KR19980032276A - 서울 바이러스 r22의 뉴클레오캡시드 단백질 유전자, 재조합 플라스미드, 형질전환 대장균, 및 신증후 출혈열 진단제 및 예방백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공지의 서울 바이러스 R22균주로 부터 선별한 뉴클레오캡시드 유전자를 함유하는 발현 플라스미드, 이 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체, 형질전환체를 배양하여 단백질을 발현시키고 이를 정제함으로써, 얻어진 뉴클레오캡시드 단백질, 및 이 단백질을 함유한 신증후 출혈열 진단제 및 예방 백신을 제공한다.

Description

서울 바이러스 R22의 클레오캡시드 단백질 유전자, 재조합 플라스미드, 형질전환 대장균, 및 신증후 출혈열 진단제 및 예방 백신

본 발명의 목적은 한타 바이러스 감염에 의한 신증후 출혈열을 정확, 신속하며 간편하게 진단할 수 있으면서 저렴한 비용으로 구입할 수 있는 새로운 전단제 및 안전하고 효과적인 예방 백신을 개발하는 데 있다.

본 발명은 공지의 서울 바이러스 R22 균주(Song Gan. etc.. The Journal of Infectious Diseases Vo1. 150, P889∼894, 1984)로 부터 선별한 뉴클레오캡시드 유전자를 함유하는 발현 플라스미드, 이 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균, 이 형질전환체를 배양하여 단백질을 발현시키고 정제함으로써 얻어진 뉴클레오캡시드 단백질, 및 이 단백질을 함유한 신증후출혈열 진단용 약제학적 조성물 및 제형 및 예방 백신에 관한 것이다.

버어니아 바이러스과의 한타 바이러스속에 속하는 한타 바이러스에는 10여종의 혈청형이 알려져 있으나 한국에서는 주로 한탄 바이러스와 서울 바이러스가 신증후 출혈열을 유발시키는 원인균으로 알려져 있다. 이들 바이러스는 3개의 세그먼트(S. M. L 세그먼트)로 이루어진 일본쇄 리보핵산 게놈(RNA genomc)을 함유한다. 이중 L 절편 RNA는 RNA 의존형 RNA 폴리머라제를 암호화하고 M 절편 RNA는 당단백질인 G1 및 G2를 암호화하며 S 절편 RNA는 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는데, 여기서 G1, G2 및 뉴클레오캡시드 단백질이 면역반응에 관여하는 것으로 밝혀져 있다.

한타 바이러스 감염에 의한 신증후 출혈열의 효과적인 진단제 및 예방 백신을 개발하고자, 지금까지 바이러스 자체 또는 이들 면역반응에 관여하는 단백질들을 이용한 많은 연구가 이루어져 왔다. 신증후 출혈열은 초기 증상이 감기와 비슷하고 또한 렙토스피라나 리켓치아에 의한 증상과 유사한 점이 많아 임상적 관찰로만은 정확한 진단이 어렵다. 신증후 출혈열의 조기 발견을 통한 치료는 환자가 치명적인 상태에 도달하는 것을 예방할 수 있다. 따라서 신증후 출혈열은 초기의 정확한 진단이 필수적이다. 정확한 진단 방법으로는 혈청학적 진단으로서 환자로 부터 1주일 간격으로 2회 혈액을 채취하여 간접면역형광법에 의한 항체와 한타 바이러스에 대한 중화항체 역가의 상승을 증명함으로써 이루어질 수 있는데 이 방법은 정확하기는 하지만 시간이 최소 1주 길게는 2주 이상 소요되며 세포배양을 수반해야만 하는 번거로움이 수반된다. 따라서 진단에 소요되는 시간을 단축하고 세포배양의 번거로움을 없애기 위해 한타 바이러스의 항원을 사용하여 환자 혈액 중의 항체와의 반응을 통해 환자의 혈액중의 한타 바이러스에 대한 항체를 포착하여 진단하는 방법이 연구되어 왔다. 진단 목적의 바이러스 항원으로는 G1, G2 당단백질과 뉴클레오캡시드 단백질을 생각할 수 있는데 G1, G2 당단백질의 경우는 일단 항체가 형성되면 수십년간 항체가 지속되기 때문에 급성 환자의 진단의 지표로 삼기에는 부적합하다고 할 수 있다. 뉴클레오캡시드 단백질의 경우는 감염 초기에 주요 항원으로 작용하여 신중후 출혈열 환자의 경우 이 단백질에 대한 다량의 항체를 생성하며 항체가 G1, G2 당단백질에 대한 항체처럼 오래 지속되지 않기 때문에 신증후 출혈열 진단 목적의 항원으로 필요 충분한 항원으로 생각할 수 있다.

현재 시중에 판매되고 있는 진단제의 경우 원료인 항원 물질을 세포배양이나 마우스의 뇌에서 바이러스를 증식하여 사용하고 있지만, 진단에 필요한 항원 물질을 세포배양이나 마우스 뇌에서의 증식을 통해 확보하는 경우 작업자의 감염의 위험성과 낮은 수율 및 고비용 등의 제반 문제가 따른다. 따라서 한타 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 유전자 재조합 방법으로 대량 생산하고자 하는 연구들이 진행되어 왔다.

쉬말존(Schmaljohn) 등(J. Gen. Virol. (1988) 69. 777-786)은 베큘로 바이러스 발현 시스템을 이용하여 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 곤충 세포에서 발현시켜 진단제로서 사용 가능성을 시사하였으나 발현량이 충분하지 않았다.

왕(Wang) 등(J. Gen. Virol. (1993) 74, 1115-1124)과 Gott 등(Virus Res. (1991) 19, 1-16)은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 대장균에서 발현하여 진단제로서의 이용 가능성을 보고한 바 있다. 그러나 이러한 연구들은 발현량이 저조하거나 정제 순도가 낮거나 또는 봉합체(inclusion body) 형태로 발현되어 상품화하기에는 부적합하였다.

한편, 신증후 출혈열의 예방 백신을 개발함에 있어서, 바이러스 자체를 약독화 또는 불활화시켜 이용하는 것은 통상 효과면에서 우수한 것으로 알려져 있는 반면, 첫째, 종류에 따라 바이러스 배양 자체가 용이하지 않고 배양액으로 부터의 바이러스 정제가 어려울 수 있으며 정제중 바이러스가 파괴되어 온전한 바이러스를 얻을 수 없는 경우가 많고, 둘째 정제된 바이러스를 백신으로 사용하기 위해서는 포르말린이나 열처리를 통하여 약독화 또는 불활화시켜야 하는데 이 과정에서 백신물질이 변성될 수 있으며, 셋째 백신제조에 있어 가장 중요한 관건이라 할 수 있는 안정성이 미흡한 등의 문제를 안고 있다.

