EA020617B1 - Конструкции casb7439 - Google Patents

Конструкции casb7439 Download PDF

Info

Publication number
EA020617B1
EA020617B1 EA201190274A EA201190274A EA020617B1 EA 020617 B1 EA020617 B1 EA 020617B1 EA 201190274 A EA201190274 A EA 201190274A EA 201190274 A EA201190274 A EA 201190274A EA 020617 B1 EA020617 B1 EA 020617B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ca8b7439
protein
mice
асс асс
polypeptide
Prior art date
Application number
EA201190274A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201190274A1 (ru
Inventor
Норманд Блэйс
Мартин Харви
Энтони Пилорге
Клеман Риу
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA201190274A1 publication Critical patent/EA201190274A1/ru
Publication of EA020617B1 publication Critical patent/EA020617B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55577—Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP

Abstract

Изобретение относится к соединениям и способам увеличения рекомбинантной продукции полипептидов CASB7439 и к способам их применения.

Description

Предшествующий уровень техники
Гомологи АсНае1е-8сн1е млекопитающих представляют собой консервативных родственников млекопитающих комплекса Асйае1е-8си1е дрозофилы. Они являются членами основного семейства генов спираль-петля-спираль (ЬНЬН или НЬН), которые действуют как специфичные для линий клеток транскрипционные факторы, необходимые для развития. Один из членов этого семейства МА8Н2, обнаруженный у мышей, необходим для развития плаценты, но не является важным для правильного развития эмбриона. НА8Н2, представляющий собой человеческий ортолог гена МА8Н2, был клонирован в 1997 году Л1йет5 е1 а1. (обозначенный авторами как А8СЬ2). Л1йет5 е1 а1. (1997), Нит. Мо1ес. Оеие1. 6:859867.
Как описано в \У0 01/62778, исследования экспрессии выявили, что транскрипт НА8Н2 (называемый здесь как СА8В7439) сверхэкспрессируется при колоректальных опухолях по сравнению с соседними нормальными участками толстого кишечника и другими исследованными нормальными тканями. Этот ген сверхэкспрессируется у пациентов, имеющих стадии Ι-ΐν аденокарциономы. Таким образом, белок можно рассматривать как раковый антиген, полезный при иммунотерапевтическом подходе для уменьшения интенсивности рака у субъекта, например путем использования рекомбинантного СА8В7439 в качестве антигенспецифического противоракового иммунотерапевтического агента (Л8С1).
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении предложены соединения и способы увеличения рекомбинантной продукции полипептидов СА8В7439. В некоторых воплощениях предложены модифицированные полипептиды СА8В7439, а также белковые конструкции, содержащие такие модифицированные полипептиды СА8В7439. Указанные модифицированные полипептиды СА8В7439 включают по меньшей мере одну модификацию для усиленной продукции СА8В7439. Авторы настоящего изобретения также раскрыли молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие полинуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированные полипептиды СА8В7439 и белковые конструкции, содержащие такие описанные здесь модифицированные полипептиды СА8В7439. В некоторых аспектах авторы настоящего изобретения раскрыли белковые конструкции, имеющие аминокислотные (аа) последовательности, и кодирующую их нуклеотидную последовательность (ДНК), представляющие собой следующие:
КУЪ055 |8ΙΤ) ΙΌ N0: 1 (аа); 81 Τ) ΙΌ N0: 2 (ДНК)];
Ь\Ы11 |8Ш ΙΌ N0: 3 (аа); 81 Τ) ΙΌ N0: 4 (ДНК)];
Ь\Ы37 |8ΙΤ) ΙΌ N0: 5 (аа); 81 Τ) ΙΌ N0: 6 (ДНК)];
Ь\Ы41 |8ΙΤ) ΙΌ N0: 7 (аа); 81 Τ) ΙΌ N0: 8 (ДНК)];
Ь\Ы44 |8ΙΤ) ΙΌ N0: 9 (аа); 81 Τ) ΙΌ N0: 10 (ДНК)];
Ь\Ы68 |8ΙΤ) ΙΌ N0: 11 (аа); 81 Τ) ΙΌ N0: 12 (ДНК)].
Также раскрыты способы и процессы, в которых используются описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты, для продукции белковых конструкций.
Авторы настоящего изобретения также раскрыли иммуногенные композиции, содержащие один или более чем один описанный здесь модифицированный полипептид СА8В7439 или конструкции, и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, где носитель или эксципиент могут возможно содержать буфер.
В некоторых воплощениях раскрыто применение описанных здесь модифицированных полипептидов СА8В7439 или белковых конструкций или кодирующей их молекулы нуклеиновой кислоты в изготовлении лекарственного средства для лечения колоректального рака. В некоторых воплощениях раскрыты белковые конструкции для применения в терапии, в частности терапии колоректального рака. В некоторых воплощениях раскрыты способы индукции иммунного ответа против СА8В7439 у субъекта, страдающего от колоректального рака, включающие (а) выбор субъекта, страдающего от колоректального рака; и (б) введение этому субъекту эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей описанные здесь модифицированные полипептиды СА8В7439 или конструкцию и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, где носитель или эксципиент могут возможно содержать буфер.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Схематическая диаграмма, изображающая различные области полипептида СА8В7439, а именно ДНК-специфический (ДНК-связывающий) домен, домен ЬНЬН и богатую пролином область. Подробную информацию см. в примере 2. Также изображены схематические представления следующих областей: нацеливающая на ядро (серая стрелка); альфа-спиральная (серые цилиндры); биспиральная (черные цилиндры); характерное расстройство (черные стрелки) и низкая интеграция (серая полоска).
Фиг. 2. Схематическая диаграмма, изображающая различные усеченные варианты полипептида СА8В7439 (черные стрелки), совмещенные с полноразмерным полипептидом СА8В7439. Подробную информацию см. в примере 4.
Фиг. 3. Схематическая диаграмма СА8В7439, демонстрирующая приблизительное расположение богатой пролином области, и идентифицированных и предсказанных эпитопов. Различные воплощения содержат полипептид СА8В7439, модифицированный путем удаления некоторых или всех аминокислот в богатой пролином области. Такие модифицированные полипептиды СА8В7439 сохраняют большую долю эпитопов в полипептиде СА8В7439.
- 1 020617
Фиг. 4. Представлено совмещение между последовательностью немодифицированного полипептида СА8В7439 (8ЕЦ ГО N0: 13) и полипептидной последовательностью, возникающей в результате двух возможных модификаций полипептида СА8В7439: первая, при которой удаляют 21 последовательный аминокислотный остаток (133-153 включительно); вторая, при которой удаляют 21 последовательный аминокислотный остаток (131-151 включительно). Кроме того, может быть описана третья модификация полипептида СА8В7439, при которой удаляют 21 последовательный аминокислотный остаток (132-152 включительно). Как изображено на фигуре, получающаяся в результате модифицированная полипептидная последовательность СА8В7439 (вставка, в круге) в области делеции является идентичной для всех трех модификаций. Последнее возникает в результате повторяющихся КС аминокислотных остатков в позициях 131-132 и 152-153 в 81 А) ГО N0: 13.
Фиг. 5. Представлено совмещение аминокислотной последовательности между белковыми конструкциями в примере 6:
СА8В7439 = аминокислотная последовательность НА8Н2 (8ЕЦ ГО N0: 13);
ЬУЪ088 (8ЕС ГО N0: 27);
ЬУЪ111 (8ЕС ГО N0: 3);
ЬУЪ137 (8ЕС ГО N0: 5);
ЬУЪ138 (8ЕС ГО N0: 33);
ЬУЪ168 (8ЕС ГО N0: 11).
Фиг. 6. Представлено совмещение между аминокислотной последовательностью НА8Н2 (СА8В7439) (8ЕЦ ГО N0: 13) и следующими белковыми конструкциями:
ЬУЪ168 (8ЕС ГО N0: 11); ρΌ1/3 (8ЕС ΙΌ N0: 39) и ЬУЪ144 (8ЕС ГО N0: 9).
Фиг. 7. Анализ при помощи с|РС'К (количественной ПЦР) в реальном времени экспрессии мРНК СА8В7439 в нормальной ткани (12) и ткани колоректального рака (83), см. пример 9.
Фиг. 8. Соответствие между мРНК СА8В7439 и экспрессией белка в различных человеческих колоректальных образцах (СКС), черные круги демонстрируют экспрессию мРНК СА8В7439 в образцах рака толстой кишки, тогда как пустые окружности (о) демонстрируют экспрессию мРНК СА8В7439 в нормальных соседних тканях. Соответствующий уровень белка СА8В7439, обнаруженный при помощи иммунофлуоресценции, указан над каждым образцом (- отсутствие экспрессии, +/- очень низкая экспрессия, + низкая экспрессия, ++ сильная экспрессия и +++ очень сильная экспрессия). СКС: первичные опухоли, МЕТ8: метастаз, NАΤ: нормальные соседние ткани. Все образцы представляют образцы аденокарциономы толстой кишки, за исключением образцов 22440 и 24762, которые представляют собой слизеобразующие карциномы, см. пример 9.
Фиг. 9. В данной таблице представлен банк пептидов, охватывающий последовательность полноразмерного белка СА8В7439, используемый для повторной стимуляции спленоцитов после иммунизации различными конструкциями СА8В7439, см. пример 10.
Фиг. 10. Изображена пептидная матрица СА8В7439, используемая для исследований Т-клеточной иммуногенности, см. пример 10.
Фиг. 11А-1ГО. СГО4 ответ, выраженный в виде процентной доли дважды положительных (ГОИу/ТИРа) СГО4 Т-клеток в четырех линиях инбредных мышей (С57ВЬ6, ВАЬВС, СВ6Р1 и С3Н), иммунизированных ЬУЬ111 + А801В с последующей рестимуляцией перекрывающимися пептидами СА8В7439 (совокупности, матричный подход), см. пример 10, Эксперимент по мультилинейному сравнению инбредных мышей.
Фиг. 12А, 12В. СГО4 ответ, выраженный в виде процентной доли дважды положительных (ГОИу/ТИРа) СГО4 Т-клеток в четырех линиях инбредных мышей, иммунизированных ЬУЪ111 + А815 с последующей повторной стимуляцией СА8В7439 перекрывающимися пептидами (совокупности, матричный подход), см. пример 10, Эксперимент по мультилинейному сравнению инбредных мышей.
Фиг. 13. Идентификация СГО4 иммуногенных пептидов СА8В7439 в четырех инбредных линиях мышей, обсуждавшихся в предшествующем абзаце. Светло-серый = 0,2-0,4% дважды положительных (ГОИу/ТИРа) СГО4 Т-клеток; темно-серый >0,5% дважды положительных (ГОИу/ТИРа) СГО4 Т-клеток, см. пример 10, Эксперимент по мультилинейному сравнению инбредных мышей.
Фиг. 14. Идентификация СГО4 иммуногенных СА8В7439 пептидов у аутбредных СГО1 мышей (А801В, фиг.14А; А815, фиг. 14В). Светло-серый = 0,2-0,4% дважды положительных (ГОИу/ТИРа) СГО4 Т-клеток; темно-серый >0,5% дважды положительных (ГОИу/ТИРа) СГО4 Т-клеток, см. пример 10, Иммуногенность СА8В7439 у мышей: СА8В7439 Т-клеточная иммуногенность у аутбредных мышей.
Фиг. 15А, 15В. СГО4 и СГО8 Т-клеточные ответы, выраженные в виде процентной доли дважды положительных (ГОИу/ТОТа) у отдельных СГО1 аутбредных мышей, иммунизированных ЬУЬШ, ЬУР168 или ЬУР144, приготовленных с А815, с последующей повторной стимуляцией СА8В7439 перекрывающимися пептидами (совокупности иммунодоминантных пептидов), см. пример 10, Исследования ЬУЬ111, РУЬ168 и РУЪ144 у аутбредных мышей.
- 2 020617
Фиг. 16. СЭ4 Т-клеточные ответы (выраженные в виде процентной доли дважды положительных (ΙΡΝγ/ΤΝΡα)) в совокупности лейкоцитов периферической крови (РВЬ), выделенных у трансгенных мышей НЬА Α2.1/ΏΚ-1, иммунизированных ЬУЪ168 (8ЕО ГО N0: 11) или ЬУЪ144 (8Е0 ГО N0: 9), приготовленных с А815, с последующей повторной стимуляцией СА8В7439 перекрывающимися пептидами (7 совокупностей из 7 пептидов/совокупность + пептид 24 (8Е0 ГО N0: 76)).
Фиг. 17. СГО8 Т-клеточные ответы (выраженные в виде процентной доли дважды положительных (ΙΡΝγ/ΤΝΡα)) в объединенных РВЬ, выделенных у НЬА А2.1ГОК-1 трансгенных мышей, иммунизированных ЬУЪ168 (8Е0 ГО N0: 11) или ЬУЬ144 (8Е0 ГО N0: 9), приготовленных с А815, с последующей повторной стимуляцией СА8В7439 перекрывающимися пептидами (7 совокупностей из 7 пептидов + пептид 24 (8ЕС) ГО N0: 76)).
Фиг. 18. СГО4 Т-клеточные ответы (выраженные в виде процентной доли дважды положительных (ΣΡ^/ΤΉΡα)) в спленоцитах, выделенных у НЬА А2.1ГОК-1 трансгенных мышей, иммунизированных ЬУЪ168 (8Е0 ГО N0: 11) или ЬУЪ144 (8Е0 ГО N0: 9), приготовленных с А815, с последующей повторной стимуляцией СА8В7439 перекрывающимися пептидами (7 совокупностей из 7 пептидов + пептид 24 (8ЕС) ГО N0: 76)).
Фиг. 19. СГО8 Т-клеточные ответы (выраженные в виде процентной доли дважды положительных (1Р^/Т№а)) в спленоцитах, выделенных у НЬА А2.1ГОК-1 трансгенных мышей, иммунизированных ЬУЪ168 (8Е0 ГО N0: 11) или ЬУЪ144 (8Е0 ГО N0: 9), приготовленных с А815, с последующей повторной стимуляцией СА8В7439 перекрывающимися пептидами (7 совокупностей из 7 пептидов + пептид 24 (8ЕС) ГО N0: 76)).
Фиг. 20А-2(ГО. Анализ в зависимости от времени ответа в виде СА8В7439-специфических антител (1дС] и 1дС2а), инициируемого после иммунизации ЬУЪ111 + А801В или ЬУЪ111 +А815 у СВ6Е1 инбредных мышей, см. пример 10, Иммуногенность СА8В7439 у мышей: СА8В7439-опосредованный гуморальный ответ.
Фиг. 21А, 21В. СА8В7439-специфический гуморальный ответ у инбредных СВ6Е1 мышей (Ι§Οι и 1дС2а) после иммунизации ЬУЪ111, ЬУЪ168 или ЬУЪ144, приготовленных с адъювантом А815 или только одним адъювантом А815, см. пример 10, Иммуногенность СА8В7439 у мышей: СА8В7439опосредованный гуморальный ответ.
Фиг. 22. СА8В7439-специфический гуморальный иммунный ответ (титр 1§С) у СГО1 аутбредных мышей, иммунизированных ЬУЪ111, ЬУЪ168 или ЬУЪ144, приготовленных с адъювантом А815 или только одним адъювантом А815; нативных мышей использовали в качестве контроля, см. пример 10, Исследования на мышах СО 1.
Фиг. 23. ТС1/СА8В7439 #14 опухолевый трансплантат у мышей СВ6Е1, иммунизированных ЬУЬ111, приготовленным с А801В (фиг. 23А) или А815 (фиг. 23В), см. пример 11, Исследование № 1.1. На фиг. 23А порядок кривых на графике сверху вниз представляет собой буфер, ЬУЪ111 (10 мкг), ЬУЬ111 (10 мкг) + А801В и ЬУЬ111 (1 мкг) + А801В. На фиг. 23В кривая внизу представляет собой ЬУЬ111 (10 мкг) + А815.
Фиг. 24. Кривые выживания для примера 11, исследование № 1.2. ТР: без опухоли.
Фиг. 24А. Кривая выживания СВ6Е1 мышей, иммунизированных физиологическим раствором ЬУЪ111 без адъюванта или только одним адъювантом (А801 или А815) и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14. Последняя выжившая мышь из группы, иммунизированной ЬУЬ111, умерла первой, а затем последняя выжившая мышь из группы А801В, а затем последняя выжившая мышь из группы А815 и последняя выжившая мышь из группы, которой вводили буфер.
Фиг. 24В. Кривая выживания СВ6Е1 мышей, иммунизированных только А815 или указанными дозами ЬУЪ111, приготовленных с А815, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14. Последняя выжившая мышь из группы А815 погибла первой. Из других групп: в группе 30 мкг было меньше всего выживших, а затем группа 1 мкг, затем группа 10 мкг, в которой было наибольшее количество выживших.
Фиг. 24С. Кривая выживания СВ6Е1 мышей, иммунизированных только А801В или указанными дозами ЬУЪ111, приготовленными с А801 В, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14. В этой панели последние выжившие мыши из группы 10 мкг и А801В погибли в один и тот же день. Группы 1 и 30 мкг имели одинаковую процентную долю выживших к заключительным суткам.
Фиг. 25. Кривые выживания для примера 11, представлено исследование № 1.3. ТР: без опухоли.
Фиг. 25А. Кривая выживания для СВ6Е1 мышей, иммунизированных ЬУЪ111, ЬУЪ144 или ЬУЪ168, приготовленных с А815 или только А815, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439#14.
Фиг. 25В. Кривая выживания для СВ6Е1 мышей, иммунизированных ЬУЬ111, ЬУЪ144 или ЬУЬ168, приготовленных с А815 или только А815, и сенсибилизированных клетками МС38/СА8В7439 #35.
Фиг. 26. Кривые выживания для примера 11, представлено исследование № 1.4. ТР: без опухоли.
Фиг. 26А. Кривая выживания СВ6Е1 мышей, иммунизированных ЬУЪ144 или ЬУЬ168, приготовленных с А815 или только А815, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14. В группе, иммунизированной ЬУЪ144, наблюдали несколько больший процент выживания.
- 3 020617
Фиг. 26В. Кривая выживания для СВ6Г1 мышей, иммунизированных ЬУЪ144 или ЬУЪ168, приготовленных с Л815 или только Л815, и сенсибилизированных клональными клетками ТС1/СА8В7439 #14-2. Мыши, инокулированные ЬУЬ144, демонстрировали несколько больший процент выживания.
Фиг. 26С. Кривая выживания для мышей СВ6Г1, иммунизированных ЬУЪ144 или ЬУЪ168, приготовленных с Л815 или только Л815, и сенсибилизированных клетками МС38/СА8В7439 #35. Среди мышей, инокулированных ЬУЪ144, не было выживших.
Фиг. 27. Кривые выживания для примера 11, представлено исследование № 2.1. ТР: без опухоли.
Фиг. 27А. Кривая выживания мышей СВ6Г1, иммунизированных 6,25 мкг ЬУР168 и 10 мкг ЬУР144, приготовленных с А§15 или только А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2. Группа мышей, инокулированная ЬУР168, имела несколько более высокую процентную долю выживших.
Фиг. 27В. Кривая выживания мышей СВ6Г1, иммунизированных 3,1 мкг ЬУР168 и 5 мкг ЬУР144, приготовленных с А§15 или только А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2. Группа мышей, инокулированных ЬУР144, имела несколько более высокую процентную долю выживших.
Фиг. 27С. Кривая выживания мышей СВ6Г1, иммунизированных 1,55 мкг ЬУР168 и 2,5 мкг ЬУР144, приготовленных с А§15 или только А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2. Группа мышей, инокулированных ЬУР144, имела самую высокую процентную долю выживших.
Фиг. 27Ό. Кривая выживания мышей СВ6Г1, иммунизированных 0,77 мкг ЬУР168 и 1,25 мкг ЬУР144, приготовленных с А§15 или только А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2. Группа мышей, инокулированных ЬУР168, имела несколько более высокую процентную долю выживших.
Фиг. 28. Кривые выживания для примера 11, представлено исследование № 2.2. ТР: без опухоли.
Фиг. 28А. Кривая выживания мышей С57В1/6, иммунизированных 6,25 мкг ЬУР168 или 10 мкг ЬУР144, приготовленных с А§15 или только А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2.
Фиг. 28В. Кривая выживания мышей С57В1/6, иммунизированных 3,1 мкг ЬУР168 или 5 мкг ЬУР144, приготовленных с А§15 или только А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2.
Фиг. 28С. Кривая выживания мышей С57В1/6, иммунизированных 1,55 мкг ЬУР168 или 2,5 мкг ЬУР144, приготовленных с А§15 или только А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2.
Фиг. 28Ό. Кривая выживания мышей С57В1/6, иммунизированных 0,77 мкг ЬУР168 или 1,25 мкг ЬУР144, приготовленных с А§15 или только А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2.
Фиг. 29. Кривые выживания для примера 11, представлено исследование № 2.3. ТР: без опухоли.
Фиг. 29А. Кривая выживания мышей СВ6Г1, иммунизированных 6,25 мкг ЬУР168 или 10 мкг РУЪ144, приготовленных с А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2. Группа мышей, получавшая ЬУР168, имела самую высокую процентную долю выживших, а затем группа, получавшая ЬУР144. Выжившие отсутствовали в группе, получавшей А§15.
Фиг. 29В. Кривая выживания мышей СВ6Г1, иммунизированных 3,1 мкг ЬУР168 и 5 мкг ЬУР144, приготовленных с А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2. Группа мышей, получавшая ЬУР168, имела самую высокую процентную долю выживших, а затем группа, получавшая ЬУР144. Выжившие отсутствовали в группе, получавшей А§15.
