CN117645673A - 一种IL-21与sCD4及Fc的融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种hIL‑21与sCD4及Fc的融合蛋白及其应用，属于基因工程和生物医学医疗技术领域。本发明的融合蛋白具有治疗HIV或制备治疗HIV药物的应用。所述融合蛋白的hL‑21为人的IL‑21，sCD4为CD4分子胞外区D1D2结构域，Fc为免疫球蛋白的Fc区。所述的融合蛋白具有促进CD8+T细胞分化为记忆干细胞样T细胞，增强HIV特异性CD8+T细胞免疫应答；所述的融合蛋白可通过sCD4靶向HIV+细胞，并通过Fc介导的抗体依赖的细胞毒性作用靶向杀伤HIV+细胞；同时，所述融合蛋白可中和病毒库激活和靶向杀伤过程中新产生的游离病毒，阻断新的感染和病毒库的产生，从而使治疗艾滋病作用最大化。

Description

一种IL-21与sCD4及Fc的融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物医学医疗技术领域，具体涉及IL-21、sCD4与Fc的融合蛋白，包含融合蛋白的药物，以及融合蛋白在预防及治疗HIV感染中的应用。
背景技术
HIV感染除了会导致机体CD4+T数量减少以外，还会诱导机体慢性炎症及免疫耗竭，如诱导CD8+T细胞功能耗竭。目前临床开展的抗逆转录病毒疗法(HAART或ART)可以有效抑制HIV复制，极大地促进了艾滋病的防治成效。但HAART疗法存在以下局限性：1)HAART不能彻底清除患者体内HIV病毒，停药后病毒会迅速反弹，患者需终身服药；2)HAART治疗并不能让病人的免疫系统恢复到完全正常状态，HIV感染导致的慢性炎症及免疫损伤在一部分患者体内持续存在。因此，目前亟需开发新型治疗策略，达到治愈艾滋病的目的。
细胞因子IL-21可以增强CD8+T细胞的细胞毒性、效应性和记忆性，并促进NK细胞的存活和活化。研究表明，IL-21编程活化T细胞可促进“记忆干细胞样T细胞”的产生，并增强免疫治疗效果(Li Y,et al.Targeting IL-21to tumor-reactive T cells enhancesmemory T cell responses and anti-PD-1antibody therapy.Nat Commun.2021；12(1):951)。此外，IL-21可以使CD4+T细胞抵抗Treg介导的免疫抑制作用，从而诱导CD4+T细胞的存活和增殖。IL-21在控制慢性病毒感染中也发挥重要作用，在慢性病毒感染期间，效应性CD8+T细胞IL-21信号有助于防止表型衰竭，并在病毒持续复制时维持其增殖能力(ElsaesserH,et al.IL-21is required to control chronic viral infection[publishedcorrection appears in Science.2009Aug21；325(5943):946)。研究表明，在HIV慢性感染过程中，病毒特异性CD4+T细胞可产生IL-21，并且与病毒控制相关。HIV特异性的CD8+T细胞在慢性感染中表达高水平的IL-21Ra，表明病毒特异性CD8+T细胞需要IL-21维持其存活和功能，但是，HAART治疗并不能恢复IL-21的产生，提示CD8+T细胞无法接受有效的IL-21刺激信号(Yue FY,et al.HIV-specific IL-21producing CD4+T cells are induced inacute and chronic progressive HIV infection and are associated with relativeviral control[published correction appears in J Immunol.2010Aug15；185(4):2632-3；Iannello A,et al.Dynamics and consequences of IL-21production in HIV-infected individuals:a longitudinal and cross-sectional study.J Immunol.2010；184(1):114-126)。综上所述，IL-21具有增强记忆性CD8+T细胞，特别是“记忆干细胞样T细胞”的功能，并且在体内应用中毒副作用小，可以作为HIV治疗的一个潜在药物。
CD4分子作为HIV的受体，它可以与HIV包膜蛋白上gp120结合。CD4分子由四个结构域组成，其中D1D2为胞外结构域，D3D4为胞内结构域。由CD4分子胞外D1D2结构域组成的可溶性CD4分子(sCD4)能够结合游离的HIV病毒颗粒。sCD4蛋白在人源化小鼠及恒河猴体内能有效预防HIV及SHIV感染。除了中和HIV感染功能外，sCD4或者CD4的类似物结合被感染细胞表面上的gp120后，可以使HIV包膜蛋白由“封闭”的构象转变为“开放”构象，使其暴露出更多的抗原表位，促进针对HIV包膜蛋白的内源性抗体与gp120结合，从而介导抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)，清除被感染的细胞。
