CN116042719A - 一种重组腺相关病毒载体及其应用 - Google Patents

一种重组腺相关病毒载体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116042719A
CN116042719A CN202211717413.2A CN202211717413A CN116042719A CN 116042719 A CN116042719 A CN 116042719A CN 202211717413 A CN202211717413 A CN 202211717413A CN 116042719 A CN116042719 A CN 116042719A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant adeno
mice
sequence
paav
exp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211717413.2A
Other languages
English (en)
Inventor
高堂鑫
郑楠楠
高雪
陈小祝
蔡育宜
林圣智
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Blueprints Biomedical Guangzhou Co ltd
Original Assignee
Blueprints Biomedical Guangzhou Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Blueprints Biomedical Guangzhou Co ltd filed Critical Blueprints Biomedical Guangzhou Co ltd
Priority to CN202211717413.2A priority Critical patent/CN116042719A/zh
Publication of CN116042719A publication Critical patent/CN116042719A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，公开了一种重组腺相关病毒载体及其应用。本发明的重组腺相关病毒载体包含腺相关病毒衣壳和序列元件，所示序列元件包括EFS启动子序列和编码运动神经元存活蛋白的序列。本发明提供的重组腺相关病毒载体能够避免SMN1的过度表达所导致的毒性反应，将体内的SMN1蛋白水平稳定维持在药物治疗窗内，能够延长SMA小鼠生存时间、增加小鼠体重、改善运动神经元与骨骼肌相关的组织发育，恢复神经元的生理功能。本发明采用基因治疗的策略，可用于预防、减轻或治疗神经系统疾病。

Description

一种重组腺相关病毒载体及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种重组腺相关病毒载体及其应用。
背景技术
脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是一种由存活运动神经元1基因(survival motor neuron 1gene,SMN1)缺失或突变引起的常染色体隐性遗传疾病，主要以脊髓前运动神经元退化变性导致的肌无力和肌萎缩为主要临床特征。SMA常累及呼吸系统，引起呼吸系统病理生理改变，导致低通气、咳嗽减弱、痰液堵塞等一系列呼吸问题。呼吸衰竭是SMA患儿最常见的致死原因。该病在欧美人群存活新生儿中的发病率约为1:10 000，位居2岁以下儿童致死性遗传病的首位。
位于着丝粒侧的SMN2基因与端粒侧SMN1基因具有高度同源性，仅在各自的3'端有5个单核苷酸的差别。SMN2基因的缺失虽不致病，但其是SMN1基因的修饰基因，在SMN1基因缺失的情况下起着剂量补偿作用，SMN2拷贝数与SMA表型严重程度相关。根据发病年龄、肌无力严重程度和达到的运动功能，SMA可分为4种常见临床类型，分别为SMA-Ⅰ型、SMA-Ⅱ型、SMA-Ⅲ型和SMA-Ⅳ型。I型SMA也称Werdnig-Hoffman病，即婴儿型，约占全部SMA病例的45％。患儿出生6个月内发病，出现迅速发展的进行性、对称性四肢无力，最大运动能力不能达到独坐。多数患儿在2岁内死于呼吸衰竭。Ⅰ型SMA患儿的SMN2拷贝数以2拷贝者居多。II型SMA也称Dubowitz病，即中间型，约占30％～40％。患者多在出生后6～18个月发病，进展较I型慢，最大运动能力可达到独坐，不能独站活独走。多数可以活到成年期。Ⅱ型的SMN2拷贝数以3拷贝者居多。Ⅲ型也称Kugelberg-Welander病，即青少年型，约占20％。患者多数在出生18个月以后发病，早期运动发育正常，能够独走。随着年龄的增长出现以近端为主的肌无力，最终部分丧失独走能力。患者寿命不缩短或轻度下降。Ⅲ型的SMN2拷贝数以3或4拷贝者居多。Ⅳ型，晚发型，即成人型。患者早期运动发育正常，成人后发病，出现肢体近端无力，轻微运动障碍，病情进展缓慢，寿命一般不受影响。Ⅳ型的SMN2拷贝数以4拷贝者为主。