Фиг. 29С. Кривая выживания мышей СВ6Г1, иммунизированных 1,55 мкг ЬУР168 и 2,5 мкг РУЪ144, приготовленных с А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2. Группа мышей, получавшая ЬУР168, имела самую высокую процентную долю выживших, а затем группа, получавшая ЬУР144. Выжившие отсутствовали в группе, получавшей А§15. В качестве контролей использовали физиологический раствор или А§15.
Фиг. 30. Кривые выживания для примера 11, исследование № 2.3. ТР: без опухоли.
Фиг. 30А. Кривая выживания мышей СВ6Г1, иммунизированных 0,77 мкг ЬУР168 или 1,25 мкг РУЪ144, приготовленных с А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2. Группа мышей, получавшая ЬУР168, имела самую высокую процентную долю выживших, а затем группа, получавшая ЬУР144. Выжившие отсутствовали в группе, получавшей А§15.
Фиг. 30В. Кривая выживания мышей СВ6Г1, иммунизированных 0,19 мкг РУЬ168 или 0,31 мкг РУЪ144, приготовленных с А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2. Группа мышей, получавшая ЬУР168, имела самую высокую процентную долю выживших. Последняя выжившая мышь из группы, получавшей ЬУР144, пережила последнюю выжившую из группы А§15 и группы, получавшей буфер.
Фиг. 30С. Кривая выживания мышей СВ6Г1, иммунизированных 0,048 мкг Ь\Ы68 или 0,078 мкг РУЪ144, приготовленных с А§15, и сенсибилизированных клетками ТС1/СА8В7439 #14-2. Группа мышей, получавшая ЬУР168, имела самую высокую процентную долю выживших. Последняя выжившая
- 4 020617 мышь из группы, получавшей ЬУЪ144, пережила последнюю выжившую из группы АЗ15 и группы, получавшей буфер. Физиологический раствор или АЗ15 использовали в качестве контролей.
Фиг. 31. ТС1/САЗВ7439 #14-2 опухолевый трансплантат у самцов и самок мышей СВ6Г1, иммунизированных 1 мкг ЬУЪ168, приготовленных с АЗ15; только АЗ15 использовали в качестве контроля (фиг. 31А). ТС1/САЗВ7439 #14-2 опухолевый трансплантат у мышей С57В1/6, иммунизированных 1 мкг ЬУЪ168, приготовленных с АЗ15; АЗ15 использовали в качестве контроля (фиг. 31В).
Фиг. 32А. Кривая выживания самцов или самок мышей СВ6Г1, иммунизированных 1 мкг ЬУЪ168, приготовленных с АЗ15, и сенсибилизированных клетками ТС1/САЗВ7439 #14-2. АЗ15 использовали в качестве контроля у самцов и самок мышей СВ6Г1. Среди мышей СВ6Г1, иммунизированных ЬУЪ168 вместе с АЗ15, только 7 самцов и 3 самки не имели опухоли (ТР). ТР отсутствовали среди мышей, получавших только АЗ15.
Фиг. 32В. Кривая выживания мышей С57В1/6, иммунизированных 1 мкг ЬУЪ168, приготовленных с АЗ15, и сенсибилизированных клетками ТС1/САЗВ7439 #14-2. АЗ15 использовали в качестве контроля у самцов и самок мышей С57В1/6. Среди мышей С57В1/6, иммунизированных ЬУЪ168 вместе с АЗ15, присутствовали 2 ТР самца и 1 ТР самка. Среди мышей, получавших только АЗ15, присутствовали 5 ТР самцов и 1 ТР самка.
Фиг. 33. САЗВ7439-специфический гуморальный иммунный ответ (титр 1§О) у самцов (черные кружки) и самок (серые кружки) мышей СВ6Р1, иммунизированных 1 мкг ЬУЪ168, приготовленных с АЗ15 или только АЗ15 (слева). САЗВ7439-специфический гуморальный иммунный ответ (титр 1§С) у самцов (черные кружки) и самок (серые кружки) мышей С57В1/6, иммунизированных 1 мкг ЬУЪ168, приготовленных с АЗ15, или только АЗ15 (справа).
Фиг. 34. СЭ4 Т-клеточные ответы (выраженные в виде процентной доли дважды положительных (ГРИу/ТЫРа)) в объединенных РВЬ, выделенных у мышей СВ6Р1, иммунизированных 1 мкг ЬУТ168 (ЗЕО ГО N0: 11), приготовленных с АЗ15 или только АЗ15, с последующей повторной стимуляцией банком из 46 пептидов (см. фиг. 9), покрывающим последовательность полноразмерного белка САЗВ7439 (фиг. 34А). СГО4 Т-клеточные ответы (выраженные в виде процентной доли дважды положительных (ГРЫу/ТЫРа)) в объединенных РВЬ, выделенных у мышей С57В1/6, иммунизированных 1 мкг ЬУТ168 (ЗЕО ГО N0: 11), приготовленных с АЗ15 или только АЗ15, с последующей повторной стимуляцией совокупными пептидами САЗВ7439 из банка 46 пептидов (см. фиг. 9), покрывающего последовательность полноразмерного белка САЗВ7439 (фиг. 34В, слева); САЗВ7439 пептид 39 (ЗЕО ГО N0: 91) (фиг. 34В, середина); или РРМ1 (фиг. 34В, справа).
Фиг. 35. СГО8 Т-клеточные ответы (выраженные в виде процентной доли дважды положительных (ГРЫу/ТЫРа)) в объединенных РВЬ, выделенных у мышей СВ6Р1, иммунизированных 1 мкг ЬУТ168 (ЗЕО ГО N0: 11), приготовленных с АЗ15 или только АЗ15, с последующей повторной стимуляцией банком из 46 пептидов (см. фиг. 9), покрывающим последовательность полноразмерного белка САЗВ7439 (фиг. 35А). СГО8 Т-клеточные ответы (выраженные в виде процентной доли дважды положительных (ГРНу/ТОТа)) в объединенных РВЬ, выделенных у мышей С57В1/6, иммунизированных 1 мкг ЬУТ168 (ЗЕО ГО N0: 11), приготовленных с АЗ15 или только АЗ15, с последующей повторной стимуляцией банком 46 пептидов (см. фиг. 9), покрывающим последовательность полноразмерного белка САЗВ7439 (фиг. 35В, слева); САЗВ7439 пептид 39 (ЗЕО ГО N0: 91) (фиг. 35В, середина) или КРМ1 (фиг. 35В, справа).
Подробное описание изобретения
Единственным препятствием для коммерчески приемлемых иммунотерапевтических агентов является получение коммерчески приемлемых количеств рекомбинантного ракового антигена. В общем и без ограничения, коммерчески приемлемый уровень продукции рекомбинантного полипептида составляет примерно 5% от общего белка, продуцируемого клеткой-хозяином, что оценивают при помощи окрашивания геля ЗЭЗ-РЛСЕ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) красителем Кумасси.
Существует множество причин того, почему нативная полипептидная последовательность может обеспечивать выход только небольших количеств при получении рекомбинантными способами. Подходы для увеличения продукции полипептида включают изменение системы экспрессии хозяина или оптимизацию кодона. Тем не менее, эти стандартные подходы не всегда приводят в результате к приемлемой продукции полипептида, и продукция некоторых полипептидов остается невозможной в коммерческих целях. Как более подробно описано ниже, заявители изучали, будет ли модифицированный полипептид САЗВ7439 продуцировать приемлемые белковые уровни при использовании рекомбинантных средств.
В некоторых воплощениях предложены модифицированные полипептиды САЗВ7439, где модификация состоит из или включает С-концевое усечение полипептида САЗВ7439, так что удаляют весь или фрагмент богатой пролином области. В некоторых воплощениях модификация полипептида САЗВ7439 состоит из или включает делецию всей или фрагмента богатой пролином области. В некоторых воплощениях предложены модифицированные полипептиды САЗВ7439, которые сохраняют, по меньшей мере, аминокислотную последовательность 193 из ЗЕО ГО N0: 13, но где вся богатая пролином область или
- 5 020617 ее фрагмент удален.
В других воплощениях предложены белковые конструкции, содержащие модифицированный полипептид СА8В7439, описанный ниже. В некоторых воплощениях такие белковые конструкции дополнительно содержат один или более гетерологичный полипептид. В некоторых воплощениях гетерологичный полипептид представляет собой партнер слияния, как описано здесь более подробно. В особенно подходящих воплощениях такие белковые конструкции содержат гетерологичный полипептид, располагающийся с Ν-конца относительно модифицированного полипептида СА8В7439. В других особенно подходящих воплощениях предложены белковые конструкции, где гетерологичный полипептид представляет собой фрагмент белка Ό НапПисп/ас (как более подробно описано ниже), располагающийся с Ν-конца модифицированного полипептида СА8В7439.
В некоторых воплощениях предложены белковые конструкции, где гетерологичный полипептид содержит полигистидиновую область. В дополнительных воплощениях полигистидиновая последовательность располагается в С-концевой области белковой конструкции. В других воплощениях полигистидиновая последовательность располагается на С-конце белковой конструкции. В дополнительных воплощениях полигистидиновая последовательность располагается в Ν-концевом фрагменте белковой конструкции. В других воплощениях полигистидиновая последовательность располагается на Ν-конце белковой конструкции. В подходящих воплощениях полигистидиновая область содержит десять или более последовательных гистидиновых остатков. В особенно подходящих воплощениях полигистидиновая область содержит десять или более последовательных гистидиновых остатков, располагающихся на Ν-конце модифицированного полипептида СА8В7439. В некоторых воплощениях более чем одна полигистидиновая область может быть включена по одной или более из описанных здесь областей.
В некоторых воплощениях предложены белковые конструкции, где гетерологичный полипептид представляет собой белок-носитель, химически конъюгированный с модифицированным полипептидом СА8В7439.
В некоторых воплощениях предложены белковые конструкции, содержащие гетерологичный полипептид, представляющий собой полигистидиновую область, и гетерологичный полипептид, представляющий собой белок-носитель. В некоторых воплощениях предложены белковые конструкции, содержащие гетерологичный полипептид, представляющий собой полигистидиновую область, и гетерологичный полипептид, представляющий собой партнер слияния. В некоторых воплощениях предложены белковые конструкции, содержащие гетерологичный полипептид, представляющий собой полигистидиновую область, гетерологичный полипептид, представляющий собой партнер слияния, и гетерологичный полипептид, представляющий собой белок-носитель.
Заявители также раскрыли воплощения каждой из конструкций, описанных здесь, в которых некоторые или все из гетерологичных полипептидов, таких как полигистидиновая область, удалены. Композиции и способы удаления гетерологичных полипептидов известны в области техники, включая, без ограничения, расщепление эндо- или экзопептидазами, химическую модификацию или расщепление связи между гетерологичным полипептидом и оставшейся частью молекулы и т.п.
Заявители также раскрыли здесь иммуногенные композиции, содержащие любой модифицированный полипептид СА8В7439 или белковую конструкцию, включающую описанный здесь модифицированный полипептид СА8В7439, и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, где носитель или эксципиент могут возможно содержать буфер. В некоторых аспектах эти композиции дополнительно содержат адъювант. В некоторых аспектах эти композиции содержат адъювант, который вызывает, по меньшей мере, ТЫ иммунный ответ. В некоторых аспектах описанный здесь адъювант содержит по меньшей мере одно из следующего: 3Ό-ΜΡΕ (монофосфориллипид), 0821 и СрО. В некоторых воплощениях композиция содержит 3Ό-ΜΡΕ. В других воплощениях композиция содержит СрО. В некоторых воплощениях композиция содержит 0821. В некоторых воплощениях композиция содержит 0821 и холестерин. В некоторых воплощениях композиция содержит холестерин, 3Ό-ΜΡΕ и 0821 в липосомальной композиции.
Заявители также раскрыли здесь молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие полинуклеотидные последовательности, кодирующие модифицированные СА8В7439 полипептиды и описанные здесь конструкции. В некоторых воплощениях раскрыт вектор, содержащий такие описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях вектор содержит прокариотический экспрессирующийся вектор. В некоторых воплощениях вектор содержит эукариотический экспрессирующийся вектор. В некоторых воплощениях полинуклеотидная последовательность, кодирующая конструкцию, оптимизирована по кодонам для экспрессии в клетке-хозяине.
Заявители также раскрыли клетки-хозяева, содержащие (1) описанную здесь молекулу нуклеиновой кислоты или (2) вектор, содержащий описанную здесь молекулу нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях клетка-хозяин выбрана из группы: бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток млекопитающих.
В некоторых воплощениях предложена иммуногенная композиция, содержащая (1) описанную здесь молекулу нуклеиновой кислоты или (2) вектор, содержащий описанную здесь молекулу нуклеиновой кислоты, и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
- 6 020617
В некоторых воплощениях предложено применение модифицированных полипептидов СА8В7439 или описанных здесь белковых конструкций (или кодирующих их молекул нуклеиновой кислоты) в изготовлении лекарственного средства для лечения колоректального рака. В некоторых воплощениях раскрыты описанные здесь модифицированные полипептиды СА8В7439 или белковые конструкции (или кодирующие их молекулы нуклеиновой кислоты) для применения в терапии, в частности для терапии колоректального рака. В некоторых воплощениях предложены способы индукции иммунного ответа против СА8В7439 у субъекта, страдающего от колоректального рака, где в способе осуществляют (1) выбор субъекта, страдающего от колоректального рака; и (2) введение субъекту эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей описанный здесь модифицированный полипептид СА8В7439 или белковую конструкцию, и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, где носитель или эксципиент могут возможно содержать буфер. В некоторых воплощениях раскрытых здесь способов иммуногенная композиция дополнительно содержит адъювант. В некоторых воплощениях описанного здесь способа адъювант вызывает, по меньшей мере, ТЫ иммунный ответ. В некоторых воплощениях раскрытого здесь способа адъювант содержит по меньшей мере один из: 3Ό-ΜΡΕ, 0821 и СрО. В некоторых воплощениях описанного здесь способа субъект представляет собой человека.
Белковые конструкции
Полипептиды СА8В7439.
СА8В7439, как он здесь назван, также известен как НА8Н2 или А8СЬ2. НА8Н2 представляет собой полипептид человеческого происхождения из 193 аминокислотных остатков (8ЕО ГО N0: 13). См., например, № ААВ86993. Здесь ссылка на СА8В7439 сделана с точки зрения полипептидной последовательности, предложенной в 8Е0 ГО N0: 13.
Богатая пролином область.
Область высокой пролиновой периодичности обнаружена в 8Е0 ГО N0: 13 в области аминокислот 127-158. Заявители назвали область 8Е0 ГО N0: 13 с аминокислоты 133 по аминокислоту 153 включительно как богатая пролином, полипролиновая, полипролин-подобная или полипро область или домен. Соответственно, используемые здесь термины богатая пролином, полипролиновая, полипролин-подобная или полипро относятся к этой области (или домену) белка СА8В7439.
Модификации.
В этом описании предложены белковые конструкции, содержащие полипептид СА8В7439, содержащий по меньшей мере одну усиливающую экспрессию модификацию. В некоторых воплощениях фрагмент полипептида СА8В7439 удаляют, где указанный фрагмент содержит полноразмерную или фрагмент богатой пролином области. В некоторых воплощениях полноразмерный С-концевой фрагмент полипептида СА8В7439 удаляют, что приводит в результате к усеченному полипептиду СА8В7439, содержащему аминокислотные остатки 1-117 из 8Е0 ГО N0: 13. В некоторых воплощениях гетерологичный полипептид расположен на Оконце полипептида СА8В7439.
Используемый здесь термин усиление экспрессии или усиленная экспрессия в контексте модифицированного полипептида СА8В7439 относится к модификации, предназначенной для увеличения уровней экспрессии белковой конструкции, содержащей указанный модифицированный полипептид СА8В7439 по сравнению с экспрессией иным образом эквивалентной белковой конструкции, содержащей немодифицированный полипептид СА8В7439 8Е0 ГО N0: 13, т.е. тот же самый вектор, клеткахозяин и т.д.. Любые из способов, известных в области техники для определения количества белка, приемлемы для определения того, обладает ли заданная конструкция, содержащая модифицированный полипептид СА8В7439, увеличенным уровнем экспрессии по сравнению с иным образом эквивалентными белковыми конструкциями, содержащими немодифицированный полипептид СА8В7439. В некоторых воплощениях продукция может быть оценена с использованием 8И8-РАОЕ и окрашивания при помощи Кумасси голубого.
Удаление богатой пролином области.
В некоторых воплощениях модификация полипептида СА8В7439 включает делецию части богатой пролином области. В некоторых воплощениях модификация полипептида СА8В7439 включает делецию всей богатой пролином области. В некоторых воплощениях модификация полипептида СА8В7439 включает делецию аминокислот за пределами богатой пролином области дополнительно к делеции богатой пролином области.
В некоторых воплощениях модификацию осуществляют путем усечения С-концевого фрагмента 8Е0 ГО N0: 13. Таким образом, в некоторых воплощениях получают белковую конструкцию, в которой С-концевой аминокислотный остаток модифицированного полипептида СА8В7439 соответствует остатку, расположенному по Оконцу богатой пролином области 8Е0 ГО N0: 13. В некоторых воплощениях получают белковую конструкцию, в которой С-концевой аминокислотный остаток модифицированного полипептида СА8В7439 соответствует остатку, расположенному в богатой пролином области 8Е0 ГО N0: 13. В некоторых воплощениях С-концевой аминокислотный остаток модифицированного полипептида СА8В7439 соответствует аминокислотному остатку 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 или 152 в 8ЕО ГО N0: 13.
- 7 020617
В некоторых воплощениях модификация включает делецию части или всей богатой пролином области. В некоторых воплощениях модифицированная полипептидная последовательность СА8В7439 соответствует 5>ЕЭ ГО N0: 13, из которого удален 21 или более непрерывный аминокислотный остаток. Этот 21 или более последовательный остаток соответствуют непрерывной аминокислотной последовательности 5>ЕЭ ГО N0: 13, начиная по любому из остатков 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 или 152 включительно. В дополнительных воплощениях модифицированная полипептидная последовательность СА8В7439 соответствует 5>ЕЭ ГО N0: 13, из которой удален 21 последовательный аминокислотный остаток, где указанный 21 последовательный остаток начинается по любому из остатков 131,132 и 133.
В некоторых воплощениях модифицированная полипептидная последовательность СА8В7439 соответствует 5>ЕЭ ГО N0: 13, из которой удален один или более остаток 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153. В некоторых воплощениях модифицированная полипептидная последовательность СА8В7439 соответствует 5>ЕЭ ГО N0: 13, из которой удалены два или более последовательных аминокислотных остатка в области аминокислотных остатков 133153 включительно.
В некоторых воплощениях модифицированная полипептидная последовательность СА8В7439 соответствует 5>ЕЭ ГО N0: 13, из которой удалены остатки с 133 по 153 последовательности 5>ЕЭ ГО N0: 13 включительно. Примеры не ограничивающих объем изобретения воплощений включают следующие:
ЬУЬ055, 5ЕО ГО N0: 1 (аа);
ЬУЬ111, 5ЕО ГО N0: 3(аа);
ЬУЬ137, 5ЕО ГО N0: 5 (аа);
ЬУЬ141, 5ЕО ГО N0: 7(аа);
ЬУЬ144, 5ЕО ГО N0: 9 (аа) и
ЬУЬ168, 5ЕО ГО N0: 11 (аа).
Г етерологичные последовательности.
В некоторых воплощениях модифицированный полипептид СА8В7439 комбинирован с гетерологичным полипептидом. Термин гетерологичный в отношении молекулы нуклеиновой кислоты, полипептида или другого клеточного компонента указывает на то, что имеется компонент, в норме не обнаруживаемый в природе, и/или что он происходит из отличающегося от референсной молекулы источника или видов. Использованные здесь гетерологичные молекулы включают, без ограничения, слитые белки, белки-носители и последовательности для очистки.
В некоторых воплощениях гетерологичный полипептид может быть химически конъюгирован с модифицированным полипептидом СА8В7439, т.е. белком-носителем. В других воплощениях гетерологичный полипептид и модифицированный полипептид СА8В7439 могут экспрессироваться в виде единичного рекомбинантного слитого белка. В других воплощениях модифицированный полипептид СА8В7439 и гетерологичный полипептид экспрессируются в виде единичного рекомбинантного слитого белка и химически конъюгированного с другим гетерологичным полипептидом.
Гетерологичный полипептид может способствовать получению Т-хелперных эпитопов, включая Т-хелперные эпитопы, распознаваемые у людей. В случае белковой конструкции, содержащей полипептид СА8В7439 и гетерологичный полипептид, который представляет собой слитый белок, гетерологичный полипептид (партнер слияния) может способствовать получению таких эпитопов или способствовать экспрессии белка (усилитель экспрессии) с более высокими выходами по сравнению с нативным рекомбинантным белком. Партнер слияния может представлять собой иммунологический партнер слияния и партнер, усиливающий экспрессию.
Белки-носители.
Белок-носитель химически конъюгирован с другим целевым полипептидом. Химическое связывание полипептида с белком-носителем может быть осуществлено при помощи любого из способов, известных в области техники. Таким образом, для прямого ковалентного связывания можно использовать карбодиимид, глутаровый альдегид или ^[у-малеимидобутирилокси]сукцинимидный эфир с использованием обычных имеющихся в продаже гетеробифункциональных линкеров, таких как С'БАР и 8РБР (с использованием указаний производителей). После реакции связывания конъюгат полипептид-белокноситель легко может быть выделен и очищен при помощи способов диализа, способа гель-фильтрации, способа фракционирования и т.д.
Типы белков-носителей, используемых в некоторых воплощениях, известны специалистам в данной области техники. Функция некоторых белков-носителей заключается в том, чтобы обеспечить помощь цитокинам для того, чтобы способствовать индукции иммунного ответа против связанного полипептида. Например, неполный перечень белков-носителей, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включает: гемоцианин лимфы улитки (КЬН), сывороточные альбумины, такие как бычий сывороточный альбумин (В8А), инактивированные бактериальные токсины, такие как столбнячный или дифтерийный токсины (ТТ и БТ), или их рекомбинантные фрагменты (например, домен 1 фрагмента С из ТТ или домен транслокации БТ), или очищенный белок, происходящий из туберкулина (РРБ).
