PL229124B1 - Szczepionka DNA skierowana przeciwko wirusowi grypy H5N1, zmodyfikowana sekwencja nukleotydowa oraz zastosowanie zmodyfikowanej nukleotydowej sekwencji do wytwarzania szczepionki - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku są: szczepionka DNA skierowana przeciwko wirusowi grypy H5N1, zmodyfikowana sekwencja nukleotydowa oraz zastosowanie zmodyfikowanej nukleotydowej sekwencji do wytwarzania szczepionki. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy zastosowania modyfikacji sekwencji kodującej antygen w celu podwyższenia efektywności szczepionki DNA.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka DNA skierowana przeciwko wirusowi grypy H5N1, zmodyfikowana sekwencja nukleotydowa oraz zastosowanie zmodyfikowanej nukleotydowej sekwencji do wytwarzania szczepionki. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy zastosowania modyfikacji sekwencji kodującej antygen w celu podwyższenia efektywności szczepionki DNA.

Szczepionki DNA stanowią coraz silniej rozwijający się segment szczepionek nowej generacji, o czym świadczą chociażby trwające badania kliniczne przeciwko różnym chorobom, głównie wirusowym jak grypa, AIDS, żółtaczka, gorączka krwotoczna, a także nowotworom (clinicaltrials.gov).

Szczepionki DNA spełniają wiele wymogów, które stanowią o ich atrakcyjności względem tradycyjnych preparatów. Są one stosunkowo łatwe i tanie w produkcji dzięki ominięciu często długotrwałej i skomplikowanej procedury otrzymywania białek w systemach ekspresyjnych oraz ich oczyszczania. Tym samym dają możliwość szybkiego zaprojektowania i skonstruowania szczepionki, np. w przypadku nagłego wybuchu epidemii. Dodatkowo często gwarantują uzyskanie antygenu o strukturze identycznej z wersją powstającą w trakcie infekcji, tj. zawierającego post-translacyjne modyfikacje właściwe dla gospodarza, ponieważ produkcja białka zachodzi in vivo, właśnie w komórkach gospodarza. Natomiast są one bezpieczne, gdyż na żadnym etapie produkcji nie wykorzystuje się infekcyjnych form patogenu. Są także o wiele bardziej stabilne w przechowywaniu i transporcie w porównaniu z preparatami białkowymi. Ponadto wiadomo, że szczepionki DNA indukują zarówno komórkową, jak i humoralną odpowiedź immunologiczną stymulując limfocyty T, komórki APC i produkcję przeciwciał, co w wielu przypadkach skutkuje szeroką i długotrwałą ochroną przed zakażeniem. Technologia ta posiada także pewne ograniczenia. Na przykład, w tego typu szczepionkach mogą być wykorzystywane jedynie antygeny białkowe, ponieważ tylko takie antygeny mogą być kodowane przez DNA. Poza tym, antygeny bakteryjne mogą być niewłaściwie formowane podczas obróbki post-translacyjnej. Brak jest także skutecznych metod masowej aplikacji. Często opisywanym problemem jest to, że są one o wiele mniej immunogenne w przypadku dużych zwierząt oraz człowieka niż w przypadku małych zwierząt laboratoryjnych. Dlatego stosowane są modyfikacje umożliwiające zwiększenie skuteczności aplikowanego DNA, uwzględniające zastosowanie chemicznych nośników, jak liposomy, czy też metody fizyczne, jak elektroporacj a, a także modyfikacje samego DNA w oparciu o wiedzę z dziedzin immunologii, inżynierii genetycznej, genomiki czy biochemii. Przykładowe publikacje przeglądowe o szczepionkach DNA (Liu, 2011; Stachyra et al., 2014b).

Oprócz szczepionek DNA technologie wprowadzania obcego DNA do komórek różnych organizmów rozwijane są w kilku dziedzinach. Ich zastosowanie to tak zwana terapia genowa, np. przeciwko nowotworom lub chorobom genetycznym, produkcja potrzebnych białek terapeutycznych, w tym leków i szczepionek w systemach ekspresyjnych opartych o komórki różnych organizmów: roślin, bakterii, drożdży, owadów i ssaków. Wszystkie te systemy wymagają ciągłego dopracowywania i zwiększenia wydajności by były skuteczne i opłacalne. Każdy gospodarz i każdy docelowy gen musi być traktowany inaczej. Wiele nowatorskich rozwiązań testowano w oparciu o nośniki DNA, poprawiające wnikanie cząsteczek do komórki, oraz modyfikacje kasety ekspresyjnej i wektora. Modyfikacje takie mogą uwzględniać dodawanie elementów regulatorowych lub sygnalnych, a także zmiany w samej sekwencji antygenu pozwalających na zwiększenie ekspresji na różnych etapach. Począwszy od transportu cząsteczki DNA do jądra komórkowego, zwiększenie wydajności i tempa transkrypcji, a następnie translacji, aż do kierowania powstałego białka do różnych kompartmentów komórki czy szlaków transportowych. Jeśli chodzi o wzmocnienie transkrypcji i translacji to stosowane są manipulacje sekwencją nukleotydową w celu zwiększenia procentowego udziału kodonów preferowanych przez dany organizm (przy zachowaniu niezmienionej sekwencji białka), uniknięcia motywów tworzących drugo-rzędowe struktury RNA, czy innych obniżających efektywność pracy polimeraz i rybosomów (Plotkin and Kudla, 2011).

W opisie tym kodonem nazywamy sekwencję trzech nukleotydów kodujących aminokwas. Każdy aminokwas, z wyjątkiem metioniny i tryptofanu, jest kodowany przez kilka synonimicznych kodonów. W kodzie genetycznym bardzo często substytucja (zamiana) zasady A w G lub U w C w trzeciej pozycji kodonu jest zmianą synonimiczną, nie prowadzi do zmiany aminokwasu i może wpłynąć tylko na stabilność mRNA czy też wydajność syntezy białka (Brown, 2012).

Częstotliwość występowania danego kodonu zależy od gatunku. Organizmy ewolucyjnie blisko spokrewnione na ogół wykorzystują bardzo podobne kodony do syntezy swoich białek, podczas gdy odlegle taksonomicznie organizmy wykorzystują bardzo różne zestawy kodonów. Zatem, częstotliwość

PL 229 124 B1 występowania tych samych kodonów, np. w komórkach bakterii lub drożdży jest inna niż w komórkach ssaczych (Nagata i wsp., 1999).

W stanie techniki dostępne są publikacje dotyczące modyfikacji (optymalizacji) genu polegającej na wzbogaceniu sekwencji kodującej w zasady: guaninę (G) i cytozynę (C). W prowadzonych wcześniej badaniach także zauważono, że zwiększenie udziału zasad GC w sekwencji kodującej może wpłynąć np. na zwiększenie efektywności (wzmocnienie) transkrypcji, translacji, zwiększenie stabilności mRNA oraz poziomu produkcji białka. Taki efekt modyfikacji genu był obserwowany m.in. dla sekwencji kodującej GFP (Zolotukhin i wsp., 1996), HIV env (Haas i wsp., 1996), białko EPO (Kim i wsp., 1997), BPVL1 (Zhou i wsp. 1999), HIV gag (Kotsopoulou i wsp., 2000), aequorin (Vemon i Printen, 2002). W każdym przypadku zauważono zwiększenie poziomu produkcji białka w transfekowanych komórkach od 10- do nawet 1000-krotnie w porównaniu z formą niezmodyfikowaną, zawierającą mały procent GC.

