CN111295448A - 非病毒的无衣壳dna载体的脂质纳米粒子制剂 - Google Patents
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Abstract
本文提供了脂质纳米粒子制剂，其包含可电离脂质和具有共价封闭端的非病毒的无衣壳DNA载体。
Description
相关申请的交叉参考
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2017年9月8日提交的美国临时申请No.62/556,334、于2017 年9月8日提交的No.62/556,333、于2017年9月9日提交的No.62/556,381、于2018年5月23日提交 的No.62/675,317、于2018年5月23日提交的No.62/675,322、于2018年5月23日提交的No.62/675,324 和于2018年5月23日提交的No.62/675,327的权益，所述美国临时申请各自的内容通过引用整体并入本 文。
序列表
本申请包含序列表，其已经以ASCII格式电子提交并特此通过引用整体并入。所述ASCII副本，创建 于2018年9月7日，名为080170-090660WOPT_SL.txt并且大小为63,790字节。
技术领域
本发明涉及非病毒的无衣壳DNA载体的脂质纳米粒子(LNP)制剂及其在将外源性DNA序列递送至靶 细胞、组织、器官或生物体中的用途。
背景技术
近来，报道了具有共价封闭端的非病毒的无衣壳DNA载体(vectors)，其包含侧翼有AAV 2ITR的转基 因。然而，将这些DNA载体体内和体外靶向递送至细胞仍然具有挑战性。因此，在本领域中仍然需要解 决这些挑战的制剂。
发明内容
在一个方面，本文提供了新颖的脂质制剂，其包含可电离脂质和无衣壳的非病毒载体(ceDNA)。本文 所述的ceDNA载体是无衣壳的线性双链体DNA分子，由具有共价封闭端的互补DNA的连续链形成(线性、 连续和非衣壳化结构)，其包含彼此不同或不对称的5’反向末端重复(ITR)和3’ITR序列。在一个方面，具 有共价封闭端的非病毒的无衣壳DNA载体优选是线性双链体分子，并可获得自载体多核苷酸，所述载体 多核苷酸编码操作性地定位在两个不同的反向末端重复序列(ITR)(例如，AAV ITR)之间的异源核酸，其中 所述ITR中的至少一个包含末端解离位点和复制蛋白结合位点(RPS)(有时称为复制性蛋白结合位点)，例如 Rep结合位点，并且所述ITR中的一个相对于另一个ITR包含缺失、插入和/或取代。也就是说，一个ITR 相对于另一个ITR是不对称的。在一个实施方式中，ITR中的至少一个是AAV ITR，例如野生型AAV ITR 或修饰的AAV ITR。在一个实施方式中，ITR中的至少一个相对于另一个ITR是修饰的ITR–即，所述 ceDNA包含彼此不对称的ITR。
在一个实施方式中，ITR中的至少一个是非功能性ITR。
在一些实施方式中，ITR中的一个或多个不是野生型ITR。
在一些实施方式中，当使用在所述ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化并通过天然和变性 凝胶电泳二者进行分析时，与线性和非连续DNA对照相比，所述ceDNA载体显示线性和连续DNA的特 征条带。
在一些实施方式中，所述ceDNA载体的不对称ITR序列中的一个或多个来自选自细小病毒、依赖病 毒和腺相关病毒(AAV)的病毒。在一些实施方式中，所述不对称的ITR来自不同的病毒血清型。例如，一 个或多个不对称的ITR可以来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12的AAV血清型。
在一些实施方式中，所述ceDNA载体的不对称ITR序列中的一个或多个是合成的。
在一些实施方式中，所述不对称ITR中的至少一个(例如，一者或二者)通过在至少一个选自A、A’、B、 B’、C、C’、D和D’的ITR区域中的缺失、插入和/或取代来修饰。
在一些实施方式中，所述ceDNA载体包含选自以下的至少两个不对称ITR：(a)SEQID NO：1和SEQ ID NO：52；以及(b)SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：51。
在一些实施方式中，所述ceDNA载体由包括以下步骤的方法获得：(a)在诱导在昆虫细胞内产生所述 ceDNA载体的有效条件和充分时间下，在至少一种Rep蛋白的存在下，温育包含ceDNA表达构建体的昆 虫细胞群，其中所述ceDNA表达构建体编码所述ceDNA载体；和(b)从昆虫细胞分离ceDNA载体。不 受限制地，ceDNA表达构建体可以是ceDNA质粒、ceDNA杆粒或ceDNA杆状病毒。
通常，所述昆虫细胞表达至少一种Rep蛋白。所述至少一种Rep蛋白可来自选自细小病毒、依赖病毒 和腺相关病毒(AAV)的病毒。例如，所述至少一种Rep蛋白可来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12的AAV血清型。
在一些实施方式中，可电离脂质是表1中所列的公开文本中描述的脂质。
在本文中公开的各个方面的一些实施方式中，可以通过使用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限 制酶消化并在变性和非变性凝胶上分析消化的DNA物质来证实与线性和非连续DNA相比存在线性和连续 DNA的特征条带，从而能够证实ceDNA的存在。
在一些实施方式中，所述DNA载体获得自载体多核苷酸，其中所述载体多核苷酸编码操作性地定位 在两个反向末端重复序列(ITR)之间的异源核酸，其中所述两个ITR彼此不同(不对称)，并且ITR中的至少 一个是包含功能性末端解离位点和Rep结合位点的功能性ITR，并且ITR中的一个相对于所述功能性ITR 包含缺失、插入和/或取代；Rep蛋白的存在诱导载体多核苷酸的复制。
在一些实施方式中，在昆虫细胞中生产所述DNA载体。例如，所述DNA载体可从包括以下步骤的方 法获得：(a)在诱导在昆虫细胞内产生所述无衣壳的非病毒DNA的有效条件和充分时间下，在Rep蛋白存 在下，温育包含缺乏病毒衣壳编码序列的载体多核苷酸的昆虫细胞群，其中在没有所述载体的情况下，所 述昆虫细胞不包含在昆虫细胞内无衣壳的非病毒DNA的产生；和(b)从昆虫细胞中收获并分离无衣壳的非 病毒DNA。在一些进一步的实施方式中，可以证实从昆虫细胞分离的无衣壳的非病毒DNA的存在。可以 通过使用在所述DNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从昆虫细胞分离的DNA并在非变性凝胶上分 析消化的DNA物质来证实与线性和非连续DNA相比存在线性和连续DNA的特征性条带，从而证实从昆 虫细胞分离的无衣壳的非病毒DNA的存在。
在一些实施方式中，所述DNA载体得自载体多核苷酸。例如，所述DNA载体是从编码操作性地定位 在第一和第二AAV2反向末端重复DNA多核苷酸序列(ITR)之间的异源核酸的载体多核苷酸获得的，其中 ITR中的至少一个相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：51的相应AAV2野生型ITR具有至少一个多核苷 酸缺失、插入或取代，以在Rep蛋白存在下诱导DNA载体在昆虫细胞中的复制。在这些进一步实施方式 中，所述DNA载体可从包括以下步骤的方法获得：(a)在诱导在昆虫细胞内产生所述无衣壳的非病毒DNA 的有效条件和充分时间下，在Rep蛋白存在下，温育包含缺乏病毒衣壳编码序列的载体多核苷酸的昆虫细 胞群，其中所述昆虫细胞不包含病毒衣壳编码序列；和(b)从昆虫细胞中收获并分离无衣壳的非病毒DNA。 在一些进一步的实施方式中，可以证实从昆虫细胞中分离的无衣壳的非病毒DNA的存在。例如，可以通 过使用在所述DNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从昆虫细胞分离的DNA并在非变性凝胶上分析 所消化的DNA物质来证实与线性和非连续DNA相比存在线性和连续DNA的特征性条带，从而证实从昆 虫细胞分离的无衣壳的非病毒DNA的存在。
在一些实施方式中，脂质纳米粒子还可以包含非阳离子脂质、PEG缀合脂质、固醇或其任何组合。
在一些实施方式中，脂质纳米粒子还包含非阳离子脂质，其中所述非离子脂质选自由以下所组成的组： 二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰 基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙 醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基磷脂 酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基磷脂酰乙醇胺(例如16-O-单甲基PE)、 二甲基磷脂酰乙醇胺(例如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、 氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉 豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰 基磷脂酰胆碱酰(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)、二反油酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、卵磷脂、 磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、 脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二鲸蜡基磷酸酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱、以及例 如WO2017/099823或US2018/0028664中描述的非阳离子脂质。
在一些实施方式中，脂质粒子还包含缀合脂质，其中缀合脂质选自由以下所组成的组：PEG-二酰基甘 油(DAG)(例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG- 磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、PEG化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS-DAG)(例如 4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙 基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐、以及表2中所 述的那些。
在一些实施方式中，脂质粒子还包含胆固醇或胆固醇衍生物，如PCT公布文本WO2009/127060或美 国专利公布文本US2010/0130588中所述。
在一些实施方式中，脂质粒子包含可电离脂质、非阳离子脂质、抑制粒子聚集的缀合脂质、和固醇。 可电离脂质、非阳离子脂质、抑制粒子聚集的缀合脂质和固醇的量可以独立变化。在一些实施方式中，脂 质纳米粒子包含的可电离脂质的量为粒子中存在的总脂质的约20mol％至约90mol％，非阳离子脂质的量为 粒子中存在的总脂质的约5mol％至约30mol％，抑制粒子聚集的缀合脂质的量为粒子中存在的总脂质的约 0.5mol％至约20mol％，以及固醇的量为粒子中存在的总脂质的约20mol％至约50mol％。
总脂质与DNA载体的比率可以根据需要变化。例如，总脂质与DNA载体(质量或重量)比可以从约10:1 至约30:1。
本文还提供了包含第一脂质纳米粒子和另外的化合物的组合物。第一脂质纳米粒子包含可电离脂质和 第一无衣壳的非病毒载体。当使用在所述DNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化时，与线性和非连 续DNA对照相比，所述无衣壳的非病毒载体当在非变性凝胶上分析时存在线性和连续DNA的特征性条带。
在一些实施方式中，另外的化合物被包含在第二脂质纳米粒子中。第一和第二脂质纳米粒子可以相同 或不同。在一些实施方式中，第一和第二脂质纳米粒子不同。在一些实施方式中，第一和第二脂质纳米粒 子相同，即，另外的化合物被包含在第一脂质纳米粒子中。
任何所需的分子可以用作另外的化合物。在一些实施方式中，另外的化合物是第二无衣壳的非病毒载 体。第一和第二无衣壳的非病毒载体可以相同或不同。在一些实施方式中，第一和第二无衣壳的非病毒载 体是不同的。
在一些实施方式中，另外的化合物是治疗剂。
下面进一步详细描述本发明的这些和其他方面。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一张彩色绘图。根据请求并支付必要的费用，专利局将提供带有彩色绘图 的本专利或专利申请公布的副本。
图1A示出了ceDNA载体的示例性结构。在该实施方式中，示例性的ceDNA载体包含含有CAG启 动子、WPRE和BGHpA的表达盒。将编码荧光素酶转基因的开放阅读框(ORF)插入CAG启动子和WPRE 之间的克隆位点(R3/R4)中。表达盒的侧翼是两个反向末端重复(ITR)–表达盒上游(5’-端)的野生型AAV2 ITR和下游(3’-端)的修饰ITR，因此表达盒侧翼的两个ITR相对于彼此不对称。
图1B示出了具有表达盒的ceDNA载体的示例性结构，所述表达盒含有CAG启动子、WPRE和 BGHpA。将编码荧光素酶转基因的开放阅读框(ORF)插入CAG启动子和WPRE之间的克隆位点(R3/R4) 中。表达盒的侧翼是两个反向末端重复(ITR)–表达盒上游(5’-端)的修饰ITR和下游(3’-端)的野生型ITR。
图1C示出了具有表达盒的ceDNA载体的示例性结构，所述表达盒含有增强子/启动子、用于插入转 基因的开放阅读框(ORF)、转录后元件(WPRE)和聚A信号(poly A signal)。开放阅读框(ORF)允许将转基 因插入CAG启动子和WPRE之间的克隆位点中。表达盒的侧翼是两个彼此不对称的反向末端重复(ITR)； 表达盒上游(5’-端)的修饰ITR和下游(3’-端)的修饰ITR，其中5’ITR和3’ITR都是修饰的ITR，但是具有 不同的修饰(即，它们不具有相同的修饰)。
图2A提供了AAV2的一个野生型ITR的T形茎环结构，并鉴定了A-A’臂、B-B’臂、C-C’臂、两个 Rep结合位点(RBE和RBE’)、以及末端解离位点(trs)。RBE含有一连串4个双链体四聚体，它们被认为 与Rep 78或Rep 68相互作用。另外，RBE’也被认为与在所述构建体中的野生型ITR或突变ITR上装配的 Rep复合体相互作用。D和D’区域含有转录因子结合位点和其他保守结构。图2B显示了在图2A的野生 型ITR中选定的Rep催化的切刻和连接活性，其包括AAV2的野生型ITR的T形茎环结构，并鉴定了A-A’ 臂、B-B’臂、C-C’臂、两个Rep结合位点(RBE和RBE’)、以及末端解离位点(trs)，并且D和D’区域包含 数个转录因子结合位点和其他保守结构。
图3A提供了野生型左AAV2 ITR(SEQ ID NO：540)的A-A’臂的含RBE部分、B-B’臂和C-C’臂的一级 结构(多核苷酸序列)(左)和二级结构(右)。图3B显示了左ITR的示例性突变ITR(也称为修饰ITR)序列。 显示的是示例性的突变左ITR(ITR-1，左)(SEQ ID NO：113)的A-A’臂的RBE部分、C臂和B-B’臂的一级 结构(左)和预测的二级结构(右)。图3C显示了野生型右AAV2 ITR(SEQ ID NO：541)的A-A’环的含RBE 部分以及B-B’和C-C’臂的一级结构(左)和二级结构(右)。图3D显示了示例性的右修饰ITR。显示的是示 例性的突变右ITR(ITR-1，右)(SEQ ID NO：114)的A-A’臂的含RBE部分、B-B’和C臂的一级结构(左)和 预测的二级结构(右)。可以使用左和右ITR的任何组合(例如AAV2 ITR或其他病毒血清型ITR或合成ITR)，条件是左ITR与右ITR不对称或不同。图3A-3D的多核苷酸序列各自是指在用于产生本文所述的ceDNA 的质粒或杆粒/杆状病毒基因组中所用的序列。在图3A-3D每个中还包括从质粒或杆粒/杆状病毒基因组中 的ceDNA载体构造推断出的相应ceDNA二级结构以及预测的吉布斯自由能(Gibbs free energy)值。
图4A是示出了制备杆状病毒感染的昆虫细胞(BIIC)的上游过程的示意图，所述昆虫细胞可用于在图 4B的示意图所述的过程中产生ceDNA。图4C示出了证实ceDNA载体产生的生化方法和过程。图4D和 图4E是示意图，描述了从在图4B的ceDNA产生过程期间获得的细胞沉淀团收获的DNA中鉴定ceDNA 存在的方法。图4E显示了具有不连续结构的DNA。ceDNA可以通过限制性内切酶切割，在ceDNA载体 上具有单个识别位点，并在中性和变性这两种条件下生成两个大小不同(1kb和2kb)的DNA片段。图4E 还显示了具有线性和连续结构的ceDNA。所述ceDNA载体可被限制性内切酶切割，并生成两个DNA片 段，所述片段在中性条件下以1kb和2kb迁移，但在变性条件下，所述链保持连接并产生以2kb和4kb迁 移的单链。图4D显示未切割或用限制性核酸内切酶消化并然后在天然凝胶或变性凝胶上电泳的示例性ceDNA的示意性预期条带。最左边的示意图是天然凝胶，显示多条带，提示以其双链体和未切割形式的 ceDNA以至少单体和二聚体状态存在，可作为迁移较快的较小单体和迁移较慢的二聚体被显示，二聚体的 大小是单体的两倍。左起第二个示意图显示，当用限制性内切酶切割ceDNA时，原始条带消失并出现了 迁移较快(例如较小)的条带，与切割后剩余的预期片段大小相对应。在变性条件下，因为互补链是共价连 接的，所以原始双链体DNA是单链的，并作为两倍于天然凝胶上观察到的大小的物种进行迁移。因此， 在右起第二个示意图中，消化的ceDNA显示出与在天然凝胶上观察到的相似的条带分布，但是所述条带 作为其天然凝胶对应物大小的两倍的片段进行迁移。最右边的示意图显示，在变性条件下未切割的ceDNA 作为单链开环进行迁移，因此观察到的条带是在不开环的天然条件下观察到的条带大小的两倍。在此图中， “kb”用于指示核苷酸分子的相对大小，其取决于语境，基于核苷酸链长(例如，对于在变性条件下观察到的 单链分子)或碱基对数量(例如，对于在天然条件下观察到的双链分子)。
图5是有(+)或没有(-)用核酸内切酶(用于ceDNA构建体1和2的EcoRI；用于ceDNA构建体3和4 的BamH1；用于ceDNA构建体5和6的SpeI；以及用于ceDNA构建体7和8的XhoI)消化的ceDNA载 体的变性凝胶运行实例的示例性图。确定了用星号突出显示的条带的大小，并提供在图的底部。
图6A是pFBDLSR质粒中的示例性Rep-杆粒，所述质粒包含Rep蛋白Rep52和Rep78的核酸序列。 该示例性Rep-杆粒包含：IE1启动子片段(SEQ ID NO：66)；Rep78核苷酸序列，包括Kozak序列(SEQ ID NO：67)，Rep52的多角体启动子序列(SEQ ID NO：68)和Rep58核苷酸序列，从Kozak序列gccgccacc) (SEQ ID NO：69)开始。图6B是示例性的ceDNA-质粒-1的示意图，其具有wt-L ITR、CAG启动子、荧 光素酶转基因、WPRE和聚腺苷酸化序列、以及mod-RITR。
图7A显示了转染400ng(黑色)、200ng(灰色)或100ng(白色)在x轴上标识的构建体(构建体-1，构建 体-3，构建体-5，构建体-7(实施例1中的表5)后48小时，在HEK293细胞中测量荧光素酶活性(y轴，RQ(Luc)) 的体外蛋白质表达测定的结果。图7B显示了转染400ng(黑色)、200ng(灰色)或100ng(白色)在x轴上标 识的构建体(构建体-2，构建体-4，构建体-6，构建体-8)(表5)后48小时，在HEK293细胞中测量的荧光素 酶活性(y轴，RQ(Luc))。还提供了用没有任何质粒的Fugene处理的HEK293细胞(“Fugene”)或在未处理的 HEK293细胞(“未处理”)中测量的荧光素酶活性。
图8A显示了转染400ng(黑色)、200ng(灰色)或100ng(白色)在x轴上标识的构建体(构建体-1，构建 体-3，构建体-5，构建体-7)后48小时，HEK293细胞的活力(y轴)。图8B显示了转染400ng(黑色)、200ng(灰 色)或100ng(白色)在x轴上标识的构建体(构建体-2，构建体-4，构建体-6，构建体-8)后48小时，HEK293 细胞的活力(y轴)。
图9-11是显示用包含不同盐的缓冲液以恒定的N/P比(图9)或以变化的N/P比(图10和11)制备的一些 示例性脂质纳米粒子的平均脂质纳米粒子大小和ceDNA包封的条形图。
图12是显示血清/BSA对在示例性脂质纳米粒子中包封的效应的条形图。
图13是显示在二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)脂质体存在下，ceDNA从示例性脂质纳米粒子的释放的 条形图。
图14是显示血清/BSA对在示例性脂质纳米粒子中包封的效应的条形图。
图15是显示在二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)脂质体存在下，ceDNA从示例性脂质纳米粒子的释放的 条形图。
图16显示了一些示例性脂质纳米粒子的ApoE结合。
图16是显示示例性ceDNA的HEK293表达的条形图。
图18是显示示例性ceDNA的HEK293表达的凝胶电泳照片。
图19是显示示例性ceDNA的HEK293表达的条形图。
图20显示了实施例10中所述的一些示例性的式(I)和式(II)化合物。
图21是合成实施例10中公开的式(I)和(II)化合物的通用合成方案。
图22是合成实施例10中公开的式(I)和(II)化合物的通用合成方案。
图23显示了实施例11中所述的一些示例性的式(III)化合物。
图24描绘了合成实施例11中所述的式(III)、式(IV)和式(V)化合物的通用合成方案。
具体实施方式
定义
除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本公开所属领域普通技术人员通常 理解的含义。应该理解的是，本发明不限于本文所述的具体方法学、方案和试剂等，因此可以变化。本文 中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而无意于限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求 书限定。免疫学和分子生物学中常用术语的定义可在下列文献中找到：《默克诊疗手册》(Merck Manual of Diagnosis andTherapy)，第19版，由Merck Sharp&Dohme Corp.出版，2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人(编著)，《病毒学领域》(Fields Virology)，第6版，由LippincottWilliams&Wilkins出 版，Philadelphia，PA，USA(2013)；Knipe，D.M.和Howley，P.M.(编著)，《分子细胞生物学与分子医学 百科全书》(The Encyclopedia of Molecular CellBiology and Molecular Medicine)，由Blackwell Science Ltd. 出版，1999-2012(ISBN9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编著)，《分子生物学与生物技术：综合桌 面参考》(Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference)，由VCHPublishers，Inc. 出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；Werner Luttmann的《免疫学》Immunology，由Elsevier出版，2006； 《Janeway免疫生物学》(Janeway's Immunobiology)，Kenneth Murphy，Allan Mowat，Casey Weaver(编著)， Taylor&Francis Limited，2014(ISBN 0815345305，9780815345305)；《Lewin基因XI》(Lewin's Genes XI)， 由Jones&Bartlett Publishers出版，2014(ISBN-1449659055)；Michael Richard Green和JosephSambrook， 《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，USA(2012)(ISBN1936113414)；Davis等人，《分子生物学的基本方法》 (Basic Methods in MolecularBiology)，Elsevier Science Publishing，Inc.，New York，USA(2012)(ISBN044460149X)；《酶学实验室方法：DNA》(Laboratory Methods in Enzymology:DNA)，JonLorsch(编著) Elsevier，2013(ISBN 0124199542)；《分子生物学现行方案》(CurrentProtocols in Molecular Biology) (CPMB)，Frederick M.Ausubel(编著)，John Wileyand Sons，2014(ISBN 047150338X，9780471503385)； 《蛋白质科学现行方案》(CurrentProtocols in Protein Science)(CPPS)，John E.Coligan(编著)，John Wiley and Sons，Inc.，2005；以及《免疫学现行方案》(Current Protocols in Immunolog)y(CPI)(JohnE.Coligan，ADA M Kruisbeek，David H Margulies，Ethan M Shevach，Warren Strobe，(编著)John Wiley and Sons，Inc.，2003 (ISBN 0471142735，9780471142737)，它们的内容全部通过引用整体并入本文。
如本文中所用，术语“脂质纳米粒子”是指由一种或多种脂质组分形成的囊泡。在药物开发的背景下， 脂质纳米粒子通常用作核酸递送的载体(carriers)。它们通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药 物或活性药物成分(API)来起作用。通常，用于此类递送的脂质纳米粒子组合物由合成的可电离或阳离子脂 质、磷脂(特别是具有磷脂酰胆碱基团的化合物)、胆固醇和聚乙二醇(PEG)脂质构成；然而，这些组合物也 可以包括其他脂质。脂质的总组成通常决定生物系统中的表面特性并进而决定蛋白质(调理作用)含量，从 而驱动生物分布和细胞摄取特性。
如本文中所用，术语“脂质体”是指以球形构造装配的脂质分子，所述球形构造包封内部水性体积与水 性外部隔离。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在药物开发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂 递送的载体。它们通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分(API)来起作用。用 于此类递送的脂质体组合物通常由磷脂、特别是具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物也可 以包括其他脂质。
如本文中所用，术语“可电离脂质”是指具有至少一个可质子化或可去质子化基团的脂质，使得该脂质 在等于或低于生理pH(例如，pH 7.4)的pH下带正电，并在第二pH、优选在等于或高于生理pH下为中性。 本领域普通技术人员将理解，质子随pH变化的添加或除去是平衡过程，并且提及带电或中性脂质是指优 势物质的性质，并不要求所有脂质都以带电或中性形式存在。通常，可电离脂质的可质子化基团的pKa在 约4至约7的范围内。可电离脂质在本文中也称为阳离子脂质。
如本文中所用，术语“非阳离子脂质”是指任何两亲性脂质以及任何其他中性脂质或阴离子脂质。因此， 非阳离子脂质可以是中性不带电荷、两性离子或阴离子脂质。
如本文中所用，术语“缀合脂质”是指与非脂质分子例如PEG、聚噁唑啉、聚酰胺或聚合物(例如，阳离 子聚合物)缀合的脂质分子。
如本文中所用，术语“赋形剂”是指包含在具有API的制剂中的无药理活性的成分，例如ceDNA和/或 脂质纳米粒子，以在产生剂型时疏松和/或稳定所述制剂。赋形剂的一般类别包括，例如，疏松剂、填充剂、 稀释剂、抗粘附剂、粘结剂、包衣剂、崩解剂、调味剂、色素、润滑剂、助流剂、吸附剂、防腐剂、甜味 剂、以及用于促进药物吸收或溶解性或用于其他药代动力学考虑的产品。
如本文中所用，术语“异源核苷酸序列”和“转基因”可互换使用，并且是指并入本文公开的ceDNA载体 并可以由其递送和表达的目的核酸(编码衣壳多肽的核酸除外)。目的转基因包括但不限于，编码多肽的核 酸，优选治疗性(例如，用于医学、诊断或兽医用途)或免疫原性的多肽(例如，用于疫苗)。在一些实施方式 中，目的核酸包括转录成为治疗性RNA的核酸。为了用于本发明的ceDNA载体中而包含的转基因包括但 不限于表达或编码一种或多种多肽、肽、核酶、适配体、肽核酸、siRNA、RNAi、miRNA、miRNA、lncRNA、 反义寡或多核苷、抗体、抗原结合片段或其任何组合的那些转基因。
如本文中所用，术语“表达盒”和“转录盒”可互换使用，是指一段线性核酸，其包括与一个或多个启动 子或足以引导转基因转录的其他调节序列可操作连接的转基因，但是不包含衣壳编码序列、其他载体序列 或反向末端重复区域。表达盒可以另外包含一个或多个顺式作用序列(例如，启动子、增强子或阻遏子)、 一个或多个内含子和一个或多个转录后调节元件。