즉, 예를 들어 인슐린 또는 성장호로몬 등과 같이 대장균을 이용하여 생산된 기존의 유전자 재조합 단백질들은 큰 부작용 없이 의약품으로 널리 이용되고 있으나, 1세데 한탄 바이러스 백신의 경우 살아 있는 쥐의 뇌에 바이러스를 접종 배양한 후 쥐의 뇌유액으로 부터 바이러스를 정제하기 때문에 아무리 정제를 잘한다 하더라도 이미 부작용의 소지가 있는 것으로 알려진 쥐 뇌의 베이직 미엘린 단백질(basic myelin protein)을 완전히 제거할 수 없으며 기타 분석되지 않은 쥐 뇌유래의 단백질들이 미량 포함되어 있을 수 있으므로 이들 동물유래 외부 단백질들에 의해 백신의 안전성에 관한 문제가 발생할 가능성이 있다.

따라서, 세포없는 생산체제(Cell free production system)나 유전자조작에 의해 발열반응 등을 일으킬 가능성이 있는 해로운 물질 및 단백질을 포함하지 않도록 면역 단백질의 유전자만을 생체외에서 발현시키려는 노력들이 많이 진행되어 왔다.

이러한 노력의 일환으로, 쉬말존 등의 원형 한탄 바이러스 76-118주의 각 세그먼트에 대한 염기서열 및 유전자 배열을 밝히고 한탄 바이러스의 외피단백질 G1 및 G2를 암호화하고 있는 M 세그먼트를 백시니아 유전자와 결합시켜 동물(Hamster)에 주입시킨 후 한탄 바이러스에 대한 방어효과를 관찰하였으며, 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는 S 세그먼트는 외피단백질의 방어능을 증가시키는 것으로 보고한 바 있다. 또한, 이들은 바큘로 바이러스(Baculovirus)를 이용하여 한탄 바이러스의 G1, G2 및 뉴클레오캡시드 단백질을 곤충세포에서 발현시키고 이 발현 세포를 파쇄하여 얻어진 세포 용해물로 동물에 접종하는 시도를 하였으나 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 의한 직접적이 중화항체 형성은 관찰하지 못하였다.

이와 같이 신증후 출혈열 예방 백신의 제조에 있어 점점 관심이 집중되고 있는 뉴클레오캡시드 단백질은 바이러스의 리보핵산 중 S 세그먼트에서 발현되어 각각의 리보핵산과 결합하여 존재하는 바이러스 구조단백질로서 바이러스 단백질 전체의 대부분을 차지하므로 바이러스 배양 후 대량으로 정제하기가 용이하다는 특성을 지니고 있다. 그러나, 이미 언급한 바와 같이 뉴클레오캡시드 단백질의 중화 등에 관한 연구로는 유전자를 백시니아 바이러스라는 매개체를 이용하여 부여하거나 발현된 뉴클레오캡시드 단백질을 포함하고 있는 전체 세포 용해물을 동물에 투여한 것이 전부일 뿐, 순수분리된 뉴클레오캡시드 단백질을 중화항체 형성의 연구에 사용한 적이 없었으므로 뉴클레오캡시드 단백질에 의한 중화능, 특히 중화항체를 형성하여 신증후 출혈열을 예방할 수 있는 백신물질로서의 가치를 판별할 수 없었다.

또한, 한탄 바이러스 또는 한탄 바이러스속에 속하는 다른 바이러스의 외피 단백질들(G1 및 G2)의 경우에는 이들 단백질이 정제하기 어려울 뿐 아니라 대장균, 효모 또는 동물세포에서 유전공학적 방법으로 대량생산이 가능하지 않았으므로, 바이러스 자체를 백신물질로 사용하는 경우의 많은 문제점에도 불구하고 현재 신증후 출혈열에 대한 예방 백신으로는 포유마우스의 뇌 또는 동물세포에서 바이러스를 직접 배양한 후 이를 포르말린으로 불활화시켜 제조된 백신만이 공급되고 있는 실정이다.

본 발명자들은 바이러스 배양에 따른 안전성이 문제와 세포배양의 번거로움과 고비용 등의 문제를 해결하고 신증후 출혈열 진단에 필요한 항원을 대량으로 생산할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 집중적인 연구를 수행한 결과, 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 유전자의 염기서열을 최초로 분석하였고 유전공학적 방법에 따라 대장균으로 부터 용해된 상태로 뉴클레오캡시드 단백질이 대량 생산할 수 있는 시스템을 개발하고 그 단백질을 정제하는 방법을 확립하였으며, 생산 정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 신증후 출혈열 진단제의 원료로 사용하면 신증후 출혈열에 대한 신속하고, 간편하고, 민감한 진단제로 사용할 수 있음을 발견하였고, 신증후 출혈열 환자의 진단 외에도 신증후 출혈열 백신을 접종한 사람의 항체 형성 여부까지도 판정할 수 있는 즉, 그 용도가 기존의 제품보다 확대된 우수한 진단제의 원료로 사용할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명자들은 본 발명의 목적에 따라서 공지의 서울 바이러스 R22 균주로 부터 내피단백질, 즉 뉴클레오캡시드 단백질의 유전자를 선별하여 대장균내에서 고효율 발현을 완성한 후, 발현된 단백질을 분리, 정제하여 신증후 출혈열 환자의 혈청, 신증후 출혈열 백신 접종자의 혈청과의 반응성을 연구함으로써 진단제로서의 가치를 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 현재의 불활화바이러스 백신에 의한 안정성의 문제를 해결하기 위하여 집중적이 연구를 수행한 결과, 지금까지 순수분리되어 사용된 적이 없는 서울 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 유전공학적 방법에 따라 대장균으로 부터 대량 생산해내고 이를 한탄 바이러스 또는 서울 바이러스 예방 백신의 성분으로 사용하면 신증후 출혈열에 대한 보다 안전하고 예방효과가 우수한 백신을 개발할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명자들이 서울 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 서울 바이러스 뿐 아니라 한탄 바이러스에 의해 야기되는 신증후 출혈열의 예방 백신 성분으로 사용하고자 시도한 것은, 서울 바이러스를 불활화시켜 제작된 백신을 사용하여 동물실험을 수행한 결과 서울 바이러스 뿐 아니라 한탄 바이러스까지 방어할 수 있었다는 연구결과(참조 : Yamanishi. et al.. Vaccine, (1988) 6,278-282)에 착안한 것이다.

즉, 본 발명자들은 서울 바이러스를 구성하고 있는 다양한 단백질의 항원성을 연구해 왔으며, 그 결과 공지의 서울 바이러스 R22 균주로 부터 내피단백질, 즉 뉴클레오캡시드 단백질의 유전자를 선별하여 대장균내에서 발현시킨 후, 발현된 단백질을 분리, 정제하고 순수정제된 단백질의 중화항체형성능을 연구함으로써 백신물질로서의 가치를 확인하였다.

도 1은 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 유전자의 염기서열을 분석하는데 사용된 프라이머의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 2은 도 1에 나타낸 프라이머들의 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 유전자상에서의 위치를 나타낸 것이다.

제 3a는 서울 바이러스 R22와 SR-11의 뉴클레오캡시드 유전자의 염기서열을 비교하여 나타낸 것이다.

도 3b는 서울 바이러스 R22와 SR-11의 뉴클레오캡시드 유전자의 염기서열에서 유추된 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.

도 4는 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 유전자를 합성 증폭하는데 사용된 프라이머들의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 5는 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 유전자를 함유한 발현 플라스미드 pET-sNP의 제조과정을 도식화하여 나타낸 것이다.