Jedną z pierwszych prac, która badała zagadnienie wpływu optymalizacji kodonów na immunogenność zmienionej sekwencji kodującej antygen (podawanej w formie szczepionki DNA) jest publikacja Andre i wsp., 1998. Praca dotyczyła optymalizacji genu HIV, kodującego białko gp120, w kierunku zwiększenia poziomu ekspresji w ludzkich komórkach poprzez zmianę kodonów na kodony optymalne w komórkach ludzkich. Poziom produkcji białka w transfekowanych komórkach 293T, HeLa, cos-7 i 3T3 był zróżnicowany i zależny od konstruktu, jednak w każdym przypadku zauważono zdecydowanie wyższy poziom produkcji białka optymalizowanego syngag120 niż formy dzikiej gag120. Dodatkowo w badaniach in vivo, polegających na immunizacji myszy BALB/c plazmidami zawierającymi niezmodyfikowaną lub syntetyczna sekwencję, zauważono, że modyfikacja sekwencji zwiększyła również poziom odpowiedzi humoralnej i komórkowej. W surowicy myszy BALB/c immunizowanych plazmidem zawierającym syntetyczną sekwencję wykrywano wyższy poziom przeciwciał. Także komórki CTL, izolowane ze śledzion immunizowanych myszy, wykazywały większą aktywność. Podobne wyniki, czyli wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej (m.in. zwiększenie poziomu przeciwciał oraz zwiększenie aktywności komórek CTL) otrzymano po immunizacji myszy: optymalizowanymi sekwencjami oligonukleotydów LLO 91-99 (epitopy z Listeria monocytogenes w fuzji z genem lucyferazy) i CSP 281-290 (epitop z Plazmodium yoelii w fuzji z genem lucyferazy) (Nagata i wsp., 1999), szczepionką DNA zawierającą optymalizowaną sekwencję genu kodującego fragment toksyny C (TetC) z Clostridium tetani (Stratford i wsp., 2001) lub HIV gag (Deml i wsp., 2001).

W kolejnych badaniach, prowadzonych w 2005 przez Ko i wsp., nie tylko potwierdzono podwyższenie poziomu produkcji białka i wzrost immunogenności szczepionki DNA zawierającej zmodyfikowaną wersję genu kodującą antygen Ag85B z Mycobacerium tuberculosis, ale również podniesienie odporności myszy immunizowanej wyżej wymienionym konstruktem po infekcji bakterią. Modyfikacja sekwencji nukleotydowej antygenu Ag85B polegała na zwiększeniu zawartości nukleotydów GC z 64,2% na 68,5%. Konsekwencją zmian był wyższy poziom białka Ag85B zarówno in vitro w transfekowanych komórkach cos-7 jak również in vivo w mięśniach immunizowanych myszy BALB/c. Ponadto, splenocyty izolowane ze śledzion myszy immunizowanych plazmidem DNA zawierającym sekwencję modyfikowaną charakteryzowały się wyższym poziomem proliferacji, jak również wyższym poziomem produkcji INF-γ niż w przypadku immunizacji myszy plazmidem zawierającym formę niezmodyfikowaną. Dodatkowo badano skuteczność zastosowanej szczepionki. Myszy były immunizowane 3-krotnie domięśniowo 100 μg dawką plazmidowego DNA, zawierającego sekwencję niezmodyfikowaną, zmodyfikowaną oraz pustym wektorem, a także komercyjnie dostępną szczepionką BCG. Cztery tygodnie po ostatniej immunizacji myszy były zakażane bakterią M. tuberculosis. Następnie 4 tygodnie po infekcji badano ilość bakterii w płucach i śledzionie. Najniższą liczbę bakterii w badanych organach zauważono u myszy immunizowanych szczepionką DNA zawierającą zmodyfikowaną sekwencję oraz komercyjnie dostępną szczepionką przeciw gruźlicy BCG.

Jedną z prac dotyczących ekspresji genów różniących się między sobą zawartością GC w trzeciej pozycji w kodonie (GC3) jest publikacja Kudly i wsp. z 2006 (Kudla i wsp., 2006). W pierwszym doświadczeniu porównano poziom ekspresji genów z rodziny Hsp70: HSPA1A zawierający 92% GC3 z HSPA8 zawierającym 46% GC3 oraz ekspresję genu kodującego GFP „bogatego” w GC (96%) w pozycji trzeciej z ekspresją genu „ubogiego” w GC3 (35%). Wyniki pokazały, że zarówno w przejściowo jak i w stabilnie transfekowanych komórkach (HeLa i MCF-7, odpowiednio) poziom ekspresji genów z większą zawartością GC3 był od kilkunastu do 100 razy wyższy niż w przypadku sekwencji ubogich w GC w trzeciej pozycji.

Dla potwierdzenia powyższych wyników Kudla i wsp. (2006) badali także poziom produkcji hIL-2, której sekwencja kodująca została zmieniona syntetycznie, zmiany obejmowały 100%, 70%, 43% i 7%

PL 229 124 B1 sekwencji i dotyczyły zawartości zasad GC w trzeciej pozycji. W tym przypadku także zauważono, że najwyższy poziom produkcji białka jest dla zmian synonimicznych obejmujących 100% sekwencji, nieco niższy dla 70%, kolejno dla 43% i na granicy wykrywalności dla 7% zmian. Powyższe wyniki otrzymano w przejściowo transfekowanych komórkach HeLa oraz potwierdzono w stabilnie transferowanych komórkach MCF-7. Niebywały wzrost produkcji białka, nawet 100-krotny, związany ze zwiększeniem udziału zasad GC w trzeciej pozycji w sekwencji kodującej powyższe białka, autorzy tłumaczą zwiększoną efektywnością transkrypcji lub stabilnością mRNA.

W oparciu o wyniki zawarte w tej pracy modyfikowano sekwencję hemaglutyniny z H5N1, która stanowi przedmiot niniejszego patentu.

W zgłoszeniu patentowym US2004022805 (opubl. 2004-02-05) opisano syntetyczne sekwencje genowe kodujące białko zarodźca malarii wiążące się z erytrocytem w celu ekspresji/produkcji tego białka. Dobór kodonów w syntetycznych sekwencjach genowych jest zbliżony do składu kodonów ssaczych. Syntetyczne sekwencje genowe są przydatne do wprowadzenia do wektorów szczepionek DNA i/lub do wprowadzania do różnych innych wektorów ekspresyjnych aby uzyskać produkcję białek malarii. Syntetyczne geny mogą być modyfikowane w celu uniknięcia post-translacyjnej modyfikacji kodowanego białka w organizmie. Podawanie syntetycznych sekwencji genowych lub kodowanego białka, jako czynnika immunizacyjnego jest przydatne do wywoływania odporności przeciwko malarii i/lub w leczeniu malarii.