如本文中所用，术语“末端重复”或“TR”包括任何包含至少一个最低需要的复制起点和包含回文发夹结 构的区域的病毒末端重复或合成序列。Rep结合序列(“RBS”)和末端解离位点(“TRS”)共同构成“最低需要的 复制起点”，因此TR包含至少一个RBS和至少一个TRS。在给定的一段多核苷酸序列内彼此是反向互补 序列的TR通常各自被称为“反向末端重复”或“ITR”。在病毒的背景下，ITR介导复制、病毒包装、整合和 原病毒拯救。正如在本发明中意外发现的，在全长上不是反向互补序列的TR仍然可以执行ITR的传统功 能，因此术语ITR在本文中用于指ceDNA基因组或ceDNA载体中能够介导ceDNA载体复制的TR。本领 域普通技术人员将理解，在复杂的ceDNA构造中，可以存在多于两个ITR或不对称的ITR对。ITR可以 是AAV ITR或非AAV ITR，或可以源自于AAV ITR或非AAV ITR。例如，ITR可以源自于细小病毒科， 其包括细小病毒和依赖病毒(例如犬细小病毒、牛细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、人细小病毒B-19)， 或可以将充当SV40复制起点的SV40发夹用作ITR，其可以通过截断、取代、缺失、插入和/或添加而被 进一步修饰。细小病毒科家族病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科和感染无脊椎动物的浓 核病毒亚科。依赖病毒属包括腺相关病毒(AAV)的病毒家族，其能够在脊椎动物宿主中复制，所述宿主包 括但不限于人类、灵长类、牛、犬、马和羊物种。
如本文中所用，术语“不对称ITR”是指单个ceDNA基因组或ceDNA载体内的一对ITR，它们在全长 上不是反向互补序列。两个ITR之间的序列差异可能是由于核苷酸添加、缺失、截断或点突变引起的。在 一个实施方式中，该对中的一个ITR可以是野生型AAV序列并且另一个可以是非野生型或合成序列。在 另一个实施方式中，该对中的两个ITR都不是野生型AAV序列并且两个ITR的序列彼此不同。本文中为 了方便起见，将位于ceDNA载体中表达盒的5’(上游)的ITR称为“5’ITR”或“左ITR”，并将位于ceDNA载 体中表达盒的3’(下游)的ITR称为“3’ITR”或“右ITR”。
如本文中所用，术语“ceDNA基因组”是指还掺入至少一个反向末端重复区域的表达盒。ceDNA基因 组还可以包含一个或多个间隔区。在一些实施方式中，ceDNA基因组作为DNA的分子间双链体多核苷酸 被掺入质粒或病毒基因组中。
如本文中所用，术语“ceDNA间隔区”是指分隔ceDNA载体或ceDNA基因组中的功能元件的间插 (intervening)序列。在一些实施方式中，ceDNA间隔区将两个功能元件保持在对于最佳功能性而言期望的 距离上。在一些实施方式中，ceDNA间隔区提供或增加了ceDNA基因组在例如质粒或杆状病毒内的遗传 稳定性。在一些实施方式中，ceDNA间隔区通过提供克隆位点等的便利位置，促进ceDNA基因组的就绪 遗传操作。例如，在某些方面，可以将含有几个限制性核酸内切酶位点的寡核苷酸“多接头”、或设计成没 有已知蛋白质(例如转录因子)结合位点的非开放阅读框序列定位在ceDNA基因组中以分隔顺式作用因子， 例如在末端解离位点和上游转录调节元件之间插入6聚体、12聚体、18聚体、24聚体、48聚体、86聚体、 176聚体等。类似地，可以在聚腺苷酸化信号序列和3'-末端解离位点之间插入间隔区。
如本文中所用，术语“Rep结合位点”、“Rep结合元件”、“RBE”和“RBS”可互换使用并且是指Rep蛋 白(例如AAV Rep 78或AAV Rep 68)的结合位点，其在被Rep蛋白结合后，允许Rep蛋白在掺入该RBS的 序列上执行其位点特异性核酸内切酶活性。RBS序列及其反向互补序列共同一起形成单个RBS。RBS序 列是本领域已知的，并且包括，例如，5’-GCGCGCTCGCTCGCTC-3′(SEQ ID NO：531)，其是在AAV2 中鉴定的RBS序列。在本发明的实施方式中可以使用任何已知的RBS序列，包括其他已知的AAV RBS 序列和其他天然已知的或合成的RBS序列。不受理论的束缚，认为Rep蛋白的核酸酶结构域与双链体核 苷酸序列GCTC结合，因此所述两个已知的AAV Rep蛋白直接结合并稳定地装配在双链体寡核苷酸 5’-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3’(SEQ ID NO：531)上。另外，可溶性聚集的构象体(即，数目未定的相 互关联的Rep蛋白)解离并结合与含有Rep结合位点的寡核苷酸结合。每个Rep蛋白都与每条链上的含氮 碱基和磷酸二酯二者主链相互作用。与含氮碱基的相互作用提供了序列特异性，而与磷酸二酯主链的相互 作用是非序列特异性或较低序列特异性的，并稳定了蛋白质-DNA复合体。
如本文中所用，术语“末端解离位点”和“TRS”在本文可互换使用，是指一个区域，在此Rep与5'胸苷 形成酪氨酸-磷酸二酯键，生成3'OH充当通过DNA聚合酶、例如DNA polΔ或DNA polε进行DNA延伸 的底物。或者，Rep-胸苷复合体可以参与配位连接反应。在一些实施方式中，TRS最低限度包括非碱基配 对的胸苷。在一些实施方式中，TRS的切刻效率可以至少部分由它在同一分子内距RBS的距离来控制。 当接纳底物是互补的ITR时，则所生成的产物是分子内双链体。TRS序列是本领域已知的，并包括，例如， 5’-GGTTGA-3’(SEQ ID NO：45)，其是在AAV2中鉴定的六核苷酸序列。本发明的实施方式中可以使用任 何已知的TRS序列，包括其他已知的AAV TRS序列和其他天然已知的或合成的TRS序列，例如AGTT(SEQ IDNO：46)、GGTTGG(SEQ ID NO：47)、AGTTGG(SEQ ID NO：48)、AGTTGA(SEQ ID NO：49)，以 及其他基序，例如RRTTRR(SEQ ID NO：50)。
如本文中所用，术语“ceDNA-质粒”是指包含ceDNA基因组作为分子间双链体的质粒。
如本文中所用，术语“ceDNA-杆粒”是指一种包含作为分子间双链体的ceDNA基因组的感染性杆状病 毒基因组，其能够作为质粒在大肠杆菌中增殖，因此可以作为杆状病毒的穿梭载体操作。
如本文中所用，术语“ceDNA-杆状病毒”是指一种杆状病毒，其在杆状病毒基因组内包含作为分子间双 链体的ceDNA基因组。
如本文中所用，术语“ceDNA-杆状病毒感染的昆虫细胞”和“ceDNA-BIIC”可互换使用，是指被ceDNA- 杆状病毒感染的无脊椎动物宿主细胞(包括但不限于昆虫细胞(例如Sf9细胞))。
如本文中所用，术语“封闭端DNA载体”、“ceDNA载体”和“ceDNA”可互换使用，是指具有至少一个 共价封闭端(即分子内双链体)的非病毒无衣壳DNA载体。在一些实施方式中，ceDNA包含两个共价封闭 端。
如本文中所定义，“报告分子”是指可用于提供可检测的读出数的蛋白质。报告分子通常产生可测量的 信号，例如荧光、颜色或发光。报告蛋白编码序列编码在细胞或生物中的存在易于观察的蛋白质。例如， 荧光蛋白当被特定波长的光激发时会导致细胞发荧光，荧光素酶导致细胞催化产生光的反应，以及诸如β- 半乳糖苷酶之类的酶将底物转化为有色产物。可用于实验或诊断目的的示例性报告多肽包括但不限于β- 内酰胺酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶(AP)、胸苷激酶(TK)、绿色荧光蛋白(GFP)和其他荧光蛋白、 氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和其他在本领域中公知的。
如本文中所用，术语“效应蛋白”是指提供可检测的读出的多肽，例如作为报告多肽，或更适当地，作 为杀伤细胞的多肽，例如毒素，或致使细胞易受到所选作用剂或缺乏所选作用剂而被杀伤的作用剂。效应 蛋白包括直接靶向或损害宿主细胞DNA和/或RNA的任何蛋白质或肽。例如，效应蛋白可以包括但不限 于，靶向宿主细胞DNA序列(无论是基因组的还是在染色体外元件上的)的限制性内切酶、降解细胞存活所 必需的多肽靶标的蛋白酶、DNA回旋酶抑制剂、以及核糖核酸酶型毒素。在一些实施方式中，由如本文 所述的合成生物回路控制的效应蛋白表达可作为因素参与另一个合成生物回路，从而扩展了生物回路系统响应性的范围和复杂度。
转录调节子是指激活或阻遏目的基因转录的转录激活子和阻遏子。启动子是启动特定基因转录的核酸 区域。转录激活子通常在附近与转录启动子结合并募集RNA聚合酶来直接启动转录。阻遏子与转录启动 子结合，并在空间上阻碍RNA聚合酶的转录启动。其他转录调节子可取决于它们的结合位置以及细胞和 环境条件而充当激活子或阻遏子。转录调节子类别的非限制性例子包括但不限于同源域蛋白、锌指蛋白、 翼状螺旋(叉头)蛋白和亮氨酸拉链蛋白。
如本文中所用，“阻遏蛋白”或“诱导蛋白”是与调节序列元件结合并分别阻遏或激活与调节序列元件可 操作连接的序列的转录的蛋白质。本文所述的优选的阻遏和诱导蛋白对至少一种输入剂或环境输入物的存 在或不存在敏感。本文所述的优选蛋白质是模块的形式，包含，例如可分离的DNA结合和输入剂结合或 响应性的元件或结构域。
如本文中所用，“载体(carrier)”包括所有的溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗菌和抗真菌剂、 等渗和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬液，胶体等。这样的介质和作用剂对药物活性物质的用途是本 领域公知的。补充的活性成分也可以被掺入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不会产 生毒性的、变应性的或类似的不良反应的分子实体和组合物。
如本文中所用，“输入剂响应结构域”是转录因子的结构域，其以致使连接的DNA结合融合结构域对 条件或输入剂的存在作出响应的方式与该条件或输入剂结合或以其他方式进行响应。在一个实施方式中， 条件或输入剂的存在导致输入试剂响应结构域中或其融合的蛋白质中的构象变化，从而变更转录因子的转 录调制活性。
术语“体内”是指在生物体、例如多细胞动物中或内部发生的测定或过程。在本文描述的一些方面中， 当使用单细胞生物例如细菌时，可以说方法或用途是在“体内”发生的。术语“离体”是指使用具有完整膜的 活细胞进行转化的方法和用途，所述活细胞在多细胞动物或植物体之外，例如，外植体，培养细胞、包括 原代细胞和细胞系，转化的细胞系，以及提取的组织或细胞、包括血细胞，等等。术语“体外”是指不需要 存在具有完整膜的细胞的测定和方法，例如细胞提取物，并且可以指在非细胞系统、例如不包含细胞或细 胞系统的介质、例如细胞提取物中引入可编程的合成生物回路。
本文中所用的术语“启动子”是指通过驱动核酸序列的转录来调节另一核酸序列表达的任何核酸序列， 其可以是编码蛋白质或RNA的异源靶基因。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性 的或其任何组合。启动子是核酸序列的控制区域，在此核酸序列的其余部分的启动和转录速率是受控的。 启动子也可以含有可以结合调节蛋白和分子的遗传元件，例如RNA聚合酶和其他转录因子。在一些实施 方式中，在本文所述的方面中，启动子可以驱动转录因子的表达，所述转录因子调节该启动子本身的表达 或本文所述的合成生物回路的另一模块组件中所用的另一启动子的表达。在启动子序列内将发现转录起始 位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域。真核启动子将经常但并非总是含有“TATA”框和“CAT” 框。各种启动子，包括诱导型启动子，可用于驱动本文公开的ceDNA载体中转基因的表达。
如本文所用的术语“增强子”是指顺式作用调节序列(例如50-1,500个碱基对)，其结合一种或多种蛋白 质(例如激活蛋白或转录因子)以增加核酸序列的转录激活。增强子可以定位在其调节的基因起始位点上游 或基因起始位点下游最多1,000,000个碱基对处。增强子可以定位在内含子区域内，或无关基因的外显子 区域中。
启动子可以被说成驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其转录。短语“可操作地连接”、“操作性定位”、 “操作性连接”、“在控制之下”和“在转录控制下”指示启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置 和/或取向，以控制该序列的转录启动和/或表达。如本文所用的“反向启动子”是指这样的启动子，其中核 酸序列处于相反的取向，使得编码链现在成为非编码链，反之亦然。反向启动子序列可以在各种实施方式 中用于调节开关的状态。另外，在各种实施方式中，启动子可以与增强子结合使用。
启动子可以是与基因或序列天然关联的启动子，这可以通过分离位于给定基因或序列的编码区段和/ 或外显子上游的5'非编码序列来获得。这样的启动子可以被称为“内源性的”。类似地，在一些实施方式中， 增强子可以是与核酸序列天然关联的增强子，位于该序列的下游或上游。
在一些实施方式中，编码核酸区段定位在“重组启动子”或“异源启动子”的控制下，两者均指在其天然 环境中正常不与其可操作地连接的编码核酸序列关联的启动子。重组或异源增强子是指正常在其天然环境 中不与给定核酸序列关联的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子；从任何 其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子；以及非“天然存在”的合成启动子或增强子，即包含 不同转录调节区域的不同元件、和/或通过本领域已知的基因工程方法来改变表达的突变。除了通过合成产生启动子和增强子的核酸序列之外，还可以关于本文公开的合成生物回路和模块，使用重组克隆和/或核酸 扩增技术，包括PCR，来产生启动子序列(参见，例如，美国专利No.4,683,202，美国专利No.5,928,906， 各自通过引用并入本文)。此外，预期也可以采用指导在非核细胞器例如线粒体、叶绿体等内的序列转录和 /或表达的控制序列。
如本文所述，“诱导型启动子”是特征在于当存在诱导物或诱导剂或受其影响或被其接触时，启动或增 强转录活性的启动子。如本文所定义的“诱导物”或“诱导剂”可以是内源性的，或以在诱导来自诱寻型启动 子的转录活性中起作用的方式进行施用的通常外源性的化合物或蛋白质。在一些实施方式中，诱导物或诱 导剂，即化学物质、化合物或蛋白质，本身可以是核酸序列转录或表达的结果(即诱导物可以是由另一组件 或模块表达的诱导蛋白)，该转录或表达本身可以处于诱导型启动子的控制之下。在一些实施方式中，诱导型启动子是在不存在某些剂、例如阻遏蛋白的情况下被诱导的。诱导型启动子的例子包括但不限于：四环 素，金属硫蛋白，蜕皮素，哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；以及小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复 (MMTV-LTR))和其他类固醇响应性启动子、雷帕霉素响应性启动子等。
如本文所用的术语“对象”是指向其提供用本发明的ceDNA载体的治疗、包括预防性治疗的人类或动 物。通常，动物是脊椎动物，例如但不限于灵长类动物、啮齿动物、家养动物或野生动物。灵长类动物包 括但不限于黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和 仓鼠。家养和野生动物包括但不限于：牛，马，猪，鹿，野牛，水牛，猫科物种例如家猫，犬科物种例如 狗、狐狸、狼，禽类物种例如鸡、鸸鹋、鸵鸟，以及鱼例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。在本文所述方面的某些实 施方式中，对象是哺乳动物，例如灵长类动物或人类。对象可以是雄性或雌性。另外，对象可以是婴儿或 儿童。在一些实施方式中，对象可以是新生儿或未出生的对象，例如，对象还在子宫内。优选地，对象是哺乳动物。哺乳动物可以是人类、非人类的灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些例 子。人类以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病和病症的动物模型的对象。另外，本文所述的方法和组 合物可用于家养动物和/或宠物。人类对象可以是任何年龄、性别、种族或人种群，例如，高加索人(白人)、 亚洲人、非洲人、黑人、非裔美国人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在一些实施方式中，对象可以 是临床环境中的患者或其他对象。在一些实施方式中，对象已在进行治疗。
如本文中所用，术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、 多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出期望的抗原结合活性即可。“抗 体片段”是指并非完整抗体的分子，其包含完整抗体的一部分，该部分与完整抗体结合的相同抗原结合。 在一个实施方式中，抗体或抗体片段包含免疫球蛋白链或抗体片段和至少一个免疫球蛋白可变域序列。抗 体和抗体片段的例子包括但不限于：Fv、scFv、Fab片段、Fab’、F(ab’)2、Fab’-SH、单域抗体(dAb)、重 链、轻链、重链和轻链、全抗体(例如、包括Fc、Fab、重链、轻链、可变区等中的每一个)、双特异性抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、胞内抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、多特异性抗体、或多聚抗体。抗 体或抗体片段可以是任何类别，包括但不限于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，及其任何亚类，包括但不限 于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。另外，抗体可以来源于任何哺乳动物，例如，灵长类动物、 人类、大鼠、小鼠、马、山羊等。在一个实施方式中，抗体是人类的或人源化的。在一些实施方式中，抗 体是修饰的抗体。在一些实施方式中，抗体的组分可以分开表达，使得抗体在蛋白质组分表达后自装配。 在一些实施方式中，抗体具有期望的功能，例如，对目标蛋白质的相互作用和抑制以治疗疾病或疾病的症 状。在一个实施方式中，抗体或抗体片段包含框架区或Fc区。
如本文中所用，抗体分子的“抗原结合结构域”是指抗体分子、例如免疫球蛋白(Ig)分子中参与抗原结合 的部分。在实施方式中，抗原结合位点由重(H)链和轻(L)链的可变(V)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的 可变区内的三个高度趋异的段，称为高变区，布置在被称为“框架区”(FR)的更为保守的侧翼段之间。FR是 天然存在于免疫球蛋白高变区之间和附近的氨基酸序列。在实施方式中，在抗体分子中，轻链的三个高变 区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此布置以形成抗原结合表面，该表面与结合的抗原的三维表 面互补。重链和轻链各自的三个高变区被称为“互补性决定区”或“CDR”。框架区和CDR已有定义并在例 如下列文献中描述：Kabat，E.A.等人.(1991)《免疫学感兴趣的蛋白质序列》，(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第五版，美国卫生与公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services)， NIH出版号91-3242，以及Chothia，C.等人(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。每条可变链(例如，可变重链 和可变轻链)通常由三个CDR和四个FR构成，以氨基酸顺序从氨基末端到羧基末端的排列为：FR1、CDR1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。
如本文中所用，术语“全长抗体”是指例如天然存在并通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的免 疫球蛋白(Ig)分子(例如IgG抗体)。
如本文中所用，术语“功能性抗体片段”是指与完整(例如，全长)抗体识别的抗原相同的抗原结合的片 段。术语“抗体片段”或“功能片段”还包括由可变区组成的分离的片段，例如由重链和轻链的可变区组成的 “Fv”片段或其中轻和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。在一些实施方式中， 抗体片段不包括没有抗原结合活性的抗体部分，例如Fc片段或单个氨基酸残基。
如本文中所用，“免疫球蛋白可变域序列”是指可以形成免疫球蛋白可变域的结构的氨基酸序列。例如， 该序列可以包括天然存在的可变域的全部或部分氨基酸序列。例如，该序列可以包括或可以不包括一个、 两个或更多个N-末端或C-末端氨基酸，或者可以包括与形成该蛋白质结构相容的其他改变。
如本文所用的术语“包含”用于指示组成、方法以及对该方法或组成必不可少的其相应组分，但对于包 括未指明的元素，无论是否必要，仍然是开放的。
如本文所用的术语“基本上由...组成”是指给定实施方式所需要的那些元素。该术语允许存在不实质影 响该实施方式的基本和新颖或功能性特征的元素。
术语“由...组成”是指如本文所述的组成、方法及其相应组分，其不包括在该实施方式的描述中未叙述 的任何元素。
如本说明书和所附权利要求所用，不带数量指示的指称物包括复数指称物，除非上下文另有明确规定。 因此，例如，提到“方法”包括本文所述的和/或在阅读本公开等之后对于本领域技术人员而言将变得显而易 见的类型的一个或多个方法和/或步骤，。同样，单词“或”旨在包括“和”，除非上下文中另有明确指示。虽 然与本文中所述的相似或等效的方法和材料可用于本公开的实践或检验，但合适的方法和材料在下面描 述。缩写“例如(e.g.)”源自于拉丁文exempli gratia，在本文中用来指示非限制性例子。因此，缩写“例如(e.g.)” 与术语“例如(for example)”是同义的。
除了在操作例中或在另外指出的情况之外，在本文中使用的表示成分或反应条件的量的所有数字应理 解为在所有情况下均由术语“约”修饰。术语“约”当结合百分比使用时，可以是指±1％。以下实施例进一步 详细解释本发明，但本发明的范围不应限于此。
应该理解，本发明不限于本文所述的特定方法学、方案和试剂等，因此可以变化。本文中所用的术语 仅为了描述特定实施方式的目的，而无意于限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。
不受限制地，本发明的脂质纳米粒子包括可用于将无衣壳的非病毒DNA载体递送至目标靶部位(例如， 细胞、组织、器官等)的脂质制剂。通常，脂质纳米粒子包含无衣壳的非病毒DNA载体和可电离脂质或其 盐。
因此，在一些方面，本公开提供了包含ceDNA和可电离脂质的脂质纳米粒子。例如，与由实施例1 的方法或由本文公开的其他方法获得的ceDNA一起制成并负载所述ceDNA的脂质纳米粒子制剂。这可以 通过在低pH值下将乙醇脂质与ceDNA水溶液高能混合来实现，低pH下将可电离脂质质子化并为ceDNA/ 脂质结合和粒子的成核提供有利的能量。可通过水稀释和除去有机溶剂来进一步稳定粒子。可以将粒子浓 缩至期望的水平。
通常，所述脂质粒子以总脂质与ceDNA(质量或重量)之比从约10:1至30:1来制备。在一些实施方式 中，脂质与ceDNA之比(质量/质量比；w/w比)可以在从约1:1至约25:1、从约10:1至约14:1、从约3:1 至约15:1、从约4:1至约10:1、从约5:1至约9:1、或约6:1至约9:1的范围内。可以调节脂质和ceDNA的 量以提供期望的N/P比，例如N/P比为3、4、5、6、7、8、9、10或更高。通常，脂质粒子制剂的总脂质 含量可以在从约5m/mL至约30mg/mL的范围内。
通常采用可电离脂质在低pH值下浓缩核酸货物，例如ceDNA，并驱动膜结合和促融合性。通常，可 电离脂质是包含至少一个在酸性条件下、例如在pH值为6.5或更低的条件下带正电荷或变成质子化的氨 基基团的脂质。可电离脂质在本文中也称为阳离子脂质。
示例性的可电离脂质描述于表1中列出的PCT和美国专利公布中，它们的全部内容通过引用整体并入 本文。
表1：可电离脂质
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2016/0311759中限定的式(X)
的化合物， US2016/0311759的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US20150376115或US2016/0376224中限定的式 
的化合物，US20150376115和US2016/0376224二者的内容 通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US20160151284中限定的式(I)
的化合物，US20160151284 的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US20170210967中限定的式(I)
的化合物，US20170210967的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US20150140070中限定的式
的化 合物，US20150140070的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0178541中限定的式A的化合物，
US2013/0178541的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0303587或US2013/0123338中限定的式 
的化合物，US2013/0303587和US2013/0123338二者的内容通过引用整体并 入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2015/0141678中限定的式(I)
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2015/0239926中限定的式(II)
的化合物，US2015/0239926的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2017/0119904中限定的式(I)
的化合物，US2017/0119904的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如WO2017/117528中限定的各自具有
结构的式(I)或式(II)的化合物，WO2017/117528的内容通过引用整体并入本 文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2012/0149894中限定的式A
的化合物，US2012/0149894的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2015/0057373中限定的式A
的化合物，US2015/0057373的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如WO2013/116126中限定的式A
的 化合物，WO2013/116126的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0090372中限定的式A
的化 合物，US2013/0090372的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0274523中限定的式A
的化 合物，US2013/0274523的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0274504中限定的式A
的化 合物，US2013/0274504的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0053572中限定的式A
的 化合物，US2013/0053572的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如WO2013/016058中限定的式A
的 化合物，WO2013/016058的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如WO2012/162210中限定的式A
的 化合物，WO2012/162210的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2008/042973中限定的式(I)
的 化合物，US2008/042973的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2012/01287670中限定的式(I)
的化合物，US2012/01287670的内容通过 引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2014/0200257中限定的各自具有
结构的式(I)或式(II)的化合物，US2014/0200257的内容通过引用整体并 入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2015/0203446中限定的各自具有
结构的式(I)、式(II)或式(III)的化合物，US2015/0203446的内容通过引用整 体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2015/0005363中限定的式(I)
的化合物，US2015/0005363的内容通过引用整 体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2014/0308304中限定的式(I)
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0338210中限定的式
的化合物， US2013/0338210的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如WO2009/132131中限定的式((I)
的化合物，WO2009/132131的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2012/01011478中限定的式A
