CN116179605A - 一种重组腺相关病毒载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物技术领域，公开了一种重组腺相关病毒载体及其应用。该重组腺相关病毒载体，包含腺相关病毒衣壳和非自身互补的单链基因组；所述单链基因组包含EF1α启动子和编码运动神经元存活蛋白的基因；本发明通过采用EF1α启动子，调控SMN1基因表达，在SMA患者发育成型后不在保持SMN基因的持续性高表达，避免出现由于SMN持续性过表达引起的运动神经元延迟性退行性病变，使得本发明提供的重组腺相关病毒载体治疗SMA的效果显著优于包含其他启动子的重组腺相关病毒载体：延长小鼠生存时间、增加小鼠体重、改善运动神经元与骨骼肌相关的组织发育，可用于预防、减轻或治疗神经系统疾病。

Description

一种重组腺相关病毒载体及其应用
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒载体及其应用。
背景技术
腺相关病毒(AAV)是细小病毒科的一种。AAV基因组由一个长度约为4.7kb的线性单链DNA分子组成，具有两个主要的开放阅读框，编码非结构复制和结构帽(衣壳)蛋白。AAV编码区两侧是两个顺式作用的反向末端重复序列(ITR)，长度约为145个核苷酸，在DNA复制起始阶段起引物的作用。ITR序列除了在DNA复制中发挥作用外，还被证明在病毒整合、将病毒核酸包封到成熟的病毒粒子中等过程中起作用。引导病毒DNA复制(rep)、包封/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在ITR中。cap基因从p40启动子中表达，编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。衣壳蛋白由cap基因编码，根据cap基因的不同，AAV具有多种血清型，并提供不同的组织倾向性。AAV有多种血清型，包括:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10和AAV11等。其中AAV9及其突变体AAVPHP.eb和AAVPHP.b被用在靶向中枢神经系统内的细胞递送中，用于治疗神经退行性疾病。
AAV载体对于体内递送遗传物质有很大潜力，因为(i)它们能够感染(转导)各种非分裂和分裂细胞类型，包括肌纤维和神经元；(ii)它们没有病毒结构基因，从而消除了宿主细胞对病毒感染的自然反应，例如干扰素介导的反应；(iii)野生型病毒从未与人类的任何病理有关；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组的野生型AAV不同，复制缺陷的AAV载体通常以游离体形式存在，从而限制了插入突变或致癌基因激活的风险；(v)与其他载体系统相比，AAV载体不会引发显著的免疫反应，因此能够长期表达治疗性转基因(前提是其基因产物不被排斥)。
脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是由5q13染色体存活运动神经元1基因(survival motor neuron 1gene,SMN1)缺失或突变引起的一种神经遗传性疾病，导致SMN蛋白水平降低，导致运动神经元选择性功能障碍。SMA是一种常染色体隐性的早期儿童疾病，发病率为1:10 000。人类也携带着另一种与SMN1几乎完全相同的基因，称为SMN2。SMN1和SMN2基因均表达SMN蛋白，但SMN2产生的功能性全长蛋白数量远少于SMN1(10～15％)。虽然SMN2不能完全弥补SMN1基因的缺失，但轻度SMA患者通常具有较高的SMN2拷贝数。2拷贝SMN2可以97％预测发生I型SMA,3拷贝SMN2可以83％预测发生II型SMA,4拷贝SMN2可以84％预测发生III型SMA。由于这些百分比不能反映修饰基因突变的可能影响，它们可能低估了拷贝数(在缺乏遗传修饰基因的情况下)和临床表型之间的关系。
I型SMA是遗传疾病导致婴儿死亡的主要原因。疾病的严重程度和临床预后取决于SMN2的拷贝数。在其最常见和最严重的形式(I型)中，张力减退和渐进性虚弱在出生后的头几个月被发现，6个月左右被诊断，然后在2岁左右多死于呼吸衰竭。I型SMA的运动神经元丢失在出生后早期严重(甚至可能在产前就开始)，患者从未获得独立的坐姿。I型SMA患者通常有1或2个SMN2基因拷贝。相比之下，II型SMA在头18个月内出现，患有这种疾病的儿童能够独自坐着，但不能独立行走。II型SMA患者通常有3个SMN2基因拷贝。SMA III型患者获得独立行走的能力。II型和III型SMA患者的运动神经元似乎在发育过程中适应和补偿，并坚持到成年。III型SMA患者通常有3或4个SMN2基因拷贝。II型和III型SMA患者的临床病程相对稳定。此外，研究表明，结果差异与SMN2拷贝的数量有关，SMN2使运动神经元在儿童成长过程中能够适应和补偿，并持续到成年。这与I型SMA不同，在出生后早期运动神经元严重缺失(甚至可能在产前就开始，特别是对于出生后三个月出现的I型SMA患者)。在小鼠和非人类灵长类动物中，SMN的过表达被证明是耐受良好的，而在人类中，SMN2的高拷贝数不构成风险(正如在II、III和IV型患者中看到的，他们有较高的SMN2拷贝数)。到目前为止，SMA的治疗研究进展，尤其是II型和III型SMA，主要集中在利用小分子增加SMN水平方面。这些药物包括去乙酰化酶抑制剂，如丙戊酸、丁酸钠、丁酸苯酯和曲黴素a。这些药物激活SMN2启动子，导致SMA动物模型中全长SMN蛋白增加，目的是改变疾病表型，使其具有III型SMA患者中所见的更温和的特征。