W zgłoszeniu patentowym JP2012161329 (opubl. 2012-08-30) przedstawiono gen lucyferazy zoptymalizowany do obserwacji wewnątrzkomórkowej luminescencji. Konstrukt genowy koduje niewrażliwą na pH lucyferazę z Pyrearinus termitilluminans i zapewniający intensywność luminescencji w komórkach ssaków 15-krotnie lub więcej wyższą względem konstruktu genowego kodującego lucyferazę świetlika Photinus pyralis. Sekwencja genowa została tak zmodyfikowana aby zapewnić wystarczający poziom translacji w komórkach ssaczych konstruktu genowego kodującego niewrażliwą na pH lucyferazę z Pyrearinus termitilluminans.

W zgłoszeniu patentowym US5670356 (opubl. 1997-09-23) opisano zmodyfikowaną lucyferazę chrząszcza, którą opracowano w celu zwiększenia wydajności jej działania. Zmodyfikowana forma zawiera co najmniej jedną nową cechę. Najważniejszą spośród nich jest usunięcie sekwencji translokacji peroksysomalnej, co prowadzi do uzyskania cytoplazmatycznej formy enzymu. Inne zmiany obejmują usunięcie z genu potencjalnie zakłócających miejsc restrykcyjnych i genetycznych miejsc regulatorowych, a także poprawę wykorzystania kodonów w komórkach ssaczych. Zmodyfikowany enzym reporterowy lucyferazy jest także pozbawiony potencjalnych miejsc N-glikozylacji w celu zminimalizowania post-translacyjnej modyfikacji i pozostaje w cytoplazmie komórek gospodarza, w celu optymalizacji dostępności substratu.

W zgłoszeniach patentowych WO0143693 (opubl. 2001-06-21) oraz US2003096778 (opubl. 2003-05-22) ujawniono kompozycje farmaceutyczne, które zawierają szczepionki DNA oparte na sekwencji kodującej białko Nef wirusa HIV, sposób ich wytwarzania i zastosowania. Te szczepionki DNA wprowadzane są bezpośrednio do żywych tkanek kręgowców, korzystnie ludzkich, gdzie następuje wytwarzanie białka Nef wirusa HIV albo jego immunogennych biologicznych pochodnych, wywołując odpowiedź immunologiczną, zapewniającą istotny poziom ochrony przed infekcją wirusem HIV-1. Wchodzące w skład szczepionki DNA cząsteczki DNA, które zawierają otwarte ramki odczytu są syntetycznymi cząsteczkami DNA z zoptymalizowanymi kodonami kodującymi Nef HIV 1 oraz jego pochodne, włączając modyfikacje Nef obejmujące N-końcowe peptydy liderowe, usunięcie miejsca mirystylowania, i/lub modyfikację motywu dwuleucynowego. Modyfikacje te mogą wpływać na charakterystykę Nef typu dzikiego, na przykład mirystylację i ograniczenie produkcji CD4 gospodarza.

W zgłoszeniu patentowym WO2008124331 (opubl. 2008-10-16) przedstawiono nowe sekwencje oraz szczepionki DNA przeciwko ptasiej grypie. Nowe sekwencje zaprojektowane zostały do ochrony gospodarza przed zjadliwym szczepem H5N1 wirusa grypy typu A (ptasiej grypy) i obejmują sekwencje zoptymalizowane pod względem kodonów kodujących hemaglutyninę (np. H5) i neuraminadazę (np. N1) - antygenowe białka wirusa. Sekwencje mogą być stosowane pojedynczo, razem lub w połączeniu z innymi sekwencjami, tak by wywołać ochronną odpowiedź immunologiczną po prowokacji wirusem (jako szczepionka DNA). Wynalazek obejmuje również kasety ekspresyjne zawierające sekwencje H5 i/lub N1 zoptymalizowane pod względem kodonów, oraz mające dodatkowe optymalizacje innych sekwencji takich jak promotory, terminatory transkrypcji i innych które mogą być wykorzystywane do wzmocnienia ekspresji i prezentacji antygenu ulegającego ekspresji wewnątrz gospodarza.

PL 229 124 B1

W zgłoszeniu patentowym ΜΧ2009013008 (opubl. 2010-06-09) opisano szczepionki przeciwko grypie. Wynalazek dotyczy szczepionek i zastosowania nagiego DNA i/lub RNA kodujących hemaglutyninę (HA) z różnych typów wirusa grypy jako składnika szczepionki przeciwko obecnej i przyszłej infekcji wirusami zawierającymi H1, H2, H3, H5, H7, N1, N2, N3, obejmując zakażenia grypą A u ludzi i/lub ewentualnie świń oraz zastosowanie nagiego DNA i/lub RNA kodującego cząsteczkę neuraminidazy (NA) i/lub białko macierzy (M) i/lub nukleoproteinę (NP). Jeśli składniki szczepionki są stosowane jako szczepionki DNA lub RNA, z lub bez odpowiedniego białka, kodony mogą być opcjonalnie humanizowane poprzez użycie preferowanych kodonów np. obecnych w wydajnie eksprymowanych genach ssaczych, a podawanie takiej szczepionki DNA może polegać na wstrzyknięciu roztworu soli fizjologicznej lub buforowanej soli fizjologicznej z nagim DNA lub RNA lub na wstrzyknięciu plazmidowego DNA lub liniowych fragmentów DNA zapewniających ekspresję genu. W wynalazku ujawniono także białko macierzy (M) i/lub nukleoproteiny (NP), jako białka lub DNA ze szczepu grypy 1918.

W zgłoszeniu patentowym WO2009092038 (opubl. 2009-07-23) opisano szczepionkę DNA przeciwko grypie oraz sposoby jej zastosowania. W rozwiązaniu opisano szczepionki DNA kodujące białka hemaglutyniny (HA) z różnych serotypów HPAI H5N1 przeciwko homologicznym i heterologicznym szczepom HPAI H5N1. Szczepionki te indukują powstanie przeciwciał, które neutralizują wiele serotypów HPAI H5N1, gdy zostaną podane w kombinacji zawierającej do 10 HAs. Poziom odpowiedzi jest zależny od stosowanej dawki. Zakres ochrony zależy od wybranego typu HA szczepu wirusa grypy do szczepionki. Monowalentne i trójwalentne immunogeny HA i/lub szczepionki zapewniają pełną ochronę myszy przed infekcją śmiertelnym szczepem H5N1 A/Vietnam/1203/2004 w teście próbnego zakażenia 68 tygodni po szczepieniu. W przypadku kurcząt, całkowita ochrona przed heterologicznymi szczepami HPAI H5N1 została uzyskana po szczepieniu trójwalentną szczepionką DNA serotyp H5 dawkami tak małymi jak 5 μg DNA podawanymi dwa razy, domięśniowo z użyciem igły lub za pomocą urządzenia bezigłowego.

W zgłoszeniu patentowym PL396415 opisana została eksperymentalna szczepionka DNA przeznaczona do immunizacji drobiu przeciwko grypie ptaków. Grypa ptaków jest poważną i wysoce zaraźliwą chorobą drobiu i innych ptaków spowodowaną różnymi rodzajami wirusów grypy, które mogą również infekować ssaki, w tym ludzi.

