KR20170078862A - 항체 및 그 제조 방법 - Google Patents
항체 및 그 제조 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20170078862A KR20170078862A KR1020177017674A KR20177017674A KR20170078862A KR 20170078862 A KR20170078862 A KR 20170078862A KR 1020177017674 A KR1020177017674 A KR 1020177017674A KR 20177017674 A KR20177017674 A KR 20177017674A KR 20170078862 A KR20170078862 A KR 20170078862A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- myc
- peptide
- cell
- cells
- antibody
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 250
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 493
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 34
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 762
- 101150039798 MYC gene Proteins 0.000 claims description 369
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 359
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 357
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 357
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 claims description 346
- 101100459258 Xenopus laevis myc-a gene Proteins 0.000 claims description 345
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 267
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 179
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 159
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 154
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 130
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 104
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 86
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 77
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 77
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 59
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 59
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 51
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 45
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 45
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 44
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 claims description 35
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 claims description 35
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 claims description 35
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 claims description 35
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 claims description 35
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 claims description 33
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 claims description 33
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 31
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 28
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 26
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 claims description 24
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 claims description 24
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 23
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 23
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 23
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 22
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 16
- -1 Pol Proteins 0.000 claims description 15
- 101000971171 Homo sapiens Apoptosis regulator Bcl-2 Proteins 0.000 claims description 14
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 102100027828 DNA repair protein XRCC4 Human genes 0.000 claims description 10
- 101100193633 Danio rerio rag2 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101000649315 Homo sapiens DNA repair protein XRCC4 Proteins 0.000 claims description 10
- 101100193635 Mus musculus Rag2 gene Proteins 0.000 claims description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 10
- 102100036973 X-ray repair cross-complementing protein 5 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710124921 X-ray repair cross-complementing protein 5 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100036976 X-ray repair cross-complementing protein 6 Human genes 0.000 claims description 10
- 101710124907 X-ray repair cross-complementing protein 6 Proteins 0.000 claims description 10
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 claims description 9
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 8
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 claims 3
- 101710090322 Truncated surface protein Proteins 0.000 claims 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims 2
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 claims 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 claims 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 218
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 218
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 210
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 176
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 166
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 132
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 123
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 46
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 42
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 42
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 41
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 32
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 32
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 32
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 30
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- 238000012452 Xenomouse strains Methods 0.000 description 27
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 24
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 24
- 102000003676 Glucocorticoid Receptors Human genes 0.000 description 22
- 108090000079 Glucocorticoid Receptors Proteins 0.000 description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 18
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 18
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 13
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 13
- 101001056180 Homo sapiens Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Proteins 0.000 description 13
- 102100026539 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 Human genes 0.000 description 13
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 13
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 13
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 13
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 13
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 13
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 description 13
- 102000051485 Bcl-2 family Human genes 0.000 description 12
- 108700038897 Bcl-2 family Proteins 0.000 description 12
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 12
- 102100039788 GTPase NRas Human genes 0.000 description 12
- 101000744505 Homo sapiens GTPase NRas Proteins 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 102000050554 Eph Family Receptors Human genes 0.000 description 11
- 108091008815 Eph receptors Proteins 0.000 description 11
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 11
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 11
- 101000579425 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Proteins 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 11
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 11
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 11
- 102100028286 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase receptor Ret Human genes 0.000 description 11
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 11
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 11
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 10
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 9
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 8
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 8
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 8
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 8
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 8
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 8
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 8
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 8
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 7
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 7
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 7
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 7
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 7
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 6
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 6
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 6
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 210000001948 pro-b lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 5
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000012645 endogenous antigen Substances 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 229940117965 Glucocorticoid receptor modulator Drugs 0.000 description 3
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 3
- 101001030211 Homo sapiens Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- 101710150912 Myc protein Proteins 0.000 description 3
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 3
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 3
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003995 blood forming stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 3
- 210000004667 early pro-b cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002834 estrogen receptor modulator Substances 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 210000002202 late pro-b cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 210000001806 memory b lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 2
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 229940124893 Fluvirin Drugs 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000002250 Hematologic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 2
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000008472 epithelial growth Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 2
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000001459 mortal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000000349 (Z)-3-carboxyprop-2-enoyl group Chemical group O=C([*])/C([H])=C([H])\C(O[H])=O 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- DODQJNMQWMSYGS-QPLCGJKRSA-N 4-[(z)-1-[4-[2-(dimethylamino)ethoxy]phenyl]-1-phenylbut-1-en-2-yl]phenol Chemical compound C=1C=C(O)C=CC=1C(/CC)=C(C=1C=CC(OCCN(C)C)=CC=1)/C1=CC=CC=C1 DODQJNMQWMSYGS-QPLCGJKRSA-N 0.000 description 1
- 108700031308 Antennapedia Homeodomain Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102100027205 B-cell antigen receptor complex-associated protein alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 101710095183 B-cell antigen receptor complex-associated protein alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 102100027203 B-cell antigen receptor complex-associated protein beta chain Human genes 0.000 description 1
- 101710166261 B-cell antigen receptor complex-associated protein beta chain Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000197306 H1N1 subtype Species 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000716729 Homo sapiens Kit ligand Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 206010020631 Hypergammaglobulinaemia benign monoclonal Diseases 0.000 description 1
- 102000012745 Immunoglobulin Subunits Human genes 0.000 description 1
- 108010079585 Immunoglobulin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N L-methionine (R)-S-oxide Chemical compound C[S@@](=O)CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O QEFRNWWLZKMPFJ-ZXPFJRLXSA-N 0.000 description 1
- QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N L-methionine sulphoxide Natural products CS(=O)CCC(N)C(O)=O QEFRNWWLZKMPFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031671 Large B-Cell Diffuse Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 108010058398 Macrophage Colony-Stimulating Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 101150111783 NTRK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150117329 NTRK3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100023181 Neurogenic locus notch homolog protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700037638 Neurogenic locus notch homolog protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 101150056950 Ntrk2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 101710101493 Viral myc transforming protein Proteins 0.000 description 1
- 208000033559 Waldenström macroglobulinemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 1
- RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N alizarin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=C(O)C(O)=CC=C3C(=O)C2=C1 RGCKGOZRHPZPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 1
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 108700041737 bcl-2 Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940096384 chicken egg white lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 206010012818 diffuse large B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 108060002566 ephrin Proteins 0.000 description 1
- 102000012803 ephrin Human genes 0.000 description 1
- 239000003687 estradiol congener Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 201000003444 follicular lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 230000022244 formylation Effects 0.000 description 1
- 238000006170 formylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 102000055276 human IL3 Human genes 0.000 description 1
- 102000055151 human KITLG Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000000014 large pre-b cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004324 lymphatic system Anatomy 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O methylsulfide anion Chemical compound [SH2+]C LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 201000005328 monoclonal gammopathy of uncertain significance Diseases 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 108700024542 myc Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N phosphoramidic acid Chemical compound NP(O)(O)=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000000345 small pre-b cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 1
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본원은 항체 생산 유기체, 항체 생산 조직, 항체 생산 세포 및 항체의 다양한 개선된 제조 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본원은 특정 단백질을 과발현하도록 유전자 조작된 인간, 유기체, 식물 또는 세포로부터 유래된 항체 생산 유기체, 조직, 세포 및 항체의 신속한 제조 방법을 제공한다.
Description
[상호 참조]
본 출원은 2008년 5월 16일에 출원된 미국 가출원 제61/054,047호를 기초로 우선권의 이익을 주장하며, 상기 가출원은 본원에서 참조 인용된다.
[연방 정부 지원 연구에 관한 언급]
본 발명은 미국 국립보건원(NIH) 국립암연구소(NCI)에 의해 계약 번호 R01 CA117802로 미국 정부의 지원을 받아 이루어졌다.
항원 특이적 단일클론 항체를 생성하기 위한 전통적인 접근법은 한계가 있다. 일반적으로, 적은 비율의 고다양성 항원 특이적 B 세포 집단만이 얻어진다. 일부 경우, 항원 특이적 B 세포는 자기 관용으로 인하여 증식하지 못한다. 다른 경우, 항원 특이적 B 세포는 골수종 융합 파트너와의 세포 융합이 일어나면 증식하지 못한다.
본원은, 특정 실시형태에서, 목적하는 항체를 생성, 생산, 수득 및/또는 제조하는 방법(간략함을 위해, 본원에서 사용되는 바와 같은 "제조하는"이란 용어는 "생성하는", "생산하는" 및 "수득하는"과 동등한 의미로 사용된다)을 개시한다. 또한, 목적하는 항체를 제조하는 데 사용되는 시스템, 세포주 및 유기체도 개시한다. 항체 및 이러한 항체를 포함하는 조성물도 추가로 개시한다.
본원은 (a) 항체 생산 세포 및 (b) 종래의 항체 생산과 관련된 많은 문제점들을 극복한 항체의 다양한 제조 방법을 제공한다. 본원은 특정 실시형태에서, (a) 항체 생산 세포 및 (b) MYC을 과발현하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)로부터 유래된 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 본원은 일부 실시형태에서, (a) 항체 생산 세포 및 (b) MYC이 과발현되는 세포로부터 유래된 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 본원은 특정 실시형태에서, 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)로서, 이 유기체의 면역계가 이종성 MYC 유전자(즉, Myc 펩티드를 코딩하는 MYC 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열); 즉, 유전자 이식 MYC)를 포함하는 복수의 조혈모세포로 재구성된 면역결핍 유기체로부터 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본원은 인간 항체를 코딩하는 인간 유전자를, 유전자 이식 MYC을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)로 도입함으로써(또는 다른 방식으로 제공함으로써) 인간 또는 인간화 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 본원에서, 특정 실시형태는, MYC 유전자를 과발현하는 인간 또는 인간화 항체를 제조하기 위한 단리된 B 세포를 제공한다. 또한, 본원은 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 제조된 단리된 항체를 제공한다. 본원에서는 또한, 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 제조된 항체를 생산하도록 조작된 세포를 제공한다.
본원은 특정 실시형태에서, 세포 융합에 대한 필요성 없이 항체(예를 들어, 단일클론 항체)를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은, 항체 생산 B 세포를 융합 파트너와 융합시킬 필요성이 없이 단일클론 항체를 제조하기 때문에, 항체 제조에 요구되는 시간을 단축시킬 수 있다. 본원에 기재된 특정 실시형태는, 일반적으로 면역학적 제약(예를 들어, 자기 관용)의 대상이 되는 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 상기 방법은 자기 항원에 대한 단일클론 항체(즉, mAB)를 제조하는 데 사용된다.
본원은 유전자 이식 MYC을 포함하는 세포를 선택된 항원과 접촉시키는 단계를 포함하는 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 그 세포 표면 상에 CD79를 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 이식 MYC 유전자는 이 유전자의 오픈 리딩 프레임(즉, ORF)에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포 선택적 프로모터는 Eμ 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 프로모터는 하나 이상의 TRE를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 선택된 항원과 접촉시키는 단계는 선택된 항원을 유기체(예를 들어, 포유동물)에 투여하는 것(즉, 접종 또는 도입하는 것)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)의 게놈은 테트라사이클린 역전사 활성화인자(즉, rtTA), 테트라사이클린 전사 활성화인자(즉, tTA), 또는 둘 다를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, rtTA를 코딩하는 핵산 서열은 이 서열의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, rtTA를 코딩하는 핵산 서열은 이 서열의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 MMTV 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, tTA를 코딩하는 핵산 서열은 이 서열의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, tTA를 코딩하는 핵산 서열은 이 서열의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 MMTV 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 유전자 이식 MYC 유전자의 tTA 의존적 발현 또는 rtTA 의존적 발현을 억제하기에 충분한 기간 동안 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 유기체(예를 들어, 포유동물)에 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 (a) 유전자 이식 MYC 유전자의 tTA 의존적 발현 또는 rtTA 의존적 발현을 억제하기에 충분한 기간 동안 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 유기체(예를 들어, 포유동물)에 제공하는 단계 및 (b) 상기 충분한 기간 후에, 유전자 이식 MYC 유전자의 tTA 의존적 발현 또는 rtTA 의존적 발현을 유도할 수 있도록 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 선택된 항원을 코딩하는 이종성 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 선택된 항원에 특이적인 항체를 발현하는 하나 이상의 B 세포를 상기 유기체로부터 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 이식 MYC 유전자는 Myc-ER 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 이식 MYC 유전자는 Myc-GR 폴리펩티드를 코딩한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "GR"은 글루코코티코이드 수용체를 의미한다. 일부 실시형태에서, Myc-ER 폴리펩티드는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 ER 리간드와 접촉시키는 것에 의해 세포의 핵으로 전치된다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 선택된 항원을 코딩하는 발현 벡터를 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 포함한다.
본원은 유기체(예를 들어, 포유동물)에 선택된 항원을 투여하는(즉, 도입하는 또는 접종하는) 단계로서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 유전자 이식 MYC 유전자 및 MYC 유전자의 ORF에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함하는 것인 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다.
본원은 (a) 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 B 세포를 제공하는 단계로서, 상기 B 세포는 유전자 이식 MYC 유전자 및/또는 이종성 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 포함하는 것인 단계; 및 (b) 상기 B 세포에서 상기 MYC 유전자의 발현 및/또는 상기 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))의 활성을 유도하는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포는, 유전자 이식 MYC 유전자 및/또는 이종성 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 포함하는 B 세포를 선택된 항원과 접촉시킴으로써 제조한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 단일클론 B 세포 집단을 생성하기 위해 B 세포를 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 단일클론 B 세포 집단으로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재하고, Myc 활성의 유도는 생체 내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 유도 단계 전에 생체 외에서 B 세포에 유전자 이식 MYC 유전자 또는 이종성 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 생체 외에서 B 세포에 이종성 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 이종성 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))는 단백질 전달 도메인(예를 들어, TAT 도메인)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포는 무력성(anergic) B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 이식 MYC 유전자는 유전자의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 유전자의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 프로모터는 하나 이상의 TRE를 포함하고, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 세포는 tTA 펩티드를 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 이종성 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))는 Myc-ER 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 유도는 B 세포를 ER 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 이종성 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))는 Myc-GR 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 유도는 B 세포를 GR 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포는 마우스 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포는 선택된 항원이 투여된(즉, 이것이 접종되거나 이것으로 면역화된) 유기체(예를 들어, 포유동물) 유래의 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역화된 유기체는 유전자 이식 MYC 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 이식 MYC 유전자는 유도성이다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 이식 MYC 유전자는 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터는 하나 이상의 TRE를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 담체(carrier)를 추가로 포함하며, tTA 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열) 또는 rtTA 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 담체를 추가로 포함하며, 선택된 항원을 코딩하는 유전자(예를 들어, 이종성 유전자)를 발현한다.
본원은 면역결핍 포유동물에게 유전자 이식 MYC 유전자를 포함하는 복수의 조혈모세포를 투여하는 단계; 및 (c) 상기 면역결핍 포유동물에게 선택된 항원을 투여하는(즉, 도입하는 또는 접종하는) 단계를 포함하는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 조혈모세포는 이종성 BCL-2 유전자를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 복수의 조혈모세포가 B 세포로 분화되도록 유도하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 면역결핍 포유동물로부터 항체를 발현하는 복수의 B 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 항체를 발현하는 복수의 B 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 이식 MYC 유전자는 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 이식 MYC 유전자는 하나 이상의 TRE를 포함하는 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조혈모세포는 tTA 또는 rtTA를 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 (a) tTA 의존적 트랜스 활성화를 억제하기에 충분한 기간 동안 면역결핍 포유동물에게 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 기간 후에, tTA 의존적 트랜스 활성화가 일어날 수 있도록 상기 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포 선택적 프로모터는 Eμ 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 이식 MYC 유전자는 Myc-ER 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 (a) 면역결핍 포유동물로부터 항원 특이적 항체를 발현하는 하나 이상의 B 세포를 회수하는 단계; 및 (b) 상기 B 세포를 ER 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 이종성 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))는 Myc-GR 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 (a) 면역결핍 포유동물로부터 항원 특이적 항체를 발현하는 하나 이상의 B 세포를 회수하는 단계; 및 (b) 상기 B 세포를 GR 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다. 일부 실시형태에서, 면역결핍 유기체는 유기체(예를 들어, 포유동물)에 방사선을 조사하여 얻는다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 Rag-1ko, Rag-2, SCID, DNA-PK, Ku70, Ku80, XRCC4, 또는 μT 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 상기 선택된 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 상기 선택된 항원을 코딩하는 이종성 DNA 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 핵산 발현 벡터에 의한 형질감염 또는 바이러스 발현 벡터에 의한 감염에 의해 유기체의 게놈에 도입된다. 일부 실시형태에서, 상기 발현 벡터는 렌티바이러스이다.
본원은 (a) 인간 항체를 발현하고 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 코딩하는 이종성 DNA 서열을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 선택된 항원과 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 Myc을 유도에 의해 과발현한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 (a) 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)에게 MYC을 과발현하는 복수의 조혈모세포를 투여하는 단계에 의해 얻는다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 유기체(예를 들어, 포유동물)에 방사선을 조사하여 얻는다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 Rag-1ko, Rag-2, SCID, DNA-PK, Ku70, Ku80, XRCC4, 또는 μMT 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 선택된 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 MYC의 과발현을 유도하는 조건에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 MYC DNA 서열은 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 단리하기 전에, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 MYC의 과발현을 유도하는 조건에 적용한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다.
일부 실시형태에서, 포유동물로부터 항체 생산 세포를 단리한 후에, 상기 항체 생산 세포를 MYC의 과발현을 유도하는 조건에 적용한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 포유동물은 MMTV-rtTA/TRE-MYC; MMTV-rtTA/TRE-MYC/Rag-1-/-; MMTV-tTA/TRE-MYC; 또는 MMTV-tTA/TRE-MYC/Rag-1-/- 마우스이고, MYC의 과발현을 유도하는 조건은 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체에의 노출이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 포유동물 세포를 에스트로겐 수용체 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 포유동물 세포를 에스트로겐 수용체 리간드 부재 하에 선택된 항원과 접촉시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 포유동물 세포를 글루코코티코이드 수용체 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 포유동물 세포를 글루코코티코이드 수용체 리간드 부재 하에 선택된 항원과 접촉시킨다.
본원은 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법으로서, (a) 인간 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 인간 세포로부터 상기 항체를 코딩하는 인간 유전자를 단리하는 단계; 및 (c) 유전자 이식 MYC 유전자 또는 이종성 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 포함하는 세포로 상기 유전자를 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 포함하는 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 인간 유전자는 인간 IgH(면역글로불린 중쇄) 및 IgL(면역글로불린 경쇄)을 코딩하고, 상기 IgH와 IgL은 함께 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 유기체(예를 들어, 마우스)에 이식하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 인간 유전자는 제1 항체 및 제2 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유전자 이식 MYC DNA 서열은 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 이종성 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))는 Myc-ER 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR 융합 펩티드이다.
본원은 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법으로서, (a) Myc을 과발현하는 세포로 인간 면역글로불린을 코딩하는 유전자를 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계; 및 (b) 코딩된 인간 면역글로불린을 단리하는 단계를 포함하는 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다.
본원은 인간 또는 인간화 항체를 제조하기 위한 단리된 B 세포로서, Myc을 과발현하는 단리된 B 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 또한, 본 발명에서는 본원에 개시된 임의의 방법의 공정에 따라 제조된 단리된 항체를 제공하며, 나아가 본원에 개시된 방법의 공정에 따라 제조된 임의의 항체의 재조합 형태를 생성하도록 조작된 포유동물 세포를 제공한다.
도 1. Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 유전자 이식 마우스에서 발생하는 종양 및 세포주의 표면 표현형의 예시적인 예. 흑색으로 채워진 히스토그램은 야생형 마우스로부터 얻은 세포의 프로파일에 해당하고, 회색 트레이스는 BCRHEL 유전자 이식 마우스에 해당하며, 가는 선 또는 점선 트레이스는 BCRHEL/sHEL 마우스에 해당하고, 흑색 트레이스는 삼중 유전자 이식 마우스로부터 얻은 세포에 해당한다. 이 데이터는 B220+ 비장 세포 상의 표시된 마커의 발현을 나타낸다.
도 2. Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스에서 발생하는 종양 및 세포주에서의 면역글로불린 생산 및 HEL 특이적 역가의 예시적인 예. 각각의 세포주(TBL-1, TBL-8, TBL-14 및 TTLN9, 모두 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스에서 발생하는 종양으로부터 유래됨)로부터 유래된 정해진 수의 세포(105)를 사이토카인의 첨가 없이 24웰 플레이트의 배양 배지 1 ml 중에 시딩하였다. 4일 후 상청액 샘플을 수집하여 총 IgM(패널 A) 농도 및 HEL 특이적 IgM의 역가(패널 B)를 분석하였다. 각종 마우스로부터 얻은 혈청을 세포주의 항체 생산을 비교하는 데 사용하였다. 이들 마우스는 야생형 C57/BL6 마우스(WT), BCRHEL 유전자 이식 마우스(BCR-tg), sHEL 유전자 이식 마우스(Ag-tg), BCRHEL/sHEL 이중 유전자 이식 마우스(BCR/Ag-tg), Eμ-MYC 마우스 및 종양 보유 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 삼중 유전자 이식 마우스(BL)를 포함하였다. 여기에 제시된 결과는 한 실험으로부터 얻은 것이며, 3회의 독립된 분석을 대표하는 것이다.
도 3. MYC이 급성 과발현된 후의 활성화 B 세포의 양상. 활성화된 B 세포의 유세포 측정 검출. 분석은 야생형 마우스(흑색으로 채워진 히스토그램), 계속해서 독시사이클린 상에서 유지시킨 MMTV-tTA/TRE-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(회색 트레이스) 및 안락사 전에 독시사이클린을 제거한 MMTV-tTA/TRE-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(흑색 트레이스)로부터 얻은 림프절 세포에 대해 수행하였다. 선택된 항원에 의존적인 B 세포의 활성화 후에 상향 조절된 두 분자, 즉 CD69(A) 및 B7-2(CD86)(B)에 대한 항체로 세포를 염색하였다. 트레이스는 세포의 B220+ 분획 상에 존재하는 CD69 및 B7-2 수준을 나타내며, 이는 유세포 측정법에 의해 사이토크롬 C 염색 세포에서의 게이팅에 의해 확인된다.
도 4. 활성화 B 세포의 축적은 MYC의 연속적인 과발현을 요한다. B 세포는 MYC에 반응하여 활성화됨. 림프절 내의 활성화 B 세포의 수는 종래에 개시된 바와 같이 측정하였다(34). 이들 그래프의 각각의 데이터 포인트는 개개의 마우스의 림프절 내에서 검출된 활성화 B 세포의 수를 나타낸다. 각 시점에 마우스 4 마리의 코호트를 사용하였다. 이 도면은 유도된 MMTV-tTA/TRE-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스에서의 활성화 B 세포의 축적 개시 및 유지에 MYC이 필요함을 보여준다.
도 5. MYC이 과발현된 후 혈청 중 자가항체의 축적. 파괴된 내성의 혈청학적 증거. 각각 지정된 유전자형을 갖는 그룹당 4 마리의 마우스 그룹으로부터 혈청을 얻어, HEL(A), 또는 총 혈청 면역글로불린(B)에 대해 ELISA로 삼중으로 분석하였다. 번호가 매겨진 카테고리는 야생형 마우스(1), BCRHEL 마우스(2), BCRHEL/sHEL 마우스(3), 명백한 종양이 발생하기 전의 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(4), 계속해서 독시사이클린 상에서 유지시킨 MMTV-tTA/TRE-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(5) 및 혈청 수집 28일 전에 독시사이클린을 제거한 MMTV-tTA/TRE-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(6)로부터 얻은 혈청을 나타낸다.
도 6. MYC이 과발현된 후 신장 내의 자가항체 및 면역 복합체의 축적. 조직학적 검사를 위해, 야생형 마우스(A) 또는 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(B)로부터 신장을 적출하였다. 조직을 절편화하여 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여, 현미경 이미지를 얻었다. 배율은 100배였다. 면역형광 분석을 위해, 야생형 마우스(C) 또는 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(D)로부터 신장을 적출하였다. 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이, 냉동 조직을 절편화하여 IgM에 대한 로다민 접합 항체로 염색하였다. 배율은 5배였다.
도 7. HEL을 발현하는 PRV 변이체의 치사적 항원공격으로부터 얻은 신규한 HEL 특이적 항체를 사용한 마우스의 보호. 마우스 코호트에 PRV의 2종의 상이한 변이체, 즉 상기 바이러스의 Us9-GFP 변이체(실선) 또는 Us9-HEL 변이체(점선)를 정맥내 투여하여 이들을 감염시켰다. 마우스에게 주사하기 전에, 바이러스 상청액을 항HEL 항체(MMTV-tTA/TRE-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스로부터 본 발명자들이 생성한 것)와 얼음 위에서 1 시간 동안 인큐베이트하였다. 주사는 모든 마우스에 대해 동시에 실시하였으며, PRV 감염에 따른 임상 징후 발생을 확인하기 위해 1일 3회 관찰하였다. 이것은 한 실험으로부터 얻은 것이며, 2회의 독립된 분석을 대표하는 것이다.
도 8. 레트로바이러스 키메라 마우스에서 발생된 B 세포 종양의 표면 표현형. TRE-MYC 골수 유래의 HSC를 pMIG-tTA 및 pMIG-H5로 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 치사적 방사선 조사 마우스 코호트를 재구성하는 데 사용하였다. 마우스가 외적으로 혈액 악성종양의 명백한 임상 징후를 나타내기 시작하여 안락사시켰다. 림프절 및 비장을 수집하여 이를 단일 세포 현탁액을 조제하는 데 사용하였다. 이들 세포 중 일부를 B220 및 IgM에 대한 항체로 염색하였다. 이 패널은 이들 세포에 대해 수행된 유세포 측정 분석의 결과를 나타낸다. 종양은, 본 발명자들이 성숙 활성화 B 세포로 이루어진 MYC 유도 항원 의존적 종양을 발생시킨 본 발명자들의 버킷 림프종 마우스 모델에서 관찰했던 것과 유사한 성숙 활성화(블라스팅) B 세포로 이루어졌다.
도 9. 레트로바이러스 키메라 마우스로부터 얻은 혈청의 반응성의 웨스턴 블롯 분석. TRE-MYC 골수 유래 HSC를 pMIG-tTA 및 pMIG-H5로 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 치사적 방사선 조사 마우스 코호트를 재구성하는 데 사용하였다. 마우스가 외적으로 혈액 악성종양의 명백한 임상 징후를 나타내기 시작하여 안락사시켰다. 안락사 직후 혈액을 수집해서 응고시켜 혈청을 얻었다. H5 HA에 대한 반응성을 테스트하기 위해, 293FT 세포를 pMIG, pcDNA2-H5 또는 pMIG-H5(키메라 마우스를 제작하는 데 사용되는 것과 동일한 플라스미드)로 일시적 형질감염시켰다. 종래에 알려진 바와 같이, 형질감염 48 시간 후 세포를 수집하여 Triton X-100에 기초한 용해 완충액으로 용해시켰다. 용해물을 12% SDS-PAGE 겔에서 러닝하여 PVDF 막으로 이전하였다. 블롯을 레트로바이러스 키메라 마우스로부터 얻은 희석률 1:5,000의 혈청으로 프로빙하였다. 아랫쪽 분자량 밴드(19 Kd)는 비특이적인 것으로 이 경우 바람직한 로딩 대조군 역할을 한다. 혈청에 의해 인식된 특이적 밴드는 ER에서의 프로세싱 과정에서 퓨린(furin) 프로테아제에 의한 HA0의 절단으로부터 얻어지는 HA1 서브유닛(약 40 kDa) 및 비절단 (HA0)H5(약 60 kDa)에 대한 예상 분자량을 나타낸다.
도 10. 레트로바이러스 키메라 마우스로부터 얻은 마우스 혈청의 적혈구 응집 반응 억제 분석. H5/tTA BM 형질도입으로부터 6∼8주 후 3 마리의 마우스(1-3)로부터 분리한 혈청 또는 인산염 완충 염수[PBS](C1)를 미량적정 플레이트에서 이중 웰로 계열 희석하였다. 계열 희석 후, 인플루엔자 A 바이러스의 4 응집 단위 A/Mal/WI/944/82(H5N2), A/NY/1469/02(H1N1), 또는 PBS(바이러스 없음)를 각각의 웰에 첨가하여 30분 동안 인큐베이트하였다. 그 후, 적혈구 응집 반응 활성을 검출하기 위해, 칠면조 적혈구를 첨가하여 30분 동안 인큐베이트하였다. 첫 번째 컬럼은 1:20의 최종 혈청 농도를 포함한다.
도 11. HEL 및 CFA(완전 프로인트 면역보강제), 또는 HEL 및 TAT-Myc으로 면역화한 마우스로부터 항체를 얻었다. HEL 및 TAT-Myc으로 면역화한 마우스로부터 얻은 항체는 조기에 검출되고 더 활발한 반응을 나타내었다.
도 12. 0일째 HEL 및 CFA(완전 프로인트 면역보강제), 또는 HEL 및 TAT-Myc으로 면역화한 마우스로부터 항체를 얻었다. 30일째 추가 접종분의 항원을 투여하였다. HEL 및 TAT-Myc으로 면역화한 마우스는 HEL 항원에 대한 숙주의 기억 반응(recall 반응) 향상을 나타내었다.
도 13. 플루비린(2007-2008) 및 CFA(완전 프로인트 면역보강제), 또는 HEL 및 TAT-Myc으로 면역화한 마우스로부터 항체를 얻었다. 플루비린 및 TAT-Myc으로 면역화한 마우스로부터 얻은 항체는 조기에 검출되고 더 활발한 반응을 나타내었다.
도 2. Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스에서 발생하는 종양 및 세포주에서의 면역글로불린 생산 및 HEL 특이적 역가의 예시적인 예. 각각의 세포주(TBL-1, TBL-8, TBL-14 및 TTLN9, 모두 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스에서 발생하는 종양으로부터 유래됨)로부터 유래된 정해진 수의 세포(105)를 사이토카인의 첨가 없이 24웰 플레이트의 배양 배지 1 ml 중에 시딩하였다. 4일 후 상청액 샘플을 수집하여 총 IgM(패널 A) 농도 및 HEL 특이적 IgM의 역가(패널 B)를 분석하였다. 각종 마우스로부터 얻은 혈청을 세포주의 항체 생산을 비교하는 데 사용하였다. 이들 마우스는 야생형 C57/BL6 마우스(WT), BCRHEL 유전자 이식 마우스(BCR-tg), sHEL 유전자 이식 마우스(Ag-tg), BCRHEL/sHEL 이중 유전자 이식 마우스(BCR/Ag-tg), Eμ-MYC 마우스 및 종양 보유 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 삼중 유전자 이식 마우스(BL)를 포함하였다. 여기에 제시된 결과는 한 실험으로부터 얻은 것이며, 3회의 독립된 분석을 대표하는 것이다.
도 3. MYC이 급성 과발현된 후의 활성화 B 세포의 양상. 활성화된 B 세포의 유세포 측정 검출. 분석은 야생형 마우스(흑색으로 채워진 히스토그램), 계속해서 독시사이클린 상에서 유지시킨 MMTV-tTA/TRE-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(회색 트레이스) 및 안락사 전에 독시사이클린을 제거한 MMTV-tTA/TRE-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(흑색 트레이스)로부터 얻은 림프절 세포에 대해 수행하였다. 선택된 항원에 의존적인 B 세포의 활성화 후에 상향 조절된 두 분자, 즉 CD69(A) 및 B7-2(CD86)(B)에 대한 항체로 세포를 염색하였다. 트레이스는 세포의 B220+ 분획 상에 존재하는 CD69 및 B7-2 수준을 나타내며, 이는 유세포 측정법에 의해 사이토크롬 C 염색 세포에서의 게이팅에 의해 확인된다.
도 4. 활성화 B 세포의 축적은 MYC의 연속적인 과발현을 요한다. B 세포는 MYC에 반응하여 활성화됨. 림프절 내의 활성화 B 세포의 수는 종래에 개시된 바와 같이 측정하였다(34). 이들 그래프의 각각의 데이터 포인트는 개개의 마우스의 림프절 내에서 검출된 활성화 B 세포의 수를 나타낸다. 각 시점에 마우스 4 마리의 코호트를 사용하였다. 이 도면은 유도된 MMTV-tTA/TRE-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스에서의 활성화 B 세포의 축적 개시 및 유지에 MYC이 필요함을 보여준다.
도 5. MYC이 과발현된 후 혈청 중 자가항체의 축적. 파괴된 내성의 혈청학적 증거. 각각 지정된 유전자형을 갖는 그룹당 4 마리의 마우스 그룹으로부터 혈청을 얻어, HEL(A), 또는 총 혈청 면역글로불린(B)에 대해 ELISA로 삼중으로 분석하였다. 번호가 매겨진 카테고리는 야생형 마우스(1), BCRHEL 마우스(2), BCRHEL/sHEL 마우스(3), 명백한 종양이 발생하기 전의 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(4), 계속해서 독시사이클린 상에서 유지시킨 MMTV-tTA/TRE-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(5) 및 혈청 수집 28일 전에 독시사이클린을 제거한 MMTV-tTA/TRE-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(6)로부터 얻은 혈청을 나타낸다.
도 6. MYC이 과발현된 후 신장 내의 자가항체 및 면역 복합체의 축적. 조직학적 검사를 위해, 야생형 마우스(A) 또는 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(B)로부터 신장을 적출하였다. 조직을 절편화하여 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여, 현미경 이미지를 얻었다. 배율은 100배였다. 면역형광 분석을 위해, 야생형 마우스(C) 또는 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스(D)로부터 신장을 적출하였다. 재료 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이, 냉동 조직을 절편화하여 IgM에 대한 로다민 접합 항체로 염색하였다. 배율은 5배였다.
