RU2390525C2 - Новая растворимая и стабилизированная тримерная форма полипептидов gp41 - Google Patents
Новая растворимая и стабилизированная тримерная форма полипептидов gp41 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2390525C2 RU2390525C2 RU2006114353/13A RU2006114353A RU2390525C2 RU 2390525 C2 RU2390525 C2 RU 2390525C2 RU 2006114353/13 A RU2006114353/13 A RU 2006114353/13A RU 2006114353 A RU2006114353 A RU 2006114353A RU 2390525 C2 RU2390525 C2 RU 2390525C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- modified
- polypeptide
- amino acid
- modified polypeptide
- Prior art date
Links
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 title claims abstract description 76
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 56
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims abstract description 20
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 claims description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 8
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 abstract description 2
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 abstract 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 33
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 22
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 17
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 8
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 4
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 4
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 3
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 3
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000255 pathogenic effect Toxicity 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000653197 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Movement protein TGB3 Proteins 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 102100035875 C-C chemokine receptor type 5 Human genes 0.000 description 1
- 101710149870 C-C chemokine receptor type 5 Proteins 0.000 description 1
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000009410 Chemokine receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000299 Chemokine receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 101710114816 Gene 41 protein Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000900206 Hantaan virus (strain 76-118) Envelopment polyprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000012435 analytical chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L aspartate group Chemical group N[C@@H](CC(=O)[O-])C(=O)[O-] CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-L 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к модифицированному полипептиду гликопротеина оболочки HIV-1 gp41, полинуклеотиду, который кодирует данный модифицированный полипептид, и экспрессирующему вектору, который содержит кодирующий модифицированный полипептид гликопротеина оболочки HIV-1 gp41. Модифицированный полипептид гликопротеина оболочки HIV-1 gp41 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:14, где последовательность между положениями 603 и 615 или 598 и 622 SEQ ID NO:1 или последовательность между положениями 530 и 542 или 525 и 549 SEQ ID NO:14 заменена на линкерный фрагмент, представляющий собой олигопептид SEQ ID NO:2. Представленное изобретение позволяет получить улучшение растворимости модифицированного полипептида гликопротеина оболочки HIV-1 gp41 без изменения его иммуногенной реактивности. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 10 ил., 1 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к растворимым и стабилизированным тримерным формам гликопротеина оболочки HIV-1 gp41 и их применению в качестве вакцинного средства.
Вирус иммунодефицита человека типа 1 (HIV-1) кодирует предшественник гликопротеина оболочки массой 160 кДа (gp160), протеолитически расщепляемый на наружный (gp120) и трансмембранный (gp41) гликопротеины.
В зрелой гликопротеиновой оболочке гликопротеин gp120 остается ассоциированным с концевым доменом gp41 посредством нековалентного взаимодействия. Природные гликопротеины оболочки HIV-1 существуют в виде тримеров, содержащих три субъединицы gp120 и три - gp41 и заякорены в мембрану вируса или инфицированной клетки посредством трансмембранного участка gp41.
Показано, что связывание gp120 с рецептором CD4 индуцирует конформационные изменения, приводящие к последующему взаимодействию с одним из ряда рецепторов хемокинов (CXCR4, CCR5…). Эти события связывания запускают конформационные изменения gp41. В частности, исследования рентгеноструктурной кристаллографией и ядерно-магнитным резонансом показывают, что гликопротеин оболочки gp41 существует, по меньшей мере, в трех конформациях, нативной конформации (шипа), пре-сливающей неустойчивой конформации, которая переходит в термостабильную сливающую конформацию «тройной шпильки» после запускающего события, такого как связывание вирусной частицы HIV с мембраной клеток-мишеней.
Таким образом, связывание gp120 с клеточными корецепторами индуцирует переход gp41 из пре-сливающей формы в сливающую форму.
Линейная организация gp41 включает в себя пептид слияния, эктодомен (N-концевую суперспираль, участок связанной дисульфидными мостиками петли и C-концевой α-спиральный отрезок) и трансмембранный домен.
В сливающем 6-спиральном узле три N-концевых спирали формируют тримерную суперспираль и три C-концевых спирали упакованы в обратном направлении в три гидрофобные бороздки на поверхности суперспирали. Такая спирально-шпилечная структура соответствует конформации gp41 со сливающей активностью. Поскольку мембранный якорь и пептид слияния эктодомена gp41 внедрены в мембраны вируса и клетки-мишени соответственно, формирование сливающей шпилечной структуры приводит к колокализации двух мембран и таким образом преодолевает энергетический барьер для слияния мембран.
Гликопротеины оболочки представляют собой единственную реалистичную вирусную мишень для индуцированных вакциной ответов нейтрализующих антител, поскольку они способствуют слиянию вирусной мембраны посредством опосредованного рецептором конформационного изменения и они экспрессированы на поверхности как вириона, так и инфицированной клетки. Изначально главными кандидатами для вакцины считали мономерный gp120 HIV-1 и его производные. Однако gp120 HIV-1 является высоковариабельным и неоднократно показана его иммуногенная неэффективность для индукции нейтрализующих антител против клинических изолятов HIV-1. Немногие из антител, индуцированных мономерами gp120, эффективно связывают собранные тримеры гликопротеинов оболочки HIV-1.
Напротив, gp41 представляет собой чрезвычайно иммуногенный гликопротеин, индуцирующий антитела, по существу, у всех HIV-инфицированных индивидуумов.
Эктодомен gp41 является наиболее консервативным участком оболочки HIV-1, которая во всем остальном демонстрирует значительное генетическое разнообразие, даже между близкородственными изолятами.
