BR112020004219A2 - formulações de nanopartículas lipídicas de vetores de dna não viral e sem capsíde - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se, neste relatório, a formulações de nanopartículas lipídicas que compreendem lipídios ionizáveis e vetores de DNA não virais e sem capsídeos com extremidades fechadas covalentemente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULAÇÕES DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS DE VETORES DE DNA NÃO VIRAL E SEM CAPSÍDEOS",

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] O pedido reivindica benefício sob 35 U.S.C $ 119(e) do Pedido Provisório Nº US 62/556.334, depositado em 8 de setembro de 2017, Nº 62/556.333, depositado em 8 de setembro de 2017, Nº 62/556.381, depositado em 9 de setembro de 2017, Nº 62/675.317, depositado em 23 de maio de 2018, Nº 62/675.322, depositado em 23 de maio de 2018, Nº 62/675.324, depositado em 23 de maio de 2018 e Nº 62/675.327, depositado em 23 de maio de 2018, cujo conteúdo de cada um dos mesmos é incorporado neste documento a título de referência na sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporada a título de referência na sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 7 de setembro de 2018, é denominada 080170-090660WOPT SL.bxt e tem

63.790 bytes de tamanho.

CAMPO TÉCNICO

[0003] A presente invenção é direcionada a formulações de nanopartículas lipídicas (LNP) de vetores de DNA não virais e sem capsídeos e seu uso para a entrega de sequências de DNA exógeno a uma célula, tecido, órgão ou organismo alvo.

ANTECEDENTES

[0004] Recentemente, foram relatados vetores de DNA não virais e sem capsídeos com extremidades fechadas covalentemente que contêm transgenes flanqueados por ITRs AAV 2. No entanto, a entrega direcionada desses vetores de DNA às células, in vitro e in vivo,

permanece desafiadora. Por conseguinte, continua a haver uma necessidade na técnica de formulações que abordem esses desafios.

SUMÁRIO

[0005] Em um aspecto, são fornecidas aqui novas formulações lipídicas que compreendem um lipídio ionizável e um vetor não viral sem capsídeo (ceDNA). Os vetores de ceDNA aqui descritos são moléculas de DNA dúplex linear e sem capsídeos, formadas a partir de uma cadeia contínua de DNA complementar com extremidades fechadas —covalentemente (estrutura linear, contínua e não encapsidada), que compreendem uma sequência de repetição terminal invertida (ITR) de 5' e uma sequência ITR de 3' que são diferentes ou assimétricas entre si. Em um aspecto, vetores de DNA não virais sem capsídeo com extremidades fechadas covalentemente são moléculas dúplex lineares, e são obtidos a partir de um vetor polinucleotídico que codifia um ácido nucleico heterólogo operativamente posicionado entre duas sequências de repetição terminais invertidas (ITRs) diferentes (por exemplo, ITRs de AAV), em que pelo menos uma das ITRs compreende um sítio de resolução de terminal e um sítio de ligação à proteína de replicação (RPS) (algumas vezes referido como um sítio de ligação à proteína replicativa), por exemplo, um sítio de ligação à Rep e uma das ITRs compreende uma deleção, inserção e/ou substituição com relação às outras ITR. Ou seja, uma das ITRs é assimétrica em relação à outra ITR. Em uma modalidade, pelo menos uma das ITRs é uma ITR de AAV, por exemplo, uma ITR de AAV do tipo selvagem ou ITR de AAV modificada. Em uma modalidade, pelo menos uma das ITRs é uma ITR modificada em relação à outra ITR - ou seja, o ceDNA compreende ITRs que são assimétricas entre si.

[0006] Em uma modalidade, pelo menos uma das ITRs é uma ITR não funcional.

[0007] Em algumas modalidades, uma ou mais das ITRs não são uma ITR do tipo selvagem.

[0008] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA quando digerido com uma enzima de restrição que tem um único sítio de reconhecimento no vetor de ceDNA e analisado por eletroforese em gel nativa e desnaturante exibe bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com controles de DNA linear e não contínuo.

[0009] Em algumas modalidades, uma ou mais das sequências de ITR assimétricas do vetor de ceDNA são de um vírus selecionado dentre um parvovírus, um dependovírus e um vírus adeno-associado (AAV). Em algumas modalidades, as ITRs assimétricas são de diferentes sorotipos virais. Por exemplo, uma ou mais ITRs assimétricas podem ser de um sorotipo de AAV selecionado dentre AAV1, AAV2, AAV3, AAVA, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV1O, AAV11 e AAV12.

[0010] Em algumas modalidades, uma ou mais das sequências de ITR assimétricas do vetor de ceDNA são sintéticas.

[0011] Em algumas modalidades, pelo menos uma (por exemplo, uma ou ambas) das ITRs assimétricas é modificada por uma deleção, inserção e/ou substituição em pelo menos uma das regiões de ITR selecionadas de A, A', B, BC, C' De D'.

[0012] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende pelo menos duas ITRs assimétricas selecionadas dentre: (a) SEQ ID Nº: 1eSEQIDNº 52; e(b) SEQID Nº 2eSEQID Nº: 51.

[0013] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: (a) incubar uma população de células de insetos que abrigam um construto de expressão de ceDNA na presença de pelo menos uma proteína Rep, em que o construto de expressão de ceDNA codifica o vetor de ceDNA, em condições efetivas e por um tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA nas células de inseto; e (b) isolar o vetor de ceDNA das células de inseto. Sem limitações, o construto de expressão do ceDNA pode ser um plasmídeo ceDNA, um bacmídeo CeDNA ou um baculovírus ceDNA.

[0014] Geralmente, a célula de inseto expressa pelo menos uma proteína Rep. A pelo menos uma proteína Rep pode ser de um vírus selecionado dentre um parvovírus, um dependovírus e um vírus adeno- associado (AAV). Por exemplo, a pelo menos uma proteína Rep pode ser de um sorotipo de AAV selecionado dentre AAV1, AAV2, AAV3, AAVA, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV1O, AAV11 e AAV12.

[0015] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um lipídio descrito em uma publicação listada na Tabela 1.

[0016] Em algumas modalidades dos vários aspectos divulgados neste documento, a presença de ceDNA pode ser confirmada por digestão com uma enzima de restrição com um único sítio de reconhecimento no vetor de ceDNA e analisando o material de DNA digerido em géis desnaturantes e não desnaturantes para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.

[0017] Em algumas modalidades, o vetor de DNA é obtido a partir de um polinucleotídeo de vetor, em que o polinucleotídeo de vetor codifica um ácido nucleico heterólogo operativamente posicionado entre duas sequências de repetição terminal invertidas (ITRs), em que os dois ITS são diferentes entre si (assimétrico), e pelo menos uma das ITRs é uma ITR funcional que compreende um sítio de resolução de terminal funcional e um sítio de ligação Rep, e uma das ITRs compreende uma deleção, inserção ou substituição em relação à ITR funcional; a presença de proteína Rep induzindo a replicação do polinucleotídeo de vetor.

[0018] Em algumas modalidades, a produção do vetor de DNA em uma célula de inseto. Por exemplo, o vetor de DNA sendo obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: (a) incubar uma população de células de insetos que abrigam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codificação do capsídeo viral, na presença de proteína Rep em condições efetivas e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de DNA não viral sem capsídeo dentro das células de inseto, em que as células de inseto não compreendem a produção de DNA não viral sem capsídeo dentro das células de inseto na ausência do vetor; e (b) colher e isolar o DNA não viral sem capsídeo das células de inseto. Em algumas modalidades adicionais, a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada. Por exemplo, a presença do DNA não viral sem capsídeos isolado das células de inseto pode ser confirmada digerindo o DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição com um único sítio de reconhecimento no vetor de DNA e analisando o material de DNA digerido em um gel não desnaturante para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.

[0019] Em algumas modalidades, o vetor de DNA é obtido a partir de um polinucleotídeo de vetor. Por exemplo, o vetor de DNA é obtido à partir de um polinucleotídeo de vetor que codifica um ácido nucleico heterólogo posicionado operacionalmente entre uma primeira e uma segunda sequência de polinucleotídeos de DNA de repetição terminal invertida AAV2 (ITRs), com pelo menos uma das ITRs tendo pelo menos uma deleção, inserção ou substituição de polinucleotídeo em relação à ITR do tipo selvagem de AAV? correspondente de SEQ ID Nº: 1ou SEQ ID Nº: 51 para induzir a replicação do vetor de DNA em uma célula de inseto na presença da proteína Rep. Em algumas modalidades adicionais disso, o vetor de DNA é obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: (a) incubar uma população de células de insetos que abrigam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codificação do capsídeo viral, na presença da proteína Rep, sob condições eficazes e por um tempo suficiente para induzir a produção do DNA não viral não capsídeo dentro das células de inseto, em que as células de inseto não compreendem sequências codificantes de capsídeo viral; e (b) colher e isolar o DNA não viral sem capsídeo das células de inseto. Em algumas modalidades adicionais, a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada. Por exemplo, a presença do DNA não viral sem capsídeos isolado das células de inseto pode ser confirmada digerindo o DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição com um único sítio de reconhecimento no vetor de DNA e analisando o material de DNA digerido em um gel não desnaturante para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.

[0020] Em algumas modalidades, a nanopartícula lipídica pode ainda compreender um lipídio não catiônico, um lipídio conjugado com PEG, um estero!l ou qualquer combinação dos mesmos.

[0021] Em algumas modalidades, a nanopartícula lipídica compreende ainda um lipídio não catiônico, em que o lipídio não iônico é selecionado do grupo que consiste em distearoil-sn- glicerofosfoetanolamina, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfa- tidofoscolina (DOPC), dipalmitoilfenofilfidofosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicero! (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamina — (DOPE), — palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidoletilamina (POPE), dipalmitoilfosfatidil- etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), monometilfosfatidiletanolamina (como 16-O-monometil PE), dimetil-fosfatidiletanolamina (como PE-16- dimetil-etanolamina), 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-

fosfatidietanolamina (SOPE), fosfatidilcolihna de soja hidrogenada (HSPC), fosfato de ovo idilcolina (EPC), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), esfingomielina (SM), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), diestroilfosfatidilglicerol (DSPG), dierucoilfosfatidilcolina (DEPC), palmitoiloleioIfosfatidilglicerol (POPG), dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE), lecitina, lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, esfingomielina de ovo (ESM), cefalinay cardiolipinay fosfatidicídeo, cerebrosídeos, dicetilfosfato, lisofosfatidilcolina, dilinoleilitfosfatidilcolina e lipídios não catiônicos descritos, por exemplo, nos documentos W02017/099823 ou US2018/0028664.

[0022] Em algumas modalidades, a partícula lipídica compreende ainda um lipídio conjugado, em que o lipídio conjugado, em que o lipídio conjugado é selecionado do grupo que consiste em PEG-diacilglicero! (DAG) (como l-(monometóxi-polietilenoglico!)-2,3-dimiristoilglicero] (PEG-DMG)), PEG-dialquiloxipropil (DAA), PEG-fosfolipídio, PEG- ceramida (Cer), uma fosfatidiletanoloamina peguilada (PEG-PE), diacilglicerol succinato de PEG (PEGS-DAG) (como 4-0-(2',3"- di(tetradecanoilóxi)propil-1-O0 -(w-metóxi(polietóxi)etil) butanodioato (PEG-S-DMG)), PEG dialcoxipropilcarbam, N-(carbonil- metoxipolietileno glicol) 2000) sal de sódio-1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina, e aqueles descritos na Tabela 2.

[0023] Em algumas modalidades, a partícula lipídica compreende ainda colesterol ou um derivado de colesterol descrito na publicação PCT WO2Z009/127060 ou na publicação de patente US US2010/0130588.

[0024] Em algumas modalidades, a partícula lipídica compreende um lipídio ionizável, um lipídio não catiônico, um lipídio conjugado que inibe a agregação de partículas e um esterol. A quantidade do lipídio ionizável, o lipídio não catiônico, o lipídio conjugado que inibe a agregação de partículas e o esterol podem variar independentemente. Em algumas modalidades, a nanopartícula lipídica compreende um lipídio ionizável em uma quantidade de cerca de 20% em mol a cerca de 90% em mol do lipídio total presente na partícula, um lipídio não catiônico em uma quantidade de cerca de 5% em mol a cerca de 30% em mol do lipídio total presente na partícula, um lipídio conjugado que inibe a agregação de partículas em uma quantidade de cerca de 0,5% em mol a cerca de 20% em mol do lipídio total presente na partícula e um esterol em uma quantidade de cerca de 20% em mol a cerca de 50% em mol do lipídio total presente na partícula.

[0025] A razão entre lipídios totais e o vetor de DNA pode variar conforme desejado. Por exemplo, a razão entre lipídio total e vetor de DNA (massa ou peso) pode ser de cerca de 10:1 a cerca de 30:1.

[0026] Também é fornecida aqui uma composição que compreende uma primeira nanopartícula lipídica e um composto adicional. A primeira nanopartícula lipídica compreende um lipídio ionizável e um primeiro vetor não viral sem capsídeo. O vetor não viral do capsídeo, livre do capsídeo, quando digerido com uma enzima de restrição que tem um único sítio de reconhecimento no vetor de DNA, tem a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo quando analisado em um gel não desnaturante.

[0027] Em algumas modalidades, o composto adicional é englobado em uma segunda nanopartícula lipídica. A primeira e a segunda nanopartículas lipídicas podem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda nanopartículas lipídicas são diferentes. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda nanopartículas lipídicas são as mesmas, isto é, o composto adicional é abrangido na primeira nanopartícula lipídica.

[0028] Qualquer molécula desejada pode ser usada como composto adicional. Em algumas modalidades, o composto adicional é um segundo vetor não viral do capsídeo. O primeiro e o segundo vetores não virais do capsídeo podem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo vetores não virais do capsídeo são diferentes.

[0029] Em algumas modalidades, o composto adicional é um agente terapêutico.

[0030] Esses e outros aspectos da invenção são descritos em mais detalhes abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0031] Este arquivo de patente ou pedido contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias desta patente ou publicação de pedido de patente com desenho (ou desenhos) em cores serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.

[0032] A Figura 1A ilustra uma estrutura exemplificadora de um vetor de ceDNA. Nessa modalidade, o vetor de ceDNA exemplificador compreende um cassete de expressão contendo o promotor CAG, WPRE e BGHpA. Um quadro de leitura aberto (ORF) que codifica um transgene de Luciferase é inserido no sítio de clonagem (R3/R4) entre o promotor CAG e WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais invertidas (ITRs) - a ATR do tipo selvagem AAV2 a montante (extremidade 5') e uma ITR modificada a jusante (extremidade 3') do cassete de expressão; portanto, as duas ITRs que flanqueiam o cassete de expressão são assimétricas entre si.

[0033] A Figura 1B ilustra uma estrutura exemplificadora de um vetor de ceDNA com um cassete de expressão contendo o promotor CAG, WPRE e BGHpA. Um quadro de leitura aberto (ORF) que codifica o transgene de Luciferase é inserido no sítio de clonagem entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais invertidas (ITRs) - uma ITR modificada a montante (extremidade 5') e uma ITR do tipo selvagem na jusante (extremidade 3') do cassete de expressão.

[0034] A Figura 1C ilustra uma estrutura exemplificadora de um vetor de ceDNA com um cassete de expressão contendo um intensificador/promotor, um quadro de leitura aberto (ORF) para inserção de um transgene, um elemento pós-transcricional (WPRE) e um sinal polyA. Um quadro de leitura aberto (ORF) permite a inserção de um transgene no sítio de clonagem entre o promotor CAG e o WPRE. O cassete de expressão é flanqueado por duas repetições terminais invertidas (ITRs) que são assimétricas entre si; uma ITR modificada a montante (extremidade 5') e uma ITR modificada a jusante (extremidade 3') do cassete de expressão, em que a ITR 5' e a ITR 3' são ambas ITRs modificadas, mas têm modificações diferentes (por exemplo, não têm as mesmas modificações).

[0035] A Figura 2A fornece a estrutura de haste-alça em forma de T de uma ITR do tipo selvagem de AAV2 com a identificação de braço AA', braço BB', braço CC', dois sítios de Ligação Rep (RBE e RBE')eo sítio de resolução de terminal (trs). O RBE contém uma série de 4 tetrâmeros dúplex que se acredita que interagem com o Rep 78 ou o Rep 68. Além disso, também se acredita que o RBE' interaja com o complexo Rep montado na ITR do tipo selvagem ou ITR mutada no construto. As regiões D e D' contêm sítios de ligação ao fator de transcrição e outra estrutura conservada. A Figura 2B mostra atividades de nicking e ligação catalisadas por Rep propostas na ITR do tipo selvagem da Figura 2A, incluindo a estrutura de haste-alça em forma de T do ITR do tipo selvagem do AAV2 com identificação de braço AA', braço BB', braço CC', dois sítios de Ligação Rep (RBE e RBE') e o sítio de resolução de terminal (trs) e a região D e D'

compreendendo vários sítios de ligação ao fator de transcrição e outra estrutura conservada.

[0036] A Figura 3A fornece a estrutura primária (sequência polinucleotídica) (esquerda) e a estrutura secundária (direita) das porções contendo RBE do braço AA' e o braço CC' e BB' do tipo selvagem esquerdo ITR de AAV2 (SEQ ID Nº: 540). A Figura 3B mostra uma sequência de ITR mutada exemplificadora (também dita como uma ITR modificada) para a ITR esquerda. É mostrada a estrutura primária (esquerda) e a estrutura secundária prevista (direita) da porção RBE do braço AA', o braço C e o braço BB' de uma ITR esquerda mutada exemplificadora (ITR-1, esquerda) (SEQ ID Nº: 113). A Figura 3C mostra a estrutura primária (esquerda) e a estrutura secundária (direita) da porção que contém RBE do laço A-A' e os braços BB' e CC' de ITR de AAV? direita do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 541). A Figura 3D mostra uma ITR modificada direita exemplificadora. É mostrada a estrutura primária (esquerda) e a estrutura secundária prevista (direita) da porção RBE do braço AA', o BB' e o braço C de uma ITR direita mutante exemplificadora (ITR-1, direita) (SEQ ID Nº: 114). Qualquer combinação de ITR esquerda e direita (por exemplo, ITRs de AAV2 ou outro sorotipo viral ou ITR sintética) pode ser usada, desde que a ITR esquerda seja assimétrica ou diferente da ITR direita. Cada uma das Figuras 3A-3D mostra que sequências polinucleotídicas se referem à sequência usada no genoma do plasmídeo ou bacmídeo/baculovírus usado para produzir o ceDNA como descrito no presente documento. Também estão incluídas em cada uma das Figuras 3A-3D estruturas secundárias de ceDNA correspondentes inferidas a partir das configurações do vetor de cCeDNA no genoma do plasmídeo ou bacmídeo/baculovirus e os valores previstos de energia livre de Gibbs.

[0037] A Figura 4A é um esquema que ilustra um processo a montante para produzir células de inseto infectadas com baculovírus (BIICs) que são úteis na produção de ceDNA no processo descrito no esquema na Figura 4B.

A Figura 4C ilustra um método e processo bioquímico para confirmar a produção do vetor de ceDNA.

As Figuras 4D e 4E são ilustrações esquemáticas que descrevem um processo para identificar a presença de ceDNA no DNA colhido de péletes de células obtidas durante os processos de produção de ceDNA na Figura 4B.

À Figura 4E mostra DNA que tem uma estrutura não contínua.

O ceDNA pode ser cortado por uma endonuclease de restrição, que tem um único sítio de reconhecimento no vetor de ceDNA, e gerar dois fragmentos de DNA com tamanhos diferentes (1kb e 2kb) em condições neutras e desnaturantes.

A Figura 4E também mostra um ceDNA que tem uma estrutura linear e contínua.

O vetor de ceDNA pode ser cortado pela endonuclease de restrição e gerar dois fragmentos de DNA que migram como 1lkb e 2kb em condições neutras, mas em condições desnaturantes, as fitas permanecem conectadas e produzem fitas únicas que migram como 2kb e 4kb.

A Figura 4D mostra bandas esquemáticas esperadas para um ceDNA exemplificador deixado sem cortes ou digerido com uma endonuclease de restrição e depois submetido a eletroforese em um gel nativo ou em um gel desnaturante.

O esquema mais à esquerda é um gel nativo e mostra várias bandas sugerindo que, em sua forma dúplex e sem cortes, o ceDNA existe em pelo menos estados monoméricos e diméricos, visíveis como um monômero menor de migração mais rápida e um dímero de migração mais lenta com o dobro do tamanho do monômero.

O segundo esquema da esquerda mostra que quando o ceDNA é cortado com uma endonuclease de restrição, as bandas originais desaparecem e as bandas de migração mais rápida (por exemplo, menores) aparecem, correspondendo aos tamanhos de fragmentos esperados após a clivagem.

Sob condições desnaturantes, o DNA dúplex original é de fita simples e migra como espécie duas vezes maior que o observado no gel nativo, devido ao fato de que as fitas complementares estão ligadas covalentemente. Assim, no segundo esquema da direita, o ceDNA digerido mostra uma distribuição de faixas similar à observada no gel nativo, mas as bandas migram como fragmentos duas vezes o tamanho de seus equivalentes de gel nativos. O esquema mais à direita mostra que o ceDNA sem cortes em condições de desnaturação migra como um círculo aberto de fita simples e, portanto, as bandas observadas têm o dobro do tamanho daquelas observadas em condições nativas em que o círculo não está aberto. Nessa figura, "kb" é usado para indicar o tamanho relativo das moléculas de nucleotídeo com base, dependendo do contexto, no comprimento da cadeia de nucleotídeos (por exemplo, para as moléculas de fita simples observadas em condições de desnaturação) ou no número de pares de bases (por exemplo, para as moléculas de fita dupla observadas em condições nativas).

[0038] A Figura 5 é uma imagem exemplificadora de um gel desnaturante executando exemplos de vetores de ceDNA com (+) ou sem (-) digestão com endonucleases (EcoR! para construtos de ceEDNA 1 e 2; BamH1 para construtos de ceDNA 3 e 4; Spel para construtos de cCeDNA 5 e 6 e Xhol para construto de ceDNA 7 e 8). Os tamanhos das bandas destacadas com um asterisco foram determinados e fornecidos na parte inferior da imagem.

[0039] A Figura 6A é um Rep-bacmídeo exemplificador no plasmídeo pFBDLSR que compreende as sequências de ácido nucleico para as proteínas Rep Rep52 e Rep78. Esse exemplo de Rep-bacmídeo compreende: fragmento de promotor IE1 (SEQ ID Nº: 66); sequência de nucleotídeos Rep78, incluindo a sequência Kozak (SEQ ID Nº: 67), sequência promotora de poliedro para a sequência de nucleotídeos Rep52 (SEQ ID Nº: 68) e Rep58, começando com a sequência Kozak gcegecace) (SEQ ID Nº: 69). A Figura 6B é um esquema de um exemplo de plasmídeo ceDNA-1, com a ITR wt-L, promotor CAG, transgene de luciferase, WPRE e sequência de poliadenilação e ITR mod-R.

[0040] A Figura 7A mostra resultados de um ensaio de expressão proteica in vitro medindo a atividade da luciferase (eixo i, RQ (Luc)) em células HEK293 48 horas após a transfecção de 400 ng (preto), 200 ng (cinza) ou 100 ng (branco) dos construtos identificados no eixo x (construto-1, construto-3, construto-5, construto-7 (Tabela 5 no Exemplo 1). A Figura 7B mostra à atividade da luciferase (eixo i, RQ (Luc)) medida nas células HEK293 48 horas após a transfecção de 400 ng (preto), 200 ng (cinza) ou 100 ng (branco) dos construtos identificados no eixo x (construto-2, construto-4, construto-6, construto- 8) (Tabela 5). Também são fornecidas atividades de luciferase medidas em células HEK293 tratadas com Fugene sem plasmídeos ("Fugene") ou em células HEK293 não tratadas ("Não tratadas").

[0041] A Figura 8A mostra viabilidade das células HEK293 (eixo i) 48 horas após a transfecção de 400 ng (preto), 200 ng (cinza) ou 100 ng (branco) dos construtos identificados no eixo x (construto-1, construto-3, construto-5, construto-7). A Figura 8B mostra viabilidade das células HEK293 (eixo i) 48 horas após a transfecção de 400 ng (preto), 200 ng (cinza) ou 100 ng (branco) dos construtos identificados no eixo x (construto-2, construto-4, construto-6, construto-8).

[0042] As Figuras 9 a 11 são gráficos de barras que mostram o tamanho médio das nanopartículas lipídicas e o encapsulamento de ceDNA de algumas nanopartículas lipídicas exemplificadoras preparadas com tampões que compreendem sais diferentes a uma razão N/P constante (Figura 9) ou a razões N/P variáveis (Figuras 10 e1l1l).

[0043] A Figura 12 é um gráfico de barras que mostra o efeito do soro/BS5SA no encapsulamento em nanopartículas lipídicas exemplificadoras.

[0044] A Figura 13 é um gráfico de barras que mostra a liberação de ceDNA a partir de nanopartículas lipídicas exemplificadoras na presença de lipossomas de dioleoilfosfatidilserina (DOPS).

[0045] A Figura 14 é um gráfico de barras que mostra o efeito do soro/BS5SA no encapsulamento em nanopartículas lipídicas exemplificadoras.

[0046] A Figura 15 é um gráfico de barras que mostra a liberação de ceDNA a partir de nanopartículas lipídicas exemplificadoras na presença de lipossomos de dioleoilfosfatidilserina (DOPS).

[0047] A Figura 16 mostra a ligação de ApoE de algumas nanopartículas lipídicas exemplificadoras.

[0048] A Figura 17 é um gráfico de barras mostrando a expressão HEK293 de ceDNA exemplificador.

[0049] A Figura 18 são fotografias de eletroforese em gel mostrando a expressão HEK293 de ceDNA exemplificador.

[0050] A Figura 19 é um gráfico de barras mostrando a expressão HEK293 de ceDNA exemplificador.

[0051] A Figura 20 mostra alguns exemplos de compostos de Fórmulas (1) e (11) descritos no Exemplo 10.

[0052] A Figura 21 é um esquema sintético genérico para síntese de compostos de Fórmulas (1) e (II) divulgados no Exemplo 10.

[0053] A Figura 22 é um esquema sintético genérico para síntese de compostos de Fórmulas (1) e (II) divulgados no Exemplo 10.

[0054] A Figura 23 mostra alguns compostos exemplificadores de Fórmula (Ill) descritos no Exemplo 11.

[0055] A Figura 24 representa esquemas de síntese genéricos para síntese de compostos de Fórmulas (III), (IV) e (V) descritos no Exemplo

11.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0056] A menos que de outra forma definido neste documento, os termos científicos e técnicos usados em conexão com o presente pedido terão os significados que são comumente entendidos pelos versados na técnica a que essa divulgação pertence. Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes específicos, etc., descritos aqui e, como tal, podem variar. À terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definida apenas pelas reivindicações. Definições de termos comuns em imunologia e biologia molecular podem ser encontradas em The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19º edição, publicado pela Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6º Edição, publicado por Lippincott Williams & amp; Wilkins, Philadelphia, PA, EUA (2013), Knipe, DM e Howley, PM (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, publicado pela Blackwell Science Ltd, 1999-2012 (ISBN 9783527600908); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology por Werner Luttmann, publicado por Elsevier, 2006; ) aneway'Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, publicado por J ones and Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green e Joseph Sambrook, Molecular Cloning: À Laboratory Manual, 4º ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EUA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al, Methods Basic in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc.,

Nova York, EUA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, J on Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), | ohn Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X,9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; e Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), os conteúdos dos quais são todos aqui incorporados a título de referência na sua totalidade.

[0057] Como usado neste documento, o termo "nanopartícula lipídica" se refere a uma vesícula formada por um ou mais componentes lipídicos. Nanopartículas lipídicas são tipicamente usadas como carreadores para a entrega de ácidos nucleicos no contexto do desenvolvimento farmacêutico. As mesmas trabalham fundindo-se com uma membrana celular e reposicionando sua estrutura lipídica para entregar um fármaco ou ingrediente farmacêutico ativo (API). Geralmente, as composições de nanopartículas lipídicas para essa distribuição são compostas por lipídios ionizáveis ou catiônicos sintéticos, fosfolipídios (especialmente compostos com um grupo fosfatidilcolina), colesterol e um lipídio de polietilenoglicol (PEG); no entanto, essas composições também podem incluir outros lipídios. À composição da soma dos lipídios tipicamente determina as características da superfície e, portanto, o teor de proteína (opsonização) em sistemas biológicos, impulsionando assim as propriedades de biodistribuição e de captação celular.

[0058] Como usado neste documento, o termo "lipossomo'" se refere a moléculas lipídicas montadas em uma configuração esférica que encapsulam um volume aquoso interno que é segregado de um exterior aquoso. Lipossomas são vesículas que têm pelo menos uma bicamada lipídica. Os lipossomas são tipicamente usados como carreadores para entrega de fármacos/agentes terapêuticos no contexto do desenvolvimento farmacêutico. Os mesmos trabalham fundindo-se com uma membrana celular e reposicionando sua estrutura lipídica para entregar um fármaco ou ingrediente farmacêutico ativo. As composições de lipossomas para essa entrega são tipicamente compostas por fosfolipídios, especialmente compostos com um grupo fosfatidilcolina, no entanto, essas composições também podem incluir outros lipídios.

[0059] Como usado neste documento, o termo "lipídio ionizável" se refere a lipídios com pelo menos um grupo protonável ou desprotonável, de modo que o lipídio seja carregado positivamente a um pH igual ou inferior ao pH fisiológico (por exemplo, pH 7,4) e neutro em um segundo pH, preferencialmente igual ou superior ao pH fisiológico. Será entendido por um versado na técnica que a adição ou remoção de prótons em função do pH é um processo de equilíbrio e que a referência a um lipídio carregado ou neutro se refere à natureza das espécies predominantes e não exige que todo o lipídio esteja presente na forma carregada ou neutra. Geralmente, os lipídios ionizáveis têm uma pKa do grupo protonável na faixa de cerca de 4 a cerca de 7. Os lipídios ionizáveis também são aqui referidos como lipídios catiônicos.

[0060] Como usado neste documento, o termo "lipídio não catiônico" se refere a qualquer lipídio anfipático, bem como a qualquer outro lipídio neutro ou lipídio aniônico. Por conseguinte, o lipídio não catiônico pode ser um lipídio neutro, não carregado, zwitteriônico ou aniônico.

[0061] Como usado neste documento, o termo "lipídio conjugado" se refere a uma molécula lipídica conjugada com uma molécula não lipídica, como um PEG, polioxazolina, poliamida ou polímero (por exemplo, polímero catiônico).

[0062] Como usado neste documento, o termo "excipiente" se refere a ingredientes farmacologicamente inativos que são incluídos em uma formulação com a API, por exemplo, ceDNA e/ou nanopartículas lipídicas para aumentar e/ou estabilizar a formulação ao produzir uma forma de dosagem. As categorias gerais de excipientes incluem, por exemplo, agentes de volume, cargas, diluentes, antiaderentes, aglutinantes, — revestimentos, — desintegrantes, — sabores, cores, lubrificantes, deslizantes, sorventes, conservantes, adoçantes e produtos utilizados para facilitar a absorção ou solubilidade de fármacos ou para outras considerações farmacocinéticas.

[0063] Como usado neste documento, os termos "sequência nucleotídica heteróloga" e "transgene" são usados de forma intercambiável e se referem a um ácido nucleico de interesse (que não seja um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de capsídeo) que é incorporado e pode ser entregue e expresso por um vetor de ceEDNA como aqui divulgado. Transgenes de interesse incluem, sem limitação, ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos, preferencialmente terapêuticos (por exemplo, para uso médico, diagnóstico ou veterinário) ou polipeptídeos imunogênicos (por exemplo, para vacinas). Em algumas modalidades, ácidos nucleicos de interesse incluem ácidos nucleicos que são transcritos no RNA terapêutico. Os transgenes incluídos para uso nos vetores de ceDNA da invenção incluem, sem limitação, aqueles que expressam ou codificam um ou mais polipeptídeos, peptídeos, ribozimas, aptâmeros, ácidos nucleicos peptídicos, siRNAs, RNAis, miRNAs, INncRNAs, oligo-antissenso ou polinucleotídeos, anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno ou qualquer combinação dos mesmos.

[0064] Como usado neste documento, os termos "cassete de expressão" e "cassete de transcrição" são usados de forma intercambiável e se referem a um trecho linear de ácidos nucleicos que inclui um transgene que está operacionalmente ligado a um ou mais promotores ou outras sequências reguladoras suficientes para direcionar transcrição do transgene, mas que não compreende sequências que codificam o capsídeo, outras sequências de vetores ou regiões de repetição terminal invertidas. Um cassete de expressão pode adicionalmente compreender uma ou mais sequências que atuam em cis (por exemplo, promotores, intensificadores ou repressores), um ou mais Íntrons e um ou mais elementos reguladores pós-transcricionais.

[0065] Como usado neste documento, o termo "repetição terminal" ou "TR" inclui qualquer repetição terminal viral ou sequência sintética que compreende pelo menos uma origem mínima necessária de replicação e uma região que compreende uma estrutura em gancho de cabelo palíndromo. Uma sequência de ligação a Rep ("RBS") e um sítio de resolução de terminal ("TRS") juntos constituem uma "origem mínima de replicação necessária" e, portanto, o TR compreende pelo menos uma RBS e pelo menos um TRS. TRs que são o complemento inverso um do outro dentro de um determinado trecho de sequência polinucleotídica são tipicamente referidos como "repetição terminal invertida" ou "ITR". No contexto de um vírus, as ITRs mediam replicação, empacotamento de vírus, integração e resgate de provírus. Como foi inesperadamente encontrado na invenção, as TRs que não são complementos inversos em todo o seu comprimento ainda podem desempenhar as funções tradicionais das ITRs e, portanto, o termo ITR é usado neste documento para se referir a uma TR em um genoma CeDNA ou vetor de ceDNA que tem a capacidade de mediar a replicação do vetor de ceDNA. Será entendido por um versado na técnica que em configurações complexas de ceDNA podem estar presentes mais de duas ITRs ou pares de ITR assimétricos. A ITR pode ser uma ITR de AAV ou um ITR de não AAV ou pode ser derivada de uma ITR de AAV ou um ITR de não AAV. Por exemplo, a ITR pode ser derivada da família Parvoviridae, que inclui parvovírus e dependovírus (por exemplo,

parvovírus canino, parvovírus bovino, parvovírus de camundongo, parvovírus suíno, parvovírus suíno, parvovírus humano B-19) ou o grampo SV40 que serve como origem. A replicação do SV40 pode ser usada como uma ITR, que pode ser modificado ainda mais por truncamento, substituição, exclusão, inserção e/ou adição. Os vírus da família Parvoviridae consistem em duas subfamílias: Parvovirinae, que infecta vertebrados, e Densovirinae, que infecta invertebrados. Os dependoparvovírus incluem a família viral dos vírus adeno-associados (AAV) que têm a capacidade de replicação em hospedeiros vertebrados, incluindo, sem limitação, espécies humanas, primatas, bovinas, caninas, equinas e ovinas.

[0066] Como usado neste documento, o termo "ITRs assimétricas" se refere a um par de ITRs dentro de um único genoma de ceDNA ou vetor de ceDNA que não são complementos inversos em todo o seu comprimento. A diferença na sequência entre as duas ITRs pode ser devida à adição, deleção, truncamento ou mutação pontual de nucleotídeos. Em uma modalidade, uma ITR do par pode ser uma sequência AAV do tipo selvagem e a outra uma sequência sintética ou não do tipo selvagem. Em outra modalidade, nenhuma ITR do par é uma sequência de AAV do tipo selvagem e as duas ITRs diferem em sequência uma da outra. Por conveniência aqui, uma ITR localizado 5' para (a montante) de um cassete de expressão em um vetor ceDNA é referido como uma "ITR 5" ou uma "ITR esquerda", e uma ITR localizada a 3' para (a jusante de) um cassete de expressão em um vetor de ceDNA é referido como "ITR 3" ou "ITR direita".