目前，在依赖SMN的治疗策略中，主要包括SMNl基因替代治疗、增强SMN2基因启动子活性、增加SMN2基因全长转录本的表达等。进入临床试验阶段的药物包括苯基丁酸、丙戊酸和羟基脲等，但并没有产生足够的临床效益。FDA批准的诺西那生钠(SPINRAZA)，一种反义寡核苷酸(ASO)药物，旨在通过调节SMN2基因的剪接来增加全长SMN蛋白的产量，从而弥补潜在的遗传缺陷。临床研究显示，有望改善运动障碍；然而，这种治疗方法必须通过鞘内注射无限期地给药，在生效前需要很长的诱导期，并有需要临床监测的安全性考虑。FDA批准的Zolgensma通过AAV9载体将自身互补的双链SMN1表达序列递送到体内，并在巨细胞病毒(CMV)即刻/早期增强子和鸡β-肌动蛋白(CB)启动子的调控作用下已达到治疗的目的，但就目前的临床数据来看，针对SMA患者治疗效果有待提升。
腺相关病毒(AAV)是细小病毒科的一种，对于体内递送遗传物质有很大潜力。AAV载体系统是一种备受欢迎的体内外基因传递系统，对哺乳动物多种类型细胞具有高效的转导效率。在包装细胞中，位于两个反向重复序列(ITRs)之间的DNA片段与辅助质粒表达的病毒蛋白在包装细胞中包装成病毒颗粒。当病毒转导宿主细胞时，携带外源DNA的AAV病毒进入细胞，线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。根据病毒表面衣壳蛋白的不同将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织亲和性。其中，AAV9对心肌、肺、视网膜、皮肤等组织具有亲和性。此外，由于AAV9具有跨血脑屏障的能力，在神经科学领域应用广泛。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种重组腺相关病毒载体及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种重组腺相关病毒载体，包含腺相关病毒衣壳和序列元件，所示序列元件包括EFS启动子序列和编码运动神经元存活蛋白的序列。
本发明提供的重组腺相关病毒载体能够避免SMN1的过度表达所导致的毒性反应，将体内的SMN1蛋白水平稳定维持在药物治疗窗内，能够延长SMA小鼠生存时间、增加小鼠体重、改善运动神经元与骨骼肌相关的组织发育。
作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，所述EFS启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，所述运动神经元存活蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，所述编码运动神经元存活蛋白的序列由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物组以hSMN1cDNA为模板克隆而得。
作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，所述神经元存活蛋白的基因为SMN1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，还包括WPRE序列、Kozak序列、多聚腺苷酸序列、AAV反向末端重复序列中的至少一种。
作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，所述AAV反向末端重复序列包含AAV 5’-ITR和AAV3’-ITR。
作为本发明所述的重组腺相关病毒载体的优选实施方式，所述腺相关病毒衣壳为AAVPHP.eb、AAVPHP.b和AAV9衣壳中的任意一种。
第二方面，本发明提供一种药物组合物，包括上述的重组腺相关病毒载体。
优选的，所述药物组合物还包括任一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
进一步的，所述药物组合物的给药方式为注射；
更进一步的，所述注射为静脉注射、脑室注射和鞘内注射中的至少一种。
第三方面，本发明将所述的重组腺相关病毒载体、所述的药物组合物在制备治疗和/或预防神经系统疾病的药物中应用。
优选的，所述神经系统疾病为涉及运动功能的运动神经元疾病。
本发明采用基因治疗的策略，通过EFS启动子调控SMN1基因表达，恢复神经元的生理功能，显著延长SMA小鼠模型的生存期。可用于预防、减轻或治疗神经系统疾病。
进一步的，所述运动神经元疾病包括脊髓性肌萎缩、肌萎缩性侧索硬化症、延髓肌肉萎缩症、脊髓小脑共济失调、原发性侧索硬化和外伤性脊髓损伤。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的重组腺相关病毒载体能够避免SMN1的过度表达所导致的毒性反应，将体内的SMN1蛋白水平稳定维持在药物治疗窗内，能够延长SMA小鼠生存时间、增加小鼠体重、改善运动神经元与骨骼肌相关的组织发育。本发明采用基因治疗的策略，通过EFS启动子调控SMN1基因表达，恢复神经元的生理功能，显著延长小鼠模型的生存期。相比于前述已有的基于AAV载体的SMA基因治疗策略，特别是FDA批准的Zolgensma，本发明独特的SMN1表达框设计能够在治疗SMA的同时避免外源基因过表达带来安全性风险，避免出现由于SMN持续性过表达引起的运动神经元延迟性退行性病变，尤其是基于CMV(Human cytomegalovirusimmediate early enhancer/promoter,人巨细胞病毒即刻早期增强型启动子)启动子衍生出的CB系列启动子或者CAG系列启动子，这些启动子可以让其所控制的人SMN1基因序列在体内一直保持高水平表达。本发明提供的重组腺相关病毒载体治疗SMA的效果显著优于包含其他启动子的重组腺相关病毒载体。可用于预防、减轻或治疗神经系统疾病。