Pomimo istniejących do tej pory rozwiązań istnieje ciągła potrzeba uzyskania szczepionki DNA skierowanej przeciwko wirusowi grypy H5N1 zawierającej zmodyfikowaną nukleotydową sekwencję kodującą białko hemaglutyninę (HA) z wirusa H5N1. Dostępne obecnie konwencjonalne szczepionki przeciwko grypie ptaków (i ludzi) to szczepionki inaktywowane, zawierające cząstki wirusa namnażane w kurzych zarodkach, choć od niedawna dostępne są także preparaty zawierające antygeny pochodzące z hodowli komórkowych (Flucelvax, Novatrix). Dostępne są także preparaty oparte o żywe atenuowane wirusy, ale są one mniej popularne. Tradycyjne techniki wytwarzania szczepionek mają wiele poważnych wad i potrzeba opracowania preparatów nowej generacji jest duża. W opisie patentowym PL396415 szczepionka zawierająca wektor pCI oraz sekwencje genu hemaglutyniny, została opisana, jako skuteczna w zastrzeżonym sposobie podania, oraz przy użyciu modyfikacji sekwencji DNA, obejmującej delecję w miejscu proteolitycznego cięcia między podjednostkami HA1 i HA2, oraz zawierającej kodony zmienione na optymalne dla kur. Przykład publikacji opisującej zastosowanie tej szczepionki (Stachyra et al., 2014a; Stachyra et al. 2014c).

Celem wynalazku jest uzyskanie szczepionki DNA skierowanej przeciwko wirusowi grypy H5N1 zawierającej zmodyfikowaną nukleotydową sekwencję kodującą białko hemaglutyninę (HA) z wirusa H5N1. Modyfikacja nukleotydowej sekwencji hemaglutyniny polegała na zmianie zasady w kodonie w trzeciej pozycji z adeniny na guaninę (A >G) i z uracylu na cytozynę (U >C) bez zmiany kodowanego aminokwasu. Celem modyfikacji było zwiększenie ekspresji genu kodującego HA w komórkach zwierzęcych, a tym samym zwiększenie skuteczności (immunogenności) szczepionki DNA.

Realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z zapewnieniem skutecznej ochrony i możliwości odróżnienia kur immunizowanych od tych zainfekowanych wirusem, przy jednocześnie łatwej aplikacji zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest szczepionka DNA skierowana przeciwko wirusowi grypy H5N1, charakteryzująca się tym, że zawiera zmodyfikowaną nukleotydową sekwencję kodującą białko hemaglutyninę (HA) z wirusa H5N1 lub dowolnego wirusa grypy, przy czym modyfikacja nukleotydowej sekwencji hemaglutyniny polega na zmianie zasady w trzeciej pozycji kodonu z adeniny na guaninę (A >G) i z uracylu na cytozynę (U>C) bez zmiany kodowanego aminokwasu.

PL 229 124 B1

Korzystnie, gdy szczepionka DNA zawiera sekwencję nukleotydową kodującą H5 HA z delecją (ARRRKKR) miejsca cięcia hemaglutyniny na podjednostkę HA1 i HA2 lub bez delecji miejsca cięcia.

Korzystnie, gdy szczepionka DNA stanowi sekwencję zmodyfikowaną poprzez zamianę zasady w trzeciej pozycji kodonu na C lub G bez zmiany kodowanego aminokwasu.

Korzystnie, gdy szczepionka stanowi sekwencję SEQ. ID nr 1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowana sekwencja nukleotydową kodująca białko hemaglutyninę (HA) z wirusa H5N1, przy czym modyfikacja sekwencji nukleotydowej hemaglutyniny polega na zmianie zasady w kodonie w trzeciej pozycji z adeniny na guaninę (A >G) i z uracylu na cytozynę (U>C) i stanowi sekwencję SEQ. ID nr 1.

Korzystnie, gdy zmodyfikowana sekwencja nukleotydową wchodzi w skład szczepionki DNA skierowanej przeciwko wirusowi grypy H5N1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zmodyfikowanej nukleotydowej sekwencji kodującej białko hemaglutyninę (HA) z wirusa H5N1, przy czym modyfikacja nukleotydowej sekwencji hemaglutyniny polega na zmianie zasady w trzeciej pozycji kodonu z adeniny na guaninę (A >G) i z uracylu na cytozynę (U>C) bez zmiany kodowanego aminokwasu, do wytwarzania szczepionki.

Korzystnie, gdy sekwencja określona jest powyżej.

Korzystnie, gdy szczepionka ma zastosowanie do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej.

Korzystnie, gdy zastosowana modyfikacja sekwencji kodującej antygen HA wpływa na poziom indukowanych przeciwciał anty-HA IgG bez względu na zastosowana dawkę szczepionki.

Załączone figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku.

Na Figurze 1 przedstawiono wyniki immunizacji - odpowiedź humoralną kur niosek. Przedstawiono porównanie odpowiedzi immunologicznej na poziomie przeciwciał anty-HA IgY u kurcząt typu nieśnego (Rosa 1) immunizowanych przygotowanymi szczepionkami DNA: K3 i GK. Jedna dawka szczepionki stanowiła 62 pg DNA zmieszanego z nośnikiem do transfekcji komórek. Negatywną kontrolą (Vect) była grupa szczepiona mieszaniną pustego wektora (bez sekwencji kodującej hemaglutyninę) z nośnikiem. Poziom specyficznych przeciwciał w rozcieńczonych 1:200 surowicach oszacowano testem ELISA. Krew pobierano w 21,28 i 35 dobie życia (21d, 28d, 35d). Uzyskane wyniki testu ELISA dla poszczególnych osobników przedstawiono na panelu A, natomiast dane uzyskane w teście zahamowania hemaglutynacji (HI) dla tych samych kurcząt umieszczono na panelu B. W tym przypadku badano surowice z trzeciego pobrania (35 doba życia). Przeprowadzone testy wskazują na wzrost efektywności szczepień po zastosowaniu preparatu DNA ze zmodyfikowaną sekwencją kodującą hemaglutyninę - plazmid GK.

Na Figurze 2 przedstawiono wyniki immunizacji - odpowiedź humoralną kur brojlerów. Przedstawiono porównanie odpowiedzi immunologicznej na poziomie przeciwciał anty-HA IgY u kurcząt typu mięsnego (Ross 308) immunizowanych przygotowanymi szczepionkami DNA - K3 i GK. Negatywną kontrolą (Vect) była grupa szczepiona mieszaniną pustego wektora (bez sekwencji kodującej hemaglutyninę) z nośnikiem. Poziom specyficznych przeciwciał w rozcieńczonych 1:200 surowicach oszacowano testem ELISA. Krew pobierano w 20 i 34 dobie życia (20d, 34d). Uzyskane wyniki dla poszczególnych osobników przedstawiono na panelu A, natomiast dane uzyskane w teście zahamowania hemaglutynacji (HI) dla tych samych kurcząt umieszczono na panelu B. W tym przypadku badano surowice z drugiego pobrania (34 doba życia). Przeprowadzone testy wskazują na wzrost efektywności szczepień po zastosowaniu preparatu DNA ze zmodyfikowaną sekwencją kodująca hemaglutyninę - plazmid GK.

Na Figurze 3 przedstawiono końcowe miana surowic kurzych pobranych w 5 tygodniu życia od obu typów immunizowanych kur (niosek i brojlerów). Miano przeciwciał anty-HA IgY w serii kolejnych dwukrotnych rozcieńczeń surowic oznaczano testem ELISA. Przestawiono procentowy rozkład surowic o określonej wartości końcowego miana arbitralnie określonego, jako wysokie (>10⁵), średnie (10⁴-10⁵), niskie (10³-10⁴) i bardzo niskie (<10³) w badanych grupach kurcząt immunizowanych preparatem K3 i GK. Wyniki wskazują na wyższą efektywność preparatu szczepionkowego GK w porównaniu z K3.