的化合 物，US2012/01011478的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2012/0027796中限定的式(I)
的化合物，US2012/0027796的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2012/0058144中限定的式(XIV)
的化合物，US2012/0058144的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0323269中限定的式
的化合物，US2013/0323269的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2011/0117125中限定的式(I)
的化合物，US2011/0117125的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2011/0256175中限定的式(I)
的化合物，US2011/0256175的内 容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2012/0202871中限定的式(I)
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2011/0076335中限定的式(I)
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2006/008378中限定的式(I)
的化合物，US2006/008378的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0123338中限定的式(I)
合物，US2013/0123338的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2015/0064242中限定的式(I)X-A-Y-Z的化合物， US2015/0064242的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0022649中限定的式(XVIX)
的化合物，US2013/0022649的内容通过引 用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0116307中限定的式(I)
的化合物，US2013/0116307的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2010/0062967中限定的式(I)
的化合物， US2010/0062967的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0189351中限定的各自具有
结构的式(I)-(X)的化合物，US2013/0189351的内容通过引用整体并入本 文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2014/0039032中限定的式(I)
的化合物， US2014/0039032的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2018/0028664中限定的式(V)
的化 合物，US2018/0028664的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2016/0317458中限定的式(I)
的化合物，US2016/0317458的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是如US2013/0195920中限定的式(I)
的化合物，US2013/0195920的内容通过引用整体并入 本文。
在一些实施方式中，可电离脂质是实施例1所述的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19- 基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)。
在一些实施方式中，可电离脂质是实施例10所述的脂质ATX-002。
在一些实施方式中，可电离脂质是实施例11所述的(13Z,16Z)-N,N-d二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二 烯-1-胺(化合物32)。
在一些实施方式中，可电离脂质是实施例12所述的化合物6或化合物22。
不受限制地，可电离脂质可占脂质纳米粒子中存在的总脂质的20-90％(mol)。例如，可电离脂质的摩 尔含量可以是脂质纳米粒子中存在的总脂质的20-70％(mol)、30-60％(mol)或40-50％(mol)。在一些实施 方式中，可电离脂质占脂质纳米粒子中存在的总脂质的约50mol％至约90mol％。
在一些方面，脂质纳米粒子还可以包含非阳离子脂质。非离子脂质包括两亲性脂质、中性脂质和阴离 子脂质。因此，非阳离子脂质可以是中性不带电荷、两性离子或阴离子脂质。非阳离子脂质通常用于增强 促融合性。
示例性的非阳离子脂质包括但不限于：二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰胆碱 (DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二 棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈 酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯 (DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙 醇胺(DSPE)、单甲基磷脂酰乙醇胺(例如16-O-单甲基PE)、二甲基磷脂酰乙醇胺(例如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱 (EPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰基磷 脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱酰(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰 甘油(POPG)、二反油酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二鲸蜡基磷 酸酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱、或其混合物。应理解，也可以使用其他二酰基磷脂酰胆 碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基基团优选是由具有C10-C24碳链的脂肪酸衍生的酰基基 团，例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。
适合用于脂质纳米粒子的非阳离子脂质的其他例子包括非磷脂质，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷 基胺、棕榈酸乙酰基酯、甘油蓖麻油酸酯、基硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸类聚合物、 三乙醇胺-硫酸月桂基酯、硫酸烷基-芳基酯聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺、 鞘磷脂等。
在一些实施方式中，非阳离子脂质是磷脂。在一些实施方式中，非阳离子脂质选自DSPC、DPPC、 DMPC、DOPC、POPC、DOPE、和SM。在一些优选的实施方式中，非阳离子脂质是DPSC。
示例性的非阳离子脂质在PCT公布WO2017/099823和美国专利公布US2018/0028664中描述，这两篇 公布的内容通过引用整体并入本文。
在某些实施例中，非阳离子脂质是油酸或如US2018/0028664中限定的式(I)
的化合物，US2018/0028664的 内容通过引用整体并入本文。
非阳离子脂质可占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0-30％(mol)。例如，非阳离子脂质含量是脂质纳 米粒子中存在的总脂质的5-20％(mol)或10-15％(mol)。中各种实施方式中，可电离脂质与中性脂质的摩尔 比范围从约2:1至约8:1。
在一些实施方式中，脂质纳米粒子不包含任何磷脂。
在一些方面，脂质纳米粒子还可以包含诸如固醇之类的组分，以提供膜完整性。
可以用于脂质纳米粒子中的一种示例性固醇是胆固醇及其衍生物。胆固醇衍生物的非限制性例子包括 极性类似物，例如5α-胆甾烷醇、5β-粪醇、胆固醇基-(2'-羟基)-乙基醚、胆固醇基-(4'-羟基)-丁基醚和6-酮- 胆甾烷醇；非极性类似物，例如5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5β-胆甾烷酮和癸酸胆固醇酯；及其 混合物。在一些实施方式中，胆固醇衍生物是极性类似物例如胆固醇基-(4'-羟基)-丁基醚。
示例性胆固醇衍生物在PCT公布WO2009/27060和美国专利公布US2010/0130588中描述，这两篇公 布的内容通过引用整体并入本文。
提供膜完整性的组分，例如固醇，可占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0-50％(mol)。在一些实施方式 中，这样的组分是脂质纳米粒子的总脂质含量的20-50％(mol)30-40％(mol)。
在一些方面，脂质纳米粒子还可以包含聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质 纳米粒子的聚集和/或提供空间稳定作用。示例性的缀合脂质包括但不限于，PEG-脂质缀合物、聚噁唑啉 (POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(例如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物及其混 合物。在一些实施方式中，缀合的脂质分子是PEG-脂质缀合物，例如(甲氧基聚乙二醇)缀合的脂质。
示例性的PEG-脂质缀合物包括但不限于：PEG-二酰基甘油(DAG)(例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二 肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、PEG化的磷脂 酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS-DAG)(例如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲 氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇 2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐、或其混合物。另外的示例性PEG-脂质缀合物描述于例如US5,885,613、US6,287,591、US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、 US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224、US2017/0119904、和US/099823中，所有它们的内 容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，PEG-脂质是如US2018/0028664中限定的式(III)
的化合物，US2018/0028664的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，PEG-脂质是如US20150376115或US2016/0376224中限定的式
的脂质，US20150376115和US2016/0376224二者的内容通过引用整体 并入本文。
PEG-DAA缀合物可以是，例如，PEG-二月桂氧基丙基、PEG-二肉豆蔻氧基丙基、PEG-二棕榈氧基丙 基或PEG-二硬脂氧基丙基。PEG-脂质可以是下列中的一种或多种：PEG-DMG，PEG-二月桂基甘油，PEG- 二棕榈酰基甘油，PEG-二硬脂基甘油，PEG-二月桂基聚糖酰胺，PEG-二肉豆蔻基聚糖酰胺，PEG-二棕榈 酰基聚糖酰胺，PEG-二硬脂基聚糖酰胺，PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)羧酰胺基-3',6'-二氧杂辛 烷基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇))，PEG-DMB(3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、和1,2- 二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一些例子中，PEG-脂质可以选自由下 列所组成的组：PEG-DMG，1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]，
与PEG以外的分子缀合的脂质也可以代替PEG-脂质使用。例如，聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰 胺-脂质缀合物(例如ATTA-脂质缀合物)、和阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物可代替或附加于PEG-脂质使用。
示例性的缀合脂质，即PEG-脂质、(POZ)-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质在表2 列出的PCT和美国专利申请中描述，所有这些专利申请的内容通过引用整体并入本文。
表2：缀合脂质
| PCT公布 | US公布 |
| WO1996/010392 | US5,885,613 |
| WO1998/051278 | US6,287,591 |
| WO2002/087541 | US2003/0077829 |
| WO2005/026372 | US2005/0175682 |
| WO2008/147438 | US2008/0020058 |
| WO2009/086558 | US2011/0117125 |
| WO2012/000104 | US2013/0303587 |
| WO2017/117528 | |
| WO2017/099823 | US2018/0028664 |
| WO2015/199952 | US2015/0376115 |
| WO2017/004143 | US2016/0376224 |
| WO2015/095346 | US2016/0317458 |
| US6,320,017 | |
| US6,586,559 | |
| WO2012/000104 | US2013/0303587 |
| WO2012/000104 | US2013/0303587 |
| WO2010/006282 | US20110123453 |
PEG或缀合的脂质可占脂质纳米粒子中存在的总脂质的0-20％(mol)。在一些实施方式中，PEG或缀 合脂质的含量是脂质纳米粒子中存在的总脂质的0.5-10％或2-5％(mol)。
可电离脂质、非阳离子脂质、固醇和PEG/缀合脂质的摩尔比可以根据需要变化。例如，脂质粒子可 以包含以组合物的摩尔或总重量计30-70％的可电离脂质、以组合物的摩尔或总重量计0-60％的胆固醇、以 组合物的摩尔或总重量计0-30％的非阳离子脂质、和以组合物的摩尔或总重量计1-10％的缀合脂质。优选 地，组合物包含以组合物的摩尔或总重量计30-40％的可电离脂质、以组合物的摩尔或总重量计40-50％的 胆固醇、和以组合物的摩尔或总重量计10-20％的非阳离子脂质。在一些其他实施方式中，组合物是以组 合物的摩尔或总重量计50-75％的可电离脂质、以组合物的摩尔或总重量计20-40％的胆固醇、以组合物的 摩尔或总重量计5-10％的非阳离子脂质、和以组合物的摩尔或总重量计1-10％的缀合脂质。组合物可以含 有以组合物的摩尔或总重量计60-70％的可电离脂质、以组合物的摩尔或总重量计25-35％的胆固醇、和以 组合物的摩尔或总重量计5-10％的非阳离子脂质。组合物也可以含有以组合物的摩尔或总重量计高达90％ 的可电离脂质和以组合物的摩尔或总重量计2-15％的非阳离子脂质。制剂也可以是脂质纳米粒子制剂，例 如包含以组合物的摩尔或总重量计8-30％的可电离脂质、以组合物的摩尔或总重量计5-30％的非阳离子脂 质、和以组合物的摩尔或总重量计0-20％的胆固醇；以组合物的摩尔或总重量计4-25％的可电离脂质、以 组合物的摩尔或总重量计4-25％的非阳离子脂质、以组合物的摩尔或总重量计2-25％的胆固醇、以组合物 的摩尔或总重量计10-35％的缀合脂质、和以组合物的摩尔或总重量计5％的胆固醇；或以组合物的摩尔或 总重量计2-30％的可电离脂质、以组合物的摩尔或总重量计2-30％的非阳离子脂质、以组合物的摩尔或总 重量计1-15％的胆固醇、以组合物的摩尔或总重量计2-35％的缀合脂质、和以组合物的摩尔或总重量计1-20％的胆固醇；或甚至以组合物的摩尔或总重量计高达90％的可电离脂质和以组合物的摩尔或总重量计 2-10％的非阳离子脂质，或甚至以组合物的摩尔或总重量计高达100％的可电离脂质。在一些实施方式中， 脂质粒子制剂包含可电离脂质、磷脂、胆固醇和PEG化脂质，摩尔比为50:10:38.5:1.5。在一些其他实施 方式中，脂质粒子制剂包含可电离脂质、胆固醇和PEG化脂质，摩尔比为60:38.5:1.5。
在一些实施方式中，脂质粒子包含可电离脂质、非阳离子脂质(例如磷脂)、固醇(例如胆固醇)和PEG 化脂质，其中可离子化脂质的脂质摩尔比范围从20至70摩尔％，目标为40-60，非阳离子脂质的摩尔百 分比范围从0至30，目标为0至15，固醇的摩尔百分比范围从20至70，目标为30至50，以及PEG化脂 质的摩尔百分比范围从1至6，目标是2至5。
在一些实施方式中，脂质粒子包含可电离脂质/非阳离子脂质/固醇/缀合脂质，摩尔比为50:10:38.5:1.5。
在其他方面，本公开提供了包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷酯酰乙醇胺的脂质纳米粒子制剂。
在一些实施方式中，也可以包括一种或多种附加化合物。那些化合物可以分开施用，或者附加化合物 可以包括在本发明的脂质纳米粒子中。换句话说，脂质纳米粒子可含有除ceDNA之外的其他化合物或至 少不同于第一ceDNA的第二ceDNA。不受限制地，其他附加化合物可以选自由下列所组成的组：小或大 的有机或无机分子、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白质、肽类似物及其衍生物、肽模拟物、核 酸、核酸类似物和衍生物、由生物材料制成的提取物、或其任何组合。
在一些实施方式中，所述一种或多种附加化合物可以是治疗剂。治疗剂可以选自适合于治疗目的的任 何类别。换句话说，治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。换句话说，可以根据期望的治疗目的和 生物学作用来选择治疗剂。例如，如果LNP内的ceDNA可用于治疗癌症，则附加化合物可以是抗癌剂(例 如化学治疗剂、靶向癌症疗法(包括但不限于小分子、抗体、或抗体-药物缀合物)。在另一个示例中，如果 含有ceDNA的LNP可用于治疗感染，则附加化合物可以是抗微生物剂(例如，抗生素或抗病毒化合物)。 在又一个示例中，如果含有ceDNA的LNP可用于治疗免疫疾病或病症，则附加化合物可以是调制免疫应 答的化合物(例如，免疫抑制性、免疫刺激性化合物、或调节一个或多个特异性免疫途径的化合物)。在一 些实施方式中，含有不同化合物、例如编码不同蛋白质的ceDNA或诸如治疗剂的不同化合物的不同脂质 纳米粒子的不同混合物，可以用于本发明的组合物和方法中。
在一些实施方式中，附加化合物是免疫调制剂。例如，附加化合物是免疫抑制剂。在一些实施方式中， 附加化合物是免疫刺激性的。
示例性免疫调制剂包括但不限于：白介素(例如，IL-2、IL-7、IL-12)，细胞因子(例如，粒细胞集落刺 激因子(G-CSF)、干扰素)，趋化因子(例如，CCL3、CCL26、CXCL7)，免疫调节性酰亚胺药物(IMiD)(例如 沙利度胺及其类似物(来那度胺、泊马度胺和阿普斯特))，其他免疫调制剂，包括但不限于：胞嘧啶磷酸鸟 苷、寡脱氧核苷酸、葡聚糖。
在一些实施方式中，免疫调节剂可以是免疫抑制药物。示例性的免疫抑制药物包括但不限于糖皮质激 素、细胞抑制剂、抗体、作用于抑免蛋白的药物、和其他药物。糖皮质激素包括但不限于泼尼松、地塞米 松和氢化可的松。细胞抑制剂的例子包括烷基化剂，例如氮芥子气(例如，环磷酰胺)、亚硝基脲和铂化合 物。细胞抑制剂还可以包括抗代谢物，例如叶酸类似物(例如甲氨蝶呤)、嘌呤类似物(例如硫唑嘌呤和巯基 嘌呤)、嘧啶类似物(例如氟尿嘧啶)和蛋白质合成抑制剂。其他细胞抑制剂包括细胞毒性抗生素，例如放线 菌素、蒽环类、丝裂霉素C、博来霉素和光神霉素。
用于免疫抑制的抗体包括但不限于：从马血清中获得的Atgam，和胸腺球蛋白(Thymoglobulin)——一 种针对IL-2受体-(CD25-)和/或CD3-引导抗体的抗体，MUROMONAB-CD3TM(Orthoclone OKT3)，巴利昔 单抗(SIMULECTTM)，达利珠单抗(ZENAPAXTM)和莫罗莫那(muromonab)。
作用于抑免蛋白的药物包括但不限于环孢菌素、他克莫司、雷帕霉素(SIROLIMUSTM)和依维莫司。 生物制剂的例子包括阿巴西普、阿那白滞素、赛妥珠单抗、戈利木单抗、依奇珠单抗(ixekizumab)、那他珠 单抗、利妥昔单抗、苏金单抗、托珠单抗(tocilizumab)、优特克单抗和维多珠单抗(vedolizumab)。
可用作免疫调制剂或免疫抑制剂的其他药物包括但不限于：干扰素(例如IFN-β)、阿片类、TNF结合 蛋白(例如TNF-α(肿瘤坏死因子-α)结合蛋白、英夫利昔单抗(REMICADETM)、依那西普(ENBRELTM)、或阿 达木单抗(HUMIRATM))、姜黄索(姜黄中的成分)和儿茶素(绿茶中)、麦考酚酯(Mycophenolate)、芬戈莫德、 多球壳菌素、抗增殖剂(例如、多球壳菌素、他克莫司、吗替麦考酚酯(Mycophenolate mofetil)、麦考酚钠、 硫唑嘌呤)、mTOR抑制剂(例如西罗莫司和依维莫司)、钙依赖磷酸酶抑制剂(例如环孢菌素和他克莫司)、 IMDS抑制剂(例如硫唑嘌呤、来氟米特和麦考酚酯)、fingolmod、阿巴西普、阿那白滞素、赛妥珠单抗、 戈利木单抗、依奇珠单抗、那他珠单抗、利妥昔单抗、苏金单抗、托珠单抗、优特克单抗、和维多珠单抗。
在一些实施方式中，可用于如本文公开的组合物和方法中的免疫抑制剂可以选自以下化合物之一：麦 考酚酸、环孢菌素、硫唑嘌呤、他克莫司、环孢菌素A、FK506、雷帕霉素、来氟米特、去氧精胍菌素、 泼尼松、硫唑嘌呤、吗替麦考酚酯、OKT3、ATAG或咪唑立宾。
在某些实施方式中，免疫抑制剂选自由下列所组成的组：泼尼松、甲泼尼龙、Kenalog、Medrol口服 剂、Medrol(Pak)口服剂、Depo-Medrol注射剂、泼尼松龙口服剂、Solu-Medrol注射剂、氢化可的松口服 剂、Cortef口服剂、Solu-Medrol静脉注射剂、可的松口服剂、Celestone Soluspan注射剂、Orapred ODT口 服剂、Orapred口服剂、Prelone口服剂、醋酸甲泼尼龙注射剂、Prednisone Intensol口服剂、醋酸倍他米松 &磷酸钠注射剂、Veripred、Celestone口服剂、甲基泼尼松龙琥珀酸钠静脉注射剂、甲基泼尼松龙琥珀酸 钠注射剂、Millipred口服剂、Solu-Medrol(PF)注射剂、Solu-Cortef注射剂、Aristospan动脉内注射剂、氢 化可的松琥珀酸钠注射剂、泼尼松龙磷酸钠口服剂、甲泼尼龙琥珀酸钠(PF)静脉注射剂、Solu-Medrol(PF) 静脉注射剂、己曲安奈德注射剂、A-Hydrocort注射剂、A-Methapred注射剂、Millipred DP口服剂、Flo-Pred 口服剂、Aristospan Intralesional注射剂、倍他米松口服剂、甲泼尼龙琥珀酸钠(PF)注射剂、氢化可的松琥 珀酸钠(PF)注射剂、Solu-Cortef(PF)注射剂、醋酸泼尼松龙口服剂、地塞米松的0.9％NaCl静脉注射剂、Rayos、左甲状腺素。当然，本领域普通技术人员知道免疫抑制剂可以轻易地被取代，因为该列表不应被 认为是穷举的或限制性的。
免疫抑制剂可导致对象的免疫细胞减少，例如减少表达CD11b、CD4、CD8中至少一种或多种的免疫 细胞，和/或减少选自但不限于TNFα或MCP-1的促炎细胞因子。在一些实施方式中，促炎细胞因子选自 下列中的任何一个或组合：细胞因子、淋巴因子、单核因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集 落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、卵 泡刺激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、 催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、转化生长因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子(IGF)、促红细 胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、苗勒管抑制物(MIS)、小鼠促性腺激 素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、白介素(IL)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、S1因子、IL-1、IL-1cc、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、 IL-18IL-21、IL-23、IL-25、LIF、kit配体、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白和内皮抑素。
在一些实施方式中，促炎细胞因子可选自下列中的任何一个或组合：白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因 子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、干扰素-γ(IFN-γ)、血管内皮生长因子(VEGF)、白血病 抑制因子(LIF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、RANTES、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、 基质金属蛋白酶2(MMP2)、IP-10、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP1α)和/或巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP1β)。
在一些实施方式中，免疫调制剂是NLRP3激动剂。示范性的NLRP3激动剂包括但不限于咪唑并喹啉； 咪唑并萘啶；吡唑并吡啶；芳基取代的咪唑并喹啉；具有1-烷氧基1H-咪唑并环系的化合物；噻唑并[4,5-c]- 喹啉-4-胺；噻唑并[4,5-c]-喹啉-4-胺；硒唑并[4,5-c]-喹啉-4-胺；咪唑并萘啶，咪唑并喹啉胺；1-取代、2- 取代的1H-咪唑并[4,5-C]喹啉-4-胺；稠合的环烷基咪唑并吡啶；1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；1-取代的1H- 咪唑并-[4,5-c]喹啉-4-胺；咪唑并-[4,5-C]喹啉-4-胺；2-乙基1H-咪唑并[4,5-ci喹啉-4-胺；烯属1H-咪唑[4,5-c] 喹啉-4-胺；6,7-二氢-8-(咪唑-1-基)-5-甲基-1-氧代-1H,5H-苯并[ij]喹嗪-2-羧酸；吡啶并喹喔啉-6-羧酸；6,7- 二氢-8-(咪唑-1-基)-5-甲基-1-氧代-1H,5H-苯并[ij]喹嗪-2-羧酸；取代的萘并[ij]喹嗪；取代的吡啶并喹喔啉-6- 羧酸；7-羟基-苯并[ij]喹嗪-2-羧酸衍生物；取代的苯并[ij]喹嗪-2-羧酸；7-羟基-苯并[ij]喹嗪-2-羧酸；取代的吡啶并[1,2,3,-de]-1,4-苯并噁嗪；和四氢喹啉的N-亚甲基丙二酸酯。在一些实施方式中，NLRP3激动剂 是如US20170056448A1中限定的式
的化合物，US20170056448A1的内容通 过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，免疫调制剂是TLR7和/或TLR8配体。在一些实施方式中，免疫调制剂是咪喹莫 特(1-异丁基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺)或雷西莫德。
在一些实施方式中，免疫调制剂是如US9034336B2中限定的式
的基于咪喹并 喹啉的化合物，US9034336B2的内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，免疫调制剂是SMAD7调制剂。例如，SMAD7调制剂可以是如WO2017059225A1 中限定的SMAD7反义寡核苷酸(AON)，WO2017059225A1的内容通过引用整体并入本文。