도 7. HEL을 발현하는 PRV 변이체의 치사적 항원공격으로부터 얻은 신규한 HEL 특이적 항체를 사용한 마우스의 보호. 마우스 코호트에 PRV의 2종의 상이한 변이체, 즉 상기 바이러스의 Us9-GFP 변이체(실선) 또는 Us9-HEL 변이체(점선)를 정맥내 투여하여 이들을 감염시켰다. 마우스에게 주사하기 전에, 바이러스 상청액을 항HEL 항체(MMTV-tTA/TRE-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스로부터 본 발명자들이 생성한 것)와 얼음 위에서 1 시간 동안 인큐베이트하였다. 주사는 모든 마우스에 대해 동시에 실시하였으며, PRV 감염에 따른 임상 징후 발생을 확인하기 위해 1일 3회 관찰하였다. 이것은 한 실험으로부터 얻은 것이며, 2회의 독립된 분석을 대표하는 것이다.
도 8. 레트로바이러스 키메라 마우스에서 발생된 B 세포 종양의 표면 표현형. TRE-MYC 골수 유래의 HSC를 pMIG-tTA 및 pMIG-H5로 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 치사적 방사선 조사 마우스 코호트를 재구성하는 데 사용하였다. 마우스가 외적으로 혈액 악성종양의 명백한 임상 징후를 나타내기 시작하여 안락사시켰다. 림프절 및 비장을 수집하여 이를 단일 세포 현탁액을 조제하는 데 사용하였다. 이들 세포 중 일부를 B220 및 IgM에 대한 항체로 염색하였다. 이 패널은 이들 세포에 대해 수행된 유세포 측정 분석의 결과를 나타낸다. 종양은, 본 발명자들이 성숙 활성화 B 세포로 이루어진 MYC 유도 항원 의존적 종양을 발생시킨 본 발명자들의 버킷 림프종 마우스 모델에서 관찰했던 것과 유사한 성숙 활성화(블라스팅) B 세포로 이루어졌다.
도 9. 레트로바이러스 키메라 마우스로부터 얻은 혈청의 반응성의 웨스턴 블롯 분석. TRE-MYC 골수 유래 HSC를 pMIG-tTA 및 pMIG-H5로 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 치사적 방사선 조사 마우스 코호트를 재구성하는 데 사용하였다. 마우스가 외적으로 혈액 악성종양의 명백한 임상 징후를 나타내기 시작하여 안락사시켰다. 안락사 직후 혈액을 수집해서 응고시켜 혈청을 얻었다. H5 HA에 대한 반응성을 테스트하기 위해, 293FT 세포를 pMIG, pcDNA2-H5 또는 pMIG-H5(키메라 마우스를 제작하는 데 사용되는 것과 동일한 플라스미드)로 일시적 형질감염시켰다. 종래에 알려진 바와 같이, 형질감염 48 시간 후 세포를 수집하여 Triton X-100에 기초한 용해 완충액으로 용해시켰다. 용해물을 12% SDS-PAGE 겔에서 러닝하여 PVDF 막으로 이전하였다. 블롯을 레트로바이러스 키메라 마우스로부터 얻은 희석률 1:5,000의 혈청으로 프로빙하였다. 아랫쪽 분자량 밴드(19 Kd)는 비특이적인 것으로 이 경우 바람직한 로딩 대조군 역할을 한다. 혈청에 의해 인식된 특이적 밴드는 ER에서의 프로세싱 과정에서 퓨린(furin) 프로테아제에 의한 HA0의 절단으로부터 얻어지는 HA1 서브유닛(약 40 kDa) 및 비절단 (HA0)H5(약 60 kDa)에 대한 예상 분자량을 나타낸다.
도 10. 레트로바이러스 키메라 마우스로부터 얻은 마우스 혈청의 적혈구 응집 반응 억제 분석. H5/tTA BM 형질도입으로부터 6∼8주 후 3 마리의 마우스(1-3)로부터 분리한 혈청 또는 인산염 완충 염수[PBS](C1)를 미량적정 플레이트에서 이중 웰로 계열 희석하였다. 계열 희석 후, 인플루엔자 A 바이러스의 4 응집 단위 A/Mal/WI/944/82(H5N2), A/NY/1469/02(H1N1), 또는 PBS(바이러스 없음)를 각각의 웰에 첨가하여 30분 동안 인큐베이트하였다. 그 후, 적혈구 응집 반응 활성을 검출하기 위해, 칠면조 적혈구를 첨가하여 30분 동안 인큐베이트하였다. 첫 번째 컬럼은 1:20의 최종 혈청 농도를 포함한다.
도 11. HEL 및 CFA(완전 프로인트 면역보강제), 또는 HEL 및 TAT-Myc으로 면역화한 마우스로부터 항체를 얻었다. HEL 및 TAT-Myc으로 면역화한 마우스로부터 얻은 항체는 조기에 검출되고 더 활발한 반응을 나타내었다.
도 12. 0일째 HEL 및 CFA(완전 프로인트 면역보강제), 또는 HEL 및 TAT-Myc으로 면역화한 마우스로부터 항체를 얻었다. 30일째 추가 접종분의 항원을 투여하였다. HEL 및 TAT-Myc으로 면역화한 마우스는 HEL 항원에 대한 숙주의 기억 반응(recall 반응) 향상을 나타내었다.
도 13. 플루비린(2007-2008) 및 CFA(완전 프로인트 면역보강제), 또는 HEL 및 TAT-Myc으로 면역화한 마우스로부터 항체를 얻었다. 플루비린 및 TAT-Myc으로 면역화한 마우스로부터 얻은 항체는 조기에 검출되고 더 활발한 반응을 나타내었다.
본원은 (a) 개선된 특이성, (b) 현저히 증가된 효능, 또는 이들의 조합을 갖는 항체를 생성하기 위한 시스템 및 방법을 기재한다. 일부 실시형태에서, 상기 시스템 및 방법은 현행 접근법보다 더 효율적이고 신속하다.
일부 실시형태에서, 자기 관용의 부재는 이들 시스템이 현저한 (또는 임의의) 면역학적 제약 없이 항체를 생성할 수 있게 한다. 이들 시스템 및 접근법에 의하면, 현행 면역화법에 의해서는 얻을 수 없는 항체 특이성을 얻을 수 있다.
일부 실시형태에서, 동족 항원은 생체 내에서 B 세포 종양 형성을 유도하고, 림프종으로 발달하여 그 결과 단일클론 항체 생산 세포주를 얻을 수 있는 항체 생산 세포의 선택을 가능하게 한다. 이러한 시스템 및 접근법은 얻어진 단일클론 항체의 스크리닝을 직접적인 방식으로 수행할 수 있도록 하기 때문에, 이러한 시스템 및 접근법은 항체 개발 시간을 단축시킨다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법 및 시스템은 종양으로부터 항체 생산 세포주를 생성하고 클론 증식시켜 항체 생산 비장 B 세포와 골수종 융합 파트너의 세포 융합에 대한 필요성을 없앨 수 있는 역량을 제공한다. 당업계에 공지된 세포 융합 과정은, 매우 비효율적이며, 면역화 후 증식하는 B 세포 중 일부의 불멸화만을 가능하게 하여, 얻어진 항원 특이적 단일클론 항체의 수와 다양성을 제한한다.
특정 정의
달리 나타내지 않는다면, 본 명세서와 첨부된 특허청구범위에서 사용될 때 하기 용어는 이하의 의미를 갖는다.
용어 "백혈구"는 비한정적인 예로서 림프구, 단핵구, 대식세포, 호산구, 호중구 및 호염구를 포함한다. 일부 실시형태에서, 백혈구는 조혈모세포와 조혈모세포로부터 기원하는 모든 골수계 및 림프계 세포를 말한다. 일부 실시형태에서, 백혈구는 조직 특이적 변종 및 특수화된 변종을 비롯한 모든 미성숙, 성숙, 미분화 및 분화 백혈구 집단을 말한다.
용어 "림프구"는 비한정적인 예로서 B 세포, T 세포, NKT 세포 및 NK 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 림프구는 조직 특이적 변종 및 특수화된 변종을 비롯한 모든 미성숙, 성숙, 미분화 및 분화 림프구 집단을 말한다. 일부 실시형태에서, 림프구는 프리 B 세포(pre-B cell), 전구 B 세포(Progenitor B cell), 조기 프로 B 세포(Early Pro-B cell), 후기 프로 B 세포(Late Pro-B cell), 대형 프리 B 세포(Large Pre-B cell), 소형 프리 B 세포(Small Pre-B cell), 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 형질 B 세포, 기억 B 세포, B-1 세포, B-2 세포 및 무력성 AN1/T3 세포 집단을 비롯한 모든 B 세포 계통을 포함한다.
용어 "B 세포"는 비한정적인 예로서 프리 B 세포, 전구 B 세포, 조기 프로 B 세포, 후기 프로 B 세포, 대형 프리 B 세포, 소형 프리 B 세포, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 형질 B 세포, 기억 B 세포, B-1 세포, B-2 세포 및 무력성 AN1/T3 세포 집단을 말한다. 일부 실시형태에서, "B 세포"란 용어는 그 세포 표면 상에 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄를 발현하는 B 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, "B 세포"란 용어는 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄를 발현하여 분비하는 B 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, "B 세포"란 용어는 그 세포 표면 상의 항원에 결합하는 세포를 포함한다. 본원에 개시된 일부 실시형태에서, B 세포 또는 AN1/T3 세포를 상기에 기재된 방법에 사용한다. 특정 실시형태에서, 이러한 세포를, 예를 들어, 조혈모세포, B 세포, 프리 B 세포, 전구 B 세포, 조기 프로 B 세포, 후기 프로 B 세포, 대형 프리 B 세포, 소형 프리 B 세포, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 형질 B 세포, 기억 B 세포, B-1 세포, B-2 세포, 무력성 B 세포, 또는 무력성 AN1/T3 세포를 비롯한, 항체를 발현하기에 적합하거나, 항체를 발현할 수 있거나(예를 들어, 유도성 발현), 항체를 발현하기에 적합한 세포로 분화될 수 있는 임의의 동물 세포로 대체한다.
용어 "면역화한다"는 임의의 적절한 방법에 의해 유기체로 항원을 도입하는 것을 말한다. 다양한 경로의 비한정적인 예로는 피내 주사, 정맥내 주사, 안내 투여, 피하 주사, 복강내 주사, 경구 투여 또는 국소 투여가 있다.
용어 "항원"은 항체 생산을 유도할 수 있는 물질을 말한다. 일부 실시형태에서, 항원은 항체 가변 영역에 결합하는 물질이다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원은 항체 생산 유기체 본래의 것이 아닌 물질이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 상기 항체 생산 유기체 본래의 것(예를 들어, 자기 항원)인 물질이다.
용어 "AN1/T3 세포 집단"은 무력성 B 세포 집단을 말하며; AN1/T3 세포 집단을 기재한 실시형태는 또한 "AN1/T3 세포 집단"이란 용어가 "무력성 B 세포 집단"이란 용어로 대체되는 실시형태를 포함한다.
용어 "무력성"은 항원이 결합될 때 활성화되지 않는 CD79 발현 세포를 말한다. 일부 실시형태에서, 활성화는 세포 표면 CD79의 상향 조절에 의해 정의된다. 일부 실시형태에서, 활성화는 CD79a의 인산화 및/또는 Syk의 인산화에 의해 정의된다. 일부 실시형태에서, 활성화는 칼슘 이동에 의해 정의된다.
용어 "CD79"는 CD79a(Ig 알파) 또는 CD79b(Ig 베타)를 포함하는 세포 표면 단백질을 말한다.
용어 "융합 단백질"과 "융합 펩티드"는 상호 교환하여 사용될 수 있으며 자연에서 정상적으로는 함께 존재하지 않는 2종 이상의 상이한 단백질, 단백질의 부분 또는 도메인을 포함하는 연속된 폴리펩티드쇄를 말한다.
용어 "Myc", "cMyc", "Myc 단백질" 및 "Myc 폴리펩티드"는 상호 교환하여 사용될 수 있으며, 특정 경우 NCBI 수탁 번호 NP002458.2, 이의 기능성 동족체, 유사체 또는 단편을 말한다. Myc의 동의어로는 c-Myc, v-Myc, Myc 원발암유전자 단백질 및 전사 인자 p64를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, Myc 폴리펩티드는 NCBI 수탁 번호 NP002458.2의 서열과 적어도 40%∼100% 동일한, 예를 들어, 적어도 40%, 45%. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 90%, 91%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 약 40%∼약 100% 내의 임의의 다른 비율로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Myc 폴리펩티드는 NCBI 수탁 번호 NP002458.2의 서열과 적어도 50%∼100% 동일한, 예를 들어, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 90%, 91%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 약 50%∼약 100% 내의 임의의 다른 비율로 동일한 40개 이상의 아미노산 길이의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, Myc 폴리펩티드는 NCBI 수탁 번호 NP002458.2의 서열과 적어도 50%∼100% 동일한, 예를 들어, 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 90%, 91%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 약 50%∼약 100% 내의 임의의 비율로 동일한 40개 이상의 아미노산 길이의 폴리펩티드 서열을 포함하며, 상기 Myc 폴리펩티드는 세포 생존, 세포 불멸성, 세포 성장 및/또는 세포 증식을 촉진한다. 또한, 본원에서 사용되는 바와 같이 발암 펩티드의 기능은 세포 생존, 세포 불멸성, 세포 성장 및/또는 세포 증식의 촉진 중 하나 이상을 말한다. 본원에 개시된 몇 가지 실시형태에서, Myc은 발암 펩티드 기능을 갖는 발암 펩티드의 예시적인 예로서 사용된다. 본원에 개시된 이러한 실시형태에서, 상기 Myc은 경우에 따라 세포 생존, 세포 불멸성, 세포 성장 및/또는 세포 증식을 촉진하는 임의의 적절한 발암 펩티드, 이의 유사체, 동족체, 또는 단편으로 대체된다.
"MYC"은 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 코딩하는 핵산을 말한다.
MYC 유전자는 NCBI 수탁 번호 NM_002467의 서열과 적어도 60%∼100% 동일하거나 상동성인, 예를 들어, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 90%, 91%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 약 70%∼약 100% 내의 임의의 다른 비율로 동일한 120개 이상의 뉴클레오티드로 된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
"Myc-ER"은 에스트로겐 수용체(ER)의 변형된 호르몬 결합 도메인에 융합된 Myc 펩티드를 말한다. 4-하이드록시타목시펜 또는 다른 에스트로겐 유사체에 노출될 경우, 상기 Myc-ER 폴리펩티드는 세포의 핵으로 전치되도록 유도된다.
"Myc-ER"은 Myc-ER 폴리펩티드를 코딩하는 이식 유전자를 말한다.
"Myc-GR"은 글루코코티코이드 수용체(GR)의 변형된 호르몬 결합 도메인에 융합된 Myc 펩티드를 말한다.
"MYC-GR"은 Myc-GR 폴리펩티드를 코딩하는 이식 유전자를 말한다.
두 핵산 또는 두 아미노산 서열의 상동성 비율(%)을 측정하기 위해, 서열을 최적 비교 목적으로 정렬시킬 수 있다(예를 들어, 제2 아미노산 서열 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열 내에 갭을 도입함). 그 후, 해당 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교할 수 있다. 제1 서열의 위치를 제2 서열의 해당 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 차지할 경우, 그 분자들은 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 상동성 비율(%)은 서열이 공유하는 동일 위치의 수와 상관관계에 있다(즉, 동일성 비율(%) = 동일 위치 수/위치의 총수(예를 들어, 중복 위치) × 100). 일부 실시형태에서, 상기 두 서열은 동일한 길이를 갖는다.
두 서열 간의 상동성 비율(%)을 측정하기 위해, 문헌[Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된 문헌[Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리즘이 사용된다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 도입된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 본원에 기재 또는 개시된 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 점수 = 100, 워드 길이= 12로 수행된다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수 = 50, 워드 길이 = 3로 수행된다. 비교 목적을 위해 갭이 있는 정렬을 얻기 위해서는, 문헌[Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 Gapped BLAST를 이용한다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용된다. 추가적인 상세사항은 국립 생명공학 정보 센터의 웹사이트(World Wide Web at ncbi.nlm.nih.gov)를 참조할 수 있다. 본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 단백질은 또한 본원에 기재된 임의의 단백질의 아미노산 서열과 비교할 때 1∼15개 아미노산의 변경, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 변경된 아미노산 서열은 본원에 기재된 임의의 단백질 억제제의 아미노산 서열과 적어도 75% 동일하며, 예를 들어, 77%, 80%, 82%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 이러한 서열 변이체 단백질은, 변경된 아미노산 서열이 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 기능을 나타내기에 충분한 생물학적 활성을 유지하는 한, 본원에 기재된 방법에 적합하다. 아미노산 치환이 이루어질 경우, 이 치환은 보존적 아미노산 치환이어야 한다. 일반 아미노산 중에서, 예를 들어, "보존적 아미노산 치환"은 이하의 각각의 그룹 내의 아미노산 간의 치환으로 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신, (2) 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판, (3) 세린 및 트레오닌, (4) 아스파르테이트 및 글루타메이트, (5) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (6) 리신, 아르기닌 및 히스티딘. BLOSUM62 표는, 500개 이상의 관련 단백질 그룹의 고도로 보존된 영역을 대표하는, 단백질 서열 세그먼트의 약 2,000개의 국부적 다중 정렬로부터 유도된 아미노산 치환 매트릭스이다[Henikoff et al (1992), Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89:10915-10919]. 따라서, 상기 BLOSUM62 치환 빈도는, 일부 실시형태에서 본원에 기재 또는 개시된 아미노산 서열로 도입되는 보존적 아미노산 치환을 정의하는 데 사용된다. (전술한 바와 같이) 화학적 특성에만 기초하여 아미노산 치환을 디자인할 수도 있지만, "보존적 아미노산 치환"이란 표현은 바람직하게는 1보다 큰 BLOSUM62 값으로 표시되는 치환을 말한다. 예를 들어, 치환이 0, 1, 2 또는 3의 BLOSUM62 값을 특징으로 할 경우 아미노산 치환은 보존적이다. 이 시스템에 따르면, 바람직한 보존적 아미노산 치환은 1 이상(예를 들어, 1, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 하는 한편, 더 바람직한 보존적 아미노산 치환은 2 이상(예를 들어, 2 또는 3)의 BLOSUM62 값을 특징으로 한다.
용어 "발현"은 이하의 사건: (1) 세포 내에서의 (예를 들어, 전사에 의한) DNA 서열로부터의 RNA의 생성; (2) 세포 내에서의 (예를 들어, 스플라이싱, 에디팅, 5' 캡 형성 및/또는 3' 말단 형성에 의한) RNA 전사체의 프로세싱; (3) 세포 내에서의 RNA의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; (4) 세포 내에서의 폴리펩티드 또는 단백질의 번역후 변형; (5) 세포 표면 상에서의 폴리펩티드 또는 단백질의 제시; (6) 세포로부터의 폴리펩티드 또는 단백질의 분비 또는 방출 중 하나 이상을 말한다.
용어 "과발현"은 동일 세포 내에서의 동일한 폴리펩티드 또는 단백질의 내인적 발현 수준과 비교할 때 더 높은 발현 수준을 말한다. 특정 경우, "과발현"은 폴리펩티드의 재조합 발현을 의미한다. 일부 실시형태에서, 더 높은 발현 수준은 2%∼200% 또는 그 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 더 높은 발현 수준은 2배∼1,000배 더 높은 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 더 높은 발현 수준은 2배∼1,000배 더 높은 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 더 높은 발현 수준은 2배∼10,000배 더 높은 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 더 높은 발현 수준은 이전에 검출 불가능하였던 발현 수준과 비교할 때 검출 가능한 발현 수준을 포함한다. 일부 실시형태에서, "과발현"은 이종성 폴리펩티드 또는 단백질의 임의의 검출 가능한 수준을 말한다.
"MYC의 과발현"이란 어구는 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드)) 또는 다른 펩티드에 융합된 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))의 과발현을 말한다. 일부 실시형태에서, "MYC의 과발현"은 MYC-ER의 과발현을 말한다. 일부 실시형태에서, "MYC의 과발현"은 MYC-GR의 과발현을 말한다. 일부 실시형태에서, "MYC의 과발현"은 Myc의 DNA 결합 도메인을 포함하는 Myc-폴리펩티드 단편의 과발현을 말한다. 일부 실시형태에서, "MYC의 과발현"은 Myc의 DNA 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 과발현을 말한다.
용어 "항체" 및 항체들"은 단일클론 항체, 다클론 항체, 이특이적 항체, 다특이적 항체, 그래프팅 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화 항체, 단일쇄 Fv(scFv), 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 디설파이드 결합 Fv(sdFv), 인트라바디 및 항이디오타입(항Id) 항체 및 상기에 기재한 것 중 임의의 것의 항원 결합성 단편을 말한다. 특히, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역 활성 단편, 즉, 항원 결합 부위를 포함하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스이다. 용어 "항체" 및 면역글로불린은 최광의의 의미로 상호 교환하여 사용될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 입체배치는 당업계에 잘 알려져 있다. 일부 실시형태에서, 항체는, 항체와 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 결합에 의해 형성된, 큰 분자의 일부이다.
폴리펩티드 또는 단백질, 예를 들어 항체와 관련하여 사용되는 "유도체"란 용어는 아미노산 잔기 치환, 결실 또는 부가의 도입에 의해 변경된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 또는 단백질을 말한다. 용어 "유도체"는 또한 변형된, 즉, 임의의 유형의 분자의 항체에의 공유 결합에 의해 변형된 폴리펩티드 또는 단백질을 말한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 또는 단백질은, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, PEG화, 인산화, 아미드화, 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질에의 결합 등에 의해 변형된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 또는 단백질의 유도체는 특이적 화학적 절단, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 대사적 합성 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 적절한 기법을 이용하여 제조한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 또는 단백질의 유도체는 이것이 유래된 폴리펩티드 또는 단백질과 유사한 또는 동일한 기능을 보유한다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "완전한 항체"는 본원에서 상호 교환하여 사용될 수 있으며, 실질적으로 온전한 형태의 항체를 의미하고 하기에 정의된 것과 같은 항체 단편을 의미하지는 않는다. 이들 용어는 특히 중쇄가 Fc 영역을 포함하는 항체를 말한다. 일부 실시형태에서, 본원에 제공된 항체 변이체는 전장 항체이다. 일부 실시형태에서, 상기 전장 항체는 인간, 인간화, 키메라 및/또는 친화성 성숙 항체이다.
"친화성 성숙" 항체는 변경(들)을 갖지 않는 모 항체와 비교할 때 항원에 대한 항체의 친화성을 개선시키는 하나 이상의 CDR에 있어서의 하나 이상의 변경을 갖는 항체이다. 바람직한 친화성 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화성을 갖는다. 친화성 성숙 항체는 적절한 절차에 의해 제조된다. 예를 들어, 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인 셔플링에 의한 친화성 성숙을 기재하는 문헌[Marks et al., (1992) Biotechnology 10:779-783]을 참조할 수 있다. CDR 및/또는 골격구조 잔기의 무작위 돌연변이 유발에 대해서는, 예를 들어 문헌[Barbas, et al., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813]; 문헌[Shier et al., (1995) Gene 169 :147-155]; 문헌[Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004]; 문헌[Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9]; 및 문헌[Hawkins et al, (1992), J. Mol. Biol. 226 :889-896]에 기재되어 있다.
용어 "결합성 단편", "항체 단편" 또는 "항원 결합성 단편"은 본 명세서 및 특허청구범위의 목적을 위해 본원에서 온전한 항체 분자의 일부분 또는 단편(여기서, 상기 단편은 항원 결합 기능을 보유함)을 의미하는 것으로 사용된다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fd' 및 Fv 단편, 다이아바디, 선형 항체[Zapata et al. (1995) Protein Eng. 10: 1057], 단일쇄 항체 분자, 단일쇄 결합 폴리펩티드, scFv, 2가 scFv, 3가 scFv 및 항체 단편으로부터 형성된 이특이적 또는 다특이적 항체를 포함한다.
"Fab" 단편은 일반적으로, 항체의 파파인 분해에 의해, 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는 2개의 동일한 항원 결합성 단편과 나머지 "Fc" 단편이 만들어지는 것에 의해 생성된다. 펩신 처리에 의하면 항원을 가교 결합시킬 수 있는 2개의 항원 결합 결합 부위를 갖는 F(ab')2 단편이 생성된다. "Fv"는 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이중쇄 Fv 종에서는, 이 영역이 강하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 단일쇄 Fv(scFv) 종에서는, 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인이 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 결합되어 경쇄와 중쇄가 이중쇄 Fv 종의 구조와 유사한 "이량체" 구조로 회합된다. 이 구성에서는, 각각의 가변 도메인의 3개 CDR이 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면에 항체 결합 특이성을 부여한다. 모두 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만 포함하는 Fv의 절반)이라도 항원을 인식하여 결합하는 능력을 지니며, 다만, 일반적으로 전체 결합 부위보다 낮은 친화력으로 결합한다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab 단편은 항체 힌지 영역 유래의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇 개 잔기가 부가된 것에 의해 Fab' 단편과 다르다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 갖는 Fab'을 말한다. F(ab')2 항체 단편은 처음에 힌지 시스테인이 사이에 삽입되어 있는 Fab' 단편쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 적합하다. 단일클론 Ab로부터 다양한 단편을 생성하는 방법으로는, 예를 들어 문헌[Pluekthun, 1992, Immunol. Rev. 130:152-188]에 기재된 방법을 포함한다.
용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 얻은 항체를 말하며, 즉, 이 집단을 구성하는 개별 항체들은 가능한 자연 발생 돌연변이가 미량으로 존재할 수 있다는 것을 제외하고는 동일하다. 일부 실시형태에서, 단일클론 항체는, 예를 들어, 문헌[Koeler and Milstein (1975) Nature 256 :495]에 처음 기재된 하이브리도마법에 의해 제조되거나, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 재조합법에 의해 제조된다. 일부 실시형태에서, 단일클론 항체는 문헌[Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 및 문헌[Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기법을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리된다.
본원에서의 항체는 인간에 있어서는 면역원성이 더 적도록 만들기 위한 임의의 수단에 의해 변경된 항체를 포함하여 단일클론 항체, 다클론 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 이특이적 항체, 그래프팅 항체, 인간 항체 및 이들의 단편을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본원에서 단일클론 항체 및 단편 등은 "키메라" 항체 및 "인간화" 항체를 포함한다. 일반적으로, 키메라 항체는, 이것이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 해당 서열과 동일하거나 이와 상동성인 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분을 포함하는 한편, 상기 쇄(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 해당 서열과 동일하거나 이에 상동성이다[미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al. Proc. Natl Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984)]. 예를 들어 일부 실시형태에서, 키메라 항체는 마우스 유래의 가변 영역과 인간 유래의 불변 영역을 포함하며, 이때 상기 불변 영역은 인간 IgG2 및 인간 IgG4 둘 다에 상동성인 서열을 포함한다. "키메라" 항체 등을 제조하기 위한 다수의 방법이 당업계에 공지되어 있다. 비인간(예를 들어, 쥐과동물) 항체의 "인간화" 형태 또는 단편은 비인간 면역글로불린 유래의 서열을 최소로 포함하는 키메라 면역글로불린, 면역글로불린쇄 또는 이들의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합성 부분서열)이다. 인간화 항체는, 비인간 동물 항체로부터 유래된 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열의 일부 또는 전부가 본래의 비인간 항체의 원하는 결합 특이성 및/또는 친화성을 유지하면서 인간 항체의 적절한 위치로 그래프팅된 그래프팅 항체 또는 CDR 그래프팅 항체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상응하는 비인간 잔기가 인간 면역글로불린의 Fv 골격구조 잔기를 대체한다. 일부 실시형태에서, 인간화 항체는 수용자 항체에도 존재하지 않고 이식된 CDR 또는 골격구조 서열에도 존재하지 않는 잔기를 포함한다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개량하고 최적화하기 위해 실시된다. 일부 실시형태에서, 상기 인간화 항체는 하나 이상, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하며, 이때 CDR 영역 전부 또는 실질적으로 전부가 비인간 면역글로불린의 것에 해당하고 FR 영역 전부 또는 실질적으로 전부가 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 추가적인 상세사항에 대해서는, 예를 들어 문헌[Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986)]; 문헌[Reichmann et al., Nature 332: 323-329 (1988)]; 및 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)]을 참조할 수 있다. 항체를 "인간화"하기 위한 방법 등은 다수가 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 숙주 세포에 원하는 유전자를 도입(또는 다른 방식으로 제공)하고/하거나 숙주 세포에서 발현시키기 위해 적절한 수송체로서 사용되는 벡터를 의미하는 것으로 사용된다. 벡터의 예로는 플라스미드, 파지, 바이러스 및 레트로바이러스를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 적절한 벡터는 선별 마커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 적절한 벡터는 원하는 유전자의 클로닝을 촉진하기 위한 제한 부위를 포함하며, 일부 실시형태에서, 적절한 벡터는 진핵생물 또는 원핵생물 세포로 진입하고/하거나 여기에서 복제할 수 있는 능력을 포함한다.
다수의 발현 벡터 시스템이 경우에 따라 본원에 개시된 방법에 이용된다. 예를 들어, 제1 벡터류는 소 파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로바이러스(RSV, MMTV 또는 MOMLV) 또는 SV40 바이러스와 같은 동물 바이러스로부터 유래된 DNA 요소를 이용한다. 다른 벡터류는 내부 리보솜 결합 부위를 갖는 폴리시스트론 시스템의 사용을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이종성 DNA가 염색체로 통합된 세포를, 하나 이상의 선별 마커를 형질감염 숙주 세포에 도입(또는 다른 방식으로 제공)함으로써 선별한다. 일부 실시형태에서, 상기 선별 마커는 영양요구성 숙주에의 영양요구성, 살생물제 내성(예를 들어, 항생제) 또는 구리 등의 중금속에 대한 내성을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 선별 마커 유전자는 발현시키고자 하는 DNA 서열에 직접 연결하거나 동시 형질전환에 의해 동일 세포로 도입한다. 일부 실시형태에서, 최적 전사를 위해 벡터로 추가적인 조절 요소를 도입한다. 조절 요소의 예로는 신호 서열, 스플라이스 신호 및 전사 프로모터, 인핸서 및 종결 신호를 들 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 핵산은 테트라사이클린 반응 요소를 포함하는 프로모터 및 rtTA(역 테트라사이클린 트랜스액티베이터) 또는 tTA(테트라사이클린 제어 트랜스엑티베이터)를 항상적으로 발현하는 이식 유전자를 포함한다. rtTA 단백질은 TRE에 결합하여 테트라사이클린, 독시사이클린 또는 이들의 유사체 존재 하에서만 전사를 활성화시킨다. 테트라사이클린, 독시사이클린 또는 이들의 유사체 존재 하에서 tTA 단백질은 TRE에 결합하여 전사를 억제한다. 테트라사이클린, 독시사이클린 또는 이들의 유사체 부재 하에 tTA는 전사를 허용한다.
용어 "에피토프"는 유기체, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에 있어서 항원성 또는 면역원성 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질의 단편을 말한다. 면역원성 활성을 갖는 에피토프는 동물에게서 항체 반응을 유발하는 폴리펩티드 또는 단백질의 단편이다. 항원성 활성을 갖는 에피토프는 임의의 공지된 방법에 의해, 예를 들어 면역분석에 의해 측정할 때 항체가 면역특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 단백질의 단편이다. 항원성 에피토프가 반드시 면역원성일 필요는 없다.
항체 또는 다른 결합성 분자와 단백질 또는 폴리펩티드 또는 에피토프 간의 상호작용을 말할 때 "특이적으로 결합한다"란 어구는 일반적으로 관심있는 표적을 인식하여 이에 대해 높은 친화력으로 검출 가능하게 결합하는 항체 또는 다른 결합성 분자를 말한다. 바람직하게는, 지정된 또는 생리학적 조건 하에, 규정된 항체 또는 결합 분자는 특정 폴리펩티드, 단백질 또는 에피토프에 결합하지만, 샘플 중에 존재하는 다른 분자에는 유의적인 또는 바람직하지 않은 양으로 결합하지 않는다. 다시 말해서, 규정된 항체 또는 결합성 분자는 비표적 항원 및/또는 에피토프와 바람직하지 않게 교차 반응하지 않는다. 특정 폴리펩티드와 면역반응성이고 원하는 특이성을 갖는 항체 또는 다른 결합성 분자를 선별하기 위해 다양한 면역분석 포맷이 이용된다. 예를 들어, 고상 ELISA 면역분석, BIAcore, 유세포 측정 및 방사성 면역분석이 원하는 면역활성 및 특이성을 갖는 단일클론 항체를 선별하는 데 이용된다. 면역반응성 및 특이성을 측정 또는 평가하는 데 이용되는 면역분석 포맷 및 조건에 관한 설명을 위해서는, 문헌[Harlow, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (이하, "Harlow")]을 참조할 수 있다.
"선택적 결합", "선택성" 등은 항체가 다른 분자와 비교하여 한 분자와 우선적으로 상호작용하는 것을 말한다. 바람직하게는, 항체, 특히 조절인자와 단백질 간의 상호작용은 특이적이면서 선택적이다. 일부 실시형태에서, 항체는 바람직하지 않은 다른 표적에는 결합하지 않은 채 2종의 구별되나 유사한 표적에 "특이적으로 결합하고", "선택적으로 결합하도록" 디자인된다.
세포 단백질과 관련하여 "내인성"이란 용어는 재조합 조작없이 자연 발생하고/하거나 세포에 의해 발현되는 단백질을 말하며, 따라서, "내인적으로 발현된 단백질" 또는 "내인성 단백질"이란 용어는 재조합 기법에 의해 발현된 세포 단백질을 배제한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 일겉는 것으로 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 이 용어들은 천연 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비천연 아미노산, 예를 들어, 아미노산 유사체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 이 용어는 전장 단백질(즉, 항원)을 비롯하여 임의의 길이의 아미노산쇄를 포함하며, 이때 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결된다.