附图说明
图1为pDown-hSMN1[NM-000344]质粒结构示意图。
图2为pAAV[Exp]-EFS>hSMN1[NM_000344.4]:WPRE质粒结构示意图。
图3为pDown-EGFP质粒结构示意图。
图4为pAAV[Exp]-EFS>EGFP质粒结构示意图。
图5为pAAV[Exp]-EFS>EGFP质粒转染后EGFP的表达情况(100×)。实施例2制备的质粒转染293T细胞48小时后EGFP的表达结果图。其中，白光的曝光之间为10ms，绿色荧光的曝光时间为100ms。
图6为AAV9(pAAV[Exp]-EFS>EGFP)载体转导293T细胞中SMN1的表达情况(100×)。实施例1制备的AAV9载体转导293T细胞48小时后的SMN1免疫荧光染色结果图。
图7为AAV9(pAAV[Exp]-EFS>EGFP)载体转导大脑皮层神经元后EGFP的表达情况(200×)。实施例2制备的AAV9载体转导小鼠胚胎来源的大脑皮层神经元72小时后的EGFP表达结果图。其中，白光和绿色荧光的曝光之间均为100ms。红框对部分表达EGFP的神经元进行了标记。
图8为AAV9(pAAV[Exp]-EFS>EGFP)和AAV9(pAAV[Exp]-CAG>EGFP)载体转导脊髓运动神经元后EGFP的表达情况(200×)。其中，白光和绿色荧光的曝光之间均为100ms。红色箭头对部分表达EGFP的非运动神经元进行了标记。
图9为新生小鼠注射治疗后生存曲线。实施例1所制备的ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)载体经过侧脑室注射(ICV)或静脉注射(IV)至SMA小鼠体内后的生存时间曲线。WT＝wild-type mice、US＝Untreated SMA mouse model、ICV＝Intracerebroventricular、IV＝Intravenous。#表示在该时间点仅1只小鼠存活。
图10为治疗期间小鼠体重变化情况。实施例1制备的ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)载体经ICV或IV注射至SMA小鼠体内后各组小鼠体重变化。WT＝wild-typemice、US＝Untreated SMA mouse model、ICV＝Intracerebroventricular、IV＝Intravenous。
图11为翻正反射实验结果图。实施例1制备的ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)载体经ICV或IV注射至SMA小鼠体内12天和30天后各组小鼠的翻正反射实验结果。WT＝wild-type mice、US＝Untreated SMA mouse model、ICV＝Intracerebroventricular；IV＝Intravenous。#表示在检测时间该组仅1只小鼠存活；*表示在检测时间该组小鼠全部死亡，无数据。评分标准：6分：0-4s,5分：5-9s,4分：10-14s,3分：15-19s,2分：20-24s,1分：25-30s,0分：>30s。
图12为游泳实验结果图。实施例1制备的ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)载体经ICV或IV注射至SMA小鼠体内60天后各组小鼠的游泳实验结果。WT＝wild-type mice、US＝Untreated SMA mouse model、ICV＝Intracerebroventricular、IV＝Intravenous。#表示在检测时间该组仅1只小鼠存活。
图13为平衡木实验结果图。实施例1制备的ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)载体经ICV或IV注射至SMA小鼠体内60天后各组小鼠的平衡木实验结果。WT＝wild-typemice、US＝Untreated SMA mouse model、ICV＝Intracerebroventricular、IV＝Intravenous。#表示在检测时间该组仅1只小鼠存活。
图14为注射不同载体对SMA生存曲线的影响。实施例1所制备的ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)与Zolgensma、ssAAV9(pAAV[Exp]-EF1A>hSMN1:WPRE)、ssAAV9(pAAV[Exp]-EF1A>hSMN1)、ssAAV9(pAAV[Exp]-CMV>hSMN1:WPRE)载体经过侧脑室注射(ICV)至SMA小鼠体内后的生存时间曲线。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)载体制备
(1)SMN1基因载体构建
1)构建pDown-hSMN1载体
以pDown-AarI-ccdB-cmR-AarI(购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB210730-1146dss)为骨架，将hSMN1[NM-000344]片段通过Golden gate反应克隆到pDown-AarI-ccdB-cmR-AarI载体的Aar I酶切位点之间，得到pDown-hSMN1载体；