[0067] Como usado neste documento, o termo "genoma de ceDNA" se refere a um cassete de expressão que incorpora ainda pelo menos uma região de repetição terminal invertida. Um genoma de ceDNA pode ainda compreender uma ou mais regiões espaçadoras. Em algumas modalidades, o genoma de ceDNA é incorporado como um polinucleotídeo dúplex intermolecular de DNA em um plasmídeo ou genoma viral.

[0068] Como usado neste documento, o termo "região espaçadora de ceDNA" se refere a uma sequência intermediária que separa elementos funcionais no vetor de ceDNA ou no genoma ceDNA. Em algumas modalidades, as regiões espaçadoras de ceDNA mantêm dois elementos funcionais a uma distância desejada para a funcionalidade ideal. Em algumas modalidades, as regiões espaçadoras de ceDNA fornecem ou aumentam a estabilidade genética do genoma de ceDNA dentro, por exemplo, de um plasmídeo ou baculovírus. Em algumas modalidades, as regiões espaçadoras de ceDNA facilitam a manipulação genética pronta do genoma de ceDNA, fornecendo uma localização conveniente para locais de clonagem e similares. Por exemplo, em certos aspectos, um oligonucleotídeo "poliligante" contendo vários sítios de endonuclease de restrição ou uma sequência de quadro de leitura não aberta projetada para não ter nenhum sítio de ligação conhecido à proteína (por exemplo, fator de transcrição) pode ser posicionado no genoma do ceDNA para separar o fatores de ação cis, por exemplo, inserção de 6mer, 12mer, 18mer, 24mer, 48mer, 86mer, 176mer, etc. entre o sítio de resolução de terminal e o elemento regulador da transcrição a montante. Do mesmo modo, o espaçador pode ser incorporado entre a sequência do sinal de poliadenilação e o sítio de resolução 3'-terminal.

[0069] Conforme usado neste documento, os termos "sítio de ligação Rep", elemento de ligação Rep, "RBE" e "RBS"são usados de forma intercambiável e se referem a um sítio de ligação para a proteína Rep (por exemplo, AAV Rep 78 ou AAV Rep 68) que por ligação de uma proteína Rep permite que a proteína Rep realize sua atividade de endonuclease sítio-específica na sequência que incorpora o RBS. Uma sequência RBS e seu complemento inverso juntos formam um único

RBS. As sequências RBS são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, 5"-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID Nº: 531), uma sequência RBS identificada no AAV2. Qualquer sequência RBS conhecida pode ser utilizada nas modalidades da invenção, incluindo outras sequências conhecidas de AAV RBS e outras sequências naturalmente conhecidas ou sintéticas de RBS. Sem estar limitado pela teoria, pensa-se que o domínio da nuclease de uma proteína Rep se liga à sequência nucleotídica dúplex GCTC e, portanto, as duas proteínas Rep AAV conhecidas se ligam diretamente e se montam de forma estável no oligonucleotídeo dúplex, 5-(GCGC) (GCTC) (GCTC) (GCTC)-3' (SEQ ID Nº: 531). Além disso, os conformes agregados solúveis (isto é, número indefinido de proteínas Rep inter-associadas) se dissociam e se ligam a oligonucleotídeos que contêm sítios de ligação a Rep. Cada proteína Rep interage com as bases nitrogenadas e a estrutura principal do fosfodiéster em cada fita. As interações com as bases nitrogenadas fornecem especificidade de sequência, enquanto as interações com o esqueleto de fosfodiéster são não ou menos específicas da sequência e estabilizam o complexo proteína-DNA.

[0070] Conforme usado neste documento, os termos "sítio de resolução de terminal" e "TRS" são usados de forma intercambiável neste documento e se referem a uma região na qual Rep forma uma ligação tirosina-fosfodiéster com a 5' timidina gerando um 3' OH que serve como um substrato para extensão de DNA através de uma polimerase de DNA celular, por exemplo, DNA pol delta ou DNA pol epsilon. Alternativamente, o complexo Rep-timidina pode participar de uma reação de ligação coordenada. Em algumas modalidades, um TRS abrange minimamente uma timidina não emparelhada com base. Em algumas modalidades, a eficiência de corte do TRS pode ser controlada pelo menos em parte por sua distância dentro da mesma molécula do RBS. Quando o substrato aceitador é a ITR complementar, o produto resultante é um dúplex intramolecular. As sequências TRS são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, 5:GGTTGA-3' (SEQ ID Nº: 45), a sequência hexanucleotídica identificada no AAV2. Qualquer sequência TRS conhecida pode ser usada nas modalidades da invenção, incluindo outras sequências TRS de AAV conhecidas e outras sequências TRS naturalmente conhecidas ou sintéticas, como AGTT (SEQ ID Nº: 46), GGTTGG (SEQ ID Nº: 47), AGTTGG (SEQ ID Nº: 48), AGTTGA (SEQ ID Nº: 49) e outros motivos como RRTTRR (SEQ ID Nº: 50).

[0071] Como usado neste documento, o termo "plasmídeo ceDNA" se refere a um plasmídeo que compreende um genoma de ceDNA como um dúplex intermolecular.

[0072] Como usado neste documento, o termo "ceDNA-bacmídeo" se refere a um genoma de baculovírus infeccioso que compreende um genoma de ceDNA como um dúplex intermolecular que tem a capacidade de se propagar em E. coli como um plasmídeo e, portanto, pode operar como um vetor de vaivém para baculovírus.

[0073] Como usado neste documento, o termo "ceDNA- baculovírus" se refere a um baculovírus que compreende um genoma de ceDNA como um dúplex intermolecular dentro do genoma de baculovírus.

[0074] Como usado neste documento, os termos "célula de inseto infectada por ceDNA-baculovírus" e "ceDNA-BIIC" são usados de forma intercambiável e se referem a uma célula hospedeira de invertebrado (incluindo, sem limitação uma célula de inseto (por exemplo, uma célula Sf9)) infectados com um ceDNA-baculovírus.

[0075] Conforme usado neste documento, os termos "vetor de DNA fechado", "vetor de ceDNA" e "ceDNA" são usados de forma intercambiável e se referem a um vetor de DNA sem capsídeos sem vírus com pelo menos uma extremidade covalentemente fechada (ou seja, um dúplex intramolecular). Em algumas modalidades, o ceDNA compreende duas extremidades fechadas covalentemente.

[0076] Conforme definido neste documento, "repórteres" se referem a proteínas que podem ser usadas para fornecer leituras detectáveis. Os repórteres geralmente produzem um sinal mensurável, como fluorescência, cor ou luminescência. As sequências codificadoras de proteínas repórter codificam proteínas cuja presença na célula ou organismo é facilmente observada. Por exemplo, proteínas fluorescentes fazem com que uma célula fluorescente quando excitada com luz de um comprimento de onda específico, as luciferases fazem com que uma célula catalise uma reação que produz luz, e enzimas como a B-galactosidase convertem um substrato em um produto colorido. Polipeptídeos repórter exemplares úteis para fins experimentais ou de diagnóstico incluem, sem limitação B-lactamase, B- galactosidase (LacZ), fosfatase alcalina (AP), timidina cinase (TK), proteína verde fluorescente (GFP) e outras proteínas fluorescentes, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), luciferase e outras bem conhecidas na técnica.

[0077] Como usado neste documento, o termo "proteína efetora" se refere a um polipeptídeo que fornece uma leitura detectável, como, por exemplo, um polipeptídeo repórter, ou mais apropriadamente, como um polipeptídeo que mata uma célula, por exemplo, uma toxina ou um agente que torne uma célula suscetível de matar com um agente escolhido ou a falta dele. Proteínas efectoras incluem qualquer proteína ou peptídeo que directamente alvos ou dano do DNA e/ou RNA da célula hospedeira. Por exemplo, proteínas efetoras podem incluir, sem limitação, uma endonuclease de restrição que tem como alvo uma sequência de DNA da célula hospedeira (seja genômica ou em um elemento extracromossômico), uma protease que degrada um alvo polipeptídico necessário para a sobrevivência celular, um inibidor da

DNA girase e uma toxina do tipo ribonuclease. Em algumas modalidades, a expressão de uma proteína efectora controlado por um circuito biológico sintético, como descrito no presente documento pode participar como um fator no outro circuito biológico sintético para expandir a gama e, assim, a complexidade de uma responsividade do sistema de circuito biológica.

[0078] Reguladores da transcrição se referem a ativadores e repressores da transcrição que ativam ou reprimem a transcrição de um gene de interesse. Promotores são regiões de ácido nucleico que iniciam a transcrição de um gene específico. Os ativadores da transcrição tipicamente se ligam próximo a promotores da transcrição e recrutam a RNA polimerase para iniciar diretamente a transcrição. Os repressores se ligam aos promotores da transcrição e dificultam estereotipadamente a iniciação da transcrição pela RNA polimerase. Outros reguladores da transcrição podem servir como ativadores ou repressores, dependendo de onde eles se ligam e das condições celulares e ambientais. Exemplos não limitativos de classes reguladoras da transcrição incluem, sem limitação proteínas de domínio doméstico, proteínas de dedos de zinco, proteínas de hélice alada (cabeça de forquilha) e proteínas de zíper de leucina.

[0079] Como usado neste documento, uma "proteína repressora" ou "proteína indutora" é uma proteína que se liga a um elemento de sequência reguladora e reprime ou ativa, respectivamente, a transcrição de sequências operacionalmente ligadas ao elemento de sequência reguladora. As proteínas repressoras e indutoras preferenciais, como aqui descritas, são sensíveis à presença ou ausência de pelo menos um agente de entrada ou entrada ambiental. As proteínas preferenciais como aqui descritas são de forma modular, que compreendem, por exemplo, elementos ou domínios de ligação separáveis para ligação ao DNA e ligação ao agente de entrada ou responsivos.

[0080] Como usado neste documento, "carreador" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, carreadores, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamento da absorção, tampões, soluções de suporte, suspensões, coloides e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecido na técnica. Os ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições. A expressão "farmaceuticamente aceitável" se refere a entidades e composições moleculares que não produzem uma reação indesejável tóxica, alérgica ou similar quando administradas a um hospedeiro.

[0081] Como usado neste documento, um "domínio responsivo ao agente de entrada" é um domínio de um fator de transcrição que se liga ou responde a uma condição ou agente de entrada de uma maneira que torna um domínio de fusão de ligação a DNA ligado responsivo à presença dessa condição ou entrada. Em uma modalidade, a presença da condição ou entrada resulta em uma alteração conformacional no domínio responsivo do agente de entrada ou em uma proteína à qual ele é fundido, que modifica a atividade de modulação da transcrição do fator de transcrição.

[0082] O termo "in vivo" se refere a ensaios ou processos que ocorrem em ou dentro de um organismo, como um animal multicelular. Em alguns dos aspectos aqui descritos, pode-se dizer que um método ou uso ocorre "in vivo" quando um organismo unicelular, como uma bactéria, é usado. O termo "ex vivo" se refere a métodos e usos que são realizados usando uma célula viva com uma membrana intacta que está fora do corpo de um animal ou planta multicelular, por exemplo, explantes, células cultivadas, incluindo células primárias e linhas celulares, transformadas linhas celulares e tecido ou células extraídas, incluindo células sanguíneas, entre outros. O termo "in vitro" se refere a ensaios e métodos que não requerem a presença de uma célula com uma membrana intacta, como extratos celulares, e podem se referir à introdução de um circuito biológico sintético programável em um sistema não celular, como como um meio que não compreende células ou sistemas celulares, como extratos celulares.

[0083] O termo "promotor" como usado neste documento, se refere a qualquer sequência de ácido nucleico que regula a expressão de outra sequência de ácido nucleico dirigindo a transcrição da sequência de ácido nucleico, que pode ser um gene alvo heterólogo que codifica uma proteína ou um RNA. Os promotores podem ser constitutivos, induzíveis, repressíveis, específicos de tecido ou qualquer combinação dos mesmos. Um promotor é uma região de controle de uma sequência de ácido nucleico na qual são controladas a iniciação e a taxa de transcrição do restante de uma sequência de ácido nucleico. Um promotor também pode conter elementos genéticos nos quais proteínas e moléculas reguladoras podem se ligar, como RNA polimerase e outros fatores de transcrição. Em algumas modalidades dos aspectos aqui descritos, um promotor pode dirigir a expressão de um fator de transcrição que regula a expressão do próprio promotor ou de outro promotor usado em outro componente modular dos circuitos biológicos sintéticos aqui descritos. Dentro da sequência do promotor, será encontrado um local de iniciação da transcrição, bem como os domínios de ligação às proteínas responsáveis pela ligação da RNA polimerase. Promotores eucarióticos, muitas vezes, mas nem sempre, contêm "TATA" boxes e "CAT" boxes. Vários promotores, incluindo promotores induzíveis, podem ser usados para dirigir a expressão de transgenes nos vetores de ceDNA divulgados neste documento.

[0084] O termo “"intensificador", conforme usado neste documento, se refere a uma sequência reguladora de ação cis (por exemplo, 50-1.500 pares de bases) que liga uma ou mais proteínas (por exemplo, proteínas ativadoras ou fator de transcrição) para aumentar a ativação transcricional! de um núcleo sequência ácida. Os intensificadores podem ser posicionados em até 1.000.000 pares de bases a montante do local inicial do gene ou a jusante do local inicial do gene que eles regulam. Um intensificador pode ser posicionado dentro de uma região intrônica ou na região exônica de um gene não relacionado.

[0085] Pode-se dizer que um promotor direciona à expressão ou direciona a transcrição da sequência de ácidos nucleicos que ele regula. As expressões "operativamente ligado", "operativamente posicionado”, "operativamente ligado", "sob o controle" e "sob o controle transcricional" indicam que um promotor está na zona funcional correcto e/ou da orientação em relação a uma sequência de ácido nucleico que regula para controlar a iniciação da transcrição e/ou expressão dessa sequência. Um "promotor invertido", como usado neste documento, se refere a um promotor, em que a sequência de ácido nucleico está na orientação inversa, de modo que o que foi a cadeia codificadora é agora a cadeia não codificante, e vice-versa. Sequências promotoras invertidas podem ser usadas em várias modalidades para regular o estado de um comutador. Além disso, em várias modalidades, um promotor pode ser usado em conjunto com um intensificador.

[0086] Um promotor pode ser um naturalmente associado a um gene ou sequência, como pode ser obtido isolando as sequências não codificadoras 5' localizadas a montante do segmento codificador e/ou éxon de um determinado gene ou sequência. Esse promotor pode ser referido como "endógeno". Do mesmo modo, em algumas modalidades, um intensificador pode ser uma naturalmente associada com uma sequência de ácido nucleico, localizados a jusante ou a montante da dita sequência.

[0087] Em algumas modalidades, um segmento de ácido nucleico codificador é posicionado sob o controle de um "promotor recombinante" ou "promotor heterólogo", ambos os quais se referem a um promotor que normalmente não está associado à sequência de ácido nucleico codificada, é operacionalmente ligado ao seu ambiente natural. Um intensificador recombinante ou heterólogo se refere a um intensificador que normalmente não está associado a uma dada sequência de ácido nucleico no seu ambiente natural. Tais promotores ou intensificadores podem incluir promotores ou intensificadores de outros genes; promotores ou intensificadores isolados de qualquer outra célula procariótica, viral ou eucariótica; e promotores sintéticos ou intensificadores que não são "de ocorrência natural", ou seja, compreender diversos elementos de diferentes regiões reguladoras da transcrição e/ou mutações que alteram expressão por meio de métodos de engenharia genética que são conhecidos na técnica. Além de produzir sequências de ácido nucleico de promotores e intensificadores sinteticamente, as sequências de promotor podem ser produzidas usando a tecnologia de clonagem recombinante e/ou de amplificação de ácido nucleico, incluindo PCR, em conexão com os circuitos e módulos biológicos sintéticos divulgados neste documento (ver, por exemplo, US 4.683.202, US 5.928.906, cada uma aqui incorporada a título de referência). Além disso, é contemplado que sequências de controle que direcionam a transcrição e/ou expressão de sequências dentro de organelas não nucleares, como mitocôndrias, cloroplastos e similares, também podem ser usadas.

[0088] Como descrito neste documento, um "promotor induzível" é aquele que é caracterizado por iniciar ou aprimorar a atividade transcricional quando na presença de, influenciado por ou contactado por um indutor ou agente indutor. Um "indutor" ou "indutor de agente" como é aqui definido, pode ser endógeno, ou um composto normalmente exógeno ou proteína que é administrado de modo um como para ser ativo na indução de atividade de transcrição a partir do promotor induzível. Em algumas modalidades, o indutor ou agente indutor, ou seja, um produto químico, um composto ou uma proteína, pode ser o resultado da transcrição ou expressão de uma sequência de ácido nucleico (ou seja, um indutor pode ser uma proteína indutora expressa por outro componente ou módulo), que por si só pode estar sob o controle ou um promotor induzível. Em algumas modalidades, um promotor induzível é induzido na ausência de certos agentes, como um repressor. Exemplos de promotores induzíveis incluem, entre outros, tetraciclina, metalotionina, ecdisona, vírus de mamífero (por exemplo, o promotor tardio dos adenovírus; e repetição terminal longa do vírus do tumor mamário do mouse (MMTV-LTR)) e outros promotores responsivos aos esteroides, rapamicina promotores responsivos e afins.

[0089] O termo "indivíduo", como usado neste documento, se refere a um ser humano ou animal, a quem é fornecido tratamento, incluindo tratamento profilático, com o vetor de ceDNA de acordo com a presente invenção. Normalmente, o animal é um vertebrado como, sem limitação, primata, roedor, animal doméstico ou animal de caça. Os primatas incluem sem limitação chimpanzés, macacos cinomólogos, mMacacos-aranha e macacos, por exemplo, Rhesus. Os roedores incluem ratos, ratos, marmotas, furões, coelhos e hamsters. Os animais domésticos e de caça incluem, entre outros, vacas, cavalos, porcos, veados, bisontes, búfalos, espécies felinas, por exemplo, gato doméstico, espécies caninas, por exemplo, cachorro, raposa, lobo, espécies aviárias, por exemplo, frango, emu, avestruz e peixe, por exemplo, truta, peixe-gato e salmão. Em certas modalidades dos aspectos aqui descritos, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um primata ou um humano. Um sujeito pode ser homem ou mulher. Além disso, um indivíduo pode ser um bebê ou uma criança. Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um recém-nascido ou não nascido,

por exemplo, o indivíduo está no útero. De preferência, o indivíduo é um mamífero. O mamífero pode ser um primata humano, não humano, camundongo, rato, cachorro, gato, cavalo ou vaca, mas não está limitado a esses exemplos. Outros mamíferos que não humanos podem ser usados com vantagem como indivíduos que representam modelos animais de doenças e distúrbios. Além disso, os métodos e composições aqui descritos podem ser usados para animais domesticados e/ou animais de estimação. Um indivíduo humano pode ser de qualquer idade, sexo, raça ou grupo étnico, por exemplo, caucasiano (branco), asiático, africano, preto, afro-americano, europeu africano, hispânico, médio-oriental etc. Em algumas modalidades, o indivíduo pode ser um paciente ou outro indivíduo em um ambiente clínico. Em algumas modalidades, o indivíduo já está em tratamento.

[0090] Como usado neste documento, o termo "anticorpo" é usado no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpos, incluindo, entre outros, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibem a atividade de ligação ao antígeno desejada. Um "fragmento de anticorpo" se refere a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que liga o mesmo antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma cadeia de imunoglobulina ou um fragmento da mesma e pelo menos uma sequência de domínio variável de imunoglobulina. Exemplos de anticorpos e fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação, um Fv, um scFv, um fragmento Fab, um Fab', um F'(ab')o, um Fab-SH, um anticorpo de domínio único (dAb), uma cadeia pesada, uma cadeia leve, uma cadeia pesada e leve, um anticorpo completo (por exemplo, inclui cada um dos Fc, Fab, cadeias pesadas, cadeias leves, regiões variáveis etc.), um anticorpo biespecífico, um diabody, um anticorpo linear, um anticorpo de cadeia única, um intracorpo, um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo multies pecífico ou um anticorpo multimérico. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser de qualquer classe, incluindo, sem limitação IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e de qualquer subclasse do mesmo, incluindo sem limitação 19G1, Ig9G2, I9G3, I9GA4, IgAl e I1gA2. Além disso, um anticorpo pode ser derivado de qualquer mamífero, por exemplo, primatas, humanos, ratos, camundongos, cavalos, cabras etc. Em uma modalidade, o anticorpo é humano ou humanizado. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo modificado. Em algumas modalidades, os componentes de um anticorpo podem ser expressos separadamente, de modo que o anticorpo se auto-monte após a expressão dos componentes da proteína. Em algumas modalidades, o anticorpo tem uma função desejada, por exemplo, interação e inibição de uma proteína desejada com a finalidade de tratar uma doença ou um sintoma de uma doença. Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região estrutural ou uma região Fc.

[0091] Como usado neste documento, o termo "domínio de ligação ao antígeno" de uma molécula de anticorpo se refere à parte de uma molécula de anticorpo, por exemplo, uma molécula de imunoglobulina (lg), que participa da ligação ao antígeno. Em modalidades, o sítio de ligação ao antígeno é formado por resíduos de aminoácidos das regiões variáveis (V) das cadeias pesada (H) e leve (L). Três trechos altamente divergentes nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve, denominadas regiões hipervariáveis, são dispostos entre trechos de flanqueamento “mais conservados, denominados "regiões de arcabouço" (FRs). FRs são sequências de aminoácidos que são naturalmente encontradas entre e adjacentes a regiões hipervariáveis nas imunoglobulinas. Nas modalidades, em uma molécula de anticorpo,

as três regiões hipervariáveis de uma cadeia leve e as três regiões hipervariáveis de uma cadeia pesada são dispostas uma em relação à outra no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação ao antígeno, que é complementar à tri- superfície dimensional de um antígeno ligado. As três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesada e leve são denominadas "regiões determinantes da complementaridade" ou "CDRs". A região de estrutura e CDRs foram definidos e descritos, por exemplo, em Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, Departamento de S aúde e Serviços Humanos dos EUA, Publicação NIH no 91-3242, e Chothia, C. et al. (1987) ) . Mol. Biol. 196: 901-917. Cada cadeia variável (por exemplo, cadeia pesada variável e cadeia leve variável) é tipicamente composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carbóxi na ordem de aminoácidos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4.

[0092] Como usado neste documento, o termo "anticorpo de comprimento total" se refere a uma molécula de imunoglobulina (Ig) (por exemplo, um anticorpo IgG), por exemplo, que ocorre naturalmente e formada por processos recombinatórios normais de fragmentos de genes de imunoglobulina.

[0093] Como usado neste documento, o termo "fragmento de anticorpo funcional" se refere a um fragmento que se liga ao mesmo antígeno que o reconhecido pelo anticorpo intacto (por exemplo, comprimento total). Os termos "fragmento de anticorpo" ou "fragmento funcional", também incluem fragmentos isolados que consistem em regiões variáveis, como os "Fv "fragmentos que consistem em regiões variáveis das cadeias pesada e leve ou polipeptídeo de fita simples recombinantes de moléculas na qual a luz e pesada regiões variáveis são conectadas por um ligante peptídico ("proteínas scFv"). Em algumas modalidades, um fragmento de anticorpo não inclui porções de anticorpos sem atividade de ligação ao antígeno, como fragmentos Fc ou resíduos de aminoácidos únicos.

[0094] Como usado neste documento, uma "sequência de domínio variável de imunoglobulina" se refere a uma sequência de aminoácidos que pode formar a estrutura de um domínio variável de imunoglobulina. P or exemplo, a sequência pode incluir toda ou parte da sequência de aminoácidos de um domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, a sequência pode ou não incluir um, dois ou mais aminoácidos N ou C-terminais ou pode incluir outras alterações compatíveis com a formação da estrutura da proteína

[0095] Como usado neste documento, o termo "que compreende" ou "compreende" é usado em referência a composições, métodos e respectivos componentes, que são essenciais para o método ou composição, mas abertos à inclusão de elementos não especificados, essencial ou não.

[0096] Como usado neste documento, o termo "que consiste essencialmente em" se refere aos elementos necessários para uma determinada modalidade. O termo permite a presença de elementos que não afctam materialmente a característica (ou características) básica e inovadora daquela modalidade.

[0097] O termo "que consiste em" se refere a composições, métodos e respectivos componentes, como descrito no presente documento, que são exclusivos de qualquer elemento não recitado nessa descrição da modalidade.

[0098] Conforme usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, as referências ao "método" incluem um ou mais métodos e/ou etapas do tipo descrito aqui e/ou que se tornarão aparentes para as pessoas versadas na técnica ao ler esta divulgação e assim por diante. Da mesma forma, a palavra "ou" pretende incluir "e", a menos que o contexto indique claramente o contrário. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou no teste desta divulgação, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. A abreviação, "e.g" é derivada do exemplo latino gratia e é usada aqui para indicar um exemplo não limitativo. Assim, a abreviação "e.g" é sinônimo do termo "por exemplo".

[0099] Além dos exemplos operacionais, ou onde indicado de outra forma, todos os números que expressam quantidades de ingredientes ou condições de reação usado nestes documentos devem ser entendidos como modificados em todas as instâncias pelo termo "cerca de". O termo "cerca de" quando usado em conexão com porcentagens pode significar + 1%. A presente invenção é ainda explicada em detalhes pelos exemplos a seguir, mas o escopo da invenção não deve ser limitado à isso.

[0100] Deve ser entendido que esta invenção não se limita à metodologia, protocolos e reagentes específicos, etc., aqui descritos e, como tal, podem variar. A terminologia usada neste documento tem o objetivo de descrever apenas modalidades particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção, que é definida apenas pelas reivindicações.

[0101] Sem limitações, uma nanopartícula lipídica da invenção inclui uma formulação lipídica que pode ser usada para fornecer um vetor de DNA não viral sem capsídeo para um local de interesse (por exemplo, célula, tecido, órgão e similares)). Geralmente, a nanopartícula lipídica compreende vetor de DNA não viral sem capsídeo e um lipídio ionizável ou um sal do mesmo.

[0102] Por conseguinte, em alguns aspectos, a divulgação fornece uma nanopartícula lipídica compreendendo ceDNA e um lipídio ionizável. Por exemplo, uma formulação de nanopartículas lipídicas que é feita e carregada com ceDNA obtida pelo processo do Exemplo 1 ou aqui revelada de outra forma. Isto pode ser conseguido através da mistura de alta energia de lipídios etanólicos com ceDNA aquoso a pH baixo, que protona o lipídio ionizável e fornece energia favorável à associação ceDNA/lipídio e nucleação de partículas. As partículas podem ainda ser estabilizadas através de diluição aquosa e remoção do solvente orgânico. As partículas podem ser concentradas no nível desejado.

[0103] Geralmente, as partículas lipídicas são preparadas na proporção total de lipídios/ceDNA (massa ou peso) de cerca de 10:1 a 30:1. Em algumas modalidades, a razão lipídio/ceDNA (razão em Massa; razão em peso) pode estar na faixa de cerca de 1:1 a cerca de 25:1, de cerca de 10:1 a cerca de 14:1, de cerca de 3:1 a cerca de 15:1, de cerca de 4:1 a cerca de 10:1, de cerca de 5:1 a cerca de 9:1 ou cerca de 6:1 a cerca de 9:1. As quantidades de lipídios e ceEDNA podem ser ajustadas para fornecer uma relação N/P desejada, por exemplo, razão N/P de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou superior. De um modo geral, o teor lipídico geral da formulação de partículas lipídicas pode variar de cerca de 5 mg/ml a cerca de 30 mg/ml.

[0104] O lipídio ionizável é tipicamente usado para condensar a carga de ácido nucleico, por exemplo, ceDNA em pH baixo e para conduzir a associação e fusogenicidade da membrana. Geralmente, lipídios ionizáveis são lipídios que compreendem pelo menos um grupo amino que é carregado positivamente ou se torna protonado em condições ácidas, por exemplo, a pH de 6,5 ou menos. Os lipídios ionizáveis são também aqui referidos como lipídios catiônicos.

[0105] Lipídios ionizáveis exemplificadores são descritos nas publicações de patentes PCT e US listadas na Tabela 1, cujo conteúdo é todo incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.

Tabela 1: Lipídios ionizáveis po o pose poe

RE

BRR WO2010/054401 WO2010/054406 US2012/0027796 memo Ju

WO2011/038160 US2013/0065939 WO02005/121348 US2006/0008910 WO2011/066651 US2003/0022649 WO2009/127060 US2010/0130588 WO02011/141704 US2013/0116307 WO02006/069782 US2010/0062967 WO02012/031043 US2013/0202684 WO02013/006825 US2014/0141070 WO02013/033563 US2014/0255472 WO02013/089151 US2014/0039032 WO02017/099823 US2018/0028664 WO2015/095346 US2016/0317458 WO02013/086354 US2013/0195920

[0106] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (X), o. R ' f o (1 , L; o. o

A Rê R , como definido no documento US2016/0311759, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0107] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (1),

Re REMO qe ge Art Ar Rº RA | qo go e

O o , como definido no documento US20150376115 ou no documento US2016/0376224, o conteúdo de ambos os quais é aqui incorporada a título de referência na sua totalidade.

[0108] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (1), Ri ri

VE R? o ps ou Fórmula (Il), Rº Y. Rº Ness ), R? R? v Rº m ou Fórmula (Ill), nº + nº n(H2C) AMADA DS2AMADADAN, > — — — nº

NANA como definido no documento US20160151284, o conteúdo das quais é aqui incorporada a título de referência na sua totalidade.

[0109] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto

Ra R1 Di Ra

M R6 R3 de Fórmula (1), m ou Fórmula (IA) Mingo ne ' Í n R2 OI " RO EA = R3: , ou Fórmula (Il), Ra Ds mono Rs o R3 ( Dr Y ou Fórmula (IA), mº > como definido no documento US20170210967, o conteúdo dos quais é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0110] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto No , |

R L XY

N o o R6 N X No qo. R de Fórmula lc, nº "conforme definido no documento US20150140070, cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.

[0111] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto Rº uh | á 2 L de Fórmula A n , como definido no documento US2013/0178541, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0112] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto RºOR: Rº N7 NY —x

PÁ de Fórmula (1), ? Rº conforme definido no documento US2013/0303587 ou no documento US2013/0123338, cujo conteúdo de ambos é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0113] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto RO o Ra do d N DÓ Drs /

X

VP de Fórmula (1) R? , conforme definido no documento US2015/0141678, cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.

[0114] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto o Ra o—L | = VOO R1 Vá

X o

A de Fórmula (ll) o , Fórmula (Il), RA o Ra | d AA, 4d > x GA Fórmula (IV),

o Y o—L = ho, R1 /

XY o

A > ou Fórmula (V), () Ra e o Vá > Ve mp er; R2 como definido no documento US2015/0239926, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0115] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto R3ô Do

AR A A de Fórmula (1), Rº G G? R?º como definido no documento US2017/0119904, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0116] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (1) ou Fórmula (l1l)) cada um tendo a estrutura: R Rº / Gl al Z L——X d pI Ne n, como definido no documento WO2017/117528, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0117] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula A,

RU Rê o o

N / Pp Rn o—r como definido no documento US2012/0149894, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0118] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto o Qu Rº Dip DS | o o? np Dps gs de Fórmula A, m como definido no documento US2015/0057373, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0119] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto Q1 Rº Rn Dão Pa 2 R? R5 SRo de Fórmula A, n como definido no documento WO2013/116126, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0120] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto o

LL Ri o Di >". de Fórmula A, R2 como definido no documento US 2013/0090372, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0121] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto o Rº >". | 2 La de Fórmula A, n como definido no documento US2013/0274523, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0122] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é o composto ha

AKI

RL Dl Y de Fórmula A, R? como definido no documento US2013/0274504, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0123] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto R2 | R Rº ps N o nO ee DN n

NX de Fórmula A, 122 —como definido no documento US2013/0053572, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0124] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto R? L 2 Z/ / Ri——N Y— AN

NE L2 n de Fórmula A, Rº como definido no documento WO2013/016058, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0125] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto

E—L "” & 7 ).

OO de Fórmula A, o—.como definido no documento WO2012/162210, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0126] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto xº x ol SS. NR? de Fórmula (|), n como definido na US2008/042973, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0127] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto SS x A B ma de Fórmula (1), n Fórmula (11), xº x” at . NR? n Fórmula (11), AN |

RN IODO SO R R ou Fórmula (IV),

R | N NAS Pi RO O NX / ' R R como definido no documento US2012/01287670, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0128] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (1) ou Fórmula (1l)) cada um tendo a estrutura: Rô Rº R1 L— (A, R? PS : Pal R? , como definido no documento US2014/0200257, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0129] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (1), Fórmula (11) de Fórmula (Ill), cada um tendo a estrutura:

MEO R? , como definido no documento US2015/0203446, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0130] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto Rº 1 R R x z DS ht br sn R? Mex z de Fórmula (1), > ou Fórmula (III), O x O DA Da Y Da o Y. o Tx o como definido no documento US 2015/0005363, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0131] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto o de Fórmula (1), E A (IA),

o A) Ao, Áfh, Ás) AR Eng E ; TRE Dá ' % th "W º SS Xaa “ D r R R R R R Pá | ço hey” ço hey soa h 1 Pp Fórmula (IB), o E AA (IC), o ad gaz RN Ro EÓMmUha (ID), o o A AA (ID, ll zoo o Ró Ar Fórmula (11), Rº NH3* Fórmula (IA), o x LR R R R R R7HN 8 A e is hay Ing oo | g k o | NH3* R R R R R Z Pra aos h 1 p o Rº Sr Fórmula (IB), Rg NH3* Fórmula U(UIC), o R4—Ml——R? Sr —Rº NH3* RV2—M? Fórmula (IID) ou Fórmula (Ill) - (XXIV), conforme definido no documento US2014/0308304, cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência em suas totalidade.

[0132] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto .-.. R1 R3——L, de Fórmula R2, conforme definido no documento US2013/0338210, cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.

[0133] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula ((1), R3 Ra Rs e DO BR A x o ma a É é “rórmula (1), D crómuh (11), Rs o Ba At x e Ran" Re R o Ri (6) da, , X, o , ou Fórmula geral (IV), o como definido no documento WO2009/132131, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0134] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto Ra

À No

OO x de Fórmula A, É R como definido no documento US2012/01011478, o conteúdo das quais é aqui incorporada a título de referência na sua totalidade.

[0135] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto

R3Z X Ra > de Fórmula (|), n ou Fórmula (XXXV), Rs NX, R2

NA

P & —como definido no documento US2012/0027796, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0136] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto A? x R1 e Á REA R2

Y 7 ; FA, ; de Fórmula (XIV), Rô j ou Fórmula (XVII), R1 mo / pr Ra Z,

VW À . t:.como definido no documento US2012/0058144, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0137] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto x XX) O) de Fórmula Ré Cas, R Hd” ou Rº—Hd87 como definido no documento US 2013/0323269, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0138] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto R$ RÔ Y 2 N/ (Fr DR Ahh nº nº de Fórmula (1), ? m como definido US2011/0117125, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0139] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto

Y NE No N——(CH;). É i Rº de Fórmula (1), ? m Fórmula (11), x ( p Rº Rº Ró 2

W / z , Rº ” ou Fórmula (11), -

SSOSOODSIS ] — —

N / ; como definido no documento US2011/0256175, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0140] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (1),

RR nº Le, AMADA DA NS NAN Ré T>» — = = Rº

ANNAN MENINO

XY NE Nr Ato ; R? R Fórmula (11), i m Fórmula (1), RºORô Pr : Neto, AR ROO rá > Rn o o > Fórmula — (IV), >r

Rº Rô N/ N— (CH), Rº nÓ OO

MN Fórmula (V), Ró Fórmula (VI), Rº Rô NA As pn Y> () gr Fórmula (VII), Rê R2 AS eh, Rº / ONO R2? o > Fórmula (VI), x, Ad RR Ró 4 ME o R? z Rn né Fórmula — (IX), Rn Rº Rê RºRI Y N/ ( n pt N/ ( n p nº Nha ; AN eHh ; R2 R R2 R ? m Fórmula (X), ? m - Rº Rê Neem, A” é YO” o Fórmula (XI), ou ea Fórmula (XII), como definido no documento US 2012/0202871, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0141] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é composto de

Rº Rº LL MEO or em Fórmula (1), R? OR? , Fórmula (11), Rº , Fórmula XY: R$ Rô N/ NA p A N—— (CH)g á Rº z , (1), m , Fórmula (IV), x:

A DR Rº Ró VW e VÁ z , nº ” , Fórmula (V), " Rº Do AAA * T> — — — ge NAN /MNSNONS S/N DINº XY: Rº R3 N/ VA o AR N—— (CH7), á Rô ; z ; Fórmula (VI), nm , Fórmula (VII),

NZ NZ NH), Ré N—(CH2), nº Tá VS Dá DANA NO , NR , Ró , Fórmula (VIII), Rô , Fórmula

NZ NZ N—(CH2), Rº N—(CH2), Rº Pa O YZ NO O. o (IX), > , Fórmula (X), Do ; Rd FR NOS cho, Rº / DA nz o Fórmula — (XI), > , Fórmula (XI),

*., Pi 20 Oo. o R R Í A N/ Y Rº O Rê N—— (CH), Né Ro É À" ZA era o , Zz nº , Fórmula (XII), RS, RºR? Y 4

VV C SK N—(CH2h / 5 R? R Fórmula — (XIV), ? m , Fórmula (XV), 1 3 x R R 4 YW (CH7) Á A N— CH É R5ó ? m , ou Fórmula (XVI), Rº RB NARA Ai nº YO>

NX Rô , conforme definido no documento US2011/0076335, cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.