目前，进入临床试验阶段的药物包括苯基丁酸、丙戊酸和羟基脲等，但并没有产生足够的临床效益。FDA批准的诺西那生钠(SPINRAZA)，一种反义寡核苷酸(ASO)药物，旨在通过调节SMN2基因的剪接来增加全长SMN蛋白的产量，从而弥补潜在的遗传缺陷。临床研究显示，有望改善运动障碍；然而，这种治疗方法必须通过鞘内注射无限期地给药，在生效前需要很长的诱导期，并有需要临床监测的安全性考虑。FDA批准的Zolgensma就是通过AAV9载体将自身互补的双链SMN1表达序列递送到体内，并在受到巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子和鸡β-肌动蛋白(CB)启动子的调控作用下已达到治疗的目的，但就目前的临床数据来看，针对SMA患者治疗效果有待提升。
发明内容
本发明第一个方面的目的，在于提供一种重组腺相关病毒载体。
本发明的第二方面的目的，在于提供一种药物组合物。
本发明的第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的重组腺相关病毒载体、第二方面的药物组合物的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种重组腺相关病毒(AAV)载体，包含腺相关病毒(AAV)衣壳和非自身互补的单链基因组；所述单链基因组包含EF1α启动子和编码运动神经元存活(SMN)蛋白的基因。
优选地，所述腺相关病毒(AAV)衣壳为AAVPHP.eb、AAVPHP.b和AAV9衣壳中的一种；进一步为AAV9衣壳。
优选地，所述EF1α启动子为(a1)～(a3)中任一种：
(a1)具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的启动子；
(a2)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经过一个或多个碱基的取代、缺失或添加后仍具有EF1α启动子功能的核苷酸序列所示的启动子；
(a3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性且具有EF1α启动子功能的核苷酸序列所示的启动子。
优选地，所述运动神经元存活(SMN)蛋白为人运动神经元存活(SMN)蛋白。
优选地，所述运动神经元存活(SMN)蛋白为(b1)～(b3)中任一种：
(b1)具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白；
(b2)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加后仍具有运动神经元存活蛋白功能的氨基酸序列所示的蛋白；
(b3)与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性且具有运动神经元存活蛋白功能的氨基酸序列所示的蛋白；
其中，SEQ ID NO.2为：MAMSSGGSGGGVPEQEDSVLFRRGTGQSDDSDIWDDTALIKAYDKAVASFKHALKNGDICETSGKPKTTPKRKPAKKNKSQKKNTAASLQQWKVGDKCSAIWSEDGCIYPATIASIDFKRETCVVVYTGYGNREEQNLSDLLSPICEVANNIEQNAQENENESQVSTDESENSRSPGNKSDNIKPKSAPWNSFLPPPPPMPGPRLGPGKPGLKFNGPPPPPPPPPPHLLSCWLPPFPSGPPIIPPPPPICPDSLDDADALGSMLISWYMSGYHTGYYMGFRQNQKEGRCSHSLN。
进一步优选地，所述编码运动神经元存活(SMN)蛋白的基因为人SMN1基因(NM_000344)。
优选地，所述单链基因组还包含：WPRE。
优选地，所述单链基因组还包含：Kozak序列、聚腺苷酸(polyA)、AAV反向末端重复(ITRs)序列中的至少一种。
进一步优选地，所述单链基因组还包含Kozak序列、聚腺苷酸(polyA)、WPRE和AAV反向末端重复(ITRs)序列。
优选地，所述AAV反向末端重复(ITRs)序列包含AAV 5’-ITR和AAV3’-ITR。
优选地，所述聚腺苷酸为BGH聚腺苷酸(polyA)。
优选地，一种重组腺相关病毒(AAV)载体，包含腺相关病毒(AAV)衣壳和非自身互补的单链基因组；所述单链基因组包含AAV 5’-ITR、EF1α启动子、Kozak序列、编码运动神经元存活(SMN)蛋白的基因、聚腺苷酸(polyA)、WPRE和AAV3’-ITR。
本发明的第二个方面，提供一种药物组合物，包含本发明第一方面的重组腺相关病毒载体和药学上可接受的载体/赋形剂。
本发明的第三个方面，提供(1)～(2)中任一项中在制备预防、减轻或治疗神经系统疾病的药物中的应用：
(1)本发明第一方面的重组腺相关病毒载体；
(2)本发明第二方面的药物组合物。
优选地，所述神经系统疾病为涉及运动功能的运动神经元疾病。
优选地，所述运动神经元疾病选自脊髓性肌萎缩(SMA)、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化(PLS)和外伤性脊髓损伤中的至少一种；进一步为脊髓性肌萎缩(SMA)。
优选地，所述脊髓性肌萎缩(SMA)包括I型脊髓性肌萎缩(SMA)、II型脊髓性肌萎缩(SMA)、III型脊髓性肌萎缩(SMA)和IV型脊髓性肌萎缩(SMA)。
优选地，所述药物的给药方式为注射。
优选地，所述注射为静脉注射、脑室注射和鞘内注射中的至少一种；进一步为脑室注射。
本发明的有益效果是：
本发明提供了提供一种重组腺相关病毒(AAV)载体，包含腺相关病毒(AAV)衣壳和非自身互补的单链基因组；所述单链基因组包含EF1α启动子和编码运动神经元存活(SMN)蛋白的基因；现有的针对SMA的基因治疗药物或策略，多使用全时段广泛性表达的启动子，尤其是基于CMV(Human cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter,人巨细胞病毒即刻早期增强型启动子)启动子衍生出的CB系列启动子或者CAG系列启动子，这些启动子可以让其所控制的人SMN1基因序列在体内一直保持高水平表达，本发明通过采用EF1α启动子，调控SMN1基因表达，在SMA患者发育成型后不再保持SMN基因的持续性高表达，避免出现由于SMN持续性过表达引起的运动神经元延迟性退行性病变，使得本发明提供的重组腺相关病毒(AAV)载体治疗SMA的效果显著优于包含其他启动子的重组腺相关病毒(AAV)载体：延长小鼠生存时间、增加小鼠体重、改善运动神经元与骨骼肌相关的组织发育，可用于预防、减轻或治疗神经系统疾病。