免疫调制剂可以是TLR调制剂。例如，免疫调制剂可以是TLR3、TLR4、TLR7、TLR8或TLR9调制 剂，例如TLR3、TLR4、TLR7、TLR8或TLR9激动剂或者TLR3、TLR4、TLR7、TLR8或TLR9拮抗剂。 在一些实施方式中，TLR调制剂是TLR3调制剂。在一些实施方式中，TLR调制剂是TLR4调制剂。在一 些实施方式中，TLR调制剂是TLR7调制剂。在一些实施方式中，TLR调制剂是TLR8调制剂。在一些实 施方式中，TLR调制剂是TLR9调制剂。在一些实施方式中，TLR调制剂是TLR3激动剂。在一些实施方 式中，TLR调制剂是TLR4激动剂。在一些实施方式中，TLR调制剂是TLR7激动剂。在一些实施方式中， TLR调制剂是TLR8激动剂。在一些实施方式中，TLR调制剂是TLR9激动剂。在一些实施方式中，TLR 调制剂是TLR3拮抗剂。在一些实施方式中，TLR调制剂是TLR4拮抗剂。在一些实施方式中，TLR调制 剂是TLR7拮抗剂。在一些实施方式中，TLR调制剂是TLR8拮抗剂。在一些实施方式中，TLR调制剂是 TLR9拮抗剂。在一些实施方式中，本文描述的TLR调制剂可以调制两种或更多种TLR。在一些实施方式 中，TLR调制剂可以激活一种或多种TLR并抑制一种或多种TLR。在一些实施方式中，TLR调制剂是TLR9 调制剂，例如
或
一些示例性TLR调制剂在例如WO2017059225A1中描述。
在一些实施方式中，免疫调制剂是如WO2017059225A1中所述的CpG-A或Cpg-B寡核苷酸。
病原体来源的DNA的胞质检测需要通过TANK结合激酶1(TBK1)及其下游转录因子——IFN调节因 子3(IRF3)进行信号传导。称为STING(IFN基因的刺激物；也称为MITA、ERIS、MPYS和TMEM173)的 跨膜蛋白起到这些环状嘌呤二核苷酸的信号传导受体的功能，引起TBK1-IRF3信号传导轴的刺激和STING 依赖性I型干扰素响应。因而，在一些实施方式中，免疫调制剂是STING调制剂。STING直接与环状二 鸟苷酸一磷酸结合，但不与其他无关的核苷酸或核酸结合。因此，在一些实施方式中，STING调制剂是环 嘌呤二核苷酸。示例性的环嘌呤二核苷酸和STING调制剂在例如US9549944B2中描述，US9549944B2的 内容通过引用整体并入本文。
其他示例性的免疫抑制剂包括但不限于：阿巴西普；阿达木单抗；腺苷受体激动剂；阿那白滞素；芳 基烃受体抑制剂；自噬抑制剂，例如3-甲基腺嘌呤；钙依赖磷酸酶抑制剂；钙依赖磷酸酶抑制剂，例如环 孢菌素和他克莫司；半胱天冬酶-1抑制剂；赛妥珠单抗；cGAS抑制剂；皮质类固醇；皮质类固醇，例如 泼尼松、布地奈德、泼尼松龙；细胞因子抑制剂；细胞因子受体激活剂；细胞因子受体抑制剂；依那西普； 糖皮质激素；戈利木单抗；G-蛋白偶联受体激动剂；G-蛋白偶联受体拮抗剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；组 蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如曲古抑菌素A；IMDH抑制剂，例如硫唑嘌呤、来氟米特和麦考酚酯；英夫利 昔单抗；线粒体功能抑制剂，例如鱼藤酮；依奇珠单抗；激酶抑制剂；甲泼尼龙；单克隆抗体，如巴利昔 单抗、达克珠单抗和莫罗莫那；mTOR抑制剂，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物、西罗莫司和依维莫司； 那他珠单抗；NF-κβ抑制剂，例如6Bio、地塞米松、TCPA-1、IKK VII；OTK3；氧化ATP，例如P2X受 体阻滞剂；P38抑制剂；过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂；过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂；磷 酸酶抑制剂；磷酸二酯酶抑制剂，例如磷酸二酯酶4抑制剂(PDE4)，例如咯利普兰；PI3 KB抑制剂，例如 TGX-221；前列腺素E2激动剂(PGE2)，例如米索前列醇；蛋白酶体抑制剂I(PSI)；蛋白酶体抑制剂；类视 色素；利妥昔单抗；苏金单抗；他汀类；TGF-β受体激动剂；TGF-β信号传导剂；胸腺球蛋白(Thymoglobulin)； TLR拮抗剂；托珠单抗；优特克单抗；和维多珠单抗。免疫抑制剂还包括：IDO，维生素D3，环孢菌素、 例如环孢菌素A，芳基烃受体抑制剂，白藜芦醇，硫唑嘌呤(Aza)，6-巯基嘌呤(6-MP)，6-硫鸟嘌呤(6-TG)， FK506，萨菲菌素(sanglifehrin)A，沙美特罗，吗替霉酚酸酯(MMF)，阿司匹林和其他COX抑制剂，尼氟 酸，雌三醇和雷公藤内酯，白介素(例如，IL-1、IL-10)，环孢菌素A，靶向细胞因子或细胞因子受体的siRNA， 等等。
在一些实施方式中，免疫调制剂选自由下列所组成的组：3-甲基腺嘌呤、6-Bio、6-巯基嘌呤(6-MP、 6-硫鸟嘌呤(6-TG)、FK506、萨菲菌素A、阿巴西普、阿达木单抗、阿那白滞素、芳基烃受体抑制剂、阿 司匹林、自噬抑制剂、硫唑嘌呤、巴利昔单抗、布地奈德、钙依赖磷酸酶抑制剂、半胱天冬酶-1抑制剂、 赛妥珠单抗、cGAS抑制剂、COX抑制剂、尼氟酸、环孢菌素、细胞因子抑制剂、细胞因子受体激活剂、 细胞因子受体抑制剂、达利珠单抗、地塞米松、雌三醇、依那西普、依维莫司、糖皮质激素、戈利木单抗、 G-蛋白偶联受体激动剂、G-蛋白偶联受体拮抗剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、IDO、IKK VII、英夫利昔单 抗、白介素-1、白介素10、依奇珠单抗、激酶抑制剂、来氟米特、甲泼尼龙、米索前列醇、莫罗莫那、麦 考酚酯、吗替霉酚酸酯(MMF)、那他珠单抗、OTK3、氧化ATP、P2X受体阻滞剂、P38抑制剂、过氧化 物酶体增殖物激活受体激动剂、过氧化物酶体增殖物激活受体拮抗剂、磷酸酶抑制剂、PI3 KB抑制剂、泼 尼松龙、泼尼松、蛋白酶体抑制剂I(PSI)、蛋白酶体抑制剂、雷帕霉素和雷帕霉素类似物、白藜芦醇、类 视色素、利妥昔单抗、咯利普兰、鱼藤酮、沙美特罗、苏金单抗、西罗莫司、他汀类、他克莫司、TCPA-1、 TGX-221、胸腺球蛋白、TLR9拮抗剂、托珠单抗、曲古抑菌素A、雷公藤素、优特克单抗、维多珠单抗、 维生素D3、及其任何组合。
注意，本文所述的任何一种免疫调节剂均可与本文公开的脂质纳米粒子、ceDNA载体和/或组合物一 起使用。例如，免疫调制剂可单独使用或与本文所述的一种或多种(例如，一、二、三、四、五种或更多种) 其他免疫调制剂组合使用。
在一些实施方式中，免疫调制剂选自由下列所组成的组：芳基烃受体抑制剂；半胱天冬酶-1抑制剂； cGAS抑制剂；细胞因子抑制剂；G-蛋白偶联受体激动剂；G-蛋白偶联受体拮抗剂；线粒体功能抑制剂； mTOR抑制剂；NF-κβ抑制剂；过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂；磷酸酶抑制剂；磷酸二酯酶抑制剂， TGX-221；前列腺素E2激动剂(PGE2)；TLR9拮抗剂；蛋白酶体抑制剂；TGF-β受体激动剂和TGF-β信 号传导剂。任何一种或多种上述剂可以单独使用或与含有ceDNA的LNP组合使用。
本文还提供了包含脂质纳米粒子和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
在一些方面，本公开提供了还包含一种或多种药物赋形剂的脂质纳米粒子制剂。在一些实施方式中， 脂质纳米粒子制剂还包含蔗糖、三羟甲基氨基甲烷(tris)、海藻糖和/或甘氨酸。
一些示例性的LNP特性
通常，本发明的脂质纳米粒子具有选定的平均直径以提供意向治疗效果。因此，在一些方面，脂质纳 米粒子的平均直径从约30nm至约150nm，更通常从约50nm至约150nm，更通常约60nm至约130nm， 更通常约70nm至约110nm，最通常约85nm至约105nm，并优选约100nm。在一些方面，本公开提供 了相对普通纳米粒子的相对尺寸更大并且尺寸为约150至250nm的脂质粒子。脂质纳米粒子的粒度可以 使用例如Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern，英国)系统通过准弹性光散射来确定。
取决于脂质颗粒的意向用途，组分的比例可以变化，并可以使用例如内体释放参数(ERP)测定来测量 特定制剂的递送效率。
ceDNA可以与粒子的脂质部分复合或包封在脂质纳米粒子的脂质位置中。在一些实施方式中，可以将 ceDNA完全包封在脂质纳米粒子的脂质位置中，从而保护其免受核酸酶、例如水溶液中的核酸酶的降解。 在一些实施方式中，脂质纳米粒子在37℃下暴露于核酸酶至少约20、30、45或60分钟后，脂质纳米粒 子中的ceDNA基本未降解。在一些实施方式中，脂质纳米粒子在37℃下在血清中温育至少约30、45或 60分钟或者至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34 或36小时后，粒子中的ceDNA基本未降解。
在某些实施方式中，脂质纳米粒子对于对象、例如对于诸如人类的哺乳动物基本上是无毒的。
在一些方面，脂质纳米粒子制剂是冻干粉末。
在一些实施方式中，脂质纳米粒子是具有至少一个脂质双层的固体芯粒子。在其他实施方式中，脂质 纳米粒子具有非双层结构，即非层状(即，非双层)形态。不受限制地，非双层形态可以包括，例如，三维 的管、棒、立方对称等。脂质粒子的非层状形态(即，非双层结构)可以使用本领域技术人员已知和使用的 分析技术来确定。这样的技术包括但不限于低温透射电子显微镜(“Cryo-TEM”)、差示扫描量热法(“DSC”)、 X射线衍射等。例如，可以使用，例如，如US2010/0130588中所述的Cryo-TEM分析来容易地评估和表 征脂质纳米粒子的形态(层状对非层状)，US2010/0130588的内容通过引用整体并入本文。
在一些进一步的实施方式中，具有非层状形态的脂质纳米粒子是电子致密的。
在一些方面，本公开提供了结构上为单层或多层的脂质纳米粒子。在一些方面，本公开提供了包含多 囊泡粒子和/或泡沫基粒子的脂质纳米粒子制剂。
通过控制脂质组分的组成和浓度，可以控制脂质缀合物从脂质粒子中交换出来的速率，进而可以控制 脂质纳米粒子变融合的速率。另外，其他变量，包括例如pH、温度或离子强度，可用于变化和/或控制脂 质纳米粒子变融合的速率。基于本公开，可用于控制脂质纳米粒子变融合的速率的其他方法对于本领域普 通技术人员将是显而易见的。通过控制脂质缀合物的组成和浓度，可以控制脂质粒度，也将是显而易见的。
配制的阳离子脂质的pKa可与LNP递送核酸的有效性相关(see Jayaraman等人，Angewandte Chemie， International Edition(2012)，51(34)，8529-8533；Semple等人，Nature Biotechnology 28，172-176(20l 0)， 两者均通过引用整体并入)。优选的pKa范围是约5至约7。使用基于2-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS)的荧 光的测定，可以确定脂质纳米粒子中阳离子脂质的pKa。
ceDNA在脂质粒子中的包封可以通过进行膜不透性荧光染料排除测定来确定，该测定使用当与核酸结 合时具有增强的荧光的染料，例如
测定或
测定。通常，包封是通过将所述染料添加到 脂质粒子制剂中、测量所生成的荧光并将其与在添加少量非离子型洗涤剂后观察到的荧光进行比较来确定 的。洗涤剂介导的脂质双层破坏释放了包封的ceDNA，使其与膜不透性染料相互作用。ceDNA的包封可 以计算为E＝(I0-I)/I0，其中I和I0是指添加洗涤剂之前和之后的荧光强度。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体制剂，其包含一种或多种具有聚乙二醇(PEG)官能团的化合物(所 谓的“PEG化的化合物”)，聚乙二醇官能团可以降低所述化合物的免疫原性/抗原性、为其提供亲水性和疏 水性和/或降低治疗有效剂量频率。在其他方面，所述脂质体制剂可以仅包含聚乙二醇(PEG)聚合物作为附 加组分。在这样的方面，PEG或PEG官能团的分子量可以从62Da至约5,000Da。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体制剂，其将在数小时至数周的时间内以延长释放或受控释放规 律来递送ceDNA。在一些相关的方面，脂质体制剂可包含以脂质双层为界的水性腔。在其他相关方面，脂 质体制剂将ceDNA与附加组分一起包封起来，所述附加组分在升高的温度下经历物理转变，在数小时至 数周的时间内释放ceDNA。
在一些方面，脂质体制剂包含鞘磷脂和一种或多种本文公开的脂质。在一些方面，脂质体制剂包含光 敏体(optisomes)。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体制剂，其包含一种或多种选自下列的脂质：N-(羰基-甲氧基聚 乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)，MPEG(甲氧 基聚乙二醇)缀合的脂质，HSPC(氢化大豆磷脂酰胆碱)；PEG(聚乙二醇)；DSPE(二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸 乙醇胺)；DSPC(二硬脂酰基磷脂酰胆碱)；DOPC(二油酰基磷脂酰胆碱)；DPPG(二棕榈酰基磷脂酰甘油)； EPC(卵磷脂酰胆碱)；DOPS(二油酰基磷脂酰丝氨酸)；POPC(棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱)；SM(鞘磷脂)；MPEG(甲氧基聚乙二醇)；DMPC(二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱)；DMPG(二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油)；DSPG(二 硬脂酰基磷脂酰甘油)；DEPC(二芥酰基磷脂酰胆碱)；DOPE(二油酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺)，硫酸胆固醇 酯(CS)，二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)，DOPC(二油酰基-sn-甘油-磷脂酰胆碱)，或其任何组合。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体制剂，其包含磷脂、胆固醇和PEG化脂质，摩尔比为56:38:5。 在一些方面，脂质体制剂的总脂质含量为2-16mg/mL。在一些方面，本公开提供了一种脂质体制剂，其包 含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一 种脂质体制剂，其分别包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、含有乙醇胺官能团的脂质和PEG化脂质，相应 的摩尔比为3:0.015:2。在一些方面，本公开提供了一种脂质体制剂，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质、 胆固醇和PEG化脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体制剂，其包含含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和胆固醇。在一些方面，EG化脂质是PEG-2000-DSPE。在一些方面，本公开提供了一种脂质体制剂，其 包含DPPG、大豆PC、MPEG-DSPE脂质缀合物和胆固醇。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体制剂，其包含一种或多种含有磷脂酰胆碱官能团的脂质和一种 或多种含有乙醇胺官能团的脂质。在一些方面，本公开提供了一种脂质体制剂，其包含下列中的一种或多 种：含有磷脂酰胆碱官能团的脂质，含有乙醇胺官能团的脂质，和/或固醇，例如胆固醇。在一些方面，脂 质体制剂包含DOPC/DEPC；和DOPE。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体制剂，其还包含一种或多种药物赋形剂，例如蔗糖和/或甘氨酸。
在一些方面，本公开提供了一种结构上为单层或多层的脂质体制剂。在一些方面，本公开提供了一种 包含多囊泡粒子和/或泡沫基粒子的脂质体制剂。在一些方面，本公开提供了一种相对普通纳米粒子的相对 尺寸更大并且尺寸为约150至250nm的脂质体制剂。在一些方面，脂质体制剂是冻干粉末。
在一些方面，本公开提供了一种脂质体制剂，其通过向在脂质体外部具有分离的ceDNA的混合物中 添加弱碱，与通过实施例1的方法或在本文中公开的其他方式方法获得的ceDNA载体一起制备并负载所 述ceDNA载体。这种添加将脂质体外部的pH提高到大约7.3，并驱动ceDNA进入脂质体中。在一些方面， 本公开提供了一种在脂质体内部为酸性pH的脂质体制剂。在这样的情况下，脂质体的内部可以为pH 4-6.9， 更优选pH 6.5。在其他方面，本发明提供了一种通过使用脂质体内药物稳定化技术制备的脂质体制剂。在 这种情况下，利用聚合或非聚合的高带电阴离子和脂质体内俘获剂，例如多磷酸盐或蔗糖八硫酸盐。
在其他方面，本发明提供了一种包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质体制剂。
本文公开的ceDNA可以掺入适合施用于对象的药物组合物中，以体内递送至对象的细胞、组织或器 官。通常，药物组合物包含本文公开的ceDNA和药学上可接受的载体。例如，可以将本发明的ceDNA载 体掺入适合于期望的治疗施用途径(例如，肠胃外施用)的药物组合物中。还考虑了通过高压静脉内或动脉 内输注、以及细胞内注射例如核内显微注射或胞浆内注射进行的被动组织转导。可将用于治疗目的的药物 组合物配制成溶液、微乳液、分散体、脂质体或其他适合高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液 可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分之一或组合一起掺入适当的缓冲液中、 然后进行过滤灭菌来制备。
如本文公开的ceDNA载体可被掺入适合于局部、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋 巴内、腹膜内、皮下、气管内、组织内(例如、肌内、心内、肝内、肾内、脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例 如眼眶外、眼眶内、眼眶后、视网膜内、视网膜下、脉络膜、脉络膜下、基质内、前房内和玻璃体内)、耳 蜗内和粘膜(例如口腔、直肠、鼻)施用的药物组合物。还考虑了通过高压静脉内或动脉内输注、以及细胞 内注射例如核内显微注射或胞浆内注射进行的被动组织转导。
可以配制包含ceDNA载体的药物活性组合物，以将核酸中的转基因递送至接受者的细胞，导致在其 中治疗性表达转基因的。所述组合物也可以包括药学上可接受的载体。
本文提供的组合物和载体可用于为了各种目的递送转基因。在一些实施方式中，转基因编码意欲用于 研究目的的蛋白质或功能性RNA，例如，创建包藏该转基因的体细胞转基因动物模型，例如，以研究转基 因产物的功能。在另一个示例中，转基因编码意欲用于创建疾病动物模型的蛋白质或功能性RNA。在一些 实施方式中，转基因编码一种或多种肽、多肽或蛋白质，其可用于治疗、改善，预防哺乳动物的疾病状态。 可以在临床环境中将转基因以足够的量将转移给对象(例如，在其中表达)，以治疗与该基因表达降低、缺 乏表达或功能障碍有关的疾病。在一些实施方式中，可以将转基因以足够的量转移给对象(例如，在其中表 达)，以治疗被该转基因抑制或以其他方式引起表达降低的基因与其基因产物表达、活性增加或该基因的不 适当上调相关的疾病。
用于治疗目的的药物组合物通常在制造和储存条件下必须是无菌的和稳定的。所述组合物可以配制为 溶液、微乳液、分散体、脂质体或其他适合高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所 需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分之一或组合一起掺入适当的缓冲液中、然后进行过 滤灭菌来制备。
可以将本文所述的ceDNA载体施用于生物体以在体内转导细胞。
通常，施用是通过正常用于引入分子最终与血细胞或组织细胞接触的任何途径进行的。合适的施用此 类核酸的方法是已有的并且是本领域技术人员公知的，虽然可以使用多于一种途径来施用特定的组合物， 但是特定的途径经常可以提供比其他途径更直接和更有效的反应。本文公开的ceDNA载体的示例性施用 模式包括口服、直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如通过气雾剂)、颊(例如舌下)、阴道、鞘内、眼内、经皮、 内皮内、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如静脉内、皮下、皮内、颅内、肌内[包括施用于骨骼肌、隔膜肌和/ 或心肌]、胸膜内、大脑内和关节内)、局部(例如皮肤和粘膜表面二者，包括气道表面和经皮施用)、淋巴内等，以及直接组织或器官注射(例如，对肝脏、眼睛、骨骼肌、心肌、隔膜肌或脑)。
可以向对象的任何部位施用ceDNA载体，包括但不限于选自由下列所组成的组中的部位：脑，骨骼 肌，平滑肌，心脏，隔膜，气道上皮，肝脏，肾脏，脾脏，胰腺，皮肤，和眼睛。也可以对肿瘤(例如，肿 瘤或淋巴结内或附近)施用ceDNA载体。在任何给定情况下最合适的途径将取决于待治疗、改善和/或预防 的病情的性质和严重程度，以及所使用的特定ceDNA载体的性质。另外，ceDNA允许在单个载体或多个 ceDNA载体(例如ceDNA混合物)中施用多个转基因。
对骨骼肌施用本文公开的ceDNA载体包括但不限于对肢体(例如，上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背 部、颈部、头部(例如舌头)、胸部、腹部、骨盆/会阴和/或手指中的骨骼肌施用。如本文公开的ceDNA载 体可以通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢体灌注(任选地，腿和/或手臂的隔离肢体灌注；参 见，例如Arruda等人.，(2005)Blood 105:3458-3464)、和/或直接肌肉注射而递送给骨骼肌。在特定实施方 式中，本文公开的ceDNA载体通过肢体灌注、任选隔离肢体灌注(例如，静脉内或关节内施用)来施用于对 象(例如患有肌营养不良症例如DMD的对象)的肢体(臂和/或腿)。在实施方案中，本文公开的ceDNA载体 可以在不采用“流体动力”技术下施用。
对心肌施用本文公开的ceDNA载体包括对左心房、右心房、左心室、右心室和/或中隔施用。本文所 述的ceDNA载体可以通过静脉内施用、动脉内施用例如主动脉内施用、直接心脏注射(例如，注入左心房、 右心房、左心室、右心室)和/或冠状动脉灌注而递送到心肌。对隔膜肌的施用可以通过任何合适的方法， 包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。对平滑肌的施用可以通过任何合适的方法，包括静脉内施 用、动脉内施用和/或腹膜内施用。在一个实施方式中，可以对存在于平滑肌之内、附近和/或之上的内皮 细胞施用。
在一些实施方式中，将本发明的ceDNA载体施用于骨骼肌、隔膜肌和/或心肌(例如，以治疗、改善和 /或预防肌营养不良或心脏病(例如，PAD或充血性心力衰竭)。
本发明的ceDNA载体可以施用于CNS(例如，脑或眼睛)。可以将ceDNA载体引入脊髓、脑干(延髓， 脑桥)、中脑(下丘脑，丘脑，上丘脑，垂体腺，黑质，松果腺)、小脑、端脑(纹状体，包括枕骨、颞叶、顶 叶和额叶的大脑，皮质，基底神经节，海马，和背侧杏仁核(portaamygdala))、边缘系统、新皮质、纹状体、 大脑和下丘。ceDNA载体也可以施用于眼睛的不同区域，例如视网膜、角膜和/或视神经。所述ceDNA载 体可以被递送到脑脊髓液中(例如，通过腰椎穿刺)。还可以在血脑屏障已被扰动的情况下(例如，脑肿瘤或 脑梗塞)，将ceDNA载体血管内施用于CNS。
ceDNA载体可以通过本领域已知的任何途径施用于目标CNS区域，所述途径包括但不限于鞘内、眼 内、大脑内、脑室内、静脉内(例如在糖例如甘露糖醇的存在下)、鼻内、耳内、眼内(例如，玻璃体内、视 网膜下、前房)和眼周(例如，Tenon区下)递送，以及肌内递送伴逆行递送至运动神经元。
在一些实施方式中，ceDNA载体以液体制剂通过直接注射(例如立体定向注射)施用到CNS中的目标 区域或区室。在其他实施方式中，可以通过局部施用至目标区域或通过鼻内施用气雾剂来提供ceDNA载 体。可以通过局部施用液滴来对眼睛施用。作为另一种替代方案，可以将ceDNA载体以固体缓释制剂施 用(参见，例如，美国专利No.7,201,898)。在另外的实施方式中，ceDNA载体可用于逆行运输，以治疗、 改善和/或预防涉及运动神经元的疾病和病症(例如，肌萎缩性侧索硬化(ALS)；脊髓性肌萎缩(SMA)等)。例 如，可以将ceDNA载体递送到肌肉组织，它可以由此迁移到神经元中。
离体处理
在一些实施方式中，从对象取出细胞，将ceDNA载体引入其中，然后将细胞替换回对象中。从对象 取出细胞进行离体处理、然后再引回到对象中的方法，是本领域已知的(参见，例如，美国专利No.5,399,346； 其公开内容整体并入本文)。或者，将ceDNA载体引入另一个对象的细胞、引入培养细胞、或引入任何其 他合适来源的细胞，并将细胞施用于有此需要的对象。
用ceDNA载体转导的细胞优选与药物载体组合以“治疗有效量”施用于对象。本领域技术人员将理解， 治疗效果不必是完全的或治愈的，只要给对象提供了一些益处即可。
在一些实施方式中，ceDNA载体可以编码转基因(有时称为异源核苷酸序列)，其是希望体外、离体或 体内在细胞中产生的任何多肽。例如，与在治疗方法中使用ceDNA载体相反，在一些实施方式中，可以 将ceDNA载体引入培养细胞中并从中分离表达的基因产物，例如用于生产抗原或疫苗。
兽医和医学应用中均可使用ceDNA载体。如上所述的离体基因递送方法的合对象包括禽类(例如鸡、 鸭、鹅、鹌鹑、火鸡和野鸡)和哺乳动物(例如人、牛、绵羊、山羊、马、猫、犬和兔))，以哺乳动物为优 选。人类对象是最优选的。人类对象包括新生儿、婴儿、少年和成人。
在一些实施方式中，存在于本文所述的表达盒、表达构建体或ceDNA载体中的转基因可以针对宿主 细胞进行密码子优化。如本文中所用，术语“密码子优化的”或“密码子优化”是指在感兴趣的脊椎动物、例 如小鼠或人的细胞(例如人源化细胞)中，通过以在该脊椎动物基因中更频率或最频繁使用的密码子替换天 然序列(例如原核序列)中的至少一个、多于一个或为数可观的密码子来修饰核酸序列以增强表达的方法。 各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白质的氨 基酸序列。优化的密码子可以使用例如Aptagen的
密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen， Inc.)或其他公共可用的数据库来确定。
在一些实施方式中，ceDNA载体在对象宿主细胞中表达转基因。在一些实施方式中，对象宿主细胞是 人类宿主细胞，包括例如血细胞、干细胞、造血细胞、CD34+细胞、肝细胞、癌细胞、血管细胞、肌细胞、 胰腺细胞、神经细胞、眼或视网膜细胞、上皮或内皮细胞、树突状细胞、成纤维细胞，或任何其他哺乳动 物来源的细胞，包括但不限于肝(即肝脏)细胞、肺细胞、心脏细胞、胰腺细胞、肠细胞、隔膜细胞、肾(即 肾脏)细胞、神经细胞、血细胞、骨髓细胞，或考虑进行基因疗法的对象的任何一种或多种选定的组织。在 一个方面，对象宿主细胞是人类宿主细胞。
本文描述的技术的一个方面涉及一种将转基因递送至细胞的方法。通常，对于体外方法，可以使用如 本文公开的方法以及本领域已知的其他方法将ceDNA载体引入细胞。本文公开的ceDNA载体优选以生物 有效量施用于细胞。如果将ceDNA载体体内施用于细胞(例如，对象)，则ceDNA载体的生物有效量是足 以导致转基因在靶细胞中转导和表达的量。
剂量范围
可以任选采用体内和/或体外测定来帮助鉴定使用的最佳剂量范围。制剂中准备采用的精确剂量也将取 决于施用途径、病情严重度，并应根据本领域普通技术人员的判断和每个对象的情况来决定。有效剂量可 从体外或动物模型试验系统获得的剂量-反应曲线推断。
足量施用ceDNA载体以转染目标组织的细胞，并在没有过度不良效应下提供足够水平的基因转移和 表达。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于上文在“施用”部分中所述的那些，例如直接递送至选 定的器官(例如，门静脉内递送至肝脏)、口服、吸入(包括鼻内和气管内递送)、眼内、静脉内、肌内、皮下、 皮内、肿瘤内、和其他胃肠外施用途径。如果需要，可以组合施用途径。
实现特定“治疗效果”所需的ceDNA载体量的剂量将基于若干因素而变化，这些因素包括但不限于： 核酸施用途径，实现治疗效果所需的基因或RNA表达水平，所治疗的具体疾病或病症，以及基因、RNA 产物或最终表达的蛋白质的稳定性。本领域技术人员可以基于前述的因素以及本领域公知的其他因素来容 易确定治疗患有特定疾病或病症的对象的ceDNA载体剂量范围。
剂量方案可以调整，以提供最佳的治疗反应。例如，可以重复施用寡核苷酸，例如，可以每天施用若 干剂，或者可以根据治疗情况的紧急程度的指示，按比例减少剂量。本领域普通技术人员将能够容易地确 定主题寡核苷酸的适当剂量和施用计划，无论该寡核苷酸是要施用于细胞还是对象。
“治疗有效剂量”将落在相对较宽的范围内，该范围可以通过临床试验确定并将取决于特定应用(神经细 胞将需要很少的量，而全身性注射将需要大量)。例如，对于体内直接注射到人类对象的骨骼肌或心肌中， 治疗有效剂量将为约1μg至100g左右的ceDNA载体。如果使用外泌体或微粒来递送ceDNA载体，则可 以通过实验确定治疗有效剂量，但预计递送1μg至约100g的载体。
药学上可接受的赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员公知的，为了在各种治疗方案中使用本文 所述的特定组合物而制定合适的给药和治疗方案也是公知的。
对于体外转染，要递送至细胞(lx106细胞)的有效量的ceDNA载体将为约0.1至100μg ceDNA载体， 优选1至20μg，更优选1至15μg或8至10μg。ceDNA载体越大需要的剂量越高。如果使用外泌体或 微粒，则可以通过实验确定有效的体外剂量，但将意欲递送相同量的ceDNA载体。