具体为：以hSMN1[NM-000344]cDNA为模板，设计两条引物，PCR扩增得到含有hSMN1编码区的序列片段；使用Golden Gate技术进行载体构建，AarI反应体系如表1以及反应程序如表2所示。将Golden Gate反应产物转化VBUltraStableTM感受态细胞，挑单克隆进行PCR及测序验证如SEQ ID NO.3所示。即得到pDown-hSMN1[NM-000344]载体(如图1所示)。
引物序列为：
AarI-hSMN1-F:atcgCACCTGCATCGGGGTTTAATTTAAGGAATGTGAGCACCTTC；
AarI-hSMN1-R:atcgCACCTGCATCGGGCTgccaccATGGCGATGAGCAGCGGCG。
表1 AarI反应体系
组分 加入量
AarI 1μL(2U/μL)
T7 DNA ligase 1μL
10×AarI buffer 2μL
ATP(10mM) 1μL
DTT(10mM) 4μL
AarI-hSMN1-AarI 1μL(140ng/μL)
pDown-AarI-ccdB-cmR-AarI 1uL(20ng/uL)
水 Up to 20uL
表2 AarI反应程序
2)构建pAAV[Exp]-EFS>hSMN1[NM-000344]
将入门克隆pUp-EFS(购买于云舟生物科技(广州)有限公司)、pDown-hSMN1[NM-000344]与目的载体pAAV.Des2d-WPRE(px601/5’ITR modified)(购于云舟生物科技(广州)有限公司)进行Gateway LR重组反应，将LR反应产物转化VB UltraStableTM感受态细胞，挑单克隆进行PCR及测序验证，即得到pAAV[Exp]-EFS>hSMN1[NM-000344]:WPRE载体。反应体系及反应条件如表3。
表3反应体系及反应条件
(2)病毒生产
使用三质粒(载体质粒、包装质粒和辅助质粒)系统转染293T细胞进行AAV病毒包装，质粒1(载体质粒)是包含AAV基因组5’端的ITR序列以及表达SMN1的表达盒，该表达盒含有EFS启动子序列(SEQ ID NO.1)、Kozak序列、SMN1转基因(NM_000344.4)、BGH pA、3'ITR、卡纳霉素(Kanamycin)、pUC ori(即pAAV[Exp]-EFS>hSMN1[NM-000344.4]:WPRE载体)，以pAAV2/2(retro)(购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB180917-1100ncc)为重组AAV辅助质粒(包装质粒)，其以反式方式提供AAV2 Rep基因和AAV9 Cap基因；以及pHelper辅助病毒质粒(辅助质粒，购于云舟生物科技(广州)有限公司，ID：VB180712-1021bcx)，含有起辅助功能的基因E2a、E4和VA。
HEK293T细胞使用10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(Gibco,11965-02)、胎牛血清(Gibco)、2mM谷氨酰胺(Gibco)、1％青霉素/链霉素(ThermoFisherScientific)和0.1mM非必需氨基酸(Gibco)，在5％ CO2、37℃条件下进行培养。使用磷酸钙转染法将三质粒系统转染293T细胞后6h进行换液，转染后48h，敲打瓶壁，使大部分细胞脱落。反复吹打细胞，使剩余细胞脱壁，然后将细胞和上清一并收集移至一支无菌的50mL离心管中，并于4℃、4000rpm离心20min，弃上清；细胞沉淀中加入一定量的AAV病毒裂解液(500μL/25mL收集的细胞)重悬，然后在液氮和37℃水浴锅中反复冻融3次，溶解过程中用力晃动摇匀；将悬液置于37℃培养箱过夜并在第二天观察细胞破碎状态。确认细胞裂解成功后，加入终浓度为2mM MgCl2及终浓度为62.5U/mL的Benzonase，用移液枪吹打混匀，放在37℃孵育45min，消化细胞基因组；将悬液4℃、4000rpm离心20分钟，取上清；之后使用密度梯度超速离心进行AAV纯化。取最底层加PBS稀释，再使用超滤管进行浓缩。浓缩后的AAV病毒使用qPCR的方法进行滴度测定，所得AAV病毒称为ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)。
实施例2：ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>EGFP)载体制备
本实施例2的制备方法与实施例1的区别仅在于：
构建pAAV[Exp]-EFS>EGFP时将入门克隆pUp-EFS、pDown-EGFP(如图3所示)与目的载体pAAV.Des2d(px601-5'ITR modified)(购于云舟生物科技(广州)有限公司)进行Gateway LR重组反应。表达盒含有EFS启动子序列、Kozak序列、EGFP、3'ITR、卡那霉素(Kanamycin)、pUC orii(即pAAV[Exp]-EFS>EGFP载体)；得到pAAV[Exp]-Kan-EFS>EGFP(如图4所示)，通过病毒包装得到ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>EGFP)。
实施例3：EFS启动子体外评价实验