용어 "발암 펩티드" 및 "발암 단백질"은 본원에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 발암 유전자 또는 원발암 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 잔기의 중합체, 이의 단편 또는 유사체를 말한다. 특정 경우, 발암 펩티드는 세포 생존 및/또는 세포 증식을 촉진한다.
용어 "아미노산"은 천연 아미노산 및 비천연 아미노산뿐만 아니라 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 말한다. 자연적으로 코딩되는 아미노산은 20개의 일반 아미노산(알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린)과 파이로리신 및 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체란 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소에 결합된 α 탄소, 카복실기, 아미노기 및 R 기를 갖는 물질로서, 예컨대 호모세린, 노르루신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 말한다. 이러한 유사체는 변형된 R기(예컨대, 노르루신) 또는 변형된 펩티드 골격을 가지지만, 천연 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다.
본원에서 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에서 권장하는 널리 알려진 3 문자 기호 또는 1 문자 기호로 기재된다. 뉴클레오티드 역시 널리 인정되는 단문자 코드로 기재된다.
용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오티드 및 이들의 중합체를 말한다. 특별히 한정하지 않는다면, 이 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함하는 핵산을 포함하며, 천연 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사된다. 특별히 달리 한정하지 않는다면, 이 용어는 또한 PNA(펩티도핵산), 안티센스 기술에 사용되는 DNA의 유사체(포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트 등)를 비롯한 올리고뉴클레오티드 유사체를 말한다. 달리 나타내지 않는다면, 특정 핵산 서열은 또한 이들의 보존적 변형 변이체(축퇴성 코돈 치환을 들 수 있으나 이에 한정되지 않음) 및 상보성 서열뿐만 아니라 명시적으로 나타낸 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 세 번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환되는 서열을 생성함으로써 얻는다[Batzer et al., Nucleic Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); 및 Cassol et al., (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)].
용어 "단리된" 및 "정제된"은 그 자연 환경으로부터 실질적으로 또는 본질적으로 제거되거나 농축된 물질을 말한다. 예를 들어, 단리된 핵산은 정상적으로는 그것의 측면에 위치하는 핵산 또는 샘플 중의 다른 핵산 또는 성분(단백질, 지질 등)의 적어도 일부로부터 분리된 것이다. 또 다른 예에서, 폴리펩티드는, 이것이 그 자연 환경으로부터 실질적으로 제거되거나 농축된다면 정제된 것이다. 핵산 및 단백질의 정제 및 단리 방법은 공지된 방법이다. "실질적으로"의 예는 20% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 75% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상을 포함한다.
"재조합 핵산"이란 어구는 하나 이상의 핵산의 결합 또는 삽입을 통해 조작되어, 자연에서 정상적으로는 함께 존재하지 않는 서열을 결합한 핵산을 말한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 프로모터 또는 인핸서를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 제한 효소 부위를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 재조합 핵산은 돌연변이를 포함한다.
용어 "재조합 폴리펩티드"는 재조합 핵산으로부터 생성된 폴리펩티드를 말한다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 폴리펩티드는 Myc 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 폴리펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 융합 펩티드이다.
용어 "재조합 Myc 폴리펩티드"는 재조합 핵산으로부터 생성된 Myc 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 Myc 폴리펩티드는 Myc 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 Myc 폴리펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 융합 펩티드이다.
용어 "재조합 Myc 활성"은 세포의 핵 내에 위치한 DNA에 재조합 Myc 폴리펩티드가 결합한 것을 말하며, 상기 재조합 Myc은 Myc 반응성 유전자의 전사 활성을 조절한다.
용어 "유전자 이식 동물"은 이식 유전자를 보유하는 동물을 말한다.
용어 "이식 유전자"는 유기체 게놈으로 도입된 이종성 유전자를 말한다.
용어 "유전자 조작된(유전적으로 변경된)"은 재조합 핵산을 포함하는 동물, 박테리아, 바이러스 또는 세포를 말한다.
용어 "자기 항원(self antigen)"은 동물, 조직 또는 세포 내에서부터 기원하는 항원을 말한다. 일부 실시형태에서, 자기 항원은 내인성 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 자기 항원은 내인성 레트로바이러스에 의해 생성된 내인성 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 자기 항원은 신 자기 항원, 미생물 또는 기생충이 코딩하는 신 자기 항원, 또는 동물 또는 세포에의 유전적 변경으로 인해 발현된 다른 신 자기 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 마우스는 신 자기 항원을 발현한다.
용어 "자가 항원(auto antigen)"은 자기 항원의 에피토프 또는 자기 항원의 것을 모방한 면역 반응성 에피토프를 포함하는 항원을 말한다. 일부 실시형태에서, "자가 항원"이란 용어는 자가 항체를 생성시키는 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 자가 항원은 내인성 항원이 기원한 동물이 선택된 항원에 대해 면역 내성이거나 면역 내성이었던 적이 있는 내인성 항원을 포함한다.
용어 "신 자기 항원(neo-self antigen)"은 레트로바이러스의 사용을 통해 유기체로 도입된 항원을 말한다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스는 줄기 세포에서 단백질을 과발현시키는 데 사용되며, 이들 세포는 유기체로 이식된다. 일부 실시형태에서, 상기 단백질은 키메라의 동물 면역계에 의해 자기 항원으로서 인식된다.
용어 "Myc 활성"은 세포의 핵 내 DNA에 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))가 결합하는 것을 말하며, 이때 Myc은 Myc 반응성 유전자의 전사 활성을 조절한다. 일부 실시형태에서, Myc 활성은 세포 증식 및/또는 항체 생산을 유도한다.
용어 "Myc의 활성화" 및 "Myc 활성화"는 Myc 활성의 유도를 말한다. 일부 실시형태에서, Myc의 활성화는 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))의 과발현에 의해 유도된다. 일부 실시형태에서, Myc의 활성화는 세포의 핵 내로의 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))의 수송에 의해 유도된다. 일부 실시형태에서, Myc의 활성화는 세포로의 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))의 수송에 의해 유도된다.
용어 "TRE"는 테트라사이클린 반응 요소를 말한다.
용어 "불멸"은 전체 집단의 생존력 손실을 최소화하면서 여러 세대에 걸친 배양 과정에서 증식할 수 있는 세포의 능력을 말한다. 일부 실시형태에서, 불멸 세포는 형질전환 세포로 간주된다. 일부 실시형태에서, 불멸 세포는 악성으로 간주된다. 일부 실시형태에서, 불멸 B 세포는 림프종으로 칭해진다. 유전적 변경, 돌연변이, 변형 또는 바이러스 감염 부재 하에, 천연 1차 세포 및 1차 B 세포는, 일부 실시형태에서, 불멸이 아니며 몇 대의 계대 배양 후 생존력을 상실하고 만다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "제노마우스"는 하나 이상의 비천연 유전자를 발현하도록 유전자 조작된 마우스를 의미한다. 일부 실시형태에서, 제노마우스는 인간 항체를 생성하도록 유전자 조작된 것이다.
"수송체 펩티드" 및 "펩티드 전달 도메인(PTD)"은 상호 교환 가능하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 이들 용어는 세포 및 조직으로의 펩티드 침투를 촉진하는 펩티드 서열을 의미한다. 일부 실시형태에서, 수송체 펩티드는 TAT이다. 일부 실시형태에서, 수송체 펩티드는 TAT[48-57]이다. 일부 실시형태에서, 수송체 펩티드는 TAT[57-48]이다. 일부 실시형태에서, 상기 수송체 펩티드는 HIV-Vpr, HSV-Vp22, 안테나페디아(antennapedia), 채리엇 시스템(chariot system), 또는 이들의 조합이다. 수송체 펩티드의 예에 대해서는, 미국 출원 제11/583,970호(공개 번호 2007-0116691)를 참조할 수 있으며, 그 개시 내용은 본원에서 참조 인용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "MYC 서열"은 MYC 아미노산 펩티드 서열이다. 일부 실시형태에서, MYC 펩티드는 완전 MYC 펩티드 서열이다. 일부 실시형태에서, MYC 펩티드는 부분 MYC 펩티드 서열이다. 일부 실시형태에서, MYC은 c-MYC이다. 일부 실시형태에서, MYC 펩티드 서열은 하기 서열을 포함한다:
항체 제조 방법
일부 실시형태에서, 본원은 발암 펩티드(예를 들어, MYC) 또는 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, TAT-Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포를 선택된 항원과 접촉시키는 단계를 포함하는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 세포 생존 및/또는 증식을 촉진하는 펩티드이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 조혈모세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 인간 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 인간 조혈모세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 그 세포 표면 상에 CD79를 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 퓨린 생합성을 위한 온전한 재이용 경로(salvage pathway)를 포함하며, 선택된 항원에 대해 관용성 또는 무력성이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 B 세포, B 세포 전구체 또는 선구체, 또는 조혈모세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 세포 생존 및/또는 증식을 촉진하는 펩티드이다.
특정 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 임의의 적절한 방법에 의해 선택된 항원과 접촉시킨다. 구체적인 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하며, 따라서 선택된 항원과 접촉한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원은 자기 항원이다.
B 세포 전구체 또는 선구체 또는 조혈모세포가 사용되는 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)의 B 세포로의 분화를 허용 또는 유도하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, MYC 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 B 세포 선택적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 B 세포 선택적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, B 세포 선택적 프로모터는, 비한정적인 예로서, Eμ 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 프로모터는, 비한정적인 예로서, 하나 이상의 TRE를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 MMTV 프로모터를 포함한다. 또한, 유도성 프로모터가 하나 이상의 TRE를 포함하는 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 리간드에 결합될 때 발암 펩티드 활성(예를 들어, 세포 생존 및/또는 증식)을 활성화시키는 수용체를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 수용체는 에스트로겐 수용체(ER)이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER 융합 펩티드이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR 융합 펩티드이다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 수용체를 포함하는 융합 펩티드인 재조합 발암 펩티드를 포함하는 세포를 수용체에 결합하는 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 Myc-ER 융합 펩티드를 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 에스트로겐 수용체 조절인자(예를 들어, ER 작용제 또는 길항제)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 Myc-GR 융합 펩티드를 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 글루코코티코이드 수용체 조절인자(예를 들어, GR 작용제 또는 길항제)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 (a) 수송체 펩티드 서열(예를 들어, TAT); 및 (b) MYC 서열(예를 들어, c-MYC)을 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 펩티드는 식 (I):
수송체 펩티드 서열-MYC 서열
의 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 (a) 수송체 펩티드 서열; (b) MYC 서열; 및 (c) 상기 수송체 펩티드 서열과 상기 MYC 서열을 연결하는 하나 이상의 분자(즉, "X")를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 펩티드는 식 (II):
수송체 펩티드 서열-X-MYC 서열
의 펩티드이며, 여기서 -X-는 상기 수송체 펩티드 서열와 상기 MYC 서열을 연결하는 분자이다. 일부 실시형태에서, -X-는 아미노산이다. 일부 실시형태에서, -X-는 하나 이상의 아미노산이다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내에서 MYC 발현, Myc 활성, 또는 이들의 조합을 유도하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 증식시키거나 증식을 유도하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 적어도 림프종(예를 들어, B 세포 림프종)이 형성될 때까지 증식시킨다. 일부 실시형태에서, 증식하는 세포는 림프종 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 (예를 들어, 합당한 기간 동안 유의량 또는 치료량의 항체를 생성하기에 충분한 세포 집단을 제공하기 위해), 증식 전에, 예를 들어 골수종과의 융합을 필요로 하지 않고/않거나 골수종과 융합시키지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 생성된 항체는 가용성이며 막 결합형이 아니다.
일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)(예를 들어, 포유동물 세포)는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 특정 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 유전자 이식 발암 펩티드 서열(예를 들어, MYC)을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 유전자 이식 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 tTA펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 MMTV 프로모터를 포함한다.
특정 실시형태에서, Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 포함하는 세포를 접촉시키는 단계는 임의의 적절한 방식에 의해 선택된 항원을 유기체(예를 들어, 포유동물)로 도입하는 것(또는 다른 방식으로 제공하는 것)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 특정 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 선택된 항원을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 Myc 펩티드의 tTA 의존적 발현을 억제하기 위해 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 유기체(예를 들어, 포유동물)에 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 유전자 이식 MYC 유전자의 tTA 의존적 발현을 억제하기에 충분한 기간 동안 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 유기체(예를 들어, 포유동물)에 제공하는 단계; 및 상기 기간 후에, 유전자 이식 MYC의 tTA 의존적 발현을 유도하기 위해 상기 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 유기체(예를 들어, 포유동물; 예를 들어, 제노마우스)로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 세포(예를 들어, B 세포)를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)(예를 들어, B 세포)로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원은 세포를 선택된 항원 및 발암 펩티드(예를 들어 Myc)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 세포 생존 및/또는 증식을 촉진하는 펩티드이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 조혈모세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 인간 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 인간 조혈모세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 그 세포 표면 상에 CD79를 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 퓨린 생합성을 위한 온전한 재이용 경로를 포함하며, 선택된 항원에 관용성 및/또는 무력성이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 B 세포, B 세포 전구체 또는 선구체, 또는 조혈모세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 세포 생존 및/또는 증식을 촉진하는 펩티드이다.
특정 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 임의의 적절한 방법으로 선택된 항원과 접촉시킨다. 구체적인 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하며, 따라서, 선택된 항원과 접촉한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다.
B 세포 전구체 또는 선구체 또는 조혈모세포가 사용되는 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)의 B 세포로의 분화를 허용 또는 유도하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 리간드와 결합할 때 발암 펩티드 활성(예를 들어, 세포 생존 및/또는 증식)을 활성화시키는 수용체를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 수용체는 에스트로겐 수용체(ER)이다. 일부 실시형태에서, 상기 수용체는 글루코코티코이드 수용체(GR)이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR 융합 펩티드이다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 수용체를 포함하는 융합 펩티드인 재조합 발암 펩티드를 포함하는 세포를 수용체에 결합하는 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 Myc-ER 융합 펩티드를 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 에스트로겐 수용체 조절인자(예를 들어, ER 작용제 또는 길항제)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 Myc-GR 융합 펩티드를 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 글루코코티코이드 수용체 조절인자(예를 들어, GR 작용제 또는 길항제)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 (a) 수송체 펩티드 서열(예를 들어, TAT); 및 (b) MYC 서열(예를 들어, c-MYC)을 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 펩티드는 식 (I):
수송체 펩티드 서열-MYC 서열
의 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 (a) 수송체 펩티드 서열; (b) MYC 서열; 및 (c) 상기 수송체 펩티드 서열과 상기 MYC 서열을 연결하는 하나 이상의 분자(즉, "X")를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 펩티드는 식 (II):
수송체 펩티드 서열-X-MYC 서열
의 펩티드이며, 여기서 -X-는 상기 수송체 펩티드 서열과 상기 MYC 서열을 연결하는 분자이다. 일부 실시형태에서, -X-는 아미노산. 일부 실시형태에서, -X-는 하나 이상의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 생성된 항체는 가용성이고 막 결합형이 아니다.
특정 실시형태에서, Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드, TAT-Myc 융합 펩티드)를 포함하는 세포를 접촉시키는 단계는 선택된 항원을 임의의 적절한 방식으로 유기체(예를 들어, 포유동물)에 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 특정 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원을 코딩하는 상기 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 선택된 항원을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 세포(예를 들어, B 세포)를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)(예를 들어, B 세포)로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원은 세포를 선택된 항원과 접촉시키는 단계로서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 과발현하는 것인 단계를 포함하는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 세포 생존 및/또는 증식을 촉진하는 펩티드이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 조혈모세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 인간 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 인간 조혈모세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 그 세포 표면 상에 CD79를 발현한다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 퓨린 생합성을 위한 온전한 재이용 경로를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열) 을 포함하는 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 퓨린 생합성을 위한 온전한 재이용 경로를 포함하며, 선택된 항원에 관용성 및/또는 무력성이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 B 세포, B 세포 선구체 또는 전구체, 또는 조혈모세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 세포 생존 및/또는 증식을 촉진하는 펩티드이다.
일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 특정 경우, Max-1 유전자 및/또는 폴리펩티드의 하향 조절은 MYC 원발암 유전자 및/또는 MYC 원발암 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 상향 조절한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 특정 경우, Mxi-1 유전자 및/또는 폴리펩티드의 하향 조절은 MYC 원발암 유전자 및/또는 MYC 원발암 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 상향 조절한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 특정 경우, MAD-1 유전자 및/또는 폴리펩티드의 하향 조절은 MYC 원발암 유전자 및/또는 MYC 원발암 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 발현을 상향 조절한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다.
특정 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 임의의 적절한 방법에 의해 선택된 항원과 접촉시킨다. 구체적인 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다.
B 세포 전구체 또는 선구체 또는 조혈모세포가 사용되는 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)의 B 세포로의 분화를 허용 또는 유도하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, MYC 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 B 세포 선택적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 B 세포 선택적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, B 세포 선택적 프로모터는, 비한정적인 예로서, Eμ 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 프로모터는, 비한정적인 예로서, 하나 이상의 TRE를 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 MMTV 프로모터를 포함한다. 또한, 유도성 프로모터가 하나 이상의 TRE를 포함하는 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 리간드와 결합할 때 발암 펩티드 활성(예를 들어, 세포 생존 및/또는 증식)을 활성화하는 수용체를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 수용체는 에스트로겐 수용체(ER)이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 수용체는 글루코코티코이드 수용체(GR)이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR 융합 펩티드이다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 수용체를 포함하는 융합 펩티드를 포함하는 세포를 상기 수용체에 특이적으로 결합하는 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 Myc-ER 펩티드를 포함하는 세포를 에스트로겐 수용체 조절인자(예를 들어, ER 작용제 또는 길항제)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 Myc-GR 펩티드를 포함하는 세포를 글루코코티코이드 수용체 조절인자(예를 들어, GR 작용제 또는 길항제)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 (a) 수송체 펩티드 서열(예를 들어, TAT); 및 (b) MYC 서열(예를 들어, c-MYC)를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 펩티드는 식 (I):
수송체 펩티드 서열-MYC 서열
의 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 (a) 수송체 펩티드 서열; (b) MYC 서열; 및 (c) 상기 수송체 펩티드 서열과 상기 MYC 서열을 연결하는 하나 이상의 분자(즉, "X")를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 펩티드는 식 (II):
수송체 펩티드 서열-X-MYC 서열
의 펩티드이며, 여기서 -X-는 상기 수송체 펩티드 서열과 상기 MYC 서열을 연결하는 분자이다. 일부 실시형태에서, -X-는 아미노산이다. 일부 실시형태에서, -X-는 하나 이상의 아미노산이다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에서 MYC 발현, Myc 활성, 또는 이들의 조합을 유도하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 증식시키거나 증식을 유도하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 적어도 림프종(예를 들어, B 세포 림프종)이 형성될 때까지 증식시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 증식하는 세포는 림프종 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 (예를 들어, 합당한 기간 동안 유의량 또는 치료량의 항체를 생성하기에 충분한 세포 집단을 제공하기 위해), 증식 전에, 예를 들어 골수종과의 융합을 필요로 하지 않고/않거나 골수종과 융합시키지 않는다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 생성된 항체는 가용성이며 막 결합형이 아니다. 일부 실시형태에서, 생성된 항체는 막 결합형이다. 일부 실시형태에서, 생성된 항체는 세포내 항체이다.
일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 특정 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 발암 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 MMTV 프로모터를 포함한다.
특정 실시형태에서, MYC(예를 들어, 유전자 이식 MYC)를 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 접촉시키는 단계는 선택된 항원을 임의의 적절한 방식으로 유기체(예를 들어, 포유동물)에 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 선택된 항원을 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)의 tTA 의존적 발현을 억제하기 위해, 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)에 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 (a) Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)의 tTA 의존적 발현을 억제하기에 충분한 기간 동안 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)에 제공하는 단계; 및 (b) 상기 기간 후에, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)의 tTA 의존적 발현을 유도하기 위해 상기 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 세포(예를 들어, B 세포)를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)(예를 들어, B 세포)로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 본원은 선택된 항원을 유기체(예를 들어, 포유동물)로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계로서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)가 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하고, 코딩된 발암 펩티드의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함하는 것인 단계를 포함하는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다.
일부 실시형태에서, 본원은
a. 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 세포(예를 들어, B 세포)를 제공하는 단계로서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 또는 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 것인 단계; 및
b. 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에서 상기 발암 펩티드의 활성을 유도하는 단계
를 포함하는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 세포를 상기 선택된 항원과 접촉시켜 조제한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 선택된 항원에 특이적으로 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 특정 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 B 세포, B 세포 전구체 또는 선구체, 또는 조혈모세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포는 무력성 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 그 세포 표면 상에 CD79를 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포는 마우스 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포; 예를 들어, B 세포)는 선택된 항원이 투여된(즉, 접종된 또는 그에 대해 면역화된) 유기체(예를 들어, 포유동물; 예를 들어, 제노마우스)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 또는 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, MYC 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 B 세포 선택적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 B 세포 선택적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, B 세포 선택적 프로모터는, 비한정적인 예로서, Eμ 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 프로모터는, 비한정적인 예로서, 하나 이상의 TRE를 포함한다.
B 세포 전구체 또는 선구체 또는 조혈모세포가 사용되는 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)의 B 세포로의 분화를 허용 또는 유도하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 발암 펩티드의 활성은 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 집단의 증식을 유도한다.
일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)(예를 들어, B 세포)는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재하고, 세포(예를 들어, 포유동물 세포)(예를 들어, B 세포)에서의 상기 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 활성의 유도는 생체 내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 또는 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)을 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드 또는 상기 발암 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)을 생체 외에서 세포(예를 들어, 포유동물 세포)로 도입하고, 그 후 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 유기체(예를 들어, 포유동물)로 도입한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 방법은 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 생체 외에서 세포(예를 들어, B 세포)로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)는 단백질 전달 도메인, 예를 들어, HIV-1 Tat 또는 Vpr(예를 들어, Tat-Myc 또는 Vpr-Myc)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 발암 펩티드의 활성을 유도하는 것은 상기 발암 펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 발현을 유도하는 것, 상기 발암 펩티드의 활성을 유도하는 것, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 경우, 상기 발암 펩티드의 활성을 유도하는 것은 상기 발암 펩티드의 과발현을 유도하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드의 유도성 발현 또는 과발현은 발암 펩티드의 발현을 유도하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)의 유도성 프로모터를 활성화시키는 것에 의해 이루어진다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다.
특정 실시형태에서, 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 상기 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 예를 들어, B 세포 선택적 프로모터 또는 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 구체적 실시형태에서, 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 특정한 구체적인 실시형태에서, 발암 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 Myc 펩티드에 대한 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 프로모터는 하나 이상의 TRE를 포함하고, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 추가로 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 tTA 펩티드를 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 유도에 의해 활성화되는 융합 펩티드이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 조절될 때(즉, 작용제 또는 길항제와 같은 리간드에 결합될 때) 발암 펩티드의 생존 및/또는 증식 특성을 활성화시키는 수용체를 포함하는 융합 펩티드이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)는 에스트로겐 수용체(예를 들어, Myc-ER)를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내에서 발암 펩티드의 활성을 유도하는 것은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 ER 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 상기 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)는 글루코코티코이드 수용체(예를 들어, Myc-GR)를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내에서 상기 발암 펩티드의 활성을 유도하는 것은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 GR 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 (a) 수송체 펩티드 서열(예를 들어, TAT); 및 (b) MYC 서열(예를 들어, c-MYC)를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 펩티드는 식 (I):
수송체 펩티드 서열-MYC 서열
의 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 (a) 수송체 펩티드 서열; (b) MYC 서열; 및 (c) 상기 수송체 펩티드 서열과 상기 MYC 서열을 연결하는 하나 이상의 분자(즉, "X")를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 펩티드는 식 (II):
수송체 펩티드 서열-X-MYC 서열
의 펩티드이며, 여기서 -X-는 상기 수송체 펩티드 서열과 상기 MYC 서열을 연결하는 분자이다. 일부 실시형태에서, -X-는 아미노산이다. 일부 실시형태에서, -X-는 하나 이상의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 또는 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포; 예를 들어, B 세포)는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체에 항원을 투여하여(즉, 항원에 대해 면역화하거나 항원을 접종하여) 선택된 항원에 대한 면역 반응을 유발하도록 한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체를 임의의 적절한 방식으로 상기 선택된 항원에 노출시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원을 면역보강제와 함께 투여한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 담체에 공유 결합된다. 담체의 예로는 소 혈청 알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌, 난알부민 및 티로글로불린을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 사용되는 세포 또는 유기체는 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 유도에 의해 과발현하고 항원을 발현하도록 조작된 것들을 포함한다. 이러한 세포 및 유기체는, 비한정적인 예로서, 골수 조혈모세포의 레트로바이러스 매개 형질도입, 유전자 이식 유기체의 생산(또는 상기 발암 펩티드 과발현 유기체와 상기 선택된 항원 발현 유기체의 교잡), 또는 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 또는 유기체로의 유전자 전달을 위한 임의의 다른 방법을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 제조한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 또는 유기체를 항체 생성이 필요할 때까지 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)가 과발현되지 않는 조건 하에 유지하는 것이 바람직하다. 일부 실시형태에서, 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 또는 유기체를 항체 생성이 필요할 때까지 발암 펩티드 활성의 유도되지 않는 조건 하에 유지하는 것이 바람직하다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 또는 유기체를, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포; 예를 들어, B 세포) 내에서 발암 펩티드가 과발현되는 조건 하에 유지한다.
일부 실시형태에서, 이종성 항원, 자기 항원 또는 자가 항원에 특이적인 B 세포는 상기 이종성 항원, 자기 항원, 또는 자가 항원에 관용성이다. 일부 실시형태에서, 관용성 B 세포에서의 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 활성의 유도는 항원에 대한 관용성을 파괴하고 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 생산을 유도한다. 일부 실시형태에서, 관용성 B 세포는 항원에 대해 무력성이다. 일부 실시형태에서, 관용성 B 세포는 자가 항원 또는 자기 항원과 면역학적으로 유사한 항원에 대해 무력성이다. 일부 실시형태에서, 관용성 B 세포는 이종성 항원인 항원에 대해 관용성이다. 일부 실시형태에서, 상기 이종성 항원은 자가 항원 또는 자기 항원에 대해 상동성이다. 일부 실시형태에서, MYC 과발현에 의해 생산된 상기 선택된 항원 특이적 B 세포를 상기 유기체로부터 회수해서 클로닝하여, 골수종 파트너에의 세포 융합의 필요성 없이 B 세포 생산 불멸 항체를 생산한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다.
구체적인 실시형태에서, 본원은
a. 항원에 대해 관용성인 B 세포를 제공하는 단계; 및
b. 상기 선택된 항원에 대해 관용성인 B 세포에서 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 활성을 유도하는 단계
를 포함하는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다. 특정 실시형태에서, 발암 펩티드 활성의 유도는 상기 B 세포 집단의 증식을 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 재조합 B 세포의 증식에 의해 생성된 복수의 재조합 B 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 본원은 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)에 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 복수의 조혈모세포(예를 들어, 재조합 조혈모세포)를 투여하는 단계; 및 선택된 항원을 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다.
특정 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 유도에 의해 활성화된다(예를 들어, 유도에 의해 발현되거나 또는 유도에 의해 기능이 활성화된다). 특정 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 수용체를 포함하는 융합 펩티드이고, 상기 발암 펩티드의 기능은 수용체(예를 들어, 작용제 또는 길항제와 같은 리간드로)를 조절하거나 이에 결합하는 것에 의해 유도에 의해 활성화된다. 구체적인 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 구체적인 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다. 추가적인 실시형태에서, 상기 방법은 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)에서 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 활성을 유도하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 예를 들어, Myc-ER의 경우, Myc 활성은 경우에 따라 에스트로겐 수용체 리간드를 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)에 투여하는 것에 의해 유도하거나; 하나 이상의 TRE를 포함하는 유도성 프로모터를 갖는 MYC 핵산 서열의 경우, Myc 활성은 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)에 투여하는 것에 의해 유도하거나; 또는, Myc-GR의 경우, Myc 활성은 글루코코티코이드 수용체 리간드를 상기 면역결핍 유기체에 투여하는 것에 의해 유도된다.
일부 실시형태에서, 상기 조혈모세포는 아폽토시스를 억제하는 폴리펩티드(예를 들어, Bcl-2, Bcl-x, Mcl-1)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 복수의 조혈모세포가 B 세포로 분화되도록 유도하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 복수의 B 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 또는 상기 항체를 발현하는 복수의 B 세포로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 발암 펩티드를 코딩하는 상기 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 발암 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 하나 이상의 TRE를 포함하는 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조혈모세포는 tTA 또는 rtTA를 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 tTA 의존적 트랜스 활성화를 억제하기 위해 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)에 제공하는 단계; 및 tTA 의존적 트랜스 활성화를 유도하기 위해 상기 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포 선택적 프로모터는 Eμ 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 유기체(예를 들어, 포유동물)에 방사선을 조사하여 얻는다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 Rag-1ko, Rag-2, SCID, DNA-PK, Ku70, Ku80, XRCC4, 또는 μMT 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다.
특정 실시형태에서, 상기 선택된 항원을 임의의 적절한 방법에 의해 상기 유기체에 투여한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 면역결핍 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 면역결핍 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 면역결핍 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 상기 선택된 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원을 발현하는 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 상기 선택된 항원을 코딩하는 이종성 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원을 핵산 발현 벡터에 의한 형질감염 또는 재조합 바이러스 발현 벡터에 의한 감염에 의해 도입한다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 바이러스 발현 벡터는 재조합 렌티바이러스이다. 특정 실시형태에서, 상기 항체는 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다.
일부 실시형태에서, MYC을 과발현하는 조혈모세포를 면역결핍 유기체의 말초 림프계 기관을 재구성하는 데 사용한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체는 치사적 방사선 조사에 의해 면역결핍으로 만든다. 일부 실시형태에서, 면역결핍 유기체는 치사적으로 방사선 조사된 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체는 임의의 면역결핍 또는 면역손상 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 동물은 Rag-1 넉아웃(knock out), Rag-2, SCID, DNA-PK, Ku70, Ku80, XRCC4, 또는 μMT 마우스이다. 면역결핍 동물의 말초 림프계 기관은 일반적으로 조혈모세포 이식 후 8∼12 주 내에 재구성한다. 일부 실시형태에서, MYC을 과발현하는 조혈모세포로 재구성된 유기체를 상기 선택된 항원을 발현하도록 추가적으로 유전자 조작한다. 일부 실시형태에서, MYC을 과발현하는 조혈모세포로 재구성된 유기체에 상기 선택된 항원을 투여한다(즉, 이 항원으로 면역화하거나 이 항원을 접종함).
일부 실시형태에서, B 세포 집단(예를 들어, AN1/T3과 같은 무력성 B 세포)을 조혈모세포로 재구성된 유기체로부터 단리하여 본원에 기재된 임의의 방법에 사용한다. 일부 실시형태에서, 면역결핍 유기체의 말초 조혈 기관을 재구성하는 MYC을 과발현하는 조혈모세포를 상기 선택된 항원에 노출시켜 항원 특이적 AN1/T3 세포 집단을 발생시킨다. 일부 실시형태에서, 이들 세포에서의 Myc 활성의 유도는 항원 특이적 불멸 B 세포를 생성한다.
본원에서 사용되는 조혈모세포는 임의의 적절한 방법에 의해 조제한다. 일부 실시형태에서, 조혈모세포를 Myc을 과발현하는 유기체로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 조혈모세포를 항원 특이적 B 세포 집단을 포함하는 유기체로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, 조혈모세포를 항원 결합 B 세포 집단을 포함하는 유기체로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, 조혈모세포를 항원 특이적 AN1/T3 세포 집단을 포함하는 유기체로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, 조혈모세포를 항원 특이적 무력성 B 세포 집단을 포함하는 유기체로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, 조혈모세포를 야생형 유기체로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 마우스(예를 들어, 유전자 이식 마우스 또는 유전자 조작 마우스)이다. 일부 실시형태에서, 장기(long term) 조혈모세포로 농축시키기 위해 유기체를 5FU로 처리하고, 생체 내에서의 그 증식을 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 마우스)를 0.01∼100 mg/마우스의 5FU로 처리한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 마우스)를 0.1∼50 mg/마우스의 5FU로 처리한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 마우스)를 1∼10 mg/마우스의 5FU로 처리한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 마우스)를 5 mg/마우스의 5FU로 처리한다. 일부 실시형태에서, 조혈모세포의 5FU 농축 집단을 함유하는 골수 세포를, 임의의 적절한 방법에 의해, MYC을 과발현하는 유기체의 대퇴골 및 경골로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 5FU를 투여한 지 약 1∼10일 후 조혈모세포를 단리한다. 일부 실시형태에서, 5FU를 투여한 지 약 5일 후 조혈모세포를 단리한다. 일부 실시형태에서, 조혈모세포를 시험관 내에서 인간 IL-3, IL-6 및 줄기 세포 인자(SCF)를 포함하는 배지에서 배양한다. 특정 실시형태에서, 단리된 조혈모세포는 MYC을 과발현한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 조혈모세포를, MYC의 과발현을 지시하는 핵산을 상기 조혈모세포로 도입(또는 다른 방식으로 제공)함으로써 시험관 내에서 MYC을 과발현하도록 유전자 조작한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 유도성이다. 일부 실시형태에서, 상기 조혈모세포를, MYC의 과발현을 지시하는 바이러스로 상기 조혈모세포를 시험관 내에서 감염시킴으로써 MYC을 과발현하도록 유전자 조작한다. 일부 실시형태에서, 상기 바이러스는 렌티바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스이다. 일부 실시형태에서, 상기 조혈모세포를, 핵산으로 형질감염시킴으로써 MYC을 과발현하도록 유전자 조작한다. 일부 실시형태에서, 상기 조혈모세포를 또한 리포터 유전자를 발현하도록 유전자 조작한다. 특정 실시형태에서, 리포터 유전자가 사용되며 이것은 Myc을 발현하도록 유전자 조작된 세포의 선별 또는 단리를 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 상기 리포터 유전자는 GFP(녹색 형광 단백질)이다. 일부 실시형태에서, 조혈모세포를 MYC 및 GFP의 과발현을 지시하는 바이러스로 형질도입한다. 일부 실시형태에서, 상기 조혈모세포를 MYC 및 GFP의 과발현을 지시하는 렌티바이러스로 감염시킨다. 일부 실시형태에서, 본원은 본원에 기재된 것과 같은 MYC을 과발현하는 조혈모세포를 제공하며, 이것은 항체 생산 불멸 B 세포를 생성하는 데 사용된다.