- 8 020617
Партнеры слияния.
Несмотря на то что имеется множество генетических слитых систем, экспрессия рекомбинантного белка в ЕзсЬепсЫа соП остается затруднительной. Разработка партнера слияния, который в наилучшей степени усиливает экспрессию сложных для экспрессии белков, остается эмпирической задачей. Обычные партнеры слияния включают С-концы белка, связывающего мальтозу (МВР), глутатион δ-трансферазу (О8Т), тиоредоксин (ТЕХ), Νυδ А, убиквитин (ИЬ) и небольшие последовательности убиквитин-подобного модификатора (8ИМО), каждый из которых описан в литературе. См., например, МагЬ1ез!опе (2006), Рго1еш δα. 15:182-7; Нип! (2005), Рто1еш Ехр. & РитИ, 40:1-22; НаттагзЮт е! а1. (2002), Рго1еш δα. 11:313-321.
Иммуногенные партнеры слияния включают белок И НаеторЬНиз тЛиеп/а В и неструктурный белок вируса гриппа, Νδ1 (гемагглютинин). Другой иммунологический партнер слияния представляет собой белок, известный как ЬУТА. Может быть использован С-концевой фрагмент молекулы. ЬУТА происходит из δΐ^ерΐососсиз рпеитоша, синтезирующего Ν-ацетил-Ь-аланинамидазу, амидазу ЬУТА (кодируемую геном 1у!А Оатаа е! а1. (1986), Оепе, 43:265-272). Можно использовать повторяющийся фрагмент молекулы Ьу1а, обнаруженный на С-конце, начиная с остатка 178, например остатки 188-305. Другой подходящий партнер слияния представляет собой белок аденилатциклазу (СуаА) или его фрагмент, где указанный фрагмент СуаА сохраняет свойство указанного белка аденилатциклазы нацеливания на антигенпрезентирующие клетки, см. АО 2005/089792.
В одном из воплощений изобретения гетерологичный полипептид представляет собой белок И НаеторЬНиз тЛиеп/ае (ЕР 0594610 В1) или его фрагмент. Белок И представляет собой 1дИ-связывающий белок НаеторЬНиз тЛиеп/ае (АО 91/18926, выданный как ЕР 0594610 В1). В некоторых случаях, например, в системах экспрессии рекомбинантного иммуногена может быть желательно использовать Ν-концевые фрагменты белка И, например, содержащие от приблизительно 100 до приблизительно 110 Ν-концевых аминокислот белка И (ОВ 9717953.5) (рИ1/3, δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 39).
Белок И НлпЛиеп/ае синтезируется в виде предшественника с 18 аминокислотной сигнальной последовательностью (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 41, см. также номер ААА24998). Когда сигнальная последовательность процессируется во время секреции, тогда цистеиновый остаток в положении 19 в молекулепредшественнике становится Ν-концевым остатком.
В одном из воплощений гетерологичная полипептидная последовательность содержит приблизительно первую треть процессированной молекулы белка И НлпЛиеп/ае или Ν-концевые 100-110 аминокислот процессированного белка И. В одном из воплощений гетерологичный белок содержит аминокислотные остатки Ме!-Азр-Рго, связанные с Ν-концевыми 109 аминокислотами процессированного белка Ό. В еще одном воплощении гетерологичный белок содержит аминокислотные остатки Ме!-Азр-Рго, связанные с аминокислотными остатками 2-109 процессированного белка Ό (δΕΟ ΙΌ ΝΟ: 39).
В одном из воплощений модифицированный полипептид САδВ7439 или белковая конструкция химически связана с белком СуаА или его фрагментом, см. АО 2005/054851. В еще одном воплощении модифицированный полипептид САδВ7439 или белковая конструкция химически связана с В субъединицей токсина Шига или его иммунологически функциональным эквивалентом, см. патент США № 6613882; АО 02/060937; АО 2005/112991.
Полигистидиновые последовательности, неродственные аминокислоты.
Часто благоприятным является включение гетерологичного полипептида, содержащего секреторную или лидерную последовательности, пропоследовательности, последовательности, способствующие очистке, такие как гистидиновая метка, например, полигистидиновая последовательность (состоящая из множественных гистидиновых остатков), или дополнительную последовательность для стабильности во время рекомбинантной продукции.
Векторы и наборы с гистидиновыми метками имеются в продаже. Например, векторы для добавления к полипептиду метки из шести гистидиновых молекул доступны от ЕосЬе. Наборы для приготовления и применения полипептидов с гистидиновыми метками доступны от 01адеп. δίβΐηπ. ТЬегто δс^епι^Πс. ОЕ НеаЬЬсате и т.п. За гистидиновой последовательностью может также следовать подходящая аминокислотная последовательность, облегчающая удаление полигистидиновой последовательности с использованием эндопептидаз. Эндопептидаза, например 01адеп ТАО2уте, может быть использована для удаления концевой полигистидиновой последовательности без дополнительной последовательности.
В некоторых воплощениях полигистидиновая последовательность располагается в Ν-концевой области белковой конструкции. В дополнительных воплощениях полигистидиновая последовательность располагается на Ν-конце белковой конструкции. В некоторых воплощениях полигистидиновая последовательность содержит 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше последовательных гистидинов. В дополнительных воплощениях полигистидиновая последовательность содержит десять последовательных гистидинов.
В некоторых воплощениях гетерологичный полипептид включает полигистидиновую последовательность и одну или более неродственную аминокислоту. Под неродственными аминокислотами подразумевают одну или более аминокислоту, которая не является частью полигистидиновой последовательности или слитого белка и в природе не является частью полипептидной последовательности
- 9 020617
СА8В7439. Например, неродственные аминокислоты могут представлять собой аминокислоты, включенные в предложенный пептидазный сайт, они могут просто представлять собой внешнюю последовательность, такую как артефакт клонирования и т.п.
Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие конструкции СА8В7439
Другие воплощения этого описания относятся к рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим описанные здесь модифицированные полипептиды СА8В7439 и белковые конструкции. В некоторых воплощениях рекомбинантные нуклеиновые кислоты оптимизированы по кодонам для экспрессии в выбранных прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах. Для облегчения репликации и экспрессии нуклеиновые кислоты могут быть включены в вектор, такой как прокариотический или эукариотический экспрессирующийся вектор. Клетки-хозяева, включающие рекомбинантные модифицированные СА8В7439 полипептиды или нуклеиновые кислоты, кодирующие белковую конструкцию, также представляют собой характеристику данного описания. Благоприятные клетки-хозяева включают прокариотические (т.е. бактериальные) клетки-хозяева, такие как Е.соН, а также многочисленные эукариотические клетки-хозяева, включая клетки грибов (например, дрожжи), клетки насекомых и клетки млекопитающих (такие как клетки НЕК-293 (человеческие эмбриональные почечные клетки), СН0 (клетки яичника китайского хомячка) и νΈΚ0 (клетки почки африканской зеленой мартышки)).
Экспрессирующиеся векторы.
Для облегчения репликации и экспрессии нуклеиновые кислоты могут быть включены в вектор, такой как прокариотический или эукариотический экспрессирующийся вектор. Хотя раскрытые здесь нуклеиновые кислоты могут быть включены в любой из множества векторов (включая, например, бактериальные плазмиды; фаговую ДНК; бакуловирус; дрожжевые плазмиды; векторы, происходящие из комбинаций плазмид и фаговой ДНК, ДНК вирусов, таких как вирус оспы, аденовирус, вирус оспы птиц, вирус псевдобешенства, аденовирус, аденоассоциированный вирус, ретровирусы и множество других), наиболее обычный вектор представляет собой экспрессирующийся вектор, подходящий для получения продуктов полипептидной экспрессии. В экспрессирующемся векторе нуклеиновая кислота, кодирующая белковую конструкцию, типично расположена поблизости и ориентирована к соответствующей последовательности, контролирующей транскрипцию (промотор, и возможно одному или более энхансеру) для управления синтезом мРНК. То есть, интересующая полинуклеотидная последовательность функционально связана с соответствующей последовательностью, контролирующей транскрипцию. Примеры таких промоторов включают предранний промотор СМV, ЬТК или промотор 8ν40, полигедроновый промотор бакуловируса, промотор 1ас или Егр Е.соН, промотор фага Т7 и лямбда РЬ и другие промоторы, известные для контроля экспрессии генов в прокариотических или эукариотических клетках или соответствующих вирусах. Экспрессирующийся вектор типично также содержит сайт связывания с рибосомой для инициации трансляции и терминатор транскрипции. Вектор возможно включает соответствующие последовательности для увеличения экспрессии. Кроме того, экспрессирующиеся векторы возможно содержат один или более селективный маркерный ген для обеспечения фенотипического признака для отбора трансформированных клеток-хозяев, такой как дигидрофолатредуктаза или резистентность к неомицину для культуры эукариотических клеток или такой как резистентность к тетрациклину или ампициллину у Е соН.
Примеры способов, достаточных для ознакомления специалиста в данной области техники с продукцией нуклеиновых кислот рекомбинантного СА8В7439, можно найти в 8атЬгоок еЕ а1., Мо1еси1аг С1ои1ид: А ЬаЬогаЕогу Мапиа1, 2пй ей., Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬогаЕогу Рге§5, 1989; 8атЬгоок еЕ а1., Мо1еси1аг С1оп1пд: А ЬаЬогаЕогу Мапиа1, 3пй ей., Со1й 8ргшд НагЬог Рге§5, 2001; Аи5иЬе1 еЕ а1., СиггепЕ РгоЕосок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬНкНтд Л55ос1а1е5. 1992 (и дополнения к 2003) и Аи5иЬе1 еЕ а1., 8НогЕ РгоЕосок т Мо1еси1аг Вю1оду: А Сотрепйшт оГ МеЕНойк Ггот СиггепЕ РгоЕосок ш Мо1еси1аг Вю1оду, 4|Н ей., \УПеу & 8оп§, 1999.
Примеры молекул нуклеиновых кислот, кодирующих белковые конструкции, представлены 81%) ГО N0: 2, 81%) ГО N0: 4, 81%) ГО N0: 6, 81%) ГО N0: 8, 81%) ГО N0: 10 и 81%) ГО N0: 12. Дополнительные варианты последовательности, которые обладают идентичной последовательностью с взятой для примера молекулой нуклеиновой кислоты, могут быть получены специалистами в данной области техники. Типично, варианты нуклеиновой кислоты кодируют полипептиды, отличающиеся не более чем на 1, или 2, или 5, или 10, или 15, или 20% по аминокислотным остаткам. То есть, кодируемые полипептиды обладают по меньшей мере 80 или 85%, более типично по меньшей мере приблизительно 90% или большей, такой как 95, 98, 99 или 99,5%, идентичностью последовательности. Специалистам в данной области техники понятно, что полинуклеотидные последовательности, кодирующие белковые конструкции, сами могут обладать меньшей идентичностью последовательности вследствие вырожденности генетического кода. В некоторых случаях модифицированный полипептид СА8В7439 или белковая конструкция имеют модификацию одной или более аминокислоты относительно аминокислотной последовательности, изложенной здесь, используемой в качестве примера конструкции (например, дополнительно к вышеупомянутым модификациям). Такие отличия могут представлять собой добавление, делецию или замену одного или более нуклеотида или аминокислоты соответственно. Вариант, как правило, отличается не более чем приблизительно 1, или 2, или 5, или 10, или 15, или 20, или 25, или 30% нуклеотидных
- 10 020617 остатков. Например, вариант нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид СА8В7439 или белковую конструкцию, может включать 1, или 2, или до 5, или до приблизительно 10, или до приблизительно 15, или до приблизительно 50, или до приблизительно 100 нуклеотидных различий по сравнению с используемыми в качестве примера нуклеиновыми кислотами, кодирующими полипептид СА8В7439 или белковую конструкцию в соответствии с последовательностями 8ЕО ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 4, 8Е0 ГО N0: 6, 8Е0 ГО N0: 8, 8Е0 ГО N0: 10 и 8Е0 ГО N0: 12. Таким образом, вариант в контексте нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид СА8В7439 или белковую конструкцию, типично обладает по меньшей мере 70, или 75, или 80, или 85, или 90, или 95, или 98, или 99, или 99,5% идентичностью последовательности с референсной последовательностью, например референсной последовательностью, проиллюстрированной как 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 4, 8Е0 ГО N0: 6, 8Е0 ГО N0: 8, 8Е0 ГО N0: 10 и 8Е0 ГО N0: 12, или любые другие из раскрытых здесь примеров нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид СА8В7439 или белковую конструкцию. Дополнительные варианты могут возникать в результате генетического дрейфа или могут быть получены искусственно с использованием сайтнаправленного или произвольного мутагенеза или путем рекомбинации двух или более предварительно существующих вариантов. Такие дополнительные варианты также подходят в контексте раскрытого здесь полипептида СА8В7439 или белковых конструкций.
Дополнительно к ранее описанному варианту нуклеиновой кислоты, нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с одним или более из примеров нуклеиновых кислот, представленных 8Е0 ГО N0: 2, 81Т) ГО N0: 4, 81 У) ГО N0: 6, 81 У) ГО N0: 8, 81 У) ГО N0: 10 и 81 У) ГО N0: 12, также могут быть использованы для того, чтобы кодировать раскрытые здесь полипептиды СА8В7439 или белковые конструкции. Специалисту в данной области техники понятно, что дополнительно к обсуждающейся здесь процентной доле (%) меры идентичности последовательности другой признак сходства последовательности между двумя нуклеиновыми кислотами заключается в способности гибридизоваться. Чем ближе последовательности двух нуклеиновых кислот, тем более строгими являются условия, в которых они гибридизуются. Строгость условий гибридизации зависит от последовательности и отличается при различных параметрах окружающей среды. Таким образом, условия гибридизации, приводящие в результате к конкретной степени строгости, варьируют в зависимости от природы выбранного способа гибридизации и композиции и длины гибридизуемой последовательности нуклеиновой кислоты. Как правило, температура гибридизации и ионная сила (в особенности концентрация №Е и/или Мд) буфера для гибридизации определяют строгость условий гибридизации, хотя значения времени промывания также влияют на строгость. Как правило, строгие условия выбирают такими, что они приблизительно на 5-20°С ниже температуры плавления (Тт) специфической последовательности при определенной ионной силе и рН. Тт представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% последовательности-мишени гибридизуется с наиболее подходящим зондом. Условия для гибридизации нуклеиновой кислоты и расчет строгости условий можно найти, например, в 8атЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз, Со1б 8ргшд НагЬог, ОТ, 2001; Туззеи, НуЬп<к/аОоп \νί11ι Шс1е1с Ааб РгоЬез, Рай I: Тйеогу аиб Шскю Ааб Ргерагайои, ЬаЬога1огу Тескпкщез ίη ВюскепизЦу аиб Мо1еси1аг Вю1оду, Е18еу1ег 8аеисе Нб.. ΗΥ, №Υ, 1993 и Аи8иЬе1 е1 а1. 81юг1 РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 4'1' еб., 1оЬи \УПеу & 8оиз, 1ис., 1999.
Для задач настоящего описания строгие условия охватывают условия, при которых гибридизация происходит только в том случае, если имеется меньше 25% несовпадений между гибридизуемой молекулой и последовательностью-мишенью. Строгие условия могут быть классифицированы до конкретной степени строгости для более точного определения. Таким образом, используемый здесь термин умеренно строгие условия представляют собой такие условия, при которых молекулы с более чем 25% несовпадениями последовательности не будут гибридизоваться; условия средней строгости представляют собой условия, в которых молекулы с более чем 15% несовпадений не будут гибридизоваться, и условия высокой строгости представляют собой условия, при которых последовательности с более чем 10% несовпадениями не будут гибридизоваться. Условия очень высокой строгости представляют собой условия, в которых последовательности с более чем 6% несовпадениями не будут гибридизоваться. Наоборот, нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются в условиях низкой строгости, включают кислоты с гораздо меньшей идентичностью последовательности или с идентичностью последовательности только на очень коротких подпоследовательностях нуклеиновой кислоты. Таким образом, понятно, что различные варианты нуклеиновых кислот, которые охватываются этим изобретением, способны гибридизоваться в строгих условиях по меньшей мере с одной из 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 4, 8Е0 ГО N0: 6, 8Е0 ГО N0: 8, 8Е0 ГО N0: 10 и 8Е0 ГО N0: 12, по существу, по всей их длине.
Продукция белковых конструкций
Раскрытые здесь белковые конструкции могут быть получены с использованием признанных способов экспрессии и очистки рекомбинантных белков. Способы, достаточные для ознакомления специалиста в данной области техники, можно найти в следующих ссылках: 8атЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1отид: А ЬаЬога1огу Маииа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога1огу Ргезз, Со1б 8ргтд НагЬог, ОТ, 200 и Аи8иЬе1 е1 а1. 81юг1 РгоЮсоЕ т Мо1еси1аг Вю1оду, 4'1' еб., 1ойи \УПеу & 8оиз, 1ис., 999. Дополнительная и конкретная подробная информация приведена ниже.
- 11 020617
Рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие белковые конструкции, могут быть введены в клетки-хозяева при помощи множества хорошо известных способов, таких как электропорация, опосредованная липосомами трансфекция (например, с использованием имеющегося в продаже реагента для липосомальной трансфекции, такого как Ь1Р0РЕСТАМ1ИЕ™ 2000 или ТКАЖРЕСТШ™). осаждение фосфатом кальция, инфицирование, трансфекция и т.п., в зависимости от выбранных векторов и клетокхозяев.
Клетки-хозяева можно выращивать в обычных питательных средах, модифицированных таким образом, чтобы они подходили для активации промоторов, выбранных трансформантов или амплификации встроенных полинуклеотидных последовательностей. Условия выращивания, такие как температура, рН и т.п., типично являются такими, какие использовались ранее для клеток-хозяев, выбранных для экспрессии, и будут понятны специалистам в данной области техники и в цитированных здесь ссылках, включая, например, Ргекйпеу (1994), СиЙиге οί Атта1 Се11к, а Мапиа1 οί Вак1с Тесйп1цие, 1ййб ебШоп, ^йеу-Ыкк, №ν Уогк и цитированные там ссылки. В некоторых воплощениях подходящая температура культивирования составляет 16°С; в других - 37°С. Продукты экспрессии, соответствующие нуклеиновым кислотам по изобретению, также могут продуцироваться в клетках, отличающихся от клеток животных, таких как растения, дрожжи, грибы, бактерии и т.п. Дополнительно к 8атЬгоок, Вегдег апб АикиЬе1, подробную информацию, относящуюся к клеточной культуре, можно найти в Раупе е1 а1. (1992), Р1ап1 Се11 апб Т1ккие СиЙиге ш Екциб 8ук1етк 1ойп \Уйеу & 8опк, 1пс. Ега Уогк, КУ; СатЬогд апб Рйбйрк (ебк) (1995), Р1ап1 Се11, Т155ие апб 0гдап СиЙиге; РипбатепЫ Мебюбк 8рппдег ЬаЬ Мапиа1, 8ргшдег-Уег1ад (Вегйп Не1бе1Ьегд №ν Уогк) и Абак апб Рагкк (ебк), Тйе НапбЬоок οί МюгоЬю1одюа1 Меб1а (1993), СКС Ргекк, Воса КаЮп, РЬ.
Клетки-хозяева.
Таким образом, клетки-хозяева, которые включают нуклеиновые кислоты, кодирующие рекомбинантную белковую конструкцию, также представляют собой признак этого изобретения. Благоприятные клетки-хозяева включают прокариотические (т.е. бактериальные) клетки-хозяева, такие как Е.сой, а также многочисленные эукариотические клетки-хозяева, включая клетки грибов (например, дрожжей, таких как 8ассйаготусек сегеуыае и РюсЫа ракЮпк), клетки насекомых, клетки растений и клетки млекопитающих (такие как клетки СНО). Нуклеиновые кислоты, кодирующие рекомбинантный белок, вводят (например, трансдуцируют, трансформируют или трансфицируют) в клетки-хозяева, например, при помощи вектора, такого как экспрессирующий вектор.
Как здесь описано, вектор наиболее типично представляет собой плазмиду, но такие векторы также могут представлять собой, например, вирусную частицу, фаг и т.д. Примеры подходящих экспрессирующих хозяев включают бактериальные клетки, такие как Е.сой, 81гер1отусек и 8а1топе11а 1урЫтигшт; клетки грибов, такие как 8ассйаготусек сегеу1К1ае, РюЫа ракЮпк и №игокрога сгакка; клетки насекомых, такие как Эгокорйба и 8робор1ега йидрегба; клетки млекопитающих, такие как 3Т3, С08, СН0, ВНК, НЕК293 или Во\\ек те1апота; клетки растений, включая клетки водорослей, и т.д.
Клетка-хозяин возможно выбрана по ее способности модулировать экспрессию встроенной последовательности или процессировать экспрессированный белок желаемым образом. Такие модификации белка включают гликозилирование (а также, например, ацетилирование, карбоксилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование), но не ограничиваются ими. Посттрансляционный процессинг, например, расщепляющий форму-предшественника на зрелую форму белка (например, посредством фуриновой протеазы), возможно осуществляют в контексте клетки-хозяина. Различные клетки-хозяева, такие как 3Т3, С08, СН0, НеЬа, ВНК, МОСК, НЕК293, ^138 и т.д., обладают специфическим клеточным аппаратом и характерными механизмами для таких посттрансляционных активностей и могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга введенного чужеродного белка.