[0142] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto RA R? x ME or! ade ; , | de Fórmula (1), R? OR? ou Fórmula (Il), Rº como definido no documento US2006/008378, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0143] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto go Rô Rº

NÃ NY — x

É de Fórmula (1), *? Rºcomo definido no documento US2013/0123338, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0144] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (1)) X-A-Y-Z, conforme definido no documento US2015/0064242, cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.

[0145] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto Ri R2

E ; RO Rx , de Fórmula (XVIX), n , Fórmula (XVII), R1 R1

A A R2 ou Fórmula (XVIII) R2, como definido no documento US 2013/0022649, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0146] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é o composto de Fórmula (1), 3 Rº R Né Rº

Á Tá > x Mm Ró Fórmula (1),

Y Rº Rô X / ( n p RÉ N—z RÉ Rô x s nm ou Fórmula (11) 3 4 Rº R R

NÃ NY ——X

VÁ R Rº, como definido no documento US2013/0116307, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0147] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é composto de o Aba Fórmula (1), h NH3* ou Fórmula (Il), o Au NH? + + Y NH3 NH, Yv como definido no documento US2010/0062967, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0148] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (1) - (X) cada um com a estrutura: R2 e b—X1—Y!

A t—xX—Ll—Y, conforme definido no documento US2013/0189351, cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.

[0149] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (1), R2 2 [OO x Sã R? como definido no documento US 2014/0039032, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0150] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (V),

Ra Ri R2

MA AK

A m , como definido no documento US 2018/0028664, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0151] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (1), R? 4 L O Di o como definido no documento US2016/0317458, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0152] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é um composto de Fórmula (1), Rº no É sd Ns RO, Moe ; R Dx H R? como definido no documento US2013/0195920, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0153] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é MC3 (62, 97, 287, 31 Z) - heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il-4- (dimetilamino) butanoato (DLin-MC3- DMA ou MC3) descrito no Exemplo 9.

[0154] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é o lipídio ATX- 002 descrito no Exemplo 10.

[0155] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é (132,162Z)- N ,N-dimetil-3-nonildocosa-13,16-dien-1-amina (Composto 32), descrito no Exemplo 11.

[0156] Em algumas modalidades, o lipídio ionizável é o composto 6 ou o composto 22 descrito no Exemplo 12.

[0157] Sem limitações, o lipídio ionizável pode compreender 20- 90% (em mol) do teor lipídico total presente na nanopartícula lipídica. Por exemplo, o conteúdo molar lipídico ionizável pode ser 20-70% (em mol), 30-60% (em mol) ou 40-50% (em mol) do teor lipídico total presente na nanopartícula lipídica. Em algumas modalidades, o lipídio ionizável compreende de cerca de 50% em mol a cerca de 90% em mol do teor lipídico total presente na nanopartícula lipídica.

[0158] Em alguns aspectos, a nanopartícula lipídica pode ainda compreender um lipídio não catiônico. Os lipídios não iônicos incluem lipídios —anfipáticos, lipídios neutros e lipídios aniônicos. Por conseguinte, o lipídio não catiônico pode ser um lipídio neutro, não carregado, zwitteriônico ou aniônico. Os lipídios não catiônicos são tipicamente usados para aumentar a fusogenicidade.

[0159] Os lipídios não catiônicos exemplificativos incluem, sem limitação, distearoil-sn-glicerofosfoetanolamina, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina —“(DPPC), dioleoilfosfatidilcolihna (DPPC), dioleoilfosfatidilamina -fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), dioleoil-fosfatidiletanolamina —4-(N-maleimidometil) -ciclo- hexano-l-carboxilamina (DOP E-etil), dipalmotilamida, dipalmidilamina distearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), monometil- fosfatidiletanolamina (como 16-O-monometil PE), dimetil- fosfatidiletanolamina (como 16-O-dimetil PE), 18-1-trans PE, 1- estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), fosfatidilcolina de Ovo (EPC), dioleoilfosfatidilserina —(DOPS), esfingomielihna (SM), dimiristoil- fosfatidilcolina — (DMPC), dimiristoil —fosfatidilglicerol “(DMPG), diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG), dierucoilfosfatidilcolina (DEPC),

palmitoiloleioIfosfatidilglicerol (POPG), dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE), lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol|, esfingomielina, esfingomielina de ovo (ESM), cefalina, cardiolipina, fosfatidicácido, —cerebrosídeos, —dicetilfosfato, lisofosfatidilcolina, dilinololitfosfatidilcolihna ou misturas dos mesmos. Entende-se que também podem ser usados outros fosfolipídios de diacilfosfatidilcolina e diacilfosfatidiletanolamina. Os grupos acila desses lipídios são, de preferência, grupos acila derivados de ácidos gordos que têm cadeias de carbono C10-C24, por exemplo, lauroíla, miristoíla, palmitoíla, estearoíla ou oleoíla.

[0160] Outros exemplos de lipídios não catiônicos adequados para uso nas nanopartículas lipídicas incluem lipídios não fosforosos, como, por exemplo, estearilamina, dodecilamina, hexadecilamina, acetil palmitato, glicerolricinoleato, esteradato de hexadecil, miristato de isopropil, polímeros de anfoteril-acrílico, polímeros de anfoteril-acrílico, amidas de ácidos graxos polietiloxilados de alquil-aril sulfato, brometo de dioctadecildimetil amônio, ceramida, esfingomielina e similares.

[0161] Em algumas modalidades, o lipídio não catiônico é um fosfolipídio. Em algumas modalidades, o lipídio não catiônico é selecionado dentre DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE e SM. Em algumas modalidades preferenciais, o lipídio não catiônico é DPSC.

[0162] Exemplos de lipídios não catiônicos são descritos na publicação PCT WO2017/099823 e na publicação de patente US US2018/0028664, cujo conteúdo de ambos é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.

[0163] Em alguns exemplos, o lipídio não catiônico é o ácido oleico Ri RI-NO oo A 1, th TP tm ou um composto de Fórmula (1), R' Õ Fórmula (11)

Za 7 Tm , ou Fórmula (IV), Ho Ra como definido no documento US2018/0028664, cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.

[0164] O lipídio não catiônico pode compreender de O a 30% (em mol) do teor lipídico total presente na nanopartícula lipídica. Por exemplo, o conteúdo lipídico não catiônico é de 5 a 20% (em mol) ou 10 a 15% (em mol) do teor lipídico total presente na nanopartícula lipídica. Em várias modalidades, a razão molar de lipídio ionizável para lipídio neutro varia de cerca de 2:1 a cerca de 8:1.

[0165] Em algumas modalidades, as nanopartículas lipídicas não compreendem fosfolipídios.

[0166] Em alguns aspectos, a nanopartícula lipídica pode ainda compreender um componente, como um esterol, para fornecer integridade à membrana.

[0167] Um esterol exemplificador que pode ser usado na nanopartícula lipídica é o colesterol e seus derivados. Exemplos não limitativos de derivados de colesterol! incluem análogos polares, como Sa-colestanol, 5B-coprostanol, colesteril-(2'-hidróxi) etil éter, colesteril- (4'-hidróxi) butil éter, e 6-cetocolestanol; análogos não polares como 5a- colestano, colestenona, 5a-colestanona, 5B-colestanona e decanoato de colesteril; e misturas dos mesmos. Em algumas modalidades, o derivado do colesterol é um análogo polar, como éter colesteril-(4'- hidroxil)-butílico.

[0168] Derivados de colesterol exemplares são descritos na publicação PCT WO2009/127060 e na publicação de patente nº US2010/0130588, cujo conteúdo de ambos é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0169] O componente que fornece integridade da membrana, como um esterol, pode compreender O a 50% (em mol) do teor lipídico total presente na nanopartícula lipídica. Em algumas modalidades, esse componente é 20 a 50% (em mol) 30 a 40% (em mol) do conteúdo lipídico total da nanopartícula lipídica.

[0170] Em alguns aspectos, a nanopartícula lipídica pode ainda compreender um polietileno glicol (PEG) ou uma molécula lipídica conjugada. Geralmente, estes são usados para inibir a agregação de nanopartículas lipídicas e/ou proporcionar estabilização estérica. Exemplos de lipídios conjugados incluem, sem limitação, conjugados de PEG-lipídio, conjugados de polioxazolina (POZ)-lipídios, conjugados de poliamida-lipídios (como conjugados de ATTA-lipídios), conjugados de catiônicos de polímero-polímero (CPL) e misturas dos mesmos. Em algumas modalidades, a molécula lipídica conjugada é um conjugado PEG-lipídio, por exemplo, um lipídio conjugado (metóxi polietilenoglicol!).

[0171] Conjugados exemplares de PEG-lipídio incluem, sem limitação, PEG-diacilglicero! (DAG) (como 1-(monometóxi- polietilenoglico!)-2,3-dimiristoilglicero] (PEG-DMG)), PEG- dialquiloxipropil (DAA)), PEG-fosfolipídio, PEG-ceramida (Cer), uma fosfatidiletanoloamina peguilada (PEG-PE), succinato de diacilglicero! de PEG (PEGS-DAG) (como 4-0-(2',3'-di(tetradecanoilóxi)propil-1-0- (w-metóxi (polietóxi)etil)butanodioato (PEG-S-DMG)), PEG dialcoxipropilcarbam, — N-(carbonil-metoxipolietilenoglicol “2000)-1,2- distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina sódica sal, ou uma mistura dos mesmos. Exemplos adicionais de conjugados de PEG-lipídicos são descritos, por exemplo, no documento US 5.885.613, US 6.287.591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224,US2017/0119904 e US/099823, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0172] Em algumas modalidades, um PEG-lipídio é um composto de Fórmula (Ill)

RÃ L—D A Rã uv A NO A , Fórmula (lll-a-l), AO R/ É ú R DS Fórmula (lIl-a-2), AD E, Fórmula (NII-b-1),

ADIOU o ' , Fórmula (111-b-2), o o RÀ u A Rã OK o , ou Fórmula (V), EF conforme definido no documento US2018/0028664, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0173] Em algumas modalidades, um lipídio-PEG é da Fórmula (11), o AAA, + i do conforme — definido no documento US20150376115 ou no documento US2016/0376224, cujo conteúdo de ambos é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0174] O conjugado PEG-DAA pode ser, por exemplo, PEG- dilauriloxipropil, PEG-dimiristiloxipropil, PEG-dipalmitiloxipropil, ou PEG-disteariloxipropil. O PEG-lipídio pode ser um ou mais dentre PEG- DMG, PEG-dilaurilglicerol, PE G-dipalmitoilglicero|, P EG -disterilglicerol, PEG-dilaurilglicamida, PEG-dimiristilglicamida, PEG- dipalmitoilglicamida, “PEG-disterilglicamida, PEG-colesterol (1-[8"- (Colest-5-en-3[beta]-óxi)carboxamido-3"',6'-dioxaoctanil] carbamoil- [ômega]-metil-poliletileno glicol),) PEG-DMB (3,4-ditetradecoxilbenzil- [omega]-metil-poliletileno glicol) éter), e 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-N-[metóxi(polietileno — glicol)-2000l. Em alguns exemplos, o PEG-lipídio pode ser selecionado do grupo que consiste em PEG-DMG, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metóxi(polietileno glicol)-2000],

RIOS DI DISSO LOCO PR À, " QE ADADADAODADAOSÔ

PAZ AAA ; o e o

AAA

AFAZGAAP DI o .

[0175] Os lipídios conjugados com uma molécula que não seja um PEG também podem ser usados no lugar de lipídios do PEG. Por exemplo, conjugados de polioxazolina (POZ) - lipídio, conjugados de poliamida-lipídio (como conjugados de ATTA-lipídio) e conjugados de lipídio de polímero catiônico (CPL) podem ser usados no lugar ou em adição ao PEG-lipídio.

[0176] Lipídios conjugados exemplares, isto é, lipídios PEG, (POZ) - conjugados lipídicos, conjugados ATTA lipídicos e lipídios poliméricos catiônicos são descritos nos pedidos de patente PCT e US listados na Tabela 2, cujo conteúdo é todo aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

Tabela 2: Lipídios conjugados pes Ls ss

[0177] O PEG ou o lipídio conjugado pode compreender 0-20% (em mol) do teor lipídico total presente na nanopartícula lipídica. Em algumas modalidades, o PEG ou o conteúdo lipídico conjugado é de 0,5 a 10% ou 2 a 5% (em mol) do teor lipídico total presente na nanopartícula lipídica.

[0178] As razões molares de lipídios ionizáveis, lipídios não catiônicos, esterol e PEG/lipídio conjugado podem variar conforme necessário.

Por exemplo, a partícula lipídica pode compreender 30 a - 70% de lipídios ionizáveis em mol ou em peso total da composição, O a -60% de colesterol em mol ou em peso total da composição, O a -30% de lipídios não catiônicos por mol ou em peso total da composição e 1 a 10% de lipídio conjugado em mol ou em peso total da composição.

De preferência, a composição compreende 30 a 40% de lipídios ionizáveis em mol ou em peso total da composição, 40 a 50% de colesterol em mol ou em peso total da composição e 10 a 20% de lipídios não catiônicos por mol ou por peso total da composição.

Em algumas outras modalidades, a composição é 50 a 75% de lipídios ionizáveis por mol ou pelo peso total da composição, 20 a 40% de colesterol por mol ou pelo peso total da composição e 5 a 10% de lipídios não catiônicos, em mol ou em peso total da composição e 1-10% de lipídio conjugado em mol ou em peso total da composição.

A composição pode conter 60- 70% de lipídios ionizáveis por mol ou em peso total da composição, 25 a 35% de colesterol por mol ou pelo peso total da composição e 5-10% de lipídios não catiônicos por mol ou por total peso da composição.

À composição também pode conter até 90% de lipídios ionizáveis em mo! ou em peso total da composição e 2 a 15% de lipídios não catiônicos em mol ou em peso total da composição.

A formulação também pode ser uma formulação de nanopartículas lipídicas, por exemplo compreendendo 8 a 30% de lipídios ionizáveis por mol ou por peso total da composição, 5 a 30% de lipídios não catiônicos por mol ou por peso total da composição e O a 20% de colesterol em mol ou em peso total da composição; 4 a 25% de lipídio ionizável em mol ou em peso total da composição, 4 a 25% de lipídio não catiônico em mol ou em peso total da composição, 2 a 25% de colesterol em mol ou em peso total da composição, 10 a 35% de lipídio conjugado em mol ou em peso total da composição e 5% de colesterol em mol ou em peso total da composição;

ou 2 a 30% de lipídio ionizável em mol ou em peso total da composição, 2 a 30% de lipídio não catiônico em mol ou em peso total da composição, 1 a 15% de colesterol em mol ou em peso total da composição, 2 a 35% de lipídio conjugado em mol ou em peso total da composição e 1 a 20% de colesterol em mol ou em peso total da composição; ou mesmo até 90% de lipídios ionizáveis em mol ou em peso total da composição e 2 a 10% de lipídios não catiônicos em mol ou em peso total da composição, ou mesmo 100% de lipídio catiônico em mol ou em peso total de composição. Em algumas modalidades, a formulação de partículas lipídicas compreende lipídios ionizáveis, fosfolipídios, colesterol e um lipídio PEGuilado em uma razão molar de 50:10:38,5:1,5. Em algumas outras modalidades, a formulação de partículas lipídicas compreende lipídios ionizáveis, colesterol e um lipídio PEGuilado em uma razão molar de 60:38,5:1,5.

[0179] Em algumas modalidades, a partícula lipídica compreende lipídio ionizável, lipídio não catiônico (por exemplo, fosfolipídio), um esterol (por exemplo, colesterol) e um lipídio PEGuilado, em que a razão molar de lipídios varia de 20 a 70% em moles para o lipídio ionizável, com uma meta de 40 a 60, a porcentagem molar de lipídios não catiônicos varia de O a 30, com uma meta de O a 15, a porcentagem molar de esterol! varia de 20 a 70, com uma meta de 30 a 50, e a porcentagem molar de lipídio PEGuilado varia de 1 a 6, com um alvo de 2a 5.

[0180] Em algumas modalidades, a partícula lipídica compreende lipídio ionizável/lipídio não catiônico/esterol/lipídio conjugado em uma razão molar de 50:10:38,5:1,5.

[0181] Em outros aspectos, a divulgação fornece uma formulação de nanopartículas lipídicas que compreende fosfolipídios, lecitina, fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina.

[0182] Em algumas modalidades, um ou mais compostos adicionais também podem ser incluídos. Esses compostos podem ser administrados separadamente ou os compostos adicionais podem ser incluídos nas nanopartículas lipídicas da invenção. Em outras palavras, as nanopartículas lipídicas podem conter outros compostos além do CeDNA ou pelo menos um segundo ceDNA, diferente do primeiro. Sem limitações, outros compostos adicionais podem ser selecionados do grupo que consiste em pequenas ou grandes moléculas orgânicas ou inorgânicasó, — monossacarídeos, — dissacarídeos, —trissacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, peptídeos, proteínas, análogos peptídicos e seus derivados, peptidomiméticos, ácidos nucleicos, análogos de ácidos nucleicos e derivados, um extrato feito de materiais biológicos ou qualquer combinação dos mesmos.

[0183] Em algumas modalidades, o um ou mais compostos adicionais podem ser um agente terapêutico. O agente terapêutico pode ser selecionado de qualquer classe adequada para o objetivo terapêutico. Por outras palavras, o agente terapêutico pode ser selecionado de qualquer classe adequada ao objetivo terapêutico. Em outras palavras, o agente terapêutico pode ser selecionado de acordo com o objetivo do tratamento e a ação biológica desejada. P or exemplo, se o ceDNA no LNP for útil para o tratamento de câncer, o composto adicional pode ser um agente anticâncer (por exemplo, um agente quimioterapêutico, uma terapia de câncer direcionada (incluindo, entre outros, uma molécula pequena, um anticorpo, ou um conjugado anticorpo-droga). Em um outro exemplo, se o LNP contendo o ceDNA é útil para o tratamento de uma infecção, o composto adicional pode ser um agente antimicrobiano (por exemplo, um antibiótico ou um composto antiviral). Em ainda outro exemplo, se o LNP contendo o ceDNA é útil para o tratamento de uma doença imune ou desordem, o composto adicional pode ser um composto que modula uma resposta imune (por exemplo, um imunossupressor, composto imunoestimulante, ou composto modulador um ou mais específicos vias imunes). Em algumas modalidades, diferentes coquetéis de diferentes nanopartículas lipídicas contendo diferentes compostos, como um ceDNA que codifica uma proteína diferente ou um composto diferente, como um terapêutico, podem ser usados nas composições e m métodos da invenção.

[0184] Em algumas modalidades, o composto adicional é um agente modulador imunológico. Por exemplo, o composto adicional é um imunossupressor. Em algumas modalidades, o composto adicional é imunoestimulador.

[0185] Moduladores imunológicos exemplares incluem, sem limitação, interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-12), citocinas (por exemplo, fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), interferons), quimiocinas (por exemplo, CCL3, CCL26, CXCL7), imidas imunomoduladoras (IMiDs) (por exemplo, talidomida e seus análogos (lenalidomida, pomalidomida e apremilast)), outros moduladores imunes, incluindo mas não limitados a: citosina fosfato-guanosina, oligodesoxinucleotídeos.

[0186] Em algumas modalidades, o modulador imunológico pode ser um fármaco imunossupressor. Drogas imunossupressoras exemplares incluem, mas não se limitam a, glicocorticoides, citostáticos, anticorpos, drogas que agem sobre imunofilinas e outras drogas. Os glicocorticoides incluem, sem limitação, prednisona, dexametasona e hidrocortisona. Exemplos de citostáticos incluem agentes alquilantes, como mostardas de nitrogênio (por exemplo, ciclofosfamida), nitrosoureias e compostos de platina. Os citostáticos também podem incluir os antimetabólitos, como análogos do ácido fólico (por exemplo, metotrexato), análogos da purina (por exemplo, azatioprina e mercaptopurina), análogos da pirimidina (por exemplo, fluorouracil) e inibidores da síntese de proteínas. Outros cistostáticos incluem antibióticos citotóxicos, como dactinomicinas, antraciclinas, mitomicina C, bleomicina e mitramicina.

[0187] Anticorpos para supressão imunológica incluem, sem limitação, Atgam, obtido a partir de soro de cavalo e Timoglobulina, anticorpos direcionados aos anticorpos direcionados ao receptor IL-2 (CD25-) e/ou CD3, MUROMONAB-CD3'"Y (Orthoclone OKT3), basiliximab (SIMULE CTY), daclizumab (ZENAPAXTY) e muromonab.

[0188] Os fármacos que atuam nas imunofilinas incluem, entre outros, ciclosporina, tacrolimus, rapamicina (SIROLIMUSTY) e Everolimus. Exemplos de produtos biológicos incluem abatacept, anakinra, —certolizumab, golimumab, ixekizumab, natalizumab, rituximabe, secukinumab, tocilizumab, ustekinumab e vedolizumab.

[0189] Outros fármacos úteis como moduladores imunes ou supressores imunológicos incluem, sem limitação, interferons (por exemplo, IF N-B), opioides, proteínas de ligação ao TNF (por exemplo, proteína de ligação ao TNF-a (fator de necrose tumoral alfa), infliimab (REMICADE TY), etanercept (ENBRELTY) ou adalimumab (HUMIRATY)), curcumina (um ingrediente em açafrão) e catequinas (no chá verde), Micofenolato, Fingolimod, mirriocina, agentes antiproliferativos (por exemplo, mirriocina, tacrolimus, micofenolato de mofetil, micofenolato de sódio, azatioprina), inibidores da MTOR (por exemplo, sirolimus e everolimus), inibidores da calcineurina (por exemplo, ciclosporina e tacrolimus), inibidores da IMDS (por exemplo, azatioprina, leflunomida e micofizolacina, golimumab, ixekizumab, natalizumab, rituximabe, secukinumab, tocilizumab, ustekinumab e vedolizumab.

[0190] Em algumas modalidades, agentes imunossupressores úteis nas composições e métodos divulgados neste documento podem ser selecionados a partir de um dos seguintes compostos: ácido micofenólico, ciclosporina, azatioprina, tacrolimus, ciclosporina A, FK506, rapamicina, leflunomida, desoxispergualina, prednisona, azatioprina, micofenolato de mofetil, OKT3, ATAG ou mizoribina.

[0191] Em certas modalidades, um imunossupressor é selecionado do grupo que consiste em Prednisona, metilprednisolona, Kenalog, Medrol Oral, Medrol (Pak) Oral, Depo-Medrol Inj, prednisolona Oral, Solu-Medrol Inj, hidrocortisona Oral, Cortef Oral, Solu-Medrol |V, cortisona Oral, Celestone Soluspan Inj, Orapred ODT Oral, Orapred Oral, Prelone Oral, acetato de metilprednisolona Inj, Prednisona Intenso! Oral, betametasona acete sulfato de sódio Inj, Veripred, Celestone Oral, metilprednisolona sódica succ, metilprednisolona sódica succ Inj, Millipred Oral, Solu-Medrol (PF) Inj, Solu-Cortef Inj, Aristospan Inj Intra- Articular, succinato de hidrocortisona-sodada Inj, fosfato de sódio de prednisolona Oral, metilprednisolona sod suc (PF) IV, Solu-Medrol (PF) IV, triancinolona hexacetonídeo Inj, A-Hydrocort Inj, A-Methapred Inj, Millipred DP Oral, Flo-Pred Oral, Aristospan Intralesional |nj, betametasona oral, metilprednisolona sod suc (PF) Inj, hidrocortisona sod succ (PF) Inj, Solu-Cortef (PF) Inj, acetato de prednisolona Oral, dexametasona em NaCl IV a 0,9%, Rayos, levotiroxina. Obviamente, os imunossupressores são conhecidos pelos versados na técnica e podem ser facilmente substituídos, uma vez que esta lista não deve ser considerada exaustiva ou limitativa.

[0192] Um imunossupressor pode resultar na redução de células imunes no indivíduo, por exemplo, uma redução de células imunes que expressam pelo menos um ou mais dos seguintes: CD11b, CD4, CD8 e/ou uma redução nas citocinas pró- inflamatórias selecionado, sem limitação, TNF TN ou MCP-1. Em algumas modalidades, uma citocina pró-inflamatória é selecionada a partir de qualquer uma ou uma combinação de: citocinas, linfocinas, monocinas, fatores de crescimento de células-tronco, linfotoxinas, fatores hematopoiéticos, fatores estimuladores de colônias (LCR), interferons (IFN), hormônio da paratireoide, tiroxina, insulina, pró-insulina, relaxina, prorelaxina, hormônio folículo estimulante (FSH), hormônio estimulador da tireoide (TSH), hormônio luteinizante (LH), fator de crescimento hepático,

prostaglandina, fator de crescimento de fibroblastos, prolactina, lactogênio placentário, proteína OB, crescimento transformador fator (TGF), TGF-a, TGF-B, fator de crescimento similar à insulina (IGF), eritropoietina, trombopoietina, fator de necrose tumoral (TNF), TNF-a, TNF-B, substância inibidora de mullerian (MIS), peptídeo associado à gonadotrofina de camundongo, inibina, ativina, fator de crescimento endotelial vascular, integrina, interleucina (IL), fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF), fator estimulador de colônias de macrófagos (GM-CSF), interferon-alfa, interferon-beta, interferon-gama, fator S1, IL-1, IL-1 cc, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-10, IL-11, IL-12, 1L-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, 1L-18 11-21, 11-23, 11-25, LIF, kit-ligante, FLT-3, angiostatina, trombospondina e endostatina.

[0193] Em algumas modalidades, uma citocina pró-inflamatória pode ser selecionada de qualquer ou uma combinação de interleucina- 1 B (IL-1 Bb), fator de necrose tumoral a. (TNF-a), interleucina-6 (IL-6), interleucina-8 (IL-8), interferon y (IFN-y), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), leucemia fator inibidor (LIF), proteína quimiotática de monócitos-1 (MCP-1), RANTES, interleucina 10 (IL-10), interleucina-12 (IL-12), metaloproteinase da matriz 2 (MMP2), IP-10, proteína inflamatória de macrófago 1 a (MIP1 a) e/ou proteína inflamatória de macrófago 1 B(MIP1 GB).

[0194] Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um agonista de NLRP3. Agonistas de NLRP3 exemplares incluem, sem limitação, uma imadazoquinolina; uma imidazonaftiridina;y uma pirazolopiridina; uma imidazoquinolina substituída por arila; um composto que tem um sistema de anel 1-alcóxi 1H-imidazo; um oxazolo [4,5-c] -quinolin-4-amina; uma tiazolo [4,5-c]-quinolin-4-amina; um selenazolo [4,5-c]-quinolin-4-amina; uma imidazonaftiridina, uma imidazoquinolinamina; uma 1H-imidazo [4,5-C] quinolin-4-amina 1- substituída; uma cicloalquilimidazopiridina fundida; uma 1H-imidazo

[4,5-c] quinolin-4-amina; uma 1H-imidazo-[4,5-c] quinolin-4-amina 1- substituída; uma imidazo-[4,5-C] quinolin-4-amina; uma 1H-imidazo [4,5-ciquinolin-4-amina 2-etil; uma 1H-imidazo [4,5-c] quinolin-4-amina olfénica; um ácido 6,7-di-hidro-8- (imidazol-1-i1)-5-metil-1-0x0-1H, 5H- benzo [ij] quinolizina-2-carboxílio; um ácido piridoquinoxalina-6- carboxílico; um ácido 6,7-di-hidro-8- (imidazol-1-il)-5-metil-1-0x0-1H, SH-benzo [ij] quinolizina-2-carboxílico; uma nafto [ij]] quinolizina substituída; um ácido piridoquinoxalina-6-carboxílico substituído; um derivado do ácido 7-hidróxi-benzo [ij] quinolizina-2-carboxílico; um ácido benzo [ij] quinolizina-2-carboxílico substituído; ácido a7-hidróxi-benzo [i]] quinolizina-2-carboxílico; uma pirido [1,2,3, -de] -1,4-benzoxazina substituída; e um malonato de N-metileno de tetra-hidroquinolina. Em algumas modalidades, o agonista NLRP3 é um composto de Fórmula: NH, ÁSIA à Ss R o como definido no documento US20170056448A1, o conteúdo das quais é aqui incorporada a título de referência na sua totalidade.

[0195] Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um ligante TLR7 e/ou TLR8. Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é imiquimod (1-isobutil-LH-imidazo [4,5-c] quinolin-4- amina) ou resiquimod.

[0196] Em algumas modalidades, o agente modulador imunitário é um composto à base de Imquidazolequinolihe de Fórmula: NRR; ne NX 2 [= CT Rs z , como definido no documento US9034336B2, o conteúdo das quais é aqui incorporada a título de referência na sua totalidade.

[0197] Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um modulador SMAD7. Por exemplo, o modulador SMAD7 pode ser um oligonucleotídeo antisense SMAD7 (AON), conforme definido no documento WO2017059225A1, cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.

[0198] O agente imunomodulador pode ser um modulador de TLR. Por exemplo, o agente imunomodulador pode ser um modulador TLR3, TLRA4, TLR7, TLR8 ou TLR9, como um agonista TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 ou TLR9 ou um antagonista de TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 ou TLR9. Em algumas modalidades, o modulador TLR é um modulador TLR3. Em algumas modalidades, o modulador TLR é um modulador TLRA4. Em algumas modalidades, o modulador TLR é um modulador TLR7. Em algumas modalidades, o modulador TLR é um modulador TLR8. Em algumas modalidades, o modulador TLR é um modulador TLR9. Em algumas modalidades, o modulador de TLR é um agonista de TLR3. Em algumas modalidades, o modulador de TLR é um agonista de TLRA4. Em algumas modalidades, o modulador de TLR é um agonista de TLR7. Em algumas modalidades, o modulador de TLR é um agonista de TLR8. Em algumas modalidades, o modulador de TLR é um agonista de TLR9. Em algumas modalidades, o modulador de TLR é um antagonista de TLR3. Em algumas modalidades, o modulador de TLR é um antagonista de TLR4. Em algumas modalidades, o modulador de TLR é um antagonista de TLR7. Em algumas modalidades, o modulador de TLR é um antagonista de TLR8. Em algumas modalidades, o modulador de TLR é um antagonista de TLR9. Em algumas modalidades, o modulador de TLR aqui descrito pode modular dois ou mais TLRs. Em algumas modalidades, o modulador de TLR pode ativar um ou mais TLRs e inibir um ou mais TLR. Em algumas modalidades, o modulador TLR é um modulador TLR9, como KAPPAPROCTº ou MONARSENº Alguns moduladores de TLR exemplares são descritos, por exemplo, nº documento WO2017059225A1.

[0199] Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um oligonucleotídeo CpG-A ou Cpg-B, conforme descrito no documento WO2017059225A1.

[0200] A detecção citosólica de DNA derivado de patógeno requer sinalização através da quinase de ligação a TANK 1 (TBK1) e seu fator de transcrição a jusante, fator regulador de IFN 3 (IRF3). Uma proteína transmembranar chamada STING (estimulador dos genes IFN; também conhecido como MITA, ERIS, MPYS e TMEM173) funciona como receptor de sinalização para esses dinucleotídeos de purina cíclicos, causando estimulação do eixo de sinalização TBK1-IRF3 e um interferon do tipo | dependente de STING resposta. Assim, em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um modulador STING. O STING se liga diretamente ao diguanilato monofosfato cíclico, mas não a outros nucleotídeos ou ácidos nucleicos não relacionados. Por conseguinte, em algumas modalidades, o modulador STING é um dinucleotídeo de purina cíclico. Exemplos de dinucleotídeos de purina cíclicos e moduladores STING são descritos, por exemplo, no documento US 9549944B2, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade.

[0201] Imunossupressores exemplificadores adicionais incluem, sem limitação abatacept; adalimumab; agonistas do receptor de adenosina; anakinra; inibidores de receptores aril-hidrocarbonetos; inibidores de autofagia, como 3-metiladenina; inibidores de calcineurina; inibidores de calcineurina, como ciclosporina e tacrolimus; Inibidores de caspase-l; certolizumab; inibidores de cGAS; corticosteroides; corticosteroides, “como prednisonay budesonida, prednisolona; inibidores de citocina; ativadores de receptores de citocinas; inibidores de receptores de citocinas; etanercept; glicocorticoides; golimumab; Agonistas do receptor acoplado à proteína G; Antagonistas do receptor acoplado à proteína G; inibidores de histona desacetilase; inibidores de histona desacetilase, como tricostatina A; Inibidores de IMDH, como azatioprina, leflunomida e micofenolato; inflióimabe; inibidores da função mitocondrial, como a rotenona; ixekizumab; inibidores de quinase; —Metilprednisolona; anticorpos — monoclonais, — como basiliximabe, daclizumab e muromonab; inibidores de mMTOR, como rapamicina ou um análogo da rapamicina, sirolimus e everolimus; natalizumab; Inibidores de NF-KkB, como 6Bio, Dexametasona, TCPA-1, IKK VII; OTK3; ATPs oxidados, como bloqueadores de receptores P 2X; Inibidores de P 38; agonistas de receptores ativados por proliferador de peroxissomo; antagonistas de receptores ativados por proliferador de peroxissomo; inibidores de fosfatase; inibidores de fosfodiesterase, como inibidor de fosfodiesterase 4 (PDE4), como Rolipram; Inibidores de PI3 KB, como TG X-221; agonistas da prostaglandina E2 (PGE2), como Misoprostol; inibidor de proteassoma | (PSI); inibidores de proteassoma; retinoides; rituximabe; secukinumab; estatinas; Agonistas do receptor TGF-p; Agentes de sinalização de TGF-B; Timoglobulina; Antagonistas de TLR9; tocilizumab; ustekinumab; e vedolizumab. Os imunossupressores também incluem IDO, vitamina D3, ciclosporinas, como ciclosporina A, inibidores de receptores de aril hidrocarbonetos, resveratro|, azatiopurina (Aza), 6-mercaptopurina (6- MP), G6-tioguanina (6-TG), FK506, sangliferira A, salmeterol, micofenolato de mofetil (MMF), aspirina e outros inibidores de COX, ácido niflumico, estriol e triptolídeo, interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-10), ciclosporina A, siRNAs direcionados a citocinas ou receptores de citocinas e similares.

