到装运到干冰上。
麻醉恢复：在适用的情况下，在麻醉下、恢复期间和移动之前，对动物进行持续监测。
终末程序和收集
表15：血液收集-终末
MOV＝最大可获得体积
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中
表16：血液收集-终末
终末血液：第1-12组，在第49天，从在预定时间点之前安乐死的垂死动物收集终末血液。对于所有动物，将来自放血的全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并根据设施SOP处理成四(4)份血清。将所有样品在标称-70℃储存，直到装运到干冰上。
终末组织：对于第1-9组，收获脾并称重。根据测试设施方案，使用Miltenyi解离试剂盒将脾处理成脾细胞。处理后，对脾进行计数，沉淀并再悬浮。记录产率和解离的细胞活力。在细胞培养冷冻培养基(Gibco#12648010)中将多达6千万个细胞以悬浮液形式冷冻，每毫升多达1千万个细胞。将细胞储存于标称-70℃，直到在干冰上装运。
结果
图6示出了在研究的中间第21天和第49天终点测定的刺突蛋白抗体滴度。使用代表可商购获得的COVID-19疫苗的mRNA构建体作为比较刺突蛋白抗体滴度的基准。如图6所示，即使当ceDNA的剂量是mRNA的剂量的1/3时，使用ceDNA时的刺突蛋白Ab滴度也在小鼠中mRNA基准的约10倍以内。图7示出了在用编码SARS-CoV-2刺突蛋白抗原的ceDNA处理的Balb/c小鼠组中观察到的可检测的中和动力学。
体内成像方案(IVIS)
材料：
用于荧光素施用的适当注射器
用于荧光素施用的适当装置和/或注射器
萤火虫荧光素
PBS
pH计或等同物
5-M NaOH
5-M HCl
K/X麻醉剂或异氟醚
程序：
荧光素制备
荧光素原粉储存于标称-20℃。将配制的荧光素以1mL等分试样于2℃-8℃避光储存。配制的荧光素于2℃-8℃避光可稳定长达3周，并且在室温(RT)处可稳定约12小时。
将荧光素溶解在PBS中，以达到60mg/mL的目标浓度，并根据需要用5-M NaOH(～0.5μl/mg荧光素)和HCl(～0.5μL/mg荧光素)将其调节至pH＝7.4。
根据方案制备适当的量，包含至少约50％的过量。
注射和成像(注意：一次最多可对5只动物进行成像)
剃掉动物的毛发(根据需要)。根据方案，通过IP以60mg/mL在PBS中注射150mg/kg荧光素。可以在给药后即刻或至多15分钟进行成像。将异氟醚蒸发器设置为1-3％(通常为2.5％)，以便在成像期间麻醉动物。
异氟醚麻醉以进行成像：将动物放入异氟醚室，等待异氟醚生效，大约2-3分钟。确保IVIS机器侧面的麻醉级别位于“开启”位置。将动物放入IVIS机器并关上门。登录IVIS计算机并打开期望的采集方案。最高灵敏度的推荐采集设置为：D级别的相机高度、f1的F/Stop、中等分辨率的分档和自动的曝光时间。按下相机控制面板界面中的“获取”。在所有获取的图像上插入标签。图像将被保存。
实施例7：在食蟹猴中通过肌肉内注射进行的28天免疫原性和耐受性研究
本研究的目的是确定两种COVID-19疫苗制剂(LNP 1和LNP 2)在重复剂量肌肉内注射到食蟹猴后的免疫原性概况，并评价任何发现的潜在可逆性。
测试材料鉴定
所使用的测试制品如下：
测试制品鉴定1
测试制品鉴定2
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pDNA阳性对照鉴定
mRNA阳性对照鉴定
媒介物鉴定
给药配制物
配制物制备：进行给药配制物分析。在需要时将给药配制物分成等分试样，以允许它们在每个给药时机被分配。
给药配制物制备
将所有剩余体积(最少0.5mL)(包括来自每个给药时机的所有未使用体积的给药配制物)转移至设定为保持-80℃的冷冻器中并且随后运送至赞助方。
制备细节
在给药当天，在开始剂量制备之前，将散装测试制品和阳性对照材料从冷藏转移至环境温度至少15分钟(但不长于60分钟)。散装测试制品和阳性对照材料在使用前轻轻旋转或轻轻倒置，即，不进行涡旋和剧烈摇动。
通过在无菌聚丙烯容器中用媒介物(如果需要)稀释散装测试制品和阳性对照测试材料，在生物安全箱中以满足剂量水平要求的适当浓度制备给药配制物。给药配制物不过滤。在稀释后记录给药配制物的物理外观。每天给药后保留剩余的给药配制物，包括所有未使用体积的给药配制物，并将其储存在设定为保持-80℃的冷冻器中，在此将其保持用于可能的未来浓度分析。
在制备结束后4小时内完成给药。所有剩余的散装测试制品、阳性对照测试材料和媒介物在给药完成后返回至-80℃储存，直到运送至赞助方。
测试系统
物种：食蟹猴(Macaca fascicularis)
动物筛选
方法：用于研究的所有动物具有证明一个阴性结核(TB)测试的文件。根据需要进行另外的TB测试。
动物鉴定
方法：纹身和/或皮下植入的电子识别芯片
环境适应
方法：在开始给药之前，使动物适应实验室住所至少2周。
动物的选择、分配、替换和处置
选择和分配：在转移到研究之前，使用基于计算机的程序将动物随机化并分组。健康状况差或体重范围极端的动物不进行分组。
替换：在开始给药之前，将认为不适合用于研究的任何指定动物替换为备用动物。在开始给药之后，如果发生意外损伤、非测试制品相关的健康问题或类似情况，可以在替换期间用备用动物替换研究动物。备用动物可在3天内用作研究的替代品。一般的存活期评估包括备用动物，直到从研究中释放。