본원에 개시된 임의의 방법의 다양한 실시형태에서, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 다클론 항체 집단뿐만 아니라 이러한 항체를 생산하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 유기체의 조직(비장, 림프절, 혈액 등) 또는 혈청으로부터 직접 단리한다. 일부 실시형태에서, 항체 생산 세포의 단일클론 집단을 유기체로부터 단리하고, 단일클론 항체를 배양 배지로부터 회수한다.
일부 실시형태에서, 본원은 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 임의의 단리된 B 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원은 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 제조된 임의의 항체의 재조합 형태를 생성하도록 조작된 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 제공한다. 특정 실시형태에서, 본원은 인간 또는 인간화 항체를 발현하고 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc), 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 B 세포를 제공하며, 상기 B 세포는 Myc을 과발현한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 특정 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 전달 도메인(예를 들어, Tat-Myc 또는 Vpr-Myc), 조절되거나 결합될 때 상기 발암 펩티드의 기능을 활성화하는 수용체(예를 들어, Myc-ER, Myc-GR), 또는 이들의 조합(예를 들어, Tat-Myc-ER, Tat-Myc-GR, Vpr-Myc-ER, 또는 Vpr-Myc-GR)을 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 본원은 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 제조된 단리된 항체를 제공한다.
인간 항체
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 인간 또는 인간화 항체를 제조하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 방법의 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 또는 유기체는 인간 항체를 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다.
일부 실시형태에서, 본원은 인간 항체를 발현하고 Myc 펩티드, 또는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 제공하는 단계; 및 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 선택된 항원과 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 인간 항체를 발현하고 Myc 펩티드, 또는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 세포 표면 CD79를 발현하는 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 CD79를 발현하고, 퓨린 생합성을 위한 온전한 재이용 경로를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 CD79를 발현하고, 퓨린 생합성을 위한 온전한 재이용 경로를 포함하며, 선택된 항원에 관용성 및/또는 무력성이다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 발현하고 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열), 또는 Myc 펩티드를 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 B 세포, B 세포 선구체 또는 전구체, 또는 조혈모세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포는 Myc을 과발현한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 발현하고, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 Myc 펩티드를 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재하며, 이때 상기 방법은 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 항체 생산 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 (a) 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)에 MYC을 과발현하는 복수의 조혈모세포를 투여하는 단계에 의해 얻는다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 조혈모세포는, 예를 들어 인간의 1차 제대혈 줄기 세포를 비롯한 인간 줄기 세포이다. 추가적인 실시형태에서, 인간 줄기 세포를, 예를 들어 MYC-ER 및 Myc-GR을 비롯한 조건부 활성화 MYC을 생성하도록 형질도입한다. 추가적인 또는 대안의 실시형태에서, 상기에 언급된 인간 줄기 세포를 또한 항원의 cDNA로 형질도입하며, 이러한 실시형태에서는, 인간 줄기 세포가 상기 선택된 항원 및 상기 조건부 활성화 Myc을 둘 다 생성한다. 추가적인 또는 대안의 실시형태에서, 말초혈에서 B 세포가 검출되면, 제1 선택안으로서, 얻어진 인간 줄기 세포를 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)에 투여하며, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)에 MYC의 조건부 발현을 유도하는 제제를 제공한다. 대안으로, 조건부 활성화 Myc을 생성하도록 형질도입된 인간 줄기 세포를 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)에 바로 제공하고; 말초혈에서 B 세포가 검출되면, 얻어진 유기체(예를 들어, 포유동물)에 관심있는 선택된 항원(들)을 발현하는 림프종 세포(상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)와 동일한 종 또는 속 유래의 림프종 세포를 포함함)를 제공하고; 그 후, 얻어진 유기체(예를 들어, 포유동물)에 MYC을 조건부 활성화하는 제제를 제공한다.
본원에 기재된 실시형태 중 어느 하나에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)에 방사선을 조사하여 얻는다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 Rag-1ko, Rag-2, SCID, DNA-PK, Ku70, Ku80, XRCC4, 또는 μMT 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 상기 선택된 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 항체 생산 세포에 의해 생산된 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 항체 생산 세포를 MYC의 과발현을 유도하는 조건에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 상기 항체 생산 세포를 단리하기 전에, 상기 항체 생산 세포를 MYC의 과발현을 유도하는 조건에 적용한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다.
일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 항체 생산 세포를 단리한 후, 상기 항체 생산 세포를 MYC의 과발현을 유도하는 조건에 적용한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)은 MMTV-rtTA/TRE-MYC; MMTV-rtTA/TRE-MYC/Rag-1-/-; MMTV-tTA/TRE-MYC; 또는 MMTV-tTA/TRE-MYC/Rag-1-/- 마우스이고, 상기 MYC의 과발현을 유도하는 조건은 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체에 노출시키는 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 에스트로겐 수용체 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 에스트로겐 수용체 리간드 부재 하에 상기 선택된 항원과 접촉시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 글루코코티코이드 수용체 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 글루코코티코이드 수용체 리간드 부재 하에 상기 선택된 항원과 접촉시킨다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) Myc(예를 들어, 재조합 Myc)을 포함하는 세포를 선택된 항원과 접촉시키는 단계; (b) 불멸 세포가 된 Myc(예를 들어, 재조합 Myc)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 회수하는 단계; 및 (c) 상기 불멸 세포로부터 상기 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 CDR 그래프팅 항체이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 인간 IgG이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체는 인간 IgG1, IgG4, IgG2, IgD, IgA 또는 IgM 유래의 하나 이상의 폴리펩티드이거나 이것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 닭 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 마우스 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 유기체 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 AN1/T3 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 HSC이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 미성숙 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 인간 또는 인간화 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 CD79의 세포 표면 발현을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 세포 표면 B 세포 수용체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 상기 선택된 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 상기 선택된 항원에 항원에 무력성 또는 관용성이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성 존재 하에 항원과 접촉하기 전에 상기 선택된 항원에 대해 무력성 또는 관용성이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 필멸(즉, 불멸화되지 않음) 및/또는 비악성이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성 존재 하에 항원과 접촉하기 전에 필멸(즉, 불멸화되지 않음) 및/또는 비악성이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 온전한 기능성의 퓨린 생합성 재이용 경로를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 기능성 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 악성이다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 림프종이다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 CD79를 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 온전한 기능성의 퓨린 생합성 재이용 경로를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 기능성 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 1개 이하의 핵을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 하이브리도마가 아니다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 골수종이 아니다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는, 상기 선택된 항원과 접촉하기 전에 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내에 존재하였던 수와 동일한 수의 염색체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 상기 선택된 항원과 접촉하기 전에 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내에 존재하였던 수보다 5개 이하로 더 많은 추가적인 염색체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 상기 선택된 항원과 접촉하기 전에 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내에 존재하였던 수보다 4개 이하로 더 많은 추가적인 염색체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 상기 선택된 항원과 접촉하기 전에 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내에 존재하였던 수보다 3개 이하로 더 많은 추가적인 염색체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 상기 선택된 항원과 접촉하기 전에 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내에 존재하였던 수보다 2개 이하로 더 많은 추가적인 염색체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 상기 선택된 항원과 접촉하기 전에 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내에 존재하였던 수보다 1개 이하로 더 많은 추가적인 염색체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 불멸 세포는 상기 선택된 항원과 접촉하기 전에 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내에 존재하였던 수에 비해 추가적인 염색체를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성은 유도성이다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성은 유도성이고, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성은 항원과 접촉하기 전에는 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 내에 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 Myc을 과발현한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자가 항원, 자기 항원 또는 관용성 항원이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 상기 유기체 고유의 자가 항원 또는 자기 항원이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자가 항원, 자기 항원 또는 관용성 항원에 대해 상동성이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 60%∼100% 상동성이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원, 자가 항원 또는 관용성 항원에 대해 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 상동성이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원, 자가 항원 또는 관용성 항원에 대해 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 BCR에 결합하지만, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성 부재 하에서는 BCR을 통해 신호 전달을 하지 못한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성 부재 하에 이것으로 유기체를 면역화할 경우 면역 반응을 유발하지 못한다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 포함하는 세포를 상기 선택된 항원과 접촉시키는 것은, 유기체에서 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)에 의해 선택된 항원을 과발현시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 포함하는 세포를 상기 선택된 항원과 접촉시키는 것은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)에서 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)에 의해 선택된 항원을 과발현시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 포함하는 세포를 상기 선택된 항원과 접촉시키는 것은 유기체를 상기 선택된 항원으로 면역화하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 인간 항체를 생산하는 불멸 세포주를 제조하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 생산하고 MYC을 과발현하도록 유전자 조작된 유기체를 제조한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 마우스(예를 들어, 제노마우스)이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 인간 항체를 생산하도록 유전자 조작된 유기체와 Myc을 과발현하는 유기체를 교잡하여 제조한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 인간 항체, CDR 그래프팅 항체 또는 키메라 항체를 생산하도록 유전자 조작된다. 일부 실시형태에서, 인간 면역글로불린 유전자좌(IgH 및 IgL)를 코딩하는 유전자 이식 BAC 구성체를 보유하는 마우스 품종을, Myc을 과발현하는 마우스와 교잡한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, Myc을 과발현하는 마우스는 Eμ-MYC 마우스 또는 MMTV-rtTA/TRE-MYC 마우스이다. 일부 실시형태에서, Myc을 과발현하는 마우스는 Myc-ER을 발현한다. 일부 실시형태에서, Myc을 과발현하는 마우스는 Myc-GR을 발현한다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 생산하고 MYC을 과발현하도록 유전자 조작된 유기체를 항원에 노출시킨다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 생산하고 MYC을 과발현하도록 유전자 조작된 제조된 유기체를 항원으로 면역화한다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 생산하고 MYC을 과발현하도록 유전자 조작된 제조된 유기체는 또한 자기 항원, 신(neo) 자기 항원, 자가 항원 또는 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 생산하고 MYC을 과발현하도록 유전자 조작된 본원에 기재된 유기체로부터 조혈모세포가 제조된다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 상기 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 동물로부터 제조된 조혈모세포를 항체 생산 불멸 B 세포를 생성하는 데 사용한다. 일부 실시형태에서, 항체 생산 불멸 B 세포를, 인간 항체를 생산하고 MYC을 과발현하도록 유전자 조작된 유기체를 사용하여 본원에 기재된 방법에 의해 제조한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 항체는 인간화 항체, CDR 그래프팅 항체 또는 키메라 항체이다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 포함하는 세포를 선택된 항원과 접촉시키는 단계로서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재하는 것인 단계; (b) 불멸 세포가 된 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 회수하는 단계; 및 (c) 상기 불멸 세포로부터 상기 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, Myc은 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, Myc은 PTD를 포함하는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, Myc은 TAT-MYC이다. 일부 실시형태에서, Myc은 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, Myc은 Myc-GR이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다.
일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 (a) 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)에 MYC을 과발현하는 복수의 조혈모세포를 투여하는 단계에 의해 얻는다. 일부 실시형태에서, MYC은 융합 펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYC은 PTD를 포함하는 융합 펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYC은 TAT-MYC을 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYC은 Myc-ER을 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYC은 Myc-GR을 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 MYC을 과발현하는 복수의 조혈모세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)은 유기체(예를 들어, 포유동물)에 방사선을 조사하여 얻는다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 Rag-1ko, Rag-2, SCID, DNA-PK, Ku70, Ku80, XRCC4, 또는 μMT 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 상기 선택된 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 항체 생산 세포에 의해 생산된 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 항체 생산 세포를 MYC의 과발현을 유도하는 조건에 적용하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 상기 항체 생산 세포를 단리하기 전에, 상기 항체 생산 세포를 MYC의 과발현을 유도하는 조건에 적용한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다.
일부 실시형태에서, 본원은
a. 항체를 생산하는 인간 세포를 제공하는 단계;
b. 상기 항체를 생산하는 인간 세포로부터 항체를 코딩하는 인간 유전자를 단리하는 단계; 및
c. 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)로 상기 항체를 코딩하는 인간 세포를 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계
를 포함하는, 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 인간 유전자는 인간 IgH 및 IgL을 코딩하며, 여기서 IgH와 IgL은 함께 상기 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 마우스로 이식하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 인간 유전자는 제1 항체 및 제2 항체를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 TAT-Myc 본원에 개시된 융합 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) Myc을 과발현하는 세포로 인간 면역글로불린을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계; 및 (b) 코딩된 인간 면역글로불린을 단리하는 단계를 포함하는, 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다.
일부 실시형태에서, 인간으로부터 말초혈 B 세포를 얻는다. 일부 실시형태에서, 인간은 특정 항원에 대한 혈청 항체 역가를 갖는다. B 세포는 표준 절차를 이용하여 얻는다. 일부 실시형태에서, B 세포를 임의의 적절한 방법에 의해 농축시키거나 정제한다. 일부 실시형태에서, 관심있는 특이성을 갖는 B 세포로 농축시키기 위해, 정제된 B 세포를 선택된 항원으로 코팅된 플라스틱 플레이트 상에서 패닝(panning)한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원을 자성 비드에 접합시켜, 이것을 관심있는 특이성을 갖는 B 세포를 단리하는 데 사용한다. 일부 실시형태에서, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 항원 특이적 B 세포의 농축 집단으로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, 핵산을 정제된 항원 특이적 B 세포로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 RT-PCR 또는 PCR로 단리한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 B 세포의 농축 집단은 단일 세포 RT-PCR을 위해 테라사키(terasaki) 플레이트로 분류한다. 일부 실시형태에서, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 핵산을 단리한다.
일부 실시형태에서, Myc을 과발현하는 세포에서 인간 항체의 발현이 가능하도록 인간 항체를 코딩하는 핵산을 벡터로 이전한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, 인간 항체의 가변 영역을 코딩하는 핵산을 인간 항체의 불변 영역을 포함하는 벡터 카세트로 이전한다. 이러한 방법 또는 임의의 다른 적절한 방법을 이용하여, 원하는 클래스, 서브클래스 또는 아이소타입의 정해진 항원 특이성을 갖는 인간 항체를 제조한다. 일부 실시형태에서, 인간 가변 영역을 코딩하는 cDNA 단편을 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 코딩하는 레트로바이러스 벡터로 클로닝한다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 코딩하는 얻어진 벡터를 임의의 적절한 방법으로 MYC을 과발현하는 조혈모세포로 도입한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 그 후, 본원에 기재된 방법에 의해 불멸화 B 세포를 제조한다. 일부 실시형태에서, 조혈모세포는 MMTV-tTA/TRE-MYC/Rag-1 넉아웃 마우스, Eμ-MYC/Rag-1 넉아웃 마우스, 또는 MYC의 과발현을 지시하는 레트로바이러스로 형질도입된 Rag-1 넉아웃 마우스 유래의 골수로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 인간 항체 및 Myc 발현 세포는 면역결핍 유기체를 재구성하는 데 사용되며 항체 또는 항체 생산 불멸 B 세포를 제조하기 위해 본원에 기재된 프로토콜에 적용된다. 이 접근법으로부터 얻은 세포주는 관심있는 단백질에 특이적인 인간 면역글로불린 서열을 코딩한다. 일부 실시형태에서, 이것은 바이러스 감염, 종양, 박테리아 및 진균류 등에 대한 억제성 항체의 혼합물을 생성하기 위한 접근법이다.
본원에 개시된 바와 같이, Myc을 과발현하는 조혈모세포 또는 B 세포로부터 항원 특이적 비인간(예를 들어, 마우스) 항체를 제조하는 다수의 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 비인간 항체는 인간화 항체이고, 상기 인간화 항체는 Myc을 과발현하는 조혈모세포 또는 B 세포에서 발현된다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원 특이적 마우스 항체를 코딩하는 핵산을 임의의 적절한 방법에 의해 임의의 공급원으로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원 특이적 마우스 항체를 코딩하는 핵산을 관심있는 항체를 발현하는 하이브리도마로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원 특이적 비인간(예를 들어, 마우스) 항체를 코딩하는 핵산을 본원에 기재된 임의의 항체 생산 세포로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원 특이적 마우스 항체를 코딩하는 핵산을 MYC을 과발현하는 조혈모세포로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원 특이적 비인간(예를 들어, 마우스) 항체를 코딩하는 핵산을 Myc을 과발현하는 불멸화 B 세포로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 인간화, CDR 그래프팅, 또는 키메라 항체를 코딩하도록 유전자 조작한다. 일부 실시형태에서, PCR은 쥐과동물 Ig 중쇄 유래의 재배열된 VDJ 연결 서열 및 Ig 경쇄 유전자좌 유래의 VJ 영역을 증폭시키는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, PCR 증폭 단편을 인간 Ig 중쇄 및 인간 Ig 경쇄를 코딩하는 레트로바이러스 플라스미드로 클로닝한다. 일부 실시형태에서, PCR 증폭 단편을 원하는 항체의 발현을 지시하는 임의의 벡터로 클로닝한다. 일부 실시형태에서, 상기 Ig 중쇄 및 경쇄 서열은 두 cDNA가 동일한 바이러스 벡터로부터 발현되도록 IRES 요소에 의해 이격된다. 상이한 항체 아이소타입, 클래스 및 서브클래스의 생성을 위한 다종 다양한 바이러스 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 이펙터 기능, 자가면역 반응을 유발하는 능력 또는 면역복합체 침착 문제를 유발하는 능력을 변경하기 위해 Fc 영역을 코딩하는 서열을 추가로 변경한다.
일부 실시형태에서, 얻어진 벡터 또는 레트로바이러스를 MYC을 과발현하는 조혈모세포로 도입한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC을 과발현하는 조혈모세포는 재조합 Myc을 유도에 의해 발현하는 유기체(예를 들어, MMTV-tTA/TRE-MYC/Rag-1 넉아웃 마우스)로부터 얻는다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조혈모세포를 치사적으로 방사선을 조사한 동물, 예를 들어, 치사적으로 방사선을 조사한 C57/BL6 야생형 마우스에 도입한다. 일부 실시형태에서, 얻어진 마우스는 인간화 항체의 부가된 특징 전부에 특이적인 항원인 단일클론 항체 생산 불멸 세포를 생성한다.
일부 실시형태에서, 인간 항체를 코딩하는 핵산은 건강한 공여자, 항체 매개성 자가면역 질환(예를 들어, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 전신 홍반성 루푸스, 발덴스트룀 거대글로불린혈증 등)을 앓고 있는 환자, 또는 비호지킨 림프종(예를 들어, 버킷 림프종, 여포성 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, MGUS 및 다발성 골수종)을 앓고 있는 환자로부터 얻은 인간 B 세포로부터 단리한다. 특정 실시형태에서, 상기 인간 항체를 코딩하는 핵산을, 임의의 적절한 방식을 이용하여, 본원에 기재된 것과 같은 레트로바이러스 벡터에 클로닝하여 레트로바이러스 라이브러리를 제조한다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스 라이브러리의 생성을 진척시키기 위해 2종의 상이한 레트로바이러스 벡터를 사용한다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 코딩하는 얻어진 벡터를, 임의의 적절한 방식을 이용하여, MYC을 과발현하는 조혈모세포로 도입한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 특정 실시형태에서, 그 후, 이러한 조혈모세포를, 클로닝된 핵산에 의해 코딩되는 선택된 항원을 발현하는 불멸화 B 세포(조건부 불멸화를 포함함)를 생산하도록 분화시킨다. 일부 실시형태에서, 조혈모세포는 Myc을 조건부로 발현하는 유기체(예를 들어, MMTV-tTA/TRE-MYC/Rag-1 넉아웃 마우스), B 세포에서 재조합 Myc을 발현하는 유기체(예를 들어, Eμ-MYC/Rag-1 넉아웃 마우스), 또는 MYC의 과발현을 지시하는 레트로바이러스로 형질도입된 면역결핍 동물(예를 들어, Rag-1 넉아웃 마우스) 유래의 골수로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 인간 항체 및 Myc 발현 세포를 면역결핍 유기체를 재구성하는 데 사용하고 항체 또는 항체 생산 불멸 B 세포를 제조하기 위해 본원에 기재된 프로토콜에 적용한다. 일부 실시형태에서, 골수 키메라 마우스를 생성하기 위해, 상기 레트로바이러스 라이브러리를 MYC을 조건부로 발현하는 유기체(예를 들어, MMTV-tTA/TRE-MYC/Rag-1 넉아웃 마우스)로부터 얻은 조혈모세포를 형질도입하는 데 사용한다. 일부 실시형태에서, 상기 골수 키메라 마우스는 인간 항체를 발현하는 B 세포만을 만들며, 이것을 (MYC 발현을 억제하기 위해) 면역화에 사용할 때까지 독시사이클린 함유 식이로 유지한다. 일부 실시형태에서, 이들 마우스를 독시사이클린 부재 하에 면역화하여 그 B 세포에서의 MYC의 과발현을 유도한다. 일부 실시형태에서, 반응성의 항원 특이적 B 세포를 단리하여, 항원에 대해 패닝함으로써 농축시킨다. 일부 실시형태에서, 반응성의 항원 특이적 B 세포를 단리하여 당업계에 공지된 다른 선별 방법에 의해 농축시킨다. 선별 방법의 예로는 패닝법, 세포 분류법 및 자성 비드 단리법 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 생성하는 불멸 단일클론 세포주를 제조하기 위해 항원 특이적 집단을 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성 존재 하에 성장시킨다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 생성하는 불멸 단일클론 세포주를 제조하기 위해 항원 특이적 집단을 Myc 과발현 존재 하에 성장시킨다. 일부 실시형태에서, 상기에 기재된 접근법은 특이적 항원에 대한 인간 IgA 항체를 특이적으로 단리하는 데 이용된다. 인간 IgA 항체는 예방을 위해 얻고자 하는 요구가 크다. 일부 실시형태에서, 본원에서 제조된 항체의 Fc 영역은, 상이한 클래스, 서브클래스 또는 아이소타입의 항체 또는 변경된 이펙터 기능을 갖는 항체를 생성하기 위해 쉽게 교환 또는 변경이 가능하다.
발암 펩티드
특정 실시형태에서, 임의의 발암 펩티드가 본원에서 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 세포 생존, 세포 불멸성, 세포 성장 및/또는 세포 증식을 촉진한다. 구체적인 실시형태에서, 발암 펩티드로는, 비한정적인 예로서, Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드)), Notch-1 펩티드(예를 들어, 재조합 펩티드), Akt 펩티드(예를 들어, 재조합 펩티드), hTERT 펩티드(예를 들어, 재조합 펩티드) 등을 들 수 있다. 발암 펩티드(예를 들어, 원발암 유전자 또는 발암 유전자에 의해 코딩되는 펩티드)의 추가적인 예는 그 개시내용이 본원에서 참조 인용되는 U.S. 2007/0116691에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR이다.
본원에 기재된 특정 실시형태에서는 Myc이 사용된 발암 펩티드이지만, 세포 생존, 세포 불멸성, 세포 성장 및/또는 세포 증식을 촉진하는 임의의 발암 펩티드가 경우에 따라 Myc 펩티드 대신에 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 일부 실시형태에서, 발암 펩티드의 과발현은 발암 펩티드 활성으로 이어진다.
예를 들어, Myc 과발현 BCRHEL 유전자 이식 B 세포는 가용성 HEL(닭의 난백 라이소자임)에 대해 강한 반응을 유발하여 악성 개시 전에 다클론 자가면역 림프증식성 질환을 야기한다(도 1∼6). 자가 반응성 B 세포에서의 MYC의 과발현은, 증식 및 생존 신호를 제공하는 Myc의 능력을 통해, B 세포가 T 세포의 도움에 독립적이 되도록 한다. 일부 실시형태에서, Myc 과발현 자가 반응성 B 세포의 증식 집단은 B 세포 림프종으로 발달하고, 이것은 그 동족체 항원 및 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성 둘 다에 연속 노출될 때 의존성인 상태로 유지된다. 일부 실시형태에서, B 세포를, 예를 들어, 종양 보유 유기체의 림프절, 비장 및/또는 골수로부터 회수한다. 특정 실시형태에서, 융합 파트너로의 1차 세포의 세포 융합을 필요로 하지 않고, BCRHEL 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 발현하고 항HEL 항체를 분비하는 많은 세포주를 확립하는 데 이러한 B 세포를 사용한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 특정 실시형태에서, 융합 펩티드는, 예를 들어, 전달 도메인 및/또는 수용체(예를 들어, Tat-Myc, Myc-ER, Myc-GR, Tat-Myc-ER, 및 Tat-Myc-GR)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Bcl-2, Mcl-1, Bcl-2 패밀리 구성원 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Ras, H-Ras, K-Ras, N-Ras, ERK, c-erbB2, RET 또는 TRK 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시형태에서, 본원은 SV40 T-Ag를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 선택된 항원과 접촉시키는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 방법의 발암 펩티드를 경우에 따라, 세포 생존, 세포 불멸성, 세포 성장 및/또는 세포 증식을 촉진하는 성장 인자로 대체한다. 일부 실시형태에서, 본원은 성장 인자 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 선택된 항원과 접촉시키는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다. 성장 인자 수용체의 예로는 상피세포 성장 인자 수용체(EGFr), 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFr), erbB2, erbB4, 혈관 내피세포 성장 인자 수용체(VEGFr), 면역글로불린 유사 및 상피세포 성장 인자 상동성 도메인을 갖는 타이로신 키나제(TIE-2), 인슐린 성장 인자-I(IGFI) 수용체, 대식세포 콜로니 자극 인자(cfms), BTK, ckit, cmet, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 수용체, Trk 수용체(TrkA, TrkB, 및 TrkC), 에프린(ephrin: eph) 수용체 및 RET 원발암 유전자를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본원은 우성 음성 종양 서프레서 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 이식 유전자 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 선택된 항원과 접촉시키는 단계를 포함하는, 항원에 대해 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 우성 음성 서프레서 폴리펩티드는 p53의 우성 음성 폴리펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원은 선택된 항원을 유기체(예를 들어, 포유동물)로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계로서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)가 Bcl-2, Mcl-1, Bcl-2 패밀리 구성원, Ras, H-Ras, K-Ras, N-Ras, ERK, c-erbB2, RET 또는 TRK, SV40 T-Ag, EGFr, PDGFr, erbB2, erbB4, VEGFr, TIE-2, IGFI 수용체, cfms, BTK, ckit, cmet, FGF 수용체, Trk 수용체, eph 수용체, RET 및/또는 p53의 우성 음성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 것인 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 항원 특이적 불멸 B 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 열거된 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열) 중 하나 이상을 발현하도록 유전자 조작된 조혈모 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 인간 항체의 제조를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 재조합 B 세포의 증식에 의해 생성된 복수의 재조합 B 세포로부터 항원에 특이적인 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 열거된 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열) 중 하나 이상을 과발현하는 무력성 B 세포로부터 항원 특이적 불멸 B 세포를 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 자기 항원 또는 자가 항원인 항원을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 B 세포를 선택된 항원과 접촉시키는 단계 및 상기 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 과발현시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 유기체(예를 들어, 포유동물)를 선택된 항원으로 면역화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 추가로 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 보유하고 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)에 Bcl-2, Mcl-1, Bcl-2 패밀리 구성원, Ras, H-Ras, K-Ras, N-Ras, ERK, c-erbB2, RET 또는 TRK, SV40 T-Ag, EGFr, PDGFr, erbB2, erbB4, VEGFr, TIE-2, IGFI 수용체, cfms, BTK, ckit, cmet, FGF 수용체, Trk 수용체, eph 수용체, RET 및/또는 p53의 우성 음성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 복수의 조혈모세포를 투여하는 단계; 및 (b) 선택된 항원을 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)에 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 포함하는, 항원에 선택적인 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 조혈모세포는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 복수의 조혈모세포가 B 세포로 분화되도록 유도하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 선택된 항원에 특이적인 항체를 발현하는 복수의 B 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 항체를 발현하는 복수의 B 세포로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 하나 이상의 TRE를 포함하는 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 조혈모세포는 tTA 또는 rtTA를 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 tTA 의존적 트랜스 활성화를 억제하기에 충분한 기간 동안 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)에 제공하는 단계; 및 상기 기간 후에, tTA 의존적 트랜스 활성화를 유도하기 위해 상기 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 B 세포 선택적 프로모터를 포함하고, 상기 B 세포 선택적 프로모터는 Eμ 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체 또는 세포는 융합 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원 또는 자가 항원이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 유기체(예를 들어, 포유동물)에 방사선을 조사하여 얻는다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 Rag-1ko, Rag-2, SCID, DNA-PK, Ku70, Ku80, XRCC4, 또는 μMT 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 상기 선택된 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원을 발현하는 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 상기 선택된 항원에 대한 유전자 이식 유기체이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 핵산 발현 벡터에 의한 형질감염 또는 재조합 바이러스 발현 벡터에 의한 감염에 의해 도입된다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 바이러스 발현 벡터는 재조합 렌티바이러스이다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) 인간 항체를 발현하고, 재조합 Bcl-2, Mcl-1, Bcl-2 패밀리 구성원, Ras, H-Ras, K-Ras, N-Ras, ERK, c-erbB2, RET 또는 TRK, SV40 T-Ag, EGFr, PDGFr, erbB2, erbB4, VEGFr, TIE-2, IGFI 수용체, cfms, BTK, ckit, cmet, FGF 수용체, Trk 수용체, eph 수용체, RET 및/또는 우성 음성 p53 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 선택된 항원과 접촉시키는 단계를 포함하는, 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 발현하고, 재조합 Bcl-2, Mcl-1, Bcl-2 패밀리 구성원, Ras, H-Ras, K-Ras, N-Ras, ERK, c-erbB2, RET 또는 TRK, SV40 T-Ag, EGFr, PDGFr, erbB2, erbB4, VEGFr, TIE-2, IGFI 수용체, cfms, BTK, ckit, cmet, FGF 수용체, Trk 수용체, eph 수용체, RET 및/또는 우성 음성 p53 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, B 세포)는 유도에 의해 Myc을 과발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, B 세포)는 재조합 Bcl-2, Mcl-1, Bcl-2 패밀리 구성원, Ras, H-Ras, K-Ras, N-Ras, ERK, c-erbB2, RET 또는 TRK, SV40 T-Ag, EGFr, PDGFr, erbB2, erbB4, VEGFr, TIE-2, IGFI 수용체, cfms, BTK, ckit, cmet, FGF 수용체, Trk 수용체, eph 수용체, RET 및/또는 우성 음성 p53 폴리펩티드를 유도에 의해 발현한다. 일부 실시형태에서, 인간 항체를 발현하고, Bcl-2, Mcl-1, Bcl-2 패밀리 구성원, Ras, H-Ras, K-Ras, N-Ras, ERK, c-erbB2, RET 또는 TRK, SV40 T-Ag, EGFr, PDGFr, erbB2, erbB4, VEGFr, TIE-2, IGFI 수용체, cfms, BTK, ckit, cmet, FGF 수용체, Trk 수용체, eph 수용체, RET 및/또는 우성 음성 p53 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재하고, 상기 방법은 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)로부터 항체 생산 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 사용되는 유기체(예를 들어, 포유동물)는 (a) 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)를 제공하는 단계; 및 (b) 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)에 Bcl-2, Mcl-1, Bcl-2 패밀리 구성원, Ras, H-Ras, K-Ras, N-Ras, ERK, c-erbB2, RET 또는 TRK, SV40 T-Ag, EGFr, PDGFr, erbB2, erbB4, VEGFr, TIE-2, IGFI 수용체, cfms, BTK, ckit, cmet, FGF 수용체, Trk 수용체, eph 수용체, RET 및/또는 우성 음성 p53 폴리펩티드를 과발현하는 복수의 조혈모세포를 투여하는 단계에 의해 얻는다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)에 방사선을 조사하여 얻는다. 일부 실시형태에서, 상기 면역결핍 유기체(예를 들어, 포유동물)는 Rag-1ko, Rag-2, SCID, DNA-PK, Ku70, Ku80, XRCC4, 또는 μMT 마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 선택된 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 항체 생산 세포 또는 동물에 의해 생산된 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 항체 생산 세포를, Bcl-2, Mcl-1, Bcl-2 패밀리 구성원, Ras, H-Ras, K-Ras, N-Ras, ERK, c-erbB2, RET 또는 TRK, SV40 T-Ag, EGFr, PDGFr, erbB2, erbB4, VEGFr, TIE-2, IGFI 수용체, cfms, BTK, ckit, cmet, FGF 수용체, Trk 수용체, eph 수용체, RET 및/또는 우성 음성 p53 폴리펩티드의 과발현을 유도하는 조건에 적용하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) 항체 생산 인간 세포를 제공하는 단계; (b) 항체 생산 인간 세포로부터 항체를 코딩하는 인간 유전자를 단리하는 단계; 및 (c) 상기 항체를 코딩하는 인간 유전자를 Bcl-2, Mcl-1, Bcl-2 패밀리 구성원, Ras, H-Ras, K-Ras, N-Ras, ERK, c-erbB2, RET 또는 TRK, SV40 T-Ag, EGFr, PDGFr, erbB2, erbB4, VEGFr, TIE-2, IGFI 수용체, cfms, BTK, ckit, cmet, FGF 수용체, Trk 수용체, eph 수용체, RET 및/또는 우성 음성 p53 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 포함하는, 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 과발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 인간 유전자는 인간 IgH 및 IgL을 코딩하며, 여기서 IgH와 IgL은 함께 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 마우스로 이식하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 인간 유전자는 제1 항체 및 제2 항체를 코딩한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포(예를 들어, 포유동물 세포)로부터 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) Bcl-2, Mcl-1, Bcl-2 패밀리 구성원, Ras, H-Ras, K-Ras, N-Ras, ERK, c-erbB2, RET 또는 TRK, SV40 T-Ag, EGFr, PDGFr, erbB2, erbB4, VEGFr, TIE-2, IGFI 수용체, cfms, BTK, ckit, cmet, FGF 수용체, Trk 수용체, eph 수용체, RET 및/또는 우성 음성 p53 폴리펩티드를 과발현하는 세포로 인간 면역글로불린을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계; 및 (b) 코딩된 인간 면역글로불린을 단리하는 단계를 포함하는, 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본원은 Bcl-2, Mcl-1, Bcl-2 패밀리 구성원, Ras, H-Ras, K-Ras, N-Ras, ERK, c-erbB2, RET 또는 TRK, SV40 T-Ag, EGFr, PDGFr, erbB2, erbB4, VEGFr, TIE-2, IGFI 수용체, cfms, BTK, ckit, cmet, FGF 수용체, Trk 수용체, eph 수용체, RET 및/또는 우성 음성 p53 폴리펩티드를 과발현하는, 인간 또는 인간화 항체의 제조를 위한 단리된 B 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포는 또한 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 과발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 얻는다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 shRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 얻는다.
