PL211762B1 - Zastosowanie białka fuzyjnego zawierającego białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko, białka lub polinukleotydu HIV gp120, białka lub polinukleotydu SIV Nef, adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego oraz kompozycja szczepionki - Google Patents

Zastosowanie białka fuzyjnego zawierającego białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko, białka lub polinukleotydu HIV gp120, białka lub polinukleotydu SIV Nef, adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego oraz kompozycja szczepionki

Info

Publication number
PL211762B1
PL211762B1 PL357210A PL35721001A PL211762B1 PL 211762 B1 PL211762 B1 PL 211762B1 PL 357210 A PL357210 A PL 357210A PL 35721001 A PL35721001 A PL 35721001A PL 211762 B1 PL211762 B1 PL 211762B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
protein
tat
hiv
nef
gly
Prior art date
Application number
PL357210A
Other languages
English (en)
Other versions
PL357210A1 (pl
Inventor
Gerald Voss
Original Assignee
Smithkline Beecham Biolog
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0002200A external-priority patent/GB0002200D0/en
Priority claimed from GB0009336A external-priority patent/GB0009336D0/en
Priority claimed from GB0013806A external-priority patent/GB0013806D0/en
Priority claimed from PCT/EP2000/005998 external-priority patent/WO2001000232A2/en
Application filed by Smithkline Beecham Biolog filed Critical Smithkline Beecham Biolog
Publication of PL357210A1 publication Critical patent/PL357210A1/pl
Publication of PL211762B1 publication Critical patent/PL211762B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
    • C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka fuzyjnego zawierającego białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko, białka lub polinukleotydu HIV gp120, białka lub polinukleotydu SIV Nef, adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego oraz kompozycja szczepionki zawierają ca takie biał ka.
HIV-1 jest pierwotną przyczyną nabytego zespołu niedoboru odporności (AIDS), który jest uważany za jeden z głównych światowych problemów zdrowotnych. Chociaż na całym świecie prowadzono szeroko zakrojone badania by wytworzyć szczepionkę, te próby nie były dotychczas udane.
Glikoproteina gp120 otoczki HIV jest białkiem wirusa, które jest wykorzystywane do przyłączenia do komórki gospodarza. W tym przyłączeniu bierze udział wiązanie do dwóch cząsteczek powierzchniowych komórek T pomocniczych i makrofagów znanych jako CD4 oraz jednego z dwóch receptorów chemokin CCR-4 lub CXCR-5. Białko gp120 jest na początku eksprymowane jako większa cząsteczka prekursora (gp160), która jest następnie cięta potranslacyjnie z wytworzeniem gp120 i gp41. Białko gp120 jest utrzymywane na powierzchni wiriona przez połączenie z cząsteczką gp41, która jest wstawiana do błony wirusa.
Białko gp120 jest głównym celem neutralizujących przeciwciał, ale niestety najbardziej immunogenne regiony białka (pętla V3) są jednocześnie najbardziej zmiennymi częściami białka. Tak więc zastosowanie gp120 (lub jego prekursora gp160) jako antygenu szczepionki do wywołania neutralizujących przeciwciał uważa się za ograniczone w przypadku szczepionki ochronnej o szerokim zakresie działania. Białko gp120 zawiera także epitopy, które są rozpoznawane przez cytotoksyczne limfocyty T (CTL). Te komórki efektorowe są zdolne do eliminowania komórek zakażonych wirusem, a więc stanowią drugi główny mechanizm oporności na wirusy. W przeciwieństwie do docelowych regionów neutralizujących przeciwciał, niektóre epitopy CTL wydają się być stosunkowo konserwatywne wśród różnych szczepów HIV. Z tego względu uważa się gp120 i gp160 za pożyteczne składniki antygenowe w szczepionkach, których celem jest wywołanie komórkowych odpowiedzi odpornościowych (szczególnie CTL).
Opisano nieotoczkowe białka HIV-1, które obejmują przykładowo wewnętrzne białka strukturalne, takie jak produkty genów gag i pol, oraz inne niestrukturalne białka, takie jak Rev, Nef, Vif i Tat (Greene i in., New England J. Med, 324, 5, 308 i dalsze (1991) i Bryant i in., (red. Pizzo), Pediatr. Infect. Dis. J. 11, 5, 390 i dalsze (1992).
Białka HIV Tat i Nef są wczesnymi białkami, to znaczy, że są eksprymowane we wczesnym stadium infekcji i pod nieobecność białka strukturalnego.
W prezentacji na konferencji (C. David Pauza, Immunization with Tat toxoid attenuates SHIV89.6PD infection in rhesus macaques, 12th Cent Gardes Meeting, Marnes-La-Coquette 26.10.1999), opisano eksperymenty, w których makaki rezus immunizowano samym toksoidem Tat lub w połączeniu z kompozycją szczepionkową z glikoproteiną otoczki gp160 (jedna dawka zrekorabinowanego wirusa krowianki i jedna dawka zrekombinowanego białka). Jednak zaobserwowane wyniki wykazały, że obecność glikoproteiny otoczki nie dała korzyści w porównaniu z eksperymentami wykonanymi z samym Tat.
Stwierdzono jednak, że immunogen zawierający Tat i/lub Nef (szczególnie białko fuzyjne Nef-Tat) działa synergicznie z gp120, chroniąc małpy rezus przed patogenną prowokacją chimerowym ludzkim-małpim wirusem niedoboru odporności (SHIV). Dotychczas infekcja SHIV u makaków rezusów jest uważana za najodpowiedniejszy model zwierzęcy ludzkiego AIDS. Tak więc zastosowaliśmy ten model przedkliniczny, aby ocenić ochronną skuteczność szczepionek zawierających antygen gp120 i antygen zawierający Nef i Tat, pojedynczo albo w połączeniu. Analiza dwóch wskaźników infekcji wirusowej i patogenności, udziału procentowego komórek CD4-dodatnich we krwi obwodowej i stężenia wolnych genomów RNA SHIV w osoczu mał p, wskazał y, ż e te dwa antygeny dział ają synergicznie. Immunizacja samym gp120 albo samym NefTat + SIV Nef nie wykazała różnicy w porównaniu z immunizacją samym adiuwantem. Natomiast podanie połączenia antygenów gp120 i NefTat + SIV Nef spowodowało wyraźne polepszenie dwóch wymienionych powyżej parametrów u wszystkich zwierząt w tej konkretnej grupie doświadczalnej.
Umożliwiło to nowe zastosowanie białka HIV Tat i/lub Nef wraz z HIV gp120 do wytwarzania szczepionki dla immunizacji profilaktycznej lub terapeutycznej ludzi przeciw HIV.
Wynalazek dotyczy zastosowania (a) białka fuzyjnego zawierającego białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko; i
PL 211 762 B1 (b) białka lub polinukleotydu HIV gp120; i (c) białka lub polinukleotydu SIV Nef; i (d) adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego do wytwarzania szczepionki do immunizacji profilaktycznej lub terapeutycznej ludzi przeciw HIV, Nef-Tat, SIV Nef i gp120 działają synergicznie w terapii lub profilaktyce HIV przy czym stosowana szczepionka zmniejsza obciążenie wirusem HIV u ludzi zakażonych HIV oraz powoduje utrzymanie poziomów CD4+ powyżej tych spotykanych przy braku szczepienia Nef-Tat, SIV Nef i HIV gp120.
Wynalazek dotyczy również zastosowania (a) białka lub polinukleotydu HIV Tat; i (b) białka lub polinukleotydu HIV gp120; i (c) adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego do wytwarzania szczepionki do immunizacji profilaktycznej lub terapeutycznej ludzi przeciw HIV, przy czym stosowana szczepionka zmniejsza obciążenie wirusem HIV u ludzi zakażonych HIV oraz powoduje utrzymanie poziomów CD4+ powyżej tych spotykanych przy braku szczepienia HIV Tat i HIV gp120.
Korzystne jest zastosowanie, w którym szczepionka dodatkowo zawiera antygen wybrany z grupy obejmującej gag, rev, vif, vpr i vpu.
Korzystne jest zastosowanie, w którym białko Tat jest białkiem zmutowanym.
Korzystne jest zastosowanie, w którym białko Tat lub Nef-Tat jest zredukowane.
Korzystne jest zastosowanie, w którym białko Tat lub Nef-Tat jest utlenione.
Korzystne jest zastosowanie, w którym białko Tat lub Nef-Tat jest karbamidometylowane.
Korzystne jest zastosowanie, w którym pochodną monofosforylolipidu A stanowi 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A.
Korzystne jest zastosowanie, w którym jako adiuwant saponinowy stosuje się QS21.
Korzystne jest zastosowanie, w którym dodatkowo stosuje się emulsję olej w wodzie.
Wynalazek dotyczy ponadto kompozycji szczepionki do stosowania u ludzi zawierającej białko fuzyjne oraz adiuwant, która to kompozycja jako białko fuzyjne zawiera białko fuzyjne zawierające białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko fuzyjne, białko lub polinukleotyd HIV gp120, białko lub polinukleotyd SIV Nef, a jako adiuwant zawiera adiuwant zawierający QS21 i 3D-MPL.
Korzystna jest kompozycja szczepionki do stosowania u ludzi, która zawiera białko lub polinukleotyd HIV Tat, białko lub polinukleotyd HIV gp120 oraz adiuwant zawierający QS21 i 3D-MPL.
Jak opisano powyżej, białko NefTat, białko SIV Nef i białko gp120 razem zapewniają wzmocnioną odpowiedź w porównaniu z obserwowaną, gdy stosuje się same NefTat+SIV Nef lub gp120. Ta wzmocniona odpowiedź czyli działanie synergiczne można zaobserwować w postaci zmniejszenia obciążenia wirusem w wyniku szczepienia tymi połączonymi białkami. Alternatywnie lub dodatkowo ta wzmocniona odpowiedź przejawia się utrzymaniem poziomów CD4+ ponad te występujące przy braku szczepienia HIV NefTat, SIV Nef i HIV gp120. Efekt synergiczny przypisuje się połączeniu gp120 i Tat lub gp120 i Nef, lub gp120 oraz Nef i Tat.
Dodatek innych białek HIV może dalej wzmocnić działanie synergiczne obserwowane pomiędzy gp120 i Tat i/lub Nef. Te inne białka mogą też działać synergicznie z poszczególnymi składnikami szczepionki zawierającej gp120, Tat i/lub Nef, bez konieczności obecności pełnego oryginalnego połączenia antygenów. Dodatkowe białka mogą być białkami regulatorowymi HIV, takimi jak Rev, Vif, Vpu i Vpr. Mogą być też one białkami strukturalnymi pochodzącymi z genów HIV gag lub pol.
Gen HIV gag koduje białko prekursorowe p55, które może spontanicznie łączyć się w niedojrzałe cząsteczki wirusopodobne (VLP). Prekursor jest następnie cięty proteolitycznie na główne białka strukturalne p24 (kapsyd) i p18 (macierz) i na kilka mniejszych białek. Zarówno białko prekursorowe p55, jak i jego główne pochodne p24 i p18, mogą być uważane za odpowiednie antygeny szczepionek, które mogą dalej wzmacniać obserwowane działanie synergiczne między gp120 i Tat i/lub Nef. Prekursor p55 i białko kapsydu p24 mogą być stosowane jako VLP lub jako białka monomeryczne.
Białko HIV Tat w szczepionce według wynalazku może być ewentualnie połączone z białkiem HIV Nef, na przykład jako białko fuzyjne.
Białko HIV Tat, białko HIV Nef lub białko fuzyjne NefTat stosowane zgodnie z wynalazkiem mogą mieć C-końcowy ogon histydynowy, który korzystnie zawiera 5-10 reszt histydyny. Obecność ogona histydynowego (lub „His) ułatwia oczyszczanie.
PL 211 762 B1
W korzystnej postaci białka są eksprymowane z ogonem histydynowym zawierającym 5-10, a korzystnie 6 reszt histydynowych. Są one korzystne gdyż uł atwiają oczyszczanie. Opisano oddzielną ekspresję w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) Nef (Macreadie I.G. i in., 1993, Yeast 9 (6) 565-573) i Tat (Braddock M i in., 1989, Cell 58(2) 269-79). Białko Nef oraz białka Gag p55 i p18 są mirystylowane. Ekspresję Nef i Tat oddzielnie w układzie ekspresyjnym Pichia (konstrukty Nef-His i Tat-His) i ekspresję konstruktu fuzyjnego Nef-Tat-His opisano uprzednio w WO99/16884.
Sekwencje DNA i aminokwasowe reprezentatywnych białek fuzyjnych Nef-His (SEQ ID NO: 8 i 9), Tat-His (SEQ ID NO: 10 i 11) i Nef-Tat-His (SEQ ID NO: 12 i 13) przedstawiono na fig. 1.
Białka HIV można stosować w ich natywnych konformacjach, lub korzystniej można je modyfikować do stosowania w szczepionkach. Te modyfikacje mogą być albo konieczne z przyczyn technicznych dotyczących sposobu oczyszczania albo mogą służyć do biologicznej inaktywacji jednej lub większej liczby właściwości funkcjonalnych białka Tat lub Nef. Tak więc wynalazek obejmuje stosowanie pochodnych białek HIV, które mogą być np. zmutowanymi białkami. Stosowane tu określenie „zmutowane oznacza cząsteczkę, którą poddano delecji, addycji lub substytucji jednego lub większej liczby aminokwasów z użyciem dobrze znanych technik mutagenezy ukierunkowanej na miejsce lub dowolnym innym znanym sposobem.
Przykładowo zmutowane białko Tat może być zmutowane tak, że jest nieaktywne biologicznie, ale nadal utrzymuje swoje immunogenne epitopy. Jeden możliwy zmutowany gen tat skonstruowany przez D. Clements (Tulane University) (pochodzący z klonu molekularnego BH10) niesie mutacje w miejscu regionu aktywnego (Lys41 >Ala) i w motywie RGD (Arg78 >Lys i Asp80 >Glu) (ViroIogy
235: 48-64, 1997).
Zmutowany Tat przedstawiono na fig. 1 (SEQ ID NO: 22 i 23), podobnie jak mutant-His Nef-Tat (SEQ ID NO: 24 i 25).
Białka HIV Tat lub Nef w szczepionce według wynalazku mogą być zmodyfikowane metodami chemicznymi podczas oczyszczania, dla nadania białkom trwałości i monomeryczności. Jednym ze sposobów zapobiegania oksydacyjnej agregacji takiego białka jak Tat lub Nef jest stosowanie modyfikacji chemicznych grup tiolowych białka. W pierwszym etapie mostki disulfidowe redukuje się przez działanie środkiem redukującym, takim jak DTT, β-merkaptoetanol lub glutation. W drugim etapie powstałe tiole blokuje się przez reakcje ze środkiem alilującym (np. białko może być karboksyamidowane/karbamidometylowane z użyciem jodoacetamidu). Taka chemiczna modyfikacja nie modyfikuje funkcjonalnych właściwości Tat lub Nef, co stwierdzono na podstawie testów wiązania do komórek i hamowania limfoproliferacji jednojądrzastych komórek ludzkiej krwi obwodowej.
Białko HIV Tat i białka HIV gp120 można oczyszczać sposobami przedstawionymi w podanych poniżej przykładach.
Szczepionka według wynalazku będzie zawierała immunoochronną lub immunoterapeutyczną ilość antygenów Tat i/lub Nef albo NefTat i gp120 i można ją wytworzyć znanymi technikami.
Wytwarzanie szczepionek opisano ogólnie w New Trends and Developments in Vaccines, red. Voller i in., University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Kapsułkowanie w liposomach opisał np. Fullerton w opisie patentowym US 4232877. Koniugację białek do makrocząsteczek ujawnili np. Likhite w opisie patentowym US 4372945 oraz Armor i in., w opisie patentowym US 4474757.
Ilość białka w dawce szczepionki dobiera się jako ilość, która indukuje immunoochronną odpowiedź bez znaczących niekorzystnych skutków ubocznych w typowych szczepionkach. Taka ilość będzie się zmieniać w zależności od konkretnego użytego immunogenu. Na ogół oczekuje się, że każda dawka będzie zawierać 1-1000 μg każdego białka, korzystnie 2-200 μg, a najkorzystniej 4-40 μg Tat lub Nef lub NefTat oraz korzystnie 1-150 μg, a najkorzystniej 2-25 μg gp120. Optymalną ilość dla danej szczepionki można ustalić na podstawie standardowych badań obejmujących obserwację mian przeciwciał i inne odpowiedzi u pacjentów. Jedna szczególna przykładowa dawka szczepionki będzie zawierała 20 μg NefTat i 5 lub 20 μg gp120. Po pierwszym szczepieniu pacjenci mogą otrzymać dawkę przypominającą po około 4 tygodniach, a następnie drugą immunizację przypominającą.
Do białek stosowanych zgodnie z wynalazkiem w preparacie szczepionki według wynalazku korzystnie dodaje się adiuwanty. Adiuwanty są ogólnie opisane w Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach, red. Powell i Newman, Plenum Press, New York, 1995.
Odpowiednie adiuwanty obejmują sól glinu, taką jak żel wodorotlenku glinu (ałun) lub fosforan glinu, ale może to być sól wapnia, żelaza lub cynku, albo nierozpuszczalna zawiesina acylowanej tyrozyny, albo acylowane cukry, kationowe lub anionowe modyfikowane polisacharydy lub polifosfazeny.
PL 211 762 B1
W przypadku preparatu wedł ug wynalazku korzystne jest, aby kompozycja adiuwantu indukowała zwłaszcza odpowiedź Th1. Jednak będzie zrozumiałe, że inne odpowiedzi, w tym odpowiedzi humoralne, nie są wykluczone.
Odpowiedź odpornościowa na antygen jest wywoływana poprzez oddziaływanie antygenu z komórkami ukł adu odpornoś ciowego. Wystę pują cą odpowiedź odpornoś ciową moż na ogólnie podzielić na dwie skrajne kategorie, odpowiedź humoralną lub pośredniczoną przez komórki (tradycyjnie określane jako odpowiednio mechanizm ochrony przez przeciwciała i mechanizm ochrony przez efektory komórkowe). Te kategorie odpowiedzi określono jako odpowiedzi typu Th1 (odpowiedź komórkowa) i odpowiedzi typu Th2 (odpowiedź humoralna).
Ekstremalne odpowiedzi typu Th1 mogą charakteryzować się generacją cytotoksycznych limfocytów T, specyficznych w stosunku do antygenu i ograniczonych względem haplotypu, oraz odpowiedziami komórek NK. U myszy odpowiedzi typu Th1 często charakteryzuje generacja przeciwciał podtypu Ig2a, podczas gdy u ludzi odpowiadają one przeciwciałom typu IgG1. Odpowiedzi odpornościowe typu Th2 charakteryzują się generacją szerokiego spektrum izotypów immunoglobulinowych, obejmujących u myszy IgG1, IgA i IgM.