将293T细胞按1×105cells/孔密度接种至24孔板中，每孔的液体总体积为1mL，转导当天细胞生长达到50％～60％的融合度；转导前先消化一个孔的细胞进行细胞计数，根据DNA copy number:2.5E+11计算所需的质粒，根据Lipo2000Transfection Reagent试剂使用说明书进行质粒转染，加入至293T细胞中，并设置添加不含质粒的Buffer的组别作为NC对照组。轻轻摇晃均匀后放回37℃培养箱继续培养72小时，荧光显微镜下观察EGFP的表达情况。结果如图5所示，与NC组相比，转染pAAV[Exp]-EFS>EGFP质粒后293T细胞中EGFP显著高表达。结果提示，EFS启动子能够启动目的基因在哺乳动物细胞中的表达。
实施例4：体外评价ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>EGFP)表达功能
将293T细胞按5×105cells/孔密度接种至24孔板中，每孔的液体总体积为1mL，转导当天细胞生长达到50％～60％的融合度；转导前先消化一个孔的细胞进行细胞计数，根据MOI＝2.0E+05计算所需的AAV载体，加入至293T细胞中，并设置添加不含病毒颗粒的Buffer的组别作为NC对照组。轻轻摇晃均匀后放回37℃培养箱继续培养72小时，荧光显微镜下观察EGFP的表达情况。一抗Anti-EGFP对细胞表达的EGFP结合，并将荧光信号进行放大，并使用二抗Goat anti Rabbit 594与一抗结合，呈现红色荧光。如图6所示，与NC组相比，转染ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>EGFP)的293T细胞中可见EGFP的表达。
实施例5：EFS启动子调控目的基因在大脑皮层神经元中的表达
取小鼠胚胎大脑皮层，得到大脑皮层神经元，培养48h后转导ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>EGFP)，MOI＝5E+05，转导72小时后，荧光显微镜下观察EGFP蛋白表达情况。如图7所示，与NC组相比，转导组组中可观察到明显的EGFP表达情况；结果提示，ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>EGFP)能在大脑皮层神经细胞中表达。EFS启动子能够在大脑皮层神经元中调控基因表达。
实施例6：不同启动子调控目的基因在脊髓运动神经元中的表达情况
取小鼠胚胎脊髓组织，得到脊髓运动神经元，培养48h后转导ssAAV9(pAAV[Exp]-CAG>EGFP)与ssAAV9(pAAV[Exp]-EF1A>EGFP)病毒载体，MOI＝2E+05。转导72小时后，荧光显微镜下观察EGFP蛋白表达情况。如图8所示，与NC组相比，转导ssAAV9(pAAV[Exp]-EF1A>EGFP)组中可观察到明显的EGFP表达情况；ssAAV9(pAAV[Exp]-CAG>EGFP)不能在运动神经元细胞中表达，对运动神经元的靶向性较差。
实施例7：体内评价ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)的有效性
分别采用静脉注射和侧脑室注射的方法，将ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)载体经静脉注射(Intravenous，IV)(注射剂量为7.5E+13vg/kg、1.5E+14vg/kg)和侧脑室注射(Intracerebroventricular，ICV)(注射剂量为4E+13vg/kg、7.5E+13vg/kg、1.5E+14vg/kg)递送至出生48小时内的SMA模型小鼠体内(SMN2+/+,SMNΔ7+/+，smn+/-，购于JacksonLaboratory，货号005025，SMN2+/+，SMNΔ7+/+，smn+/-小鼠通过繁殖得到SMN2+/+，SMNΔ7+/+，smn-/-小鼠用作本实施例的评价小鼠)新生小鼠体内，载体注射后，每天记录小鼠的体重变化、存活天数等生长状态。
存活曲线如图9所示。WT(wild-type mice)组为未进行任何注射操作的野生型小鼠。US(Untreated SMA mouse model，未进行任何注射操作的SMA模型小鼠)组小鼠存活时间中位数为15天，且无法获得正常运动能力。与US组相比，注射ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)各组小鼠的存活率均明显改善。其中，ICV-4E+13vg/kg组有11.1％的小鼠生存时间延长至62天；ICV-7.5E+13vg/kg组84.6％的小鼠存活时间延长至170天，76.9％延长至185天，小鼠的存活天数约是US组的7倍；ICV-1.5E+14vg/kg组中100％的小鼠生存时间延长至111天，83.3％的小鼠生存时间延长至161天。与US组相比，IV-7.5E+13vg/kg组中20％的小鼠生存时间延长至99天；IV-1.5E+14vg/kg组中60％的小鼠生存时间为20天，未有小鼠生存超过30天。上述结果提示，采用EFS作为启动子调控SMN1表达能够明显提高SMA小鼠的存活时间。
体重变化如图10所示。在注射治疗期间对小鼠体重进行监测，小鼠的体重曲线表明，在注射ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)载体后，体重随着时间的增加而逐渐增加。
实施例8：ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)改善运动神经元与骨骼肌相关的组织发育
