KR20090130236A - 항체의 제조 방법 - Google Patents

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KR20090130236A
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요세프 레파에리
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내셔날 쥬이쉬 헬스
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Abstract

본 발명은 원암유전자 (protooncogene)를 발현하는 동물에서 항체를 생산하는 세포들과 항체들을 생산하는 방법들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 자가-내성 (self-tolerance)과 같은 면역학적 이상이 생기기 쉬운 항원들에 대한 특이 항체들을 효율적으로 생산하는 방법들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체를 생산하는 B 세포를 융합 파트너인 마이엘로마 (myeloma) 세포와의 통상적인 융합이 필요 없이 항체를 생산하는 세포들과 항체들을 생산하는 방법에 관한 것이다.
프로토온토 유전자 (protooncogene), 항체를 생산하는 세포, 항체, 자가-내성

Description

항체의 제조 방법{METHODS FOR GENERATION OF ANTIBODIES}
본 출원은 2007년 3월 13일 가출원된 미국 가출원 제60/894,654호 및 2007년 5월 18일 가출원된 미국 가출원 제60/939,042호를 U.S.C.§119(e)하에 교차 참조한다. 이들 각 출원의 전체 개시 내용을 모든 목적을 위해 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
-기술분야-
본 발명은 원암유전자 (protooncogene)를 발현하는 동물에서 항체를 생산하는 세포들과 항체들을 생산하는 방법들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 자가-내성 (self-tolerance)과 같은 면역학적 이상이 생기기 쉬운 항원들에 대한 특이 항체들을 효율적으로 생산하는 방법들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체를 생산하는 B 세포를 융합 파트너인 마이엘로마 (myeloma) 세포와의 통상적인 융합이 필요 없이 항체를 생산하는 세포들과 항체들을 생산하는 방법에 관한 것이다.
항체, 상세하게는 단일클론 (monoclonal) 항체의 사용은 일반적인 진단 방법뿐만 아니라 기초 및 임상 연구에서 여러 분야를 혁신적으로 발전시켜 왔다. 단일클론 항체의 임상적 적용은 새로운 암 치료 약물의 주요한 출처가 되었다. 실제로 CD20 이라고 불리는 표면 단백질에 대한 항체들은 항체가 관련된 자가면역 질환을 가진 환자들뿐만 아니라 NHL 환자들의 예후도 극적으로 개선시켰다.
중화 항체 (neutralizing antibody)에 높은 역가 (titer)를 생기는 것은 많은 바이러스 감염에 대항하는 환자들의 능력과 관련이 있다고 알려져 왔다. 최근 동남아시아에서 유행한 조류 독감에서도 이 감염에 살아남은 사람은 B 세포 항체에 의존적인 중화 반응을 효과적으로 갖출 수 있는 사람들이었다. 이와 유사한 보고는 1년 전 SARS 생존자의 사례에서도 볼 수 있었다. 미국에서 인플루엔자가 유발하는 연간 사망자수는 어림잡아도 매년 30,000 에서 50,000명에 이르는 것으로 판단된다. 전세계적으로 인플루엔자로 인한 사망자수는 미국만의 숫자보다 대략 20 내지 30배 더 높을 것으로 추산된다. 특별히 이 질병이 취약한 집단은 어린 아이들과 노인들이다. 중화 항체가 개인적으로 공급될 수 있도록 개발되면 인플루엔자 또는 HIV와 같은 바이러스로 인한 치사율을 극적으로 감소시킬 수 있다.
2005년 5월부터, 미국 시장에서 18가지의 치료용 단일클론 항체 제품들이 판매되었다. 전세계적으로 소모성 질환 모두의 치료를 위해 200개 이상의 국가에서 약 500가지의 단일클론 항체 제품들이 개발되고 있는 것으로 추산된다. 이들 단일클론 항체 제품들 중 80개는 현재 임상시험이 진행 중이다. 2008년에는 단일클론 항체들의 전세계 시장 규모가 167억 달러로 증가할 것으로 예상된다.
종래에 단일클론 항체를 제조하는 방법은 마우스 또는 다른 대체 동물에 과다 면역반응을 유발시키는 것이었다. 이 때 비장에서 항체를 생산하는 세포는 채취하여 융합 파트너인 마이엘로마 세포에 융합시킨다. 이 항체를 생산하는 유전자를 보유하는 세포는 전방향 및 역방향 선택 과정에 의해 선택된다. 이 방법은 매우 강 력한 기술로 증명되어 있긴 하지만, 기초 생물학적인 제한들이 많아 전체 가능성 있는 특이 세포들 중 90% 정도는 손실될 수 밖에 없다. 이러한 제한들로는 항체를 생산하는 세포와 마이엘로마 융합 파트너 간에 성공적인 융합을 달성하는 데 요구되는 몇 가지 필수사항뿐만 아니라 "자가-내성 (self tolerance)"이라는 기작을 들 수 있다.
따라서, 상기에서 나열한 제한들과 관련된 문제점을 해결하고 해당 항체들을 확인하는 데 필요한 시간을 절약하도록 항체의 제조 방법들을 개선하는 기술이 절실히 필요하다.
-본 발명의 요약-
본 발명의 양태에서는 (a) 동물에서 MYC 이 과발현 되지 않는 조건 하에서 MYC 을 유도 과발현 하는 동물에게 항원을 도입시키는 단계; (b) 상기 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계; 및 (c) 상기 B 세포를 MYC 이 과발현 되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 항체를 생산하는 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시 양태에서는 상기 동물에게 상기 항원을 도입하는 단계 이후에 상기 동물에서 MYC이 과발현 되는 조건 하에서 동물을 유지시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에서 상기 동물이 MYC 을 상기 동물의 B 세포에서 압도적으로 유도 과발현 하도록 한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 동물은 MMTV-rtTA/TRE-MYC 마우스이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 동물에게 상기 항원을 도입하는 단계는 상기 동물에게 상기 항원을 인코딩하는 DNA 를 유전자적으로 전달하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 항원은 자가-항원을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 동물은 상기 항원을 더욱 발현한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 항원은 HIV 단백질 예컨대 gp120 또는 gp41 단백질을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 항원은 헤마글루티닌 (hemaglutinin)과 같은 인플루엔자 바이러스로부터 나온 항원을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 (a) 항원을 상기 동물에게 도입하는 상기 단계에서 마우스는 MYC 발현을 억제하는 항생제 조건에서 유지시키고; 상기 (b) B 세포를 배양하는 단계는 항체 생성 세포를 생성하도록 항생제가 없는 조건에서 수행한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서는 상기 동물에게 상기 항원을 도입하는 단계 이후에 마우스에 대한 항생제 노출을 제거하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 항생제는 독시사이클린이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 동물에서 MYC 이 과발현 되지 않는 조건 하에서 MYC 을 유도 과발현 하는 동물에게 항원을 도입시키는 단계; (b) 상기 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계; (c) 상기 B 세포를 MYC 이 과발현 되는 조건 하에서 배양하는 단계: 및 (d) 상기 B 세포 배양액으로부터 상기 항체를 회수 하는 단계를 포함하는, 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시 양태에서는 상기 동물에게 상기 항원을 도입하는 단계 이후에 상기 동물에서 MYC이 과발현 되는 조건 하에서 동물을 유지시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에서는 상기 동물이 MYC 을 상기 동물의 B 세포에서 압도적으로 유도 과발현 하도록 한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 동물은 MMTV-rtTA/TRE-MYC 마우스이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 동물에게 상기 항원을 도입하는 단계는 상기 동물에게 상기 항원을 인코딩 하는 DNA 를 유전자적으로 전달하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 항원은 자가항원을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 동물은 상기 항원을 더욱 발현한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 항원은 HIV 단백질 예컨대 gp120 및 gp41을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 항원은 헤마글루티닌과 같은 인플루엔자 바이러스 유래의 항원을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 항체는 인간화된 항체이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) B 세포의 중쇄 또는 경쇄 유전자의 VDJ 연결 부위를 인코딩 하는 핵산 분자를 MYC 을 유도 과발현 하고 상기 B 세포의 생성을 억제하는 유전적 변형을 포함하는 동물로부터 얻은 골수에서 유래한 줄기세포 내로 도입하는 단계; (b) 상기 골수에서 유래한 줄기세포를 수여 동물에게 전달하는 단계; (c) 상기 수여 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계; (d) 상기 B 세포를 MYC 이 과발현 되는 조건 하에서 배양하는 단계; 및 (e) 상기 B 세포로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시 양태에서는 상기 골수에서 유래한 줄기세포를 상기 수여 동물에게 전달하는 단계 이후에 상기 수여 동물에서 MYC 이 과발현 되는 조건 하에서 수여 동물을 유지시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 다른 실시 양태에서는 상기 골수에서 유래한 줄기세포를 상기 수여 동물에게 전달하는 단계 이후에 상기 수여 동물에서 MYC 이 과발현 되지 않는 조건 하에서 수여 동물을 유지시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서는 상기 첫 번째 단계로부터 얻은 상기 B 세포는 인간 B 세포이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 B 세포는 인간으로부터 분리된다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 인간은 항체가 매개하는 자가면역 질환 (autoimmune disease)을 앓고 있는 환자이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 첫 번째 단계에서 상기 골수에서 유래한 줄기세포는 상기 VJD 연결 부위를 인코딩 하는 핵산 분자로 레트로바이러스적으로 형질도입시키는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 VDJ 연결 부위를 인코딩하는 핵산 분 자는 해당 항원에 선택적으로 결합하는 분리된 인간 B 세포로부터 클로닝된다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 VDJ 연결 부위를 인코딩 하는 핵산 분자는 인간 공여자로부터 얻은 B 세포에서 찾아낸 IgH 및 IgL 서열로부터 재배열된 VDJ 부위를 PCR로 증폭시킨 단편이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 인간 공여자는 건강한 공여자 및 항체가 매개하는 자가면역 질환을 가진 환자로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 골수에서 유래한 줄기세포는 인간 IgH 를 인코딩 하는 핵산 분자 및 인간 IgL 를 인코딩 하는 핵산 분자를 이용하여 더욱 형질도입된다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 인간 IgH 를 인코딩 하는 핵산 분자 및 인간 IgL 를 인코딩 하는 핵산 분자는 동일한 핵산 분자이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 인간 IgH 및 상기 인간 IgL 을 인코딩 하는 하나 또는 모든 핵산 분자는 동일한 상기 VDJ 부위를 인코딩 하는 핵산 분자이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 골수에서 유래한 줄기세포는 인간 또는 마우스로부터 얻는다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 마우스는 Rag-2"-/-", SCID, DNA-PK"-/-", Ku70"-/-", Ku80"-/-", XRCC4"-/-" 및 μMT"-/-"로 이루어진 리스트로부터 선택된 유전적 변형을 가지는 MMTV-rtTA/TRE-MYC 마우스이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 수여 동물은 치사량으로 조사된 마우스이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 수여 동물은 SCID 마우스이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 동물에게 상기 VDJ 부위가 선택적으로 반응하는 상기 항원을 체내 도입한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 항체의 이소타입은 IgA 또는 IgG 이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 항체의 Fc 부위는 상기 항체가 자가면역 반응 및 이와 관련된 면역-복합체 (immune complex) 침착을 유발하는 능력을 최소화 하도록 유전자적으로 변형된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 원암유전자가 동물에서 과발현되지 않는 조건 하에서 항원을 상기 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원암유전자를 유도 과발현 하는 상기 동물에게 도입시키는 단계; (b) 상기 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계; 및 (c) 상기 B 세포를 상기 원암유전자가 과발현 되는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 항체를 생산하는 세포를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 원암유전자가 상기 동물에서 과발현되지 않는 조건 하에서 항원을 상기 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원암유전자를 유도 과발현하는 상기 동물에게 도입시키는 단계; (b) 상기 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계; (c) 상기 B 세포를 상기 원암유전자가 과발현 되는 조건 하 에서 배양하는 단계: 및 (d) 상기 B 세포 배양액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원암유전자를 유도 과발현하는 동물로부터 얻은 골수에서 유래한 줄기세포 내로 항원을 인코딩하는 핵산 분자를 도입시키는 단계; (b) 상기 골수에서 유래한 줄기세포를 수여 동물 내로 전달하는 단계; (c) 상기 동물에서 원암유전자가 과발현 되는 조건 하에서 상기 수여 동물을 유지시키는 단계; (d) 상기 수여 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계: (e) 상기 원암유전자가 과발현 되는 조건 하에서 B 세포를 배양하는 단계; 및 (f) 상기 B 세포 배양액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원암유전자를 인코딩하는 핵산 분자를 동물로부터 얻은 골수에서 유래한 줄기세포 내로 도입시키는 단계; (b) 상기 골수에서 유래한 줄기세포를 수여 동물 내로 전달하는 단계; (c) 상기 수여 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계: (d) 상기 B 세포 내로 항원을 인코딩 하는 핵산 분자를 도입시키는 단계; (e) 상기 원암유전자가 과발현 되는 조건 하에서 B 세포를 배양하는 단계; 및 (f) 상기 B 세포 배양액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원암유전자를 유도 과발현하는 동물로부터 얻은 골수에서 유래한 줄기세포 내로 항원을 인코딩하는 핵산 분자를 도입하는 단계; (b) 상기 골수에서 유래한 줄기 세포를 첫 번째 수여 동물 내로 전달하는 단계; (c) 상기 첫 번째 수여 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계: (d) 상기 B 세포 내로 항원을 인코딩하는 핵산 분자를 도입시키는 단계; (e) 상기 B 세포를 두 번째 수여 동물 내로 전달하는 단계; (f) 상기 원암유전자가 과발현 되는 조건 하에서 상기 두 번째 수여 동물을 유지시키는 단계; (g) 상기 두 번째 수여 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계; (h) 상기 원암유전자가 과발현 되는 조건 하에서 상기 B 세포를 배양하는 단계; 및 (i) 상기 B 세포 배양액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시 양태에서 상기 원암유전자는 MYC 이다.