本发明通过限定AAV病毒载体血清型，实现将非自身互补的单链基因组高效地转运至目标器官和组织。
附图说明
图1是pDown-hSMN1[NM_000344]质粒图谱。
图2是pAAV[Exp]-EF1α>hSMN1[NM_000344]:WPRE质粒图谱。
图3是pAAV[Exp]-CAG>hSMN1[NM_000344]]:WPRE质粒图谱。
图4是pDown-EGFP质粒图谱。
图5是pAAV[Exp]-EF1α>EGFP:WPRE质粒图谱。
图6是pscAAV[Exp]-CBh>EGFP质粒图谱。
图7是pAAV[Exp]-CAG>EGFP:WPRE质粒图谱。
图8是pAAV[Exp]-EF1α>hSMN1[NM_000344]质粒图谱。
图9是pAAV[Exp]-CAG>hSMN1[NM_000344]质粒图谱。
图10是实施例1、2制备的病毒转导293T细胞后SMN1表达的结果图：其中，A是实施例1、2制备的病毒转导293T细胞后SMN1表达的凝胶电泳结果图；B是实施例1、2制备的病毒转导293T细胞后SMN1表达量相对于未转导病毒的293T细胞SMN1表达量的统计图；1是实施例2制备的病毒转导293T细胞后SMN1表达量；2是实施例1制备的病毒转导293T细胞后SMN1表达量；3是未转导病毒的293T细胞的SMN1表达量。
图11是实施例4、5制备的病毒在不同组织中EGFP的表达结果图：其中，A是实施例4制备的病毒在不同组织中EGFP的表达结果图；B是实施例5制备的病毒在不同组织中EGFP的表达结果图；C是实施例3制备的病毒在不同组织中EGFP的表达结果图。
图12是实施例3、4、5制备的病毒在脊髓前角中EGFP的表达结果图：其中，A是实施例4、5制备的病毒在脊髓前角中EGFP的表达结果图(比例尺为50μm)；B是实施例3制备的病毒在脊髓前角中EGFP的表达结果图(比例尺为100μm)。
图13是实施例3、4、5制备的病毒在脑组织中的海马区中EGFP的表达结果图：其中，A是实施例4、5制备的病毒在脑组织中的海马区中EGFP的表达结果图(比例尺为50μm)；B是实施例3制备的病毒在脑组织中的海马区中EGFP的表达结果图(比例尺为100μm)。
图14是实施例5制备的病毒注射10天或40天后脊髓前角和海马区中EGFP的表达结果图：其中，A是实施例5制备的病毒注射10天或40天后脊髓前角中EGFP的表达结果图(比例尺为100μm)；B是实施例5制备的病毒注射10天或40天后海马区中EGFP的表达结果图(比例尺为100μm)；C是实施例3制备的病毒注射10天或40天后脊髓前角中EGFP的表达结果图(比例尺为100μm)；D是实施例3制备的病毒注射10天或40天后海马区中EGFP的表达结果图(比例尺为100μm)。
图15是采用不同注射方式注射实施例1、2、6、7制备的病毒对小鼠存活率的影响图。
图16是采用不同注射方式注射实施例1、2、6、7制备的病毒对体重及存活天数的影响图。
图17是不同SMA品系小鼠注射实施例1制备的病毒后SMN1表达量图：其中，A是不同SMA品系小鼠注射实施例1制备的病毒后SMN1表达的凝胶电泳图；B是不同SMA品系小鼠注射实施例1制备的病毒后SMN1表达的统计结果图：1是未注射病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/+小鼠的脑组织；2是未注射病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脑组织；3是静脉注射实施例1制备的病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脑组织；4是脑室注射实施例1制备的病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脑组织；5是未注射病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/+小鼠的脊髓组织；6是未注射病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脊髓组织；7是静脉注射实施例1制备的病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脊髓组织；8是脑室注射实施例1制备的病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脊髓组织。
图18是不同SMA品系小鼠注射实施例6制备的病毒后SMN1表达量图：1是未注射病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脑组织；2是未注射病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-小鼠的脑组织；3是脑室注射病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脑组织；4是未注射病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脊髓组织；5是未注射病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-小鼠的脊髓组织；6是脑室注射病毒的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脊髓组织。
图19是脑注射ssAAV9(EF1α>SMN1:WPRE)对小鼠平衡能力的影响图。