관용성
일부 실시형태에서, 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 활성은 항원(예를 들어, 가용성 항원)에 대한 B 세포 관용성을 종결시킨다(또는 감소시킨다). 따라서, 본원에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 발암 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 선택된 항원에 대해 관용성 및/또는 무력성이다.
일부 실시형태에서, 본원은 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포를 선택된 항원과 접촉시키는 단계로서, 발암 펩티드 활성(발현 및/또는 발암 펩티드 기능) 부재 하에, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 상기 선택된 항원에 대해 관용성 및/또는 무력성인 단계를 포함하는, 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 이 항체를 생산하는 세포의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
특정 실시형태에서, 상기 방법은 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현하는 하나 이상의 B 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다.
일부 실시형태에서, 본원은
a. 선택된 항체를 발현하고, 유도에 의해 활성화되는 발암 펩티드(예를 들어, Myc-ER, Myc-GR) 및/또는 발암 펩티드(예를 들어, TRE-Myyc, TRE-Myc-ER, 또는 TRE-Myc-GR)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, B 세포)에서 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 활성(발현 및/또는 발암 펩티드 기능)을 유도하는 단계;
b. 상기 유기체 세포(예를 들어, B 세포)로부터 발현된 항체를 회수하는 단계
를 포함하는, 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다.
일부 실시형태에서, 발암 펩티드 활성(발현 및/또는 발암 펩티드 기능) 부재 하에, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 선택된 항원에 대해 관용성 및/또는 무력성이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 특정 실시형태에서, 발암 펩티드 활성의 유도는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)의 증식을 유도한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 상기 항체를 세포의 증식에 의해 생성된 세포(예를 들어, B 세포)로부터 회수한다. 구체적인 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다. 일부 실시형태에서, 항체를 회수하는 과정은 상기 항체를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원은
a. 선택된 항체를 발현하고, 유도에 의해 활성화되는 발암 펩티드(예를 들어, Myc-ER, Myc-GR) 및/또는 발암 펩티드(예를 들어, TRE-Myc, TRE-Myc-GR, 또는 TRE-Myc-ER)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, B 세포)에서 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 활성(발현 및/또는 발암 펩티드 기능)을 유도하는 단계;
b. 세포(예를 들어, B 세포)로부터 발현된 항체를 회수하는 단계
를 포함하는, 자기 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 본원은 자기 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법으로서,
a. 상기 항체를 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc, TAT-Myc)와 접촉시키는 단계;
b. 세포(예를 들어, B 세포)로부터 상기 항체를 회수하는 단계
를 포함하는 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 항체를 본원에 개시된 TAT-Myc 융합 펩티드와 접촉시키는 단계; 및 세포(예를 들어, B 세포)로부터 발현된 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 발암 펩티드 활성(발현 및/또는 발암 펩티드 기능) 부재 하에, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 상기 자기 항원에 대해 관용성 및/또는 무력성이다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
특정 실시형태에서, 발암 펩티드 활성의 유도는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)의 증식을 유도한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 상기 항체는 세포의 증식에 의해 생성된 복수의 세포(예를 들어, B 세포)로부터 회수된다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) Myc 펩티드 또는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 관용성 B 세포에서 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 단계; (b) 상기 유도 후에 B 세포를 증식시키는 단계; 및 (c) 재조합 B 세포의 증식에 의해 생성된 복수의 재조합 B 세포로부터 상기 선택된 항원에 선택적인 발현된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 본원은 항원에 선택적인 항체의 제조 방법으로서, (a) 상기 항체를 발현하고, Myc 펩티드 또는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 B 세포에서 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 단계; (b) 상기 유도 후, 재조합 B 세포를 증식시키는 단계; 및 (c) 재조합 B 세포의 증식에 의해 생성된 복수의 재조합 B 세포로부터 발현된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 기재된 세포(예를 들어, 포유동물 세포 또는 B 세포)의 증식은 세포(예를 들어, B 세포)에서의 상기 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 활성의 유도에 의해 유발된다.
예를 들어, Myc 과발현 Ars.A1 마우스는 관용성을 파괴하여 활성화 항원 특이적 B 세포를 발달시킨다. Ars.A1 마우스는 선택된 항원 아르세네이트(Ars)에 특이적인 유전자 이식 B 세포 수용체(BCR)를 발현한다. 이들 마우스에서, 유전자 이식 BCR은 아르세네이트에 특이적으로 결합하지만, DNA와 낮은 친화력의 교차 반응성을 나타낸다. 이들 유기체로부터의 미성숙 B 세포는 골수에서의 Ag 인식으로 인하여 무력성이다. Eu-MYC 마우스는, 면역글로불린 중쇄 유전자 인핸서의 제어 하에, B 세포에서 거의 독점적으로 Myc을 발현한다. Ars.A1 마우스와 Eμ-MYC 품종 간의 교잡으로부터 얻은 마우스는 버킷 유사 림프종을 발달시킨다. 이 종양은 그 표면 상에 아르세네이트 특이적 IgM을 발현하는 성숙 활성화 B 세포로 이루어진다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같이, 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성은 저친화력의 항DNA 항체 존재 하에 자가 반응성 B 세포에 대한 관용성을 파괴한다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성은 자기 항원 또는 자가 항원에 결합하는 B 세포의 관용성을 파괴한다. 일부 실시형태에서, 본원은 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법으로서, (a) 선택된 항원에 결합하고, 재조합 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 B 세포에서 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 단계; (b) 상기 유도 후, B 세포를 증식시키는 단계; 및 (c) 재조합 B 세포의 증식으로부터 생성된 복수의 제조합 B 세포로부터 발현된 항체를 회수하는 단계를 포함하는 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 발암 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원은 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포를 선택된 항원과 접촉시키는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 B 세포 또는 그 세포 표면 상에 B 세포 수용체를 발현하는 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 그 세포 표면 상에 CD79를 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포)는 퓨린 생합성을 위한 온전한 재이용 경로를 갖는 B 세포이다.
일부 실시형태에서, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 코딩된 Myc 펩티드의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 B 세포 선택적 프로모터는 Eμ 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) CD79 발현 세포를 선택된 항원과 접촉시키는 단계로서, 상기 CD79 발현 세포는 Myc을 포함하는 것인 단계; 및 (b) 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 CD79 발현 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR이다.
일부 실시형태에서, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 회수된 CD79 발현 세포는 공정 전반에 걸쳐 동일한 염색체수를 유지한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 CD79 발현 세포는 가용성 항체를 생산한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 회수된 CD79 발현 세포를 시험관 내에서 증식시켜, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 단리한다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체를 정제한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에서 제공된 유기체는 발암 펩티드의 B 세포 특이적 발현 및/또는 폴리펩티드의 일시적 조절 과발현을 갖는 유기체이다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 임의의 방법에서 사용되는 세포는 이러한 유기체로부터 얻은 세포이다. 예를 들어, MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스는 식이로부터 독시사이클린을 제거한 후 MYC의 B 세포 특이적 및 일시적 조절 과발현을 할 수 있다. 4 월령 때 독시사이클린 제거 후, Ars.A1 마우스와 상기 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스의 교잡으로부터 얻은 마우스는 활성화 말초 B 세포 및 항핵 항체를 생성한다. 이들 마우스는 또한 그 신장에 면역 복합체 침착물을 축적하여 B 세포 림프종을 발달시킨다. 이들 마우스의 종양 유래의 불멸 항체 생산 세포주의 생성은 골수종 파트너 세포와의 세포 융합을 필요로 하지 않는다.
일부 실시형태에서, 임의의 Myc 과발현 유기체 또는 세포를 본원에 기재된 방법에 사용한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 예를 들어, Eμ-MYC 마우스 품종과 같은 B 세포 집단에서 MYC을 과발현하는 유기체를 사용한다.
일부 실시형태에서, MYC을 유도에 의해 과발현하는 유기체 또는 세포를 사용한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, Myc 과발현은 일시적으로 조절하며, 일부 실시형태에서, Myc 과발현은 항체 생산이 시작될 때까지 억제한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스 품종을 사용하는 것을 포함한다. MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스의 경우, Myc 과발현은, 마우스 또는 마우스 세포의 식이로부터 독시사이클린 또는 테트라사이클린을 제거함으로써 개시한다. 일부 실시형태에서, 출생시부터 관심있는 항체를 생산하는 데 사용되기까지 상기 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스 품종에 독시사이클린 또는 테트라사이클린을 투여함으로써, 자발성 림프증식성 질환의 발생을 최소화한다.
일부 실시형태에서, MMTV-rtTA/TRE-MYC 마우스 품종을 사용한다. MMTV-rtTA/TRE-MYC 마우스의 경우, Myc 과발현은 마우스의 식이에 독시사이클린 또는 테트라사이클린을 첨가하여 개시한다.
일부 실시형태에서, Myc-ER 마우스 또는 마우스 세포를 이용한다. Myc-ER 마우스 및 마우스 세포에서, Myc을 에스트로겐 또는 에스트로겐 유사체의 첨가에 의해 활성화한다. 일부 실시형태에서, 에스트로겐 유사체는 4OHT이다. 일부 실시형태에서, 대안적인 유도성 유전자 발현/억제 시스템을 이용한다. 일부 실시형태에서, Myc을 과발현하도록 유전자 조작된 임의의 동물이 본원에 기재된 방법에 의해 불멸화 항체 생산 세포를 제조하는 데 사용된다.
일부 실시형태에서, Myc-GR 마우스 또는 마우스 세포를 사용한다. Myc-GR 마우스 및 마우스 세포의 경우, Myc을 글루코코티코이드 또는 글루코코티코이드 유사체의 첨가에 의해 활성화한다. 일부 실시형태에서, 대안적인 유도성 유전자 발현/억제 시스템을 이용한다. 일부 실시형태에서, MYC을 과발현하도록 유전자 조작된 임의의 동물을 본원에 기재된 방법에 의해 불멸화 항체 생산 세포를 제조하는 데 사용한다.
일부 실시형태에서, 항원 반응성 불멸 B 세포주는 MYC을 과발현하는 유기체 내에 존재하는 무력성 AN1/T3 세포 집단으로부터 생성한다. 일부 실시형태에서, MYC은 융합 펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYC은 PTD를 포함하는 융합 펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYC은 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드를 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYC은 Myc-ER을 코딩한다. 일부 실시형태에서, MYC은 Myc-GR을 코딩한다.
일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다.
일부 실시형태에서, 이들 유기체는 관심있는 선택된 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원은, 표준 형질전환법 또는 유기체로 유전자를 전달하기 위한 임의의 다른 방법을 이용하여, 선택된 항원의 발현을 지시하는 재조합 레트로바이러스를 사용한 골수 유래 조혈모세포(조혈모세포)의 레트로바이러스 매개 형질도입에 의해 발현시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체를 면역화에 의해 선택된 항원에 노출시킨다. 일부 실시형태에서, Myc을 발현하도록 유전자 조작된 유기체는 수태시부터 독시사이클론 하에 유지한 MMTV-tTA/TRE-MYC 유기체이다. 일부 실시형태에서, 상기 MMTV-tTA/TRE-MYC 유기체는 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스이다.
일부 실시형태에서, AN1/T3 세포 집단을 포함하는 림프구를 Myc을 발현하도록 유전자 조작된 유기체의 비장으로부터 단리하여 시험관 내에서 추가로 배양한다. 일부 실시형태에서, AN1/T3 집단을 포함하는 림프구를 혈액, 골수, 또는 림프절로부터 단리한다. 일부 실시형태에서, AN1/T3 세포 집단을 포함하는 림프구를 MYC이 과발현되는 조건 하에 배양한다. 일부 실시형태에서, AN1/T3 세포 집단을 포함하는 림프구를 MYC이 과발현되는 조건 하에 항원 존재 하에 배양한다. 일부 실시형태에서, AN1/T3 세포 집단을 포함하는 림프구를 MYC이 과발현되는 조건 하에 항원 존재 하에 배양한다. 일부 실시형태에서, AN1/T3 세포 집단을 포함하는 림프구를 항원 및 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성 존재 하에 배양한다. 일부 실시형태에서, AN1/T3 세포 집단을 포함하는 림프구를 독시사이클린 존재 하에 배양한다. 일부 실시형태에서, 상기 독시사이클린 농도는 약 0.01 nM∼약 300 nM이다. 일부 실시형태에서, 상기 독시사이클린 농도는 약 1 nM∼약 100 nM이다. 일부 실시형태에서, 상기 독시사이클린 농도는 40 nM∼60 nM이다. 일부 실시형태에서, 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유사체를 독시사이클린 대신에 사용한다.
일부 실시형태에서, 항원 특이적 B 세포를 선별하여 다양한 적절한 방법으로 단리한다. 유세포 측정법, 패닝, 자성 비드, 친화성 컬럼, 면역컬럼 및 다양한 세포 분류 수단을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다수의 세포 선별 및 세포 단리 기법을 이용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 배양된 세포를 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드)가 활성화되는 조건 하에 항원에 재노출시킨다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-ER 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-GR 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 선택된 항원 특이적 B 세포 또는 항원 특이적 항체를 발현하는 세포를 클로닝하여 파트너 세포에의 세포 융합에 대한 필요성 없이 증식시킨다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) AN1/T3 B 세포를 제공하는 단계로서, 상기 AN1/T3 B 세포는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 것인 단계; (b) 상기 AN1/T3 B 세포를 항원과 접촉시키는 단계로서, 상기 AN1/T3 B 세포는 상기 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 단계; 및 (c) 상기 AN1/T3 B 세포에서 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-ER 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-GR 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 복수의 AN1/T3 B 세포로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 AN1/T3 B 세포는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재하고, 상기 AN1/T3 B 세포에서의 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성의 유도는 생체 내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 상기 AN1/T3 B 세포와 항원의 접촉은 시험관 내 또는 생체 외에서 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 유도 단계 전에 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열) 또는 Myc 펩티드를 생체 외에서 AN1/T3 B 세포에 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-ER 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-GR 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 Myc 펩티드를 생체 외에서 상기 AN1/T3 B 세포로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-ER 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-GR 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 상기 AN1/T3 B 세포는 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성 유도 전에는 무력성 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 Myc 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 Myc 펩티드의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 프로모터는 하나 이상의 TRE을 포함하고, 상기 재조합 AN1/T3 B 세포는 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 추가로 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 AN1/T3 B 세포는 tTA 펩티드를 발현한다.
일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 것은 재조합 AN1/T3 B 세포를 ER 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 것은 재조합 AN1/T3 B 세포를 GR 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 AN1/T3 B 세포는 마우스 세포이다. 일부 실시형태에서, AN1/T3 B 세포를 항원과 접촉시키는 것은 유기체를 선택된 항원과 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 면역화된 유기체는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)을 보유하는 유기체(예를 들어, 포유동물)이다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 유도성 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)이다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터는 하나 이상의 TRE를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 담체를 추가로 포함하고, tTA 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열) 또는 rtTA 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 담체를 추가로 포함하고, 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 발현한다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) 무력성 또는 관용성 B 세포를 제공하는 단계로서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 것인 단계; (b) 상기 무력성 또는 관용성 B 세포를 항원과 접촉시키는 단계로서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 단계; 및 (c) 상기 무력성 또는 관용성 B 세포에서 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-ER 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-GR 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 복수의 무력성 또는 관용성 B 세포로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재하고, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포에서 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 것은 생체 내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포를 항원과 접촉시키는 것은 시험관 내 또는 생체 외에서 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 유도 단계 전에 Myc 펩티드 또는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 무력성 또는 관용성 B 세포로 생체 외에서 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 Myc 펩티드를 생체 외에서 상기 무력성 또는 관용성 B 세포로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-ER 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-GR 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성의 유도 전에 선택된 항원에 대해 무력성 또는 관용성이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다.
일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 Myc 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 Myc 펩티드의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 프로모터는 하나 이상의 TRE를 포함하며, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 추가로 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는 tTA 펩티드를 발현한다.
일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 것은 무력성 또는 관용성 B 세포를 ER 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 것은 무력성 또는 관용성 B 세포를 GR 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는 마우스 세포이다. 일부 실시형태에서, 무력성 또는 관용성 B 세포를 항원과 접촉시키는 것은 선택된 항원을 유기체에 투여하는 것(즉, 상기 유기체를 면역화하거나 접종하는 것)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역화된 동물는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)을 보유하는 유기체(예를 들어, 포유동물)이다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 유도성 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)이다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 프로모터를 포함하며, 상기 프로모터는 하나 이상의 TRE를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 담체를 추가로 포함하며, tTA 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열) 또는 rtTA 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 담체를 추가로 포함하며, 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 발현한다.
일부 실시형태에서, 관심있는 항원 특이적 항체를 생산하는 B 세포주로의 AN1/T3 집단의 형질전환은 생체 내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 MMTV-tTA/TRE-Myc 유기체를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 Eu-Myc, Myc-GR, 또는 Myc-ER 유기체를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, Myc을 과발현하는 임의의 유기체가 사용된다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 소분자, 생물학적 물질, 펩티드, 항체, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1, Mxi-1 또는 MAD의 길항제, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Max-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 Mxi-1의 길항제이다. 일부 실시형태에서, 상기 소분자는 MAD의 길항제이다. 일부 실시형태에서, MYC의 과발현은 세포를 Max-1, Mxi-1 또는 MAD에 대한 siRNA 분자, 또는 이들의 조합과 접촉시키는 것에 의해 유도한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성이 유도성인 임의의 유기체를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성이 존재하거나 유도성인 임의의 마우스를 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, MYC을 과발현하는 유기체는 마우스이다. 일부 실시형태에서, 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 유기체를 선택된 항원에 노출시키고, 이 유기체를 MYC이 과발현되는 조건 하에 유지한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 통합된 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)에 의해 선택된 항원을 발현하는 유기체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항원에 대한 관용성은 생체 내에서 MYC의 과발현에 의해 파괴된다. 일부 실시형태에서, 항원에 대한 B 세포 관용성은 선택된 항원에 결합하는 AN1-T3 세포에서의 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성에 의해 파괴된다. 일부 실시형태에서, 관용성은 생체 내에서 무력성 B 세포에서 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 것에 의해 파괴된다. 일부 실시형태에서, 생체 내 MYC의 과발현은 한때 무력성이었던 선택된 항원에 대한 항체를 생산하는 B 세포 집단의 증식으로 이어진다. 일부 실시형태에서, 항원 특이적 B 세포의 증식을 유도하기 위해 MYC을 3 주령 또는 그 이후에 과발현시킨다. 일부 실시형태에서, MYC을 3∼30 주령에 과발현시킨다. 일부 실시형태에서, MYC을 3∼6 주령, 3∼12 주령, 또는 3∼24 주령에 과발현시킨다. 일부 실시형태에서, MYC을 6 주령에 과발현시킨다. 일부 실시형태에서, Myc을 본원에 기재된 것과 같은 항원 특이적 B 세포를 생산하는 유기체의 생활 주기 중 임의의 시점에 발현시킨다.
일부 실시형태에서, 항원에 노출된 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스를 수태 이후부터 독시사이클린 식이로 유지시킨다. 후에 MYC의 과발현을 유도하기 위해 이들 마우스의 식이를 정상 식이로 전환한다. 일부 실시형태에서, 3∼30 주령에 식이로부터 독시사이클린을 제거한다. 일부 실시형태에서, 3∼6 주령, 3∼12 주령, 또는 3∼24 주령에 식이로부터 독시사이클린을 제거한다. 일부 실시형태에서, 6 주령에 식이로부터 독시사이클린을 제거한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 항원 특이적 B 세포를 생산하는 유기체의 생활 주기 중 임의의 시점에 식이로부터 독시사이클린을 제거한다. 상기 유기체를 B 세포 림프종의 발달과 관련된 임상 신호를 나타내는지에 대해 매일 조사한다. 일부 실시형태에서, B 세포 림프종을 발달시킨 마우스는 지저분한 털, 외적으로 명백한 림프절병증, 탈수, 무기력감, 뒷다리 마비(상행형) 등을 나타낸다. 종양이 발달되면, 발생된 종양으로부터, 또는 림프절, 비장, 골수 또는 혈액으로부터 백혈구를 단리한다. 일부 실시형태에서, 종양 발달 전에 백혈구를 단리한다. 일부 실시형태에서, MYC을 과발현하는 항원 특이적 B 세포를 단리된 백혈구로부터 회수한다. 일부 실시형태에서, 회수된 항원 특이적 B 세포를 시험관 내에서 증식시킨다. 일부 실시형태에서, 항원에 대한 항원 특이적 항체를 Myc을 발현하도록 유전자 조작된 선택된 항원 특이적 B 세포로부터 회수한다. 일부 실시형태에서, 단일클론 세포주를 회수된 항원 특이적 B 세포로부터 생성한다. 일부 실시형태에서, 단일클론 항체를 선택된 항원 특이적 B 세포로부터 생성한다. 일부 실시형태에서, 생존 가능한 1차 항체 생산 세포를 추후에 사용할 수 있도록 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 동결 보관한다. 일부 실시형태에서, B 세포 림프종을 가진 유기체로부터 직접 항체를 단리한다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) 무력성 또는 관용성 B 세포를 제공하는 단계로서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 것인 단계; (b) 상기 무력성 또는 관용성 B 세포를 항원과 접촉시키는 단계로서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포가 선택된 항원과 특이적으로 결합하는 것인 단계; 및 (c) 상기 무력성 또는 관용성 B 세포에서 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-ER 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-GR 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는, 항원 및 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성에 노출되면, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 불멸 B 세포로 형질전환된다. 일부 실시형태에서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는, 항원 및 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성에 노출되면, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 불멸 B 세포로 형질전환되며, 세포 융합은 필요하지 않다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 복수의 불멸 B 세포로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재하며, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포에서 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 것은 생체 내에서 이루어진다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 유도 단계 전에 Myc 펩티드 또는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 생체 외에서 무력성 또는 관용성 B 세포에 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-ER 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-GR 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 생체 외에서 무력성 또는 관용성 B 세포로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-ER 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-GR 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성 유도 전에 선택된 항원에 대해 무력성 또는 관용성이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 Myc 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 Myc 펩티드의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 프로모터는 하나 이상의 TRE를 포함하며, 상기 재조합 무력성 또는 관용성 B 세포는 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 추가로 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 무력성 또는 관용성 B 세포는 tTA 펩티드를 발현한다.
일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 것은 재조합 무력성 또는 관용성 B 세포를 ER 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 것은 재조합 무력성 또는 관용성 B 세포를 GR 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 무력성 또는 관용성 B 세포는 마우스 세포이다. 일부 실시형태에서, 무력성 또는 관용성 B 세포를 항원과 접촉시키는 것은 유기체를 선택된 항원으로 면역화하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역화된 동물은 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)을 보유하는 유기체(예를 들어, 포유동물)이다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 유도성 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)이다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터는 하나 이상의 TRE를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 담체를 추가로 포함하고, tTA 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열) 또는 rtTA 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 담체를 추가로 포함하고, 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 발현한다.
일부 실시형태에서, 본원은 (a) CD79 양성 세포를 제공하는 단계로서, 상기 CD79 양성 세포가 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 것인 단계;, (b) 상기 CD79 양성 세포를 항원과 접촉시키는 단계로서, 상기 CD79 양성 세포는 상기 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 것인 단계; 및 (c) 상기 CD79 양성 세포에서 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 항체의 제조 방법을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 CD79 양성 세포는, 항원 및 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성에 노출되면, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 불멸 CD79 양성 세포로 형질전환된다. 일부 실시형태에서, 상기 CD79 양성 세포는, 항원 및 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성에 노출되면, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 불멸 B 세포로 형질전환되며, 세포 융합은 필요하지 않다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 복수의 불멸 CD79 양성 세포로부터 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, CD79 양성 세포는 유기체(예를 들어, 포유동물) 내에 존재하고, CD79 양성 세포에서 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 것은 생체 내에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-ER 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-GR 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 상기 유도 단계 전에 Myc 펩티드 또는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 생체 외에서 CD79 양성 세포로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-ER 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-GR 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 Myc 펩티드(예를 들어, 재조합 Myc 펩티드(예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 Myc 융합 펩티드))를 생체 외에서 CD79 양성 세포로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 PTD를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 TAT-Myc 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-ER 펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 본원에 기재된 것과 같은 Myc-GR 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 단백질 전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 CD79 양성 세포는 Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성의 유도 전에 선택된 항원에 대해 무력성 또는 관용성이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자기 항원이다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 Myc 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)은 Myc 펩티드의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 프로모터는 하나 이상의 TRE를 포함하며, 상기 재조합 CD79 양성 세포는 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 추가로 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 재조합 CD79 양성 세포는 tTA 펩티드를 발현한다.
일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-ER 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 것은 재조합 CD79 양성 세포를 ER 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 Myc 펩티드는 Myc-GR 융합 펩티드이다. 일부 실시형태에서, Myc(예를 들어, 재조합 Myc) 활성을 유도하는 것은 재조합 CD79 양성 세포를 GR 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 CD79 양성 세포는 마우스 세포이다. 일부 실시형태에서, CD79 양성 세포를 항원과 접촉시키는 것은 유기체를 선택된 항원으로 면역화하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체는 제노마우스이다. 일부 실시형태에서, 상기 면역화된 동물은 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 핵산 서열)을 보유하는 유기체(예를 들어, 포유동물)이다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 유도성 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)이다. 일부 실시형태에서, 상기 유도성 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)은 프로모터를 포함하며, 상기 프로모터는 하나 이상의 TRE를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 담체를 추가로 포함하며, tTA 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열) 또는 rtTA 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 발현한다. 일부 실시형태에서, 상기 유기체(예를 들어, 포유동물)는 담체를 추가로 포함하며, 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 발현한다.
일부 실시형태에서, 불멸 항체 생산 세포는 인간, 비인간 영장류, 마우스, 랫트, 닭, 토끼, 돼지, 소 또는 양을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 B 세포를 생성할 수 있는 임의의 동물로부터 얻는다.
일부 실시형태에서, 생성된 항체 생산 세포(예를 들어, 동물 B 세포)는 불멸 및/또는 악성 세포이다. B 세포와 골수종 파트너의 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 융합으로부터 얻은 하이브리도마는 일반적으로 이핵접합체이며 2개 이상의 별개의 핵을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체 생산 세포(예를 들어, B 세포)는 하나의 핵을 갖는다. B 세포와 골수종 파트너의 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 융합으로부터 얻은 하이브리도마는 각각의 공여친 세포 내에 존재하는 염색체수의 합과 대개 동일한 증가된 염색체수를 포함한다. 시간이 경과함에 따라, 또 여러 차례의 세포 계대를 거침에 따라, 하이브리도마는 종종 일부 염색체를 상실하게 되지만, 일반적으로 공여친 세포 중 어느 하나에 존재하는 것보다는 더 많은 염색체를 유지한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법 중 어느 하나에 의해 생성된 항체 생산 세포(예를 들어, B 세포)는 Myc이 과발현되기 전에 존재하였던 것과 동일한 수의 염색체를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체 생산 세포는 항체 생산 직전 시점과 비교할 때 5개 이하의 추가의 염색체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체 생산 세포는 항체 생산 직전 시점과 비교할 때 4개 이하의 추가의 염색체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체 생산 세포는 항체 생산 직전 시점과 비교할 때 3개 이하의 추가의 염색체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체 생산 세포는 항체 생산 직전 시점과 비교할 때 2개 이하의 추가의 염색체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체 생산 세포는 항체 생산 직전 시점과 비교할 때 1개 이하의 추가의 염색체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체 생산 세포는 항체 생산 직전 시점과 비교할 때 추가의 염색체를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 반응성 비장 B 세포를 발암 펩티드(예를 들어, Myc) 존재 하에 배양한다. 일부 실시형태에서, 반응성 비장 B 세포를 Myc 펩티드 존재 하에 배양한다. 일부 실시형태에서, 반응성 비장 B 세포를 본원에 개시된 TAT-Myc 융합 펩티드는 존재 하에 배양한다. 일부 실시형태에서, 반응성 비장 B 세포를 TAT-Myc 융합 펩티드 존재 하에 배양하는 것은 B 세포와 골수종 융합 파트너의 융합을 촉진한다. 일부 실시형태에서, 반응성 비장 B 세포를 TAT-Myc 융합 펩티드 존재 하에 배양하는 것은 B 세포와 골수종 융합 파트너를 융합할 때 S 기에서 반응성 B 세포를 사용할 필요성을 개선한다.
TAT-MYC 융합 펩티드
본원은 특정 실시형태에서, (a) 수송체 펩티드 서열; 및 (b) MYC 서열을 포함하는 융합 펩티드를 개시한다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 펩티드는 펩티드 하기 식 (I):
수송체 펩티드 서열-MYC 서열
의 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 (a) 수송체 펩티드 서열; (b) MYC 서열; 및 (c) 상기 수송체 펩티드 서열과 상기 MYC 서열을 연결하는 하나 이상의 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 펩티드는 하기 식 (II):
수송체 펩티드 서열-X-MYC 서열
의 펩티드이며, 여기서 -X-는 상기 수송체 펩티드 서열과 상기 MYC 서열을 연결하는 분자이다. 일부 실시형태에서, -X-는 아미노산이다. 일부 실시형태에서, -X-는 하나 이상의 아미노산이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 (a) TAT 및 (b) c-MYC을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 (a) TAT[48-57] 및 (b) c-MYC을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 (a) TAT[57-48] 및 (b) c-MYC을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 (a) TAT, (b) 링커 아미노산 및 (c) c-MYC을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 (a) TAT[48-57], (b) 링커 아미노산 및 (c) c-MYC을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 (a) TAT[57-48], (b) 링커 아미노산 및 (c) c-MYC을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 융합 단백질의 정제를 용이하게 하는 하나 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 단백질 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 폴리히스티딘 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 에피토프 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 폴리히스티딘 태그와 에피토프 태그 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 6-히스티딘 태그(서열 번호 2)와 V5 에피토프 태그 중 하나 이상을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 히스티딘 태그는 6-히스티딘 태그(서열 번호 2)이다. 일부 실시형태에서, 상기 히스티딘 태그는 서열 HHHHHH(서열 번호 2)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리His 태그를 임의의 적절한 방법에 의해 본원에 개시된 융합 단백질에 부가한다. 일부 실시형태에서, TAT-MYC 펩티드 서열을 폴리His 태그를 코딩하는 발현 벡터로 클로닝한다. 일부 실시형태에서, 폴리His 태그를 PCR에 의해 부가한다(즉, PCR 프라이머는 폴리His 서열을 포함한다).
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 하나 이상의 단백질 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 에피토프 태그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 융합 펩티드는 V5 에피토프 태그를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, V5 태그는 아미노산: GKPIPNPLLGLDST(서열 번호 3)를 포함한다. 일부 실시형태에서, V5 태그는 아미노산: IPNPLLGLD(서열 번호 4)를 포함한다. 일부 실시형태에서, V5 태그를 임의의 적절한 방법에 방법에 의해 본원에 개시된 융합 단백질에 부가한다. 일부 실시형태에서, TAT-MYC 펩티드 서열을 V5 태그를 코딩하는 발현 벡터로 클로닝한다. 일부 실시형태에서, V5 태그를 PCR에 의해 부가한다(즉, PCR 프라이머는 V5 서열을 포함한다).
일부 실시형태에서, 아미노산은 D형이다. 일부 실시형태에서, 아미노산 L형이다. 일부 실시형태에서, 복수의 제1 아미노산은 D형이고, 복수의 제2 아미노산은 L형이다.
일부 실시형태에서, MYC 증가제는 하기 서열을 포함한다:
TAT-MYC 펩티드의 구성
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 TAT-MYC 융합 펩티드는 임의의 적절한 방법에 의해 구성된다. 일부 실시형태에서, TAT-MYC 융합 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 PCR에 의해 생성한다. 일부 실시형태에서, 인간 MYC 서열에 대한 정방향 프라이머는 TAT 단백질 전달 도메인의 프레임 내 N 말단의 9개 아미노산(즉, RKKRRQRRR)(서열 번호 6)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인간 MYC 서열에 대한 역방향 프라이머는 종결 코돈이 제거되도록 디자인한다. 일부 실시형태에서, PCR 생성물을 임의의 적절한 발현 벡터(이하, p-TAT-MYC)로 클로닝한다. 일부 실시형태에서, 상기 발현 벡터는 폴리히스티딘 태그 및 V5 태그를 포함한다.