Można uważać, że siłą napędową rozwoju tych dwóch typów odpowiedzi odpornościowej są cytokiny, szereg określonych posłańców białkowych, które służą do pomagania komórkom układu odpornościowego i sterują ewentualną odpowiedzią odpornościową w kierunku odpowiedzi Th1 lub Th2. Tak więc przy wysokim poziomie cytokin typu Th1 istnieje tendencja do faworyzowania indukcji komórkowych odpowiedzi odpornościowych na dany antygen, podczas gdy przy wysokim poziomie cytokin typu Th2 istnieje tendencja do faworyzowania indukcji humoralnych odpowiedzi odpornościowych na antygen.
Należy pamiętać, że rozróżnienie między odpowiedziami odpornościowymi typu Th1 i Th2 nie jest bezwzględne. W rzeczywistości osobnik będzie utrzymywał odpowiedź odpornościową, która jest opisywana jako głównie Th1 lub głównie Th2. Często wygodne jest jednak rozważanie rodzin cytokin według warunków opisanych dla klonów komórek T myszy CD4+VE przez Mosmanna i Coffmana (Mosmann, T.R. i Coffman, R.L. (1989). TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphocyte secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology. 7 str. 145-173). Tradycyjnie odpowiedzi typu Th1 są powiązane z wytwarzaniem cytokin INF-γ i IL-2 przez limfocyty T. Inne cytokiny, często bezpośrednio powiązane z indukcją odpowiedzi typu Th1, takie jak IL-12, nie są wytwarzane przez komórki T. Przeciwnie, odpowiedzi typu Th1 są związane z wydzielaniem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 oraz czynnika β martwicy nowotworu (TNF-β).
Wiadomo, że pewne adiuwanty szczepionkowe są szczególnie odpowiednie dla stymulacji odpowiedzi cytokin typu Th1 i Th2. Tradycyjnie najlepsze wskaźniki równowagi Th1/Th2 odpowiedzi odpornościowej po szczepieniu lub zakażeniu to wynik bezpośredniego pomiaru wytwarzania cytokin Th1 lub Th2 przez limfocyty T in vitro po ponownej stymulacji przez antygen, i/lub wynik pomiaru stosunku IgG1:IgG2a specyficznych dla antygenu odpowiedzi przeciwciał.
Tak więc adiuwant typu Th1 to taki, który stymuluje wyizolowane populacje komórek T do wytwarzania wysokich poziomów cytokin typu Th1 po ponownej stymulacji antygenem in vitro oraz indukuje specyficzne dla antygenu odpowiedzi immunoglobulin związane z izotypem Th1.
Korzystne immunostymulanty typu Th1, które można fomułować tak, aby wytwarzały adiuwanty odpowiednie do stosowania zgodnie z wynalazkiem, obejmują, lecz nie wyłącznie, te podane poniżej.
Monofosforylolipid A, w szczególności 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A (3D-MPL) jest korzystnym immunostymulantem typu Th1 do stosowania zgodnie z wynalazkiem. 3D-MPL jest dobrze znanym adiuwantem wytwarzanym przez Ribi Immunochem, Montana. Chemicznie jest często dostarczany jako mieszanina 3-de-O-monofosforylowanego lipidu A z 4, 5 lub 6-acylowanymi łańcuchami. Może być oczyszczony i wytwarzany sposobami opisanymi w GB 2122204B, gdzie także ujawniono wytwarzanie difosforylolipidu A i jego 3-O-deacylowanych wariantów. Opisano inne oczyszczone i syntetyczne lipopolisacharydy (US 6005099 i EP 0729473 B1; Hilgers i in., 1986, Int. Arch. Allergy Immunol., 79(4):392-6; Hilgers i in., 1987, Immunology, 60(1):141-6; i EP 0549074 B1). Korzystną postać 3D-MPL stanowi preparat w postaci cząstek, zawierający małe cząstki o średnicy poniżej 0,2 Lim, a sposób jego wytwarzania opisano w EP 0 689 454.
Korzystnymi immunostymulantami Th1 zgodnie z wynalazkiem są również saponiny. Saponiny są dobrze znanymi adiuwantami, a opisano je w Lacaille-Dubois M. i Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine, tom 2 str. 363-380). Przykładowo Quil A (pochodząca z kory południowoamerykańskiego drzewa Quillaja Saponaria Molina) i jej frakcje opisano w US 5057540 oraz w „Saponins as vaccine adjuvants, Kensil, C.R., Crit Rev Ther
PL 211 762 B1
Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55; i EP 0362279 B1). Hemolityczne saponiny QS21 i QS17 (frakcje Quil A oczyszczone metodą HPLC) opisano jako silne adiuwanty ogólnoustrojowe, a sposób ich wytwarzania ujawniono w opisach patentowych US nr 5057540 i EP 0362279 B1. W publikacjach tych opisano również zastosowanie QS7 (niehemolitycznej frakcji Quil-A), która działa jako silny adiuwant dla szczepionek ogólnoustrojowych. Zastosowanie QS21 opisano ponadto w Kensil i in., (1991. J. Immunology, tom 146, 431-437. Połączenia QS21 i polisorbatu lub cyklodekstryn są też znane (WO 99/10008). Układy adiuwantów w postaci cząstek, zawierające frakcje QuilA, takie jak QS21 i QS7, opisano w WO 96/33739 i WO 96/11711.
Innym korzystnym immunostymulantem jest immunostymulacyjny oligonukleotyd zawierający niemetylowane dinukleotydy CpG („CpG). CpG jest skrótem dinukleotydowych motywów cytozyna-guanozyna obecnych w DNA. CpG jest znany jako adiuwant podawany zarówno ogólnoustrojowo, jak i dośluzówkowo (WO 96/02555, EP 468520, Davis i in., J. Immunol. 1998, 160(2):870-876; McCluskie i Davis, J. Immunol., 1998, 161(9):4463-6). Historycznie zaobserwowano, ż e frakcja DNA z BCG mogła wywierać działanie przeciwnowotworowe. W dalszych badaniach wykazano, że syntetyczne oligonukleotydy pochodzące z sekwencji genu BCG są zdolne do wywoływania działania immunostymulacyjnego (zarówno in vitro, jak i in vivo). Autorzy tych badań wywnioskowali, że pewne sekwencje palindromowe, w tym centralny motyw CG, wykazują tę aktywność. Centralna rola motywu CG w immunostymulacji została później wyjaśniona w publikacji Krieg, Nature 374, str. 546 1995. Szczegółowa analiza wykazała, że motyw CG musi istnieć w kontekście pewnej sekwencji, i że takie sekwencje są wspólne w DNA bakterii, ale rzadkie w DNA kręgowców. Immunostymulującą sekwencją często jest puryna, puryna, C, G, pirymidyna, pirymidyna, gdzie motyw CG nie jest metylowany, ale wiadomo, że inne niemetylowane sekwencje CpG wykazują działanie immunostymylujące i mogą być stosowane zgodnie z wynalazkiem.
W pewnych kombinacjach sześ ciu nukleotydów obecna jest sekwencja palindromowa. Kilka z tych motywów, jako powtórzenia jednego motywu, albo kombinacja róż nych motywów, moż e być obecnych w tym samym oligonukleotydzie. Obecność jednego lub większej liczby tych sekwencji immunostymulujacych zawierających oligonukleotydy może aktywować różne podzbiory odpornościowe, w tym komórki NK (które wytwarzają interferon γ i mają aktywność cytolityczną) i makrofagi (Wooldridge i in., tom 89 (nr 8), 1977). Obecnie wykazano, że także inne sekwencje zawierające niemetylowane CpG, nie mające tej sekwencji najwyższej zgodności, są immunomodulujące.
CpG sformułowany w postaci szczepionek jest zazwyczaj podawany w postaci wolnej w roztworze wraz z wolnym antygenem (WO 96/02555; McCluskie i Davis, powyżej) lub kowalencyjnie sprzężony z antygenem (WO 98/16247), albo sformułowany z nośnikiem, takim jak wodorotlenek glinu (antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby) Davis i in., powyżej; Brazolot-Millan i in. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95(26), 15553-8).
Takie immunostymulanty jak opisano powyżej można formułować razem z nośnikami, takimi jak np. liposomy, emulsje olej w wodzie i/lub sole metali, w tym sole glinu (takie jak wodorotlenek glinu). Przykładowo 3D-MPL może być formułowany z wodorotlenkiem glinu (EP 0689454) lub w emulsji olej w wodzie (WO 95/17210); QS21 może być korzystnie formułowany z liposomami zawierającymi cholesterol (WO 96/33739), w emulsji olej w wodzie (WO 95/17210) lub z ałunem (WO 98/15287); CpG może być formułowany z ałunem (Davis i in., powyżej; Brazolot-Millan, powyżej) lub z innymi nośnikami kationowymi.
Korzystne są połączenia immunostymulantów, w szczególności połączenia monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny (WO 94/00153; WO 95/17210; WO 96/33739; WO 98/56414; WO 99/12565; WO 99/11241), a zwłaszcza połączenie QS21 i 3D-MPL ujawniona w WO 94/00153. Alternatywnie połączenie CpG i saponiny, takiej jak QS21, także tworzy silny adiuwant do stosowania zgodnie z wynalazkiem.
Tak więc odpowiednie układy adiuwantów obejmują np. połączenie monofosforylolipidu A, korzystnie 3D-MPL, z solą glinu. Wzmocniony układ zawiera połączenie monofosforylolipidu A i pochodnej saponiny, zwłaszcza połączenie QS21 i 3D-MPL, jak to ujawniono w WO 94/00153, lub mniej reaktywne połączenie, w którym QS21 jest wygaszany w liposomach zawierających cholesterol (DQ), jak to ujawniono w WO 96/33739.
Szczególnie silny preparat adiuwanta, zawierający QS21, 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej w wodzie, opisano w WO 95/17210 i stanowi on następny korzystny preparat do stosowania zgodnie z wynalazkiem.
Inny korzystny preparat zawiera oligonukleotyd CpG, sam lub razem z solą glinu.
PL 211 762 B1
W innym aspekcie wynalazku szczepionka może zawierać DNA kodujący jeden lub większą liczbę polipeptydów Tat, Nef i gp120, dzięki czemu polipeptyd powstaje in situ. DNA może być obecny w dowolnym z róż nych znanych ukł adów dostarczania, w tym ukł ady ekspresyjne kwasu nukleinowego, takie jak układy ekspresji plazmidowego DNA, bakterii i wirusów. Znane są liczne techniki dostarczania genów, takie jak opisane przez Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198, 1998 i cytowane tam odnośniki. Odpowiednie układy ekspresji kwasów nukleinowych zawierają potrzebne sekwencje DNA dla ekspresji u pacjenta (takie jak odpowiedni promotor i sygnał terminacji). Gdy układ ekspresji jest zrekombinowanym żywym mikroorganizmem, takim jak wirus lub bakteria, interesujący gen może być wstawiony do genomu żywego zrekombinowanego wirusa lub bakterii. Zaszczepienie i zakażenie in vivo tym żywym wektorem doprowadzi do ekspresji in vivo antygenu i wywoł ania odpowiedzi odpornoś ciowych. Wirusami i bakteriami stosowanymi w tym celu są np.: wirusy ospy (np. krowianki, ospy ptasiej, ospy kanarka, modyfikowane wirusy ospy, np. modyfikowany wirus Ankara (MVA)), alfawirusy (wirus Sindbis, wirus Semliki Forest, Wirus wenezuelskiego zapalenia mózgu koni), flawiwirusy (wirus żółtej febry, wirus Dengi, wirus japońskiego zapalenia mózgu), adenowirusy, wirus związany z adenowirusem, pikornawirusy (wirus polio, wirus nieżytu nosa), wirusy opryszczki (wirus półpaśca, itd.), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria i BCG. Te wirusy i bakterie mogą być wirulentne lub atenuowane na różne sposoby, aby uzyskać żywe szczepionki. Takie żywe szczepionki są także przydatne w profilaktyce chorób.
Tak więc składniki Nef, Tat i gp120 korzystnej szczepionki według wynalazku mogą być dostarczane w postaci polinukleotydów kodujących pożądane białka.
Ponadto immunizację zgodnie z wynalazkiem mogą być przeprowadzone z użyciem połączeń preparatów na bazie białka i DNA. Immunizacje pierwotne-przypominające („prime-boost) uważa się za skuteczne indukujące szerokie odpowiedzi odpornościowe. Szczepionki białkowe z adiuwantem głównie indukują odpowiedzi przeciwciał i komórek T pomocniczych, podczas gdy dostarczanie DNA jako plazmidu lub żywego wektora indukuje silne odpowiedzi limfocytów cytotoksycznych T (CTL). Tak więc połączenie szczepienia białkiem i DNA zapewni szeroki zakres odpowiedzi odpornościowych. Jest to szczególnie istotne w kontekście HIV, gdyż uważa się, że zarówno przeciwciała neutralizujące, jak i CTL są ważne dla obrony immunologicznej przeciw HIV.
Schemat szczepienia gp120, Nef i Tat, samymi lub w połączeniu, może obejmować kolejne (pierwotne plus przypominające) albo równoczesne podawanie antygenów białkowych i DNA kodujących wyżej wymienione białka. DNA może być dostarczony jako DNA plazmidowy lub w postaci zrekombinowanego żywego wektora, np. wektora w postaci wirusa ospy lub dowolnego innego odpowiedniego żywego wektora, takiego jak te tu opisane. Antygeny białkowe można wstrzykiwać jeden lub kilka razy, po czym podaje się raz lub większą liczbę razy DNA, albo DNA może być stosowany najpierw do jednego lub większej liczby podań, po czym następuje jedna lub większa liczba immunizacji białkami.
Konkretny przykład immunizacji pierwotnej-przypominającej obejmuje zaszczepianie pierwotne DNA w postaci zrekombinowanego żywego wektora, takiego jak zmodyfikowany wirus ospy, np. zmodyfikowany wirus Ankara (MVA), lub alfawirus, np. wirus wenezuelskiego zapalenia mózgu koni, a następnie wspomaganie białkiem, korzystnie białkiem z adiuwantem.
Wynalazek umożliwia ponadto opracowanie zestawu farmaceutycznego zawierającego: a) kompozycję zawierającą jedno lub większą liczbę białek gp120, Nef i Tat wraz z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką i
b) kompozycję zawierającą jeden lub większą liczbę polinukleotydów kodujących białka gp120, Nef lub Tat, wraz z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką; z tym, ż e co najmniej jedna z kompozycji (a) i (b) zawiera gp120 z Nef i/lub Tat i/lub Nef-Tat.
Kompozycje a) i b) mogą być podawane oddzielnie, w dowolnej kolejności, albo razem. Korzystnie a) zawiera wszystkie trzy białka, gp120, Nef i Tat, Korzystnie b) zawiera wszystkie trzy DNA, gp120, Nef i Tat. Najkorzystniej Nef i Tat są w postaci białka fuzyjnego NefTat.
Preparat szczepionki wytwarza się sposobem obejmującym domieszanie połączenia opisanych białek. Kompozycja białek może być zmieszana z odpowiednim adiuwantem i ewentualnie nośnikiem.
Szczególnie korzystne połączenia adiuwanta i/lub nośnika do stosowania w preparatach według wynalazku są następujące:
i) 3D-MPL + QS21 w DQ ii) ałun + 3D-MPL iii) ałun + QS21 w DQ + 3D-MPL iv) ałun + CpG
PL 211 762 B1
v) 3D-MPL + QS21 w DQ + emulsja olej w wodzie vi) CpG
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady i załączone figury.
Gen Nef z izolatu Bru/Lai (Cell 40:9-17, 1985) wybrano do konstruktów w tych doświadczeniach, gdyż gen ten należy do najbardziej spokrewnionych z sekwencją najwyższej zgodności Nef. Materiałem wyjściowym dla genu Bru/Lai Nef był fragment DNA 1170 bp sklonowany na wektorze ekspresyjnym ssaka pcDNA3 (pcDNA3/Nef).
Gen Tat pochodzi z klonu molekularnego BH10. Ten gen był otrzymany jako klon cDNA HTLV
III nazwany pCV1 i opisany w Science, 229, str. 69-73, 1985.
Ekspresja genów Nef i Tat może być w Pichia lub dowolnym innym gospodarzu.
P r z y k ł a d 1. Ekspresja sekwencji HIV-1 nef i tat w Pichia pastoris
Białko Nef, białko Tat i fuzję Nef-Tat eksprymowano w metylotropowych drożdżach Pichia pastoris pod kontrolą indukowalnego promotora oksydazy alkoholowej (AOX1).
Aby eksprymować te geny HIV-1, zastosowano zmodyfikowaną wersję wektora integracyjnego
PHIL-D2 (INVITROGEN). Wektor ten zmodyfikowano w taki sposób, że ekspresja białka heterolgicznego zaczyna się zaraz po natywnym kodonie ATG genu AOX1 i spowoduje wytworzenie zrekombinowanego białka z ogonem z jednej glicyny i sześciu reszt histydynowych. Ten wektor PHIL-D2-MOD skonstruowano przez wklonowanie linkera oligonukleotydowego między sąsiednimi miejscami AsuII i EcoRI wektora PHIL-D2 (patrz fig. 2). Oprócz tego ogona His linker przenosi miejsca restrykcyjne Ncol, Spel i Xbal, między którymi wstawiono fuzję nef, tat i nef-tat.
1.1 Konstrukcja wektorów integracyjnych pRIT14597 (kodujący białko Nef-His), pRIT14598 (kodujący białko Tat-His) o pRIT14599 (kodujący fuzję Nef-Tat-His)
Gen nef zamplifikowano metodą PCR z plazmidu pcDNA3/Nef z użyciem starterów 01 i 02 NCOI
STARTER 01(SEQ ID NO: 1):5'ATCGTCCATG.GGT.GGC.AAG.TGG.T 3'
Spel
STARTER 02 (SEQ ID NO: 2) : 5 ' CGGCTACTAGTGCAGTTCTTGAA 3'
Otrzymany fragment PCR i wektor integracyjny PHIL-D2-MOD strawiono Ncol i Spel, oczyszczono w żelu agarozowym i zligowano z wytworzeniem plazmidu integracyjnego pRIT14597 (patrz fig. 2). Gen tat zamplifikowano metodą PCR z pochodnej plazmidu pCV1 z użyciem starterów 05 i 04:
Spel
STARTER 04(SEQ ID NO: 4):5'CGGCTACTAGTTTCCTTCGGGCCT 3'
NCOI
STARTER 05(SEQ ID NO: 5):5'ATCGTCCATGGAGCCAGTAGATC 3'
Wprowadzono miejsce restrykcyjne Ncol na końcu 5' fragmentu PCR oraz wprowadzono miejsce Spel na końcu 3' starterem 04. Otrzymany fragment PCR i wektor PHIL-D2-MOD strawiono Ncol i Spel, oczyszczono w żelu agarozowym i zligowano, z wytworzeniem plazmidu integracyjnego pRIT14598.
Aby skonstruować pRIT14599, zligowano fragment DNA 910 bp odpowiadający sekwencji kodującej nef-tat-His między stępionym (polimeraza T4) miejscem EcoRI i miejscem Ncol wektora PHIL-D2-NOD. Sekwencję kodującą nef-tat-His otrzymano przez trawienie Xbal stępionego (polimeraza T4) i Ncol pRIT14596.