Кроме того, gp41 играет критическую роль в поддержании структуры и инфекционности вириона HIV.
Антитела, направленные против структур шестиспирального пучка (сливающая форма) и пре-шпильки (пре-сливающая форма) в определенных условиях останавливают слияние. Антитела, имеющие доступ к конформациям пре-шпильки и шестиспирального пучка gp41, будут способны ингибировать gp41-опосредованное слияние. Кроме того, шестиспиральный пучок является чрезвычайно стабильной структурой.
Эти наблюдения позволяют считать шестичленную спираль gp41, в модифицированной форме или нет, привлекательной мишенью для развития лекарственных средств и вакцины.
В US 6455265 авторы изобретения показали, что некоторые производные gp41 могут являться особенно эффективными для получения вакцины для предупреждения патогенного эффекта, связанного с ретровирусной инфекцией, при условии, что соответствующие полипептиды имеют эпитопы с модифицированной антигенностью, так чтобы получать отличающийся иммунный ответ по отношению к вирусной оболочке и некоторым собственным белкам.
Более точно, они обнаружили, что консервативные и иммунодоминантные участки оболочки ретровируса могут отвечать за опасный феномен аутоиммунности, особенно в случае ретровирусной оболочки gp41. Авторы изобретения наблюдали, что определенные иммунодоминантные участки gp41 демонстрируют трехмерные структурные аналогии и/или перекрестную реактивность с определенными участками белка иммунной системы человека и, в особенности, IL-2.
Таким образом, они предложили модифицированные полипептиды, полученные модификацией антигенности интересующего эпитопа белка оболочки, чтобы получить отличающийся иммунный ответ по отношению к вирусному белку оболочки и этим белкам иммунной системы человека.
Как правило, gp41 можно получить в бакуловирусе или клетках млекопитающих, но выход ниже, чем в E. coli. Более того, гликозилирование в бакуловирусе или клетках млекопитающих отличается от гликозилирования в клетках человека и не является необходимым для иммуногенности белка. Gp41, в сущности, является очень иммуногенным без гликозилирования.
Однако рекомбинантный эктодомен gp41 HIV, полученный в Escherichia coli, при нейтральном pH формирует нерастворимые преципитаты (агрегаты тримерной формы gp41).
Настоящее изобретение более точно направлено на предложение стабилизированных водорастворимых форм белка gp41, в частности производных белка gp41, и еще более конкретно, производных, как раскрыто в US 6455265.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что возможно значительно уменьшить гидрофобность петли, получив улучшение растворимости рекомбинантного эктодомена gp41 HIV, без изменения его иммуногенной реактивности.
Соответственно, в одном аспекте изобретения предоставлен модифицированный полипептид, содержащий, по меньшей мере, иммунодоминантный участок и соединяющую петлю между N- и C-концевыми спиралями эктодомена gp41 HIV-1, где соединяющая петля включает в себя, по меньшей мере, линкерный фрагмент, обладающий:
- размером, подходящим для поддержания нативной конформации взаимодействия между N- и C-концевыми спиралями, и
- гидрофильностью, достаточной для обеспечения растворимой и стабильной тримерной формы указанного модифицированного полипептида.
В значении по настоящему изобретению выражение «поддержание нативной конформации взаимодействия между N- и C-концевыми спиралями» понимают как означающее, что взаимодействие между N- и C-концевыми спиралями модифицированного полипептида gp41 функционально подобное или одинаковое с взаимодействием данных спиралей в полипептиде gp41 дикого типа.
В одном варианте осуществления по изобретению линкерный фрагмент включен в петлю взамен всего или части делетированного олигопептида дикого типа.
В другом варианте осуществления по изобретению делетированный олигопептид дикого типа локализован в области от 598 до 622, в частности в области от 603 до 615 белка gp41, в соответствии с нумерацией по SEQ ID NO: 1 (фиг.2A).
В другом варианте осуществления по изобретению делетированный олигопептид локализован в области от 525 до 549, в частности в области от 530 до 542, в соответствии с нумерацией по SEQ ID NO: 14 (фиг.3).
В дополнительном варианте осуществления по изобретению делетированный олигопептид дикого типа состоит из последовательности, по меньшей мере из 10, в частности из 13, и, более конкретно, из 25 аминокислотных остатков.
В другом варианте осуществления линкерный фрагмент представляет собой олигопептидный линкер, основанный преимущественно на гидрофильных аминокислотных остатках.
В еще одном варианте осуществления по изобретению олигопептидный линкер состоит из последовательности SGGRGGS, как изложено в SEQ ID NO: 2.
По второму аспекту изобретения предоставлен полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид, как раскрыто выше.
По третьему аспекту изобретения предоставлен экспрессирующий вектор, содержащий следующие функционально связанные элементы: промотор транскрипта, фрагмент ДНК, кодирующий модифицированный полипептид, как раскрыто выше, и терминатор транскрипта.
По четвертому аспекту изобретения предоставлена вакцина для предотвращения патогенного эффекта, связанного с ретровирусной инфекцией, включающая в себя в качестве активного вещества, по меньшей мере, один модифицированный полипептид, как раскрыто выше.
Определения, данные выше, подразумевают, что применяемый полипептид содержит, по меньшей мере, часть иммунодоминантного участка белка оболочки вируса HIV-1 gp41.