[0202] Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é selecionado do grupo que consiste em 3-metiladenina, 6-Bio, 6-

mercaptopurina (6-MP, 6-tioguanina (6-TG), FK506, sanglifehrin A, abatacept, adalimumab, anakinra, inibidores do receptor de hidrocarboneto de arilo, aspirina, inibidores da autofagia, azatioprina, basiliximab, budesonida, inibidores da calcineurina, os inibidores da caspase-l, certolizumab, inibidores cgas, inibidores da COX, ácido niflúmico, ciclosporina, inibidores de citoquinas, ativadores de receptor de citocinas, inibidores de receptores de citocinas, daclizumab, Dexametasona, estriol, etanercept, everolímus, glicocorticoides, golimumab, agonistas dos receptores acoplados à proteína G, antagonistas dos receptores acoplados à proteína G, antagonistas dos receptores acoplados à proteína G, inibidores da histona desacetilase, IDO, IKK VII, inflióimabe, interleucina-1, interleucina-10, interleucina, inibidores de quinase, leflunomida, Metilprednisolona, Misoprostol, muromonab, micofenolato, micofenolato mofetil (MMF), natalizumab, OTK3, ATPs oxidados, bloqueadores de receptores P 2X, inibidores de P38, perox agonistas de receptores ativados por proliferador de isoma, antagonistas de receptores ativados por proliferador de peroxissomo, inibidores de fosfatase, inibidores de P13 KB, prednisolona, prednisona, inibidor de proteassoma | (PSI), inibidores de proteassoma, análogos de rapamicina e rapamicina, resveratrol, retinoides, rituximabe, roliximabe, rolipram, rotenona, rotenona, salmeterol, secukinumab, sirolimus, estatinas, tacrolimus, TCP A-1, TGX-221, timoglobulina, antagonistas de TLRO9, tocilizumab, tricostatina A, triptolide, ustekinumab, vedolizumab, vitamina D3 e qualquer combinação dos mesmos.

[0203] Note-se que qualquer um dos agentes de modulação imune aqui descritos pode ser usado com nanopartículas lipídicas, vetores de cCeDNA e/ou composições aqui reveladas. Por exemplo, o agente modulador de aimmune pode ser usado sozinho ou combinado com um ou mais (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco ou mais) outros agentes moduladores imunes aqui descritos.

[0204] Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é selecionado do grupo que consiste em inibidores do receptor de aril hidrocarboneto; Inibidores de caspase-1; inibidores de cGAS; inibidores de citocina; Agonistas do receptor acoplado à proteína G; Antagonistas do receptor acoplado à proteína G; inibidores da função mitocondrial ; inibidores de mMTOR ; Inibidores de NF-k; agonistas de receptores ativados por proliferador de peroxissomo; inibidores de fosfatase; inibidores de fosfodiesterase, TG X-221; agonistas da prostaglandina E2 (PGE2); Antagonistas de TLR9; inibidores de proteassoma; Agonistas do receptor TGF-B e agentes de sinalização do TGF-B. Pode-se usar qualguer um ou mais dos agentes acima, isoladamente ou em combinação com o LNP contendo ceDNA.

[0205] Também é fornecida aqui uma composição farmacêutica que compreende a nanopartícula lipídica e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0206] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de nanopartículas lipídicas que compreende ainda um ou mais excipientes farmacêuticos. Em algumas modalidades, a formulação de nanopartículas lipídicas compreende ainda sacarose, tris, trealose e/ou glicina. Algumas Características Exemplares do LNP

[0207] Geralmente, as nanopartículas lipídicas da invenção têm um diâmetro médio selecionado para fornecer um efeito terapêutico pretendido. Por conseguinte, em alguns aspectos, a nanopartícula lipídica tem um diâmetro médio de cerca de 30 nm a cerca de 150 nm, mais tipicamente de cerca de 50 nm a cerca de 150 nm, mais tipicamente cerca de 60 nm a cerca de 130 nm, mais tipicamente cerca de 70 nm a cerca de 110 nm, mais tipicamente cerca de 85 nm a cerca de 105 nm e, de preferência, cerca de 100 nm. Em alguns aspectos, a divulgação fornece partículas lipídicas que são maiores em tamanho relativo às nanopartículas comuns e cerca de 150 a 250 nm em tamanho. O tamanho das partículas das nanopartículas lipídicas pode ser determinado por espalhamento de luz quase elástico usando, por exemplo, um sistema Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, Reino Unido).

[0208] Dependendo do uso pretendido das partículas lipídicas, as proporções dos componentes podem ser variadas e a eficiência da entrega de uma formulação específica pode ser medida usando, por exemplo, um ensaio de parâmetro de liberação endossômica (ERP).

[0209] O ceDNA pode ser complexado com a porção lipídica da partícula ou encapsulado na posição lipídica da nanopartícula lipídica. Em algumas modalidades, o ceDNA pode ser totalmente encapsulado na posição lipídica da nanopartícula lipídica, protegendo-o desse modo da degradação por uma nuclease, por exemplo, em uma solução aquosa. Em algumas modalidades, o ceDNA na nanopartícula lipídica não é substancialmente degradado após a exposição da nanopartícula lipídica a uma nuclease a 37ºC. por pelo menos 20, 30, 45 ou 60 minutos. Em algumas modalidades, o ceDNA na nanopartícula lipídica não é substancialmente degradado após a incubação da partícula no soro a 37ºC por pelo menos cerca de 30, 45 ou 60 minutos ou pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 ou 36 horas.

[0210] Em certas modalidades, as nanopartículas lipídicas são substancialmente não tóxicas para um indivíduo, por exemplo, para um mamífero como um ser humano.

[0211] Em alguns aspectos, a formulação de nanopartículas lipídicas é um pó liofilizado.

[0212] Em algumas modalidades, nanopartículas lipídicas são partículas sólidas do núcleo que têm pelo menos uma bicamada lipídica. Em outras modalidades, as nanopartículas lipídicas têm uma estrutura não bicamada, isto é, uma morfologia não lamelar (isto é, não bicamada). Sem limitações, a morfologia não bicamada pode incluir, por exemplo, tubos tridimensionais, varetas, simetrias cúbicas etc. A morfologia não lamelar (isto é, estrutura não bicamada) das partículas lipídicas pode ser determinada usando técnicas analíticas conhecidas por e usado por aqueles versados na técnica. Tais técnicas incluem, sem limitação, microscopia eletrônica de transmissão criogênica ("Cryo- TEM"), calorimetria de varredura diferencial ("DSC"), difração de raios- X e similares. Por exemplo, a morfologia das nanopartículas lipídicas (lamelar vs. não lamelar) pode ser prontamente avaliada e caracterizada usando, por exemplo, a análise Cryo-TEM conforme descrito no documento US2010/0130588, cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade.

[0213] Em algumas modalidades adicionais, as nanopartículas lipídicas com uma morfologia não lamelar são densas em elétrons.

[0214] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma nanopartícula lipídica que é de estrutura unilamelar ou multilamelar. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de nanopartículas lipídicas que compreende partículas multivesiculares e/ou partículas à base de espuma.

[0215] Controlando a composição e a concentração dos componentes lipídicos, pode-se controlar a taxa na qual o conjugado lipídico troca da partícula lipídica e, por sua vez, a taxa na qual a nanopartícula lipídica se torna fusogênica. Além disso, outras variáveis, incluindo, por exemplo, pH, temperatura ou força iônica, podem ser usadas para variar e/ou controlar a taxa na qual a nanopartícula lipídica se torna fusogênica. Outros métodos que podem ser usados para controlar a taxa na qual a nanopartícula lipídica se torna fusogênica serão evidentes para aqueles versados na técnica com base nesta divulgação. Também será aparente que, controlando a composição e a concentração do conjugado lipídico, pode-se controlar o tamanho das partículas lipídicas.

[0216] O pKa de lipídios catiônicos formulados pode ser correlacionado com a eficácia dos LNPs na entrega de ácidos nucleicos (consulte J ayaraman et al., Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51 (34), 8.529 a 8.533; Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172 a 176 (20 O), os quais são incorporados a título de referência na sua totalidade). A faixa preferencial de pKa é de -5 a -7. O pKa do lipídio catiônico pode ser determinado em nanopartículas lipídicas utilizando um ensaio baseado na fluorescência do ácido 2-(p-toluidino)-6- naftaleno sulfônico (TNS).

[0217] A encapsulação de ceDNA em partículas de lipídio pode ser determinada através da realização de um ensaio de exclusão com o corante fluorescente de membrana impermeável, que utiliza um corante que tem fluorescência reforçada quando relacionado com ácido nucleico, por exemplo, um ensaio Oligreenº ou ensaio PicoGreenº. Geralmente, o encapsulamento é determinado adicionando o corante à formulação de partículas lipídicas, medindo a fluorescência resultante e comparando-a com a fluorescência observada após a adição de uma pequena quantidade de detergente não iônico. A ruptura mediada por detergente da bicamada lipídica libera o ceDNA encapsulado, permitindo que ele interaja com o corante impermeável à membrana. A encapsulação de CeDNA pode ser calculado como E = (lo- 1)/lo, em que | e lose refere às intensidades de fluorescência antes e após a adição de detergente.

[0218] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que inclui um ou mais compostos com um grupo funcional de polietilenoglicol (PEG) (os chamados "compostos PEGuilados") que podem reduzir a imunogenicidade/antigenicidade de fornecer hidrofilicidade e hidrofobicidade ao composto (ou compostos) e/ou reduzir a frequência de dosagem terapeuticamente eficaz. Em outros aspectos, a formulação de lipossomas pode simplesmente incluir polímero de polietileno glicol (P EG) como um componente adicional. Em tais aspectos, o peso molecular do grupo funcional PEG ou PEG pode ser de 62 Da a cerca de 5.000 Da.

[0219] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que fornecerá um ceDNA com perfil de liberação prolongada ou liberação controlada durante um período de horas a semanas. Em alguns aspectos relacionados, a formulação de lipossomas pode compreender câmaras aquosas que são ligadas por bicamadas lipídicas. Em outros aspectos relacionados, a formulação de lipossomas encapsula um ceDNA com componentes adicionais que passam por uma transição física a temperatura elevada que libera o CeDNA por um período de horas a semanas.

[0220] Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas compreende esfingomielina e um ou mais lipídios divulgados neste documento. Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas compreende optissomas.

[0221] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que inclui um ou mais lipídios selecionados a partir de: sal de sódio N-(carbonil-metoxipolietilenoglicol 2000)-1,2-distearoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina — (lipídio conjugado com distearoil-sn- glicerofosfoetanolamina), lipídio conjugado com MPEG (metóxi polietilenoglicol), HSPC (fosfatidilcolina de soja hidrogenada); PEG (polietileno glicol); DSPE (distearoil-sn-glicerofosfoetanolamina); DSPC (distearoilfosfatidilcolina); DOPC (dioleoilfosfatidilcolina);j DPPG (dipalmitoilfosfatidilglicerol); EPC (fosfatidilcolihpa de ovo); DOPS (dioleoilfosfatidilserina)); POPC (palmitoiloleoilfosfatidilcolina); SM (esfingomielina); MPEG (metóxi polietileno glicol); DMPC (dimiristoil fosfatidilcolina); DMPG (dimiristoilfosfatidilglicero!); DSPG (distearoilfosfatidilglicerol); DEPC (dierucoilfosfatidilcolina);j DOPE

(dioleol-sn-glicerofosfoetanolamina). sulfato de colesteril (CS), dipalmitoilfosfatidilglicero! (DPPG), DOPC (dioleol-sn- glicerofosfatidilcolina) ou qualguer combinação dos mesmos.

[0222] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que compreende fosfolipídio, colesterol e um lipídio PEGuilado em uma razão molar de 56:38:5. Em alguns aspectos, o conteúdo total de lipídios da formulação de lipossomas é 2 a 16 mg/ml. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfatidilcolina, um lipídio contendo um grupo funcional etanolamina e um lipídio PEGuilado. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfatidilcolina, um lipídio contendo um grupo funcional etanolamina e um lipídio PEGuilado em uma razão molar de 3:0,015:2, respectivamente. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfatidilcolina, colesterol e um lipídio PEGuilado. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que compreende um lipídio contendo um grupo funcional fosfatidilcolina e colesterol. Em alguns aspectos, o lipídio PEGuilado é PEG-2000- DSPE. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que compreende DPPG, PC de soja, conjugado lipídico MPEG-DSPE e colesterol.

[0223] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que compreende um ou mais lipídios contendo um grupo funcional fosfatidilcolina e um ou mais lipídios contendo um grupo funcional etanolamina. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que compreende um ou mais: lipídios contendo um grupo funcional fosfatidilcolina, lipídios contendo um grupo funcional etanolamina e/ou esterois, por exemplo, colesterol. Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas compreende DOPC/DEPC; e DOPE.

[0224] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que compreende ainda um ou mais excipientes farmacêuticos, por exemplo, sacarose e/ou glicina.

[0225] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que é de estrutura unilamelar ou multilamelar. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que compreende partículas multivesiculares e/ou partículas à base de espuma. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que é maior em tamanho relativo às nanopartículas comuns e cerca de 150 a 250 nm em tamanho. Em alguns aspectos, a formulação de lipossomas é um pó liofilizado.

[0226] Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma que é feita e carregada com vetores de ceDNA obtidos pelo processo do Exemplo 1 ou aqui divulgado de outra forma, adicionando uma base fraca a uma mistura com o ceDNA isolado fora do lipossomo. Essa adição aumenta o pH fora dos lipossomos para aproximadamente 7,3 e direciona o ceDNA para o lipossomo. Em alguns aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma com um pH ácido no interior do lipossomo. Nesses casos, o interior do lipossoma pode estar em pH 4-6,9 e, mais preferencialmente, em pH 6,5. Em outros aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossoma feita usando a tecnologia de estabilização de drogas intra-lipossômica. Nesses casos, são usados ânions poliméricos ou não poliméricos de alta carga e agentes de captura intra-lipossômicos, por exemplo, polifosfato ou octasulfato de sacarose.

[0227] Em outros aspectos, a divulgação fornece uma formulação de lipossomas que compreende fosfolipídios, lecitina, fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina.

[0228] O ceDNA aqui divulgado pode ser incorporado em composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo para entrega in vivo a células, tecidos ou órgãos do indivíduo. Tipicamente, a composição farmacêutica compreende o ceDNA aqui divulgado e um veículo farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, c e vetores de DNA da invenção podem ser incorporados em uma composição farmacêutica adequada para uma via desejada de administração terapêutica (por exemplo, administração parentérica). Transdução passiva de tecido por infusão intravenosa ou intra-arterial de alta pressão, bem como injeção intracelular, como microinjeção intranuclear ou injeção intracitoplasmática, também são contempladas. As composições farmacêuticas para fins terapêuticos podem ser formuladas como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomas ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de vetor de ceDNA. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto de vetor de ceDNA na quantidade necessária em um tampão apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada.

[0229] Um vetor de ceDNA como aqui divulgado pode ser incorporado a uma composição farmacêutica adequada para uso tópico, sistêmico, intra-amniótico, intratecal, intracraniano, intra-arterial, intravenoso, intralinfático, intraperitoneal, subcutâneo, traqueal, intra- tecido (por exemplo, intramuscular, intracardíaca, intra-hepática, intrarrenal, intracerebral), intratecal, intravesical, conjuntival (por exemplo, extra-orbital, intraorbital, retroorbital, intraretinal, sub- retiniana, coroidal, sub-coroidal, intrastromal, intracameral e intravítrea), intracoclear e oral (mucosa) administração retal, nasal). Transdução passiva de tecido por infusão intravenosa ou intra-arterial de alta pressão, bem como injeção intracelular, como microinjeção intranuclear ou injeção intracitoplasmática, também são contempladas.

[0230] As composições farmaceuticamente ativas compreendendo um vetor de ceDNA podem ser formuladas para entregar um transgene no ácido nucleico às células de um receptor, resultando na expressão terapêutica do transgene no mesmo. A composição também pode incluir um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0231] As composições e vetores aqui fornecidos podem ser usados para fornecer um transgene para vários propósitos. Em algumas modalidades, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina à ser usado para fins de pesquisa, por exemplo, para criar um modelo animal transgênico somático que abriga o transgene, por exemplo, para estudar a função do produto transgene. Em outro exemplo, o transgene codifica uma proteína ou RNA funcional que se destina a ser usado para criar um modelo animal de doença. Em algumas modalidades, o transgene codifica um ou mais peptídeos, polipeptídeos ou proteínas, que são úteis para o tratamento, melhora, prevenção de estados de doença em um mamífero. O transgene pode ser transferido para (por exemplo, expresso em) um indivíduo em um ambiente clínico em quantidade suficiente para tratar uma doença associada à expressão reduzida, falta de expressão ou disfunção do gene. Em algumas modalidades, o transgene pode ser transferido para (por exemplo, expresso em) um indivíduo em quantidade suficiente para tratar uma doença associada ao aumento da expressão, atividade do produto do gene ou regulação positiva inadequada de um gene que o transgene suprime ou causa a expressão da qual deve ser reduzida.

[0232] As composições farmacêuticas para fins terapêuticos geralmente devem ser estéreis e estáveis nas condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossomas ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de vetor de ceDNA. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto de vetor de ceDNA na quantidade necessária em um tampão apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada.

[0233] Um vetor de ceDNA aqui descrito pode ser administrado a um organismo para transdução de células in vivo.

[0234] Geralmente, a administração é realizada por qualquer uma das vias normalmente usadas para introduzir uma molécula no contato final com células sanguíneas ou teciduais. Os métodos adequados para administrar esses ácidos nucleicos estão disponíveis e são bem conhecidos dos versados na técnica e, embora mais de uma via possa ser usada para administrar uma composição específica, uma via específica pode frequentemente fornecer uma reação mais imediata e mais eficaz do que outra via. Exemplos de modos de administração do vetor de ceDNA divulgados neste documento incluem oral, retal, transmucosa, intranasal, inalação (por exemplo, via aerossol), bucal (por exemplo, sublingual), vaginal, intratecal, intraocular, transdérmica, intraendotelial, no útero (ou em ovo), parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intradérmica, intracraniana, intramuscular [incluindo administração ao músculo esquelético, diafragma e/ou cardíaco], intrapleural, intracerebral e intra-articular), tópico (por exemplo, tanto na pele como nas superfícies mucosas, incluindo superfícies das vias aéreas e administração transdérmica), intralinfática e similares, bem como injeção direta de tecido ou órgão (por exemplo, fígado, olho, músculo esquelético, músculo cardíaco, músculo diafragma ou cérebro).

[0235] A administração do vetor de ceDNA pode ser em qualquer local de um indivíduo, incluindo, sem limitação, um local selecionado do grupo que consiste no cérebro, um músculo esquelético, um músculo liso, o coração, o diafragma, o epitélio das vias aéreas, fígado, rim, baço, pâncreas, pele e olhos. A administração do vetor de ceDNA também pode ser em um tumor (por exemplo, em ou próximo a um tumor ou um linfonodo). A via mais adequada em qualquer caso depende da natureza e gravidade da condição a ser tratada, melhorada e/ou impedida e da natureza do vetor de ceDNA específico que está sendo usado. Além disso, o ceDNA permite administrar mais de um transgene em um único vetor ou vários vetores de ceDNA (por exemplo, um coquetel de ceDNA).

[0236] A administração do vetor de ceDNA revelada neste documento ao músculo esquelético inclui, mas não está limitada à administração no músculo esquelético dos membros (por exemplo, braço, antebraço, perna superior e/ou perna inferior), costas, pescoço, cabeça (por exemplo, língua), tórax, abdômen, pelve/períneo e/ou dígitos. O ceDNA como divulgado neste vetor pode ser entregue ao músculo esquelético por administração intravenosa, administração intra-arterial, administração intraperitoneal, perfusão de membro (opcionalmente, perfusão de membro isolada de uma perna e/ou braço; ver, por exemplo, Arruda et al., (2005) Blood 105: 3.458 a 3464) e/ou injeção intramuscular direta. Em modalidades particulares, o vetor de CeDNA conforme divulgado neste documento é administrado a um membro (braço e/ou perna) de um indivíduo (por exemplo, um indivíduo com distrofia muscular como DMD) por perfusão de membro, perfusão de membro opcionalmente isolada (por exemplo, por via intravenosa ou administração intra-articular. Em modalidades, o vetor ceEDNA como descrito no presente documento, pode ser administrada sem o uso de técnicas de "hidrodinâmica".

[0237] A administração do vetor de ceDNA, conforme divulgado neste documento ao músculo cardíaco, inclui administração no átrio esquerdo, átrio direito, ventrículo esquerdo, ventrículo direito e/ou septo. O vetor de ceDNA, conforme descrito aqui, pode ser entregue ao músculo cardíaco por administração intravenosa, administração intra-

arterial como administração intra-aórtica, injeção cardíaca direta (por exemplo, no átrio esquerdo, átrio direito, ventrículo esquerdo, ventrículo direito) e/ou perfusão da artéria coronária. A administração ao músculo diafragma pode ser por qualquer método adequado, incluindo administração — intravenosa, administração intra-arterial — e/ou administração intra-peritoneal. A administração ao músculo liso pode ser por qualguer método adequado, incluindo administração intravenosa, administração intra-arterial e/ou administração intra- peritoneal. Em uma modalidade, a administração pode ser em células endoteliais presentes no músculo, próximo e/ou no músculo liso.

[0238] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA de acordo com a presente invenção é administrado ao músculo esquelético, músculo diafragma e/ou músculo cardíaco (por exemplo, para tratar, melhorar e/ou prevenir distrofia muscular ou doença cardíaca (por exemplo, PAD ou insuficiência cardíaca congestiva).

[0239] Um vetor de ceDNA de acordo com a presente invenção pode ser administrado ao SNC (por exemplo, ao cérebro ou aos olhos). O vetor de ceDNA pode ser introduzido na medula espinhal, tronco cerebral (medula oblongada, ponte), mesencéfalo (hipotálamo, tálamo, epitálamo, glândula pituitária, substância negra, glândula pineal), cerebelo, telencéfalo (corpo estriado, cérebro incluindo occipital, temporal). lobos parietais e frontais, córtex, gânglios da base, hipocampo e porta-amígdala), sistema límbico, neocórtex, corpo estriado, cérebro e colículo inferior. O vetor de ceEDNA também pode ser administrado em diferentes regiões do olho, como retina, córnea e/ou nervo óptico. O vetor de ceDNA pode ser entregue no líquido cefalorraquidiano (por exemplo, por punção lombar). O vetor de ceEDNA pode ainda ser administrado por via intravascular ao SNC em situações nas quais a barreira hematoencefálica foi perturbada (por exemplo, tumor cerebral ou infarto cerebral).

[0240] O vetor de ceDNA pode ser administrado à região (ou regiões) desejada do SNC por qualquer via conhecida na técnica, incluindo, sem limitação, intratecal, intra-ocular, intracerebral, intraventricular, intravenosa (por exemplo, na presença de um açúcar como o manitol), intranasal, intra-aural, intra-ocular (por exemplo, intra- vítreo, sub-retinal, câmara anterior) e peri-ocular (por exemplo, região de entrega sub-Tenon), bem como por via entrega intramuscular com entegra retrógrada para neurônios motores.

[0241] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é administrado em uma formulação líquida por injeção direta (por exemplo, injeção estereotática) na região ou compartimento desejado no CNS. Em outras modalidades, o vetor de ceEDNA pode ser fornecido por aplicação tópica na região desejada ou por administração intra-nasal de uma formulação de aerossol. A administração ocular pode ser por aplicação tópica de gotículas de líquido. Como alternativa adicional, o vetor de ceEDNA pode ser administrado como uma formulação sólida de liberação lenta (ver, por exemplo, Patente nº US 7.201.898). Em modalidades ainda adicionais, o vetor de ceDNA pode ser usado para transporte retrógrado para tratar, melhorar e/ou prevenir doenças e distúrbios envolvendo neurônios motores (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica (ALS); atrofia muscular espinhal (SMA), etc.). Por exemplo, o vetor de ceEDNA pode ser entregue ao tecido muscular a partir do qual pode migrar para os neurônios. Tratamento ex vivo

[0242] Em algumas modalidades, as células são removidas de um indivíduo, um vetor de ceDNA é introduzido no mesmo e as células são então substituídas novamente no indivíduo. Os métodos de remoção de células do indivíduo para tratamento ex vivo, seguidos de introdução no indivíduo, são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente nº US

5.399.346; cuja divulgação é aqui incorporada na sua totalidade).

Alternativamente, um vetor de ceDNA é introduzido em células de outro indivíduo, em células cultivadas ou em células de qualquer outra fonte adequada, e as células são administradas a um indivíduo em necessidade.

[0243] As células transduzidas com um vetor de ceDNA são preferencialmente administradas ao indivíduo em uma "quantidade terapeuticamente eficaz" em combinação com um carreador farmacêutico. Os versados na técnica compreenderão que os efeitos terapêuticos não precisam ser completos ou curativos, desde que seja fornecido algum benefício ao indivíduo.

[0244] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA pode codificar um transgene (às vezes chamado de sequência nucleotídica heteróloga) que é qualquer polipeptídeo que é desejávelmente produzido em uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Por exemplo, em contraste com o uso dos vetores de ceDNA em um método de tratamento, em algumas modalidades os vetores de ceDNA podem ser introduzidos em células cultivadas e o produto genético expresso isolado a partir das mesmas, por exemplo, para a produção de antígenos ou vacinas.

[0245] Os vetores ceDNA podem ser usados em aplicações veterinárias e médicas. Os indivíduos adequados para os métodos de entrega de genes ex vivo, conforme descrito acima, incluem tanto aves (por exemplo, galinhas, patos, gansos, codornas, perus e faisões) quanto mamíferos (por exemplo, seres humanos, bovinos, ovinos, caprinos, equinos, felinos, caninos e lagomorfos), sendo preferenciais os mamíferos. Os seres humanos são os preferenciais. Os seres humanos incluem recém-nascidos, bebês, jovens e adultos.

[0246] Em algumas modalidades, um transgene presente no cassete de expressão, no construto de expressão ou no vetor de ceEDNA aqui descrito pode ser otimizado por códon para a célula hospedeira.

Conforme usado neste documento, o termo "códon otimizado" ou "otimização de códon" se refere ao processo de modificação de uma sequência de ácido nucleico para expressão aprimorada nas células do vertebrado de interesse, por exemplo, camundongo ou humano (por exemplo, humanizado), substituindo pelo menos um, mais de um ou um número significativo de códons da sequência nativa (por exemplo, uma sequência procariótica) com códons que são mais frequentemente ou mais frequentemente usados nos genes desse vertebrado. Várias espécies exibem viés particular para certos códons de um aminoácido particular. Tipicamente, a otimização do códon não altera a sequência de aminoácidos da proteína traduzida original. Códons optimizados podem ser determinados com o uso, por exemplo, de plataforma de síntese de genes de códon de otimização e personalizado Gene Forgeº da Aptagen (Aptagen, Inc.) ou uma outra base de dados disponíveis publicamente.

[0247] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA expressa o transgene em uma célula hospedeira em questão. Em algumas modalidades, a célula hospedeira em questão é uma célula hospedeira humana, incluindo, por exemplo, células sanguíneas, células-tronco, células hematopoiéticas, células CD34*t, células hepáticas, células cancerígenas, células vasculares, células musculares, células pancreáticas, células neurais, oculares ou células da retina, células epiteliais ou endoteliais, células dendríticas, fibroblastos ou qualquer outra célula de origem mamiífera, incluindo, sem limitação, células hepáticas (isto é, fígado), células pulmonares, células cardíacas, células pancreáticas, células intestinais, células diafragmáticas, células renais (isto é, rim), células neurais, células sanguíneas, células da medula óssea ou qualquer um ou mais tecidos selecionados de um indivíduo para o qual a terapia gênica é contemplada. Em um aspecto, a célula hospedeira em questão é uma célula hospedeira humana

[0248] Um aspecto da tecnologia aqui descrita se refere a um método de entrega de um transgene a uma célula. Tipicamente, para métodos in vitro, o vetor de ceDNA pode ser introduzido na célula usando os métodos como divulgados neste documento, bem como outros métodos conhecidos na técnica. Os vetores de ceDNA divulgados neste documento são preferencialmente administrados à célula em uma quantidade biologicamente eficaz. Se o vetor de ceEDNA for administrado a uma célula in vivo (por exemplo, a um indivíduo), uma quantidade biologicamente eficaz do vetor de ceDNA é uma quantidade que é suficiente para resultar na transdução e expressão do transgene em uma célula alvo. Faixas de Dose

[0249] Ensaios in vivo e/ou in vitro podem opcionalmente ser usados para ajudar a identificar faixas de dosagem ideais para uso. À dose exata a ser usada na formulação também dependerá da via de administração e da gravidade da condição, e deve ser decidida de acordo com o julgamento da versado na técnica e com as circunstâncias de cada indivíduo. As doses efetivas podem ser extrapoladas a partir de curvas dose-resposta derivadas de sistemas de teste in vitro ou em modelo animal.

[0250] Um vetor de ceDNA é administrado em quantidades suficientes para transfectar as células de um tecido desejado e fornecer níveis suficientes de transferência e expressão de genes sem efeitos adversos indevidos. As vias de administração convencionais e farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outras, as descritas acima na seção "administração", como entrega direta ao órgão selecionado (por exemplo, entrega intraportal ao fígado), oral, inalação (incluindo intranasal e administração intratraqueal), intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intradérmica, intratumoral e outras vias de administração parentais. As vias de administração podem ser combinadas, se desejado.

[0251] A dose da quantidade de um vetor ceDNA necessária para atingir um determinado "efeito terapêutico" irá variar de acordo com vários fatores, incluindo, sem limitação: a via de administração de ácido nucleico, o nível do gene ou expressão de RNA necessária para alcançar um efeito terapêutico, a doença ou distúrbio específico a ser tratado e a estabilidade do gene (ou genes), produto (ou produtos) de RNA ou proteína (ou proteínas) expressa resultante. Um versado na técnica pode determinar rapidamente um intervalo de dose do vetor de CeDNA para tratar um indivíduo com uma doença ou distúrbio específico com base nos fatores mencionados acima, bem como em outros fatores que são bem conhecidos na técnica.

[0252] O regime de dosagem pode ser ajustado para fornecer a resposta terapêutica ideal. Por exemplo, o oligonucleotídeo pode ser administrado repetidamente, por exemplo, várias doses podem ser administradas diariamente ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. Um versado na técnica será capaz de determinar prontamente doses e esquemas de administração apropriados dos oligonucleotídeos indivíduos, se os oligonucleotídeos devem ser administrados às células ou aos indivíduos.

[0253] Uma "dose terapeuticamente eficaz" cairá em uma faixa relativamente ampla que pode ser determinada através de ensaios clínicos e dependerá da aplicação específica (as células neurais exigirão quantidades muito pequenas, enquanto a injeção sistêmica exigiria grandes quantidades). Por exemplo, para injeção direta in vivo no músculo esquelético ou cardíaco de um indivíduo humano, uma dose terapeuticamente eficaz será da ordem de cerca de 1 ug a 100 g do vetor de ceDNA. Se exossomos ou micropartículas são usadas para fornecer o vetor de ceDNA, então uma dose terapeuticamente eficaz pode ser determinada experimentalmente, mas é esperado que entregue de 1 ug a cerca de 100 g de vetor.

[0254] A formulação de excipientes e soluções transportadoras farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecida dos versados na técnica, como é o desenvolvimento de regimes de dosagem e tratamento adequados para usar as composições particulares descritas aqui em uma variedade de regimes de tratamento.

[0255] Para a transfecção in vitro, uma quantidade eficaz de um vetor de ceDNA a ser entregue às células (1x105 células) será da ordem de 0,1 a 100 ug de vetor de ceDNA, de preferência de 1 a 20 ug e mais preferencialmente de 1 a 15 ug ou 8 a 10 ug. Vetores maiores de ce-EDNA exigirão doses mais altas. Se forem usados exossomos ou micropartículas, uma dose eficaz in vitro pode ser determinada experimentalmente, mas se destinaria a fornecer geralmente a mesma quantidade do vetor de ceDNA.

[0256] O tratamento pode envolver a administração de uma dose única ou várias doses. Em modalidades particulares, mais de uma administração (por exemplo, duas, três, quatro ou mais administrações) pode ser usada para atingir o nível desejado de expressão gênica durante um período de vários intervalos, por exemplo, diário, semanal, mensal, anual, etc. Em algumas modalidades, mais de uma dose pode ser administrada a um indivíduo; de fato, doses múltiplas podem ser administradas conforme necessário, devido ao fato de que o vetor de CeDNA não provoca uma resposta imune do hospedeiro antidesmídeo devido à ausência de um capsídeo viral. Como tal, um versado na técnica pode determinar rapidamente um número apropriado de doses. O número de doses administradas pode, por exemplo, ser da ordem de 1 a 100, de preferência 2 a 20 doses.

[0257] Sem desejar ater-se a nenhuma teoria em particular, a falta de resposta imune antiviral típica provocada pela administração de um vetor de ceDNA conforme descrito na divulgação (isto é, a ausência de componentes do capsídeo) permite que o vetor de ceDNA seja administrado para um host em várias ocasiões. Em algumas modalidades, o número de ocasiões em que um ácido nucleico heterólogo é entregue a um indivíduo varia de duas a 10 vezes (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes). Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA é entregue a um indivíduo mais de 10 vezes.

[0258] Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceEDNA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez por dia do calendário (por exemplo, um período de 24 horas). Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez a cada 2,3, 4, 5, 6 ou 7 dias corridos. Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez por semana civil (por exemplo, 7 dias corridos). Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais do que duas vezes por semana (por exemplo, uma vez em um período de duas semanas civis). Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de cCeDNA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez por mês de calendário (por exemplo, uma vez em 30 dias corridos). Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez a cada seis meses. Em algumas modalidades, uma dose de um vetor de ceDNA é administrada a um indivíduo não mais que uma vez por ano de calendário (por exemplo, 365 dias ou 366 dias em um ano bissexto). Formas de Dosagem Unitária

[0259] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas na forma de dosagem unitária. Uma forma de dosagem unitária será tipicamente adaptada a uma ou mais vias de administração específicas da composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por inalação. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por um vaporizador. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por um nebulizador. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração por um aerossolizador. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração oral, para administração bucal ou para administração sublingual. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Em algumas modalidades, a forma de dosagem unitária é adaptada para administração intratecal ou intracerebroventricular. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é formulada para administração tópica. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material transportador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente a quantidade do composto que produz um efeito terapêutico Preparação de Nanopartículas Lipídicas

[0260] Nanopartículas lipídicas podem se formar espontaneamente após a mistura do ceDNA e do lipídio (ou lipídios). Dependendo da distribuição de tamanho de partícula desejada, a mistura de nanopartículas resultante pode ser estrudada através de uma membrana (por exemplo, corte de 100 nm) usando, por exemplo, uma extrusora de termobarrel, como E xtrusora Lipex (Northern Lipids, Inc). Em alguns casos, a etapa de extrusão pode ser omitida. A remoção de etanol e a troca simultânea de tampão podem ser realizadas por, por exemplo, diálise ou filtração de fluxo tangencial.

[0261] Geralmente, as nanopartículas lipídicas podem ser formadas por qualquer método conhecido na técnica, incluindo. Por exemplo, as nanopartículas lipídicas podem ser preparadas pelos métodos descritos, por exemplo, nos documentos US2013/0037977, US2010/0015218, US2013/0156845, US2013/0164400, US2012/0225129 e US2010/0130588, conteúdo de cada um dos quais é incorporado aqui a título de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, as nanopartículas lipídicas podem ser preparadas usando um método de mistura contínua, um processo de diluição direta ou um processo de diluição em linha. Os processos e aparelhos para aparelhos para a preparação de nanopartículas lipídicas usando processos de diluição direta e diluição em linha são descritos no documento US2007/0042031, cujo conteúdo é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade. Os processos e aparelhos para a preparação de nanopartículas lipídicas usando processos de diluição passo a passo são descritos no documento US2004/0142025, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade.

[0262] Em um exemplo não limitativo, as nanopartículas lipídicas podem ser preparadas por um processo de jato iminente. Geralmente, as partículas são formadas pela mistura de lipídios dissolvidos em álcool (por exemplo, etanol) com ceDNA dissolvido em um tampão, por exemplo, um tampão de citrato, um tampão de acetato de sódio, um tampão de acetato de sódio e cloreto de magnésio, um tampão de ácido málico, um tampão de ácido málico e cloreto de sódio ou tampão citrato de sódio e cloreto de sódio. A razão de mistura de lipídios e cCeDNA pode ser de cerca de 45 a 55% de lipídios e cerca de 65 a 45% de ceDNA.