1.2 Transformacja szczepu Pichia pastoris GS115 (his4)
Aby uzyskać szczepy Pichia pastoris eksprymujące Nef-His, Tat-His i fuzję Nef-Tat-His, transformowano szczep GS115 liniowymi fragmentami Notl niosącymi odpowiednie kasety ekspresyjne plus gen HIS4, aby uzupełnić his4 w genomie gospodarza. Transformacja GS115 linowymi fragmentami NotI sprzyja rekombinacji w locus AOX1.
Wielokopiowe klony integrantów wybrano przez ilościową analizę typu dot blot i określono typ integracji, insercję (fenotyp Mut+) lub przemieszczenie (fenotyp MutS).
PL 211 762 B1
Z każ dej transformacji wybrano jeden transformant wykazuj ący wysoki poziom wytwarzania zrekombinowanego białka:
Szczep Y1738 (fenotyp Mut+) wytwarzający zrekombinowane białko Nef-His, mirystylowane białko z 215 aminokwasów, które skł ada się z:
kwasu mirystynowego;
metioniny, wprowadzonej z wykorzystaniem miejsca klonowania Ncol wektora PHIL-D2-MOD;
205 aminokwasów białka Nef (począwszy od aminokwasu 2 aż do aminokwasu 206);
treoniny i seryny, wprowadzonych z zastosowaniem procedury klonowania (klonowanie w miejscu Spel wektora PHIL-D2-MOD); jednej glicyny i sześciu histydyn.
Szczep Y1739 (fenotyp Mut+) wytwarzający zrekombinowane białko Tat-His, białko z 95 aminokwasów, które składa się z:
metioniny, wprowadzonej z wykorzystaniem miejsca klonowania Ncol;
aminokwasów białka Tat (począwszy od aminokwasu 2 aż do aminokwasu 86); treoniny i seryny, wprowadzonych z zastosowaniem procedury klonowania; jednej glicyny i sześciu histydyn.
Szczep Y1737 (fenotyp MutS) wytwarzający zrekombinowane białko fuzyjne Nef-Tat-His, mirystylowane białko z 302 aminokwasów, które składa się z:
kwasu mirystynowego;
metioniny, wytworzonej z wykorzystaniem miejsca klonowania Ncol;
205 aminokwasów białka Nef (począwszy od aminokwasu 2 aż do aminokwasu 206); treoniny i seryny, wytworzonych z zastosowaniem procedury klonowania;
aminokwasów białka Tat (począwszy od aminokwasu 2 aż do aminokwasu 86); treoniny i seryny, wprowadzonych z zastosowaniem procedury klonowania; jednej glicyny i sześciu histydyn.
P r z y k ł a d 2. Ekspresja zmutowanego Tat HIV-1 w Pichia pastoris
Przeprowadzono ekspresję także zmutowanego zrekombinowanego białka Tat. Zmutowane białko Tat musi być nieaktywne biologicznie, zarazem zachowując epitopy immunogenne.
Do tych konstruktów wybrano podwójnie zmutowany gen tat, skonstruowany przez D. Clements (Tulane University).
Ten gen tat (pochodzi z klonu molekularnego BH10) niesie mutacje w regionie miejsca aktywnego (Lys41^Ala) i w motywie RGD (Arg78^Lys i Asp80^Glu) (ViroIogy 235: 48-64, 1997).
Zmutowany gen tat otrzymano jako fragment cDNA subklonowany między miejscami EcoRI i Hindlll w plazmidzie ekspresyjnym CMV (pCMVLys41/KGE).
2.1 Konstrukcja wektorów integracyjnych pRIT14912 (kodujący białko zmutowany Tat-His) i pRIT14913 (kodujący białko fuzyjne Nefzmutowany Tat-His)
Zmutowany gen tat zamplifikowano metodą PCR z plazmidu pCMVLys41/KGE z użyciem starterów 05 i 04 (patrz sekcja 1.1 konstrukcja pRIT14598).
Wprowadzono miejsce restrykcyjne Ncol na końcu 5' fragmentu PCR i miejsce Spel na końcu 3' z użyciem startera 04. Otrzymany fragment PCR i wektor PHIL-D2-MOD strawiono Ncol i Spel, oczyszczono w żelu agarozowym i zligowano, z wytworzeniem plazmidu integracyjnego pRIT14912.
Aby skonstruować pRIT14913, zmutowany gen tat zamplifikowano metodą PCR z plazmidu pCMVLys41/KGE z użyciem starterów 03 i 04.
Spel
STARTER 03 (SEQ ID NO: 3) : 5 ' ATCGTACTAGT. GAG. CCA. GTA. GAT. C 3'
Spel
STARTER 04(SEQ ID NO: 4):5'CGGCTACTAGTTTCCTTCGGGCCT 3'
Otrzymany fragment PCR i plazmid pRIT14597 (eksprymujacy białko Nef-His) strawiono enzymem restrykcyjnym Spel, oczyszczono w żelu agarozowym i zligowano, aby otrzymać plazmid integracyjny pRIT14913.
2.2 Transformacja szczepu Pichia pastoris GS115
PL 211 762 B1
Otrzymano szczepy Pichia pastoris eksprymujące białko zmutowane Tat-His i fuzję Nefzmutowane Tat-His z zastosowaniem strategii integracji i selekcji zrekombinowanych szczepów uprzednio opisanej w części 1.2.
Wybrano dwa zrekombinowane szczepy wytwarzające białko zmutowany Tat-His, białko z 95 aminokwasów: Y1775 (fenotyp Mut+) i Y1776 (fenotyp MutS).
Wybrano jeden zrekombinowany szczep eksprymujący białko fuzyjne Nef- zmutowany Tat-His, białko z 302 aminokwasów: Y1774 (fenotyp Mut+).
P r z y k ł a d 3. Fermentacja Pichia pastoris wytwarzającej zrekombinowany Tat-His
Typowy proces jest przedstawiony w poniższej tabeli.
Fermentacja obejmuje fazę wzrostu (zasilanie pożywką opartą na glicynie, zgodnie z odpowiednią krzywą) prowadzącą do hodowli o dużej gęstości komórek i fazę indukcji (zasilanie metanolem i roztworem soli-mikroelementów). Podczas fermentacji wzrost monitoruje się przez pobieranie próbek i pomiar ich absorbancji przy 620 nm. W czasie fazy indukcji metanol dodawano za pomocą pompy, a jego stężenie mierzono metodą chromatografii gazowej (na próbkach hodowli) i przez równoczesną analizę gazów spektrometrem masowym. Po fermentacji komórki odzyskiwano przez wirowanie przy 5020 x g przez 30 minut w 2-8°C i pastę komórkową przechowywano w -20°C. Do dalszej pracy pastę rozmrażano, przeprowadzano w stan zawiesiny o OD (przy 620 nm) 150 w buforze (50 mM Na2HPO4 pH 7, 5% PMSF, 4 mM izopropanol) i rozbijano przez 4-krotne przepuszczenie przez DynoMill (objętość 0,6 litra, 3000 obr./min, 6 litrów/godzinę, średnica perełek 0,40-0,70 mm).
W celu oceny ekspresji próbki usuwano w czasie indukcji, rozbijano i analizowano metodą SDS-PAGE lub techniką Western. Na żelach z SDS barwionych błękitem Coomassie wyraźnie zidentyfikowano zrekombinowane Tat-his jako intensywny około 72-96 godzinach indukcji.
Rozmnożenie roboczej fiolki do zaszczepienia i
Wstępna hodowla w stanie stałym 30°C, 14-16 h i
Płynna wstępna hodowla w dwóch 2 litrowych kolbach erlenmeyera, 30°C, 200 obr./min i
Zaszczepienie 20 litrowego fermentora prążek wykazujący maksymalną intensywność po
Pożywka syntetyczna: YNB + glukoza + agar
Pożywka syntetyczna: 2 x 400 ml YNB + gliceryna
Zatrzymać gdy OD > 1 (przy 620 nm) litrów wstępnej pożywki (FSC006AA) ml środka przeciw pienieniu SAG471 (z Witco) Ustawienia:
Temperatura: 30°C
Nadciśnienie: 0,3 bar;
Przepływ powietrza: 20 Nl/min
Rozpuszczony O2: regulowany > 40% pH: regulowane do 5 za pomocą NH4OH i
Fermentacja półokresowa: faza wzrostu.
Czas trwania około 40 h
Fermentacja półokresowa: faza indukcji:
Czas trwania: do 97 h i
Wirowanie i
Odzyskanie pasty komórek i przechowywanie w -20°C i
Rozmnożenie komórek i przeprowadzenie w zawiesinę o OD150 (620 nm) w buforze
Zasilanie pożywką na bazie glicerolu FFB005AA Końcowa OD 200-500 OD (620 nm)
Zasilanie metanolem i roztworem soli/mikroelementów (FSE021AB).
5020 g/30 min/2-8°C
Bufor: Na2HPO4 pH7 50 mM, 5% PMSF, 4 mM izopropanol
PL 211 762 B1 i
Rozbicie komórek w Dyno-mill Dyno-mill: objętość 0,6 litra, 3000 obr/min, przejścia 6 litrów/godzinę, średnica paciorków
0,40-0,70 mm).
i
Przeniesienie do ekstrakcji/oczyszczania Pożywki stosowane do fermentacji
Wstępna hodowla w stanie stałym: (YNB + glukoza + agar)
Glukoza: 10 g/l Na2MoO4^2H2O: 0,0002 g/l Kwas foliowy 0,000064 g/l
KH2PO4: 1 g/l MnSO4^H2O: 0,0004 g/l Inozytol: 0,064 g/l
MgSCW^O: 0,5 g/l H3BO3: 0,0005 g/l Pirydoksyna: 0,008 g/l
CaCU2H2O: 0,1 g/l KI: 0,0001 g/l Tiamina: 0,008 g/l
NaCl: 0,1 g/l CoCU6H2O: 0,00009 g/l Niacyna: 0,000032 g/l
FeCU6H2O: 0,0002 g/l Ryboflawina: 0,000016 g/l Pantotenian Ca: 0,008 g/l
CuSO4^5H2O: 0,00004 g/l Biotyna: 0,000064 g/l Kwas p-aminobenzoesowy 0,000016 g/l
ZnSO47H2O: 0,0004 g/l (NH4)2SO4: 5 g/l Agar 18 g/l
Płynna wstępn a hodowla (YNB + gliceryna)
Gliceryna: 2% (obj./obj.) Na2MoO4^2H2O: 0,0002 g/l Kwas foliowy 0,000064 g/l
KH2PO4: 1 g/l MnSO4^H2O: 0,0004 g/l Inozytol: 0,064 g/l
MgSO47H2O: 0,5 g/l H3BO3: 0,0005 g/l Pirydoksyna: 0,008 g/l
CaCU2H2O: 0,1 g/l KI: 0,0001 g/l Tiamina: 0,008 g/l
NaCl: 0,1 g/l CoCU6H2O: 0,00009 g/l Niacyna: 0,000032 g/l
FeCU6H2O: 0,0002 g/l Ryboflawina: 0,000016 g/l Pantotenian Ca: 0,008 g/l
CuSO4^5H2O: 0,00004 g/l Biotyna: 0,000064 g/l Kwas p-aminobenzoesowy 0,000016 g/l
ZnSO47H2O: 0,0004 g/l (NH4)2SO4: 5 g/l
Pierwszy wsad do fermentora: (FSC006AA)
(NH4)2SO4: 6,4 g/l
KH2PO4: 9 g/l Na2MoO4GH2O: 2,04 mg/l
MgSO47H2O: 4,7 g/l MnSO4^H2O: 4,08 mg/l
CaCU2H2O: 0,94 g/l H3BO3: 5,1 mg/l
FeCU6H2O: 10 mg/l KI: 1,022 mg/l
HCl: 1,67 ml/l CoCU6H2O: 0,91 mg/l
CuSO4^5H2O: 0,408 mg/l NaCl: 0,06 g/l
ZnSO47H2O: 4,08 mg/l Biotyna: 0,534 mg/l
Roztwór zasilający stosowany w fazie wzrostu (FFB005AA)
Gliceryna: 38,7% obj./obj. Na2MoO4GH2O: 5,7 mg/l
MgSO47H2O: 13 g/l CuSO4^5H2O: 1,13 mg/l
CaCU2H2O: 2,6 g/l CoC^6H2O: 2,5 mg/l
FeCU6H2O: 27,8 mg/l H3BO3: 14,2 mg/l
ZnSO47H2O: 11,3 mg/l Biotyna: 1,5 mg/l
MnSO4^H2O: 11,3 mg/l KI: 2,84 mg/l
KH2PO4: 24,93 g/l NaCl: 0,167 g/l
PL 211 762 B1
Roztwór zasilający soli i mikroelementów stosowany w czasie indukcji (FSE021AB):
KH2PO4: 45 g/l Na2MoO4^H2O: 10,2 mg/l
MgSCUTI-hO: 23,5 g/l MnSO4^H2O: 20,4 mg/l
CaCU2H2O: 4,70 g/l H3BO3: 25,5 mg/l
NaCI: 0,3 g/l KI: 5,11 mg/l
HCl: 8,3 ml/l CoCU6H2O: 4,55 mg/l
CuSO4dH2O: 2,04 mg/l FeCU6H2O: 50,0 mg/l
ZnSO47H2O: 20,4 mg/l Biotyna: 2,70 mg/l
P r z y k ł a d 4. Oczyszczanie białka fuzyjnego Nef-Tat-His (Pichia pastoris)
Schemat oczyszczania opracowano z 146 g zrekombinowanych komórek Pichia pastoris (mokra masa) lub 2 litrów homogenatu z Dyno-mill OD55. Etapy chromatograficzne przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Mię dzy etapami frakcje Nef-Tat-dodatnie trzymano przez noc w chł odni (+4°C); na dłuższe okresy próbki zamrażano w -20°C.
146 g komórek Pichia pastoris i
Homogenizacja i
Rozbijanie w Dyno-mill (4 przejścia) i
Wirowanie i
Osad z Dyno-mill i
Płukanie (1 h 4°C) i
Wirowanie
Bufor: 2 litry 50 mM PO4 pH 7,0 końcowa OD: 50
Rotor JA10/9500 obr./min/30 min/temperatura pokojowa
Bufor: + 2 litry 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM-NaCl 0,5% empigen
Rotor JA10/9500 obr./min/30 min/temperatura pokojowa i
Osad i
Solubilizacja (przez noc - 4°C) i
Redukcja (4 h - temperatura pokojowa w ciemnościach)
Bufor: + 660 ml 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 4,0 M GuHCl + 0,2 M sól sodowa kwasu 2-merkaptoetanosulfonowego, sodowa (dodanie proszku)/pH doprowadzone do 7,5 (roztworem 0,5 M NaOH) przed inkubacją i karbamidometylowanie (1/2 h - temperatura pokojowa w ciemnosciach) + 0,25 M jodoacetamid (dodanie proszku)/pH doprowadzone do 7,5 (roztworem 0,5 M NaOH) przed inkubacją
PL 211 762 B1 i
Chromatografia powinowactwa z immobilizowanymi jonami metali na agarozie Ni++-NTA (Qiagen - 30 ml żywicy)
Bufor do równoważenia: 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCl - 4,0 GuHCl
Bufor do płukania:
1) bufor do równoważenia
2) 10 mM PO4 pH 7,5 - 150 mM NaCl - 6M mocznik
3) 10 mM PO4 pH 7,5 - 150 mM NaCl - 6M mocznik - 25 mM imidazol
Bufor do elucji: 10 mM PO4 pH 7,5 - 150 mM NaCl - 6M mocznik - 0,5M imidazol i
Rozcieńczanie 2
Do siły jonowej 18 mS/cm2
Bufor do rozcieńczenia: 10 mM PO4 pH 7,5 - 6M mocznik i
Chromatografia kationowymienna na SP Sepharose FF (Pharmacia - 30 ml żywicy)
Bufor do równoważenia: 10 mM PO4 pH 7,5 150 mM NaCl - 6,0M mocznik
Bufor do płukania: 1) bufor do równoważenia
2) 10 mM PO4 pH 7,5 - 250 mM NaCl - 6M mocznik bufor do elucji: 10 mM boran pH 9,0 - 2 M NaCl 6M mocznik i
Zatężanie do 5 mg/ml membrana Omega 10 kDa (Filtron) i
Chromatografia żelowa Superdex200 XK 16/60 (Pharmacia - 120 ml zywicy) i
Dializa (przez noc - 4°C)
Bufor do elucji: 10 mM PO4 pH 7,7 - 160 mM NaCl - 6M mocznik 5 ml próbki/iniekcję >5 iniekcji
Bufor: 10 mM PO4 pH 6,8 - 150 mM NaCl - 0,5M arginina* i
Sterylne sączenie Millex GV 0,22 μm * stosunek 0,5M arginina dla stęż. białka 1600 μg/ml.
Czystość:
Poziom czystości oceniony metodą SDS-PAGE przedstawiono na fig. 3 przy barwieniu srebrem Daiichi i na fig. 4 przy barwieniu błękitem Coomassie G250.
Po etapie Superdex200 > 95%
Po etapach dializy i sterylnego sączenia: > 95%
Odzyskanie
Oczyszczono 51 mg białka Nef-Tat-His ze 146 g zrekombinowanych komórek Pichia pastoris (= 2 litry homogenatu Dyno-mill o OD 55).
P r z y k ł a d 5. Oczyszczanie utlenionego białka fuzyjnego Nef-Tat-His w Pichia pastoris Schemat oczyszczania opracowano dla 73 g zrekombinowanych komórek Pichia pastoris (mokra masa) lub 1 litra homogenatu z Dyno-mill OD50. Etapy chromatograficzne przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Między etapami frakcje Nef-Tat-dodatnie trzymano przez noc w chłodni (+4°C); na dłuższe okresy próbki zamrażano w -20°C.