Для длительной продукции с высоким выходом раскрытых здесь рекомбинантных белковых конструкций типично используют стабильные системы экспрессии. Например, молекулы нуклеиновой кислоты, которые стабильно экспрессируют белковую конструкцию, вводят в клетку-хозяина с использованием экспрессирующих векторов, которые содержат вирусные ориджины репликации или эндогенные экспрессирующие элементы и селективный маркерный ген. После введения вектора клетки оставляют расти в течение 1-2 суток в обогащенных средах, а затем переводят в селективные среды. Задача селективного маркера заключается в том, чтобы придать резистентность для отбора, и его присутствие дает возможность для роста и выделения клеток, которые успешно экспрессируют введенные последовательности. Например, резистентные группы или колонии стабильно трансформированных клеток могут быть распространены с использованием способов обращения с культурой ткани, подходящих для типа клеток. Клетки-хозяева, трансформированные нуклеиновой кислотой, кодирующей белковую конструкцию, возможно выращивают в условиях, подходящих для экспрессии и выделения кодируемого белка из клеточной культуры.
Экспрессированные белковые конструкции могут быть выделены и очищены из рекомбинантных клеточных культур при помощи любого из множества способов, хорошо известных в области техники, включая осаждение сульфатом аммония или этанолом, кислотную экстракцию, фильтрацию, ультрафильтрацию, центрифугирование, анион- или катионообменную хроматографию, фосфоцеллюлозную
- 12 020617 хроматографию, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию (например, с использованием любой из указанных здесь систем маркирующих последовательностей), гидроксилапатитную хроматографию и лектиновую хроматографию. Могут быть использованы желаемые стадии рефолдинга белка для заключительной конфигурации зрелого белка. Наконец, высокоэффективная жидкостная хроматография (НРЬС) может быть использована для конечных стадий очистки. Дополнительно к указанным здесь ссылкам, в области техники хорошо известны различные способы очистки, включая, например, изложенные в 8апйапа (1997), Вюкерагайоп οί Рго1ешк, Асайет1с Ргекк, 1пс.; Во11ад е! а1. (1996), Рго1ет Ме!Ьойк, 2'1 Εάίΐίοη ^йеу-Ыкк, ΝΥ; \Уа1кег (1996) Рго1ет РгоЮсо1к НапйЬоок Нитапа Ргекк, N1, Натк апй Апда1 (1990), Рго1еш Риййсайоп Аррйсайопк: А Ргасйса1 АрргоасЬ 1КЬ Ргекк а! ОхГогй, ОхГогй, и.К.; 8сорек (1993), РгоЮш Риййсайоп: Рйпщр1ек апй Ргасйсе 3гй Еййюп Брйпдег Уег1ад, ΝΥ; кткоп апй Куйеп (1998), Рго1ет Риййсайоп: Рйпар1ек, НщЬ Кеко1ийоп Мейюйк апй Аррйсайопк, 8есопй Еййюп ^йеу-УСН, ΝΥ и \Уа1кег (1998), Рго1ет Рго1осо1к оп СО-КОМ Нитапа Ргекк, N1.
В некоторых примерах нуклеиновые кислоты вводят в клетки посредством векторов, подходящих для введения и экспрессии в прокариотических клетках, например клетках Е.сой. Например, нуклеиновая кислота, включающая полинуклеотидную последовательность, кодирующую белковую конструкцию, может быть введена в любой из множества имеющихся в продаже или индивидуально изготовленных векторов, таких как серии рЕТ экспрессирующих векторов (например, рЕТ9Ь и рЕТ2й). Экспрессию кодирующей последовательности вызывает изопропил β-Ό-1-тиогалактопиранозид (1РТС), что приводит в результате к высоким уровням экспрессии белка. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая белковую конструкцию СА8В7439, транскрибируется под управлением промотора фага Т7. Также подходят альтернативные векторы, такие как рИКУ22, которые включают индуцируемый теплом промотор лямбда рЬ.
Экспрессирующий вектор вводят (например, путем электропорации) подходящему хозяинубактерии. Существуют многочисленные подходящие штаммы Е.сой, и они могут быть выбраны специалистом в данной области техники (например, штаммы ВЬК ΌΕ3, ВЬ21 ΌΕ3 и Кокейа ΌΕ3 признаны благоприятными для экспрессии рекомбинантных векторов, содержащих полинуклеотидные последовательности, которые кодируют белковые конструкции).
Возможно, что полинуклеотиды, кодирующие белковые конструкции, включены в экспрессирующие векторы, подходящие для введения и экспрессии у эукариот (например, насекомых или клетках млекопитающих). Благоприятным образом, такие нуклеиновые кислоты оптимизированы по кодонам для экспрессии в выбранном векторе/клетке хозяина. Выбранные клетки могут быть клонированы и охарактеризованы в отношении экспрессии желаемой белковой конструкции. Способы оптимизации кодона известны в области техники. Кроме того, коммерческие организации, обеспечивающие сервис в области молекулярной биологии, предлагают оптимизацию кодона, кроме других стандартных технических сервисов.
Прокариотические.
В бактериальных системах множество экспрессирующих векторов может быть выбрано в зависимости от предполагаемого применения экспрессируемого продукта. Например, когда большие количества полипептида или его фрагментов необходимы для продукции антител, тогда благоприятно использование векторов, которые обеспечивают высокий уровень экспрессии слитых белков, которые легко очищаются. Такие векторы включают мультифункциональные клонирующие и экспрессирующие векторы Ε^Η, такие как В^υΕ§СКIРТ (§1га1адепе), в которых интересующая кодирующая последовательность, например описанный здесь полинуклеотид по изобретению, может быть лигирована в векторе внутри рамки с последовательностями для Ν-концевой трансляции, инициируя метионин и последующие 7 остатков бета-галактозидазы продуцировать каталитически активный слитый с бета-галактозидазой белок; рШ векторы (Уап Нееке & 8сЬик1ег (1989), 1. Вю1. СЬет. 264:5503-5509); рΕТ векторы (Шуадеп, Майкоп ^1), в которых Ν-концевой метионин лигирован внутри рамки с гистидиновой последовательностью; и т.п., но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях подходящий вектор представляет собой рЕТ19; в других рЕТ24; в других рЕТ26.
Эукариотические.
Аналогично, в дрожжах, таких как 8ассЬаготусек сегеу1К1ае, множество векторов, содержащих конститутивные или индуцируемые промоторы, такие как альфа-фактор, алкогольоксидаза и РСН, может быть использовано для продукции желаемых продуктов экспрессии. Обзор см. в Вегдег, АикиЬе1, и, например, СгаЩ е! а/. (1987; Мейюйк ш Нп/утоКду 153:516-544). В клетках-хозяевах млекопитающих может быть использовано множество экспрессирующих систем, включая плазмиды и вирусные системы.
Иммуногенные композиции
Фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты.
Фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты хорошо известны и могут быть выбраны специалистом в данной области техники. Например, носитель или эксципиент благоприятным образом может включать буфер. Возможно, носитель или эксципиент также содержит по меньшей мере один компонент, который стабилизирует растворимость и/или стабильность. Примеры солюбилизато- 13 020617 ров/стабилизаторов включают детергенты, например лаурилсаркозин и/или Нуссп. Альтернативные солюбилизаторы/стабилизаторы включают аргинин и стеклообразующие полиолы (такие как сахароза, трегалоза и т.п.). Многочисленные фармацевтически приемлемые носители и/или фармацевтически приемлемые эксципиенты известны в области техники и описаны, например, в РспипдЮп'х РЬаттасеи11са1 8с1спсс5. Ьу Ε.ν. Матйи, Маск РиЬЬккид Со., Еайоп. РА, 5* Εάίίίοη (975).
Соответственно, подходящие эксципиенты и носители могут быть выбраны специалистами в данной области техники для получения композиции, подходящей для доставки субъекту при помощи выбранного пути введения.
Подходящие эксципиенты включают, без ограничения, глицерин, полиэтиленгликоль (РЕС), сорбит, трегалозу, Ν-лауроилсаркозин натриевую соль, Ь-пролин, недетергентный сульфобетаин, гуанидин гидрохлорид, мочевину, оксид триметиламина, КС1, Са2+, М§2+, Μη2+, Ζη2' и другие относящиеся к двухвалентному катиону соли, дитиотреитол, дитиоэритрол и β-меркаптоэтанол. Другие эксципиенты могут представлять собой детергенты (включая Туссп 80, Туееп 20, Ττίίοη Х-00, №-40, Етр1§еп ВВ, октилглюкозид, лаурилмальтозид, ΖΜίίοτ^ηί 3-08, Ζ^ίίΦτ^ηί 3-0, ΖΜίίοτ^ηί 3-2, Ζ^ίίίοτ^ηί 3-4, ΖΜίίοτ^ηί 3-6, СНАР8, дезоксихолат натрия, додецилсульфат натрия, бромид цетилтриметиламмония).
Адъюванты.
Возможно, иммуногенные композиции также включают адъювант. В контексте иммуногенной композиции, подходящей для введения субъекту, такому как субъект-человек, для задач индукции иммунного ответа против СА8В7439, адъювант выбран таким образом, чтобы индуцировать ТЫ иммунный ответ. Адъювант типично выбран таким образом, чтобы усилить ТЫ иммунный ответ у субъекта или популяции субъектов, которым вводят композицию.
ТЫ иммунный ответ.
ТЫ тип иммунного ответа характеризуется индукцией СЭ4+ Т-хелперных клеток, которые продуцируют 1Ь-2 и ΙΡΝγ. Наоборот,ТЬ2 тип иммунного ответа характеризуется индукцией СЭ4+ хелперных клеток, продуцирующих 1Ь-4, 1Ь-5 и 1Ь-13.
Аффекторы ТЬК, включая, без ограничения, 3Э-МРЕ
Один из подходящих адъювантов для применения в комбинации с модифицированными полипептидами СА8В7439 представляет собой модулятор ТЬК-4. Один из примеров представляет собой нетоксичное производное липида А, такое как монофосфориллипид А или, конкретней, 3-деацилированный монофосфориллипид А (3О-МРЬ). 30-МРЬ продается под названием МРЬ от С1ахо8тйЬК1те Вю1одюа18 8.А. и в документе обозначается как МРЬ или 3О-МРЕ см., например, патенты США № 4436727; 4877611; 4866034 и 4912094. 30-МРЬ прежде всего способствует СЭ4' Т-клеточным ответам с фенотипом ΙΡΝγ (ТЫ). 30-МРЬ может быть продуцирован в соответствии со способами, раскрытыми в СВ 2220211 А. Химически он представляет собой смесь 3-деацилированного монофосфориллипида А с 3, 4, 5 или 6 ацилированными цепями. В композициях по настоящему изобретению может быть использован 30-МРЬ с небольшим размером частиц. 30-МРЬ с небольшим размером частиц имеет такой размер частиц, что он может быть подвергнут стерильной фильтрации через фильтр 0,22 мкм. Такие препараты описаны в \УО 94/21292.
В других воплощениях липополисахарид может представлять собой β(1-6) глюкозаминовый дисахарид, описанный в патенте США № 6005099 и европейском патенте № 0729473 В1. Специалист в данной области техники способен легко получить различные липополисахариды, такие как 3О-МРЕ на основе информации, изложенной в указанных ссылках. Дополнительно к вышеупомянутым иммуностимуляторам (близким по структуре с ЬР8, или МРЬ, или 3П-МРЬ), ацилированные моносахаридные и дисахаридные производные, представляющие собой субфрагмент приведенной здесь структуры МРЬ, также представляют собой подходящие адъюванты. В других воплощениях адъювант представляет собой синтетические производные липида А, некоторые из которых описаны как агонисты ТЬК-4 и включают ОМ174 (2-дезокси-6-о-[2-дезокси-2-[(К)-3-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-офосфо-β -Ό-глюкопира нозил] -2-[(К) -3 -гидрокситетрадеканоиламино] -α-Ό глюкопиранозилдигидрофосфат), \УО 95/14026;
ОМ294 ОР (38,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-(К)-[(К)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол,1,10-бис-(дигидрофосфат), \УО 99/64301 и \УО 00/0462 и
ОМ197 МР-Ас ОР (38-,9К)-3-[(К)-додеканоилокситетрадеканоиламино]-4-оксо-5-аза-9-[(К)-3гидрокситетрадеканоиламино]декан-1,10-диол, 1-дигидрофосфат 10-(6-аминогексаноат), \УО 01/46127, но не ограничиваются ими.
Другие лиганды ТЬК-4, которые могут быть использованы, представляют собой алкил глюкозаминидфосфаты (АСР), такие как раскрытые в \УО 98/50399 или патенте США № 6303347 (также раскрыты способы получения), подходящим образом КС527 или КС529, или фармацевтически приемлемые соли АСР, как раскрыто в патенте США № 6764840. Некоторые АСР представляют собой агонисты ТЬК-4, а некоторые представляют собой антагонисты ТЬК-4. Полагают, что и те и другие полезны в качестве адъювантов.
Другие подходящие лиганды ТЬК-4, способные вызывать сигнальный ответ посредством ТЬК-4
- 14 020617 (8аЬгое е! а1., Л, 2003, р. 1630-5), представляют собой, например, липополисахарид грамотрицательных бактерий и его производные или его фрагменты, в частности нетоксичное производное ЬР8 (такое как 3Ό-ΜΡΕ). Другие подходящие агонисты ТЬК представляют собой белок теплового шока (Н8Р) 10, 60, 65, 70, 75 или 90; поверхностно-активный белок А, гиалуронановые олигосахариды, гепарансульфатные фрагменты, фибронектиновые фрагменты, фибриногеновые пептиды, в-дефенсин-2 и мурамилдипептид (ΜΌΡ). В одном из воплощений агонист ТЬК представляет собой Η8Ρ 60, 70 или 90. Другие подходящие лиганды ТЬК-4 являются такими, как описано в УО 2003/011223 и в УО 2003/099195, такие как соединение I, соединение II и соединение III, раскрытые на стр. 4, 5 в УО 2003/011223 или на стр. 3, 4 в УО 2003/099195 и, в частности, соединения, раскрытые в УО 2003/011223 как ЕК803022, ЕК803058, ЕК803732, ЕК804053, ЕК804057, ЕК804058, ЕК804059, ЕК804442, ЕК804680 и ЕК804764. Например, один из подходящих лигандов ТЬК-4 представляет собой ЕК804057.
Сапониновые адъюванты.
Другие адъюванты, которые могут быть использованы в иммуногенных композициях с СА8В7439, например, сами по себе или в комбинации с 3Ό-ΜΡΕ или другим описанным здесь адъювантом, представляют собой сапонины, такие как 0821.
Сапонины обсуждают в ЬасаШе-ОиЬо^, Μ. апб Уадпег Н. (1996), А ге\'1с\у οί 1Не Ью1одюа1 апб рЬагтасо1одюа1 асбуЮек οί каропшк. Ρ1ινΙοπκ6ίαικ. νοί 2, р. 363-386). Сапонины представляют собой стероидные или тритерпеновые гликозиды, широко распространенные среди растений и морских животных. Сапонины известны образованием коллоидных растворов в воде, которые вспениваются при встряхивании, и осаждением холестерина. Когда сапонины находятся рядом с клеточными мембранами, они формируют структуры типа пор в мембране, что приводит к нарушению мембраны. Гемолиз эритроцитов представляет собой пример этого явления, представляющего собой свойство некоторых, но не всех сапонинов.
Сапонины, в частности иммунологически активные фракции сапонинов, известны в качестве адъювантов в вакцинах для системного введения. Адъювант и гемолитическая активность индивидуальных сапонинов широко исследуются в области техники (ЪасаШе-ЭнЬоб апб Уадпег, выше). Например, Οιιίΐ А (полученный из коры южно-американского дерева Ош11а)а 8аропапа Μο1^иа) и его фракции описаны в И8 5057540 и 8аротп5 ак уассше абц.1Уап1к, КепкП, С.К., Сгб Реу ТЬег Эгид Сатег 8ук!, 1996, 12(1-2):155; и ЕР 0362279 В1. Структуры в виде частиц, названные иммуностимулирующими комплексами (I8СОΜ8), содержащие фракции Οιιίΐ А, являются гемолитическими и используются в приготовлении вакцин (Μο^е^η, В., ЕР 0109942 В1; УО 96/11711; УО 96/33739). Гемолитические сапонины 0821 и 0817 (фракции Οιιίΐ А, очищенные путем ВЭЖХ) описаны в качестве сильных системных адъювантов, и способ их получения раскрыт в патенте США № 5057540 и ЕР 0362279 В1. Другие сапонины, используемые в исследованиях по системному введению вакцин, включают вакцины, происходящие из других видов растений, таких как ОуркорЬба и 8аропапа (ВотГогб е! а1., Уассше, 10(9):572-577,1992).
Показано, что такие композиции, содержащие 0821 и холестерин, являются хорошими ТЬ1 стимулирующими адъювантами при приготовлении вместе с антигеном. Таким образом, например, СА8В7439 благоприятно может быть использован в иммуногенных композициях с адъювантом, содержащим комбинацию 0821 и холестерина.
Иммуностимулирующие олигонуклеиновые кислоты.
Один из подходящих адъювантов для применения в комбинации с СА8В7439 представляет собой агонист ТЬК бактериальной ДНК, способный вызывать сигнальный ответ посредством ТЬК-9, т.е. агонист ТЬК-9, более конкретно ДНК, содержащей неметилированные СрО нуклеотиды, в конкретных контекстах последовательностей, известных как мотивы СрО. СрО-содержащие олигонуклеотиды вызывают преимущественно ТЬ1 ответ. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в УО 96/02555, УО 99/33488 и патентах США № 6008200 и 5856462. Подходящим образом, нуклеотиды СрО представляют собой олигонуклеотиды СрО. Подходящие олигонуклеотиды для применения в иммуногенных композициях по настоящему изобретению представляют собой олигонуклеотиды, содержащие СрО, возможно содержащие два или более динуклеотидных СрО мотива, разделенных по меньшей мере тремя, подходящим образом по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Мотив СрО представляет собой цитозиновый нуклеотид с последующим гуаниновым нуклеотидом. Олигонуклеотиды СрО по настоящему изобретению типично представляют собой дезоксинуклеотиды. В конкретном воплощении межнуклеотидный компонент в олигонуклеотиде представляет собой фосфородитиоат, или подходящим образом фосфоротиоатную связь, хотя фосфодиэфир и другие межнуклеотидные связи входят в объем изобретения. Некоторые воплощения представляют собой олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоата описаны в патентах США № 5666153, 5278302 и УО 95/26204.
В альтернативном воплощении используют агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ посредством ТЬК-9. В одном из воплощений агонист ТЬК, способный вызывать сигнальный ответ посредством ТЬК-9, представляет собой Η8Ρ90. Комбинации различных адъювантов, таких как упомянутые здесь, также могут быть использованы в композициях с СА8В7439. Например, как уже указывалось, 0821 может быть приготовлен вместе с 3Ό-ΜΡΕ. Отношение Ο821:3Ό-ΜΡΕ, как правило, имеет порядок
- 15 020617 от 1:10 до 10:1; такой как от 1:5 до 5:1 и часто, по существу, 1:1. Как правило, отношение находится в диапазоне от 2,5:1 до 1:1 3Э-МРЕ:О821. Еще один адъювант комбинации представляет собой 3Э-МРБ вместе с 0821 в липосомальной композиции, также в комбинации с СрС.
Субъекты, имеющие колоректальный рак.
Выбор субъекта, имеющего колоректальный рак, для участия в описанных здесь способах может быть осуществлен при помощи клинической диагностики, молекулярной диагностики или их комбинации. В некоторых воплощениях субъекта тестируют для определения того, экспрессируют ли его раковые клетки СА8В7439 (НА8Н2). Клинические способы диагностики колоректального рака известны в области техники. Молекулярные способы и способы определения того, экспрессирует ли раковая клетка или ткань СА8В7439 (НА8Н2), раскрыты в \У0 01/62778.
Экспериментальные примеры
Пример 1.
Две молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие белковые конструкции, содержащие полипептид СА8В7439, конструировали в векторе рЕТ19Ь. Н15-метку располагали рядом с ^концом последовательности СА8В7439. Эти клоны назвали ЬУЬ007 [8Е0 ГО N0: 15(аа); 8Е0 ГО N0: 16 (ДНК)] и ЬУЬ010 [8Е0 ГО N0: 17 (аа); 8Е0 ГО N0: 18 (ДНК)] соответственно). Наблюдали, что имела место непреднамеренная мутация в клоне ЬУЕ007, приводя в результате к одной аминокислотной замене пролина на лейцин (по аминокислотному остатку 17 относительно 8Е0 ГО N0: 13). Молекулы нуклеиновой кислоты использовали с тремя различными типами клеток-хозяев, а именно штаммами Е.соП ВЬК ЭЕ3. ВЬ21 ЭЕ3 и Колена ЭЕ3. Индукции осуществляли при двух температурах на индукцию (16 или 37°С) и с 1 мМ 1РТС (изопропил-в-тиогалактозид). См. нижеприведенный раздел Материалы и способы в отношении подробной информации о протоколе.
Белки собирали для каждой индукции и анализировали при помощи вестерн-блоттинга и при помощи 8Э8-РАСЕ с окрашиванием Кумасси голубым. В этих экспериментах белок обнаруживается только на вестерн-блоте.
Пример 2.
Осуществляли биоинформатические анализы гена СА8В7439, выявившие следующие структурные особенности:
структурный элемент РНК типа гребенки, расположенный между нуклеотидами 2 и 27 в 8Е0 ГО N0: 14;
содержание СС в нуклеотидной последовательность, составляющее 62%;
нуклеотидную последовательность, богатую аргининовыми кодонами (26/193 кодированных аминокислот);
аминокислотную последовательность с высоким уровнем основных аминокислотных остатков;
аминокислотную последовательность с высокой изоэлектрической точкой (11, 18);
область с низкой вариабельностью (1оте сотр1ехйу) в аминокислотной последовательности (остатки
7-27 в 8Е0 ГО N0: 13;
домен спираль-петля-спираль (НЬН) (ΙΡΚ000014) в аминокислотной последовательности (остатки 56-108 в 8Е0 ГО N0: 13);
первую область присущего расстройства в аминокислотной последовательности (остатки 118-164 8Е0 ГО N0: 13);
вторую область присущего расстройства в аминокислотной последовательности (остатки 118-164 в 8Е0 ГО N0: 13).