图20是脑注射ssAAV9(EF1α>SMN1:WPRE)对小鼠翻转能力的影响图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所采用的原料，除特殊说明外，均通过常规手段制备或者通过商业渠道购买。
实施例1启动子为EF1α的病毒ssAAV9(EF1α>SMN1:WPRE)制备
1.质粒载体构建
(1)SMN1基因载体构建
1)构建pDown-hSMN1载体：以pDown-AarI-ccdB-cmR-AarI(购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB210730-1146dss)为骨架，将hSMN1[NM-000344]片段通过Golden gate反应克隆到pDown-AarI-ccdB-cmR-AarI载体的AarI酶切位点之间，得到pDown-hSMN1载体；具体为：以hSMN1[NM-000344]cDNA为模板，设计两条引物(AarI-hSMN1-F:atcgCACCTGCATCGGGGTTTAATTTAAGGAATGTGAGCACCTTC(SEQ ID NO.3)和AarI-hSMN1-R:atcgCACCTGCATCGGGCTgccaccATGGCGATGAGCAGCGGCG(SEQ ID NO.4))，PCR扩增得到含有hSMN1编码区的序列片段；使用Golden Gate技术进行载体构建，AarI反应体系如表1以及反应程序如表2所示。将Golden Gate反应产物转化VB UltraStableTM感受态细胞，挑单克隆进行PCR及测序验证，即得到pDown-hSMN1[NM_000344]载体(如图1所示)。
表1 AarI反应体系
Figure BDA0003786434230000051
表2 AarI反应程序
Figure BDA0003786434230000052
2)构建pAAV[Exp]-EF1α>hSMN1[NM-000344]:WPRE：将入门克隆pUp-EF1α(pUp-EF1α购买于云舟生物科技(广州)有限公司，ID:VB210730-1149xuq)、pDown-hSMN1[NM_000344]与目的载体pAAV.Des2d-WPRE(px601/5’ITR modified，购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB180718-1039jtn(Bacteria))进行Gateway LR重组反应，将LR反应产物转化VBUltraStableTM感受态细胞，挑单克隆进行PCR及测序验证，即得到pAAV[Exp]-EF1α>hSMN1[NM-000344]:WPRE载体(质粒图谱如图2所示)。反应体系及反应条件如表3。
表3反应体系及反应条件
Figure BDA0003786434230000061
(2)病毒生产
使用三质粒(载体质粒、包装质粒和辅助质粒)系统转染293T细胞进行AAV病毒包装，质粒1(载体质粒)是包含AAV基因组5’端的ITR序列以及表达SMN1的表达盒，该表达盒含有EF1α启动子序列(序列为：GGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGTCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA，SEQ ID NO.1)、Kozak序列、SMN1转基因(NM_000344)、BGH pA、3'ITR、氨苄青霉素(Ampicillin)、pUC ori、WPRE(即pAAV[Exp]-EF1α>hSMN1[NM_000344]:WPRE载体)，以pAAV2/2(retro)(购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB180917-1100ncc)为重组AAV辅助质粒(包装质粒)﹐其以反式方式提供AAV2 Rep基因和AAV9 Cap基因；以及pHelper辅助病毒质粒(辅助质粒，购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB180712-1021bcx)，含有起辅助功能的基因E2a、E4和VA。
HEK293T细胞使用10％FBS培养基(DMEM(Gibco,11965-02)、10％胎牛血清(FBS，Gibco)、2mM谷氨酰胺(Gibco)、1％青霉素/链霉素(ThermoFisherScientific)和0.1mM非必需氨基酸(Gibco))，在5％CO2、37℃条件下进行培养。使用磷酸钙转染法将三质粒系统转染293T细胞后6h进行换液，转染后48h，敲打瓶壁，使大部分细胞脱落。反复吹打细胞，使剩余细胞脱壁，然后将细胞和上清一并收集移至一支无菌的50mL离心管中，并于4℃、4000rpm离心20min，弃上清；细胞沉淀中加入一定量的AAV病毒裂解液(500μL/25mL收集的细胞)重悬，然后在液氮和37℃水浴锅中反复冻融3次，溶解过程中用力晃动摇匀；将悬液置于37℃培养箱过夜并在第二天观察细胞破碎状态。确认细胞裂解成功后，加入终浓度为2mM MgCl2及终浓度为62.5U/mL的Benzonase，用移液枪吹打混匀，放在37℃孵育45min，消化细胞基因组；将悬液4℃、4000rpm离心20分钟，取上清；之后使用密度梯度超速离心进行AAV纯化。取最底层加PBS稀释，再使用超滤管进行浓缩。浓缩后的AAV病毒使用qPCR的方法进行滴度测定，所得AAV病毒称为ssAAV9(EF1α-SMN1:WPRE)。
实施例2启动子为CAG的病毒ssAAV9(CAG>SMN1:WPRE)制备
本实施例的制备方法与实施例1一致，区别仅在于：
步骤2)中入门克隆由pUp-EF1α替换为pUp-CAG(购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB210730-1148mga)；得到pAAV[Exp]-CAG>hSMN1[NM_000344]]:WPRE(质粒图谱如图3所示)，通过病毒包装得到ssAAV9(CAG-SMN1:WPRE)。