治疗可以涉及施用单剂量或多剂量。在特定的实施方式中，可以采用多于一次施用(例如两次、三次、 四次或更多次施用)以在各种间隔的时间段例如每天、每周、每月、每年等内达到期望的基因表达水平。在 一些实施方式中，可以向对象施用多于一剂；实际上，可以根据需要施用多剂，因为ceDNA载体由于没 有病毒衣壳而不会引起抗衣壳的宿主免疫应答。因此，本领域技术人员可以容易地确定适当剂数。施用的 剂数可以，例如，约1-100剂，优选2-20剂。
不希望受任何特定理论的束缚，通过施用如本公开内容所述的ceDNA载体(即，没有衣壳组分)引起的 缺乏典型抗病毒免疫应答，允许该ceDNA载体多次施用于宿主。在一些实施方式中，将异源核酸递送给 对象的次数在2至10次的范围内(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10次)。在一些实施方式中，向对象递 送ceDNA载体超过10次。
在一些实施方式中，每日历日(例如24小时期间)不超过一次向对象施用一剂ceDNA载体。在一些实 施方式中，每2、3、4、5、6或7个日历日不超过一次向对象施用一剂ceDNA载体。在一些实施方式中， 每日历周(例如7个日历日)不超过一次向对象施用一剂ceDNA载体。在一些实施方式中，不超过两周一次 (例如，在两个日历周期间一次)向对象施用一剂ceDNA载体。在一些实施方式中，每日历月不超过一次(例 如30个日历日一次)向对象施用一剂ceDNA载体。在一些实施方式中，每六个日历月不超过一次向对象施 用一剂ceDNA载体。在一些实施方式中，每日历年不超过一次(例如365天或闰年366天)向对象施用一剂 ceDNA载体。
单位剂型
在一些实施方式中，所述药物组合物可以方便地以单位剂型存在。单位剂型通常将适于药物组合物的 一种或多种具体的施用途径。在一些实施方式中，单位剂型适于通过吸入施用。在一些实施方式中，单位 剂型适于通过汽化器施用。在一些实施方式中，单位剂型适于通过喷雾器施用。在一些实施方式中，单位 剂型适于通过气雾器施用。在一些实施方式中，单位剂型适于口服施用、经颊施用或舌下施用。在一些实 施方式中，单位剂型适于静脉内、肌内或皮下施用。在一些实施方式中，单位剂型适合鞘内或脑室内施用。 在一些实施方式中，配制药物组合物以供局部施用。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量 将通常是该化合物产生治疗效果的量。
脂质纳米粒子的制备
ceDNA和脂质混合后，可以自发形成脂质纳米粒子。取决于期望的粒度分布，可以使用例如热桶挤出 机，例如Lipex挤出机(Northern Lipids，Inc)，将所得纳米粒子混合物挤过膜(例如，截止值为100nm)。在 某些情况下，可以省略挤出步骤。去除乙醇和同时交换缓冲液可以通过例如透析或切向流过滤来完成。
通常，脂质纳米粒子可以通过本领域已知的任何方法形成。例如，脂质纳米粒子可以通过例如 US2013/0037977、US2010/0015218、US2013/0156845、US2013/0164400、US2012/0225129、和 US2010/0130588中描述的方法来制备，这些文献各自的内容通过引用整体并入本文。在一些实施方式中， 脂质纳米粒子可以使用连续混合法、直接稀释法或在线稀释法制备。使用直接稀释和在线稀释法制备脂质 纳米粒子的方法和设备在US2007/0042031中描述，US2007/0042031的内容通过引用整体并入本文。使 用逐步稀释和法制备脂质纳米粒子的方法和设备在US2004/0142025中描述，US2004/0142025的内容通过 引用整体并入本文。
在一个非限制性示例中，脂质纳米粒子可以通过冲击射流法制备。通常，粒子是通过将溶解在醇(例如 乙醇)中的脂质与溶解在缓冲液例如柠檬酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液、乙酸钠和氯化镁缓冲液、苹果酸缓冲 液、苹果酸和氯化钠缓冲液，或柠檬酸钠和氯化钠缓冲液中的ceDNA混合而形成的。脂质与ceDNA的混 合比可以是约45-55％的脂质和约65-45％的ceDNA。
脂质溶液可以在醇、例如乙醇中含有可电离脂质、非阳离子脂质(例如磷脂，例如DPSC)、PEG或PEG 缀合的分子(例如PEG-脂质)和固醇(例如胆固醇)，总脂质浓度为5-30mg/mL、更可能5-15mg/mL、最可能 9-12mg/mL。
在脂质溶液中，脂质的摩尔比对于阳离子脂质可以范围从约25-98％，优选在约35-65％；对于非离子 脂质为约0-15％，优选约0-12％；对于PEG或PEG缀合的分子为约0-15％，优选约1-6％；以及对于固醇 为约0-75％，优选约30-50％。
所述ceDNA溶液可以包含在缓冲溶液中浓度范围从0.3至1.0mg/mL、优选为0.3-0.9mg/mL的ceDNA， pH范围为3.5-5。
为了形成LNP，在一个示例性但非限制性的实施方式中，将所述两种液体加热至温度在约15-40℃、 优选约30-40℃范围内，然后例如在冲击射流混合器中混合，立即形成LNP。混合流量的范围可以为10-600 ml/分钟。管ID的范围可以从0.25至1.0mm，总流量为10-600mL/分钟。流量和管路ID的组合可以具有 将LNP的粒度控制在30至200nm之间的效果。然后可以将溶液与pH较高的缓冲溶液混合，混合比在1:1 至1:3体积:体积的范围内，优选约1:2体积:体积。如果需要，该缓冲溶液的温度可以在15-40℃或30-40℃ 范围内。然后可以对混合的LNP进行阴离子交换过滤步骤。在阴离子交换之前，可以将混合的LNP温育 一段时间，例如30分钟至2小时。温育期间的温度可以在15-40℃或30-40℃范围内。温育后，将溶液通 过含有阴离子交换分离步骤的过滤器、例如0.8μm过滤器进行过滤。该过程可以使用从1mm ID到5mm ID 范围的管路ID以及从10至2000mL/分钟的流量。
形成之后，可以将LNP通过超滤过程浓缩和渗滤，在超滤中除去醇并将缓冲液交换为最终缓冲溶液， 例如，约pH 7、例如约pH 6.9、约pH 7.0、约pH 7.1、约pH 7.2、约pH 7.3、或约pH 7.4的磷酸盐缓冲盐 水(PBS)。
超滤过程可以使用切向流过滤样式(TFF)，使用额定分子量截留范围为30-500KD的膜。膜的样式为 中空纤维或平片盒。截留分子量适当的TFF过程可以将LNP保留在截留物中，而滤液或渗透液含有醇、 柠檬酸盐缓冲液和最终的废缓冲液。TFF过程是多步骤过程，初始浓度为ceDNA浓度1-3mg/mL。浓缩后， 将LNP溶液靠最终缓冲液进行10-20体积的渗滤，以除去醇并交换缓冲液。然后可以将所述材料再浓缩 1-3倍。浓缩的LNP溶液可以进行无菌过滤。
ceDNA
在各种实施方式中，ceDNA载体是无衣壳的线性双链体DNA分子，由具有共价封闭端的互补DNA 的连续链形成(线性、连续和非衣壳化结构)，其包含彼此不同或不对称的5’反向末端重复(ITR)和3’ITR序 列。ITR中的至少一个包含功能性末端解离位点和复制蛋白结合位点(RPS)(有时称为复制性蛋白结合位点)， 例如Rep结合位点。通常，ceDNA载体含有至少一个修饰的AAV反向末端重复序列(ITR)，即相对于另一 个ITR有缺失、插入和/或取代，以及可表达的转基因。
在一个实施方式中，ITR中的至少一个是AAV ITR，例如野生型AAV ITR。在一个实施方式中，ITR 中的至少一个是相对于另一个ITR的修饰ITR–即，所述ceDNA包含彼此不对称的ITR。在一个实施方 式中，ITR中的至少一个是非功能性ITR。
在一些实施方式中，ceDNA载体包含：(1)包含顺式调节元件、启动子和至少一个转基因的表达盒； 或(2)与至少一个转基因可操作连接的启动子，和(3)两个自互补序列，例如，所述表达盒侧翼的ITR，其 中ceDNA载体不与衣壳蛋白结合。在一些实施方式中，ceDNA载体包含在AAV基因组中发现的两个自 互补序列，其中至少一个包含AAV的操作性Rep结合元件(RBE)和末端解离位点(trs)或RBE的功能变体、 以及与转基因操作性连接的一个或多个顺式调节元件。在一些实施方式中，所述ceDNA载体包含调节转 基因表达的其他组分，例如用于控制和调节转基因的表达的调节开关，并且可以包括作为杀伤开关以使包 含ceDNA载体的细胞能够受控细胞死亡的调节开关。
在一些实施方式中，两个自互补序列可以是来自任何已知的细小病毒、例如依赖病毒如AAV(例如， AAV1-AAV12)的ITR序列。可以使用任何AAV血清型，包括但不限于修饰的AAV2 ITR序列，其除了允 许发夹二级结构形成的可变回文序列外，还保留了Rep结合位点(RBS)例如5′-GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO：531)和末端解离位点(trs)。在一些实施方式中，ITR可以是合成的。在一个实施方式中，合 成的ITR基于来自多于一种AAV血清型的ITR序列。在另一个实施方式中，合成的ITR不包括基于AAV 的序列。在又一个实施方式中，合成的ITR虽然只有一些或没有AAV来源的序列，但保留了上述的ITR 结构。在一些方面，合成的ITR可以优先与野生型Rep或特定血清型的Rep相互作用，或者在一些情况下， 不会被野生型Rep识别而仅被突变的Rep识别。在一些实施方式中，ITR是合成的ITR序列，其除了允许 发夹二级结构形成的可变回文序列外，还保留了功能性Rep结合位点(RBS)例如 5′-GCGCGCTCGCTCGCTC-3′(SEQ ID NO：531)和末端解离位点(TRS)。在一些例子中，修饰的ITR序 列从野生型AAV2 ITR的相应序列中保留了RBS、trs的序列以及Rep结合元件的结构和位置，形成ITR 发夹二级结构之一的末端环部分。在表2-9、10A和10B、SEQ ID NO：2、52、101-449和545-547、以及 2018年9月7日提交的PCT申请No.PCT/US18/49996的图26A-26B中显示的ITR部分序列中公开了用于 ceDNA载体的示例性ITR序列。在一些实施方式中，ceDNA载体包含的ITR在该ITR中的修饰可以对应 于2018年9月7日提交的PCT申请No.PCT/US18/49996中表2、3、4、5、6、7、8、9、10A和10B的 任何一个或多个所示的ITR序列或ITR部分序列中的任何修饰。
在一些实施方式中，封闭端DNA载体包含与转基因可操作连接的启动子，其中ceDNA缺乏衣壳蛋并 且：(a)由ceDNA-质粒产生，所述ceDNA-质粒编码其发夹二级构造中具有与SEQ ID NO：2相同数量的 分子内双链体碱基对的突变右侧AAV2 ITR或具有与SEQ IDNO：51相同数量的分子内双链体碱基对的突 变左侧AAV2 ITR产生(与这些参比序列相比，优选在该构造中不包括任何AAA或TTT末端环的缺失)， 以及(b)使用实施例1中在天然凝胶和变性条件下通过琼脂糖凝胶电泳鉴定ceDNA的测定，被鉴定为 ceDNA。
所述ceDNA载体可通过普通技术人员在阅读本公开后将会知道的许多手段来获得。例如，无衣壳的 非病毒DNA载体可以从质粒(本文中称为“ceDNA质粒”)获得，所述质粒包含多核苷酸表达构建体模板， 该模板依次包含：第一5’反向末端重复(例如AAV ITR)；表达盒；和3’ITR(例如AAV ITR)，其中5’和3’ITR 中的至少一个是修饰的ITR，或者其中当5’和3’ITR均被修饰时，它们彼此具有不同的修饰并且不是相同 的序列。不受限制地，用于生成ceDNA载体的多核苷酸表达构建体模板可以是ceDNA-质粒、ceDNA-杆 粒和/或ceDNA-杆状病毒。在一些实施方式中，cDNA-质粒包含可操作地定位在ITR之间的限制性克隆位 点(例如SEQ ID NO：7)，其中可以插入包含例如与转基因例如报告基因和/或治疗基因操作性连接的启动 子的表达盒。
例如，非病毒无衣壳的DNA载体可以在许可宿主细胞中由表达构建体(例如质粒、杆粒、杆状病毒或 整合的细胞系)产生，所述表达构建体含有定位在两个不同反向末端重复(ITR)之间的异源基因。与野生型 ITR序列(例如，AAV ITR)相比，ITR中的至少一个通过缺失、插入和/或取代而被修饰；并且ITR中的至 少一个包含功能性末端解离位点(trs)和Rep结合位点。ceDNA载体优选在分子的至少一部分例如表达盒上 是双链体，例如自互补的。例如ceDNA不是双链环状分子。在一些实施方式中，ceDNA载体具有共价封 闭端，因此抵抗核酸外切酶(例如核酸外切酶I或核酸外切酶III)消化，例如在37℃下超过一个小时。
在一些实施方式中，ceDNA载体以5’到3’方向包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)，目 的核苷酸序列(例如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR和第二ITR相对于彼此不对称–也 就是说，它们彼此不同。作为示例性实施方式，第一ITR可以是野生型ITR，第二ITR可以是突变或修饰 的ITR。在一些实施方式中，第一ITR可以是突变或修饰的ITR，第二ITR可以是野生型ITR。在另一个 实施方式中，第一ITR和第二ITR都被修饰，但是序列不同，或者具有不同的修饰，或者不是相同的修饰 ITR。换言之，ITR是不对称的，因为一个ITR中的任何变化不会反映在另一个ITR中；或者，其中ITR 相对于彼此是不同的。
在一些实施方式中，表达盒位于两个ITR之间，按以下顺序包含下列中的一种或多种：与转基因可操 作连接的启动子，转录后调节元件，以及聚腺苷酸化和终止信号。在一个实施方式中，启动子是可调节- 可诱导的或可抑制的。启动子可以是促进转基因转录的任何序列。在一个实施方式中，启动子是CAG启 动子(例如SEQ ID NO：03)或其变体。转录后调节元件是调制转基因表达的序列，作为非限制性例子，是 缔造增强转基因表达的三级结构的任何序列。
通常，ceDNA载体没有受到病毒衣壳内有限空间所施加的包装约束。与包封的AAV基因组相反， ceDNA载体相对于包封的AAV基因组代表了对原核生物产生的质粒DNA载体的切实可行的真核生物产 生的替代品。(原文似乎有问题)这允许插入控制元件，例如如本文公开的调节开关、大的转基因、多个转 基因等。
在一些实施方式中，第一ITR可以是突变或修饰的ITR，并且第二ITR是野生型ITR。在另一个实施 方式中，第一ITR和第二ITR都被修饰，但是序列不同，或者具有不同的修饰，或者不是相同的修饰ITR。 换言之，ITR是不对称的，因为一个ITR中的任何变化不会反映在另一个ITR中；或者，其中ITR相对于 彼此是不同的。在ceDNA载体中并用于生成ceDNA-质粒的的示例性ITR公开在2018年9月7日提交的 PCT申请No.PCT/US18/49996中。
虽然在本文的说明书和实施例中举例说明的ITR是AAV2 ITR，但是本领域普通技术人员知道，可以 如上所述使用来自任何已知细小病毒例如AAV(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、 AAV8、AAV9、AAV10、AAV 11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAV-DJ、和AAV-DJ8基因组。例如， NCBI:NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC006260；NC 006261)的ITR、嵌 合ITR、或来自任何合成AAV的ITR。在一些实施方式中，AAV可以感染温血动物，例如禽类(AAAV)、 牛(BAAV)、犬、马和羊腺相关病毒。在一些实施方式中，ITR来自B19细小病毒(GenBank登录号：NC 000883)，小鼠微小病毒(MVM)(GenBank登录号：NC 001510)；鹅细小病毒(GenBank登录号：NC 001701)； 蛇细小病毒1(GenBank登录号：NC006148)。
细小病毒和细小病毒科的其他成员在《病毒学领域》(FIELDS VIROLOGY)(第3版，1996年)中第 69章，Kenneth I.Berns，“细小病毒科：病毒及其复制(Parvoviridae:TheViruses and Their Replication)” 中有一般性描述。
普通技术人员知道，ITR序列具有双链霍利迪连结体(Holliday junction)的共同结构，该结构典型是T 形或Y形发夹结构(参见例如图2A和3A)，其中每个ITR由两个回文臂或环(B-B’和C-C’)嵌入较大回文臂 (A-A’)中与单链D序列形成(其中这些回文序列的顺序限定了ITR的翻转或翻动取向)，基于本文提供的示 例性AAV2 ITR序列，可以从用于ceDNA载体或ceDNA质粒的任何AAV血清型容易地确定相应修饰的ITR序列。参见，例如，来自不同AAV血清型(AAV1-AAV6)的ITR的结构分析和序列比较，并在下列文 献中描述：Grimm等人.，J.Virology，2006；80(1)；426-439；Yan等人.，J.Virology，2005；364-379；Duan 等人.，Virology 1999；261；8-14。ITR中的示例性具体改变和突变在2018年9月7日提交的PCT申请No.PCT/US18/49996中进行了详细描述。为清楚起见，在ITR的背景下，“改变”或“突变”表明相对于野生 型、参比、或原始ITR序列已有核苷酸的插入、缺失和/或取代，并且在具有两个侧翼ITR的ceDNA载体 中可以相对于另一个侧翼ITR进行改变。改变或突变的ITR可以是工程化的ITR。如本文中所用，“工程 化的”是指已被人手工操纵的方面。例如，当多肽的至少一个方面，例如其序列，已被人手工操纵以不同 于它天然存在的该方面时，则认为该多肽是“工程化的”。
任何细小病毒ITR都可以用作ITR或进行修饰的基础ITR。优选地，细小病毒是依赖病毒。更优选是 AAV。选择的血清型可以是基于血清型的组织嗜性。AAV2具有广泛的组织嗜性，AAV1优先靶向神经元 和骨骼肌，而AAV5优先靶向神经元、视网膜色素上皮和光感受器。AAV6优先靶向骨骼肌和肺。AAV8 优先靶向肝脏、骨骼肌、心脏和胰腺组织。AAV9优先靶向肝脏、骨骼和肺组织。在一个实施方式中，修 饰的ITR是基于AAV2 ITR。例如，它选自由SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：52组成的组。在这些方面每 一个的一个实施方式中，载体多核苷酸包含一对ITR，其选自由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：52；以及 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：51组成的组。在这些方面每一个的一个实施方式中，载体多核苷酸或具有 共价封闭端的非病毒无衣壳DNA载体包含一对不同的ITR，所述ITR选自由下列所组成的组：SEQ ID NO： 101与SEQID NO：102；SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：105和SEQ ID NO：106； SEQ IDNO：107和SEQ ID NO：108；SEQ ID NO：109和SEQ ID NO：110；SEQ ID NO：111和SEQ ID NO：112；SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：114；以及SEQ ID NO：115和SEQ ID NO：116。在一些实 施方式中，修饰的ITR选自SEQ ID NO：2、52、63、64、101-499中的任何一个，并在2018年9月7日提交的PCT申请PCT/US18/49996中公开。在一些实施方式中，ceDNA载体不具有选自由如本文所提供的 SEQ ID NO：500-529组成或基本由其组成的任何序列的修饰ITR。在一些实施方式中，ceDNA载体不具 有选自SEQ ID NO：500-529的任何序列中的ITR。
在一些实施方式中，ceDNA可以形成分子内双链体二级结构。第一ITR和不对称的第二ITR的二级 结构在野生型ITR(参见，例如，图2A、3A和3C)和修饰的ITR结构(参见，例如，图2B、3B和3D)的背 景下举例说明。二级结构是基于用于产生ceDNA载体的质粒的ITR序列来推断或预测的。
在一些实施方式中，ceDNA载体的左ITR相对于野生型(wt)AAV ITR结构是修饰或突变的，而右ITR 是野生型ITR。在一个实施方式中，ceDNA载体的右ITR相对于野生型AAVITR结构是修饰的，而左ITR 是野生型AAV ITR。在这样的实施方式中，可以通过从源自于AAV基因组的野生型ITR中缺失、插入或 取代一个或多个核苷酸来生成ITR(例如，左或右ITR)的修饰。
本文所用的ITR可以是可解离的和不可解离的，并且选择用于ceDNA载体的优选是AAV序列，以血 清型1、2、3、4、5、6、7、8和9为优选。可解离的AAV ITR不要求野生型ITR序列(例如，内源性或野 生型AAV ITR序列可通过插入、缺失、截短和/或错义突变来改变)，只要末端重复介导期望的功能例如复 制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等即可。通常，但不一定，ITR来自相同的AAV血清型，例如ceDNA 载体的两个ITR序列均来自AAV2。ITR可以是起到AAV反向末端重复的功能的合成序列。虽然不是必要 的，但ITR可以来自相同的细小病毒，例如，两个ITR序列均来自AAV2。
在一些实施方式中，ITR中的至少一个是相对于Rep结合和/或Rep切刻有缺陷的ITR。在一个实施方 式中，该缺陷相对于野生型还原ITR为至少30％，在其他实施方式中，其至少35％...、50％...、65％...、75％...、 85％...、90％...、95％...、98％...、或完全缺乏功能或介于之间的任何点。宿主细胞不表达病毒衣壳蛋白，并 且多核苷酸载体模板缺乏任何病毒衣壳编码序列。在一个实施方式中，缺乏AAV衣壳基因的多核苷酸载 体模板和宿主细胞以及所生成的蛋白质也不编码或表达其他病毒的衣壳基因。另外，在一个特定实施方式 中，核酸分子也缺乏AAV Rep蛋白编码序列。
在一些实施方式中，ITR的结构元件可以是参与ITR与大的Rep蛋白(例如，Rep 78或Rep 68)的功能 性相互作用的任何结构元件。在某些实施方式中，结构元件为ITR与大的Rep蛋白的相互作用提供选择性， 即，至少部分确定哪种Rep蛋白与ITR功能性相互作用。在其他实施方式中，当Rep蛋白与ITR结合时， 结构元件与大的Rep蛋白物理性相互作用。每个结构元件可以是，例如，ITR的二级结构、ITR的核苷酸 序列、两个或更多个元件之间的间隔、或上述任何的组合。在一个实施方式中，结构元件选自由A和A’ 臂、B和B’臂、C和C’臂、D臂、Rep结合位点(RBE)和RBE’、以及末端解离位点(trs)组成的组。
更具体地，可以通过修饰结构元件来改变结构元件与特定的大Rep蛋白功能性相互作用的能力。例如， 可以与ITR的野生型序列相比较来修饰结构元件的核苷酸序列。在一个实施方式中，可以除去ITR的结构 元件(例如A臂、A’臂、B臂、B’臂、C臂、C’臂、D臂、RBE、RBE’和trs)并用来自不同细小病毒的野 生型结构元件替代。例如，替代结构可以来自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、蛇细小病毒(例如、皇蟒细小病毒)、牛细小病毒、山 羊细小病毒、禽细小病毒、犬细小病毒、马细小病毒、虾细小病毒、猪细小病毒、或昆虫AAV。例如，ITR 可以是AAV2 ITR，并且A或A’臂或RBE可以用来自AAV5的结构元件替代。在另一个示例中，ITR可 以是AAV5 ITR，并且C或C臂、RBE、和trs可以用来自AAV2的结构元件替代。在另一个示例中，AAV ITR可以是B和B’臂被AAV2 ITR B和B’臂替代的AAV5 ITR。
在一些实施方式中，可以对结构元件的核苷酸序列进行修饰(例如，通过修饰1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个核苷酸或其中的任何范围)以产生修饰 的结构元件。
在一些实施方式中，结构元件的结构可以被修饰。例如，结构元件改变了茎高和/或环中核苷酸的数量。 例如，茎高可以是约2、3、4、5、6、7、8或9个核苷酸或更多个，或其中的任何范围。在一些实施方式 中，茎高可以是约5个核苷酸至约9个核苷酸并与Rep功能性相互作用。在另一个实施方式中，茎高可以 是约7个核苷酸并与Rep功能性相互作用。在另一个示例中，环可以具有3、4、5、6、7、8、9或10个 核苷酸或更多个或其中的任何范围。
在一些实施方式中，RBE或扩展RBE中GAGY结合位点或GAGY相关结合位点的数量可以增加或 减少。在一个示例中，RBE或扩展RBE可包含1、2、3、4、5或6个或更多个GAGY结合位点或其中的 任何范围。每个GAGY结合位点可以独立地是精确的GAGY序列或类似于GAGY的序列，只要该序列足 以结合Rep蛋白即可。
在一些实施方式中，两个元件(例如但不限于RBE和发夹)之间的间隔可以改变(例如，增加或减少)， 以改变与大Rep蛋白的功能性相互作用。例如，间隔可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20或21个核苷酸或更多个或其中的任何范围。
图2A和2B显示了在ceDNA载体的野生型ITR结构部分内操作trs位点的一种可能的机制。在一些 实施方式中，ceDNA载体含有一个或多个包含Rep结合位点(RBS；关于AAV2的是 5′-GCGCGCTCGCTCGCTC-3′，SEQ ID NO：531)和末端解离位点(TRS；5′-AGTT，SEQ ID NO：46)的 功能性ITR多核苷酸序列。在一些实施方式中，至少一个ITR(wt或修饰的ITR)是功能性的。在替代实施 方式中，其中ceDNA载体包含彼此不同或不对称的两个修饰ITR，至少一个修饰ITR是功能性的，而至 少一个修饰ITR是无功能的。
在一些实施方式中，本文所述的ceDNA载体的修饰ITR(例如，左ITR或右ITR)在环臂、截短臂或间 隔区内具有修饰。在环臂、截短臂或间隔区内具有修饰的ITR的示例性序列在2018年9月7日提交的PCT 申请No.PCT/US18/49996的表2-9、10A和10B中列出。
ceDNA载体可以由还包含顺式调节元件的特定组合的表达构建体产生。顺式调节元件包括但不限于启 动子、核糖开关、绝缘子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞型特异性启动子、以及增强子。 在一些实施方式中，ITR可以充当转基因的启动子。在一些实施方式中，ceDNA载体包含调节转基因表达 的其他组分，例如如2018年9月7日提交的PCT申请No.PCT/US18/49996中所述的调节转基因表达的调 节开关，或可以杀伤包含ceDNA载体的细胞的杀伤开关。
表达盒也可以包括转录后元件以增加转基因的表达。在一些实施方式中，使用土拨鼠肝炎病毒(WHP) 转录后调节元件(WPRE)(例如，SEQ ID NO：8)来增加转基因的表达。可以使用其他转录后加工元件，例 如来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因或乙型肝炎病毒(HBV)的转录后元件。分泌序列可以与转基因例如 VH-02和VK-A26序列、例如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26相连。表达盒可以包括本领域已知的聚 腺苷酸化序列或其变体，例如从牛BGHpA(例如，SEQ ID NO：74)或病毒SV40pA(例如，SEQ ID NO：10) 分离的天然存在的序列，或合成序列(例如，SEQ ID NO：27)。一些表达盒也可以包括SV40晚期polyA信 号上游增强子(USE)序列。USE可以与SV40pA或异源poly-A信号组合使用。
表达盒可包含多于4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸、或30,000个 核苷酸、或40,000个核苷酸、或50,000个核苷酸，或在约4000-10,000个核苷酸或10,000-50,000个核苷 酸之间的任何范围，或多于50,000个核苷酸。在一些实施方式中，表达盒可包含长度在500至50,000个 核苷酸范围内的转基因或核酸。在一些实施方式中，表达盒可包含长度在500至75,000个核苷酸范围内的 转基因或核酸。在一些实施方式中，表达盒可包含长度在500至10,000个核苷酸范围内的转基因或核酸。 在一些实施方式中，表达盒可包含长度在1000至10,000个核苷酸范围内的转基因或核酸。在一些实施方 式中，表达盒可包含长度在500至5,000个核苷酸范围内的转基因或核酸。ceDNA载体没有衣壳化的AAV 载体的大小限制，因此能够递送大尺寸的表达盒来提供有效的转基因表达。在一些实施方式中，ceDNA载 体缺乏原核生物特异性甲基化。在一些实施方式中，表达盒在5’至3’方向上的长度大于在AAV病毒体中 被衣壳化已知的最大长度。在一些实施方式中，长度大于4.6kb，或大于5kb，或大于6kb，或大于7kb。
图1A-1C显示了非限制性的示例性ceDNA载体、或ceDNA质粒的相应序列的示意图。ceDNA载体 无衣壳，并可由依次编码第一ITR、可表达的转基因盒和第二ITR的质粒获得，其中第一和/或第二ITR 序列中的至少一个相对于相应的野生型AAV2 ITR序列是突变的。可表达的转基因盒优选依次包括下列中 的一个或多个：增强子/启动子，ORF报告基因(转基因)，转录后调节元件(例如WPRE)，以及聚腺苷酸化 和终止信号(例如BGH polyA)。
表达盒可包含任何目的转基因。目的转基因包括但不限于编码多肽的核酸、或非编码核酸(例如RNAi、 miR等)，优选治疗性(例如，用于医疗、诊断或兽医用途)或免疫原性(例如，用于疫苗)的多肽。在某些实 施方式中，表达盒中的转基因编码一种或多种多肽、肽、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、 反义多核苷酸、抗体、抗原结合片段、或其任何组合。在一些实施方式中，转基因是治疗性基因、或标志 蛋白。在一些实施方式中，转基因是激动剂或拮抗剂。在一些实施方式中，拮抗剂是模拟物或抗体、或抗 体片段、或其抗原结合片段，例如中和抗体或抗体片段等。在一些实施方式中，转基因编码如本文定义的 抗体，包括全长抗体或抗体片段。在一些实施方式中，抗体是如本文所定义的抗原结合域或免疫球蛋白可 变域序列。
特别地，转基因可以编码一种或多种治疗剂，包括但不限于，例如，蛋白质、多肽、肽、酶、抗体、 抗原结合片段、及其变体和/或活性片段，用于治疗、预防和/或改善疾病、功能障碍、损伤和/或病症的一 种或多种症状。