재조합 폴리펩티드
본원에서는 특정 재조합 폴리펩티드를 개시한다. 특정 경우, 항체는 폴리펩티드 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체의 경쇄를 코딩하는 DNA 서열과 중쇄를 코딩하는 DNA 서열을 적절한 방법에 따라 역전사효소와 DNA 중합효소를 사용하여 동시에 또는 개별적으로 제조한다. 일부 실시형태에서, PCR은 공통 불변 영역 프라이머에 의해 또는 공개된 중쇄 및 경쇄 DNA 및 아미노산 서열을 기초로 한 보다 특이적 프라이머에 의해 개시한다. 상기에 기재한 바와 같이, 일부 실시형태에서, 항체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA 클론을 단리하기 위해 PCR을 사용하기도 한다. 일부 실시형태에서, 상기 라이브러리를 공통 프라이머 또는 상동성이 더 큰 프로브(예컨대, 마우스 불변 영역 프로브)로 스크리닝한다.
일부 실시형태에서, DNA, 예를 들어, 플라스미드 DNA를 임의의 적절한 방법에 의해 세포(예를 들어, 포유동물 세포)로부터 단리하여, 예를 들어 재조합 DNA 기법과 관련된 전술한 참고문헌에 상세히 기재된 임의의 적절한 기법에 따라 제한 효소 맵핑하고, 서열결정한다. 일부 실시형태에서, DNA를 단리 과정 또는 후속 분석 과정의 임의의 시점에 합성한다.
일부 실시형태에서, 항체, 또는 항원 결합성 단편, 변이체, 또는 이들의 유도체를 제공하기 위해 단리된 유전 물질을 조작한 후, 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 원하는 양의 항체를 생산하는 데 사용되는 숙주 세포로 도입하기 위한 발현 벡터에 삽입한다.
특정 실시형태에서, 표적 분자에 결합하는 항체, 이의 단편, 유도체 또는 유사체(예를 들어, 항체의 중쇄 또는 경쇄)의 재조합 발현은 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터의 작제를 이용한다. 항체 분자 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄, 또는 이의 일부분(바람직하게는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 얻어지면, 일부 실시형태에서, 임의의 적절한 기법을 이용하여 재조합 DNA 기술로 항체 분자의 제조를 위한 벡터를 제조한다. 따라서, 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 단백질을 제조하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시형태에서, 적절한 전사 및 번역 조절 서열을 포함하는 항체 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터의 임의의 적절한 작제 공정이 본원에 개시된 방법에 이용된다. 이러한 공정으로는, 예를 들어 시험관 내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체 내 유전자 재조합을 들 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항체 분자, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄, 또는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복제 가능한 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 항체의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 항체의 가변 도메인은 전체 중쇄 또는 경쇄의 발현을 위한 벡터로 도입된다.
일부 실시형태에서, 클로닝된 가변 영역 유전자를 상기에 언급된 것과 같은 중쇄 및 경쇄 불변 영역 유전자와 함께 발현 벡터로 삽입한다. 일부 실시형태에서, 진핵생물 세포에서 발현을 유발할 수 있는 발현 벡터를 사용한다. 적절한 벡터의 예로는 플라스미드 pcDNA3, pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1 및 pZeoSV2(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 Invitrogen 제품) 및 플라스미드 pCI(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 Promega 제품)를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 특정 경우, 다수의 형질전환 세포를, 적당히 높은 수준의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 발현하는 세포에 대해 스크리닝하는 것은 임의의 적절한 방법으로, 예를 들어, 로봇 시스템으로 수행한다.
일부 실시형태에서, 항체를 코딩하는 벡터 또는 DNA 서열이 제조되면, 발현 벡터를 본원에 개시된 것과 같은 적절한 숙주 세포로 도입한다. 숙주 세포로의 플라스미드의 도입은 임의의 적절한 방법에 의해 수행한다. 이러한 방법으로는 형질감염(전기천공을 포함함), 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 막에 싸인 DNA와의 세포 융합, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 마이크로인젝션, 양이온 지질 매개 형질감염, 형질도입, 스크레이프 로딩(scrape loading), 탄도체 도입(ballistic introduction) 및 온전한 바이러스에 의한 감염을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 예를 들어, 문헌[Ridgway (1988) "Mammalian Expression Vector＂ in Vectors, ed. Rodriguez and Denhardt (Butterworths, Boston, Mass.), 24.2장, pp. 470-472]; 문헌[Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y]을 참조할 수 있다. 특정 경우, 발현 구성체를 보유하는 숙주 세포를 경쇄 및 중쇄 생산에 적절한 조건 하에 배양하고, 중쇄 및/또는 경쇄 단백질 합성에 대해 분석한다. 예시적인 분석 기법으로는 ELISA, 방사성 면역분석(RIA) 또는 형광 활성화 세포 분류 분석(FACS), 면역조직학적 분석 등을 들 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이, 핵산 및/또는 벡터를 숙주 유기체로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 것은 임의의 적절한 방법에 의해 수행한다. 이러한 방법의 예로는 유전자 총 기법, 네이키드(naked) DNA 면역화, 유전자 이식 또는 염색체 이식 유기체 제조, 렌티바이러스 매개 유전자 이식 유기체 제조, 백시니아 바이러스 및 아데노바이러스 형질도입을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
본원에 개시된 바와 같이, 항원을 유기체 또는 세포로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 것은 임의의 적절한 방식을 포함한다. 이러한 방법 중 일부의 예로는 Tat 융합 펩티드의 사용, 다양한 면역화 프로토콜, 바이러스에 의한 감염 및 항원을 발현하는 전체 세포의 도입을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 발현 벡터를 임의의 적절한 방법에 의해 숙주 세포로 도입하고, 형질감염된 세포를 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 항체를 제조하기 위해 통상적인 기법 또는 본원에 개시된 기법으로 배양한다. 따라서, 본원은 특정 실시형태에서, 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 항체, 또는 이의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 이중쇄 항체의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 벡터를 전체 면역글로불린 분자의 발현에 사용한다.
일부 실시형태에서, 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt- 세포에서 이용되는 단순 허피스 바이러스 티미딘 키나제 유전자[Wigler et al. (1977) Cell 11:223], 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자[Szybalska and Szybalski (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자[Lowy et al. (1980) Cell 22:817]를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다수의 선별 시스템이 이용된다. 또한, 일부 실시형태에서, 하기 유전자의 선별을 위한 기초로서 대사길항물질 내성이 이용된다: dhfr, 이것은 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함[Wigler et al. (1980) Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527]; gpt, 이것은 마이코페놀산에 대한 내성을 부여함[Mulligan and Berg (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072]; neo, 이것은 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여함[Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu (1991) Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev (1993) Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) Science 260:926-932; 및 Morgan and Anderson (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); TIB TECH 11(5):155-215 (May, 1993)]; 및 hygro, 이것은 하이그로마이신에 대한 내성을 부여함[Santerre et al. (1984) Gene 30:147]. 일부 실시형태에서, 문헌[Ausubel et al. (1993) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY)]; 문헌[Kriegler (1990) "Gene Transfer and Expression＂ in A Laboratory Manual (Stockton Press, NY)]; 문헌[Dracopoli et al. (eds) (1994) Current Prolocols in Human Genetics (John Wiley & Sons, N.Y.) 12장 및 13장]; 문헌[Colberre-Garapin et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1]에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 기술 분야에 널리 알려진 방법이 이용된다.
일부 실시형태에서, 항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해 증가시킨다(재검토를 위해서는, 문헌[Bebbington and Hentschel (1987) "The Use of Vectors Based on Gene Amplification for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA Cloning" (Academic Press, NY) 3권] 참조). 항체 발현 벡터 시스템 내의 마커를 증폭시킬 경우, 숙주 세포 배양물 중에 존재하는 억제제 수준의 증가가 마커 유전자 카피수를 증가시킨다. 증폭된 영역은 항체 유전자와 관련이 있기 때문에, 항체 생산 역시 증가한다[Crouse et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:257].
항체 회수
본원에 개시된 임의의 방법의 다양한 실시형태에서, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체 및 이러한 항체를 생산하는 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 유기체(예를 들어, 마우스, 토끼)의 조직(비장, 림프절, 혈액 등) 또는 혈청으로부터 직접 단리한다. 일부 실시형태에서, 비장 조직으로부터 항체를 단리한다. 일부 실시형태에서, 림프절로부터 항체를 회수한다. 일부 실시형태에서, 혈액으로부터 항체를 회수한다. 일부 실시형태에서, 임의의 적절한 방법으로 조직을 회수한다.
일부 실시형태에서, 선택된 항원 존재 하에 항체를 회수한다. 일부 실시형태에서, 발암 펩티드(예를 들어, Myc, TAT-Myc) 존재 하에 항체를 회수한다. 일부 실시형태에서, 발암 펩티드(예를 들어, Myc, TAT-Myc) 및 선택된 항원 존재 하에 항체를 회수한다. 일부 실시형태에서, Myc 펩티드 존재 하에 항체를 회수한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 TAT-Myc 융합 펩티드 존재 하에 항체를 회수한다.
일부 실시형태에서, 선택된 항원, 선택된 항원 및 발암 펩티드, 선택된 항원 및 Myc, 또는 선택된 항원 및 TAT-Myc 존재 하에서의 항체의 회수는 관용성 및/또는 무력성 세포의 농도를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원 및 TAT-Myc 존재 하에서의 항체의 회수는 관용성 및/또는 무력성 세포(예를 들어, B 세포)의 농도를 감소시킨다.
규모 확장
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 항체를 대규모 생산을 위해 재조작한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 항체를, 예를 들어, GMP 또는 cGMP 가이드라인에 따른 임상적 사용 또는 진단 분석에서의 사용을 위해 대규모 생산을 위해 재조작한다. 일부 실시형태에서, 선택된 항체를 하기 a 및 b에 의해 제조한다:
a. 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc) 및/또는 재조합 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, B 세포)로부터 항체를 코딩하는 핵산을 회수하는 단계;
b. 항체를 코딩하는 핵산을 항체의 대규모 생산에 적합한 세포로 도입하는(또는 다른 방식으로 제공하는) 단계.
일부 실시형태에서, 발암 펩티드를 발현하도록 유전자 조작되고 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포를 본원에 기재된 임의의 방법에 따라 제조한다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 항체를 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간 항체이다. 특정 실시형태에서, 세포는 인간 항체를 발현한다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 발암 펩티드(예를 들어, 재조합 발암 펩티드; 예를 들어, Myc)를 코딩하는 핵산 서열(예를 들어, 유전자 이식 서열)을 포함하는 세포(예를 들어, B 세포)를 선택된 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 항체 생산에 적합한 조건 하에 항체의 대규모 생산에 적합한 세포(예를 들어, 포유동물 세포)를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 항체를, 예를 들어, 0.1 kg 이상, 0.5 kg 이상, 1 kg 이상, 10 kg 이상, 또는 100 kg 이상의 양으로 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
대규모 생산을 위한 임의의 적절한 세포주가 이러한 방법에 사용된다. 대규모 생산에 적합한 세포 또는 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소 CHO, NSO, BSC-1 세포, LLC-MK 세포, CV-1, HeLa, HEK293, VERO, MDBK, MDCK, MDOK, CRFK, RAF, TCMK, LLC-PK, PK15, WI-38, MRC-5, T-FLY, BHK, BRL 3A, HepG2, HT1080 또는 이들의 유도체를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 항체의 대규모 생산을 위해, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 항체를 코딩하는 핵산을, Myc을 발현하도록 유전자 조작되고 CHO 세포 또는 이들의 유도체(DHFR 선별 마커와 함께 사용되는 dhfr- CHO 세포를 포함함)로 재도입된 B 세포로부터 회수한다. 일부 실시형태에서, Myc을 발현하도록 유전자 조작되고 항체의 대규모 생산에 적합한 식물 세포로 재도입된 B 세포로부터 관심있는 항체를 코딩하는 핵산을 회수한다. 일부 실시형태에서, Myc을 발현하도록 유전자 조작되고 항체의 대규모 생산에 적합한 식물, 식물의 일부 또는 식물 종자로 재도입된 B 세포로부터 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 항체를 코딩하는 핵산을 회수한다. 일부 실시형태에서, Myc을 발현하도록 유전자 조작되고 항체의 대규모 생산을 위해 목화, 감자, 대두, 옥수수(corn, maize), 담배, 대두, 알팔파 또는 벼로 재도입된 B 세포로부터 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 항체를 코딩하는 핵산을 회수한다. 일부 실시형태에서, Myc을 발현하도록 유전자 조작되고 항체의 대규모 생산을 위해 효모로 재도입된 B 세포로부터 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 항체를 코딩하는 핵산을 회수한다[Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220; 및 R. J. Kaufman and P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621].
시험관 내 생산에 의하면 원하는 폴리펩티드를 다량 생산할 수 있도록 규모 확장이 가능하다. 조직 배양 조건 하에서의 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 배양 기법으로는, 예를 들어 공기 부양 반응기 또는 연속 교반 반응기에서의 균질 현탁 배양, 또는 예를 들어 중공 섬유, 마이크로캡슐 또는 아가로스 마이크로비드 또는 세라믹 카트리지에서의 고정화 또는 봉입 세포 배양을 들 수 있다. 필요에 따라 및/또는 원할 경우, 일부 실시형태에서, 폴리펩티드 용액을 임의의 적절한 방식으로 정제한다. 이러한 방법의 예로는 크로마토그래피법, 예를 들어 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, DEAE-셀룰로스 크로마토그래피 또는 (면역) 친화성 크로마토그래피를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
항체 분자가 재조합에 의해 발현되면, 일부 실시형태에서, 이 항체를 면역글로불린 분자의 정제를 위한 임의의 적절한 방법, 예를 들어, 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 단백질 A 친화성, 단백질 G 친화성, 겔 여과 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차등 또는 항체 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의해 정제한다. 일부 실시형태에서, 단리된 항체는 이러한 항체를 포함하는 혈청, 또는 다양한 정도로 정제된 항체를 포함한다.
항원
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 항원에 결합하고/하거나 항원에 특이적인 항체를 생성하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원은 치료 대상이다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원이 TNF 또는 TNF 수용체 패밀리 구성원 또는 TNF 유사 분자인 항원에 결합하는 항체를 생성한다. 일부 실시형태에서, 상기 TNF 또는 TNF 수용체 패밀리 구성원 또는 TNF 유사 분자는 TNF-알파, 림포톡신(LT), LT-알파(TNF-베타라고도 함), LT-베타(LT-알파와의 복합 이종삼량체에서 관찰됨), OPGL, FasL, CD27L, CD30L, CD40L, 4-1BBL, DcR3, OX40, OX40L, TNF-감마(국제 공개 공보 WO 96/14328), TRAIL, AIM-II(국제 공개 공보 WO 97/34911), APRIL(J. Exp. Med. 188(6):1185-1190), 엔도카인-알파(국제 공개 공보 WO 98/07880), TR6(국제 공개 공보 WO 98/30694), OPG 및 뉴로카인-알파(국제 공개 공보 WO 98/18921), OX40, 및 신경 성장 인자(NGF), 및 Fas, CD30, CD27, CD40 및 4-1BB의 가용성 형태, TR2(국제 공개 공보 WO 96/34095), DR3(국제 공개 공보 WO 97/35904), TR5(국제 공개 공보 WO 98/30693), TR6(국제 공개 공보 WO 98/30694), TR7(국제 공개 공보 WO 98/41629), TRANK, TR9(국제 공개 공보 WO 98/56892), TR10(국제 공개 공보 WO 98/54202), 312C2(국제 공개 공보 WO 98/06842), 및 TR12, LIGHT, TRANCE, TACI, BAFFR, BCMA, NGFR, APRIL, CD154, CD70, CD153(이들 분자의 모든 가용성 및 막 결합형 형태를 포함함)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원이 임의의 사이토카인 또는 인터루킨인 항원에 결합하는 항체를 생성한다. 일부 실시형태에서, 상기 사이토카인 또는 인터루킨 항원은 IL-1알파, IL-1베타, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, MIF, GM-CSF 및 G-CSF로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 선택된 항원이 케모카인 또는 케모카인 수용체인 항원에 결합하는 항체를 생성한다. 일부 실시형태에서, 상기 케모카인 항원은 감마-인터페론 유도성 단백질-10(γP-10), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판 인자-4(PF4), 호중구 활성화 단백질(NAP-2), GRO-α, GRO-β, GRO-γ, 호중구 활성화 펩티드(ENA-78), 과립구 화학유인 단백질-2(GCP-2) 및 기질 세포 유래 인자-1(SDF-1, 또는 전구 B 세포 자극 인자(PBSF))로부터 선택되고/되거나; β(CC) 케모카인은 RANTES(활성화될 때 조절되고, 정상 T 세포에서 발현되고 분비됨), 대식세포 염증성 단백질-1 알파(MIP-1α), 대식세포 염증성 단백질-1 베타(MIP-1β), 단핵구 주화성 단백질-1(MCP-1), 단핵구 주화성 단백질-2(MCP-2), 단핵구 주화성 단백질-3(MCP-3), 단핵구 주화성 단백질-4(MCP-4), 대식세포 염증성 단백질-1 감마(MIP-1γ), 대식세포 염증성 단백질-3 알파(MIP-3α), 대식세포 염증성 단백질-3 베타(MIP-3β), 대식세포 염증성 단백질-4(MIP-4/DC-CK-1/PARC), 에오탁신, 엑소더스(Exodus) 및 I-309; 및/또는 γ(C) 케모카인 및 림포택틴으로 구성된 군에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 케모카인 수용체이다. 일부 실시형태에서, 상기 케모카인 리간드는 CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL10, CCL11, CCL12, CCL13, CCL2, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27 및 CCL28을 포함하는 리스트로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 및 CCR11로부터 선택되는 케모카인 수용체이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 섬유아세포 성장 인자이다. 일부 실시형태에서, 상기 섬유아세포 성장 인자는 FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14 및 FGF-15로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 세포 표면 단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 표면 단백질은 인간 백혈구 분화 항원이다. 일부 실시형태에서, 인간 백혈구 분화 항원은 CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD10, CD20, CD100, CD280, CD281, CD282, CD283, CD284 및 CD289로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 인간 백혈구 분화 항원은 CD1∼CD300을 포함하는 리스트로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 세포내 암 바이오마커 이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 HIV에 의해 코딩된다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 Gag, pol, 프로테아제(prot), 역전사효소, 인테그라제, RNAseH, Tat, Rev, Nef, Vpr, Vpu, Vif 및 Env(예를 들어, gp120, gp140, gp41 및 gp160)로부터 선택되는 HIV 코딩 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 오르소믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 종으로부터 유래된 항원이다. 일부 실시형태에서, 오르소믹소바이러스과 유래의 선택된 항원은, 비한정적인 예로서, H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2 H9N2, H7N2, H7N3 및 H10N7로부터 선택되는 인플루엔자 A 균주로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 오르소믹소바이러스과 유래의 헤마글루티닌 당단백질이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 오르소믹소바이러스과 유래의 뉴라미니다제이다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 코로나바이러스로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 SARS 코로나바이러스로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 선택된 자기 항원에 결합하고/하거나 선택된 자기 항원에 특이적인 항체를 생성하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 상기 자기 항원은 유기체, 조직 또는 세포 내에서 기원한다. 일부 실시형태에서, 자기 항원은 내인성 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 자기 항원은 내인성 레트로바이러스에 의해 생성된 내인성 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 자기 항원은 신 자기 항원, 미생물 또는 기생충 코딩 신 자기 항원, 또는 유기체 또는 세포에 대한 유전자 조작으로 인하여 발현된 다른 신 자기 항원을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키메라 마우스는 신 자기 항원을 발현한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 병적 과정을 억제하는 선택된 자기 항원에 결합하고/하거나 이에 특이적인 항체를 생성하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 상기 병적 과정은 자가면역 질환이다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 선택된 자가 항원, 또는 자기 항원 또는 자가 항원의 것을 모방하는 면역학적 반응성 에피토프에 결합하고/하거나 이에 특이적인 항체를 생성하는 데 사용된다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 항원에 결합하고/하거나 이에 특이적이며 병적 과정을 억제하는 항체를 생성하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 질환 또는 병적 과정의 발병에 기여하는 항원이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 기법을 이용하여, HIV 변이체의 전체 클레이드를 중화시키는 다중 특이성을 나타내는 단일클론 항체를 생성한다. 일부 실시형태에서, 이것은 HIV 바이러스 외피 단백질의 필수 구조 성분을 표적으로 함으로써 수행한다. 일부 실시형태에서, 이것은 숙주 보조 수용체 단백질을 표적으로 함으로써 수행한다.
일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 자가면역 항원이다. 일부 실시형태에서, 상기 자가면역 항원은 타이로글로불린, 타이로이드 퍼옥시다제, 세포질 TSH 수용체, 내인성 인자, 베타-아드레날린 수용체, 아세틸 콜린 수용체, 마이엘린 염기성 단백질, 아밀로이드 베타, 아밀로이드 전구체 단백질, 콜라겐, 나트륨-요오다이드 동반 수송체(symporter), 히스톤 폴리펩티드 및 핵산으로부터 선택된다.
본원에 개시된 기법은 암 및 자가면역 질환과 같은 감염성 질환 및 만성 질환의 발병을 검출 및 치료하기 위한 진단용 및 치료용 항체의 신속한 개발을 위한 새로운 전략을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 항체는 진단 목적을 위해 다양한 혈청 단백질을 검출 또는 정량하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 항체는 진단 목적으로 다양한 마커를 검출 또는 정량하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 상기 마커는 세포 표면 마커이다. 일부 실시형태에서, 상기 마커는 암 또는 종양 마커이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 항체는 치료적 처치를 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 항체는 진단 및/또는 연구 목적으로 사용된다.
일부 실시형태에서, 다양한 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 항체가 본원에 기재된 방법에 의해 제조된다. 유기체에 도입될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 항원이 본원에 기재된 방법에 사용하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 자가 항원과 같이 자가 내성(관용성) 메커니즘에 일반적으로 적용되는 항원이 본원에 기재된 방법에 사용된다. 일부 실시형태에서, 상기 선택된 항원은 표준 면역화 프로토콜을 이용할 경우 항체를 유도하지 못한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 세포 또는 그 조직을 비롯하여 항체 생산에 적합한 임의의 유기체를 이용한다. 일부 실시형태에서, 항체 생산에 적합한 유기체는 영장류, 설치류, 가축 및 애완동물을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 척추동물강 포유류(즉, 포유동물)의 임의의 동물을 포함한다. 특정 경우, 항체 생산에 있어서, 예를 들어, 토끼, 양, 햄스터, 기니 피그, 마우스, 랫트 또는 닭을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 적절한 실험 동물에게 항체 생산을 원하는 항원을 투여한다(즉, 그것으로 면역화하거나 그것을 접종한다).
약학 조성물 및 투여 방법
특정 실시형태에서, 본원은 항체 및 1종 이상의 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 생리학적으로 허용되는 담체로는 약학적으로 사용되는 제제로의 활성 제제의 가공을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함한다. 특정 경우, 적절한 제제는 선택된 투여 경로에 따라 달라진다. 약학 조성물의 개요는, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)]; 문헌[Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975]; 문헌[Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980]; 및 문헌[Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, 1999)]으로부터 참조할 수 있다.
본원은 항체 및 약학적으로 허용되는 희석제(들), 부형제(들) 또는 담체(들)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또한, 항체는 경우에 따라 병용 요법으로서 다른 활성 성분과 함께 혼합하여 사용되는 약학 조성물로서 투여된다. 일부 실시형태에서, 상기 약학 조성물은 다른 의약 또는 약학 물질, 담체, 보강제, 예컨대 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용해 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제를 포함한다. 또한, 약학 조성물은 치료에 유효한 다른 물질도 포함한다.
약학 조성물이란 항체와 담체, 안정화제, 희석제, 분산제, 현탁제, 증점제 및/또는 부형제와 같은 다른 화학 성분의 혼합물을 말한다. 약학 조성물은 유기체로의 항체의 투여를 용이하게 한다. 본원에 제공된 치료 또는 사용 방법을 실시함에 있어서, 치료적 유효량의 항체를 약학 조성물 형태로 치료하고자 하는 병증, 질병 또는 질환을 앓고 있는 유기체(예를 들어, 포유동물)에 투여한다. 바람직하게는, 유기체(예를 들어, 포유동물)는 인간이다. 치료적 유효량은 병증의 중증도 및 단계, 피험체의 나이 및 상대적 건강, 사용되는 항체의 효능 및 다른 인자에 따라 달라진다. 항체는 경우에 따라 단독으로 또는 1종 이상의 치료제와 함께 혼합물의 성분으로서 사용된다.
본원에 기재된 약학 제제는 경우에 따라 경구, 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내), 비내, 협측, 국소, 직장내 또는 경피 투여 경로를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 복수의 투여 경로로 피험체에 투여된다. 본원에 기재된 약학 제제는 수성 액체 현탁제, 자체 유화 분산제, 고체 용액제, 리포솜 분산제, 에어로졸제, 고체 제형, 분말제, 속방형 제제, 제어 방출형 제제, 급속 용융 제제, 정제, 캡슐제, 환제, 서방형 제제, 펄스 방출형 제제, 다미립자 제제, 및 혼합 속방 및 제어 방출 제제를 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
투여 방법 및 치료 계획
항체는 경우에 따라 개선으로부터 적어도 부분적으로 이익을 얻는 병증 또는 염증성 병증의 예방 및/또는 치료적 처치를 위한 의약의 제조를 위해 사용된다. 또한, 이러한 치료를 필요로 하는 피험체에 대해 본원에 기재된 임의의 질환 또는 병증을 치료하는 방법은 본원에 기재된 것과 같은 항체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 약학적으로 허용되는 N 산화물, 약학적 활성 대사산물, 약학적으로 허용되는 프로드럭, 또는 약학적으로 허용되는 용매화물을 함유하는 약학 조성물을 상기 피험체에게 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
또한, 일부 실시형태에서, 본원은 선택된 항원에 결합하거나 특이적으로 결합하는 치료적으로 유효한 항체를 치료를 필요로 하는 개체에 투여함으로써 항원에 의해 매개되는 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 예시적인 항원은 본원에 개시되어 있고, 비한정적인 예로서, 바이러스 항원(예를 들어, HIV 항원, 인플루엔자 항원, SARS 항원), 자가 항원, 종양 항원, 다양한 병원체 관련 항원 등을 들 수 있다. 마찬가지로, 선택된 항원에 의해 매개되는 질환으로는, 비한정적인 예로서, 바이러스 감염 및 이로 인해 유발되는 증후군(예를 들어, HIV, 인플루엔자 및 SARS), 및 병원체 및 기생충 감염 및 이로 인해 유발되는 증후군을 들 수 있다.
환자의 병증이 개선되지 않는 특정한 경우, 의사의 판단에 따라, 환자의 질환 또는 병증의 증상을 개선하거나 다른 방식으로 제어 또는 억제하기 위해, 환자의 생애 기간 전반을 포함하여 만성적으로, 즉 장기간 동안 항체를 임의로 투여한다.
환자의 상태가 개선되는 경우, 의사의 판단에 따라, 항체를 임의로 연속적으로 투여하거나, 대안으로, 투여되는 약물의 용량을 일시적으로 줄이거나 특정 기간 동안(즉, "휴약기") 일시적으로 중단한다. 휴약기의 기간은 경우에 따라 예를 들어 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일 또는 365일을 비롯하여 2일∼1년으로 다양하다. 휴약기 동안의 용량 감소는, 예를 들어 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%를 비롯하여 10%∼100%를 포함한다.
환자의 상태가 개선되면, 필요에 따라 유지 용량을 투여한다. 그 후, 증상에 따라 투여량 또는 투여 빈도 또는 둘 다를 질환, 질병 또는 병증의 개선 상태가 유지되는 수준까지 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 환자는 증상 재발 여부에 따라 장기간의 기간을 기초로 간헐적 치료를 필요로 한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 약학 조성물은 정확한 투여량의 1회 투여에 적합한 단위 제형 형태이다. 단위 제형의 경우, 제제를 적정량의 항체를 함유하는 단위 용량으로 분할한다. 일부 실시형태에서, 단위 용량은 개별량의 제제를 포함하는 패키지 형태이다. 비한정적인 예로는 포장된 정제 또는 캡슐 및 바이알 또는 앰플에 든 분말이 있다. 일부 실시형태에서, 수성 현탁액 조성물을 단일 용량의 비재봉합 용기에 포장한다. 대안으로, 다용량 재봉합 용기를 사용하며, 이 경우 조성물에 방부제를 포함시키는 것이 일반적이다. 예를 들어, 방부제가 첨가된 비경구 주사용 제제가 앰플을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는 단위 제형 또는 다용량 용기로 제공된다.
항체에 대한 적절한 1일 용량은 체중 kg당 약 0.01∼2.5 mg이다. 인간을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는 더 큰 유기체(예를 들어, 포유동물)에 있어서의 지시된 1일 용량은 약 0.5 mg∼약 100 mg이며, 이것은 편의상 1일 최대 4회 또는 장기 방출 형태를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는 분할 용량으로 투여된다. 경구 투여를 위한 적절한 단위 제형은 약 1∼50 mg의 활성 성분을 포함한다. 개개의 치료 계획에 대한 변수 정도는 크기 때문에, 상기 범위는 단지 예시적인 것이며, 이러한 권장된 값으로부터의 큰 편차는 일반적인 것이다. 이러한 용량은 경우에 따라 비한정적인 예로서 사용된 항체의 활성, 치료 대상 질환 또는 병증, 투여 방식, 개별 피험체의 요구사항, 치료 대상 질환 또는 병태의 중증도 및 의사의 판단을 비롯한 다수의 변수에 따라 조정된다.
LD50(집단의 50%에 치사적인 양) 및 ED50(집단의 50%에 치료 효과를 나타내는 양)을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 이러한 치료 계획의 독성 및 효능은, 경우에 따라 세포 배양물 또는 실험 동물에서 측정한다. 독성 효과와 치료 효과의 용량비는 치료 지수이며, 이것은 LD50과 ED50의 비로서 표현된다. 높은 치료 지수를 나타내는 항체가 바람직하다. 세포 배양 분석 및 동물 실험으로부터 얻은 데이터는 경우에 따라 인체 사용을 위한 투여량 범위를 정하는 데 사용된다. 이러한 항체의 투여량은 최소 독성을 나타내는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내인 것이 바람직하다. 투여량은 이용되는 제형 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 임의로 달라진다.
병용 치료
본원에 기재된 항체는 또한 경우에 따라 치료 대상 병증에 대한 그 치료 효과에 따라 선택되는 다른 치료제와 함께 사용된다. 일반적으로, 병용 요법이 이용되는 경우, 다른 제제가 동일한 약학 조성물로 투여되어야 할 필요는 없으며, 상이한 물리적 특성 및 화학적 특성으로 인해 경우에 따라 상이한 경로로 투여된다. 초기 투여는 경우에 따라 확립된 프로토콜에 따라 이루어지며, 그 후 관찰된 효과에 기초하여, 투여량, 투여 방식 및 투여 횟수를 변경한다.
특정 경우, 본원에 기재된 항체 조성물을 다른 치료제와 함께 투여하는 것이 적절하다. 예를 들어, 본원에 기재된 항체 조성물을 투여받은 환자가 경험하는 부작용 중 하나는 메스꺼움이며, 이 경우, 메스꺼움 방지제를 초기 치료제와 함께 투여하는 것이 적절하다. 또는, 예를 들어, 항체의 치료 효과는 보강제의 투여에 의해 증강된다(즉, 보강제 그 자체는 최소 치료 이익을 나타내지만, 다른 치료제와 병용될 때 환자에 대한 전체 치료 이익이 증강된다). 또는, 예를 들어, 항체를 역시 치료 이익을 나타내는 다른 치료제(다른 치료 계획도 포함함)와 함께 투여함으로써 환자가 경험하는 이익을 증가시킨다. 어느 경우에나, 치료 대상 질환, 질병 또는 병증에 관계없이, 환자가 경험하는 전체 이익은 단지 2종의 치료제의 상가적 효과이거나 또는 환자가 상승적 이익을 경험한다.
치료적 유효량은 약물이 병용 치료에 사용될 경우 달라진다. 병용 치료 요법에 사용하기 위한 약물 및 다른 제제의 치료 유효량을 실험적으로 결정하는 방법은 보고된 방법이다. 이러한 방법의 일례는 메트로놈(metronomic) 투여의 이용, 즉 독성 부작용을 최소화하기 위해 더 적은 용량을 더 자주 투여하는 것을 이용하는 것이다. 병용 치료는 환자의 임상적 관리를 보조하기 위해 다양한 시점에 개시하고 중단하는 주기적 치료를 추가로 포함한다.
어느 경우에나, 복수의 치료제(이 중 하나는 본원에 기재된 항체임)를 임의의 순서로 또는 동시에 투여한다. 동시에 투여할 경우, 복수의 치료제가 경우에 따라 하나의 통합된 형태로, 또는 복수의 형태로(예를 들어, 단일 환제로서 또는 2개의 별개의 환제로서) 제공된다. 일부 실시형태에서, 치료제 중 하나는 다회 투여로 투여되거나, 또는 둘 다 다회 투여로 투여된다. 동시에 투여되지 않는 경우, 다회 투여 간의 타이밍은 경우에 따라 0주 이상 내지 4주 미만으로 다양하다. 또한, 병용 방법, 조성물 및 제제는 단지 2종의 제제의 사용에만 한정되지 않으며, 복수의 치료제 조합의 사용도 고려된다.