본 발명의 다른 실시 양태에서 상기 골수에서 유래한 줄기세포는 항-세포사멸 (anti-apoptosis) 단백질을 인코딩하는 핵산 분자로 형질도입된다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 항-세포사멸 단백질은 Bcl-2이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 핵산 분자는 레트로바이러스적으로 도입된다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 골수에서 유래한 줄기세포는 인간으로부터 유래한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 골수에서 유래한 줄기세포는 조건적으로 불멸화된 (conditionally immortalized) 장기 조혈 줄기세포이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 수여 동물은 치사량 이하로 조사된 NOD/SCID 마우스이다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서 상기 동물은 상기 인간 Ig 유전자좌를 인코딩 하는 핵산 분자로 형질전환된다.
도 1은 TBLK6 세포주 및 TBLK7 세포주의 표면에서 CD138의 발현 (Y-축) 및 CD40의 발현 (X-축) (상단 패널)그리고 TBLK6 및 TBLK7 세포주에서 나온 IgM 분비 정도 (하단 패널)를 분석하여 나타낸 것이다.
도 2는 형질전환 된 Eμ-MYC/BCRHEL /sHEL 마우스에서 나온 종양 및 세포주의 표면형 (상단 패널) 그리고 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스에서 나온 종양 및 세포주에서 면역글로불린의 생산 (A) 및 HEL 특이 역가 (B) (하단 패널)를 나타낸 것이다.
도 3은 MYC 의 일시적 과다 발현에 의해 활성화된 B 세포의 형태 (상단 패널) 그리고 MYC의 지속적 과다 발현에 의해 활성화된 B 세포의 축적 (하단 패널)을 나타낸 것이다.
도 4는 MYC의 과다 발현에 의한 혈청 내 자가 항체의 축적 (상단 패널) 그리고 MYC의 과다 발현에 의한 신장 내 자가 항체 및 면역 복합체의 축적 (하단 패널)을 나타낸 것이다.
도 5는 HEL를 발현하는 PRV 변이체에 letHA1 cHA1lenge를 조사하여 새로운 HEL 특이 항체가 마우스를 보호하는 것을 나타낸 것이다.
도 6은 레트로바이러스로 재조합 된 (retrovirally chimeric) 마우스에서 발달한 B 세포 종양에서 표면의 표면형을 나타낸 것이다.
도 7은 레트로바이러스로 재조합 된 마우스로부터 얻은 혈청의 반응성을 HA 를 발현하는 세포 용출액으로 웨스턴 블럿 분석하여 나타낸 것이다.
도 8은 레트로바이러스로 재조합 된 마우스로부터 얻은 마우스 혈청에서 적혈구 응집 억제를 분석하여 나타낸 것이다.
도 9는 2가지 MYC 을 과다 발현하는 마우스를 사용하여 얻은 항체의 특이성을 인간화하는 레트로바이러스 벡터에 기초한 방법을 모식적으로 나타낸 것이다.
본 발명은 종래의 항체 생산에 있어 많은 문제점들을 극복하는 새로운 항체를 생산하는 세포들 및 항체들을 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 원암유전자를 발현하는 동물에서 항체를 생산하는 세포들 및 항체들을 신속하게 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 때 상기 동물은 MYC 또는 Akt 를 과다 발현하는 동물을 사용하는 것이 바람직하고 MYX 을 과다 발현하는 경우는 더욱 바람직하다. 본 발명에서 기술하는 방법은 항체를 생산하는 B 세포를 마이엘로마 융합 파트너와 융합시킬 필요가 없이 단일클론 항체를 생산할 수 있게 한다. 또한, 본 발명의 방법에서는 기존의 항체 생산 기술에서 반드시 요구되는, 마이엘로마 융합 파트너와 성공적으로 융합시키기 위해 세포 주기의 특정 단계에 있는 면역화된 마우스로부터 B 세포를 분리할 필요가 없다. 또한, 본 발명은 정상적으로 자가-내성 등과 같은 면역학적인 제한이 있는 항원에 특이적인 항체를 효율적으로 생산할 수 있게 한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 자가 항원들 (self-antigens)에 대한 단일클론 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다.
본 발명자들은 MYC의 과다가 수용성 항원에 대한 B 세포 내성을 파괴할 수 있다고 보고한 바 있었다. 예를 들어, MYC을 과다 발현하는 BCRHEL 형질전환 된 B 세포는 sHEL 에 대한 격렬한 반응을 유발하고 악성 질환이 생기기 전에 다중클론 (polyclonal) 자가면역 림프 증식성 질환을 일으킨다 (도 3 및 도 4 참조). 자가 면역성 B 세포에서 MYC 의 과다 발현은 MYC 이 증식 및 생존 신호를 제공하는 능력을 가지기 때문에 B 세포를 T 세포의 도움에 의존하지 않게 만들 수 있다. MYC 을 과다 발현하는 자가 반응성 B 세포의 집단이 증가하면 지속적인 해당 항원에 대한 노출과 MYC의 과다 발현에 의존하는 B 세포 림프 종양을 계속 생성시킨다. 상기 종양을 갖는 마우스에서 림프절, 비장 및 골수로부터 유래한 B 세포를 채취할 수 있고, 일차 세포를 마이엘로마 융합 파트너와 융합하지 않더라도 BCRHEL 형질전환 유전자를 발현하고 항-HEL IgM 을 분비하는 많은 세포주들을 만들 수 있다 (도 2 참조). 이 프로토콜은 하기에 기술한 바와 같이 어떠한 항원에도 손쉽게 적용시킬 수 있다.
이와 유사한 결과가 2가지 동물 프로토콜을 추가적으로 사용하여 얻어졌다. 한 가지 사례는 Ars/Al 마우스를 Eμ-MYC 마우스와 교배하여 얻은 마우스이다. 상기 마우스에서는 평균 36일이 경과한 시점에 버킷과 유사한 림프 종양 (Burkitt like lymphoma)이 발생된다. 이 종양은 성숙한 활성화된 B 세포로 구성되어 있고 이들 세포는 표면에 IgM 을 발현한다. 따라서, 낮은 친화성을 가지는 항-DNA 항체에서 MYC 의 과다 발현은 자가 반응성 B 세포에 대한 내성을 파괴하는 것을 알 수 있다.
두 번째 사례에서는 MMTV-rtTA/TRE-MYC 마우스를 사용한다. 상기 마우스에서는 이중 형질전환 마우스의 식사로부터 독시사이클린 (doxycycline)을 제거하고 나서 일시적으로 조절되는 MYC의 과다 발현이 B 세포에 특이적이 된다. 4개월에 독시사이클린을 포함하는 식사를 제거하면 상기 마우스는 활성화된 말단 B 세포 및 혈청 내 항-핵 항체를 축적시키고 신장 내 면역 복합체를 침착시키며 6주 내 (평균 42일)에 B 세포 림프 종양을 발달시킨다. 중요한 것은 본 발명자들은 이들 종양으로부터 마이엘로마 파트너 세포와 융합시키지 않고도 세포주를 만들 수 있었다.
본 발명에서는 이 시스템의 적어도 3가지 생물학적 측면에 근거하여 최근의 방법보다 탁월하게 개선된 기지의 특이성을 가지는 항체를 생산하는 새로운 방법을 제공한다. 먼저, 이 시스템은 자가 내성의 기작에 의한 장벽을 없애서 면역학적 제한이 없는 항체를 생산할 수 있다. 이 방법은 표준 면역화 방법 (종래 기술)으로는 달성할 수 없는 항체 특이성을 생성할 수 있게 한다. 더구나 표준 면역화 프로토콜로는 자가 내성을 파괴하는 간단한 수단이 없다. 둘째, 해당 동종 항원은 생체 내 B 세포 종양을 유발하고 림프 종양으로 발달할 수 있는 항체를 생산하는 세포와 이로부터 얻은 단일클론 항체를 생산하는 세포주를 선택할 수 있게 한다. 이 방법은 단일클론 항체를 직접적으로 검색할 수 있기 때문에 개발하는 데 걸리는 시간을 감소시킨다. 셋째, 마우스에서 유발되는 종양으로부터 항체를 생산하는 세포주를 생성시키고 이는 클론으로 증식하는 능력이 있어 항체를 생산하는 비장 B 세포를 마이엘로마 융합 파트너와 융합시킬 필요가 없다. 종래의 융합 방법은 매우 비효율적이어서 면역화 후에 증식하는 B 세포 분획을 불멸화 시키기 위해서는 단일클론 항체에서의 특이성의 종류가 많이 제한된다. 이러한 종래의 비효율성에는 많은 이유가 있다 (예를 들어, B 세포는 세포 주기 상 S기에 머물러야 하고 B 세포로부터 유래한 염색체는 적당한 수와 조합을 가져야 하며 마이엘로마 융합 파트너가 세포 상태로 HAT 및 6-TG 배지에서 살아남아야 한다.). 정리하면, 단일클론 항체들을 생산하는 본 발명의 방법은 기존의 방법보다 훨씬 짧은 시간 안에 더 많은 항체들을 제공한다. 이 방법에는 최근에 사용되고 있는 실험적 도구들을 사용하여 다양하게 변형될 수 있고 이에 관해서는 하기에 기술한다.
본 발명의 실시 양태에서, 상기 항체를 생산하는 데 사용되는 비-인간 동물에는 항체를 생산할 수 있고 세포 생존 및 증식을 증진시키는 원암유전자를 적어도 하나 이상 과다 발현하는 (예를 들어, 유전적 변형 또는 자연적 또는 의도된 돌연변이에 의해) 비-인간 동물이라면 어느 것도 포함된다. 본 발명의 방법에서 사용되는 비-인간 동물에서 과다 발현되는 바람직한 원암유전자는 MYC 또는 Akt (미리스테이티드)에 한정되지 않지만 MYC 을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는, MYC을 과다 발현하는 마우스가 상세히 기술되어 있긴 하지만 상기 프로토콜의 변형이 이 프로토콜을 수행하는 세부 기술의 변형뿐만 아니라 다른 적절한 원암유전자 및 다른 동물들을 사용하는 것을 포함하면서 이러한 개시에 기초하여 고찰되고 의미를 갖는 것으로 이해된다.
MYC 을 과다 발현하는 동물이라면 어떤 것도 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 동물은 비-인간 포유동물인 것이 바람직하고, 설치류인 것은 더욱 바람직하며 마우스를 포함하는 것이 훨씬 더 바람직하다. 특히 유용한 동물로는 B 세포 집단에서 MYC 을 압도적으로 과다 발현하는 Eμ-MYC 마우스 등을 들 수 있다. 또한 바람직한 동물로는 MYX을 유도적으로 과다 발현하는 동물을 들 수 있다. 상기 동물에서 MYC의 과다 발현은 일시적으로 조절될 수 있다. 구체적으로, 항체 생산이 시작될 때까지 억제된다. 예를 들어, 상기 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스는 태어나서 해당 항체를 생산하는 데 사용되기 전까지 독시사이클린 또는 테트라사이클린을 투여하여 자발적인 림프 종양의 형성을 최소화시킨다. MYC의 과다 발현은 마우스의 식사에서 독시사이클린 또는 테트라사이클린을 제거하면 시작된다. 본 발명에도 사용할 수 있는 적절한 유도성 유전자 발현/억제 시스템이 종래 기술에 많이 추가되어 있다. 또한, 적절한 마우스는 레트로바이러스로 형질전환 및 기타 선택적인 전달 기술에 의해 제작될 수 있다. 예를 들어, TRE-MYC 마우스의 골수세포 또는 순수 분리된 B 세포는 rtTA와 함께 레트로바이러스 형질전환 되어 수여 동물에게 전달되거나 생체 외 배양될 수 있다. 또한 이로부터 나온 세포는 형질전환 또는 배양 전에 더 형질전환 될 수 있다 (예로, 해당 항원 (antigen of interest)으로).
본 발명의 또 다른 실시 양태에서, MYC을 과다 발현하는 세포를 가지는 동물은 생체 내로 (in vitro) 항원이 도입되어 (예로, 노출되어) 항원에 대한 면역 반응을 유발하게 된다. 예를 들어, 이 동물은 종래 기술에서 알려진 대로 외부 항원을 동물 내로 도입하는 기존의 방법에 의해 해당 항원에 노출될 수 있다.
또한, 다른 실시 양태에서는 MYC을 유도 발현하는 세포를 가지는 동물은 해당 항원을 발현하도록 종래 기술에 의해 조작되거나, 해당 항원을 발현하는 세포가 동물 내로 도입될 수 있다. 하기 실시예에서는 골수 조혈 줄기세포에 대한 레트로바이러스가 매개하는 형질전환, 형질전환 동물의 제조 (MYC 을 과다 발현하는 동물을 항원을 발현하는 기존 형질전환 동물과의 교배 또는 동물 내로 유전자의 전달) 및 기타 방법들을 기술하고 있다. 또 다른 실시 양태에서는, 상기 동물은 항체를 생산하기 전까지는 MYC 이 과다 발현되지 않는 조건 하에서 유지된다. 이 때 해당 항원에 대한 특이 항체를 생산하는 B 세포를 생산하기 위해 동물을 MYC 을 과다 발현하는 조건 하에서 유지시킬 수 있다. 본 발명자들은 항원에 특이한 B 세포는 MYC 이 과다 발현되지 않더라도 항원에 대해 내성을 가진다고 믿는다. 일단 MYC의 과다 발현이 유도되면 B 세포는 이 신생-자가 항원에 대한 내성을 파괴하고 항원에 대한 특이 항체를 생산한다.