分别采用静脉注射和侧脑室注射的方法，将ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)载体经静脉注射和侧脑室注射递送至SMA模型小鼠体内，通过翻正反射实验、游泳实验和平衡木实验评价小鼠运动神经元与骨骼肌相关的组织发育水平。结果表明，ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)能够在延长SMA小鼠生存期、提高生存率的同时促进运动神经元与骨骼肌相关的组织发育，提高SMA小鼠的运动能力。
翻正反射实验结果如图11所示。受试小鼠轻轻用手将其侧卧或仰卧会立即恢复正常姿势即翻正反射。如图11A所示，注射治疗后12天，WT组翻正反射实验评分均为6.00分。与WT组相比，US组小鼠评分显著降低，平均分为1.00分。与US组相比，各注射治疗组小鼠翻正反射评分均有明显升高，其中，以侧脑室注射中剂量组最为显著(ICV-4E+13vg/kg组为4.67±0.67分；ICV-7.5E+13vg/kg组为5.67±0.33分；ICV-1.5E+14vg/kg组为5.00±1.00分；IV-7.5E+13vg/kg组为5.00±0.58分；IV-1.5E+14vg/kg组0.00±0.00分)。如图11B所示，在注射治疗后30天，WT组翻正反射实验评分均为6.00分。由于US组和IV-1.5E+14vg/kg组小鼠死亡，无数据。其余给治疗组小鼠翻正反射评分均提高至6.00分。
游泳实验结果如图12所示。将小鼠放入一个不可逃避的盛满水的透明容器中，记录小鼠爬上逃逸平台所需的时间。如图12所示，在注射治疗后30天对各组小鼠进行游泳实验。在WT组中，3只小鼠能迅速爬上岸，所用的平均时间为6.33±88s。由于US组和IFV-1.5E+14vg/kg组小鼠死亡，无数据。ICV-7.5E+13vg/kg组小鼠上岸所用的平均时间为5.67±0.88s。IFV-7.5E+13vg/kg组小鼠上岸所需时间为5.00s。
平衡木实验结果如图13所示。测试根据动物在狭窄的木条上移动时能否保持平衡，观察前后肢的使用情况和跌落次数，对动物进行评分。如图13所示，在注射治疗60天后，WT组全部小鼠均可以转身而不摔倒。由于US组和IV-1.5E+14vg/kg组小鼠死亡，无数据。ICV-7.5E+13vg/kg组全部小鼠均可以转身，平均跌落次数为0.67±0.67。IV-7.5E+13vg/kg组小鼠仅1只小鼠存活，在平衡木实验中可以转身，共跌落3次。
实施例9：WPRE调控元件对hSMN1治疗效果的影响
采用侧脑室注射途径比较ssAAV9(pAAV[Exp]-EF1A>hSMN1:WPRE)与ssAAV9(pAAV[Exp]-EF1A>hSMN1)对SMA模型小鼠生存期的影响。如图14所示，WPRE调控元件能够明显延长SMA小鼠的生存期，对AAV9-hSMN1的治疗效果具有十分重要的作用。
实施例10：AAV9-hSMN1的体内有效性比较
采用侧脑室注射途径比较ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)与Zolgensma、ssAAV9(pAAV[Exp]-EF1A>hSMN1:WPRE)、ssAAV9(pAAV[Exp]-EF1A>hSMN1)、ssAAV9(pAAV[Exp]-CMV>hSMN1:WPRE)对SMA模型小鼠生存期的影响。将AAV9载体以7.0E+13～1.0+13vg/kg的注射剂量递送至出生48小时内的SMA模型小鼠体内，记录小鼠存活天数。如图14所示，ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)与Zolgensma、ssAAV9(pAAV[Exp]-EF1A>hSMN1:WPRE)、ssAAV9(pAAV[Exp]-EF1A>hSMN1)、ssAAV9(pAAV[Exp]-CMV>hSMN1:WPRE)均能明显提高小鼠的存活时间，其中，注射ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)载体的小鼠存活率高于注射Zolgensma、ssAAV9(pAAV[Exp]-EF1A>hSMN1:WPRE)、ssAAV9(pAAV[Exp]-EF1A>hSMN1)、ssAAV9(pAAV[Exp]-CMV>hSMN1:WPRE)载体小鼠。
本发明提供的重组腺相关病毒载体ssAAV9(pAAV[Exp]-EFS>hSMN1:WPRE)能够避免SMN1的过度表达所导致的毒性反应，将体内的SMN1蛋白水平稳定维持在药物治疗窗内，能够延长小鼠生存时间、增加小鼠体重、改善运动神经元与骨骼肌相关的组织发育。本发明采用基因治疗的策略，通过EFS启动子调控SMN1基因表达，恢复神经元的生理功能，显著延长小鼠模型的生存期。相比于前述已有的基于AAV载体的SMA基因治疗策略，特别是FDA批准的Zolgensma，本发明独特的SMN1表达框设计能够在治疗SMA的同时避免外源基因过表达带来安全性风险，避免出现由于SMN持续性过表达引起的运动神经元延迟性退行性病变，尤其是基于CMV(Human cytomegalovirus immediate early enhancer/promoter,人巨细胞病毒即刻早期增强型启动子)启动子衍生出的CB系列启动子或者CAG系列启动子，这些启动子可以让其所控制的人SMN1基因序列在体内一直保持高水平表达。可用于预防、减轻或治疗神经系统疾病。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (11)

1.一种重组腺相关病毒载体，包含腺相关病毒衣壳和序列元件，其特征在于，所示序列元件包括EFS启动子序列和编码运动神经元存活蛋白的序列。