Авторы изобретения также идентифицировали область с высокой периодичностью пролина от аминокислоты 127 по 158. Заявители обозначили область аминокислот 133-153 включительно в 8Е0 ГО N0: 13 (аа) как богатую пролином область. Богатая пролином область вместе с некоторыми другими особенностями, упомянутыми в этом примере, схематически изображены на фиг. 1 вместе с упомянутыми здесь областями.
Пример 3.
Немодифицированная нуклеотидная последовательность ДНК СА8В7439 (8Е0 ГО N0: 14) оптимизирована по кодонам фирмой, осуществляющей услугу синтеза ДНК на коммерческой основе, Сеиеай (уникальный идентификатор 0606597), и клонирована. СеиеаЛ АС, ВюРатк, 1о5еЕ-Еидет1-81г. 11Ό-93053 КедеикЬитд, Сегтапу. Нуклеотидную последовательность СА8В7439 получали из клона при помощи амплификации путем ПЦР и использовали для построения двух конструкций. В первой конструкции ЬУЪ016 [8Е0 ГО N0: 29 (аа), 8Е0 ГО N0: 30 (ДНК)] последовательность СА8В7439 встраивали в вектор рЕТ21Ь (+) в слиянии с белком рЭ1/3 белок (из НаеторЫ1и5 тЛиеп/ае) по ^концевой последовательности СА8В7439. Во второй конструкции ЬУЬ018 [8Е0 ГО N0: 31 (аа); 8Е0 ГО N0: 32 (ДНК)] СА8В7439 встраивали в вектор рЕТ21Ь (+) (без какого-либо компонента белка Ό). Эти конструкции оценивали в отношении продукции в ВЬК ЭЕ3 Е.сой при 16 и 37°С с 1 мМ 1РТС. Продукцию обнаруживали при помощи вестерн-блоттинга в виде нерастворимого белка, в основном продуцируемого при 16°С.
Четыре домена СА8В7439 выбирали для дальнейшего исследования для улучшения продукции белка: нацеливающий на ядро домен, богатую пролином область, ДНК-связывающий домен и домен
- 16 020617
НЬН.
Пример 4.
Нацеливающий на ядро домен, ДНК-связывающий домен, домен ЬНЬН и богатую пролином область СА8В7439 выбирали для исследования продукции белка конструкциями, содержащими нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды СА8В7439. Различные участки нуклеотидной последовательности СА8В7439 амплифицировали при помощи ПЦР из оптимизированного по кодонам клона Дженеарта, описанного здесь и встроенного в вектор рЕТ19Ь (+), приводя в результате к пяти конструкциям, имеющим отличающуюся последовательность СА8В7439 (усеченную некоторым образом или полноразмерную); каждая конструкция с полигистидиновой последовательностью по ^концевой последовательности СА8В7439, см. фиг. 2.
Эти конструкции, представленные на фиг. 2, оценивали в отношении экспрессии белка в штамме ВЬК ΌΕ3 Е.соН при 37 и 16°С с 1 мМ 1РТО. Как изображено на фиг. 2, эти конструкции содержали полноразмерную СА8В7439 [ЬУЪ060, 8ЕО ГО N0: 19 (аа), 8ЕО ГО N0: 20 (ДНК)]; СА8В7439, усеченную для удаления нацеливающего на ядро домена |Соп51-1. 8ЕЦ ГО N0: 21 (аа), 8ЕЦ ГО N0: 22 (ДНК)]; СА8В7439, усеченную для удаления богатой пролином области [ЬУЬ055, 8ЕЦ ГО N0: 1 (аа), 8ЕЦ ГО N0: 2 (ДНК)]; СА8В7439, усеченную для удаления ДНК-связывающего домена [ЬУЪ056, 8ЕЦ ГО N0: 23 (аа), 8ЕЦ ГО N0: 24 (ДНК)]; СА8В7439, усеченную для высвобождения основного домена спираль-петля-спираль (ЬНЬН) [ЬУЬ057, 8ЕЦ ГО N0: 25 (аа), 8ЕЦ ГО N0: 26 (ДНК)]. Вследствие экспериментальной ошибки Соп51-1 был лишен стоп-кодона, что приводило в результате к трансляции фрагмента нуклеотидной последовательности вектора (приводя в результате к дополнительной 21 аминокислоте в С-концевой области, начиная с БЕЭ...). Продукцию ЬУЪ055 после инкубации при 16°С (усеченная по С-концу) ясно обнаруживали на окрашенном Кумасси голубым геле для 8Э8-РАОЕ.
Пример 5.
На основе результатов, описанных в примере 4, разработаны новые конструкции для (1) удаления богатой пролином области при (2) сохранении других областей С-концевого фрагмента полипептида. См. описание на фиг. 3 и 4, в которых обсуждаются (1) различные идентифицированные или предсказанные эпитопы в полипептиде и (2) различные альтернативные подходы к удалению богатой пролином области.
Оптимизированная по кодонам синтетическая нуклеиновая генная последовательность, кодирующая модифицированный полипептид СА8В7439, получена затем из Оеиеай (уникальный идентификатор 0706840), расщеплена и встроена в параллели в два отличающихся вектора для построения следующих конструкций:
(1) ЬУЬ088, содержащей ген СА8В7439 ген с делецией богатой пролином области из 21 аминокислоты, слитый с полигистидиновой последовательностью по С-концу в векторе рЕТ26Ь (+) (8ЕС) ГО N0: 27 (аа), 8ЕО ГО N0: 28 (ДНК)); и (2) ЬУЪ111, содержащей ген СА8В7439 с делецией богатой пролином области из 21 аминокислоты и полигистидиновой последовательностью как по И-, так и С-концу в векторе рЕТ19Ь (+) (8ЕС) ГО N0: 3 (аа), 8ЕО ГО N0: 4 (ДНК)).
Конструкцию ЬУЬ111 (см. 8ЕЦ ГО N0: 3) клонировали в соответствии с той же самой стратегией, используемой для ЬУЬ055, т.е. с использованием вектора рЕТ19 (+), который включает полигистидиновую последовательность, состоящую из 10 гистидинов с последующим сайтом энтерокиназы. Это приводило в результате к образованию партнера слияния из 23 аминокислот (8ЕЦ ГО N0: 42) на Оконце.
Другие конструкции конструировали с оптимизированным по кодонам синтетическим геном, обсуждающимся в примере 3 (уникальный идентификатор 0606597), включающие следующие:
ЬУЬ090 (белковая конструкция, содержащая (с Оконца) белок Ό, полноразмерный оптимизированный СА8В7439, и 6-Н15 в векторе рЕТ21) (8ЕО ГО N0: 43 (аа); 8ЕО ГО N0: 44 (ДНК));
ЬУЬ112 (белковая конструкция, содержащая (с Оконца) белок 8ИМ0, полноразмерный оптимизированный СА8В7439 в векторе р8ИМ0) (8ЕО ГО N0: 45 (аа); 8ЕО ГО N0: 46 (ДНК));
ЬУЬ113 (белковая конструкция, содержащая (с Оконца) белок 8ИМ0, белок рЭ1/3, полноразмерный оптимизированный СА8В7439 в векторе р8ИМ0) (8ЕЦ ГО N0: 47 (аа); 8ЕЦ ГО N0: 48 (ДНК));
ЬУЬ114 (белковая конструкция, содержащая (с Оконца) белок 8ИМ0, СА8В7439, усеченный по аминокислоте 117, в векторе р8ИМ0) (8ЕЦ ГО N0: 49 (аа); 8ЕЦ ГО N0: 50 (ДНК));
ЬУЬ115 (белковая конструкция, содержащая (с Оконца) белок 8ИМ0, модифицированный СА8В7439 с удаленной богатой пролином областью, в векторе р8ИМ0) (8ЕЦ ГО N0: 51 (аа); 8ЕО ГО N0: 52 (ДНК)).
Не обнаружено никакого улучшения продукции, хотя осуществляли только один повтор (данные не представлены).
Продукцию ЬУЪ088 анализировали после индукции в течение ночи с использованием 1 мМ 1РТО при 37 и при 16°С. При анализе путем электрофореза продукцию ЬУЪ088 визуализировали только при помощи вестерн-блоттинга. Одна партия, очищенная из четырех культуральных колб по 800 мл, приводила в результате к 0,4 мг белка. С другой стороны, ЬУЪ111 легко обнаруживали после окрашивания Кумасси голубым. Рекомбинантный белок ЬУЬ111 продуцировали и очищали в 8 партиях. Несколько партий ЬУЪ111 (каждая из четырех культуральных колб по 800 мл) оценивали в отношении продукции в
- 17 020617 диапазоне от 3,3 мг/партию до 10 мг/партию очищенного белка. Таким образом, продукция ЬУЬ088 была ниже по сравнению с обнаруженной для ЕУЕ111. Очищенный белок также тестировали в отношении его реактивности с несколькими моноклональными антителами против СА8В7439 и во всех случаях обнаружили положительную реактивность.
Пример 6.
Исследовали удаление С-концевой полигистидиновой последовательности из конструкции ЕУЕ111. Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипро(-)полипептид СА8В7439 без фрагмента, кодирующего С-концевой полигистидин, амплифицировали при помощи ПЦР из конструкции ЕУЕ111 и клонировали в вектор рЕТ19Ь. Эту конструкцию обозначали как ЕУЕ137. Конструкция ЕУЕ137, по существу, представляет собой ЬУЫП без нуклеотидной последовательности, кодирующей С-концевую полигистидиновую последовательность. δΕ^ ГО ΝΟ: 5 (аа); δΕ^ ГО ΝΟ: 6 (ДНК). Удаление С-концевой полигистидиновой последовательности, по-видимому, не оказывает действия на уровень продукции. В соответствии с анализом при помощи окрашенного Кумасси геля после δΌδ-ΡΛΟΕ ЕУЕ137 продуцировал тот же самый уровень белка, как и ЕУЕ111.
Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипро(-)полипептид СА8В7439, затем амплифицировали при помощи РСК из синтетической последовательности СенеаП (0706840) СА8В7439 и клонировали в вектор рЕТ26 с концевой последовательностью из шести полигистидинов на Ν-конце (ЕУЕ138). δΕ^ ГО ΝΟ: 33 (аа); δΕ^ ГО ΝΟ: 34 (ДНК). Эта конструкция демонстрировала значительно уменьшенный уровень продукции белка и ее сложно обнаружить при помощи вестерн-блоттинга.
Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность шести полигистидинов по Ν-концу полипро(-)полипептида СА8В7439, конструировали в устойчивом к канамицину векторе рЕТ24. Новую конструкцию линкера использовали для удаления структуры типа гребенки, сформировавшейся между полигистидиновой концевой последовательностью и 5' концом гена СА8В7439. Конкретно, кодоны для первых восьми аминокислотных остатков белковой конструкции заменяли следующей нуклеотидной последовательностью: 5' АТС САТ САТ САТ САТ САТ САТ ОАС ... 3' (δΕς ΙΌ ΝΟ: 35). (Исходные кодоны представляли собой 5' АТС САС САТ САС САТ САС САТ ОАТ ... 3' (δΕς ΙΌ ΝΟ: 36).) Эту конструкцию обозначали как ЕУЕ160. δΕ^ ГО ΝΟ: 37 (аа); δΕ^ ГО ΝΟ: 38 (ДНК). Как определено анализом на геле и вестерн-блоттингом, продукция белка, по-видимому, является столь же слабой, как и для ЕУЕ138.
Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белковую конструкцию с концевой последовательностью из десяти полигистидинов по Ν-концу полипро(-)полипептида СА8В7439, конструировали в устойчивом к канамицину векторе рЕТ24. Эту конструкцию идентифицировали как ЕУЕ168. δΕ^ ГО ΝΟ: 11 (аа); δΕ^ ГО ΝΟ: 12 (ДНК). Уровень продукции сравним с уровнем, обнаруженным для ЕУЕ111. Сопоставление нескольких конструкций, обсуждавшихся в этом примере, представлено на фиг. 5.
Результаты для конструкций, обсуждавшихся в этом примере и примере 1, обобщены в табл. 1.
Таблица 1. Уровни экспрессии для конструкции, обсуждавшейся в примерах 1, 3, и 6. Конструкцию, которая приводит к продукции гель-/блот+ в общем, обнаруживают только при помощи вестернблоттинга, когда лизат целых клеток подвергают δΌδ-РАОЕ. Конструкцию, которая приводит к продукции гель+++/блот +++, ясно обнаруживают при помощи окрашивания Кумасси голубым, когда лизат целых клеток подвергают δΌδ-РАОЕ.
Таблица 1
#ι_νι_ Описание Вектор Продукция
Ι_νΐ_007 1_опд Ηίδ-ΟΑ5Β7439 рЕТ19Ь(+) гель-/блот+
1_νΐ_010 1_опд Н15-САЗВ7439 рЕТ19Ь(+) гель-/блот+
13/1.016 ρϋ 1 /3-САЗВ7439-ОРТ-6Н ίδ рЕТ21Ь(+) гель-/блот+
ι_νι_ι 11 !_опд Н|5-Ое1-ро1у-Рго-с1ота1п-Н15-ОРТ рЕТ19Ь(+) гель+++/блот+ ++
13/1.137 1_олд Н|5-Ое1-ро1у-Рго-с1ота1п-ОРТ рЕТ19Ь(+) гель+++/блот+ ++
13/1.138 6Н|5-Ое1-ро1у-Рго-бота1п-ОРТ рЕТ26Ь(+) гель-/блот+
Ι_νΐ_160 Н15то0И-Ое1-ро1у-рго-с1ота1п-ОРТ рЕТ24Ь(+) гель-/блот+
Ι_νΐ_168 10Н!5-Ое1-ро1у-рго-с1ота1п-ОРТ рЕТ24Ь(+) гепь+++/блот+ ++
6Ηΐδ: концевая последовательность из гистидинов = 6 гистидиновых остатков.
Ьопд Ηίδ = 23аа (МОННННННННННЗЗОНГОИПИКН) (δΕΟ ГО ΝΟ: 42). Ие1-ро1у-Рго-дотат: СА8В7439, модифицированный путем делеции богатой пролином области.
ОРТ: оптимизированный по кодонам.
I ΙΐδΐηοώΓ: гистидиновая концевая последовательность, модифицированная для выбора кодона (см. пример 6).
1/3рИ: конструкция белка И, описанная здесь.
101 Ιΐδ: гистидиновая последовательность с 10 гистидиновыми остатками.
- 18 020617
Пример 7.
Еще одну конструкцию САЗВ7439 конструировали в слиянии с фрагментом белка Б из НаеторЬйик тЛисп/ас. Как представлено в ЗЕЦ 1Б N0: 39 (аа) (ЗЕЦ 1Б N0: 40 (ДНК)), аминокислоты МеЕАкр-Рго сливали с 108 ^концевыми аминокислотами процессированного Белка Б (аминокислотные остатки 2-109 процессированного Белка Б). ЗЕЦ 1Б N0: 39 названа здесь как 1/3рБ или 1/3 Белок Б. Синтетическую нуклеотидную последовательность СА8В7439, полученную из Сепеаг! (0706840) (удалена пролинбогатая область), субклонировали в рЕТ26-1/3рБ, представляющей собой устойчивую к канамицину плазмиду, которая содержит 1/3рБ, с получением ЬУЪ141. Последовательность ЬУЪ141 представлена в ЗЕЦ 1Б N0: 7 (аа) и ЗЕЦ 1Б N0: 8 (ДНК). Продукция сравнима с продукцией ЬУЬ111.
Затем производили мутацию этого клона при помощи ПЦР для удаления линкера из четырех аминокислот (А1а-А1а-А1а-Н18) между компонентами 1/3рБ и СА8В7439. Последовательность получающейся в результате конструкции, обозначенной ЬУЪ144, представлена на ЗЕЦ 1Б N0: 9 (аа) и ЗЕЦ 1Б N0: 10 (ДНК). Продукция сравнима с продукцией ЬУЫИ. На фиг. 6 представлено сопоставление СА8В7439 (ЗЕО 1Б N0: 13); ЕУЪ168 (ЗЕО 1Б N0: 12); РБ1/3 (ЗЕО 1Б N0: 39) и ЕУЬ144(ЗЕЦ 1Б N0: 9).
Пример 8.
Тесты солюбилизации ЬУЬ168.
В общем, очищенные белковые конструкции, содержащие СА8В7439, солюбилизировали в 6 М гуанидиновом буфере, переносили в буфер на основе 8 М мочевины и хранили в 4 М мочевине, 20 мМ НЕРЕЗ, 1 мМ ТСЕР (трихлорэтилфосфат), 150 мМ №С1, рН 7,0. Предварительные результаты, полученные на небольших объемах, свидетельствуют о том, что ЬУЬ168 также может быть солюбилизирован в фосфатном буфере без мочевины, а также каких-либо восстановителей, таких как ЕБТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) или ТСЕР, и с ЕаС! или без него. Никакого осаждения не обнаруживали после диализа в этих буферах. Анализы солюбилизации осуществляли для того, чтобы охарактеризовать белок ЕУЪ168 в 16 буферах, представленных в табл.2. 100 мкл очищенных образцов белка ЕУЪ168 в буфере на основе 8 М мочевины, 20 мМ НЕРЕЗ, 150 мМ №С1, 1 мМ ТСЕР, рН 7,0 помещали в блок для минидиализа 10000 М\УС0 (Вю1упх), предварительно уравновешенный буфером путем двух промываний. Диализ осуществляли в течение ночи в 100 мл каждого из 16 буферов, представленных в табл. 2, при встряхивании при 4°С. Образцы затем отбирали из блоков, помещали в пробирки еррепбогГк и центрифугировали в течение 5 мин при 20000д. Растворимые белки оставались в суспензии, а нерастворимые белки осаждались и формировали осадок после центрифугирования. Буферы, в которых растворим белок ЬАЫ68, представлены в табл. 2.
Супернатанты тестировали при помощи ЗБЗ-РАСЕ и концентрации оставшихся растворимых белков измеряли при помощи способа КС БС в соответствии с указаниями производителя. Набор для осуществления способа КС БС, представляющего собой модифицированный метод Лоури, получен из ВюКаб ЬаЬога1ог1е8, 1000 А1Ггеб №Ье1 Бпуе, Негси1е8, СА 94547). Образцы оставляли при 4°С для тестирования стабильности.
Тесты стабильности ЬУЬ168.
Белки ЬАЫ68 после анализа растворимости содержали в течение 7 суток при 4°С. 20 мкл каждого из образцов 2, 3, 5, 6, 9-16 переносили в другие пробирки и тестировали в отношении стабильности при 4°С, 37°С или комнатной температуре в течение еще 2 суток. Образцы центрифугировали в течение 5 мин при 20000д. Супернатанты разделяли при помощи ЗБЗ-РАСЕ и профили анализировали в отношении разрушения, агрегации или утраты белка путем сравнения с исходным очищенным белком. Белок оставался стабильным в большинстве исследованных буферов.
- 19 020617
Таблица 2
Тесты растворимости и стабильности ΙΛ'1.168
Для удобства читателя обобщение упомянутых здесь конструкций и их относительная продукция представлены в табл. 3.
Таблица 3
№Ι_νΐ_ Описание Вектор Продукция
ΙΛ/Ι.007 1_опд Ηίδ-ΟΑ3Β7439 рЕТ19Ь(+) гель-/блот+
ΙΛ/ЮЮ 1_опд Н15-САЗВ7439 рЕТ19Ь(+) гель-:блот+
Ι_νί_016 ρϋ1/3-ΟΑ3Β7439-ΟΡΤ-6ΗΪ5 рЕТ21Ь(+) гель-/блот +
Ι_νΐ_018 САЗВ7439-ОРТ-6Н15 рЕТ21Ь(+) гель-/блот +
СопзМ 1_опд Ηί5-ΟΑ3Β7439-ΟΡΤ-Οοπ5ΐ-1 (нацеливающая на ядро усеч.) рЕТ19Ь(+) гель-/ блот +
Ι_νΐ_055 Ьопд Н 15-ро1у-Р го-бо т а1П-1ги пс-ОРТ рЕТ19Ь(+) гель+++/блот +++
Ι_νΐ_056 1_опд Ηίδ-ϋΝΑ Ыпб йипс-ОРТ рЕТ19Ь(+) гель-/блот -
1Л/Ю57 1_опд Ηίδ-ЬНШ а1опе-ОРТ рЕТ19Ь(+) гель-/блот -
13/1.060 1_опд Н15-С7439-ОРТ рЕТ19Ь(+) гель-/блот +
1Л/Ю88 Ое1-ро1у-Рго-с1ота1П-ОРТ-6Н15 рЕТ26Ь(+) гель-/блот +
ί_νΐ_111 1_опд Н 15-Ое1-ро1у-Р го-бота! η-Η Ϊ5-ΟΡΤ рЕТ19Ь(+) гель+++/ блот +++
ΙΛ/1.137 1_опд Н|5-Ое1-ро1у-Рго-с1ота1п-ОРТ рЕТ19Ь(+) гель+++/блот +++
1Л/И38 6Н15-Ое1-ро1у-Рго-бота1П-ОРТ рЕТ26Ь(+) гель-/ блот +
1Л/И41 1/ЗрО-Ое1-ро1у-Рго-бота1п-ОРТ-6Н15 рЕТ26Ь(+) гель+++/блот +++
1Л/И44 1/ЗрО-Ое1-ро1у-Рго-бота1П-ОРТН15 ти1 Нпкег рЕТ26Ь(+) гель+++/ блот +++
Ι_νΐ_160 Н|5тоб|Г-0е1-ро1у-рго-бота1п-0РТ рЕТ24Ь(+) гель-/блот +
Ι_νΐ_168 10Н|5-бе1-ро1у-рго-бота!п-ОРТ рЕТ24Ь(+) гель+++/ блот +++
Сокращения см. в табл. 1. В табл. 3 использованы следующие дополнительные сокращения: йипс: унесенный. сопзТ конструкция.