정상 AN-1 세포 집단에서 나온 세포주들 (B 세포의 발달 중에 T3 로도 알려져 있는 집단으로서, 골수에서 결합하는 자가 항원에 민감하지 않은 B 세포라고 생각된다.)은 다양한 방법으로 제조될 수 있고 상기 방법들 중 일부는 하기에 기술된다. 상기 AN-1 세포 집단은 임신된 이후 독시사이클린 조건에서 유지된 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스로부터 나오는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 따르면, 이들 마우스도 해당 특이 항원을 발현해야 한다. 상기에서 기술한 바와 같이, 이것은 골수 조혈 줄기세포의 레트로바이러스가 매개하는 형질전환, 표준 형질전환 방법 또는 마우스에서 유전자를 전달하는 기타 방법으로 통해 수행될 수 있다. 이들 세포는 야생형 마우스 또는 형질전환 유전자 중 하나를 가지는 마우스뿐만 아니라 약 6주 된 마우스의 비장으로부터 분리될 수 있다. 이 세포는 적절한 임파구 배지 (RPMI 1640, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum), 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin), L-글루타민, HEPES, 비-필수 아미노산 (non-essential amino acids), 소듐 피루베이트 (sodium pyruvate) 및 2-β-머캅토에탄올)를 사용하여 독시사이클린 (50 nM)이 있거나 없는 조건에서 배양될 수 있다. 세포는 약 2 x 106 세포/ml 농도로 24-웰 플레이트 상에 뿌려진다. 상기 실험 과정은 당업자에 의해 쉽게 최적화되거나 변형될 수 있다. 상기 배지는 보통 한 주에 한 번 교환해준다. 상기 방법은 세포의 종류와 상태에 따라 (종양 또는 정상세포, 기관 등) 10 내지 70% 의 효율로 세포주를 제공할 수 있다. 이들 세포는 육안으로 클론의 성장이 관찰될 수 있다. 약 14 내지 28일에 증식하기 시작하는 클론은 천천히 6-웰 플레이트에 옮기고 마지막에는 조직 배양 플라스크에서 배양한다. 종래 기술에 기술된 바와 같이, 모든 다중클론 세포주는 분석하기 전에 희석법을 실시하여 단일 세포 클론으로 만든다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서는, 해당 항체를 생산할 수 있는 B 세포주의 형질전환은 생체 내 (in vivo)에서 이루어질 수 있다. 하기 실시예에서는 임신된 이후 독시사이클린을 포함하는 식사로 유지된 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스 (cDNA 를 인코딩 하는 플라스미드로부터 해당 항원을 발현하는)를 6주가 경과한 후 정상의 식사로 바꾸어 키운다. 상기 마우스는 B 세포 림프절 종양의 생성과 연관 있는 임상적 증상 (초라한 털, 외관상 명백한 림프절 질환, 탈수, 느린 행동, 뒷다리 마비-상승 등과 같은)에 대해 매일 관찰될 수 있다. 또한, 이 마우스는 정기적으로 채혈하여 해당 항원에 대한 반응성을 조사해둔다. 일단 마우스에 종양이 생기면, 림프절, 비장, 골수 및 혈청이 채취된다. 이로부터 얻은 세포 현탁액은 유동세포 측정 (FACS) 분석에 사용될 수 있고 상기에서 기술한 바와 같이 세포는 세포주를 만들기 위해 배양된다. 남은 세포는 살아있는 일차 종양 조직을 계속 유지할 수 있도록 10% DMSO 를 처리하여 냉동 보관된다. 상기 혈청은 해당 항원을 발현하는 세포를 염색하고 특이 항원에 대항한 웨스턴 블럿 및 ELISA 분석을 실시하는 데 사용된다. 대조군 마우스로는 보통 야생형 마우스 및 단일 형질전환 (singly transgenic) 마우스를 사용한다.
본 발명의 또 다른 실시 양태에서, 상기 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스 (상기와 같이 임신된 이후 독시사이클린을 포함하는 식사로 유지된)에서 얻은 순수 분리된 B 세포가 생체 외에서 형질전환 되어 선택된 항원을 발현하게 한다. 이 때 상기 형질전환 된 세포는 독시사이클린 조건에서 유지되지 않은 수여자 (recipient) 마우스 (야생형 마우스) 내로 선택적으로 전달 (adoptively transferred)될 수 있다. 이 과정은 전달된 B 세포에서 MYC 이 과다 발현되게 유도한다. 이 때 상기 마우스에서 상기에 기술한 바와 같이 B 세포 림프절 종양 및 세포주들의 생성과 관련되어 있는 임상 증상에 대해 매일 관찰한다.
또 다른 단일클론 항체를 생산하는 세포를 제조하는 방법에서는, 세포의 생존과 증식을 증진시키는 (바람직하게는 조절될 수 있는 (유도되거나 조정되는)) 원암유전자의 선택된 조합 및 세포사멸을 억제하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 발현하는 마우스에서 나온 골수 레트로바이러스 조합 (retroviral chimera)를 사용한다. 대표적인 조합으로는 MYC-ER 및 Bcl-2 등을 들 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 이 방법에는 4-하이드록시타목시펜 (4OHT)를 첨가하여 발현된 MYC을 활성화시키는 것이 포함된다. 본 발명자들은 장기 조혈 줄기세포의 조건적 불멸화 (conditional immortalization)와 관련된 실험에서 MYC 기능을 조절하기 위해 이러한 구성을 성공적으로 사용하였다. 이 경우에 골수 조합 마우스 집단이 하기 기술한 바와 같이 5FU가 많은 골수에서 유래한 줄기세포를 사용하여 제조될 수 있다. 구체적으로, 골수에서 유래한 조혈 줄기세포를 얻기 위해, 마우스 당 5 mg의 5-플루오르우라실 (5FU)이 정맥 내 투여되어 장기 (long-term) HSCs 가 많아지게 하고 생체 내 증식이 유발되게 한다. 골수세포는 5일 후에 대퇴골 및 경골에서 채취된다. 적혈구는 저장성 용출 완충용액을 사용하여 용출된다. 남은 세포는 배지로 2번 세척하여 24-웰 플레이트 상에 열을 가해 불활성화시킨 15% 우태아 혈청, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 비-필수 아미노산, 재조합 인간 IL-3, IL-6 및 줄기세포인자 (stem cell factor, SCF)를 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 2 x 106 세포/ml 농도로 배양한다. 상기에서 기술한 바와 같이, 골수세포는 생체 외에서 형질전환 되어 선택된 항원을 발현할 수 있다. 이 세포는 첫 번째 스핀 감염 전에 24시간 동안 배양되고 매 24시간 마다 3번 이 과정을 반복 실시한다. 마지막 스핀 감염 후 1일째에 이 세포는 유동 세포측정법으로 분석된다. 구체적으로, 렌티바이러스로 형질전환된 골수에서 유래한 HSCs가 letHA1ly 조사된 마우스를 재구성하는 데 사용될 수 있다. 리포터 유전자 GFP 를 12주 후에 림프 기관에서 발현시켜 세포를 추적하는 데 사용할 수 있다. 이 경우에 마우스는 정상 말단 림프 부분을 형성한다 (골수 이식 후 8 내지 12주). 이 때 비장의 GFP+AN-1/T3 세포가 이 마우스로부터 분리되어 상기에서 기술한 바와 같이 생체 외 불멸화 프로토콜에 사용될 수 있다. 중요한 차이점은 이 시스템에서는 독시사이클린을 제거하는 대신에 4OHT 가 배지에 첨가된다. 또한, 이 선발된 GFP+AN-1/T3 세포는 선택적으로 1주에 한 번씩 4OHT가 마우스당 1mg씩 정맥 내로 투여된 야생형 수여 마우스 내로 전달될 수 있다. 이 마우스로는 B 세포 림프 종양 또는 백혈병의 발생과 관련이 있는 임상 증상을 매일 관찰한다. 이로부터 얻은 종양은 수집되어 상기에서 기술된 바와 같이 MYC의 기능을 조절하는 독시사이클린 대신에 4OHT 를 사용하여 B 세포주를 생산하는 데 사용된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기에서 기술한 바와 같이 조건적으로 불멸화된 골수에서 유래한 줄기 세포주가 5FU 가 풍부한 골수에서 유래한 줄기세포를 대신하여 사용될 수 있다. 또 다른 양태에서는 세포의 생존과 증식을 증진시키는 (바람직하게는 조절될 수 있는 (유도되거나 조정되는)) 원암유전자의 상기 조합, 대표적인 조합에는 MYC-ER 및 Bcl-2, 그리고 세포사멸을 억제하는 단백질을 인코딩하는 핵산 분자를 발현하는 세포주가 사용될 수 있다. 조건적으로 불멸화된 골수에서 유래한 줄기 세포주와 그의 제조방법에 관해서는 상세한 설명과 실시예가 국제 출원 제 WO 2007/047583호에 기재되어 있다. 참고적으로 그 내용을 여기서 기술한다. 특허출원 제 WO 2007/047583호에서는 본 발명에서도 사용될 수 있는 원암유전자, 항-세포사멸 유전자 및 그들 유도체의 추가적인 조합을 상세히 기술하고 있다. 또 다른 양태에서, 상기 세포주들은 생체 외에서 형질전환 되어 선택된 항원을 발현할 수 있다.
항체를 생산하는 세포뿐만 아니라 해당 항원에 대한 특이 다중클론 항체 집단은 조직 (비장, 림프절 등) 또는 동물의 혈청으로부터 직접 분리될 수 있다. 또 다른 양태에서, 항체를 생산하는 세포의 단일클론 집단은 종래의 표준 방법에 의해 분리될 수 있고 단일클론 항체는 배양 배지로부터 회수될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 인간 항체를 생산하는 세포주를 생산하는 데 사용될 수 있다. 이러한 양태를 달성하는 2가지 대표적인 기술은: (1) 인간 면역글로불린 유전자좌 (IgH 및 IgL)를 인코딩 하는 형질전환 BAC 제작물을 Eμ-MYC 마우스 또는 MMTV-tTA/TRE-MYC 형질전환 마우스 둘 중 하나 내로 전달하는 마우스 주의 교차 (교배)에 의해, 그리고 (2) MYC-ER (또는 기타 적절한 유도성 원암유전자)의 cDNA 로 이루어진 레트로바이러스 골수 조합을 사용하는 것이다. 상기 후자의 방법에서는 해당 항원이 신생-자가 항원으로서 레트로바이러스 인코딩 되는 cDNA로부터, 전통적인 외부 유전자로부터 또는 유전자 및 단백질의 운반 수단에 의해 발현된다. 상기에서 기술한 바와 비교하여 중요한 차이점은 이러한 경우에서 생산되는 항체가 인간 단백질이라는 것이다.
인간 항체를 생산하는 세포주를 생산하는 두 번째 방법은 어떤 해당 단백질에 대한 혈청 항체 역가를 가지는 인간으로부터 얻은 말단 혈액 B 세포를 분리하는 것이 기초가 된다. 상기 B 세포는 종래의 표준 과정으로 순수 분리된다. 순수 분리된 B 세포는 해당 단백질로 코팅된 플라스틱 플레이트 상에 뿌려진다. 또한 이 해당 단백질은 해당 특이성을 가진 B 세포를 분리하는 데 사용될 수 있는 자성 비드와 결합될 수도 있다. 이 때 상기 세포들은 단일 세포 RT-PCR 을 수행하기 위해 테라사키 플레이트 (Terasaki plate) 내에 단일 세포로 분리된다. 분리된 각각의 B 세포에서 IgH 및 IgL 유전자를 가지는 VDJ 조합 부위 (joint region)에 대한 cDNAs 가 제조된다. 이 cDNAs 단편들은 인간 IgH 및/또는 IgL을 인코딩 하는 데, 정상적으로 자신의 VDJ 서열을 가지는 위치에 다중 클로닝 부위를 포함하도록 제작된 레트로바이러스 벡터 (IgH 및 IgL, 또는 LTR-IgH-IRES-IgL-LTR 을 인코딩 하는 레트로바이러스 벡터) 내로 클로닝 된다. 이로부터 얻은 레트로바이러스 벡터는 서열 분석되고 (sequenced) MYC을 과다 발현하고 B 세포의 생산을 막는 유전적 변형을 포함하는 마우스로부터 유래한 5FU가 풍부한 골수에서 유래한 HSCs를 형질전환하는 데 사용된다. 하기 실시예에서는 MMTV-rtTA/TRE-MYC/Rag-1-/- 마우스, Eμ-MYC/Rag-1-/-마우스 또는 IgH/IgL 레트로바이러스 및 MYC-ER 레트로바이러스로 공감염된 골수 Rag-1-/- 를 기술한다. 또 다른 실시예에서는 상기에서 기술한 Rag-2-/-, SCID, DNA-PK-/-, Ku70-/-, Ku80-/-, XRCC4-/-, μMT-/- 와 같은 유전자좌가 제거된 마우스들과 교차 교배되고 MYC 을 과다 발현하는 마우스를 기술하고 있다. 이들 세포는 상기에서 기술한 프로토콜 (레트로바이러스 골수 조합 마우스)을 사용하여 letHA1ly가 조사된 마우스를 제작하는 데 사용될 수 있다. 특정 항원을 인코딩하는 핵산을 마우스로 형질전환하는 수단은 어느 것이라도 사용될 수 있다 (유전자 총 (gene gun), DNA 그대로 면역화 (naked DNA immunization), 형질전환 마우스, 렌티바이러스 "형질전환" 마우스, 재조합 단백질의 직접적인 주입, 유전자의 cDNA 를 인코딩하는 백시니아 바이러스 (vaccinia virus), 재조합 아데노바이러스, 재조합 효모 또는 포유동물 세포, tat-융합 단백질 등).