[0263] A solução lipídica pode conter um lipídio ionizável, um lipídio não catiônico (por exemplo, um fosfolipídio, como DPSC), uma molécula conjugada com PEG ou PEG (por exemplo, PEG-lipídio) e um estero! (por exemplo, colesterol) em uma concentração lipídica total de 5 a 30 mg/ml, mais provável 5 a 15 mg/ml, provavelmente 9 a 12 mg/ml em um álcool, por exemplo, em etanol.

[0264] Na solução lipídica, a razão molar dos lipídios pode variar de cerca de 25 a 98% para o lipídio catiônico, preferencialmente cerca de a 65%; cerca de O a 15% para o lipídio não iônico, preferencialmente cerca de O a 12%; cerca de O a 15% para a molécula conjugada com PEG ou PEG, preferencialmente cerca de 1 a 6%; e cerca de 0 a 75% para o esterol|, preferencialmente cerca de 30 a 50%.

[0265] A solução de ceDNA pode compreender o ceDNA em uma faixa de concentração de 0,3 a 1,0 mg/ml, preferencialmente 0,3 a 0,9 mg/ml em solução tamponada, com pH na faixa de 3,5a5.

[0266] Para formar os LNPs, em uma modalidade exemplificadora, mas não limitativa, os dois líquidos são aquecidos a uma temperatura na faixa de cerca de 15 a 40ºC, preferencialmente cerca de 30 a 40ºC, e depois misturados, por exemplo, em um misturador a jato, formando instantaneamente o LNP. A vazão de mistura pode variar de 10 a 600 ml/min. O ID do tubo pode ter um intervalo de 0,25 a 1,0 mm e uma taxa de fluxo total de 10 a 600 ml/min. A combinação de taxa de fluxo e ID da tubulação pode ter o efeito de controlar o tamanho de partícula dos LNPs entre 30 e 200 nm. A solução pode então ser misturada com uma solução tamponada a um pH mais alto com uma razão de mistura na faixa de 1:1 a 1:3 em volume, preferencialmente cerca de 1:2 em volume. Se necessário, essa solução tamponada pode estar a uma temperatura na faixa de 15 a 40ºC ou 30 a 40ºC. Os LNPs mistos podem então passar por uma etapa de filtração por troca aniônica. Antes da troca aniônica, os LNPs misturados podem ser incubados por um período de tempo, por exemplo, de 30 minutos a 2 horas. A temperatura durante a incubação pode estar na faixa de 15 a 40ºC ou 30 a 40ºC. Após a incubação, a solução é filtrada através de um filtro, como um filtro de 0,8 um, contendo uma etapa de separação por troca aniônica. Esse processo pode usar IDs de tubulação que variam de 1 mm de ID a 5 mm de ID e uma taxa de fluxo de 10 a 2.000 ml/min.

[0267] Após a formação, os LNPs podem ser concentrados e diafiltrados através de um processo de ultrafiltração em que o álcool é removido e o tampão é trocado pela solução tampão final, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato (PBS) a cerca de pH 7, por exemplo, aproximadamente pH 6,9, cerca de pH 7,0, cerca de pH 7,1, cerca de pH 7,2, cerca de pH 7,3 ou cerca de pH 7,4.

[0268] O processo de ultrafiltrtação pode usar um formato de filtragem de fluxo tangencial (TFF) usando um intervalo de corte de peso molecular nominal de membrana de 30 a 500 KD. O formato da membrana é fibra oca ou cassete de folha plana. Os processos de TFF com o limite de peso molecular adequado podem reter o LNP no retido e o filtrado ou permeado contém o álcool; tampão citrato e resíduos finais de tampão. O processo TFF é um processo de etapas múltiplas com uma concentração inicial para uma concentração de ceDNA de 1 à 3 mg/ml. Após a concentração, a solução de LNPs é diafiltrada contra o tampão final por 10 a 20 volumes para remover o álcool e realizar a troca de tampões. O material pode então ser concentrado mais uma dobra de 1-3. A solução concentrada de LNP pode ser filtrada estéril. ceDNA

[0269] Em várias modalidades, os vetores de ceDNA são moléculas de DNA dúplex lineares, livres de capsídeos, formadas a partir de uma cadeia contínua de DNA complementar com extremidades fechadas covalentemente (estrutura linear, contínua e não encapsidada), que compreende um terminal invertido de 5' sequência de repetição (ITR) e uma sequência de 3' ITR que são diferentes ou assimétricas entre si. Pelo menos uma das ITRs compreende um sítio de resolução de terminal funcional e um sítio de ligação à proteína de replicação (RPS) (algumas vezes referido como um sítio de ligação à proteína replicativa), por exemplo, um sítio de ligação Rep. Geralmente, o vetor de ceEDNA contém pelo menos uma sequência de repetição terminal invertida (ITR)

de AAV modificada, isto é, uma deleção, inserção e/ou substituição em relação à outra ITR e um transgene expressável.

[0270] Em uma modalidade, pelo menos uma das ITRs é uma ITR de AAV, por exemplo, um AAV do tipo selvagem ITR. Em uma modalidade, pelo menos uma das ITRs é uma ITR modificada em relação à outra ITR - ou seja, o ceDNA compreende ITRs que são assimétricos entre si. Em uma modalidade, pelo menos uma das ITRs é uma ITR não funcional.

[0271] Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende: (1) um cassete de expressão que compreende um elemento regulador cis, um promotor e pelo menos um transgene; ou (2) um promotor operacionalmente ligado a pelo menos um transgene e (3) duas sequências auto-complementares, por exemplo, ITRs, flanqueando a dita cassete de expressão, em que o vetor de ceDNA não está associado a uma proteína do capsídeo. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende duas sequências auto-complementares encontradas em um genoma de AAV, em que pelo menos uma compreende um elemento de ligação a Rep (RBE) e um sítio de resolução de terminal (trs) de AAV ou uma variante funcional do RBE, e um ou mais elementos de regulação cis ligados operacionalmente a um transgene. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA compreende componentes adicionais para regular a expressão do transgene, por exemplo, comutadores reguladores para controlar e regular a expressão do transgene e pode incluir um comutador regulador que é um comutador de morte para permitir a morte celular controlada de uma célula que compreende um vetor de ceDNA.

[0272] Em algumas modalidades, as duas sequências auto- complementares podem ser sequências de ITR de qualquer parvovírus conhecido, por exemplo, um dependovírus como o AAV (por exemplo, AAVI1-AAV12). Qualquer sorotipo de AAV pode ser usado, incluindo,

sem limitação, uma sequência ITR de AAV2 modificada, que retém um sítio de ligação a Rep (RBS) como 5"-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'(SEQ ID Nº: 531) e um sítio de resolução de terminal (trs) além de uma sequência palindrômica variável que permite a formação de estrutura secundária em gancho de cabelo.

Em algumas modalidades, uma ITR pode ser sintética.

Em uma modalidade, uma ITR sintética é baseada em sequências de ITR de mais de um sorotipo de AAV.

Em outra modalidade, uma ITR sintética não inclui sequência baseada em AAV.

Em ainda outra modalidade, uma ITR sintética preserva a estrutura de ITR descrita acima, embora possua apenas alguma ou nenhuma sequência originada por AAV.

Em alguns aspectos, uma ITR sintética pode interagir preferencialmente com um representante do tipo selvagem ou um representante de um sorotipo específico ou, em alguns casos, não será reconhecido por um representante do tipo selvagem e será reconhecido apenas por um representante com mutação.

Em algumas modalidades, a ITR é uma sequência ITR sintética que retém um sítio de ligação a Rep (RBS) funcional, como 5' - GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID Nº: 531) e um sítio de resolução de terminal (TRS), além de uma sequência palindrômica variável que permite gancho de cabelo formação de estrutura secundária.

Em alguns exemplos, uma sequência ITR modificada retém a sequência do RBS, trs e a estrutura e posição de um elemento de ligação Rep que forma a porção de alça terminal de uma das estruturas secundárias em gancho de cabelo ITR da sequência correspondente do ITR AAV2 do tipo selvagem.

Sequências de ITR exemplificativas para uso nos vetores de cCeDNA são reveladas nas Tabelas 2-9, 10A e 10B, SEQ ID Nº: 2, 52, 101-449 e 545-547, e nas sequências de ITR parciais mostradas nas Figuras 26A-26B do pedido Nº PCT/US18/49996, depositado em 7 de setembro de 2018. Em algumas modalidades, um vetor de ceEDNA pode compreender uma ITR com uma modificação na ITR correspondente a qualquer uma das modificações nas sequências de ITR ou sequências parciais ITR mostradas em qualquer uma ou mais das Tabelas 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10A e 10B pedido Nº PCT/US18/49996, depositado em 7 de setembro de 2018.

[0273] Em algumas modalidades, o vetor de DNA fechado compreende um promotor operacionalmente ligado a um transgene, em que o ceDNA é desprovido de proteínas do capsídeo e é: (a) produzido a partir de um plasmídeo ceDNA que codifica um IAV de AAV2 do lado direito mutado ter o mesmo número de pares de bases dúplex intramolecularmente como SEQ ID Nº: 2 ou um ITR de AAV2 do lado esquerdo mutado com o mesmo número de pares de bases dúplex intramolecularmente duplos como SEQ ID Nº: 51 em sua configuração secundária em gancho de cabelo (de preferência excluindo a exclusão de qualquer AAA ou Loop terminal TTT nessa configuração em comparação com essas sequências de referência) e (b) é identificado como ceDNA usando o ensaio para a identificação de ceDNA por eletroforese em gel de agarose sob gel nativo e condições de desnaturação no Exemplo 1.

[0274] Os vetores de ceDNA são obtidos por um número de meios que seriam conhecidos do versado na técnica depois de ler esta divulgação. Por exemplo, o vetor de DNA não viral sem capsídeo pode ser obtido a partir de um plasmídeo (referido aqui como "plasmídeo ceDNA'") que compreende um modelo de construto de expressão de polinucleotídeo compreendendo nesta ordem: uma primeira repetição terminal invertida de 5' (por exemplo, ITR de AAV); um cassete de expressão; e uma ITR 3' (por exemplo, ITR de AAV), em que pelo menos uma dentre 5' e 3! ITR é uma ITR modificada ou quando, quando as ITRs 5' e 3' são modificados, as mesmas têm modificações diferentes entre si e não são a mesma sequência. Sem limitações, um modelo de construto de expressão de polinucleotídeo usado para gerar os vetores de ceDNA pode ser um plasmídeo ceDNA, um ceDNA-bacmídeo e/ou um ceDNA-baculovírus. Em algumas modalidades, o plasmídeo ceDNA compreende um sítio de clonagem de restrição (por exemplo, SEQ ID Nº: 7) operacionalmente posicionado entre as ITRs onde um cassete de expressão que compreende, por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um transgene, por exemplo, um gene repórter e/ou um gene terapêutico) pode ser inserido.

[0275] Por exemplo, os vetores de DNA livres do capsídeo não viral podem ser produzidos em células hospedeiras permissivas a partir de um construto de expressão (por exemplo, um plasmídeo, um bacmídeo, um baculovírus ou uma linha celular integrada) contendo um gene heterólogo posicionado entre duas sequências diferentes de repetição terminal invertida (ITR). Pelo menos uma das ITRs é modificada por deleção, inserção e/ou substituição em comparação com uma sequência ITR do tipo selvagem (por exemplo, ITR de AAV); e pelo menos uma das ITRs compreende um sítio de resolução de terminal funcional (trs) e um sítio de ligação a Rep. O vetor de ceDNA é preferencialmente dúplex, por exemplo, auto-complementar, sobre pelo menos uma porção da molécula, como a cassete de expressão. Por exemplo, o ceDNA não é um molecular circular de fita dupla. Em algumas modalidades, o vetor de cCeDNA tem extremidades fechadas covalentemente e, portanto, é resistente à digestão com exonucleases (por exemplo, exonuclease | ou exonuclease Ill), por exemplo, por mais de uma hora a 37ºC.

[0276] Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA compreende, na direção 5' a 3': uma primeira repetição terminal invertida (ITR) de vírus adeno-associado (AAV), uma sequência de nucleotídeos de interesse (por exemplo, um cassete de expressão como descrito aqui) e um segundo ITR de AAV, em que a primeira ITR e a segunda ITR são assimétricas entre si - ou seja, são diferentes entre si. Como uma modalidade exemplificadora, a primeira ITR pode ser uma ITR do tipo selvagem e a segunda ITR pode ser uma ITR mutada ou modificada. Em algumas modalidades, a primeira ITR pode ser uma ITR mutada ou modificada e a segunda ITR uma ITR do tipo selvagem. Em outra modalidade, a primeira ITR e a segunda ITR são ambas modificadas, mas são sequências diferentes, ou têm modificações diferentes, ou não são ITRs modificadas idênticas. Em outras palavras, as ITRs são assimétricas, pois quaisquer alterações em uma ITR não são refletidas na outra ITR; ou, alternativamente, em que as ITRs são diferentes entre si.

[0277] Em algumas modalidades, um cassete de expressão está localizado entre duas ITRs compreendidas na seguinte ordem com um ou mais dentre: um promotor operacionalmente ligado a um transgene, um elemento regulador pós-transcricional e um sinal de poliadenilação e terminação. Em uma modalidade, o promotor é regulável - induzível ou repressível. O promotor pode ser qualquer sequência que facilite a transcrição do transgene. Em uma modalidade, o promotor é um promotor CAG (por exemplo, SEQ ID Nº: 03), ou uma variação do mesmo. O elemento regulador pós-transcricional é uma sequência que modula a expressão do transgene, como um exemplo não limitativo, qualquer sequência que cria uma estrutura terciária que aprimora a expressão do transgene.

[0278] Geralmente, os vetores de ceDNA não têm restrições de empacotamento impostas pelo espaço limitador dentro do capsídeo viral. Os vetores de ceDNA em oposição aos genomas de AAV encapsulados representam uma alternativa viável produzida por eucariotos aos vetores de DNA plasmídico produzidos em procariotas, em oposição aos genomas de AAV encapsulados. Isso permite a inserção de elementos de controle, por exemplo, chaves reguladoras, conforme divulgado neste documento, grandes transgenes, múltiplos transgenes etc.

[0279] Em algumas modalidades, a primeira ITR pode ser uma ITR mutada ou modificada e a segunda ITR uma ITR do tipo selvagem. Em outra modalidade, a primeira ITR e a segunda ITR são ambas modificadas, mas são sequências diferentes, ou têm modificações diferentes, ou não são ITRs modificadas idênticas. Em outras palavras, as ITRs são assimétricas, pois quaisquer alterações em uma ITR não são refletidas na outra ITR; ou, alternativamente, em que as ITRs são diferentes entre si. Exemplos de ITRs no vetor ceDNA e para utilização para gerar uma ceDNA-plasmídeo são divulgados no pedido nº PCT/US18/49996, depositado em 7 de setembro de 2018.

[0280] Embora as ITRs exemplificadas no relatório descritivo e nos exemplos aqui contidos sejam ITRs de AAV2, um versado na técnica está ciente de que é possível, conforme indicado acima, usar ITRs de qualquer parvovírus conhecido, por exemplo, um dependovírus como o AAV (por exemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAVA, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV1O, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-D)J e AAV-DJ 8, por exemplo, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729 ; NCO001829; NCOO6152; NC 006260; NC 006261), ITRs quiméricas ou ITRs de qualquer AAV sintético. Em algumas modalidades, o AAV pode infectar animais de sangue quente, por exemplo, vírus adeno-associado a aves (AAAV), bovinos (BAAV), caninos, equinos e ovinos. Em algumas modalidades, a ITR é de B19 parvoviris (nº de acesso ao GenBank: NC 000883), vírus em minutos do mouse (MVM) (nº de acesso ao GenBank NC 001510); parvovírus de ganso (nº de acesso ao GenBank NC 001701); parvovírus de cobra 1 (nº de acesso ao GenBank NC 006148).

[0281] Os parvovírus e outros membros da família Parvoviridae são geralmente descritos em Kenneth |. Berns, "Parvoviridae: The viroses and Their Replication", capítulo 69 em FIELDS VIROLOGY (3º Ed. 1996).

[0282] Um versado na técnica sabe que as sequências de ITR têm uma estrutura comum de uma junção de Holliday de fita dupla, que geralmente é uma estrutura em gancho em forma de T ou Y (ver, por exemplo, Figuras 2A e 3A), em que cada ITR é formada por dois braços ou alças palíndricos (BB' e CC') embutidos em um braço palíndrico maior (AA') e uma sequência D de fita simples (onde a ordem dessas sequências palindrômicas define a orientação de flip ou flop do ITR), pode-se determinar facilmente as sequências de ITR modificadas correspondentes de qualquer sorotipo de AAV para uso em um vetor de CeDNA ou plasmídeo ceDNA com base nas sequências exemplares de ITR de AAV2 aqui fornecidas. Ver, por exemplo, análise estrutural e comparação de sequências de ITRs de diferentes sorotipos de AAV (AAV1-AAV6) e descritas em Grimm etal,,) . Virology, 2006; 80 (1); 426 a 439; Yan et al, J). Virology, 2005; 364 a 379; Duan et al., Virology 1999; 261; 8 a 14. Exemplos de alterações específicas e mutações nas ITRs encontram-se descritos em pormenor no pedido nº PCT/US18/49996, depositado em 7 de setembro de 2018. Para fins de clareza, no contexto de ITRs, "alterado" ou "mutado" indica que os nucleotídeos foram inseridos, deletados e/ou substituídos em relação ao tipo selvagem, referência, ou sequência ITR original e pode ser alterada em relação à outra ITR de flanqueamento em um vetor de cCeDNA com duas ITRs de flanqueamento. A ITR alterada ou mutada pode ser uma ITR projetada. Conforme usado neste documento, "manipulado" se refere ao aspecto de ter sido manipulado pela mão do homem. Por exemplo, um polipeptídeo é considerado "manipulado" quando pelo menos um aspecto do polipeptídeo, por exemplo, sua sequência, foi manipulado pela mão do homem para diferir do aspecto que existe na natureza.

[0283] Qualquer ITR de parvovírus pode ser usado como uma ITR ou como uma ITR básico para modificação. De preferência, o parvovírus é um dependovírus.

Mais preferencialmente AAV.

O sorotipo escolhido pode ser baseado no tropismo tecidual do sorotipo.

O AAV2 tem um amplo tropismo tecidual, o AAV1 tem como alvo preferencial os músculos neuronais e esqueléticos e o AAV5 tem como alvo preferencial os neurônios, epitélios pigmentados da retina e fotorreceptores.

O AAV6 tem como alvo preferencial o músculo esquelético e o pulmão.

O AAV8 tem como alvo preferencial tecidos hepáticos, musculares esqueléticos, cardíacos e pancreáticos.

O AAV9 tem como alvo preferencial tecido hepático, esquelético e pulmonar.

Em uma modalidade, a ITR modificada é baseada em uma ITR de AAV2. Por exemplo, é selecionado no grupo que consiste em: SEQ ID Nº: 2 e SEQ ID Nº: 52. Em uma modalidade de cada um desses aspectos, o polinucleotídeo de vetor compreende um par de ITRs, selecionados do grupo que consiste em: SEQ ID Nº: 1e SEQ ID Nº: 52; é SEQ ID Nº: 2 e SEQ ID Nº: 51. Em uma modalidade de cada um desses aspectos, o polinucleotídeo de vetor ou o vetor de DNA não viral, sem capsídeo com extremidades fechadas covalentemente, compreende um par de ITRs diferentes selecionados do grupo que consiste em: SEQ ID Nº: 101 e SEQ ID Nº: 102; SEQ ID Nº: 103 e SEQ ID Nº: 104, SEQ ID Nº: 105 e SEQ ID Nº: 106; SEQ ID Nº: 107 e SEQ ID Nº: 108; SEQ ID Nº: 109 e SEQ ID Nº: 110; SEQ ID Nº: 111 e SEQ ID Nº: 112; SEQ ID Nº: 113 e SEQ ID Nº: 114; e SEQID Nº: 115 e SEQ ID Nº: 116. Em algumas modalidades, uma ITR modificada é selecionada de qualquer uma das SEQ ID NºS: 2, 52, 63, 64, 101-499, e descrito no pedido Nº PCT/US18/49996, depositado em 7 de setembro de 2018. Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA não tem uma ITR modificada selecionada de qualquer sequência que consiste em, ou consiste essencialmente em: SEQ ID Nº: 500-529, conforme aqui fornecido.

Em algumas modalidades, um vetor de ceDNA não tem uma ITR que é selecionada a partir de qualquer sequência selecionada de SEQ ID Nº: 500-529.

[0284] Em algumas modalidades, o ceDNA pode formar uma estrutura secundária dúplex intramolecular. A estrutura secundária da primeira ITR e da segunda ITR assimétrica são exemplificadas no contexto de ITRs do tipo selvagem (ver, por exemplo, Figuras 2A, 3A e 3C) e estruturas de ITR modificadas (ver, por exemplo, Figuras 2B, 3B e 3D). As estruturas secundárias são inferidas ou previstas com base nas sequências de ITR do plasmídeo usado para produzir o vetor de ceDNA.

[0285] Em algumas modalidades, a ITR esquerda do vetor de ceDNA é modificada ou mutada em relação a uma estrutura de ITR de AAV do tipo selvagem (wt), e a ITR direita é uma ITR do tipo selvagem. Em uma modalidade, a ITR direita do vetor de ceEDNA é modificada em relação à uma estrutura de ITR de AAV do tipo selvagem, e a ITR esquerda é uma ITR de AAV do tipo selvagem. Em tais modalidades, uma modificação da ITR (por exemplo, a ITR esquerda ou direita) pode ser gerada por uma deleção, uma inserção ou substituição de um ou mais nucleotídeos do ITR do tipo selvagem derivado do genoma do AAV.

[0286] AS ITRs aqui usadas podem ser resolvidas e não resolvíveis, e selecionadas para uso nos vetores ceDNA são preferencialmente sequências AAV, sendo preferenciais os sorotipos 1, 2, 3,4,5,6,7,8e

9. OS ITRs de AAV resolvíveis não requerem uma sequência ITR do tipo selvagem (por exemplo, a sequência ITR do AAV endógena ou do tipo selvagem pode ser alterada por inserção, exclusão, truncamento e/ou mutações sem sentido), desde que a repetição do terminal medeia as funções desejadas, por exemplo, replicação, empacotamento de vírus, integração e/ou resgate de vírus, e similares. Tipicamente, mas não necessariamente, os TRs são do mesmo sorotipo de AAV, por exemplo, ambas as sequências de ITR do vetor de ceDNA são do AAV2. As ITRs podem ser sequências sintéticas que funcionam como repetições terminais invertidas AAV. Embora não seja necessário, as ITRs podem ser do mesmo parvovírus, por exemplo, ambas as sequências de ITR são do AAV2.

[0287] Em algumas modalidades, pelo menos uma das ITRs é uma ITR defeituosa em relação à ligação de Rep e/ou rep Nicking. Em uma modalidade, o defeito é de pelo menos 30% em relação a uma ITR de redução do tipo selvagem; em outras modalidades, é de pelo menos 35%..., 50%..., 65%..., 715%..., 715%..., 85%..., 90%..., 95%..., 98%..., OU completamente sem função ou qualquer ponto intermediário. As células hospedeiras não expressam proteínas do capsídeo viral e o modelo de vetor polinucleotídico é desprovido de qualquer sequência de codificação do capsídeo viral. Em uma modalidade, os modelos de vetores polinucleotídicos e células hospedeiras que são desprovidos de genes da capsídeo de AAV e a proteína resultante também não codificam ou expressam genes do capsídeo de outros vírus. Além disso, em uma modalidade específica, a molécula de ácido nucleico também é desprovida de sequências de codificação da proteína AAV Rep.

[0288] Em algumas modalidades, o elemento estrutural da ITR pode ser qualquer elemento estrutural que esteja envolvido na interação funcional da ITR com uma grande proteína Rep (por exemplo, Rep 78 ou Rep 68). Em certas modalidades, o elemento estrutural fornece seletividade para a interação de uma ITR com uma proteína Rep grande, isto é, determina pelo menos em parte qual proteína Rep interage funcionalmente com a ITR. Em outras modalidades, o elemento estrutural interage fisicamente com uma proteína Rep grande quando a proteína Rep está ligada à ITR. Cada elemento estrutural pode ser, por exemplo, uma estrutura secundária da ITR, uma sequência nucleotídica da ITR, um espaçamento entre dois ou mais elementos ou uma combinação de qualquer uma das alternativas acima. Em uma modalidade, os elementos estruturais são selecionados do grupo que consiste em um braço A e A', um braço B e um B', um braço C e C', um braço D, um sítio de ligação Rep (RBE) e um RBE' e um sítio de resolução de terminal (trs).

[0289] Mais especificamente, a capacidade de um elemento estrutural de interagir funcionalmente com uma determinada proteína Rep grande pode ser alterada modificando o elemento estrutural. Por exemplo, a sequência nucleotídica do elemento estrutural pode ser modificada em comparação com a sequência do tipo selvagem da ITR. Em uma modalidade, o elemento estrutural (por exemplo, braço A, braço A', braço B, braço B', braço C, braço C', braço D, RBE, RBE' e trs) de uma ITR pode ser removido e substituído com um elemento estrutural do tipo selvagem de um parvovírus diferente. Por exemplo, a estrutura de substituição pode ser de AAV1, AAV2, AAV3, AAVA4, AAV5, AAVSG, AAV7, AAV8, AAV9, AAVI1O, AAV11, AAV12, AAVI13, parvovírus de cobra (por exemplo, parvovírus python real), parvovírus bovino, parvovírus de cabra, parvovírus aviário, parvovírus canino, parvovírus equino, parvovírus de camarão, parvovírus suíno ou AAV de inseto. Por exemplo, a ITR pode ser um ITR de AAV2 e o braço A ou A' ou RBE pode ser substituído por um elemento estrutural do AAV5. Em outro exemplo, a ITR pode ser um ITR de AAVS5 e os braços C ou C', o RBE e os trs podem ser substituídos por um elemento estrutural do AAV2. Em outro exemplo, a ITR de AAV pode ser um ITR de AAV5 com os braços B e B' substituídos pelos braços B e B' de ITR de AAV?2.

[0290] Em algumas modalidades, a sequência nucleotídica do elemento estrutural pode ser modificada (por exemplo, modificando 1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14,15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ou mais nucleotídeos ou qualquer faixa nisso) para produzir um elemento estrutural modificado.

[0291] Em algumas modalidades, a estrutura do elemento estrutural pode ser modificada. Por exemplo, o elemento estrutural altera a altura da haste e/ou o número de nucleotídeos na alça. Por exemplo, a altura da haste pode ser de cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 nucleotídeos ou mais ou qualquer faixa nisso. Em algumas modalidades, a altura da haste pode ser de cerca de 5 nucleotídeos a cerca de 9 nucleotídeos e interage funcionalmente com Rep. Em outra modalidade, a altura da haste pode ser de cerca de 7 nucleotídeos e interage funcionalmente com Rep. Em outro exemplo, o alça pode ter 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 0u 10 nucleotídeos ou mais ou qualquer faixa nisso.

[0292] Em algumas modalidades, o número de sítios de ligação ao GAGY ou sítios de ligação relacionados ao GAGY no RBE ou no RBE estendido pode ser aumentado ou diminuído. Em um exemplo, o RBE ou RBE estendido pode compreender 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais sítios de ligação ao GAGY ou qualquer intervalo nele. Cada sítio de ligação de GAGY pode ser independentemente uma sequência exata de GAGY ou uma sequência similar a GAGY, desde que a sequência seja suficiente para ligar uma proteína Rep.

[0293] Em algumas modalidades, o espaçamento entre dois elementos (como sem limitaçãoo RBE e um gancho de cabelo) pode ser alterado (por exemplo, aumentado ou diminuído) para alterar a interação funcional com uma grande proteína Rep. Por exemplo, o espaçamento pode ser de cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos ou mais ou qualquer faixa nele.

[0294] As Figuras 2A e 2B mostram um mecanismo possível para a operação de um sítio trs dentro de uma porção da estrutura ITR do tipo selvagem de um vetor de ceDNA. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA contém uma ou mais sequências polinucleotídicas ITR funcionais que compreendem um sítio de ligação Rep (RBS; 5- GCGCGCTCGCTCGCTC-3' para AAV2, SEQ ID Nº: 531) e um sítio de resolução de terminal (TRS; 5-AGTT, SEQ ID Nº: 46). Em algumas modalidades, pelo menos uma ITR (em peso ou ITR modificada) é funcional. Em modalidades alternativas, em que um vetor de ceDNA compreende duas ITRs modificadas que são diferentes ou assimétricas entre si, pelo menos uma ITR modificada é funcional e pelo menos uma ITR modificada não é funcional.

[0295] Em algumas modalidades, a ITR modificada (por exemplo, a ITR esquerda ou direita) do vetor de ceDNA aqui descrita tem modificações dentro do braço de alça, braço truncado ou espaçador. Sequências exemplificativas de ITRs com modificações no braço do laço, Nº braço truncado ou no espaçador estão listadas nas Tabelas 2- 9, 10A e 10B do pedido nº PCT/US18/49996, depositado em 7 de setembro de 2018.

[0296] Os vetores de ceDNA podem ser produzidos a partir de construtos de expressão que compreendem ainda uma combinação específica de elementos reguladores cis. Os elementos reguladores cis incluem, sem limitação, um promotor, um interruptor de ribossomos, um isolador, um elemento regulável por mir, um elemento regulador pós- transcricional, um promotor específico de tipo de tecido e célula e um intensificador. Em algumas modalidades, a ITR pode atuar como o promotor do transgene. Em algumas modalidades, o vetor compreende cCeDNA componentes adicionais para regular a expressão do transgene, por exemplo, interruptores de regulação como descrito no documento nº PCT/US18/49996, depositado em 7 de setembro de 2018, para regular a expressão do transgene ou de um interruptor de morte, que pode matar uma célula que compreende o vetor de ceDNA.

[0297] Os cassetes de expressão também podem incluir um elemento pós-transcricional para aumentar a expressão de um transgene. Em algumas modalidades, o elemento regulador pós- transcricional (WPRE) do vírus da hepatite da marmota (WPRE) (por exemplo, SEQ ID Nº: 8) é usado para aumentar a expressão de um transgene. Podem ser usados outros elementos de processamento pós- transcricionais, como o elemento pós-transcricional do gene da timidina- quinase do vírus do herpes simplex ou o vírus da hepatite B (HBV). As sequências secretoras podem ser ligadas aos transgenes, por exemplo, sequências VH-02 e VK-A26, por exemplo, SEQ ID Nº: 25 e SEQ ID Nº:

26. Os cassetes de expressão podem incluir uma sequência de poliadenilação conhecida na técnica ou uma variação da mesma, como uma sequência de ocorrência natural isolada de BGHpA bovino (por exemplo, SEQ ID Nº: 74) ou um vírus SV40pA (por exemplo, SEQ ID Nº: 10) ou uma sequência sintética (por exemplo, SEQ ID Nº: 27). Alguns cassetes de expressão também podem incluir a sequência aprimoradora de sinal tardio poliA SV40 (USE). O, USE pode ser usado em combinação com SV40pA ou sinal poli-A heterólogo.

[0298] O cassete de expressão pode compreender mais de 4000 nucleotídeos, 5.000 nucleotídeos, 10.000 nucleotídeos ou 20.000 nucleotídeos ou 30.000 nucleotídeos, 40.000 nucleotídeos ou 50.000 nucleotídeos, ou qualquer intervalo entre 4.000 a 10.000 nucleotídeos ou 10.000 a 50.000 nucleotídeos, ou mais de 50.000 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene ou ácido nucleico na faixa de 500 a 50.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene ou ácido nucleico na faixa de 500 a 75.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene ou ácido nucleico na faixa de 500 a 10.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene ou ácido nucleico na faixa de 1000 a 10.000 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o cassete de expressão pode compreender um transgene ou ácido nucleico na faixa de 500 a 5.000 nucleotídeos de comprimento. Os vetores ceDNA não têm as limitações de tamanho dos vetores AAV encapsidados, permitindo assim a entrega de um cassete de expressão de tamanho grande para fornecer expressão eficiente de transgenes. Em algumas modalidades, o vetor de ceDNA é desprovido de metilação específica de procariota. Em algumas modalidades, o comprimento do cassete de expressão na direção 5' a 3' é maior que o comprimento máximo conhecido por ser encapsidado em um virion de AAV. Em algumas modalidades, o comprimento é superior a 4,6kb, ou superior a 5kb, ou superior a 6kb, ou superior a 7kb.

[0299] As Figuras 1A-1C mostram esquemas de vetores de ceEDNA exemplares não limitativos ou a sequência correspondente de plasmídeos de ceDNA. Os vetores ceDNA são sem capsídeos e podem ser obtidos a partir de um plasmídeo que codifica nesta ordem: uma primeira ITR, cassete de transgene expressível e uma segunda ITR, em que pelo menos uma dentre a primeira e/ou segunda sequência de ITR sofre mutação em relação à correspondente sequência ITR de AAV2 do tipo selvagem. O cassete de transgene expressível inclui, de preferência, um ou mais de, nesta ordem: um intensificador/promotor, um repórter de ORF (transgene), um elemento regulador de pós- transcrição (por exemplo, WPRE) e um sinal de poliadenilação e terminação (por exemplo, BGH polyA)

[0300] O cassete de expressão pode compreender qualquer transgene de interesse. Os transgenes de interesse incluem, entre outros, ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos ou ácidos nucleicos não codificadores (por exemplo, RNAi, miRs etc.), de preferência terapêuticos (por exemplo, para uso médico, diagnóstico ou veterinário) ou imunogênicos (por exemplo, para vacinas) polipeptídeos. Em certas modalidades, os transgenes no cassete de expressão codificam um ou mais polipeptídeos, peptídeos, ribozimas, ácidos nucleicos peptídicos, SiRNAs, RNAis, oligonucleotídeos antisense,

polinucleotídeos antisense, anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o transgene é um gene terapêutico ou uma proteína marcadora. Em algumas modalidades, o transgene é um agonista ou antagonista. Em algumas modalidades, o antagonista é um mimético ou anticorpo, ou fragmento de anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, por exemplo, um anticorpo neutralizante ou fragmento de anticorpo e similares. Em algumas modalidades, o transgene codifica um anticorpo, incluindo um anticorpo completo ou fragmento de anticorpo, conforme aqui definido. Em algumas modalidades, o anticorpo é um domínio de ligação ao antígeno ou uma sequência de domínio variável da imunoglobulina, como aqui definido.

[0301] Em particular, o transgene pode codificar um ou mais agentes terapêuticos, incluindo, sem limitação, por exemplo, proteína (ou proteínas), polipeptídeo (ou polipeptídeos), peptídeo (ou peptídeos), enzima (ou enzimas), anticorpos, fragmentos de ligação ao antígeno, bem como variantes e/ou fragmentos ativos dos mesmos, para uso no tratamento, profilaxia e/ou melhora de um ou mais sintomas de uma doença, disfunção, lesão e/ou distúrbio.

[0302] Há muitas características estruturais dos vetores de ceDNA que diferem dos vetores de expressão baseados em plasmídeo. Os vetores ceDNA podem possuir uma ou mais das seguintes características: a falta de DNA bacteriano original (ou seja, não inserido), a falta de uma origem de replicação procariótica, sendo auto- suficiente, ou seja, eles não requerem nenhuma sequência além das duas ITRs, incluindo os sítios de ligação Rep e resolução terminal (RBS e TRS), e uma sequência exógena entre os ITRs, a presença de sequências de ITR que formam grampos de cabelo, de origem eucariótica (ou seja, são produzidas em células eucarióticas) e o ausência de metilação do DNA do tipo bacteriano ou qualquer outra metilação considerada anormal por um hospedeiro mamífero. Em geral, é preferencial que os presentes vetores não contenham DNA procariótico, mas é contemplado que algum DNA procariótico possa ser inserido como uma sequência exógena, como um exemplo não limitativo em uma região promotora ou intensificadora. Outra característica importante que distingue os vetores de ceDNA dos vetores de expressão de plasmídeo é que os vetores de ceDNA são DNA linear de fita simples com extremidades fechadas, enquanto os plasmídeos são sempre DNA de fita dupla.