Na Figurze 4 przedstawiono wyniki trzech eksperymentów immunizacji myszy szczepionkami DNA - K3 i GK. Stosowano różne dawki, tj. 10, 20 lub 50 pg DNA zmieszanego z nośnikiem do transfekcji komórek. Negatywną kontrolą immunizacji była grupa myszy (Vect) szczepionych mieszaniną pustego wektora z nośnikiem. Odpowiedź immunologiczną typu humoralnego oszacowano testem ELISA pokazującym poziom przeciwciał anty-HA IgG. Krew do testów pobierano trzykrotnie w 49, 56 i 63 dobie życia (oznaczone, jako 49d, 56d i 63d). Wyniki uzyskane dla indywidualnych osobników pokazano na

PL 229 124 B1 panelu A, natomiast procentowy rozkład odczytów OD450 dla surowic pobranych w 49 i 56 dniu, podzielonych arbitralnie na wysokie (OD405 >0,5) i niskie (OD405 <0,5), pokazano na panelu B. Wyniki wskazują na wyższą efektywność preparatu szczepionkowego GK w porównaniu z K3.

W odniesieniu do listy sekwencji:

SEQ. ID nr 1 stanowi sekwencję nukleotydową kodującą H5 HA (GK) z delecją (ARRRKKR) miejsca cięcia hemaglutyniny na podjednostkę HA1 i HA2. Jest to sekwencja zmodyfikowana poprzez zamianę zasady w trzeciej pozycji kodonu na C lub G. Ten fragment DNA został sklonowany w wektorze pCI i używany jako preparat szczepionkowy oznaczony GK.

SEQ. ID nr 2 stanowi sekwencję nukleotydową kodującą H5 HA (K3) z delecją (ARRRKKR) miejsca cięcia hemaglutyniny na podjednostkę HA1 i HA2. Jest to sekwencja zoptymalizowana do ekspresji w komórkach kur (Gallus gallus). Ten fragment DNA został sklonowany w wektorze pCI i używany jako preparat szczepionkowy oznaczony K3. Sekwencja ta jest opisana w zgłoszeniach patentowych PL396415 oraz PCT/PL2012/000095 i stanowi stan techniki. W przypadku obecnego zgłoszenia sekwencja ta stanowi sekwencję kontrolną.

W celu lepszego zrozumienia poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.

Przykłady

P r z y k ł a d I.

Modyfikacja sekwencji kodującej hemaglutyninę wirusa grypy

Sekwencja kodująca hemaglutyninę (HA) wirusa grypy H5N1 została zoptymalizowana w celu osiągnięcia wydajnej ekspresji w komórkach ssaków i ptaków. Optymalizacja obejmowała wzbogacenie sekwencji kodującej w zasady: guaninę (G) i cytozynę (C), w taki sposób, aby nie doszło do zmiany kodowanej sekwencji aminokwasowej.

Optymalizację przeprowadzono za pomocą programu komputerowego, poprzez zamianę kodonów w genie H5 HA w taki sposób, aby rozkład częstości kodonów w genie zoptymalizowanym był zgodny z rozkładem przedstawionym w Tabeli 1. Kodony wykorzystane do optymalizacji zawierają zasady G i C w trzeciej pozycji i prowadzą do wydajnej ekspresji genów reporterowych w komórkach ludzkich (Grzegorz Kudla, wyniki niepublikowane). Zastosowano tę samą metodę optymalizacji dla komórek ssaków i ptaków, ponieważ częstości występowania kodonów oraz zawartość zasad G i C w genomie są podobne w obu grupach zwierząt. Zmodyfikowana sekwencja kodująca HA, przedstawiona, jako SEQ ID nr 1, była sklonowana w wektorze pCI w celu otrzymania rekombinowanego plazmidu do immunizacji - GK. Kontrolą pozytywną był plazmid K3, czyli wektor pCI zawierający sekwencję kodującą HA. W tym przypadku była to sekwencja HA zoptymalizowana pod względem występowania częstości kodonów u kury (Gallus gallus). Jest ona przedstawiona, jako SEQ ID nr 2. W obu przypadkach (GK i K3) sekwencja HA była pozbawiona sekwencji kodującej miejsce proteolitycznego cięcia (ARRRKKR) białka hemaglutyniny na podjednostkę HA1 i HA2. Sekwencja K3 jest przedmiotem zgłoszeń patentowych PL396415 oraz PCT/PL2012/000095.

P r z y k ł a d II.

Immunizacja kurcząt plazmidem GK

Kurczęta szczepiono dwukrotnie przygotowanym preparatem plazmidowego DNA GK lub K3 zmieszanym z dostępnym komercyjnie odczynnikiem do transfekcji, Lipofectin® (Invitrogen). Procedura przygotowania preparatów do szczepień została opisana wcześniej (Stachyra et al., 2014a, Stachyra et al. 2014c). Szczepienie przeprowadzano dwukrotnie, w 7 i 21 dobie życia, stosując po 62 μg plazmidu w objętości 100 μ!. Preparatem szczepionkowym immunizowano kury typu nieśnego (przykład III) oraz typu mięsnego (przykład IV).

P r z y k ł a d III.

Analiza odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu kurcząt typu nieśnego testem ELISA i testem HI

Kurczęta szczepiono jak opisano w przykładzie II, próbki krwi pobierano z żyły skrzydłowej w 21, 28 i 35 dobie życia. Poziom odpowiedzi immunologicznej określano testem ELISA (test immunoenzymatyczny) pośredni oraz testem HI (zahamowania hemaglutynacji).

Test ELISA

Analizę typu ELISA (ELISA pośrednia) przeprowadzano w 96-dołkowych płytkach z płaskim dnem (mediSorp Surface, Nunc). Dołki opłaszczano antygenem homologicznym (H5 HA, otrzymany w systemie baculowirusowym) w ilości 300 ng (50 μl z roztworu o stężeniu 6 μg /ml PBS) i inkubowano przez

PL 229 124 B1 noc w 4°C. Następnie płytki płukano cztery razy używając 1xPBST (bufor PBS z 0,05% Tween 20) i blokowano (2% BSA w buforze PBS) przez 90 minut w 37°C. Po płukaniu nakładano rozcieńczone surowice i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Standardowo stosowano rozcieńczenie surowic w 2% BSA w buforze PBSS 1:200. Po nocy płytki płukano 5 razy i nakładano przeciwciała drugorzędowe anti-chicken IgY (Fc specific) sprzężone z peroksydazą chrzanową, HRP (Pierce/Thermo Scientific, IL, USA). TMB (3,3' 5,5' tetrametylobenzydyna, Sigma) użyto jako substrat reakcji enzymatycznej. Po zatrzymaniu reakcji kwasem siarkowym (0,5 M H2SO4) przeprowadzano odczyt absorbancji przy długości fali 450 nm (OD450). Wyniki testu ELISA dla surowic pobranych od poszczególnych kurcząt przedstawiono na Figurze 1A. Wskazują one na znacznie wyższy poziom specyficznych przeciwciał po szczepieniu preparatem GK z Lipofectinem w porównaniu ze szczepieniem K3.