ши!: последовательность, мутированная для удаления аминокислот между ρΏ1/3 и модифицированным полипептидом СА8В7439.
Нпкег: аминокислоты между двумя фрагментами молекулы.
ΩΝΛ Ьтб: ДНК-связывающий домен.
ЬНЬН а1опе: основной домен спираль-петля-спираль.
- 20 020617
Материалы и способы.
Экспрессия - мелкомасштабные индукции.
Штаммы Е.соП ВЬК (ЮЕ3) трансформировали упомянутыми здесь конструкциями, помещали в планшеты с агаром Луриа-Бертани (ЬВ), содержащие соответствующий антибиотик (40 мкг/мл канамицина или 100 мкг/мл карбеницилина), и инкубировали в течение ночи при 37°С. Образующийся в результате бактериальный газон использовали для инокуляции 20 мл ЬВ альтернативной белковой среды (АРЗ) подходящим антибиотиком (40 мкг/мл канамицина или 100 мкг на 1 мл карбеницилина) и помещали на 37°С для достижения 0Ό600 от 0,5 до 1,0.
Индукции осуществляли путем добавления 1 мМ 1РТО при 16 или 37°С. Для индукции при 16°С растущую культуру охлаждали на льду за 1 ч перед индукцией экспрессии рекомбинантного белка. Культуру затем возвращали назад для роста при 16°С и поддерживали при этих условиях в течение 16 ч. Для индукции при 37°С экспрессию рекомбинантных белков немедленно индуцировали путем добавления 1РТО к растущей культуре. Индукцию осуществляли при 37°С в течение 3 ч. Небольшие аликвоты по 1 мл отбирали до и после индукции.
Аликвоты затем центрифугировали (10 мин, 4°С, 20000/д), и бактериальный осадок после центрифугирования хранили при -20°С до анализа. Анализ осуществляли после экстракции белка ВидВиЧег в соответствии с рекомендациями производителя. ВидВиЧег, производимый Коуадеп, имеется в продаже от ν\νΡ. Уровень экспрессии определяли путем окрашивания гелей после ЗИЗ-РАОЕ Кумасси голубым и при помощи вестерн-блоттинга. Растворимость оценивали после обнаружения белка в осадках или в супернатантах после экстракции ВидВиЧег.
Экспрессия - крупномасштабные индукции.
Штаммы Е.соП ВЬК (ИЕ3) трансформировали описанными здесь конструкциями, помещали на планшеты с агаром ЬВ, содержащим соответствующий антибиотик, и инкубировали в течение ночи при 37°С. Образующийся в результате бактериальный газон использовали для инокуляции желаемого количества среды ЬВ АРЗ в колбах объемом 800 мл с подходящим антибиотиком (40 мкг/мл канамицина или 100 мкг на 1 мл карбеницилина) и помещали на 37°С для достижения 0И600 от 0,5 до 1,0. Колбы объемом 2,5 л, содержащие 800 мл ростовой среды, затем охлаждали на льду за 1 ч перед индукцией экспрессии рекомбинантного белка путем добавления 1 мМ 1РТО. Для индукции при 16°С растущую культуру охлаждали на льду за один час перед индукцией. Культуры затем помещали назад для роста при 16°С и поддерживали при этих условиях в течение 16 ч.
Культуры центрифугировали (15 мин, 4°С, 6000/д), и бактериальный осадок после центрифугирвоания хранили при -80°С до очистки. Небольшие алквоты по 1 мл также отбирали до и после индукции ВидВийет и анализировали при помощи ЗИЗ-РАОЕ и вестерн-блоттинга перед очисткой.
Очистка.
Бактериальный осадок ресуспендировали в буфере для лизиса (20 мМ буфер Тт15 (рН 8,0), содержащий 500 мМ №С1, 10 мМ ТСЕР) и смесь ингибиторов протеаз (полные без ЕИТА (этилендиаминтетрауксусная кислота)). Бактерии лизировали путем ультразвуковой обработки с использованием 13 мм зонда на ультразвуковом процессоре νίΠπι се11, от ЕишЫЛех С3 (АуекПп) или при помощи системы разрушения СогМаШ Се11 (СогМаШ ЗуЧет). Растворимые (супернатант) и нерастворимые (осадок) компоненты разделяли путем центрифугирования при 20000/д в течение 20 мин при 4°С. Поскольку рекомбинантные белки САЗВ7439 ожидали обнаружить в осадках, супернатанты удаляли.
Обычно нерастворимые компоненты (осадок) повторно солюбилизировали в 50 мМ бициновом буфере рН 8,0, содержащем 6М гуанидин НС1, 500 мМ №С1, 10 мМ ТСЕР, и затем центрифугировали (20000/д в течение 20 мин). Супернатант наносили на колонку Ηίδ Тгар объемом 5 мл (ОЕ НеаНПсате), уже предварительно уравновешенную в предшествующем буфере, но концентрацию ТСЕР уменьшали до 1 мМ. После загрузки колонку однократно промывали тем же самым буфером. 6 М ОпНС1 хаотропный агент замещали 8 М мочевиной (8 М мочевина, 20 мМ НЕРЕЗ, 500 мМ №С1, 1 мМ ТСЕР, рН 8,0). Элюцию осуществляли с использованием 20 мМ буфера НЕРЕЗ (рН 8,0), содержащего 8 М мочевину, 500 мМ №С1, 1 мМ ТСЕР и 250 мМ имидазол. Образцы из элюируемых фракций анализировали при помощи ЗИЗ-РАОЕ и фракции, содержащие интересующий белок, объединяли, при необходимости концентрировали на центрифуге и использовали на второй стадии очистки.
Осуществляли одну или две стадии ЗЕС (гель-фильтрация) (ЗиретПех 200, ОЕ НеаНПсате) в зависимости от требуемой чистоты в 8 М мочевине, 20 мМ НЕРЕЗ, 500 мМ №С1, 1 мМ ТСЕР, рН 8,0 перед последней стадией обессоливания. Обессоливание осуществляли на О25 обессоливающей колонке, предварительно уравновешенной конечным буфером 20 мМ НЕРЕЗ (рН 7,0), содержащим 4 М мочевину, 150 мМ №С1 и 1 мМ ТСЕР.
Белковые образцы аликвотировали по 1 мл пробирки и хранили при -80°С.
Анализ белка - определение концентрации.
Концентрацию белка определяли с использованием КС ИС белкового анализа (модифицированный метод по Лоури от Вю-КаП). Этот анализ использовали из-за несовместимости некоторых компонентов конечного буфера с классическими анализами Лоури или ВЗА. Количество препарата конечного белка
- 21 020617 также анализировали при помощи δΌδ-РАОЕ, вестерн-блоттинга и в отношении содержания ЬАЬ для обеспечения или деградации белка Е.соП и уровня контаминации ΠΓδ.
Пример 9.
Подтверждение экспрессии САδВ7439 в нормальных тканях и тканях, пораженных колоректальным раком (СКС).
Заявители проводили анализ экспрессии мРНК САδВ7439 с использованием цРСК (количественной ПЦР) в режиме реального времени в 83 образцах СКС и 12 нормальных образцах толстой кишки, полученных из С’опха Согрогайоп. Значения экспрессии мРНК САδВ7439 были по меньшей мере в 10 раз выше в СКС по сравнению с нормальной толстой кишкой в 63% тестируемых образцов СКС по сравнению с нормальными тканями (данные приведены в виде усредненного отношения экспрессии САδВ7439/β-актин) (фиг. 7). Кроме того, заявители обнаружили белок САδВ7439 путем иммунофлуоресценции (ΙΡ) в человеческих СКС тканях с использованием кроличьего моноклонального антитела против САδВ7439 (40-12) (обсуждаемое здесь антитело); никакого количества белка САδВ7439 не обнаружено на срезах нормальных соседних тканей.
Дополнительные данные по экспрессии для САδВ7439 получены при помощи анализа ОепеЬодю (Оепе Мюгоаггау) с использованием стандартных способов. Обнаружено, что мРНК САδВ7439 сильно экспрессируется в образцах СКС со всех стадий заболевания (данные не представлены). Заявители провели анализ экспрессии мРНК САδВ7439 цРСК в режиме реального времени в 83 образцах СКС и 12 образцах нормальной толстой кишки, полученных из С’опха Согрогайоп. Наблюдали сверхэкспрессию мРНК САδВ7439 по меньшей мере в 10 раз выше в СКС по сравнению с нормальной толстой кишкой в 63% тестированных образцов СКС по сравнению с нормальными тканями (данные приведены в виде усредненного отношения экспрессии САδВ7439/β-актин) (фиг. 7).
В независимых литературных источниках сообщается об обнаружении мРНК САδВ7439, т.е. НАδН-2, путем гибридизации ш 311и (^Н) на очень низком уровне на дне кишечных крипт, но ни в какой из других нормальных тканей, за исключением плаценты. 1иЬЬ е! а1. (2006), Опсодепе 25:3445-3457. В тканях, пораженных колоректальным раком (СКС), показано, что мРНК САδВ7439 в 15 раз сверхэкспрессируется в 70% тестируемых образцов человеческих тканей.
Экспрессия белка САδВ7439 в СКС и нормальных соседних тканях толстой кишки.
Для анализа экспрессии белка САδВ7439 с использованием иммунофлуоресценции в нормальных и СКС тканях сконструировали специфическое кроличье моноклональное антитело против САδВ7439 (4012). Кроличьи гибридомы, наработанные против САδВ7439, получены из коммерческого источника Ерйотюз 1пс. и отобраны заявителями. Моноклональные антитела (тАЬ), продуцируемые гибридомами, сначала отбирали при помощи ЕШБА (иммуноферментного анализа) с использованием рекомбинантного белка ЬУЪ111 (^ЕЦ ГО NΟ: 3). Специфичность моноклональных антител подтверждали при помощи вестерн-блоттинга с использованием ЬУЪ111 и клеточного лизата, полученного из рекомбинантной клеточной линии, сконструированной для экспрессии САδВ7439 (см. ниже ТС1/САδВ7439). Экспрессию белка САδВ7439 в опухолях ТС1/САδВ7439 (выращенных у мышей), клетках δΑ-620 и δΑ-480 (положительная в отношении САδВ7439 человеческая линия клеток колоректального рака) и в клетках НСТ-116 (отрицательная в отношении САδВ7439 человеческая линия клеток колоректального рака) оценивали при помощи иммунофлуоресценции с использованием тАЬ. тАЬ 40-12 выбраны для подтверждения экспрессии белка САδВ7439.
Заявители получили из ΝΏΜ (№йопа1 Э|зеазе КезеагсЬ 1п!егсЬапде (Национальная организация по обмену информации по исследованию заболеваний), 8 Репп СеШег, 8* Иоог, 1628 ΙΡΚ Вои1еуагй, РЫ1айе1р1йа, РА 19103) залитые в ОСТ замороженные образцы ткани СКС и нормальной соседней ткани 17 различных индивидов; для 5 из этих индивидов также получены метастатические ткани. Заявители отобрали образцы 17 первичных опухолей, 17 нормальных соседних тканей и 5 метастатических тканей. Из 17 проанализированных первичных опухолей СКС 13 оказались положительными в отношении экспрессии белка САδВ7439 (76,5%). Все эти положительные в отношении САδВ7439 образцы представляли собой аденокарциномы. Ни в одной из нормальных соседних тканей не экспрессировались обнаруживаемые уровни белка САδВ7439. Среди метастатических тканей 3 из 5 были положительными (60%) в отношении экспрессии белка САδВ7439.
Корреляцию между белком САδВ7439 и экспрессией мРНК исследовали в 16 тканях СКС при помощи анализа цРСК в режиме реального времени, проводимого с использованием стандартных способов в отношении раковых и нормальных соседних тканей толстой кишки. Окрашивание Κί67 использовали в качестве маркера пролиферации. Корреляция между белком САδВ7439 и экспрессией мРНК представлена на фиг. 8. Образцы ткани, которые демонстрировали наличие белка САδВ7439 в соответствии с иммунофлуоресценцией, также продемонстрировали самые высокие уровни мРНК САδВ7439.
Пример 10.
Иммуногенность САδВ7439 у мышей: Т-клеточная иммуногенность САδВ7439 у инбредных мышей.
Для исследования Т-клеточной иммуногенности САδВ7439 у мышей банк пептидов получали при
- 22 020617 помощи стандартных способов синтеза для того, чтобы покрыть всю последовательность белка СА8В7439 (фиг. 9). Каждый пептид представлял собой 15-мер, перекрывающийся со следующим пептидом по 11 аминокислотам. Для исследования иммунодоминантных областей 14 совокупностей пептидов расположили в соответствии с матрицей таким образом, что любые две совокупности пептидов имели только один общий пептид (фиг. 10).
Для исследования Т-клеточной иммуногенности у мышей до 15 инбредных мышей и до 10 аутбредных мышей на группу получали четыре внутримышечные иммунизации каждые две недели различными дозами (от 0 до 30 мкг) различных рекомбинантных белков СА8В7439, приготовленных с А801В или А815, оба из которых представляют собой патентованные адъюванты С8К. После приготовления с антигеном А801В состоял из МРЬ (100 мкг/мл) и 0821 (100 мкг/мл) в липосомах). После приготовления с антигеном А815 состоял из МРЬ (100 мкг/мл), 0821 (100 мкг/мл) и СрС7909 (840 мкг/мл) в липосомах. Каждая иммунизация содержала 25 мкл рекомбинантного белка СА8В7439, смешанного с 25 мкл 2х концентрированного адъюванта. Таким образом, каждая мышь в группе А801В получала 5 мкг МРЬ и 5 мкг Ц821. Каждая мышь в группе А815 получала 5 мкг МРЬ, 5 мкг Ц821 и 5 мкг СрС7909. После последней иммунизации из мышей отбирали образцы селезенок или РВЬ (лейкоциты периферической крови). Для анализа иммуногенности СА8В7439 у инбредных мышей образцы селезенок или РВЬ анализировали индивидуально или объединяли. Для анализа иммуногенности СА8В7439 у СГО1 аутбредных мышей каждый образец селезенки обрабатывали индивидуально.
РВЬ или выделенные спленоциты ресуспендировали в конечной концентрации 10х106 клеток на 1 мл в культуральной среде ΚРМI 1640 со следующими добавками: пенициллин-стрептомицин (1х), ненезаменимые аминокислоты (1х), 2-меркаптоэтанол (55 мМ), пируват натрия (100 мМ), Ь-глутамин (200 мМ). Клетки стимулировали пептидами из последовательности СА8В7439 (используемого в конечной концентрации 1 мкг/мл/пептид в ΚРМI 1640 + добавки + 5% инактивированная теплом РВ8 (фетальная телячья сыворотка)). Внутриклеточное окрашивание ^С8) в отношении СЭ4, СЭ8, ГЬ-2, ΙΕ-5, ΙΡΚγ и ЮТа осуществляли в соответствии с классическими способами. После стимуляции клетки обрабатывали брефельдином А и фиксировали. Окрашивание поверхностных СЭ4 и СЭ8 осуществляли при помощи специфических в отношении СГО4 и СЭ8 моноклональных антител. Затем клетки пермеабилизовали и окрашивали специфическими моноклональными антителами против белков ΙΕ-2, ΙΕ-5, ГОИу и ТНРа. Клетки анализировали при помощи проточной цитометрии с использованием ВО РАС8СапЕо ΙΙ. Данные выражены в процентной доле СЭ4 или СЭ8 Т-клеток, положительных в отношении как №N7+, так и Т№а+.
Эксперимент по сравнению мультилинейной Т-клеточной иммуногенности у инбредных мышей.
Заявители сравнили иммуногенность белка СА8В7439, приготовленного с А801В или А815, у инбредных мышей С57В1/6, Ва1Ь/С, СВ6Г1 (потомство первого поколения мышей С57В1/6, скрещенных с Ва1Ь/С) и С3Н, приобретенных в СНаг1е5 Ркег, 8еппеуШе, ОС, Сапайа. Пять мышей на группу иммунизировали 10 мкг рекомбинантного белка СА8В7439 (Ь\Ы11), приготовленного с А801В или А815. Образцы селезенок собирали и объединяли (один пул из пяти образцов селезенок на группу). СГО4 Т-клеточный ответ (положительный в отношении как №N7+, так и ТНРа') на Ь\Ы11 для каждого штамма представлен на фиг. 11 для композиции А801В и на фиг. 12 для композиции А815. Никакой СГО8 Т-клеточный (положительный как в отношении №N7+, так и Т\Ра ) ответ не обнаружен в какой-либо из четырех инбредных линий мышей.
Иммунодоминантные пептиды СА8В7439, идентифицированные у инбредных мышей, иммунизированные СА8В7439+А815, представлены на фиг. 13. Иммунодоминантные пептиды и соответствующие области 8ЕО ГО N0: 13 представляют собой:
С57В1/6: пептид 39 (81%) ГО N0: 91) (а.к. от 153 по 167 в 81%) ГО N0: 13);
Ва1Ь/с: пептид 24 (а.к. от 93 по 107 в 8Е0 ГО N0: 13);
СВ6Г1: пептиды 7-8 (а.к. от 25 по 43 в 81%) ГО N0: 13) и 23-24 (а.к. с 89 по 107 в 81%) ГО N0: 13);
С3Н: пептиды 9-11 (а.к. с 33 по 55 в 81%) ГО N0: 13), 16-19 (а.к. с 61 по 87 в 81%) ГО N0: 13) и 41-43 (а.к. 161-183 в 81%) ГО N0: 13).
Исследования Т-клеточной иммуногенности ΕνΕ111, Ь\Ъ168 и ЬУЕ144 у инбредных мышей.
Иммуногенность ЬУЫ11, Ь\Ы68 и ЬУЕ144 исследовали у инбредных мышей СВ6Г1. В этом эксперименте по пять мышей на группу (СНаг1е§ Кгуег, 8еппеуШе, ОС, Сапайа) иммунизировали четыре раза каждые две недели рекомбинантными белками СА8В7439 (Ь\Е111, ΕνΣ168 и Ь\Ы44), приготовленными с А815. Каждая иммунизация содержала 25 мкл рекомбинантного белка СА8В7439, смешанного с 25 мкл 2х концентрированного описанного здесь адъюванта. СГО4 и СГО8 Т-клеточные ответы (положительные в отношении как №N7, так и ТОТа) измеряли путем внутриклеточного окрашивания и при помощи анализа путем проточной цитометрии у индивидуальных инбредных мышей СВ6Г1 после повторной стимуляции спленоцитов матрицей пептидов СА8В7439 (данные не представлены). Иммунизации всеми тремя конструкциями запускали СГО4 Т-клеточный иммунный ответ против тех же самых иммуногенных областей (а.к. с 25 по 43 в 8Е0 ГО N0: 13 и а.к. с 89 по 107 в 8Е0 ГО N0: 13) у инбредных мышей СВ6Г1.
- 23 020617
Иммуногенность СА8В7439 у мышей: Т-клеточная иммуногенность СА8В7439 у аутбредных мышей.
СЭ1 аутбредных мышей (Сйаг1е5 Ктует, 8еппеуб1е, ОС, Сапаба) иммунизировали четыре раза каждые две недели рекомбинантным белком СА8В7439 (ЬУЪ111), приготовленным с А801В или А815. Каждая иммунизация содержала 25 мкл рекомбинантного белка СА8В7439, смешанного с 25 мкл 2х концентрированного описанного здесь адъюванта. СГО4 и СЭ8 Т-клеточные ответы (положительные в отношении как ΙΡ^ так и 'ТЫРа) измеряли путем внутриклеточного окрашивания и при помощи анализа путем проточной цитометрии у индивидуальных СГО1 мышей после повторной стимуляции спленоцитов при помощи матрицы пептидов СА8В7439.
Таблицы СА8В7439 СО4-иммуногенных пептидов, идентифицированных у аутбредных мышей, иммунизированных СА8В7439+А801В или СА8В7439+А815, представлены на фиг. 14 вверху и внизу, соответственно. СГО4 Т-клеточные иммуногенные области, идентифицированные у СЭ1 аутбредных мышей, покрывают следующие области СА8В7439 (выраженные с точки зрения аминокислотных позиций в 8Е0 ГО N0: 13): пептиды 8-10 (а.к. с 29 по 51 в 8Е0 ГО N0: 13), пептиды 16-18 (а.к. с 61 по 83 в 8Е0 ГО N0: 13) и пептиды 24-26 (а.к. с 93 по 115 в 8Е0 ГО N0: 13). СГО8 Т-клеточные иммунодоминантные области, идентифицированные у СГО1 аутбредных мышей, покрывают следующие части СА8В7439 (8Е0 ГО N0: 13): пептиды 16-18 (а.к. с 61 по 83 в 8Е0 ГО N0: 13), пептиды 24-26 (а.к. с 93 по 115 в 8Е0 ГО N0: 13) и пептид 32 (а.к. с 125 по 139 в 8Е0 ГО N0: 13). (Данные не представлены.)
Исследования Т-клеточной иммуногенности ЬУЕ111, ЬУЕ168 и ЬУЕ144 у аутбредных мышей.