상기 방법으로 얻은 세포주는 해당 단백질에 대한 특이 인간 면역글로불린 서열을 인코딩 한다. 이것은 바이러스 감염, 종양, 세균 및 곰팡이 등을 포함한 다양한 병원균 및 질환에 대항하여 억제 작용을 가지는 항체 혼합물을 생산하는 새롭고도 강력한 방법이다. 또한, 본 발명은 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스를 사용하여 획득한 항체 특이성을 인간화하는 방법을 포함한다. 이 경우에, 마우스 IgH 에서 유래한 재배열한 VDJ 조합 서열 및 IgL 유전자좌에서의 VJ 부위는 PCR 로 증폭된다. 이 서열들은 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스에서 발달하여 이미 해당 항원에 대한 항체를 생산하는 것으로 확인된 클론 세포주로부터 얻을 수 있다. 상기 PCR 로 증폭된 단편들은 이들이 클로닝 될 수 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 인간 IgH 및 IgL 서열을 인코딩 하는 레트로바이러스 플라스미드 내로 삽입될 수 있다 (도 9 참조). 상기 IgH 및 IgL 서열은 IRES 요소 (IRES element)에 의해 나뉘어져 있어 이 둘 cDNAs 는 동일한 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있다. 서로 다른 바이러스 벡터를 사용하면 주어진 특이성을 가지는 이소타입 (isotype)이 서로 다른 항체를 생산할 수 있다 (IgA, IgG, IgM, IgE 및 기타 서브그룹). 또한 Fc 부위를 인코딩하는 서열은 이로부터 얻은 항체가 자가 면역 반응 및 이와 관련된 면역 복합체 침착의 문제를 촉발하지 않도록 변형될 수 있다. 여기서 얻은 레트로바이러스 벡터는 Rag-1-/- /MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스로부터 얻은 조혈 줄기세포에서 유래한 골수를 형질전환하는 데 사용될 수 있다. 상기 형질전환된 세포는 letHA1ly 로 조사된 C57/BL6 야생형 마우스 집단에 이식될 수 있다. 이로부터 얻은 마우스는 하나의 항원에 대한 단일 특이성을 가지며 또한 인간화된 항체의 부가적인 특성도 가지는 단일클론 항체를 생산하는 세포를 생산하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 해당 항원에 대한 인간 단일클론 항체는 하기의 방법에 따라 생산될 수 있다. 해당 세포주에서 발견되는 IgH 및 IgL 로부터 나온 특이적 VJD 조합 서열을 증폭시키는 대신에, 호지킨 림프 종양 (버킷 림프종, 여포와 유사한 림프종, 확산된 대형 B 세포 림프종, MGUS 및 다발성 마이엘로마)뿐만 아니라 건강한 공여자 또는 항체가 매개하는 자가면역 질환으로 고생하는 환자 (예로, 조그렌 증후군 (Sjogren syndrome), 하시모토 갑상선염 (Hashimoto thyroditis), 루프스 질환 (Systemic Lupus Erythematosus), 왈든스트롬 마크로글로불린혈증 (Waldenstrom macroglobulinemia) 등)로부터 얻은 B 세포에서 발견되는 IgH 및 IgL 서열을 재배열한 VDJ 서열을 PCR 로 증폭시킨 단편을 분리할 수 있다. 상기 PCR 단편은 상기에서 기술한 바와 같이 레트로바이러스 벡터 내로 클로닝 되어 제작된다 (또한, 유전자 라이브러리의 제조를 용이하게 하도록 2개의 서로 다른 레트로바이러스 벡터가 제조될 수 있다.). 상기 레트로바이러스 라이브러리는 상기에서 기술한 바와 같이 골수 조합 마우스를 제조하기 위하여 Rag-1-/-/MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스로부터 얻은 골수에서 유래한 조혈 줄기세포 (HSCs)를 형질전환 하는 데 사용될 수 있다. 상기 골수 조합 마우스만이 인간 면역글로불린들을 발현하는 B 세포를 만드는 데, 이는 면역화가 준비되기 전까지 독시사이클린을 포함하는 식사로 유지시킨다 (MYC 의 과다 발현을 억제하기 위하여). 이들 마우스는 (B 세포에서 MYC의 과다 발현을 성취하기 위해) 독시사이클린이 없이도 면역화될 수 있다. 반응성이 있는 항원 특이 B 세포는 분리되어 생체 외에서 특이 항원에 대해 반응하면서 그 양이 증가한다. 상기 세포는 불멸화 되고 인간 항체를 만드는 단일클론 세포주를 만들기 위해 MYC이 과다 발현되는 조건 하에서 배양될 수 있다.
상기에서 기술한 바와 같이, 이 방법은 특이 항원에 대한 인간 IgA 항체와 같이 서로 다른 이소타입을 가지는 인간 항체를 특이적으로 분리하는 데 사용될 수 있다. IgA 항체는 질환의 예방을 위해 면역화 이후에 매우 증가한다. 종래 항원의 제조방법에서는 IgA 생산을 유도하는 동물 면역화 방법이 잘 밝혀져 있지 않다. 본 발명은 이 문제점을 해결하고 있다. 더구나 여기서 정의한 특이성은 상기에서 기술한 바와 같이 또 다른 Fc 기본틀 (backbone)에 손쉽게 적용될 수 있다.
이로부터 얻은 세포주가 많은 양의 항체들을 최적의 조건에서 생산할 수 있는 것은 아니다. 이러한 문제는 IgH 및 IgL 을 인코딩하는 cDNAs 를 PCR 로 증폭시켜 극복할 수 있다. 상기 cDNAs 를 발현 벡터에 클로닝하고 마이엘로마 세포주 (또는 기타 B 세포 림프종 세포주)를 형질전환 하여 항체 생산을 증가시키다.
세 번째 방법은 인간 ctlt-HSC 세포주를 해당 항원으로 레트로바이러스 벡터에 형질전환시키고 이 형질전환된 ctlt-HSC 세포주를 subletHA1ly 로 조사된 NOD/SCID 마우스에 이식하는 것이다. 상기 마우스에는 4OHT를 주사하고 이로부터 나온 백혈병/림프종은 인간 단일클론 항체를 생산하는 세포주를 생산하기 위해 배양될 수 있다. 장점은 전체 단일클론 항체가 인간 유전자로부터 인코딩 되어 생체 내에서 성숙한 형태라는 것이다.
네 번째 방법은 subletHA1ly 로 조사되고 인간 ctlt-HSC 세포주를 이용하여 재구성된 NOD/SCID 마우스에서 유래한 비장으로부터 성숙한 인간 B 세포를 분리하는 것이다. MYC이 과다 발현되지 않는 조건에서 발달한 성숙한 B 세포는 상기 해당 항원과 함께 레트로바이러스 형질전환 될 수 있다. 이 세포는 다시 subletHA1ly 로 조사되고 NOD/SCID 마우스 내로 이식되거나 마우스에 4OHT 를 투여하여 생체 내 형질전환 시키거나 4OHT 를 가하여 생체 외 배양을 유지시킬 수 있다. 이것은 해당 항원의 핵산 서열만으로 시작하여 2 내지 3주 후에 새로운 인간 단일클론 항체를 발달시키는 것을 가능케 한다.
MYC 은 자가 항원에 대한 B 세포 내성을 파괴하는 능력이 있어 면역 우세한 T 세포 에피토프와는 상관 없이 다양한 특이성을 가지는 항체들을 발달시킬 수 있다. MYC 이 B 세포 내성을 파괴하는 기작은 자가 반응성 B 세포를 T 세포 헬프와는 독립적으로 반응하게 하고 또한 이들이 단백질 서열의 특정 부분과만 반응해야 하는 제한을 풀어줄 수 있다. 이 방법은 정상적으로 면역 시스템에 의해 인지되지 않으면서 자가 단백질과 유사하게 행동하는 바이러스가 인코딩하는 에피토프의 정체를 밝혀줄 수 있다. 상기 내성 기작은 전형적으로 이들 잔기에 대한 제대로 된 반응을 막는다. 따라서 본 발명은 이 공통의 영역 (domain)을 바람직한 백신 후보로 삼을 수 있는 새로운 방법을 제공한다.
여기서 기술한 기술은 새로이 출현하는 감염성 질환 그리고 암과 자가면역과 같은 만성 질환을 찾아내고 치료하는 진단용 항체 및 치료용 항체를 신속히 개발하는 새로운 전략을 제시한다. 본 발명의 방법은 기존 항체의 제조 방법과 비교하여 속도와 효율 측면에서 우수하기 때문에, 이 항체는 새로운 감염원이 나타나면 즉시 생산될 수 있다. 예를 들어, 갑작스런 질병 (유행성 독감 등)을 일으키는 바이러스에 대한 특이 항체는 현재 사용되는 방법보다 훨씬 더 짧은 시간 내에 치료제로서 개발될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 제조되는 항체에는 항체와 결합하는 단편 및 항체의 유도체뿐만 아니라 모든 타입 및 클래스의 항체들이 포함될 수 있다. 보다 상세하게는 본 발명의 방법으로 생산된 항체에는 상기 항체를 포함하는 혈청 또는 다양한 정도로 순수 분리된 항체가 포함될 수 있다. 본 발명의 전체 항체는 다중클론 또는 단일클론일 수 있다. 또한 단일 사슬 항체와 같이 유전적 조작이 된 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 인간 항체, 인간화된 항체 (상기에서 언급함), 하나 이상의 에피토프와 반응할 수 있는 항체 (이중 특이 항체) 또는 하나 이상의 서로 다른 항원과 반응하는 항체 (이중 또는 다중 특이 항체)뿐만 아니라 하나 이상의 항체 도메인이 잘리거나 없는 항원 결합 단편들 (Fv, Fab, Fab' 또는 F(ab)2 단편들)과 같이 전체 항체의 기능적 동등물도 역시 본 발명의 방법으로 제조될 수 있다.
넓은 범위의 항원들과 선택적으로 결합할 수 있는 항체들 모두는 본 발명의 방법으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 동물에게 도입되어 면역 반응을 유도할 수 있는 어떠한 항원이라도 본 발명에서 사용될 수 있다. 또한, 자가 항원과 같이 정상 동물에서 보통은 자가 내성 기작을 나타내는 항원도 역시 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항원에는 바이러스 항원, 곰팡이 항원, 박테리아 항원, 장내 기생충 항원 (helminth antigen), 기생충 항원, 외부 기생충 항원, 원충 항원 또는 기타 감염원으로부터 온 항원을 포함하는 병원균과 관련된 어떠한 항원이라도 한정되지 않고 포함될 수 있다. 또한, 항원에는 암 (종양) 항원, 자가 면역 질환과 관련된 항원 (당뇨병 항원), 알러지 항원 (알러젠), 하나 이상의 돌연변이 된 아미노산을 포함하는 포유동물 세포 분자, 포유동물 세포로부터 미리 또는 신생적으로 발현되는 단백질, 감염원 (바이러스)의 삽입으로 발현 유도되는 단백질, 유전자 전좌 (gene translocation)에 의해 발현 유도되는 단백질 및 조절 서열의 돌연변이에 의해 발현 유도되는 단백질을 포함하여 병원성 또는 세포성 출처로부터 온 것인지 상관없이 특정 질환 또는 조건과 관련이 있는 어떠한 항원이라도 한정되지 않고 포함될 수 있다. 상기 항원들은 자연 그대로의 항원 또는 몇 가지가 변형된 유전적으로 조작된 항원 (서열 변화 또는 융합 단백질의 제조)들일 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 항원은 아데노바이러스 (adenovirus), 아레나 바이러스 (arena virus), 부냐바이러스 (bunyavirus), 코로나바이러스 (coronavirus), 콕사키 바이러스 (coxsackie virus), 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus), 엡스타인 바 바이러스 (Epstein-Barr virus), 플라비바이러스 (flavivirus). 헤파드나바이러스 (hepadnavirus), 간염 바이러스 (hepatitis virus), 허피스 바이러스 (herpes virus), 인플루엔자 바이러스 (influenza virus), 렌티바이러스 (lentivirus), 홍역 바이러스 (measles virus), 멈프스 바이러스 (mumps virus), 믹소바이러스 (myxovirus), 발암 바이러스 (oncogenic virus), 오소믹소바이러스 (orthomyxovirus), 파필로마 바이러스 (papilloma virus), 파포바바이러스 (papovavirus), 파라인플루엔자 바이러스 (parainfluenza virus), 파라믹소바이러스 (paramyxovirus), 파보바이러스 (parvovirus), 피코나바이러스 (picornavirus), 천연두 바이러스 (pox virus), 광견병 바이러스 (rabies virus), 호흡 합포체 바이러스 (respiratory syncytial virus), 레오바이러스 (reovirus), 랩도바이러스 (rhabdovirus), 루벨라 바이러스 (rubella virus), 토가바이러스 (togavirus) 및 바리셀라 바이러스 (varicella virus)를 포함한 바이러스로부터 나오지만 이에 한정된 것은 아니다. 다른 바이러스로는 인간 T 세포 임파구 친화 바이러스 (HTLV1 및 HTLV-II 와 같은 HTLVs)와 같은 T 임파구 친화 바이러스, 소 백혈병 바이러스 (BLVS), 및 고양이 백혈병 바이러스 (FLVs) 를 들 수 있다. 렌티바이러스에는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1 및 HIV-2 를 포함하는 HIV), 원숭이 (FIV), 고양이 (FIV) 및 개 (CIV) 면역 결핍 바이러스가 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 새로운 방법으로 단일클론 항체를 생산하는 것은 HIV 변형체 (variant)의 전체 그룹을 중화시킬 수 있는 새로운 특이성을 개발하게 할 수 있다. 구체적으로, 이 방법은 바이러스의 외피 단백질의 필수 구성성분을 추적하거나 숙주의 공동-수용체 (co-receptor) 단백질을 추적 (targeting)하여 달성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 한 양태에서 이 방법은 헤마글루티닌 (HA) 단백질 또는 뉴라미니다제 (NA) 단백질와 같은 인플루엔자 바이러스 단백질에 특이적인 항체를 생산하는 데 사용될 수 있다. 상기 HA 단백질은 Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 및 H16로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 HA 단백질은 H5 인 것이 바람직하다. 또한 상기 NA 단백질은 Nl, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 및 N9로부터 선택될 수 있고 상기 N5 인 것이 바람직하다. 또 다른 양태에서 상기 항체는 HA 단백질의 서브유닛에 대한 특이성을 가지는 것이 바람직하다.
상기 항원은 아스퍼질러스 (Aspergillus), 보르드텔라 (Bordetella), 브루기아 (Brugia), 칸디다 (Candida), 클라미디아 (Ch1amydia), 콕시디아 (Coccidia), 크립토코커스 (Cryptococcus), 디로필라리아 (Dirofilaria), 대장균 (Escherichia), 프란시셀라 (Francisella), 고노코커스 (Gonococcus), 히스토플라스마 (Histoplasma), 리슈마니아 (Leishmania), 마이코박테리움 (Mycobacterium), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 파라메시움 (Paramecium), 퍼튜시스 (Pertussis), 플라스모듐 (Plasmodium), 뉴모코커스 (Pneumococcus), 뉴모시스티스 (Pneumocystis), 리케차 (Rickettsia), 살모넬라 (Salmonella), 쉬겔라 (Shigella), 스태필로코커스 (Staphylococcus), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 톡소플라스마 (Toxoplasma), 비브리오콜레라 (Vibriocholerae) 및 예르시니아 (Yersinia)로부터 선택될 수 있다. 또한 상기 감염원은 플라스모둠 팔시파룸 (Plasmodium falciparum) 또는 플라스모둠 비박스 (Plasmodium vivax)로부터 선택될 수 있다.