Модифицированный полипептид по настоящему изобретению может представлять собой, например, целый белок оболочки HIV-1, модифицированный, как указано ниже. Модифицированный полипептид может являться также частью белка оболочки, модифицированного, как указано ниже, где указанная часть содержит, по меньшей мере, один иммунодоминантный фрагмент, как указано ниже. Модифицированный полипептид может также представлять собой химерный белок, содержащий, по меньшей мере, часть белка оболочки, где указанная часть белка оболочки является такой, как описано выше.
Пептидная последовательность участка 545-684 (SEQ ID NO: 1), воспроизведенная в прилагаемой фиг.2A, представляет собой консенсусную последовательность (штамм 32 HIV-1 в SWISS PROT).
Последовательность, представленная на фиг.3, SEQ ID NO: 14, получена из последовательности gp41 штамма HxB2 вируса HIV (SWISS PROT CODE: ENV HV 1 BR), где аминокислотные остатки цистеина в положениях 530 и 536 заменены на аминокислотные остатки серина. Иммунодоминантный участок относится к пептидной последовательности, индуцирующей в огромном большинстве случаев (например, по меньшей мере, примерно в 7 случаях из 10) гуморальный и/или клеточный ответ иммунной системы, направленный против указанного участка после иммунизации белком, содержащим указанную последовательность, или пептидом, по существу, состоящим из указанной последовательности.
В настоящей заявке, когда ссылаются на иммунный ответ без любой другой конкретной информации, он представляет собой иммунный ответ позвоночного после иммунизации in vivo.
Изобретение ссылается на клетки-мишени вируса, которые представляют собой клетки, в которые вирус способен проникать. Клетки-мишени ретровирусов широко известны. Вирусы обладают свойством связываться с клетками, которые они способны инфицировать. Таким образом, не обязательно, можно проверить клетки-мишени изучаемого вируса с применением общепринятых экспериментов in vitro.
Изобретение ссылается также на клетки хозяина, имеющие мембранный рецептор для белка хозяина. Клетки хозяина, имеющие рецептор для белка указанного хозяина, часто известны, и, в противном случае, возможно с применением общепринятых экспериментов определить, связывается ли данный белок с определенным типом клеток. Например, возможно применять меченный радиоактивным изотопом белок, чтобы определить, связывается ли он с указанным типом клеток. Возможно также проверить, связывается ли белок с данным мембранным рецептором, с применением линии клеток, трансфицированной геном, экспрессирующим указанный мембранный рецептор.
Белки хозяина, мембранным рецептором для которых обладают определенные клетки хозяина, в основном, являются белками, принадлежащими к ряду растворимых белковых медиаторов. Данный ряд включает в себя белки, называемые, в зависимости от случаев, гормонами, факторами роста или цитокинами, хотя не существует определенной границы между данными разными категориями медиаторов; смотри, например, CAVAILLON J. M. , Les Cytokines (Masson, Paris, 1966), часть 1, страницы 1-3 и предисловие.
Линкерный фрагмент, рассматриваемый по изобретению, обладает общим гидрофильным характером и является неиммуногенным или слабоиммуногенным и гибким.
Он является синтетическим линкером и, более конкретно, он является олигопептидным линкером.
Как применяют здесь, «гибкий» линкер представляет собой такой, у которого отсутствует, главным образом, стабильная высокоупорядоченная конформация в растворе. Следует избегать областей локального заряда. Как правило, предпочтительнее маленькие, полярные и гидрофильные остатки, а объемные и гидрофобные остатки нежелательны. Если линкерный полипептид включает в себя заряженные остатки, их обычно располагают так, чтобы получать результирующий нейтральный заряд внутри небольшого участка полипептида. Таким образом предпочтительнее располагать заряженный остаток рядом с остатком противоположного заряда.
Как правило, предпочтительные остатки для включения в линкерный полипептид включают в себя Gly, Ser, Ala, Thr, Asn и Gln; более предпочтительные остатки включают в себя Gly, Ser, Ala и Thr и наиболее предпочтительными остатками являются Gly и Ser. Как правило, следует избегать остатков Phe, Tyr, Trp, Cys, Pro, Leu, Ile, Lys и Arg, остатков Cys из-за их способности формировать нежелательные дисульфидные связи, остатков Pro из-за их гидрофобности и отсутствия гибкости и остатков Lys и Arg из-за риска возможной иммуногенности.
Подходящий линкер можно представить последовательностью SEQ ID NO:2, представленной на фиг.2С.
Данный линкерный фрагмент включен в петлю взамен остатков дикого типа.
Делегированный олигопептид дикого типа может обладать или нет такой же длиной, как и линкерный олигопептид.
В конкретном варианте осуществления делегированный олигопептид дикого типа короче, чем линкерный фрагменг.
В другом конкретном варианте осуществления делегированный олигопептид дикого типа длиннее, чем линкерный фрагмент.
В еще одном конкретном варианте осуществления они одинаковой длины.
Олигопептиды дикого типа, которые можно преимущественно заменять на линкер по настоящему изобретению, представлены на SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16 (фиг.2D) и представляют собой соответственно последовательности между положениями 603 и 615 и между положениями 598 и 622 SEQ ID NO:1 и последовательности олигопептидов между положениями 530-542 и между положениями 525-149 SEQ ID NO:14.
В конкретном варианте осуществления модифицированный полипептид по настоящему изобретению включает в себя, кроме того, по меньшей мере, одну мутацию в иммунодоминантном участке.
Иммунодоминантные участки, антигенность которых желательно модифицировать по изобретению, можно выбирать из дающих in vitro перекрестную реакцию B-типа и/или T-типа с белком хозяина, в частности с IL-2.