СА8В7439+А815-опосредованные СГО4 и СГО8 Т-клеточные ответы, вызванные ЬУЫИ, ЕУЪ168 и ЬУЕ144, тестировали у индивидуальных аутбредных СГО1 мышей, приобретенных в СЬаг1е§ Ктует, 8еипеуб1е, ОС, Сапаба. Пять мышей на группу получали по четыре внутримышечных иммунизации каждые две недели, состоящие из 10 мкг рекомбинантного белка СА8В7439 (ЬУЬ111, ЕУЪ168 или ЕУЬ144), приготовленного с А815. Каждая иммунизация содержала 25 мкл рекомбинантного белка СА8В7439, смешанного с 25 мкл 2х концентрированного описанного здесь адъюванта. Пять мышей в контрольной группе иммунизировали физиологическим раствором.
Через две недели после четвертой иммунизации мышей умерщвляли. СГО4 и СГО8 Т-клеточные ответы (положительные в отношении как ГР^ так и 'ТИРа) измеряли путем внутриклеточного окрашивания и при помощи анализа путем проточной цитометрии после повторной стимуляции спленоцитов четырьмя совокупностями пептидов (пул 1: пептиды 8-9-10, пул 2: пептиды 16-17-18, пул 3: пептиды 24-25-26 и пул 4: пептиды 30-31-32). Данные представлены на фиг. 15. Те же самые СГО4 Т-клеточные иммуногенные области 8Е0 ГО N0: 13, а именно пептиды 16-18 (а.к. с 61 по 83 в 8Е0 ГО N0: 13) и пептиды 24-26 (а.к. с 93 по 115 в 8Е0 ГО N0: 13) активировали после иммунизации каждой из трех конструкций СА8В7439, приготовленных с А815.
Исследования Т-клеточной иммуногенности ЬУЕ144 и ЬУЕ168 у НЬА А2.1ГОК1-трансгенных мышей.
СА8В7439 + А815-опосредованные СГО4 и СГО8 Т-клеточные ответы, вызванные двумя конструкциями (ЬУЕ168 или ЬУЕ144), тестировали у группы НЬА А2.1ГОК1-трансгенных мышей (3 совокупности из 3 мышей), приобретенных в РаЧенг Пъицце, Рат15, Ргапсе. 9 мышей на группу получали четыре внутримышечные иммунизации каждые две недели, состоящие из 6,25 мкг ЬУЕ168 или 10 мкг ЬУЕ144, приготовленных с А815. Каждая иммунизация содержала 25 мкл рекомбинантного белка СА8В7439, смешанного с 25 мкл 2х концентрированного описанного здесь адъюванта. Двух мышей в контрольной группе иммунизировали только адъювантом.
Через две недели после четвертой иммунизации мышей умерщвляли. СГО4 и СГО8 Т-клеточные ответы (положительные в отношении как так и ТНРа) измеряли путем внутриклеточного окрашивания и при помощи анализа путем проточной цитометрии после повторной стимуляции РВЬ и спленоцитов 7 совокупностями пептидов, покрывающих всю последовательность СА8В7439 [пул 1: пептиды 1-7 (8Е0 ГО N0: 53-59), пул 2: пептиды 8-14 (8Е0 ГО N0: 60-66), пул 3: пептиды 15-21 (8Е0 ГО N0: 67-73), пул 4: пептиды 22-28 (8Е0 ГО N0: 74-80), пул 5: пептиды 29-35 (8Е0 ГО N0: 81-87), пул 6: пептиды 3642 (8Е0 ГО N0: 88-94) и пул 7: пептиды 43-46 (8Е0 ГО N0: 95-98)]. Кроме того, человеческий НЬА ΌΚ иммунодоминантный пептид 24 (8Е0 ГО N0: 76) тестировали индивидуально. Результаты, представленные на фиг. 16-19, демонстрируют, что одна и та же СГО4 и СГО8 Т-клеточная иммунодоминантная область (пептиды 22-28 + пептид 24) активируется после иммунизации каждой из двух конструкций СА8В7439, приготовленных с А815. Таким образом, пептид 24 также представляет собой человеческий НЬА А2.1 иммунодоминантный пептид. Эти результаты подтверждены во втором эксперименте, в котором те же самые пептиды СА8В7439 использовали для повторной стимуляции спленоцитов, полученных у 5 индивидуальных мышей на группу, иммунизированных ЬУЕ168 или ЬУЕ144, приготовленных с А815 (данные не представлены).
Иммуногенность СА8В7439 у мышей: исследования СА8В7439-опосредованного гуморального ответа у мышей СВ6Г1.
- 24 020617
СА8В7439-опосредованный гуморальный ответ на 10 мкг СА8В7439 (ЬУЪ111), приготовленного с А801В или А815, использованного в 1/10 человеческой дозы, оценивали у инбредных мышей СВ6П (Сйаг1ек Кгуег, 8еппеуй1е, ОС, Сапаба). 19 мышей на группу получали четыре внутримышечные иммунизации каждые две недели. Каждая иммунизация содержала 25 мкл рекомбинантного белка СА8В7439, смешанного с 25 мкл адъюванта (2х концентрация). У мышей отбирали кровь непосредственно перед каждой иммунизацией и через две недели после четвертой иммунизации. В еще одном эксперименте СА8В7439-опосредованный гуморальный ответ на ЬУЬ111, ЬУЪ168 или ЬУЬ144 оценивали у инбредных мышей СВ6П (Сйаг1ек Шуег, 8еппеуШе, ОС, Сапаба). 50 мышей на группу получали четыре внутримышечные иммунизации каждые две недели 10 мкг рекомбинантного белка СА8В7439 (ЬУЪ111, ЬУЪ168 или ЬУЬ144), приготовленного с А815 или только А815 в качестве контрольной группы. Каждая иммунизация содержала 25 мкл рекомбинантного белка СА8В7439, смешанного с 25 мкл 2х концентрированного описанного здесь адъюванта. У мышей отбирали кровь через две недели после четвертой иммунизации.
Титры антител ЦС| и 1дС2а в сыворотке крови против СА8В7439 определяли с использованием ЕЫ8А в соответствии со стандартными способами. Кратко, рекомбинантный белок СА8В7439 наносили в 96-луночный планшет в физиологическом растворе (РВ8). После блокирования бычьим сывороточным альбумином 1% в РВ8-Т\уееп (0,1%) сыворотки крови, иммунизированных мышей инкубировали в планшетах в течение 1 ч при 37°С. После промывания планшета на 1 ч при 37°С добавляли специфическое козье антитело против мышиного антитела 1дС| или 1дС2а, меченого НКР (перокисдаза хрена) (8он1йегп Вю1есй АккоааЮк, Вйпипдйат, АЬ, И8А). После промывания планшета добавляли субстрат ТМВ (тетраметилбензидин) (ВО Рйагтшдеп, Мюыккаида, 0К Сапаба) на 15 мин. Колориметрическую реакцию останавливали путем добавления 1 М серной кислоты. 0Ό измеряли при 450 нм с использованием спектрофотометра 8рес1гата.\ (Мо1еси1аг Оеуюе, 8иппууа1е, СА, И8А). Титр антитела определяли при помощи стандартной кривой с использованием специфических общих антител 1дС, 1дС или 1дС2а и мышиной сыворотки крови с СА8В7439.
На фиг. 20 представлен анализ зависимости от времени титров антител 1дС| и 1дС2а в сыворотках крови мышей, иммунизированных СА8В7439 (ЬУЪ111), приготовленным с А801В или А815. Данные демонстрируют, что А815 запускает более высокий Тй1 (приблизительно в 10 раз выше отношение 1дС2а/1дС1 после 4 иммунизации по сравнению с А801В (1§С2а представляет собой суррогатный маркер иммунного ответа 1 типа). Как представлено на фиг. 21, белок СА8В7439, приготовленный с А815, запускает очень сильный ответ в виде антител 1дС| и 1дС2а у инбредных мышей СВ6П независимо от используемой конструкции (ЬУЪ111, ЬУЪ168 или ЬУЬ144).
Иммуногенность СА8В7439 у мышей: исследования СА8В7439-опосредованного гуморального ответа у мышей СО 1.
СА8В7439-опосредованный гуморальный ответ после иммунизации СА8В7439 (ЬУЪ111, ЬУЬ168 или ЬУЪ144) оценивали у аутбредных мышей СЭ1 (Сйаг1ек Шуег, 8еппеуШе, ОС, Сапаба). Десять мышей на группу получали четыре внутримышечные иммунизации каждые две недели 10 мкг рекомбинантного белка СА8В7439 (ЬУЪ111, ЬУЪ168 или ЬУЪ144), приготовленного с А815 (или только А815 в качестве контрольной группы). Каждая иммунизация содержала 25 мкл рекомбинантного белка СА8В7439, смешанного с 25мкл 2х концентрированного описанного здесь адъюванта.
Через две недели после четвертой иммунизации у мышей отбирали кровь и титры в сыворотке крови общих антител 1дС против СА8В7439 определяли при помощи ЕЫ8А, как описано ранее. У мышей СЭЕ иммунизированных различными конструкциями СА8В7439 (ЬУЪ111, ЬУЪ168 или ЬУЪ144), развивался очень сильный СА8В7439-специфический гуморальный иммунный ответ (фиг. 22). Данные указывают на то, что в 8-10-раз более высокие титры общего 1дС против СА8В7439 индуцировались при помощи ЬУЪ144 по сравнению с ЬУЬ168 и ЬУЪ111 соответственно у аутбредных мышей СЭЕ
Пример 11.
Противоопухолевая эффективность СА8В7439 А8С1 у мышей: разработка модели опухоли у мышей.
Модель опухоли у мыши, экспрессирующей белок СА8В7439, с использованием мышиных опухолевых клеток ТС-1 или мышиных клеток колоректального рака МС38 разработали для исследования СА8В7439-опосредованной защиты от опухоли у мышей ш У1уо. Клетки опухоли ТС-1 клеток любезно предоставлены Т.С. \Уи Цойпк Норкшк Итуегкйу, Ва1йтоге, МО). Они получены из первичных легочных клеток мышей С57В1/6 путем успешного переноса генов НРУ16 Е6 и Е7 и активированного онкогена гак, как описано ранее (Ьт е1 а1. (1996), Сапсег Кек. йш 1; 56(1):21-6. Клетки МС38, представляющие собой мышиную клеточную линию колоректальной аденокарциономы, приобретали в АТСС (Мапаккак, УА).
Эти клетки стабильно трансфицировали конструкцией, кодирующей СА8В7439, с использованием нелипосомального реагента для трансфекции Ридепе-6 (Косйе, Мюыккаида, 0К Сапаба) в соответствии с рекомендациями производителя. Кратко, плазмиду (рсДНК3.1/2еосше), кодирующую полноразмерную последовательность белка СА8В7439 и содержащую ген резистентности к зеоцину, смешивали с Ридепе-6 и добавляли сверху к опухолевым клеткам ТС-1 или МС38 в бессывороточной среде в течение
- 25 020617 ночи. После трансфекции клетки оставляли для восстановления в течение 24 ч в культуральной среде + 10% инактивированной теплом РВЗ (фетальная телячья сыворотка). Клетки затем собирали и распределяли в 96-луночных планшетах (50 мкл клеточной суспензии на лунку) для ограниченных разведений. После высевания клеток среду заменяли на культуральную среду + 10% инактивированной теплом РВЗ, содержащую 100 мкг/мл зеоцина (1пуйгодеп, ВигПпдЮп, 0К Сапаба). После отбора каждый клон собирали и оставляли расти в 24-луночных планшетах и замораживали. Экспрессию мРНК САЗВ7439 в клетках ТС1/САЗВ7439 и МС38/САЗВ7439 контролировали посредством дРСК в реальном времени с использованием САЗВ7439-специфических праймеров и зонда ТадМаи. Реакции дРСК в реальном времени осуществляли с использованием реакционного набора ТадМап с использованием аппарата ТадМап 7900 (Аррйеб В|о5у51ет, Ро§1ег Сбу, СА, ИЗА). Экспрессию белка САЗВ7439 оценивали при помощи вестернблоттинга и иммунофлуоресценции с использованием специфического моноклонального антитела против САЗВ7439 (40-12).
Клеточная популяция ТС-1/САЗВ7439 #14 не является полностью клональной, но скорее всего состоит по меньшей мере из двух отличающихся субклонов. Таким образом, еще одну стадию ограниченного разведения осуществляли для получения полностью клональной клеточной популяции ТС-1/САЗВ7439: клетки ТС-1/САЗВ7439 #14-2.
Для определения оптимальной дозы клеток ТС-1 или МС38 для опухолевой сенсибилизации у мышей различные дозы клеток (от 1х 105 до 2х 106 клеток на мышь) инъецировали инбредным мышам СВ6Г1. Оптимальная определенная доза составляет 2,5х105 клеток на мышь для сенсибилизации ТС-1/САЗВ7439 #14 и ТС1/САЗВ7439 #14-2; обнаружено, что 1 х 105 клеток на мышь является оптимальной для сенсибилизации клетками МС38/САЗВ7439 #35.
Противоопухолевая эффективность у мышей: эксперименты по иммунизации и сенсибилизации.
Серии из четырех исследований (1.1-1.4) разработаны для оценки САЗВ7439-опосредованной опухолевой защиты ш У1уо. В общем, в каждом из этих четырех исследований группам мышей СВ6Г1 осуществляли четыре внутримышечные иммунизации с двухнедельными интервалами, с различными дозами (0, 1, 10 или 30 мкг) специфического рекомбинантного белка САЗВ7439, выбранными для исследования, приготовленными с АЗ01В или АЗ15 в описанной здесь конечной концентрации, с физиологическим раствором, только белком САЗВ7439 или только адъювантами. Через две недели после четвертой иммунизации мышей СВ6Г1 сенсибилизировали путем подкожной инъекции 250000 клеток ТС-1/САЗВ7439 #14, 100000 клеток МС38/САЗВ7439 #35 или 250000 опухолевых клеток ТС-1/САЗВ7439 #14-2. После сенсибилизации размер опухолей измеряли три раза в неделю для каждой мыши. В соответствии с протоколом мышей с опухолями больше чем 200 мм2 умерщвляли. Затем строили кривые выживания.
Дополнительно осуществляли три исследования (2.1-2.4) для изучения доз, отличающихся от 0, 1, 10 или 30 мкг рекомбинантного белка САЗВ7439. В исследовании 2.4 оценивали корреляцию между иммуногенностью и опухолевой защитой при помощи САЗВ7439 у самцов и самок мышей С57В1/6; параллельно оценивали мышей СВ6Г1. Исследования 1.1-2.4 более подробно описаны ниже.
Исследование № 1.1
Заявители исследовали противоопухолевую защиту, обеспечиваемую иммунизацией ЬУЪ111 (1 или 10 мкг), приготовленным с АЗ01В или АЗ15, по сравнению с сенсибилизацией ТС1/САЗВ7439 #14 у мышей СВ6Г1. 10 мышей на группу внутримышечно иммунизировали четыре раза с двухнедельными интервалами рекомбинантным белком САЗВ7439 (ЬУЬ111), приготовленным с АЗ01В или АЗ15 в описанной здесь конечной концентрации. Также тестировали две контрольные группы, иммунизированные физиологическим раствором или только белком САЗВ7439. Через две недели после четвертой иммунизации каждую мышь подкожно сенсибилизировали 250000 клеток ТС-1/САЗВ7439 #14.
За опухолевым ростом следили в течение 42 суток, но кривые выживания не строили, поскольку слишком мало мышей умерщвляли на 42 сутки. Тем не менее, кривые опухолевого роста строили для каждой группы. На фиг. 23 на верхней и нижней панелях представлены кривые опухолевого роста, построенные соответственно для композиций с АЗ01В и АЗ15 (замечание: АЗ15 неправильно идентифицирован на этом фиг. как АЗ015.) Кривые демонстрируют, что у мышей СВ6Г1, получающих белок САЗВ7439, приготовленный с АЗ01В или АЗ15, рост опухоли ТС1/САЗВ7439#14 замедляется.
Исследование № 1.2.
Группы из 14 мышей получали отличающуюся дозу ЬУЪ111 (1, 10 и 30 мкг) или использовались в качестве контроля. Мышей внутримышечно иммунизировали четыре раза с двухнедельными интервалами различными дозами ЬУЬ111, приготовленными с АЗ01В или АЗ15 в описанной здесь конечной концентрации. Четыре контрольные группы также иммунизировали только АЗ01В, только АЗ15, только физиологическим раствором или только 30 мкг ЬУЬ111. Через две недели после четвертой иммунизации каждую мышь подкожно сенсибилизировали 250000 клеток ТС-1/САЗВ7439 #14. После сенсибилизации размер опухолей измеряли три раза в неделю для каждой мыши. В соответствии с протоколом мышей, имеющих опухоль больше чем 200 мм2, умерщвляли. Строили кривую выживания.
- 26 020617
Результаты указывают на то, что мыши, иммунизированные ЬУЬ111, приготовленным с А815, лучше защищены против опухолевой сенсибилизации ТС1/СА8В7439 #14 по сравнению с мышами, иммунизированными ЬУЪ111, приготовленным с А801В. Оптимальные результаты у мышей СВ6Г1 получены для 10 мкг ЬУЪ111, приготовленного с А815, см. фиг. 24.
Исследование № 1.3.
мышей СВ6Г1 на группу внутримышечно иммунизировали четыре раза с двухнедельными интервалами 10 мкг ЬУЪ111, ЬУЪ168 или ЬУЪ144, приготовленных с А815 в описанной здесь конечной концентрации. Также тестировали контрольную группу, иммунизированную только А815.
Через две недели после четвертой иммунизации 28 мышей подкожно сенсибилизировали 250000 клеток ТС-1/СА8В7439 #14 и 10 оставшихся мышей подкожно сенсибилизировали 100000 клеток МС38/СА8В7439 #35. После сенсибилизации размер опухолей измеряли три раза в неделю для каждой мыши. В соответствии с протоколом мышей, имеющих опухоль больше чем 200 мм2, умерщвляли. Результаты указывают на то, что все из ЬУЬ111, ЬУЪ168 и ЬУЪ144, приготовленных с А815, защищают против сенсибилизации ТС1/СА8В7439#14 или МС38/СА8В7439#35, см. фиг. 25.
Исследование № 1.4.
мышей СВ6Г1 на группу внутримышечно иммунизировали четыре раза с двухнедельными интервалами 10 мкг ЬУЪ168 или ЬУЪ144, приготовленных с А815 в описанной здесь конечной концентрации. Также тестировали контрольную группу, иммунизированную только А815.
Через две недели после четвертой иммунизации 22 мыши на группу подкожно сенсибилизировали 250000 клеток ТС-1/СА8В7439 #14 (неклональная популяция), 250000 клеток ТС-1/СА8В7439 #14-2 (клональная популяция) или 100000 клеток МС38/СА8В7439 #35. После сенсибилизации размер опухолей измеряли три раза в неделю для каждой мыши. В соответствии с протоколом мышей, имеющих опухоль больше чем 200 мм2, умерщвляли. По-видимому, сенсибилизация ТС1/СА8В7439 #14-2 более агрессивна по сравнению с сенсибилизацией ТС1/СА8В7439 #14, о чем свидетельствует более ранняя гибель контрольных мышей и отсутствие видимого защитного действия в этом конкретном исследовании. См. фиг. 26. Последующие эксперименты осуществляли более агрессивным ТС-1/СА8В7439 #14-2, как здесь описано.
Исследование № 2.1.
мышей СВ6Г1 на группу внутримышечно иммунизировали четыре раза различными эквимолярными дозами ЬУЪ168 или ЬУЪ144, приготовленных с А815 в описанной здесь конечной концентрации. Для ЬУЪ168 использовали следующие дозы антигена: 0,77, 1,5, 3,1 и 6,25 мкг/мышь. Для ЬУЪ144 использовали следующие дозы антигена: 1,25, 2,5, 5 и 10 мкг/мышь. Также тестировали контрольную группу, иммунизированную только А815. Через две недели после четвертой иммунизации всех мышей подкожно сенсибилизировали 250000 клеток ТС-1/СА8В7439 #14-2 (клональная популяция). После сенсибилизации размер опухолей измеряли три раза в неделю для каждой мыши. Мышей, имеющих опухоль больше чем 289 мм2 (17x17 мм), умерщвляли. Строили кривые выживания для каждой группы. См. фиг. 27, на которой изображены кривые выживания, полученные с эквимолярными дозами ЬУЪ168 и ЬУЪ144, приготовленных с А815, после сенсибилизации опухолью ТС1/СА8В7439 #14-2. ТР обозначает мышей без опухоли. По сравнению с контрольной группой А815 четыре набора эквимолярных доз ЬУЪ144 и ЬУЪ168, по-видимому, ингибируют рост опухоли у мышей СВ6Г1 в равной степени.
Исследование № 2.2.
мышей С57В1/6 на группу внутримышечно иммунизировали четыре раза различными эквимолярными дозами ЬУЪ168 или ЬУЪ144, приготовленных с А815 в описанной здесь конечной концентрации. Для ЬУЪ168 использовали следующие дозы антигена: 0,77, 1,5, 3,1 и 6,25 мкг/мышь. Для ЬУЪ144 использовали следующие дозы антигена: 1,25, 2,5, 5 и 10 мкг/мышь. В качестве контрольных групп мышей также иммунизировали только А815 или буфером. Через две недели после четвертой иммунизации всех мышей подкожно сенсибилизировали 250000 клеток ТС-1/СА8В7439 #14-2 (клональная популяция). После сенсибилизации размер опухолей измеряли три раза в неделю для каждой мыши. Мышей, имеющих опухоль больше чем 289 мм2 (17x17 мм), умерщвляли. Строили кривые выживания для каждой группы, см. фиг. 28, на котором изображены кривые выживания, построенные для различных эквимолярных доз ЬУЪ168 и ЬУЪ144, приготовленных с А815, после сенсибилизации опухолью ТС1/СА8В7439 #14-2. ТР обозначает мышей без опухоли. В противоположность исследованиям, проведенным для мышей СВ6Г1, в настоящем исследовании отсутствует статистически значимое различие между выживанием мышей С57В1/6 в иммунизированных группах, группой А815 или группой, которой вводили буфер.