또한 상기 항원은 박테리움으로부터 선택될 수 있고, 상기 박테리움은 엔테로박테리아 (Enterobacteriaceae), 마이크로코커스 (Micrococcaceae), 비브리오나 (Vibrionaceae), 파스퇴렐라 (Pasteurellaceae), 마이코플라즈마 (Mycoplasmataceae) 및 리케차 (Rickettsiaceae) 패밀리로부터 선택될 수 있다. 상기 박테리아는 슈도모나스 (Pseudomonas), 보르드텔라 (Bordetella), 마이코박테리움 (Mycobacterium), 비브리오 (Vibrio), 바실러스 (Bacillus), 살모넬라 (Salmonella), 프란시셀라 (Francisella), 스태필로코커스 (Staphylococcus), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 에스케리키아 (Escherichia), 엔테로코커스 (Enterococcus), 파스테렐라 (Pasteurella) 및 예르시니아 (Yersinia) 속으로부터 선택될 수 있다. 상기 박테리아는 슈도모나스 에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 말레이 (Pseudomonas mallei), 슈도모나스 슈도말레이 (Pseudomonas pseudomallei), 보르드텔라 퍼튜시스 (Bordetella pertussis), 마이코박테리움 튜버큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 레프리 (Mycobacterium leprae), 프란시셀라 튜라엔시스 (Francisella tularensis), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 바실러스 앤스라시스 (Bacillus anthracis), 살모넬라 엔테릭 (Salmonella enteric), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 대장균 (Escherichia coli) 및 보르드텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica)로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한 상기 항원에는 바이러스가 부착하는 세포 수용체가 포함된다 (예로 CD4 등).
본 발명에 따르면, "선택적으로 결합하는" 항체 또는 항원 결합하는 단편이 특정 단백질 또는 다른 항원을 선호하여 결합하는 능력을 말한다. 보다 상세하게는 "선택적으로 결합하는"는 한 가지 단백질이 다른 단백질에 특이적으로 결합하여, 결합 수준이 어느 표준 분석법으로 측정되어 대조군의 기본 수준 (background)보다 통계적으로 유의하게 더 높은 것을 말한다. 예를 들어 면역분석법을 실시할 때 대조군은 전형적으로 항체 또는 항원과 결합하는 단편만 (항원 없이)을 포함하는 반응 웰/튜브이고, 항원이 존재하지 않을 때 항체 또는 항원과 결합하는 단편의 반응 정도 (상기 웰에 대한 비-특이 반응)를 기본 수준 (background)이라고 간주한다. 상기 결합 정도는 종래 기술의 다양한 표준 방법을 사용하여 측정될 수 있다 (ELISA, 면역블럿 분석법 등).
본 발명에서 사용하기 적합한 항원에는 동일한 항원에서 나온 둘 이상의 면역원 부위 (immunogenic domain) 또는 에피토프 (epitope); 동일한 세포, 조직 또는 생물에서 나온 둘 이상의 항원, 면역원 부위 또는 에피토프; 및/또는 서로 다른 세포, 조직 또는 생물에서 나온 둘 이상의 서로 다른 항원, 면역원 부위 또는 에피토프가 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명은 한 번의 면역화로 다중 특이성을 가지는 단일클론 항체를 생산하는 방법을 제공할 수 있다. 구체적으로, 여기서 기술하는 마우스 (MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스)는 세균 또는 효모에서 재조합 단백질로 생산되고 GST-융합 단백질로 만들어지는 항원들과 같이 둘 이상의 면역원 부위, 에피토프 또는 다른 항원을 사용하여 표준 면역화 기술을 통해 면역화될 수 있다. 이 때 면역화된 마우스에서 나온 B 세포는 순수 분리된 단백질 항원이 코팅된 플레이트 상에서 뿌려서 분리될 수 있다. 상기 분리된 항원 특이 B 세포는 MYC의 과다 발현을 활성화시키고 해당 항원의 존재 하에서 B 세포를 생체 외 형질전환하기 위해 항생제 (독시사이클린) 없이 배양될 수 있다. 이로부터 얻은 세포주는 항체 생산 및 특이성을 조사하여 검색될 수 있다. 이 방법은 200개 정도의 항원에 대해 특이 단일클론 항체들을 한 번에 신속하게 생산할 수 있게 한다. 또한, 많은 단백질에 대한 단일클론 항체들을 풍부하게 제공할 수 있어 단백질학 (proteomics) 분야에서 어려운 문제들을 해결할 수 있다.
상기에서 기술한 방법은 항원 또는 다중 항원의 많은 또는 모든 에피토프를 인식하는 중화하는 항체 조성물 (composition)들을 생산하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 마우스는 한 가지 바이러스의 몇 가지 항원들로 또는 몇 가지 관련된 바이러스 주들에서 나온 특정 항원의 다양한 변이체들 (variants)로 면역화될 수 있다. 상기에서 분리된 항원 특이 B 세포는 항원의 특정 에피토프에 대한 특이성을 가지는 항체를 생산하는 세포로 배양될 수 있다. 이 세포는 바이러스의 대부분 또는 모든 에피토프 또는 바이러스 주에서 나온 특이 항원의 모든 변이체들에 결합하는 항체 조성물을 생산하는 데 사용될 수 있다. 또한 이 항체들은 유사한 에피토프들과 교차 반응시키지 않고도 하나의 특정 항원 또는 에피토프에 결합시키는 유사한 방법들에 의해 선택될 수 있다.
본 발명에 의해 생산된 예방 또는 치료제로 유용한 항체들은 보통 조성물 (formulation)의 형태로 제공된다. 본 발명의 양태에서, 약학적 조성물은 항체 또는 그의 항원과 결합하는 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 유효량 포함한다, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 당업자에게 널리 잘 알려져 있다. 본 발명에서 "약학적으로 허용 가능한 담체"에는 약학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 약학적으로 허용 가능한 전달 운반체를 포함하고, 이들은 상기 조성물을 적합한 생체 내 부위에 투여하는 데 사용될 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 항체가 환자의 목적 부위에 도달해서 항체가 작용할 수 있는, 더 나아가 환자에게 치료적으로 유익을 줄 수 있는 형태로 조성물에 사용되는 항체들을 보존시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 제조된 하나 이상의 항체 또는 그의 유도체들을 사용하여 사람을 치료하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 병원균에 의한 감염 (코로나 바이러스 감염) 또는 이로 인한 질병과 같은 조건 또는 질병을 일으킬 위험을 가진 동물을 치료하는 방법 (조건 또는 질병의 예방 및/또는 치료적 처치를 포함)을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 동물에서 질병으로부터 기인한 적어도 하나의 증상을 예방하거나 감소시키는 것 같이 질병 또는 조건을 감소시키거나 예방하기 위하여 질병 또는 조건을 일으킬 위험이 있는 동물에게 여기서 기술한 바와 같이 본 발명에서 생산한 하나 이상의 항체 또는 그의 기능적 유도체들을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에서는 마우스를 사용한 실시예들을 기재하고 있지만, 종래기술에서 항체 생산에 사용되는 것으로 알려진 실험 동물이라면 모두 사용될 수 있는 것은 당업자에게 당연하다. 본 발명의 방법에는 항체 생산에 적합한 생물이라면 세포 또는 조직을 포함하여 모두가 사용될 수 있다. 상기 동물에는 영장류, 설치류, 가축 및 애완 동물과 같이 포유동물에 한정되지 않고 척추동물 강의 모든 동물을 포함하는 것이 바람직하다. 일반적으로 항체 생산에 있어서 적합한 실험 동물로 토끼, 양, 햄스터, 기니아 피그, 마우스, 래트 또는 닭을 사용하여 원하는 항체들이 만들어질 수 있는 항원들에 노출시키는 것이 바람직하지만 이에 한정되지는 않는다. 이 동물은 "인간화된" 동물인 것이 바람직하고, 그 예로는 인간 항체 및 인간 단일클론 항체를 생산하는 세포주를 생산하는 인간 ctlt-HSC 세포주로 재구성된 NOD/SCID 마우스를 들 수 있다.
용어 정의
달리 언급하지 않는 한 본 발명에서는 분자생물학 (재조합 기술), 미생물학, 세포생물학, 생화학, 핵산 화학 및 면역학의 종래기술을 적용하고 있으며, 이들은 이미 당업자에게는 널리 알려진 것이다. 이러한 기술들은 분자 클로닝 II (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition; Sambrook et al, 1989) 및 분자 클로닝 III (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, third edition; Sambrook and Russel, 2001) (하기에서 공통으로 "샘브룩"이라고 약칭함), 분자생물학의 최신 프로토콜 (Current Protocols in Molecular Biology; F.M. Ausubel et al., eds., 1987, including supplements through 2001); PCR: 폴리머라제 연쇄반응 (PCR: The Polymerase Chain Reaction; Mullis et al., eds., 1994); 할로우 및 레인 (1988) 항체 (Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York); 할로우 및 레인 항체의 사용 (Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) (하기에서 공통으로 "할로우 및 레인"이라고 약칭함); 핵산 화학의 최신 프로토콜 (Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry John Wiley & Sons, Inc., New York, 2000); 및 백신 (Vaccines, S. Plotkin and W. Orenstein, eds., 3rd edition (1999))과 같은 서적에 잘 설명되어 있다.
본 발명에 따르면, 일반적으로 "항원"이라는 용어는 자연에서 발견되거나 합성되어 나온 것을 포함하여 단백질의 일부분 (펩티드, 부분 단백질, 전체 단백질), 세포 조성물 (전체 세포, 세포 용출액 또는 파쇄된 세포), 생물 (생물 전체, 용출액 또는 파쇄된 세포) 또는 탄수화물 (암 세포에서 발현된 것) 또는 기타 분자 또는 그의 일부분 모두를 포함하여 일컫는다. 항원은 이 항원이 투여된 개체의 세포 및 조직 내에서 만나는 동일한 또는 유사한 항원에 대항하여 항원 특이적인 면역 반응 (체액 및/또는 세포가 매개하는 면역 반응)을 이끌어낸다. 또한, 항원은 내성원 (toleragen)로도 작용을 할 수 있다. 면역 반응의 촉발을 언급할 때, "항원"이라는 용어는 "면역원 (immunogen)"이라는 용어와 상호 교환하여 사용될 수 있다. 항원은 단일 에피토프 만큼이나 작거나 더 클 수도 있으며 다중 에피토프도 포함한다. 마찬가지로 항원의 크기는 5 내지 12개의 아미노산 정도로 작을 수도 있고 (펩티드), 다중머 (multimer) 및 융합 단백질, 조합된 단백질, 전체 세포, 전체 생물 또는 그들의 일부분을 포함하는 전체 길이 단백질 정도로 커질 수도 있다. 또한 항원에는 탄수화물이 포함될 수 있다.
주어진 항원의 "면역원 영역 (immunogenic domain)"은 동물에게 투여될 때 면역원으로 작용하는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 항원의 일부분, 단편 또는 에피토프 (펩티드 단편 또는 서브유닛 또는 항체 에피토프 또는 기타 형상적 에피토프)가 될 수 있다. 구체적으로, 단일 단백질은 서로 다른 다중 면역원 영역을 포함할 수 있다. 면역원 영역은 단백질 내에서 채액성 면역 반응에서와 같이 반드시 직선의 서열일 필요가 없다.
에피토프는 여기서 면역 반응을 유발하는 주어진 항원 내의 단일 면역원 부위 또는 면역 반응을 억제하거나 삭제하거나 불활성화시키는 주어진 항원 내의 단일 내성원 부위로 정의된다. 당업자에게 T 세포 에피토프는 크기와 조성 면에서 B 세포 에피토프와 서로 다르고 MHC 클래스 I 경로를 통해 발현되는 에피토프가 MHC 클래스 II 경로를 통해 발현되는 에피토프와 서로 다르다는 점은 당연한 것이다. 에피토프는 직선 서열 또는 형상적 에피토프 (보존된 결합 부위) 일 수 있다.
"백신화 (vaccination)" 또는 면역화 (immunization)"는 항원을 단독으로 또는 보강제 (adjuvant)와 함께 투여한 결과 나타나는 항원 또는 그의 일부분에 대항하여 면역 반응을 유도하는 것을 말한다. 면역화의 개념은 종래 기술에 이미 잘 알려져 있다. 항원의 투여로 유발되는 면역 반응은 항원을 투여하지 않는 경우와 비교하여 면역 반응의 측면에서 변화로 감지될 수 있다.
본 발명에 따르면, 항체는 면역글로불린 영역 (immunoglobulin domain)으로 구성되는 특징을 가진다. 마찬가지로 항체는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 단백질이다. 일반적으로 말하면, 항체 분자는 2가지 형태의 사슬로 이루어진다. 한 사슬은 중쇄 또는 H 사슬로 다른 하나는 경쇄 또는 L 사슬로 불린다. 이 두 사슬은 동일한 몰 비율로 존재하고 각각의 항체 분자는 2개의 H 사슬과 2개의 L 사슬을 가진다. 이 2개의 H 사슬은 디설파이드 결합 (disulfide bond)들로 연결되어 있으며 각 H 사슬은 L 사슬과 하나의 디설파이드 결합으로 연결되어 있다. L 사슬은 단지 2개의 타입이 있고 각각 람다 및 카파 사슬로 불리운다. 대조적으로, H 사슬은 이소타입으로 불리는 5개의 주요 클래스가 있다. 이 5가지 클래스는 면역글로불린 (IgM 또는 μ), 면역글로불린 D (IgD 또는 δ), 면역글로불린 G (IgG 또는 λ), 면역글로불린 A (IgA 또는 α) 및 면역글로불린 E (IgE 또는 ε)로 이루어진다. 이소타입 간의 분명한 특징은 면역글로불린의 불변 영역 (constant domain)에 의해 정해지고 이에 관해 하기에 상세히 기술할 것이다. 인간 면역글로불린 분자는 9개의 이소타입, IgM, IgD, IgE, IgG1 (γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3) 및 IgG4 (γ4)와 같은 IgG의 4개 서브클래스, IgAl (α1) 및 IgA2 (α2)와 같은 IgA의 2개 서브클래스로 구성된다. 인간에서 IgG 서브클래스 3 및 IgM 은 가장 강력한 보체 활성인자 (전통적인 보체 시스템)인 반면, IgG1 서브클래스와 좀 더 낮은 정도로 IgG2는 전통적인 보체 시스템에서 적절하거나 낮은 활성인자이다. IgG4 서브클래스는 (전통적인 또는 그 외) 보체 시스템을 활성화하지 않는다. 보체 시스템을 활성화하는 것으로 알려진 단 하나의 인간 면역글로불린 이소타입은 IgA 이다. 마우스에서 IgG 서브클래스는 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3 이다. 소의 IgG1은 보체를 활성화하지 않는 반면, IgG2a, IgG2b 및 IgG3 는 보체 활성인자이다.