경감을 원하는 병증(들)을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 투여 계획은 경우에 따라 다양한 인자에 따라 변경되는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 인자로는 피험체가 앓고 있는 질환, 피험체의 나이, 체중, 성별, 식습관 및 의학적 상태를 들 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 실제로 이용되는 투여 계획은 광범위하게 달라지며, 이에 따라 본원에 기재된 투여 계획을 벗어나기도 한다.
본원에 개시된 병용 요법을 구성하는 약학 제제는 경우에 따라 복합 제형 또는 실질적으로 동시 투여를 위한 별개의 제형의 형태이다. 병용 요법을 구성하는 약학 제제는 경우에 따라 순차적으로 투여되기도 하며, 이때 어느 한 치료제는 2 단계 투여를 필요로 하는 투여법으로 투여된다. 2 단계 투여법은 경우에 따라 활성 제제의 순차적 투여 또는 별개의 활성 제제의 간격을 둔 투여를 필요로 한다. 복수 투여 단계 사이의 시간 간격은 각각의 약학 제제의 특성, 예컨대 약학 제제의 효능, 용해도, 생체이용률, 혈장 반감기 및 역학적 프로파일에 따라 수분 내지 수시간의 범위이다. 최적 투여 간격을 결정하기 위해 경우에 따라 표적 분자 농도의 24 시간 주기 변화량이 이용된다.
또한, 항체를 경우에 따라 환자에게 상가적 또는 상승적 이익을 제공하는 절차와 함께 이용한다. 예를 들어, 환자는 본원에 기재된 방법에서 치료적 및/또는 예방적 이익을 얻을 것을 기대하며, 이 경우 항체의 약학 조성물 및/또는 다른 치료제와의 조합물을, 개체가 특정 질환 또는 병증과 상관성이 있는 돌연변이 유전자 보유자인지를 결정하기 위한 유전자 검사와 병용한다.
경우에 따라 질환 또는 병증의 발병 전, 발병 중 또는 발병 후에 항체 및 추가적인 치료제(들)를 투여하며, 항체 함유 조성물의 투여 시기는 몇몇 실시형태에 따라 다르다. 따라서, 예를 들어, 항체를 예방제로서 사용하며, 이 항체를 질환 또는 병증의 발병을 예방하기 위해 질환 또는 병증이 발병하는 성향을 갖는 피험체에게 연속적으로 투여한다. 경우에 따라 증상 개시 중 또는 후에 가능한 한 빨리 피험체에 항체 및 조성물을 투여한다. 제제의 투여는 경우에 따라 증상 개시 후 처음 48 시간 내에, 바람직하게는 증상 개시 후 처음 48 시간 내에, 더 바람직하게는 증상 개시 후 처음 6 시간 내에, 가장 바람직하게는 증상 개시 후 처음 3 시간 내에 개시한다. 초기 투여는 경우에 따라, 예를 들어 정맥 주사, 볼루스 주사, 5분 내지 약 5시간에 걸친 주입, 환제, 캡슐제 투여, 경피 패치, 협측 전달 등과 같은 임의의 실용적인 경로를 통해 투여한다. 질환 또는 병증의 개시가 검출되거나 추측된 후 가능한 한 빨리 질환 치료에 필요한 기간 동안, 예를 들어 약 1 개월 내지 약 3 개월 동안 항체를 투여하는 것이 바람직하다. 치료 기간은 각각의 피험체에 따라 임의로 달라지기 때문에, 치료 기간은 공지된 기준을 이용하여 결정한다. 예를 들어, 항체 또는 항체를 함유하는 제제를 적어도 2주 동안, 바람직하게는 약 1 개월 내지 약 5년 동안, 더 바람직하게는 약 1 개월 내지 약 3년 동안 투여한다.
지금까지 본 발명의 특정 실시형태를 개시하고 기술하였으나, 당업자에게는 이러한 실시형태가 단지 예로서 제시된 것임이 명백할 것이다. 당업자는 본 발명으로부터 벗어나지 않는 다수의 변경, 수정 및 치환을 알 것이다. 본 발명의 일부 실시형태에서 본원에 기재된 실시형태의 다양한 대안이 본 발명을 실시하는 데 이용할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1
하기 실시예는 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스 유래의 B 세포주의 생산에 관해 설명한다.
MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스를 출생 후 8 주 동안 독시사이클린 상에서 유지하고, 그 후 정상 식이로 전환한다. 마우스는 외적으로 명백한 림프절병증 및 비장 비대를 나타내고, 림프 종양과 관련하여 일관되게 관찰되는 다수의 임상 징후(지저분한 털, 구부린 자세, 호흡 곤란, 빈혈, 장기 비대 등)를 나타낸다. 마우스를 안락사시켜, 분석을 위해 그 림프절과 비장을 수집한다. 림프절 일부 및 비장 일부로부터 단일 세포 현탁액을 조제한다. 이들 세포를 유세포 측정 분석에 사용한다. 종양의 초기 특징 분석은 활성화된 B 세포가 많이 퍼져 있음을 보여 주었다. 동일 세포 중 일부를 B 세포주를 생성하기 위한 배양물을 접종하는 데 사용한다. 이들 세포를 림프구 배지(RPMI 1640, 10% 우태 혈청, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, HEPES, 비필수 아미노산, 피루브산나트륨 및 2-β-머캅토에탄올)에서 배양한다. 약 14∼21일 후, 일부 웰이 세포주의 클론 증식을 나타내기 시작하였다. 이들 세포를, 대형 플라스크에서의 배양에 적합해질 때까지 조심스럽게 증식시킨다. 일부 세포는 10% DMSO에서 저온 보존한다.
먼저 2종의 세포주를 픽킹하여 TBLK6 및 TBLK7로 명명하였다. 이들 세포주는 CD138을 상이한 표면 발현 수준으로 나타내었다. 시딩 후 조직 배양 배지로의 면역글로불린 분비 수준을 측정한다. 두 세포주 모두 면역글로불린을 배양 배지로 자발적으로 분비하였다. 분비 수준은 초기 접종물로 IL-4 및 IL-6을 첨가하는 것에 의해 증가된다. TBLK6 및 TBLK7 둘 다에 의해 분비된 면역글로불린은 IgM인 것으로 확인된다. 일부 실시형태에서, 순수한 단일클론 집단을 생성하기 위해, 두 세포주로부터 단일 세포를 클로닝한다. 다수의 MMTV-tTA/TRE-MYC 이중 유전자 마우스를 제작하여, 이것을, 일부 실시형태에서, 세포 분류에 의한 AN1/T3 집단의 단리에 사용한다.
실시예 2
하기 실시예는 Myc 과발현 마우스에서 생산된 항체가 생체 내에서 기능한다는 것을 입증한다.
치사 바이러스 감염 모델을 사용한다. 돼지 래비스 바이러스(Porcine Rabies Virus: PRV)는 정맥내 투여 후 마우스에 치사적이 되는 것으로 종래에 밝혀진 알파-허피스 바이러스의 일원이다. 2종의 PRV 변종을 작제한다. 일례에서, US-9로 불리는 유전자의 서열 중 하나를 GFP에 융합시켰다. 이 구성체는 상이한 셋팅에서 바이러스 및 바이러스 감염 세포의 추적을 가능하게 하였다. US-9 단백질 발현을 확인하였으며, US-9는 융합 단백질로서의 그 기능을 유지하였다. 이 바이러스는 그 추가적인 유전 물질에도 불구하고 완전 병원성이었다. HEL에 대한 오픈 리딩 프레임을 코딩하는 PRV의 변종도 작제한다. 이 바이러스 변종은 감염된 세포의 웨스턴 블롯 분석에 의하면 HEL을 발현하는 것으로 확인된다.
GFP 발현 바이러스 또는 HEL 발현 바이러스 접종물을 1:500의 비율로 희석된 HEL 특이적 항체와 함께 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이트한다. 그 후, 이 혼합물을 그룹당 4 마리의 마우스 그룹에 정맥내 주사한다. 계속해서, 바이러스 및 항체 혼합물의 투여 후 4일 동안 마우스를 모니터링한다.
도 7에 도시된 바와 같이, GFP 발현 바이러스는 HEL 특이적 항체에 의해 영향을 받지 않는다. 이 그룹의 사망률 역학 데이터는 야생형 PRV 종으로 행한 본 발명자들의 이전의 연구에 유사하다. 이와는 달리, HEL 발현 바이러스를 투여받은 마우스에서의 사망률 역학 데이터는 유의적으로 지연되었고, 이 마우스 그룹은 GFP 발현 바이러스를 주사한 마우스보다 거의 2배 더 오랫동안 생존하였다. 이들 실험에 사용된 바이러스는 US-9 융합 단백질을 일시적으로만 발현하였다. 바이러스는 세포로 진입한 후 야생형 PRV를 생성한다.
실시예 3
이 실시예에서는, 장기 조혈모세포의 조건부 불멸화에 Myc-ER을 사용한다. 5FU 농축 골수 유래 줄기 세포를 사용하여 이하와 같이 골수 키메라 마우스 그룹을 제작한다. 골수 유래 조혈모세포에 대해서는, 장기 조혈모세포로 농축시키고 HSC의 생체 내 증식을 유도하기 위해 마우스당 5 mg의 5-플루오로우라실(5FU)을 정맥내 투여한다. 5일 후 대퇴골 및 경골로부터 골수 세포를 수집한다. 저장성 용해 완충액을 사용하여 적혈구를 용해시킨다. 남아있는 세포를 배지로 2회 세척하여 2×106개 세포/ml의 농도로 15% 열 불활성화 우태 혈청, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 비필수 아미노산, 재조합 인간 IL-3, IL-6 및 줄기 세포 인자(SCF)가 보충된 DMEM 배지 중에 24웰 플레이트에 플레이팅한다. 이 세포를 1차 스핀 감염(spin infection) 전에 24시간 동안 배양하고 24시간마다 감염 절차를 3회 실시한다. 마지막 스핀 감염 다음날, 세포를 유세포 측정으로 분석한다. 렌티바이러스 형질도입 골수 유래의 조혈모세포를 치사적으로 방사선을 조사한 마우스로 재구성하고, 12주 후 림프계 기관에서의 GFP 발현에 대해 조사한다. 이 경우, 골수 이식 후 8∼12주 동안 조혈모세포가 정상 말초 림프계 기관으로 재구성되도록 한다. 이들 마우스로부터 비장 GFP+ AN-1/T3 세포를 단리하여 전술한 바와 같이 시험관 내 불멸화 프로토콜에 사용한다. 주된 차이는 계로부터 독시사이클린을 제거하는 대신에 10 nM 4-하이드록시타목시펜(4OHT)를 배지에 첨가한다는 것이다. 일부 실시형태에서, 분류된 GFP+ AN-1/T3 세포를 마우스당 1 mg의 4OHT를 주 1회 복강내 주사한 야생형 수용자 마우스 코호트에 이식한다. 마우스를 B 세포 림프종 발생과 관련된 임상 징후의 출현에 대해 매일 모니터링한다. 발생된 종양을 수집하여, Myc 기능의 조절제로서 독시사이클린 대신에 4OHT를 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 B 세포주를 생성하는 데 사용한다.
실시예 4
이 실시예에서는, 장기 조혈모세포의 조건부 불멸화에 Myc-ER 및 Bcl-2를 사용한다. 5FU 농축 골수 유래 줄기 세포를 사용하여 이하와 같이 골수 키메라 마우스 그룹을 제작한다. 골수 유래 조혈모세포에 대해서는, 장기간 조혈모세포로 농축시키고 HSC의 생체 내 증식을 유도하기 위해 마우스당 5 mg의 5-플루오로우라실(5FU)을 정맥내 투여한다. 5일 후 대퇴골 및 경골로부터 골수 세포를 수집한다. 저장성 용해 완충액을 사용하여 적혈구를 용해시킨다. 남아있는 세포를 배지로 2회 세척하여 2×106개 세포/ml의 농도로 15% 열 불활성화 우태 혈청, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 비필수 아미노산, 재조합 인간 IL-3, IL-6 및 줄기 세포 인자(SCF)가 보충된 DMEM 배지 중에 24웰 플레이트에 플레이팅한다. 이 세포를, Myc-ER 및 Bcl-2의 발현을 코딩하는 GFP 발현 렌티바이러스에 의한 1차 스핀 감염 전에 24시간 동안 배양한다. 세포에 대해 24시간마다 감염 절차를 3회 실시한다. 마지막 스핀 감염한 날, 세포를 유세포 측정으로 분석한다. 렌티바이러스 형질도입 골수 유래의 조혈모세포를 치사적으로 방사선을 조사한 마우스로 재구성한다. 이 경우, 골수 이식 후 8∼12주 동안 조혈모세포가 정상 말초 림프계 기관으로 재구성되도록 한다. 이들 마우스로부터 비장 GFP+ AN-1/T3 세포를 단리하여 전술한 바와 같이 시험관 내 불멸화 프로토콜에 사용한다. Myc 활성화를 유도하기 위해 배지에 4OHT를 첨가한다. 일부 실시형태에서, 분류된 GFP+ AN-1/T3 세포를 마우스당 1 mg의 4OHT를 주 1회 복강내 주사한 야생형 수용자 마우스 코호트에 이식한다. 마우스를 B 세포 림프종 발생과 관련된 임상 징후의 출현에 대해 매일 모니터링한다. 발생된 종양을 수집하여, Myc 기능의 조절제로서 독시사이클린 대신에 4OHT를 사용하여 본원에 기재된 바와 같이 B 세포주를 생성하는 데 사용한다.
실시예 5
신 자기 항원으로서의 마우스로의 도입을 통해 관심있는 항원에 대한 신규 항체를 생성하기 위해 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스를 이용하려는 개념을 테스트하기 위해, 레트로바이러스 골수 키메라 마우스를 사용하였다. 먼저, 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 유래의 H5 헤마글루티닌, 즉 A/Ty/Ont/7732/66(H5N9)에 대한 cDNA를 코딩하는 pMIG 변이체를 제작하였다. 그 후, 수집 5일 전에 5-플루오로우라실로 처리한 마우스의 골수로부터 농축시킨 HSC를 종래 알려진 바와 같이 하여 얻었다. TRE-MYC 마우스로부터 공여자 세포를 얻었다. 이 세포를 테트라사이클린 트랜스활성화제 단백질(tTA) 및 pMIG-H5를 코딩하는 1종의 레트로바이러스로 형질도입하였다. 이 형질도입된 골수 HSC를 치사적으로 방사선을 조사한 마우스를 재구성하는 데 사용하였다. 골수 키메라 마우스를 SEPTRA 상에서 유지하고, 혈액 악성종양의 임상 징후(지저분한 털, 호흡 곤란, 외적으로 명백한 림프절병증 또는 비장 비대증, 구부린 자세, 탈수 및 뒷다리 마비)를 보이는지에 대해 매일 관찰하였다. 5 마리 마우스 코호트는, 이식한 지 6주째부터 시작하여 7일의 기간 동안 혈액 악성종양의 임상 징후를 나타내었다. 안락사시킨 마우스로부터 림프절 및 비장을 수집하여 단일 세포 현탁액을 생성하는 데 사용하였다. 남아있는 세포를 배양하여 세포주를 생성하기 시작하거나 후속 분석을 위해 저온 보존하였다. 일부 세포를 세포 표면 마커에 대해 염색하여 유세포 측정법으로 분석하였다(도 8). 도 8은 혈액 악성종양을 발달시킨 골수 키메라 마우스로부터 단리된 세포의 표면 프로파일을 나타낸다. 이들은 한결같이 B220+/IgM+였으며, 이는 마우스가 B 세포 백혈병/성숙 B 세포로 이루어진 림프종을 발생시켰음을 시사한다. 이들 세포를 배양액에 넣고, 초기 시딩 후 8일째부터 시작하여 클론 증식 집단을 계대하였다. 이것은 단일클론 항체 생산을 위한 현행 접근법에 의해 일반적으로 달성되는 것보다 현저히 더 빠른 작업 일정이다. 게다가, 이러한 신규 접근법에 의해 본 발명자들이 헤마글루티닌에 대한 신규한 항체를 생성할 수 있게 된 빨라진 작업 일정은, 이 접근법이, 새로 출현하는 감염성 질환 및 다른 생물학적 위협에 대한 새로운 중화 항체의 개발을 위한 빠른 반응 기반이 될 수 있게 한다.
H5에 대한 항체의 존재에 대해 테스트하기 위해, 이들 마우스의 혈청을 수집하였다. 이들 마우스 유래의 혈청을 사용한 면역블롯 분석은 H5 HA의 HA1 서브유닛에 대한 특이적 반응성을 나타내었다(도 9). H5를 코딩하는 2종의 상이한 발현 플라스미드(pCDNA3-H5 및 pMIG-H5)로 일시적으로 형질감염시킨 293FT 세포로부터 세포 용해물을 얻었다. 이 블롯을 백혈병 마우스로부터 얻은 혈청으로 프로빙하였다. 형성된 밴드 패턴은 세포 내에서의 HA의 정상적인 성숙 및 프로세싱 과정에서 발생하는 H5 및 절단 생성물과 일치하였다. 성숙 HA는 2개 서브유닛, 즉 HA1 및 HA2로 이루어진다. HA1 서브유닛(∼40 kDa)은 분자의 구형 헤드를 형성하며 표면 당단백질 및 당지질 상의 숙주 세포 시알산 수용체에의 결합을 담당한다.
HA2(∼20 kDa) 서브유닛은 바이러스의 진입 과정에서의 바이러스 외피와 숙주 세포의 엔도솜 막과의 융합에 관여한다. 프로테아제 절단 부위는 이들 2개의 서브유닛을 분리하고, 숙주 프로테아제에 의한 절단은 숙주 세포로의 진입에 필요하다. 상당수의 바이러스 중화 에피토프가 HA1 서브유닛 22에서 발견되고 바이러스-수용체 상호작용을 억제한다.
레트로바이러스 키메라 마우스로부터 얻은 마우스 혈청이 H5N2, H1N1, H7N2, H3N2 및 H6N8 서브타입을 비롯한 다양한 인플루엔자 A 분리물과의 바이러스-수용체 상호작용을 차단할 수 있는 능력을 테스트하기 위해, 상기 혈청의 적혈구 응집 억제 분석을 수행하였다(도 10).
실시예 6
마우스(n=20)를 2개 그룹으로 분류한다. 제1 그룹(n=10)은 프로인트 면역보강제와 혼합된 HEL로 면역화한다. 제2 그룹(n=10)은 Tat-Myc과 혼합된 HEL로 면역화한다.
두 그룹에 불완전 프로인트 면역보강제와 혼합된 HEL 항원의 추가 접종을 실시한다.
4일, 7일, 14일, 21일 및 28일째 각각의 마우스로부터 혈청을 수집한다. HEL 단백질에 대한 반응성을 ELISA로 분석한다.
35일째, 각각의 마우스로부터 비장을 적출한다. 비장을 가공하여 단일 세포 현탁액을 얻는다. 용해 완충액을 사용하여 적혈구(RBC)를 제거한다. 림프구를 2개 샘플로 분류한다. 제1 샘플을 Tat-Myc 및 HEL 항원과 인큐베이트한다. 제2 샘플은 TAT-MYC과 인큐베이트한다.
실시예 7
마우스(n=20)를 2개 그룹으로 분류한다. 제1 그룹(n=10)은 프로인트 면역보강제와 혼합된 플루비린(2007-2008)으로 면역화한다. 제2 그룹(n=10)은 Tat-Myc과 혼합된 플루비린(2007-2008)으로 면역화한다.
두 그룹에 불완전 프로인트 면역보강제(IFA)와 혼합된 플루비린(2007-2008)의 추가 접종을 실시한다.
4일, 7일, 14일, 21일 및 28일째 각각의 마우스로부터 혈청을 수집한다. 플루비린(2007-2008)에 대한 반응성을 ELISA로 분석한다.
35일째, 각각의 마우스로부터 비장을 적출한다. 비장을 가공하여 단일 세포 현탁액을 얻는다. 용해 완충액을 사용하여 적혈구(RBC)를 제거한다. 림프구를 2개 샘플로 분류한다. 제1 샘플을 Tat-Myc 및 플루비린(2007-2008)과 인큐베이트한다. 제2 샘플은 TAT-MYC과 인큐베이트한다.
본원에 기재된 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안의 실시형태가 본 발명을 실시하는 데 이용될 수 있음은 당연하다. 하기 특허청구범위는 본 발명의 범위를 한정하는 것이며, 이러한 특허청구범위 내의 방법 및 구조와 그 균등범위가 그에 따라 커버되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> REFAELI, YOSEF
TURNER, BRIAN CURTIS
<120> ANTIBODIES AND PROCESSES FOR PREPARING THE SAME
<130> 36824-703.201
<140> 12/467,957
<141> 2009-05-18
<150> 61/054,047
<151> 2008-05-16
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 459
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 1
Met Asp Phe Phe Arg Val Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met
1 5 10 15
Pro Leu Asn Val Ser Phe Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp
20 25 30
Ser Val Gln Pro Tyr Phe Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln
35 40 45
Gln Gln Gln Gln Ser Glu Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile
50 55 60
Trp Lys Lys Phe Glu Leu Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg
65 70 75 80
Arg Ser Gly Leu Cys Ser Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser
85 90 95
Leu Arg Gly Asp Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp
100 105 110
Gln Leu Glu Met Val Thr Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln
115 120 125
Ser Phe Ile Cys Asp Pro Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile
130 135 140
Ile Gln Asp Cys Met Trp Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val
145 150 155 160
Ser Glu Lys Leu Ala Ser Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser
165 170 175
Pro Asn Pro Ala Arg Gly His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr
180 185 190
Leu Gln Asp Leu Ser Ala Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val
195 200 205
Val Phe Pro Tyr Pro Leu Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala
210 215 220
Ser Gln Asp Ser Ser Ala Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser
225 230 235 240
Ser Thr Glu Ser Ser Pro Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His
245 250 255
Glu Glu Thr Pro Pro Thr Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu
260 265 270
Asp Glu Glu Glu Ile Asp Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro
275 280 285
Gly Lys Arg Ser Glu Ser Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys
290 295 300
Pro Pro His Ser Pro Leu Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His
305 310 315 320
Gln His Asn Tyr Ala Ala Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala
325 330 335
Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser
340 345 350
Asn Asn Arg Lys Cys Thr Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn
355 360 365
Val Lys Arg Arg Thr His Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu
370 375 380
Leu Lys Arg Ser Phe Phe Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu
385 390 395 400
Asn Asn Glu Lys Ala Pro Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala
405 410 415
Tyr Ile Leu Ser Val Gln Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu
420 425 430
Asp Leu Leu Arg Lys Arg Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln
435 440 445
Leu Arg Lys Gly Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu
450 455
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag
<400> 2
His His His His His His
1 5
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 3
Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide
<400> 4
Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp
1 5
<210> 5
<211> 492
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide
<400> 5
Met Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Asp Phe Phe Arg Val
1 5 10 15
Val Glu Asn Gln Gln Pro Pro Ala Thr Met Pro Leu Asn Val Ser Phe
20 25 30
Thr Asn Arg Asn Tyr Asp Leu Asp Tyr Asp Ser Val Gln Pro Tyr Phe
35 40 45
Tyr Cys Asp Glu Glu Glu Asn Phe Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Ser Glu
50 55 60
Leu Gln Pro Pro Ala Pro Ser Glu Asp Ile Trp Lys Lys Phe Glu Leu
65 70 75 80
Leu Pro Thr Pro Pro Leu Ser Pro Ser Arg Arg Ser Gly Leu Cys Ser
85 90 95
Pro Ser Tyr Val Ala Val Thr Pro Phe Ser Leu Arg Gly Asp Asn Asp
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Phe Ser Thr Ala Asp Gln Leu Glu Met Val Thr
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Asp Met Val Asn Gln Ser Phe Ile Cys Asp Pro
130 135 140
Asp Asp Glu Thr Phe Ile Lys Asn Ile Ile Ile Gln Asp Cys Met Trp
145 150 155 160
Ser Gly Phe Ser Ala Ala Ala Lys Leu Val Ser Glu Lys Leu Ala Ser
165 170 175
Tyr Gln Ala Ala Arg Lys Asp Ser Gly Ser Pro Asn Pro Ala Arg Gly
180 185 190
His Ser Val Cys Ser Thr Ser Ser Leu Tyr Leu Gln Asp Leu Ser Ala
195 200 205
Ala Ala Ser Glu Cys Ile Asp Pro Ser Val Val Phe Pro Tyr Pro Leu
210 215 220
Asn Asp Ser Ser Ser Pro Lys Ser Cys Ala Ser Gln Asp Ser Ser Ala
225 230 235 240
Phe Ser Pro Ser Ser Asp Ser Leu Leu Ser Ser Thr Glu Ser Ser Pro
245 250 255
Gln Gly Ser Pro Glu Pro Leu Val Leu His Glu Glu Thr Pro Pro Thr
260 265 270
Thr Ser Ser Asp Ser Glu Glu Glu Gln Glu Asp Glu Glu Glu Ile Asp
275 280 285
Val Val Ser Val Glu Lys Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Ser Glu Ser
290 295 300
Gly Ser Pro Ser Ala Gly Gly His Ser Lys Pro Pro His Ser Pro Leu
305 310 315 320
Val Leu Lys Arg Cys His Val Ser Thr His Gln His Asn Tyr Ala Ala
325 330 335
Pro Pro Ser Thr Arg Lys Asp Tyr Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu
340 345 350
Asp Ser Val Arg Val Leu Arg Gln Ile Ser Asn Asn Arg Lys Cys Thr
355 360 365
Ser Pro Arg Ser Ser Asp Thr Glu Glu Asn Val Lys Arg Arg Thr His
370 375 380
Asn Val Leu Glu Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Phe Phe
385 390 395 400
Ala Leu Arg Asp Gln Ile Pro Glu Leu Glu Asn Asn Glu Lys Ala Pro
405 410 415
Lys Val Val Ile Leu Lys Lys Ala Thr Ala Tyr Ile Leu Ser Val Gln
420 425 430
Ala Glu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Leu Arg Lys Arg
435 440 445
Arg Glu Gln Leu Lys His Lys Leu Glu Gln Leu Arg Lys Gly Glu Leu
450 455 460
Asn Ser Lys Leu Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
465 470 475 480
Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His His
485 490
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Human immunodeficiency virus
<400> 6
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5
Claims (94)
- 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제조 방법으로서, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 선택된 항원과 접촉시키는 단계를 포함하는 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포가 B 세포인 제조 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 핵산 서열이 코딩된 Myc 펩티드의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 B 세포 선택적 프로모터가 Eμ 프로모터인 제조 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 하나 이상의 TRE를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 유기체 내에 존재하고, 상기 유기체는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 대한 유전자 이식 유기체이며, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 세포를 접촉시키는 단계는 상기 선택된 항원을 상기 유기체로 도입하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 유기체가 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인 제조 방법.
- 제7항에 있어서, tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제7항에 있어서, tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 MMTV 프로모터를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제6항에 있어서, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 tTA 의존적 발현을 억제하기에 충분한 기간 동안 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 상기 유기체에 제공하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제6항에 있어서, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 tTA 의존적 발현을 억제하기에 충분한 기간 동안 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 상기 유기체에 제공하는 단계; 및 상기 기간 후에, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 tTA 의존적 발현을 유도하기 위해 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 유기체가 상기 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인 제조 방법.
- 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택된 항원에 특이적인 항체를 발현하는 하나 이상의 B 세포를 상기 유기체로부터 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 Myc 펩티드가 Myc-ER 폴리펩티드인 제조 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 세포를 ER 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 선택된 항원이 자기 항원인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 선택된 항원이 HIV 단백질, Gag, Pol, 프로테아제, 역전사효소, 인테그라제, RNAseH, Tat, Rev, Nef, Vpr, Vpu, Vif 및 Env인 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 선택된 항원을 도입하는 것이 선택된 항원을 코딩하는 발현 벡터를 도입하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
- 항원에 특이적인 항체의 제조 방법으로서, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 대한 유전자 이식 유기체이고 코딩된 Myc 펩티드의 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함하는 유기체에 선택된 항원을 도입하는 단계를 포함하는 제조 방법.
- 선택된 항원에 특이적인 항체의 제조 방법으로서,
a. 선택된 항원에 선택적으로 결합하고 Myc 펩티드 또는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 항체를 발현하는 B 세포를 제공하는 단계; 및
b. 상기 B 세포에서 Myc 활성을 유도하는 단계
를 포함하는 제조 방법. - 제20항에 있어서, 항원에 선택적으로 결합하고 Myc 펩티드 또는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 항체를 발현하는 B 세포를, Myc 펩티드 또는 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 B 세포를 상기 선택된 항원과 접촉시킴으로써 제조하는 것인 제조 방법.
- 제20항에 있어서, 재조합 B 세포의 증식에 의해 생성된 복수의 재조합 B 세포로부터 발현된 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 B 세포는 유기체 내에 존재하고, B 세포에서의 Myc 활성의 유도는 생체 내에서 이루어지는 것인 제조 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 유도 단계 전에 상기 Myc 펩티드 또는 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 생체 외에서 상기 B 세포로 도입하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 Myc 펩티드를 생체 외에서 상기 B 세포로 도입하는 단계를 포함하는 제조 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 Myc 펩티드가 단백질 전달 도메인을 포함하는 것인 제조 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 B 세포가 무력성 B 세포인 제조 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 선택된 항원이 자기 항원인 제조 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 핵산 서열이 Myc 펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 B 세포 선택적 프로모터를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 핵산 서열이 Myc 펩티드에 대한 오픈 리딩 프레임에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제30항에 있어서, 상기 유도성 프로모터가 하나 이상의 TRE를 포함하고, 재조합 세포가 tTA 펩티드 또는 rtTA 펩티드를 추가로 발현하는 것인 제조 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 재조합 세포가 tTA 펩티드를 발현하는 것인 제조 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 Myc 펩티드가 Myc-ER 융합 펩티드인 제조 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 유도 단계가 재조합 B 세포를 ER 리간드와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 B 세포가 마우스 B 세포인 제조 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 B 세포가 상기 선택된 항원으로 면역화된 유기체로부터 유래되는 것인 제조 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 면역화된 유기체가 상기 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 보유하는 유기체인 제조 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 핵산 서열이 유도성 핵산 서열인 제조 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 유도성 핵산 서열이 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터가 하나 이상의 TRE를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 유기체가 담체를 추가로 포함하고, tTA 핵산 서열 또는 rtTA 핵산 서열을 발현하는 것인 제조 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 유기체가 담체를 추가로 포함하고, 상기 선택된 항원을 코딩하는 핵산 서열을 발현하는 것인 제조 방법.
- 항원에 선택적으로 결합하는 항체의 제조 방법으로서,
a. Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 복수의 재조합 조혈모세포를 면역결핍 유기체에 투여하는 단계; 및
b. 선택된 항원을 상기 면역결핍 유기체에 도입하는 단계
를 포함하는 제조 방법. - 제42항에 있어서, 상기 조혈모세포가 bcl-2 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 것인 제조 방법.
- 제42항에 있어서, 복수의 조혈모세포가 B 세포로 분화되도록 유도하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제44항에 있어서, 상기 항원 선택적 항체를 발현하는 복수의 B 세포를 상기 면역결핍 유기체로부터 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제45항에 있어서, 상기 항체를 발현하는 복수의 B 세포로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 핵산 서열이 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 핵산 서열이 하나 이상의 TRE를 포함하는 유도성 프로모터를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 조혈모세포가 tTA 또는 rtTA를 발현하는 것인 제조 방법.
- 제49항에 있어서, 단계 (a) 후에, tTA 의존적 트랜스 활성화를 억제할 수 있는 기간 동안 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 상기 면역결핍 유기체에 제공하는 단계; 및 상기 기간 후에, tTA 의존적 트랜스 활성화를 유도하기 위해 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제47항에 있어서, 상기 B 세포 선택적 프로모터가 Eμ 프로모터인 제조 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 선택된 항원이 HIV 단백질, gp120 또는 gp41인 제조 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 Myc 펩티드가 Myc-ER 폴리펩티드인 제조 방법.
- 제53항에 있어서,
a. 상기 면역결핍 유기체로부터 상기 항원 선택적 항체를 발현하는 하나 이상의 B 세포를 회수하는 단계; 및
b. 상기 B 세포를 ER 리간드와 접촉시키는 단계
를 추가로 포함하는 제조 방법. - 제42항에 있어서, 상기 선택된 항원이 자기 항원인 제조 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 면역결핍 유기체는 유기체에 방사선을 조사하여 얻는 것인 제조 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 면역결핍 유기체가 Rag-1ko, Rag-2, SCID, DNA-PK, Ku70, Ku80, XRCC4 또는 μMT 마우스인 제조 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 면역결핍 유기체가 상기 선택된 항원을 발현하는 것인 제조 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 선택된 항원을 발현하는 면역결핍 유기체가 상기 선택된 항원에 대한 유전자 이식 유기체인 제조 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 선택된 항원을, 핵산 발현 벡터에 의한 형질감염 또는 재조합 바이러스 발현 벡터에 의한 감염에 의해 도입하는 것인 제조 방법.
- 제60항에 있어서, 상기 재조합 바이러스 발현 벡터가 재조합 렌티바이러스인 제조 방법.
- 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법으로서,
a. 인간 항체를 발현하고 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 Myc 펩티드를 포함하는 세포를 제공하는 단계; 및
b. 상기 세포를 선택된 항원과 접촉시키는 단계
를 포함하는 제조 방법. - 제62항에 있어서, 인간 항체를 발현하고 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 Myc 펩티드를 포함하는 세포가 B 세포인 제조 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 B 세포가 Myc을 유도에 의해 과발현하는 것인 제조 방법.
- 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체를 발현하고 Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 Myc 펩티드를 포함하는 세포가 유기체 내에 존재하고, 상기 방법은 상기 유기체로부터 항체 생산 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인 제조 방법.
- 제65항에 있어서, 상기 유기체가 마우스인 제조 방법.
- 제66항에 있어서, 상기 유기체가 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스인 제조 방법.