处置：所有动物的处置记载于研究记录中。
饲养
住所
住所：分组安置(同一给药组的至多3只动物在一起)。
笼养：具有网格底板的不锈钢笼。
笼识别：标记指示研究、组、动物/纹身编号和性别。
住所设置如USDA Animal Welfare Act(联邦法规，标题9)中所指定，并且如Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals(NRC，现行版)中所描述。在指定的程序/活动期间或根据监测和/或健康目的的需要将动物分开，如研究指导和/或临床兽医认为合适的那样。动物所在的房间记载于研究记录中。
动物富集
为群居安置的动物提供心理富集，诸如装置(例如，玩具)。也可以偶尔给予动物少量的水果、谷物或其他零食。
作为促进操作性条件反射和期望行为的奖励和手段，在整个研究期间认为必要的研究相关程序(例如，给药或样品收集)之后，可向每只动物提供食物零食。
环境条件
动物房环境的目标条件如下：
温度：64℉至84℉(18℃至29℃)
湿度：30％至70％
光循环：12小时光照和12小时黑暗(指定程序期间除外)
通风：用100％新鲜空气每小时更换10次或更多次空气(无再循环)
报告可能影响研究完整性的超过警报延迟时间范围的温度或湿度的任何偏差。
食物
饮食：PMI营养国际认证的灵长类动物食物No.5048。
为饮食补充水果或蔬菜，每周至少2-3次。
频率/比率：以适合动物的体型和年龄的量提供食物。
分析：营养组分和环境污染物的分析结果由供应商提供并在测试设施处存档。认为饲料中不存在会干扰研究目的的已知污染物。
水
类型：城市自来水，通过反渗透和紫外线照射处理。
频率/比率：每只动物可经由自动浇水系统自由获得(指定程序期间除外)。
分析：进行水的周期性分析，并且这些分析的结果在测试设施处存档。认为水中不存在会干扰研究结果的已知污染物。
兽医护理
在整个研究过程中可获得兽医护理，并且由兽医人员根据临床体征或其他变化对动物进行检查。
实验设计
a所有研究动物在不早于最后一次存活期收集完成后的那天(即，不早于研究第41天之后的那天)被释放到测试设施。
测试材料的施用
给药途径：肌肉内注射至大腿前部
频率：每天一次
持续时间：第1天和第28天
方法：将给药的第一天称为第1天。暂时限制动物的剂量施用并且不镇静。每个注射部位用纹身或不可擦除的墨水标记，并且根据需要时常重新标记。
存活期程序、观察和测量
一般存活期评估
a包括备用动物，直到从研究中释放。
b对于由于群居住所而不能归因于单个动物的观察结果(例如，水样粪便)，该观察结果归因于群居组中的每个动物。
参数 群体a 频率(所需最小值) 注释
c对于由于群居住所而不能归因于单个动物的食欲降低的观察结果，该观察结果归因于群居组中的每个动物。
实验室评价
临床病理学
样品收集
X＝要收集的样品；-＝不适用。
a在非计划尸检的日子，如果通过静脉穿刺收集血液的尝试不成功，则在即将尸检前从腔静脉收集血液(尽可能)，同时使动物处于深度麻醉下。
b由于收集的总血液低于测试设施IACUC推荐的最大血液体积限制，允许另外收集方案指定的血液样品(例如，由于不可接受的样品质量)。
血液学
血液学参数
从每个血液学样品制备血液涂片。如果需要，检查涂片以在研究指导人员批准后评估动物的健康状况，或确认血液学分析仪的结果。如果认为有必要对血液涂片进行额外检查，则随后评价涂片。
临床化学
临床化学参数
a当总胆红素>1.0mg/dL时，测量直接胆红素并计算间接胆红素。
中和抗体的收集、处理和分析
-＝不适用；hr＝小时；post＝给药后；pre＝给药前。
a由于收集的总血液低于测试设施IACUC推荐的最大血液体积限制，允许另外收集方案指定的血液样品(例如，由于不可接受的样品质量)。
将样品离心并将所得血清分离，在独特标记的聚丙烯管中分成5个大致相等的等分试样，并立即冷冻在干冰上或设定保持-80℃的冷冻器中。
将样品运输并储存在设定为保持-70℃或更冷的冷冻器中，直到分析。分析样品的中和抗体。
外周血单核细胞(PBMC)分离和冷冻保存
PMBC样品收集
-＝不适用；hr＝小时；post＝给药后。
a由于收集的总血液低于测试设施IACUC推荐的最大血液体积限制，允许另外收集方案指定的血液样品(例如，由于不可接受的样品质量)。
在收集的1小时内，在环境温度处将全血样品转移到测试设施的适当实验室。冷冻时PBMC的目标浓度为4×106个细胞/mL。
根据测试设施SOP，从血液样品中分离PBMC。将所得的PBMC在独特标记的冷冻小瓶中分成两个大致相等的等分试样。将等分试样在设定为保持-80℃的冷冻器中冷冻储存至少24小时。在72小时内将冷冻小瓶从-80℃冷冻器转移到液氮(-140℃)中。
将样品运输，然后储存于液氮(-140℃)中，直到分析。
细胞因子样品的收集、处理和分析
-＝不适用；hr＝小时；post＝给药后；pre＝给药前。
a由于收集的总血液低于测试设施IACUC推荐的最大血液体积限制，允许另外收集方案指定的血液样品(例如，由于不可接受的样品质量)。
将样品离心并将所得血清分离，在独特标记的聚丙烯管中分成两个大致相等的等分试样，并立即冷冻在干冰上或设定保持-80℃的冷冻器中。
将样品运输并储存在设定为保持-70℃或更冷的冷冻器中，直到分析。