면역글로불린 분자의 각 H 또는 L 사슬은 L 사슬 가변 영역 (VL 도메인) 및 L 사슬 불변 영역 (CL 도메인) 그리고 H 사슬 가변 영역 (VH 도메인) 및 H 사슬 불변 영역 (CH 도메인)이라고 불리는 2개의 부위로 이루어진다. 하나의 완전한 CH 도메인은 3개의 서브도메인 (CH1, CH2, CH3)과 연결 부위 (hinge region)로 이루어진다. 또한 하나의 H 사슬과 하나의 L 사슬은 면역글로불린의 가변 영역을 가지는 면역글로불린 분자의 팔을 형성할 수 있다. 하나의 완전한 면역글로불린은 2개의 연관된 (디설파이드 연결) 팔로 이루어진다. 따라서 전체 면역글로불린의 각각의 팔은 하나의 VH +L 부위와 하나의 CH +L 부위로 이루어진다. 여기서 사용하는 "가변 부위 (variable region)" 또는 "V 부위"라는 용어는 VH +L 부위 (Fv 단편이라고도 부른다.), VL 부위 또는 VH 부위를 말한다. 또한, "불변 영역 (constant region)" 또는 "C 부위"라는 용어는 CH +L 부위, CL 부위 또는 CH 부위를 말한다.
면역글로불린을 단백질분해효소로 제한적으로 소화시키면 2개의 단편을 만들 수 있다. 항원이 부착하는 단편은 Fab, Fab' 또는 F(ab')2 단편을 말한다. 항원과 결합하는 능력이 없는 단편은 Fc 단편이라고 부른다. Fab 단편은 VH 부위와 CH 부위의 일부분과 쌍을 이루는 L 사슬 (VL + CL 도메인)을 포함하는 면역글로불린 분자의 하나의 팔로 이루어진다. Fab' 단편은 CH1 도메인에 부착된 연결 부위 (hinge region)의 일부분을 가지는 Fab 단편이다. F(ab')2 단편은 정상적으로 서로 디설파이드 결합을 통해 전형적으로는 연결 부위에 공유 결합된 2개의 Fab'단편이다.
CH 도메인은 면역글로불린의 이소타입을 결정하고, 이소타입에 따른 서로 다른 기능적 특성을 부여한다. 구체적으로, μ불변 영역은 5개의 IgM 분자로 된 펜타머 응집체 (pentameric aggregate)를 형성할 수 있고 α 불변 영역은 다이머를 형성할 수 있다.
면역글로불린 분자의 항원 특이성은 가변 영역 또는 V 부위의 아미노산 서열에 의해 부여된다. 마찬가지로, 서로 다른 면역글로불린 분자의 V 부위는 항원 특이성에 따라 유의하게 변화될 수 있다. V 부위의 어떤 부분은 다른 것보다 더 보존되어 원형틀 부위 (framework region), FW 부위라고 불린다. 대조적으로, V 부위의 어떤 부분은 매우 변화 무쌍하여 과다가변 (hypervariable) 부위라고 불린다. CL 및 CH 도메인이 면역글로불린 분자에서 쌍을 이루고 있을 때 각 도메인에서 나온 과다가변 부위는 항원 결합 부위를 형성하는 과다가변 고리 구조 (loop structure)를 만든다. 따라서 과다가변 고리는 면역글로불린의 특이성을 결정하고 표면이 항원에 대해 상보적이기 때문에 상보성을 결정하는 부위 (CDRs)라고도 불린다.
또한 V 부위의 다양성은 면역글로불린의 V 부위를 인코딩 하는 유전자 단편이 조합하여 다양성을 부여하여 생긴다. 면역글로불린 유전자는 체세포적으로 재배열하여 면역글로불린 분자를 인코딩하는 재배열된 면역글로불린 유전자를 형성하는 다중의 배아계열 (germline) 유전자로 이루어진다. VL 부위는 L 사슬 V 유전자 단편 및 J 유전자 단편 (결합 단편 (joining segment))에 의해 인코딩 된다. CH 부위는 H 사슬 V 유전자 단편, D 유전자 단편 (다양성 단편 (diversity segment)) 및 J 유전자 단편에 의해 인코딩 된다.
상기 L 사슬 및 H 사슬 V 유전자 단편은 실질적인 아미노산 서열 상의 다양성을 가지는 3개의 부위를 포함하여 이루어진다. 이러한 부위는 L 사슬 CDR1, CDR2 및 CDR3, 그리고 H 사슬 CDR1, CDR2 및 CDR3 라고 각각 불리운다. L 사슬 CDR1 은 서로 다른 VL 부위 간에 실질적으로 변화할 수 있다. 예를 들어 CDR1의 길이는 약 7개에서부터 17개까지 아미노산의 수가 변화할 수 있다. 대조적으로, L 사슬 CDR2 및 CDR3 의 길이는 서로 다른 VL 부위 간에 변화되지 않다. H 사슬 CDR3 의 길이는 서로 다른 VH 부위 간에 실질적으로 변화할 수 있다. 예를 들어, CDR3 의 길이는 약 1개에서부터 20개까지 아미노산의 수가 변화할 수 있다. 각 H 및 L 사슬의 CDR은 FW 부위에 의해 나뉘어진다.
면역글로불린 분자의 또 다른 기능적 측면은 면역글로불린 분자의 결합수 (valency), 면역글로불린 분자의 친화도 (affinity) 및 면역글로불린 분자의 화합력 (avidity)를 포함한다. 여기서 사용하는 친화도는 면역글로불린 분자가 단일 부위에서 항원과 면역글로불린 분자 상에 (단일 결합 항원에 결합하는 단가 Fab (monovalent fab) 단편) 반응하는 힘을 말한다. 친화도는 면역글로불린이 항원에 결합하는 힘의 총합을 말하는 화합력과는 다른 것이다. 면역글로불린이 결합하는 친화도는 종래기술에서 표준기술로 받아들여지는 경쟁적 결합 기술 (competitive binding techniques), 평형 투석 (equilibrium dialysis) 또는 BIAcore 방법 등을 사용하여 측정될 수 있다. 여기서 사용하는 결합수는 면역글로불린 분자 당 서로 다른 항원이 결합하는 부위의 숫자를 말한다 (항원이 결합하는 단편이 되는 항체 분자 당의 항원 결합 부위의 수). 예를 들어, 단가 면역글로불린 분자는 한 번에 한 가지 항원과만 반응하는 한편, 이가 (divalent) 면역글로불린 분자는 한 번에 둘 이상의 항원과 반응할 수 있다.
"개체 (individual)"는 척추동물 바람직하게는 포유동물 더욱 바람직하게는 인간이다. 포유동물에는 가축 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 마우스 및 래트가 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다. "개체"는 "동물", "주체" 및 "환자"라는 용어와 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명의 여러 가지 측면은 하기 실험들 및 실시예들을 통해 기술된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지
본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1
하기 실시예는 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스에서 유래한 B 세포주의 생산에 관해 기술한다.
B 세포에 특이 반응하여 MYC을 유도 과발현 할 수 있는 마우스 AN1/T3 집단에서 B 세포주를 생산하기 위하여, MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스를 태어난지 8주 동안 독시사이클린를 포함하는 식사를 주어 유지시킨 다음 정상 식사로 바꾸었다. 이 마우스는 외관상으로 분명한 림프절 질환 및 비장 종대를 발생시키고 림프절 종양 (초라한 털, 구부린 자세, 호흡 장애, 빈혈, 장기 종대 등)과 계속 연관 있는 것으로 관찰된 많은 임상적 증상들을 나타내었다. 이 마우스는 안락사 시키고 이로부터 림프절과 지라를 떼어내어 분석하였다. 몇 개의 림프절과 지라의 일부로부터 단일한 세포 현탁액을 만들었다. 이들 세포를 사용하여 유동 세포 측정 분석을 실시하였다. 처음 분석에서 이 종양에는 활성화된 B 세포가 매우 많은 것으로 나타났다. 이 세포 일부를 사용하여 종배양하고 B 세포주를 생성시켰다. 이들 세포는 임파구 배지 (RPMI 1640, 10% 우태아 혈청, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, HEPES, 비-필수 아미노산, 소듐 피루베이트 및 2-β-머캅토에탄올)를 사용하여 배양하였다. 약 14 내지 21일이 경과한 후 몇 개의 웰에서 세포주의 클론이 성장하기 시작하였다. 이 세포는 대형 플라스크에서 성장이 적응할 때까지 조심스럽게 증식시켰고 세포의 일부는 따로 냉동 저장하였다.
초기에 2가지 세포주를 분리하여 각각 TBLK6 및 TBLK7 이라고 명명하였다. 이들 세포중의 시료를 CD138 (Y-축) 및 CD40 (X-축)에 대한 특이 항체로 염색하고 유동 세포분석법으로 분석하였다. 도 1 (상단 패널)에서 나타난 바와 같이, 2가지 세포주는 서로 다른 CD138 발현을 보여주었다. 또한 세포 접종 후 면역글로불린이 세포 배양액으로 분비되는 정도를 측정하였다. 각 세포주로부터 정해진 수 (105 세포)의 세포를 24-웰 플레이트의 웰에 접종하였고, 각 웰에는 1 ml의 성장 배지 또 는 여기에 IL-4, IL-6 또는 둘 다를 첨가하였다. 세포 배양을 시작하고 1, 3 또는 4일에 상층액 시료를 모았다. 그 다음 이 상층액을 사용하여 항-IgM 포획 ELISA 를 실시하였다. 그 결과는 도 1 (하단 패널)에 나타난 바와 같이 두 세포주가 면역글로불린을 동시에 성장 배지 내로 분비할 때, 초기 접종액에 IL-4 및 IL-6 첨가가 이 분비 정도를 증가시키는 것을 보여주었다. 이 때 TBLK6 및 TBLK7 세포주 모두에 의해 분비되는 면역글로불린은 IgM 인 것을 확인하였다. 진정한 단일 클론 집단을 생성하기 위하여 이들 세포주의 세포 클론을 계속 단일화 할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 현재 세포 선택에 의해 AN1/T3 집단을 분리하는 데 사용될 수 있는 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스의 이중 유전자 (bigenic) 집단을 제작하고 있다.
실시예 2
하기 실시예는 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 형질전환 마우스에서 나온 종양과 세포주에서 관찰한 표면형 그리고 HEL-특히 항체의 생산에 관해 기술한다.
야생형 마우스 (굵은 막대), BCRHEL 형질전환 마우스 (굵은, 옅은 회색선), BCRHEL/sHEL 마우스 (점선 회색선) 및 Eμ-MYC/BCRHEL/sHE 삼중 형질전환 (triply transgenic) 마우스 (굵은 검은색선)으로부터 얻은 세포들은 표시된 표면 마커에 대한 특이 항체들로 염색하였고 유동 세포분석법으로 분석하였다. 도 2에 나타난 결과는 B220+ 비장세포 상의 표시된 마커의 발현을 보여준다.
TBL-I, TBL-8, TBL-14 및 TTLN9 세포주 (모두 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스에 서 나온 종양으로부터 유래)에서 각 105개의 세포를 24-웰 플레이트 상에 다른 사이토카인은 첨가하지 않고 1 ml 성장 배지를 첨가하여 접종 배양하였다. 상층액 시료를 4일 후에 수집하여 HEL 특이 IgM (B)의 역가 뿐만 아니라 전체 IgM (A)의 농도를 측정하였다. 또한 다양한 대조군 마우스에서 얻은 혈청도 이들 세포주에서의 항체 생산을 비교하는 척도로서 포함되었다. 이들 마우스에는 C57/BL6 마우스 (WT), BCRHEL 형질전환 마우스 (BCR-tg), sHEL 형질전환 마우스 (Ag-tg), BCRHEL/sHEL 이중 형질전환 마우스 (BCR/Ag-tg), Eμ-MYC 마우스 및 종양 형성 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 삼중 형질전환 마우스 (BL)가 포함된다. 그 결과는 도 2 (하단 패널)에 나타난 바와 같이, Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스로부터 나온 종양 및 세포주에서의 HEL 특이 역가로 나타내었다.
실시예 3
하기 실시예는 MYC 이 B 세포 내성을 파괴하고 항원이 유도하는 MYC-의존성 B 세포 림프종양을 유발하는 것을 기술한다.
MYC 은 내성을 파괴하여 B 세포와 T 세포를 자가 항원에 의한 지속적인 자극에 노출시키고 세포 증식 및 생길 수 있는 게놈상의 위험을 발생시킬 수 있다. MYC 을 과다 발현하는 B 세포의 전-종양 상태에 관한 연구를 통해 B 세포 내성의 조절에서 MYC의 새로운 역할을 밝힐 수 있다.
유동 세포측정 분석법은 야생형 마우스 (굵은 막대), 독시사이클린에서 계속 유지된 MMTV-rtTA/TRE-M7C/BCRHEL/sHEL 마우스 (엷은 회색선) 및 안락사 1주일 전에 독시사이클린을 제거한 MMTV-rtTA/TRE-M7C/BCRHEL/sHEL 마우스 (진한 회색선)로부터 유래한 림프절 세포를 사용하여 수행되었다. 도 3 (상단 패널)에서는 B 세포의 항원 의존성 활성화를 상승시키는 2가지 분자인 CD69 (A) 및 B7-2 (CD86) (B)에 대한 항체로 염색했을 때 결과를 보여준다. CD69와 B7-2 의 표시된 수준은 유동 세포측정법으로 사이크롬-C 로 염색된 세포 상에 대해 열려서 확인되고 이 세포의 B220+ 분획에서 나타난다. 이 결과는 MYC의 급성 과다 발현에 따라 활성화된 B 세포가 출현하는 것을 나타낸다.
도 3 (하단 패널)에서는 활성화된 B 세포가 축적되기 위해서는 지속적인 MYC의 과다 발현이 필요한 것을 보여준다. 그래프에서 각 데이터 점수는 각 마우스의 림프절에서 관찰되는 활성화된 B 세포의 수를 나타낸다. 4가지 마우스 집단이 각 시간 대에 사용되었다. 이 도면은 유도된 MMTV-rtTA/TRE-M7C/BCRHEL/sHEL 마우스에서 활성화된 B 세포의 축적이 시작되고 유지되는 데 MYC 이 필요한 것을 나타낸다.