增强机体针对HIV的体液免疫应答也是促进对病毒库杀伤的潜在手段，然而，广谱中和抗体只能在约2％-5％的HIV患者体内产生。通过从这一部分患者分离得到广谱中和抗体，然后利用基因工程手段表达并回输给患者，是实现阻断病毒复制，持久的控制病毒血症的潜在方法。早期的研究显示，广谱中和抗体在HIV感染的人源化小鼠及SHIV感染猴子模型体内有良好的治疗效果。临床试验也显示，HIV患者接受了针对HIV胞膜蛋白CD4结合位点的广谱中和抗体3BNC117治疗后，病毒反弹所需时间显著延迟。广谱中和抗体在体内发挥效果需要抗体功能区Fc，提示抗体依赖的细胞毒作用对于其发挥功能的重要性。
HIV病毒感染导致的机体抗病毒免疫功能耗竭，是HIV无法被有效清除的主要原因。如何有效靶向清除HIV感染细胞，是艾滋病治疗的难点，也是该领域目前待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种hIL-21与sCD4及Fc的融合蛋白及其应用，在实验中观察到，其可以促进记忆干细胞样CD8+T细胞的分化，中和游离病毒，靶向潜伏库细胞，增强CD8+细胞杀伤功能，能够更好的抑制HIV复制。hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白可作为新一代的HIV免疫治疗药物。
本发明目的通过以下技术方案来实现：
本发明提供了一种融合蛋白，所述的融合蛋白包含细胞因子hIL-21、sCD4及免疫球蛋白Fc区(Fc)三个功能元件。所述的融合蛋白为异源二聚体hIL-21×sCD4-Fc，其包含第一多肽和第二多肽，第一多肽与第二多肽不同；第一多肽自N端至C端顺序包含hIL-21、免疫球蛋白Fc区(hIL-21-Fc6)，第二多肽自N端至C端顺序包含sCD4、免疫球蛋白Fc区(sCD4-Fc9)。第一多肽包含的免疫球蛋白Fc区与第二多肽包含的免疫球蛋白Fc区由具有相同亚型的免疫球蛋白突变而来。功能元件之间可通过linker连接。
所述的hIL-21选自人IL-21(SEQ ID NO.5)。
所述的sCD4由HIV受体蛋白CD4胞外区D1D2结构域组成，所述的CD4可选自CD4分子以及CD4的各种分子的突变体，如CD4Q40A、CD4G38A、CD4K46A、CD4P48Q、CD4E85A等。所述的sCD4的氨基酸序列优选如SEQ ID NO.11所示。
所述的免疫球蛋白Fc区可选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区氨基酸序列，优选来自IgG1的突变体Fc6(SEQ ID NO.7)或Fc9(SEQ ID NO.9)。其中IgG1具有较强的诱导ADCC和CDC效应的能力和较长的血清半衰期，是抗体药最常见的抗体亚型；IgG2、IgG4具有较弱的诱导ADCC和CDC效应的能力，但血清半衰期较长。
优选的，所述的异源二聚体hIL-21×sCD4-Fc的第一多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示，第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的融合蛋白具有如下效果：将hIL-21×sCD4-Fc施用于人外周血单核细胞(PBMC)，可以促进记忆干细胞样CD8+T细胞的分化。将hIL-21×sCD4-Fc施用于被激活的HIV潜伏感染细胞系，在体外可以靶向被激活的HIV潜伏感染细胞。将hIL-21×sCD4-Fc施用于Thp-1细胞系，可以靶向Thp-1细胞表面的FcR。将hIL-21×sCD4-Fc施用于游离HIV，在体外可以中和游离的HIV病毒，阻断其感染靶细胞。将hIL-21×sCD4-Fc施用于病毒库激活的潜伏感染细胞系，可以促进HIV患者内源性抗体结合到感染细胞表面，具有潜在促进ADCC功能。将hIL-21×sCD4-Fc施用于HAART治疗来源的PBMC，可以抑制HIV复制，更好的杀伤p24+T细胞。
本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明所述的融合蛋白hIL-21×sCD4-Fc。
编码所述异源二聚体hIL-21×sCD4-Fc的第一多肽的核酸分子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2所示；编码第二多肽的核酸分子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了一种载体，所述载体包含了上述核酸分子。
本发明提供了一种细胞，所述细胞包含本发明所述融合蛋白hIL-21×sCD4-Fc、编码融合蛋白的核酸分子或表达所述融合蛋白的载体，用于生产融合蛋白。所述细胞选自非人哺乳动物细胞，优选CHO和HEK293细胞。
本发明提供了所述的融合蛋白、核酸分子、载体和/或细胞在制备预防或治疗HIV感染的药物中的应用；所述HIV感染优选为HIV急性或慢性感染患者；更优选为经过临床抗逆转录病毒疗法(HAART)治疗的HIV患者。
本发明提供一种预防或治疗HIV感染的药物，所述药物包含上述融合蛋白、核酸分子、载体或细胞。
术语及定义
除非特别说明，本申请中所使用的术语和定义均为本领域中惯常使用的含义并且为本领域技术人员知晓。
如本申请中所使用的，术语“HIV病毒库”是指HIV潜伏感染或低水平复制的细胞，这类细胞整合了HIV基因组，但是不发生或以较低水平发生HIV的转录和相关蛋白的合成，但是在特定的条件下，会重新起始HIV的复制，并且产生具有复制和感染能力的HIV。
本发明所述的“HIV感染”主要是HIV-1感染；HIV-1的病毒可以选JR-CSF、T278-50、242-14、T250-4、HO86.8、DU422.01、X2088.c9、6322.V4.C1、6471.V1.C16、6631.V3.C10、620345.c1等多种毒株。
本发明所述“应用”或“用途”，既可以以疾病预防或治疗为目的的应用，也可表示非治疗目的的应用，例如科学研究等。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白，数据显示可以促进活化的CD8+T细胞分化为记忆干细胞样T细胞。
(2)本发明提供的hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白，数据显示可靶向地结合被激活的HIV潜伏感染细胞。
(3)本发明提供的hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白，数据显示可高效结合Fc受体。
(4)本发明提供的hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白，数据显示可有效的中和游离的HIV病毒，阻断新的感染。
(5)本发明提供的hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白，数据显示可有效促进内源性抗体结合到HIV+细胞表面，具有潜在促进ADCC的功能。
(6)本发明提供的hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白，数据显示在体外可以有效的抑制HAART治疗患者的HIV复制。
(7)本发明提供的hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白，数据显示可有效地促进HAART治疗患者的CD8+T细胞更好的杀伤p24+T细胞。
附图说明
图1：hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白示意图及蛋白纯化结果。(A)hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白结构示意图。(B)SDS-PAGE鉴定纯化后的hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白。
图2：hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白显著促进活化的CD8+T细胞分化为记忆干细胞样T细胞。(A)将人的PBMC通过a-CD3/a-CD28刺激48小时后，分别加入sCD4-Fc(20nM)、hIL-21-Fc(20nM)、hIL-21×sCD4-Fc(20nM)刺激分化72h。(B)流式鉴定总的CD8+T上CD45RAhighCCR7high表达。(C)将P14小鼠(针对LCMV病毒gp33抗原的TCR转基因小鼠)的脾细胞用gp33肽段刺激48小时后，分别加入sCD4-Fc(20nM)、hIL-21-Fc(20nM)、hIL-21×sCD4-Fc(20nM)刺激分化72h。(D)流式鉴定CD8+T上CD44lowCD62Lhigh表达。
图3：hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白有效的靶向HIV+细胞。(A)体外检测hIL-21×sCD4-Fc结合经PMA刺激的ACH2细胞实验流程：将ACH2细胞利用10ng/mL PMA刺激48h后，与融合蛋白室温孵育30min，然后再加入a-Flag-PE抗体染色15min，最后流式上机检测。(B)q-PCR检测ACH2细胞经PMA激活后HIV基因转录。(C)流式检测hIL-21×sCD4-Fc与未经刺激或经PMA刺激的ACH2细胞的结合。
图4：hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白与Fc受体结合。(A)融合蛋白结合Fc受体实验流程图：将人单核细胞系Thp-1与融合蛋白共孵育30min，再与对应的荧光二抗共孵育15min，最后流式上机检测。(B)流式检测hIL-21×sCD4-Fc与Thp-1细胞结合。
图5：hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白有效的中和游离的HIV。(A)融合蛋白中和游离HIV的实验流程：将HIV-1病毒与不同浓度hIL-21×sCD4-Fc/sCD4-Fc在37℃共孵育1h后，再感染TZM-bl细胞(1×104)，感染44h后进行荧光素酶活性测定。(B)多功能酶标仪检测萤光素酶活性。
图6：hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白促进HIV患者内源性抗体结合到HIV+细胞表面。(A)融合蛋白促进患者内源性抗体结合到HIV+细胞表面实验流程：PMA刺激ACH2细胞48小时后，加入健康人的血浆(3个样品)或HIV患者的血浆(3个样品)，再加入PBS、hIL-21-Fc或hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白，流式检测ACH2细胞hIgG+细胞。(B)流式结果展示图。(C)统计hIgG+细胞比例。(D)统计hIgG+细胞的MFI。
图7：hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白可以体外抑制HIV复制。(A)融合蛋白抑制HIV复制实验设计流程：将来自HAART治疗患者的PHA blast CD4+细胞与自身来源的经hIL-21-Fc、sCD4-Fc、hIL-21-Fc+sCD4-Fc或hIL-21×sCD4-Fc蛋白预处理5h的CD8+细胞按照1：1进行混合，在第3天对上清进行p24 ELISA测定。(B)ELISA检测共培养第3天细胞上清中的p24含量。
图8：hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白显著促进HIV患者的CD8+T细胞杀伤p24+T细胞。(A)融合蛋白促进HIV患者CD8+T细胞杀伤功能的实验设计流程：将来自HAART治疗患者的PHAblast CD4+细胞与自身来源的经PBS或hIL-21×sCD4-Fc蛋白预处理2.5d的CD8+细胞按照1：10进行混合，共孵育5h后流式上机检测。(B)流式鉴定CD4+T(CD3+CD8-)细胞数量和比例。(C)流式鉴定CD4+T细胞中P24+T细胞的数量和比例。
具体实施方式
通过以下实施对本发明作进一步的详细描述，但应理解本发明不受以下内容所限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
本发明中所涉及的序列如下表1：
表1
序列名称 序列编号
hIL-21-Fc6(hole)的氨基酸序列 SEQ ID NO.1
编码hIL-21-Fc6(hole)的核苷酸序列 SEQ ID NO.2
sCD4-Fc9(Knob)的氨基酸序列 SEQ ID NO.3
编码sCD4-Fc9(Knob)的核苷酸序列 SEQ ID NO.4
hIL-21的氨基酸序列 SEQ ID NO.5
编码hIL-21的核苷酸序列 SEQ ID NO.6
IgG1-Fc6的氨基酸序列 SEQ ID NO.7
编码IgG1-Fc6的核苷酸序列 SEQ ID NO.8
IgG1-Fc9的氨基酸序列 SEQ ID NO.9
编码IgG1-Fc9的核苷酸序列 SEQ ID NO.10
sCD4的氨基酸序列 SEQ ID NO.11
编码sCD4的核苷酸序列 SEQ ID NO.12
下述实施例所涉及的材料、方法：
(1)细胞和试剂：
HEK293T细胞由王丽教授(武汉大学医学研究院)提供，并在DMEM培养基(Sigma，D6429-500mL)中培养。ACH2细胞由张立国教授(中国科学院生物物理所)提供，并在1640培养基(Sigma，R8758-500mL)中培养。TZM-bl细胞由张立国教授(中国科学院生物物理所)提供，并在DMEM培养基(Sigma，D6429-500mL)中培养。HIV患者PBMCs和血浆由武汉大学中南医院熊勇教授提供。健康人PBMC由武汉大学基础医学院医学病毒学研究所候玮教授提供。
(2)hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白的构建：
异源二聚体(hIL-21×sCD4-Fc)：第一多肽为hIL-21通过接头GGGGSGGGGSGGGGS连接到IgG1-Fc6 N端的hIL-21-Fc6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。第二多肽为sCD4通过接头GGGGSGGGGSGGGGS连接到IgG1-Fc9 N端，再与3×flag连接，获得sCD4-Fc9，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。将编码第一多肽和第二多肽的核苷酸序列分别克隆到pEE6.4载体(Lonza)中。hIL-21和sCD4的异二聚化使用之前报道的knob-to-holes技术产生(Ridgway,J.B.,Presta,L.G.&Carter,P.‘Knobs-into-holes’engineering of antibody CH3 domainsfor heavy chain heterodimerization.Protein Engineering,Design and Selection9,617-621(1996).)。质粒比1：1的比例瞬时转染到293T细胞中。转染后，第48h收集上清，用于蛋白纯化。
(3)流式细胞技术：
使用PE-抗Flag抗体(Biolegend，637309)检测融合蛋白的结合。特异性抗体：抗CD3抗体(Biolegend，300411)，抗CD8抗体(Biolegend，344712)，抗CD45Ra抗体(Biolegend，304108)，抗CCR7抗体(Biolegend，353216)，抗人IgG Fc(Biolegend，410711)。细胞悬浮于FACS缓冲液(1％牛血清蛋白)，加入Fc受体阻断溶液(Biolegend，422302)冰上孵育10分钟，再加入对应的特异性抗体冰上孵育30分钟。样品在Fortessa flowcytometer(BD生物科学)上进行分析。使用FlowJo软件(TreeStar)分析数据。
(4)hIL-21×sCD4-Fc促进活化的总CD8+T细胞分化为记忆干细胞样T细胞：
在人PBMC培养体系中加入a-CD3(1μg/mL)/a-CD28(0.5μg/mL)刺激48小时后，清洗并且重悬至5×105/well，分别加入sCD4-Fc(20nM)、hIL-21-Fc(20nM)、hIL-21×sCD4-Fc(20nM)，刺激分化72h后，收集细胞，流式分析CD8+T(CD3+CD8+)细胞表面CCR7和CD45Ra表达。
(5)hIL-21×sCD4-Fc促进活化的特异性CD8+T细胞分化为记忆干细胞样T细胞：
将P14小鼠(针对LCMV病毒gp33抗原的TCR转基因小鼠)的脾细胞用gp33肽段(0.2ng/ml)刺激48小时后，清洗并且重悬至5×105/well，分别加入sCD4-Fc(20nM)、hIL-21-Fc(20nM)、hIL-21×sCD4-Fc(20nM)，刺激分化72h后，收集细胞，流式分析CD8+T(CD3+CD8+)细胞表面CD62L和CD44表达。
(6)hIL-21×sCD4-Fc靶向HIV潜伏感染细胞研究：
取5×105ACH2于48孔板中，加入终浓度为10ng/mL的PMA刺激48h。将PMA激活的ACH2细胞通过trizol法提取总RNA，采用逆转录酶将总RNA逆转录为cDNA，使用GAPDH作为内参，HIV gag mRNA相对表达水平通过SYBR green进行q-PCR。引物如下：GAPDH：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’(forward)和5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’(reverse)；HIVgag：5’-GGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAG-3’(forward)和5’-AGCTCCCTGCTTGCCCATA-3’(reverse)。
收集对照细胞和PMA刺激细胞，用1％的FPBS洗一遍细胞，再加入0.2μg hIL-21-Fc/sCD4-Fc/hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白室温孵育30min，加入1％的FPBS洗一遍细胞，再加入anti-Flag-PE二抗冰上孵育15min，流式上机。
(7)hIL-21×sCD4-Fc与FcR结合研究：
利用人单核细胞来源的Thp-1细胞作为研究对象，该细胞表达人FcR。
取5×104Thp-1细胞，其中一组加入健康人血清(作为Fc block)孵育10min，在向体系中分别加入PBS或0.2μg hIL-21×sCD4-Fc，室温孵育30min，加入1％ FPBS洗一遍，加入anti-Flag-PE二抗冰上孵育15min，流式上机。
(8)hIL-21×sCD4-Fc中和作用研究：
将不同浓度的hIL-21×sCD4-Fc/sCD4-Fc与HIV-1病毒(200PFU)在37℃共孵育1小时后(总体积50μL)，加入104TZM-bl(总体积50μL)细胞。培养48小时，去掉细胞上清，加入50μL裂解液裂解细胞。收集细胞裂解液上清，12000rpm离心5min，取40μL上清，加入50μL萤光素酶检测试剂，用移液器混匀后利用荧光酶标仪进行测定。
(9)hIL-21×sCD4-Fc促进内源性抗体识别HIV+细胞研究：
利用10ng/mL PMA刺激ACH2细胞48h，得到激活ACH2细胞。取5×104激活的ACH2细胞，向其中分别加入健康人或HIV患者血浆(1：500)，再向体系中加入PBS、0.2μg hIL-21-Fc或0.2μg hIL-21×sCD4-Fc，室温孵育30min，加入1％ FPBS洗一遍，加入anti-hIgG-APC二抗冰上孵育15min，流式上机。
(10)hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白体外抑制HIV复制研究：
将来源于HAART治疗患者的PBMC通过MACS分选出CD4+细胞和CD8+细胞，用PHA-P(4μg/mL)和IL-2(100U/mL)活化CD4+细胞48h，得到PHA-blast细胞。0.01MOI进行106PHA-blast细胞/100μL在培养箱中静止感染3h，加入10mL完全培养基洗一遍，得到HIV+PHA-blast细胞。将自身来源的CD8+细胞加入PBS、hIL-21-Fc(20nM)、sCD4-Fc(20nM)、hIL-21-Fc(20nM)+sCD4-Fc(20nM)或hIL-21×sCD4-Fc(20nM)预处理5h，1×105CD8+预处理细胞与1×105HIV+PHA-blast CD4+细胞共培养于96孔板中，培养3天后，收集细胞上清用于p24 ELISA测定。
(11)hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白体外促进CD8+T细胞杀伤p24+T细胞研究：
将来源于HAART治疗患者的PBMC通过MACS分选出CD4+细胞和CD8+细胞，用PHA-P(4μg/mL)和IL-2(100U/mL)活化CD4+细胞48h，得到PHA-blast细胞。0.1MOI进行106PHA-blast细胞/100μL在培养箱中静止感染3h，加入10mL完全培养基洗一遍，得到HIV+PHA-blast细胞，加入IL-2(300U/mL)培养2.5d。将自身来源的CD8+细胞加入PBS、hIL-21×sCD4-Fc(20nM)预处理2.5d，1.5×105CD8+预处理细胞与1.5×104HIV+PHA-blast CD4+细胞共培养于96孔板中，5h后，收集细胞，流式分析CD4+T(CD3+CD8-)细胞内P24表达。
(12)统计分析：
数据显示为平均值。使用不成对的Student’s双尾t检验比较统计学分析。使用GraphPad Prism 9.0版(GraphPad Software)进行分析。用*、**和***分别表示p<0.05、p<0.0l和p<0.001的统计学显著性差异。
实施例1 hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白设计及表达纯化
细胞因子IL-21可以增强CD8+T细胞杀伤功能，并且促进活化的CD8+T细胞分化为记忆干细胞样T细胞。HIV受体分子CD4胞外区sCD4可结合HIV胞膜蛋白，可以发挥靶向和中和HIV病毒的作用。基于此，我们设计了融合蛋白hIL-21×sCD4-Fc。免疫球蛋白Fc区是发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)所必须的结构，并且可以有效的延长融合蛋白的半衰期。因此本发明设计了由hIL-21、sCD4及IgG1-Fc三个功能元件组成的融合蛋白异二聚体hIL-21×sCD4-Fc(图1A)。通过质粒共转染HEK 293T细胞，并利用Flag琼脂糖凝胶珠子纯化，如图1B，可以得到异二聚体hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白。该新型融合蛋白药物可靶向HIV+细胞并中和新产生的游离病毒(sCD4)、增强CD8 T细胞杀伤功能(hIL-21)、介导抗体依赖的细胞毒性作用(Fc)等多种治疗功效。
实施例2 hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白可以促进活化的CD8+T细胞分化为记忆干细 胞样T细胞
在HIV感染中，CD8+T细胞持续的暴露于病毒抗原刺激，发生功能耗竭，其效应功能和再次应答能力降低。即使使用了HAART治疗控制病毒复制，患者CD8+T依然难以彻底恢复其效应功能，难以发挥有效的杀伤作用。因此在恢复或增强CD8+T细胞的功能对治疗HIV至关重要。IL-21可以增强CD8+T细胞的杀伤功能，并且促进活化的CD8+T细胞分化为记忆干细胞样T细胞(TSCM)，TSCM具有干细胞样的自我更新能力，可以维持长期的细胞免疫功能。
为了确定hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白是否具有hIL-21的功能。在体外利用a-CD3/a-CD28刺激健康人的PBMC，获得活化的CD8+T细胞，再利用hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白刺激活化的CD8+T细胞(图2A)。结果显示hIL-21×sCD4-Fc(20nM)可以显著的提高Naive标志蛋白CCR7highCD45Rahigh在人PBMCs来源CD8+T细胞上表达(图2B)。同时利用P14小鼠(针对LCMV病毒gp33抗原的TCR转基因小鼠)的脾细胞用gp33肽段活化特异性的CD8+T细胞，再用hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白刺激活化的特异性CD8+T细胞(图2C)。结果显示hIL-21×sCD4-Fc(20nM)可以显著的提高Naive标志蛋白CD44lowCD62Lhigh在小鼠脾细胞来源CD8+T细胞上表达(图2D)。在同等浓度下，hIL-21×sCD4-Fc相比hIL-21-Fc能够更好的促进CD44lowCD62LhighCD8+T比例(图2D)。上述实验证明hIL-21×sCD4-Fc保留了hIL-21的功能，可以促进活化的CD8+T细胞分化为记忆干细胞样T细胞。
实施例3 hIL-21×sCD4-Fc靶向被激活的HIV潜伏感染细胞
HIV潜伏感染的细胞在特定的条件下会被激活HIV的转录，表达HIV相关的蛋白，如gp160等。其中gp160在高尔基体中加工成熟为gp120和gp41蛋白，gp120和gp41形成复合物会被转运到细胞膜上，因此被激活的HIV潜伏感染细胞表面会出现HIV的包膜蛋白。CD4分子作为HIV的受体，其胞外区(sCD4)可以与HIV包膜蛋白上gp120结合。在本发明中，利用融合蛋白的sCD4结构域来靶向HIV+细胞。
本实施例采用了一种整合了HIV基因组并可模拟HIV潜伏感染的T细胞系ACH2细胞。ACH2细胞经PMA刺激，启动HIV的转录及蛋白表达，利用这一系统检测hIL-21×sCD4-Fc结合被激活的HIV潜伏感染细胞的功能(图3A)。经过PMA(10ng/mL)刺激的ACH2细胞，其HIV相关基因表达上调300倍(图3B)。进一步实验探究，发现hIL-21×sCD4-Fc微弱的结合未经刺激的ACH2细胞(4.45％)。而高达60.4％的激活的ACH2细胞可被hIL-21×sCD4-Fc结合(图3C)。综上结果显示hIL-21×sCD4-Fc可以有效的靶向被激活的HIV病毒库细胞。
实施例4 hIL-21×sCD4-Fc与Fc受体结合
融合蛋白hIL-21×sCD4-Fc中加入免疫球蛋白Fc区，使其通过ADCC的功能杀伤被融合蛋白靶向结合的HIV+细胞。
为了验证融合蛋白Fc区是否正常，体外检测了hIL-21×sCD4-Fc与Thp-1(人单核细胞系)上FcR结合的能力(图4A)。结果证明，hIL-21×sCD4-Fc可通过FcR依赖的方式与Thp-1结合(图4B)。
实施例5 hIL-21×sCD4-Fc中和游离的HIV病毒
在利用“激活”及“清除”策略治疗HIV慢性感染的过程中，被激活的HIV病毒库细胞会产生新的游离病毒可能导致新的感染。本发明融合蛋白中的sCD4能够中和游离的病毒，阻断新的感染。
为了验证融合蛋白中和HIV的功能，将不同浓度hIL-21×sCD4-Fc蛋白与游离HIV病毒颗粒预先孵育后，感染TZM-bl细胞(一种通过改造后高表达CD4、CCR5及CXCR4分子，并整合了受HIV长重复末端控制的萤火虫萤光素酶和大肠杆菌β-半乳糖苷酶报告基因的HeLa细胞系)，通过测定TZM-bl细胞中萤光素酶的活性来检测hIL-21×sCD4-Fc蛋白中和游离HIV病毒的效果(图5A)。如图5B所示，100μg/mL融合蛋白可以有效的中和游离病毒感染TZM-bl细胞，中和效率大约100％，通过计算得融合蛋白得IC50为14.73μg/mL，即hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白在浓度14.73μg/mL时，可以有效地阻断一半的HIV感染。
实施例6 hIL-21×sCD4-Fc促进内源性抗体识别HIV+细胞
HIV患者体内存在着大量针对于HIV胞膜蛋白的内源性抗体，具有识别被HIV感染的细胞表面病毒包膜蛋白的作用。但是，在通常情况下被感染细胞表面的HIV胞膜蛋白处于一种“关闭”的构象，没有暴露胞膜蛋白内部抗原，使许多针对于HIV胞膜蛋白的抗体无法识别被感染的细胞。前期研究表明，sCD4分子可以结合被感染细胞表面的胞膜蛋白，促进胞膜蛋白由“关闭”的构象转化为一种“过度”构象，促进胞膜蛋白的“开放”，从而促进患者体内的针对于胞膜蛋白的内源性抗体相与之结合，并介导ADCC作用，清除被感染的细胞。然而，HIV感染会导致靶细胞CD4分子表达显著降低，被感染细胞表面的HIV胞膜蛋白往往处于一种“关闭”的构象，一部分内源性抗体无法结合，从而逃避ADCC介导的杀伤。
为了验证融合蛋白促进内源性抗体识别HIV+细胞，将hIL-21-Fc、hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白与PMA激活的ACH2细胞进行共孵育，并且加入来自于健康人或HIV患者的血浆，通过测定hIgG+细胞的比例及结合强度，来判断融合蛋白hIL-21×sCD4-Fc是否能促进内源性抗体结合到细胞表面(图6A)。结果显示，在HIV患者血浆中存在一些内源性抗体对HIV+细胞的本底结合，而在健康人血浆中几乎不存在(图6B)。相比于对照组(PBS或0.2μg hIL-21-Fc)，0.2μg hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白可以促进患者内源性抗体结合到HIV+细胞，具体表现为显著增加hIgG+细胞比例及结合强度(图6B-D)。上述结果显示hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白具有促进患者内源性抗体结合到HIV+细胞，并增强ADCC介导杀伤靶细胞的潜在功能。