Dodatkowo testem ELISA oznaczono końcowe miana surowic pobranych w 5 tygodniu życia. Końcowe miano surowicy rozumiane jest, jako najwyższe rozcieńczenie surowicy, przy którym wykrywa się jeszcze specyficzne oddziaływanie przeciwciał zawartych w tej surowicy z antygenem. Do testu ELISA określającego końcowe miano surowic użyto rozcieńczeń w zakresie od 10³ do 5 x 10⁵ razy. Następnie zastosowano arbitralny podział końcowych mian surowic na cztery zakresy: wysokie (>10⁵), średnie (10⁴-10⁵), niskie (10³-10⁴) i bardzo niskie (<10³). Na Figurze 3 pokazano procentowy rozkład wydzielonych czterech zakresów mian surowic w szczepionych grupach. Wyniki te wskazują na brak surowic o najwyższym końcowym mianie w grupie K3 oraz na mniejszy procent surowic o bardzo niskim mianie w grupie GK (16%) w porównaniu do grupy K3 (33%).

Test inhibicji hemaglutynacji. HI

Serologiczny test inhibicji hemaglutynacji (HI) jest wykonywany w celu wykrycia specyficznych przeciwciał posiadających zdolność do hamowania hemaglutynacji. Wykrywane są w nim głównie te przeciwciała, które wiążą się specyficznie z miejscem RBS (ang. receptor binding site). Test został wykonany zgodnie z obecnie obowiązującymi zaleceniami (Avian Influenza in: OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2010). Badano serię dwukrotnych rozcieńczeń surowic w zakresie od 1:8 do 1:512. Rozcieńczone surowice (25 ąl) inkubowano przez 25 min w temperaturze pokojowej z 4 jednostkami inaktywowanego antygenu HA z wirusa H5N2 (AIV szczep A/chicken/Belgium/150/1999) (DG Denver). Następnie po dodaniu takiej samej objętości zawiesiny 1% kurzych erytrocytów kontynuowano inkubację przez kolejne 25 minut. Miano HI surowic określono, jako odwrotność najwyższego rozcieńczenia, przy którym obserwowano zahamowanie aglutynacji kurzych erytrocytów. Miana surowic o wartości 8 lub wyższej uznawano za pozytywne. Wyniki testu HI przedstawiono na Figurze 1B. Wskazują one na korzystne działanie zastosowanej optymalizacji sekwencji do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej monitorowanej za pomocą testu HI.

P r z y k ł a d IV.

Analiza odpowiedzi immunologicznej po szczepieniu kurcząt typu mięsnego metodą ELISA i testem HI

Kurczęta szczepiono jak opisano w przykładzie II, próbki krwi pobierano z żyły skrzydłowej w 20 i 34 dobie życia. Poziom odpowiedzi immunologicznej określano testem ELISA oraz testem HI. Testy przeprowadzono według procedury opisanej w przykładzie III. Przedstawione wyniki testu ELISA na Figurze 2A potwierdzają korzystne działanie modyfikacji sekwencji kodującej antygen w plazmidzie szczepionkowym na poziom odpowiedzi humoralnej u immunizowanych kurcząt typu mięsnego. Warto podkreślić znacząco wyższy poziom przeciwciał w grupie GK niż w grupie K3 już po immunizacji jedną dawką szczepionki, czyli w 20 dobie życia kurcząt (Figura 2A). Na korzyść zastosowanych modyfikacji (szczepienie plazmidem GK) przemawiają również wyniki przedstawione na Figurze 3 dotyczące ustalenia końcowego miana surowic immunizowanych brojlerów, uzyskane tak jak opisano w przykładzie III. W grupie GK obecne są jedynie surowice o wysokim (66%) i bardzo wysokim (33%) mianie, natomiast w grupie K3 są także surowice o mianie niskim (20%). Wyniki testu HI przeprowadzonego dla surowic pobranych w 34 dobie życia kurcząt przedstawiono na Figurze 2B. Wskazują one na korzystne działanie zastosowanej optymalizacji sekwencji do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej.

P r z y k ł a d V.

Immunizacja myszy plazmidem GK i analiza odpowiedzi immunologicznej

Samice myszy BALB/c immunizowano domięśniowo preparatem plazmidowego DNA GK lub K3 zmieszanym z dostępnym komercyjnie odczynnikiem do transfekcji, Lipofectin® (Invitrogen). Myszy szczepiono dwukrotnie w 35 i 49 dobie życia natomiast krew pobierano w 49, 56 i 63 dobie życia. Do szczepień stosowano trzy różne dawki szczepionki: 10, 20 lub 50 ąg DNA. Całkowita objętość szczePL229 124 Β1 pionki (DNA + nośnik) dla dawek 10 μο i 20 μο DNA wynosiła 50 μΙ a dla dawki 50 μο - 80 μΙ. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty immunizacji. W pierwszym stosowano dawkę 10 μο i 50 μο, w drugim eksperymencie tylko 10 μg natomiast w trzecim tylko 20 μg. Grupę kontrolną stanowiły myszy szczepione pustym wektorem zmieszanym z nośnikiem.

Test ELISA surowic pobranych od immunizowanych myszy

Analizę typu ELISA przeprowadzano w 96-dołkowych płytkach z płaskim dnem (MaxiSorp Surface, Nunc). Dołki opłaszczano antygenem homologicznym (H5 HA, otrzymany w systemie baculowirusowym) w ilości 300 μg (50 μΙ z roztworu o stężeniu 6 μg/ml PBS) i inkubowano przez noc w 4°C. Następnie płytki płukano cztery razy używając buforu PBST (PBS z 0,05% Tween 20) i blokowano (2% BSA w buforze PBS) przez 90 minut w 37°C. Po płukaniu nakładano rozcieńczone surowice i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Stosowane standardowe rozcieńczenia surowic w buforze PBS: 1:50 (eksperyment 1; surowice 49d), 1:100 (eksperyment 2 i 3; wszystkie surowice) i 1:200 (eksperyment 1 ; 56d i 63d). Po nocy płytki płukano 4 razy i nakładano przeciwciała drugorzędowe anti-mouse IgG (whole molecule)-alkaline phosphatase antibody (A3562, Sigma), inkubacje prowadzono przez 1 godzinę w 37°C. Stosowanym substratem był pNPP (p-nitrophenyl phosphate P7998, Sigma) reakcja była stopowana 3M NaOH. Odczyt absorbancji przeprowadzono przy długości fali 405 nm (OD 405) używając czytnika Synergy/HT firmy BioTek.

Uzyskane wyniki z testów ELISA dla surowic pochodzących od immunizowanych myszy przedstawiono na Figurze 4A natomiast Figura 4B zawiera procentowy rozkład uzyskanych odczytów OD w teście ELISA z pogrupowaniem surowic na dwie kategorie odpowiedzi: silną (wartości OD405 powyżej 0,5) oraz słabą (wartości OD405 poniżej 0,5). Podział na kategorie wykonany został arbitralnie. Porównanie poziomu odpowiedzi immunologicznej myszy wskazuje, że zastosowana modyfikacja sekwencji kodującej antygen HA wpływa korzystnie na poziom indukowanych przeciwciał anty-HA IgG bez względu na zastosowaną dawkę szczepionki.