도 6은 플라스미드 pET-sNP를 함유한 대장균으로 부터 발현된 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질을 정제하는 방법을 나타낸 것이다.

도 7은 형질전환체 이. 콜라이 BL(pET-sNP)로 부터 발현된 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질의 정제단계별 순도를 나타내는 폴리아크릴아미드겔 전기 영동 사진(a) 및 웨스턴블롯팅(Western blotting) 사진(b)이다. 사진에서 표기된 숫자는 다음을 나타낸다:

1 : 분자량 마커

2 : 암모니움 설페이트로 침전시킨 후 재현탁한 용액

3 : 파쇄한 균체를 원심분리한 후의 상등액

4 : 페닐 세파로즈로 칼럼을 통과한 프로쓰로우(flow through)

5 : 페닐 세파로즈 칼럼의 용출액

도 8은 플라스미드 pET-sNP를 함유한 대장균으로 부터 생산, 정제된 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질을 확인하기 위해, 사람환자 혈액과 단일 클론 항체를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과의 사진이다. 이 사진에서 표기된 부호 a는 환자 혈액을 이용한 웨스턴 블로팅을, b는 항뉴클레오캡시드 단백질 단일군 항체를 이용한 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸다.

도 9는 서로 다른 농도의 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질이 흡착된 니트로셀룰로즈 막과 신증후 출혈열 환자(P) 또는 정상인(N) 혈청과의 반응 결과를 나타낸 사진이다. 사진에서 표기된 숫자는 다음을 나타낸다:

1 : 100μg/㎖d의 뉴클레오캡시드 단백질

2 : 50 μg/㎖d의 뉴클레오캡시드 단백질

3 : 25 μg/㎖d의 뉴클레오캡시드 단백질

4 : 13 μg/㎖d의 뉴클레오캡시드 단백질

5 : 6 μg/㎖d의 뉴클레오캡시드 단백질

도 10은 한탄 바이러스 76-118 또는 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 유전자를 갖는 여러 가지 백터에 의해 형질전환된 대장균으로 부터 발현된 뉴클레오캡시드 단백질을 웨스턴 블롯 분석 사진이다. 이 사진에서 표기된 숫자는 다음을 나타낸다:

1 : 분자량 마커

2 : BL21(pET-3a) 배양추출액

3 : BL21(pET-NP) 배양추출액

4 : BL21(pET-sNP) 배양추출액

5 : BL21(pKK-sNP) 배양추출액

본 발명은 서울 바이러스 R22 뉴클레오캡시드 유전자를 외래유전자로서 함유하는 재조합 발현 플라스미드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기한 본 발명의 제조합 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균을 제공한다. 본 출원인은 이 형질전환체를 한국종균협회에 1996년 9월 9일자로 기탁신청하여 1996년 9월 16일자로 수탁번호 KFCC-10914를 부여받았다.

또한, 본 발명은 이 형질전환제를 적당한 배지에서 배양하고, 분리 및 정제 과정을 거쳐 고수율로 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기한 본 발명의 대장균 형질전환체의 배양액으로 부터 분리되고 정제된 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 신증후 출혈열 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 신증후 출혈열 백신 접종한 사람의 항체형성 여부를 판정하는 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 96공 플레이트에 상기한 본 발명의 뉴클레오캡시드 단백질을 코팅한 진단 제형 및 니트로셀룰로즈 막에 상기한 본 발명의 뉴클레오캡시드 단백질을 흡착시킨 진단 제형을 제공한다.

또한, 본 발명은 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 신증후 출혈열 예방 백신을 제공한다.

또한, 본 발명은 유효량의 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질과 함께 알루미늄하이드록사이드겔, 치메로살, 및 정제젤라틴 중에서 선택된 1종 이상의 약제학적으로 허용되는 첨가제를 함유함을 특징으로 하는 신증후 출혈열 예방 백신을 제공한다.

서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 유전자로 부터 본 발명의 궁극적으로 목적하는 효과적이면서도 정확한 신증후 출혈열 진단제 및 예방 백신을 제조하기 위해서는 먼저 뉴클레오캡시드 유전자의 증폭, 재조합 발현 플라스미드 및 형질전환체의 제조, 형질전환체의 배양 및 뉴클레오캡시드 단백질의 분리, 정제과정을 거쳐야 하며 최종적으로 진단제의 효능성 및 제조된 백신의 효능성을 조사함으로써 발명이 완성될 수 있다.

그런 후, 본 발명에서는 도 4에 나타낸 3가지의 프라이머를 사용하여 2회에 걸친 중합효소 연쇄반응을 수행함으로써 플라스미드에 클로닝하기에 충분한 양의 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 유전자를 확보하였고, 이들 유전자에 공지된 플라스미드 pET-3a(Stratagene사, cat# 211621)에 클로닝될 수 있도록 적절한 제한효소 인식부위를 첨가하였다. 즉, 1차 중합효소 연쇄반응에서 동일하게 NP1 및 NP3의 두 가지 프라이머를 이용하여 증폭시킨 다음, 2차 중합효소 연쇄반응에서는 pET-3a에 삽입하기 위한 유전자 BglII및 EcoRI 인식부위를 함유하도록 NP2 및 NP3를 이용하여 증폭시켰다.

여기서 뉴클레오캡시드 유전자와 재조합시키기 위해 사용된 출발 플라스미드 pET-3a는 s10 유도아미노산 서열의 일부를 포함함으로 이 플라스미드에 클로닝되어 발현된 뉴클레오캡시드 단백질은 아미노 말단에 14개의 아미노산을 더 함유한 융합단백질 형태로 발현된다.

플라스미드 pET-3a에 뉴클레오캡시드 유전자를 클로닝하여 본 발명에서 목적하는 발현 플라스미드 pET-sNP를 제조하기 위한 과정은 도 5에 도식화하여 나타낸 바와 같다. 또한, 이러한 절차에 따라 제조된 각각의 발현 플라스미드를 전기장축격법을 사용하여 숙주세포인 대장균 BL21(DE3)(Stratagene사. cat# 211621)내로 삽입함으로써, 원하는 뉴클레오캡시드 단백질을 대량으로 생산해 낼 수 있는 대장균 형질전화체 E. coli BL(pET-sNP)를 수득하였다. 이 균주는 1996년 9월 9일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁되었으며 기탁번호를 부여받았다(KFCC-10914).

먼저, 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 유전자의 염기서열을 분석하였다. 이 유전자의 염기서열 분석(nucleotide sequencing)은 뉴클레오캡시드 단백질 발현용 재조합 플라스미드 pET-sNP를 템플레이트 DNA(template DNA)로 사용하고 이미 알려진 서울 바이러스 SR-11(Virology 176, pp114∼125. 1990)의 뉴클레오캡시드 유전자의 염기서열에 준해서 도 1과 같은 염기서열의 프라이머들(primers)를 합성하여 사용하였다. 합성된 프라이머들의 뉴클레오캡시드 유전자 상에서의 위치는 도 2와 같다.