В прилагаемой фиг.2B представлены пептидные последовательности четырех участков данной области gp41 555-577 (SEQ ID NO: 3), 572-601 (SEQ ID NO: 4), 590-620 (SEQ ID NO: 5) и 628-663 (SEQ ID NO:6), для которых отмечали структурные аналогии и/или перекрестные реакции с IL-2. Данные участки найдены по гомологии в SEQ ID NO: 14 и соотносятся, соответственно, с пептидными последовательностями, обнаруженными в положениях 482-504, 499-529, 517-547 и 555-590.
Таким образом, в другом аспекте по изобретению предоставлен модифицированный полипептид, как раскрыто здесь выше, включающий, кроме того, по меньшей мере, одну мутацию в иммунодоминантном участке для предотвращения перекрестной реакции B-типа и/или T-типа с белком хозяина, в частности с IL-2 человека.
Особенно интересны модифицированные полипептиды по изобретению, кроме того, включающие мутацию, по меньшей мере, в одном иммунодоминантном участке, представленном пептидной последовательностью SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и/или SEQ ID NO: 6.
В настоящей заявке «мутация» относится к любой модификации участка (не обязательно, уменьшенного до одного аминокислотного остатка) полипептида физическими способами, химическими способами (ковалентной или нековалентной модификацией) и/или биологическими способами (мутациями посредством замены, делеции и/или вставки одной или нескольких аминокислот), приводящей к модификации функциональных возможностей составляющей аминокислоты (аминокислот) указанного участка, обозначенного «мутированный участок». В качестве примера, возможно вносить мутации, приводящие к уничтожению, приобретению и/или модификации свойств дисульфидных мостиков, водородных связей, электростатических взаимодействий и/или гидрофобных взаимодействий, модификации способности белка формировать гетерокомплекс или, в качестве альтернативы, в случае олигомерного белка, модификации состояния олигомеризации или стабильности олигомера.
Некоторые мутации, имеющие значение для воздействия на антигенность, раскрыты в US 6455265, идея которого полностью включена сюда в качестве ссылки.
Модифицированный полипептид по настоящему изобретению представлен, в частности, SEQ ID NO: 8 на фиг.1. Данный модифицированный полипептид получен из SEQ ID NO: 14, где последовательность олигопептида между положениями 531-542 заменена на линкер, соответствующий SEQ ID NO: 2 (фиг.2C), и последовательность олигопептида между положениями 597-607 заменена на His-таг. В данных последовательностях дополнительная мутация внесена в положении 528 (нумерация согласно SEQ ID NO:14), где остаток триптофана заменен на аминокислотный остаток аспартата.
Другие полипептидные последовательности, иллюстрирующие настоящее изобретение, представлены на SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20 (фиг.4 и 5).
В другом конкретном варианте осуществления по настоящему изобретению модифицированный полипептид gp41 может также включать в себя модификацию, такую как усечение части аминокислотной последовательности на N- или C-концах.
В преимущественном варианте осуществления модифицированный полипептид gp41 усечен на N-конце.
Без намерения быть связанными какой-либо теорией, авторы изобретения выдвинули гипотезу, что такие модификации полипептида позволяют некоторым C-концевым пептидным последовательностям не являться, например, полностью или частично замаскированными, в частности, на C-конце, который, таким образом, является более доступным для антител.
Более конкретно, модифицированный полипептид gp41 представляет собой усеченный с N-конца олигопептид. Длина делеции имеет размер в пределах от 8 до 15 аминокислотных остатков, пронумерованых по SEQ ID NO: 1.
Более предпочтительно, модифицированный полипептид gp41 усечен, по меньшей мере, на 10, в частности, по меньшей мере, на 12 аминокислотных остатков в N-концевом положении.
Иллюстративная полипептидная последовательность, показывающая N-концевое усечение и замену олигонуклеотидной последовательности в последовательности петли на линкер (SED ID NO: 2) по настоящему изобретению, представлена, в частности, последовательностью SEQ ID NO: 21 (фиг.6).
В другом конкретном варианте осуществления по изобретению можно вносить, помимо модификаций в петле, выполненных для улучшения растворимости и модификаций для улучшения антигенности полипептида gp41, дополнительные модификации для улучшения растворимости.
В качестве конкретного варианта осуществления таких модификаций может быть указана мутация аминокислотного остатка, как, например, замена остатка триптофана в положении 528 (нумерация по SEQ ID NO: 14) более гидрофильным аминокислотным остатком, таким как аспартат.
Другие подобные мутации проиллюстрированы модифицированными полипептидами gp41, представленными на SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 19, где триптофан в положении 124 в SEQ ID NO: 17 и 130 в SEQ ID NO: 19, соответствующий триптофану в положении 685 SEQ ID NO: 1 (не представленному в данной последовательности), заменен на аспартат.
Такие мутации выполняют с целью замены гидрофобных аминокислотных остатков более гидрофильными аминокислотными остатками.
Другими модификациями, улучшающими растворимость модифицированного полипептида gp41, могут являться делеция или вставка аминокислотных остатков.
В качестве конкретного варианта осуществления таких модификаций можно указать делецию аминокислотных остатков, например делецию аминокислотных остатков триптофана и лейцина, соответственно, в положениях 122 и 123 SEQ ID NO: 17, и в положениях 128 и 129 SEQ ID NO: 19, дающих последовательности, соответственно, представленные на SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20.
Кроме того, без отклонения от границ настоящего изобретения модифицированные полипептиды по настоящему изобретению могут содержать дополнительные модификации, полезные для лабораторных экспериментов, такие как слияние с His-тагом или флуоресцентным белком, как, например, зеленый флуоресцентный белок.
Иллюстративные модифицированные полипептиды gp41 по настоящему изобретению, несущие дополнительные модификации, такие как His-таг, представлены на SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21 (фиг.1, 4-6). His-таг добавляли к C-концу данных пептидов.
Для получения модифицированного полипептида по изобретению можно применять любые известные способы пептидного синтеза или способы генной инженерии, такие как описаны в Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001.
Возможно выделить или получить полинуклеотидную последовательность, кодирующую, по меньшей мере, часть gp41 оболочек HIV-1, и, если желательно, на этой стадии возможно введение в нуклеотидную последовательность линкера и, не обязательно, мутаций, обеспечивающих возможность получения мутированного продукта трансляции, представляющего собой модифицированный полипептид.
Возможно также напрямую синтезировать модифицированную полинуклеотидную последовательность, содержащую одну или несколько мутаций, кодирующих модифицированный полипептид. Полученные таким образом полинуклеотидные последовательности вводят известным способом в подходящий вектор, предоставляющий возможность экспрессировать указанный полипептид, не обязательно, в модифицированной форме. Таким вектором является, например, вектор для E. Coli, бакуловирус или вектор для клетки млекопитающих. Возможно также вносить мутацию в немодифицированный полипептид, полученный по одному из предшествующих способов.
Таким образом, настоящее изобретение относится также к молекулам полинуклеотидов, включая молекулы ДНК и РНК, кодирующим модифицированные полипептиды, описанные выше.
Полинуклеотиды по настоящему изобретению включают в себя как одноцепочечные, так и двухцепочечные молекулы. Типичная последовательность ДНК представлена на SEQ ID NO: 7 на фиг.1.
Дополнительные последовательности ДНК, кодирующие модифицированные полипептиды, могут быть легко получены специалистами в данной области на основе генетического кода. Эквивалентные последовательности РНК можно получить посредством замены T на U. Специалистам в данной области абсолютно понятно, что ввиду вырожденности генетического кода возможна значительная изменчивость молекул полинуклеотидов, кодирующих модифицированные полипептиды.
Объектом изобретения является также применение модифицированного полипептида, как определено выше, в получении композиции вакцины для предупреждения патогенных воздействий, связанных с инфекцией хозяина ретровирусом HIV-1.
Таким образом, модифицированный полипептид, полученный по изобретению, может служить иммуногенным веществом, чтобы индуцировать посредством иммунизации формирование антител, которые можно применять, в частности, в лечении ретровирусных инфекций, таким образом, изобретение также относится к антителам, полученным в ответ на иммунизацию животных (включая человека) in vivo с помощью вакцинного средства, содержащего модифицированный полипептид, как описано выше.
Фармацевтические композиции, содержащие такие антитела, также составляют один из объектов изобретения.
Специалистам в данной области известно, что существуют различные штаммы вирусов HIV и, следовательно, различные гомологичные формы белков gp41.
Специалистам в данной области известно также, что, зная различные гомологичные последовательности данного пептида или белка, можно рассчитать консенсусные последовательности такого пептида или белка, демонстрирующие аминокислотные остатки, наиболее часто присутствующие в таком белке или пептиде.
Следовательно, не выходит за пределы настоящего изобретения осуществление подобного конструирования петли и других описанных модификаций посредством их адаптации для модификации конкретной изоформы белка gp41 или для модификации консенсусной последовательности.
Настоящее изобретение иллюстрируют следующими неограничивающими примерами.
Пример 1
Конструирование gp41 с модифицированной петлей по SEQ ID NO: 8 посредством молекулярной биологии
a) Конструирование олигонуклеотидных праймеров
gp41 с модифицированной петлей конструировали посредством ПЦР. Амплификацию N-концевой спирали и введение гидрофильного линкера проводили с применением олигонуклеотидного праймера gp41-NdeI (SEQ ID NO: 9): 5'GG AAT CCA CAT ATG CAG GCC AGA CAA TTA TTG 3' и олигонуклеотидного праймера gp41-BamlIL (SEQ ID NO: 10): 5'ACC GTT GGA TCC ACC TCT ACC TCC ACT GCT ACC GTC AAT CCC CAG GAG CTG TTG ATC 3' (фиг.7).
Данные олигонуклеотидные праймеры сконструированы, чтобы соответственно вводить сайты рестрикционных ферментов NdeI и BamHI (дважды подчеркнуты в последовательностях олигонуклеотидных праймеров). Последовательности, гомологичные гену gp41, в обоих олигонуклеотидных праймерах даны наклонным шрифтом. Олигонуклеотидный праймер gp41-BamlIL сконструирован также, чтобы вводить олигопептидный линкер SGGRGGS (SEQ ID NO: 2) для замены делетированной части петли (соответствуют однократно и дважды подчеркнутым последовательностям) и вводить мутацию в положение 528 (нумерация белка по SEQ ID NO: 14), где триптофан заменен на аспарагиновую аминокислоту (полужирный триплет).
Амплификацию C-концевой спирали белка gp41 проводили посредством ПЦР с применением олигонуклеотидного праймера gp41-Bam2IL (SEQ ID NO: 11): 5'GG AAT CCA GGA TCC AAT GCT AGT TGG AGT AAT AAA TCT CTG GAA 3' и олигонуклеотидного праймера gp41-XhoI (SEQ ID NO: 12): 5'GCC CGG CTC GAG ATC TAA TTC CAA TAA TTC TTG TTC ATT CTT TTC 3' (фиг.7). Данные олигонуклеотидные праймеры сконструированы, чтобы соответственно вводить сайты рестрикции ферментами BamHI и XhoI (последовательности дважды подчеркнуты). Последовательности, гомологичные гену gp41, в обоих олигонуклеотидных праймерах даны наклонным шрифтом.
b) Условия ПЦР
Модифицированный полипептид gp41 амплифицировали с матрицы gp41 (SEQ ID NO: 13) посредством ПЦР с описанными выше олигонуклеотидными праймерами. Плазмиду применяли при 0,5 мкг/мкл, праймеры применяли по 10 мкМ каждый и dNTP
применяли по 10 мМ каждый. Амплификацию проводили с применением ДНК-полимеразы DyNazyme от Finnzymes. Амплификацию начинали стадией денатурации 5 минут при 94°C с последующими 30 циклами, каждый из которых содержал стадию одной минуты при 94°C (стадия денатурации), стадию одной минуты при 60°C (гибридизация) и стадию одной минуты при 72°C (удлинение), амплификацию завершали последней стадией 10 минут при 72°C.
Очищенные продукты ПЦР расщепляли NdeI-BamHI для амплификации N-концевой спирали и BamHI и XhoI для амплификации C-концевой спирали. Два очищенных фрагмента NdeI-BamHI и BamHI-XhoI лигировали по участкам NdeI-XhoI в вектор pET21b (Novagen®), получая pET21b-gp41 с модифицированной петлей.
Введение лигированного фрагмента по участку XhoI в плазмиду pET21b приводило к добавлению His-тага на C-конце модифицированных полипептидов gp41, предваряемому аминокислотными остатками глутамата и лейцина (смотри SEQ ID NO: 8). Продуктами pET21b-gp41 с модифицированной петлей трансформировали DH5α.
Полную нуклеотидную последовательность модифицированного полипептида (SEQ ID NO: 8) определяли в Genome Express (Grenoble). Мутаций не обнаружили.
Пример 2
Воспроизведение модифицированного полипептида в E. coli
a) Трансформация
Плазмидой pET21b-gp41 с модифицированной петлей трансформировали экспрессирующий штамм E. coli (BL21 (DE3)).
b) Проверки экспрессии
6 порций культуры штамма E. coli BL21 (DE3), несущего плазмиду pET21b-gp41 с модифицированной петлей, растили при 37°C в среде Лурия до достижения оптической плотности 0,6 при 600 нм (спектрофотометр Jasco V-530). Модифицированный полипептид индуцировали 1 мМ IPTG (изопропил-βD-тиогалактозид) и продолжали культивирование дополнительные 2 часа при 37°C. Белок gp41 с модифицированной петлей экспрессировался в E. coli как фракция белка размером 15 кДа.
Экспрессию белков контролировали посредством разделения в SDS-4-12% PAGE и иммуноблотинга с антителами к His-тагу.
c) Получение
1) Культура
Один литр культуры BL21 (DE3)/pET2lb-gp41 с модифицированной петлей растили при 37°C в среде Луриа до достижения оптической плотности 6,0. Экспрессию gp41 с модифицированной петлей индуцировали 1 мМ IPTG и продолжали культивирование дополнительные 2 часа при 37°C. Культуру центрифугировали (Центрифуга Beckman Coulter Avanti J20XP с ротором JLA 8-1000, 4000 x g, 30 мин, 4°C), осадок хранили при -80°C.
2) Выделение модифицированного полипептида gp41
Осадок ресуспендировали в буфере для обработки ультразвуком (40 мл Трис-HCl 50 мМ pH 8, NaCl 300 мМ). Бактерии разрушали на стадии обработки ультразвуком 15 мин во льду/этаноле (дезинтегратор UP200S, амплитуда 80%, коэфф. 0,5). Затем суспензию центрифугировали при 40000 x g 30 мин при 4°C для отделения растворимых белков (супернатанта) от нерастворимых белков (осадка) (Центрифуга Beckman Coulter Avanti J20XP с ротором JA20).
Модифицированный полипептид gp41 в основном (80%) растворен в супернатанте после обработки ультразвуком.
d) Очистка модифицированного полипептида gp41
Супернатант после обработки ультразвуком (# 50 мл) фильтровали через 0,2-мкм фильтр. Присутствие 6 His на C-конце позволяет очистку на колонках для аффинной хроматографии.
1) Аффинная хроматография
Аффинную хроматографию проводили с применением Akta FPLC (Fast Pressure Liquid Chromatography, Amersham-Biosciences)и колонки Chelating Sepharose Fast Flow (от Amersham-Pharmacia). Сначала колонку уравновешивали пропусканием уравновешивающего буфера A (Трис 50 мМ pH8, NaCl 300 мМ) (10-кратный объем колонки).
Затем через колонку пропускали 50 мл образца, содержащего белки gp41 с модифицированной петлей.
Примеси элюировали в четыре стадии пропусканием буфера A, содержащего увеличивающееся количество буфера B (Трис 50 мМ pH8, NaCl 300 мМ, имидазол 500 мМ), в объеме, соответствующем 10-кратному объему колонки, на каждой стадии (0, 20, 50 и 100 мМ имидазол). И, наконец, элюировали белок gp41 пропусканием 100% буфера B в объеме, соответствующем 10-кратному объему колонки.
Устанавливали скорость потока 8 мл/мин и объем собираемой фракции 2 мл.
Присутствие белков детектировали с применением УФ-лампы и измерением оптической плотности при 280 нм.
Первые четыре фракции собирали и смешивали (8 мл при 0,2 мг/мл).
2) Диализ
Белок gp41 с модифицированной петлей (8 мл в буфере B (Трис 50 мМ pH8, NaCl 300 мМ, имидазол 500 мМ) подвергали диализу три раза (два анализа в течение 1ч 30 и один в течение ночи) при 4°C против 300 мл Трис 50 мМ pH8, NaCl 200 мМ, имидазол 200 мМ. Полученный образец центрифугировали 30 мин при 30000 g, 4°C.
Из одного литра бактериальной культуры получали 10 мл очищенного белка gp41 с модифицированной петлей в Трис 50 мМ pH8, NaCl 200 мМ, имидазол 200 мМ при 0,2 мг/мл.
Для хранения при -80°C добавляли 5% глицерин и замораживали очищенный белок в жидком азоте. На данной стадии концентрация белка составляла приблизительно 0,2 мг/мл.
Пример 3:
a) Определение олигомерного состояния
Для определения олигомерного состояния белка gp41 с модифицированной петлей проводили гель-фильтрацию с разделением между 3000 и 600000 Дальтон.
Определение олигомерного состояния проводили с применением Fast Performance Liquid Chromatography (System BioLogic, Bio-Rad) на колонке для аналитической хроматографии Superdex 200 HR 10/30 Amersham-pharmacia.
Колонку уравновешивали 50 мл буфера A (Трис 50 мМ pH8, NaCl 200 мМ), затем через колонку пропускали 250 мл образца, содержащего белок gp41 с модифицированной петлей (соответствующих 500 мкг белка gp41 с модифицированной петлей).
Таким образом элюировали белки с применением 30 мл буфера A при скорости потока 0,25 мл/мин. Собирали фракции объемом 2 мл. Белки детектировали с применением УФ-лампы и измерения оптической плотности при 280 нм.
Полученная хроматограмма (фиг.8) показывает, что конструкция белка gp41 с модифицированной петлей получена в растворимой и стабильной тримерной форме при 0,2 мг/мл.
Различия между консенсусной последовательностью эктодомена gp41 и gp41 с модифицированной петлей составили 13%. Среди 18 аминокислот, составляющих эктодомен, 6 были различными и 12 были удалены. Эктодомен белка gp41 представляет 71% полной последовательности gp41.
Краткое описание результатов | |
Конструкция | Модифицированный полипептид gp41 |
Экспрессирующая система | E. coli |
Выход на литр культуры | 10 мл очищенного белка при 0,2 мг/мл |
Экспрессирован как | Растворимая фракция |
Чистота после переукладки | > 97% |
pH-зависимость | Растворим при pH выше или равном 7 |
Стадии хроматографии | Очистка аффинной хроматографией |
Олигомерное состояние | Тримерный растворимый при 0,2 мг/мл |
Claims (10)
1. Модифицированный полипептид гликопротеина оболочки HIV-1 gp41, содержащий, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO:14, где последовательность между положениями 603 и 615 или 598 и 622 SEQ ID NO:1 или последовательность между положениями 530 и 542 или 525 и 549 SEQ ID NO:14 заменена на линкерный фрагмент, представляющий собой олигопептид SEQ ID NO:2 и, где необязательно полипептид является усеченным с N-конца олигопептидом, где длина делеции имеет размер в пределах от 8 до 15 аминокислотных остатков и, где необязательно остаток триптофана в положении 528 SEQ ID NO:14 заменен на более гидрофильный аминокислотный остаток и, где необязательно к С-концу полипептида добавлен His-таг.
2. Модифицированный полипептид по п.1, где его выбирают из полипептидов SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:20.
3. Модифицированный полипептид по п.2, где он представляет собой полипептид SEQ ID NO:8.
4. Модифицированный полипептид по п.1, являющийся, кроме того, усеченным с N-конца олигопептидом, где длина делеции имеет размер в пределах от 8 до 15 аминокислотных остатков.
5. Модифицированный полипептид по п.4, где он усечен, в частности, по меньшей мере, на 10 аминокислотных остатков и, более конкретно, по меньшей мере, на 12 аминокислотных остатков в N-концевом положении.
6. Модифицированный полипептид по п.4, где он представляет собой полипептид, как представлено на SEQ ID NO:21.
7. Полинуклеотид, кодирующий модифицированный полипептид по любому из пп.1-6.
8. Полинуклеотид по п.7, представляющий собой ДНК.
9. Полинуклеотид по п.7 или 8, где он представляет собой полинуклеотид SEQ ID NO:7.
10. Экспрессирующий вектор, содержащий, по меньшей мере, промотор транскрипции, фрагмент ДНК, кодирующий модифицированный полипептид по любому из пп.1-6 и терминатор транскрипции.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US49094603P | 2003-07-30 | 2003-07-30 | |
US60/490,946 | 2003-07-30 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2006114353A RU2006114353A (ru) | 2007-11-10 |
RU2390525C2 true RU2390525C2 (ru) | 2010-05-27 |
Family
ID=34103000
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006114353/13A RU2390525C2 (ru) | 2003-07-30 | 2004-07-29 | Новая растворимая и стабилизированная тримерная форма полипептидов gp41 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7919100B2 (ru) |
EP (1) | EP1680444A1 (ru) |
CN (1) | CN1860130B (ru) |
RU (1) | RU2390525C2 (ru) |
WO (1) | WO2005010033A1 (ru) |
ZA (1) | ZA200604244B (ru) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007099387A1 (en) | 2006-03-03 | 2007-09-07 | Mymetics Corporation | Virosome-like vesicles comprising gp41-derived antigens |
WO2010042760A2 (en) * | 2008-10-08 | 2010-04-15 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Compositions, methods, and kits for enhancing the immunogenicity of pathogenic antigens |
MX2011007703A (es) * | 2009-02-06 | 2011-09-28 | Mymetics Corp | Antigenos gp41 novedosos. |
EP2393509A1 (en) * | 2009-02-06 | 2011-12-14 | Mymetics Corporation | Splitting gp41 |
GB2471692A (en) * | 2009-07-08 | 2011-01-12 | Complix Nv | HIV gp41-binding single-chain coiled-coil peptide comprising heptad repeats |
CN103073625B (zh) * | 2013-01-21 | 2015-02-18 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种缺失疏水区的人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用 |
WO2021185851A1 (en) | 2020-03-17 | 2021-09-23 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Vaccine compositions for hiv prevention and treatment |
CN112940138A (zh) * | 2021-02-10 | 2021-06-11 | 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 | 三聚体化新冠病毒受体结合域、其制备方法与应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2771011B1 (fr) | 1997-11-17 | 2000-01-28 | Hippocampe | Obtention de vaccins destines a prevenir les effets pathogenes associes a une infection retrovirale |
EP1379646A2 (en) | 2000-10-27 | 2004-01-14 | Abbott Laboratories | Engineered chimera of protein fragments and methods of use thereof |
-
2004
- 2004-07-29 RU RU2006114353/13A patent/RU2390525C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-07-29 US US10/573,704 patent/US7919100B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-29 CN CN200480028485XA patent/CN1860130B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-07-29 WO PCT/IB2004/002433 patent/WO2005010033A1/en active Application Filing
- 2004-07-29 EP EP04744087A patent/EP1680444A1/en not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-05-25 ZA ZA2006/04244A patent/ZA200604244B/en unknown
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LOUIS J.M. et al. Design and properties of N(CCG)-gp41, a chimeric gp41 molecule with nanomolar HIV fusion inhibitory activity. - J. Biol Chem., 2001; v.276, n.31, p.29485-9. ECKERT D.M. et al. Design of potent inhibitors of HIV-1 entry from the gp41 N-peptide region, Proc Nati Acad Sci US A, 2001, v.98, n.20, p.11187-92. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1860130B (zh) | 2012-05-30 |
ZA200604244B (en) | 2012-10-31 |
RU2006114353A (ru) | 2007-11-10 |
US7919100B2 (en) | 2011-04-05 |
WO2005010033A1 (en) | 2005-02-03 |
CN1860130A (zh) | 2006-11-08 |
US20080213292A1 (en) | 2008-09-04 |
EP1680444A1 (en) | 2006-07-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7429653B2 (en) | Stabilized soluble glycoprotein trimers | |
JP3658690B2 (ja) | ウイルスの膜蛋白質の天然ドメインの獲得方法、特にhivに対するワクチンとしてのそれらの使用 | |
JP4925540B2 (ja) | 5−ヘリックスタンパク質 | |
AP1282A (en) | HIV envelope polypeptides and vaccine. | |
EP1149115A1 (en) | METHODS OF ELICITING BROADLY NEUTRALIZING ANTIBODIES TARGETING HIV-1 gp41 | |
US20090203884A1 (en) | Chimeric hiv fusion proteins as vaccines | |
US7048929B1 (en) | Stabilized primate lentivirus envelope glycoproteins | |
US11517616B2 (en) | Composite polypeptide monomer, aggregate of said composite polypeptide monomer having cell penetration function, and norovirus component vaccine for subcutaneous, intradermal, percutaneous, or intramuscular administration and having said aggregate as effective component thereof | |
RU2390525C2 (ru) | Новая растворимая и стабилизированная тримерная форма полипептидов gp41 | |
WO2017013564A1 (en) | A new approach to produce hiv-1 gp140 envelope protein trimers | |
JPH05505616A (ja) | 天然のコンホメーションを保持している精製gp120組成物 | |
EP0728015B1 (en) | Method of producing a set of combinatorial polypeptide antigens | |
CA2431881C (en) | Polypeptide inducing hiv-neutralising antibodies | |
WO2005034842A2 (en) | Peptides useful as hiv fusion inhibitors | |
EP1137786B1 (en) | Virus coat protein/receptor chimeras and methods of use | |
WO2005035555A1 (en) | Hiv/siv env chimeras that promote trimerization and maintain targets of neutralizing antibodies | |
Ximba | Investigation of particulate HIV-1 env vaccine candidates using Zera® and Spytag/Spycatcher technologies | |
Cruz et al. | Enhanced immunogenicity and cross-reactivity of HIV-1 V3-peptide and multiple antigen peptides conjugated to distinct carrier proteins | |
US20220372079A1 (en) | Resurfaced dengue virus and ziki virus glycoprotein e diii variants and uses thereof | |
US6861253B2 (en) | Polypeptide inducing antibodies neutralizing HIV | |
Massi et al. | The antiviral activity of a synthetic peptide derived from the envelope SU glycoprotein of feline immunodeficiency virus maps in correspondence of an amphipathic helical segment | |
Quintana et al. | Antibody response in rabbits against two HIV-1 multi-epitope polypeptides bearing different copies of V3 epitopes fused to the N terminal fragment of N. meningitidis P64K protein | |
EA021191B1 (ru) | НОВЫЕ АНТИГЕНЫ gp41 | |
EA038287B1 (ru) | Стабилизирующие тример мутации белка оболочки hiv | |
Beebe | Peptide vaccine development for the human T-Lymphotropic virus type 1: elicitation of humoral immune responses |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150730 |