ceDNA载体有许多结构特征与基于质粒的表达载体不同。ceDNA载体可具有以下特征中的一个或多 个：缺乏原始(即没有插入)的细菌DNA，缺乏原核复制起点，是自给的、即它们不需要这两个ITR以外的 任何序列，包括Rep结合位点和末端解离位点(RBS和TRS)、以及ITR之间的外源性序列，存在形成发夹 的ITR序列，具有真核来源(即它们在真核细胞中产生)，以及不存在细菌型DNA甲基化或甚至被哺乳动 物宿主认为异常的任何其他甲基化。一般而言，优选本载体不含任何原核DNA，但是预期一些原核DNA 可以作为外源性序列插入，作为非限制性例子，在启动子或增强子区域中插入。区别ceDNA载体与质粒 表达载体的另一个重要特征是ceDNA载体是具有封闭端的单链线性DNA，而质粒始终是双链DNA。
如通过限制酶消化测定所确定的，ceDNA载体优选具有线性和连续的结构而不是非连续的结构(图 4D)。线性和连续的结构被认为在受到细胞内切核酸酶攻击时更稳定，并且不太可能重组并引起诱变。因 此，线性和连续结构的ceDNA载体是优选的实施方式。连续、线性、单链的分子内双链体ceDNA载体可 以具有共价结合的末端，而没有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上有别于质粒(包括 本文所述的ceDNA质粒)，后者是细菌来源的环状双链体核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离而产 生两个核酸分子，而与此相反，ceDNA载体，虽然有互补链，却是单个DNA分子，因此即使变性，也仍 然是单个分子。在一些实施方式中，与质粒不同，产生ceDNA载体无需原核类型的DNA碱基甲基化。因此，在结构(特别是，线性对环形)以及还根据用于生产和纯化这些不同物体的方法这两方面，以及还根据 它们的DNA甲基化方面：ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型，ceDNA载体和ceDNA 质粒是不同的。
对于从细胞收获和收集本文所述的DNA载体的时间可以进行选择和优化，以实现DNA载体的高产量 生产。例如，收获时间可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择。通常，可以在杆状病毒感染后足 够的时间以产生DNA载体之后、但在大部分细胞因为病毒毒性开始死亡之前收获细胞。可以分离DNA载 体，例如，使用质粒纯化试剂盒，例如QiagenEndo-FreeTMPlasmid试剂盒。为分离质粒而开发的其他方法 也可以适用于DNA载体。通常，可以采用本领域已知的任何核酸纯化方法。
启动子：合适的启动子，包括上述启动子，可以源自于病毒并因此可以称为病毒启动子，或者它们可 以源自于任何生物，包括原核或真核生物。合适的启动子可用于通过任何RNA聚合酶(例如，pol I、pol II、 pol III)来驱动表达。示例性启动子包括但不限于：SV40早期启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复(LTR) 启动子；腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子例如CMV 立即早期启动子区域(CMVIE)，劳氏(rous)肉瘤病毒(RSV)启动子，人U6小核启动子(U6，例如SEQ ID NO： 18(Miyagishi等人.，Nature Biotechnology 20，497-500(2002))，增强的U6启动子(例如，Xia等人.，Nucleic Acids Res.2003年9月1日；31(17))，人H1启动子(H1)(例如，SEQ IDNO：19)，CAG启动子，人α1-抗 胰蛋白酶(HAAT)启动子(例如，SEQ ID NO：21)，等等。在实施方式中，这些启动子在其下游含内含子 的末端处被改变以包括一个或多个核酸酶切割位点。在实施方式中，含有核酸酶切割位点的DNA与启动 子DNA是无关的。
启动子可以包含一个或多个特异性转录调节序列，以进一步增强表达和/或改变其空间表达和/或时间 表达。启动子也可以包含远端增强子或阻遏子元件，它们可以位于距转录起始位点多达数千个碱基对的位 置。启动子可以源自于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物在内的来源。启动子可以对于发生表达 的细胞、组织或器官、或对于发生表达的发育阶段、或响应外部刺激例如生理压力、病原体、金属离子、 或诱导剂，组成性或差异性地调节基因组分的表达。启动子的代表性例子包括噬菌体T7启动子、噬菌体 T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子、和CMV IE启动子，以及下面列出的启 动子。这样的启动子和/或增强子可以用于表达任何目的基因，例如编辑分子、供体序列、治疗性蛋白等的 基因。例如，所述载体可以包含与编码治疗性蛋白的核酸序列可操作地连接的启动子。与治疗性蛋白编码 序列可操作地连接的启动子可以是：来自猿猴病毒40(SV40)的启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子， 人类免疫缺陷性病毒(HIV)启动子、例如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子，莫洛尼(Moloney) 病毒启动子，禽类白血病病毒(ALV)启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子、例如CMV立即早期启动子，EB 病毒(EBV)启动子，或劳氏肉瘤病毒(RSV))启动子。启动子也可以是来自人类基因例如人泛素C(hUbC)、 人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。启动子也可以是天然或合 成的组织特异性启动子，例如肝特异性启动子，例如人α1-抗胃蛋白酶(HAAT)启动子。在一个实施方式中， 可以使用包含ceDNA载体的组合物的内源性ApoE特异性靶向，通过肝细胞表面上存在的低密度脂蛋白 (LDL)受体，来实现递送到肝脏。
在一个实施方式中，使用的启动子是编码治疗性蛋白的基因的天然启动子。编码治疗性蛋白的相应基 因的启动子和其他调节序列是已知的并且已被表征。所用的启动子区域还可以包括一个或多个附加调节序 列(例如，天然的)，例如，增强子，(例如SEQ IDNO：22和SEQ ID NO：23)。
本发明所使用的合适的启动子的非限制性例子包括：CAG启动子，例如(SEQ IDNO：3)的CAG启动 子，HAAT启动子(SEQ ID NO：21)，人EF1-α启动子(SEQ ID NO：6)或EF1a启动子的片段(SEQ ID NO： 15)，和大鼠EF1-α启动子(SEQ ID NO：24)。
聚腺苷酸化序列：ceDNA载体中可包括编码聚腺苷酸化序列的序列，以稳定由ceDNA载体表达的 mRNA，并有助于核输出和翻译。在一个实施方式中，ceDNA载体不包括聚腺苷酸化序列。在其他实施方 式中，所述载体包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至 少30、至少40、至少45、至少50个或更多个腺嘌呤二核苷酸。在一些实施方式中，聚腺苷酸化序列包含 约43个核苷酸、约40-50个核苷酸、约40-55个核苷酸、约45-50个核苷酸、约35-50个核苷酸、或它们 之间的任何范围。
在一些实施方式中，ceDNA可以从载体多核苷酸获得，所述载体多核苷酸编码操作性地定位在两个不 同的反向末端重复序列(ITR)(例如AAV ITR)之间的异源核酸，其中ITR中的至少一个包含末端解离位点和 复制蛋白结合位点(RPS)，例如Rep结合位点(例如，AAV2的wt AAV ITR SEQ ID NO：1或SEQ ID NO： 2)，并且其中一个ITR相对于另一个ITR，例如功能性ITR，包含缺失、插入和/或取代。
宿主细胞不表达病毒衣壳蛋白，并且多核苷酸载体模板缺乏任何病毒衣壳编码序列。在一个实施方式 中，多核苷酸载体模板缺乏AAV衣壳基因，而且也缺乏其他病毒的衣壳基因。另外，在一个特定实施方 式中，核酸分子也缺乏AAV Rep蛋白编码序列。因此，在一个优选实施方式中，本发明的核酸分子缺乏功 能性AAV cap和AAV rep基因二者。
在本发明的某些实施方式中，ceDNA载体不具有包含选自由SEQ ID NO：548、549、551、552、553、 553、554、555、556和557组成的组中的核苷酸序列的修饰ITR。
在一些实施方式中，所述ceDNA载体包含如本文(或在2018年9月7日提交的PCT申请No. PCT/US18/49996中)公开的调节开关，和具有选自由SEQ ID NO：548、549、551、552、553、553、554、 555、556和557组成的组中的核苷酸序列的修饰ITR。
不受限制地，我们声明，上述放弃要求权的保留至少适用于本申请的权利要求1-33以及[00293]和 [00294]阐述的段落。
本文公开的各个方面的一些实施方式可以由以下段落中的任何一项来限定：
1.脂质体ceDNA载体，其包含包封ceDNA载体的脂质体，所述ceDNA载体包含：
包含顺式调节元件的表达盒，其中所述顺式调节元件选自由转录后调节元件和BGH聚A信号组成的 组；
表达盒上游(5’-端)的野生型ITR，其中所述野生型ITR包含SEQ ID NO：51的多核苷酸；和
表达盒下游(3’-端)的修饰ITR，其中所述修饰ITR包含SEQ ID NO：2的多核苷酸，
其中所述DNA载体缺乏原核生物特异性的甲基化，并且没有在AAV衣壳蛋白中衣壳化。
2.段落1的DNA载体，其中所述DNA载体具有线性和连续的结构。
3.段落1-2中任一项的DNA载体，其中转录后调节元件包括WHP转录后调节元件(WPRE)。
4.段落1-3中任一项的DNA载体，其中所述表达盒还包含克隆位点。
5.段落1-4中任一项的DNA载体，其中所述表达盒包含选自由CAG启动子、AAT启动子、LP1启 动子和EF1a启动子组成的组中的启动子。
6.段落1的DNA载体，其中所述表达盒包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和 SEQ ID NO：9的多核苷酸。
7.段落1-6中任一项的DNA载体，其中所述表达盒还包含克隆位点和插入所述克隆位点中的外源 性序列。
8.段落7的DNA载体，其中所述外源性序列包含至少2000个核苷酸。
9.段落7的DNA载体，其中所述外源性序列编码蛋白质。
10.段落7的DNA载体，其中所述外源性序列编码报告蛋白。
本文公开的各个方面的一些实施方式可以由以下段落中的任何一项来限定：
1.一种脂质粒子，其包含可电离脂质和具有共价封闭端的非病毒的无衣壳DNA载体(ceDNA载体)， 其中所述ceDNA载体包含至少一个可操作地定位在不对称反向末端重复序列(不对称ITR)之间的异源核苷 酸序列，其中所述不对称ITR中的至少一个包含功能性末端解离位点和Rep结合位点。
2.段落1的脂质纳米粒子，其中当使用在所述ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化并通 过天然和变性凝胶电泳二者进行分析时，与线性和非连续DNA对照相比，所述ceDNA载体显示线性和连 续DNA的特征性条带。
3.段落1或2的脂质纳米粒子，其中所述不对称ITR序列中的一个或多个来自选自细小病毒、依赖 病毒和腺相关病毒(AAV)的病毒。
4.段落3的脂质纳米粒子，其中所述不对称的ITR来自不同的病毒血清型。
5.段落4的脂质纳米粒子，其中所述一个或多个不对称ITR来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12的AAV血清型。
6.段落1-3中任一项的脂质纳米粒子，其中所述不对称ITR序列中的一个或多个是合成的。
7.段落1-6中任一项的脂质纳米粒子，其中所述ITR中的一个或多个不是野生型ITR。
8.段落1-7中任一项的脂质纳米粒子，其中所述不对称ITR中的一个或多个都通过在至少一个选自 A、A’、B、B’、C、C’、D和D’的ITR区域中的缺失、插入和/或取代来修饰。
9.段落1-8中任一项的脂质纳米粒子，其中所述ceDNA载体包含至少两个不对称ITR，所述至少两 个不对称ITR选自：
a.SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：52；以及
b.SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：51。
10.段落1-9中任一项的脂质纳米粒子，其中所述ceDNA载体由包括以下步骤的方法获得：
a.在诱导在昆虫细胞内产生所述ceDNA载体的有效条件和充分时间下，在至少一种Rep蛋白的存 在下，温育包含ceDNA表达构建体的昆虫细胞群，其中所述ceDNA表达构建体编码所述ceDNA载体； 和
b.从所述昆虫细胞分离所述ceDNA载体。
11.段落10的脂质纳米粒子，其中所述ceDNA表达构建体选自ceDNA质粒、ceDNA杆粒和ceDNA 杆状病毒。
12.段落10或段落11的脂质纳米粒子，其中所述昆虫细胞表达至少一种Rep蛋白。
13.段落10的脂质纳米粒子，其中至少一种Rep蛋白来自选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV) 的病毒。
14.段落13的脂质纳米粒子，其中至少一种Rep蛋白来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、 AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12的AAV血清型。
15.段落1-15中任一项的脂质粒子，其中所述DNA载体由载体多核苷酸获得，其中所述载体多核苷 酸编码操作性地定位在两个反向末端重复序列(ITR)之间的异源核酸，其中所述两个ITS彼此不同(不对称)， 并且ITR中的至少一个是包含功能性末端解离位点和Rep结合位点的功能性ITR，并且所述ITR中的一个 相对于所述功能性ITR包含缺失、插入和/或取代；在昆虫细胞中Rep蛋白的存在诱导所述载体多核苷酸 的复制和所述DNA载体的产生，所述DNA载体可由包括以下步骤的方法获得：
a.在诱导在昆虫细胞内产生所述无衣壳的非病毒DNA载体的有效条件和充分时间下，在Rep蛋白 的存在下，温育包含所述载体多核苷酸的昆虫细胞群，所述载体多核苷酸缺乏病毒衣壳编码序列，其中在 没有所述载体的情况下，所述昆虫细胞不包含在所述昆虫细胞内产生无衣壳的非病毒DNA；以及
b.从昆虫细胞中收获并分离所述无衣壳的非病毒DNA。
16.段落10-15中任一项的脂质粒子，其中能够证实从昆虫细胞中分离的所述无衣壳的非病毒DNA 的存在。
17.段落16的脂质粒子，其中通过使用在所述DNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从所述昆 虫细胞分离的DNA并在非变性凝胶上分析所消化的DNA物质以证实与线性和非连续DNA相比存在线性 和连续DNA的特征性条带，从而能够证实从所述昆虫细胞中分离的所述无衣壳的非病毒DNA的存在。
18.段落1-17中任一项的脂质粒子，其中所述DNA载体由载体多核苷酸获得，其中所述载体多核苷 酸编码操作性地定位在第一和第二AAV2反向末端重复DNA多核苷酸序列(ITR)之间的异源核酸，其中相 对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：51的相应AAV2野生型ITR，所述ITR中的至少一个具有至少一个多 核苷酸缺失、插入和/或取代，以在昆虫细胞中在Rep蛋白存在下诱导所述DNA载体的复制，所述DNA 载体能够由包括以下步骤的方法获得：
a.在诱导在昆虫细胞内产生所述无衣壳的非病毒DNA的有效条件和充分时间下，在Rep蛋白存在 下，温育包含所述载体多核苷酸的昆虫细胞群，所述载体多核苷酸缺乏病毒衣壳编码序列，其中所述昆虫 细胞不包含病毒衣壳编码序列；以及
b.从所述昆虫细胞中收获并分离所述无衣壳的非病毒DNA。
19.段落18的脂质粒子，其中能够证实从所述昆虫细胞中分离的所述无衣壳的非病毒DNA的存在。
20.段落19的脂质粒子，其中通过使用在所述DNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从所述昆 虫细胞分离的DNA并在非变性凝胶上分析所消化的DNA物质以证实与线性和非连续DNA相比存在线性 和连续DNA的特征性条带，从而能够证实从所述昆虫细胞中分离的所述无衣壳的非病毒DNA的存在。
21.段落1-20中任一项的脂质粒子，其中所述脂质粒子还包含非阳离子脂质、PEG缀合脂质、以及 固醇中的一种或多种。
22.段落1-21中任一项的脂质粒子，其中可电离的脂质是表1中所述的脂质。
23.段落1-22中任一项的脂质粒子，其中所述脂质粒子还包含非阳离子脂质，其中非离子脂质选自由 下列所组成的组：二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱 (DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、 二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺 (POPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰 乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基磷脂酰乙醇 胺(例如16-O-单甲基PE)、二甲基磷脂酰乙醇胺(例如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰 基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸 (DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰基 磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱酰(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)、二反油酰基磷脂 酰乙醇胺(DEPE)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、 鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二鲸蜡基磷酸酯、溶血磷脂酰胆碱、和二 亚油酰基磷脂酰胆碱。
24.段落1-23中任一项的脂质粒子，其中所述脂质粒子还包含缀合脂质，其中所述缀合脂质选自由下 列所组成的组：PEG-二酰基甘油(DAG)(例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG))， PEG-二烷氧基丙基(DAA)，PEG-磷脂，PEG-神经酰胺(Cer)，PEG化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)，PEG琥珀 酸二酰基甘油(PEGS-DAG)(例如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯 (PEG-S-DMG))，PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，和N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn- 甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐。
25.段落1-24中任一项的脂质粒子，其中所述脂质粒子还包含胆固醇或胆固醇衍生物。
26.段落1-25中任一项的脂质粒子，其中所述脂质粒子包含：
(i)可电离脂质；
(ii)非阳离子脂质；
(iii)抑制粒子聚集的缀合脂质；和
(iv)固醇。
27.段落1-26中任一项的脂质粒子，其中所述脂质粒子包含：
(a)可电离脂质，其量为所述粒子中存在的总脂质的约20mol％至约90mol％；
(b)非阳离子脂质，其量为所述粒子中存在的总脂质的约5mol％至约30mol％；
(c)抑制粒子聚集的缀合脂质，其量为所述粒子中存在的总脂质的约0.5mol％至约20mol％；和
(d)固醇，其量为所述粒子中存在的总脂质的约20mol％至约50mol％。
28.段落1-27中任一项的脂质粒子，其中总脂质与DNA载体(质量或重量)比为约10:1至约30:1。
29.一种包含第一脂质纳米粒子和另外的化合物的组合物，其中所述第一脂质纳米粒子包含第一无衣 壳的非病毒载体，并且是段落1-28中任一项的脂质纳米粒子。
30.段落29的组合物，其中所述另外的化合物被包含在第二脂质纳米粒子中，并且其中第一和第二 脂质纳米粒子不同。
31.段落28或29的组合物，其中所述另外的化合物被包含在第一脂质纳米粒子中。
32.段落28-30中任一项的组合物，其中所述另外的化合物是治疗剂。
33.段落28的组合物，其中所述另外的化合物是第二无衣壳的非病毒载体，其中第一和第二无衣壳 的非病毒载体是不同的。
提供以下实施例作为说明而不是限制。
实施例
实施例1：产生ceDNA载体的示例性方法
ceDNA质粒的构建
描述了使用多核苷酸构建体模板产生ceDNA载体。例如，用于生成本发明的ceDNA载体的多核苷酸 构建体模板可以是ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒和/或ceDNA-杆状病毒。不受理论的限制，在允许宿主细胞 中，在例如Rep的存在下，复制具有两个ITR和表达构建体的多核苷酸构建体模板以产生ceDNA载体， 其中所述ITR中的至少一个被修饰。ceDNA载体的产生经历两个步骤：首先，通过Rep蛋白从模板主链(例 如ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒的基因组等)中切下(“拯救”)模板，其次，Rep介导切下的 ceDNA载体的复制。
产生ceDNA载体的示例性方法来自本文所述的ceDNA-质粒。参考图1A和1B，各ceDNA-质粒的多 核苷酸构建体模板均包含左ITR和右突变ITR，在所述ITR序列之间具有：(i)增强子/启动子；(ii)转基 因的克隆位点；(iii)转录后反应元件(例如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE))；和(iv)聚腺苷酸化信 号(例如来自牛生长激素基因(BGHpA))。在每个组分之间还引入了独特的限制性核酸内切酶识别位点 (R1-R6)(图1A和1B中所示)，以便于将新的遗传组分引入构建体中的特定位点。将R3(PmeI)GTTTAAAC (SEQ ID NO：7)和R4(PacI)TTAATTAA(SEQ ID NO：542)酶位点工程化到所述克隆位点中，以引入转基 因的开放阅读框。将这些序列克隆到从ThermoFisher Scientific获得的pFastBac HT B质粒中。
简而言之，使用图4A-4C中所示的方法，从表3所示的ceDNA-质粒构建体获得了一系列ceDNA载 体。表5表明了每种组分对应的多核苷酸序列的数目，包括在与转基因操作性连接的启动子的任一端上具 有作为复制蛋白位点(RPS)(例如Rep结合位点)活性的序列。表3中的数字是指本文中的SEQ ID NO，与各 组分的序列相对应。
表3：示例性ceDNA构建体
在一些实施方式中，用于制备ceDNA载体的构建体包含作为调节开关的启动子，例如诱导型启动子。 其他构建体用于制备包含与荧光素酶转基因操作性连接的MND或HLCR启动子的ceDNA载体。
ceDNA-杆粒的产生：
参考图4A，根据制造商的说明，按照方案，用测试或对照质粒转化DH10Bac感受态细胞(MAX 
DH10BacTM感受态细胞，Thermo Fisher)。诱导所述质粒和杆状病毒穿梭载体之间在 DH10Bac细胞中重组，以生成重组ceDNA-杆粒。通过在含有X-gal和IPTG与用于选择转化体的抗生素的 细菌琼脂平板上的大肠杆菌(E.coli)中基于蓝白筛选来筛选阳性选择，来选择重组杆粒(Φ80dlacZΔM15标 志提供了来自所述杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互补)，并维持所述杆粒和转座酶质粒。挑选出由破 坏-半乳糖苷指示基因的易位所造成的白色菌落，并在10ml培养基中进行培养。
从大肠杆菌中分离重组ceDNA-杆粒，并使用FugeneHD将其转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中以产生感 染性杆状病毒。将附着性Sf9或Sf21昆虫细胞在T25烧瓶内的50ml培养基中于25℃培养。四天后，从 细胞去除培养基(含有P0病毒)，将培养基通过0.45μm过滤器过滤，从细胞或细胞碎片中分离出感染性杆 状病毒粒子。
任选地，通过在50至500ml培养基中感染幼稚Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增第一代杆状病毒(P0)。将 细胞在130rpm的轨道振动培养箱中于25℃维持在悬浮培养物中，监测细胞直径和活力，直到细胞达到 18-19nm的直径(从14-15nm的幼稚直径开始)、和约4.0E+6细胞/mL的密度为止。在感染后3和8天之 间，离心去除细胞和碎片，然后通过0.45μm过滤器过滤后收集培养基中的P1杆状病毒粒子。
收集包含测试构建体的ceDNA-杆状病毒，并确定杆状病毒的感染活性或滴度。具体而言，用P1杆状 病毒按下列稀释度处理4x20ml 2.5E+6细胞/ml的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000， 并在25-27℃下温育。通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4至5天中每天细胞活力的变化来确 定感染性。
参考图4A，在包含Rep78(SEQ ID NO：13)或Rep68(SEQ ID NO：12)与Rep52(SEQ IDNO：14)二者 的pFASTBACTM-Dual表达载体(ThermoFisher)中，生产图6A的“Rep-质粒”。
根据制造商提供的方案，将所述Rep-质粒转化到DH10Bac感受态细胞(MAX
DH10BacTM感受态细胞(Thermo Fisher)中。诱导Rep-质粒和杆状病毒穿梭载体之间在DH10Bac细胞中重 组，以生成重组杆粒(“Rep-杆粒”)。通过在含有X-gal和IPTG的细菌琼脂平板上的大肠杆菌中包含蓝白筛 选的阳性选择来选择重组杆粒(Φ80dlacZΔM15标志提供了来自所述杆粒载体的β-半乳糖苷酶基因的α-互 补)。挑选孤立的白色菌落，接种到10ml选择培养基(在LB肉汤中有卡那霉素、庆大霉素、四环素)中。 从大肠杆菌中分离出重组杆粒(Rep-杆粒)，并将该Rep-杆粒转染到Sf9或Sf21昆虫细胞中，以产生感染性杆状病毒。
将Sf9或Sf21昆虫细胞在50ml培养基中培养4天，并从培养物中分离感染性重组杆状病毒(“Rep-杆 状病毒”)。任选地，通过感染幼稚Sf9或Sf21昆虫细胞来扩增所述第一代Rep-杆状病毒(P0)，并在50至 500ml培养基中培养。在感染后3和8天之间，通过离心或过滤或其他分级方法分离细胞，来收集培养基 中的P1杆状病毒粒子。收集Rep-杆状病毒并确定杆状病毒的感染活性。具体而言，用P1杆状病毒按下列 稀释度处理4x20ml 2.5x106细胞/ml的Sf9细胞培养物：1/1000、1/10,000、1/50,000、1/100,000，并温育。 通过细胞直径增加和细胞周期停滞的速率以及4至5天中每天细胞活力的变化来确定感染性。
ceDNA载体生成和表征
参考图4B，然后将含有(1)含有ceDNA-杆粒或ceDNA-杆状病毒的样品和(2)上述Rep-杆状病毒二者之 一的Sf昆虫细胞培养基分别以1:1000和1:10,000的比率添加到新鲜的Sf9细胞培养物(2.5E+6细胞/ml， 20ml)中。然后将细胞在25℃下以130rpm培养。共同感染4-5天后，检测细胞直径和活力。当细胞直径 达到18-20nm且活力为约70-80％时，将细胞培养物离心，除去培养基，并收集细胞沉淀团。首先将细胞 沉淀团重悬于适量的水性介质、即水或缓冲液中。使用Qiagen MIDI PLUSTM纯化方案(Qiagen，0.2毫克处 理的细胞沉淀团质量/柱)，从细胞中分离并纯化ceDNA载体。
基于260nm处的UV吸光度，初始确定从Sf9昆虫细胞产生和纯化的ceDNA载体的产量。下表4中 提供了基于UV吸光度确定的各种ceDNA载体的产量。
表4：来自示例性构建体的ceDNA载体的产量。
可以通过如图4D所示，在天然或变性条件下的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，来评估ceDNA载体，其中 ceDNA载体在天然凝胶上生成多个条带，例如参见图4D。每个条带可以代表具有不同构造例如单体、二 聚体构造等的载体。变性条件下单条带的存在和非变性条件下双条带(对应于单体和二聚体形式)的存在是 ceDNA载体存在的特征。
通过用限制性核酸内切酶消化从共同感染的Sf9细胞(如本文所述)获得的DNA，进一步分析分离的 ceDNA载体的结构，所述限制性内切酶是针对以下条件选择的：a)在ceDNA载体内仅存在单个切割位点， 和b)产生的片段足够大，以便在0.8％变性琼脂糖凝胶上进行分级时被清楚看到(>800bp)。如图4E所示， 具有不连续结构的线性DNA载体以及具有线性和连续结构的ceDNA载体可以通过它们反应产物的大小来 区分-例如，预计具有不连续结构的DNA载体将产生1kb和2kb片段，而具有连续结构的非衣壳化载体预 计产生2kb和4kb片段。
因此，为了以定性方式证明分离的ceDNA载体是根据定义要求的共价封闭端的，将样品用在特定DNA 载体序列的背景下被鉴定为具有单个限制位点的限制性内切酶消化，优选初始两个大小不等的裂解产物(例 如1000bp和2000bp)。在变性凝胶(其将两条互补的DNA链分开)上进行消化和电泳后，线性、非共价封 闭的DNA将以1000bp和2000bp大小分解，而共价封闭的DNA(即ceDNA载体)将以2x大小分解，这是 因为两条DNA链是连接的并且现在伸展且长度翻倍(尽管是单链)。此外，由于多聚体DNA载体的端对端 连接，对单体、二聚体和n-聚体形式的DNA载体的消化都将分解为相同大小的片段(参见图4D)。