使用由Invitrogen供应的合格商业试剂盒，通过多重Luminex测定，一式两份地分析样品的IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α。
结果
图8示出了在非人灵长类动物(食蟹猴)中在研究的第21天和第41天终点测定的刺突蛋白抗体滴度。使用代表可商购获得的COVID-19疫苗的mRNA构建体(100ug/剂)作为比较刺突蛋白抗体滴度的基准。如图8所示，即使当ceDNA的剂量是mRNA的剂量的1/3时，使用ceDNA(30ug/剂)时的刺突蛋白Ab滴度也在mRNA基准的约10倍以内。此外，在该实验中测定的基准的绝对结合滴度与公布的临床mRNA候选物密切相关。所有剂量均耐受良好，具有极小的注射部位反应和细胞因子(未示出)。此外，图8示出了相对结合的Ab滴度(ceDNA对比mRNA)转化为非人灵长类动物。
在ceDNA和mRNA构建体中证实了可检测的病毒中和。在ceDNA组中，第41天(即，在加强给药后两周)的可检测的中和似乎与第21天(即，在第一次给药后3周)的更高结合滴度相关。
实施例8：评价在雌性BALB/c小鼠中肌肉内施用LNP:DNA制剂后抗刺突抗体应答的研究
根据上述实施例1中所述的方法制备ceDNA载体。
本研究的目的是评价肌肉内(IM)注射五(5)种不同的LNP:ceDNA制剂(LNP1-5)后的抗刺突蛋白抗体应答。如下文所阐述进行研究设计和细节。
研究设计
表17列出了研究的设计。如表17所示，将含有编码SARS-CoV-2刺突蛋白抗原的核酸的ceDNA以3μg或10μg的剂量水平、以30μl/只动物的剂量体积对7组(第2-8组)小鼠(n＝5)给药。第1组用作对照。在第0天和第28天通过肌肉内(IM)注射进行给药。第49天是研究的终末时间点。
表17
No.＝数目；an＝动物；IM＝肌肉内；ROA＝施用途径
测试系统
测试系统如下：
物种：小家鼠(Mus musculus)
品系：Balb/c小鼠
雌性数目：40加3只备用
年龄：到达时6周龄
来源：Charles River Laboratories
住所：动物被分组安置在透明的聚碳酸酯笼中，在手术室中放置接触式寝具。
食物和水：随意向动物提供小鼠饮食5058，并用1N HCl将过滤自来水酸化至目标pH 2.5-3.0。
测试材料
化合物类别：重组DNA载体：ceDNA
给药配制物：测试制品以浓缩原液形式供应。在接收时记录测试制品浓度。
将原液温热至室温并在使用前根据需要即刻用提供的PBS稀释。如果不立即给药，则将制备好的材料储存在约4℃。
测试材料施用：对于全部第1-8组，在第0天和第28天以每只动物30μL的剂量施用测试和对照制品。通过肌肉内施用到左腓肠肌中进行给药。用吸入异氟醚麻醉动物，剂量程序遵循设施SOP。
剩余材料：保留所有剩余的开放储液用于将来的给药，冷藏。稀释的给药材料在剂量施用完成后丢弃。
生活中的观察和测量
笼侧观察(动物健康检查)：每天将至少执行一次笼侧动物健康检查以检查一般健康状况、死亡率和垂死率。
临床观察：在第0天和第28天进行临床观察：每次给药后60-120分钟和工作日结束时(给药后3-6小时)，以及在第1天和第29天进行临床观察：在第0天和第28天测试材料给药后22-26小时。
体重：在第0、1、2、3、7、14、21、28、29、30、31、35、42和49天记录所有动物的体重(如对于剩余动物适用)。根据需要记录额外的体重。
麻醉和恢复：在麻醉状态下、恢复期间和直到移动时，根据测试设施SOP，连续监测动物。
血液收集
第1-8组中的所有动物具有在第0天收集的用于血清的中期血液；测试材料给药后4-6小时如下表18和表19所示。
第1-8组中的动物具有在第21天收集的用于血清的中期血液。
通过隐静脉收集用于血清的全血。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成每个设施SOP一(1)份血清。
将所有样品在标称-70℃储存，直到装运到干冰上。
表18：细胞因子的血液收集(中期)
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中
表19：血液收集(中期)
a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中
每次采血后，动物接受0.5mL-1.0mL乳酸林格氏液；皮下注射。
通过尾静脉切口、大隐静脉或眶窦穿刺在吸入异氟醚下收集用于血清的全血。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并处理成两(2)份25μL血清。
将所有样品在标称-70℃储存，直到装运到干冰上。
麻醉恢复：在适用的情况下，在麻醉下、恢复期间和移动之前，对动物进行持续监测。
结果
图9示出了在研究的第21天和第49天测定的刺突蛋白抗体滴度。测试各种含可电离脂质的ceDNA制剂(LNP1-5)，以确定在疫苗制剂中某些脂质是否比其他脂质更优选。如图9所示，LNP制剂(例如，LNP 3和4)比测试的其他脂质制剂(例如，LNP 5)更具免疫原性，表明在ceDNA疫苗制剂中一些脂质可能比其他脂质更优选。可在ceDNA疫苗制剂中实现的可电离脂质和LNP制剂的非限制性示例例示于国际申请PCT/US2022/025455中，该国际申请的全部内容全文以引用方式并入本文。
参考文献