实施例3启动子为EF1α的病毒ssAAV9(EF1α>EGFP:WPRE)制备
本实施例的制备方法与实施例1一致，区别仅在于：
步骤1)中模板为EGFP cDNA(SEQ ID NO.5)，引物为AarI-EGFP-F:atcgCACCTGCATCGGGGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC(SEQ ID NO.6)和AarI-EGFP-R:atcgCACCTGCATCGGGCTgccaccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA(SEQ ID NO.7)，得到pDown-EGFP载体(质粒图谱如图4所示)；
步骤2)得到pAAV[Exp]-EF1α>EGFP:WPRE载体(质粒图谱如图5所示)，通过病毒包装得到ssAA V9(EF1α>EGFP:WPRE)。
实施例4启动子为CBh的病毒scAAV9(CBh>EGFP)制备
本实施例的制备方法与实施例1一致，区别仅在于：
步骤1)中模板为EGFP cDNA(SEQ ID NO.5)，引物为AarI-EGFP-F:atcgCACCTGCATCGGGGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC(SEQ ID NO.6)和AarI-EGFP-R:atcgCACCTGCATCGGGCTgccaccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA(SEQ ID NO.7)，得到pDown-EGFP载体(质粒图谱如图4所示)；
步骤2)中入门克隆由pUp-EF1α替换为pUp-CBh(购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB210730-1150ugd)；目的载体由pAAV.Des2d-WPRE(px601/5’ITR modified，购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB180718-1039jtn(Bacteria)，改为pscAAV.Des2d(购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB190301-1011vej)，得到pscAAV[Exp]-CBh>EGFP载体(质粒图谱如图6所示)，通过病毒包装得到scAAV9(CBh>EGFP)。
实施例5启动子为CAG的病毒ssAAV9(CAG>EGFP:WPRE)制备
本实施例的制备方法与实施例1一致，区别仅在于：
步骤1)中模板为EGFP cDNA(序列为：ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA，SEQ ID NO.5)，引物为AarI-EGFP-F:atcgCACCTGCATCGGGGTTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC(SEQID NO.6)和AarI-EGFP-R:atcgCACCTGCATCGGGCTgccaccATGGTGAGCAAGGGCGAGGA(SEQ IDNO.7)，得到pDown-EGFP载体(质粒图谱如图4所示)；
步骤2)中入门克隆由pUp-EF1α替换为pUp-CAG(购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB210730-1148mga)；得到pAAV[Exp]-CAG>EGFP:WPRE(质粒图谱如图7所示)，通过病毒包装得到ssAAV9(CAG>EGFP:WPRE)。
实施例6启动子为EF1α的病毒ssAAV9(EF1α>SMN1)制备
本实施例的制备方法与实施例1一致，区别仅在于：
步骤2)中目的载体由pAAV.Des2d-WPRE(px601/5’ITR modified，购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB180718-1039jtn(Bacteria)改为pAAV.Des2d(px601-5&apos；ITRmodified)(购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB180605-1173cfq)得到pAAV[Exp]-EF1α>hSMN1[NM_000344](质粒图谱如图8所示)，通过病毒包装得到ssAAV9(EF1α>SMN1)。
实施例7启动子为CAG的病毒ssAAV9(CAG>SMN1)制备
本实施例的制备方法与实施例1一致，区别仅在于：
步骤2)中入门克隆由pUp-EF1α替换为pUp-CAG(购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB210730-1148mga)，目的载体由pAAV.Des2d-WPRE(px601/5’ITR modified，购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB180718-1039jtn(Bacteria)改为pAAV.Des2d(px601-5&apos；ITR modified)(购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB180605-1173cfq)得到pAAV9[Exp]-CAG>hSMN1[NM_000344](质粒图谱如图9所示)，通过病毒包装得到ssAAV9(CAG>SMN1)。
实施例8体外评价AAV病毒载体表达SMN1的功能