[0303] Os vetores de ceDNA têm preferencialmente uma estrutura linear e contínua em vez de uma estrutura não contínua, conforme determinado pelo ensaio de digestão com enzimas de restrição (Figura 4D). Acredita-se que a estrutura linear e contínua seja mais estável do ataque por endonucleases celulares, bem como menos provável de ser recombinada e causar mutagênese. Assim, um vetor de ceDNA na estrutura linear e contínua é uma modalidade preferida. O vetor de ceDNA dúplex intramolecular de fita simples, linear e contínua, pode ter extremidades terminais ligadas covalentemente, sem sequências que codificam proteínas do capsídeo AAV. Estes vetores de ceDNA são estruturalmente distintos dos plasmídeos (incluindo plasmídeos de CeDNA aqui descritos), que são moléculas de ácido nucleico dúplex circular de origem bacteriana. As cadeias complementares de plasmídeos podem ser separadas após a desnaturação para produzir duas moléculas de ácido nucleico, enquanto, por outro lado, os vetores cCeDNA, embora tenham cadeias complementares, são uma única molécula de DNA e, portanto, mesmo se desnaturados, permanecem uma molécula única. Em algumas modalidades, os vetores de ceEDNA podem ser produzidos sem a metilação da base de DNA do tipo procariótico, diferentemente dos plasmídeos. Portanto, os vetores CeDNA e os plasmídeos de ceDNA são diferentes tanto em termos de estrutura (em particular lineares versus circulares) quanto em vista dos métodos usados para produzir e purificar esses diferentes objetos, e também em vista de sua metilação de DNA, do tipo procariótico para plasmídeos de ceDNA e do tipo eucariótico para o vetor de ceDNA.

[0304] O tempo para colher e coletar vetores de DNA aqui descritos a partir das células pode ser selecionado e otimizado para alcançar uma produção de alto rendimento dos vetores de DNA. Por exemplo, o tempo de colheita pode ser selecionado em vista da viabilidade celular, morfologia celular, crescimento celular e similares. Normalmente, as células podem ser colhidas após um tempo suficiente após a infecção baculoviral para produzir vetores de DNA, mas antes que a maioria das células comece a morrer devido à toxicidade viral. Os vetores de DNA podem ser isolados, por exemplo, usando kits de purificação de plasmídeo, como os kits de plasmídeo Qiagen Endo-Free'Y., Outros métodos desenvolvidos para o isolamento de plasmídeo também podem ser adaptados para vetores de DNA. Geralmente, qualquer método de purificação de ácido nucleico conhecido na técnica pode ser adotado.

[0305] Promotores: promotores adequados, incluindo os descritos acima, podem ser derivados de vírus e, portanto, podem ser referidos como promotores virais, ou podem ser derivados de qualquer organismo, incluindo organismos procarióticos ou eucarióticos. Promotores adequados podem ser usados para direcionar a expressão por qualguer RNA polimerase (por exemplo, pol |, pol Il, pol Ill). Promotores exemplares incluem, sem limitação promotor inicial de SV40, promotor de repetição terminal longa (LTR) do vírus do tumor mamário do rato; principal promotor tardio de adenovírus (Ad MLP); um promotor do vírus herpes simplex (HSV), um promotor do citomegalovírus (CMV), como a região do promotor imediato do CMV (CMVIE), um promotor do vírus do sarcoma rous (RSV), um pequeno promotor nuclear U6 humano (U6, por exemplo, SEQ ID Nº: 18 (Miyagishi et al., Nature Biotechnolog 20, 497 a 500 (2002)), um promotor U6 aprimorado (por exemplo, Xia et al., Nucleic Acids Res. 1 de setembro de 2003; 31 de setembro de 2003; 31 (17)), um humano Promotor H1 (H1) (por exemplo, SEQ ID Nº: 19), um promotor CAG, um promotor de alfa 1-antitipsina humana (HAAT) (por exemplo, SEQ ID Nº: 21) e similares. Nas modalidades, esses promotores são alterados na extremidade contendo intrão a jusante a jusante para incluir um ou mais sítios de clivagem de nuclease. Em modalidades, o DNA contendo o sítio (ou sítios) de clivagem de nuclease é estranho ao DNA do promotor.

[0306] Um promotor pode compreender uma ou mais sequências reguladoras transcricionais específicas para aprimorar ainda mais a expressão e/ou alterar a expressão espacial e/ou expressão temporal da mesma. Um promotor também pode compreender elementos intensificadores ou repressores distais, que podem estar localizados até vários milhares de pares de bases a partir do local inicial da transcrição. Um promotor pode ser derivado de fontes que incluem vírus, bactérias, fungos, plantas, insetos e animais. Um promotor pode regular a expressão de um componente do gene de forma constitutiva ou diferencial em relação à célula, tecido ou órgão em que a expressão ocorre ou, em relação ao estágio de desenvolvimento em que a expressão ocorre, ou em resposta a estímulos externos, como estresses fisiológicos, patógenos, íons metálicos ou agentes indutores. Exemplos representativos de promotores incluem o promotor bacteriófago T7, promotor bacteriófago T3, promotor SP6, operador lac, promotor tac, promotor final SV40, promotor inicial SV40, promotor inicial SVA40, promotor RSV-LTR, promotor CMV IE, promotor inicial SV40 ou promotor final SV40 e o promotor CMV IE, bem como os promotores listados abaixo. Tais promotores e/ou intensificadores podem ser usados para a expressão de qualquer gene de interesse, por exemplo, as moléculas de edição de genes, sequência de doadores, proteínas terapêuticas, etc.). Por exemplo, o vetor pode compreender um promotor que está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína terapêutica. O promotor operacionalmente ligado à sequência de codificação da proteína terapêutica pode ser um promotor do vírus símio 40 (SV40), um promotor do vírus do tumor mamário do mouse (MMTV), um promotor do vírus da imunodeficiência humana (HIV), como o vírus da imunodeficiência bovina (BIV) promotor de repetição terminal (LTR), um promotor do vírus Moloney, um promotor do vírus da leucose aviária (ALV), um promotor do citomegalovírus (CMV), como o promotor imediato do CMV, o promotor do vírus Epstein Barr (EBV) ou um vírus do sarcoma Rous (RSV)) promotor. O promotor também pode ser um promotor de um gene humano, como a ubiquitina C humana (hUbC), actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana ou metalotioneína humana. O promotor também pode ser um promotor específico de tecido, como um promotor específico de fígado, como alfa 1-antitipsina humana (HAAT), natural ou sintética. Em uma modalidade, a entrega ao fígado pode ser conseguida usando o direcionamento específico de ApoE endógeno da composição que compreende um vetor de ceDNA para hepatócitos através do receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL) presente na superfície do hepatócito.

[0307] Em uma modalidade, o promotor usado é o promotor nativo do gene que codifica a proteína terapêutica. Os promotores e outras sequências reguladoras para os respectivos genes que codificam as proteínas terapêuticas são conhecidos e foram caracterizados. A região promotora usada pode ainda incluir uma ou mais sequências reguladoras adicionais (por exemplo, nativas), por exemplo, intensificadores (por exemplo, SEQ ID Nº: 22 e SEQ ID Nº: 23).

[0308] Exemplos não limitativos de promotores adequados para uso de acordo com a presente invenção incluem o promotor CAG de, por exemplo (SEQ ID Nº: 3), o promotor HAAT (SEQ ID Nº: 21), o EF1-a humano promotor (SEQ ID Nº: 6) ou um fragmento do promotor EFl1a (SEQ ID Nº: 15) e o promotor EF 1-a de rato (SEQ ID Nº: 24).

[0309] Sequências de poliadenilação: uma sequência que codifica uma sequência de poliadenilação pode ser incluída no vetor de ceEDNA para estabilizar o MRNA expresso a partir do vetor de ceDNA e para ajudar na exportação e tradução nuclear. Em uma modalidade, o vetor de ceDNA não inclui uma sequência de poliadenilação. Em outras modalidades, o vetor inclui pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50 ou mais dinucleotídeos de adenina. Em algumas modalidades, a sequência de poliadenilação compreende cerca de 43 nucleotídeos, cerca de 40 a 50 nucleotídeos, cerca de 40 à 55 nucleotídeos, cerca de 45 a 50 nucleotídeos, cerca de 35 a 50 nucleotídeos ou qualquer intervalo entre isso.

[0310] Em algumas modalidades, o ceDNA pode ser obtido a partir de um polinucleotídeo de vetor que codifica um ácido nucleico heterólogo posicionado operacionalmente entre duas sequências de repetição terminais invertidas (ITRs) diferentes (por exemplo, ITRs de AAV), em que pelo menos uma das ITRs compreende um terminal sítio de resolução e um sítio de ligação a proteínas replicativas (RPS), por exemplo, um sítio de ligação a Rep (por exemplo, com ITR de AAV SEQ ID Nº: 1 ou SEQ ID Nº: 2 para AAV2) e uma das ITRs compreende uma deleção, inserção e/ou substituição com relação à outra ITR, por exemplo, ITR funcional.

[0311] As células hospedeiras não expressam proteínas do capsídeo viral e o modelo de vetor polinucleotídico é desprovido de qualquer sequência de codificação do capsídeo viral. Em uma modalidade, o modelo de vetor polinucleotídico é desprovido de genes de capsídeo de AAV, mas também de genes da capsídeo de outros vírus). Além disso, em uma modalidade específica, a molécula de ácido nucleico também é desprovida de sequências de codificação da proteína AAV Rep. Por conseguinte, em uma concretização preferida, a molécula de ácido nucleico da invenção é desprovida de ambos os genes funcionais de cap de AAV e rep de AAV.

[0312] Em certas modalidades da presente invenção, o vetor de CeDNA não tem ITRs modificadas que compreendem a sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nº: 548, 549, 551, 552, 553, 553, 554, 555, 556 e 557.

[0313] Em algumas modalidades, o vetor ceEDNA compreende um interruptor de regulamentação, como aqui divulgado (ou no pedido nº PCT/US18/49996, depositado em 7 de setembro, 2018) e uma ITR modificada que tem a sequência de nucleotídeo selecionada do grupo constituído por: SEQ ID Nº: 548, 549, 551, 552, 553, 553, 554, 555, 556 e 557.

[0314] Sem limitação, afirmamos que a reserva acima de um direito de exoneração de responsabilidade se aplica pelo menos às reivindicações 1-33 deste pedido e parágrafos, conforme estabelecido em [00293] e [00294].

[0315] Algumas modalidades dos vários aspectos divulgados neste documento podem ser definidas por qualguer um dos seguintes parágrafos:

1. Um vetor de ceDNA lipossômico que compreende um lipossoma que encapsula um vetor de ceDNA, em que o vetor de ceDNA compreende: um cassete de expressão que compreende um elemento regulador cis, em que o elemento regulador cis é selecionado do grupo que consiste em um elemento regulador pós-transcricional e um sinal BGH poli-A; uma ITR do tipo selvagem a montante (extremidade 5') do cassete de expressão, em que a ITR do tipo selvagem compreende um polinucleotídeo de SEQ ID Nº: 51; e uma ITR modificada na jusante (extremidade 3') do cassete de expressão, em que a ITR modificada compreende um polinucleotídeo de SEQ ID Nº: 2, em que o dito vetor de DNA tem é desprovido de uma metilação específica de procariota e não é encapsidado em uma proteína do capsídeo AAV.

2. O vetor de DNA do parágrafo 1, em que o vetor de DNA tem uma estrutura linear e contínua.

3. O vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 1 ou 2, em que o elemento regulador pós-transcricional compreende um elemento regulador pós-transcricional WHP (WPRE).

4. O vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 3, em que o cassete de expressão compreende ainda um sítio de clonagem.

5. O vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 4, em que o cassete de expressão compreende um promotor selecionado do grupo que consiste em promotor CAG, promotor AAT, promotor LP 1 e promotor EF la.

6. O vetor de DNA do parágrafo 1, em que o cassete de expressão compreende polinucleotídeos de SEQ ID Nº: 3, SEQ ID Nº: 7, SEQID Nº: Be SEQ ID Nº: 9.

7. O vetor de DNA de qualquer um dos parágrafos 1 a 6, em que o cassete de expressão compreende ainda um sítio de clonagem e uma sequência exógena inserida no sítio de clonagem.

8. O vetor de DNA do parágrafo 7, em que a sequência exógena compreende pelo menos 2.000 nucleotídeos.

9. O vetor de DNA do parágrafo 7, em que a sequência exógena codifica uma proteína.

10. O vetor de DNA do parágrafo 7, em que a sequência exógena codifica uma proteína repórter.

[0316] Algumas modalidades dos vários aspectos divulgados neste documento podem ser definidas por qualguer um dos seguintes parágrafos:

1. —Partícula lipídica que compreende um lipídio ionizável e um vetor de DNA não viral sem capsídeo com extremidades fechadas covalentemente (vetor de ceDNA), em que o vetor de ceDNA compreende pelo menos uma sequência nucleotídica heteróloga posicionada operacionalmente entre sequências de repetição terminal invertidas assimétricas (ITRS assimétricas), em que pelo menos uma das ITRs assimétricas compreende um sítio de resolução de terminal funcional e um sítio de ligação Rep.

2. A nanopartícula lipídica do parágrafo 1, em que o vetor de ceDNA quando digerido com uma enzima de restrição que tem um único sítio de reconhecimento no vetor de ceDNA e analisado por eletroforese em gel nativa e desnaturante exibe bandas características de DNA linear e contínuo em comparação controles lineares e não contínuos de DNA.

3. — Nanopartícula lipídica dos parágrafos 1 ou 2, em que uma ou mais das sequências de ITR assimétricas são de um vírus selecionado dentre um parvovírus, um dependovírus e um vírus adeno-associado (AAV).

4. — Nanopartícula lipídica do parágrafo 3, em que as ITRs assimétricas são de diferentes sorotipos virais.

5. — Nanopartícula lipídica do parágrafo 4, em que os uma ou mais ITRs assimétricas são de um sorotipo de AAV selecionado dentre AAV1, AAV2, AAV3, AAVA, AAV5, AAVG6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVI1O, AAV11 e AAV1, AAV12.

6. A nanopartícula lipídica de qualguer um dos parágrafos 1 a 3, em que uma ou mais das sequências de ITR assimétricas são sintéticas.

7. A nanopartícula lipídica de qualquer um dos parágrafos 1 a 6, em que uma ou mais das ITRs não é uma ITR do tipo selvagem.

8. — A nanopartícula lipídica de qualguer um dos parágrafos 1 a 7, em que um ou mais dos dois ITRs assimétricas são modificados por uma deleção, inserção e/ou substituição em pelo menos uma das regiões de ITR selecionadas de A, A', B,B',C,C'|,DeD".

9. A nanopartícula lipídica de qualguer um dos parágrafos 1 a 8, em que o vetor de ceDNA compreende pelo menos duas ITRs assimétricas selecionadas dentre: a. SEQIDNº 1e SEQIDNº:52;e b. SEQ ID Nº: 26 SEQ ID Nº: 51.

10. A nanopartícula lipídica de qualquer um dos parágrafos 1 a 9, em que o vetor de ceDNA é obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: a. incubar uma população de células de inseto que abrigam um construto de expressão de ceDNA na presença de pelo menos uma proteína Rep, em que o construto de expressão de ceDNA codifica o vetor de ceDNA, sob condições efetivas e por um tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA dentro das células de inseto; e b. isolar o vetor de ceDNA das células de insetos.

11. A nanopartícula lipídica do parágrafo 10, em que o construto de expressão de ceDNA é selecionado dentre um plasmídeo de ceDNA, um bacmídeo de ceDNA e um baculovírus de ceDNA.

12. A nanopartícula lipídica do parágrafo 10 ou 11, em que a célula de inseto expressa pelo menos uma proteína Rep.

13. A nanopartícula lipídica do parágrafo 10, em que pelo menos uma proteína Rep é de um vírus selecionado de um parvovírus, um dependovírus e um vírus adeno-associado (AAV)

14. A nanopartícula lipídica do parágrafo 13, em que pelo menos uma proteína Rep é de um sorotipo de AAV selecionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAVA, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVO, AAV1O, AAV11 e AAV12.

15. A partícula lipídica de qualguer um dos parágrafos 1 a 15, em que o vetor de DNA é obtido a partir de um polinucleotídeo de vetor, em que o polinucleotídeo de vetor codifica um ácido nucleico heterólogo operativamente posicionado entre duas sequências de repetição terminal invertidas (ITRs), em que as duas ITRs são diferentes entre si (assimétrico) e pelo menos uma das ITRs é uma ITR funcional que compreende um sítio de resolução funcional do terminal e um sítio de ligação Rep, e uma das ITRs compreende uma deleção, inserção e/ou substituição em relação ao ITR funcional; a presença da proteína Rep induzindo a replicação do vetor polinucleotídico e produção do vetor DNA em uma célula de inseto, sendo o vetor DNA obtido a partir de um processo que compreende as etapas de:

a. incubar uma população de células de inseto que abrigam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codificação do capsídeo viral, na presença da proteína Rep sob condições efetivas e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de DNA não viral não capsídico em células de inseto, em que as células de inseto não compreendem produção de DNA não viral sem capsídeo dentro das células de inseto na ausência do vetor; e b. colher e isolar o DNA não viral sem capsídeo das células dos insetos.

16. A partícula lipídica, de acordo com qualquer um dos parágrafos 10 a 15, em que a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada.

17. A partícula lipídica do parágrafo 16, em que a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada digerindo DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição com um único sítio de reconhecimento no vetor de DNA e analisando o material de DNA digerido em um gel não desnaturante para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.

18. A partícula lipídica de qualguer um dos parágrafos 1 a 17, em que o vetor de DNA é obtido a partir de um polinucleotídeo de vetor, em que o polinucleotídeo de vetor codifica um ácido nucleico heterólogo operativamente posicionado entre uma primeira e uma segunda sequência de polinucleotídeos de DNA de repetição terminal invertido AAV2 (ITRS), com pelo menos uma das ITRs tendo pelo menos uma deleção, inserção e/ou substituição de polinucleotídeos em relação à ITR do tipo selvagem AAV2 correspondente de SEQ ID Nº: 1 ou SEQ ID Nº: 51 para induzir replicação do vetor de DNA em uma célula de inseto na presença da proteína Rep, o vetor de DNA sendo obtido de um processo compreendendo as etapas de: a. incubar uma população de células de inseto que abrigam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codificação do capsídeo viral, na presença de proteína Rep, em condições efetivas e por um tempo suficiente para induzir a produção do DNA não viral sem capsídeos dentro de células de inseto, em que as células de inseto não compreendem sequências codificantes do capsídeo viral; e b. colher e isolar o DNA não viral sem capsídeo das células dos insetos.

19. A partícula lipídica do parágrafo 18, em que a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada.

20. A partícula lipídica do parágrafo 19, em que a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada digerindo o DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição com um único sítio de reconhecimento no vetor de DNA e analisando o material de DNA digerido em um gel não desnaturante para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.

21. A partícula lipídica de qualquer um dos parágrafos 1 a 20, em que a partícula lipídica compreende ainda um ou mais dentre um lipídio não catiônico; um lipídio conjugado com PEG; e um esterol.

22. A partícula lipídica de qualquer um dos parágrafos 1 a 21,

em que o lipídio ionizável é um lipídio descrito na Tabela 1.

23. A partícula lipídica de qualquer um dos parágrafos 1 a 22, em que a partícula lipídica compreende ainda um lipídio não catiônico, em que o lipídio não iônico é selecionado do grupo que consiste em distearoil-sn-glicerofosfoetanolamina, t (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidil- colina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicero! (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicero| (DPPG), dioleoil- fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamina (POPE), dioleoil- fosfatidiletanolamina — 4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-1- carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil-fosfatidil-etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoil- fosfatidil-etanolamina (DSPE), monometil- fosfatidiletanolamina (como 16-O-etil-dimetil-etanolamina) - fosfatidiletanolamina (como 16-O-dimetil PE), 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), osfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), fosfatidilcolina do ovo (EPC), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), esfingomielina (SM), dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), dimiristoilfosfatidilglicerol! (DMPG), dearoilfosfatidilglicero|, fosfatidiletanolamina (DEPE), lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, esfingomielina de ovo (ESM), cefalina, cardiolipina, fosfatidicacid, cerebrósidos, dicetilfosfato, lisofosfatidilcolina, e dilinoleoilfosfatidilcolina.

24. A partícula lipídica de qualquer um dos parágrafos 1 a 23, em que a partícula lipídica compreende ainda um lipídio conjugado, em que o lipídio conjugado, em que o lipídio conjugado é selecionado do grupo que consiste em PEG-

diacilglicerol (DAG) (como I|-(monometóxi-polietilenoglico!) - 2,3-dimiristoilglicerol (PEG-DMG)), PEG-dialquiloxipropil (DAA), fosfoP E G-lipídio, PEG-ceramida (Cer), fosfatidiletanoloamina peguilada (PEG-PE), Diacilglicero! de succinato de PEG (PEGS-DAG) (como 4-0- (2',3"- di(tetradecanoilóxi) propil-1-O-(w-metóxi (polietóxi)etil)butanodioato (PEG-S-DMG)), PEG dialcoxipropiltarbam e sal de sódio N-(carbonil- metoxipolietilenoglicol 2000) -1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina.

25. A partícula lipídica de qualquer um dos parágrafos 1 a 24, em que a partícula lipídica compreende ainda colesterol ou um derivado de colesterol.

26. A partícula lipídica de qualquer um dos parágrafos 1 a 25, em que a partícula lipídica compreende: (i) um lipídio ionizável; (ii) um lipídio não catiônico; (iii) um lipídio conjugado que inibe a agregação de partículas; e (iv) um esterol.

27. A partícula lipídica de qualquer um dos parágrafos 1 a 26, em que a partícula lipídica compreende: (a) umlipídioionizável em uma quantidade de cerca de 20% em mol a cerca de 90% em mol do lipídio total presente na partícula; (b) um lipídio não catiônico em uma quantidade de cerca de 5% em mol a cerca de 30% em mol do lipídio total presente na partícula; (c) umlipídio conjugado que inibe a agregação de partículas em uma quantidade de cerca de 0,5% em mol a cerca de 20% em mol do lipídio total presente na partícula; e

(d) um esterol em uma quantidade de cerca de 20% em mol a cerca de 50% em mol do lipídio total presente na partícula.

28. A partícula lipídica de qualquer um dos parágrafos 1 a 27, em que a razão entre lipídio total e vetor de DNA (massa ou peso) é de cerca de 10:1 a cerca de 30:1.

29. Uma composição compreendendo uma primeira nanopartícula lipídica e um composto adicional, em que a primeira nanopartícula lipídica compreende um primeiro vetor não viral não capsídico e é uma nanopartícula lipídica de qualquer um dos parágrafos 1 a 28.

30. A composição do parágrafo 29, em que o dito composto adicional é abrangido em uma segunda nanopartícula lipídica e em que a primeira e a segunda nanopartículas lipídicas são diferentes.

31. A composição dos parágrafos 28 ou 29, em que o dito composto adicional é abrangido na primeira nanopartícula lipídica.

32. A composição de qualquer um dos parágrafos 28-30, em que o dito composto adicional é um agente terapêutico.

33. A composição do parágrafo 28, em que o dito composto adicional é um vetor não viral do segundo capsídeo, em que o primeiro e o segundo vetores não virais do capsídeo são diferentes.

[0317] Os exemplos a seguir são fornecidos a título de ilustração, não como limitação.

EXEMPLOS Exemplo 1: Método exemplificador para produzir vetores de ceEDNA Construção de plasmídeos de ceDNA

[0318] A produção dos vetores de ceDNA usando um modelo de construto de polinucleotídeo é descrita. Por exemplo, um modelo de construto de polinucleotídeo usado para gerar os vetores de ceDNA da presente invenção pode ser um plasmídeo ceDNA, um ceDNA- bacmídeo e/ou um ceDNA-baculovírus. Sem se limitar à teoria, em uma célula hospedeira permissiva, na presença de, por exemplo, Rep, o modelo de construto de polinucleotídeo com duas ITRs e um construto de expressão, em que pelo menos uma das ITRs é modificada, replica para produzir vetores de ceDNA. A produção do vetor de ceDNA passa por duas etapas: primeira, excisão ("resgate") do modelo do esqueleto modelo (por exemplo, plasmídeo ceDNA, ceDNA-bacmídeo, genoma ceDNA-baculovírus etc.) por meio de proteínas Rep e segunda replicação mediada por Rep do vetor de ceDNA excisado.

[0319] Um método exemplificador para produzir vetores de ceEDNA é a partir de um plasmídeo ceDNA como descrito no presente documento. Com referência às Figuras 1A e 1B, o modelo de construção polinucleotídica de cada um dos plasmídeos de ceDNA inclui uma ITR esquerda e uma ITR mutada direita com o seguinte entre as sequências de ITR: (i) um intensificador/promotor; (ii) um sítio de clonagem para um transgene; (iii) um elemento de resposta pós- transcricional (por exemplo, o elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite por marmota) (WPRE); e (iv) um sinal de poliadenilação (por exemplo, do gene do hormônio do crescimento bovino (BGHpA)). Sítios únicos de reconhecimento de endonucleases de restrição (R1-R6) (mostrados nas Figuras 1A e 1B) também foram introduzidos entre cada componente para facilitar a introdução de novos componentes genéticos nos locais específicos da construção. R3 (Pmel) GTTTAAAC (SEQ ID Nº: 7) e R4 (Pacl) Os sítios das enzimas TTAATTAA (SEQ ID Nº: 542) são projetados no sítio de clonagem para introduzir um quadro de leitura aberto de um transgene. Essas sequências foram clonadas em um plasmídeo pFastBac HT B obtido da ThermoFisher Scientific.

[0320] Em resumo, uma série de vetores de ceDNA foi obtida a partir dos construtos de plasmídeo ceDNA mostrados na Tabela 3, usando o processo mostrado nas Figuras 4A-4C. A Tabela 5 indica o número da sequência polinucleotídica correspondente para cada componente, incluindo sequências ativas como sítio de proteína de replicação (RPS) (por exemplo, sítio de ligação Rep) em cada extremidade de um promotor operacionalmente ligado a um transgene. Os números na Tabela 3 se referem às SEQ ID Nºs neste documento, correspondentes às sequências de cada componente. Tabela 3: Construtos de ceDNA exemplificadres Plasmídeo ITR-L Promotor Transgene MR -R (SEQ ID Nº) (SEQ ID Nº) (SEQ ID Nº) Construto-1 51 3 Luciferase 2 Construto -2 52 3 Luciferase 1 Construto -3 51 4 c/SVA40 intr Luciferase 2 Construto -4 52 4 c/SVA40 intr Luciferase 1 Construto -5 51 5 c/SV40 intr Luciferase 2 Construto -6 52 5 w/SVA40 intr Luciferase 1 Construto -7 51 6 Luciferase 2 Construto -8 52 6 Luciferase 1

[0321] Em algumas modalidades, uma construção para fazer vetores de ceDNA compreende um promotor que é uma chave reguladora, por exemplo, um promotor induzível. Outras construções foram usadas para produzir vetores de ceDNA que compreendem um promotor MND ou HLCR operacionalmente ligado a um transgene de luciferase. Produção de ceDNA-bacmídeos:

[0322] Com referência à Figura 4A, as células competentes DH10Bac (células competentes MAX EFFICIENCYº DHI1O0Bac"Y, Thermo Fisher) foram transformadas com plasmídeos de teste ou controle, seguindo um protocolo de acordo com as instruções do fabricante. A recombinação entre o plasmídeo e um vetor shuttle de baculovírus nas células DH10Bac foi induzida para gerar ceDNA- bacmídeos recombinantes. Os bacmídeos recombinantes foram selecionados por triagem de uma seleção positiva com base na triagem azul-branca em E. coli (o marcador $8OdlacZAM1IS fornece a complementação a do gene da B-galactosidase do vetor bacmídeo) em uma placa de ágar bacteriana contendo X-gal e IPTG com antibióticos para selecionar transformantes e manutenção dos plasmídeos bacmídeos e transposases. Colônias brancas causadas por transposição que rompe o gene indicador de galactosídeo foram colhidas e cultivadas em 10 ml de meio.

[0323] Os ceDNA-bacmídeos recombinantes foram isolados a partir de E. coli e transfectados para células de inseto Sf9 ou Sf21 usando FugeneHD para produzir baculovírus infeccioso. As células de inseto aderentes Sf9 ou Sf21 foram cultivadas em 50 ml de meio em balões T25 a 25ºC. Quatro dias depois, o meio de cultura (contendo o vírus P 0) foi removido das células, filtrado através de um filtro de 0,45 um, separando as partículas infecciosas de baculovírus das células ou detritos celulares.

[0324] Opcionalmente, a primeira geração do baculovírus (PO) foi amplificada através da infecção de células de inseto Sf9 ou Sf21 intocadas em 50 a 500 ml de meio. As células foram mantidas em culturas em suspensão em uma incubadora agitadora orbital a 130 rom a 25ºC, monitorando o diâmetro e a viabilidade das células, até as células atingirem um diâmetro de 18-19 nm (a partir de um diâmetro ingênuo de 14-15 nm) e uma densidade de — 4,0E +6 células/ml. E ntre 3 e 8 dias após a infecção, as partículas de baculovírus P1 no meio foram coletadas após centrifugação para remover células e detritos e filtração através de um filtro de 0,45 um.

[0325] Os ceDNA-baculovírus que compreendem os produtos de teste foram coletados e a atividade infecciosa, ou titulação, do baculovírus foi determinada. Especificamente, quatro x 20 ml de culturas de células Sf9 a 2,5E +6 células/ml foram tratadas com baculovírus P1 nas seguintes diluições: 1/1000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000 e incubadas a 25 a 27ºC. A infectividade foi determinada pela taxa de aumento do diâmetro celular e parada do ciclo celular, e alteração na viabilidade celular todos os dias, durante 4 a 5 dias.

[0326] Com referência à Figura 44, um "plasmídeo Rep" de acordo com a Figura 6A foi produzido em um vetor de expressão pFASTBAC'Y-Dual (ThermoFisher) que compreende tanto a Rep78 (SEQ ID Nº: 13) ou Rep68 (SEQ ID Nº: 12) e Rep52 (SEQ ID Nº: 14).

[0327] O plasmídeo Rep foi transformado nas células competentes DH1OBac (células competentes MAX EFFICIENCYº DHI10BacTY (Thermo Fisher), seguindo um protocolo fornecido pelo fabricante. À recombinação entre o plasmídeo Rep e um vetor shuttle de baculovírus nas células DH10Bac foi induzida para gerar bacmídeos recombinantes ("Rep-bacmídeos"). Os bacmídeos recombinantes foram selecionados por uma seleção positiva que incluía triagem azul-branca em E. coli (o marcador gal80dlacZAM15 fornece a complementação de a do gene da B-galactosidase do vetor bacmídeo) em uma placa de ágar bacteriano contendo X-gal e IPTG. Colônias brancas isoladas foram colhidas e inoculadas em 10 ml de meio de seleção (canamicina, gentamicina, tetraciclina em caldo LB). Os bacmídeos recombinantes (Rep- bacmídeos) foram isolados do E. coli e os Rep-bacmídeos foram transfectados em células de inseto Sfo ou Sf21 para produzir baculovírus infeccioso.

[0328] As células de inseto Sf9 ou Sf21 foram cultivadas em 50 ml! de meio por 4 dias e os baculovírus recombinantes infecciosos ("Rep- baculovírus") foram isolados da cultura. Opcionalmente, a Rep- baculovírus de primeira geração (P 0) foi amplificada infectando células de inseto Sf9 ou Sf21 intocadas e cultivada em 50 a 500 ml de meio. Entre 3 e 8 dias após a infecção, as partículas de baculovírus P1 no meio foram coletadas pela separação de células por centrifugação ou filtração ou outro processo de fracionamento. Os Rep-baculovírus foram coletados e a atividade infecciosa do baculovírus foi determinada. Especificamente, quatro x 20 ml de culturas de células Sf9 a 2,5 x 105 células/ml foram tratadas com baculovírus P1 nas seguintes diluições, 1/1.000, 1/10.000, 1/50.000, 1/100.000 e incubadas. A infectividade foi determinada pela taxa de aumento do diâmetro celular e parada do ciclo celular, e alteração na viabilidade celular todos os dias, durante 4 a 5 dias. Geração e Caracterização do Vetor de ceDNA

[0329] Com referência à Figura 4B, meios de cultura de células de inseto Sf contendo (1) uma amostra contendo um ceDNA-bacmídeo ou um ceDNA-baculovírus e (2) rep-baculovírus descritos acima foram então adicionados a uma nova cultura de células Sf9 (2.5E + 6 células/ml, 20 ml) na proporção de 1:1.000 e 1:10.000, respectivamente. As células foram então cultivadas a 130 rom a 25ºC. 4 a 5 dias após a coinfecção, o diâmetro e a viabilidade celular são detectados. Quando os diâmetros celulares atingiram 18 a 20 nm com uma viabilidade de —70-80%, as culturas celulares foram centrifugadas, o meio foi removido e os péletes celulares foram coletados. Os sedimentos celulares são primeiro ressuspensos em um volume adequado de meio aquoso, água ou tampão. O vetor de ceDNA foi isolado e purificado das células com o uso do protocolo de purificação Qiagen MIDI PLUS Ty (Qiagen, 0,2 mg de massa de grânulos de células processadas por coluna).

[0330] Os rendimentos dos vetores de ceDNA produzidos e purificados a partir das células de inseto Sf9 foram determinados inicialmente com base na absorvância de UV a 260 nm. Os rendimentos de vários vetores de ceDNA determinados com base na absorvância UV são fornecidos abaixo na Tabela 4.

Tabela 4: Rendimento de vetores de ceDNA de construções exemplares. Construto Volume da|Parâmetros de cultura |Rendimento Rendimento

EEE micrômetros) Viabilidade: 53,3% Diâmetro: 18,4

[0331] Os vetores de ceDNA podem ser avaliados por identificados por eletroforese em gel de agarose em condições nativas ou desnaturantes, como ilustrado na Figura 4D, em que os vetores ceEDNA geram várias bandas em géis nativos, por exemplo, ver Figura 4D. Cada banda pode representar vetores com uma conformação diferente, por exemplo, monomérica, dimérica, etc. A presença de uma banda única sob condições de desnaturaçção e bandas duplas (correspondentes às formas monoméricas e diméricas) sob condições de não desnaturação é característica da presença do vetor de ceDNA.

[0332] As estruturas dos vetores de ceDNA isolados foram analisadas posteriormente pela digestão do DNA obtido das células Sf9 coinfectadas (como descrito aqui) com endonucleases de restrição selecionadas para a) a presença de apenas um único local de corte nos vetores de ceDNA e b) fragmentos resultantes que eram grandes o suficiente para serem vistos claramente quando fracionados em um gel de agarose desnaturante a 0,8% (>800 pb). Como ilustrado na Figura 4E, os vetores lineares de DNA com uma estrutura não contínua e o vetor de ceDNA com a estrutura linear e contínua podem ser distinguidos pelos tamanhos de seus produtos de reação - por exemplo, espera-se que um vetor de DNA com uma estrutura não contínua produza Fragmentos de 1kb e 2kb, enquanto espera-se que um vetor não encapsidado com a estrutura contínua produza fragmentos de 2kb e 4kb.

[0333] Portanto, para demonstrar de maneira qualitativa que os vetores ceDNA isolados são covalentemente fechados, conforme exigido por definição, as amostras foram digeridas com uma endonuclease de restrição identificada no contexto da sequência específica do vetor de DNA como tendo um único sítio de restrição, de preferência resultando em dois produtos de clivagem de tamanho desigual (por exemplo, 1.000 pb e 2.000 pb). Após digestão e eletroforese em um gel desnaturante (que separa as duas cadeias complementares de DNA), um DNA linear e não covalentemente fechado será resolvido nos tamanhos de 1.000 bp e 2.000 bp, enquanto um DNA covalentemente fechado (ou seja, um vetor de ceDNA) será resolvido em tamanhos 2x (2.000 pb e 4.000 pb), à medida que as duas cadeias de DNA estão ligadas e agora são desdobradas e duas vezes o comprimento (embora de fita simples). Além disso, a digestão das formas monoméricas, diméricas e n- américas dos vetores de DNA será resolvida como fragmentos do mesmo tamanho devido à ligação de ponta a ponta dos vetores de DNA multiméricos (consulte Figura 4D).