PL 211 762 B1 g komórek Pichia pastoris i
Homogenizacja
Bufor: 1 litr 50 mM PO4 pH 7,0 - 5 mM
Pefabloc końcowa OD: 50 i
Rozbijanie w Dyno-mill (4 przejścia) i
Wirowanie
Rotor JA10/9500 obr./min/30 min/temperatura pokojowa i
Osad z Dyno-mill i
Płukanie (2 h - 4°C) i
Wirowanie
Bufor: + 1 litr 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl 0,5% Empigen
Rotor JA10/9500 obr./min/30 min/temperatura pokojowa i
Osad i
Solubilizacja (przez noc - 4°C) i
Chromatografia powinowactwa z immobilizowanymi jonami metali na agarozie Ni++-NTA (Qiagen - 15 ml żywicy) i
Rozcieńczanie
Bufor: + 330 ml 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 4,0 M GuHCl
Bufor do równoważenia: 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 4,0 M GuHCl
Bufor do płukania: 1) bufor do równoważenia
2) 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 6M mocznik
3) 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 6M mocznik - 25 mM imidazol
Bufor do elucji: 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM
NaCl - 6M mocznik - 0,5M imidazol 2
Do siły jonowej 18 mS/cmi 2
Bufor do rozcieńczenia: 10 mM PO4 pH 7,5-6M mocznik i
Chromatografia kationowymienna na SP
Sepharose FF (Pharmacia - 7 ml żywicy) i
Zatężanie i
Bufor do rownoważenia: 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 6,0 M mocznik
Bufor do płukania: 1) bufor do równoważenia
2) 10 mM do PO4 pH 7,5 0 250 mM NaCl - 6M mocznik
Bufor do elucji: 10 mM boran pH 9,0 - 2M NaCl 6M mocznik do 0,8 mg/ml membrana Omega 10 kDa (Filtron)
PL 211 762 B1
Dializa (przez noc - 4°C) Bufor: 10 mM PO4 pH 6,8 - 150 mM NaCl - 0,5M arginina i
Sterylne sączenie Millex GV 0,22 μm
Poziom czystości oceniony metodą SDS-PAGE przedstawiono na fig. 6 (barwienie srebrem Daiichi, błękit Coomassie G250, technika Western)
Po etapach dializy i sterylnego sączenia: > 95%
Odzysk (oceniono poprzez kolorymetryczne oznaczenie białka: DOC TCA BCA)
Oczyszczono 2,8 mg utlenionego białka Nef-Tat-his z 73 g zrekombinowanych komórek Pichia pastoris (masa mokra) lub 1 litra homogenatu Dyno-mill o OD 50).
P r z y k ł a d 6. Oczyszczanie zredukowanego białka Tat-His (Pichia pastoris)
Schemat oczyszczania opracowano dla 160 g zrekombinowanych komórek Pichia pastoris (mokra masa) lub 2 litrów homogenatu z Dyno-mill o OD 66. Etapy chromatograficzne przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Między etapami frakcje Tat-dodatnie trzymano przez noc w chłodni (+4°C); na dłuższe okresy próbki zamrażano w -20°C.
160 g komórek Pichia pastoris i
Homogenizacja Bufor: + 2 litry 50 mM PO4 pH 7,04 mM PMSF końcowa OD: 66 i
Rozbijanie w Dyno-mill (4 przejścia) i
Wirowanie i
Osad z Dyno-mill i
Płukanie (1 h - 4°C) i
Wirowanie i
Osad i
Solubilizacja (przez noc - 4°C) i
Rotor JA10/9500 obr./min/30 min/temperatura pokojowa
Bufor: +2 l 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM-NaCl 1% Empigen
Rotor JA10/9500 obr./min/30 min/temperatura pokojowa
Bufor: + 660 ml 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl-4,0 M GuHCl
Wirowanie
Rotor JA10/9500 obr./min/30 min/temperatura pokojowa i
Redukcja (4 h - temperatura pokojowa dopro- + 0,2M sól sodowa kwasu wadzone w ciemnościach) 2-merkaptoetanosulfonowego (dodanie proszku)/pH do 7,5 (roztworem 1M NaOH) przed inkubacją i
PL 211 762 B1 karbamidometylowanie (1/2 h - temperatura pokojowa - w ciemnościach) i
Chromatografia powinowactwa z immobilizowanymi jonami metali na agarozie Ni++-NTA (Qiagen - 60 ml żywicy) + 0,25 M jodoacetamid (dodanie proszku)/pH doprowadzone do 7,5 (roztworem 1M NaOH) przed inkubacją
Bufor do równoważenia: 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 4,0 M GuHCl
Bufor do płukania: 1) bufor do równoważenia
2) 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 6M mocznik
3) 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 6M mocznik - 35 mM imidazol
Bufor do elucji: 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 6M mocznik - 0,5M imidazol i
Rozcieńczanie
Do siły jonowej 12 mS/cm
Bufor do rozcieńczenia: 20 mM boran pH 8,5 6M mocznik i
Chromatografia kationowymienna na SP Sepharose FF (Pharmacia - 30 ml żywicy)
Bufor do równoważenia: 20 mM boran pH 8,5 150 mM NaCl - 6,0M mocznik
Bufor do płukania: bufor do równoważenia bufor do elucji: 20 mM boran pH 8,5-400 mM
NaCl - 6M mocznik i
Zatężanie i
Dializa (przez noc - 4°C) i
Sterylne sączenie do 1,5 mg/ml membrana Omega 10 kDa (Filtron)
Bufor: 10 mM PO4 pH 6,8 - 150 mM NaCl - 0,5M arginina
Millex GV 0,22 μm
Poziom czystości oceniony metodą SDS-PAGE przedstawiono na fig. 7 (barwienie srebrem Daiichi, błękit Coomassie G250, technika Western)
Po etapach dializy i sterylnego sączenia: > 95%
Odzysk (oceniony przez oznaczenie białka kolorymetrycznie; DOC TCA BCA)
Oczyszczono 48 mg zredukowanego białka Tat-his ze 160 g zrekombinowanych komórek
Pichia pastoris (masa mokra) lub 2 litry homogenatu z Dyno-mill o OD 66.
P r z y k ł a d 7. Oczyszczanie utlenionego białka Tat-His (Pichia pastoris)
Schemat oczyszczania opracowano dla 74 g zrekombinowanych komórek Pichia pastoris (mokra masa) lub 1 litr homogenatu z Dyno-mill OD60. Etapy chromatograficzne przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Między etapami frakcje Tat-dodatnie trzymano przez noc w chłodni (+4°C); na dłuższe okresy próbki zamrażano w -20°C.
g komórek Pichia pastoris i
Homogenizacja Bufor: 1 litr 50 mM PO4 pH 7,0-5 mM pefabloc końcowa OD:60 i
Rozbijanie w Dyno-mill (4 przejścia) i
PL 211 762 B1
Wirowanie
Rotor JA10/9500 obr/min/30 min/temperatura pokojowa i
Osad z Dyno-mill i
Płukanie (1 h - 4°C) i
Wirowanie i
Osad i
Solubilizacja (przez noc - 4°C) i
Bufor: + 1 litr 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM-NaCl 1% Empigen
Rotor JA10/9500 obr/min/30 min/temperatura pokojowa
Bufor: + 330 ml 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 4,0M GuHCl
Wirowanie
Rotor JA10/9500 obr/min/30 min/temperatura pokojowa i
Chromatografia powinowactwa z immobilizowanymi jonami metali na agarozie Ni++-NTA (Qiagen - 30 ml żywicy)
Bufor do równoważenia: 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 4,0 M GuHCl
Bufor do płukania: 1) bufor do równoważenia
2) 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 6M mocznik
3) 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 6M mocznik - 35 mM imidazol
Bufor do elucji: 10 mM PO4 pH 7,5 - 150 mM NaCl - 6M mocznik - 0,5M imidazol i
Rozcieńczanie i
Chromatografia kationowymienna na SP Sepharose FF (Pharmacia - 15 ml żywicy)
Do mocy jonowej 12 mS/cm bufor do rozcieńczenia: 20 mM boran pH 8,5-6M mocznik
Bufor do równoważenia: 20 mM boran pH 8,5150 mM NaCl - 6,0M mocznik Bufor do płukania: 1) bufor do równoważenia 2) 20 mM boran pH 8,5 - 400 mM NaCl - 6M mocznik
Bufor do elucji: 20 mM piperazyna pH 11,0-2M NaCl - 6M mocznik i
Zatężanie i
Dializa (przez noc - 4°C)
Sterylne sączenie do 1,5 mg/ml membrana Omega 10 kDa (Filtron)
Bufor: 10 mM PO4 pH 6-8 - 150 mM NaCl-0,5M arginina
Millex GV 0,22 μm
PL 211 762 B1
Poziom czystości oceniony metodą SDS-PAGE przedstawiono na fig. 8 (barwienie srebrem Daiichi, błękit Coomassie G250, technika Western)
Po etapach dializy i sterylnego sączenia: > 95%
Odzysk (oceniany na podstawie kolorymetrycznego oznaczenia białka: DOC TCA BCA) Oczyszczono 19 mg utlenionego białka Tat-his z 74 g zrekombinowanych komórek Pichia pastoris (masa mokra) lub 1 litra homogenatu z Dyno-mill o OD 60).
P r z y k ł a d 8. Oczyszczanie zredukowanego białka Nef-His SIV (Pichia pastoris)
Schemat oczyszczania opracowano dla 340 g zrekombinowanych komórek Pichia pastoris (mokra masa) lub 4 litrów homogenatu z Dyno-mill o OD 100. Etapy chromatograficzne przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Między etapami frakcje Tat-dodatnie trzymano przez noc w chłodni (+4°C); na dłuższe okresy próbki zamrażano w -20°C.
340 g komórek Pichia pastoris i
Homogenizacja i
Rozbijanie w Dyno-mill (4 przejścia) i
Wirowanie i
Osad z Dyno-mill i
Solubilizacja (przez noc -4°C) i
Wirowanie i
Redukcja (4 h - temperatura i karbamidometylowanie (1/2 h - temperatura pokojowa - w ciemnościach) i
Chromatografia powinowactwa z immobilizowanymi jonami metali na agarozie Ni++-NTA (Qiagen - 40 ml żywicy)
Bufor: 4 litry 50 mM PO4 pH 7,0-4 mM PMSF końcowa OD: 100
Rotor JA10/9500 obr/min/60 min/temperatura pokojowa
Bufor: + 2,6 litra 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 4,0 M GuHCl
Rotor JA10/9500 obr/min/30 min/temperatura pokojowa + 0,2 M sól sodowa kwasu
2-merkaptoetanosulfonowego, sodowa (dodanie proszku)/pH doprowadzone do 7,5 (roztworem 1 M NaOH) przed inkubacją + 0,25 M jodoacetamid (dodanie proszku)/pH doprowadzone do 7,5 (roztworem 1 M NaOH) przed inkubacją
Bufor do równoważenia: 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 4,0 M GuHCl
Bufor do płukania: 1) bufor do równoważenia 2) 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 6M mocznik - 25 mM imidazol
Bufor do elucji: 10 mM PO4 pH 7,5 - 150mM NaCl - 6M mocznik - 0,5 imidazol i
Zatężanie do 3 mg/ml membrana Omega 10 kDa (Filtron) i
PL 211 762 B1
Chromatografia żelowa na Superdex200 (Pharmacia - 120 ml żywicy) i
Zatężanie i
Dializa (przez noc - 4°C) i
Sterylne sączenie
Bufor do elucji: 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl - 6M mocznik do 1,5 mg/ml membrana Omega 10 kDa (Filtron)
Bufor: 10 mM PO4 pH 6,8 - 150 mM NaCl - 0,3% Empigen
Millex GV 0,22 μm
Poziom czystości oceniony metodą SDS-PAGE przedstawiono na fig. 9 (barwienie srebrem Daiichi, błękit Coomassie G250, technika Western)
Po etapach dializy i sterylnego sączenia: > 95%
Odzysk (oceniany na podstawie kolorymetrycznego oznaczenia białka: DOC TCA BCA) Oczyszczono 20 mg zredukowanego białka Nef-his z 340 g zrekombinowanych komórek Pichia pastoris (masa mokra) lub 4 litry homogenatu z Dyno-mill o OD 100.
P r z y k ł a d 9. Oczyszczanie zredukowanego białka HIV Nef-His (Pichia pastoris)
Schemat oczyszczania opracowano dla 160 g zrekombinowanych komórek Pichia pastoris (mokra masa) lub 3 litrów homogenatu z Dyno-mill o OD 50. Etapy chromatograficzne przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Między etapami frakcje Tat-dodatnie trzymano przez noc w chłodni (+4°C); na dłuższe okresy próbki zamrażano w -20°C.
160 g komórek Pichia pastoris
Homogenizacja i
Rozbijanie w Dyno-mill (4 przejścia) i
Zamrażanie/Rozmrażanie i
Wirowanie i
Osad z Dyno-mill i
Solubilizacja (przez noc - 4°C) i
Wirowanie i
Redukcja (3 h - temperatura pokojowa w ciemnościach)
Bufor: 3 litry 50 mM PO4 pH 7,0 - Pefabloc 5 mM; końcowa OD: 50
Rotor JA10/9500 obr/min/60 min/temperatura pokojowa
Bufor: + 1 litr 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl 4,0 M GuHCl
Rotor JA10/9500 obr/min/60 min/temperatura pokojowa + 0,1 M sól sodowa kwasu
2-merkaptoetanosulfonowego, sodowa (dodanie proszku)/pH doprowadzone do 7,5 (roztworem 1 M NaOH) przed inkubacją i karbamidometylowanie (1/2 h - temperatura pokojowa - w ciemnościach) + 0,15 M jodoacetamid (dodanie proszku)/pH doprowadzone do 7,5 (roztworem 1 M NaOH) przed inkubacją
PL 211 762 B1 i
Chromatografia powinowactwa z immobilizowanymi jonami metali na agarozie Ni++-NTA (Qiagen - 10 ml zywicy)
Bufor do równoważenia: 10 mM PO4 pH 7,5- 50 mM NaCl - 4,0 M GuHCl
Bufor do płukania: 1) bufor do równoważnia
2) 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl-6M mocznik
3) 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl-6M mocznik - 25 mM imidazol
Bufor do elucji: 10 mM cytrynian pH 6,0-150 mM NaCl-6M mocznik - 0,5M imidazol i
Zatężanie i
Chromatografia żelowa na Superdex200 (Pharmacia-120 ml zywicy) i
Dializa (przez noc - 4°C) i
Sterylne sączenie do 3 mg/ml membrana Omega 10 kDa (Filtron)
Bufor do elucji: 10 mM PO4 pH 7,5-150 mM NaCl-6M mocznik
Bufor: 10 mM PO4 pH 6,8-150 mM NaCl -0,5M arginina
Millex GV 0,22 L m
Poziom czystości oceniony metodą SDS-PAGE przedstawiono na fig. 10 (barwienie srebrem Daiichi, błękit Coomassie G250, technika Western):
Po etapach dializy i sterylnego sączenia: > 95%
Odzysk (oceniany na podstawie kolorymetrycznego oznaczenia białka: DOC TCA BCA)
Oczyszczono 20 mg zredukowanego białka HIV Nef-his z 160 g zrekombinowanych komórek Pichia pastoris (masa mokra) lub 3 litrów homogenatu z Dyno-mill o OD 50.
P r z y k ł a d 10. Ekspresja sekwencji nef SIV w Pichia pastoris
Aby ocenić antygeny Nef i Tat w modelu prowokacji patogennym SHIV, eksprymowane białko Nef wirusa niedoboru odporności (SIV) makaków, SIVmac239 (Aids Research and Human Retroviruses, 6:1221-1231, 1990). W regionie kodującym Nef, SIV mac 239 ma kodon stop w ramce odczytu po 92 aminokwasach co przewiduje skrócony produkt z tylko 10 kD. Reszta ramki odczytu Nef jest otwarta i prawdopodobnie koduje białko z 263 aminokwasów (30 kD) w swojej w pełni otwartej postaci.
Materiałem wyjściowym dla genu nef SIVmac239 był fragment DNA odpowiadający kompletnej sekwencji kodującej, sklonowany na plazmidzie LX5N (otrzymany od dr R.C. Desrosiers, Southborough, MA, USA).
Ten gen nef SIV jest zmutowany w przedwczesnym kodonie stop (nukleotyd G w pozycji 9353 zastępuje oryginalny nukleotyd T) aby eksprymować białko SIVmac239 Nef pełnej długości.
Aby eksprymować gen nef SIV w Pichia pastoris zastosowano wektor PHIL-D2-MOD (uprzednio stosowany do ekspresji sekwencji nef i tat HIV-1). Białko zrekombinowane jest eksprymowane pod kontrolą indukowalnego promotora oksydazy alkoholowej (AOX1), a C-koniec białka jest wydłużony o histydynowy ogon powinowactwa, co ułatwi oczyszczanie.
10.1 Konstrukcja wektora integracyjnego pRIT 14908
Aby skonstruować pRIT 14908, gen nef SIV zamplifikowano metodą PCR z plazmidu pLX5N/SIV-NEF ze starterami SNEFl i SNEF2.
STARTER SNEFl: 5'ATCGTCCATG.GGTGGAGCTATTTT 3'
Ncol
STARTER SNEF2: 5'CGGCTACTAGTGCGAGTTTCCTT 3'
Spel
PL 211 762 B1
Zamplifikowany region DNA nef SIV rozpoczyna się od nukleotydu 9077 i kończy się na nukleotydzie 9865 (Aids Research and Human Retroviruses, 6:1221-1231, 1990).
Wprowadzono miejsce restrykcyjne Ncol (które niesie kodon ATG genu nef) na końcu 5' fragmentu PCR oraz miejsce Spel na końcu 3'. Otrzymany fragment PCR i wektor PHIL-D2-MOD strawiono Ncol i Spel. Z uwagi na to, że jedno miejsce Ncol jest obecne na powielonej sekwencji nef SIV (pozycja 9286) dwa odpowiednie fragmenty ± 200 bp i ± 600 bp, oczyszczono w żelu agarozowym i zligowano z wektorem PHIL-D2-MOD. Powstały zrekombinowany wektor został nazwany pRIT 14908 po sprawdzeniu zamplifikowanego regionu nef na podstawie automatycznego sekwencjonowania.
10.2 Transformacja szczepu GS115(his4) Pichia pastoris
Aby otrzymać szczep Pichia pastoris eksprymujacy SIV nef-His, transformowano szczep GS115 liniowym fragmentem Notl niosącym tylko kasetę ekspresyjną i gen HIS4 (fig. 11).
Ten liniowy fragment DNA Notl z homologiami na obu końcach do genu AOX1 P. pastoris faworyzuje rekombinację w locus AOX1.
Wybrano wielokopiowe klony integracyjne na podstawie ilościowej analizy dot blot.
Wybrano jednego transformanta wykazującego najlepszy poziom wytwarzania zrekombinowanego białka i oznaczono jako Y1772.
Szczep 1772 wytwarza zrekombinowane białko SIV Nef-His, białko z 272 aminokwasów, które powinno składać się z:
kwasu mirystynowego;
metioniny, wprowadzonej przez zastosowanie miejsca klonowania Ncol wektora PHIL-D2-MOD;
262 aminokwasów (aa) białka Nef (począwszy od aa 2 aż do aa 263, patrz fig. 12);
treoniny i seryny, wprowadzonych z zastosowaniem procedury klonowania (klonowanie w miejscu Spel wektora PHIL-D2-MOD (fig. 11);
jednej glicyny i sześciu histydyn.
Sekwencje nukleinowe i białkowe są przedstawione na fig. 12.
10.3 Charakterystyka eksprymowanego produktu szczepu Y1772
Poziom ekspresji
Po 16 godzinach indukcji w pożywce zawierającej 1% metanol jako źródło węgla, ilość zrekombinowanego białka Nef-His oszacowano jako 10% całkowitego białka (fig. 13, ścieżki 3-4).
Rozpuszczalność
Wirowano zaindukowane hodowle zrekombinowanego szczepu Y1772 wytwarzającego białko Nef-His. Osady komórek ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze do rozbijania, rozbito 0,5 mm perełkami szklanymi i odwirowano ekstrakty komórkowe. Białka zawarte w nierozpuszczalnym osadzie (P) rozpuszczalnym supernatancie (S) porównywano na zabarwionym błękitem Coomassie 10% SDS-PAGE.
Jak przedstawiono na fig. 13, większość zrekombinowanych białek ze szczepu Y1772 (ścieżki 3-4) jest związana z nierozpuszczalną frakcją.
Szczep Y1772, który przedstawia zadawalający poziom ekspresji białek, zastosowano do wytwarzania białka SIV Nef-His.
P r z y k ł a d 11. Ekspresja gp120 w CHO
Ustalono trwałą linię komórkową CHO-K1, która wytwarza zrekombinowaną glikoproteinę gP120. Zrekombinowana glikoproteina gP120 jest zrekombinowaną skróconą postacią białka otoczki gP120 izolatu HIV-1 W61D. Białko jest wydzielane do pożywki hodowlanej, z której następnie jest oczyszczane.
Konstrukcja plazmidu do transfekcji gp120 pRIT13968
Sekwencję DNA kodującą otoczkę (obejmująca ekson 5' tat i rev) izolatu HIV-1 W61D otrzymano (Dr Tersmette, CCB, Amsterdam) jako plazmid zawierający genomową otoczkę gp160 W61D (NcoI-XhoI). Plazmid nazwano pRIT13965.
Aby skonstruować kasetę ekspresyjną gp120, kodon stop musiał być wstawiony na kodonie aminokwasu glu 515 sekwencji kodującej gp160 w pRIT13965, z użyciem oligonukleotydowej sekwencji startera (DIR 131) i techniki PCR. Starter DIR131 zawiera trzy kodony stop (we wszystkich otwartych ramkach) i miejsce restrykcyjne SalI.
Następnie odtworzono całą sekwencję otoczki gp120 z N-końcowego fragmentu BamH1-Dral (170 bp) z subklonu pW61d env plazmidu gp160 (pRIT13966) otrzymanego z pRIT13965 i fragmentu Dral-Sall (510 bp) wytworzonego metodą PCR z pRIT13965. Oba fragmenty oczyszczono w żelu i zligowano razem z plazmidem E. coli pUC18 najpierw rozciętym SalI (obróbka Klenowa), a następnie BamH1. Otrzymano w ten sposób plazmid pRIT13967. W wyniku zsekwencjowania sekwencji genu fragmentu Xmal-Sall (1580 bp) zawierającej kasetę kodującą gp120 okazało się, że była ona iden22
PL 211 762 B1 tyczna z sekwencją przewidywaną. Plazmid pRIT13967 zligowano z wektorem ekspresyjnym CHO GS pEE14 (Celltech Ltd., Wielka Brytania) przez pocięcie najpierw BclI (obróbka Klenowa), a następnie Xmal. Powstały plazmid nazwano PRIT13968.
Przygotowanie wzorcowego banku komórek (MCB)
Konstrukt gp120 (pRIT13968) transfekowano do komórek CHO za pomocą klasycznej procedury wytrącania CaPO4/szoku glicerynowego. Po dwóch dniach komórki CHOK1 poddano działaniu selekcyjnej pożywki wzrostowej (GMEM + 25 μΜ sulfoksyimina metioniny (MSX) + glutaminian + asparagina + 10% płodowa surowica cielęca). Trzy wybrane klony transfektantów dalej zamplifikowano w kolbach 175 m2 i kilka fiolek z komórkami przechowywano w -80°C. C-env 23,9 wybrano do dalszego namnażania.
Przygotowano mały wstępny bank komórek i zamrożono 20 ampułek. W celu przygotowania wstępnego banku i MCB komórki hodowano w pożywce hodowlanej GMEM, uzupełnionej 7,5% płodową surowicą cielęcą i zawierającej 50 μM MSX. Te hodowle komórek badano pod kątem sterylności i mikoplazmy i okazały się negatywne.
Wzorcowy bank komórek CHOK1 env. 23.9 (przy pasażu 12) przygotowano stosując komórki pochodzące z wstępnego banku komórek. W skrócie, dwie ampułki inokulum przedwzorcowego zaszczepiono w pożywce uzupełnionej 7,5% dializowanej płodowej surowicy bydlęcej. Komórki rozmieszczono w czterech kolbach hodowlanych i hodowano w 37°C. Po przyczepieniu się komórek pożywkę zmieniono na świeżą pożywkę uzupełnioną 50 μM MSX. Po osiągnięciu konfluencji komórki zebrano z zastosowaniem trypsynizacji i przygotowano podhodowle z podziałem 1/8 w kolbach T butelkach obrotowych - jednostkach typu fabryki komórek. Komórki zbierano z jednostek typu fabryki komórek przez trypsynizację i wirowanie. Osad komórek ponownie przeprowadzano w stan zawiesiny w pożywce hodowlanej uzupełnionej DMSO jako konserwantem kriogenicznym. Ampułki oznakowano, autoklawowano i zatopiono (250 fiolek). Sprawdzono ich szczelność i przechowywano przez noc w -70°C przed przechowywaniem w ciekłym azocie.
Hodowla komórek i wytwarzanie nieoczyszczonego zbioru
Szybko rozmrożono dwie fiolki z banku wzorcowego. Komórki połączono i zaszczepiono w dwóch kolbach T w 37°C ± 1°C z odpowiednią pożywką hodowlaną uzupełnioną 7,5% dializowaną płodową surowicą bydlęcą (FBS). Po osiągnięciu konfluencji (pasaż 13) komórki zbierano z zastosowaniem trypsynizacji, łączono i namnażano w 10 kolbach T jak powyżej. Komórki konfluentne (pasaż 14) trypsynizowano i namnażano seryjnie w dwóch jednostkach typu fabryki komórek (każda 6000 cm2; pasaż 15), następnie w 10 fabrykach komórek (pasaż 16). Pożywkę hodowlaną uzupełniono 7,5% dializowaną płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% MSX. Gdy komórki osiągają stan konfluencji, usuwa się pożywkę hodowlaną i zastępuje „pożywką produkcyjną zawierającą tylko 1% dializowaną płodową surowicę bydlęcą i bez MSX. Supernatant zbiera się co dwa dni (odstępy 48 godzinne) aż do 32 dnia. Zebrane płyny hodowlane klaruje się natychmiast przez jednostkę filtracyjną 1,2-0,22 μm i trzyma w -20°C przed oczyszczaniem.
P r z y k ł a d 12. Oczyszczanie HIV gp120 (W61D CHO) z płynu z hodowli komórek
Wszystkie etapy oczyszczania przeprowadza się w chłodni w 2-8°C. Wartości pH buforów nastawia się w tej temperaturze i bufory sączy się przez filtr 0,2 μM. Bada się je pod kątem zawartości pirogenów (oznaczenie LAL). Stale bada się gęstość optyczną przy 280 nm, pH i przewodnictwo eluatów z kolumny.
(i) Klarowany płyn z hodowli
Zebrany klarowany płyn z hodowli (CCF) sterylizuje się przez sączenie przez filtr i dodanie buforu Tris, pH 8,0 do końcowego stężenia 30 mM. CCF przechowuje się zamrożony w -20°C do oczyszczania.
(ii) Chromatografia oddziaływań hydrofobowych
Po rozmrożeniu dodaje się siarczan amonu do klarownego płynu hodowlanego, do stężenia 1M. Roztwór przepuszcza się przez noc przez kolumnę TSK/TOYOPEARL-BUTYL 650 M (TOSOHAAS) zrównoważoną buforem 30 mM Tris, pH 8,0 - 1M siarczan amonu. W tych warunkach antygen wiąże się z matrycą żelu. Kolumnę płucze się zmniejszającym się skokowo gradientem siarczanu amonu. Antygen jest eluowany w 30 mM buforze Tris pH 8,0 - 0,25 M siarczan amonu.
(iii) Chromatografia anionowymienna
Po zmniejszeniu przewodnictwa roztworu do wartości 5-6 mS/cm, połączone frakcje gp120 wprowadza się do kolumny Q-sepharose Fast Flow (Pharmacia), zrównoważonej buforem Tris - roztwór soli - pH 8,0. Kolumna działa w trybie negatywnym, tzn. gp120 nie wiąże się z żelem, podczas gdy większość zanieczyszczeń jest zatrzymywanych.
(iv) Zatężanie i diafiltracja metodą ultrafiltracji
PL 211 762 B1
Aby zwiększyć stężenie białka pulę gp120 wprowadza się na membranę FILTRON „Omega Screen Channel z odcięciem 50 kDa. Pod koniec zatężania bufor wymienia się przez diafiltrację z 5 mM buforem fosforanowym zawierającym 0,3 mM CaCl2, pH 7,0. Jeśli nie przeprowadza się natychmiast dalszej obróbki, pulę gP120 przechowuje się w stanie zamrożonym w -20°C. Po rozmrożeniu roztwór jest sączony na membranę 0,2 μΜ, aby usunąć nierozpuszczalny materiał.
(v) Chromatografia na hydroksyapatycie
Pulę gP120 UF wprowadza się do kolumny macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite typ II (Biorad) , zrównoważonej 5 mM buforem fosforanowym + 0,3 mM CaCl2, pH 7,0. Kolumnę przemywa się tym samym buforem. Antygen przechodzi przez kolumnę, a zanieczyszczenia wiążą się z kolumną.
(vi) Chromatografia kationowymienna
Pulę gP120 wprowadza się do kolumny CM/TOYOPEARL-650 S (TOSOHAAS) zrównoważonej buforem octanowym 20 mM, pH 5,0. Kolumnę przemywa się tym samym buforem, a następnie octanem 20 mM, pH 5,0 i NaCl 10 mM. Antygen następnie eluuje się tym samym buforem zawierającym 80 mM NaCl.
(vii) Ultrafiltracja
Aby zwiększyć zdolność do klarowania wirusa w procesie oczyszczania, przeprowadza się dodatkowy etap ultrafiltracji. Pulę gP120 poddaje się ultrafiltracji na membranie FILTRON „Omega Screen Channel” z odcięciem 150 kDa. Membrana o tej wielkości porów nie zatrzymuje antygenu. Po tej obróbce rozcieńczony antygen zatęża się na membranie tego samego typu (Filtron), ale z odcięciem 50 kD.
(viii) Chromatografia w żelu z wykluczaniem wielkości
Pulę gP120 wprowadza się do kolumny SUPERDEX 200 (PHARMACIA) aby zmienić bufor i usunąć resztkowe zanieczyszczenia. Kolumnę eluuje się solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
(ix) Sterylne sączenie i przechowywanie
Frakcje sterylizuje się przez sączenie przez membranę 0,2 μM PVDF (Millipore). Po sterylnym sączeniu oczyszczony surowy preparat przechowuje się zamrożony w -20°C do czasu formułowania. Schemat oczyszczania przedstawiono poniżej na schemacie blokowym.
Poziom czystości oceniano na podstawie analizy SDS-PAGE (barwienie srebrem/błękit Coomassie/Western blot (wynosi > 95%).
Wydajność wytwarzania wynosi około 2,5 mg/litr CCF (według oznaczenia Lowry'ego). Całkowita wydajność oczyszczania wynosi około 25% (według oznaczenia Elisa).
Oczyszczony materiał jest trwały przez 1 tydzień w 37°C (według analizy WB)
Oczyszczanie gp120 z płynu hodowlanego
Oznaczenie oznacza etapy krytyczne dla usunięcia wirusa
Klarowany supernatant hodowlany i
Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (Butyl-toyopearl 650 M) i
Chromatografia anionowymienna (sposób negatywny) (Q-Sepharose) i
Ultrafiltracja 50 kD (Zatężanie i wymiana buforu) i (Przechowywanie w -20°C) i
Chromatografia na hydroksyapatycie (tryb negatywny) (Macroprep Ceramic Hydroxyapatite II) i
Chromatografia kationowymienna (CM-Toyopearl 650 S) i
Ultrafiltracja 150 kD (membrany omega/Filtron)
PL 211 762 B1 i
Ultrafiltracja 50 kD (zatężenie) i
Chromatografia wykluczania wielkości Ultrafiltracja (Superdex 200)
Sterylne sączenie i
Oczyszczony preparat surowy Przechowywanie w -20°C
P r z y k ł a d 13. Wytwarzanie szczepionki
Szczepionka wytworzona zgodnie z wynalazkiem zawiera produkty ekspresji jednego lub większej liczby rekombinantów DNA kodujących antygen. Ponadto preparaty zawierają mieszaninę 3 de-O-acylowanego monofosforylolipidu A 3D-MPL i QS21 w emulsji oleju w wodzie lub oligonukleotyd zawierający motywy niemetylowanego dinukleotydu CpG i wodorotlenek glinu jako nośnik.
3D-MPL jest chemicznie detoksykowaną postacią lipopolisacharydu (LPS) Gram-ujemnej bakterii Salmonella minnesota
Eksperymenty przeprowadzone w Smith Kline Beecham Biologicals wykazały, że 3D-MPL połączony z różnymi nośnikami silnie wzmacnia zarówno odporność humoralną i typ odporności komórkowej TH1.
QS21: jest saponiną oczyszczoną z surowego ekstraktu kory drzewa Quillaja Saponaria Molina, która ma silną aktywność adiuwantową: indukuje zarówno specyficzną w stosunku do antygenu limfoproliferację jak i CTL względem kilku antygenów.
Eksperymenty przeprowadzone w Smith Kline Beecham Biologicals wykazały wyraźne działanie synergiczne połączenia 3D-MPL i QS21 w indukcji zarówno odporności humoralnej jak i typu odporno ś ci komórkowej TH1.
Emulsja olej/woda składa się z dwóch olejów (tokoferolu i skwalenu) oraz PBS zawierającego Tween 80 jako emulgator. Emulsja zawiera 5% skwalenu, 5% tokoferolu, 2% Tween 80 i ma średnią wielkość cząstek 180 nm (patrz WO 95/17210).
Eksperymenty przeprowadzone w Smith Kline Beecham Biologicals wykazały, że dodatek tej emulsji O/W do 3D-MPL/QS21 jeszcze bardziej zwiększa ich właściwości immunostymulujące.
Wytwarzanie emulsji olej/woda (2-krotny koncentrat)
Tween 80 rozpuszcza się w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) aby uzyskać 2% roztwór w PBS. W celu otrzymania 100 ml dwukrotnie stężonej emulsji worteksuje się 5 g DL α-tokoferolu i 5 ml skwalenu w celu dokładnego wymieszania. Dodaje się 90 ml roztworu PBS/Tween i miesza starannie. Powstałą emulsję przepuszcza się przez strzykawkę i w końcu mikroupłynnia przez stosowanie urządzenia M110S Microfluidics. Powstałe kropelki oleju mają wielkość około 180 nm.
Wytwarzanie preparatu olej w wodzie
Antygeny (100 μg gp120, 20 μg NefTat i 20 μg SIV Nef, same lub w połączeniu) rozcieńczono w 10-krotnie stężonym PBS o pH 6,8 i H2O przed dodaniem następnie emulsji olej w wodzie, 3D-MPL (50 μg), QS21 (50 μg) i 1 μg/ml tiomersalu jako środka konserwującego, w odstępach 5 minutowych. Objętość emulsji jest równa 50% całkowitej objętości (250 μl dla dawki 500 μ^.
Wszystkie inkubacje przeprowadzono w temperaturze pokojowej w trakcie mieszania.
Oligonukleotyd CpG (CpG) jest syntetycznym niemetylowanym oligonukleotydem zawierającym jeden lub większą liczbę motywów sekwencji CpG. CpG jest bardzo silnym induktorem odporności typu TH1 w porównaniu z emulsją olej w wodzie, która indukuje głównie mieszaną odpowiedź TH1/TH2. CpG indukuje niższy poziom przeciwciał niż preparat olej w wodzie i dobrą komórkową odpowiedź immunologiczną. Oczekuje się, że CpG będzie indukować niższą lokalną reaktywność.
Wytwarzanie roztworu oligonukleotydów CpG: suchy proszek CpG rozpuszczono w H2O aby uzyskać roztwór 5 mg CpG/ml.
Wytwarzanie preparatu CpG antygeny dializowano wobec 150 mM NaCl, aby usunąć jony fosforanowe, które hamują adsorpcję gp120 na wodorotlenku glinu.
Antygeny (100 μg gp120, 20 μg NefTat i 20 μg SIV Nef) rozcieńczone w H2O inkubowano z roztworem CpG (500 μg CpG) przez 30 minut przed adsorpcją na Al(OH)3, aby sprzyjać potencjalnemu oddziaływaniu między ogonem His antygenów NefTat i Nef i oligonukleotydem (stwierdzono silniejszy
PL 211 762 B1 efekt immunostymulujący CpG postaci związanej z antygenem w porównaniu z wolnym Cpg). Kolejno dodano w odstępach 5 minutowych Al(OH)3 (500 L g), 10-krotnie stężony NaCl i 1 L g/ml tiomersal jako środek konserwujący.
Wszystkie inkubacje prowadzono w temperaturze pokojowej w trakcie mieszania.
P r z y k ł a d 14. Immunizacja i doświadczenie z prowokacją SHIV u małp rezus
Pierwsze badania
Grupy 4 małp rezus immunizowano domięśniowo w 0, 1 i 3 miesiącu następującymi kompozycjami szczepionek:
Grupa 1: Adiuwant 2 + gp 120
Grupa 2: Adiuwant 2 + gp 120 + NefTat + SIV Nef
Grupa 3: Adiuwant 2 + + NefTat* + SIV Nef
Grupa 4: Adiuwant 6 + gp 120 + NefTat + SIV Nef
Grupa 5: Adiuwant 2 + + NefTat + SIV Nef
Grupa 6: Adiuwant 2
Adiuwant 2 zawiera skwalen/tokoferol/Tween 80/3D-MPL/ QS21, a adiuwant 6 zawiera ałun i CpG.
Tat* oznacza zmutowany Tat, w którym (Lys41 >Ala) i w motywie RGD (Arg78 >Lys) i (Asp80 >Glu) (Virology 235: 48-64, 1997).
Jeden miesiąc po ostatniej immunizacji wszystkie zwierzęta prowokowano patogennym SHIV (szczep 89.6p). Od tygodnia prowokacji (tydzień 16) pobierano periodyczne próbki krwi we wskazanych punktach czasowych aby określić % komórek CD-4 dodatnich wśród jednojądrzastych komórek krwi obwodowej za pomocą analizy FACS (fig. 14) i stężenie genomów RNA wirusa w osoczu za pomocą oznaczenia bDNA (fig. 15).
Wyniki
Wszystkie zwierzęta zostały zakażone po prowokacji SHIV89.6p.
Liczba komórek CD4-dodatnich obniżyła się po prowokacji u wszystkich zwierząt grup 1, 3, 5 i 6 z wyjątkiem jednego zwierzęcia w każdej z grup 1 i 6 (grupa kontrolna). Wszystkie zwierzęta w grupie 2 wykazują nieznaczne obniżenie ilości komórek CD4 dodatnich i wracają z czasem do poziomu podstawowego. Podobną tendencję zaobserwowano w zwierzętach grupy 4 (fig. 14).
Dane dotyczące obciążenia wirusem są prawie odwrotnością danych dotyczących CD4. Obciążenie wirusem spada ponżej poziomu wykrywalności u 3/4 zwierząt w grupie 2 (i u jednego zwierzęcia kontrolnego, które utrzymuje swoje komórki CD4-dodatnie), a czwarte zwierzę wykazuje tylko nieznaczne obciążenie wirusem. Większość z pozostałych zwierząt utrzymuje wysokie lub pośrednie obciążenie wirusem (fig. 15).
Nieoczekiwanie miana przeciwciał anty-Tat i anty-Nef mierzone metodą ELISA były 2-3 razy wyższe w grupie 3 (ze zmutowanym Tat) niż w Grupie 5 (równoważna grupa z niezmutowanym Tat) w czasie tych badań.
W 68 tygodniu (56 tygodni po prowokacji) wszystkie zwierzęta z grup, które otrzymały pełne połączenia (grupy 2 i 4) były nadal żywe, podczas gdy większość zwierząt w pozostałych grupach musiała być poddana eutanazji ze względu na objawy podobne do AIDS. Liczba zwierząt, które przeżyły w grupach była następująca:
Grupa 1: 2/4
Grupa 2: 4/4
Grupa 3: 0/4
Grupa 4: 4/4
Grupa 5: 0/4
Grupa 6: 1/4
Wnioski
Połączenie gp120 i Nef-Tat (w obecności SIV Nef) zapobiega utracie komórek CD4 dodatnich, obniża obciążenie wirusem u zwierząt zakażonych patogennym SHIV89.6p opóźnia lub zapobiega rozwojowi objawów chorobowych podobnych do AIDS, podczas gdy same gp120 lub NefTat/SIV Nef nie chronią przed patologicznymi konsekwencjami prowokacji SHIV.
Adiuwant 2, będący emulsją olej w wodzie zawierającą skwalen, tokoferol i Tween 80 razem z 3D-MPL i QS21 wydaje się mieć silniejszy wpływ na wyniki końcowe badań niż adiuwant ałun/CpG.
PL 211 762 B1
Drugie badania
Przeprowadzono drugie badania prowokacji małp rezus SHIV aby potwierdzić skuteczność kandydata na szczepionkę gp120/NefTat + adiuwant i porównać różne antygeny oparte na Tat. Badania przeprowadzono w innym laboratorium.
Projekt badań był następujący.
Grupy sześciu małp rezus immunizowano w 0, 4 i 12 tygodniu zastrzykami domięśniowymi i prowokowano w 16 tygodniu standardową dawką patogennego SHIV89.6p.
Grupa 1 jest powtórzeniem grupy 2 w pierwszych badaniach.
Grupa 1: Adiuwant 2 + gp 120 + NefTat + SIV Nef
Grupa 2: Adiuwant 2 + gp 120 + Tat (utleniony)
Grupa 3: Adiuwant 2 + gp 120 + Tat (zredukowany)
Grupa 4: Adiuwant 2
Badano ponownie punkty końcowe % komórek CD4 dodatnich, obciążenie wirusem za pomocą RT-PCR, chorobowość i śmiertelność.
Wyniki
Wszystkie zwierzęta z wyjątkiem jednego w grupie 2 zostały zakażone po prowokacji SHIV89.6p.
Ilość komórek CD4-dodatnie obniżyła się znacząco po prowokacji u wszystkich zwierząt kontrolnej grupy 3 i 4 i u wszystkich zwierząt z wyjątkiem jednego z grupy 2. Tylko jedno zwierzę z grupy 1 wykazuje znaczne obniżenie ilości komórek CD4 dodatnich. W odróżnieniu od zwierząt z pierwszych badań, małpy z drugiego doświadczenia wykazują stabilizację CD4 dodatnich komórek na różnych poziomach jeden miesiąc po prowokacji wirusem (fig. 16). Stabilizacja jest ogólnie niższa niż wyjściowy % komórek CD4-dodatnich, ale nigdy nie prowadzi do całkowitej utraty komórek. To może wskazywać na niższą wrażliwość na indukowaną przez SHIV chorobę w populacji małp, która była stosowana do drugich badań. Tym niemniej korzystne działanie szczepionki gp120/NefTat/SIV Nef i dwóch szczepionek gp120/Tat jest widoczne. Liczba zwierząt z % komórek CD4 dodatnich powyżej 20 wynosi 5 dla zwierząt szczepionych, podczas gdy żadne ze zwierząt kontrolnych z grupy z adiuwantem nie wykazało przekroczenia tego poziomu.
Analiza obciążenia RNA wirusa w osoczu potwierdza względnie niską podatność badanych zwierząt (fig. 17). Tylko 2 z 6 kontrolnych zwierząt utrzymują wysokie obciążenie wirusem, podczas gdy wirus znika z osocza u innych zwierząt. Tak więc wpływ szczepionki jest trudny do wykazania w odniesieniu do parametru obciążenia wirusem.
Wnioski
Analiza komórek CD4-dodatnich wskazuje, że szczepionka gp120/NefTat + adiuwant (w obecności SIV Nef) zapobiega spadkowi ilości komórek CD4 dodatnich u większości szczepionych zwierząt. Stanowi to potwierdzenie wyniku uzyskanego w pierwszych badaniach SHIV. Ze względu na brak podatności u badanych zwierząt parametr obciążenia wirusem nie mógł być stosowany do wykazania działania szczepionki. Wzięte razem połączenie gp120 i antygenów Tat i Nef HIV zapewnia ochronę przed patologicznymi konsekwencjami zakażenia HIV, jak wykazano w modelu SHIV.
Same antygeny Tat w połączeniu z gp120 także zapewniają pewną ochronę przed spadkiem ilości komórek CD4 dodatnich. Efekt jest mniej wyraźny niż w przypadku połączenia antygenów gp120/NefTat/SIV Nef ale wykazuje, że gp120 i Tat są zdolne do nadawania pewnej skuteczności w ochronie przeciw objawom choroby indukowanej przez SHIV.
Drugie badania nad prowokacją SHIV przeprowadzono z małpami rezus ze źródła całkowicie niezwiązanego ze źródłem zwierząt z pierwszych badań. Oba parametry, % komórek CD4 dodatnich i obciążenie wirusem osocza sugerują, że zwierzęta z drugich badań są mniej wrażliwe na chorobę indukowaną przez SHIV i że znacznie większa była zmienność wśród zwierząt. Tym niemniej zaobserwowano korzystny wpływ na utrzymywanie komórek CD4 dodatnich szczepionki gp120/NefTat/SIV Nef ze szczepionką eksperymentalną zawierającą gp120/NefTat i SIV Nef. To wskazuje, że efekt szczepionki był nie tylko powtórzony w odrębnych badaniach ale dalej wykazany w niespokrewnionej populacji małp.
PL 211 762 B1
Wykaz sekwencji <110> SmithKline Beecham Biologicals S.A.
<120> Zastosowanie białka fuzyjnego zawierającego białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko, białka lub polinukleotydu HIV gpl20, białka lub polinukleotydu SIV Nef, adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego oraz kompozycja szczepionki <130» B45205 <180» 31 <170> FastSEO dla Windows Wersja 3,0 <210» 1 <211» 28 <212» DNA <213> Sekwencja sztuczna <220» <223> starter <400» 1 atcgtccatg nggtnggena agntggnt 2Θ <210» 2 <211» 23 <212» DNA <213> Sekwencja sztuczna <220» <223> starter <400» 2 cggctactag tgcagttctt gsa <210» 3 <211» 25 <212» DNA <213> Sekwencja sztuczna <220» <223> starter <400» 3 atcgtactag tngagnccan gtangatne <210» 4 <211» 24 <212» DNA <213> Sekwencja sztuczna <220» <223> starter <400» 4 cggctactag tttccttcgg gcct <210> 5 <211» 23 <212» DRA <213> Sekwencja sztuczna <220>
PL 211 762 B1 <223> starter <400? S atcgtccatg gagccagtag atc 23 <210? S <211? 24 <212? DNA <213> Sekwencja sztuczna <220?
<223> starter <400? 6 atcgtccatg ggtggageta tttt 24 <210? 7 <211? 23 <212? DNA <213> Sekwencja sztuczna <220?
<223> starter <400? 7 cggccactag tgcgagtttc ctt 23 <210? 8 <211? G48 <212? DNA <213> człowiek <400? 8 acgggtggca agtggtcaaa aagtagtgtg gttggatggc ctactgtaag ggaaagaatg 60 agacgagctg agccagcagc agatggggtg ggagcagcat ctcgagacct ggaaaaacat 120 ggagcaatca caagtagcaa tacagcagct accaatgctg cttgtgcctg gctagaagca 180 caagaggagg aggaggtggg ttttccagtc acacctcagg tacctttaag accaatgact 240 tacaaggcag ctgtagatct tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta 300 actcactccc aacgaagaca, agatatcctt gatctgtgga tctaccacac acaaggctac 3S0 ttccctgatt ggcagaacta cacaccaggg ccaggggtca gatatccact gacctttgga 420 tggtgctaca agctagtacc agttgagcca gataaggcag aagaggccaa taaaggagag 480 aacaccagct tgttacaccc tgtgagcctg catggaatgg atgaccctga gagagaagtg 540 ttagagtgga ggtttgacag ccgcctagca tttcatcacg tggcccgaga gctgcatccg 600 gagtacttca agaactgcac tagtggccac catcaccatc accattaa 648 <210? 9 <211? 215 <212? PRT <213> człowiek <400? 9
Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Val Gly Trp Pro Thr Val
1 5 10 15
Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala
20 25 30
Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr
35 40 45
Ala Ala Thr Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gin Glu Glu Glu
50 55 60
Glu Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gin Val Pro Leu Arg Pro Met Thr
63 70 75 80
Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly
as 90 95
Leu Glu Gly Leu Ile His Ser Gin Arg Arg Gin Asp Ile Leu Asp Leu
PL 211 762 B1
100 105 110
Trp Ile Tyr His Thr Gin Gl/ Tyr Phe Pro Asp Trp Gin Asn Tyr Thr
115 120 125
Pro Gly Pro Gly Val Arg Ty; Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys
130 133 140
Leu Val Pro Val Glu Pro Aso Lys Val Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu
14 5 150 155 160
Asn Thr Ser Leu Leu His Pro 7al Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro
165 170 17S
Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His
180 185 190
His Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys Thr Ser
195 200 205
Gly His His His His His His
210 215
<210» 10 <211» 288 <212» DNA <213> człowiek <400» 10 acggagccag cagaccccag actagagccc cggaagcacc caggaagtca gcctaaaacC gctcgtacca actgccaccg caaaaagcgc cgcccccacc gccaagtctg ctccacaaca aaagcctcag gcatctccca cggcaggaag aagcggagac agcgacgaag acccccccaa ggcagccaga cccaccaagt ctctctacca aagcaaccca cctcccaaCc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaaac tagtggccac caccaccacc accatcaa <210» 11 <211» 95 <212» PRT <213> człowiek <400» 11
120
180
240
288
Met 1 Glu Pro Val Asp 5 Pro Arg Leu Glu Pro 10 Trp Lys His Pro Gly 15 Ser
Gin Pro Lys Thr 20 Ala Cys Thr Asn Cys 25 Tyr Cys Lys Lys Cys 30 Cys Phe
His Cys Gin 35 Val Cys Phe Ile Thr 40 Lys Ala Leu Gly Ile 45 Ser Tyr Gly
Arg Lys 50 Lys Arg Arg Gin Arg 55 Arg Arg Pro Pro Gin 60 Gly Ser Gin Thr
His 65 Gin Val Ser Leu Ser 70 Lys Gin Pro Thr Ser 75 Gin Ser Arg Gly Asp 30
Pro Thr Gly Pro Lys 85 Glu Thr Ser Gly His 90 His His His His His 95
<210» 12 <211» 909 <212» DNA <213> człowiek <400» 12 atgggtggca agcggtcaaa agacgagctg agccagcagc ggagcaacca caagcagcaa caagaggagg aggaggcggg tacaaggcag ccgcagaccc acccaccccc aacgaagaca ccccccgact ggcagaacta cggtgctaca agccagtacc aacaccagcc cgccacaccc tcagagcgga ggtttgacag gagcactcca agaactgcac aagtagcgcg gccggacggc agatggggtg ggagcagcac Cacagcagct accaatgctg ttccccagtc acacctcagg cagccacccc Ctaaaagaaa agacatcctt gatccgcgga cacaccaggg ccaggggcca agccgagcca gataaggcag tgtgagcctg catggaacgg ccgcctagca tcccaccacg cagcgagcca gcagatccta ctaccgcaag ggaaagaacg ctcgagaccC ggaaaaacat cttgcgcccg gctagaagca caccctcaag accaacgact aggggggacc ggaagggcca tccaccacac acaaggctac gacatccact gacccctgga aagaggccaa caaaggagag acgaccctga gagagaagcg tggcccgaga gctgcatccg gaccagagcc ctggaagcaC
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
PL 211 762 B1 ccaggaagtc agcccaaaac tgcttgracc aattgctatt gtaaaaagcg ttgctttcat tgccaagctc gtttcataac aaaagcctta ggcatctcct acggcaggaa gaagcggaga cagcgacgaa gacctcctca aggcagtcag actcatcaag cctctctatc aaagcaaccc acctcccaat cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaaa ctagtggcca ccatcaccat caccattaa <210? 13 <211? 302 <212? PRT <213> człowiek
720
780
840
900
909
<400? 13
Met 1 Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser 5
Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu 20
Ala Ser Arg 35 Asp Leu Glu Lys His 40
Ala Ala Thr 50 Asn Ala Ala Cys Ala 55
Glu 65 Val Gly Phe Pro Val Thr Pro 70
Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser 85
Leu Glu Gly Leu Ile His Ser Gin 100
Trp Ile Tyr 115 His Thr Gin Gly Tyr 120
Pro Gly Pro 130 Gly Val Arg Tyr Pro 135
Leu 145 Val Pro Val Glu Pro Asp Lys 150
Asn Thr Ser Leu Leu His Pro Val 165
Glu Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg 130
His Val Ala 195 Arg Glu Leu His Pro 200
Glu Pro Val 210 Asp Pro Arg Leu Glu 215
Pro 225 Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys 230
Cys Gin Val Cys Phe Ile Thr Lys 245
Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg 260
Gin Val Ser 275 Leu Ser Lys Gin Pro 280
Thr Gly Pro Lys Glu Thr Ser Gly
290 295
Ser Val 10 Val Gly Trp Pro Thr 15 Val
Pro 25 Ala Ala Asp Gly Val 30 Gly Ala
Gly Ala Ile Thr Ser 45 Ser Asn Thr
Trp Leu Glu Ala 60 Gin Glu Glu Glu
Gin Val Pro 75 Leu Arg Pro Met Thr 80
His Phe 90 Leu Lys Glu Lys Gly 95 Gly
Arg 105 Arg Gin Asp Ile Leu 110 Asp Leu
Phe Pro Asp Trp Gin 125 Asn Tyr Thr
Leu Thr Phe Gly 140 Trp Cys Tyr Lys
Val Glu Glu 155 Ala Asn Lys Gly Glu 160
Ser Leu 170 His Gly Met Asp Asp 175 Pro
Phe 185 Asp Ser Arg Leu Ala 190 Phe His
Glu Tyr Phe Lys Asn 205 Cys Thr Ser
Pro Trp Lys His 220 Pro Gly Ser Gin
Tyr Cys Lys 235 Lys Cys Cys Phe His 240
Ala Leu 250 Gly Ile Ser Tyr Gly 255 Arg
Pro 265 Pro Gin Gly Ser Gin 270 Thr His
Thr His Ser His Gin His Ser His 300 Arg 285 His Gly His Asp Pro
<210? 14 <211? 1029 <212? DNA <213> człowiek <400? 14 atggatccaa aaactttagc cctttcttta tcagcagctg gcgtactagc aggctgtagc 60 agccattcat caaatatggc gaatacccaa atgaaaccag acaaaatcat tattgctcac 120 cgcggcgcta gcggctattt accagagcat acgttagaat ctaaagcact tgcttttgca 130 caacaggctg attacttaga gcaagattta gcaacgacta aggacggtcg tttagtggtt 240 attcacgatc actttttaga eggcttgact gatgtcgcga aaaaattccc acatcgtcat 300 cgcaaagatg gccgttacta tgtcatcgac tttaccttaa aagaaattca aagtttagaa 3S0 atgaeagaaa actccgaaac catgggtggc aagtggtcaa aaagcagtgt ggttggacgg 420
PL 211 762 B1 cctactgtaa gggaaagaat gagacgagcc gagccagcag cagatggggt gggagcagca 4 80 tctcgagacc tggaaaaaca tggagcaatc acaagcagca atacagcagc taccaatgct 540 gcttgtgcct ggctagaagc acaagaggag gaggaggtgg gtcttccagt cacacctcag 600 gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt tctaaaagaa 660 aaggggggac tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgacctgcgg 720 atctaccaca cacaaggcta cttccctgat tggcagaact acacaccagg gccaggggtc 780 agatatccac cgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta 840 gaagaggcca acaaaggaga gaacaccagc tcgttacacc ctgcgagcct gcacggaacg 900 gatgaccctg agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac 960 gtggcccgag agctgcaecc ggagtacttc aagaactgca ctagtggcca ccatcaccat 1020 caccactaa 1029 <210> 15 <211> 324 <212> PRT
<213> człowiek
Cys <400> Ser Ser 15 His Ser Ser
1 Lys Ile Ile 5 Ile Ala His
Thr Leu Glu 20 Ser Lys Ala
Glu 35 Gin Asp Leu Ala Met
Asp 50 His Phe Leu Asp Gly
65 Arg His Arg 70 Lys Asp Gly
Glu ile Gin 95 Ser Leu Glu
Lys Trp Ser 100 Lys Ser Ser
Met 115 Arg Arg Ala Glu Pro
Asp 130 Leu Glu Lys His Gly
145 Asn Ala Ala 150 Cys Ala Trp
Phe Pro Val 165 Thr Pro Gin
Ala Val Asp 180 Leu Ser His
Leu 195 Ile His Ser Gin Arg
His 210 Thr Gin Gly Tyr Phe
225 Gly Val Arg 230 Tyr Pro Leu
Val Glu Pro 245 Asp Lys Val
Leu Leu His 260 Pro Val Ser
Val 275 Leu Glu Trp Arg Phe
Arg 290 Glu Leu His Pro Glu
305 His His His 310 His
Asn Met Ala Asn 10 Thr Gin
Arg Gly Ala 25 Ser Gly Tyr
Leu Ala 40 Phe Ala Gin Gin
Thr 55 Lys Asp Gly Arg Leu 60
Leu Thr Asp Val Ala 75 Lys
Arg T/r Tyr Val 90 Ile Asp '
Met Thr Glu 105 Asn Phe Glu
Val Val 120 Gly Trp Pro Thr
Ala 135 Ala Asp Gly Val Gly 140
Ala Ile Thr Ser Ser 15S Asn
Leu Glu Ala Gin 170 Glu Glu
Val Pro Leu 135 Arg Pro Met
Phe Leu 200 Lys Glu Lys Gly
Arg 215 Gin Asp Ile Leu Asp 220
Pro Asp Trp Gin Asn 235 Tyr
Thr Phe Gly Trp 250 Cys Tyr
Glu Glu Ala 265 Asn Lys Gly
Leu His 280 Gly Met Asp Asp
Asp 295 Ser Arg Leu Ala Phe 300
Tyr Phe Lys Asn Cys Thr
31S
Met Lys Ser Asp
Leu Pro 15 Glu His
Ala 30 Asp Tyr Leu
45 Val Val Ile His
Lys Phe Pro His
Phe Thr Leu 80 Lys
Thr Met 95 Gly Gly
Val 110 Arg Glu Arg
125 Ala Ala Ser Arg
Thr Ala Ala Thr
Glu Glu Val 160 Gly
Thr Tyr 175 Lys Ala
Gly 190 Leu Glu Gly
205 Leu Trp Ile Tyr
Thr Pro Gly Pro
Lys Leu Val 240 Pro
Glu Asn 255 Thr Ser
Pro 270 Glu Arg Glu
285 His His Val Ala
Ser Gly His His
320 <210> 1S <2ll> 1290 <212 > DNA
PL 211 762 B1 <213> człowiek <400» 15 atggatccaa aaactttagc cctttcttta ttagcagctg gcgtactagc aggttgtagc 50 agccattcat caaacacggc gaatacccaa atgaaaccag acaaaatcat tatcgctcac 120 cgtggcgcta gcggttactt accagagcat acgctagaac ctaaagcact tgcgtttgca 180 caacaggctg attatttaga gcaagattta gcaatgacta aggatggtcg tctagtggtt 240 attcacgacc actttttaga tggcttgact gatgttgcga aaaaattccc acatcgtcat 300 cgcaaagatg gccgttacta tgtcatcgac tttaccccaa aagaaactca aagtttagaa 350 atgaeagaaa actttgaaac cacgggtggc aagtggtcaa aaagcagcgt ggccggatgg 420 cctactgtaa gggaaagaat gagacgagcc gagccagcag cagacggggt gggagcagca 480 tctcgagacc tggaaaaaca Cggagcaacc acaagtagca atacagcagc caccaatgct 540 gcttgtgcct ggccagaagc acaagaggag gaggaggcgg gttttccagt cacaccccag 500 gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca gccgtagacc ttagccactt tttaaaagaa 550 aa993’3H9rac tggaagggcc aattcactce caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg 720 atctaccaca cacaaggcta cttecctgat tggcagaact acacaccagg gccaggggcc 780 agatatccac tgacetttgg atggtgctac aagccagcac cagccgagcc agataaggta 840 gaagaggcca acaaaggaga gaacaccagc tcgttacacc ctgtgagcct gcacggaacg 300 gacgaccccg agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac 960 gcggcccgag agctgcatcc ggagtacttc aagaactgca ctagtgagcc agtagatcct 1020 agactagagc cctggaagca cccaggaagt cagcctaaaa ctgcttgtac caattgctat 1080 cgcaaaaagc gttgctttca ttgccaagtt tgtttcataa caaaagcctc aggcatcccc 1140 tatggcagga agaagcggag acagcgacga agacctcctc aaggcagcca gacccatcaa 1200 gtttctctat caaagcaacc cacctcccaa tcccgagggg acccgacagg cccgaaggaa 1250 actagtggce accaccacca tcaccattaa 1290
<210» 17
<211» 411
<212» PRT
<213> człowiek
<400» 17
Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys Ser Asp
1 5 10 15
Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro Glu His
20 25 30
Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp Tyr Leu
35 40 45
Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val Ile His
50 55 60
Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe Pro His
55 70 75 80
Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr Leu Lys
85 90 95
Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Mec Gly Gly
100 105 110
Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Val Gly Trp Pro Thr Val Arg Glu Arg
115 120 125
Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala Ser Arg
130 135 140
Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala Ala Thr
145 150 155 ISO
Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gin Glu Glu Glu Glu Val Gly
155 170 175
Phe Pro Val Thr Pro Gin Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr Lys Ala
180 185 190
Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu Glu Gly
195 200 205
Leu Ile His Ser Gin Arg Arg Gin Asp Ile Leu Asp Leu Trp Ile Tyr
210 215 220
His Thr Gin Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gin Asn Tyr Thr ?TO Gly Pro
225 230 23 5 240
Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu Val Pro
245 250 2S5
PL 211 762 B1
Val Glu Pro Asp 260 Lys Val Glu Glu Ala 265 Asn Lys
Leu Leu His 275 Pro Val Ser L:U His 280 Gly Mec Asp
Val Leu 290 Glu Trp Arg Phe A;p 295 Ser Arg Leu Ala
Arg 305 Glu Leu His Pro Glu 310 Τ·_τ: Phe Lys Asn Cys 315
Asp Pro Arg Leu Glu 325 Pro Trp Lys His Pro 330 Gly
Ala Cys Thr Asn 340 Cys Tyr Cys Lys Lys 345 Cys Cys
Cys Phe Ile 355 Thr Lys Ala Leu Gly 360 Ile Ser Tyr
Arg Gin 370 Arg Arg Arg Pro Pro 375 Gin Gly Ser Gin
Leu 385 Ser Lys Gin Pro Thr 390 Ser Gin Ser Arg Gly 395
Lys Glu Thr Ser Gly 405 His His His His His 410 His
Gly Glu Asn 270 Thr Ser
Asp Pro 235 Glu Arg Glu
Phe 300 His His Val Ala
Thr Ser Glu Pro Val 320
Ser Gin Pro Lys 335 Thr
Phe His Cys 350 Gin Val
Gly Arg 365 Lys Lys Arg
Thr 380 His Gin Val Ser
Asp Pro Thr Gly Pro 400
<2io> ia <211> 981 <212> DNA <213> człowiek <400> 18 atggatccaa gcagccactc atcaaatatg gcgaataccc attattgctc accgtggtgc tagcggttat ttaccagagc cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagcaagatt cgttcagtgg ttatccacga tcacttttta gatggcttga ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accatgggcg gtggttggat ggcctactgt aagggaaaga atgagacgag gtgggagcag catctcgaga cctggaaaaa catggagcaa gctaccaatg ctgcttgtgc ctggctagaa gcacaagagg gtcacacctc aggtaccttt aagaccaatg acttacaagg tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cttgatctgt ggatctacca cacacaaggc tacttccctg gggccagggg tcagatatcc actgaccttt ggatggtgct ccagataagg tagaagaggc caataaagga gagaacacca ctgcatggaa tggatgaccc tgagagagaa gtgttagagt 3catttcatc acgtggcccg agagctgcat ccggagtact caccatcacc atcaccatta a <210? 19 <211? 326 <212> PRT <213> człowiek <400? 19 aaatgaaatc atacgttaga tagcaatgac ctgatgttgc actttacctt gcaagtggtc ctgagccagc
Ccacaagtag aggaggaggt cagctgcaga cccaacgaag attggcagaa acaagctagt gcttgttaca ggaggtttga tcaagaactg agacaaaatc atctaaagca taaggatggt gaaaaaattc aaaagaaatt aaaaagtagt agcagatggg caatacagca gggttttcca tcttagccac acaagatatc ccacacacca accagttgag ccctgtgagc cagccgccta cactagtggc
120
180
240
300
3Ó0
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
981
Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala
1 5 10
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala
20 25
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe
35 40
Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp
50 55
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp
65 70 75
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr
85 90
Leu Lys Glu He Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu
Asn Thr Gin Met 15 Lys
Ser Gly Tyr 30 Leu Pro
Ala Gin 45 Gin Ala Asp
Gly 60 Arg Leu Val Val
Val Ala Lys Lys Phe 80
Val Ile Asp Phe 95 Thr
Asn Phe Glu Thr Met
PL 211 762 B1
100 105 110
Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Val Gly Trp Pro Thr Val Arg
115 120 12S
Glu Arg Het Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala
130 13S 140
Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala
145 150 155 ISO
Ala Thr Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gin Glu Glu Glu Glu
165 170 175
Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gin Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr
180 185 190
Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu
195 200 205
Glu Gly Leu Ile His Ser Gin Arg Arg Gin Asp Ile Leu Asp Leu Trp
210 215 220
Ile Tyr His Thr Gin Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gin Asn Tyr Thr Pro
225 230 235 240
Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu
245 250 255
Val Pro Val Glu Pro Asp Lys Val Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu Asn
260 265 270
Thr Ser Leu Leu His Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro Glu
275 280 285
Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His His
290 295 300
Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys Thr Ser Gly
305 310 315 320
Hi 3 His His His His His
325
<210> 20 «211» 1242 <212> DNA <213> człowiek <400» 20 atggaeccaa gcagccattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc SO attattgctc accgtggtgc tagcggttac ttaccagagc acacgttaga acctaaagca 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgactattta gagcaagatt tagcaatgac taaggatggt ISO cgtttagtgg ttattcacga tcactttcta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 coacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac tatgtcatcg aotttacctt aaaagaaatt 300 caaagcttag aaatgacaga aaactttgaa accatgggtg gcaaguggto aaaaagtagt 360
StHSttggat ggcctactgt aagggaaaga atgagacgag ctgagccagc agoagatggg 420 gtgggagcag catctcgaga cctggaaaaa catggagcaa toacaagtag caatacagca 4 30 gctaccaatg ctgcttgtgc ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggc gggtcttcoa 540 gtcacacctc aggtaccttt aagaccaatg acttacaagg cagctgtaga tcttagccao S00 tttttaaaag aaaagggggg actggaaggg ctaattcact cccaacgaag acaagatatc 650 cttgatctgt ggatetacca cacacaaggc tacttccctg attggcagaa ctacacacca 720 gggccagggg tcagatatco actgacctct ggacggtgct acaagctagt accagctgag 780 ccagataagg tagaagaggc caataaagga gagaacacca gcttgttaca ccctgtgagc 340 ctgcatggaa tggatgacco tgagagagaa gtgttagagt ggaggtttga cagccgccta 900 gcatcccatc acgtggcccg agagctgcat ccggagtact tcaagaactg cactagtgag 950 ccagtagatc ccagactaga gccctggaag catccaggaa gtcagcctaa aactgcttgt 1020 accaattgct attgtaaaaa gtgttgcctc cattgccaag tttgtttcat aacaaaagcc 1080 ttaggcatct cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagaccccc tcaaggcagt 114 0 eagactcatc aagtttctct atcaaagcaa cccacctccc aatcccgagg ggacccgaca 1200 ggcccgaagg aaactagtgg ccaccatcac caccaccatt aa 1242
<210> 21
<211> 413
<212> PRT
<213> człowiek
<400> 21
PL 211 762 B1
Met Asp Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
20 25 30
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gin Gin Ala Asp
35 40 45
Tyr Leu Glu Gin Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
50 55 60
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp val Ala Lys Lys Phe
65 70 75 80
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Gin Ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Met
100 105 110
Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Val Gly Trp Pro Thr Val Arg
115 120 125
Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala Ala
130 135 140
Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr Ala
145 150 155 160
Ala Thr Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gin Glu Glu Glu Glu
165 170 175
Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gin Val Pro Leu Arg Pro Met Thr Tyr
180 185 190
Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly Leu
195 200 205
Glu Gly Leu Ile His Ser Gin Arg Arg Gin Asp Ile Leu Asp Leu Trp
210 215 220
Ile Tyr His Thr Gin Gly Tyr Phe Pro Asp Trp Gin Asn Tyr Thr Pro
225 230 235 240
Gly Pro Gly Val Arg Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Trp Cys Tyr Lys Leu
245 250 255
Val Pro Val Glu Pro Asp Lys Val Glu Glu Ala Asn Lys Gly Glu Asn
260 265 270
Thr Ser Leu Leu His Pro Val Ser Leu His Gly Met Asp Asp Pro Glu
275 280 285
Arg Glu Val Leu Glu Trp Arg Phe Asp Ser Arg Leu Ala Phe His His
290 295 300
Val Ala Arg Glu Leu His Pro Glu Tyr Phe Lys Asn Cys Thr Ser Glu
305 310 315 320
Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser Gin Pro
325 330 335
Lys Thr Ala Cys Thr Asn cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe His Cys
340 345 350
Gin Val Cys Phe Ile Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly Arg Lys
355 360 365
Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser Gin Thr His Gin
370 37S 380
Val Ser Leu Ser Lys Gin Pro Thr Ser Gin Ser Arg Gly Asp Pro Thr
385 390 395 400
Gly Pro Lys Glu Thr Ser Gly 'His His His His His His
405 410 <210> 22 <211? 288 <212> DNA <213> człowiek <400? 22 atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact 60 gcttgtacca attgctattg taaaaagtgc tgctttcatt gccaagtttg tttcataaca 120 gctgccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag acctcctcaa 180 ggcagtcaga ctcatcaagt ccctctatca aagcaaccca ccccccaacc caaaggggag 240 ccgacaggcc cgaaggaaac tagtggccac catcaccatc accattaa 288
PL 211 762 B1 <210» 23 <211» 95 <212? PRT <213> człowiek <400? 23
Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser
1 5 10 15
Gin Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe
20 25 30
His Cys Gin Val Cys Phe Ile Thr Ala Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly
35 40 45
Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Pro Pro Gin Gly Ser Gin Thr
50 55 60
His Gin Val Ser Leu Ser Lys Gin Pro Thr Ser Gin Ser Lys Gly Glu
65 70 75 80
Pro Thr Gly Pro Lys Glu Thr Ser Gly His His His His His His
85 90 95
<210» 24 <211? 909 <212» DNA <213> człowiek <400» 24 atgggtggca agtggtcaaa aagtagtgtg gttggacggc ctactgtaag ggaaagaatg 50 agacgagctg agccagcagc agatggggcg ggagcagcac ctcgagacct ggaaaaacac 120 ggagcaatca caagtagcaa tacagcagct accaatgctg cttgtgcctg gccagaagca 180 caagaggagg aggaggtggg ctttccagtc acacctcagg tacctttaag accaacgact 24 0 tacaaggcag ctgtagatet tagccacttt ttaaaagaaa aggggggact ggaagggcta 3 00 attcactccc aacgaagaca agatatcctt gatctgtgga tccaccacac acaaggccac 350 ttccctgatt ggcagaacta eaeaccaggg ccaggggtca gatatccact gacctttgga 420 tggtgctaca agctagtacc agttgagcca gataaggtag aagaggccaa taaaggagag 4 80 aacaceagct tgttacaccc tgtgagcctg catggaatgg atgaccctga gagagaagtg 540 ttagagtgga ggtctgacag ccgcetagca ttteatcacg tggcccgaga gctgcatccg 600 gagtacttca agaactgcac tagtgagcca gtagatccta gactagagcc ctggaagcat 660 ccaggaagtc agcctaaaac tgcctgtace aattgetatt gtaaaaagtg ttgctttcat 720 tgccaagttt gtttcataac agetgeetta ggcatctcct acggcaggaa gaagcggaga 780 cagcgacgaa gacctcctca aggcagtcag actcatcaag cttctctatc aaagcaaccc 840 acctcccaat ccaaagggga gccgacaggc ccgaaggaaa ctagtggcca ccatcaccat 900 caccattaa 909 <210» 25 <211» 302 <212» PRT <213> człowiek <400> 25
Met Gly Gly Lys Trp Ser Lys Ser Ser Val Val Gly Trp Pro Thr Val
1 5 10 15
Arg Glu Arg Met Arg Arg Ala Glu Pro Ala Ala Asp Gly Val Gly Ala
20 25 30
Ala Ser Arg Asp Leu Glu Lys His Gly Ala Ile Thr Ser Ser Asn Thr
35 40 45
Ala Ala Thr Asn Ala Ala Cys Ala Trp Leu Glu Ala Gin Glu Glu Glu
50 55 5 0
Glu Val Gly Phe Pro Val Thr Pro Gin Val Pro Leu Arg Pro Met Thr
65 70 75 80
Tyr Lys Ala Ala Val Asp Leu Ser His Phe Leu Lys Glu Lys Gly Gly
85 90 95
Leu Glu Gly Leu Ile His Ser Gin Arg Arg Gin Asp Ile Leu Asp Leu
100 105 110
Trp Ile Tyr His Thr Gin Gly Tyr Phe Pro Asp Gin Asn Tyr Thr
PL 211 762 B1
Pro Gly 115 Pro Gly Val Arg T/r 120 Pro Leu Thr Phe Gly 12S Trp Cys Tyr Lys
Leu 130 Val Pro Val Glu Pro 135 Aip Lys Val Glu Glu 140 Ala Asn Lys Gly Glu
145 Asn Thr Ser Leu Leu 150 His Pro Val Ser Leu 155 His Gly Met Asp Asp 150 Pro
Glu Arg Glu Val 165 Leu Glu Trp Arg Phe 170 Asp Ser Arg Leu Ala 175 Phe His
His Val Ala 180 Arg Glu Leu His Pro 185 Glu Tyr Phe Lys Asn 190 Cys Thr Ser
Glu Pro 195 Val Asp Pro Arg Leu 200 Glu Pro Trp Lys His 205 Pro Gly Ser Gin
Pro 210 Lys Thr Ala Cys Thr 215 Asn Cys Tyr Cys Lys 220 Lys Cys Cys Phe His
225 Cys Gin Val Cys Phe 230 Ile Thr Ala Ala Leu 235 Gly Ile Ser Tyr Gly 240 Arg
Lys Lys Arg Arg 245 Gin Arg Arg Arg Pro 250 Pro Gin Gly Ser Gin 255 Thr His
Gin Val Ser 260 Leu Ser Lys Gin Pro 265 Thr Ser Gin Ser Lys 270 Gly Glu Pro
Thr Gly 275 Pro Lys Glu Thr Ser 280 Gly His His His His 285 His His
290 295 300 <210? 26 <211» 57 <212» DNA <213> człowiek <400» 26 ttcgaaacca tggccgcgga ctagtggcca ccatcaccat caccattaac ggaactc 57 <210» 27 <211» 9 <212» PRT <213> człowiek <400» 27
Thr Ser Gly His His His His His His 1 5 <210» 23 <211» 53 <212» DNA <213> człowiek <400» 28 ttcgaaacca tggccgcgga ctagtggcca ccatcaccat caccattaac gcgaattc 58 <210» 29 <211» 9 <212» PRT <213> człowiek <400» 29
Thr Ser Gly His His His His His His 1 5 <210» 30 <211» 819 <212» DNA <213> człowiek <400» 30
PL 211 762 B1 aegggtggag ctatttccat gaggcggtcc aggccgtctg gagatctgcg acagagactc SO ttgcgggcgc gtggggagac ttacgggaga etcttaggag aggtggaaga tggatactcg 120 caatccccag gaggactaga caagggctcg agctcactct cctgtgaggg acagaaatac 180 aatcagggac agtatatgaa taccccacgg agaaacccag ccgaagagag agaaaaacta 240 gcatacagaa aacaaaatat ggatgataca gacgaggaag acgacgaccc ggtaggggta 300 tcagtgaggc caaaagtccc cctaagaaca atgagtcaca aatcggcaat agacatgcct 360 catcttataa aagaaaaggg gggactggaa gggattcact acagtgcaag aagacataga 420 atcttagaca tatacttaga aaaggaagaa ggcatcatac cagattggca ggactacacc 480 tcaggaccag gaattagata cccaaagaca tctggctggc tatggaaatc agtccctgta 540 aatgtatcag atgaggcaca ggaggatgag gagcattatt taacgcaccc agctcaaact S00 tcccagtggg atgacccttg gggagaggtt ctagcatgga agcttgatcc aactctggcc SSO tacacttatg aggcatatgt tagataccca gaagagtttg gaagcaagtc aggcctgtca 720 gaggaagagg ttagaagaag gctaaccgca agaggccttc ttaacatggc tgacaagaag 780 gaaactcgca ctagtggcca ccatcaccac caccattaa 819
<210> 31 <211> 272 <212> PRT
<213> człowiek
<400> 31
Met 1 Gly Gly Ala Ile Ser Met Arg Arg Ser Arg Pro Ser Gly Asp Leu 5 10 15
Arg Gin Arg Leu Leu Arg Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Gly Arg Leu Leu 20 25 30
Gly Glu Val Glu Asp Gly Tyr Ser Gin Ser Pro Gly Gly Leu Asp Lys 35 40 45
Gly Leu Ser Ser Leu Ser Cys Glu Gly Gin Lys Tyr Asn Gin Gly Gin 50 55 SO
Tyr 65 Met Asn Thr Pro Trp Arg Asn Pro Ala Glu Glu Arg Glu Lys Leu 70 75 80
Ala Tyr Arg Lys Gin Asn Met Asp Asp Ile Asp Glu Glu Asp Asp Asp 35 90 95
Leu Val Gly Val Ser Val Arg Pro Lys Val Pro Leu Arg Thr Met Ser 100 105 110
Tyr Lys Leu Ala Ile Asp Met Ser His Phe Ile Lys Glu Lys Gly Gly 115 120 _ 125
Leu Glu Gly Ile Tyr Tyr Ser Ala Arg Arg His Arg Ile Leu Asp Ile 150 . 135 140
Tyr 145 Leu Glu Lys Glu Glu Gly Ile Ile Pro Asp Trp Gin Asp Tyr Thr 150 155 160
Ser Gly Pro Gly Ile Arg Tyr Pro Lys Thr Phe Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175
Leu Val Pro Val Asn Val Ser Asp Glu Ala Gin Glu Asp Glu Glu His 180 13S 190
Tyr Leu Met His Pro Ala Gin Thr Ser Gin Trp Asp Asp Pro Trp Gly 155 2CG 205
Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Thr Leu Ala Tyr Thr Tyr Glu 210 215 220
Ala 225 Tyr Val Arg Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser Gly Leu Ser 230 235 240
Glu Glu Glu Val Arg Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu Leu Asn Met 245 250 255
Ala Asp Lys Lys Glu Thr Arg Thr Ser Gly His His His His His His 260 265 270
PL 211 762 B1

Claims (12)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Zastosowanie (a) białka fuzyjnego zawierającego białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko; i (b) białka lub polinukleotydu HIV gp120; i (c) białka lub polinukleotydu SIV Nef; i (d) adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego do wytwarzania szczepionki do immunizacji profilaktycznej lub terapeutycznej ludzi przeciw HIV, Nef-Tat, SIV Nef i gp120 działają synergicznie w terapii lub profilaktyce HIV przy czym stosowana szczepionka zmniejsza obciążenie wirusem HIV u ludzi zakażonych HIV oraz powoduje utrzymanie poziomów CD4+ powyżej tych spotykanych przy braku szczepienia Nef-Tat, SIV Nef i HIV gp120.
  2. 2. Zastosowanie (a) białka lub polinukleotydu HIV Tat; i (b) białka lub polinukleotydu HIV gp120; i (c) adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego do wytwarzania szczepionki do immunizacji profilaktycznej lub terapeutycznej ludzi przeciw HIV, przy czym stosowana szczepionka zmniejsza obciążenie wirusem HIV u ludzi zakażonych HIV oraz powoduje utrzymanie poziomów CD4+ powyżej tych spotykanych przy braku szczepienia HIV Tat i HIV gp120.
  3. 3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, w którym szczepionka dodatkowo zawiera antygen wybrany z grupy obejmującej gag, rev, vif, vpr i vpu.
  4. 4. Zastosowanie według zastrz. 1-3, w którym białko Tat jest białkiem zmutowanym.
  5. 5. Zastosowanie według zastrz. 1-4, w którym białko Tat lub Nef-Tat jest zredukowane.
  6. 6. Zastosowanie według zastrz. 1-4, w którym białko Tat lub Nef-Tat jest utlenione.
  7. 7. Zastosowanie według zastrz. 1-6, w którym białko Tat lub Nef-Tat jest karbamidometylowane.
  8. 8. Zastosowanie według zastrz. 1-7, w którym pochodną monofosforylolipidu A stanowi 3-de-O-acylowany monofosforylolipid A.
  9. 9. Zastosowanie według zastrz. 1-8, w którym jako adiuwant saponinowy stosuje się QS21.
  10. 10. Zastosowanie według zastrz. 1-9, w którym dodatkowo stosuje się emulsję olej w wodzie.
  11. 11. Kompozycja szczepionki do stosowania u ludzi zawierająca białko fuzyjne oraz adiuwant, znamienna tym, że jako białko fuzyjne zawiera białko fuzyjne zawierające białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko fuzyjne, białko lub polinukleotyd HIV gp120, białko lub polinukleotyd SIV Nef, a jako adiuwant zawiera adiuwant zawierający QS21 i 3D-MPL.
  12. 12. Kompozycja szczepionki do stosowania u ludzi, znamienna tym, że zawiera białko lub polinukleotyd HIV Tat, białko lub polinukleotyd HIV gp120 oraz adiuwant zawierający QS21 i 3D-MPL.
PL357210A 2000-01-31 2001-01-29 Zastosowanie białka fuzyjnego zawierającego białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko, białka lub polinukleotydu HIV gp120, białka lub polinukleotydu SIV Nef, adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego oraz kompozycja szczepionki PL211762B1 (pl)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0002200A GB0002200D0 (en) 2000-01-31 2000-01-31 Novel use
GB0009336A GB0009336D0 (en) 2000-04-14 2000-04-14 Novel use
GB0013806A GB0013806D0 (en) 2000-06-06 2000-06-06 Novel use
PCT/EP2000/005998 WO2001000232A2 (en) 1999-06-29 2000-06-28 Use of cpg as an adjuvant for hiv vaccine
PCT/EP2001/000944 WO2001054719A2 (en) 2000-01-31 2001-01-29 Vaccine for the prophylactic or therapeutic immunization against hiv

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL357210A1 PL357210A1 (pl) 2004-07-26
PL211762B1 true PL211762B1 (pl) 2012-06-29

Family

ID=27255504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL357210A PL211762B1 (pl) 2000-01-31 2001-01-29 Zastosowanie białka fuzyjnego zawierającego białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko, białka lub polinukleotydu HIV gp120, białka lub polinukleotydu SIV Nef, adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego oraz kompozycja szczepionki

Country Status (23)

Country Link
US (3) US20030158134A1 (pl)
EP (1) EP1251870A2 (pl)
JP (1) JP2003529559A (pl)
KR (2) KR20070073987A (pl)
CN (1) CN1326873C (pl)
AP (1) AP2002002592A0 (pl)
AU (1) AU783005B2 (pl)
BG (1) BG106964A (pl)
BR (1) BR0107972A (pl)
CA (1) CA2398611A1 (pl)
CZ (1) CZ20022643A3 (pl)
DZ (1) DZ3286A1 (pl)
EA (1) EA200200724A1 (pl)
HK (1) HK1051317A1 (pl)
HU (1) HUP0204250A3 (pl)
IL (1) IL150756A0 (pl)
MX (1) MXPA02007413A (pl)
NO (1) NO20023616L (pl)
NZ (1) NZ520327A (pl)
OA (1) OA12168A (pl)
PL (1) PL211762B1 (pl)
SK (1) SK11122002A3 (pl)
WO (1) WO2001054719A2 (pl)

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
IT1297090B1 (it) * 1997-12-01 1999-08-03 Barbara Ensoli Tat di hiv-1 o suoi derivati, da soli od in combinazione, a scopo vaccinale, profilattico e terapeutico, contro l'aids i tumori e le
SI1077722T1 (sl) 1998-05-22 2007-02-28 Ottawa Health Research Inst Metode in produkti za induciranje sluznicne imunosti
CA2358385C (en) 1998-12-31 2013-08-06 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
US20050226890A1 (en) * 1999-08-12 2005-10-13 Cohen David I Tat-based vaccine compositions and methods of making and using same
US6982086B2 (en) 2000-02-04 2006-01-03 Duke University Human immunodeficiency virus immunogenic composition
WO2005090392A1 (en) * 2004-03-16 2005-09-29 Inist Inc. Tat-based tolerogen compositions and methods of making and using same
EP2412242A3 (en) 2001-07-05 2012-06-13 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof
EP1279404A1 (en) 2001-07-26 2003-01-29 Istituto Superiore di Sanità Use of HIV-1 tat, fragments or derivatives thereof, to target or to activate antigen-presenting cells, to deliver cargo molecules for vaccination or to treat other diseases
GB0118367D0 (en) * 2001-07-27 2001-09-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel use
FR2828404B1 (fr) * 2001-08-10 2005-07-15 Neovacs Superimmunogene composite a usage vaccinal bifonctionnel pour le traitement des maladies associees a un desordre tissulaire stromal
SG2013034475A (en) 2001-11-21 2016-10-28 Univ Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
EP1944043A1 (en) 2001-11-21 2008-07-16 The Trustees of the University of Pennsylvania Simian adenovirus nucleic acid and amino acid sequences, vectors containing same, and methods of use
GB0206360D0 (en) 2002-03-18 2002-05-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Viral antigens
GB0206359D0 (en) 2002-03-18 2002-05-01 Glaxosmithkline Biolog Sa Viral antigens
DE60325838D1 (de) * 2002-03-19 2009-03-05 Glaxo Group Ltd Imidazoquinolinamine als adjuvantien für hiv dna vakzine
GB0210682D0 (en) * 2002-05-09 2002-06-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel use
WO2003097675A1 (en) 2002-05-16 2003-11-27 Bavarian Nordic A/S Fusion protein of hiv regulatory/accessory proteins
JP2005533855A (ja) 2002-07-24 2005-11-10 インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト 病原性ウイルスからの別のリーディングフレームによりコードされる抗原
EP2402026A3 (en) 2002-09-13 2012-04-18 Intercell AG Method for isolating hepatitis C virus peptides
PT2241325E (pt) 2002-10-29 2012-04-12 Coley Pharm Gmbh Utilização de oligonucleótidos cpg no tratamento de infecção com vírus da hepatite c
GB0225788D0 (en) * 2002-11-05 2002-12-11 Glaxo Group Ltd Vaccine
GB0225786D0 (en) * 2002-11-05 2002-12-11 Glaxo Group Ltd Vaccine
WO2004053104A2 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5’ cpg nucleic acids and methods of use
JP2006521321A (ja) * 2003-03-24 2006-09-21 インターツェル・アクチェンゲゼルシャフト 免疫応答を促進するためのミョウバンおよびＴｈ１免疫応答誘起アジュバントの使用
ATE485056T1 (de) 2003-03-24 2010-11-15 Intercell Ag Verbesserte impfstoffe
WO2005070041A2 (en) * 2004-01-09 2005-08-04 Morehouse School Of Medicine Modulating vaccine against hiv nef protein-induced lymphocyte depletion
GB0405480D0 (en) * 2004-03-11 2004-04-21 Istituto Superiore Di Sanito Novel tat complexes,and vaccines comprising them
US7927580B2 (en) * 2004-03-16 2011-04-19 Nanirx, Inc. Tat-based immunomodulatory compositions and methods of their discovery and use
FR2868318B1 (fr) * 2004-04-01 2012-11-16 Commissariat Energie Atomique Antigene tat stabilise et ses applications pour la vaccination anti-vih
PT1861120T (pt) 2005-03-23 2016-08-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Utilização de um vírus influenza e de um adjuvante de emulsão óleo-em-água para induzir células t cd4 e/ou melhorar a resposta de células b de memória
MX2009000660A (es) 2006-07-17 2009-04-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vacuna de influenza.
WO2008094188A2 (en) 2006-07-17 2008-08-07 Anza Therapeutics, Inc. Methods and compositions using listeria for enhancing immunogenicity by prime boost
JP2010510226A (ja) * 2006-11-17 2010-04-02 デューク ユニバーシティ 多構成要素ワクチン
EP2137210B1 (en) * 2007-03-02 2016-10-19 GlaxoSmithKline Biologicals SA Novel method and compositions
US9717788B2 (en) 2007-03-02 2017-08-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Method of inducing an immune response against HIV employing HIV immunogens, adenoviral vectors encoding said immunogens, and adjuvant
PE20090146A1 (es) 2007-04-20 2009-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica contra el virus influenza
WO2009105084A2 (en) 2007-11-28 2009-08-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian subfamily c adenoviruses sadv-40, -31, and-34 and uses thereof
MX347246B (es) 2007-11-28 2017-04-19 Univ Pennsylvania Adenovirus e simianos sadv-39, sadv-25.2, sadv-26, sadv-30, sadv-37 y sadv-38.
US8470310B2 (en) 2008-03-04 2013-06-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses SAdV-36, -42.1, -42.2, and -44 and uses thereof
US8940290B2 (en) 2008-10-31 2015-01-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Simian adenoviruses SAdV-43, -45, -46, -47, -48, -49, and -50 and uses thereof
CN102405057B (zh) 2009-03-23 2016-05-25 那尼尔科斯治疗公司 用免疫刺激性Hiv Tat衍生物多肽治疗癌症
CN102575232B (zh) 2009-05-29 2015-07-22 宾夕法尼亚大学托管会 猿腺病毒41及其应用
AU2011332025B2 (en) 2010-11-23 2015-06-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Subfamily E simian adenoviruses A1321, A1325, A1295, A1309 and A1322 and uses thereof
KR20150014505A (ko) 2012-05-18 2015-02-06 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 아과 e 원숭이 아데노바이러스 a1302, a1320, a1331 및 a1337 및 이것들의 사용
WO2015051245A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Pin Pharma, Inc. Immunostimulatory hiv tat derivative polypeptides for use in cancer treatment
MY186389A (en) 2014-05-13 2021-07-22 Univ Pennsylvania Compositions comprising aav expressing dual antibody constructs and uses thereof
CN104001155B (zh) * 2014-06-12 2016-04-13 中山大学 一种Tat蛋白及其制备方法和应用
US10188749B2 (en) 2016-04-14 2019-01-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods to program therapeutic cells using targeted nucleic acid nanocarriers
CA3049244A1 (en) * 2017-01-05 2018-07-12 Fred Hutchinson Cancer Research Center Systems and methods to improve vaccine efficacy
AU2021229710A1 (en) 2020-03-01 2022-10-06 Dynavax Technologies Corporation CPG-adjuvanted SARS-CoV-2 virus vaccine
CA3216585A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Nathaniel SILVER Non-viral dna vectors expressing therapeutic antibodies and uses thereof
WO2023177655A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5863542A (en) * 1991-03-07 1999-01-26 Virogenetics Corporation Recombinant attenuated ALVAC canaryopox virus containing heterologous HIV or SIV inserts
KR100278157B1 (ko) * 1992-06-25 2001-01-15 장 스테판느 보조약을 함유하는 백신 조성물
WO1996027389A1 (fr) * 1995-03-08 1996-09-12 Neovacs Immunogenes denues de toxicite derivant d'une proteine de regulation retrovirale, anticorps, procede de preparation et compositions pharmaceutiques les renfermant
US20050033022A1 (en) * 1997-09-26 2005-02-10 Smithkline Beecham Biologicals Sa Fusion proteins comprising HIV-1 Tat and/or Nef proteins
GB9720585D0 (en) * 1997-09-26 1997-11-26 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
FR2773156B1 (fr) * 1997-12-26 2000-03-31 Biovacs Inc Nouveaux immunogenes anti-retroviraux (toxoides), nouveaux procedes de preparation et application a la prevention et au traitement du sida

Also Published As

Publication number Publication date
PL357210A1 (pl) 2004-07-26
AP2002002592A0 (en) 2002-09-30
NZ520327A (en) 2004-06-25
US20090104229A1 (en) 2009-04-23
IL150756A0 (en) 2003-02-12
US20030158134A1 (en) 2003-08-21
HK1051317A1 (zh) 2003-08-01
US20050266025A1 (en) 2005-12-01
KR20070073987A (ko) 2007-07-10
BR0107972A (pt) 2002-11-05
AU783005B2 (en) 2005-09-15
AU5791001A (en) 2001-08-07
KR100808348B1 (ko) 2008-02-27
NO20023616D0 (no) 2002-07-30
EA200200724A1 (ru) 2003-02-27
CZ20022643A3 (cs) 2003-02-12
NO20023616L (no) 2002-09-17
BG106964A (bg) 2004-01-30
SK11122002A3 (sk) 2003-01-09
KR20020073569A (ko) 2002-09-27
CN1326873C (zh) 2007-07-18
HUP0204250A3 (en) 2005-06-28
WO2001054719A2 (en) 2001-08-02
EP1251870A2 (en) 2002-10-30
JP2003529559A (ja) 2003-10-07
WO2001054719A3 (en) 2001-12-20
MXPA02007413A (es) 2004-07-30
CN1419456A (zh) 2003-05-21
DZ3286A1 (fr) 2001-08-02
HUP0204250A1 (hu) 2003-03-28
CA2398611A1 (en) 2001-08-02
OA12168A (en) 2006-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL211762B1 (pl) Zastosowanie białka fuzyjnego zawierającego białka HIV Tat i HIV Nef lub polinukleotyd kodujący takie białko, białka lub polinukleotydu HIV gp120, białka lub polinukleotydu SIV Nef, adiuwanta indukującego TH1 zawierającego monofosforylolipid A lub jego pochodną i adiuwanta saponinowego oraz kompozycja szczepionki
EP2130921B1 (en) Vaccine for prevention and treatment of HIV-infection
US20080102085A1 (en) Vaccine comprising gp120 and nef and/or tat for the immunization against hiv
CZ20001091A3 (cs) Fúzní proteiny obsahující proteiny HIV-1TAT a/nebo NEF
JP2012508160A (ja) ワクチン組成物
KR20100109555A (ko) 백신
ZA200205968B (en) Vaccine for the prophylactic or therapeutic immunization against HIV.

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140129