转导前一天，将293T细胞按3×106cells/孔密度接种至12孔板中，每孔的液体总体积为1mL，转导当天细胞生长达到50％～60％的融合度；转导前先消化一个孔的细胞进行细胞计数，根据MOI＝1.0E+05计算所需的AAV病毒(实施例1、2制备的病毒)，加入相应体积的病毒至293T中，并设置添加不含病毒颗粒的Buffer的组别作为NC对照组(该组别中的成分除了不含病毒颗粒，其他与实验组一致)。轻轻摇晃均匀后放回37℃培养箱继续培养72小时，转导72小时后，收取相应的细胞至1.5ml EP管，保证每管细胞数量达到1×107以上，1300rpm离心四分钟弃上清，液氮速冻后置于-80℃保存。使用RIPA裂解液从细胞中提取总蛋白通过Western blot实验检测SMN1表达水平，实验操作同行业常规操作，上述实验平行操作三次。实验结果如图10所示：实施例1、2的病毒的转导显著提升了293T细胞中的SMN1表达水平，证明病毒载体表达SMN1的功能正常且针对于提高SMN1表达水平具有明显的效果。
实施例9体内评价AAV病毒组织亲和性
以出生48小时内的12只SMA品系(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-，购于JacksonLaboratory，货号005025，SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-小鼠通过繁殖得到SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠和SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/+小鼠，用作设计SMA基因药物的动物评价模型)小鼠作为实验对象，分为三组，NC对照组(添加不含病毒颗粒的Buffer的组别作为NC对照组(该组别中的成分除了不含病毒颗粒，其他与实验组一致))、实施例4制备的启动子为CBh的病毒scAAV9(CBh>EGFP)和实施例5制备的启动子为CAG的病毒ssAAV9(CAG>EGFP:WPRE)组分别为6、3和6只，并进行脸静脉注射，这两种病毒的注射剂量均为1E+14vg/kg。给药10或40天后(10天处死NC、CBh和CAG组各3只，40天处死NC组、CAG组余下3只小鼠)，将上述3组小鼠进行深麻处死，同时心脏灌注4％多聚甲醛(PFA)，解剖小鼠，取出脊椎、心脏、脑、肾等组织放置于透明袋子上并在蓝光下进行拍照，随后使用并用4％PFA将组织进行固定，接着使用30％蔗糖溶液进行脱水，然后制备冰冻切片，并观察EGFP在不同组织中的表达情况。以出生48小时内的9只SMA品系(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-，购于Jackson Laboratory，货号005025，SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-小鼠通过繁殖得到SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠和SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/+小鼠，用作设计SMA基因药物的动物评价模型)小鼠作为实验对象，分为两组，NC对照组(添加不含病毒颗粒的Buffer的组别作为NC对照组(该组别中的成分除了不含病毒颗粒，其他与实验组一致))、实施例3制备的启动子为EF1α的病毒ssAAV9(EF1α>EGFP:WPRE)组分别为6、6只，并进行脸静脉注射，这两种病毒的注射剂量均为1E+14vg/kg。给药10或40天后(10天处死NC、EF1α组各3只，40天处死NC组、EF1α组各余下的3只小鼠)，将上述2组小鼠进行深麻处死，同时心脏灌注4％多聚甲醛(PFA)，解剖小鼠，取出脊椎、心脏、脑、肾等组织放置于皿中并在蓝光下进行拍照，随后使用4％PFA将组织进行固定，接着使用30％蔗糖溶液进行脱水，然后制备冰冻切片，并观察EGFP在不同组织中的表达情况。结果如图11(10天处死)所示：在激光共聚焦扫描显微镜下可以观察到：与NC组相比，scAAV9(CBh>EGFP)、ssAAV9(EF1α>EGFP:WPRE)和ssAAV9(CAG>EGFP:WPRE)组中不同的组织表现出不同程度的荧光亮度，这说明这三种病毒均在体内分布并且已经表达。为了进一步比较这两种病毒在脊髓前角和脑组织中的海马区的表达，进行冰冻切片处理。实验结果如图12、图13所示，通过荧光显微镜可以看出：ssAAV9(EF1α>EGFP:WPRE)、scAAV9(CBh>EGFP)和ssAAV9(CAG>EGFP:WPRE)在脊椎前角和在脑组织中的海马区的均可以表达，相同剂量的ssAAV9(EF1α>EGFP:WPRE)在脊髓前角和海马区中的靶向细胞运动神经元中的表达最为突出。另外，从图14中可以看出，ssAAV9(EF1α>EGFP:WPRE)、ssAAV9(CAG>EGFP:WPRE)在体内40天后的表达明显优于10天组，这说明给药时间也是影响基因在体内表达的主要因素。综上所述，ssAAV9(CAG>EGFP:WPRE)、ssAAV9(EF1α>EGFP:WPRE)经静脉注射进入体内不同的组织，可在靶向细胞运动神经元中表达明显，并且在体内的时间对基因表达量具有重要的意义。
实施例10体内评价AAV病毒的效果