图5提供了带有有(+)或没有(-)被内切核酸酶消化的如下ceDNA载体的变性凝胶的示例性图片：构 建体-1、构建体-2、构建体-3、构建体-4、构建体-5、构建体-6、构建体-7和构建体-8(全部在上面表3中 描述)。内切核酸酶反应后，从构建体-1到构建体-8的各ceDNA载体均产生两个条带(*)。图片的底部提供 了基于大小标志物确定的它们的两个条带大小。条带大小证实了由包含构建体-1至构建体-8的质粒产生的 ceDNA载体各自具有连续的结构。
如本文中所用，短语“通过在天然凝胶和变性条件下的琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA载体的测定”是指通 过进行限制性核酸内切酶消化、然后对消化产物进行电泳评估来评估ceDNA封闭性的测定。遵照一种这 样的示例性测定，尽管本领域普通技术人员将领会，对该示例可以进行许多本领域已知的变化。选择限制 性核酸内切酶作为目的ceDNA载体的单切酶，其将生成DNA载体长度的大约1/3x和2/3x的产物。其在 天然和变性凝胶上均分解条带。变性之前，重要的是从样品中除去缓冲液。Qiagen PCR清洁试剂盒或脱盐 “离心柱”，例如GE HEALTHCARE ILUSTRATMMICROSPINTMG-25柱，是核酸内切酶消化的一些本领域 已知的选项。所述测定包括，例如：i)用适当的限制性核酸内切酶消化DNA，2)施加于例如Qiagen PCR清洁试剂盒，用蒸馏水洗脱，iii)添加10x变性溶液(10x＝0.5M NaOH，10mM EDTA)，添加10X染料， 不进行缓冲，并与通过添加10X变性溶液至4x而制备的DNA序列梯一起，在预先与1mMEDTA和200mM NaOH一起温育以确保凝胶和凝胶盒中的NaOH浓度均匀的0.8-1.0％凝胶上进行分析，并在1x变性溶液存 在下运行凝胶(50mM NaOH，1mM EDTA)。本领域普通技术人员将基于所得物的大小和期望的计时来调 整运行电泳所用的电压。电泳后，将凝胶排出并在1xTBE或TAE中中和，并转移至蒸馏水或1x TBE/TAE with 1x SYBR Gold。然后可以用例如Thermo Fisher，
Gold核酸凝胶染料(在DMSO中的10,000X 浓缩物)和落射荧光(蓝色)或UV(312nm)来显现条带。
产生的ceDNA载体的纯度可以使用任何本领域已知的方法来评估。作为一种示例性且非限制性的方 法，可以通过将ceDNA载体的荧光强度与标准品进行比较来估算ceDNA-质粒对样品总体UV吸光度的贡 献。例如，如果基于UV吸光度，将4μg ceDNA载体加载到凝胶上，并且ceDNA载体荧光强度等同于已 知为1μg的2kb条带，那么就有1μg的ceDNA载体，并且ceDNA载体为总UV吸收物质的25％。然后将 凝胶上的条带强度对条带代表的计算输入作图，例如，如果总ceDNA载体是8kb，而切下的比较条带为 2kb，则条带强度将按总输入的25％绘制，在这种情况下，对于1.0μg输入将为.25μg。使用ceDNA载体质 粒滴定来绘制标准曲线，然后使用回归线方程计算ceDNA载体条带的量，然后可用于它来确定ceDNA载 体所占的总输入的百分比、或纯度百分比。
实施例2：ceDNA载体在体外表达荧光素酶转基因
通过将编码荧光素酶报告基因的开放阅读框引入下列ceDNA-质粒构建体的克隆位点来生成构建体： 构建体-1，构建体-3，构建体-5，和构建体-7。包括荧光素酶编码序列的ceDNA-质粒(参见上面表3)分别 名为质粒构建体-1-Luc、质粒构建体-3-Luc、质粒构建体-5-Luc和质粒构建体-7-Luc。
培养HEK293细胞，并使用
(Promega Corp.)作为转染剂，用100ng、200ng或400ng的质 粒构建体1、3、5和7进行转染。基于各细胞培养物中的荧光素酶活性来确定各质粒的荧光素酶表达，结 果提供在图7A中。在未处理的对照细胞(“未处理”)或仅用Fugene处理的细胞(“Fugene”)中未检测到荧光素 酶活性，证实了荧光素酶活性是由质粒的基因表达引起的。如图7A和7B所示，从构建体1和7中检测 到强大的荧光素酶表达。来自构建体7的表达表达了荧光素酶，并检测到荧光素酶活性的剂量依赖性增加。
还确定了用各质粒转染的细胞的生长和活力，并在图8A和8B中呈现。在用不同构建体处理的不同 细胞组之间，感染细胞的细胞生长和生存力没有显著差异。
因此，在各组中测量的并基于细胞生长和活力进行归一化的荧光素酶活性与未归一化的荧光素酶活性 没有不同。带有构建体1-Luc的ceDNA质粒在有或没有归一化的情况下都显示了最强大的荧光素酶表达。
因此，图7A、7B、8A和8B中呈现的数据证明了，从5’到3’包含：WT-ITR(SEQ ID NO：51)、CAG 启动子(SEQ ID NO：3)、R3/R4克隆位点(SEQ ID NO：7)、WPRE(SEQ ID NO：8)、BGHpA(SEQ ID NO： 9)和修饰的ITR(SEQ ID NO：2)的构建体1，有效产生可表达ceDNA载体内转基因的蛋白的ceDNA载体。
实施例3：脂质(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯 (DLin-MC3-DMA)
包含ceDNA的脂质粒子可以组合脂质(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基) 丁酸酯(DLin-MC3-DMA)来制备或配制，该脂质在本文中也称为“MC3”，具有以下结构：
脂质DLin-MC3-DMA在Jayaraman等人，Angew.Chem.Int.Ed Engl.(2012)，51(34)：8529-8533中描 述，该文献的内容通过引用整体并入本文。它的合成如下：
合成甲磺酸十八碳-9,12-二烯基酯：向醇1(26.6g，100mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液添加三 乙胺(13.13g，130mmol)，并将该溶液在冰浴中冷却。向该冷溶液中滴添甲磺酰氯(12.6g，110mmol)在二 氯甲烷(60mL)中的溶液，添加完成后，使反应混合物升温至环境温度并搅拌过夜。反应混合物的TLC显 示反应完成。将反应混合物用二氯甲烷(200mL)稀释，用水(200mL)、饱和NaHCO3(200mL)、盐水(100mL) 洗涤并干燥(NaSO4)。浓缩有机层得到粗产物，将其通过柱色谱(硅胶)使用0-10％Et2O的己烷溶液进行纯 化。合并纯产物级分并浓缩，得到纯产物甲磺酸十八碳-9,12-二烯基酯，为无色油。1H NMR(CDCl3，400MHz) δ5.42-5.21(m，4H)，4.20(t，2H)，3.06(s，3H)，2.79(t，2H)，2.19-2.00(m，4H)，1.90-1.70(m，2H)， 1.06-1.18(m，18H)，0.88(t，3H)。13C NMR(CDCl3)δ130.76，130.54，128.6，128.4，70.67，37.9，32.05， 30.12，29.87，29.85，29.68，29.65，29.53，27.72，27.71，26.15，25.94，23.09，14.60.MS。C19H36O3S 的计算分子量为344.53。
合成18-溴-十八碳-6,9-二烯：将所述甲磺酸酯(甲磺酸十八碳-9,12-二烯基酯，13.44g，39mmol)溶 解在无水乙醚(500mL)中并并在氩气下向其添加MgBr.Et2O复合物(30.7g，118mmol)，并将该混合物在 氩气下回流26h，然后TLC显示反应完成。将反应混合物用乙醚(200mL)稀释，将冰冷的水(200mL)添加 到该混合物中，并分离层。有机层用1％K2CO3水溶液(100mL)、盐水(100mL)洗涤并干燥(无水Na2SO4)。 浓缩有机层提供粗产物，将其通过柱色谱(硅胶)使用0-10％Et2O的己烷溶液进一步纯化以分离产物18-溴- 十八碳-6,9-二烯，无无色油。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ5.41-5.29(m，4H)，4.20(d，2H)，3.40(t，J＝7 Hz，2H)，2.77(t，J＝6.6Hz，2H)，2.09-2.02(m，4H)，1.88-1.00(m，2H)，1.46-1.27(m，18H)，0.88(t， J＝3.9Hz，3H)。13C NMR(CDCl3)δ130.41，130.25，128.26，128.12，34.17，33.05，31.75，29.82，29.57， 29.54，29.39，28.95，28.38，27.42，27.40，25.84，22.79，14.28。
合成(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-醇(DLin-MeOH)：向经火焰干燥的500mL RB烧瓶 中加入新鲜活化的Mg切屑(2.4g，100mmol)，该烧瓶配有磁力搅拌棒、加料漏斗和回流冷凝器。将该装 置脱气并用氩气冲洗，将10mL无水乙醚通过注射器加入烧瓶中。将18-溴-十八碳-6,9-二烯(26.5g，80.47 mmol)溶解在无水乙醚(50mL)中，并添加到加料漏斗。在剧烈搅拌的同时，向Mg切屑添加约5mL的该 乙醚溶液。注意到放热反应(为了证实/加速格氏试剂(Grignard reagent)形成，添加5mg碘，观察到立即脱 色，证实格氏试剂形成)，并且醚开始回流。通过将烧瓶在水中冷却而将反应保持在温和回流下的同时，滴加其余的溴化物溶液。完成添加后，将反应混合物在35℃下保持1h，然后在冰浴中冷却。将甲酸乙酯(2.68 g，36.2mmol)溶解在无水乙醚(40mL)中，并转移到加料漏斗，随着搅拌滴加到反应混合物中。观察到放 热反应并且反应混合物开始回流。反应开始后，将其余的甲酸酯醚溶液作为液流快速加入，并将反应混合 物在环境温度下再搅拌1h时间。通过滴加10mL丙酮、然后是冰冷的水(60mL)来淬灭反应。将反应混合 物用H2SO4水溶液(10体积％，300mL)处理直到溶液变得均匀为止，分离各层。用乙醚(2x100 mL)提取水 相。将合并的醚层干燥(Na2SO4)并浓缩，得到粗产物，将其用含1g钠的甲醇(200mL)在室温下处理过夜。 反应完成后，蒸发大部分溶剂。将所生成的混合物倒入150mL的5％盐酸溶液中。用乙醚(2x150 mL)提取 水相。合并的乙醚提取物用水(2x100mL)、盐水(100mL)洗涤，并用无水硫酸钠干燥。蒸发溶剂产生粗产 物，将其通过柱色谱(硅胶，0-10％乙醚的己烷溶液)纯化，并将纯产物级分发而提供产物DLin-MeOH，为 无色油状物。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.47–5.24(m，8H)，3.56(dd，J＝6.8，4.2，1H)，2.85–2.66(m， 4H)，2.12–1.91(m，9H)，1.50–1.17(m，46H)，0.98–0.76(m，6H)。13C NMR(101MHz，CDCl3)δ130.41， 130.37，128.18，128.15，77.54，77.22，76.91，72.25，37.73，31.75，29.94，29.89，29.83，29.73，29.58， 29.53，27.46，27.43，25.89，25.86，22.80，14.30。
合成6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)：将DLin-MeOH(144 g，272mmol)溶解在1L二氯甲烷中，并向其添加二甲基氨基丁酸的盐酸盐7(55g，328mmol)，然后添加 二异丙基乙胺(70mL)和DMAP(4g)。在环境温度下搅拌5分钟后，添加EDCI(80g，417mmol)，并将反 应混合物在室温下搅拌过夜，然后TLC(硅胶，5％MeOH的CH2Cl2溶液)分析显示起始醇完全消失。将反 应混合物用CH2Cl2(500mL)稀释并用饱和NaHCO3(400mL)、水(400mL)和盐水(500mL)洗涤。合并的 有机层经无水Na2SO4干燥并真空除去溶剂。由此获得的粗产物通过快速柱色谱纯化[2.5Kg硅胶，使用以 下洗脱物i)用6L含0.1％NEt3的DCM溶液装填的柱；加载后ii)4L的0.1％NEt3的DCM溶液；iii)16L 的2％MeOH–98％的0.1％NEt3的DCM溶液；iv)4L的2.5％MeOH–97.5％0.1％Net3的DCM溶液；v) 12L的3％MeOH–97％的0.1％NEt3的DCM溶液]以分离纯产物MC3，为无色油状物。1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ5.46–5.23(m，8H)，4.93–4.77(m，1H)，2.83–2.66(m，4H)，2.37–2.22(m，4H)，2.20(s， 6H)，2.10–1.96(m，9H)，1.85–1.69(m，2H)，1.49(d，J＝5.4，4H)，1.39–1.15(m，39H)，0.95–0.75 (m，6H)。13C NMR(101MHz，CDCl3)：δ173.56，130.38，130.33，128.17，128.14，77.54，77.22，76.90， 74.44，59.17，45.64，34.36，32.69，31.73，29.87，29.76，29.74，29.70，29.56，29.50，27.44，27.41， 25.84，25.55，23.38，22.78，14.27.EI-MS(+ve):MWcalc.for C43H79NO2(M+H)+:642.6。
实施例4：脂质ATX-002
包含ceDNA的脂质粒子可以组合具有下面结构的脂质ATX-002来制备或配制：
脂质ATX-002在WO2015/074085中描述，WO2015/074085的内容通过引用整体并入本文。它的合成 如下：
合成8-溴辛酸甲酯：在N2气氛下，将8-溴辛酸(60gm，1当量)溶解在400ml无水甲醇中。滴加十滴 浓H2SO4，并将反应混合物在回流下搅拌3小时。
通过薄层色谱(TLC)监测反应直至完成。在真空下完全去除溶剂。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并用 水洗涤。水层用乙酸乙酯再提取。总有机层用饱和NaHCO3溶液洗涤。再次用水洗涤有机层，最后用盐水 洗涤。产物经无水Na2SO4干燥并浓缩。
8,8'-(benzanediyl)二辛酸二甲酯的合成：取无水K2CO3(104.7gm，6当量)并在N2下添加到无水二甲基 甲酰胺。缓慢添加在二甲基甲酰胺中的苄胺(13.54gm，1当量)。然后在室温下添加溶解在二甲基甲酰胺中 的8-溴辛酸甲酯(60gm，2当量)。将反应混合物加热至80℃，并将反应在搅拌下维持36小时。
通过薄层色谱(TLC)监测反应直至完成。将反应产物冷却至室温并添加水。用乙酸乙酯提取所述化合 物。用乙酸乙酯再提取水层。用水洗涤总有机层，最后用盐水溶液洗涤。产物经无水干Na2SO4燥并浓缩。
反应产物通过在3％甲醇的氯仿溶液中的硅胶柱色谱进行纯化。使用10％甲醇的氯仿溶液的TLC系统， 产物以Rf：0.8迁移，通过在茚三酮中炭化来显现。该化合物是浅棕色液体。通过1H-NMR证实结构。
合成8,8′-氮烷二基二辛酸二甲酯：将8,8'-(benzanediyl)二辛酸二甲酯(3.5gm，1当量)转移到氢化玻 璃容器中，添加90ml乙醇，然后添加10％Pd/C(700mg)。将反应混合物在Parr-振动设备中在50psi H2气 氛压力下在室温下振动两小时。通过硅藻土过滤反应产物，并用热乙酸乙酯洗涤。将滤液真空浓缩。
合成8,8'-((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二甲酯：将8,8′-氮烷二基二辛酸二甲酯(32gm，1当量)转移 到DCM(700ml)和无水Et3N(9gm，4当量)中至反应质量并冷却到0℃。向上述反应滴加在DCM中稀释 的Boc酐(31.3gm，1.5当量)。完成添加后，将反应混合物在室温下搅拌3小时。
用水淬灭反应，并分离DCM层。将水相用DCM再提取，并将合并的DCM层用盐水溶液洗涤并用 Na2SO4干燥。浓缩后，收集粗产物。粗反应产物通过柱色谱使用0-12％乙酸乙酯的己烷溶液纯化。单一产 物通过薄层色谱在20％乙酸乙酯的己烷溶液中以Rf 0.5迁移，并用茚三酮炭化。
合成8,8’-((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸：将8,8'-((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸二甲酯(21gm，1当 量)转移到无水THF(200ml)中。在室温下添加6N氢氧化钠水溶液(175ml)。将反应在室温下搅拌过夜。
将反应物料在25℃下真空蒸发以除去THF。反应产物用5N HCl酸化。将乙酸乙酯添加到水层。将分 离的有机层用水洗涤，并将水层用乙酸乙酯再提取。合并的有机层用盐水溶液洗涤并经无水Na2SO4干燥。 浓缩溶液产生粗产物。
合成二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8’((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸酯：将8,8’-((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸 (18gm，1当量)溶解在无水DCM(150ml)中。向该溶液添加HATU(26.15gm，2.1当量)。将D-异丙基乙胺 (14.81gm，3.5当量)在室温下缓慢添加到反应混合物中。内部温度升至40℃，形成淡黄色溶液。向反应 混合物添加DMAP(400mg，0.1当量)，然后添加在无水DCM中的顺式-2-壬烯-1-醇溶液(9.31gm，2当 量)。反应变成棕色。将反应在室温下搅拌五小时。
通过薄层色谱检查反应完成。向反应产物中加水，并用DCM萃取。DCM层先后用水、然后盐水溶液 洗涤。有机层经无水Na2SO4干燥并浓缩，得到粗化合物。
合成ATX-002：将二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8’((叔丁氧羰基)氮烷二基)二辛酸酯(13.85mmol，9克)溶解在 无水DCM(150ml)中。在0℃下添加TFA启动反应。在搅拌下使反应温度用30分钟缓慢升温至室温。薄 层色谱显示反应完成。将反应产物在40℃下真空浓缩，并将粗残余物用DCM稀释，并用10％NaHCO3溶液洗涤。水层用DCM再提取，并将合并的有机层用盐水溶液洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩。将收集的粗 产物在氮气下溶解在无水DCM(85ml)中。添加三光气并将反应混合物冷却至0℃，并滴加Et3N。将反应混 合物在室温搅拌过夜。薄层色谱显示反应完成。通过在N2下蒸馏从反应物料中除去DCM溶剂。将反应产 物冷却至0℃，用DCM(50ml)稀释，添加2-(二甲基氨基)乙硫醇HCl(0.063mol，8.3g)，然后添加Et3N(无水)。然后将反应混合物在室温下拌过夜。薄层色谱显示反应完成。将反应产物用0.3M HCl溶液(75ml)稀 释，并分离有机层。水层用DCM再提取，将合并的有机层用10％K2CO3水溶液(75ml)洗涤并经Na2SO4干燥。浓缩溶剂产生粗产物。粗化合物通过硅胶柱(100-200目)使用3％MeOH/DCM纯化。
实施例5：(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)
包含ceDNA的脂质粒子可以组合具有下面结构的(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1- 胺(化合物32)来制备或配制：
化合物32在WO2012/040184中描述，WO2012/040184的内容通过引用整体并入本文。它的合成如下：
合成α,β-不饱和酰胺(vii):
将甲硅烷基Peterson试剂(3.1g，16.7mmol)溶解在THF(35mL)中并冷却至-63℃。向该溶液添加nBuLi (16.7mmol，6.7mL的2.5M溶液)。将反应温热至环境温度30分钟。在第二个烧瓶中，将酮(iii)(5.0g，11.9mmol) 溶解在THF(25mL)中。将酮溶液用30分钟转移到Peterson试剂中，同时将温度维持在-60℃和-40℃之间。 将反应温热至-40℃1小时，然后温热至0℃30分钟。用碳酸氢钠淬灭反应，用另外的水稀释并在水/己烷 之间分配。用盐水洗涤有机物，经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发。通过快速色谱(0-40％MTBE/己烷)纯化， 产生α,β-不饱和酰胺(vii)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ5.75(s，1H)，5.36(m，4H)，3.01(s，3H)，2.99(s， 3H)，2.78(t，2H)，2.28(t，2H)，2.05(m，6H)，1.35(m，34H)，0.89(m，6H)。
将α,β-不饱和酰胺(vii)(1g，2.1mmol)和LS-三仲丁基硼氢化锂(4.1mmol，4.1mL的a 1M溶液)在密 封管中合并，并加热至60℃24小时。将反应冷却至环境温度，并在氯化铵溶液和庚烷之间分配。有机物 经硫酸钠干燥，过滤并真空蒸发，产生酰胺(viii)。将该中间体直接带入下一反应粗产物中。
α,β-不饱和酰胺(vii)的另一种共轭还原涉及使用氢化铜还原。
[在5L RB中，将铜催化剂(9.77g，17.13mmol)在氮气下溶解于甲苯(1713ml)中。向其一次性添加来 自Aldrich的PMHS(304ml，1371mmol)。将反应物老化5分钟。向该溶液添加α,β-不饱和酰胺(vii)(167.16 g，343mmol)。然后通过注射泵用3小时向该混合物添加叔戊醇(113ml，1028mmol)。添加完成后，向溶 液分批添加约1700mL 20％NH4OH到反应。注意：在淬灭开始时有剧烈的冒泡和起泡，因此必须密切监 测，并分小批缓慢添加氢氧化铵。将反应在水和己烷之间分配。将有机物通过硅藻土过滤并真空蒸发。使 用机械搅拌器在己烷中将所生成的橡胶状固体物质粉碎，产生小颗粒，然后将其过滤并用己烷洗涤。然后 将有机物真空蒸发并通过快速色谱纯化(硅胶，0-15％乙酸乙酯/己烷)，产生目标酰胺(viii)。LC/MS (M+H)＝490.7。
合成化合物32：向酰胺(viii)的溶液(2.85g，5.8mmol)添加氢化铝锂(8.7mmol，8.7mL的1M溶 液)。将反应在环境温度下搅拌10分钟，然后通过缓慢添加十水硫酸钠溶液淬灭。过滤固体并用THF洗涤， 并将滤液真空蒸发。粗混合物通过反相制备型色谱(C8柱)纯化而提供(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二 碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)，为油状物。HRMS(M+H)calculated 476.5190.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ 5.37(m，4H)，2.78(t，2H)，2.42(m，8H)，2.05(q，4H)，1.28(m，41H)，0.89(m，6H)。
实施例6：化合物6和22
包含ceDNA的脂质粒子可以组合具有下面结构的化合物6或22来制备或配制：
化合物6或22在WO2015/199952中描述，WO2015/199952的内容通过引用整体并入本文。化合物6 或22的合成如下：
化合物6的合成：用2-己基癸酸(10.0g)、DCC(8.7g)和DMAP(5.7g)处理壬烷-1,9-二醇(12.6g)在二氯 甲烷(80mL)中的溶液。将该溶液搅拌两个小时。过滤反应混合物并除去溶剂。将残余物溶解在温热的己烷 (250mL)中，并使其结晶。过滤溶液并除去溶剂。将残余物溶解在二氯甲烷中，并用稀盐酸洗涤。有机级 分经无水硫酸镁干燥，过滤并除去溶剂。使用0-12％乙酸乙酯/己烷作为洗脱剂，使残余物通过硅胶柱(75g)， 产生9-(2'-己基癸酰氧基)壬-1-醇，为油状物。
将产物溶解在二氯甲烷(60mL)中，并用氯铬酸吡啶鎓(6.4g)处理4小时。添加乙醚(200mL)，并将上清 液通过硅胶床过滤。从滤液中除去溶剂，并将生成的油状物使用乙酸乙酯/己烷(0-12％)梯度通过硅胶(75g) 柱，产生9-(2′-乙基己酰氧基)壬醛，为油状物。
将粗产物(6.1g)、乙酸(0.34g)和2-N,N-二甲基氨基乙胺(0.46g)在二氯甲烷(20mL)中的溶液用三乙酰 氧基硼氢化钠(2.9g)处理两小时。将溶液用二氯甲烷稀释，用氢氧化钠水溶液洗涤，然后用水洗涤。有机 相经无水硫酸镁干燥，过滤并除去溶剂。使用甲醇/二氯甲烷(0-8％)梯度使残余物通过硅胶(75g)柱，然后 使用二氯甲烷/乙酸/甲醇梯度通过第二柱(20g)。将纯化的级分溶解在二氯甲烷中，用稀氢氧化钠水溶液洗 涤，经无水硫酸镁干燥，过滤并除去溶剂，得到目标产物，为无色油状物。
化合物22的合成：在第一步，向6-溴己酸(20mmol，3.901g)、2-己基-1-癸醇(1.8当量，36mmol， 8.72g)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP 0.5当量，10mmol，1.22g)在DCM(80mL)中的溶液添加DCC(1.1 当量，22mmol，4.54g)。将所生成的混合物在室温搅拌16小时。通过过滤弃去沉淀物。将滤液浓缩。残 余物通过硅胶柱色谱用乙酸乙酯在己烷中的梯度混合物(0-2％)洗脱进行纯化。这产生目标产物，为无色油 状物。
在第二步，将在配备冷凝器的250mL烧瓶中来自第一步的溴化物(1.34当量，7.88g，18.8mmol)、 N,N-二异丙基乙胺(1.96当量，27.48mmol，4.78mL)和N,N-二甲基乙二胺(1当量，14.02mmol，1.236g， 1.531mL)在乙腈(70mL)中的混合物在79℃(油浴)下加热16小时。将反应混合物冷却至室温并浓缩。残 余物吸收在乙酸乙酯和己烷(1:9)和水的混合物中。进行相分离，用水(100mL)和盐水洗涤。然后将其经硫 酸钠干燥并浓缩(8.7g油状物)。粗产物(8.7g油状物)通过硅胶柱色谱(0-3％MeOH的氯仿溶液)纯化。将含 有目标产物的级分合并并浓缩。残余物溶解在1mL己烷中，并通过硅胶层(3-4mm，用8mL己烷洗涤)过滤。用Ar流将滤液吹干，并在真空中充分干燥过夜。获得目标产物，为无色油状物。1H NMR(400MHz，CDCl3) δ3.96(d，5.8Hz，4H)，2.55-2.50(m，2H)，2.43-2.39(m，4H)，3.37-3.32(m，2H)，2.30(t，7.5Hz，4H)， 2.23(s，6H)，1.63(五重样，7.6Hz，6H)，1.48-1.40(m，4H)，1.34-1.20(52H)，0.88(t样，6.8Hz，12H)。
实施例7：脂质制剂的制备
可以按总脂质与ceDNA的重量比为大致10:1至30:1来制备脂质纳米粒子(LNP)。简单说，可电离脂 质(例如，MC3，ATX-002，化合物6，化合物22，式(A’)或(A”)的化合物，或式(B’)、(B’)或(B”)的化合物)、 非阳离子脂质(例如，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC))、提供膜完整性的组分(例如，固醇，如胆固醇)和缀合 脂质分子(例如PEG-脂质，例如1-(单甲氧基)-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油，平均PEG分子量为 2000(“PEG-DMG”))的摩尔比为50:10:38.5:1.5。在缓冲溶液中将ceDNA稀释至期望的浓度。例如，可以在 包含乙酸钠、乙酸钠和氯化镁、柠檬酸盐、苹果酸、或苹果酸和氯化钠的缓冲溶液中将ceDNA稀释至0.1 mg/ml至0.25mg/ml的浓度。在一个示例中，将ceDNA在pH 4的10至50mM柠檬酸盐缓冲液中稀释至 0.2mg/mL。使用例如注射泵或冲击射流混合器，将脂质的醇溶液与ceDNA水溶液以约1:5至1:3(体积/体 积)的比率且总流量高于10ml/分钟下混合。在一个示例中，将脂质的醇溶液与ceDNA水溶液以约1:3(体 积/体积)的比率且流量为12ml/分钟下混合。除去醇，并通过透析用PBS代替缓冲液。或者，可以使用离 心管将缓冲液替换为PBS。通过例如透析或切向流过滤，可以实现去除醇和同时交换缓冲液。在进一步使 用之前，将获得的脂质纳米粒子通过0.2μm孔无菌过滤器过滤。
实施例8：脂质粒子制剂的分析
脂质纳米粒子的粒度可以使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern，英国)通过准弹性光散射来确定， 并且直径约为55-95nm或直径约为70-90nm。
配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的有效性相关(参见Jayaraman等人，《应用化学》 (Angewandte Chemie)，国际版(2012)，51(34)，8529-8533；Semple等人，Nature Biotechnology 28，172-176 (20l 0)，二者均通过引用整体并入)。优选的pKa范围是约5至约7。使用基于2-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS) 的荧光的测定，确定脂质纳米粒子中各阳离子脂质的pKa。在PBS中以脂质浓度为0.4mM包含阳离子脂 质/DSPC/胆固醇/PEG-脂质(50/10/38.5/1.5mol％)的脂质纳米粒子可以使用本文和别处所述的在线方法来 制备。TNS可以在蒸馏水中制成100μM的储备溶液。囊泡可以在2mL缓冲溶液中稀释至24μM脂质，所 述缓冲溶液含有10mM HEPES、10mM MES、10mM乙酸铵、130mM NaCl，其中pH范围为2.5至11。 可以添加小份的TNS溶液使终浓度为1μM，并在涡旋混合后，在室温下在SLM Aminco系列2发光分光 光度计中使用321nm和445nm的激发和发射波长来测量荧光强度。可以将S曲线最佳拟合分析应用于荧 光数据，并将pKa测量为产生半数最大荧光强度时的pH。
ceDNA在脂质粒子中的包封可以通过
测定来确定。
是一种超灵敏的荧光核酸染色 剂，用于定量溶液中的寡核苷酸和单链DNA或RNA(可得自InvitrogenCorporation；Carlsbad，Calif.)。 作为替代，可以使用