在本说明书和本文的实施例中引用的所有出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，都以全文引用的方式并入本文中，如同每个单独的出版物或参考文献被明确且单独地指出像充分阐述一样，以引用的方式并入本文中一般。本申请要求优先权的任何专利申请也以上述针对出版物和参考文献的方式以引用方式并入本文中。

Claims (54)

1.一种无衣壳封闭端DNA(ceDNA)载体，所述ceDNA载体包含在侧接反向末端(ITR)之间的至少一个核酸序列，其中所述至少一个核酸序列编码抗原或免疫原性肽。
2.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述抗原或所述免疫原性肽来源于细菌、病毒、真菌或寄生虫感染因子。
3.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述抗原或所述免疫原性肽是肿瘤相关抗原。
4.根据权利要求1所述的ceDNA载体，其中所述抗原或所述免疫原性肽与自身免疫病症相关联。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的ceDNA载体，其中所述抗原或所述免疫原性肽选自表1至表8列出的那些抗原或免疫原性肽中的一种或多种。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的ceDNA载体，所述ceDNA载体包含操作性地连接到所述至少一个核酸序列的启动子序列。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含至少一个聚A序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含5'UTR和/或内含子序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含3'UTR序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体包含增强子序列。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的ceDNA载体，其中至少一个ITR包含功能末端解链位点和Rep结合位点。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR来自选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)的病毒。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR相对于彼此对称或不对称。
14.根据权利要求13所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是对称的或基本上对称的。
15.根据权利要求13所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR是不对称的。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR是野生型，或者其中所述ITR两者都是野生型ITR。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR来自不同病毒血清型。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的ceDNA载体，其中所述侧接ITR选自表8所示的任何病毒血清型对。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR包含选自表9中的一个或多个序列的序列。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的至少一个ITR由于影响所述ITR的整体三维构象的缺失、添加或取代而相对于野生型AAV ITR序列改变。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR来源于选自以下的AAV血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR是合成的。
23.根据权利要求1至15中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR不是野生型ITR，或者其中所述ITR两者都不是野生型ITR。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR通过选自A、A’、B、B’、C、C’、D和D’的ITR区域中的至少一个ITR区域中的缺失、插入和/或取代而被修饰。