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述EFS启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述运动神经元存活蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述编码运动神经元存活蛋白的序列由SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物组以hSMN1 cDNA为模板克隆而得。
5.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述神经元存活蛋白的基因为SMN1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，还包括WPRE序列、Kozak序列、多聚腺苷酸序列、AAV反向末端重复序列中的至少一种。
7.根据权利要求6所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述AAV反向末端重复序列包含AAV 5’-ITR和AAV3’-ITR。
8.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒衣壳为AAVPHP.eb、AAVPHP.b和AAV9衣壳中的任意一种。
9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～8任一项权利要求所述的重组腺相关病毒载体。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的给药方式为注射。
11.权利要求1～8任一项权利要求所述的重组腺相关病毒载体、权利要求9或10所述的药物组合物在制备治疗和/或预防神经系统疾病的药物中的应用。
CN202211717413.2A 2022-12-28 2022-12-28 一种重组腺相关病毒载体及其应用 Pending CN116042719A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211717413.2A CN116042719A (zh) 2022-12-28 2022-12-28 一种重组腺相关病毒载体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211717413.2A CN116042719A (zh) 2022-12-28 2022-12-28 一种重组腺相关病毒载体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116042719A true CN116042719A (zh) 2023-05-02

Family

ID=86114117

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211717413.2A Pending CN116042719A (zh) 2022-12-28 2022-12-28 一种重组腺相关病毒载体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116042719A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102459611A (zh) * 2009-05-02 2012-05-16 建新公司 神经退行性疾病的基因治疗
WO2018203092A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Ucl Business Plc Gene therapy for ciliopathies
CN113474459A (zh) * 2018-12-21 2021-10-01 吉尼松公司 用于基因疗法载体的表达盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102459611A (zh) * 2009-05-02 2012-05-16 建新公司 神经退行性疾病的基因治疗
WO2018203092A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Ucl Business Plc Gene therapy for ciliopathies
CN110753559A (zh) * 2017-05-05 2020-02-04 Ucl商业有限公司 用于纤毛病的基因治疗
CN113474459A (zh) * 2018-12-21 2021-10-01 吉尼松公司 用于基因疗法载体的表达盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ELISA DOMINGUEZ等: "Intravenous scAAV9 delivery of a codon-optimized SMN1 sequence rescues SMA mice", HUMAN MOLECULAR GENETICS, vol. 20, no. 4, 15 February 2011 (2011-02-15), XP055347969, DOI: 10.1093/hmg/ddq514 *