혈청들은 야생형 마우스 (1), BCRHEL 마우스 (2), BCRHEL/sHEL 마우스 (3), 명확하게 종양이 생기기 전 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스 (4), 독시사이클린에 서 계속 유지되어 온 MMTV-rtTA/TRE-M7C/BCRHEL/sHEL 마우스 (5), 및 혈청을 채취하기 28일 전에 독시사이클린을 제거한 MMTV-rtTA/TRE-M7C/BCRHEL/sHEL 마우스 (6)로부 터 얻었다. 또한 HEL (A)에 대항한 또는 전체 혈청 면역글로불린 (B)에 대한 ELISA 를 3번 반복하여 실시하였다. 그 결과는 도 4 (상단 패널)에서 나타난 바와 같이, MYC의 과다 발현에 따라 혈청에서 자가 항체가 축적되는 것을 보여준다.
MYC의 과다 발현에 따라 신장에서 자가 항체와 면역 복합체가 축적되는 것을 조사하기 위해, 야생형 마우스 (A) 또는 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스 (B)로부터 신장을 얻어 조직 검사를 실시하였다. 이 조직은 섹션하여 헤마톡실린 (hematoxylin) 및 에오신 (eosin) 염색을 하고 현미경 사진을 찍어두었디. 확대 배율은 100배 (100X)로 하였다. 면역 형광을 실시하기 위해, 야생형 마우스 (C) 또는 Eμ-MYC/BCRHEL/sHEL 마우스 (D)로부터 신장을 얻었다. 냉동 조직은 섹션하여 로다민 (rhodamine)과 결합한 IgM 에 대한 항체로 염색하였다. 확대 배율은 5배 (5X)로 하였다. 그 결과는 도 4 (하단 패널)에 나타난 바와 같이, MYC의 과다 발현에 따라 신장에서 자가 항체 및 면역 복합체가 축적되는 것을 보여준다.
MYC 이 B 세포 계열에서 단일하게 발현되는 경우, 형질전환된 자가 항원에 내성을 가질 수 있는 마우스가 항원에 대한 면역 반응을 유발하는 것이 관찰되었다. 이 반응성을 가진 B 세포는 활성화된 표면형을 바꾸어 신장의 면역 복합체 질환을 일으키는 자가 항체를 생산하였다. MYC 은 내성이 희석되도록 유도하고 유지하는 데 필요하였다. 또한 이들 마우스는 BCR 및 MYC 에서 유래한 신호들 간의 협력으로 림프 종양을 발달시키는 것 같았다. 이 효과는 대체 사이토카인으로 작용하는 MYC 의 능력에서 기인하는 것으로 보인다. MYC은 B 세포의 증식과 생존에 사이 토카인의 효과를 모방하고 이들 효과를 나타내는 데 필요한 것을 확인하였다. 이 결과는 MYC 의 과다 발현이 면역학적 내성의 제거를 유발하고 유지하는 데 필요한 것을 제시한다. MYC 을 과다 발현하는 자가 반응성 B 세포가 항원 의존성 방식으로 불멸화되는 능력은 하이브리도마 세포주를 생성하는 전통적인 방법보다 더 많은 특이성을 안정화시킨다. 내성을 가진 B 세포가 수명이 짧아 제한되지 않고 마이엘로마 세포주와 생산적으로 융합시키기 위해 아네르기 B 세포가 필요하지 않기 때문이다.
실시예 4
하기 실시예는 B 세포 특이, Dox 가 조절하는 MYC을 과다 발현하는 마우스를 자가 반응성 배경에서 B 세포주를 생산하는 데 사용하는 것을 기술한다.
이 결과는 상기에서 나타난 바와 같이, MYC의 과다 발현이 수용성 자가 항원에 대한 B 세포 내성을 파괴할 수 있는 것을 보여준다. 이들 연구에서 MYC 을 과다 발현하는 BCRHEL 형질전환 마우스가 sHEL 에 대한 격렬한 반응을 유발하여 악성 질환이 생기기 전에 다중클론 자가면역 림프 증식성 질환 (polyclonal autoimmune lymphoproliferative disease)을 일으킨다 (도 3 및 도 4 참조). 또한 이 연구에서는 자가 면역성 B 세포에서 MYC의 과다 발현은 MYC 이 증식 및 생존 신호를 제공하는 능력을 가지기 때문에 B 세포를 T 세포의 도움에 의존하지 않게 만들 수 있다. MYC 을 과다 발현하는 자가 반응성 B 세포의 집단이 증가하면 여전히 해당 항원에 대한 지속적인 노출과 MYC의 과다 발현에 의존성을 가지는 B 세포 림프 종양을 계속 생성시켰다. 종양을 갖는 마우스로부터 림프절, 비장 및 골수에서 얻은 B 세포를 채취할 수 있었고, 일차 세포를 마이엘로마 융합 파트너와 융합하지 않더라도 BCR 형질전환 유전자를 발현하고 항-HEL IGM 을 분비하는 많은 세포주를 만들 수 있었다.
2가지 상황을 추가하여 이와 유사한 결과도 얻을 수 있었다. 한 사례에서는 Ars/Al 마우스를 Eμ-MYC 마우스와 교배하였다. 이 마우스 (9마리)는 평균 36일 경과한 시점에서 버킷 유사한 림프 종양을 발달시켰다. 이 종양은 성숙한 활성화된 B 세포로 구성되어 있었다. 이들 세포는 그 표면에 IgM 을 발현하였다. 이 결과는 낮은 친화성을 가지는 항-DNA 항체에서 MYC의 과다 발현이 자가 반응성 B 세포에 대한 내성을 파괴하는 것을 보여준다. 두 번째 사례에서는 MMTV-rtTA/TRE-MYC 마우스를 사용하였다. 이들 마우스는 이 이중 형질전환 마우스의 식사로부터 독시사이클린을 제거하고 나서 MYC 의 일시적으로 조절되는 과다 발현을 B 세포에 특이적이 되도록 한다.
4개월이 지난 후 독시사이클린을 포함하는 식사를 제거하고 나면 이 마우스들은 활성화된 말단 B 세포 및 혈청 내 항-핵 항체를 축적시키고 신장 내 면역 복합체를 침착시키며 6주 내 (평균 42일)에 B 세포 림프 종양을 발달시켰다. 이들 종양으로부터 마이엘로마 파트너 세포와 융합시키지 않고 세포주를 만들 수 있었다. 이 결과는 이 시스템을 자가 반응성 B 세포 수용체를 발현하는 B 세포주를 생성하는 새로운 방법에 사용될 수 있는 것을 제시해준다.
실시예 5
하기 실시예는 MYC 을 과다 발현하는 마우스에서 생산되는 항체가 생체 내에서 (in vivo) 작용하는 것을 기술한다.
상기에서 MMTV-rtTA/TRE-MYC 마우스에서 생산된 HEL-특이 항체가 생체 내에서 기능을 발휘하는 지 여부를 조사하기 위하여, letHA1 바이러스 감염 모델을 사용하기로 결정하였다. 돼지 광견병 바이러스 (PRV)는 한 때 정맥 내 투여 시 마우스에서 letHA1 으로 알려졌던 알파-허피스 바이러스의 한 종류이다. PRV의 2가지 변형체를 제작하였다. 한 사례에서는 US-9 이라 부르는 유전자 서열 하나와 GFP를 융합시켰다. 여기서는 바이러스와 바이러스가 감염된 세포가 서로 다른 조건에서 추적될 수 있게 하였다. 중요한 것은 이 US-9 단백질이 여전히 생산되고 그 기능을 유지하는 것이다. 이 바이러스는 유전적으로 추가가 됐음에도 전적으로 병원성을 가진다. 또한, 다른 사례에서는 HEL 에 대한 전체 유전자 프레임을 인코딩하는 PRV 변형체를 제작하였다. 이 바이러스 변형체는 웨스턴 블럿으로 감염된 세포를 분석한 결과 HEL 을 발현하는 것을 보여주었다.
GFP 를 발현하는 바이러스 또는 HEL 을 발현하는 바이러스의 접종액 (109 PFU 역가를 포함하는 바이러스 상층액 200μl)을 1:500으로 희석된 HEL 특이 항체와 1시간 동안 얼음 위에서 반응시켰다. 그 다음 이 혼합 반응액은 4가지 마우스 집단에 정맥 내 주사하였다. 그 다음 이 마우스는 바이러스와 항체 혼합물을 투여 하고 4일 동안 관찰되었으며 PRV 감염과 관련된 심한 신경학적 임상 증상을 나타내면 안락사 시켰다. 도 5에서 나타난 바와 같이, GFP를 발현하는 바이러스 (굵은 선)는 HEL 특이 항체에 의해 영향을 받지 않았다. 이 집단에서 치사 수준은 야생형 PRV 균주로 실험한 경우와 비교할 수 있었다. 대조적으로, HEL을 발현하는 바이러스 (사선)로 감염된 마우스의 치사 정도는 상당히 지연되었고 이 마우스 집단은 GFP를 발현하는 바이러스로 감염된 마우스보다 2배 이상 오래 살아남았다. 이 실험에 사용된 바이러스는 이 US-9 융합 단백질을 일시적으로만 발현하였다. 세포 내로 들어가고 나서 이들은 야생형 PRV 를 생산한다. 치사가 지연되는 것은 바이러스 감염을 억제하는 항체의 능력을 나타낸다.
실시예 6
하기 실시예는 프로토형으로서 H5N1 을 사용하는 감염원에 대한 새로운 항체의 생산에 관해 기술한다.
신생-자가 (neo-self) 항원으로서 이 시스템에 도입하여 이 항원에 대한 새로운 항체가 생성되는지 MMTV-tTA/TRE-MYC 마우스의 능력을 조사하기 위하여, 레트로바이러스 골수 조합 마우스를 제조하는 방법을 사용하였다. A/Ty/Ont/7732/66 (H5N9)으로부터 분리한 헤마글루티닌 (HA)의 코딩 부위 (이 cDNA의 ORF 인코딩 영역 - 이 클론에는 해독되지 않는 영역이 존재한다.)가 pMIG 벡터 내에 서브 클론되어 있는 pMISCV-H5-IRES-GFP (pMIG-H5)를 제작하였다. 5-FU를 처리한 TRE-MYC 마우스에서 얻은 골수는 pMIG-H5 및 pMIG-tTA를 사용하여 형질전환하였다. 대략 60% 세 포는 GFP 발현에 의해 유동 세포측정법으로 분석한 결과 형질전환 되어 있었다. 3일이 지난 후 세포는 letHA1ly로 조사된 마우스 (800/400R, B1/6 수여자) 집단에 이식시켰다. 골수 조합된 마우스는 SEPTRA 상에서 유지시키고 외부적으로 명확한 혈액 이상의 임상적 증상을 매일 관찰하였다. 재조합 6주가 경과하고 나서 몇 마리 마우스는 구부린 자세, 초라한 털, 외부적으로 만져지는 종양 (비장 종대 및 림프 종양) 및 가쁜 호흡을 포함한 종양 생성의 임상적 증상을 나타내기 시작하였다. 재조합한지 7 내지 8주 사이에 100% 마우스가 종양 생성의 증상을 보여주었다. 마우스는 희생되어 GFP 발현의 증거가 형광 현미경으로 분석되었다. 이 때 희생된 마우스 100%가 비장 종대 및 림프절, 골수 및 비장에서 GFP 발현을 보여주었다. 림프절과 지라는 수집되었고 24-웰 플레이트 내에 뿌려져 단일 세포 현탁액을 만드는데 사용되었다. 남은 세포들은 배양되어 세포주를 생산하기 시작하거나 다음 분석을 위해 냉동 보관되었다. 이들 세포는 B 세포 마커인 B220 및 IgM 에 대한 특이 항체로 염색되었고 동일한 발현을 유동 세포측정법으로 분석하였다. 도 6은 이 GFP 양성 세포들이 B 세포 마커인 B220 및 IgM 모두를 발현하는 것을 나타낸다. 이 종양은 MYC 이 유도하는 항원 의존성 종양을 생성하는 성숙하고 활성화된 (파괴하는) B 세포로 구성되어 있었다. 이 세포들은 배양되어 처음 접종 후 8일부터 클론으로 증식하는 집단이 계대되었다. 이것은 단일클론 항체를 생산하는 최근의 방법으로 정상적으로 달성할 수 있는 것보다 상당히 빠른 시간이다. 또한 헤마글루티닌에 대한 새로운 항체를 생산하게 하는 이 새로운 방법은 시간 일정이 가속화되어 있어 새로이 출현하는 감염성 질환 및 기타 생물학적 위협에 대해 새로운 중화 항체를 개발 하는 데 보다 신속한 반응 방법이 될 수 있다. 또한, 골수 세포는 냉동 보관될 수 있어 향후 다양한 마우스 집단을 재구성하여 특이성을 보다 높이거나 부가 항원을 추가할 수 있다. 혈청은 기관이 마우스로부터 채취되는 시간에 수집되어 영하 20°C 에서 보관되었다. 종양이 H5 HA 단백질에 대항한 항체를 생성하는지 여부를 판단하기 위하여, 혈청을 1:5,000으로 희석하여 웨스턴 블럿으로 분석하였다. A/Ty/Ont/7732/66 로부터 HA 를 발현하는 플라스미드 pMIG-HA 또는 양성 대조군 플라스미드 pCDNA3-H5 로 형질전환 된 293 세포에서 얻은 단백질 용출액 (트리톤 X-100을 포함하는 용출 완충용액)이 SDS-PAGE (12% 젤)로 분리되었고 PVDF 막에 트랜스퍼하여 희석된 혈청과 반응시킨 다음 HRP 결합 이차 항체와 다시 반응시켰다. 도 7은 종양을 갖는 마우스에서 얻은 혈청이 플라스미드 pMIG-HA (중앙 레인) 또는 양성 대조군 플라스미드 pCDNA3-H5 (오른쪽 레인)을 발현하는 293 세포로부터 나온 HA 와 반응하는 것을 나타낸다. 그러나 이것은 형질전환되지 않은 293세포로부터 나온 용출액 또는 pMIG 벡터만으로 형질전환 된 세포 (왼쪽 레인)에서 얻은 용출액과는 반응하지 않다.