简而言之，可以通过进行不透膜的荧光染料排阻测定来确定包封，该测 定使用与核酸结合时具有增强的荧光的染料。通过将所述染料添加到脂质粒子制剂中、测量所生成的荧光 并将其与在添加少量非离子型洗涤剂后观察到的荧光进行比较，来确定包封。洗涤剂介导的脂质双层破坏 释放了包封的ceDNA，使其与不透膜的染料相互作用。ceDNA的包封可以计算为E＝(I0-I)/I0，其中I和 I0是指添加洗涤剂之前和之后的荧光强度。
相对活度可以通过在通过尾静脉注射进行施用后4小时测量肝脏中的荧光素酶表达来确定。比较0.3 和1.0mg ceDNA/kg剂量下的活度，并以施用后4小时测量的纳克荧光素酶/克肝脏表示。
实施例9：示例性ceDNA-LNP的评价
使用包含MC3、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000(摩尔比50:10:38.5:1.5)的脂质溶液，以各种N/P比(例 如3、4、5和6)制备包含示例性ceDNA的脂质纳米粒子。制备了ceDNA载体在包含盐例如乙酸钠、乙酸 钠和氯化镁、柠檬酸盐、苹果酸、或苹果酸和氯化钠的缓冲溶液中的水溶液。使用内部程序在NanoAssembler 上以12ml/分钟的总流量和脂质与eDNA之比为1:3(v/v)来混合脂质溶液和ceDNA溶液。
表征
确定脂质纳米粒子的大小和ceDNA在脂质纳米粒子中的包封。粒度通过动态光散射(ZEN3600， Malvern Instruments)确定。通过在向LNP浆料添加PicoGreen(ThermoScientific)后测量荧光来确定未包封 的ceDNA含量(C游离)，并将该值与通过1％Triton裂解LNP后得到的总ceDNA含量(C总计)进行比较，来计 算包封效率，其中％包封＝(C总计-C游离)/C总计×100。结果示于图9-11。
内体逃逸测定
确定血清和BSA对LNP包封和释放ceDNA的作用。通过在氯仿中混合DOPS:DOPC:DOPE(摩尔比 1:1:2)、然后在真空下蒸发溶剂，制备模拟阴离子脂质体的内体。将干燥的脂质膜在短暂超声处理下重悬于 DPBS中，然后通过0.45μm针头式滤器过滤以形成阴离子脂质体。
将含有ceDNA的LNP和BSA或血清等体积混合在一起。将该混合物在37℃下温育20分钟。随后， 将阴离子脂质体在pH 7.5或6.0的DPBS中以期望的阴离子/阳离子脂质摩尔比添加到LNP-BSA或血清混 合物中。然后将由此产生的组合在37℃下再温育15分钟。作为对照，将等体积的DPBS代替阴离子脂质 体添加到LNP-BSA或血清混合物中。通过在向LNP浆料添加PicoGreen(Thermo Scientific)后测量荧光来 确定未包封的ceDNA含量(C游离)，并将该值与通过1％Triton裂解LNP后得到的总ceDNA含量(C总计)进行 比较，来计算在pH 7.5或6.0进行不同处理下的游离ceDNA，其中％游离＝C游离/C总计×100。与阴离子 脂质体一起温育后释放的％ceDNA是基于以下等式计算的：
％释放的ceDNA＝％游离ceDNA与阴离子脂质体混合-％游离ceDNA与DPBS混合
结果示于图12-15并在表5中总结。
表5.从示例性LNP中释放的ceDNA与DOPS脂质体一起温育
*含有6mM MgCl2和200nM肌动蛋白的血清
ApoE结合
确定脂质纳米粒子与ApoE的结合。将LNP(10μg/mL)与等体积的重组ApoE3(500μg/mL)在1x DPBS 中于37℃温育20分钟。孵育后，将LNP样品用1x DPBS稀释10倍，并根据下面的条件，在AKTA pure 150(GE Healthcare)上通过肝素琼脂糖色谱进行分析：
HiTrap色谱条件
结果示于图16。
HEK293表达
如下测定包封在脂质纳米粒子中的cDNA的表达。
将HEK293细胞在37℃与5％CO2下维持在补充有10％的胎牛血清和1％青霉素-链霉素的DMEM+ GlutaMAXTM培养基(Thermo Scientific)中。转染前一天将细胞以30,000细胞/孔的密度铺在96孔板中。 LipofectamineTM3000(Thermo Scientific)转染试剂根据制造商的方案用于转染100ng/孔的对照ceDNA。将 对照ceDNA在Opti-MEMTM(ThermoScientific)中稀释并添加P3000TMReagent。随后，将LipofectamineTM 3000在Opti-MEMTM中稀释到3％的终浓度。稀释的LipofectamineTM3000以1:1比率添加到稀释的ceDNA 中，并在室温下温育15分钟。然后将所需量的ceDNA-脂质复合物或LNP直接添加到每个含有细胞的孔 中。细胞在37℃与5％CO2下温育72小时。分泌的因子IX在HEK293条件培养基中的表达水平通过 VisuLize FIX抗原ELISA试剂盒(Affinity Biologics)根据制造商的说明书进行确定。结果显示在图17-19中。
实施例10：用于制剂A的化合物
包含ceDNA的脂质纳米粒子(LNP)可以组合一种或多种式(I)或(II)的化合物进行制备或配制，优选形 成适合于储存和治疗性递送ceDNA载体的脂质体或脂质纳米粒子。
可用于制备脂质粒子制剂的式(I)的化合物，具有以下结构：
其中
R1、R2、R4和R5各自独立地选自由氢、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基和胆固醇基组成的组；
R3选自由C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基和C2-C20炔基组成的组；
L选自由S、O、C1-C20烯基、取代的C1-C20烯基组成的组；
X1是不存在、
X2是不存在、
并且
每个R6独立地选自由C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基和C2-C20炔 基组成的组；
或其盐。
可用于制备脂质粒子制剂的式(II)的化合物，具有以下结构：
其中
R1、R2和R4各自独立地选自由氢、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯 基、C2-C20炔基和胆固醇基组成的组；
R3选自由C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基和C2-C20炔基组成的组；
R5不存在或选自由C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基和C2-C20炔基组 成的组；
L选自由S、O、C1-C20烯基、取代的C1-C20烯基组成的组；
X1是不存在、
X2是不存在、
每个R6独立地选自由氢、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基和C2-C20炔基组成的组；并且
---当R5存在时是与R5的共价键或---当R5不存在时则也不存在；
或其盐。
在式(I)或式(II)的一些示例性化合物中，R1是支链C12-C20烷基；R2是直链C5-C10烷基或支链C12-C20烷基；R4和R3各自独立地是直链C1-C5烷基；每个R6独立地是直链或支链C1-C5烷基；并且L是直链C1-C3烷基。
式(I)或式(II)的示例性化合物可以是选自图20所示化合物中的一种或多种化合物。
式(I)和(II)化合物的通用合成示于图21和22，其中每个R值是独立选择的。
一般而言，以上公开的起始化合物和其他化合物可以从商业来源购买或根据本领域普通技术人员熟悉 的方法制备。熟练的技术人员将能够用常规的合成方法并通过涉及化学化合物和化学反应的参考书和数据 库，在本文所述的化合物中构建甚至是最多取代的支架，这是本领域普通技术人员所知的。适当的参考书 和论文，其详述了可用于制备本文公开的化合物的反应物的合成、或提供了描述本文公开的化合物的制备 的文章的参考资料，包括例如，“合成有机化学(Synthetic Organic Chemistry)”，John Wiley andSons，Inc.New York；S.R.Sandler等人，“有机官能团制备(Organic Functional GroupPreparations)”，第三版，Academic Press， New York，1983；H.0.House，“现代合成反应(Modem Synthetic Reactions)”，第二版，W.A.Benjamin，Inc. Menlo Park，Calif.，1972；T.L.Glichrist，“杂环化学(Heterocyclic Chemistry)”，第二版，John Wiley and Sons，New York，1992；J.March，“高级有机化学：反应，机理和结构(Advanced OrganicChemistry:reactions， Mechanisms and Structure)”，第5版，Wiley Interscience，NewYork，2001；具体和类似的反应物也可以通 过美国化学会化学文摘服务社(ChemicalAbstract Service of the American Chemical Society)制定的已知化学 物质的索引进行识别，该索引在大多数公共图书馆和大学图书馆中可获得，也可以通过在线数据库(美国化 学会(American Chemical Society)，Washington，D.C.，可以接触更多详细信息)。目录中已知但不可商购的 化学物质可以由定制化学合成公司制备，其中许多标准化学物质供应公司还提供定制合成服务。
实施例11：用于制剂B的化合物
包含ceDNA的其他脂质粒子可以组合本实施例中所述的一种或多种式(III)、(IV)或(V)的化合物来制备 或配制，优选形成适合于储存和治疗性递送ceDNA载体的脂质体或脂质纳米粒子。
可用于制备脂质粒子制剂的式(III)的化合物，具有以下结构：
其中
R1、R2、R3和R4各自独立地选自由氢、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基和胆固醇基组成的组；并且
X1是不存在、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、
X2是不存在、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、
或其盐。
在一些示例性的式(III)的化合物中，R1、R2、R3和R4中的至少一个是
式(III)的化合物可以是选自图23所示的化合物中的化合物。
可用于制备脂质粒子制剂的式(IV)的化合物，具有以下结构：
其中：
n是0-150；并且
R1、R2和R3各自独立地选自由氢、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯 基、C2-C20炔基和胆固醇基组成的组；
或其盐。
可用于制备脂质粒子制剂的式(V)的化合物，具有以下结构：
其中
R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自由氢、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的 C2-C20烯基、C2-C20炔基和胆固醇基组成的组；
X1是不存在、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基或
X2是不存在、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、
X3是不存在、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、
或其盐。
示例性的式(V)的化合物包括但不限于以下化合物：
其中n和m各自独立地为0-20；并且
R1和R2各自独立地选自由氢、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、 C2-C20炔基和胆固醇基组成的组；
或其盐。
式(III)、式(IV)和(V)的化合物的通用合成显示在图24中，其中每个R值是独立选择的。
本领域技术人员将领会，在本文所述的方法中，中间化合物的官能团可能需要由合适的保护基保护。 这样的官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。羟基的合适保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷 基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。氨 基，脒基和胍基的合适保护基包括叔丁氧羰基、苄氧羰基等。巯基的合适保护基包括-C(O)-R”(其中R”是烷 基、芳基或芳基烷基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等。羧酸的合适保护基包括烷基酯、芳基或芳基烷基酯。 保护基可以根据本领域技术人员已知的和如本文所述的标准技术来添加或去除。保护基的使用详细描述于 Green，T.W.和P.G.M.Wutz，《有机合成中的保护基》(Protective Groups inOrganic Synthesis)(1999)，第3 版，Wiley(在此通过引用整体并入)。如本领域技术人员将领会的，保护基还可以是聚合物树脂，例如Wang 树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。一般而言，起始组分可从诸如Sigma Aldrich、Lancaster Synthesis， Inc.、Maybridge、Matrix Scientific、TCI和Fluorochem USA等来源获得，或根据本领域技术人员已知的来源合成(参见，例如，《高级有机化学：反应，机理和结构》(Advanced Organic Chemistry:reactions，Mechanisms and Structure)”，第5版(Wiley，2000年12月)，在此通过引用整体并入)。
实施例12：脂质制剂的制备
可以制备脂质体纳米粒子(LNP)。阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质可以按50:10:38.5:1.5的摩 尔比溶于乙醇中。可以按总脂质与ceDNA重量比为大致10:1至30:1来制备脂质纳米粒子(LNP)。简而言 之，将ceDNA在pH 4的10至50mM柠檬酸盐缓冲液中稀释至0.2mg/mL。可以使用注射泵将脂质乙醇 溶液与ceDNA水溶液以约1:5to 1:3(体积/体积)的比率且总流量高于15ml/分钟下混合。然后可以除去乙 醇，并通过透析将外部缓冲液替换为PBS。最后，脂质纳米粒子可以通过0.2μm孔的无菌孔过滤器进行过 滤。脂质纳米粒子的粒度为直径约55-95nm，在一些情况下为直径约70-90nm，这可以通过使用MalvernZetasizer Nano ZS(Malvern，UK)的准弹性光散射来确定。
配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的有效性相关(参见Jayaraman等人，《应用化学》 (Angewandte Chemie)，国际版(2012)，51(34)，8529-8533；Semple等人，Nature Biotechnology 28，172-176 (20l 0)，二者均通过引用整体并入)。优选的pKa范围是约5至约7。使用基于2-(对甲苯氨基)-6-萘磺酸(TNS) 的荧光的测定，确定脂质纳米粒子中各阳离子脂质的pKa。在PBS中以脂质浓度为0.4mM包含阳离子脂 质/DSPC/胆固醇/PEG-脂质(50/10/38.5/1.5mol％)的脂质纳米粒子可以使用本文和别处所述的在线方法来 制备。TNS可以在蒸馏水中制成100μM的储备溶液。囊泡可以在2mL缓冲溶液中稀释至24μM脂质，所 述缓冲溶液含有10mM HEPES、10mM MES、10mM乙酸铵、130mM NaCl，其中pH范围为2.5至11。 可以添加小份的TNS溶液产生1μM的终浓度，并在涡旋混合后，在室温下在SLMAminco系列2发光分 光光度计中使用321nm和445nm的激发和发射波长来测量荧光强度。可以将S曲线最佳拟合分析应用于 荧光数据，并将pKa测量为产生半数最大荧光强度时的pH。
脂质纳米粒子也可以使用以下摩尔25比配制：50％阳离子脂质/10％二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC)/38.5％固醇/1.5％PEG脂质(“PEG-DMG”，即(1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油，平均 PEG分子量为2000)。相对活度可以通过如本文所述在通过尾静脉注射进行施用后4小时测量肝脏中的荧 光素酶表达来确定。比较0.3和1.0mg ceDNA/kg剂量下的活度，并以施用后4小时测量的纳克荧光素酶/ 克肝脏表示。
治疗性ceDNA构建体化合物可以使用以下摩尔比配制：50％阳离子脂质/10％二硬脂酰磷脂酰胆碱 (DSPC)/38.5％胆固醇/1.5％PEG脂质(“PEG-DMA”2-[2-(w-甲氧基(聚乙二醇2000)乙氧基]-N,N-双十四烷基 乙酰胺)。如上所述在通过尾静脉注射进行施用后4小时测量肝脏中的荧光素酶表达来确定。如上所述，比 较0.3和1.0mg mRNA或DNA/kg剂量下的活度，并以施用后4小时测量的纳克荧光素酶/克肝脏表示。
实施例13：来自ceDNA载体的荧光素酶转基因的体内蛋白质表达
在小鼠中评估来自由上述构建体1-8产生的ceDNA载体的转基因的体内蛋白质表达。测试从ceDNA- 质粒构建体1(如实施例1的表5中所述)获得的ceDNA载体，并在小鼠模型中将包含脂质纳米粒子中所含 的ceDNA载体的组合物流体动力注入尾静脉后，论证持续和持久的荧光素酶转基因表达。。在静脉内施 用到
IGS小鼠(Charles RiverLaboratories；WT小鼠)中后，通过IVIS成像测量荧光素酶转基因表达。
该研究在
IGS小鼠静脉内施用后，通过IVIS评估了流体动力荧光素酶表达非病毒基因疗法载 体的生物分布。介质是无菌PBS。在这项研究中，五(5)只CD-1小鼠的两个组，通过在尾静脉中流体动力 注入1.2mL来施用PBS或0.35mg/kg编码荧光素酶的ceDNA。在第3、4、7、14、21、28、31、35和42 天，通过IVIS成像评估荧光素酶表达。简单说，小鼠腹膜内注射150mg/kg的荧光素底物，然后通过IVIS 成像评估全身发光。
体内荧光素酶表达：5-7周的雄性CD-1IGS小鼠(Charles River Laboratories)在第0天通过静脉内流 体动力施用以1.2mL体积施用0.35mg/kg的ceDNA载体构建体1-4Luc(第1组)。每组中的一些动物或在第 28天重新施用同一剂量的ceDNA载体构建体1-4Luc(第1组)。
腹膜内(i.p.)注射150mg/kg荧光素酶底物后，使用
仪器通过体内化学发光来评估来自ceDNA载 体的荧光素酶的表达。IVIS成像在第3天、第4天、第7天、第14天、第21天、第28天、第31天、第 35天和第42天进行，并在第42天处死后将收集的器官离体成像。
在研究过程期间，每天对动物进行称重并监测一般健康和安宁。处死时，通过末端心脏穿刺(terminal cardiac stick)从每只动物收集血液，分成两部分并处理为1)血浆和2)血清，并将血浆速冻，血清用于肝酶 谱，然后速冻。另外，收集肝脏、脾脏、肾脏和腹股沟淋巴结(LN)并通过IVIS离体成像。
通过
荧光素酶ELISA测定(BIOO Scientific/PerkinElmer)、肝脏样品的荧光素酶的 qPCR、肝脏样品的组织病理学和/或血清肝酶谱(VetScanVS2；AbaxisPreventative Care Profile Plus).来评估 肝脏中的荧光素酶表达。
参考文献
在说明书和实施例中列出和公开的所有参考文献，包括专利、专利申请、国际专利申请和出版物，通 过引用整体并入本文。
Claims (33)
1.一种脂质粒子，其包含可电离脂质和具有共价封闭端的非病毒的无衣壳DNA载体(ceDNA载体)，其中所述ceDNA载体包含至少一个可操作地定位在不对称反向末端重复序列(不对称ITR)之间的异源核苷酸序列，其中所述不对称ITR中的至少一个包含功能性末端解离位点和Rep结合位点。
2.根据权利要求1所述的脂质纳米粒子，其中当使用在所述ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化并通过天然和变性凝胶电泳二者进行分析时，与线性和非连续DNA对照相比，所述ceDNA载体显示线性和连续DNA的特征性条带。
3.根据权利要求1或2所述的脂质纳米粒子，其中所述不对称ITR序列中的一个或多个来自选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)的病毒。
4.根据权利要求3所述的脂质纳米粒子，其中所述不对称ITR来自不同的病毒血清型。
5.根据权利要求4所述的脂质纳米粒子，其中所述一个或多个不对称ITR来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12的AAV血清型。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的脂质纳米粒子，其中所述不对称ITR序列中的一个或多个是合成的。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的脂质纳米粒子，其中所述ITR中的一个或多个不是野生型ITR。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的脂质纳米粒子，其中所述不对称ITR中的一个或多个都通过在至少一个选自A、A’、B、B’、C、C’、D和D’的ITR区域中的缺失、插入和/或取代进行修饰。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的脂质纳米粒子，其中所述ceDNA载体包含至少两个不对称ITR，所述至少两个不对称ITR选自：
a.SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：52；以及
b.SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：51。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的脂质纳米粒子，其中所述ceDNA载体由包括以下步骤的方法获得：
a.在诱导在昆虫细胞内产生所述ceDNA载体的有效条件和充分时间下，在至少一种Rep蛋白的存在下，温育包含ceDNA表达构建体的昆虫细胞群，其中所述ceDNA表达构建体编码所述ceDNA载体；和
b.从所述昆虫细胞分离所述ceDNA载体。
11.根据权利要求10所述的脂质纳米粒子，其中所述ceDNA表达构建体选自ceDNA质粒、ceDNA杆粒和ceDNA杆状病毒。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的脂质纳米粒子，其中所述昆虫细胞表达至少一种Rep蛋白。
13.根据权利要求10所述的脂质纳米粒子，其中至少一种Rep蛋白来自选自细小病毒、依赖病毒和腺相关病毒(AAV)的病毒。
14.根据权利要求13所述的脂质纳米粒子，其中至少一种Rep蛋白来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12的AAV血清型。
15.根据权利要求1-15中任一项所述的脂质粒子，其中所述DNA载体由载体多核苷酸获得，其中所述载体多核苷酸编码操作性地定位在两个反向末端重复序列(ITR)之间的异源核酸，其中所述两个ITS彼此不同(不对称)，并且所述ITR中的至少一个是包含功能性末端解离位点和Rep结合位点的功能性ITR，并且所述ITR中的一个相对于所述功能性ITR包含缺失、插入和/或取代；在昆虫细胞中Rep蛋白的存在诱导所述载体多核苷酸的复制和所述DNA载体的产生，所述DNA载体可由包括以下步骤的方法获得：
a.在诱导在昆虫细胞内产生所述无衣壳的非病毒DNA载体的有效条件和充分时间下，在Rep蛋白的存在下，温育包含所述载体多核苷酸的昆虫细胞群，所述载体多核苷酸缺乏病毒衣壳编码序列，其中在没有所述载体的情况下，所述昆虫细胞不包含在所述昆虫细胞内产生无衣壳的非病毒DNA；以及
b.从所述昆虫细胞中收获并分离所述无衣壳的非病毒DNA。
16.根据权利要求10-15中任一项所述的脂质粒子，其中能够证实从所述昆虫细胞中分离的所述无衣壳的非病毒DNA的存在。
17.根据权利要求16所述的脂质粒子，其中通过使用在所述DNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从所述昆虫细胞分离的DNA并在非变性凝胶上分析所消化的DNA物质以证实与线性和非连续DNA相比存在线性和连续DNA的特征性条带，从而能够证实从所述昆虫细胞中分离的所述无衣壳的非病毒DNA的存在。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的脂质粒子，其中所述DNA载体由载体多核苷酸获得，其中所述载体多核苷酸编码操作性地定位在第一和第二AAV2反向末端重复DNA多核苷酸序列(ITR)之间的异源核酸，其中相对于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：51的相应AAV2野生型ITR，所述ITR中的至少一个具有至少一个多核苷酸缺失、插入和/或取代，以在昆虫细胞中在Rep蛋白存在下诱导所述DNA载体的复制，所述DNA载体能够由包括以下步骤的方法获得：
a.在诱导在昆虫细胞内产生所述无衣壳的非病毒DNA的有效条件和充分时间下，在Rep蛋白存在下，温育包含所述载体多核苷酸的昆虫细胞群，所述载体多核苷酸缺乏病毒衣壳编码序列，其中所述昆虫细胞不包含病毒衣壳编码序列；以及
b.从所述昆虫细胞中收获并分离所述无衣壳的非病毒DNA。
19.根据权利要求18所述的脂质粒子，其中能够证实从所述昆虫细胞中分离的所述无衣壳的非病毒DNA的存在。
20.根据权利要求19所述的脂质粒子，其中通过使用在所述DNA载体上具有单个识别位点的限制酶消化从所述昆虫细胞分离的DNA并在非变性凝胶上分析所消化的DNA物质以证实与线性和非连续DNA相比存在线性和连续DNA的特征性条带，从而能够证实从所述昆虫细胞中分离的所述无衣壳的非病毒DNA的存在。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的脂质粒子，其中所述脂质粒子还包含非阳离子脂质、PEG缀合脂质、以及固醇中的一种或多种。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的脂质粒子，其中所述可电离脂质是表1中所述的脂质。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的脂质粒子，其中所述脂质粒子还包含非阳离子脂质，其中所述非离子脂质选自由以下所组成的组：二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基磷脂酰乙醇胺、二甲基磷脂酰乙醇胺、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱酰(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰甘油(POPG)、二反油酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二鲸蜡基磷酸酯、溶血磷脂酰胆碱、以及二亚油酰基磷脂酰胆碱。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的脂质粒子，其中所述脂质粒子还包含缀合脂质，其中所述缀合脂质选自由以下所组成的组：PEG-二酰基甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、PEG化的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS-DAG)、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、以及N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的脂质粒子，其中所述脂质粒子还包含胆固醇或胆固醇衍生物。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的脂质粒子，其中所述脂质粒子包含：
(v)可电离脂质；
(vi)非阳离子脂质；
(vii)抑制粒子聚集的缀合脂质；和
(viii)固醇。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的脂质粒子，其中所述脂质粒子包含：
(e)可电离脂质，其量为所述粒子中存在的总脂质的约20mol％至约90mol％；
(f)非阳离子脂质，其量为所述粒子中存在的总脂质的约5mol％至约30mol％；
(g)抑制粒子聚集的缀合脂质，其量为所述粒子中存在的总脂质的约0.5mol％至约20mol％；和
(h)固醇，其量为所述粒子中存在的总脂质的约20mol％至约50mol％。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的脂质粒子，其中总脂质与DNA载体(质量或重量)比为约10:1至约30:1。
29.一种包含第一脂质纳米粒子和另外的化合物的组合物，其中所述第一脂质纳米粒子包含第一无衣壳的非病毒载体，并且是根据权利要求1-28中任一项所述的脂质纳米粒子。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述另外的化合物被包含在第二脂质纳米粒子中，并且其中所述第一和第二脂质纳米粒子不同。
31.根据权利要求28或29所述的组合物，其中所述另外的化合物被包含在所述第一脂质纳米粒子中。
32.根据权利要求28-30中任一项所述的组合物，其中所述另外的化合物是治疗剂。
33.根据权利要求28所述的组合物，其中所述另外的化合物是第二无衣壳的非病毒载体，其中所述第一和第二无衣壳的非病毒载体不同。
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