KATHRIN MEYER等: "Improving Single Injection CSF Delivery of AAV9-mediated Gene Therapy for SMA: A Dose–response Study in Mice and Nonhuman Primates", MOLECULAR THERAPY, vol. 23, 31 March 2015 (2015-03-31), XP055337771, DOI: 10.1038/mt.2014.210 *
MARCO A.PASSINI等: "CNS-targeted gene therapy improves survival and motor function in a mouse model of spinal muscular atrophy", THE JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION, 15 March 2010 (2010-03-15) *
马文豪: "AAV载体介导的脊髓性肌萎缩症基因治疗前期研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑, no. 7, 15 July 2021 (2021-07-15) *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6767483B2 (ja) 遺伝子療法のための、改変されたフリードライヒ運動失調症遺伝子およびベクター
JP2022071067A (ja) 前頭側頭型認知症の治療
Mohan et al. Gene therapy in the cornea
JP2022528416A (ja) 組換えアデノ随伴ウイルス及びその使用
JP2025060641A (ja) Ａａｖウイルスベクター及びその使用
US20250057899A1 (en) Gene therapy for ciliopathies
RU2751592C2 (ru) Выделенный модифицированный белок VP1 капсида аденоассоциированного вируса 5 серотипа (AAV5), капсид и вектор на его основе
AU2020408225A1 (en) Optimized gene therapy for targeting muscle in muscle diseases
JP2024535939A (ja) 肝臓指向性カプシドタンパク質及びアルファ－ガラクトシダーゼを含むａａｖ粒子並びにファブリー病を治療するためのそれらの使用
JP2024535121A (ja) 肝臓指向性カプシドタンパク質及び酸性α－グルコシダーゼを含むＡＡＶ粒子並びにポンペ病を治療するための使用
JP7707081B2 (ja) 網膜細胞を標的とした最適化された遺伝子治療
CN116042719A (zh) 一种重组腺相关病毒载体及其应用
US20230220420A1 (en) Gene therapy for bardet-biedl syndrome
WO2023111106A1 (en) Fukutin related protein gene transfer increase using modified itr sequences
AU2021335601A1 (en) Novel engineered capsid serotype of recombinant adeno-associated viral vector with enhanced transduction efficiency and widespread distribution in the brain
CN116179605A (zh) 一种重组腺相关病毒载体及其应用
US20240350663A1 (en) Isolated modified aav9 capsid protein vp1
US20230338582A1 (en) Methods of Treating Human X-Linked Retinoschisis Using Gene Therapy
US20240279679A1 (en) Compositions and methods for treatment of spinal muscular atrophy
US20250127923A1 (en) Isolated modified capsid protein VP1 from adeno-associated virus serotype 5 (AAV5), capsid and vector based thereon
CN119971081A (zh) 用于治疗智力障碍的组合物、其应用以及药物筛选方法
EA048714B1 (ru) Выделенный модифицированный белок vp1 капсида аденоассоциированного вируса 9 серотипа (aav9), капсид и вектор на его основе
JP2022506066A (ja) 最適化されたｆｉｇ４遺伝子および発現カセットならびにそれらの使用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination