JP2003516741A - コドン最適化ＨＩＶ−１Ｎｅｆ及び修飾ＨＩＶ−１Ｎｅｆを発現するポリヌクレオチドワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＨＩＶ Ｎｅｆ ＤＮＡワクチンを含む医薬組成物とこれらのＤＮＡワクチンの製造及び使用を開示する。本発明のｎｅｆ系ＤＮＡワクチンは脊椎動物生組織、好ましくはヒトに直接投与すると、ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質又はその生体関連部分を発現し、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）を特異的に認識する細胞性免疫応答を誘導する。これらのＤＮＡワクチンのオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ分子はコドン最適化ＨＩＶ−１ Ｎｅｆと、アミノ末端リーダーペプチドの付加、アミノ末端ミリスチル化部位の除去及び／又はＮｅｆジロイシンモチーフの修飾を含むｎｅｆ変異体等の最適化ＨＩＶ−１ Ｎｅｆの誘導体をコードする合成ＤＮＡ分子である。これらの修飾はミリスチル化や宿主ＣＤ４のダウンレギュレーション等のＮｅｆの野生型特性を変えることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の分野 本発明は脊椎動物生組織、好ましくはヒト又は商業的もしくは家畜として重要
な非ヒト哺乳動物等の哺乳動物宿主に直接導入すると、ＨＩＶ Ｎｅｆタンパク
質又はその生体関連部分を動物の体内で発現し、ヒト免疫不全ウイルス−１（Ｈ
ＩＶ−１）を特異的に認識する細胞性免疫応答を誘導するＨＩＶ Ｎｅｆポリヌ
クレオチド医薬製剤とその製造及び使用に関する。本発明のポリヌクレオチドは
コドン最適化ＨＩＶ−１ Ｎｅｆと、ミリスチル化や宿主ＣＤ４のダウンレギュ
レーション等のＮｅｆの野生型特性を変えるｎｅｆ突然変異体を含む最適化ＨＩ
Ｖ−１ Ｎｅｆの誘導体をコードする合成ＤＮＡ分子である。本発明のポリヌク
レオチドワクチンは未感染個体に予防効果を与えるか及び／又は感染個体内のウ
イルス負荷レベルを下げることにより治療効果を提供し、ＨＩＶ−１感染の無症
候期を延ばすと思われる。

【０００２】 発明の背景 ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）は後天性ヒト免疫不全症候群（ＡＩ
ＤＳ）及び関連障害の原因物質である。ＨＩＶ−１はレトロウイルスファミリー
のＲＮＡウイルスであり、全レトロウイルスで５’ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅ
ｎｖ−ＬＴＲ３’構成を示す。プロウイルスとして知られる組込み形ＨＩＶ−１
は約９．８Ｋｂ長である。ウイルスゲノムの各末端は末端反復配列（ＬＴＲ）と
して知られるフランキング配列を含む。ＨＩＶ遺伝子は少なくとも９種のタンパ
ク質をコードし、主要構造タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖ）、調節タン
パク質（Ｔａｔ及びＲｅｖ）及び補助タンパク質（Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ及び
Ｎｅｆ）の３種類に分類される。

【０００３】 ｇａｇ遺伝子は未スプライスウイルスｍＲＮＡから発現されてｐｏｌ遺伝子の
産物であるＨＩＶプロテアーゼによりタンパク分解プロセシングされる５５キロ
ダルトン（ｋＤａ）前駆体タンパク質（ｐ５５）をコードする。成熟ｐ５５タン
パク質産物はｐ１７（マトリックス）、ｐ２４（キャプシド）、ｐ９（ヌクレオ
キャプシド）及びｐ６である。

【０００４】 ｐｏｌ遺伝子はウイルス複製に必要なタンパク質である逆転写酵素、プロテア
ーゼ、インテグラーゼ及びＲＮＡｓｅＨをコードする。これらのウイルスタンパ
ク質はリボソームフレームシフトにより生成される１６０ｋＤａ前駆体タンパク
質であるＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質として発現される。ウイルスにコードさ
れているプロテアーゼはＧａｇ−Ｐｏｌ融合からＰｏｌポリペプチドをタンパク
分解により切断し、更にＰｏｌポリペプチドを切断して成熟タンパク質とし、プ
ロテアーゼ（Ｐｒｏ、Ｐ１０）、逆転写酵素（ＲＴ、Ｐ５０）、インテグラーゼ
（ＩＮ、ｐ３１）及びＲＮＡｓｅＨ（ＲＮＡｓｅ、ｐ１５）活性を提供する。

【０００５】 ｎｅｆ遺伝子はＣＤ４発現のダウンレギュレーション、Ｔ細胞活性化の阻害及
びＨＩＶ感染刺激等の数種の活性をもつことが分かっている初期補助ＨＩＶタン
パク質（Ｎｅｆ）をコードする。

【０００６】 ｅｎｖ遺伝子は１６０キロダルトン（ｋＤａ）前駆体（ｇｐ１６０）として翻
訳された後に細胞プロテアーゼにより切断されて外部１２０ｋＤａエンベロープ
糖タンパク質（ｇｐ１２０）と膜貫通型４１ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（
ｇｐ４１）を生じるウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。ｇｐ１２
０とｇｐ４１は会合したままであり、ウイルス粒子とＨＩＶ感染細胞の表面に見
られる。

【０００７】 ｔａｔ遺伝子はＨＩＶ−１複製に必須の転写トランスアクチベーターであるＲ
ＮＡ結合タンパク質であるＴａｔタンパク質の短形態と長形態をコードする。

【０００８】 ｒｅｖ遺伝子はＲＮＡ結合タンパク質である１３ｋＤａ Ｒｅｖタンパク質を
コードする。Ｒｅｖタンパク質はＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）と呼ばれるウ
イルスＲＮＡの領域と結合する。Ｒｅｖタンパク質は核から細胞質への未スプラ
イシングウイルスＲＮＡの移動を助長する。Ｒｅｖタンパク質はＨＩＶ後期遺伝
子発現に必要であり、従って、ＨＩＶ複製に必要である。

【０００９】 ｇｐ１２０は他のコレセプター分子以外にヘルパーＴリンパ球、マクロファー
ジ及び他のターゲット細胞の表面に存在するＣＤ４／ケモカインレセプターと結
合する。Ｘ４（向マクロファージ性）ウイルスはＣＤ４／ＣＸＣＲ４複合体に向
性を示し、Ｒ５（向Ｔ細胞系性）ウイルスはＣＤ４／ＣＣＲ５レセプター複合体
と相互作用する。ｇｐ１２０がＣＤ４と結合した後、ｇｐ４１はウイルス侵入の
原因となる融合を媒介する。ウイルスはターゲット細胞と融合してこれに侵入し
、その後、その１本鎖ＲＮＡゲノムはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより２
本鎖ＤＮＡに逆転写される。プロウイルスとして知られるウイルスＤＮＡは細胞
核に侵入し、ここでウイルスＤＮＡは核内で新規ウイルスＲＮＡの増殖、初期及
び後期ＨＩＶウイルスタンパク質の発現、次いで新規ウイルス粒子の産生と細胞
内放出を誘導する。近年、宿主体内のウイルス負荷を検出する技術が進歩した結
果、一次感染によるウイルスの非常に高度な生成と組織分布を生じた後に（この
期間も継続的ウイルス産生とターンオーバーは続くが）ウイルスが定常状態レベ
ルとなり、最終的にウイルス負荷が激増して臨床ＡＩＤＳの発病に至ることが分
かっている。増殖性感染細胞の半減期は数日間であり、慢性又は潜在感染細胞の
半減期は３週間であり、これに続く非増殖性感染細胞は半減期が長い（１００日
を越える）が、全疾病期間を通して見られる日々のウイルス負荷はさほど増加し
ない。

【００１０】 免疫防御に非常に重要なＣＤ４ヘルパーＴリンパ球の破壊はＨＩＶ感染の特徴
である進行性免疫機能不全の主要原因である。ＣＤ４Ｔ細胞が減少すると、身体
の殆どの侵入物に対する抵抗力は著しく低下するが、ウイルス、真菌、寄生虫及
び所定細菌（例えばマイコバクテリア）に対する防御に特に重大な影響がある。

【００１１】 最近ではＨＩＶ−１感染個体に有効な治療薬が入手可能になっている。しかし
、これらの薬剤は世界の多くの場所でこの疾患に顕著な効果があるのではなく、
人口母集団で感染の伝搬を止めるのに最小限の効果しかない。他の多くの感染性
疾患と同様に、有効なワクチンの開発と導入なしにＨＩＶ−１感染の伝搬に顕著
な疫学的効果は得られない。今まで有効なワクチン開発に至っていないのは多く
の理由がある。上述のように、慢性感染者では抗ＨＩＶ−１体液性及び細胞性免
疫応答の存在とウイルス感染細胞の破壊にも拘わらず、定常的ウイルス生産が存
在することが現在明らかである。他の感染性疾患の場合と同様に、疾患転帰は免
疫応答の速度及び大きさと病原体複製速度及び免疫応答アクセシビリティのバラ
ンスの結果である。定着感染に対して生じる免役応答よりも急性感染に対する既
存免疫のほうが有効な場合がある。第２の要因はウイルスの遺伝子変動が大きい
ことである。細胞培養でＨＩＶ−１感染性を中和することができる抗ＨＩＶ−１
抗体は存在するが、これらの抗体は一般にその活性がウイルス分離株に特異的で
ある。従来方法を使用してＨＩＶ−１の血清学的群別を決定するのは不可能であ
ることが分かっている。逆に、ウイルスは個々の中和抗体応答がせいぜい少数の
ウイルス変異体にしか有効でないように血清学的「連続」を形成するように思わ
れる。この点に鑑みると、抗ＨＩＶ−１細胞性免疫応答を誘導する可能性のある
免疫原と関連送達技術を同定することが有用であろう。ＣＴＬ応答を生じるため
には、抗原を細胞内で合成するか又は細胞に導入した後、プロテアソーム複合体
によりプロセシングして小ペプチドとし、小胞体／ゴルジ体分泌経路に送り、最
終的に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質と会合させる必要が
あることが知られている。ＣＤ８^＋Ｔリンパ球はＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と
ＣＤ８細胞表面タンパク質を介してクラスＩＭＨＣと会合した抗原を認識する。
ナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化して活性化エフェクター又はメモリー細胞とす
るには、一般に上記のような抗原のＴＣＲ関与と同時刺激タンパク質の関与の両
者が必要である。ＣＴＬ応答の最適誘導にはＴＣＲ及びＣＤ４関与を介してＭＨ
ＣクラスＩＩ分子と会合した抗原を認識するＣＤ４^＋Ｔリンパ球からのサイトカ
イン形態の「補助」が一般に必要である。

【００１２】 冒頭に述べたように、ｎｅｆ遺伝子はＣＤ４発現のダウンレギュレーション、
Ｔ細胞活性化の妨害及びＨＩＶ感染性の刺激等の数種の活性をもつことが分かっ
ている初期補助ＨＩＶタンパク質（Ｎｅｆ）をコードする。Ｚａｚｏｐｏｕｌｏ
ｓとＨａｓｅｌｔｉｎｅ（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
８９：６６３４−６６３８）はウイルス複製速度を変えるＨＩＶ−１ ｎｅｆ遺
伝子の突然変異を開示している。同著者によると、Ｇｌｙ−２の代わりにＡｌａ
−２をコードするように突然変異させたｎｅｆオープンリーディングフレームは
タンパク質のミリスチル化を阻害し、その結果、ジャーカット細胞とＰＢＭＣに
おけるウイルス複製速度が低下する。

【００１３】 Ｋａｍｉｎｃｈｉｋら（１９９１，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５（２）：５８
３−５８８）はＭｅｔ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙの代わりにＭｅｔ−Ａｌａ−Ａｌａをコ
ードするように突然変異させたアミノ末端ｎｅｆオープンリーディングフレーム
を開示している。同著者によると、この突然変異体はミリスチル化が不十分であ
る。

【００１４】 Ｓａｋｓｅｌａら（１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１４（３）：４８４−４９１）
とＬｅｅら（１９９５，ＥＭＢＯ Ｊ．１４（２０）：５００６−５０１５）は
Ｈｃｋタンパク質のＳＨ３ドメインとの結合を媒介するプロリン高含有モチーフ
のＨＩＶ−１ Ｎｅｆにおける重要性を示している。同著者はこのモチーフがウ
イルス複製の増進に重要であるが、ＣＤ４発現のダウンレギュレーションには重
要でないと結論している。

【００１５】 Ｃａｌａｒｏｔａら（１９９８，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３５１：１３２０−
１３２５）は野生型Ｎｅｆを発現するＤＮＡプラスミドで３人のＨＩＶ感染個体
を免疫したヒト臨床データを示している。同著者はＮｅｆをコードするＤＮＡプ
ラスミドで免疫すると３人の個体で細胞性免疫応答が誘導されたと結論している
。しかし、３人の患者のうちの２人は試験中に他の治療を受けており、同著者は
ＣＴＬ応答が既存ＣＴＬ応答を促進した可能性が高いと結論している。更に、試
験期間中に３人の患者のうちの２人でウイルス負荷が実質的に増加している。

【００１６】 Ｔｏｂｅｒｙら（１９９７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（５）：９０９−９
２０）はＮｅｆ開始メチオニンをコードするものとＮｅｆオープンリーディング
フレームのアミノ末端にＡｒｇ残基をもつものとの２種のユビキチン−ｎｅｆ（
Ｕｂ−ｎｅｆ）融合構築物を構築した。同著者はアミノ末端にＡｒｇ残基を含む
Ｕｂ−ｎｅｆ構築物でワクシニア又はプラスミドを介してマウスを免疫するとＮ
ｅｆ特異的ＣＴＬ応答が誘導されると述べている。同著者は発現された融合タン
パク質がより効率的にＭＨＣクラスＩ抗原提示経路に提示され、その結果、細胞
性免疫応答が改善されると示唆している。

【００１７】 Ｋｉｍら（１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８（２）：８１６−８２６）
はＩＬ−１２を発現するプラスミドＤＮＡ構築物とＮｅｆを発現するプラスミド
構築物を同時投与すると、Ｎｅｆ構築物を単独接種した場合に比較してマウスの
細胞性免疫応答が改善されることを開示している。同著者の報告によると、Ｎｅ
ｆ／ＩＬ−１２同時投与からの体液性応答はＮｅｆを発現するプラスミド構築物
の単独投与に比較して低下する。

【００１８】 Ｍｏｙｎｉｅｒら（１９９８，Ｖａｃｃｉｎｅ １６（１６）：１５２３−１
５３０）はＮｅｆをコードするＤＮＡプラスミドで免疫したマウスの体液性応答
がフロイントアジュバントの有無に応じて変化することを示している。上記ＤＮ
Ａ構築物を単独でワクチン接種したマウスの細胞性免疫応答に関するデータは開
示されていない。

【００１９】 Ｈａｎｎａら（１９９８，Ｃｅｌｌ ９５：１６３−１７５）は野生型Ｎｅｆ
がＡＩＤＳ発病に重要な役割を果たすらしいと示唆している。

【００２０】 ＡＩＤＳと闘うにはＨＩＶ感染に対して強い細胞性免疫応答を生じる予防及び
／又は治療型ＨＩＶワクチンを製造することが極めて重要である。本発明は初期
ＨＩＶ遺伝子であるｎｅｆの宿主送達と発現に基づく類のＤＮＡワクチンを開示
することによりこの必要に取組み、これに応えるものである。

【００２１】 発明の要約 本発明は霊長類、特にヒトと商業的もしくは家畜として重要な非ヒト哺乳動物
を含む哺乳動物宿主等の宿主に投与すると、ＣＴＬ応答を誘導する合成ＤＮＡ分
子（本明細書では「ポリヌクレオチド」とも言う）及び関連ＤＮＡワクチン（本
明細書では「ポリヌクレオチドワクチン」とも言う）に関する。本発明のＣＴＬ
指向ワクチンは未感染個体への伝達速度を低下させるか及び／又は感染個体内の
ウイルス負荷レベルを下げ、ＨＩＶ−１感染の無症候期を延ばすと思われる。特
に、本発明は種々の形態のＨＩＶ−１ Ｎｅｆをコードし、目的ＨＩＶ−１ ｎ
ｅｆ遺伝子の投与、細胞内送達及び発現により宿主ＣＴＬ及びＴｈ応答を誘導す
るＤＮＡワクチンに関する。本発明の好ましい合成ＤＮＡ分子はコドン最適化形
態の野生型ＨＩＶ−１ Ｎｅｆ、コドン最適化形態のＨＩＶ−１ Ｎｅｆ融合タ
ンパク質及びコドン最適化形態のＨＩＶ−１ Ｎｅｆ誘導体（例えばアミノ末端
リーダー配列の導入、アミノ末端ミリスチル化部位の除去及び／又はジロイシン
モチーフ突然変異の導入を含むｎｅｆ変異体が挙げられるが、これらに限定され
ない）をコードする。本明細書に開示するＮｅｆ系融合及び改変タンパク質は宿
主ＭＨＣ Ｉ複合体に適正に提示され、宿主ＣＴＬ及びＴｈ応答を誘導する能力
を維持しながら改変トラフィッキング及び／又は宿主細胞機能をもつことができ
る。

【００２２】 本発明の特定態様はＨＩＶ−１ ｊｆｒｌ分離株からのＨＩＶ−１ Ｎｅｆを
コードし、コドンがヒト等の哺乳動物系で発現されるように最適化されたＤＮＡ
分子に関する。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子を本明細書では配列番号
１として開示し、発現されるオープンリーディングフレームを本明細書では配列
番号２として開示する。

【００２３】 本発明の別態様はＨＩＶ−１ ＮｅｆポリペプチドのＮＨ_２末端に融合したヒ
トプラスミノーゲンアクチベーター（ｔｐａ）リーダーペプチドを含むタンパク
質をコードするコドン最適化ＤＮＡ分子に関する。このタンパク質をコードする
ＤＮＡ分子を本明細書では配列番号３として開示し、発現されるオープンリーデ
ィングフレームを本明細書では配列番号４として開示する。

【００２４】 付加態様では、本発明はオープンリーディングフレームがアミノ末端ミリスチ
ル化部位の変異（Ｇｌｙ−２→Ａｌａ−２）とＬｅｕ−１７４−Ｌｅｕ１７５ジ
ロイシンモチーフからＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５への置換をコードする最
適化ＨＩＶ−１ ＮｅｆをコードするＤＮＡ分子に関し、この分子を本明細書で
ｏｐｔ ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）と言う。このタンパク質をコードするＤＮ
Ａ分子を本明細書では配列番号５として開示し、発現されるオープンリーディン
グフレームを本明細書では配列番号６として開示する。

【００２５】 本発明の別の付加態様はアミノ末端ミリスチル化部位とジロイシンモチーフを
欠失しており、ｔＰＡリーダーペプチドを含む最適化ＨＩＶ−１ Ｎｅｆをコー
ドするＤＮＡ分子に関する。このＤＮＡ分子ｏｐｔ ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）
はＨＩＶ−１ Ｎｅｆ（ｊｆｒｌ）のアミノ酸残基６〜２１６に融合したｔＰＡ
リーダー配列を含み、Ｌｅｕ−１７４とＬｅｕ１７５をＡｌａ−１７４とＡｌａ
−１７５で置換したＮｅｆタンパク質をコードするオープンリーディングフレー
ムを含み、この分子を本明細書ではｏｐｔ ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）と言い、
このタンパク質をコードするＤＮＡ分子を本明細書では配列番号７として開示し
、発現されるオープンリーディングフレームを本明細書では配列番号８として開
示する。

【００２６】 本発明は本明細書に開示するＨＩＶ Ｎｅｆタンパク質の種々の野生型及び修
飾型をコードする非コドン最適化形態のＤＮＡ分子と関連ＤＮＡワクチンにも関
する。部分又は完全コドン最適化ＤＮＡワクチン発現ベクター構築物が好ましい
が、本明細書に開示する構築物の「非コドン最適化」形態、特に宿主投与後に実
質的な細胞性免疫応答を助長することが明らかなＨＩＶ Ｎｅｆの修飾形態を使
用することも本発明の範囲に含まれる。

【００２７】 本発明のＤＮＡワクチンのＤＮＡ骨格はＤＮＡプラスミド発現ベクターが好ま
しい。本発明で使用されるＤＮＡプラスミド発現ベクターとしては、イントロン
Ａ配列を含むサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ｉｎｔＡ）とウシ成
長ホルモン転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。更に、本発明
のＤＮＡプラスミドベクターは抗生物質耐性マーカーを含むことが好ましく、例
えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子又は他の任意の医薬的に
許容可能な抗生物質耐性マーカーが挙げられるが、これらに限定されない。更に
、適当なポリリンカークローニング部位と原核複製配列起点も好ましい。本発明
の特定ＤＮＡベクターとしてはＶ１、Ｖ１Ｊ（配列番号１４）、Ｖ１Ｊｎｅｏ（
配列番号１５）、Ｖ１Ｊｎｓ（図１Ａ、配列番号１６）、Ｖ１Ｒ（配列番号２６
）、及びリーダーペプチド、好ましくはヒトｔＰＡリーダーをコードするヌクレ
オチド配列をＣＭＶ−ｉｎｔＡプロモーターの下流に直接融合した上記ベクター
の任意のもの（例えば図１Ｂと配列番号１９に示すようなＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａが
挙げられるが、これに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。

【００２８】 本発明は特にＤＮＡワクチンとこのＤＮＡワクチンを含む医薬的に活性なワク
チン組成物、及びＨＩＶ感染を予防又はＨＩＶ発症と闘うための宿主免疫、好ま
しくはヒト宿主免疫用予防及び／又は治療ワクチンとしての使用に関する。これ
らのＤＮＡワクチンは機能的リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を
加えるか又は加えない適当なＤＮＡプラスミドベクター内に連結した生物活性Ｎ
ｅｆ修飾体又はＮｅｆ含有融合タンパク質のＨＩＶ−１ Ｎｅｆをコードするコ
ドン最適化ＤＮＡ分子である。本発明のＤＮＡワクチンはＤＮＡベクターＶ１、
Ｖ１Ｊ（配列番号１４）、Ｖ１Ｊｎｅｏ（配列番号１５）、Ｖ１Ｊｎｓ（図１Ａ
、配列番号１６）、Ｖ１Ｒ（配列番号２６）又はリーダーペプチド、好ましくは
ヒトｔＰＡリーダーをコードするヌクレオチド配列をＣＭＶ−ｉｎｔＡプロモー
ターの下流に直接融合した上記ベクターの任意のもの（例えば図１Ｂと配列番号
１９に示すようなＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａが挙げられるが、これに限定されない）に
連結した生物活性Ｎｅｆ変異体又はＮｅｆ含有融合タンパク質のＨＩＶ−１ Ｎ
ｅｆをコードするコドン最適化ＤＮＡ分子にも関する。本発明の特に好ましいＤ
ＮＡワクチンとしては実施例２に例示するようなコドン最適化ＤＮＡワクチン構
築物Ｖ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅ
ｆ（ＬＬＡＡ）及びＶ１Ｊｎｓ／（Ｇ２Ａ ＬＬＡＡ）が挙げられるが、これら
に限定されない。

【００２９】 本発明は接種に対する体液性応答を増すことにより本発明のＤＮＡポリヌクレ
オチドワクチンの免疫原性を増加することが可能なアジュバントを加えてＤＮＡ
ワクチンを処方したＨＩＶ Ｎｅｆポリヌクレオチド医薬製剤とその製造及び使
用にも関する。好ましいアジュバントはリン酸アルミニウム系アジュバント又は
リン酸カルシウム系アジュバントであり、リン酸アルミニウムアジュバントが特
に好ましい。別の好ましいアジュバントは非イオンブロックコポリマーであり、
ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーのようにポリオキシエチレン（ＰＯ
Ｅ）とポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）のブロックを含むものが好ましい。本明
細書に開示するＤＮＡワクチンにこれらのアジュバントを加えた形態は適当な細
胞性免疫応答に負の効果を与えることなくＤＮＡワクチン接種に対する体液性応
答を増すのに有用である。

【００３０】 本明細書で使用するＤＮＡワクチン又はＤＮＡポリヌクレオチドワクチン又は
ポリヌクレオチドワクチンとは脊椎動物生細胞に導入すると本発明の各種ｎｅｆ
遺伝子によりコードされる翻訳産物を細胞機構に生産させることができるような
必須調節エレメントを含むＤＮＡ分子（即ち「核酸」、「ポリヌクレオチド」）
である。

【００３１】 図面の簡単な説明 図１Ａ〜ＢはＨＩＶ−１ ｎｅｆ及びＨＩＶ−１修飾ｎｅｆ構築物に使用した
ＤＮＡワクチン発現ベクターＶ１Ｊｎｓ（Ａ）及びＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａの模式図
を示す。

【００３２】 図２Ａ〜Ｂは野生型ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）とコドン最適化ｎｅｆのヌクレオチド
配列比較を示す。ｊｒｆｌ分離株からの野生型ｎｅｆ遺伝子は２１６アミノ酸ポ
リペプチドをコードすることが可能な６４８ヌクレオチドから構成される。ＷＴ
は野生型配列（配列番号９）、ｏｐｔは（配列番号１に含まれる）コドン最適化
配列を示す。Ｎｅｆアミノ酸配列は１文字コードで示す（配列番号２）。

【００３３】 図３Ａ〜Ｃはｎｅｆ発現ベクターＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（図３Ａ）、Ｖ１Ｊｎｓ
／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（図３Ｂ）、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（図３Ｃ
）及びＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）（同じく図３Ｃ）のｎｅｆコード
配列とプラスミド骨格の結合部のヌクレオチド配列を示す。コドン最適化ｎｅｆ
又はコドン最適化ｎｅｆ突然変異遺伝子の５’及び３’フランキング配列を太字
／斜体で示し、ｎｅｆ及びｎｅｆ突然変異体コード配列を細字で示す。各ｎｅｆ
発現ベクターの構築に使用した制限エンドヌクレアーゼ部位も（下線で）示す。
Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆとＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）は結合部に
同一配列をもつ。

【００３４】 図４はｎｅｆ及びｎｅｆ誘導体の模式図を示す。Ｎｅｆ誘導体に含まれるアミ
ノ酸残基を示す。グリシン２とロイシン１７４及び１７５は夫々ミリスチル化と
ジロイシンモチーフに関与する部位である。ｔｐａｎｅｆ融合遺伝子の両形態で
は推定リーダーペプチド切断部位を「＊」で示し、突然変異体の構築中に導入さ
れた外来セリン残基を下線で示す。

【００３５】 図５はトランスフェクトした２９３細胞で発現されたｎｅｆ及び修飾ｎｅｆタ
ンパク質のウェスタンブロット分析を示す。１００ｍｍ培養皿で増殖させた２９
３細胞に各種コドン最適化ｎｅｆ構築物をトランスフェクトした。トランスフェ
クションから６０時間後に上清と細胞を別々に集め、減圧条件下に１０％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、いずれも２０００倍に
希釈したＧａｇ ｍＡｂとＮｅｆ ｍＡｂの混合物でプローブした。タンパク質
シグナルはＥＣＬで検出した。（Ａ）Ｖ１Ｊｎｓ／ｇａｇ単独をトランスフェク
トした細胞、（Ｂ）Ｖ１Ｊｎｓ／ｇａｇとＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆをトランスフェク
トした細胞、（Ｃ）Ｖ１Ｊｎｓ／ｇａｇとＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡ
Ａ）をトランスフェクトした細胞、（Ｄ）Ｖ１Ｊｎｓ／ｇａｇとＶ１Ｊｎｓ／ｔ
ｐａｎｅｆをトランスフェクトした細胞、（Ｅ）Ｖ１Ｊｎｓ／ｇａｇとＶ１Ｊｎ
ｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）をトランスフェクトした細胞。下段の文字ｃ及び
ｍは夫々細胞フラクションと培地フラクションを表す。Ｍ．Ｗ．＝分子量マーカ
ー。

【００３６】 図６はＮｅｆペプチドに対する細胞媒介応答のＥｌｉｓｐｏｔアッセイを示す
。Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６及びＣ３Ｈの３種のマウスをＶ１Ｊｎｓ／ｎｅ
ｆ（コドン最適化）５０μｇで免疫し、２週間隔で２回ブースター免疫した。最
終免疫から２週間後に脾細胞を抽出し、各種Ｎｅｆペプチドプールに対してＥｌ
ｉｓｐｏｔアッセイで試験した。対照として非免疫ナイーブマウスから脾細胞を
抽出して平行試験した。ＮｅｆペプチドプールＡは全２１種のＮｅｆペプチドか
ら構成され、ＮｅｆペプチドプールＢは残基１から開始する１１種のオーバーラ
ップしないペプチドから構成され、ＮｅｆペプチドプールＣは残基１１から開始
する１０種のオーバーラップしないペプチドから構成される。ＳＦＣはＩＮＦ−
γ分泌スポット形成細胞である。

【００３７】 図７Ａ〜ＣはＮｅｆ特異的ＣＤ８及びＣＤ４エピトープマッピングを示す。免
疫手順は図６に示した通りである。マウス脾細胞を抽出し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの
磁気細胞分離器を使用してＣＤ８^＋細胞とＣＤ８⁻細胞に分画した。次に、得ら
れたＣＤ８^＋細胞とＣＤ８⁻細胞を各Ｎｅｆペプチドに対してＥｌｉｓｐｏｔア
ッセイで試験した。ＳＦＣはＩＮＦ−γ分泌スポット形成細胞である。試験した
マウス系統はＢａｌｂ／ｃマウス（図７Ａ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（図７Ｂ）
及びＣ３Ｈマウス（図７Ｃ）である。

【００３８】 図８Ａ〜ＣはＮｅｆ ＣＴＬエピトープの同定を示す。ｎｅｆで免疫したＣ５
７ＢＬ／６マウスからの脾細胞をペプチドバルス放射線照射ナイーブ脾細胞で７
日間ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に細胞を回収し、ペプ
チドパルスＥＬ−４細胞をターゲットとして使用して標準^５１Ｃｒ放出アッセイ
で試験した。白記号はペプチドの不在下のＥＬ−４細胞の特異的死滅率であり、
黒記号はペプチドの存在下のＥＬ−４細胞の特異的死滅率である。パネルＡはペ
プチドＮｅｆ５１〜７０、パネルＢはペプチドＮｅｆ６０〜６８、パネルＣはペ
プチドＮｅｆ５８〜７０である。

【００３９】 図９Ａ〜ＢはＮｅｆと修飾型Ｎｅｆを発現するコドン最適化ＤＮＡワクチンベ
クターの免疫原性の比較を示す。各群５頭のＣ５７ＢＬ／６マウスを指定ｎｅｆ
構築物１００μｇで免疫した。免疫から１４日後に脾細胞を集め、Ｎｅｆ ＣＤ
８（ａａ５８〜６６）及びＣＤ４（ａａ８１〜１００）ペプチドに対して試験し
た。両方の実験に同一免疫手順を使用した。実験１（パネルＡ）ではＶ１Ｊｎｓ
／ｎｅｆ、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）及びＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ
２Ａ，ＬＬＡＡ）の３種のコドン最適化ｎｅｆ構築物を試験し、実験２（パネル
Ｂ）では全４種のコドン最適化ｎｅｆ構築物を試験した。データは各群５頭のマ
ウスの平均＋標準偏差を表す。

【００４０】 発明の詳細な説明 本発明は霊長類、特にヒトを含む宿主に投与すると、ＣＴＬ及び体液性応答を
誘導する合成ＤＮＡ分子（本明細書では「核酸分子」又は「ポリヌクレオチド」
とも言う）及び関連ＤＮＡベクターワクチン（本明細書では「ポリヌクレオチド
ワクチン」とも言う）に関する。特に、本発明は種々の形態のＨＩＶ−１ Ｎｅ
ｆをコードし、目的ＨＩＶ−１ ｎｅｆ遺伝子の投与、細胞内送達及び発現によ
り宿主ＣＴＬ及びＴｈ応答を誘導するＤＮＡベクターワクチンに関する。本発明
の合成ＤＮＡ分子はコドン最適化形態の野生型ＨＩＶ−１ Ｎｅｆ、コドン最適
化形態のＨＩＶ−１ Ｎｅｆ融合タンパク質及びコドン最適化形態のＨＩＶ−１
Ｎｅｆ誘導体（例えばアミノ末端リーダー配列の導入、アミノ末端ミリスチル
化部位の除去及び／又はジロイシンモチーフ突然変異の導入を含むｎｅｆ修飾体
が挙げられるが、これらに限定されない）をコードする。場合により、本明細書
に開示するＮｅｆ系融合及び改変タンパク質は宿主ＭＨＣ Ｉ複合体に適正に提
示される能力を維持しながら改変トラフィッキング及び／又は宿主細胞機能をも
つ。当業者に自明の通り、ＨＩＶ−１ Ｎｅｆに類似の機能をもつＮｅｆタンパ
ク質を発現するＨＩＶ−２株からのｎｅｆ遺伝子を使用してもＨＩＶ−１構築物
について本明細書に記載すると同様の免疫応答を生じると期待される。

【００４１】 ＣＴＬ応答を生じるためには、免疫原を細胞内で合成する（ＭＨＣＩ提示）か
又は細胞に導入する（ＭＨＣＩＩ提示）必要がある。細胞内合成免疫原では、タ
ンパク質を発現させた後にプロテアソーム複合体によりプロセシングして小ペプ
チドとし、小胞体／ゴルジ体分泌経路に送り、最終的に主要組織適合性複合体（
ＭＨＣ）クラスＩタンパク質と会合させる。ＣＤ８^＋Ｔリンパ球はＴ細胞レセプ
ター（ＴＣＲ）を介してクラスＩＭＨＣと会合した抗原を認識する。ナイーブＣ
Ｄ８^＋Ｔ細胞を活性化して活性化エフェクター又はメモリー細胞とするには、一
般に上記のような抗原のＴＣＲ関与と同時刺激タンパク質の関与の両者が必要で
ある。ＣＴＬ応答の最適誘導にはＴＣＲを介してＭＨＣクラスＩＩ分子と会合し
た抗原を認識するＣＤ４^＋Ｔリンパ球からのサイトカイン形態の「補助」が一般
に必要である。

【００４２】 ＨＩＶ−１ゲノムは高度に発現されるヒト遺伝子に比較して主に低頻度のコド
ンを使用する。従って、ヒト発現に最適なコドンを使用してｎｅｆオープンリー
ディングフレームを合成操作した。上述のように、本発明の好ましい態様は完全
長ｎｅｆをコードするか本明細書に記載するような変異又は融合をコードするか
に拘わらずＨＩＶ−１ ｎｅｆオープンリーディングフレームを含み、コドン使
用を哺乳動物、特にヒトでの発現に最適化したＤＮＡ分子に関する。

【００４３】 本発明の特定態様はＨＩＶ−１ ｊｆｒｌ分離株からのＨＩＶ−１ Ｎｅｆを
コードし、コドンがヒト等の哺乳動物系で発現されるように最適化されたＤＮＡ
分子に関する。コドン最適化形態のＨＩＶ−１ ｊｆｒｌ ｎｅｆ遺伝子のヌク
レオチド配列を本明細書では下記配列番号１として開示する。

【００４４】

【化１】

【００４５】 図２Ａ〜Ｂで天然と最適化コドン使用を比較すると明らかなように、哺乳動物
最適化には次のコドン使用が好ましい：Ｍｅｔ（ＡＴＧ）、Ｇｌｙ（ＧＧＣ）Ｌ
ｙｓ（ＡＡＧ）、Ｔｒｐ（ＴＧＧ）、Ｓｅｒ（ＴＣＣ）、Ａｒｇ（ＡＧＧ）、Ｖ
ａｌ（ＧＴＧ）、Ｐｒｏ（ＣＣＣ）、Ｔｈｒ（ＡＣＣ）、Ｇｌｕ（ＧＡＧ）、Ｌ
ｅｕ（ＣＴＧ）、Ｈｉｓ（ＣＡＣ）、Ｉｌｅ（ＡＴＣ）、Ａｓｎ（ＡＡＣ）、Ｃ
ｙｓ（ＴＧＣ）、Ａｌａ（ＧＣＣ）、Ｇｌｎ（ＣＡＧ）、Ｐｈｅ（ＴＴＣ）及び
Ｔｙｒ（ＴＡＣ）。哺乳動物（ヒト）コドン最適化に関するその他の考察につい
ては参考資料として本明細書に組込むＷＯ９７／３１１１５（ＰＣＴ／ＵＳ９７
／０２２９４）を参照されたい。

【００４６】 上記配列番号１のオープンリーディングフレームはヌクレオチド１２〜１４の
開始メチオニン残基とヌクレオチド６６０〜６６２の「ＴＡＡ」停止コドンを含
む。配列番号１のオープンリーディングフレームはコドン最適化ＤＮＡワクチン
ベクターの使用により発現される２１６アミノ酸ＨＩＶ−１ Ｎｅｆタンパク質
を提供する。２１６アミノ酸ＨＩＶ−１ Ｎｅｆ（ｊｆｒｌ）タンパク質を本明
細書では下記配列番号２として開示する。

【００４７】

【化２】

【００４８】 ＨＩＶ−１ ＮｅｆはＧｌｙ−２のミリスチル化により宿主細胞原形質膜の内
面と会合する２０６アミノ酸サイトゾルタンパク質である（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ
ら，１９８６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５５：５９３−５９９）。考えられる全Ｎ
ｅｆ機能が解明されている訳ではないが、ＨＩＶ−１生活環の初期段階を助長す
るように宿主細胞内環境を改変すると共に子孫ウイルス粒子の感染性を増すこと
によりＮｅｆを内部原形質膜に正しくトラフィッキングすると、ウイルス複製が
促進されることが明らかになっている。コドン最適化タンパク質修飾ポリペプチ
ドに関する本発明の１側面では、発現されるタンパク質のアミノ末端領域がリー
ダーペプチドを含むように異種リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含むようにＤＮＡワクチンベクター分子又はＨＩＶ−１ ｎｅｆ構築物を修飾
する。真核細胞の特徴である機能の多様性はその膜境界の構造差に依存する。こ
れらの構造を生成及び維持するためには、小胞体内のその合成部位から細胞内を
予定された目的地までタンパク質を輸送しなければならない。このためには、ト
ラフィッキングタンパク質が主トラフィッキング経路までのアクセス点に配置さ
れた経路選択に関与する分子機構により認識される選別シグナルを示す必要があ
る。殆どのタンパク質はその機能を実施する細胞部位であるその最終目的地がそ
の永住地になるので、生合成経路を通る間に一度だけ選別決定を行う必要がある
。細胞内完全性の維持はタンパク質の選択的選別とその正しい目的地への正確な
輸送にも依存する。「アドレスラベル」として作用することが可能なタンパク質
には明確な配列モチーフが存在する。膜タンパク質の細胞質ドメインに関連して
多数の選別シグナルが見出されている。ＣＴＬ応答を有効に誘導するには、多く
の場合に抗原の高レベル内因性発現を維持することが必要であった。その生体活
性の多様性に鑑みて、野生型Ｎｅｆから構成されるワクチンは宿主細胞に潜在的
に有害な作用があると思われる。ミリスチル化による膜会合はＮｅｆ機能の大半
の必須要件であるので、本明細書に記載するようにグリシン→アラニン置換、ジ
ロイシンモチーフの変異及び／又はｔｐａリーダー配列置換によりミリスチル化
を欠失する突然変異体は機能的に欠損しており、従って、野生型Ｎｅｆと比較し
てＨＩＶ−１ワクチン成分として使用するために安全性プロフィルが改善される
。

【００４９】 本発明のこの部分の好ましい例示態様では、ヒト組織特異的プラスミノーゲン
アクチベーター（ｔＰＡ）リーダーを含むようにＤＮＡベクター又はＨＩＶ−１
ｎｅｆヌクレオチド配列を改変する。ＤＮＡベクターＶ１Ｊｎｓについて図１
Ａ〜Ｂに示すように、本発明を実施するために使用可能なＤＮＡベクターは、目
的改変ＨＩＶ−１タンパク質の下流クローニングにより修飾ＨＩＶ−１ ｔＰＡ
／Ｎｅｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列が得られるような目的リーダ
ーシグナルペプチドを含むように公知組換えＤＮＡ技術により修飾することがで
きる。あるいは、上述のように目的Ｎｅｆタンパク質のオープンリーディングフ
レームを含むＤＮＡベクターにリーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列
を挿入してもよい。クローニングストラテジーに関係なく、最終結果は目的修飾
ＨＩＶ−１ Ｎｅｆタンパク質（例えばリーダーペプチドを含むＨＩＶ−１ Ｎ
ｅｆタンパク質であるが、これに限定されない）をコードするヌクレオチド配列
と共に有効な遺伝子発現のためのベクター成分を含むポリヌクレオチドワクチン
である。本発明で使用するヒトｔＰＡリーダーのアミノ酸配列は、ＭＤＡＭＫＲ
ＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＥＩＳＳ（配列番号１９）である。

【００５０】 エンドサイトーシスを介してＮｅｆに誘導されるＣＤ４のダウンレギュレーシ
ョンにはタンパク質のカルボキシ領域のジロイシンモチーフと共にＧｌｙ−２の
ミリスチル化が必須であることが示されている（Ａｉｋｅｎら，１９９４，Ｃｅ
ｌｌ ７６：８５３−８６４）。Ｎｅｆ発現がエンドサイトーシスを介してＭＨ
ＣＩのダウンレギュレーションを促進することも示されている（Ｓｃｈｗａｒｔ
ｚら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（３）：３３８−３４２
）。本発明はトラフィッキング及び／又は機能性を改変した修飾Ｎｅｆタンパク
質をコードするＤＮＡワクチンにも関する。本発明のＤＮＡワクチンに導入され
る変異としては、アミノ末端リーダーペプチド付加と、アミノ酸末端ミリスチル
化部位の変異又は欠失と、Ｎｅｆタンパク質内のジロイシンモチーフの変異又は
欠失を含む修飾Ｎｅｆタンパク質を発現して感染宿主細胞内の機能を修飾するｎ
ｅｆオープンリーディングフレームの付加、欠失又は置換が挙げられるが、これ
らに限定されない。従って、本発明のＤＮＡ分子及びＤＮＡワクチンの中心的な
主題は（１）コドン最適化ｎｅｆ系ＤＮＡベクターワクチンの宿主投与と細胞内
輸送、（２）ＣＴＬ及びＴｈ応答を誘導するという点で免疫原性である修飾Ｎｅ
ｆタンパク質の発現、並びに（３）感染宿主内でＨＩＶ−１複製及び負荷を促進
することが分かっているＮｅｆの公知初期ウイルス機能を抑制又は少なくとも修
飾することにある。

【００５１】 本発明の別の好ましい例示態様では、アミノ末端Ｇｌｙ−２ミリスチル化残基
を欠失するか又は代替アミノ酸残基を発現するように変異させた修飾Ｎｅｆタン
パク質を発現するＤＮＡワクチンが得られるようにｎｅｆコーディング領域を改
変する。

【００５２】 本発明の別の好ましい例示態様では、ジロイシンモチーフが欠失するか又は代
替アミノ酸残基を発現するように変異させた修飾Ｎｅｆタンパク質を発現するＤ
ＮＡワクチンが得られるようにｎｅｆコーディング領域を改変する。

【００５３】 従って、本発明はコドン使用に関係なく野生型又は本明細書に記載するような
修飾Ｎｅｆタンパク質（例えばＧｌｙ２の欠失又は置換、Ｌｅｕ１７４とＬｅｕ
１７５の欠失又は置換及び／又はリーダー配列の付加を含む修飾Ｎｅｆタンパク
質が挙げられるが、これらに限定されない）を発現する単離ＤＮＡ分子に関する
。

【００５４】 本発明は本発明のＤＮＡポリヌクレオチドワクチンから発現される実質的に精
製されたタンパク質、特に配列番号２、４、６及び８として以下に記載する精製
タンパク質にも関する。これらの精製タンパク質はタンパク質系ＨＩＶワクチン
として有用であると思われる。

【００５５】 ＨＩＶ−１の修飾型をコードするＤＮＡワクチンに関する本発明の特定態様で
は、ＨＩＶ−１ Ｎｅｆ（ｊｆｒｌ）のアミノ酸残基６〜２１６に融合したｔＰ
Ａリーダー配列を含むＮｅｆタンパク質をコードするオープンリーディングフレ
ームを本明細書ではｏｐｔ ｔｐａｎｅｆと言う。ｏｐｔ ｔｐａｎｅｆのオー
プンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列を本明細書では下記配列番号
３として開示する。

【００５６】

【化３】

【００５７】 配列番号３のオープンリーディングフレームはヌクレオチド２〜４の開始メチ
オニン残基とヌクレオチド７１３〜７１５の「ＴＡＡ」停止コドンを含む。配列
番号３のオープンリーディングフレームはアミノ酸残基１７４及び１７５にジロ
イシンモチーフを含むＨＩＶ−１ Ｎｅｆのアミノ酸６〜２１６に融合したｔＰ
Ａリーダー配列を含む２３７アミノ酸ＨＩＶ−１ Ｎｅｆタンパク質を提供する
。この２３７アミノ酸ｔＰＡ／Ｎｅｆ（ｊｆｒｌ）融合タンパク質を本明細書で
は下記配列番号４として開示する。

【００５８】

【化４】

【００５９】 従って、この例示Ｎｅｆタンパク質Ｏｐｔ ｔＰＡ−ＮｅｆはｔＰＡリーダー
配列を含むと共に、ＨＩＶ−１ ｊｆｒｌ分離株からのＨＩＶ−１ Ｎｅｆをコ
ードするＧｌｙ−２Ａ ＤＮＡ分子のミリスチル化部位を欠失しており、コドン
はヒト等の哺乳動物系での発現に最適化されている。

【００６０】 本発明の別の特定態様では、オープンリーディングフレームがアミノ末端ミリ
スチル化部位の修飾（Ｇｌｙ−２→Ａｌａ−２）とＬｅｕ−１７４−Ｌｅｕ１７
５ジロイシンモチーフからＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５への置換をコードす
る最適化ＨＩＶ−１ ＮｅｆをコードするＤＮＡ分子を開示する。このオープン
リーディングフレームを本明細書ではｏｐｔ ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）と言
い、ヌクレオチド１２〜１４の開始メチオニン残基とヌクレオチド６６０〜６６
２からの「ＴＡＡ」停止コドンを含む配列番号５として開示する。上記修飾を加
えたＨＩＶ−１ ｊｒｆｌ ｎｅｆ遺伝子のこのコドン最適化形態のヌクレオチ
ド配列を本明細書では下記配列番号５として開示する。

【００６１】

【化５】

【００６２】 配列番号５のオープンリーディングフレームは本明細書に下記配列番号６とし
て開示するＮｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）をコードする。

【００６３】

【化６】

【００６４】 本発明の付加態様はアミノ末端ミリスチル化部位とジロイシンモチーフを欠失
しており、ｔＰＡリーダーペプチドを含む最適化ＨＩＶ−１ Ｎｅｆをコードす
る別のＤＮＡ分子に関する。このＤＮＡ分子ｏｐｔ ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）
はＨＩＶ−１ Ｎｅｆ（ｊｆｒｌ）のアミノ酸残基６〜２１６に融合したｔＰＡ
リーダー配列を含み、Ｌｅｕ−１７４とＬｅｕ１７５をＡｌａ−１７４とＡｌａ
−１７５（このｔＰＡ系融合タンパク質のＡｌａ−１９５とＡｌａ−１９６）で
置換したＮｅｆタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
ｏｐｔ ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）のオープンリーディングフレームを含むヌク
レオチド配列を本明細書では下記配列番号７として開示する。

【００６５】

【化７】

【００６６】 ｔＰＡ−Ｎｅｆ（ＬＬＡＡ）をコードする配列番号７のオープンリーディング
フレームを下記配列番号８として開示する。

【００６７】

【化８】

【００６８】 本発明はコドン使用に関係なく野生型又は本明細書に記載するような修飾Ｎｅ
ｆタンパク質（例えばＧｌｙ２の欠失又は置換、Ｌｅｕ１７４とＬｅｕ１７５の
欠失又は置換及び／又はリーダー配列の付加を含む修飾Ｎｅｆタンパク質が挙げ
られるが、これらに限定されない）を発現する任意ＤＮＡ分子にも関する。従っ
て、宿主での発現を増進させると思われることから部分又は完全コドン最適化Ｄ
ＮＡワクチン発現ベクター構築物が好ましい。しかし、本明細書に開示する構築
物の「非コドン最適化」形態、特に宿主投与後に実質的な細胞性免疫応答を助長
することが明らかなＨＩＶ Ｎｅｆ修飾形を使用することも本発明の範囲に含ま
れる。

【００６９】 本発明のＤＮＡワクチンのＤＮＡ骨格はＤＮＡプラスミド発現ベクターが好ま
しい。ＤＮＡプラスミド発現ベクターは当分野で周知であり、本発明のＤＮＡベ
クターワクチンは少なくともＲＮＡポリメラーゼ転写プロモーターとＨＩＶ ｎ
ｅｆコード配列の３’転写ターミネーターを含むこのような任意発現骨格から構
成することができる。一好適態様では、プロモーターは強力な転写プロモーター
であるラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）である。より好ま
しいプロモーターはイントロンＡ配列をもつサイトメガロウイルスプロモーター
（ＣＭＶ−ｉｎｔＡ）である。好ましい転写ターミネーターの１例はウシ成長ホ
ルモンターミネーターである。更に、ＨＩＶ ｎｅｆ ＤＮＡベクターワクチン
の大規模製造を助長するためには、発現ベクターに抗生物質耐性マーカーも加え
ることが好ましい。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子又は他の
任意の医薬的に許容可能な抗生物質耐性マーカーを使用することができる。本発
明の一好適態様では、抗生物質耐性遺伝子はネオマイシン耐性の遺伝子産物をコ
ードする。更に、原核生物での発酵による薬剤の高レベル生産を助長するために
は、ベクターに複製起点を加え、高コピー数にすると有利である。これらの効果
は多数の市販原核クローニングベクターの任意のもので得られる。本発明の１好
適態様では、これらの機能はｐＵＣとして知られる市販ベクターにより提供され
る。非必須ＤＮＡ配列を除去することが望ましい。従って、本発明の１態様では
ｐＵＣのｌａｃＺ及びｌａｃＩコード配列を除去する。

【００７０】 本明細書に例示するＤＮＡ発現ベクターは参考資料として本明細書に組込むＰ
ＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０２７５１号、国際公開第ＷＯ９４／２１７
９７号にも開示されている。第１のＤＮＡ発現ベクターはラウス肉腫ウイルス（
ＲＳＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）をプロモーターとして使用する発現ベクターｐ
ｎＲＳＶである。第２の態様はＣＭＶプロモーターとＢＧＨ転写ターミネーター
をクローニングした突然変異ｐＢＲ３２２ベクターであるプラスミドＶ１である
。ＤＮＡベクター骨格に関する別の態様はプラスミドＶ１Ｊである。プラスミド
Ｖ１ＪはプラスミドＶ１から誘導され、プロモーター及び転写ターミネーターエ
レメントを取出してより明確なコンテキストに配置し、よりコンパクトなベクタ
ーを形成し、プラスミド精製収率を改善したものである。従って、Ｖ１Ｊも本明
細書に開示するＨＩＶ ｎｅｆ系遺伝子の発現を制御するＣＭＶｉｎｔＡプロモ
ーター及び（ＢＧＨ）転写終結エレメントを含む。Ｖ１Ｊの骨格はｐＵＣ１８に
より提供される。これは高収率のプラスミドを生産することが知られており、配
列と機能により特定されており、最小サイズである。ｌａｃオペロンを完全に除
去し、残りのプラスミドをアガロース電気泳動ゲルから精製し、Ｔ４ Ｄｎａポ
リメラーゼで平滑末端し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、ＣＭＶｉｎ
ｔＡ／ＢＧＨエレメントに連結した。別のＤＮＡ発現ベクターでは、アンピシリ
ン耐性遺伝子をＶ１Ｊから除去し、ネオマイシン耐性遺伝子で置換し、Ｖ１Ｊｎ
ｅｏとした。本明細書に具体的に例示するＤＮＡ発現ベクターの１例はＶ１Ｊｎ
ｓであり、固有Ｓｆｉ１制限部位をＶ１Ｊ−ｎｅｏの２１１４位の単一Ｋｐｎ１
部位に挿入した以外はＶ１Ｊと同一である。ヒトゲノムＤＮＡにおけるＳｆｉ１
部位の頻度は非常に低い（約１部位／１００，０００塩基）。従って、このベク
ターは抽出したゲノムＤＮＡのＳｆｉ１消化するだけで宿主ＤＮＡへの発現ベク
ター組込みを細かくモニターすることができる。本発明のＨＩＶ−１ ｎｅｆ系
ＤＮＡワクチンの骨格として使用する別のＤＮＡ発現ベクターはＶ１Ｒである。
このベクターでは非常にコンパクトなベクターを得るように最大限の非必須ＤＮ
Ａをベクターから「トリミング」した。このベクターはＶ１Ｊｎｓの誘導体であ
る。このベクターはより大きいインサートを使用することができ、望ましくない
配列がコードされる心配が少なく、特定インフルエンザウイルス遺伝子をコード
する構築物を周囲組織に導入すると細胞による取込みを最適化する。

【００７１】 本明細書の教示から明らかなように、多数のベクター／Ｎｅｆ抗原構築物を作
製することができる。例示した構築物（Ｖ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐ
ａｎｅｆ、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）及びＶ１Ｊｎｓ／（Ｇ２Ａ
ＬＬＡＡ））が好ましいが、任意数のベクター／Ｎｅｆ抗原組合せが本発明の範
囲に含まれ、特に野生型Ｎｅｆタンパク質又はＧｌｙ２の欠失もしくは置換、Ｌ
ｅｕ１７４とＬｅｕ１７５の欠失もしくは置換及び／又はリーダー配列の付加を
含む修飾Ｎｅｆタンパク質を含む。従って、本発明は特にＤＮＡワクチンとこの
ＤＮＡベクターワクチンを含む医薬的に活性なワクチン組成物、及びＨＩＶ感染
を予防又はＨＩＶ発症と闘うための宿主免疫、好ましくはヒト宿主免疫用予防及
び／又は治療ワクチンとしての使用に関する。これらのＤＮＡワクチンは機能的
リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むか又は含まない適当なＤ
ＮＡプラスミドベクターに連結された生物活性Ｎｅｆ修飾体又はＮｅｆ含有融合
タンパク質のＨＩＶ−１ Ｎｅｆをコードするコドン最適化ＤＮＡ分子である。
本発明のＤＮＡワクチンはＤＮＡベクターＶ１、Ｖ１Ｊ（配列番号１４）、Ｖ１
Ｊｎｅｏ（配列番号１５）、Ｖ１Ｊｎｓ（図１Ａ、配列番号１６）、Ｖ１Ｒ（配
列番号２６）又はリーダーペプチド、好ましくはヒトｔＰＡリーダーをコードす
るヌクレオチド配列をＣＭＶ−ｉｎｔＡプロモーターの下流に直接融合した上記
ベクターの任意のもの（例えば図１Ｂと配列番号１９に示すようなＶ１Ｊｎｓ−
ｔｐａが挙げられるが、これに限定されない）に連結した生物活性Ｎｅｆ修飾体
又はＮｅｆ含有融合タンパク質のＨＩＶ−１ Ｎｅｆをコードするコドン最適化
ＤＮＡ分子が挙げられるが、これに限定されない。本発明の特に好ましいＤＮＡ
ワクチンとしては実施例２に例示するようなＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ、Ｖ１Ｊｎｓ／
ｔｐａｎｅｆ、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）及びＶ１Ｊｎｓ／（Ｇ２
Ａ ＬＬＡＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【００７２】 本発明のＤＮＡベクターワクチンは宿主投与に医薬的に有効な任意製剤に処方
することができる。このような任意製剤としては例えばリン酸緩衝塩類（ＰＢＳ
）等の塩類溶液が挙げられる。本発明のＤＮＡベクターワクチンの長期安定性も
提供する医薬的に許容可能な製剤を使用すると有用であろう。医薬品として保存
中にＤＮＡプラスミドワクチンは物理化学的変化を受け、スーパーコイルプラス
ミドは開環直鎖形となる。このプロセスは種々の保存条件（低ｐＨ、高温、低イ
オン強度）により促進される。従って、（琥珀酸もしくはリンゴ酸、又は多重リ
ン酸リガンドを含むキレート剤を使用して）ＤＮＡプラスミド溶液、製剤緩衝液
又はバイアル及びクロージャーから微量金属イオンを除去及び／又はキレート化
し、保存中のこの分解経路からＤＮＡプラスミドを安定化させる。更に、エタノ
ールやグリセロール等の非還元性フリーラジカル補足剤を加えると、見掛けは金
属を含まない溶液中にもまだ発生する可能性があるフリーラジカル形成からＤＮ
Ａプラスミドの損傷を防ぐために有用である。更に、緩衝液種、ｐＨ、塩濃度、
露光量及びバイアルを作製するために使用する滅菌法の種類を製剤で調節し、Ｄ
ＮＡワクチンの安定性を最適化させることもできる。従って、ＤＮＡワクチンの
最高安定性を提供する製剤はｐＨ７〜８の緩衝液（リン酸又は重炭酸）、１００
〜２００ｍＭの塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌ又はＬｉＣｌ）、金属イオンキレート剤（
例えばＥＤＴＡ、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、リンゴ酸塩、イノ
シトール六リン酸、トリポリリン酸塩又はポリリン酸）、非還元性フリーラジカ
ルスカベンジャー（例えばエタノール、グリセロール、メチオニン又はジメチル
スルホキシド）を含む脱金属溶液を含み、高純度無ヌクレアーゼＤＮＡを光から
保護するように充填した滅菌ガラスバイアル中で最適ＤＮＡ濃度を提供するもの
である。本発明のＤＮＡベクターワクチンの長期安定性を増進する特に好ましい
製剤はｐＨ約８．０〜約９．０のＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、約３％ｗ／ｖのエタ
ノール又はグリセロール、約５ｍＭまでの濃度範囲のＥＤＴＡ又はＤＴＰＡ、及
び約５０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度のＮａＣｌを含む。このような安定化ＤＮＡ
ベクターワクチンとこの好適製剤範囲の種々の代替例は参考資料として本明細書
に組込むＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／０６６５５号、ＰＣＴ国際公開第
ＷＯ９７／４０８３９号に詳細に記載されている。

【００７３】 本発明のＤＮＡベクターワクチンは強いＣＴＬ性免疫応答を生じることに加え
、免疫後に測定可能な体液性応答も提供することができる。この応答は各ワクチ
ン製剤のアジュバントの添加の有無にかかわらず起こりうる。この目的のために
、本発明のＤＮＡポリヌクレオチドワクチンの免疫原性を増すことが可能なアジ
ュバントを加えて本発明のＤＮＡベクターワクチンを処方してもよい。多数のこ
れらのアジュバントが当分野で公知であり、ＤＮＡワクチンで使用することがで
き、例えばＤＮＡ被覆金ビーズを使用するボンバード粒子、サイトカイン、ケモ
カイン又は共刺激分子を発現するプラスミドＤＮＡとＤＮＡワクチンの同時投与
、カチオン脂質又は実験アジュバント（例えばサポニン、モノホスホリル脂質Ａ
もしくはＤＮＡワクチンの免疫原性を増加する他の化合物）を加えたＤＮＡの処
方が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＤＮＡベクターワクチンで
使用するのに好ましいアジュバントの１例は１種以上の形態のリン酸アルミニウ
ム系アジュバントである。リン酸アルミニウムは生ワクチン、不活化ワクチン又
はサブユニットワクチンでの使用が当分野で公知であるが、ＤＮＡワクチン製剤
で有用なアジュバントであることが開示されたのはごく最近のことである。当業
者は最適免疫応答を得るようにＤＮＡとリン酸アルミニウムの比を変えることが
できる。更に、リン酸アルミニウム系アジュバントはＰＯ_４／Ａｌモル比が約０
．９であり、同様に最適免疫応答を得るように当業者が改変することができる。
１種以上の形態のリン酸カルシウムから別の無機系アジュバントを調製すること
もできる。これらの無機系アジュバントは適切な細胞性免疫応答に負の効果を与
えることなくＤＮＡワクチン接種に対する体液性応答を増すのに有用である。Ｄ
ＮＡワクチンアジュバントとしてのこれらの無機系化合物の完全な使用指針は参
考資料として全体を本明細書に組込むＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／０２
４１４号、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／３５５６２号に開示されている。別の好
ましいアジュバントはＤＮＡワクチンにアジュバント活性を示す非イオン性ブロ
ックコポリマーである。基本構造はＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマー
のようにポリオキシエチレン（ＰＯＥ）とポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）のブ
ロックを含む。Ｎｅｗｍａｎら（１９９８，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ
１５（２）：８９−１４２）はアジュバント活性を示す非イオン性ブロックコ
ポリマー類について記載している。基本構造はＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロック
コポリマーのようにポリオキシエチレン（ＰＯＥ）とポリオキシプロピレン（Ｐ
ＯＰ）のブロックを含む。Ｎｅｗｍａｎらは所定のＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロ
ックコポリマー即ち分子量約９０００ダルトン〜約２０，０００ダルトンの中心
ＰＯＰブロックとコポリマーの合計分子量の約２０％までに相当する両側のＰＯ
Ｅブロックを含む高分子量ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーがインフ
ルエンザタンパク質系ワクチンのアジュバントとして有用であり得ると開示して
いる（これらのＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーについてはいずれも
Ｅｍａｎｕｅｌｅら名義の米国再発行特許第３６，６６５号、米国特許第５，５
６７，８５９号、米国特許第５，６９１，３８７号、米国特許第５，６９６，２
９８号及び米国特許第５，９９０，２４１号も参照）。ＷＯ９６／０４９３２は
更に界面活性特徴をもち、ワクチンアジュバントとしての生体効力を示す高分子
量ＰＯＥ／ＰＯＰブロックコポリマーを開示している。このパラグラフに挙げた
上記引用文献はその開示内容全体を参考資料として本明細書に組込む。従って、
アジュバントを加えないポリヌクレオチドワクチンの投与に比較して本発明のポ
リヌクレオチドワクチンの免疫応答を増すことが可能な利用可能なアジュバント
を使用することは当業者がなし得る範囲内である。

【００７４】 本発明のＤＮＡベクターワクチンは腸管及び腸管外経路等の当分野で公知の任
意手段により宿主に投与される。これらの送達経路としては筋肉内注射、腹膜組
織内注射、静脈内注射、吸入又は鼻腔内送達、経口輸送、舌下投与、皮下投与、
経皮投与又は任意形態のボンバード粒子（例えば「遺伝子銃」等のパーティクル
ガン装置）や任意市販無針注射装置の使用が挙げられるが、これらに限定されな
い。本明細書に開示するＨＩＶ−１ Ｎｅｆ系ＤＮＡワクチンの好ましい送達方
法は筋肉内注射と無針注射である。特に好ましい方法は筋肉内輸送である。

【００７５】 ワクチンレシピエントに導入する発現可能なＤＮＡの量はＤＮＡ構築物で使用
される転写及び翻訳プロモーターの強度と発現される遺伝子産物の免疫原性によ
り異なる。一般に、約１μｇ〜約２０ｍｇを越える値まで、好ましくは約１ｍｇ
〜約５ｍｇの免疫又は予防的に有効な用量を筋肉組織に直接投与する。上述のよ
うに、皮下注射、皮内導入、皮膚圧入及び他の投与方法（例えば腹膜組織内、静
脈内、吸入及び経口送達）も予想される。本発明のＮｅｆ系ＤＮＡベクターワク
チンに対する総ての免疫応答を最適化するようにブースターワクチン接種するこ
とも予想される。

【００７６】 上記ポリヌクレオチドは脊椎動物に直接ｉｎ ｖｉｖｏ導入すると、動物の体
内で各ＨＩＶ−１ Ｎｅｆタンパク質を発現し、発現されるＮｅｆ抗原に対する
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を宿主体内で誘導する。従って、本発明は
有効な免疫予防を提供するため、このウイルスに暴露後のＨＩＶ−１感染の定着
を防ぐため、又は急性ＨＩＶ−１感染を緩和してウイルス負荷の定着をより低く
し、有益な長期結果を得るためのＨＩＶ感染後治療用ワクチンとしての本発明の
ＨＩＶ−１ Ｎｅｆ系ポリヌクレオチドワクチンの使用方法にも関する。上述の
ように、本発明はタンパク質の発現を誘導するために生組織にポリヌクレオチド
を導入する任意公知経路を使用する本発明のＤＮＡ ｎｅｆ系ワクチンの投与又
は使用方法を予想する。

【００７７】 従って、本発明は本明細書に開示する種々のパラメーターと、哺乳動物組織に
導入するとこれらのＤＮＡ ｎｅｆ系ワクチンの細胞内発現をｉｎ ｖｉｖｏ誘
導する当分野で公知の任意付加パラメーターを使用するＤＮＡ ｎｅｆ系ワクチ
ンの使用方法を提供する。Ｎｅｆ系免疫原のこの細胞内発現は既存ＨＩＶ−１感
染に対する実質的レベルの防御を提供するか又は未感染宿主で将来の感染に対す
る実質的レベルの防御を提供するＣＴＬ及び体液性応答を誘導する。

【００７８】 以下、実施例により本発明を更に説明するが、以下の実施例により本発明を制
限するものではない。

【００７９】 実施例１ ワクチンベクター Ｖ１−ワクチンベクターＶ１はｐＣＭＶＩＥ−ＡＫＩ−ＤＨＲＦ（Ｗｈａｎｇ
ら，１９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１７９６）から構築した。ベクターをＥ
ｃｏＲＩで切断して自己連結することによりＡＫＩ及びＤＨＦＲ遺伝子を除去し
た。このベクターはＣＭＶプロモーターにイントロンＡを含まないので、内部Ｓ
ａｃＩ部位［Ｃｈａｐｍａｎら，（１９９１，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
９：３９７９）のナンバリングによる１８５５位］を欠失したＰＣＲフラグメン
トとして加えた。ＰＣＲ反応に使用した鋳型はｐＣＭＶｉｎｔＡ−Ｌｕｘであり
、ｈＣＭＶ−ＩＥ１エンハンサー／プロモーターとイントロンＡを含むｐＣＭＶ
６ａ１２０（Ｃｈａｐｍａｎら，前出）からのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩフラグ
メントをｐＢＬ３のＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部位に連結してｐＣＭＶＩｎｔ
ＢＬとすることにより作製した。ＲＳＶ−Ｌｕｘ（ｄｅ Ｗｅｔら，１９８７，
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：７２５）からの１８８１塩基対ルシフェラー
ゼ遺伝子フラグメント（クレノウ充填したＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩ）をクレノ
ウ充填してホスファターゼ処理したｐＣＭＶＩｎｔＢＬのＳａｌＩ部位に連結し
た。イントロンＡ部分のプライマーは５’プライマー：５’−ＣＴＡＴＡＴＡＡ
ＧＣＡＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＧ−３’（配列番号１０）と、３’プライマー：
５’−ＧＴＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧ−３’
（配列番号１１）である。ＳａｃＩ部位を除去するために使用したプライマーは
センスプライマー５’−ＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡ
ＧＡＴＴＧＧＧＣＴＣＧＣＡＣ−３’（配列番号１２）とアンチセンスプライマ
ー５’−ＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＡＴＴＴＴＣＡＧＡ
ＣＡＣＡＴＡＣ−３’（配列番号１３）である。ＰＣＲフラグメントをＳａｃＩ
とＢｇｌＩＩで切断し、同一酵素で予め切断しておいたベクターに挿入した。

【００８０】 Ｖ１Ｊ−ベクターＶ１からプロモーター及び転写ターミネーターエレメントを
除去してより明確なコンテキストに配置し、よりコンパクトなベクターを形成し
、プラスミド精製収率を改善するようにワクチンベクターＶ１Ｊを作製した。Ｖ
１ＪはベクターＶ１と市販プラスミドベクターｐＵＣ１８から誘導される。Ｖ１
をＳｓｐＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、２個のＤＮＡフラグメントを生成
した。異種遺伝子の発現を制御するＣＭＶｉｎｔＡプロモーター及びウシ成長ホ
ルモン（ＢＧＨ）転写終結エレメントを含むこれらのフラグメントの小さいほう
をアガロース電気泳動ゲルから精製した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用
してこのＤＮＡフラグメントの両端を「平滑化」し、別の「平滑末端」ＤＮＡフ
ラグメントに連結し易くした。ｐＵＣ１８は発現ベクターの「骨格」を提供する
ために選択した。配列と機能により特定された小サイズのプラスミドを高収率で
製造することは公知である。ＨａｅＩＩ制限酵素で部分消化することによりこの
ベクターから完全ｌａｃオペロンを除去した。残りのプラスミドをアガロース電
気泳動ゲルから精製し、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理したＴ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑末端し、上記ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨエレメントに連結した
。ｐＵＣ骨格の内側にプロモーターエレメントの可能な２方向の一方を示すプラ
スミドが得られた。これらのプラスミドの１種は大腸菌でＤＮＡ収率が著しく高
く、これをＶ１Ｊと命名した。このベクターの構造を結合領域の配列分析により
確認後、Ｖ１と同等以上の異種遺伝子発現を生じることが判明した。Ｖ１Ｊのヌ
クレオチド配列は以下の通りである。

【００８１】

【化９】

【００８２】 Ｖ１Ｊｎｅｏ−ワクチンベクターＶ１Ｊｎｅｏ発現ベクターの構築はａｍｐ^ｒ 遺伝子を除去し、ｋａｎ^ｒ遺伝子を挿入することにより行った（ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼ）。ＳｓｐＩ及びＥａｍ１１０５Ｉ制限酵素で消化する
ことによりＶ１ＪのｐＵＣ骨格からａｍｐ^ｒ遺伝子を除去した。残りのプラスミ
ドをアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末
端化した後、ウシ腸アルカリホスファターゼで処理した。トランスポゾン９０３
に由来し、ｐＵＣ４Ｋプラスミドに含まれる市販ｋａｎ^ｒ遺伝子をＰｓｔＩ制限
酵素で切出し、アガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラー
ゼで平滑末端化した。このフラグメントをＶ１Ｊ骨格と連結し、いずれかの方向
にｋａｎ^ｒ遺伝子をもつプラスミドを得、Ｖ１Ｊｎｅｏ＃１及び３と命名した。
これらのプラスミドの各々を制限酵素消化分析、結合領域のＤＮＡシークエンシ
ングにより確認し、Ｖ１Ｊと同等量のプラスミドを生じることが判明した。これ
らのＶ１Ｊｎｅｏベクターは異種遺伝子産物の発現もＶ１Ｊと同等であった。Ｖ
１Ｊのａｍｐ^ｒ遺伝子と同一方向にｋａｎ^ｒ遺伝子を含み、ネオマイシン、カナ
マイシン及びＧ４１８に対する耐性を提供するＶ１Ｊｎｅｏ＃３（以下、Ｖ１Ｊ
ｎｅｏと言う）を発現構築物として選択した。Ｖ１Ｊｎｅｏのヌクレオチド配列
は以下の通りである。

【００８３】

【化１０】

【００８４】 Ｖ１Ｊｎｓ−組込み試験を容易にするようにＶ１ＪｎｅｏにＳｆｉＩ部位を加
えて発現ベクターＶ１Ｊｎｓを作製した。ベクターのＢＧＨ配列内のＫｐｎＩ部
位に市販１３塩基対ＳｆｉＩリンカー（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ
ｓ）を加えた。Ｖ１ＪｎｅｏをＫｐｎＩで直鎖化し、ゲル精製し、Ｔ４ ＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑化し、平滑ＳｆｉＩリンカーに連結した。クローン分離株を
制限マッピングにより選択し、リンカーのシークエンシングにより確認した。新
規ベクターをＶ１Ｊｎｓと命名した。（ＳｆｉＩをもつ）Ｖ１Ｊｎｓにおける異
種遺伝子の発現は（ＫｐｎＩをもつ）Ｖ１Ｊｎｅｏにおける同一遺伝子の発現と
同等であった。

【００８５】 Ｖ１Ｊｎｓのヌクレオチド配列は以下の通りである。

【００８６】

【化１１】

【００８７】 配列番号１６の下線で示したヌクレオチドはＶ１ＪｎｅｏのＫｐｎＩ部位に導
入したＳｆｉＩ部位である。

【００８８】 Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−本発明のｎｅｆ ＤＮＡ構築物に異種リーダーペプチド
を融合するようにワクチンベクターＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡを構築した。より具体的
に説明すると、ヒト組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）リー
ダーを含むようにワクチンベクターＶ１Ｊｎｓを修飾した。アミノ末端リーダー
配列を含むｎｅｆ ＤＮＡ構築物の作製を限定するものではないが、１例として
、ヒト組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）リーダーを含むよ
うにプラスミドＶ１Ｊｎｅｏを修飾した。２種の合成相補オリゴマーをアニール
した後、ＢｇｌＩＩで消化しておいたＶ１Ｊｎｅｏに連結した。センス及びアン
チセンスオリゴマーは５’−ＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧＡ
ＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＧＡＧＣＡＧ
ＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＧＡ−３’（配列番号１７）と５’ＧＡＴ
ＣＴＣＧＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡＧＣＡＧ
ＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＣＴＣＴＣＴＴＣＡＴＴＧＣＡＴＣＣＡＴ
ＧＧＴ−３’（配列番号１８）であった。センスオリゴマー中のコザック配列を
下線で示す。これらのオリゴマーはＢｇｌＩＩで切断した配列との連結に適した
突出塩基をもつ。連結後に下流ＢｇｌＩＩを後期連結に残しながら上流ＢｇｌＩ
Ｉ部位を破壊する。両者結合部位と完全ｔＰＡリーダー配列をＤＮＡシークエン
シングにより確認した。更に、Ｖ１Ｊｎｓ（＝ＳｆｉＩ部位をもつＶ１Ｊｎｅｏ
）と一致させるために、ＫｐｎＩ部位をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した
後にＳｆｉＩリンカー（カタログ＃１１３８，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ）と連結してＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡとすることによりＶ１Ｊｎｅｏ−ｔＰ
ＡのＢＧＨターミネーター領域内のＫｐｎＩ部位にＳｆｉＩ制限部位を配置した
。この変異を制限消化とアガロースゲル電気泳動により確認した。Ｖ１Ｊｎｓ−
ｔｐａベクターヌクレオチド配列は以下の通りである。

【００８９】

【化１２】

【００９０】 配列番号９の下線で示したヌクレオチドはＶ１ＪｎｅｏのＫｐｎＩ部位に導入
したＳｆｉＩ部位であり、下線／斜体で示したヌクレオチドはヒトｔＰＡリーダ
ー配列である。

【００９１】 Ｖ１Ｒ−Ｖ１ＪとＶ１Ｊｎｓにより得られる総合的な最適化異種遺伝子発現特
性と高いプラスミド収率を維持しながら不要なＤＮＡ配列を除去した最小寸法の
ワクチンベクターを得るようにワクチンベクターＶ１Ｒを構築した。（１）細菌
からのプラスミド収率を変えずに大腸菌複製起点を含むｐＵＣ骨格内の領域を除
去することができ、（２）細菌ターミネーターをその場所に挿入するならばカナ
マイシンオープンリーディングフレームに続くｋａｎ^ｒ遺伝子の３’領域を除去
することができ、（３）その調節機能を変えずに（ＢＧＨエレメント内の元のＫ
ｐｎＩ制限酵素部位に続く）ＢＧＨターミネーターの３’側半分から〜３００ｂ
ｐを除去できることが判明した。Ｖ１ＲはＰＣＲを使用してＣＭＶｉｎｔＡプロ
モーター／ＢＧＨターミネーター、複製起点及びカナマイシン耐性エレメントに
夫々相当するＶ１Ｊｎｓからの３個のＤＮＡセグメントを合成することにより構
築した。ＰＣＲオリゴマーを使用して各セグメントに固有の制限酵素即ちＣＭＶ
ｉｎｔＡ／ＢＧＨにはＳｓｐＩとＸｈｏＩ、ｋａｎ^ｒ遺伝子にはＥｃｏＲＶとＢ
ａｍＨＩ、ｏｒｉ^ｒにはＢｃｌＩとＳａｌＩを加えた。これらの酵素部位を選択
したのはＰＣＲにより誘導されるＤＮＡセグメントの各々を各部位の後期欠損な
しに指向的に連結できるためであり、ＥｃｏＲＶとＳｓｐＩは連結に適した平滑
末端ＤＮＡを残し、ＢａｍＨＩとＢｃｌＩ及びＳａｌＩとＸｈｏＩは付着末端を
残す。ＰＣＲによりこれらのセグメントを得た後に、各セグメントを適当な上記
制限酵素で消化し、その後、全体を連結し、全３個のＤＮＡセグメントを含む単
一反応混合物とする。ｏｒｉ^ｒの５’末端はこの領域に通常存在するＴ２ｒｈｏ
独立ターミネーター配列を含むように設計し、カナマイシン耐性遺伝子に終結情
報を提供できるようにした。連結産物は制限酵素消化（＞８種酵素）と連結結合
部のＤＮＡシークエンシングにより確認した。Ｖ１Ｒ内のウイルス遺伝子を使用
したＤＮＡプラスミド収率と異種発現はＶ１Ｊｎｓと同等であると思われる。得
られたベクター寸法の純減少は１３４６ｂｐ（Ｖ１Ｊｎｓ＝４．８６ｋｂ、Ｖ１
Ｒ＝３．５２ｋｂ）であった。Ｖ１Ｒを合成するために使用したＰＣＲオリゴマ
ー配列は以下の通りである（制限酵素部位を下線で示し、配列の後の括弧内に配
列番号を示す）。（１）５’−ＧＧＴＡＣＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＡＴＴＧＧＣ
ＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＧ−３’（配列番号２０）［ＳｓｐＩ］、（２）５’−Ｃ
ＣＡＣＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＡＣＣＧＧＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣ−
３’（配列番号２１）［ＸｈｏＩ］（ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨセグメント）、（
３）５’−ＧＧＴＡＣＡＧＡＴＡＴＣＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＴＣＴ
ＣＡＡＡＡＴＣ−３’（配列番号２２）［ＥｃｏＲＶ］、（４）５’−ＣＡＣＡ
ＴＧＧＡＴＣＣＧＴＡＡＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴＡＣＡＡＣＣ−３’（
配列番号２３）［ＢａｍＨＩ］（カナマイシン耐性遺伝子セグメント）、（５）
５’−ＧＧＴＡＣＡＴＧＡＴＣＡＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣ
ＴＴＣＴＴＧ−３’（配列番号２４）［ＢｃｌＩ］、（６）５’−ＣＣＡＣＡＴ ＧＴＣＧＡＣ ＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番
号２５）［ＳａｌＩ］（大腸菌複製起点）。

【００９２】 ベクターＶ１Ｒのヌクレオチド配列は以下の通りである。

【００９３】

【化１３】

【００９４】 実施例２ ＤＮＡベクターワクチンとしてのコドン最適化ＨＩＶ−１ Ｎｅｆ及びＨＩＶ
−１ Ｎｅｆ誘導体 ＨＩＶ−１ Ｎｅｆワクチンベクター−オーバーラップする相補合成オリゴヌ
クレオチドからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＨＩＶ−１ ｊｒｆｌ分
離株の野生型Ｎｅｆタンパク質をコードするコドン最適化ｎｅｆ遺伝子を構築し
た。使用したＰＣＲプライマーはＢｇｌＩＩ部位が５’プライマーの延長部に含
まれ、ＳｒｆＩ部位とＢｇｌＩＩ部位が３’プライマーの延長部に含まれるよう
に設計した。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩで消化し、ヒトサイトメガロウイルス初期
プロモーター系発現ベクターＶ１Ｊｎｓ（図１Ａ）のＢｇｌＩＩ部位にクローニ
ングした。発現カセットのコンテキスト内でｎｅｆフラグメントが正しい方向で
あるかどうかを非対称制限マッピングにより調べた。得られたプラスミドがＶ１
Ｊｎｓ／ｎｅｆである。コドン最適化Ｖ１Ｊｎｓ／ｎｅｆの５’及び３’ヌクレ
オチド配列結合部を図３Ａに示す。

【００９５】 突然変異ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）も合成オリゴヌクレオチドから作製した
。クローニングし易くするために、５’及び３’ＰＣＲプライマーの延長部に夫
々ＰｓｔＩ部位とＳｒｆＩ部位を加えた。ＰＣＲ産物をＰｓｔＩとＳｒｆＩで消
化し、Ｖ１Ｊｎｓ／ｎｅｆのＰｓｔＩ及びＳｒｆＩ部位にクローニングし、元の
ｎｅｆをｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）フラグメントで置換した。こうしてＶ１Ｊ
ｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）を得た。コドン最適化Ｖ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（
Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）の５’及び３’ヌクレオチド配列結合部を図３Ｂに示す。

【００９６】 ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターリーダーペプチドとｎｅｆ融合遺伝
子を含む発現ベクター即ちＶ１Ｊｎｓ／ｔＰＡｎｅｆを構築するために、Ｖ１Ｊ
ｎｓ／ｎｅｆを鋳型として使用して５個のアミノ末端残基のコード配列を欠失す
る切断ｎｅｆ遺伝子フラグメントをまずＰＣＲ増幅した。この反応で使用した５
’及び３’ＰＣＲプライマーはいずれもＢｇｌＩＩ延長部を含んでいた。次にＰ
ＣＲ増幅フラグメントをＢｇｌＩＩで消化し、発現ベクターＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａ
（図１Ｂ）のＢｇｌＩＩ部位にクローニングした。ｔｐａリーダーペプチドコー
ド配列の３’末端をｎｅｆ ＰＣＲ産物の５’末端に連結してＢｇｌＩＩ部位を
復元し、２種の遺伝子のインフレーム融合体を得た。コドン最適化Ｖ１Ｊｎｓ／
ｔＰＡｎｅｆの５’及び３’ヌクレオチド配列結合部を図３Ｃに示す。

【００９７】 Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）の構築はｎｅｆ遺伝子の３’側半分と
ベクター骨格の部分を含むＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆのＢｓｕ３６−ＳａｃＩＩ
フラグメントをＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）からのＢｓｕ３６−Ｓ
ａｃＩＩフラグメントで置換することにより実施した。コドン最適化Ｖ１Ｊｎｓ
／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）の５’及び３’ヌクレオチド配列結合部を図３Ｃに
示す。

【００９８】 全ｎｅｆ構築物はシークエンシングにより確認した。これらの構築物のアミノ
酸結合部を図４に模式的に示す。

【００９９】 トランスフェクション及びタンパク質発現−１００ｍｍ培養皿で１０％ウシ胎
仔血清（ＦＢＳ，ＧＩＢＣＯ）を加えた最少必須培地（ＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ，Ｇ
ｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＭＤ）で約３０％集密に増殖させた２９３細胞（アデ
ノウイルス形質転換ヒト胚性腎細胞系２９３）にｇａｇ発現ベクターＶ１Ｊｎｓ
／ｇａｇ４μｇ又はｇａｇ発現ベクター４μｇとｎｅｆ発現ベクター４μｇの混
合物を製造業者のプロトコール（ＧＩＢＣＯ）に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎに
よりトランスフェクトした。トランスフェクションから１２時間後に細胞を無血
清培地Ｏｐｔｉ−ＭＥＭＩ（ＧＩＢＣＯ）１０ｍｌで１回洗浄し、Ｏｐｔｉ−Ｍ
ＥＭＩ５ｍｌを補充した。更に６０時間インキュベーション後に培養上清と細胞
を別々に採取し、ウェスタンブロット分析に使用した。

【０１００】 ウェスタンブロット分析−サンプル５０μｌを減圧条件下に１０％ＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離した。タンパク質をＰＶＤＦ
膜１枚にブロットし、いずれも２０００倍に希釈したｇａｇ ｍＡｂ（＃１８；
Ｉｎｔｒａｃｅｌ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）とＮｅｆ ｍＡｂ（ａａ６４〜
６８、ａａ１９５〜２０１；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）の混合物及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ
）と反応させた。タンパク質バンドを製造業者のプロトコール（Ａｍｅｒｓｈａ
ｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）に従ってＥＣＬウェスタンブ
ロッティング検出試薬により可視化した。

【０１０１】 酵素免役定量法（ＥＬＩＳＡ）−９６穴Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩ丸底プレートを
４℃で重炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）中２μｇ／ｍｌ濃度のＮｅｆタンパク質５０
μｌ／ウェルで一晩被覆した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたＰＢＳ（Ｐ
ＢＳＴ）でプレートを３回洗浄し、２４℃でＰＢＳＴ中５％スキムミルク（ミル
ク−ＰＢＳＴ）で２時間ブロックした後、試験サンプルのミルク−ＰＢＳＴ連続
希釈液を加えて２４℃で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回
洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ）５０μｌ／ウェルを加え
、２４℃で１時間インキュベートした。この後、３回洗浄し、１ｍｇ／ｍｌＡＢ
ＴＳ［（２，２’−アミノ−ジ−（３−エチルベンズチオゾリンスルホネート）
）（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）１００μｌ／ウェルを加えた。
２４℃で１時間後にＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して波長４０５ｎｍでプ
レートを読取った。

【０１０２】 酵素スポットアッセイ（Ｅｌｉｓｐｏｔ）−ニトロセルロース膜でバッキング
した９６穴プレート（ＭＳＨＡプレート；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ
，ＭＡ）を４℃でＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ濃度のラット抗マウスＩＮＦ−γｍＡｂ
捕獲抗体（Ｒ４−６Ａ２；ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）
５０μｌ／ウェルで一晩被覆した。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ＣＯ_２イ
ンキュベーターで３７℃でＲＰＭＩ−１６４０（ＦＢＳ−ＲＰＭＩ）中１０％Ｆ
ＢＳで２〜４時間ブロックした。１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ−１６４０に脾
細胞を４×１０^６個／ｍｌで懸濁した。細胞１００μｌを各ウェルに加え、プレ
ートを３７℃で２０時間インキュベートした。各サンプルをウェル３個ずつで試
験した。インキュベーション後にプレートを蒸留水で短時間濯ぎ、ＰＢＳＴで３
回洗浄した。次に、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡで濃度２μｇ／ｍｌに希釈したビオチ
ン化ラット抗マウスＩＮＦ−γｍＡｂ検出抗体（ＸＭＧ１．２；ＰｈａｒＭｉｎ
ｇｅｎ）５０μｌを各ウェルに加えた。プレートを２４℃で２時間インキュベー
トした後、ＰＢＳＴで洗浄した。ＦＢＳ−ＲＰＭＩに１０００倍に希釈したスト
レプトアビジン結合アルカリホスファターゼ（ＫＰＬ）５０μｌを各ウェルに加
えた。プレートを２４℃で更に１時間インキュベートした。ＢＰＳＴで十分に洗
浄後、ＢＣＩＴ／ＮＢＴ基質（ＫＰＬ）１００μｌを１５分間加え、プレートを
水道水で洗浄して色反応を停止した。プレートを風乾し、解剖用顕微鏡を使用し
てスポットを数えた。

【０１０３】 細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）アッセイ−免疫したマウスからの脾細胞を同一遺
伝子型のペプチドをパルスして放射線照射したナイーブ脾細胞と７日間同時培養
した。^５１Ｃｒ−クロム酸ナトリウムの存在下に指定ペプチド２０μｇ／ｍｌを
加えるか又は加えずに３７℃で１時間ＥＬ−４細胞をインキュベートし、ターゲ
ット細胞として使用した。アッセイのために、ターゲット細胞１０^４個を種々の
数の脾細胞と共に９６穴プレートに加えた。プレートを３７℃で４時間インキュ
ベートした。インキュベーション後、上清を集め、Ｗａｌｌａｃγカウンターで
計数した。（［実験放出−自然放出］／［最大放出−自然放出］）×１００％と
して特異的溶解を計算した。自然放出はターゲット細胞を培地単独中でインキュ
ベートすることにより測定し、最大放出はターゲット細胞を２．５％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００中でインキュベートすることにより測定した。アッセイは各サンプ
ル３回ずつ実施した。

【０１０４】 動物実験−６〜１０週齢雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）４頭にＰＢＳ中ＤＮＡ１００μ
ｌを注射した。免疫から２週間後に各マウスからの脾臓を集め、ＣＴＬ及びＥｌ
ｉｓｐｏｔアッセイに使用した。

【０１０５】 結果（ＤＮＡベクターワクチン構築）−例示Ｎｅｆタンパク質配列はＨＩＶ−
１クレードＢ ｊｒｆｌ分離株に基づく。コドン最適化ｎｅｆ遺伝子をワクチン
構築と他の例示構築物の親遺伝子として使用するのに選択した。図２Ａ〜Ｂは野
生型ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）とコドン最適化ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）のコード配列の比較
を示す。Ｇｌｙ２Ａｌａ置換を含むものと、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター（ｔｐａ）リーダー配列をＮｅｆの６番目の残基Ｓｅｒに融合したもの（
ｔｐａｎｅｆ）の２種類のミリスチル化部位突然変異体を構築した。ジロイシン
モチーフ突然変異体はＬｅｕ１７４Ａｌａ置換とＬｅｕ１７５Ａｌａ置換を導入
することにより作製した。図４はＮｅｆとＮｅｆ突然変異体の模式図を示す。ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ発現及びｉｎ ｖｉｖｏ免疫原性試験のためにｎｅｆ遺伝子を発
現ベクターＶ１Ｊｎｓにクローニングした。野生型ｎｅｆ、ｔｐａｎｅｆ、ジロ
イシンモチーフ突然変異をもつｔｐａｎｅｆ及びＧｌｙ２Ａｌａミリスチル化部
位とジロイシンモチーフの突然変異をもつｎｅｆ突然変異体を含むプラスミドが
得られ、Ｖ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａ
ｎｅｆ（ＬＬＡＡ）及びＶ１Ｊｎｓ／（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）と夫々命名した。

【０１０６】 結果−発現及びウェスタンブロット分析−コドン最適化ｎｅｆ構築物の発現を
評価するために、アデノウイルス形質転換ヒト腎性２９３細胞に各ｎｅｆプラス
ミドとｇａｇ発現ベクターＶ１Ｊｎｓ／ｇａｇを同時トランスフェクトした。ト
ランスフェクションから７２時間後に細胞と培地を別々に集め、Ｎｅｆ及びＧａ
ｇ特異的ｍＡｂを使用してウェスタンブロッティングにより分析した。結果を図
５に示す。Ｖ１Ｊｎｓ／ｇａｇのみをトランスフェクトした細胞は約５５Ｋｄの
明白な単一バンドを示し、ｇａｇプラスミドとｎｅｆプラスミドを同時トランス
フェクトした細胞は５５Ｋｄバンドの他に主要３０Ｋｄバンドと数個の微小バン
ドを示した。このパターンは５５Ｋｄ種がＧａｇポリペプチドであり、３０Ｋｄ
及び他の微小種がＮｅｆ関連産物であることを裏付ている。従って、トランスフ
ェクトした細胞で全ｎｅｆ構築物が発現された。基準として比較的安定したＧａ
ｇシグナルに対して測定すると、４種のｎｅｆ遺伝子が降順にｔｐａｎｅｆ、ｎ
ｅｆ、ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）及びｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）の順で異なる
レベルで発現するようである。ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）を除き、ｎｅｆ、ｔ
ｐａｎｅｆ、ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）の産物は細胞画分と培地画分の両者で検
出することができた。

【０１０７】 マウスにおけるＮｅｆ特異的ＣＤ８及びＣＤ４エピトープのマッピング−マウ
スにおけるＮｅｆ（ｊｒｆｌ）の細胞性免疫応答誘発性については情報が得られ
なかった。そこで、本明細書に例示するＮｅｆ及びＮｅｆ突然変異体の免疫原性
を決定するためにＣＤ８及びＣＤ４エピトープをマッピングした。完全２１６ａ
ａＮｅｆポリペプチドを含む１組のオーバーラップするｎｅｆペプチドを作製し
た。２０種の２０量体と１種の１６量体を含む合計２１種のペプチドを作製した
。Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ３Ｈ及びＣ５７ＢＬ／６の３種のマウスをプラスミドＶ１Ｊ
ｎｓ／Ｎｅｆで免疫し、免疫したナイーブマウスから脾細胞を抽出し、Ｅｌｉｓ
ｐｏｔアッセイによりＮｅｆ特異的ＩＮＦ−γ分泌細胞（ＳＦＣ）を測定した。
図６はＮｅｆペプチドの別個プールに対してＥｌｉｓｐｏｔアッセイを実施した
場合を示す。免疫した全３種のマウスがＮｅｆプラスミド免疫に応答し、各々陽
性Ｎｅｆペプチド特異的ＩＮＦ−γＳＦＣを生じた。これに基づき、各ペプチド
に対して分画ＣＤ８及びＣＤ４細胞で更に試験を行った。結果を図７Ａ〜Ｃに示
す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（図７Ａ）では４種のＮｅｆペプチド即ちａａ１１〜３
０、ａａ６１〜８０、ａａ１９１〜２１０及びａａ２００〜２１６が相当数のＣ
Ｄ４ ＳＦＣを誘導できることが判明した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス（図７Ｂ）で
は、相当数のＣＤ４ ＳＦＣを誘導したのはただ１種のペプチド即ちａａ８１〜
１００のみであった。Ｂａｌｂ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスに比較してＣ３Ｈ
マウス（図７Ｃ）は特定ペプチドで主要なＣＤ４ ＳＦＣ応答を示さず、ａａ２
１〜４０、ａａ３１〜５０、ａａ１２１〜１４０、ａａ１３１〜１５０、ａａ１
８１〜２００及びａａ１９１〜２１０を含む一連のペプチドに応答して発生した
ＳＦＣは少数であった。ＣＤ８細胞については、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのみで単
一ペプチドａａ５１〜７０で相当ＳＦＣ応答が検出された。

【０１０８】 Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイの結果からＮｅｆペプチドａａ５１〜７０はＨ−２ｂ
に制限されるＣＤ８細胞エピトープを含むことが示唆された。このＣＤ８エピト
ープが細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープでもあるかどうかを確認するため
に、慣用ＣＴＬアッセイを実施した。ペプチドａａ５１〜７０（図８Ａ）は低レ
ベルの特異的死滅率しか誘導しなかった。典型的ＣＴＬエピトープの９アミノ酸
よりも長いペプチドはＭＨＣクラスＩ分子に対する結合親和性が低いことが多い
。ペプチドａａ５１〜７０で観察される低い特異的死滅率はこの２０アミノ酸ペ
プチドの結合親和性が低いためであると予想された。従って、２種の短縮ペプチ
ド即ちａａ６０〜６８とａａ５８〜７０を合成し、ＣＴＬアッセイで試験した。
ペプチドａａ６０〜６８は特異的死滅を誘導しなかった（図８Ｂ）が、ペプチド
ａａ５８〜７０はその長い対応ペプチドａａ６１〜８０に比較して特異的死滅率
の著しい増加を示した（図８Ｃ）。例えば、５：１のエフェクター／ターゲット
比でペプチドａａ５８〜７０により誘導される特異的死滅率はエフェクター／タ
ーゲット比４５でａａ５１〜８０により誘導される特異的死滅率と同等であった
。即ち、ペプチドａａ５８〜７０とペプチドａａ５１〜７０を比較すると、前者
のほうがＮｅｆ特異的死滅の誘導に関してほぼ１０倍有効であった。従って、Ｃ
ＴＬアッセイの結果から、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより検出されるＣＤ８エピ
トープは確かにＣＴＬエピトープであることが確認された。Ｎｅｆ ＣＴＬエピ
トープの最小アミノ酸配列を更にマッピングするために、更に５種のペプチドを
合成してＥｌｉｓｐｏｔアッセイにより分析した処、表１に示すようにＣＴＬエ
ピトープはＮｅｆ ａａ５８〜６６にマッピングされた。

【０１０９】

【表１】

【０１１０】 結果（マウスにおけるｎｅｆ突然変異体の免疫原性の評価）−Ｈ−２ｂに制限
されるＣＴＬ及びＣＤ４細胞エピトープが同定されたので、Ｃ５７ＢＬ／６マウ
スで種々のコドン最適化ｎｅｆ構築物の免疫原性を試験した。これは２回の別々
の実験で同一免疫手順を使用して実施した。第１の実験はｎｅｆ、ｔｐａｎｅｆ
（ＬＬＡＡ）及びｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）を試験し、第２の実験はｎｅｆ、
ｔｐａｎｅｆ、ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）及びｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）を試
験した。これらの各コドン最適化ｎｅｆ遺伝子を含むプラスミドでマウスを免疫
した。免疫から２週間後に各マウスから脾細胞を抽出し、夫々Ｎｅｆペプチドａ
ａ５８〜６６及びａａ８１〜１００を使用してＥｌｉｓｐｏｔアッセイによりＮ
ｅｆ特異的ＣＤ８及びＣＤ４ ＩＮＦ−γＳＦＣを分析した。結果を図９Ａ〜Ｂ
に示す。実験１（図９Ａ）では試験した３群のうちでコドン最適化ｔｐａｎｅｆ
（ＬＬＡＡ）構築物を接種したマウスが最高のＣＤ８及びＣＤ４細胞応答を生じ
、ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）とｎｅｆを比較すると、前者のほうが約４０倍のＣ
Ｄ８ ＳＦＣと１０倍のＣＤ４ ＳＦＣを誘導した。ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）
と比較すると、ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）突然変異体は免疫原性が低く、この
突然変異体を接種したマウスは試験条件下でＣＤ８及びＣＤ４ ＳＦＣを殆ど検
出できなかった。実験２でも３種の突然変異体間で同様の応答プロフィルが観察
された（図９Ｂ）が、ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）を接種したマウスの総ＣＤ８応
答は実験１で観察されるよりも実験２のほうが約１０倍高かった。ｔＰＡｎｅｆ
突然変異体はｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）と同等の応答を示した。従って、この結
果からコドン最適化ｔｐａｎｅｆ及びｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）はいずれも非常
に高い免疫原性をもつことが判明した。

【０１１１】 結果（アカゲザルにおけるｎｅｆ突然変異体の免疫原性の評価）−０、４及び
８週に指定コドン最適化プラスミド５ｍｇでサルを免疫した。各免疫から４週間
後に末梢血単核細胞を採取し、本実施例でマウス試験について記載したようにＮ
ｅｆ特異的ＩＮＦ−γ分泌細胞を試験した。結果を表２に示す。マウス試験と同
様に、ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）はｔＰＡｎｅｆに比較して非常に高い免疫原性
を示す。

【０１１２】

【表２】

【０１１３】 ＨＩＶ−１ ｊｒｆｌ分離株Ｎｅｆポリペプチドをコードするコドン最適化ｎ
ｅｆ遺伝子を合成した。得られた合成ｎｅｆ遺伝子はｉｎ ｖｉｔｒｏトランス
フェクトした細胞で良好に発現された。この合成遺伝子を親分子として使用し、
ミルスチル化部位とジロイシンモチーフに突然変異を含むｎｅｆ突然変異体を構
築した。単一Ｇｌｙ２Ａｌａ置換を含むものとヒトプラスミノーゲンアクチベー
ター（ｔｐａ）リーダーペプチドをＮｅｆポリペプチドのＮ末端に融合したもの
の２種のミルスチル化部位突然変異体を作製した。ジロイシンモチーフ突然変異
はＬｅｕ１７４ＡｌａとＬｅｕ１７５Ａｌａの置換により導入した。得られたｎ
ｅｆ構築物をｎｅｆ、ｔｐａｎｅｆ、ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）及びｎｅｆ（Ｇ
２Ａ，ＬＬＡＡ）と命名した。ｔｐａリーダーペプチド配列を加えると、ｎｅｆ
遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ発現が著しく増加したが、Ｇｌｙ２Ａｌａ突然変異又
はジロイシン突然変異ではｎｅｆ遺伝子発現が低下した。ｎｅｆ及びｎｅｆ突然
変異体の免疫原性を決定するために、マウスでｎｅｆＣＴＬ及びＴｈエピトープ
をマッピングする実験を行った。いずれもＨ−２ｂに制限される単一ＣＴＬエピ
トープと主要Ｔｈエピトープが同定された。従って、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＤ
ＮＡ免疫手段により種々のｎｅｆ構築物で免疫し、免疫したマウスから脾細胞を
抽出し、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイと明確なＴ細胞エピトープを使用してＮｅｆ特
異的ＣＴＬ及びＴｈ応答を測定した。その結果、ｔｐａｎｅｆとｔｐａｎｅｆ（
ＬＬＡＡ）はＣＴＬ及びＴｈ応答の両者の誘導に関してｎｅｆよりも免疫原性が
非常に高いことが判明した。

【０１１４】 従って、これらの上記ポリペプチドは霊長類やヒト等の哺乳動物を含む脊椎動
物に直接ｉｎ ｖｉｖｏ投与すると、動物の体内で各種ＨＩＶ−１ Ｎｅｆタン
パク質を発現し、発現されたＮｅｆ抗原に対して少なくとも細胞傷害性Ｔリンパ
球（ＣＴＬ）応答を宿主体内で誘導すると思われる。

【０１１５】 本発明は本明細書に記載した特定態様に範囲を限定しない。実際に、本明細書
に記載した態様に加えて本発明の種々の変形が上記記載から当業者に自明である
。このような変形も特許請求の範囲に含むものとする。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１ＡはＨＩＶ−１ ｎｅｆ構築物に使用したＤＮＡワクチン発現ベクターＶ
１Ｊｎｓの模式図を示す。

【図１Ｂ】 図１ＢはＨＩＶ−１修飾ｎｅｆ構築物に使用したＤＮＡワクチン発現ベクター
Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａの模式図を示す。

【図２Ａ】 図２Ａは野生型ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）とコドン最適化ｎｅｆのヌクレオチド配列
比較を示す。ｊｒｆｌ分離株からの野生型ｎｅｆ遺伝子は２１６アミノ酸ポリペ
プチドをコードすることが可能な６４８ヌクレオチドから構成される。ＷＴは野
生型配列（配列番号９）、ｏｐｔは（配列番号１に含まれる）コドン最適化配列
を示す。Ｎｅｆアミノ酸配列は１文字コードで示す（配列番号２）。

【図２Ｂ】 図２Ｂは野生型ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）とコドン最適化ｎｅｆのヌクレオチド配列
比較を示す。ｊｒｆｌ分離株からの野生型ｎｅｆ遺伝子は２１６アミノ酸ポリペ
プチドをコードすることが可能な６４８ヌクレオチドから構成される。ＷＴは野
生型配列（配列番号９）、ｏｐｔは（配列番号１に含まれる）コドン最適化配列
を示す。Ｎｅｆアミノ酸配列は１文字コードで示す（配列番号２）。

【図３Ａ】 図３Ａはｎｅｆ発現ベクターＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆのｎｅｆコード配列とプラス
ミド骨格の結合部のヌクレオチド配列を示す。コドン最適化ｎｅｆ又はコドン最
適化ｎｅｆ突然変異遺伝子の５’及び３’フランキング配列を太字／斜体で示し
、ｎｅｆ及びｎｅｆ突然変異体コード配列を細字で示す。各ｎｅｆ発現ベクター
の構築に使用した制限エンドヌクレアーゼ部位も（下線で）示す。Ｖ１Ｊｎｓ／
ｔｐａｎｅｆとＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）は結合部に同一配列をも
つ。

【図３Ｂ】 図３ＢはＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）のｎｅｆコード配列とプラ
スミド骨格の結合部のヌクレオチド配列を示す。コドン最適化ｎｅｆ又はコドン
最適化ｎｅｆ突然変異遺伝子の５’及び３’フランキング配列を太字／斜体で示
し、ｎｅｆ及びｎｅｆ突然変異体コード配列を細字で示す。各ｎｅｆ発現ベクタ
ーの構築に使用した制限エンドヌクレアーゼ部位も（下線で）示す。Ｖ１Ｊｎｓ
／ｔｐａｎｅｆとＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）は結合部に同一配列を
もつ。

【図３Ｃ】 図３ＣはＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ及びＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ
）のｎｅｆコード配列とプラスミド骨格の結合部のヌクレオチド配列を示す。コ
ドン最適化ｎｅｆ又はコドン最適化ｎｅｆ突然変異遺伝子の５’及び３’フラン
キング配列を太字／斜体で示し、ｎｅｆ及びｎｅｆ突然変異体コード配列を細字
で示す。各ｎｅｆ発現ベクターの構築に使用した制限エンドヌクレアーゼ部位も
（下線で）示す。Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆとＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬ
ＡＡ）は結合部に同一配列をもつ。

【図４】 図４はｎｅｆ及びｎｅｆ誘導体の模式図を示す。Ｎｅｆ誘導体に含まれるアミ
ノ酸残基を示す。グリシン２とロイシン１７４及び１７５は夫々ミリスチル化と
ジロイシンモチーフに関与する部位である。ｔｐａｎｅｆ融合遺伝子の両形態で
は推定リーダーペプチド切断部位を「＊」で示し、突然変異体の構築中に導入さ
れた外来セリン残基を下線で示す。

【図５】 図５はトランスフェクトした２９３細胞で発現されたｎｅｆ及び修飾ｎｅｆタ
ンパク質のウェスタンブロット分析を示す。１００ｍｍ培養皿で増殖させた２９
３細胞に各種コドン最適化ｎｅｆ構築物をトランスフェクトした。トランスフェ
クションから６０時間後に上清と細胞を別々に集め、減圧条件下に１０％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、いずれも２０００倍に
希釈したＧａｇ ｍＡｂとＮｅｆ ｍＡｂの混合物でプローブした。タンパク質
シグナルはＥＣＬで検出した。（Ａ）Ｖ１Ｊｎｓ／ｇａｇ単独をトランスフェク
トした細胞、（Ｂ）Ｖ１Ｊｎｓ／ｇａｇとＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆをトランスフェク
トした細胞、（Ｃ）Ｖ１Ｊｎｓ／ｇａｇとＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡ
Ａ）をトランスフェクトした細胞、（Ｄ）Ｖ１Ｊｎｓ／ｇａｇとＶ１Ｊｎｓ／ｔ
ｐａｎｅｆをトランスフェクトした細胞、（Ｅ）Ｖ１Ｊｎｓ／ｇａｇとＶ１Ｊｎ
ｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）をトランスフェクトした細胞。下段の文字ｃ及び
ｍは夫々細胞フラクションと培地フラクションを表す。Ｍ．Ｗ．＝分子量マーカ
ー。

【図６】 図６はＮｅｆペプチドに対する細胞媒介応答のＥｌｉｓｐｏｔアッセイを示す
。Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６及びＣ３Ｈの３種のマウスをＶ１Ｊｎｓ／ｎｅ
ｆ（コドン最適化）５０μｇで免疫し、２週間隔で２回ブースター免疫した。最
終免疫から２週間後に脾細胞を抽出し、各種Ｎｅｆペプチドプールに対してＥｌ
ｉｓｐｏｔアッセイで試験した。対照として非免疫ナイーブマウスから脾細胞を
抽出して平行試験した。ＮｅｆペプチドプールＡは全２１種のＮｅｆペプチドか
ら構成され、ＮｅｆペプチドプールＢは残基１から開始する１１種のオーバーラ
ップしないペプチドから構成され、ＮｅｆペプチドプールＣは残基１１から開始
する１０種のオーバーラップしないペプチドから構成される。ＳＦＣはＩＮＦ−
γ分泌スポット形成細胞である。

【図７Ａ】 図７ＡはＮｅｆ特異的ＣＤ８及びＣＤ４エピトープマッピングを示す。免疫手
順は図６に示した通りである。マウス脾細胞を抽出し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの磁気
細胞分離器を使用してＣＤ８^＋細胞とＣＤ８⁻細胞に分画した。次に、得られた
ＣＤ８^＋細胞とＣＤ８⁻細胞を各Ｎｅｆペプチドに対してＥｌｉｓｐｏｔアッセ
イで試験した。ＳＦＣはＩＮＦ−γ分泌スポット形成細胞である。試験したマウ
ス系統はＢａｌｂ／ｃマウスである。

【図７Ｂ】 図７ＢはＮｅｆ特異的ＣＤ８及びＣＤ４エピトープマッピングを示す。免疫手
順は図６に示した通りである。マウス脾細胞を抽出し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの磁気
細胞分離器を使用してＣＤ８^＋細胞とＣＤ８⁻細胞に分画した。次に、得られた
ＣＤ８^＋細胞とＣＤ８⁻細胞を各Ｎｅｆペプチドに対してＥｌｉｓｐｏｔアッセ
イで試験した。ＳＦＣはＩＮＦ−γ分泌スポット形成細胞である。試験したマウ
ス系統はＣ５７ＢＬ／６マウスである。

【図７Ｃ】 図７ＣはＮｅｆ特異的ＣＤ８及びＣＤ４エピトープマッピングを示す。免疫手
順は図６に示した通りである。マウス脾細胞を抽出し、Ｍｉｌｔｅｎｙｉの磁気
細胞分離器を使用してＣＤ８^＋細胞とＣＤ８⁻細胞に分画した。次に、得られた
ＣＤ８^＋細胞とＣＤ８⁻細胞を各Ｎｅｆペプチドに対してＥｌｉｓｐｏｔアッセ
イで試験した。ＳＦＣはＩＮＦ−γ分泌スポット形成細胞である。試験したマウ
ス系統はＣ３Ｈマウスである。

【図８Ａ】 図８ＡはＮｅｆ ＣＴＬエピトープの同定を示す。ｎｅｆで免疫したＣ５７Ｂ
Ｌ／６マウスからの脾細胞をペプチドバルス放射線照射ナイーブ脾細胞で７日間
ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に細胞を回収し、ペプチド
パルスＥＬ−４細胞をターゲットとして使用して標準^５１Ｃｒ放出アッセイで試
験した。白記号はペプチドの不在下のＥＬ−４細胞の特異的致死率であり、黒記
号はペプチドの存在下のＥＬ−４細胞の特異的致死率である。パネルＡはペプチ
ドＮｅｆ５１〜７０である。

【図８Ｂ】 図８ＢはＮｅｆ ＣＴＬエピトープの同定を示す。ｎｅｆで免疫したＣ５７Ｂ
Ｌ／６マウスからの脾細胞をペプチドバルス放射線照射ナイーブ脾細胞で７日間
ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に細胞を回収し、ペプチド
パルスＥＬ−４細胞をターゲットとして使用して標準^５１Ｃｒ放出アッセイで試
験した。白記号はペプチドの不在下のＥＬ−４細胞の特異的致死率であり、黒記
号はペプチドの存在下のＥＬ−４細胞の特異的致死率である。パネルＢはペプチ
ドＮｅｆ６０〜６８である。

【図８Ｃ】 図８ＣはＮｅｆ ＣＴＬエピトープの同定を示す。ｎｅｆで免疫したＣ５７Ｂ
Ｌ／６マウスからの脾細胞をペプチドバルス放射線照射ナイーブ脾細胞で７日間
ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激後に細胞を回収し、ペプチド
パルスＥＬ−４細胞をターゲットとして使用して標準^５１Ｃｒ放出アッセイで試
験した。白記号はペプチドの不在下のＥＬ−４細胞の特異的致死率であり、黒記
号はペプチドの存在下のＥＬ−４細胞の特異的致死率である。パネルＣはペプチ
ドＮｅｆ５８〜７０である。

【図９Ａ】 図９ＡはＮｅｆと修飾型Ｎｅｆを発現するコドン最適化ＤＮＡワクチンベクタ
ーの免疫原性の比較を示す。各群５頭のＣ５７ＢＬ／６マウスを指定ｎｅｆ構築
物１００μｇで免疫した。免疫から１４日後に脾細胞を集め、Ｎｅｆ ＣＤ８（
ａａ５８〜６６）及びＣＤ４（ａａ８１〜１００）ペプチドに対して試験した。
両方の実験に同一免疫手順を使用した。実験１（パネルＡ）ではＶ１Ｊｎｓ／ｎ
ｅｆ、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）及びＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ
，ＬＬＡＡ）の３種のコドン最適化ｎｅｆ構築物を試験した。データは各群５頭
のマウスの平均＋標準偏差を表す。

【図９Ｂ】 図９ＢはＮｅｆと修飾型Ｎｅｆを発現するコドン最適化ＤＮＡワクチンベクタ
ーの免疫原性の比較を示す。各群５頭のＣ５７ＢＬ／６マウスを指定ｎｅｆ構築
物１００μｇで免疫した。免疫から１４日後に脾細胞を集め、Ｎｅｆ ＣＤ８（
ａａ５８〜６６）及びＣＤ４（ａａ８１〜１００）ペプチドに対して試験した。
両方の実験に同一免疫手順を使用した。実験２（パネルＢ）では全４種のコドン
最適化ｎｅｆ構築物を試験した。データは各群５頭のマウスの平均＋標準偏差を
表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 リアン，シヤオピン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 フー，トン−ミン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA35 CA01 DA03 EA02 EA04 GA11 GA18 HA03 4C085 AA03 AA38 BB23 CC31 EE06 FF01 FF11 4H045 AA10 AA30 BA10 CA05 DA86 EA31 FA74

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）ＤＮＡ発現ベクターと、 （ｂ）Ｎｅｆタンパク質又はその免疫原性Ｎｅｆ誘導体をコードするコドン最適
   化オープンリーディングフレームを含むＤＮＡ分子を含む医薬的に許容可能なＤ
   ＮＡワクチンであって、ＤＮＡワクチンを宿主に投与すると、Ｎｅｆタンパク質
   又は免疫原性Ｎｅｆ誘導体が発現され、ＨＩＶ−１感染に対する実質的レベルの
   保護を提供する免疫応答を生じる前記ＤＮＡワクチン。
2. 【請求項２】 ＤＮＡ分子が野生型Ｎｅｆをコードする請求項１に記載のＤ
   ＮＡワクチン。
3. 【請求項３】 ＤＮＡ分子が配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む請求
   項２に記載のＤＮＡワクチン。
4. 【請求項４】 Ｖ１Ｊｎｓ−ｏｐｔ ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）である請求項３に
   記載のＤＮＡワクチン。
5. 【請求項５】 ＤＮＡ分子が配列番号２に示すアミノ酸配列を含む野生型Ｎ
   ｅｆタンパク質を発現する請求項２に記載のＤＮＡワクチン。
6. 【請求項６】 ＤＮＡ分子がリーダーペプチドをコードするヌクレオチド配
   列を含む免疫原性Ｎｅｆ誘導体をコードする請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
7. 【請求項７】 ＤＮＡ分子がヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターリー
   ダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む免疫原性Ｎｅｆ誘導体をコー
   ドする請求項６に記載のＤＮＡワクチン。
8. 【請求項８】 ＤＮＡ分子が配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む請求
   項７に記載のＤＮＡワクチン。
9. 【請求項９】 Ｖ１Ｊｎｓ−ｏｐｔ ｔｐａｎｅｆである請求項８に記載の
   ＤＮＡワクチン。
10. 【請求項１０】 ＤＮＡ分子が配列番号４に示すアミノ酸配列を含む免疫原
    性Ｎｅｆ誘導体を発現する請求項７に記載のＤＮＡワクチン。
11. 【請求項１１】 ＤＮＡ分子がアミノ酸残基１７４及びアミノ酸残基１７５
    のジロイシンモチーフを修飾させた免疫原性Ｎｅｆ誘導体をコードする請求項６
    に記載のＤＮＡワクチン。
12. 【請求項１２】 ＤＮＡ分子がヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターリ
    ーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む免疫原性Ｎｅｆ誘導体をコ
    ードする請求項１１に記載のＤＮＡワクチン。
13. 【請求項１３】 ＤＮＡ分子が配列番号７に示すヌクレオチド配列を含む請
    求項１２に記載のＤＮＡワクチン。
14. 【請求項１４】 Ｖ１Ｊｎｓ−ｏｐｔ ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）である請
    求項１３に記載のＤＮＡワクチン。
15. 【請求項１５】 ＤＮＡ分子が配列番号８に示すアミノ酸配列を含む免疫原
    性Ｎｅｆ誘導体を発現する請求項１１に記載のＤＮＡワクチン。
16. 【請求項１６】 ＤＮＡ分子がグリシン以外のアミノ酸残基をコードするよ
    うにＮｅｆのアミノ酸残基２のグリシン残基を修飾させたＮｅｆタンパク質をコ
    ードする請求項１１に記載のＤＮＡワクチン。
17. 【請求項１７】 ＤＮＡ分子が配列番号５に示すヌクレオチド配列を含む請
    求項１６に記載のＤＮＡワクチン。
18. 【請求項１８】 Ｖ１Ｊｎｓ−ｏｐｔ ｎｅｆ（Ｇ２Ａ ＬＬＡＡ）である
    請求項１７に記載のＤＮＡワクチン。
19. 【請求項１９】 ＤＮＡ分子が配列番号６に示すアミノ酸配列を含む免疫原
    性Ｎｅｆ誘導体を発現する請求項１６に記載のＤＮＡワクチン。
20. 【請求項２０】 更にアジュバントを含む請求項１に記載のＤＮＡワクチン
    。
21. 【請求項２１】 アジュバントがリン酸アルミニウム、リン酸カルシウム及
    び非イオンブロックコポリマーから構成される群から選択される請求項２０に記
    載のＤＮＡワクチン。
22. 【請求項２２】 （ａ）ＤＮＡ発現ベクターと、 （ｂ）Ｎｅｆタンパク質又はその免疫原性Ｎｅｆ誘導体をコードするオープンリ
    ーディングフレームを含むＤＮＡ分子を含む医薬的に許容可能なＤＮＡワクチン
    であって、ＤＮＡワクチンを宿主に投与すると、Ｎｅｆタンパク質又は免疫原性
    Ｎｅｆ誘導体が発現され、ＨＩＶ−１感染に対する実質的レベルの保護を提供す
    る免疫応答を生じる前記ＤＮＡワクチン。
23. 【請求項２３】 ＤＮＡ分子が配列番号２、配列番号４、配列番号６及び配
    列番号８から構成される群に示すアミノ酸配列を含む野生型Ｎｅｆタンパク質を
    発現する請求項２２に記載のＤＮＡワクチン。
24. 【請求項２４】 更にアジュバントを含む請求項２２に記載のＤＮＡワクチ
    ン。
25. 【請求項２５】 アジュバントがリン酸アルミニウム、リン酸カルシウム及
    び非イオンブロックコポリマーから構成される群から選択される請求項２３に記
    載のＤＮＡワクチン。
26. 【請求項２６】 ＨＩＶのビルレント株に起因する感染又は疾患に対する細
    胞媒介免疫（ＣＴＬ）応答を誘導する方法であって、ＤＮＡ発現ベクターと、Ｎ
    ｅｆタンパク質又はその免疫原性Ｎｅｆ誘導体をコードするコドン最適化オープ
    ンリーディングフレームを含むＤＮＡ分子を含み、脊椎動物宿主に投与すると、
    Ｎｅｆタンパク質又は免疫原性Ｎｅｆ誘導体が発現され、細胞媒介免疫（ＣＴＬ
    ）応答を生じる医薬的に許容可能なＤＮＡワクチン組成物を脊椎動物宿主の組織
    に投与することを特徴とする前記方法。
27. 【請求項２７】 脊椎動物宿主がヒトである請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 ＤＮＡワクチンがＶ１Ｊｎｓ−ｏｐｔ ｎｅｆ（ｊｒｆｌ
    ）、Ｖ１Ｊｎｓ−ｏｐｔ ｔｐａｎｅｆ、Ｖ１Ｊｎｓ−ｏｐｔ ｔｐａｎｅｆ（
    ＬＬＡＡ）及びＶ１Ｊｎｓ−ｏｐｔ ｎｅｆ（Ｇ２Ａ ＬＬＡＡ）から構成され
    る群から選択される請求項２６に記載の方法。
29. 【請求項２９】 配列番号４、配列番号６及び配列番号８から構成される群
    から選択されるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたタンパク質。