下列实施例载体制成的病毒均采用静脉注射和侧脑室注射两种注射方法。将实施例2制备的启动子为CAG的病毒ssAAV9(CAG>SMN1:WPRE)、实施例1制备的启动子为EF1α的病毒ssAAV9(EF1α>SMN1:WPRE)、实施例6制备的启动子为EF1α的病毒ssAAV9(EF1α>SMN1)、实施例7制备的启动子为CAG的病毒ssAAV9(CAG>SMN1)均按1x1014vg/kg注射量注射到出生48小时内的SMA模型(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-，购于Jackson Laboratory，货号005025，SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-小鼠通过繁殖得到SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠，用作本实施例的评价小鼠)新生小鼠体内，病毒注射后，每天记录小鼠的体重变化、运动能力、存活天数等生长状态(各处理情况具体如图16所示)，结果如图15、16所示：与NC对照组(未进行任何注射操作，在10～14天死亡，且无法获得正常运动能力)相比，ssAAV9(EF1α>SMN1)、ssAAV9(CAG>SMN1)、ssAAV9(CAG>SMN1:WPRE)和ssAAV9(EF1α>SMN1:WPRE)组小鼠的体重和存活率均明显改善，其中，脑室注射ssAAV9(CAG>SMN1)可使小鼠存活时间最久至30天；脑室注射ssAAV9(EF1α>SMN1:WPRE)可使小鼠正常存活且截至统计时间(超过7个月，216天)仍有小鼠存活，小鼠的存活天数约是NC组的20倍，脑室注射ssAAV9(EF1α>SMN1)可使小鼠存活时间最久至145天，可见，采用EF1α作为启动子的重组腺相关病毒的效果优于CAG，包含WPRE的重组腺相关病毒的效果优于未包含WPRE，采用脑室注射重组腺相关病毒的效果优于静脉注射；并且分析了小鼠运动能力的参数：体重，翻转能力(将小鼠仰卧放置并记录小鼠将四只爪子翻转至工作台的时间，并拍视频记录，同时测量小鼠的体重。使用分数量化小鼠翻转的能力：6代表0～5s，5代表5～9s，4代表10～14s，3代表15～19s，2代表20～24s，1代表25～30s，>30s，则为0；NC为未处理的模型鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠，未进行任何注射操作)，每种处理3只小鼠)，平衡能力(在安静状态下，将实验动物放在平衡木(长约25cm、宽2cm、距地面高40cm)上，记录其在平衡木上一个折返的时间(最长不超过60s)内，小鼠掉落的次数以及是否可以转身；NC为未处理的模型鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠，未进行任何注射操作)，每种处理3只小鼠)等，与NC对照组(未进行任何注射操作)相比，静脉注射和脑室注射ssAAV9(CAG>SMN1:WPRE)的小鼠体重基本无变化，静脉注射ssAAV9(EF1α>SMN1:WPRE)和脑室注射ssAAV9(CAG>SMN1)的小鼠体重得到提升；与静脉注射ssAAV9(EF1α-SMN1:WPRE)相比，脑室注射ssAAV9(EF1α>SMN1:WPRE)的小鼠体重显著提升；与脑室注射ssAAV9(CAG>SMN1)相比，脑室注射ssAAV9(EF1α>SMN1)的小鼠体重显著提升；与脑室注射ssAAV9(EF1α>SMN1)相比，脑室注射ssAAV9(EF1α>SMN1:WPRE)的小鼠体重显著提升(图16)；可见，采用EF1α作为启动子的重组腺相关病毒的效果优于CAG，包含WPRE的重组腺相关病毒的效果优于未包含WPRE，采用脑室注射重组腺相关病毒的效果优于静脉注射；平衡木实验中，与NC对照组相比，脑室注射ssAAV9(EF1α>SMN1:WPRE)的小鼠掉落次数明显减少，并且可在平衡木上转身(图19)；翻转实验EF1α中，与NC对照组相比，脑室注射ssAAV9(EF1α>SMN1:WPRE)的小鼠的翻转能力显著提升，并且随着时间的延长而增加，而NC对照组小鼠在18天已经死亡(图20)；表明ssAAV9(EF1α>SMN1:WPRE)经脑室注射对于治疗SMA模型小鼠是具有更好的效果。
同时，从动物生理结构来看，侧脑室与脊髓鞘同处于脑脊液循环系统的腔体结构，原则上，通过脊髓鞘注射的效果与通过侧脑室注射的效果类似，药物可以通过脑脊液循环快速到达中枢神经系统的各处，但在临床上对患者进行脊髓鞘注射更容易实现。
实施例11体内评价SMN的表达效果
取SMA品系小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-，购于Jackson Laboratory，货号005025，SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-小鼠通过繁殖得到SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠和SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/+小鼠)，分别进行如下处理：①SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/+未注射；②SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-未注射；③静脉注射的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-；④脑室注射的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-；其中进行注射的小鼠其对应的病毒为：实施例1制备的启动子为EF1α的病毒；注射剂量为1.0E+14vg/kg，处理10天；小鼠两周龄时，分别取小鼠的脑和脊髓组织，使用RIPA裂解液提取总蛋白通过Western blot实验检测SMN1表达水平，实验操作同行业常规操作，上述实验平行操作3次。实验结果如图17所示：未注射情况下，SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脑和脊髓中的SMN1蛋白表达低于SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/+小鼠；静脉注射实施例1制备的启动子为EF1α的病毒使SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脊髓中的SMN1表达微弱上调，脑组织中的SMN1表达未见明显变化；脑室注射实施例1制备的启动子为EF1α的病毒使SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脑和脊髓中的SMN1表达水平明显增加。