[0334] A Figura 5 fornece uma imagem exemplificativa de um gel desnaturante com vetores de ceDNA da seguinte forma: construto-1, construto-2, “construto-3, construto-4, construto-5, construto-6, construto-7 e construto-8 (todos descritos em Tabela 3 acima), com (+) ou sem digestão (-) pela endonuclease. Cada vetor de ceDNA das construções-1 ao construto-8 produziu duas bandas (*) após a reação de endonuclease. Seus dois tamanhos de banda determinados com base no marcador de tamanho são fornecidos na parte inferior da imagem. Os tamanhos das bandas confirmam que cada um dos vetores de ceDNA produzidos a partir de plasmídeos que compreendem o construto 1 ao construto 8 tem uma estrutura contínua.

[0335] Como aqui usada, a frase "ensaio para identificação de vetores de DNA por eletroforese em gel de agarose sob condições nativas de gel e desnaturação" se refere a um ensaio para avaliar a proximidade do ceDNA, realizando digestão com endonucleases de restrição seguida de avaliação eletroforética dos produtos digeridos.

Um desses ensaios exemplares segue, embora um versado na técnica compreenda que muitas variações conhecidas na técnica neste exemplo são possíveis.

A endonuclease de restrição é selecionada para ser uma enzima de corte único para o vetor de ceDNA de interesse que irá gerar produtos com aproximadamente 1/3x e 2/3Xx do comprimento do vetor de DNA.

Isso resolve as bandas em géis nativos e desnaturantes.

Antes da desnaturação, é importante remover o buffer da amostra.

O kit de limpeza de PCR da Qiagen ou dessalgar "rotação colunas", por exemplo, G-25 colunas GE HEALTHCARE ILUSTRA!Y MICROSPIN'TY são algumas opções conhecidas na técnica para a digestão com endonucleases.

O ensaio inclui, por exemplo, i) digerir DNA com endonuclease (ou endonucleases) de restrição apropriada, 2) aplicar a, por exemplo, um kit de limpeza Qiagen PCR, eluir com água destilada, iii) adicionar 10x solução desnaturante (10x = 0,5 M NaOH, EDTA 10 mM), adicionar 10X de corante, não tamponado, e analisar, juntamente com as escadas de DNA preparadas adicionando solução de desnaturação 10X à 4x, em um gel de 0,8 a 1,0% previamente incubado com EDTA 1 mM e NaOH 200 mM para garantir que a concentração de NaOH seja uniforme na caixa de gel e gel e executando o gel na presença de uma solução desnaturante 1x (NaOH 50 mM, EDTA 1 mM). Um versado na técnica apreciará qual voltagem usar para executar a eletroforese com base no tamanho e no tempo desejado dos resultados.

Após a eletroforese, os géis são drenados e neutralizados em 1x TBE ou TAE e transferidos para água destilada ou 1x TBE/TAE com 1x SYBR Gold.

As bandas podem então ser visualizadas com, por exemplo, Thermo Fisher, mancha de gel de ácido nucleico SYBRº Gold (10.000X concentrado em DMSO) e luz epifluorescente (azul) ou UV (312nm).

[0336] A pureza do vetor de ceDNA gerado pode ser avaliada usando qualquer método conhecido na técnica. Como um método exemplificador e não limitativo, a contribuição do plasmídeo ceDNA para a absorvância total de UV de uma amostra pode ser estimada comparando a intensidade fluorescente do vetor de ceDNA com um padrão. Por exemplo, se com base na absorvância UV, 41ug do vetor de ceDNA foram carregados no gel, e a intensidade fluorescente do vetor de ceDNA é equivalente a uma banda de 2kb que é conhecida por 119, então há 1 ug do vetor de ceDNA e o vetor de ceDNA é 25% do total de material absorvente de UV. A intensidade da banda no gel é plotada contra a entrada calculada que a banda representa - por exemplo, se o vetor de ceDNA total for 8kb e a banda comparativa excisada for 2kb, a intensidade da banda será plotada como 25% da entrada total, que neste caso seria 0,25 ug para entrada de 1,0 ug. Usando a titulação do plasmídeo do vetor de ceDNA para plotar uma curva padrão, uma equação de linha de regressão é então usada para calcular a quantidade da banda do vetor de ceDNA, que pode ser usada para determinar a porcentagem da entrada total representada pelo vetor de cCeDNA, ou porcentagem de pureza. Exemplo 2: vetores de ceDNA expressam o transgene da luciferase in vitro

[0337] Os construtos foram gerados pela introdução de um quadro de leitura aberto que codifica o gene repórter da Luciferase no sítio de clonagem dos construtos de plasmídeo ceDNA: construto-1, construto- 3, construto-5 e construto-7. Os plasmídeos de ceDNA (consulte acima na Tabela 3), incluindo a sequência de codificação da Luciferase, são denominados construto plasmídico 1-Luc, construto plasmídico-3-Luc, construto — plasmídico -5-Luc e construto plasmídico 7-Luc, respectivamente.

[0338] As células HEK293 foram cultivadas e transfectadas com

100 ng, 200 ng ou 400 ng das construções plasmídicas 1, 3, 5 e 7, usando FUGENEº (Promega Corp.) como agente de transfecção. À expressão de luciferase de cada um dos plasmídeos foi determinada com base na atividade da luciferase em cada cultura de células e os resultados são fornecidos na Figura 7A. À atividade da luciferase não foi detectada a partir das células de controle não tratadas ("não tratadas") ou das células tratadas apenas com Fugene ("Fugene"), confirmando que a atividade da Luciferase resultou da expressão gênica dos plasmídeos. Como ilustrado nas Figuras 7A e 7BB, a expressão robusta de Luciferase foi detectada nos construtos 1 e 7. A expressão do construto-7 expressou Luciferase com um aumento dependente da dose da atividade da Luciferase sendo detectada.

[0339] O crescimento e a viabilidade das células transfectadas com cada um dos plasmídeos também foram determinados e apresentados nas Figuras 8A e 8B. O crescimento celular e a viabilidade das células transfectadas não foram significativamente diferentes entre os diferentes grupos de células tratadas com diferentes construções.

[0340] Consequentemente, a atividade da luciferase medida em cada grupo e normalizada com base no crescimento e viabilidade celular não foi diferente da atividade da luciferase sem a normalização. O plasmídeo ceDNA com o construto 1-Luc mostrou a expressão mais robusta da luciferase com ou sem normalização.

[0341] Assim, os dados apresentados nas Figuras 7A,7B,8A e 8B demonstram que o construto 1, que compreendem de 5' a 3-WT-ITR (SEQ ID Nº: 51), promotor CAG (SEQ ID Nº: 3), sítio de clonagem R3/R4 (SEQ ID Nº: 7), WPRE (SEQ ID Nº: 8), BGHpA (SEQ ID Nº: 9) e uma ITR modificada (SEQ ID Nº: 2) são eficazes na produção de um vetor de ceDNA que pode expressar uma proteína de um transgene dentro do vetor de ceDNA.

Exemplo 3: O lipídio (6Z, 97, 28Z, 31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-il-4- (dimetilamino) butanoato (DLin-MC3-DMA)

[0342] Partículas lipídicas que compreendem ceDNA podem ser preparadas ou formuladas em combinação com o lipídio (62, 97, 287, 31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il-4-(dimetilamino)-butanoato (DLin-MC3-DMA), também referido como "MC3" neste documento, que tem a estrutura: DLin-M-C3-DMA ("MC3") .

[0343] O lipídio DLin-MC3-DMA é descrito em ) ayaraman et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529 a 8.533, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade. É sintetizado da seguinte forma:

[0344] síntese do éster octadeca-9,12-dienil do ácido metanossulfônico: a uma solução do álcool 1 (26,6 g, 100 mmoles) em diclorometano (100 ml), é adicionada trietilamina (13,13 g, 130 mmols) e essa solução é resfriado em um banho de gelo. A essa solução fria, uma solução de cloreto de mesila (12,6 g, 110 mmoles) em diclorometano (60 ml) é adicionada por gotejamento e após a conclusão da adição, a mistura de reação é deixada aquecer até a temperatura ambiente e agitada de um dia para o outro. A TLC da mistura de reação mostra a conclusão da reação. A mistura de reação é diluída com diclorometano (200 ml), lavada com água (200 ml), saturada. De NaHCO;3 (200 ml), salmoura (100 ml) e secou-se (NaSO4). A camada orgânica é concentrada para obter o produto bruto que foi purificado por cromatografia em coluna (gel de sílica) utilizando 0-10% de EGO em hexanos. As frações do produto puro são combinadas e concentradas para obter o ácido metanossulfônico do produto puro éster octadeca- 9,12-dienila como um óleo incolor. RMN a !H (CDCl3, 400 MHz) 6 5,42-

5,21 (m, 4H), 4,20 (t, 2H), 3,06 (s, 3H), 2,79 (t, 2H), 2,19-2,00 (m, 4H), 1,90-1,70 (m, 2H), 1,06-1,18 (m, 18H), 0,88 (t, 3H). MC RMN (CDCl3) 8 130,76, 130,54, 128,6, 128,4, 70,67, 37,9, 32,05, 30,12, 29,87, 29,85, 29,68, 29,65, 29,53, 27,72, 27,71, 26,15, 25,94, 23,09, 14,60. MS. Peso molecular calculado para Ci9H3603S, 344,53.

[0345] Síntese de 18-bromo-octadeca-6,9-dieno: mesilato (éster octadeca-9,12-dienil do ácido metanossulfônico, 13,44 9g, 39 mmols) é dissolvido em éter anidro (500 ml) e a isso o complexo MgBr.Et2O (30,7 9, 118 mmols) é adicionado sob argônio e a mistura é refluxada sob argônio durante 26 horas após as quais a TLC mostra a conclusão da reação. A mistura de reação é diluída com éter (200 ml) e água gelada (200 ml) é adicionada a esta mistura e as camadas são separadas. À camada orgânica é lavada com K2CO3 aquoso a 1% (100 ml), salmoura (100 ml) e seca (Na2SOa anidro). A concentração da camada orgânica fornece o produto bruto que é ainda purificado por cromatografia em coluna (gel de sílica) usando 0-1% de Et 2O em hexanos para se isolar o produto de 18-bromo-octadeca-6,9-dieno como um óleo incolor. RMN a'H (CDC 3, 400 MHz) 5 5,41-5,29 (m, 4H), 4,20 (d, 2H), 3,40 (t J =7 Hz, 2H), 2,77 (t | =6,6 Hz, 2H), 2,09-2,02 (m, 4H), 1,88-1,00 (m, 2H), 1,46-1,27 (m, 18H), 0,88 (t | =3,9 Hz, 3H). RMN a PC (CDCl3/6 130,41, 130,25, 128,26, 128,12, 34,17, 33,05, 31,75, 29,82, 29,57, 29,54, 29,39, 28,95, 28,38, 27,42, 27,40, 25,84, 22,79, 14,28.

[0346] Síntese de (62, 97, 287, 31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-o0l (DLin-MeOH): À um frasco RB de 500 ml, seco por chama, torneados de Mg ativados recentemente (2,4 g, 100 mmoles) são adicionados e o frasco é equipado com uma barra de agitação magnética, um funil de adição e um condensador de refluxo. Essa instalação é desgaseificada e lavada com argônio e 10 ml de éter anidro são adicionados ao frasco através de uma seringa. O 18-bromo- octadeca-6,9-dieno (26,5 g, 80,47 mmoles) é dissolvido em éter anidro

(50 ml) e adicionado ao funil de adição.

Cerca de 5 ml dessa solução de éter são adicionados às aparas de Mg enquanto se agita vigorosamente.

Observa-se uma reação exotérmica (para confirmar/acelerar a formação do reagente de Grignard, são adicionados 5 mg de iodo e é observada descoloração imediata, confirmando a formação do reagente de Grignard) e o éter começa a refluxar.

O restante da solução do brometo é adicionado por gotejamento enquanto mantém a reação sob refluxo suave, resfriando o frasco em água.

Após a conclusão da adição, a mistura de reação é mantida a 35ºC durante uma hora e depois resfriada em banho de gelo.

O formato de etila (2,68 g, 36,2 mmoles) é dissolvido em éter anidro (40 ml) e transferido para o funil de adição e adicionado por gotejamento à mistura de reação com agitação.

Uma reação exotérmica é observada e a mistura de reação começou a refluir.

Após o início da reação, o restante da solução etérea de formato é rapidamente adicionado como uma corrente e a mistura de reação é agitada por um período adicional de uma hora à temperatura ambiente.

A reação é extinta pela adição de 10 ml de acetona por gotejamento, seguida por água gelada (60 ml). A mistura de reação é tratada com H25O1 aquoso (10% em volume, a 300 ml) até que a solução se tornou homogénea e as camadas são separadas.

A fase aquosa é extraída com éter (2 x 100 ml). As camadas de éter combinadas são secas (Na2S O4) e concentrada para obter o produto bruto que é tratado com 1 g de sódio em metanol! (200 ml) à temperatura ambiente de um dia para o outro.

Após a conclusão da reação, a maior parte do solvente é evaporada.

A mistura resultante é vertida em 150 ml de solução de ácido clorídrico a 5%. A fase aquosa é extraída com éter (2 x 150 ml). O extrato etéreo combinado é lavado com água (2 x 100 ml), salmoura (100 ml) e seco sobre sulfato de sódio anidro.

À evaporação do solvente deu origem ao produto bruto que é purificado por cromatografia em coluna (sílica gel, éter O a 10% em hexanos) e as frações do produto puro são evaporadas para fornecer o produto DLin-MeOH como um óleo incolor. RMN a *H (400 MHz, CDCI3) 5 5,47-5,24 (m, 8H), 3,56 (dd, |] = 6,8, 4,2, 1H), 2,85-2,66 (m, 4H), 2,12-1,91 (m, 9H), 1,50-1,17 (m, 46H), 0,98-0,76 (m, 6H). 3? C RMN (101 MHz, CDCI 3) 5 130,41, 130,37, 128,18, 128,15, 77,54, 77,22, 76,91, 72,25, 37,73, 31,75, 29,94, 29,89, 29,83, 29,73, 29,58, 29,53, 27,46, 27,43, 25,89, 25,86 22,80, 14,30.

[0347] Síntese de 62, 97, 287, 31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31- tetraen-19-il-4- (dimetilamino) butanoato (MC3): DLin-MeOH (1449,272 mmoles) é dissolvido em 1 | de diclorometano e a isso é adicionado o sal cloridrato do ácido dimetilaminobutírico 7 (55 9, 328 mmoles), seguido de diisopropiletilamina (70 ml) e DMAP (4 g). Após agitação por min à temperatura ambiente, E DCI (80 9, 417 mmoles) é adicionado e a mistura de reação é agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro e, após isso, a análise TLC (gel de sílica, 5% de MeOH em CH2Cl2) mostra o completo desaparecimento do álcool de partida. À mistura de reação é diluída com CH2CI2 (500 ml) e lavou-se com solução saturada de NaHCO3 (400 ml), água (400 ml) e salmoura (500 ml). As camadas orgânicas combinadas são secas sobre Na2S O, anidro e solventes são removidos in vácuo. O produto bruto assim obtido é purificado por cromatografia em coluna Flash [2,5 Kg de sílica gel, usando os eluentes seguintes i) coluna empacotada com 6 | de NEBa 0,1% em DCM; após o carregamento ii) 4 | de NEt3a 0,1% em DCM; iii) 16 | de MeOH a 2% - 98% de NEt3a 0,1% em DCM; iv) 41 de MeOH a 2,5% - 97,5% de Net3a 0,1% em DCM; v) 12 1 de MeOH a 3% - 97% de NEt3 a 0,1% em DCM) para isolar o produto puro MC3 como um óleo incolor. RMN a 'H (400 MHz, CDC3): 5 5,46-5,23 (m, 8H), 4,93-4,77 (m, 1H), 2,83-2,66 (m, 4H), 2,37-2,22 (m, 4H), 2,20 (s, 6H), 2,10 - 1,96 (m, 9H), 1,85 - 1,69 (m, 2H), 1,49 (d, | =5,4, 4H), 1,39 - 1,15 (m, 39H), 0,95 - 0,75 (m, 6H) RMN a PC (101 MHz, CDCI 3: 5 173,56, 130,38, 130,33, 128,17, 128,14, 77,54, 77,22, 76,90, 74,44, 59,17, 45,64, 34,36, 32,69,

31,73, 29,87, 29,76, 29,74, 29,70, 29,56, 29,50, 27,44, 27,41, 25,84, 25,55, 23,38, 22,78, 14,27. EI-MS (+ve): PM calc. para Ca3H7oNO, (M+H)*: 642,6. Exemplo 4: O lipídio ATX-002

[0348] Partículas lipídicas que compreendem ceDNA podem ser preparadas ou formuladas em combinação com o lipídio ATX-002 que tem a estrutura: e 1

E AS i ATX-002

[0349] O lipídio ATX-002 é descrito no documento WO2015/074085, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade. É sintetizado da seguinte forma:

[0350] síntese de 8-bromooctanoato de metila: sob atmosfera de N2, o ácido 8-bromooctanoico (60 9, 1 eq.) é dissolvido em 400 ml de metanol seco. Dez gotas de H2SO,4 concentrado por gotejamento são adicionadas e a mistura de reação foi agitada sob refluxo durante três horas.

[0351] A reação é monitorada por cromatografia em camada fina (TLC) até a conclusão. O solvente é completamente removido sob vácuo. A mistura de reação é diluída com acetato de etila e lavada com água. A camada aquosa é re-extraída com acetato de etila. A camada orgânica total é lavada com uma solução saturada de NaHCO;3. A camada orgânica é lavada novamente com água e finalmente lavada com salmoura. O produto é seco sobre Na2S O anidro e concentrado.

[0352] Síntese de dimetil 8,8'-(benzanediil)dioctanoato: K2CO3seco (104,7 g,. 6 eq) é tomado e adicionado a dimetilformamida seca, sob N> Adiciona-se lentamente — benzilamina (1354 gg, 1 eq) em dimetilformamida. Adiciona-se então 8-bromooctanoato de metila (60 9, 2 eq.) Isso é dissolvido em dimetilformamida à temperatura ambiente. À mistura de reação é aquecida a 80ºC e a reação é mantida por 36 horas com agitação.

[0353] A reação é monitorada por cromatografia em camada fina até a conclusão. O produto da reação é resfriado à temperatura ambiente e é adicionada água. O composto é extraído com acetato de etila. À camada aquosa é re-extraída com acetato de etila. A camada orgânica total é lavada com água e finalmente com solução de salmoura. O produto é seco sobre Na2S O, anidro e concentrado.

[0354] O produto da reação é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel em metanol a 3% em clorofórmio. Usando o sistema TLC de 10% de metanol em clorofórmio, o produto migra com um Rf: 0,8, visualizando por carbonização em ninidrina. O composto é um líquido marrom claro. A estrutura é confirmada por * H-RMN.

[0355] Síntese do 8,8-azanodiildioctanoato de dimetila: 8,8"- (benzanodiil) dioctanoato de dimetila (3,5 g, 1 eq.) é transferido para o vaso de vidro de hidrogenação e 90 ml de etanol são adicionados, seguidos de 10% de Pd/C (700 mg). A mistura de reação é chocalhada em um aparelho de Parr-Shaker, sob 50 psi de pressão atmosférica de H2 durante duas horas à temperatura ambiente. O produto da reação é filtrado através de celite e lavado com acetato de etila quente. O filtrado é concentrado sob vácuo.

[0356] Síntese de dimetil 8,8-((terc-butoxicarbonil) azanedil) dioctanoato: dimetil 8,8'-azanediil-dioctanoato (32 g, 1 eq) é transferido para DCM seco (700 ml) e EGN seco (9 g, 4 eq.) à massa da reação e resfriado a 0ºC. Anidrido Boc (31,3 g, 1,5 eq.) diluído em DCM é adicionado por gotejamento à reação acima. Após a adição estar completa, a mistura de reação é agitada à temperatura ambiente durante três horas.

[0357] A reação é extinta com água e à camada DCM é separada. A fase de água é com DCM e as camadas de DCM combinadas foram lavadas com solução de salmoura e secou-se com Na2SOa. Após a concentração, o composto bruto é coletado. O produto da reação em bruto é purificado por cromatografia em coluna usando 0-12% de acetato de etila em hexano. Um único produto migra por cromatografia em camada fina em 20% de acetato de etila em hexano com um Rf de 0,5, carbonizado com ninidrina.

[0358] Síntese de ácido 8,8-((terc-butoxicarbonil) azanodi-il) dioctanoico: dimetil 8,8'-((terc-butoxicarbonil) azanedil) dioctanoato. (21 9, 1 eq.) é transferido para THF seco (200 ml). Uma solução de hidróxido de sódio aquoso 6 N (175 ml) é adicionada à temperatura ambiente. À reação é mantida com agitação de um dia para o outro à temperatura ambiente.

[0359] A massa da reação é evaporada sob vácuo a 25ºC para remover o THF. O produto da reação é acidificado com HC1 5N. É adicionado acetato de etila à camada aquosa. A camada orgânica separada é lavada com água e a camada aquosa foi re-extraída com acetato de etila. As camadas orgânicas combinadas são lavadas com solução de salmoura e secou-se sobre Na2SOa, anidro. A concentração da solução rende o produto bruto.

[0360] Síntese do ácido di((Z)-non-2-en-1-il) 8,8'((tercbutoxicarbonil)azanodiil): — ácido 8,8"-((tercbutoxicarbonil) azanodiil) dioctanoico (18 9, 1 eq.) é dissolvido em DCM seco (150 ml). HATU (26,15 g, 2,1 eq.) é adicionado a essa solução. D- isopropiletilamina (14,81 g, 3,5 eq.) é adicionada lentamente à mistura de reação à temperatura ambiente. A temperatura interna sobe para 40ºC e é formada uma solução de cor amarela pálida. Adiciona-se DMAP (400 mg, 0,1 eq.) À mistura de reação seguida de solução de cis-2-noneno-1-ol (9,31 g, 2 eq.) em DCM seco. A reação muda para a cor marrom. A reação é agitada por cinco horas à temperatura ambiente.

[0361] A reação é verificada por cromatografia em camada fina após a conclusão. É adicionada água ao produto da reação, que é extraído com DCM. A camada DCM é lavada com água seguida de solução de salmoura. A camada orgânica é seca sobre N25 O, anidro e concentrou-se para se obter o composto bruto.

[0362] Síntese de ATX-002: DIi(Z)-non-2-en-1-il) 8,8' ((terc- butoxicarbonil) azanodiil) dioctanoato (13,85 mmoles, 9 gramas) é dissolvido em DCM seco (150 ml). É adicionado TFA a 0ºC para iniciar uma reação. A temperatura da reação é deixada aquecer lentamente até a temperatura ambiente por 30 minutos com agitação. À cromatografia em camada fina mostra que a reação está completa. O produto de reação é concentrado sob vácuo a 40ºC e o resíduo em bruto é diluído com DCM, e lavou-se com uma solução de NaHCO3a 10%. À camada aquosa é re-extraída com DCM e as camadas orgânicas combinadas são lavadas com solução de salmoura, secas sobre Na2SOa4e concentradas. O produto bruto coletado é dissolvido em DCM seco (85 ml) sob gás nitrogênio. Trifosgênio é adicionado e a mistura de reação é resfriada para 0ºC, e EGN é adicionado por gotejamento. À mistura de reação é agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. Essa cromatografia em camada mostra que a reação está completa. O solvente DCM é removido da massa de reação por destilação sob N2. O produto da reação é arrefecido a 0ºC, diluído com DCM (50 ml), e 2-(dimetilamino) etanotiol HCI (0,063 mol, 8,3 g) é adicionado, seguido por Et3N (seco). A mistura de reação é então agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. A cromatografia em camada fina mostra que a reação está completa. O produto da reação é diluído com solução de HCI 0,3M (75 ml) e a camada orgânica é separada. A camada aquosa é re-extraída com DCM e as camadas orgânicas combinadas são lavadas com solução aquosa de K2CO3 a 10% (75 ml) e secas sobre N25Oa anidro. A concentração do solvente rende o produto bruto. O composto bruto é purificado por coluna de sílica gel (malha 100-200) usando MeO0H/DCM a 3%. Exemplo 5: (13Z, 16Z)-N,N-dimetil-3-nonildocosa-13,16-dien-1- amina (Composto 32)

[0363] As partículas lipídicas que compreendem ceDNA podem ser preparadas ou formuladas em combinação com (13Z, 16,Z)-N,N-dimetil- 3-nonildocosa-13,16-dien-1-amina (Composto 32) que tem a estrutura: y

DO 32 .

[0364] O composto 32 é descrito no documento WO02012/040184, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade. É sintetizado da seguinte forma:

[0365] Síntese de amida a,B-insaturada (vii): o 9 |

COOOMTO E “X. | AN

[0366] O reagente de sililamida Peterson (3,1 g, 16,7 mmoles) é dissolvido em THF (35 ml) e resfriado a -63ºC. A essa solução é adicionado nBuLi (16,7 mmols, 6,7 ml de uma solução 2,5 M). A reação é aquecida à temperatura ambiente por 30 minutos. A cetona (iii) (5,0 9, 11,9 mmoles) é dissolvida em THF (25 ml) em um segundo frasco. À solução de cetona é transferida para o reagente Peterson por 30 minutos, mantendo a temperatura entre -60ºC e -40ºC. A reação é aquecida a -40ºC por uma hora e depois aquecida a 0ºC por 30 minutos.

A reação é extinta com bicarbonato de sódio, diluída com água adicional e particionada entre água/hexanos. Os orgânicos são lavados com salmoura, secos sobre sulfato de sódio, filtrados e evaporados in vácuo. A purificação por cromatografia flash (MTBE/hexanos a 0-40%) fornece a amida a,B-insaturada (vii). RMN a 'H (400 MHz, CDCI3) 5 5,75 (s, 1H), 5,36 (m, 4H), 3,01 (s, 3H), 2,99 (s, 3H), 2,78 (t, 2H), 2,28 (t, 2H), 2,05 (m, 6H), 1,35 (m, 34H), 0,89 (m, 6H).

MM | NS DOCA: | A

[0367] amida a,B-insaturada (vii) (19, 2,1 mmoles) e LS-Selectride (4,1 mmols, 4,1 ml de uma solução 1M) são combinados em um tubo vedado e aquecidos a 60ºC por 24 horas. A reação é resfriada à temperatura ambiente e particionada entre solução de cloreto de amônio e heptano. Os orgânicos são secos sobre sulfato de sódio, filtrados e evaporados in vácuo para render a amida (viii). Esse intermediário é transportado diretamente para a próxima reação em bruto.

[0368] Uma redução conjugada alternativa de amida a,B-insaturada (vii) envolve o uso de uma redução de hidreto de cobre.

CN. MM & : ÁVTE ODS

RECO | A =

[0369] Em uma RB de 5L, o catalisador de cobre (9,77 g, 17,13 mmoles) é dissolvido em tolueno (1713 ml) sob nitrogênio. A isto é adicionado o PMHS, da Aldrich (304 ml, 1371 mmoles) em uma única porção. A reação é envelhecida por 5 minutos. Para as soluções é adicionado a a, B insaturada amida (vii) (167,16 g, 343 mmoles). A essa mistura é então adicionado o álcool ttamílico (113 ml, 1.028 mmoles) durante 3 horas via bomba de seringa. Após a adição estar completa, à solução é adicionado — 1.700 ml de NH40H a 20% à reação em pequenas porções. Cuidado: existe uma efervescência vigorosa e espuma no início do resfriamento e deve ser monitorada de perto e o hidróxido de amônio adicionado lentamente em pequenas porções. À reação é particionada entre água e hexanos. Os orgânicos são filtrados através de celite e evaporados in vácuo. O material sólido de borracha resultante é pulverizado usando um agitador mecânico em hexanos para render pequenas partículas que são então filtradas e lavadas com hexanos. Os orgânicos são então evaporados sob vácuo e purificados por cromatografia flash (sílica, acetato de etila/hexanos a 0-15%) para render a amida desejada (viii). LC/MS (M+H) =490,7.

[0370] Síntese do Composto 32: à solução de amida (viii) (2,85 9, 5,8 mmoles) é adicionado hidreto de alumínio e lítio (8,7 mmoles, 8,7 ml de uma solução 1M). A reação é agitada à temperatura ambiente por 10 minutos e depois extinta por adição lenta de solução de decahidrato de sulfato de sódio. Os sólidos são filtrados e lavados com THF e o filtrado é evaporado in vácuo. A mistura em bruto é purificada por cromatografia preparativa de fase reversa (coluna C8), para fornecer (13Z, 16Z)-N N- 1-amina-dimetil-3-nonildocosa-13,16-dien-(Composto 32) na forma de um óleo. HRMS (M+H) calculado 476,5190. RMN a!H (400 MHz, CDCI3) 5,37 (m, 4H), 2,78 (t, 2H), 2,42 (m, 8H), 2,05 (q, 4H), 1,28 (m, 41H), 0,89 (m, 6H). Exemplo 6: Compostos 6 e 22

[0371] As partículas lipídicas que compreendem ceDNA podem ser preparadas ou formuladas em combinação com os compostos 6 ou 22, com as estruturas: | en dE ANN o 6 o Arraes raras o

MA o 2 .

[0372] Os compostos 6 e 22 são descritos no documento WO2015/199952, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência na sua totalidade. Os compostos 6 e 22 foram sintetizados da seguinte forma:

[0373] Síntese do composto 6: uma solução de nonan-1,9-diol (12,6 g) em cloreto de metileno (80 ml) é tratada com ácido 2-hexildecanoico (10,0 g), DCC (8,7 g) e DMAP (5,7 g). A solução é agitada por duas horas. A mistura de reação é filtrada e o solvente removido. O resíduo é dissolvido em hexano aquecido (250 ml) e deixado a cristalizar. À solução é filtrada e o solvente removido. O resíduo é dissolvido em cloreto de metileno e lavado com ácido clorídrico diluído. A fracção orgânica é seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e o solvente removido. O resíduo é passado através de uma coluna de sílica gel (75 g) usando acetato de etila/hexano a 0-12% como eluente, produzindo 9- (2'-hexildecanoilóxi) nonan-1-0l como um óleo.

[0374] O produto é dissolvido em cloreto de metileno (60 ml) e tratado com clorocromato de piridina (6,4 g) por quatro horas. Éter dietílico (200 ml) é adicionado e o sobrenadante filtrado através de um leito de sílica gel. O solvente é removido do filtrado e o óleo resultante é passado por uma coluna de sílica gel (75 g) usando gradiente de acetato de etila/hexano (0-12%), produzindo 9-(2'-etil- hexanoilóxi)nonanal como um óleo.

[0375] Uma solução do produto bruto (6,1 g), ácido acético (0,34 9) e 2-N N-dimetilaminoetilamina (0,46 g) em cloreto de metileno (20 ml) é tratada com triacetoxiboro-hidreto de sódio (2,9 g) por duas horas. À solução é diluída com cloreto de metileno lavado com hidróxido de sódio aquoso, seguido de água. A fase orgânica é seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrada e o solvente removido. O resíduo é passado por uma coluna de sílica gel (75 g) usando um gradiente de metanol/cloreto de metileno (0-8%), seguido por uma segunda coluna (20 g) usando um gradiente de cloreto de metileno/ácido acético/metanol. As frações purificadas são dissolvidas em cloreto de metileno, lavadas com solução aquosa diluída de hidróxido de sódio, secas sobre sulfato de magnésio anidro, filtradas e o solvente removido, para produzir o produto desejado como um óleo incolor.

[0376] Síntese do composto 22: na etapa um, a uma solução de ácido 6-bromohexanoico (20 mmoles, 3,901 g), 2-hexil-1-decanol (1,8 eq, 36 mmoles, 8,72 g) e 4-dimetilaminopiridina (DMAP 0,5 eq, 10 mmoles, 1,22 g) em DCM (80 ml) é adicionado DCC (1,1 eq, 22 mmoles, 4,54 g). A mistura resultante é agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. O precipitado é descartado por filtração. O filtrado é concentrado. O resíduo é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluída com uma mistura gradiente de acetato de etila em hexanos (0-2%). Isso fornece o produto desejado como um óleo incolor.

[0377] Na etapa dois, uma mistura do brometo da etapa um (1,34 eq, 7,88 g, 18,8 mmols), N, N- diisopropiletilamina (1,96 eq, 27,48 mmols, 4,78 ml) e N, N-dimetiletilenodiamina (1 eq, 14,02 mmols, 1,236 g, 1,531 ml) em acetonitrila (70 ml) em frasco de 250 ml! equipado com um condensador é aquecido a 79ºC (banho de óleo) por 16 horas. À mistura de reação é resfriada à temperatura ambiente e concentrada. O resíduo é recolhido em uma mistura de acetato de etila e hexanos (1: 9) e água. As fases são separadas, lavadas com água (100 ml) e salmoura. É então seco sobre sulfato de sódio e concentrado (8,7 g de óleo). O produto bruto (8,7 g de óleo) é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel (0-3% de MeOH em clorofórmio). As frações contendo o produto desejado são combinadas e concentradas. O resíduo é dissolvido em 1 ml de hexano e filtrado através de uma camada de sílica gel (3-4 mm, lavada com 8 ml de hexano). O filtrado é seco por sopro com uma corrente de Ar e seco bem in vácuo de um dia para o outro. O produto desejado é obtido como óleo incolor. RMN a *H (400 MHz, CDCl3) 5 3,96 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,55-2,50 (m, 2H), 2,43-2,39 (m, 4H), 3,37-3,32 (m, 2H), 2,30 (t, 7,5 Hz, 4H), 2,23 (s, 6H), 1,63 (tipo quinteto, 7,6 Hz, 6H), 1,48-1,40 (m, 4H), 1,34-1,20 (52H), 0,88 (tipo t, 6,8 Hz) 12H).

Exemplo 7: Preparação de formulações lipídicas

[0378] Nanopartículas lipídicas (LNP) podem ser preparadas com uma proporção total de lipídios/ceDNA de aproximadamente 10:1 a 30:1. Resumidamente, um lipídio ionizável (por exemplo, MC3, ATX-

002, Composto 6, Composto 22, um composto da Fórmula (A') ou (A'") ou um composto da Fórmula (B'), (B') ou (B ")), um lipídio não catiônico (por exemplo, distearoilfosfatidilcolina (DSPC)), um componente para fornecer integridade da membrana (como um esterol, por exemplo, colesterol) e uma molécula lipídica conjugada (como um PEG-lipídio, por exemplo, 1-(monometóxi-polietilenoglicol) -2,3-dimiristoilglicero], com um peso molecular médio de PEG de 2000 ("PEG-DMG"), são solubilizados em álcool (por exemplo, etanol) na razão molar de 50:10:38,5:1,5. O ceDNA é diluído para uma concentração desejada em solução tampão. Por exemplo, o ceDNA pode ser diluído para uma concentração de 0,1 mg/ml a 0,25 mg/ml em uma solução tampão que compreende acetato de sódio, acetato de socio e cloreto de magnésio, citrato, ácido málico ou ácido málico e cloreto de sódio. Em um exemplo, o CeDNA é diluído para 0,2 mg/ml em tampão de citrato de 10 a 50 mM, pH 4. A solução lipídica alcoólica é misturada com a solução aquosa de cCeDNA usando, por exemplo, bombas de seringa ou um misturador a jato, em uma proporção de cerca de 1:5 a 1:3 (em volume) com taxas de fluxo total acima de 10 ml/min. Em um exemplo, a solução lipídica alcoólica é misturada com ceDNA aquoso a uma razão de cerca de 1: 3 (em volume) com uma taxa de fluxo de 12 ml/min. O álcool é removido e o tampão é substituído por PBS por diálise. Alternativamente, o tampão pode ser substituído por PBS usando tubos centrífugos. À remoção de álcool e a troca simultânea de tampão podem ser realizadas por, por exemplo, diálise ou filttação de fluxo tangencial. As nanopartículas lipídicas obtidas são filtradas através de um filtro estéril de poros de 0,2 um antes de serem usadas.