LITERATURA

Avian Influenza in: OIE Manuał of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2010 [http://www.oie. int/intemational-standard-setting/terrestrialmanual/access-online/1

Andre S., Seed B., Eberle J., Schraut W., Bultmann A., et al., (1998) Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120 sequence with optimized codon usage. J Virol 72: 1497-1503.

Brown T.A. (2012) Genomy. Wydawnictwo Naukowe PWN.

Deml L. A., Bojak S., Steck M. ,Graf J., Wild R., Schirmbeck H., Wagner R.,(2001) Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J. Virol.75:10991—11001

Haas J., Park E.C., Seed B., (1996) Codon usage limitation in the expression of HIV-1 envelope glycoprotein. Curr Biol 6: 315-324

Kim C.,H., Oh Y., Lee T.,H., (1997) Codon optimization for high-level expression of human erythropoietin (EPO) in mammalian cells. Gene 199, 293-301.

Ko H-J., Ko S-Y., Kim Y-J., Lee E-G., Cho S-N., Kang C-Y., (2005) Optimization of Codon Usage Enhances the Immunogenicity of aDNA Vaccine Encoding Mycobacterial Antigen Ag85B Inffection and Immunity73, 5666-5674.

Kotsopoulou E., Kim V.N., Kingsman A.J., Kingsman S.M,. Mitrophanous K.A., (2000) A Rev-independent human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) - based vectorthat exploits a codon-optimized HIV-1 gag-pol gene. J Virol 74: 4839-4852.

Kudła G., Lipiński L., Caffin F., Helwak A., Żylicz M., (2006) High Guanine and Cytosine Content Increases mRNA Levels in Mammalian Cells. PLoS Biology, 4(6): 180

Liu, M.A. (2011) DNA vaccines: an historical perspective and view to the futurę. Immunol Rev 239, 62-84.

Nagata T., Uchijima M., Yoshida A., Minae Kawashima M. and KoideY.,(1999) Codon Optimization Effect on Translational Efficiency of DNA Vaccine in Mammalian Cells: Analysis of Plasmid DNA Encoding a CTL Epitope Derived from Microorganisms. BBRC 261,445-451

PL396415 (A1) - DNA vaccine, the method of inducing an immune response, the antibody specifically recognizing the protein of the influenza virus hemagglutinin H5 and the use of DNA vaccine (http://worldwide.espacenet.com/publicationDetails/biblio?FT=D&date=20130402&DB=world- wide.espacenet.com&locale=en EP&CC=PL&NR=396415A1 &KC=A1 &ND-9

PL229 124 Β1

Plotkin, J.B. and Kudła, G., (2011) Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nat Rev Genet12, 32-42.

Stachyra, A., Góra-Sochacka, A., Sawicka, R., Florys, K., Saczyńska, V., Olszewska, M., Pikuła, A., Śmietanka, K., Minta, Z., Szewczyk, B., Zagórski, W. and Sirko, A., (2014a) Highly immunogenic prime-boost DNA vaccination protects chickens against challenge with homologous and heterologous H5N1 virus. Trials in Vaccinology 3, 40-46.

Stachyra, A., Góra-Sochacka, A. and Sirko, A., (2014b) DNA vaccines against influenza. Acta Biochim Pol 61, 515-522.

Stachyra A, Góra-Sochacka A, Zagórski W, Król E, and Sirko A. (2014c). Antibody response to DNA vaccine against H5N1 avian influenza virus in broilers immunized according to three schedules. Acta Biochim Polon 61: 593-596

Stratford, R., G. Douce, L. Zhang-Barber, N. Fairweather, J. Eskola, and G. Dougan., (2000) Influence of codon usage on the immunogenicity of a DNA vaccine against fetanus. Vaccine 19: 810-815

Vernon W.I., Printen J.A., (2002) Assay for intracellular calciu using a codon-optimzed aequorin. Biotechniques 33, 730, 732, 734.

Zolotukhin S., Potter M., Houswirth W., Guy J., Muzyczka N., (1996) A Humanized Green Fluorescent Protein cDNA Adapted for High-Level Expression in Mammalian Cells. Journal of Virology, 70, 4646-4654

Zhou J., Liu W.J., Peng S.W., Sun XY, Frazer I., (1999) Papillomavirus capsid protein expression level depends on the match between codon usage andtRNA availability. J Virol 73: 4972-4982 https://clinicaltrials.gov/

PL229 124 Β1

LISTA SEKWENCJI

SEQ ID nr 1

ATGGAGAAGATCCTGCTGCTGTTCGCCATCGTGAGCCTGGTCAAGTCCGA

CCAGATCTGCATCGGCTACCACGCCAACAACAGCACCGAGCAGGTGGACA

CCATCATGGAGAAGAACGTGACCGTGACCCACGCCCAGGACATCCTGGAG

AAGACCCACAACGGCAAGCTGTGCGACCTGGACGGCGTGAAGCCCCTGAT

CCTGCGCGACTGCAGCGTGGCCGGCTGGCTGCTGGGCAACCCGATGTGCG

ACGAGTTCCTGAACGTGCCCGAGTGGAGCTACATCGTGGAGAAGATCAAC

CCCGCCAACGACCTGTGCTACCCCGGCAACTTCAACGACTACGAGGAGCT

GAAGCACCTGCTGAGCCGGATCAACCACTTCGAGAAGATCCAGATCATCC

CCAAGAGCAGCTGGTCCGACCACGAGGCCAGCAGCGGCGTGAGCAGCGC

CTGCCCCTACCAGGGCCGCAGCTCCTTCTTCCGGAACGTGGTGTGGCTGAT

CAAGAAGGACAACGCCTACCCCACCATCAAGCGCAGCTACAACAACACC

AACCAGGAGGACCTGCTGGTGCTGTGGGGCATCCACCACCCCAACGACGC

CGCCGAGCAGACCCGCCTGTACCAGAACCCCACCACCTACATCAGCGTGG

GCACCAGCACCCTGAACCAGCGGCTGGTGCCCAAGATCGCCACCCGCAGC

AAGGTGAACGGCCAGTCCGGCCGCATGGAGTTCTTCTGGACCATCCTGAA

GCCCAACGACGCCATCAACTTCGAGTCCAACGGCAACTTCATCGCCCCCG

AGAACGCCTACAAGATCGTGAAGAAGGGCGACAGCACCATCATGAAGAG

CGAGCTGGAGTACGGCAACTGCAACACCAAGTGCCAGACCCCCATCGGCG

CCATCAACTCCAGCATGCCCTTCCACAACATCCACCCCCTCACCATCGGCG

AGTGCCCCAAGTACGTGAAGAGCAACCGCCTGGTGCTGGCCACCGGCCTG

CGGAACTCCCCCCAGGGCGAGGGCCTGTTCGGCGCCATCGCCGGCTTCAT

CGAGGGCGGCTGGCAGGGCATGGTGGACGGCTGGTACGGCTACCACCAC

AGCAACGAGCAGGGCAGCGGCTACGCCGCCGACAAGGAGAGCACCCAGA

AGGCCATCGACGGCGTGACCAACAAGGTGAACAGCATCATCAACAAGAT

GAACACCCAGTTCGAGGCCGTGGGCCGCGAGTTCAACAACCTGGAGCGGC

GCATCGAGAACCTGAACAAGAAGATGGAGGACGGCTTCCTGGACGTGTG

GACCTACAACGCCGAGC TGCTGGTGCTCATGGAGAACGAGCGCACCCTGG

ACTTCCACGACAGCAACGTGAAGAACCTGTACGACAAGGTGCGCCTGCAG

CTGCGGGACAACGCCAAGGAGCTCGGTAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCA

CCGGTGCGACAACGAGTGCATGGAGAGCGTGCGCAACGGCACCTACGAC

TACCCCCAGTACTCCGAGGAGGCCCGCCTGAAGCGGGAGGAGATCAGCG

GCGTGAAGCTGGAGAGCATCGGCACCTACCAGATCCTGAGCATCTACTCC

ACCGTGGCGAGCAGCCTGGCCCTGGCCATCATGGTGGCCGGCCTGTCCCT

GTGGATGTGCAGCAACGGCTCCCTGCAGTGCCGCATCTGCATC

PL229 124 Β1

SEQ ID nr 2

ATGGAAAAGATTGTGCTGCTGTTTGCTATCGTGTCCCTGGTGAAAAGCGA

CCAGATTTGTATCGGGTATCATGCCAATAACTCAACCGAACAGGTGGATA

CTATTATGGAGAAAAACGTGACTGTGACCCACGCCCAGGACATCCTGGAG

AAGACCCATAACGGCAAACTGTGCGATCTGGACGGAGTGAAGCCCCTGAT

CCTGCGCGATTGCAGCGTGGCTGGCTGGCTGCTGGGAAACCCTATGTGCG

ACGAGTTCCTGAATGTGCCAGAA IGG TCCTACATCGTGGAGAAAATlAAC

CC AGCAAATGA TC TGTGCTACCCCGGCAACTTCAATGACTATGAGGAACT

GAAGCACCTGCTGTCTAGGATCAACCATTTCGAAAAGATCCAGATCATCC

Cl AAGAGCTCCTGGAGCGA1CACGAGGC TTCTTCAGGCGTGAG TAGCGCA

TGTCCATACCAGGGACGCTCCTCTTTCTTTCGGAACG TGGTGTGGCl GATT

AAGAAAGACAATGCTTACCCAACTATCAAACGCAGCTATAACAATACCAA

CCAGGAAGATCTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCATCCCAACGACGCCG

CTGAGCAGACACGGCTGTACCAGAATCCTACCACAl ATATTAGI 'GTGGGG

ACAAGCACTCTGAACCAGAGACTGGTGCCCAAGATCGCAACAAGGAGCA a a πτη a a i nr.rr a m^rrnn a a n a a τηπ a ζ^^,τ*Γ/^^ζΐ'^ντ^βτ*τ·/'ΐΛΐ a a τγγτπ a a r*

CCAAACGATGCCATTAATTTCGAATCTAACGGCAACTTCATCGCACCCGA

GAACGCCTACAAGATrGTGAAGAAAGGAGACTCCACTATCATGAAATCTG

AGCTGGAATATGGGAACTGCAATACCAAGTGTCAGACACCTATCGGTGCA

ATTAACTCAAGTATGCCCITTCACAATATCCATCCTCTGACCATTGGGCiAG

1'GCCCCAAGTACGTGA AAAGTAACCGCCTGGTGCTGGCCACAGGTCTGCG

G AATAGCCCTC AGGGGGAAGG1CTGTTCGGGGCTA1 CGCAGGTTTTATTG

AGGGCGGATGGCAGGGAATGGTGGATGGGTGGTACGGTrATCACCATrCA

AACGAACAGGGCAGTGGATACGCAGCCGATAAGGAGTCAACACAGAAAG

CCATTGACGGAG1 GACI AACAAGGTGAACTCCATCATTAACAAAATGAAC

ACCCAGTTCGAGGCTGTGGGGAGAGAGTTCAACAATCTGGAGAGAAGGA

TCGAAAACCTGAATAAGAAAATGGAAGATGGCTICCTGGACGTGTGGACT

TACAACGCTGAGCTGCTGGTGCTGATGGAGAATGAAAGGACCCTGGATTT

GGGACAACGCAAAGGAACTGGGGAATGGITGTTTCGAGTTTTACCATAGA TGCGATAACGAGTGTATGGAATCCGTGAGGAATGGCACATACGACTATCC AC AGI ATTCTGAGGAAGCCCGCCTGAAGCGGGAGGAAATTICTGGGGTGA AACTGGAGTCAATCGGTACC TACCAG Al CCTGTC TA TC TAC i 'CAACAGTG GCTAGCTCCCTGGCCC TGGCTATCA TGGTGGCTGGCCTG AGCCTGTGGATG TGCTCTAACGGTAGCCTGCAGTGTAGGATCTGTA TTTGA

Claims (10)

1. Szczepionka DNA skierowana przeciwko wirusowi grypy H5N1, znamienna tym, że zawiera zmodyfikowaną nukleotydową sekwencję kodującą białko hemaglutyninę (HA) z wirusa H5N1 lub dowolnego wirusa grypy, przy czym modyfikacja nukleotydowej sekwencji hemaglutyniny polega na zmianie zasady w trzeciej pozycji kodonu z adeniny na guaninę (A >G) i z uracylu na cytozynę (U>C) bez zmiany kodowanego aminokwasu.

2. Szczepionka DNA według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą H5 HA z delecją (ARRRKKR) miejsca cięcia hemaglutyniny na podjednostkę HA1 i HA2 lub bez delecji miejsca cięcia.

3. Szczepionka DNA według zastrz. 2, znamienna tym, że stanowi sekwencję zmodyfikowaną poprzez zamianę zasady w trzeciej pozycji kodonu na C lub G bez zmiany kodowanego aminokwasu.

4. Szczepionka DNA według zastrz. 2, znamienna tym, że stanowi sekwencję SEQ. ID nr 1.

5. Zmodyfikowana sekwencja nukleotydowa kodująca białko hemaglutyninę (HA) z wirusa H5N1, przy czym modyfikacja sekwencji nukleotydowej hemaglutyniny polega na zmianie zasady w kodonie w trzeciej pozycji z adeniny na guaninę (A >G) i z uracylu na cytozynę (U>C) i stanowi sekwencję SEQ. ID nr 1.

6. Zmodyfikowana sekwencja nukleotydowa według zastrz. 5, znamienna tym, że wchodzi w skład szczepionki DNA skierowanej przeciwko wirusowi grypy H5N1.

7. Zastosowanie zmodyfikowanej nukleotydowej sekwencji kodującej białko hemaglutyninę (HA) z wirusa H5N1, przy czym modyfikacja nukleotydowej sekwencji hemaglutyniny polega na zmianie zasady w trzeciej pozycji kodonu z adeniny na guaninę (A >G) i z uracylu na cytozynę (U>C) bez zmiany kodowanego aminokwasu, do wytwarzania szczepionki.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, w którym sekwencja określona jest zastrzeżeniami od 9 do 13.

9. Zastosowanie według zastrz. 7 do wytwarzania szczepionki do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej.

10. Zastosowanie według zastrz, 7, w którym zastosowana modyfikacja sekwencji kodującej antygen HA wpływa na poziom, indukowanych przeciwciał anty-HA IgG bez względu na zastosowaną dawkę szczepionki.