25.根据权利要求24所述的ceDNA载体，其中所述缺失、插入和/或取代导致通常由所述A、A’、B、B’、C或C’区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代导致通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代导致通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的全部或一部分发生缺失。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR通过缺失、插入和/或取代而被修饰，所述缺失、插入和/或取代导致通常由所述B和B'区域形成的茎-环结构的一部分和/或通常由所述C和C'区域形成的茎-环结构的一部分发生缺失。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎-环结构。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和两个环。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ITR中的一个或两个ITR在通常包含由所述B和B'区域形成的第一茎-环结构和由所述C和C'区域形成的第二茎-环结构的区域中包含单个茎和单个环。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的ceDNA载体，其中两个ITR以使得当所述ITR相对于彼此反转时产生整体三维对称性的方式改变。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的ceDNA载体，其中所述ceDNA载体囊封在脂质纳米粒子(LNP)中。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的ceDNA载体，所述ceDNA载体在疫苗中使用。
35.一种在细胞中表达抗原或免疫原性肽的方法，所述方法包括使所述细胞与根据权利要求1至33中任一项所述的ceDNA载体接触。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述细胞在体外或体内。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中所述至少一个核酸序列经密码子优化以在所述细胞中表达。
38.一种治疗患有细菌、病毒、寄生虫或真菌感染的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至33中任一项所述的ceDNA载体。
39.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至33中任一项所述的ceDNA载体。
40.一种治疗患有自身免疫疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至33中任一项所述的ceDNA载体。
41.一种预防受试者的细菌、病毒、寄生虫或真菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至33中任一项所述的ceDNA载体。
42.一种预防受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至33中任一项所述的ceDNA载体。
43.一种预防受试者的自身免疫疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至33中任一项所述的ceDNA载体。
44.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述受试者施用一种或多种另外的治疗剂。
45.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，其中所述ceDNA载体通过静脉内、皮下、瘤内或肌肉内注射施用。
46.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至33中任一项所述的ceDNA载体。
47.根据权利要求46所述的药物组合物，所述药物组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。
48.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含根据权利要求1至33中任一项所述的ceDNA载体。
49.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1至33中任一项所述的ceDNA载体、以及脂质。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述脂质是脂质纳米粒子(LNP)。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述脂质纳米粒子包含可电离脂质。
52.根据权利要求51所述的组合物，其中所述可电离脂质选自由以下项组成的组：
以及
53.根据权利要求48至52中任一项所述的组合物，其中所述组合物是冻干的。
54.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1至33中任一项所述的ceDNA载体、根据权利要求46或权利要求47所述的药物组合物、或根据权利要求48至53中任一项所述的组合物。
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