염기서열의 분석은 디데옥시법(PNAS 74, p5463. 1977)에 기초하여 파마시아(pharmacia)사의 오토리더시퀸싱 컷트(cat#27-2690-20, cat # 18-1033-13)를 사용하여 분석의 정확성을 위해 5'-말단으로 부터 3'-말단 방향으로 1차 분석하고 3'-말단으로 부터 5'-말단으로 2차 분석함으로써 양방향으로 분석하였으며 겹치게 분석하였다. 분석 결과를 도 3에 나타내었는데 기존에 이미 알려진 서울 바이러스 SR-11의 뉴클레오캡시드 유전자 염기서열 및 여기서 유추된 아미노산 서열을 비교 분석하였다.

서울 바이러스 R22와 SR-11의 뉴클레오캡시드 유전자는 염기서열 상에는 1290개의 염기서열 중 1241개의 염기가 일치하여 96.2%의 유사성을 여기서 유추된 아미노산 서열은 429개의 아미노산 중 423개가 일치하여 98.6%의 유사성을 보였다.

다음 단계로, 본 발명에서는 유전공학분야에서 사용되는 통상의 방법에 따라, 수득된 대장균 형질전환체를 적당한 배지에서 배양하여 단백질을 대량으로 발현시키고, 도 6에 구체적으로 도시한 과정을 수행함으로써 발현된 단백질을 정제하였다. 즉, 암모늄 설페이트 침전법, 겔 여과, 페닐 세파로즈 수지 컬럼을 이용하는 정제방법에 의해 단백질을 순수하게 수득하였으며, 이에 대한 폴리아크릴아미드겔 전기영동 및 웨스턴블롯팅을 수행한 결과는 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같다. 본 발명자들은 이들 결과도로 부터 정제된 단백질이 목적하는 서울 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질임을 확인할 수 있었으며, 특히 전기영동결과로 부터 판단된 정제된 단백질의 순도는 90% 이상이었다.

한편, 발현 플라스미드 pET-sNP로 부터 얻어진 뉴클레오캡시드 단백질의 분자량은 약 50kDa으로 측정되었은데 이는 앞에서 이미 언급한 바와 같이 pET-sNP의 제작에 사용된 pET-3a의 플라스미드 클로닝 부위인 BamlII 부위 앞쪽에 존재하는 s10 리더(leader) 서열에 기인하는 것이다. 즉, pET-sNP로 부터 생산된 뉴클레오캡시드 단백질을 천연상태의 단백질에 비해 N말단 앞쪽에 14개의 아미노산(Met-Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly-Arg-Gly-Ser)을 더 함유하고 있다.

본 발명자들은 발현용 벡터의 영향을 알아보기 위해 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질 발현 벡터로 pET-3a 외에도 매우 강력한 프로모터로 알려진 탁 프로모터(tac promoter)를 가지는 pKK223-3(Pharmacia Biotech사) cat# 27-4935-01을 사용하여 pKK-sNP를 제작하였고, 또한 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질과의 발현량을 비교해 보기 위해 원형 한탄 바이러스 76-118(Virology 155, pp633∼643. 1986)의 뉴클레오캡시드 유전자를 pET-3a에 클로닝한 pET-NP를 제작하였다. PET-NP의 작제 과정은 pET-sNP의 작제 과정에 동일하다. 이들에 대한 발현량은 한탄 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단일군 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였는데 그 결과를 도 10에 나타내었다. 이 결과를 보면 동일한 발현벡터 pET-3a를 사용한 경우 한탄 바이러스 보다는 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질의 발현량이 2배 이상 많은 것으로 나타났는데 이것은 한탄 바이러스와 서울 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 서열의 차이에 따른 대장균체 내에서의 안정성에 기안하는 것으로 판단된다. 또한 동일한 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질의 경우는 pKK223-3보다는 pET-3a를 발현 벡터로 사용하는 것이 월등히 높은 발현량을 보였는데 이것은 pET-3a를 사용하여 발현된 뉴클레오캡시드 단백질의 천연의 뉴클레오캡시드 단백질의 N 말단 앞쪽에 14개의 아미노산을 더 함유한 융합된 형태로 발현되어 대장균 내에서 보다 안정하거나 또는 pET-3상의 s-10 리더시퀸스(leader sequence)가 클로닝된 뉴클레오캡시드 유전자의 전사의 효율을 높이거나 여기서 생성된 mRNA로 부터 단백질을 합성하는 해독(translaton)과정의 효율성을 높임에 기인할 것으로 판단된다.

이상 설명한 방법에 의해 생산된 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질의 진단제 효능성을 조사하기 위해 96공 플레이트 또는 니트로세룰로즈 막에 정제된 항원을 코팅한 것을 진단제로 사용하여 환자 혈청 또는 백신 접종자의 혈청과 반응을 수행하였다. 정확성을 확인하기 위해서는 환자 혈액은 간접면역형광법으로 재확인하였다. 도 9에 나타낸 실험 결과로 부터 사용된 뉴클레오캡시드 단백질은 96공 플레이트를 사용하건 니트로셀룰로즈 막을 사용하건 환자 혈청을 매우 정확히 구분하였으며 백신 접종자의 항체 형성 여부의 판정에도 사용할 수 있음을 확인하였다.

또한, 상기 정제된 뉴클레오캡시드 단백질은 예방 백신의 정제원액으로 사용하여 이 정제원액으로 부터의 최종 백신제품을 제조하기 위한 과정에서 보조재로 알루미늄하이드록사이드 겔을 첨가할 수 있으며, 그 외에도 치메로살 및 정제젤라틴을 첨가할 수 있다. 알루미늄하이드록사이드 겔은 면역보조제로 사용하는데 바람직한 첨가량은 백신제조용 정제원액 0.5㎖ 당 최대 0.625㎎이고, 치메로살은 보조제로서 0.01%(w/v)양으로 사용함이 바람직하며, 정제젤라틴은 안정화제로서 0.02%(w/v)의 양으로 첨가할 수 있다.

본 발명에 따라 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질로 부터 제조된 백신제품은 현재 시판중인 주식회사 녹십자의 한타박스를 비교 백신으로 하여 플라크감소 중화시험법으로 실험한 결과, 훨씬 탁월한 중화능력을 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 백신효능 테스트를 위해 기니픽에 40μg씩 10일 간격으로 3회 접종한 경우에도 별 다른 이상 증상은 발견되지 않았다. 더구나, 본 발명에 따른 백신은 불활화되거나 약독화된 바이러스 자체를 백신물질로 사용함에 따른 안전사고 발생의 소지를 완전히 배제하기 위하여 그로 부터 항원성을 나타내는 것으로 규명된 특정의 단백질 성분, 즉 뉴클레오캡시드 단백질을 유전공학적 방법으로 대량 생산 및 정제하여 백신 물질로 사용하였으므로 신증후 출혈열 예방 백신에 있어서 지금까지 끊임없이 제기 되어온 안정성의 문제를 완전히 해결한 획기적인 발명으로 생각된다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명의 이해를 돕기위해 추가된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1 : 서울 바이러스 R22로 부터 RNA 게놈의 정제 및 cDNA의 합성]

서울 바이러스 R22 균주의 배양액 100μℓ를 취하여 용액 A(4.2M 구아니딘 이소티오시아네이트, 25mM 트리스-HCI(pH8.0), 0.5% 사코실(Sarkosyl), 0.7% β-머캅토에탄올)400μℓ와 혼합하였다. 여기에 용액 B(1M 트리스-HCI (pH8.0), 0.1MDETA, 10% SDS) 50μℓ를 가하고 잘 혼합한 후 65℃에서 5분간 용해시켰다. 혼합용액에 동일부피의 페놀/클로로포름(1 : 1) 혼합액을 가하고 65℃에서 30분 동안 방지한 다음 원심분리하여 상등액만을 취하고, 남은 용액에 다시 용액 A를 300μℓ 더 가하여 65℃에서 5분간 방치한 후 원심분리하였다. 여기서 취한 상등액을 먼저 취한 상등액과 합한 다음, 이를 페놀/클로로포름(1 : 1) 혼합액으로 1회, 클로로포름으로 1회 추출하였다. 추출된 용액에 1/10 부피의 3M 아세트산나트륨 및 2배 부피의 이소프로필알콜을 가하고 잘 혼합한 후 -20℃에서 16시간 보관하였다. 이것을 마이크로 원심분리기에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 침전시키고 침전을 70% 에틸알콜로 2회 세척한 후 건조시켰다. 건조된 침전을 리보핵산 분해효소(RNase)가 없는 멸균수 10μℓ에 용해시킨 다음 4℃에 보관하였다. 리보핵산 5μℓ를 취해 전체 20μℓ 부피에서 cDNA를 합성하였는데, 이때의 반응조건은 하기 표 1에 나타낸 바와 같으며 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

[표 1]

서울 바이러스 R22 RNA 게놈에 대한 cDNA 합성조건

[실시예 2 : 중합효소 연쇄반응에 의한 뉴클레오캡시드 유전자의 증폭]

본 발명에 따라 공지의 플라스미드 pET-3a에 클로닝하기 위한 뉴클레오캡시드 유전자는 도 4에 나타낸 프라이머들을 사용하여 다음에 설명하는 대로 각각 종합효소 연쇄반응에 의하여 증폭시켰다.

플라스미드 pET-3a에 클로닝하기 위한 뉴클레오캡시드 유전자를 증폭시키기 위해서는 먼저 실시예 1 에서 합성한 뉴클레오캡시드의 cDNA가 포함된 용액 5μℓ를 취해 프라이머 NP1 및 NP3를 사용하여 1차 증폭시켰다. 1차 반응한 용액중에는 원하는 뉴클레오캡시드 유전자가 충분하지 않으므로 1차 반응용액 5μℓ를 취하여 프라이머 NP2 및 NP3를 사용하여 2차 중합효소 연쇄반응을 수행하였다.

이때 사용한 프라이머 NP2 및 NP3의 5'말단 쪽에는 각각 BglII(AGATCT) 및 EcoRI(GAATTC)의 제한효소 인식부위가 포함되어 있다.

중합효소 연쇄반응에 사용된 기기는 피킨엘머사(PERKIN ELMER)의 데옥시리보핵산 온도 사이클러(DNA thermal cycler 480)를 사용하였으며, 중합효소 연쇄반응의 조건은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.

[표 2]

중합효소 연쇄반응 용액조성 및 수행절차

[실시예 3 : 발현 플라스미드 pET-sNP의 작제]

뉴클레오캡시드 유전자의 클로닝 과정은 도 5에 나타내었다. 실시예 2의 방법에 따라 증폭된 두 종류의 이본쇄 DNA는 아가로오스겔 전기영동상에서 그 크기를 확인한 후, 1.3kb 크기의 뉴클레오캡시드 유전자를 포함한 DNA 절편을 진크린키트를 사용하여 회수하였다. 회수된 DNA 절편들은 각각 s10 유도아미노산 서열의 일부를 포함하는 플라스미드 pET-3a래로 클로닝하였다. 회수된 DNA 절편중 pET-3a에 클로닝하기 위한 유전자를 제한효소 BglII 및 EcoRI로 이중소화하여, 페놀/클로로포름 혼합액(1 : 1)으로 1회 추출한 뒤 최종 20μℓ의 멸규 증류수에 용해시켰다. 한편, 유전자 운반체인 pET-3a 5μℓ을 EcoRI과 BamlII으로 이중소화한 후 5mM의 EDTA 존재하에 70℃에서 10분간 열처리하고 페놀/클로로포름 혼합액(1 : 1)으로 1회 추출한 뒤 각각 20μℓ의 멸균 증류수에 용해시켰다. 절단된 각 유전자 운반체 5μℓ와 뉴클레오캡시드 DNA 10μℓ를 혼합하여 T4 DNA 리가아제를 이용하여 25℃에서 3시간 동안 반응시켜 접합시킴으로써 본 발명에서 목적하는 발현 플라스미드 pET-sNP의 작제를 완료하였다.

[실시예 4 : pKK-sNP의 작제]

서울 바이러스 R22의 RNA를 주형으로 하여 랜덤 6량체를 프라이머로 사용하여 cDNA를 합성하고 다시 이 cDNA를 주형으로 하여 도 4의 프라이머 NP1과 NP3를 사용하여 1차 DNA를 증폭하고 이것을 다시 주형으로 사용하고 프라이머 NP4와 NP5를 사용하여 2차 증폭하였다. NP4와 NP5에는 pKK223-3에 클로닝하기 위한 제한효소 EcoRI(GAATTC)과 Sall(GTCGAC)의 인식 부위를 각각 포함시켰다.

pKK223-3에 클로닝하기 위해서는 아가로즈 겔로 부터 회수된 DNA를 절편을 먼저 클레노우 효소로 처리하여 양 말단을 평활말단으로 만든 후 EcoRI으로 처리하여 한쪽을 점착말단으로 만들고 pKK223-3은 EcoRI과 SmaI으로 이중 절단하여 상호 접합한 후 JM105에 형질전환시켰다. 당초에는 EcoRI과 Sa1I 부위에 클로닝할 목적으로 DNA 합성 때 한쪽 밀단에 SalI 부위를 포함시켰으나 pKK223-3의 MCS 이 외의 다른 부분에도 또 1개의 SalI 부위가 존재함을 발견하고 SalI 대신 SmaI 부위를 사용하여 평활말단 연결을 시켰다.

[실시예 5 : 형질전환체의 제조]

대장균의 형질전환은 전기장 충격법을 사용하였으며 숙주세포로서는 pET-sNP는 대장균 BL21(DE3)를 사용하였다.

형질전환용 숙주세포를 다량으로 수득하기 위해서 20㎖의 LB 배지에 대장균 BL21(DE3)을 한천 평판배지로 부터 접종하여 37℃에서 18시간 동안 진탕배양하였다. 이것을 1리터의 새로운 LB 배지에 접종하여 600nm의 과장에서 흡광도가 0.5 내지 0.8에 도달할 때까지 37℃에서 진탕배양하였다. 균체를 회수하기 위해 배양액을 0℃에서 20분간 방치한 후 원심분리로 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 1리터의 냉 멸균 증류수로 1회 세척한 후 다시 0.5 리터로 세척하고 최종적으로 20% 글리세롤로 세척하였다. 이를 3㎖의 10% 글리세롤 용액에 재현탁시킨 다음, 분주하여 -70℃에 보관하고 각 형질전환시 1개씩 꺼내어 사용하였다. 전기장 충격법에 사용한 기기는 Bio-Rad사에서 제작한 Gene-Pulser를 사용하였으며, 형질전환 방법은 다음과 같다. -70℃에 보관된 균체 40μℓ와 데옥시리보핵산 2μℓ를 혼합하여 전극 간격이 0.2㎝인 큐벳에 넣고 Gene-Pulser를 정전용량 25μF, 저항 200Ω, 전기장의 세기 12.5kV/㎝에 고정하여 1회 전기장 충격을 가하고 즉시 1㎖의 SOC 배지(2% 박토트립톤, 0.5% 효모엑기스, 10mM NaCl, 2.5mM KC1, 10mM MgCl₂, 10mM MgSO₄20mM 글루코오스)를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 진탕배양한 후 50μg/㎖의 암피실린이 첨가된 2개의 LB 한천평판배지에 각각 0.1㎖, 0.9㎖씩 도말하여 37℃ 인큐베이터에서 12 내지 18 시간 배양하였다. 재조합 플라스미드의 스크리닝은 단일콜로니의 크래킹(cracking)방법을 사용하였다. 즉, 크래킹 버퍼(0.05M Tris(pH6.8), 1% SDS, 2mM EDTA, 0.4M 수크로오스, 0.01% 브로모페놀 블루)80μℓ에 한천평판배지로 부터 1 루프의 균체를 넣고 볼텍스믹서로 현탁하여 마이크로 원심분리기로 12,000rpm에서 15분간 원심분리한 다음 상등액을 취해 아가로오스겔 전기영동으로 원하는 뉴클레오캡시드 유전자 운반체인 pET-sNP 플라스미드를 확인하였다. 또한, 최종적으로 분리한 재조합 플라스미드를 제한효소로 절단하여 확인함으로써 스크리닝을 수행하였다.

[실시예 6 : 형질전환체의 배양]

대장균의 배양을 위해서는 LB 배치(효모엑기스 0.5%, 박토트립톤 1%, NaCl 1%, pH7.0)에 포도당과 엠피실린을 각각 0.5%, 100μg/㎖ 되게 첨가하여 사용하였으며 밤새 배양한 종균액을 새로운 배지 1 리터에 5%되게 접종하여 37℃에서 200rpm으로 진탕배양하였다. 배양액은 흡광도(A₆₀₀)가 0.5 내지 0.8 에 도달했을때 IPTG를 0.1 내지 2mM 되게 첨가하여 4 내지 8시간 동안 더 배양하였다. 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고 0.8% NaCl 용액으로 1회 세턱하였다.

[실시예 7 : 뉴클레오캡시드 단백질의 분리 및 정제]

pET-sNP를 포함한 대장균들로 부터 발현된 뉴클레오캡시드 단백질을 정제하는 방법은 도 6에 간다히 나타내었다. 회수된 균체는 50 내지 100㎖의 TE 완충용액(50mM Tris, 1mM EDTA, pH8.0)에 현탁시키고 초음파기(sonicator)를 사용하여 균체를 파쇄하였는데 파쇄의 정도는 브래드포드 정량(Bradford assay)방법을 사용하여 파쇄액의 단백질 농도가 더 이상 증가하지 않을 때까지 수행하였다. 파쇄된 용액을 8.000×g에서 1시간 동안 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액에 암모늄설페이트를 포화농도의 25 내지 50% 되게 첨가하여 용해시킨 후 상온에서 1시간 동안 방치한 다음 8,000×g에서 다시 30분간 원심분리하여 상등액을 버리고 침전물은 20㎖의 TE 완충용액에 재현탁시켰다. 재현탁시킨 용액중의 암모늄 설페이트를 제거하기 위해 2리터의 TE 완충용액에 2시간씩 2회 투석을 수행하였다. 투석한 용액은 1차로 파마시아사의 세파크릴 S200을 사용하여 켈 필트레이션(filtration)을 수행하고 이것을 페널 세파로즈(pheny1 sepharose) CL-4B 수지를 사용하여 2차 정제하였다. 여기서 셈플의 로딩은 40mM KH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH8.0)의 용액에 황산암모늄을 0.6M이 되도록 첨가하여 사용하였고 용출은 40mM KH₂PO₄/Na₂HPO₄(pH8.0)의 용액을 사용하였다. 이때 대부분의 뉴클레오캡시드 단백질은 프로쓰로우(flow through)로 빠져나왔고 대부분의 대장균 유래의 타 단백질이 제거되었다. 이것을 다시 PBS 완충용액으로 투석하고 단백질을 원하는 농도로 농축하기 위해 아미콘사에서 제작한 센트리콘 또는 센트리프랩을 사용하였다. 각 단계에서의 정제된 단백질은 폴리아크릴아미드겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅을 통하여 확인하였는데 (도 7 참조), 이로 부터 최종적으로 정제된 단백질의 순도는 90% 이상인 것으로 판단되었다.

[실시예 8 : 뉴클레오캡시드 단백질의 웨스턴 블롯팅]

대장균에 발현된 단백질이 서울 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질임을 확인하기 위해 재조합 플라스미드로 부터 발현되어 정제된 단백질에 대해 폴리아크릴아미드겔에서 전기영동을 수행하였으며, 전기영동한 겔로 부터 단백질들을 막에 옮기고 신증후 출혈열 환자의 혈청과 항 뉴클레오캡시드 단백질 단일클론 항체 ht9040을 이용하여 웬스턴 블롯팅(Western blotting)을 수행하였다. 이때, 특이성을 갖는 단백질만의 접착을 위해 막을 5%의 스킴밀크(skim milk)를 포함한 PBS 용액(1리터당 8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g, Na₂HPO₄, 0.24g KH₂PO₄, pH7.4)과 30분간 충분히 반응시킨 후 위에서 언급한 1차 항체와 실온에서 1시간 이상 반응시켰다. 부착되지 않은 항체를 제거하기 위해 PBST 용액(PBS+0.5% Tween 20)으로 막을 3 내지 4회 각각 5 내지 10분간 세척하였다. 세척완료된 막은 정당히 희석되고 피옥시다제(peroxidase)효소가 부착된 항마우스항체G(anti-mouse immunoglobulin G) 및 5% 스킴밀크를 포함한 PBS 용액의 혼합액과 1시간 동안 진탕하여 반응시켰다. 다시금 PBST 용액으로 막을 3 내지 4회 각각 5 내지 10분간 세척한 다음 4-클로로-1-나프톨을 발색시약으로 사용하여 발색반응을 수행한 결과 예상된 위치에서 원하는 뉴클레오캡시드 단백질 특유의 밴드(약 50Kd)를 확인하였다(도 8 참조).

[실시예 9 : 정제된 뉴클레오캡시드 단백질이 흡착된 96공 플레이트를 이용한 ELISA에 의한 진단 연구]

대장균에서 발현된 서울 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 사용하여 엘라이저(ELISA)를 통하여 신증후 출혈열(HFRS) 환자의 혈청을 식별할 수 있는지를 알아보기 위해 본 연구를 수행하였다. 국립보건원으로 부터 얻은 20여명의 환자 혈청과 대조시험군으로 정상인 4명의 혈청을 사용하였다. 먼저 ELA/RIA 96공 플레이트에 각 웰 당 코텅버퍼(50mM NaHCO₃, pH9.0)에 1μg/㎖의 농도로 용해된 뉴클레오캡시드 단백질 용액 100μℓ(각 웰 당 10ng의 뉴클레오캡시드 단백질)을 상온에서 1-2시간 반응시켜 코팅하고 PBS 버퍼로 2회 세척한 후 PBS 버퍼로 제한 회석한 환자 또는 정상인의 혈청을 각 well 당 100μℓ 넣고 상온에서 1시간 반응시켯다.

이것을 다시 PBST 버퍼로 2회 세척한 후 퍼옥시데이즈(peroxidase)가 부착된 2차 항체를 1000배 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 이것을 다시 PBST 버퍼로 2회 세척한 후 1㎎/㎖ OPD(o-페닐렝디아민 디하이드로클로라이드) 및 0.03% H₂O₂가 함유된 0.1M 시트레이트-포스페이트 버퍼(pH 4.9) 100μℓ을 넣어 차광하여 실온에서 20∼30분 후 1M 황산을 50μℓ을 넣어 반응을 정지시키고 엘라이자 리더(ELISA Reader)를 이용하여 490㎚에서 흡광도를 측정하였다. ELISA 값은 490㎚에서 0.2 이상인 최대 희석 배수로 정의하였다. 결과를 표 3에 나타내었다. 신증후 출혈열 환자가 아닌 사람의 내피 단백질에 대한 이뮤노글로블린 G(lgG) ELISA 같은 대부분 100 정도였으나 환자의 경우는 500인 사람이 1명(5%), 1000인 사람이 5명(25%), 1000∼10000인 사람이 10명(50%), 10000이상인 사람이 4명 (20%)의 분포를 보였다. 23번의 경우 대조시험군으로는 ELISA값이 400으로 다소 높게 나타났으나, 이를 제외하고 500 이상을 신증후 출혈열 양성으로 판정한다면 대장균에서 정제한 뉴클레오캡시드 단백질을 사용하여 환자 혈청 중의 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 IgG 값 만을 측정하더라도 100%의 정확성을 보인다고 할 수 있으며 23번 혈청의 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 IgG값(400)을 고려하여 IgG의 ELISA값이 1000을 포함한 그 이상의 값을 가진 경우를 양성으로 판정한다고 해도 95%의 정확도를 가진다고 할 수 있겠다. 그러나 표 3에서 볼 수 있듯이 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 이뮤노글로블린 M(IgM)의 ELISA 값은 환자와 정상인 간에 더 큰 차이를 보여 주었다. 따라서 IgM에 대한 ELISA 값은 측정을 병행한다면 대장균에서 발현된 서울 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질을 이용한 환자 혈청 중의 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체를 ELISA를 통해 측정하는 방법을 신증후 출혈열의 매우 정확한 진단법으로 사용될 수 있을 것이다. 표 3에 IgG/IgM비를 표기하였는데 그 값이 1 이하인 경우는 한타 바이러스 감염 초기 환자로 분류할 수 있겠다. 또한 본 실험의 정확성을 기하기 위해 본 실험에 사용된 모든 혈청에 대하여 간접면역형광법으로 신증후 출혈열 감염 여부를 검사한 결과 표 3에서 볼 수 있듯이 ELISA에 의한 방법과 100% 일치함을 알 수 있었다.

[표 3]

정제된 뉴클레오캡시드 단백질과 환자 혈청과의 ELISA를 통한 반응성 연구

[실시예 10 : 정제된 뉴클레오캡시드 단백질이 흡착된 니트로세룰로즈 막을 이용한 진단 연구]

많은 수의 환자를 일시에 진단하기에는 96공 플레이트를 사용한 ELISA 방법이 간편하겠지만 이 경우는 엘라이자 리더(ELISA reader)라는 장비가 따로 필요하다. 그러나 실제 신증후 출혈열이 많이 발생하는 농촌의 경우 보건소나 의원 등에서 소수에 대해서 간편하게 진단할 수 있는 방법이 필요하다. 따라서 뉴클레오캡시드 단백질을 니트로셀룰로즈 막에 흡착시킨 후 이것을 환자 혈청과 퍼옥시데이즈(peroxidase)가 부착한 항인간 2차 항체와 반응을 통한 발색을 육안으로 관찰함으로써 간단히 진단할 수 있는 방법을 개발코자 본 시험을 수행하였다.

정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 PBS에 100. 50. 25. 13. 6μg/㎖의 농도가 되게 희석한 후 니트로셀룰로즈 막을 이 용액들에 넣고 1시간 동안 가볍게 흔들어 반응시킨 후 다시 PBS 버퍼에 스킴 밀크를 5% 되게 녹인 용액으로 1시간 동안 블록킹시킨 후 30℃에서 4시간 동안 건조하여 환자 혈청을 PBS 버퍼에 500배 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이것을 PBST (PBS, 0.05% Tween20)로 2회 세척한 후 퍼옥시데이즈가 부착된 항인간 2차 항체를 PBS로 1000배 희석하여 1시간 동안 반응시켰다. 다시 막을 PBST 용액으로 2회 세척한 후 발색시약 [0.1M Tris (pH 7.4) 25㎖, 4-chloro-1-naphtol 25㎎(5㎎/㎖ in methanol), H₂O₂3μℓ/50㎖]으로 사용하여 발색반응을 시켰다. 적당히 색깔이 나타나면 반응을 중단시키고 증류수로 세척하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었는데 환자 혈청의 경우 100∼13μg/㎖의 뉴클레오캡시드 단백질 용액에서 뚜렷한 발색을 보였고 6μg/㎖의 뉴클레오캡시드 단백질 용액에서는 희미하지만 발색을 관찰할 수 있었다. 반면 정상인의 혈청과 반응한 경우는 100μg/㎖의 뉴클레오캡시드 단백질에서도 뚜렷한 발색 반응을 보이지 않았다. 따라서 13∼100μg/㎖의 뉴클레오캡시드 단백질 용액에서 뉴클레오캡시드 단백질을 흡착시킨 니트로셀룰로즈 막을 사용하면 신증후 출혈열 환자를 간단히 진단할 수 있을 것으로 판되어 100μg/㎖과 10μg/㎖의 뉴클레오캡시드 단백질 용액을 사용하여 흡착시킨 니트로셀룰로즈 막을 사용하여 20명의 환자 혈청과 4명의 정상인 혈청을 대상으로 동일한 실험을 수행하였으며 모든 혈청은 간접면역형광법을 통해 재확인하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었는데 혈청별로 발색 정도에 차이가 있었지만 이 방법도 간접면역형광법의 결과와 100% 일치하였다.

[표 4]

정제된 뉴클레오캡시드 단백질과 환자 혈청과의 니트로셀룰로즈막을 이용한 반응성 연구

[실시예 11 : 대장균에서 발현된 뉴클레오캡시드 단백질과 신증후 출혈령 백신 접종자혈청과의 반응성 연구]

다음은 시중에서 시판중인 신증후 출혈열 백신인 한타 박스를 2회 접종한 후 1개월 후 채취한 혈액과 접종전의 혈액을 비교하여 대장균에서 발현 정제된 뉴클레오캡시드 단백질과의 반응성을 관찰함으로써, 대장균에서 생산된 뉴클레오캡시드 단백질이 신증후 출혈열에 대한 백신 접종후 한타 바이러스에 대한 항체 형성여부를 판단하는 용도로 사용할 수 있는지를 알아보고자 했다. 방법은 앞의 실시예 8과 실시예 9에서 행한 동일한 방법을 사용하였고 혈청만 백신 접종자의 혈청으로 대체하였다. 니트로셀룰로즈 막에 흡착시키기 위한 뉴클레오캡시드 단백질의 농도는 10μg/㎖로 하였다.

10명의 백신 접종자에 대한 결과를 표 5에 나타내었는데 ELISA에 의한 결과와 니트로셀룰로즈 막을 이용한 결과가 일치함을 알 수 있었다. 결과를 보면 10명의 접종자 중 9명은 한탄 바이러스에 대한 항체가 어느 정도 이상 형성되었으나 10번 접종자의 경우는 ELISA값이 1000 이하로 나타났으며 니트로셀룰로즈 막에서도 음성으로 나타나 한탄 바이러스에 대한 항체가 충분히 형성되지 않았음을 알 수 있다.

이상의 실험결과로 대장균에서 발현, 정제된 뉴클레오캡시드 단백질이 신증후 출혈열 백신 접종 후 항체 형성 여부의 판정에 적합한 항원으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

[표 5]

뉴클레오캡시드 단백질과 백신 접종자 혈청과의 반응성

[실시예 12 : 정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하여 제조된 백신의 효능성 조사]

실시예 6에서 정제된 백신 정제원액 0.5㎖당 보조제인 알루미늄 하이드록사이드 겔을 0.625㎎의 배합비로 첨가하고 4℃에서 15일간 정치시켰다. 그 후, 0.01%(w/v)치메로살과 0.02% 정제젤라틴을 가하여 최종 시험백신을 제조하였다.

이와 같이 제조된 시험백신의 중화 효능을 조사하기 위해 기니픽을 대상으로 실험하였으며, 비교백신으로는 현재 국내에서 시판되고 있는 백신(쥐의 뇌에서 배양된 바이러스를 불활화시켜 제조한 것임)을 사용하였다. 이때, 항원은 10μg/0.5㎖, 20μg/0.5㎖ 및 40μg/0.5㎖의 3가지 농도로 기니픽에 접종시켰고, 시험백신과 비교백신을 기니픽에 접종한 후 얻어진 기니픽의 혈청을 플라크 감소 중화시험법으로 검사함으로써 백신의 면역원성을 판정하였다. 플라크감소 중화시험은 아래 서술된 바와 같이 진행되었다.

1) 플라크 감소 중화시험을 위한 항체를 얻기 위하여, 3가지의 서로 다른 농도로 제조된 상기 시험백신과 비교백신을 기니픽에 10일 간격으로 3회 피하접종(0.5㎖/접종)하였다.

2) 기니픽으로 부터 혈청을 채취하여 56℃에서 30분간 비동화 처리한 후 3% 우태아혈청을 함유하는 유지용 배지(MEM+M199 = 1:1)를 사용하여 각각 1:10, 1:20, 1:40 및 1:80으로 희석하였다.

3) 희석시킨 혈청과 70PFU/배양용기(직경 6㎝)로 되도록 희석시킨 한탄 바이러스 공격균주 76-118을 동량씩 시험관에서 혼합한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

4) 미리 준비된 6㎝의 세포배양 용기에서 단중배양한 배로 E6 세포에 상기 혼합액을 0.2㎖씩 접종한 다음 37℃에서 90분간 반응시켰다.

5) 반응 후 접종액을 제거하고 각 배양용기당 5㎖씩의 1차 한천중층배지(Agarose overlay)를 분주하였다. 1차 한천중층배지의 조성은 다음과 같다.

M199 50㎖

우태아 혈청10㎖

7% NaHCO₃3㎖

아가로오스0.8g

증류수50㎖

이때 M199는 피놀레드를 함유하지 않은 배지로 사용하였으며 우태아 혈청은 56℃에서 30분간 열처리한 것을 사용하였다.

6) 1차 한천중층이 끝나면 각기 접종된 세포들을 37℃에서 10 내지 11일간 배양하였다.

7) 배양 후 각 배양용기당 3 내지 3.5㎖씩 2차 한천중층배지를 분주하였으며 2차 한천중층배지의 조성은 다음과 같다.

M199 배지50㎖

400mM MES10㎖

(2-(N-Morpholino)ethane sulfonic acid, monohydrate)

5% BSA5㎖

0.6% 중성적(neutral red)1㎖

1N NaOH1.5㎖

아가로오스0.7g

증류수32.5㎖

8) 2차 한천중층이 끝나면 3일간 배양한 후 직경 2㎜ 정도의 플라크 수를 관찰하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

[표 6]

정제된 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질로 부터 제조된 시험백신의 중화역가 시험

상기 표 6의 결과로 부터 알 수 있는 바와 같이, 정제된 뉴클레오캡시드 단백질을 이용하여 제조된 시험백신의 경우 40㎍/0.5㎖ 및 20㎍/0.5㎖의 농도에서는 비교 백신에 비해 탁월한 중화능력을 나타내었으며, 10㎍/0.5㎖의 농도에서는 동등한 중화능력을 나타내었다.

따라서, 공지균주인 서울 바이러스 R22에 항원성을 나타내는 물질중 하나인 뉴클레오캡시드 단백질을 유전공학적 방법으로 대량생산하여 제조된 본 발명의 백신은 기존의 백신에 비해 신증후군 출혈열에 대하여 뛰어난 면역원성을 지니고 있을 뿐 아니라, 특히 독성물질이 필연적으로 함유되게 마련인 바이러스 자체를 백신물질로 사용하지 않고 성분이 규명된 단일 단백질을 백신 물질로 사용함으로써 백신제제의 독성문제를 완전히 해결한 우수한 백신이다.

Claims (8)

1. 하기 서열을 갖는 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 유전자 :
2. 제 1 항에 따른 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 유전자를 함유하는 재조합 발현 플라스미드.
3. 제 2 항에 있어서, 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 유전자를 백터 pET-3a 내로 삽입시켜 제조된 발현 플라스미드 pET-sNP인 재조합 발현 플라스미드.
4. 제 2 항에 따른 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 대장균 형질전환체.
5. 제 4 항에 있어서, 발현 플라스미드 pET-sNP로 이 콜라이 BL21(DE3)을 형질전환시켜 생성된, 이 콜라이 BL(pET-sNP)(기탁번호 : KFCC-10914)인 대장균 형질전환체.
6. 제 4 항에 따른 대장균 형질전환체의 배양액으로 부터 분리, 정제된 하기 아미노산 서열을 갖는 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질 ;
7. 제 6 항에 따른 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질을 함유함을 특징으로 한 신증후출혈열 진단용의 약제학적 조성물.
8. 제 6 항에 따른 서울 바이러스 R22의 뉴클레오캡시드 단백질을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 신증후 출혈액 예방 백신.