Exemplo 8: Análise de formulações de partículas lipídicas

[0379] O tamanho das partículas de nanopartículas lipídicas pode ser determinado por espalhamento de luz quase elástico usando um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvernnº Reino Unido) e tem aproximadamente 55 a 95 nm de diâmetro ou aproximadamente 70 a 90 nm de diâmetro.

[0380] O pKa de lipídios catiônicos formulados pode ser correlacionado com a eficácia dos LNPs na entrega de ácidos nucleicos (consulte J ayaraman et al., Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51 (34), 8.529 a 8.533; Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172 a 176 (20 O), os quais são incorporados a título de referência na sua totalidade). O intervalo preferencial de pKa é de -5 a -7. O pKa de cada lipídio catiônico é determinado em nanopartículas lipídicas usando um ensaio baseado na fluorescência do ácido 2-(p-toluidino)-6-naftaleno sulfônico (TNS). Nanopartículas lipídicas que compreendem lipídio catiônico/DSP C/colestero|/P E G-lipídio (50/10/38,5/1,5% em mol) em PBS a uma concentração de lipídio total de 0,4 mM podem ser preparadas usando o processo em linha, como descrito aqui e em outro lugar. O TNS pode ser preparado como uma solução-mãe de 100 uM em água destilada. As vesículas podem ser diluídas para 24 uM de lipídio em 2 ml de soluções tamponadas contendo HEPES 10 mM, MES mM, acetato de amônio 10 mM, NaCl 130 mM, em que o pH varia de 2,5a 11. Uma alíquota da solução TNS pode ser adicionado para render uma concentração final de 1 UM e após a mistura de vórtice, a intensidade da fluorescência é medida à temperatura ambiente em um espectrofotômetro de luminescência SLM Aminco série 2, usando comprimentos de onda de excitação e emissão de 321 nm e 445 nm. Uma análise sigmoidal de melhor ajuste pode ser aplicada aos dados de fluorescência e o pKa é medido como o pH, dando origem a uma intensidade de fluorescência semi-máxima.

[0381] O encapsulamento de ceDNA em partículas lipídicas pode ser determinado por um ensaio Oligreen * O Oligreenº é uma mancha ultrassensível de ácido nucleico fluorescente para quantificação de oligonucleotídeos e DNA ou RNA de fita simples em solução (disponível na Invitrogen Corporation; Carlsbad, Califórnia). Como alternativa, o PicoGreenº pode ser usado. Resumidamente, o encapsulamento pode ser determinado através da realização de um ensaio de exclusão de corante fluorescente impermeável à membrana, que utiliza um corante que tem fluorescência aprimorada quando associado ao ácido nucleico. A encapsulação é determinada adicionando o corante à formulação de partículas lipídicas, medindo a fluorescência resultante e comparando a mesma com a fluorescência observada após a adição de uma pequena quantidade de detergente não iônico. A ruptura mediada por detergente da bicamada lipídica libera o ceDNA encapsulado, permitindo que ele interaja com o corante impermeável à membrana. A encapsulação de CeDNA pode ser calculado como E = (lo -I)/lo, em que /e lo se refere às intensidades de fluorescência antes e após a adição de detergente.

[0382] A atividade relativa pode ser determinada medindo a expressão da luciferase no fígado 4 horas após a administração via injeção na veia da cauda. A atividade é comparada com uma dose de 0,3 e 1,0 mg de ceDNA/kg e expressa como ng luciferase/g de fígado medido 4 horas após a administração. Exemplo 9: Avaliação de ceDNA-LNPs exemplificadores

[0383] Nanopartículas lipídicas que compreendem ceDNAs exemplificadores foram preparadas em várias razões N/P (por exemplo, 3, 4,5 e 6) usando uma solução lipídica compreendendo MC3, DSPC, colesterol! e DMG-PEG2000 (razão molar 50:10:38,5:1,5). Foram preparadas soluções aquosas de um vetor de ceDNA em soluções tamponadas compreendendo sais como acetato de sódio, acetato de sódio e cloreto de magnésio, citrato, ácido málico ou ácido málico ou ácido málico e cloreto de sódio. A solução lipídica e a solução ceDNA foram misturadas usando um procedimento interno em um NanoAssembler a uma vazão total de 12 ml/min, na proporção lipídio/2DNA de 1:3 (em volume).

Caracterização

[0384] O tamanho das nanopartículas lipídicas e o encapsulamento do ceDNA nas nanopartículas lipídicas foram determinados. O tamanho das partículas foi determinado por espalhamento dinâmico de luz (ZEN3600, Malvern Instruments). A eficiência da encapsulação foi calculada determinando o conteúdo de ceDNA não encapsulado medindo a fluorescência após a adição de PicoGreen (Thermo Scientific) à pasta de LNP (Civre) e comparando esse valor ao conteúdo total de ceDNA obtido na lise dos LNPs em 1% Triton X-100 (C tota), em que% de encapsulamento = (Crotal- Civre)/Ctotar X 100. Os resultados são mostrados nas Figuras 9 a 11. Ensaio de escape endossômico

[0385] Foi determinado o efeito do soro e da BSA no encapsulamento e liberação do ceDNA a partir dos LNPs. O endossoma que imita o lipossoma aniônico foi preparado misturando DOPS:DOPC:DOPE (razão molar 1:1:2) em clorofórmio, seguido de evaporação do solvente no vácuo. O filme lipídico seco foi ressuspenso em DPBS com sonicação breve, seguido de filtração através de um filtro de seringa de 0,45 um para formar lipossoma aniônico.

[0386] O LNP contendo ceDNA e BSA ou soro foi misturado em volumes iguais. A mistura foi incubada a 37ºC durante 20 min. Subsequentemente, o lipossoma aniônico foi adicionado ao LNP-BSA ou mistura de soro na proporção desejada de mole lipídico aniônico/catiônico em DPBS a pH 7,5 ou 6,0. A combinação resultante foi, em seguida, incubada a 37ºC durante mais 15 min. Como controle, um volume igual de DPBS, no lugar do lipossoma aniônico, foi adicionado à mistura de LNP-BSA ou soro. O ceDNA livre com diferentes tratamentos a pH 7,5 ou pH 6,0 foi calculado determinando o conteúdo de ceDNA não encapsulado medindo a fluorescência após a adição de PicoGreen (Thermo Scientific) à pasta de LNP (Civre) e comparando esse valor ao conteúdo total de ceDNA que é obtido na lise dos LNPs por 1% de Triton X-100 (Ctotal), em que % livre = Ciivre/C totai X

100. O percentual de ceDNA liberado após a incubação com lipossoma aniônico foi calculado com base na equação abaixo: % de ceDNA liberado =% ceDNAiivre misturado com lipossoma aniônico -% CEDNAiivre misturado com DPBS

[0387] Os resultados são mostrados nas Figuras 12-15 e resumidos na Tabela 5. TABELA 5. A liberação de ceDNA a partir de LNPs exemplificadores é a incubação com lipossoma DOPS Pré-incubação (1v: 1v) pH 7,4 pH 6,0 pH 7,4 | pH6,0 mede | * O soro contendo MgCl26 mM e actina 200 nM Ligação a ApoE

[0388] A ligação das nanopartículas lipídicas a ApoE foi determinada. LNP (10 ug/ml) foi incubado a 37ºC durante 20 min com um volume igual de ApoE3 recombinante (500 pg/ml) em 1X DPBS. Após a incubação, as amostras de LNP foram diluídas 10 vezes usando 1x DPBS e analisadas por cromatografia em heparina- sepharose em AKTA puro 150 (GE Healthcare), de acordo com as condições abaixo:

Condições cromatográficas HiTrap Coluna HiTrap Heparina Sepharose HP 1 mL Tampão de equilíbrio — 1x DPBS Tampão de lavagem — 1xDPBS Tampão de eluição NaCl 1 M em tampão fosfato de — sódio 10 MM, pH 7,0 Quociente de vazão 1 mL/min Volume de injeção 500 JL Detecção 260 nm Cv A (%) B (%) Equilíbrio 1 100 o Lavagem da coluna 4 100 o Eluição (linear) 10 o 100 Equilíbrio 3 100 o

[0389] Os resultados são mostrados na Figura 16. Expressão HEK293

[0390] A expressão do ceDNA encapsulado nas nanopartículas lipídicas foi testada como segue.

[0391] As células HEK293 foram mantidas a 37ºC com CO2a5% em meio de cultura DMEM + GlutaMAX'" (Thermo Scientific) enriquecido com soro fetal bovino a 10% e Penicilina-Estreptomicina a 1%. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 30.000 células/poço no dia antes da transfecção. O reagente de transfecção Lipofectamine"Y 3000 (Thermo Scientific) foi usado para transfectar 100 ng/poço de ceDNA de controle de acordo com o protocolo do fabricante. O ceDNA de controle foi diluído em O pti- MEM'Y (Thermo Scientific) e o reagente P3000'Y foi adicionado. Posteriormente, Lipofectamine'" 3000 foi diluído para uma concentração final de 3% em Opti-MEM'Y, Lipofectamine'y 3000 diluído foi adicionado ao ceDNA diluído na razão de 1:1 e incubado por minutos em temperatura ambiente. A quantidade desejada de complexo ceDNA-lipídio ou LNP foi então adicionada diretamente a cada poço contendo células. As células foram incubadas a 37ºC com

CO72 a 5% durante 72 horas. Os níveis de expressão do fator IX secretado nos meios condicionados com HEK293 foram determinados pelo kit VisuLize FIX Antigen ELISA (Affinity Biologics) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados são mostrados nas Figuras 17 a 19. Exemplo 10: Compostos para Formulação À

[0392] As nanopartículas lipídicas (LNPs) compreendendo ceDNA podem ser preparadas ou formuladas em combinação com um ou mais compostos de Fórmula (1) ou (II), de preferência formando um lipossoma ou nanopartícula lipídica adequada para armazenamento e entrega terapêutica do vetor de ceDNA.

[0393] Os compostos de Fórmula (1), úteis na preparação de formulações de partículas lipídicas, têm a estrutura: o nº MA RAÇA pr ' Rô em que cada um de Rº Rº Rº e Rº é selecionado independentemente do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C2o alquila, grupo C1-C20 alquila, C2-C209 alquenila, C2-C20o alquenila substituída, C2-C2o alquenila, e de colesterila; R? é selecionado do grupo que consiste em C1-C20 alquila, C1-C20 alquila, C2-C20 alquenila, C2-C20 alquenila e C2-C20 alquinila; L é selecionado do grupo que consiste em S, O, C1-C20 alquenila, C1-C20 alqueniila; RI$IO-R$$N — RI$SO-R$S-N X' está ausente, o ou Õ ; R?$IO-R$$N — R2$0ri—N X? está ausente, o ou o ;e cada R$ é selecionado independentemente do grupo que consiste em C1-C20 alquila, C1-C20 alquila, C2-C 20 alqguenila, C2-C 20 alquenila e C2-C20 alquinila; ou um sal do mesmo.

[0394] O composto de Fórmula (1), útil na preparação de formulações de partículas lipídicas, tem a estrutura: nó 2 Rag Aa A) xe BR n em que cada um dentre R4+ R? e Rº é selecionado independentemente do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C2o alquila, C1-C20 alquila, C2-C20o alquenila, C2-C2xo alquenila, C2-C2xo alguenila e de colesterila; Rô é selecionado do grupo que consiste em C1-C20 alquila, C1-C20 alquila, C2-C20 alquenila, C2-C20 alquenila e C2-C20 alquinila; R” é ausente ou é selecionado do grupo que consiste em C1-C20 alquila, C1-C20 alquila, C2-C20 alguenila, C2-C2o alqguenila e C2-C2o alquinila; L é selecionado do grupo que consiste em S, O, C1-C20 alquenila, C1-C20 alqueniila; 1 -R6 1 6 X ' está ausente, ' 7º ' ou * tt ; 2 —R6 2 6 X ? está ausente, ' 7º ' ou ' Pq ; cada R$ é selecionado independentemente do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C2o alquila, grupo C1-C2o alquila, C2-C2o alquenila, C2-C20 alquenila e C2-C20 alquinila; e --- é uma ligação covalente a R* quando R” está presente ou está ausente quando R* está ausente; ou um sal do mesmo.

[0395] Em alguns exemplos de compostos de Fórmula (1) ou

Fórmula (11), R* representa uma C12-C20 alquila ramificada; R? representa uma C5-C10 alquila linear ou uma C12-C20 alquila ramificada; Rº e R? são, cada um, independentemente, uma C1-Cs alquila linear; cada R$ representa independentemente uma C1-C5 alquila linear ou ramificada; e L é uma C1-C3alquila linear.

[0396] Compostos exemplificativos de Fórmula (1) ou (Il) podem ser um ou mais compostos selecionados dentre os compostos mostrados na Figura 20.

[0397] Sínteses genéricas de compostos de Fórmulas (1) e (II) são mostradas nas Figuras 21 e 22, em que cada valor R é selecionado independentemente.

[0398] Em geral, os compostos de partida divulgados acima e outros compostos podem ser adquiridos de fontes comerciais ou preparados de acordo com métodos familiares aos versados na técnica. O versado na técnica será capaz de construir até os andaimes mais substituídos nos compostos descritos aqui com métodos sintéticos convencionais e através de livros de referência e bancos de dados direcionados a compostos químicos e reações químicas, como é conhecido por um versado na técnica. Livros e tratados de referência adequados que detalham a síntese de reagentes úteis na preparação de compostos divulgados neste documento ou fornecem referências a artigos que descrevem a preparação de compostos divulgados neste documento incluem, por exemplo, "Synthetic Organic Chemistry", J ohn Wiley and Sons, Inc. Nova York; SR Sandler et al., "Organic Functional Group Preparations", 22. Ed., Academic Press, Nova York, 1983; H. O. House, "Modem S ynthetic Reactions", 2º Ed., WA Benjamin, Inc. Menlo Park, Califórnia, EUA, 1972; TL Glichrist, "Heterocyclic Chemistry", 2º Ed. John Wiley and Sons, Nova York, 1992; J. March, "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure", 52 Ed,, Wiley Interscience, Nova York, 2001; Reagentes específicos e análogos também podem ser identificados através dos índices de produtos químicos conhecidos preparados pelo Chemical Abstract Service da American Chemical Society, que estão disponíveis na maioria das bibliotecas públicas e universitárias, bem como através de bancos de dados online (American Chemical Society, Washington, DC pode ser contatado para mais detalhes). Os produtos químicos conhecidos, mas não disponíveis comercialmente em catálogos, podem ser preparados por empresas de síntese química personalizadas, em que muitas das empresas de fornecimento de produtos químicos padrão fornecem ainda serviços de síntese personalizados. Exemplo 11: Compostos para a Formulação B

[0399] Outras partículas lipídicas que compreendem ceDNA podem ser preparadas ou formuladas em combinação com um ou mais compostos de Fórmula (III), (IV) ou (V) descritos neste exemplo, de preferência formando uma lipopossoma ou nanopartícula lipídica adequada para armazenamento e terapêutica entrega do vetor de ceDNA.

[0400] Os compostos de Fórmula (Ill), úteis na preparação de formulações de partículas lipídicas, têm a estrutura: Rô R? nO Rº x nº m em que O representa um anel cíclico selecionado do grupo que consiste em C3-C1o cicloalguila, C3-C1o cicloalquenila, C3-Cao, heterocicloalquila, C3-C10 heterocicloalquenila, Cs-C1o arila e Cs- C1o heteroarila; cada um de R4 Rº Rôe Rº é selecionado independentemente do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C2o alquila, C1-C20 alquila,

C2-C20 alquenila, C2-C20 alquenila substituída, C2-C20 alguenila e colesterila; e X' está ausente, C1-C2o alquila, C1-C2o alguila substituída, RIto—pi-n — RISO i—N o ou o ; X? está ausente, C1-C2o alquila, C1-C2o alquila substituída, R2+O— in R2$0 prin o ou o ; ou um sal do mesmo.

[0401] Em alguns exemplos de compostos de Fórmula (Ill), pelo menos um dentre R" Rº? Rº e Rº representa: TOS oeooor ooo erga ale ar llegar a lsaram,

ICON OOONOSOOA

[0402] Um composto de Fórmula (Ill) pode ser um composto selecionado dentre os compostos mostrados na Figura 23.

[0403] Os compostos de Fórmula (IV), úteis na preparação de formulações de partículas lipídicas, têm a estrutura: o rod nt 2 PES ny R em que: néde0al50;e cada um dentre R* R? e R? é selecionado independentemente do grupo que consiste em hidrogênio, C1-C2o alguila, C1i-C2o alquila, C2-C2o alquenila, C2-C2ro alquenila, C2-C2xo alqguenila e colesterila; ou um sal do mesmo.

[0404] Os compostos de Fórmula (V), úteis na preparação de formulações de partículas lipídicas, têm a estrutura: o x2 art xaas

RA R3

V em que cada um dentre Rº Rº? Rº Rº e Rº é selecionado independentemente do grupo que consistem em: hidrogênio, C1-C2o alguila, C1i-C2o alquila, C2-C2o alquenila, C2-C2ro alquenila, C2-C2xo alqguenila e colesterila; X' está ausente, C1-C2o alquila, C1-C2o alguila substituída, ou R2 SET : Rito—ri- X? está ausente, C1-C2o alquila, C1-C2o alquila, o ou Riot o ; X? está ausente, C1-C2o alquila, C1-C2o alquila substituída, Ritoir — Riiqo+ Oo ou o ; ou um sal do mesmo.

[0405] Compostos exemplificadores de Fórmula (V) incluem, sem limitação, o seguinte:

o

FIOS o NONO R LS OS eo

TO o

A o : NONO o em que n e m são cada um independentemente de 0 a 20; e cada R!' e R? é independentemente selecionado do grupo que consiste em: hidrogênio, C1-C2o alquila, C1- C2o alquila, C2-C2o alquenila, C2-C20o alquenila, C2-C2o alquenila, e colesterila; ou um sal do mesmo.

[0406] Sínteses genéricas de compostos de Fórmula (III), Fórmula (IV) e (V) são mostradas na Figura 24, em que cada valor de R é selecionado independentemente.

[0407] Será apreciado pelos versados na técnica que, no processo descrito neste documento, os grupos funcionais de compostos intermediários podem precisar ser protegidos por grupos de proteção adequados. Tais grupos funcionais incluem hidroxi, amino, mercapto e ácido carboxílico. Grupos protetores adequados para hidróxi incluem trialguilsilil ou diarilalquilsill (por exemplo, t-butildimetilsilil, t butildifenilsilil ou trimetilsilil), tetra-hidropiranil, benzil e similares. Grupos protetores adequados para amino, amidino e guanidino incluem t butoxicarbonil, benziloxicarbonil e similares. Grupos protetores adequados para mercapto incluem -C(O)-R" (onde R" é alquila, arila ou arilalquila), p-metoxibenzil, tritil e similares. Grupos protetores adequados para ácido carboxílico incluem ésteres alquila, arila ou arilalguila. Grupos de proteção podem ser adicionados ou removidos de acordo com técnicas padrão, que são conhecidas por um versado na técnica e como descrito neste documento. O uso de grupos protetores é descrito em detalhe em Green, TW e PGM Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3º Ed., Wiley (aqui incorporado a título de referência na sua totalidade). Como um versado na técnica apreciaria, o grupo protetor também pode ser uma resina de polímero, como uma resina Wang, resina Rink ou uma resina de cloreto de 2-clorotritil. Em geral, os componentes de partida podem ser obtidos de fontes como Sigma Aldrich, Lancaster Synthesis, Inc., Maybridge, Matrix Scientific, TCI e Fluorochem USA, etc., ou sintetizados de acordo com fontes conhecidas pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure, 5º edição (Wiley, dezembro de 2000), aqui incorporada a título de referência em sua totalidade).

Exemplo 12: Preparação de formulações lipídicas

[0408] Nanopartículas de lipossomas (LNP) podem ser preparadas. Lípido catiônico, DSPC, colesterol e PEG-lipídio podem ser solubilizados em etanol na razão molar de 50: 10: 38,5: 1,5. As nanopartículas lipídicas (LNP) podem ser preparadas com uma proporção total de lipídios/ceDNA de aproximadamente 10:1 a 30:1. Resumidamente, o ceDNA é diluído para 0,2 mg/ml em tampão citrato a 50 MM, pH 4. As bombas de seringa podem ser usadas para misturar a solução lipídica etanólica com a solução aquosa de ceDNA em uma razão de cerca de 1:5 a 1:3 (em volume) com vazões totais acima de 15 ml/min. O etanol pode então ser removido e o tampão externo é substituído por PBS por diálise. Finalmente, as nanopartículas lipídicas podem ser filtradas através de um filtro estéril de 0,2 um poros. O tamanho de partícula de nanopartículas lipídicas é de aproximadamente 55-95 nm de diâmetro e, em alguns casos, é de aproximadamente 70-90 nm de diâmetro, como pode ser determinado pela dispersão de luz quase elástica usando um Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, Reino Unido).

[0409] O pKa de lipídios catiônicos formulados pode ser correlacionado com a eficácia dos LNPs na liberação de ácidos nucleicos (consulte | ayaraman etal., Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51 (34), 8.529 a 8.533; Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172 a 176 (2010), os quais são incorporados a título de referência na sua totalidade). O intervalo preferencial de pKa é de —5 a —7. O pKa de cada lipídio catiônico é determinado em nanopartículas lipídicas usando um ensaio baseado na fluorescência do ácido 2-(p- toluidino)-6-naftaleno sulfônico (TNS). Nanopartículas lipídicas que compreendem lipídio catiônico/DSP C/colesterol/P E G-lipídio (50/10/38,5/1,5% em mol) em PBS a uma concentração de lipídio total de 0,4 mM podem ser preparadas usando o processo em linha, como descrito aqui e em outro lugar. O TNS pode ser preparado como uma solução-mãe de 100 uM em água destilada. As vesículas podem ser diluídas para 24 UM de lipídio em 2 ml de soluções tamponadas contendo HEPES 10 MM, MES 10 mM, acetato de amônio 10 mM, NaCl 130 MM, em que o pH varia de 2,5 a 11. Uma alíquota da solução TNS pode ser adicionado para render uma concentração final de 1 uM e após a mistura de vórtice, a intensidade da fluorescência é medida à temperatura ambiente em um espectrofotômetro de luminescência SLM Aminco série 2, usando comprimentos de onda de excitação e emissão de 321 nm e 445 nm. Uma análise sigmoidal de melhor ajuste pode ser aplicada aos dados de fluorescência e o pKa é medido como o pH, dando origem a uma intensidade de fluorescência semimáxima.

[0410] Nanopartículas lipídicas também podem ser formuladas usando a seguinte relação molar 25:50% de lipídio catiônico/10% de distearoilfosfatidilcolina (DSPC)/38,5% de colesterol/1,5% de PEG- lipídio ("PEG-DMG", ou seja, (1-(monometóxi-polietilenoglico!)-2,3-

dimiristoilglicerol, com um peso molecular médio de PEG de 2000). À atividade relativa pode ser determinada medindo a expressão de luciferase no fígado 4 horas após a administração por injeção nas veias da cauda, conforme descrito neste documento. Dose de 0,3 e 1,0 mg de ceDNA/kg e expressa em ng luciferase/g de fígado medido 4 horas após a administração.

[0411] Os compostos terapêuticos de ceDNA podem ser formulados usando a seguinte razão molar: 50% de lipídio catiônico/10% de distearoilfosfatidilcolina (DSPC)/38,5% de colesterol/1,5% de PEG- lipídio ("PEG-DMA" 2-[2-w-metóxi(polietilenoglicol2000)etóxil-N, N- ditetradecilacetamida). A atividade relativa pode ser determinada medindo a expressão de luciferase no fígado 4 horas após a administração por injeção nas veias da cauda, conforme descrito acima. A atividade pode ser comparada nas doses de 0,3 e 1,0 mg de MRNA ou DNA/kg e expresso como ng luciferase/g de fígado medido 4 horas após a administração, como descrito acima. Exemplo 13: Expressão in vivo de proteínas do luciferase transgene a partir de vetores ceEDNA

[0412] A expressão proteica in vivo de um transgene a partir de vetores de ceDNA produzidos a partir dos construtos 1 a 8 descritas acima é avaliada em camundongos. O vetor de ceDNA obtido do construto ceDNA-plasmídeo 1 (como descrito na Tabela 5 no Exemplo 1) foi testado e demonstrou expressão do transgene de luciferase sustentada e durável em um modelo de camundongo após injeção hidrodinâmica de uma composição compreendendo o vetor de ceDNA compreendido em nanopartículas lipídicas na veia da cauda. À expressão do transgene da luciferase foi medida por imagem IVIS após administração intravenosa em camundongos CD-1ºIGS (Charles River Laboratories; camundongos WT).

[0413] O estudo avalia a biodistribuição do vetor de terapia genética não viral expressando luciferase hidrodinâmica pelo IVIS, após administração intravenosa em camundongos CD-1º IGS. O veículo é PBS estéril. Neste estudo, dois grupos de cinco (5) camundongos CD-1 foram administrados PBS ou 0,35 mg/kg de ceDNA codificando luciferase por injeção hidrodinâmica de 1,2 ml na veia da cauda. À expressão da luciferase foi avaliada por imagem IVIS nos dias 3, 4, 7, 14, 21, 28, 31, 35 e 42. Resumidamente, os camundongos foram injetados intraperitonealmente com 150 mg/kg de substrato de luciferina e a luminescência do corpo inteiro foi avaliada via Imagem IVIS.

[0414] Expressão in vivo da luciferase: camundongos IGS CD-1 machos de 5 a 7 semanas (Charles River Laboratories) recebem 0,35 mg/kg de construto de vetor de ceDNA 1-4 Luc (Grupo 1) em volume de 1,2 ml via administração hidrodinâmica iv em Dia O. Alguns animais em cada grupo são re-administrados com uma dose idêntica do construto de vetor de ceDNA 1-4 Luc (Grupo 1) ou no dia 28.

[0415] A expressão da luciferase do vetor de ceDNA é avaliada por quimioluminescência in vivo usando a instrumentação IVISº após a injeção intraperitoneal (ip) de substrato de luciferase de 150 mg/kg. A imagem IVIS é realizada no dia 3, dia 4, dia 7, dia 14, dia 21, dia 28, dia 31, dia 35 e dia 42, e os órgãos coletados são fotografados ex vivo após o sacrifício no dia 42.

[0416] Durante o curso do estudo, os animais são pesados e monitorados diariamente quanto à saúde e bem-estar geral. No sacrifício, o sangue é coletado de cada animal pelo bastão cardíaco terminal e dividido em duas porções e processado em 1) plasma e 2) soro, com plasma congelado rapidamente e soro usado no painel de enzimas hepáticas e subsequentemente congelado. Além disso, fígados, baços, rins e linfonodos inguinais (LNs) são coletados e gerados por imagem ex vivo pelo IVIS.

[0417] A expressão da luciferase é avaliada nos fígados pelo ensaio

Luciferase ELISA MAXDISCOVERYº (BIOO Scientific/P erkinEImer), qPCR para luciferase de amostras de fígado, histopatologia de amostras de fígado e/ou painel de enzimas hepáticas séricas (VetScanVS2; Abaxis Preventative Care Profile Plus). Referências

[0418] Todas as referências listadas e reveladas na especificação e nos Exemplos, incluindo patentes, pedidos de patente, pedidos de patente internacionais e publicações, são incorporadas aqui na sua totalidade a título de referência.

Claims (1)

1. 7. Nanopartícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que uma ou mais das ITRs não são uma ITR do tipo selvagem.

   8. Nanopartícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que uma ou mais das ITRs assimétricas são modificadas por uma deleção, inserção e/ou substituição em pelo menos uma das regiões de ITR selecionadas de A,A',B,B',C,C', DeD"'.

   9. Nanopartícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o vetor de ceEDNA compreende pelo menos duas ITRs assimétricas selecionadas de: a. SEQIDN%1eSEQIDNº%:52;e b. SEQIDNº2eSEQIDNº:51.

   10. Nanopartícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o vetor de ceDNA é obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: a. incubar uma população de células de inseto que abrigam um construto de expressão de ceDNA na presença de pelo menos uma proteína Rep, em que o construto de expressão de ceDNA codifica o vetor de ceDNA, sob condições efetivas e por um tempo suficiente para induzir a produção do vetor de ceDNA dentro das células de inseto; e b. isolaro vetor de ceDNA das células de insetos.

   11. Nanopartícula lipídica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o construto de expressão de ceDNA é selecionada dentre um plasmídeo ceDNA, um bacmídeo ceDNA e um baculovírus ceDNA.

   12. Nanopartícula lipídica, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que a célula de inseto expressa pelo menos uma proteína Rep.

   13. Nanopartícula lipídica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma proteína Rep é de um vírus selecionado dentre um parvovírus, um dependovírus e um vírus adeno-associado (AAV).

   14. Nanopartícula lipídica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma proteína Rep é de um sorotipo de AAV selecionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV3, AAVA, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVI10, AAV11 e AAV12.

   15. Partícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o vetor de DNA é obtido a partir de um polinucleotídeo de vetor, em que o polinucleotídeo de vetor codifica um ácido nucleico heterólogo operativamente posicionado entre duas sequências de repetição terminal invertidas (ITRS), em que as duas ITS são diferentes um do outro (assimétrico) e pelo menos uma das ITRs é uma ITR funcional que compreende um sítio de resolução de terminal funcional e um sítio de ligação Rep, e uma das ITRs compreende uma deleção, inserção e/ou substituição em relação ao ITR funcional; a presença da proteína Rep induzindo a replicação do vetor polinucleotídico e produção do vetor DNA em uma célula de inseto, sendo o vetor DNA obtido a partir de um processo compreendendo as etapas de.

   a. incubar uma população de células de inseto que abrigam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codificação do capsídeo viral, na presença da proteína Rep sob condições efetivas e por tempo suficiente para induzir a produção do vetor de DNA não viral não capsídico em células de inseto, em que as células de inseto não compreendem produção de DNA não viral sem capsídeo dentro das células de inseto na ausência do vetor; e b. colher e isolar o DNA não viral sem capsídeo das células dos insetos.

   16. Partícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizada pelo fato de que a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada.

   17. Partícula lipídica, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada pela digestão de DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição tendo um único sítio de reconhecimento no Vetor de DNA e análise do material de DNA digerido em um gel não desnaturante para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.

   18. Partícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que o vetor de DNA é obtido a partir de um polinucleotídeo de vetor, em que o polinucleotídeo de vetor codifia um ácido nucleico heterólogo posicionado operacionalmente entre uma primeira e uma segunda sequência de polinucleotídeo de DNA de repetição terminal invertida e finalizada por AAV?2 (ITRS), com pelo menos uma das ITRs tendo pelo menos uma deleção, inserção e/ou substituição de polinucleotídeo em relação à ITR do tipo selvagem AAV?2 correspondente de SEQ ID Nº: 10u SEQ ID Nº: 51 para induzir a replicação do Vetor de DNA em uma célula de inseto na presença de proteína Rep, sendo o vetor de DNA obtido a partir de um processo que compreende as etapas de: a. incubar uma população de células de inseto que abrigam o polinucleotídeo de vetor, que é desprovido de sequências de codificação do capsídeo viral, na presença de proteína Rep, em condições efetivas e por um tempo suficiente para induzir a produção do DNA não viral sem capsídeos dentro das células de inseto, em que as células de inseto não compreendem sequências codificantes do capsídeo viral; e b. colher e isolar o DNA não viral sem capsídeo das células dos insetos.

   19. Partícula lipídica, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a presença do DNA não viral, sem capsídeos, isolado das células de inseto pode ser confirmada.

   20. Partícula lipídica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a presença do DNA não viral sem capsídeo isolado das células de inseto pode ser confirmada pela digestão de DNA isolado das células de inseto com uma enzima de restrição que tem um único sítio de reconhecimento no Vetor de DNA e análise do material de DNA digerido em um gel não desnaturante para confirmar a presença de bandas características de DNA linear e contínuo em comparação com o DNA linear e não contínuo.

   21. Partícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a partícula lipídica compreende ainda um ou mais dentre um lipídio não catiônico; um lipídio conjugado com PEG; e um esterol.

   22. Partícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que o lipídio ionizável é um lipídio descrito na Tabela 1.

   23. Partícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que a partícula lipídica compreende ainda um lipídio não catiônico, em que o lipídio não iônico é selecionado do grupo que consiste em distearoil-sn-glicerofosfo- etanolamina, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina —“(DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DP PG), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolihna (POPC), palmitoiloleoilfosfatidil- etanolamina (POPE), dioleoil-fosfatidiletanolamina 4-(N-maleimidometil)- ciclo-hexano-1-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil-fosfatidil-etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina — (DMPE), distearoil-fosfatidil- etanolamina (DSPE), monometil-fosfatidiletanolamina, dimetil- fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, dimetil- fosfatidiletanolamina, 18-1-trans PE, 1-estearoil-2-oleoil- fosfatidietanolamina (SOPE), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), fosfatidilcolina de ovo (EPC), dioleolfosfatidilserina (DOPS), esfingomielina (SM), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), dimiristoil fosfatidilglicero| (DMPG), diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG), dierucoilfosfatidilcolihna (DEPC), palmitoiloleiolIfosfatidilglicero! (POPG), dielaidoil-fosfatidiletanolamina (DEPE), lecitina, fosfatidiletanolamina, lisolecitina, lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esfingomielina, esfingomielina de ovo (ESM), cefalina, cardiolipina, fosfatidicácido, cerebrosídeos, dicetilfosfato, lisofosfatidilcolina e dilinoleilofosfato.

   24. Partícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de que a partícula lipídica compreende ainda um lipídio conjugado, em que o lipídio conjugado, em que o lipídio conjugado é selecionado do grupo que consiste em PEG- diacilglicerol (DAG), PEG- dialquiloxipropila (DAA), PEG-fosfolipídio, PEG-ceramida (Cer), uma fosfatidiletanoloamina peguilada (PEG-PE), PEG succinato de diacilglicerol (PEGS-DAG), dialquilopropilcarbam de PEG e dialquilopropilcarbam de PEG e N-(carbonil-metoxipoletileno), sal de sódio de 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina.

   25. Partícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que a partícula lipídica compreende ainda colesterol ou um derivado de colesterol.

   26. Partícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que a partícula lipídica compreende: (i) um lipídio ionizável; (ii) um lipídio não catiônico; (iii) um lipídio conjugado que inibe a agregação de partículas; e (iv) um esterol.

   27. Partícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que a partícula lipídica compreende: (a) um lipídio ionizável em uma quantidade de cerca de 20% em mol a cerca de 90% em mol do lipídio total presente na partícula; (b) um lipídio não catiônico em uma quantidade de cerca de 5% em mol a cerca de 30% em mol do lipídio total presente na partícula; (c) um lipídio conjugado que inibe a agregação de partículas em uma quantidade de cerca de 0,5% em mol a cerca de 20% em mol do lipídio total presente na partícula; e (d) um esterol em uma quantidade de cerca de 20% em mol a cerca de 50% em mol do lipídio total presente na partícula.

   28. Partícula lipídica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizada pelo fato de que a razão lipídio total para vetor de DNA (massa ou peso) é de cerca de 10:1 a cerca de 30:1.

   29. Composição caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira nanopartícula lipídica e um composto adicional, em que a primeira nanopartícula lipídica compreende um primeiro vetor não viral sem capsídio e é uma nanopartícula lipídica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 28.

   30. Composição, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que o dito composto adicional é englobado em uma segunda nanopartícula lipídica e em que a primeira e a segunda nanopartículas lipídicas são diferentes.

   31. Composição, de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizada pelo fato de que o dito composto adicional é abrangido na primeira nanopartícula lipídica.

   32. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizada pelo fato de que o dito composto adicional é um agente terapêutico.

   33. Composição, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o dito composto adicional é um segundo vetor não viral sem capsídeo, em que o primeiro e o segundo vetor não viral sem capsídeo são diferentes.