HA 단백질은 대략 38 내지 40 kDa 밴드로 나타난다. 더 작은 분자량 밴드 (19kDa)은 비-특이적인 것으로 보이고 바람직한 로딩 대조군이 된다. 얻어진 밴드 패턴은 세포 내에서 정상적으로 성숙이 진행되는 동안 생성되는 H5 및 그 절단 산물과 일치한다. 이 성숙한 HA는 2개의 서브유닛 (HA1 및 HA2)으로 구성된다. 이 HA1 서브유닛 (40kDa 이하)는 구형 머리 부분을 형성하여 숙주세포의 표면 당단백질 및 당지질 상의 시안산 수용체와 결합하는 역할을 한다. 이 HA2 서브유닛 (20 kDa 이하)는 숙주세포에 칩입하는 동안 내부 막과 바이러스 외피가 융합하는 역할을 담당한다. 단백질 분해효소의 절단 부위는 이 2가지 서브유닛들을 분리하고 이 숙주 단백질 분해효소에 의한 절단은 숙주세포 내로 칩입하는 데 필수 불가결하다. 바이러스를 중화하는 에피토프의 다양성이 HA1 서브유닛에서 발견되고 이는 바이러스-수용체 반응을 억제한다.
바이러스-수용체 반응을 막는 혈청의 능력을 조사하기 위하여, H5N2, H1N1, H7N2, H3N2, 및 H6N8 서브타입을 포함하는 다양한 인플루엔자 A를 이용한 헤마글루티닌 억제 및 바이러스 중화 분석이 실시되었다 (도 8 참조). H5/tTA BM 형질전환 후 6 내지 8주에 3마리 마우스로부터 분리한 혈청 (1-3) 또는 PBS 완충용액 (C1)은 2개씩 마이크로타이터 플레이트 상에서 연속적으로 희석되었다. 연속 희석한 후에 인플루엔자 A 바이러스 A/Mal/WI/944/82 (H5N2) 및 A/NY/1469/02 (H1N1)의 응집 유닛 또는 PBS 완충용액 (바이러스 없음)이 각 웰에 첨가되어 30분 동안 반응을 진행시켰다. 그 다음 칠면조의 적혈구 세포가 첨가되어 30분 동안 반응시키고 혈구 응집 활성을 측정하였다. 첫 번째 컬럼에는 최종 혈청 농도가 1:20이 되게 하였다.
이들 데이터는 H5N1에 대해 생성되는 새로운 항체도 서로 다른 종류의 바이러스 (H1N1)를 중화시킬 수 있는 것을 보여준다. 이 결과는 MYC 의 과다 발현을 사용하는 이 새로운 방법이 보통은 무시되는 바이러스가 인코딩 하는 에피토프를 밝혀낼 수 있는 것을 제시한다. 이들은 자가 단백질을 모방하고 내성 기작은 이들 잔기에 대한 반응을 막는 것 같다. 이것은 특이 타입 (인플루엔자 또는 기타 타입)의 서로 다른 바이러스들 중에서 공통의 잔기를 확인하고 치료적으로 이용하는 것을 가능하게 할 수 있다.
림프절 및 비장 세포에서 얻은 세포주가 제조될 수 있고 그 상층액은 HA 단백질에 대항한 항체를 생산하는 세포주가 생산된 것을 보여주기 위해 HA와의 반응성이 조사될 수 있다. 또한 이들 상층액 및/또는 혈청은 H5를 포함하는 인플루엔자 바이러스를 중화시키는 능력을 조사하는 데 사용될 수 있다. 중화 분석에는 생체 외 상피세포 또는 생체 내 마우스의 유효한 감염뿐만 아니라 플루 바이러스 및 양 적혈구를 사용하여 항체가 응집 분석을 억제하는지 여부를 판단하는 척도를 포함할 수 있다.
본 개시 원리에 대한 이해를 목적으로 도면에 도시된 예들을 참조하고 소정 용어가 이들을 기술하는데 사용될 것이다. 그러나 이에 의해 청구범위를 제한하는 것은 아니며, 본 개시와 관련된 분야의 기술자에게 통상 착상될 수 있는 여기에 기술된 본 발명 원리의 또 다른 용도에 대한 어떠한 변경 및 변형도 고려되는 것으로 이해되어야 한다.
본 개시는 도면 및 상기 설명으로 상세하게 도시되고 기재되었으나, 이는 예시적인 것이고 특성을 제한하지 않는 것으로 고려되어야 하며 단지 바람직한 예가 도시되고 기술되었으며 본 발명의 사상 내에 있는 모든 변경 및 변형이 보호되는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (61)

  1. (a) 동물에서 MYC가 과발현되지 않는 조건 하에서 MYC를 유도 과발현하는 동물에게 항원을 도입하는 단계;
    (b) 상기 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계; 및
    (c) MYC가 과발현되는 조건 하에서 상기 B 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 항체 생산 세포의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 동물에게 항원을 도입하는 단계 이후에 상기 동물에서 MYC가 과발현되는 조건 하에서 동물을 유지시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 동물이 MYC를 상기 동물의 B 세포에서 압도적으로 유도 과발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 동물은 MMTV-rtTA/TRE-MYC 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    (a) 마우스는 항원을 동물에게 도입하는 단계 동안 MYC 발현을 억제하는 항 생제 조건에서 유지시키고;
    (b) B 세포를 배양하는 단계는 상기 항생제가 없는 조건에서 수행하여 항체 생성 세포를 생성하는 것
    을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 동물에게 항원을 도입하는 단계 이후에 마우스에 대한 항생제 노출을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 항생제는 독시사이클린 (doxycyclin)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 동물에게 항원을 도입하는 단계는 동물에게 항원을 인코딩하는 DNA를 유전자적으로 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항원은 자가항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 동물은 상기 항원을 더욱 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항원은 HIV 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 항원은 gp120 또는 gp41 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 항원은 인플루엔자 바이러스로부터 나온 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항원은 헤마글루티닌 (hemaglutinin)인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. (a) 동물에서 MYC가 과발현되지 않는 조건 하에서 MYC를 유도 과발현하는 동물에게 항원을 도입하는 단계;
    (b) 상기 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계;
    (c) MYC가 과발현되는 조건 하에서 상기 B 세포를 배양하는 단계: 및
    (d) 상기 B 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 항체의 제조 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 동물에게 항원을 도입하는 단계 이후에 상기 동물에 서 MYC가 과발현되는 조건 하에서 동물을 유지시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 동물은 상기 동물의 B 세포에서 MYC를 압도적으로 유도 과발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 동물은 MMTV-rtTA/TRE-MYC 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 동물에게 항원을 도입하는 단계는 동물에게 항원을 인코딩하는 DNA를 유전자적으로 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 항원은 자가항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 동물은 상기 항원을 더욱 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제15항에 있어서, 상기 항원은 HIV 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제15항에 있어서, 상기 항원은 gp120 또는 gp41 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제15항에 있어서, 상기 항원은 인플루엔자 바이러스로부터 나온 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 항원은 헤마글루티닌인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제15항에 있어서, 상기 항체는 인간화된 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. (a) B 세포의 중쇄 또는 경쇄 유전자의 VDJ 연결 부위(joint region)를 인코딩하는 핵산 분자를 MYC를 유도 과발현하고 B 세포의 생성을 억제하는 유전자 변형을 포함하는 동물로부터 얻은 골수 유래 줄기 세포 내로 도입하는 단계;
    (b) 상기 골수 유래 줄기 세포를 수여 동물에게 전달하는 단계;
    (c) 상기 수여 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계;
    (d) MYC가 과발현되는 조건 하에서 상기 B 세포를 배양하는 단계; 및
    (e) 상기 B 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 항체의 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 골수 유래 줄기 세포를 수여 동물에게 전달하는 단계 이후에 수여 동물에서 MYC가 과발현되는 조건 하에서 수여 동물을 유지시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 골수 유래 줄기 세포를 수여 동물에게 전달하는 단계 이후에 수여 동물에서 MYC가 과발현되지 않는 조건 하에서 수여 동물을 유지시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 (a) 단계로부터 얻은 B 세포는 인간 B 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 B 세포는 인간으로부터 분리한 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 인간은 항체가 매개하는 자가면역 질환을 앓고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제27항에 있어서, (a) 단계는 골수 유래 줄기 세포를 VJD 연결 부위를 인코딩하는 핵산 분자로 레트로바이러스적으로 형질도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 VDJ 연결 부위를 인코딩하는 핵산 분자는 해당 항원에 선택적으로 결합하는 분리된 인간 B 세포로부터 클로닝된 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 VDJ 연결 부위를 인코딩하는 핵산 분자는 인간 공여자로부터 얻은 B 세포에서 찾아낸 IgH 및 IgL 서열로부터의 재배열된 VDJ 부위를 PCR로 증폭시킨 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 인간 공여자는 건강한 공여자 및 항체가 매개하는 자가면역 질환을 가진 환자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 인간 IgH를 인코딩하는 핵산 분자 및 인간 IgL을 인코딩하는 핵산 분자로 더 형질도입된 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 인간 IgH를 인코딩하는 핵산 분자 및 인간 IgL을 인코딩하는 핵산 분자는 동일한 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제37항에 있어서, 상기 인간 IgH 및 상기 인간 IgL을 인코딩하는 하나 또는 2 핵산 분자는 VDJ 부위를 인코딩하는 핵산 분자와 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제27항에 있어서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 인간으로부터 얻은 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제27항에 있어서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 마우스로부터 얻은 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 마우스는 Rag-2-/-, SCID, DNA-PK-/-, Ku70-/-, Ku80-/-, XRCC4-/- 및 μMT-/-로 이루어진 리스트로부터 선택되는 유전자 변형을 포함하는 MMTV-rtTA/TRE-MYC 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제27항에 있어서, 상기 수여 동물은 치사량으로 조사된 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제27항에 있어서, 상기 수여 동물은 SCID 마우스인 것을 특징으로 하는 방 법.
  45. 제27항에 있어서, 상기 동물에게 VDJ 부위가 선택적으로 결합하는 항원을 생체 내에서 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제27항에 있어서, 상기 항체의 이소타입은 IgA인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제27항에 있어서, 상기 항체의 이소타입은 IgG인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제27항에 있어서, 상기 항체의 Fc 부위는 자가면역 반응 및 이와 관련된 면역-복합체 침착 문제를 유발하는 항체의 능력이 최소화되도록 유전자적으로 변형된 것을 특징으로 하는 방법.
  49. (a) 원암유전자(protooncogene)가 동물에서 과발현되지 않는 조건 하에서 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원암유전자를 유도 과발현하는 동물에게 항원을 도입하는 단계;
    (b) 상기 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계; 및
    (c) 상기 원암유전자가 과발현되는 조건 하에서 상기 B 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 항체 생산 세포의 제조 방법.
  50. (a) 원암유전자가 동물에서 과발현되지 않는 조건 하에서 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원암유전자를 유도 과발현하는 동물에게 항원을 도입하는 단계;
    (b) 상기 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계;
    (c) 상기 원암유전자가 과발현되는 조건 하에서 상기 B 세포를 배양하는 단계: 및
    (d) 상기 B 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 항체의 제조 방법.
  51. (a) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원암유전자를 유도 과발현하는 동물로부터 얻은 골수 유래 줄기 세포 내로 항원을 인코딩하는 핵산 분자를 도입하는 단계;
    (b) 상기 골수 유래 줄기 세포를 수여 동물 내로 전달하는 단계;
    (c) 상기 동물에서 원암유전자가 과발현되는 조건 하에서 상기 수여 동물을 유지시키는 단계;
    (d) 상기 수여 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계;
    (e) 상기 원암유전자가 과발현되는 조건 하에서 B 세포를 배양하는 단계; 및
    (f) 상기 B 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 항체의 제조 방법.
  52. (a) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원암유전자를 인코딩하는 핵산 분자를 동 물로부터 얻은 골수 유래 줄기 세포 내로 도입하는 단계;
    (b) 상기 골수 유래 줄기 세포를 수여 동물 내로 전달하는 단계;
    (c) 상기 수여 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계:
    (d) 상기 B 세포 내로 항원을 인코딩하는 핵산 분자를 도입하는 단계;
    (e) 상기 원암유전자가 과발현되는 조건 하에서 B 세포를 배양하는 단계; 및
    (f) 상기 B 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 항체의 제조 방법.
  53. (a) 세포 생존 및 증식을 촉진하는 원암유전자를 인코딩하는 핵산 분자를 동물로부터 얻은 골수 유래 줄기 세포 내로 도입하는 단계;
    (b) 상기 골수 유래 줄기 세포를 첫 번째 수여 동물 내로 전달하는 단계;
    (c) 상기 첫 번째 수여 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계:
    (d) 상기 B 세포 내로 항원을 인코딩하는 핵산 분자를 도입하는 단계;
    (e) 상기 B 세포를 두 번째 수여 동물 내로 전달하는 단계;
    (f) 동물 내에서 상기 원암유전자가 과발현되는 조건 하에서 상기 두 번째 수여 동물을 유지시키는 단계;
    (g) 상기 두 번째 수여 동물로부터 B 세포를 회수하는 단계;
    (h) 상기 원암유전자가 과발현되는 조건 하에서 상기 B 세포를 배양하는 단계; 및
    (i) 상기 B 세포 배양물로부터 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는 항체의 제조 방법.
  54. 제51항에 있어서, 상기 원암유전자는 MYC인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제52항에 있어서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 항-세포사멸(anti-apoptosis) 단백질을 인코딩하는 핵산 분자로 형질도입된 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 항-세포사멸 단백질은 Bcl-2인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제52항에 있어서, 상기 핵산 분자는 레트로바이러스적으로 도입된 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제52항에 있어서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 인간으로부터 나온 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제52항에 있어서, 상기 골수 유래 줄기 세포는 조건적으로 불멸화된 장기 조혈 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제51항에 있어서, 상기 수여 동물은 치사량 이하로 조사된 NOD/SCID 마우스 인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제15항에 있어서, 상기 동물은 상기 인간 Ig 유전자좌를 인코딩하는 핵산 분자로 형질전환된 것을 특징으로 하는 방법.
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