取SMA品系小鼠(SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-，购于Jackson Laboratory，货号005025，SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-小鼠通过繁殖得到SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠和SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/+小鼠)，分别进行如下处理：①SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-未注射；②SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-未注射；③脑室注射的SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-；其中进行注射的小鼠其对应的病毒为：实施例6制备的启动子为EF1α的病毒ssAAV9(EF1α>SMN1)；注射剂量为1.0E+14vg/kg，处理10天；小鼠两周龄时，分别取小鼠的脑和脊髓组织，使用RIPA裂解液提取总蛋白通过Western blot实验检测SMN1表达水平，实验操作同行业常规操作，上述实验平行操作3次。实验结果如图18所示：未注射情况下，SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脑和脊髓中的SMN1蛋白表达低于SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn+/-小鼠；脑室注射实施例6制备的启动子为EF1α的病毒使SMN2+/+,SMNΔ7+/+,smn-/-小鼠的脑与脊髓中的SMN1表达显著上调。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种重组腺相关病毒载体，包含腺相关病毒衣壳和非自身互补的单链基因组；所述单链基因组包含EF1α启动子和编码运动神经元存活蛋白的基因。
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：
所述EF1α启动子为(a1)～(a3)中任一种：
(a1)具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的启动子；
(a2)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经过一个或多个碱基的取代、缺失或添加后仍具有EF1α启动子功能的核苷酸序列所示的启动子；
(a3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性且具有EF1α启动子功能的核苷酸序列所示的启动子。
3.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：
所述运动神经元存活蛋白为(b1)～(b3)中任一种：
(b1)具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白；
(b2)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加后仍具有运动神经元存活蛋白功能的氨基酸序列所示的蛋白；
(b3)与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有80％、85％、90％、95％、98％或99％以上同源性且具有运动神经元存活蛋白功能的氨基酸序列所示的蛋白；
优选地，所述编码运动神经元存活蛋白的基因为人SMN1基因。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：
所述单链基因组还包含：WPRE；
优选地，所述单链基因组还包含：Kozak序列、聚腺苷酸、AAV反向末端重复序列中的至少一种；
优选地，所述单链基因组还包含Kozak序列、聚腺苷酸、WPRE和AAV反向末端重复序列。
5.根据权利要求4所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：
所述AAV反向末端重复序列包含AAV 5’-ITR和AAV3’-ITR。
6.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于：
所述腺相关病毒衣壳为AAVPHP.eb、AAVPHP.b和AAV9衣壳中的一种。
7.一种药物组合物，包含权利要求1～6中任一项所述的重组腺相关病毒载体和药学上可接受的载体/赋形剂。
8.(1)～(2)中任一项中在制备预防、减轻或治疗神经系统疾病的药物中的应用：
(1)权利要求1～6中任一项所述的重组腺相关病毒载体；
(2)权利要求7所述的药物组合物；
所述神经系统疾病为涉及运动功能的运动神经元疾病；
优选地，所述运动神经元疾病选自脊髓性肌萎缩、肌萎缩性侧索硬化症、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化和外伤性脊髓损伤中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：
所述药物的给药方式为注射。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
所述注射为静脉注射、脑室注射和鞘内注射中的至少一种。
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