- 제65항에 있어서, 상기 유기체는
a. 면역결핍 유기체를 제공하는 단계; 및
b. 상기 유기체에 Myc을 과발현하는 복수의 조혈모세포를 투여하는 단계
에 의해 얻는 것인 제조 방법. - 제68항에 있어서, 상기 면역결핍 유기체는 유기체에 방사선을 조사하여 얻는 것인 제조 방법.
- 제68항에 있어서, 상기 면역결핍 유기체가 Rag-1ko, Rag-2, SCID, DNA-PK, Ku70, Ku80, XRCC4 또는 μMT 마우스인 제조 방법.
- 제65항에 있어서, 상기 유기체가 상기 선택된 항원을 발현하는 것인 제조 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 선택된 항원이 HIV 단백질, gp120 또는 gp41인 제조 방법.
- 제62항에 있어서, 항체 생산 세포에 의해 생산된 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제62항에 있어서, 항체 생산 세포를 Myc의 과발현을 유도하는 조건에 적용하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제65항에 있어서, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제75항에 있어서, 상기 유기체로부터 항체 생산 세포를 단리하기 전에, 항체 생산 세포를 Myc의 과발현을 유도하는 조건에 적용하는 것인 제조 방법.
- 제75항에 있어서, 상기 유기체로부터 항체 생산 세포를 단리한 후, 항체 생산 세포를 Myc의 과발현을 유도하는 조건에 적용하는 것인 제조 방법.
- 제77항에 있어서, 상기 유기체가 MMTV-rtTA/TRE-MYC; MMTV-rtTA/TRE-MYC/Rag-1-/-; MMTV-tTA/TRE-MYC; 또는 MMTV-tTA/TRE-MYC/Rag-1-/- 마우스이고, 상기 Myc의 과발현을 유도하는 조건이 독시사이클린, 테트라사이클린 또는 이들의 유사체에 노출시키는 것인 제조 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 Myc 펩티드가 Myc-ER 융합 펩티드인 제조 방법.
- 제79항에 있어서, 상기 세포를 에스트로겐 수용체 리간드와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제80항에 있어서, 에스트로겐 수용체 리간드 부재 하에 상기 세포를 상기 선택된 항원과 접촉시키는 것인 제조 방법.
- 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법으로서,
a. 항체 생산 인간 세포를 제공하는 단계;
b. 상기 항체 생산 인간 세포로부터 항체를 코딩하는 인간 유전자를 단리하는 단계; 및
c. Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열 또는 Myc 펩티드를 포함하는 세포로 상기 항체를 코딩하는 인간 유전자를 도입하는 단계
를 포함하는 제조 방법. - 제82항에 있어서, 상기 인간 유전자가 인간 IgH 및 IgL을 코딩하고, 상기 IgH와 IgL이 함께 상기 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 형성하는 것인 제조 방법.
- 제82항에 있어서, 상기 세포가 B 세포인 제조 방법.
- 제84항에 있어서, 상기 세포를 마우스에 이식하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제82항에 있어서, 상기 선택된 항원이 HIV 단백질, gp120 또는 gp41인 제조 방법.
- 제82항에 있어서, 단리된 인간 유전자가 제1 항체 및 제2 항체를 코딩하는 것인 제조 방법.
- 제82항에 있어서, 상기 세포로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
- 제82항에 있어서, Myc 펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 유도성 프로모터 또는 B 세포 선택적 프로모터를 포함하는 것인 제조 방법.
- 제82항에 있어서, 상기 Myc 펩티드가 Myc-ER 융합 펩티드인 제조 방법.
- 인간 또는 인간화 항체의 제조 방법으로서,
a. Myc을 과발현하는 세포로 인간 면역글로불린을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 도입하는 단계; 및
b. 코딩된 인간 면역글로불린을 단리하는 단계
를 포함하는 제조 방법. - 인간 또는 인간화 항체를 제조하기 위한 단리된 B 세포로서, Myc을 과발현하는 단리된 B 세포.
- 제1항 내지 제91항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 단리된 항체.
- 제93항의 항체의 재조합 형태를 생성하도록 조작된 세포.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US5404708P | 2008-05-16 | 2008-05-16 | |
| US61/054,047 | 2008-05-16 | ||
| PCT/US2009/003105 WO2009139930A2 (en) | 2008-05-16 | 2009-05-18 | Antibodies and processes for preparing the same |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020107028384A Division KR101803099B1 (ko) | 2008-05-16 | 2009-05-18 | 항체 및 그 제조 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170078862A true KR20170078862A (ko) | 2017-07-07 |
Family
ID=41319226
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020177017674A KR20170078862A (ko) | 2008-05-16 | 2009-05-18 | 항체 및 그 제조 방법 |
| KR1020107028384A KR101803099B1 (ko) | 2008-05-16 | 2009-05-18 | 항체 및 그 제조 방법 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020107028384A KR101803099B1 (ko) | 2008-05-16 | 2009-05-18 | 항체 및 그 제조 방법 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US8986702B2 (ko) |
| EP (1) | EP2285832B1 (ko) |
| KR (2) | KR20170078862A (ko) |
| AU (1) | AU2009246876B2 (ko) |
| CA (1) | CA2723114C (ko) |
| EA (1) | EA021131B1 (ko) |
| ES (1) | ES2820873T3 (ko) |
| IL (3) | IL287311B2 (ko) |
| SG (2) | SG190661A1 (ko) |
| WO (1) | WO2009139930A2 (ko) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101330830B (zh) | 2005-10-18 | 2016-01-20 | 国家犹太健康中心 | 条件无限增殖化长期干细胞和制备和使用所述细胞的方法 |
| KR20090130236A (ko) * | 2007-03-13 | 2009-12-21 | 내셔날 쥬이쉬 헬스 | 항체의 제조 방법 |
| US8986702B2 (en) | 2008-05-16 | 2015-03-24 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Antibodies and processes for preparing the same |
| US9169462B2 (en) * | 2008-07-21 | 2015-10-27 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Methods for preparing mature erythrocytes from conditionally immortalized hematopoietic stem cells |
| EP2318435B1 (en) * | 2008-08-28 | 2015-12-23 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Modulators of myc, methods of using the same, and methods of identifying agents that modulate myc |
| AU2012216462B2 (en) * | 2008-08-28 | 2015-04-23 | Taiga Biotechnologies (Abc), Llc | Modulators of MYC, methods of using the same, and methods of identifying agents that modulate MYC |
| EP2877189B1 (en) | 2012-07-20 | 2021-01-06 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment |
| US9365825B2 (en) | 2013-03-11 | 2016-06-14 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Expansion of adult stem cells in vitro |
| US10272115B2 (en) | 2013-03-11 | 2019-04-30 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Production and use of red blood cells |
| CA3045017A1 (en) | 2016-12-02 | 2018-06-07 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Nanoparticle formulations |
| US10149898B2 (en) * | 2017-08-03 | 2018-12-11 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Methods and compositions for the treatment of melanoma |
| JP6731114B2 (ja) * | 2017-08-03 | 2020-07-29 | タイガ バイオテクノロジーズ，インク． | メラノーマの処置のための方法および組成物 |
Family Cites Families (143)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA811368B (en) | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
| EP0207147A4 (en) | 1984-12-21 | 1988-07-14 | Techniclone Res Partners | METHOD OF ELECTRICAL IMMORTALIZATION OF LYMPHOID CELLS. |
| DE3531430A1 (de) | 1985-09-03 | 1987-03-05 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur gewinnung von komponenten aus einer fluessigkeit mit in raeumlich getrennten bereichen vorliegenden komponenten |
| US4963489A (en) | 1987-04-14 | 1990-10-16 | Marrow-Tech, Inc. | Three-dimensional cell and tissue culture system |
| US4900322A (en) | 1986-09-22 | 1990-02-13 | Adams James D | Blood component pooling valve and kit |
| US5476996A (en) | 1988-06-14 | 1995-12-19 | Lidak Pharmaceuticals | Human immune system in non-human animal |
| US5399493A (en) | 1989-06-15 | 1995-03-21 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures |
| US5804604A (en) | 1989-12-21 | 1998-09-08 | Biogen, Inc. | Tat-derived transport polypeptides and fusion proteins |
| US5652122A (en) | 1989-12-21 | 1997-07-29 | Frankel; Alan | Nucleic acids encoding and methods of making tat-derived transport polypeptides |
| US5849288A (en) | 1990-01-15 | 1998-12-15 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Method for production of monoclonal antibodies in chimeric mice or rats having xenogeneic antibody-producing cells |
| US6255458B1 (en) | 1990-08-29 | 2001-07-03 | Genpharm International | High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin |
| IL101147A (en) | 1991-03-07 | 2004-06-20 | Gen Hospital Corp | Change of direction of cellular immunity by chimera receptors |
| US5912170A (en) | 1991-03-07 | 1999-06-15 | The General Hospital Corporation | Redirection of cellular immunity by protein-tyrosine kinase chimeras |
| US6004811A (en) | 1991-03-07 | 1999-12-21 | The Massachussetts General Hospital | Redirection of cellular immunity by protein tyrosine kinase chimeras |
| US5851828A (en) | 1991-03-07 | 1998-12-22 | The General Hospital Corporation | Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells |
| US5843728A (en) | 1991-03-07 | 1998-12-01 | The General Hospital Corporation | Redirection of cellular immunity by receptor chimeras |
| US6753162B1 (en) | 1991-03-07 | 2004-06-22 | The General Hospital Corporation | Targeted cytolysis of HIV-infected cells by chimeric CD4 receptor-bearing cells |
| AU781922B2 (en) | 1991-12-17 | 2005-06-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| US5289858A (en) | 1991-12-18 | 1994-03-01 | Abbott Laboratories | System for accommodating withdrawal of liquid from a bulk supply |
| US8211422B2 (en) | 1992-03-18 | 2012-07-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Chimeric receptor genes and cells transformed therewith |
| NZ255831A (en) | 1992-08-21 | 1997-04-24 | Biogen Inc | Fusion proteins comprising biologically active cargo moiety and transport peptides from the hiv tat protein, their preparation and use |
| US5580760A (en) | 1993-02-22 | 1996-12-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | FUSE binding protein and cDNA therefor |
| EP0710283A4 (en) | 1993-07-22 | 1997-07-02 | Merck & Co Inc | THE EXPRESSION OF HUMAN INTERLEUKIN-1-g (b) IN A TRANSGENIC ANIMAL |
| US5599705A (en) | 1993-11-16 | 1997-02-04 | Cameron; Robert B. | In vitro method for producing differentiated universally compatible mature human blood cells |
| WO1995023512A1 (en) * | 1994-03-03 | 1995-09-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Terminal complement inhibitor fusion genes and proteins |
| US5827642A (en) | 1994-08-31 | 1998-10-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes |
| US6713247B1 (en) | 1996-09-03 | 2004-03-30 | Signal Pharmaceuticials, Inc. | Human CNS cell lines and methods of use therefor |
| JP2002502376A (ja) * | 1997-05-21 | 2002-01-22 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 生物学的膜を横切る輸送を増強するための組成物および方法 |
| EP0893493A3 (de) | 1997-07-21 | 2002-12-04 | Aventis Pharma Deutschland GmbH | Genetisch veränderte Zellen und deren Verwendung in der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen |
| GB9720585D0 (en) | 1997-09-26 | 1997-11-26 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| US6221355B1 (en) * | 1997-12-10 | 2001-04-24 | Washington University | Anti-pathogen system and methods of use thereof |
| EP1070757B1 (en) | 1998-04-08 | 2005-02-02 | Shionogi & Co., Ltd. | Methods for isolating osteoclast precursor cells and inducing the differentiation of the same into osteoclasts |
| US6835567B1 (en) | 1998-04-14 | 2004-12-28 | Signal Pharmaceuticals, Inc. | PNS cell lines and methods of use therefor |
| US6451558B1 (en) | 1998-08-03 | 2002-09-17 | Novartis Ag | Genes in the control of hematopoiesis |
| US6913925B1 (en) | 1998-08-12 | 2005-07-05 | Signal Pharmaceuticals Llc | Human mesencephalon cell lines and methods of use therefor |
| AU7497000A (en) | 1999-02-28 | 2000-11-14 | Washington University | Novel transduction molecules and methods for using same |
| WO2000059540A1 (en) | 1999-04-05 | 2000-10-12 | Biocrystal Ltd. | Assay kits and methods for immune complex-mediated activation involving shed antigens |
| JP2002541786A (ja) | 1999-04-12 | 2002-12-10 | モデックス テラピューティク ソシエテ アノニム | 遺伝子治療における使用のための一過性不死化細胞 |
| US6451601B1 (en) | 1999-04-12 | 2002-09-17 | Modex Therapeutiques, S.A. | Transiently immortalized cells for use in gene therapy |
| US6358739B1 (en) | 1999-04-12 | 2002-03-19 | Modex Therapeutiques, S.A. | Transiently immortalized cells |
| US7135287B1 (en) | 1999-10-02 | 2006-11-14 | Biosite, Inc. | Human antibodies |
| US7311920B1 (en) * | 1999-10-08 | 2007-12-25 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Virus coat protein/receptor chimeras and methods of use |
| AU1482101A (en) | 1999-11-10 | 2001-06-06 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions comprising renilla gfp |
| CN1297044A (zh) | 1999-11-22 | 2001-05-30 | 上海博容基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人甲硫氨酰tRNA合成酶29和编码这种多肽的多核苷酸 |
| EP1103615A1 (en) | 1999-11-25 | 2001-05-30 | Universite De Geneve | Vectors capable of immortalizing non-dividing cells and cells immortalized with said vectors |
| US20010049393A1 (en) | 1999-12-07 | 2001-12-06 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Methods for defining MYC target genes and uses thereof |
| AU2001251621A1 (en) * | 2000-04-12 | 2001-10-30 | Agensys, Inc. | Gtp-binding protein useful in treatment and detection of cancer |
| AU2001256746A1 (en) | 2000-05-15 | 2001-11-26 | Sonoko Habu | Chimeric mouse having immunity constructed by using human cd34-positive cells and use thereof |
| US20020155127A1 (en) | 2000-06-02 | 2002-10-24 | Danher Wang | Genetic vaccine against human immunodeficiency virus |
| US20030072794A1 (en) | 2000-06-09 | 2003-04-17 | Teni Boulikas | Encapsulation of plasmid DNA (lipogenes™) and therapeutic agents with nuclear localization signal/fusogenic peptide conjugates into targeted liposome complexes |
| US20070248618A1 (en) | 2004-03-16 | 2007-10-25 | Cohen David I | Tat-Based vaccine Compositions and Methods of Making and Using Same |
| WO2002024899A2 (en) | 2000-09-25 | 2002-03-28 | Valentis, Inc. | Improved system for regulation of transgene expression |
| EP1330551A2 (en) * | 2000-10-30 | 2003-07-30 | Kalobios, Inc. | Affinity maturation by competitive selection |
| ES2386884T3 (es) | 2000-11-01 | 2012-09-04 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Vectores de expresión capaces de inducir respuesta inmunomejorada y métodos para usarlos |
| CA2402459A1 (en) | 2000-12-01 | 2002-06-06 | Central Institute For Experimental Animals | Method of producing a mouse suitable for engraftment, differentiation and proliferation of heterologous cells, mouse produced by this method and use of the mouse |
| US20020090606A1 (en) * | 2001-01-08 | 2002-07-11 | Sandy Stewart | Method and specific phage library for high throughput proteomics |
| WO2002057436A2 (en) | 2001-01-19 | 2002-07-25 | Gendel Limited | Red blood cell from a transgenic animal as vehicle for polypeptide delivery |
| US7033744B2 (en) | 2001-03-16 | 2006-04-25 | Naoya Kobayashi | Method for proliferating a liver cell, a liver cell obtained thereby, and use thereof |
| GB0117631D0 (en) * | 2001-07-19 | 2001-09-12 | Syngenta Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
| DE60203125T2 (de) | 2001-08-31 | 2006-04-06 | Avidex Ltd., Abingdon | Löslicher t zell rezeptor |
| CN100506978C (zh) | 2001-09-21 | 2009-07-01 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 一种新的造血干/祖细胞的富集方法及其体外定向诱导分化 |
| GB0124391D0 (en) | 2001-10-11 | 2001-11-28 | Gene Expression Technologies L | Control of gene expression |
| JP2005508171A (ja) | 2001-11-02 | 2005-03-31 | タノックス インコーポレーテッド | Ｂ細胞悪性病変の診断及び予防に用いるためのｂ細胞リンパ腫特異抗原 |
| US7745140B2 (en) | 2002-01-03 | 2010-06-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool |
| AU2003202908A1 (en) | 2002-01-03 | 2003-07-24 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Activation and expansion of t-cells using an engineered multivalent signaling platform |
| CA2476556A1 (en) | 2002-02-13 | 2003-08-21 | Duke University | Modulation of immune response by non-peptide binding stress response polypeptides |
| CN1240439C (zh) | 2002-03-28 | 2006-02-08 | 南京凯基生物科技发展有限公司 | 肿瘤基因开关药物 |
| US7211191B2 (en) | 2004-09-30 | 2007-05-01 | Thermogenesis Corp. | Blood component separation method and apparatus |
| AU2003228517B2 (en) | 2002-04-16 | 2007-06-21 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Cancer models |
| GB2387599B (en) | 2002-04-17 | 2005-08-10 | Jason Peter Brown | Methods for producing antibodies |
| US7097841B2 (en) | 2002-05-10 | 2006-08-29 | New Century Pharmaceuticals, Inc. | Ferritin fusion proteins for use in vaccines and other applications |
| CN1325512C (zh) | 2002-05-16 | 2007-07-11 | 巴法里安诺迪克有限公司 | Hiv调节/辅助蛋白的融合蛋白 |
| AU2003265948B8 (en) | 2002-09-06 | 2009-09-03 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Immunotherapy with in vitro-selected antigen-specific lymphocytes after nonmyeloablative lymphodepleting chemotherapy |
| NZ539225A (en) | 2002-10-09 | 2006-09-29 | Avidex Ltd | Single chain recombinant T cell receptors |
| ATE350480T1 (de) | 2002-10-11 | 2007-01-15 | Imvision Gmbh | Moduläre antigen-transporter moleküle (mat- moleküle) zur modulierung von immunreaktionen, zugehörige konstrukte, verfahren und verwendungen |
| AU2003274633A1 (en) | 2002-10-15 | 2004-05-04 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Erythrocyte differentiation factor, gene encoding same, and methods of use thereof |
| ATE432290T1 (de) | 2002-11-09 | 2009-06-15 | Immunocore Ltd | T ZELL REZEPTOR ßDISPLAYß |
| JP2006509010A (ja) | 2002-12-05 | 2006-03-16 | インペリアル・カレッジ・イノベイションズ・リミテッド | アポトーシスの制御 |
| DE602004008582T2 (de) | 2003-02-17 | 2008-05-21 | Peter Burkhard | Peptidische nanoteilchen als arzneimittelabgabe- und antigen-display-systeme |
| GB0304068D0 (en) | 2003-02-22 | 2003-03-26 | Avidex Ltd | Substances |
| WO2004084805A2 (en) | 2003-03-19 | 2004-10-07 | The J. David Gladstone Institutes | Acetylated tat polypeptides and methods of use thereof |
| ATE481476T1 (de) | 2003-05-08 | 2010-10-15 | Life Technologies Corp | Erzeugung und isolierung antigenspezifischer t- zellen |
| KR20060054196A (ko) | 2003-06-10 | 2006-05-22 | 주식회사 툴젠 | 전달가능한 ｄｎａ-결합 단백질 |
| WO2005014785A2 (en) | 2003-06-18 | 2005-02-17 | The George Washington University | Conditionally-immortalized hematopoietic progenitor cell lines |
| US20060222657A1 (en) | 2003-06-20 | 2006-10-05 | Dowdy Steven F | Polypeptide transduction and fusogenic peptides |
| IL161903A0 (en) | 2003-07-17 | 2005-11-20 | Gamida Cell Ltd | Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs |
| RU2259567C2 (ru) * | 2003-10-30 | 2005-08-27 | Медицинский исследовательский центр "Иммункулус" | Способ скриннингового выявления лиц группы риска развития патологии нервной системы и мониторинга за состоянием больных, страдающих нервно-психическими заболеваниями |
| EP1691824B1 (en) | 2003-11-19 | 2009-03-11 | Survac ApS | Proteins belonging to the bcl-2 family and fragments thereof, and their use in cancer patients |
| US7705049B2 (en) | 2004-01-21 | 2010-04-27 | New York University | Methods for treating non-melanoma cancers with PABA |
| JP2005232148A (ja) | 2004-02-03 | 2005-09-02 | Technion Research & Development Foundation Ltd | 神経保護剤としてプロパルギルアミンの使用 |
| DE602005009825D1 (de) | 2004-05-19 | 2008-10-30 | Medigene Ltd | Verfahren zur verbesserung von t-zellrezeptoren |
| EP1765860B1 (en) | 2004-05-19 | 2008-12-10 | MediGene Ltd. | High affinity ny-eso t cell receptor |
| ATE475669T1 (de) | 2004-06-29 | 2010-08-15 | Immunocore Ltd | Einen modifizierten t-zellen-rezeptor exprimierende zellen |
| US20060068469A1 (en) * | 2004-08-17 | 2006-03-30 | Research Development Foundation | Bacterial vector systems |
| GB0420963D0 (en) | 2004-09-21 | 2004-10-20 | Reneuron Ltd | Hepatocyte |
| CA2584738A1 (en) | 2004-10-20 | 2006-04-27 | Vitro Diagnostics, Inc. | Generation and differentiation of adult stem cell lines |
| US7767453B2 (en) | 2004-10-20 | 2010-08-03 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Cultured hematopoietic stem cells and method for expansion and analysis thereof |
| US8795650B2 (en) | 2004-12-09 | 2014-08-05 | The Regents Of The University Of California | Derivation of unlimited quantities of neutrophils or monocyte/dendritic cells |
| US20060156422A1 (en) | 2005-01-10 | 2006-07-13 | Medical Research Council | Methods and compositions for the generation of antibodies |
| JP2008535823A (ja) * | 2005-03-25 | 2008-09-04 | キュラジェン コーポレイション | テネイシンの主要な抗原に対する抗体 |
| CA2609342A1 (en) | 2005-04-26 | 2006-11-02 | Andrei L. Gartel | Nucleoside compounds and methods of use thereof |
| WO2006125962A2 (en) | 2005-05-25 | 2006-11-30 | Medigene Limited | T cell receptors which specifically bind to vygfvracl-hla-a24 |
| JP2009506076A (ja) * | 2005-08-26 | 2009-02-12 | ザ・ボード・オブ・トラスティーズ・オブ・ザ・レランド・スタンフォード・ジュニア・ユニバーシティ | 三叉神経疼痛のための薬物送達のための治療手順 |
| US20070047583A1 (en) | 2005-08-29 | 2007-03-01 | Siemens Aktiengesellschaft | Method for using a short address in a packet header |
| CN101330830B (zh) | 2005-10-18 | 2016-01-20 | 国家犹太健康中心 | 条件无限增殖化长期干细胞和制备和使用所述细胞的方法 |
| CA2626584A1 (en) * | 2005-11-04 | 2007-05-18 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of nav1.8 gene |
| EP1792627A1 (en) | 2005-12-05 | 2007-06-06 | ImVisioN AG | Modulation of the immune response by administration of intralymphatic transduction allergen (ITAG-)-molecules |
| CN101045914A (zh) | 2006-03-29 | 2007-10-03 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 体外诱导造血干/祖细胞分化为成熟红细胞的方法与应用 |
| US8088379B2 (en) | 2006-09-26 | 2012-01-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Modified T cell receptors and related materials and methods |
| WO2008038002A2 (en) | 2006-09-29 | 2008-04-03 | Medigene Limited | T cell therapies |
| KR20090130236A (ko) | 2007-03-13 | 2009-12-21 | 내셔날 쥬이쉬 헬스 | 항체의 제조 방법 |
| CA2699312A1 (en) | 2007-11-02 | 2009-05-07 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Compounds for treating abnormal cellular proliferation |
| CA2718904C (en) | 2008-03-17 | 2017-01-03 | The Scripps Research Institute | Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells |
| CN102083960B (zh) | 2008-05-06 | 2014-12-03 | 先进细胞技术公司 | 用于制备衍生自多能干细胞的去核类红细胞的方法 |
| US8986702B2 (en) | 2008-05-16 | 2015-03-24 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Antibodies and processes for preparing the same |
| WO2009149956A2 (en) | 2008-06-13 | 2009-12-17 | Life & Brain Gmbh | Fusion protein and use thereof |
| US9169462B2 (en) | 2008-07-21 | 2015-10-27 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Methods for preparing mature erythrocytes from conditionally immortalized hematopoietic stem cells |
| EP2318435B1 (en) | 2008-08-28 | 2015-12-23 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Modulators of myc, methods of using the same, and methods of identifying agents that modulate myc |
| AU2009313290B2 (en) | 2008-11-06 | 2016-04-21 | Indiana University Research & Technology Corporation | Materials and methods to enhance hematopoietic stem cells engraftment procedures |
| DK2352756T3 (da) | 2008-11-24 | 2012-12-03 | Helmholtz Zentrum Muenchen | Højaffin T-cellereceptor og anvendelse af denne |
| WO2011100477A2 (en) | 2010-02-10 | 2011-08-18 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Antibodies and processes for preparing the same |
| US20120107317A1 (en) | 2010-10-27 | 2012-05-03 | The University Of Hong Kong | Use of cytoplasmic c-myc for regulating immune responses |
| WO2012129201A1 (en) | 2011-03-22 | 2012-09-27 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers |
| CA2848209C (en) | 2011-09-15 | 2021-06-01 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | T cell receptors recognizing hla-a1- or hla-cw7-restricted mage |
| RU2014112958A (ru) | 2011-09-21 | 2015-10-27 | Йиссум Ресерч Девелопмент Компани оф де Хебрю Юниверсити оф Джерусалем Лтд. | Наносистемы доставки для мирнк |
| BR112014027374B1 (pt) | 2012-05-03 | 2022-05-31 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Método para gerar um receptor de células t (tcr) com afinidade aumentada |
| BR112014029247A2 (pt) | 2012-05-23 | 2017-06-27 | Univ Ohio State | nanopartícula de lipídio, composição farmacêutica, método para fazer uma nanopartícula de lipído, produto, método de tratamento de um distúrbio, e sistema de entrega |
| DE102012209673A1 (de) | 2012-06-08 | 2013-12-24 | Artcline Gmbh | Verfahren zum Herstellen einer Leukozytenpräparation und Leukozytenpräparation |
| EP2877189B1 (en) | 2012-07-20 | 2021-01-06 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Enhanced reconstitution and autoreconstitution of the hematopoietic compartment |
| RU2020108070A (ru) | 2012-07-27 | 2020-03-16 | Дзе Борд Оф Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Иллинойс | Конструирование t-клеточных рецепторов |
| JP6486272B2 (ja) | 2012-09-07 | 2019-03-20 | マサチューセッツ・アイ・アンド・イア・インファーマリー | 有毛細胞および／または支持細胞再生のための方法および組成物 |
| US20140109246A1 (en) | 2012-09-24 | 2014-04-17 | The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate | Methods of generating xenochimaeric mice with tumor and hematopoietic system from the same heterologous species |
| GB2508414A (en) | 2012-11-30 | 2014-06-04 | Max Delbrueck Centrum | Tumour specific T cell receptors (TCRs) |
| EP2961415B1 (en) | 2013-03-01 | 2021-01-06 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Methods of producing enriched populations of tumor-reactive t cells from tumor |
| CA2902448C (en) | 2013-03-01 | 2023-04-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of producing enriched populations of tumor reactive t cells from peripheral blood |
| US9365825B2 (en) | 2013-03-11 | 2016-06-14 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Expansion of adult stem cells in vitro |
| US10272115B2 (en) | 2013-03-11 | 2019-04-30 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Production and use of red blood cells |
| CA2945393C (en) | 2014-04-24 | 2021-03-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Application of induced pluripotent stem cells to generate adoptive cell therapy products |
| CN116869964A (zh) | 2014-12-24 | 2023-10-13 | 耐克西缪恩有限公司 | 用于免疫疗法的纳米颗粒组合物和方法 |
| EP3355922A2 (en) | 2015-10-02 | 2018-08-08 | Dana Farber Cancer Institute, Inc. | Combination therapy of bromodomain inhibitors and checkpoint blockade |
| TWI756199B (zh) | 2016-01-15 | 2022-03-01 | 美商伯克利之光生命科技公司 | 製造患者專ㄧ性抗癌治療劑之方法及使用該治療劑之治療方法 |
| WO2018104909A2 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | St. Jude Children's Research Hospital | Dna methylation profiling for t-cell immunotherapy |
| US10149898B2 (en) | 2017-08-03 | 2018-12-11 | Taiga Biotechnologies, Inc. | Methods and compositions for the treatment of melanoma |
-
2009
- 2009-05-18 US US12/467,957 patent/US8986702B2/en active Active
- 2009-05-18 ES ES09747016T patent/ES2820873T3/es active Active
- 2009-05-18 WO PCT/US2009/003105 patent/WO2009139930A2/en active Application Filing
- 2009-05-18 AU AU2009246876A patent/AU2009246876B2/en active Active
- 2009-05-18 EP EP09747016.5A patent/EP2285832B1/en active Active
- 2009-05-18 EA EA201001762A patent/EA021131B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2009-05-18 KR KR1020177017674A patent/KR20170078862A/ko not_active Application Discontinuation
- 2009-05-18 SG SG2013037908A patent/SG190661A1/en unknown
- 2009-05-18 CA CA2723114A patent/CA2723114C/en active Active
- 2009-05-18 SG SG10201803982TA patent/SG10201803982TA/en unknown
- 2009-05-18 KR KR1020107028384A patent/KR101803099B1/ko active IP Right Grant
- 2009-05-18 IL IL287311A patent/IL287311B2/en unknown
-
2010
- 2010-10-19 IL IL208810A patent/IL208810A0/en active IP Right Grant
- 2010-12-07 US US12/962,197 patent/US20110263820A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-03-18 US US14/661,786 patent/US9428571B2/en active Active
-
2016
- 2016-08-23 US US15/244,138 patent/US10442853B2/en active Active
-
2019
- 2019-03-17 IL IL265409A patent/IL265409B/en unknown
- 2019-10-10 US US16/598,690 patent/US11667695B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL287311B1 (en) | 2024-02-01 |
| CA2723114C (en) | 2018-02-27 |
| EP2285832A2 (en) | 2011-02-23 |
| US8986702B2 (en) | 2015-03-24 |
| KR101803099B1 (ko) | 2017-11-30 |
| SG10201803982TA (en) | 2018-07-30 |
| IL265409B (en) | 2021-12-01 |
| IL208810A0 (en) | 2011-01-31 |
| CA2723114A1 (en) | 2009-11-19 |
| US20150259399A1 (en) | 2015-09-17 |
| US9428571B2 (en) | 2016-08-30 |
| ES2820873T3 (es) | 2021-04-22 |
| US11667695B2 (en) | 2023-06-06 |
| US10442853B2 (en) | 2019-10-15 |
| AU2009246876B2 (en) | 2015-04-02 |
| WO2009139930A2 (en) | 2009-11-19 |
| IL287311A (en) | 2021-12-01 |
| IL265409A (en) | 2019-05-30 |
| EA021131B1 (ru) | 2015-04-30 |
| EP2285832A4 (en) | 2012-06-27 |
| US20200148749A1 (en) | 2020-05-14 |
| IL287311B2 (en) | 2024-06-01 |
| US20110263820A1 (en) | 2011-10-27 |
| KR20110016943A (ko) | 2011-02-18 |
| AU2009246876A1 (en) | 2009-11-19 |
| EP2285832B1 (en) | 2020-08-26 |
| WO2009139930A3 (en) | 2010-03-18 |
| US20090291094A1 (en) | 2009-11-26 |
| US20170044237A1 (en) | 2017-02-16 |
| SG190661A1 (en) | 2013-06-28 |
| EA201001762A1 (ru) | 2012-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11667695B2 (en) | Antibodies and processes for preparing the same | |
| JP6412072B2 (ja) | 抗ヒト受容体型プロテインチロシンホスファターゼσ抗体 | |
| JP2023542417A (ja) | Ｋｒａｓ変異に特異的ｔ細胞受容体のスクリーニング及び抗腫瘍用途 | |
| WO2020228825A1 (en) | Engineered immune cells comprsing a recognition molecule | |
| WO2011100477A2 (en) | Antibodies and processes for preparing the same | |
| CN109476722A (zh) | 用于改善免疫细胞的功效和扩张的方法 | |
| KR20110036618A (ko) | 극대화된 Ｇａｇ 및 Ｎｅｆ를 수지상 세포에 표적화시킴을 기본으로 하는 ＨＩＶ 백신 | |
| US20210275589A1 (en) | Co-receptor systems for treating infectious diseases | |
| CN112480239B (zh) | 人乳头瘤病毒特异性t细胞受体及其抗肿瘤用途 | |
| WO2019018402A2 (en) | ANTIGEN-BINDING REGIONS DIRECTED AGAINST FIBRONECTIN TYPE III DOMAINS AND METHODS OF USING THE SAME | |
| WO2019164970A1 (en) | Hpv proteins, antibodies, and uses in managing abnormal epithelial cell growth | |
| WO2022002065A1 (zh) | 抗cd40抗体或抗原结合片段及其应用 | |
| TWI841576B (zh) | 用於治療傳染病之共受體系統 | |
| WO2022162009A1 (en) | Method for rapid identification of cross-reactive and/or rare antibodies | |
| WO2022161597A1 (en) | Method for rapid identification of cross-reactive and/or rare antibodies | |
| CN117645673A (zh) | 一种IL-21与sCD4及Fc的融合蛋白及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A107 | Divisional application of patent | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |