CN117281898A - 一种复合佐剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以脂质体为载体的复合佐剂及其制备方法和应用。其中复合佐剂由两种TLR激动剂联合，主要由TLR3激动剂和TLR4激动剂联合，可同时激活以上两种TLR信号通路，更高效地激活先天免疫系统。本发明亦提供一种免疫组合物，包含上述复合佐剂和抗原。所述复合佐剂和抗原联用，能显著增强疫苗的细胞免疫反应。本发明的复合佐剂成本低、制备简单，安全性好，可作为多种疫苗的候选佐剂。

Description

一种复合佐剂及其制备方法和应用
技术领域
本申请属于生物医药工程领域，特别涉及一种复合佐剂及其制备方法和其在免疫治疗及预防领域的应用。
背景技术
Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)是表达于多种细胞表面的一类模式识别受体，可以识别病原体，如细菌、病毒和寄生虫等的分子模式。人类共有10类TLR受体，分别识别高度保守的微生物分子模式，如脂多糖(TLR4受体识别)、脂肽(TLR2识别)、鞭毛蛋白(TLR5识别)、单链或双链RNA(TLR7/8，TLR3识别)和含有CpG基序的DNA(TLR9识别)等。
TLR4是目前研究较为深入的TLR，属于Ⅰ型跨膜蛋白，其配体包括革兰阴性菌脂多糖(LPS)及其衍生物单磷酰脂A(MPLA)等。TLR4激动剂或单独应用，或作为复合佐剂的主要组分，或与其他TLR激动剂联合使用，已广泛用于多种疫苗的研发，展现良好的应用前景。
就不同的TLR激动剂联合使用而言，复合佐剂的制剂形式、复合组分的选择以及配伍的抗原种类均是能够对佐剂活性和疫苗效果产生重大影响的重要因素，因此，采用不同配方制备的复合佐剂，其佐剂活性是难以预测的，需要实验验证。发明人将本发明所述的两种TLR激动剂，特别是TLR3和TLR4激动剂，即Poly I:C和MPL按一定比例混合入脂质体制剂体系后与水痘带状疱疹疫苗联合免疫，发现两种类型的TLR激动剂优势互补，有效地活化了特异性的细胞免疫反应。因此，采用这种策略获得的复合佐剂具有很好的应用前景，可望同时应用于预防性疫苗及治疗性疫苗领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的安全性和免疫刺激活性好，具有人体应用前景的复合佐剂及其制备方法和应用。将TLR3激动剂和TLR4激动剂以最佳的联用方式制备复合佐剂，可同时激活以上两种TLR信号通路，更高效地激活先天免疫系统。
本发明人经研究出人意料地发现，采用恰当的配伍方式将TLR3激动剂和TLR4激动剂制备于脂质体制剂中作为复合佐剂，具有更强的免疫刺激活性，且与带状疱疹病毒疫苗联合应用，可显著提高疫苗的免疫原性，产生远高于包含其他任意两种TLR激动剂的脂质体制剂的免疫刺激活性。
本发明的技术方案如下：
本发明一方面提供一种复合佐剂，其在脂质体制剂中包含两种不同的TLR激动剂。
在一些实施方式中，所述TLR激动剂包括TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR7/8激动剂或TLR9激动剂。
在一些实施方式中，所述TLR激动剂优选为TLR3激动剂和TLR4激动剂。
在一些实施方式中，所述TLR3激动剂和TLR4激动剂的质量比为(1:1)～(30:1)，在一些优选的实施方式中，所述TLR3激动剂和TLR4激动剂的质量比为1:1、5:1或30:1。
在一些实施方式中，所述TLR3激动剂选自Poly I:C、Poly ICLC和Poly I:C12U中的一种。
在一些优选的实施方式中，所述TLR3激动剂是Poly I:C，其分子量介于66,000至1200,000道尔顿之间，例如，75,000至1100,000道尔顿之间、96,000至950,000道尔顿之间、150,000至550,000道尔顿之间，特别是从66,000至660,000道尔顿之间。
在一些实施方式中，所述TLR4激动剂选自革兰阴性菌脂多糖LPS、3D-单磷酰脂质A(MPL)、吡喃葡萄糖基脂质A(GLA)、热休克蛋白、纤维蛋白和盘尾丝虫的活化相关蛋白(Ov-ASP-1)中的一种。
在一些优选的实施方式中，所述TLR4激动剂是MPL。
在一些实施方式中，每人用剂量复合佐剂包含MPL 25-50μg，PolyI:C 25-1500μg，优选MPL 25μg、PolyI:C 25μg，MPL 50μg、PolyI:C 250μg或MPL 50μg、PolyI:C 1500μg。
在一些实施方式中，所述复合佐剂进一步还包含选自肽聚糖、脂磷壁酸、咪喹莫特、瑞喹莫特、CpG-ODN和细菌鞭毛蛋白中一种或多种的TLR激动剂。
在一些实施方式中，所述复合佐剂可以在脂质体制剂中包含例如TLR4激动剂联合TLR3激动剂和TLR9激动剂、TLR3激动剂联合TLR7/8激动剂和TLR9激动剂的复合形式。
在一些实施方式中，所述复合佐剂还可以在脂质体制剂中包含例如TLR4激动剂联合TLR9激动剂、TLR4激动剂联合TLR7/8激动剂、TLR4激动剂联合TLR1/2激动剂或TLR7激动剂联合TLR9激动剂的复合形式。
在一些实施方式中，所述复合佐剂还包含一种或多种额外的免疫刺激剂，所述的免疫刺激剂包括皂苷或其衍生物。
在一些实施方式中，所述皂苷衍生物选自QS-7、QS-17、QS-18和QS-21中的一种或几种，优选为QS-21。
在一些实施方式中，所述脂质体制剂包含单一/多类型脂质和固醇。
本发明第二方面公开一种复合佐剂，在脂质体制剂中包含TLR3激动剂和TLR4激动剂，所述复合佐剂包括：
a)由DOPC组成的脂质；
b)胆固醇；和
c)MPL与PolyI:C，
其中所述DOPC组成的脂质与胆固醇的重量比是3-5:0.8-1.2，胆固醇与MPL的重量比是4-6:0.8-1.2，MPL与PolyI:C的重量比是1:1-1:30。
本发明所述的复合佐剂，其中每人用剂量中所述DOPC重量为800-1200μg，胆固醇的重量为200-300μg，MPL的重量为25-50μg，PolyI:C的重量为25-1500μg。
在一个实施例中，本发明所述的复合佐剂，其中每人用剂量中所述DOPC重量为1000μg，胆固醇的重量为250μg，MPL的重量为25-50μg，PolyI:C的重量为25-1500μg。
在一个实施例中，本发明所述的复合佐剂，其中每人用剂量中所述DOPC重量为1000μg，胆固醇的重量为250μg，MPL的重量为25μg，PolyI:C的重量为25μg。
在一个实施例中，本发明所述的复合佐剂，其中每人用剂量中所述DOPC重量为1000μg，胆固醇的重量为250μg，MPL的重量为50μg，PolyI:C的重量为1500μg。
在一个实施例中，本发明所述的复合佐剂与抗原组成免疫原性组合物，其中每人用剂量中所述DOPC重量为1000μg，胆固醇的重量为250μg，MPL的重量为50μg，PolyI:C的重量为1500μg。
在一个实施例中，抗原为水痘带状疱疹病毒糖蛋白gE，用量为每人份剂量20-100μg。
本发明第三方面还公开一种包含阳离子的复合佐剂，在复合佐剂的脂质体制剂中包含TLR3激动剂和TLR4激动剂，所述复合佐剂包括：
a)由DOPC和DOTAP组合的脂质混合物；
b)胆固醇；和
c)MPL与PolyI:C，
其中DOPC与DOTAP的重量比为9:1或19:1，脂质混合物与胆固醇的重量比是3-5:0.8-1.2，胆固醇与MPL的重量比是4-6:0.8-1.2，MPL与PolyI:C的重量比是1:1-1:30。
本发明所述的复合佐剂，其中每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为800-1200μg，胆固醇的重量为200-300μg，MPL的重量为25-50μg，PolyI:C的重量为25-1500μg。
本发明所述的复合佐剂，其中每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg，胆固醇的重量为250μg，MPL的重量为25-50μg，PolyI:C的重量为25-1500μg。
在一个实施例中，本发明所述的复合佐剂，其中每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg，胆固醇的重量为250μg，MPL的重量为25μg，PolyI:C的重量为25μg。
在一个实施例中，本发明所述的复合佐剂，其中每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg，胆固醇的重量为250μg，MPL的重量为50μg，PolyI:C的重量为1500μg。
在一个实施例中，本发明所述的包含阳离子的复合佐剂与抗原组成免疫原性组合物。在一个优选的实施例中，抗原为水痘带状疱疹病毒糖蛋白gE，用量为每人份剂量20-100μg。每人用剂量佐剂中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg，胆固醇的重量为250μg，MPL的重量为50μg，PolyI:C的重量为1500μg。
在一些实施方式中，所述脂质体制剂包含不同的阳离子型脂质和固醇。
在一些实施方式中，阳离子型脂质是二油酰丙基氯化三甲铵DOTMA、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵DOTAP、DOP-DEDA、DODMA、DMG-PEG2000或DLin-MC3-DMA。
在一些实施方式中，所述脂质体制剂包含阴离子型脂质和固醇。
在一些实施方式中，所述脂质体制剂包含两性离子和固醇。
在一些实施方式中，所述脂质体制剂包含中性脂质和固醇。
在一些实施方式中，所述中性脂质是选自蛋黄磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂酰基磷脂酰胆碱的磷脂酰胆碱，优选为DOPC。
在一些实施方式中，所述固醇是胆固醇。
在一些实施方式中，所述脂质体制剂进一步包含选自乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、马来酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和Tris的缓冲剂。
在一些优选的实施方式中，所述缓冲剂是磷酸盐缓冲溶液，如PBS。
本发明第四方面提供一种免疫原性组合物，包括上述的复合佐剂及抗原，任选的，所述抗原来源于细菌、病毒、寄生虫、真菌、肿瘤、人体自身抗原和/或变态反应原的抗原；优选地，所述抗原来源于人免疫缺陷型病毒、人乳头瘤病毒HPV、水痘带状疱疹病毒、人单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、乙肝病毒、手足口病毒、柯萨奇病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、冠状病毒和新冠病毒SARS-CoV-2中的至少一种。
在一些实施方式中，所述抗原来源于水痘带状疱疹病毒。
在一些优选的实施方式中，所述抗原为病毒来源的重组蛋白抗原和/或多肽或表位抗原，优选为水痘带状疱疹病毒gE重组蛋白。
水痘带状疱疹病毒(VZV)是八种人类疱疹病毒之一，即3型人疱疹病毒。VZV糖蛋白E(glycoprotein E，gE)亚单位疫苗是目前的水痘疫苗的主流研究方向，gE由病毒的ORF68基因编码，1872个碱基组成的该基因位于VZV基因组短片段区。在利用现代生物分子学技术制备重组VZV gE蛋白时，一般将截短gE蛋白，使其缺少羧基端疏水锚区。葛兰素史克开发的Shingrix是一种基于重组gE蛋白辅以新型佐剂AS01B的亚单位疫苗，三期临床试验数据显示该亚单位疫苗在老年人中有着优于Zostavax的免疫原性和有效性，并于2017年获FDA批准上市。VZV gE蛋白的制造通常是通过在培养细胞中表达或通过化学合成来实现。常常使用并且适合用于产生蛋白质的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、昆虫以及哺乳动物。如本文中所使用的，抗原为gE蛋白的1-546aa，gE蛋白是本领域技术人员公知的(参见，例如NCBIGenbank数据库登录号：Q9J3M8)。
利用现代分子生物的常规技术手段可轻易地获得上述抗原，典型的方法包括：
(1)将本发明的gE蛋白基因(经密码子优化)克隆入表达载体中；
(2)将步骤(1)所得的表达载体转染至CHO细胞中；
(3)通过细胞群筛选和单克隆筛选，获得稳定表达gE蛋白的细胞株；
(4)使用步骤(3)所得的细胞株进行表达，获得VZV gE蛋白。
将上述获得的蛋白，经常规的处理方式，例如疏水层析、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析等可获得较纯的抗原蛋白。
在一些实施方式中，所述抗原来源于冠状病毒，例如中东呼吸综合征冠状病毒(MERS CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS CoV)，尤其是新型冠状病毒SARS-CoV-2。
SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域(RBD)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域。RBD作为疫苗能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)N端结构域(NTD)为病毒S蛋白N端的一段序列，其可与宿主细胞的蛋白或糖蛋白结合，介导病毒入侵宿主细胞，故该段区域可能包含诱导中和抗体产生的表位。为了开发本发明的目的，在本发明的实施例中，发明人采用了一种包含SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的受体结合结构域(RBD)或其功能活性片段和/或SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)N端结构域(NTD)或其功能活性片段的融合蛋白作为抗原。所述融合蛋白进一步包含foldon结构域或其功能活性片段。
在一些实施方式中，所述抗原选自HPV6、11、18、31、33、45、52、58、68型中的至少一种。
HPV的衣壳是由主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2组成。已上市疫苗都是基于HPVL1病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)为抗原的疫苗，通过基因重组表达的L1蛋白可在一定条件下形成类似病毒的颗粒，有着较好的免疫原性。在NCBI数据库中，已有许多现有的HPV各型L1 VLP蛋白(HPV 16L1、18L1、6L1、11L1、31L1、33L1、45L1、52L1、58L1)序列可供本领域技术人员进行选择，这些序列均可以作为抗原蛋白的理想选择基础。为了开发本发明的目的，在本发明的实施例中，发明人大部分采用了从现有技术中具有高度的保守性的序列，具体情况如下：HPV 6L1的氨基酸序列已于1995年在NCBI数据库中收录，登录号为AAA74218；HPV 11L1的氨基酸序列已于1994年在NCBI数据库中收录，登录号为AAA46935；HPV 16L1的氨基酸序列已于1998年在NCBI数据库中收录，登录号为AAC09292.1；HPV 18L1蛋白的氨基酸序列已于2003年在NCBI数据库中收录，登录号为AAQ92369.1；HPV 31L1蛋白的氨基酸序列已于1994年在NCBI数据库中收录，登录号为AAA46956；HPV 33L1蛋白的氨基酸序列已于2009年在NCBI数据库中收录，登录号为ACL12333.1；HPV 45L1蛋白的氨基酸序列已于2009年在NCBI数据库中收录，登录号为ABP99831.1(截短了N端26个氨基酸，上述26个氨基酸为疏水区，疏水区可能影响L1蛋白形成VLP，故而截短)；HPV52 L1蛋白的氨基酸序列已于2005年在NCBI数据库中收录，登录号为CAA52590.1(截短了N端27个氨基酸，上述27个氨基酸为疏水区，疏水区可能影响L1蛋白形成VLP，故而截短)；HPV 58L1蛋白的氨基酸序列已于2009年在NCBI数据库中收录，登录号为CAX48979.1。
利用现代分子生物的常规技术手段可轻易地获得上述抗原，典型的方法包括：在毕赤酵母中表达上述HPV各型L1 VLP蛋白的方法，包括下述步骤：
(1)将本发明的HPV各型L1蛋白基因(经密码子优化)克隆入表达载体中；
(2)将步骤(1)所得的表达载体转化至毕赤酵母宿主菌中；
(3)通过菌株筛选，获得稳定表达HPV各型L1蛋白的菌株；
(4)使用步骤(3)所得的菌株进行表达，获得HPV各型L1蛋白。
将上述获得的蛋白，经常规的处理方式，例如疏水层析、阴离子交换层析、羟基磷灰石层析等可获得较纯的抗原蛋白。
需要说明的是，使用毕赤酵母表达系统稳定表达HPV各型L1蛋白的方法是本领域众所周知的方法，具体可参照《分子克隆试验指南》及其他一些文献。本领域技术人员也可以选择例如大肠杆菌、酿酒酵母、汉逊酵母、CHO细胞、昆虫细胞等在内的其他表达方式获得HPV各型L1蛋白。
本发明第五方面还提供一种上述免疫原性组合物的制备方法，包括以下步骤：
(a)将MPL、脂质和胆固醇溶于有机溶剂，通过梯度减压旋蒸获得脂质薄膜；
(b)在脂质薄膜中加入磷酸盐水溶液，水浴旋转水化得到悬浮液；
(c)特定浓度的悬浮液经均质获得脂质体，并经过滤器过滤得到浓缩脂质体；
(d)Poly I:C溶解于生理盐水获得Poly I:C溶液；
(e)将浓缩脂质体和Poly I:C溶液混匀，得到复合佐剂；
(f)将抗原与复合佐剂充分混匀配制成免疫原性组合物。
在一些实施方式中，步骤(a)具体为通过梯度减压旋蒸制备脂质薄膜，即第一组分。称量一定质量的DOPC，胆固醇以及单磷酰脂质A(MPL)，加入一定体积的有机溶剂(例如乙醇、异丙醇或其混合物)，在20～30℃水浴中溶解；然后在20～30℃水浴温度中通过梯度减压旋蒸1～4小时获得脂质薄膜。
在一些实施方式中，步骤(b)具体为通过薄膜分散法制备悬浮液。在脂质薄膜中加入50mL磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，以75rpm～120rpm，在25℃水浴中旋转水化得到悬浮液。
在一些实施方式中，步骤(c)中为获得较好的粒径均匀性，减少均质次数，均质压力设为80MPa～160MPa，在单一均质压力或梯度压力下均质5-20次，均质后获得的脂质体进行减菌过滤，最终获得浓缩脂质体。
在一些实施方式中，减菌过滤时应采用孔径0.45微米或0.22(或以下)微米的过滤器，以获得可接受的微生物污染水平。常用的过滤器为聚醚砜(PES)材质，其中的PES膜由聚醚砜超细纤维热熔连在一起制成，其物理、化学性能稳定，具有很好的相容性。
为防止均质时产热而造成的脂质体质量下降，均质机的冷水循环温度一般不高于20℃。
在一些实施方式中，步骤(e)还包括加入磷酸盐水溶液使浓缩脂质体稀释。
在一些实施方式中，脂质体的制备还可以采用微流控的方式。
在一些实施方式中，所述微流控的方式包括在微流控装置中混合包含溶剂、DOPC、胆固醇和MPL的第一溶液以及包含水和Poly I:C的第二溶液，和除去溶剂的步骤。
本发明的实施例中使用的主要试剂信息如下表。
本发明提供了一种以脂质体为载体，将TLR3激动剂和TLR4激动剂以最佳的配伍方式联用的复合佐剂及其制备方法和应用。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)免疫诱导效力强，使用“脂质体、联合的TLR激动剂(尤其是本发明的MPL联合Poly(I:C))和免疫原”共同作用时，可以引起针对蛋白免疫原的强烈的细胞免疫反应。
(2)生物相容性好，相比于传统的铝佐剂，本发明的以脂质体为载体的TLRs激动剂复合佐剂，由于使用了中性脂质和胆固醇，使得制备的复合佐剂具有良好的生物相容性。
(3)原料易获得，成本低。相比应用于水痘带状疱疹病毒疫苗的AS01B佐剂，本发明的复合佐剂组分原料较易获得，制备工艺简单且成本低，不易造成自然资源浪费。
(4)本发明的无阳离子脂质组的8小组的平均粒径是85.19nm，平均PDI是0.30；9:1阳离子脂质组的8小组的平均粒径是97.79nm、平均PDI是0.378；而19:1阳离子脂质组的8小组的平均粒径是80.33nm、平均PDI是0.242，说明三组的平均粒径均在80-100nm之间，粒径小且均匀，特别是19:1阳离子脂质组，具有易于制备，稳定性、流动性均较好，易于注射等不可替代的优点。
具体实施方式
下面将通过非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围，因为实施方案必然是多样的。本说明书中使用的用语仅是为了阐述特定的实施方案，而非作为限制，本发明的范围已界定在所附的权利要求中。
除非特别说明，本说明书中所使用的所有技术和科学用语均和本案所属技术领域的技术人员所普遍明了的意义相同。下面就本发明的优选方法和材料加以叙述，但是与本说明书中所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用以实施或测试本发明。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法或产品说明书所描述的方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
术语定义
在本申请中，提及“一个实施例”时均意指在该实施例中描述的具体参数、步骤等至少包含在根据本发明的一个实施例中。因而，在本申请中，若采用了诸如“根据本发明的一个实施例”、“在一个实施例中”等用语并不用于特指在同一个实施例中，若采用了诸如“在另外的实施例中”、“根据本发明的不同实施例”、“根据本发明另外的实施例”等用语，也并不用于特指提及的特征只能包含在特定的不同的实施例中。本领域的技术人员应该理解，在本发明说明书的一个或者多个实施例中公开的各具体参数、步骤等可以以任何合适的方式组合。
在本申请中，术语“佐剂”是指在临床上可应用于人体或具有人体应用前景的具有增强免疫反应功能的物质，包括当前已获批准的和将来可能获得批准的各种佐剂，例如但不限于铝佐剂、MF59及各种形式的佐剂组合物。
在本申请中，术语“脂质体”是本领域中是众所周知的，并且定义一般类别的囊泡，其包含围绕水性空间的一个或多个脂质双层。因此，脂质体由一个或多个脂质和/或磷脂双层组成，并且可以在其结构中含有其他分子，诸如蛋白或碳水化合物。因为存在脂质相和水相两者，脂质体可以包封或捕获水溶性材料、脂溶性材料和/或两亲性化合物。
脂质体大小可以从30nm至几μm变化，这取决于磷脂组成和用于其制备的方法。本发明的脂质体含有磷脂酰胆碱脂质，或基本上由磷脂酰胆碱脂质和固醇组成。
合适地，本发明的脂质体含有DOPC，或基本上由DOPC和固醇组成。
在本发明中，脂质体大小将在50nm至200nm的范围内，特别是60nm至180nm，诸如70-165nm。最佳地，脂质体应当是稳定的并且具有～100nm的直径以允许通过过滤方便地灭菌。
脂质体的结构完整性可以通过方法诸如测量脂质体的大小(Z-平均直径，Zav)和多分散性的动态光散射(DLS)，或通过用于分析脂质体结构的电子显微镜来评价。合适地，平均粒径在80和100nm之间，和/或，多分散性(PdI)指数不大于0.4，尤其是不大于0.3，诸如不大于0.25。
在一些情况下，溶剂和某些额外组分的存在可以影响脂质体大小。因此，在除去溶剂和并入任何额外组分之后，合适地测量脂质体大小。
在本申请中，术语“道尔顿”为国际通用原子质量单位，可通过下列比例将道尔顿表示的核酸分子量换算成bp表示的核酸分子量：长度为1bp的核酸分子量等同于660道尔顿。
在本申请中，术语“TLR4激动剂”合适实例是脂多糖，合适地脂质A的无毒衍生物，特别是单磷酰脂质A，且更特别是3-脱-O-酰化的单磷酰脂质A(MPL)。MLA(MPL)和3D-MLA(MPL)已知并且不需要在本文中进行详细描述。参见例如1984年3月13日发布并转让给Ribi免疫化学制剂研究公司(Ribi ImmunoChem Research,Inc.)的美国专利号4,436,727，所述专利公开单磷酰脂质A及其制造。Myers等人的也转让给里比免疫化学制剂研究公司的美国专利号4,912,094和再审查证书B1美国专利号4,912,094体现3-脱酰单磷酰脂质A及其制造方法。还参见例如GB 2220211和WO 92/116556。从GB 2220211(Ribi)处已知3-脱氧酰化单磷酰脂质A。在化学方面，其是3-脱氧酰化单磷酰脂质A与4、5或6个酰化链的混合物并且由Ribi免疫化学蒙大那公司(Ribi Immunochem Montana)制造。国际专利申请号WO 92/116556中公开了3-脱氧酰化单磷酰脂质A的某种形式。关于MLA和3D-MLA的这些专利中的每一个的公开内容通过引用并入本文。
可以使用的其他TLR4激动剂是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP)，诸如WO98/50399或美国专利号6,303,347中描述的那些(还描述了用于制备AGP的方法)。一些AGP是TLR4激动剂，且一些是TLR4拮抗剂。
可用于本发明中的其他TLR4激动剂包括吡喃葡糖基脂质佐剂(GLA)，诸如描述于WO2008/153541或WO2009/143457。
通常，TLR4激动剂，诸如脂多糖且尤其是MPL，是至少90％纯的，诸如至少95％纯的，特别是至少98％纯的，尤其是99％纯的。
在本申请中，术语“抗原”或“免疫原”是指能够激发免疫应答的多肽。合适地，所述免疫原是包含至少一个B或T细胞表位的抗原。激发的免疫应答可以是抗原特异性B细胞应答，其产生中和抗体。激发的免疫应答可以是抗原特异性T细胞应答，其可以是全身性应答和/或局部应答。抗原特异性T细胞应答可以包含CD4+T细胞应答，诸如涉及表达多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD4+T细胞的应答。可替代地或额外地，所述抗原特异性T细胞应答包含CD8+T细胞应答，诸如涉及表达多种细胞因子(例如IFNγ、TNFα和/或IL2)的CD8+T细胞的应答。
所述抗原可以源自(诸如获得自)感染人和非人脊椎动物的人或非人病原体，包括例如细菌、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫，或癌细胞或肿瘤细胞。
在一个实施方案中，所述抗原是重组蛋白，诸如重组原核蛋白。
在本申请中，术语“免疫原性组合物”是指一种组合物，其包含在个体，如人中，能够刺激免疫反应的免疫原性组分。相应地，在本发明的一个实施方案中，本发明的免疫原性组合物是疫苗，即，免疫原性组合物可以给予个体以提高抗相应病毒的免疫反应，其能够预防或治疗个体的相应病毒感染。所述病毒选自人免疫缺陷型病毒HIV-1、人乳头瘤病毒、水痘带状疱疹病毒、人单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、乙肝病毒、手足口病毒、柯萨奇病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、冠状病毒和新冠病毒SARS-CoV-2。在本发明的一些实施方式中，优选地，所述病毒为人乳头瘤病毒。相应地，本文所用的术语“疫苗”是指治疗性疫苗(用于疾病的治疗)和预防性疫苗(用于疾病的预防)。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
实施例1.MPL/Poly I:C复合佐剂的制备
本实施例制备的复合佐剂为本发明所述的包含TLR3激动剂和TLR4激动剂的脂质体制剂。
将4g DOPC、1g胆固醇和200mg MPL溶于20mL异丙醇，通过梯度减压旋蒸获得脂质薄膜。
在脂质薄膜中加入50mL磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，在25℃水浴中旋转水化得到悬浮液。
获得的悬浮液稀释至特定浓度后进行均质，均质后获得的脂质体以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，最终获得适当特定的浓缩脂质体。
Poly I:C加一定体积生理盐水溶解，为Poly I:C溶液。
特定浓度的浓缩脂质体，加磷酸盐水溶液(10mM PB，包含150mM NaCl)稀释混匀至一定浓度，加Poly I:C溶液，混匀，至各组分含量浓度为DOPC 2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，MPL0.1mg/ml，Poly I:C 2mg/ml，即为最终获得的MPL/Poly I:C复合佐剂。
为研究是否(1)包含TLR4激动剂和另一种TLR激动剂的脂质体制剂或(2)包含除TLR4激动剂外任意两种TLR激动剂的脂质体制剂均可达到与实施例1同样的效果，还设计了实施例2～6。
实施例2.MPL/CpG复合佐剂的制备
本实施例涉及包含TLR4激动剂和TLR9激动剂的脂质体制剂。
将4g DOPC、1g胆固醇和200mg MPL溶于20mL异丙醇，通过梯度减压旋蒸获得脂质薄膜。
在脂质薄膜中加入50mL磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，在25℃水浴中旋转水化得到悬浮液。
获得的悬浮液稀释至特定浓度后进行均质，均质后获得的脂质体以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，最终获得适当特定的浓缩脂质体。
CpG加一定体积生理盐水溶解，为CpG溶液。
特定浓度的浓缩脂质体，加磷酸盐水溶液(10mM PB，包含150mM NaCl)稀释混匀至一定浓度，加CpG溶液，混匀，至各组分含量浓度为DOPC 2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，MPL0.1mg/ml，CpG 2mg/ml，即为最终获得的MPL/CpG复合佐剂。
实施例3.MPL/R848复合佐剂的制备
本实施例涉及包含TLR4激动剂和TLR7/8激动剂的脂质体制剂。
称取200mg DOPC、50mg胆固醇和10mg MPL，溶解于5ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)。40mg R848溶解于4ml DMSO中，获得R848母液。
1ml溶解有DOPC、胆固醇和MPL的有机相，加0.5ml R848母液，加1ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)，混合后为醇相，磷酸盐水溶液(10mM PB，含150mMNaCl)为水相，水醇比3:1制备样品，去除有机溶剂后，以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，检测过滤后的样品粒径为125.4nm，PDI为0.164。
取500μl过滤后的样品，加200μl磷酸盐水溶液(10mM PB，150mM NaCl)，混匀，至各组分含量为DOPC 2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，MPL 0.1mg/ml，R8480.5mg/ml，即为最终获得的MPL/R848复合佐剂。
实施例4.MPL/CU-T12-9复合佐剂的制备
本实施例涉及包含TLR4激动剂和TLR1/2激动剂的脂质体制剂。
称取200mg DOPC、50mg胆固醇和10mg MPL，溶解于5ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)。80mg CU-T12-9溶解于4ml DMSO中，获得CU-T12-9母液。
1ml溶解有DOPC、胆固醇和MPL的有机相，加0.125ml CU-T12-9母液，加1.375ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)，混合后为醇相，磷酸盐水溶液(10mM PB，含150mM NaCl)为水相，水醇比3:1制备样品，去除有机溶剂，检测样品粒径为115.0nm，PDI为0.260。
取500μl样品，加200μl磷酸盐水溶液(10mM PB，150mM NaCl)，混匀，至各组分含量为DOPC 2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，MPL 0.1mg/ml，CU-T12-90.125mg/ml，即为最终获得的MPL/CU-T12-9复合佐剂。
实施例5.R837/CpG复合佐剂的制备
本实施例涉及包含TLR7激动剂和TLR9激动剂的脂质体制剂。
称取200mg DOPC和50mg胆固醇，溶解于5ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)。15mg R837溶解于7.5ml DMSO中，获得R837母液。
1ml溶解有DOPC和胆固醇的有机相，加1ml R837母液，加0.5ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)，混合后为醇相，磷酸盐水溶液(10mM PB，含150mM NaCl)为水相，水醇比3:1制备样品，去除有机溶剂，以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，检测过滤后的样品粒径为65.01nm，PDI为0.171。
CpG加一定体积生理盐水溶解，为CpG溶液。
取500μl过滤后的样品，加CpG溶液，加磷酸盐水溶液(10mM PB，150mM NaCl)，混匀，至各组分含量为DOPC 2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，R837 0.1mg/ml，CpG 2mg/ml，即为最终获得的R837/CpG复合佐剂。
实施例6.R837/Poly I:C复合佐剂的制备
本实施例涉及包含TLR7激动剂和TLR3激动剂的脂质体制剂。
称取200mg DOPC和50mg胆固醇，溶解于5ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)。15mg R837溶解于7.5ml DMSO中，获得R837母液。
1ml溶解有DOPC和胆固醇的有机相，加1ml R837母液，加0.5ml乙醇/异丙醇混合有机溶剂(乙醇异丙醇体积比1:1)，混合后为醇相，磷酸盐水溶液(10mM PB，含150mM NaCl)为水相，水醇比3:1制备样品，去除有机溶剂，以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，检测过滤后的样品粒径为65.01nm，PDI为0.171。
Poly I:C加一定体积生理盐水溶解，为Poly I:C溶液。
取500μl过滤后的样品，加Poly I:C溶液，加磷酸盐水溶液(10mM PB，150mMNaCl)，混匀，至各组分含量为DOPC 2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，R8370.1mg/ml，Poly I:C2mg/ml，即为最终获得的R837/Poly I:C复合佐剂。
实施例7.QS-21/PolyI:C复合佐剂的制备
本实施例涉及包含QS-21和TLR3激动剂的脂质体制剂。
将4g DOPC和1g胆固醇溶于20mL异丙醇，通过梯度减压旋蒸获得脂质薄膜。
在脂质薄膜中加入50mL磷酸盐水溶液(50mM PB，包含100mM的NaCl)，在25℃水浴中旋转水化得到悬浮液。
获得的悬浮液稀释至特定浓度后进行均质，均质后获得的脂质体以0.22μm聚醚砜膜(PES)过滤器过滤，最终获得适当特定的浓缩脂质体。
QS-21和Poly I:C加一定体积生理盐水溶解，为混合水溶液。
特定浓度的浓缩脂质体，加磷酸盐水溶液(10mM PB，包含150mM NaCl)稀释混匀至一定浓度，再加入混合水溶液，混匀，至各组分含量浓度为DOPC 2mg/ml，胆固醇0.5mg/ml，QS-21 0.1mg/ml，Poly I:C 2mg/ml，即为最终获得的QS-21/Poly I:C复合佐剂。
实施例8.含有重组VZV gE抗原的免疫原性组合物的制备
为了研究本发明所提供的复合佐剂的技术效果。本发明的发明人制成了含有免疫原和佐剂的免疫原性组合物，免疫原使用的是重组VZV gE蛋白，佐剂使用的是实施例1-7所述的复合佐剂，以及单独的MPL、PolyIC和CpG佐剂。具体配制方法为：将VZV gE抗原以5μg的量与上述佐剂进行充分混合。各佐剂制剂信息如下：
(1)MPL/Poly I:C制剂(0.5ml/剂)：DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，MPL 50μg，Poly I:C1mg，Na2HPO4 0.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。
(2)MPL/CpG制剂(0.5ml/剂)：DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，MPL 50μg，CpG 1mg，Na2HPO4 0.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。
(3)MPL/R848制剂(0.5ml/剂)：DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，MPL 50μg，R848 250μg，Na2HPO4 0.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。
(4)MPL/CU-T12-9制剂(0.5ml/剂)：DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，MPL 50μg，CU-T12-962.5mg，Na2HPO4 0.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。
(5)R837/CpG制剂(0.5ml/剂)：DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，R837 50μg，CpG 1mg，Na2HPO4 0.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。
(6)R837/Poly I:C制剂(0.5ml/剂)：DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，R83750μg，Poly I:C 1mg，Na2HPO4 0.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。
(7)QS-21/Poly I:C制剂(0.5ml/剂)：DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，QS-2150μg，PolyI:C 1mg，Na2HPO4 0.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。
(8)MPL制剂(0.5ml/剂)：DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，MPL 50μg，Na2HPO40.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。
(9)PolyI:C制剂(0.5ml/剂)：DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，Poly I:C 1mg，Na2HPO40.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。
(10)CpG制剂(0.5ml/剂)：DOPC 1mg，胆固醇0.25mg，CpG 1mg，Na2HPO40.15mg，KH2PO4 0.54mg，NaCl 4.385mg。
实施例9.佐剂效果评价
针对实施例8中获得的含有重组VZV gE抗原的免疫原性组合物，发明人以C57BL/6小鼠为动物模型开展了免疫原性研究，考察本申请的复合佐剂联合重组VZV gE抗原的免疫原性。以重组VZV gE蛋白为抗原，结合本发明实施例1-6所述的复合佐剂为试验组，QS-21/PolyI:C复合佐剂及单独的MPL、PolyI:C和CpG佐剂为对照组，每组10只小鼠，通过研究上述组合物的免疫原性，从而评价本发明复合佐剂的效果。采用C57BL/6小鼠，0天初免，两针间隔14天的免疫程序，于0天进行水痘苗接种，35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫(1/10HD)，并于第63天评价不同佐剂的细胞免疫效果。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d)，取小鼠脾脏分离小鼠脾淋巴细胞，以VZV gE(1-546aa)肽库为刺激物，通过流式细胞术检测细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2的水平。小鼠免疫检测结果如表2所示。
表2小鼠免疫检测结果
注：“—”存在等于0的数值，无法计算几何均值
结果显示，首先，复合佐剂基本上均表现出明显优于单独的MPL、PolyI:C或CpG佐剂的佐剂活性，激发的细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2的水平普遍更高，说明两种不同的TLR激动剂复合的脂质体佐剂以及免疫刺激剂与TLR3激动剂复合的脂质体佐剂均比目前使用率较高、效果较好的三种单一的TLR激动剂更具优势，其中，两种不同的TLR激动剂复合的脂质体佐剂效果更佳。
其次，在包含两种TLR激动剂的脂质体制剂复合佐剂分组中，含有MPL的复合佐剂分组基本上能够激发更高的IFN-γ和IL-2水平。其中，Poly I:C、R848和CU-T12-9在与MPL联合后均表现出很好的佐剂活性，但相比较而言，尤其以MPL/Poly I:C复合佐剂和抗原配伍后促进产生的抗原特异性细胞因子IFN-γ和IL-2的水平最高。
实施例10.不同比例的MPL/PolyI:C复合佐剂效果评价(一)
本实施例以C57BL/6小鼠为动物模型进一步开展免疫原性研究，通过考察不同PolyI:C含量的MPL/PolyI:C复合佐剂与重组VZV gE抗原制备的组合物的免疫原性，以评价MPL与PolyI:C的配比对MPL/PolyI:C复合佐剂效果的影响，筛选出并提供一种佐剂效力更高的复合佐剂。
采用C57BL/6小鼠，每组10只，0天初免，两针间隔14天的免疫程序，于0天进行水痘苗接种，35天和49天进行重组带状疱疹疫苗免疫(1/10HD)，并于第63天评价不同佐剂的细胞免疫效果。重组带状疱疹疫苗第二次免疫后14天(63d)，取小鼠脾脏分离小鼠脾淋巴细胞，以VZV gE(1-546aa)肽库为刺激物，通过流式细胞术检测细胞内细胞因子IFN-γ、IL-2的水平。小鼠免疫检测结果如表3所示。
表3小鼠免疫检测结果
注：“—”存在等于0的数值，无法计算几何均值
结果显示，随着PolyI:C含量大幅增加，细胞因子水平出现与剂量不是正相关提高的现象，含有500μg PolyI:C的复合佐剂激发的细胞因子水平仍低于含有25μg PolyI:C的复合佐剂，说明在固定MPL含量的前提下，复合佐剂中PolyI:C的含量并非越高越好。在免疫剂量为1/10HD的情况下，以每剂疫苗中含25μg的PolyI:C有较优的免疫效果。
实施例11.不同比例的MPL/PolyI:C复合佐剂效果评价(二)
本实施例以C57BL/6小鼠为动物模型进一步开展剂量与免疫原性研究，通过考察不同比例MPL/PolyI:C的复合佐剂与重组VZV gE抗原制备的组合物的免疫原性，以评价MPL与PolyI:C的配比对MPL/PolyI:C复合佐剂效果的影响，筛选出并提供一种佐剂效力更高的复合佐剂。
本研究与实施例10相比缩短免疫程序，采用两针间隔21天的免疫程序，于0天和21天进行重组带状疱疹疫苗免疫(1/10HD)，每组10只小鼠，并于第35天进行细胞内细胞因子检测评价疫苗细胞免疫效果。
表4小鼠免疫检测结果
注：“—”存在等于0的数值，无法计算几何均值
结果显示，各组复合佐剂均能有效诱导细胞免疫应答，其中当MPL使用剂量为5μg时，PolyI:C的最佳剂量是150μg；当MPL使用剂量为2.5μg时，PolyI:C的最佳剂量是2.5μg。在免疫剂量为1/10HD的情况下，以每剂疫苗中含MPL 5μg和PolyI:C 150μg效果最佳，当减少MPL剂量，使用2.5μg的MPL时，使用同样2.5μg的PolyI:C也有不错的免疫效果。
从本发明全部的内容已经能够很清楚的知晓，复合佐剂中复合组分的选择、配比以及配伍的抗原种类均是能够对佐剂活性和疫苗效果产生重大影响的重要因素，绝非通过简单的组分替换能够筛选得到的结果。人用剂量MPL的使用量可以是25-50μg，PolyI:C的使用量可以是25-1500μg。
实施例12.增加阳离子脂质的MPL/PolyI:C复合佐剂效果评价
在使用中性脂质的基础上，进一步增加使用阳离子脂质，比较不同比例的阳离子脂质增加对免疫效果的影响。本实施例以C57BL/6小鼠为动物模型进一步开展剂量与免疫原性研究，通过考察含不同比例DOPC/DOTAP的复合佐剂与重组VZV gE抗原制备的组合物的免疫原性，以评价DOPC与DOTAP的配比对MPL/PolyI:C复合佐剂效果的影响。
本研究采用两针间隔21天的免疫程序，于0天和21天进行重组带状疱疹疫苗免疫(1/10HD)，每组10只小鼠，并于第35天进行细胞内细胞因子检测评价疫苗细胞免疫效果。
表5不同脂质配方的免疫检测结果
结果显示，整体比较三组DOPC-胆固醇-MPL-PolyIC组(无阳离子脂质组)，DOPC/DOTAP(9:1)-胆固醇-MPL-PolyIC组(9:1阳离子脂质组)，和DOPC/DO TAP(19:1)-胆固醇-MPL-PolyIC组(19:1阳离子脂质组)的免疫数据，综合评价各组的细胞免疫数据发现19:1的阳离子脂质组的免疫效果最佳。
实施例13.脂质体佐剂对大鼠体温的影响
在以1/10HD施用各免疫样品对大鼠进行一免和二免的给药日，在给药后各时段检查各免疫样品对大鼠体温的影响，以生理盐水作为空白对照组，AS01佐剂(每人用剂量0.5mL含50μg的MPL，50μg的QS-21，4.385mg氯化钠，1mg的DOPC，0.54mg磷酸二氢钾，0.25mg胆固醇和0.15mg无水磷酸二钠)作为阳性对照组。佐剂组别参照实施例12，使用直肠数字温度计监测各组大鼠的体温并记录(测温探头进入直肠内约10s，等待数值稳定后读数)，分组见下表。
表6大鼠一免后不同脂质配方的体温检测结果
/>
表7大鼠二免后不同脂质配方的体温检测结果
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相对于生理盐水对照组，经历首次免疫和二次免疫后各时段的大鼠体温在无阳离子脂质组、9:1阳离子脂质组和19:1阳离子脂质组的变化幅度很轻微，而AS01组在一免和二免后普遍显著地引起大鼠体温升高，产生不良副反应。对体温的评估表明，无阳离子脂质组中的1-4、1-8、9:1阳离子脂质组中的2-4、2-8和19:1阳离子脂质组中的3-4、3-8都被动物很好地耐受，安全性高。
基于以上结果，本申请的发明人发现，佐剂复合组分的选择对免疫效果有较大的影响，尤其以含有TLR4激动剂(MPL)和TLR3激动剂(Poly I:C)的脂质体制剂效果最佳。当前被公众熟知的用于重组带状疱疹疫苗的佐剂系统AS01B虽然具有显著的佐剂效力，但其中的QS-21存在许多局限性，主要在于它的获取极其困难且价格昂贵，若制剂不得当，其还具有显著的溶血活性和临床毒性。近年来也有国内外学者对脂质体与TLR激动剂配合使用或激动剂的联用进行了研究，例如：脂质体、TLR激动剂和免疫原共同作用时比单独使用TLR激动剂和免疫原时，产生的免疫性更强；TLR4激动剂与TLR2激动剂联用作为粘膜佐剂可以提高痢疾杆菌脂多糖的免疫原性和免疫保护作用；TLR7/8激动剂与TLR4激动剂联合用于流感和HIV等疫苗的研究，可以激活树突状细胞，提高其提成抗原的能力，调节免疫应答；TLR4激动剂与TLR9激动剂联用等等。
本发明提供的复合佐剂原料易获得，无溶血活性，制备工艺简单，作为重组带状疱疹疫苗的候选佐剂，具有很大的发展潜力。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种复合佐剂，在脂质体制剂中包含TLR3激动剂和TLR4激动剂，其特征在于所述复合佐剂包括：
a)由DOPC组成的脂质；
b)胆固醇；和
c)MPL与PolyI:C，
其中所述由DOPC组成的脂质与胆固醇的重量比是3-5:0.8-1.2，胆固醇与MPL的重量比是4-6:0.8-1.2，MPL与PolyI:C的重量比是1:1-1:30。
2.如权利要求1所述的复合佐剂，其特征在于其中每人用剂量中所述DOPC重量为800-1200μg，胆固醇的重量200-300μg，MPL的重量25-50μg，PolyI:C的重量为25-1500μg。
3.如权利要求2所述的复合佐剂，其特征在于其中每人用剂量中所述DOPC重量为1000μg，胆固醇的重量250μg，MPL的重量25-50μg，PolyI:C的重量为25-1500μg。
4.如权利要求3所述的复合佐剂，其特征在于其中每人用剂量中所述DOPC重量为1000μg，胆固醇的重量250μg，MPL的重量25μg，PolyI:C的重量为25μg。
5.如权利要求3所述的复合佐剂，其特征在于其中每人用剂量中所述DOPC重量为1000μg，胆固醇的重量250μg，MPL的重量50μg，PolyI:C的重量为1500μg。
6.一种复合佐剂，在脂质体制剂中包含TLR3激动剂和TLR4激动剂，其特征在于所述复合佐剂包括：
a)由DOPC和DOTAP组合的脂质混合物；
b)胆固醇；和
c)MPL与PolyI:C，
其中DOPC与DOTAP的重量比为9:1或19:1，脂质混合物与胆固醇的重量比是3-5:0.8-1.2，胆固醇与MPL的重量比是4-6:0.8-1.2，MPL与PolyI:C的重量比是1:1-1:30。
7.如权利要求6所述的复合佐剂，其中每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为800-1200μg，胆固醇的重量为200-300μg，MPL的重量为25-50μg，PolyI:C的重量为25-1500μg。
8.如权利要求7所述的复合佐剂，其特征在于其中每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg，胆固醇的重量为250μg，MPL的重量为25-50μg，PolyI:C的重量为25-1500μg。
9.如权利要求8所述的复合佐剂，其特征在于其中每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg，胆固醇的重量为250μg，MPL的重量为25μg，PolyI:C的重量为25μg。
10.如权利要求8所述的复合佐剂，其特征在于其中每人用剂量中所述DOPC与DOTAP重量合计为1000μg，胆固醇的重量为250μg，MPL的重量为50μg，PolyI:C的重量为1500μg。
11.一种免疫原性组合物，其特征在于包含的抗原为水痘带状疱疹病毒糖蛋白，佐剂为权利要求1-10中任一项所述的复合佐剂。
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