实施例7 hIL-21×sCD4-Fc可以体外抑制HIV复制
为了进一步确定hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白是否能够更好的抑制HIV复制。如图7A所示，从HAART治疗患者PBMCs中纯化CD4+细胞和CD8+细胞，将HIV感染的PHA-blast CD4+细胞与自身来源的经hIL-21×sCD4-Fc处理5h的CD8+细胞，按照1：1的比例进行共培养。在共培养3d后，对细胞上清中的p24进行测定，发现hIL-21×sCD4-Fc相比PBS、hIL-21-Fc、sCD4-Fc以及hIL-21-Fc+sCD4-Fc可以更好的抑制HIV复制(图7B)。上述结果显示：hIL-21×sCD4-Fc可以更好的在体外抑制HIV的复制。
实施例8 hIL-21×sCD4-Fc促进CD8+T细胞杀伤p24+T细胞
HIV特异性CD8+T细胞在清除HIV感染细胞中发挥着重要的作用。但是在HIV-1慢性感染患者中，其特异性的CD8+T细胞功能耗竭，其效应功能和再次应答能力降低，且无法被HAART治疗彻底恢复。因此恢复HIV特异性CD8+T细胞对治愈HIV有着重要的意义。
为了进一步确定hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白是否能够增强HIV特异性CD8+T细胞功能，从HAART治疗患者PBMCs中纯化CD4+细胞和CD8+细胞，将HIV感染的PHA-blast CD4+细胞与自身来源的经hIL-21×sCD4-Fc处理2.5d的CD8+细胞，按照1：10的比例进行共培养。在共培养5h后，流式检测P24+T细胞(图8A)。结果显示相比PBS处理后，hIL-21×sCD4-Fc处理后，能够降低CD4+T(CD3+CD8-)细胞的比例但数量上没有显著差异(图8B)；而CD4+T(CD3+CD8-)细胞中P24+T细胞比例和数量都显著下降(图8C)。综上结果显示：hIL-21×sCD4-Fc融合蛋白可以显著增强HAART治疗患者CD8+T杀伤p24+T细胞功能。

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于：所述的融合蛋白包含hIL-21、sCD4及免疫球蛋白Fc区三个功能元件；所述的融合蛋白为异源二聚体hIL-21×sCD4-Fc，其包含第一多肽和第二多肽，第一多肽与第二多肽不同；第一多肽自N端至C端顺序包含hIL-21、免疫球蛋白Fc区，第二多肽自N端至C端顺序包含sCD4、免疫球蛋白Fc区；
所述的hIL-21选自人的IL-21；所述的sCD4由CD4胞外区D1D2结构域组成；所述的免疫球蛋白Fc区选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述的CD4选自CD4分子以及CD4分子的突变体。
3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：
所述的hIL-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的sCD4的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述的免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.9所示。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述的异源二聚体hIL-21×sCD4-Fc的第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.编码权利要求1-4任一项所述的融合蛋白的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于：编码所述异源二聚体hIL-21×sCD4-Fc的第一多肽的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述异源二聚体的第二多肽的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.一种载体，其特征在于：所述载体包含权利要求5或权利要求6所述的核酸分子。
8.一种细胞，其特征在于：所述细胞包含权利要求1-4任一项所述的融合蛋白、权利要求5或6所述的核酸分子或权利要求7所述的载体。
9.权利要求1-4任一项所述的融合蛋白、权利要求5或6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体和/或权利要求8所述的细胞在制备预防或治疗HIV感染的药物的应用。
10.一种预防或治疗HIV感染的药物，其特征在于：包含权利要求1-4任一项所述的融合蛋白、权利要求5或6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的细胞。
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