Исследование № 2.3.
мышей СВ6Г1 на группу внутримышечно иммунизировали четыре раза различными эквимолярными дозами ЬУЪ168 или ЬУЪ144, приготовленных с А815 в описанной здесь конечной концентрации. Для ЬУЪ168 использовали следующие дозы: 0,04, 0,19, 0,77, 1,5, 3,1 и 6,25 мкг/мышь. Для ЬУЪ144 использовали следующие дозы: 0,078, 0,31, 1,25, 2,5, 5 и 10 мкг/мышь. Также тестировали контрольную группу, иммунизированную только А815. В качестве второй контрольной группы также использовали наивных мышей. Через две недели после четвертой иммунизации всех мышей подкожно сенсибилизиро- 27 020617 вали 250000 клеток ТС-1/СА8В7439#14-2 (клональная популяция). После сенсибилизации размер опухолей измеряли три раза в неделю для каждой мыши. Мышей, имеющих опухоль больше чем 289 мм2 (17x17 мм), умерщвляли. Строили кривые выживания для каждой группы, см. фиг. 29 и 30, на которых изображены кривые выживания, построенные для различных эквимолярных доз ЬУЫ68 и ЬУЫ44, приготовленных с А815, после сенсибилизации опухоли ТС1/СА8В7439 #14-2. ТР обозначает мышей без опухоли.
Две наименьшие тестированные эквимолярные дозы, по-видимому, не оказывают значительного ингибирования опухолевого роста. При четырех наибольших дозах обнаружена большая защита от опухоли для мышей, иммунизированных ЬУЫ68 + А815 по сравнению с ЬУЫ44 + А815.
Исследование № 2.4.
Дополнительно исследовали утрату защиты, обнаруженной для мышей С57В1/6, иммунизированных СА8В7439, приготовленным с А815, против сенсибилизации опухолью ТС1/СА8В7439 #14-2, как обнаружено в исследовании № 2.2. 15 мышей СВ6Г1 или С57В1/6 на группу внутримышечно иммунизировали четыре раза 1 мкг ЬУЫ68, приготовленного с А815, в описанной здесь конечной концентрации. Группы самцов и самок мышей, иммунизированных 1 мкг ЬУЪ168 + А815, исследовали по отдельности. Также тестировали отдельные контрольные группы самцов и самок, иммунизированных только А815.
Частичные заборы крови осуществляли через 7 суток после четвертой иммунизации и сывороточные титры общего антитела !дС против СА8В7439 определяли при помощи ЕЫ8А, как описано в примере 10. Аналогичные СА8В7439-специфические СЭ4 Т-клеточные ответы (приблизительно 1х 106 мкг/мл общего ^О) получены для самцов и самок мышей СВ6Г1, иммунизированных ЬУЫ68 + А815; никакого ответа в виде антител не обнаружено у мышей С57В1/6, см. фиг. 33.
Частичные заборы крови осуществляли через 14 суток после четвертой иммунизации. СЭ4 и СЭ8 Т-клеточные ответы (положительные в отношении как ΣΡΝγ, так и ТОТ1а) измеряли путем внутриклеточного окрашивания и при помощи анализа путем проточной цитометрии, как описано в примере 10, после того, как ΡΕΡ (лимфоциты периферической крови) мышей СВ6Г1 или С57В1/6 (5 совокупностей из 3 мышей на группу) повторно стимулировали пулом пептидов, покрывающих полноразмерную последовательность СА8В7439. Кроме того, пептид 39 (8Е0 ГО NО: 91) тестировали с ΡΕΡ из С57В1/6. Аналогичные СА8В7439-специфические СЭ4 Т-клеточные ответы (частота приблизительно 0,1%) получали для самцов и самок мышей СВ6Г1, иммунизированных ЬУЪ168 + А815; СА8В7439-специфический СЭ8 Тклеточный ответ (частота 0,05%) получен только для самцов мышей, см. фиг. 34А и 35А. Никакой СА8В7439-специфический СЭ4 или СЭ8 Т-клеточный ответ не обнаружен у мышей С57В1/6, иммунизированных 1 мкг ЬУЪ168 + А815 после повторной стимуляции ΡΕΡ пулом пептидов, покрывающих полноразмерную последовательность СА8В7439, или СА8В7439 пептид 39 (8Е0 ГО NО: 91) (а.к. с 153 по 167 в 8Е0 ГО NО: 13), см. фиг. 34А и 35А. Необходимо учитывать, что СА8В7439 пептид 39 (8Е0 ГО NО: 91) использовали независимо, поскольку ранее его идентифицировали как пептид, обладающий низкой СГО4 Т-клеточной иммуногенностью, в спленоцитах мышей С57В1/6, четыре раза иммунизированных 10 мкг ЬУЪ168 + А815, см. фиг. 13 в примере 10.
Через две недели после четвертой иммунизации всех мышей подкожно сенсибилизировали 250000 клеток ТС-1/СА8В7439 #14-2. После сенсибилизации размер опухолей измеряли три раза в неделю для каждой мыши. Мышей, имеющих опухоль больше чем 289 мм2 (17x17 мм), умерщвляли. Строили кривые роста опухолей и кривые выживания для каждой группы. На фиг. 31 и 32 изображен соответственно рост опухоли и кривые выживания, полученные для самцов и самок мышей СВ6Г1 или С57В1/6, иммунизированных 1 мкг ЬУЫ68 или ЬУЪ144, приготовленных с А815, после сенсибилизации опухолью ТС1/СА8В7439 #14-2. Результаты указывают на то, что СА8В7439 + А815 обладают тенденцией вызывать меньший опухолевый рост и более хорошее выживание у самцов мышей СВ6Г1 по сравнению с самками СВ6Г1, но не оказывают действие в отношении противоопухолевой защиты у мышей С57В1/6. Утрата защиты против опухоли СА8В7439 у мышей С57В1/6 соответствует отсутствию обнаруживаемых СА8В7439-специфических СГО4 и СГО8 Т-клеток, а также отсутствию обнаруживаемого СА8В7439специфического ответа в виде антител у мышей С57В1/6. Последнее указывает на то, что в используемых экспериментальных условиях мыши С57В1/6 не представляют собой идеальную модель для исследования иммуногенности и противоопухолевой защиты в отношении СА8В7439. С другой стороны, у мышей СВ6Г1 обнаруженная противоопухолевая защита в отношении СА8В7439 соответствует присутствию СА8В7439-специфических СГО4 Т-клеток [см. иммуногенные пептиды 7-8 (а.к. с 25 по 43 в 81%) ГО 13) и 23-24 (а.к. с 89 по 107 в 81%) ГО ΝΘ: 13) фиг. 13, пример 10] и СА8В7439специфических СГО8 Т-клеток, а также ответу в виде СА8В7439-специфических антител.
- 28 020617
Последовательности
8ЕО Ю N0:1
Белок 1_νΐ_055
МСННННННННННЗЗСН1Л000КНМ0ССТЬРК5АРРАРРУРУССААККЕРАЗРЕЬЬКСЗКККЕРА
ТАЕТСССАААУАКРМЕРЕЕЕЕУКЬУЖСЕОАЬКОНУРНССАЗККЬЗКУЕТЬЕЗАУЕУТИАЬСЖ
ΣΑΕΡΌΑνΗΝΑΡΑ
5ЕО Ю N0:2
ДНК 13/1_055 аЬдддссаЬсаСсаЬсаЬсаЬсаЬсаЬсаЬсаЬсасадсадсддссаЬаЬсдасдасдасдаса адсайаЬддаЬддЬддсасссЕдссдсдЬадсдсЬссдссддсассдссддЬЬссддЬЬддЬЬд
ЬдсддсдсдЬсдЬсдЬссддсдадсссддаасЕдсЬдсдЬЬдсадссдЬсдЬсдссдЬссддсс ассдсддааассддЬддЬддйдсддсадсддЬЬдсдсдЬсдЬаасдаасдЬдаасдЬаассдЬд
ЬдааасЬддЬдаассЬдддсЬЬЬсаддсдсЬдсдЬсадсаЬдЬдссдсаЬддсддЬдсдадсаа аааасЕдадсааадЬддааасссЕдсдРадсдсддЕддааЬаРаЬЕсдЬдсдсРдсаасдРсЬд сЬддссдаасаЬдаЬдсддЬдсдЬаасдсдсйддссЬаа
ЗЕО Ю N0:3
Белок 1Л/1_111
МСННННННННННЗЗбНЮОООКНМОССТЬРКЗАРРАРРУРУССААКККРАЗРЕЬЬЕСЗККККРА
ТАЕТСССАААУАККМЕКЕКНКУКЬУМЬ5Е0АЬК0НУРНССА5ККЬ5КУЕТЕКЗАУЕУ1КАЬ<2КЬ
ЬАЕН0АУКЫАЬАССЬКР<2АУКР5АРКС555ЕРС5РКЗАУ530036СЕЗАЬ5РАЕКЕЬЬ0Е551ЯЬ есунннннн
8Е0 Ю N0:4
ДНК 1Л/1_111 аЬдддссаЬсаЬсаУсаРсаРсаРсаЬсаЬсаЬсасадсадсддссаЬаЬсдасдасдасдаса адсаЬаЬддаЬддЬддсасссЬдссдсдЬадсдсассдссддсЬссдссддЬЬссддЬСддЬЬд
ЬдсддсдсдЪсдЬсдЬссддсдадсссддаасЬдсЪдсдЬЬдсадссдЬсдЬсдссдЬссддсс ассдсддааассддЬддЬддЬдсддсадсддЬЬдсдсдЬсдЕаасдаасдЬдаасдЬаассдЬд
ЬдааасЬддЬдаассЬдддсЬЬЬсаддсдсЬдсдЬсадсаЬдЬдссдсаЬддсддЬдсдадсаа аааасЬдадсааадйддааасссСдсдЬадсдсддЬддааЬаЬаЬЬсдЬдсдсЬдсаасдЬсЬд сЬддссдаасайдаЬдсддЬдсдСаасдсдсЬддссддЬддЬсЬдсдЬссдсаддсддЬЬсдЬс сдадсдсдссдсдйддЬддЬадсадсдаассдддЬадсссдсдЬадсдссЬаЬадсадсдаЬда
ЬадсддсЬдсдааддЬдсссЬдадсссддсддаасдЬдаасЕдсЬддаЬЬЬЕадсадсЬддсЬд ддсддсЬаЬсаЬсайсаЬсассаРсаЬЬаа
ЗЕО Ю N0:5
Белок Ι_νΐ_137
- 29 020617
МСННННННННННЗЗСНЮПОПКНМОССТЬРЕЗАРРАРРУРУССААЕККРАЗРЕЕЬЕСЗЕКЕЕРА
ТАЕТ5ССАААУАКРКЕЕЕКЫРУКЬ7ЫЪСГ0АЬК0НУРНССА5ККЬ5КУЕТЬР15АУЕУ1КАЬ0ЕЬ
ЬАЕНОАУЕНАЕАССЬЕРСАУЕРЗАРЕСбЗЗЕРбЗРЕЗАУЗЗООЗССЕбАЕЗРАЕКЕЬЬОГЗЗМЬ
66Υ
5ЕО Ю N0:6
ДНК Ι_νΐ_137 аЕдддссаЕсаЬсаЬсаксаЬсаЕсаЕсаЕсаЕсасадсадсддссаЪаЬсдасдасдасдаса адсаЕаЕддаЕддЕддсасссйдссдсдкадсдсассдссддсЕссдссддЕЕссддЕЕддЕЕд кдсддсдсдЕсдЕсдЕссддсдадсссддаасйдсЕдсдЕЕдсадссдЕсдЕсдссдЕссддсс ассдсддааассддЬддЕддйдсддсадсддЕЕдсдсдЕсдЕаасдаасдЕдаасдЕаассдЕд
ЕдааасЕддЕдаассЕдддсЕЕЕсаддсдсЕдсдЕсадсаЕдЕдссдсаЕддсддЕдсдадсаа аааасЕдадсааадЬддааасссЕдсдЕадсдсддЕддааЕаСаСЕсдЕдсдсЕдсаасдксЕд сЕддссдаасаЬдаЬдсддЕдсдЕаасдсдсЕддссддЕддЕсСдсдЕссдсаддсддЕЕсдйс сдадсдсдссдсдЕддЕддЕадсадсдаассдддЬадсссдсдЕадсдссЕаЬадсадсдаЕда
ЕадсддсЕдсдааддСдсссЕдадсссддсддаасдТдаасСдсСддаСЕССадсадсЕддсЕд ддсддсйаЕЬаа
5ЕО Ю N0:7
Белок Ι_νΐ_141
М0Р55Н55ЫМАМТ0МК50К111АНК6А5СУЬРЕНТЬЕ5КАЬАЕА00А0УЕЕ<Э0ЬАМТК0СК1ЛЛ/
ШОНЕЬОСЬТОУАККГРНЕНЕКОбЕУУУЮГТЬКЕЮЗЬЕМТЕЫГЕТАААНМОССТЬРКЗАРРА
РРУРУССААЕЕЕРАЗРЕЬЬЕСЗЕЕЕЕРАТАЕТСССАААУАЕЕМЕЕЕЕПЕУКЬУЫЕСЕОАЬЕОНУ
РНССАЗККЬЗКУЕТЕЕЗАУЕУ1ЕАЕ0ЕЪЕАЕН0А7ЕКАЬАССЕЕР0АУЕРЗАРЕССЗЗЕРСЗРЕ
ЗАУЗЗООЗССЕЕАЬЗРАЕЕЕЬЬОЕЗЗВДЕССУНННННН
ЗЕО Ю N0:8
Ι_νΐ_141 ДНК
- 30 020617 аРддаРссаадсадссаРРсаРсаааРаРддсдааРасссаааГдаааРсадасааааГсаРРа РРдсРсассдРддРдсРадсддРРаРРРассададсаРасдРРадааРсРааадсасРРдсдРР РдсасаасаддсРдаРРаРРРададсаадаРРРадсааРдасРааддаРддРсдРРРадРддРР аРРсаедаРсасРРРРРадаРддсРРдасРдаРдРРдсдааааааРРсссасаРсдРсаРедка аадаРддссдРРасРаРдРсаРсдасРРРассРРаааадаааРРсааадРРРадаааРдасада ааасРРРдааассдсддссдсасаРаРддаРддРддсасссРдссдсдРадсдсассдссддсР ссдссддРРссддРРддРРдРдсддсдсдРсдРсдРссддсдадсссддаасРдсРдсдРРдса дссдРсдРсдссдРссддссассдсддааассддРддРддРдсддсадсддРРдсдсдРсдРаа сдаасдРдаасдРаассдРдРдааасРддРдаассРдддсРРРсаддсдсРдсдРсадсаРдРд ссдсаРддсддРдсдадсаааааасРдадсааадРддааасссРдсдРадсдсддРддааРаРа РРсдРдсдсРдсаасдРсРдсРддссдаасаРдаРдсддРдсдРаасдсдсРддссддРддРсР дсдРссдсаддсддРРсдРссдадсдсдссдсдРддРддРадсадсдаассдддРадсссдсдР адсдссРаРадсадсдаРдаРадсддсРдсдааддРдсссРдадсссддсддаасдРдаасРдс РддаРРРРадсадсРддсРдддсддсРаРсаРсаРсаРсассаРсаРРаа
ЗЕО ГО N0:9
Белок 1_\/1_144
МОР55Н55ММАМТОМКЗОК111АНКСА5СУЬРЕНТЬЕ8КАЬАЕАООАОУЬЕООЬАМТКОСЕ1Л/У
1НОНЕЕОСЕТОУАККЕРНКНККПСКУУУЮЕТЬКЕ1ОЗЬЕМТЕМЕЕТОеСТЬРРЗАРРАРРУРУ
ССААКККРАЗРЕЬЬКСЗККККРАТАЕТСббАААУАКККЕКЕГШКУКЬ^/ЫЬСЕОАЬКОНУРНббА
ЗККЬЗКУЕТЬКЗАУЕУ1КАЬ0РЬЬАЕН0А7РЫАЬАССЬРР(ЭА7КР8АРКСС53ЕРСЗРР5АУЗЗ
ООЗССЕСАЬЗРАЕКЕЪЬОРЗЗИЬССУНННННН
ЗЕО ГО N0:10
ДНК Ι_νΐ_144 аРддаРссаадсадссаРРсаРсаааРаРддсдааРасссаааРдаааРсадасааааРсаРРа РРдсРсассдРддРдсРадсддРРаРРРассададсаРасдРРадааРсРааадсасРРдсдРР РдсасаасаддсРдаРРаРРРададсаадаРРРадсааРдасРааддаРддРсдРРРадРддРР аРРсасдаРсасРРРРРадаРддсРРдасРдаРдРРдсдааааааРРсссасаРсдРсаРсдРа аадаРддссдРРасРаРдРсаРсдасРРРассРРаааадаааРРсааадРРРадаааРдасада ааасРРРдааассдаРддРддсасссРдссдсдРадсдсассдссддсРссдссддРРссддРР ддРРдРдсддсдсдРсдРсдРссддсдадсссддаасРдсРдсдРРдсадссдРсдРсдссдРс сддссассдсддааассддРддРддРдсддсадсддРРдсдсдРсдРаасдаасдРдаасдРаа ссдРдРдааасРддРдаассРдддсРРРсаддсдсРдсдРсадсаРдРдссдсаРддсддРдсд адсаааааасРдадсааадРддааасссРдсдРадсдсддРддааРаРаРРсдРдсдсРдсаас дРсРдсРддссдаасаРдаРдсддРдсдРаасдсдсРддссддРддРсРдсдРссдсаддсддР РсдРссдадсдсдссдсдРддРддРадсадсдаассдддРадсссдсдРадсдссРаРадсадс даРдаРадсддсРдсдааддРдсссРдадсссддсддаасдРдаасРдсРддаРРРРадсадсР ддсРдддсддсРаРсаРсаРсаРсассаРсаРРаа
ЗЕО ГО N0:11
- 31 020617
Белок 1Л/1_168
МННННННННННОССТЬРКЗАРРАРРУРУССААКРРРАЗРЕЬЬРСЗКШЖРАТАЕТСССАААУАР
РЫЕРЕРИРУКЬШЬСЕ0АЬР0НУРНеСА8ККЬЗКУЕТЬРЗАУЕУ1РАЬаРЬЬАЕНРАУРЫАЬАС
СЬРРОАУКРЗАРКССЗЗЕРСЗРКЗАУЗЗООЗССЕСАЬЗРАЕРЕЪЬОЕЗЗИЬССУ
ЗЕО 0140:12
ДНК 13/1.168 аЕдсаЬсаРсаРсаЕсаЬсаЬсаЕсаРсаЕсаЪдасддЕддсасссРдссдсдЕадсдсассдс сддсЕссдссддеЬссддЬЬддЕНдРдсддсдсдЬсдНсдЪссддсдадсссддаасЪдсЕдсд
НЬдсадссдРсдНсдссдРссддссассдсддааассддНддНддЬдсддсадсддННдсдсдН сдеаасдаасдЪдаасдЪаассдЪдПдааасйддЬдаассНдддсЬЪЪсаддсдсЪдсдйсадс аЕдНдссдсаЕддсддНдсдадсаааааасЕдадсааадНддааасссЬдсдНадсдсддНдда аЁаНаЁЬсдЬдсдсЁдсаасдЁсНдсТддссдаасаЬдайдсддЬдсдйаасдсдсНддссддЁ ддЕсГ.дсдЕссдсаддсддЕЬсдУссдадсдсдссдсдНддР.ддЕадсадсдаассдддНадсс сдсдЕадсдссНаГадсадсдаУдаЬадсддсРдсдааддГдсссЪдадсссддсддаасдЬда асРдсЕддаРРРРадсадсРддсгдддсддсРаРРаа
ЗЕО 0ΝΟ:13
№. ААВ86993, белок НА8Н2
МОССТЬРРЗАРРАРРУРУССААРРРРАЗРЕЬЕКСЗНККРРАТАЕТСССАААУАРРЫЕКЕКМКУК
ЬТЫЪСЕОАЬРОНУРНССАЗККЬЗКУЕТЬРЗАУЕУРКАЬОРЬЕАЕНОАУРМАЕАССЬКРОАТРРЗ
АРКСРРСТТР7ААЗРЗРА535РСРСС58ЕРСЗРКЗАУ53ООЗССЕСАЪЗРАЕРЕЪЪОРЗЗИЪСС
У
ЗЕО Ю N0:14
ДНК НАЗН2 аЬддасддсддсасасЕдсссаддЕссдсдсссссЕдсдссссссдЕсссЕдРсддсЬдсдсЬд сссддсддадасссдсдЕссссддаасЕдЕЕдсдсЕдсадссддсддсддсдассддссассдс ададассддаддсддсдсадсддссдСадсдсддсдсааНдадсдсдадсдсаассдсдкдаад скддНдаасННдддсЬНссаддсдсНдсддсадсасдЬдссдсасддсддсдссадсаадаадс
НдадсааддНддадасдсйдсдсНсадссдНддадНасайссдсдсдсНдсадсдссНдсйддс сдадсасдасдссдЕдсдсаасдсдсРддсдддадддсНдаддссдсаддссдНдсддссдНсН дсдссссдсдддссдссадддассассссддесдссдссНсдсссНсссдсдсйЪсЪНсдНссс сдддссдсдддддсадсНсддадсссддсНссссдсдййссдссНасйсдТсддасдасадсдд скдсдааддсдсдсНдадЪссНдсддадсдсдадсЪасНсдасННсНссадсНддНЬадддддс
ЬасНда
ЗЕО Ю N0:15
Белок 13/1.007
- 32 020617
МСННННННННННЗЗСНЮЕООКНМОССТЬРКЗАРРАРРУЬУССААКККРАЗРЕЬЬКСЗККККРА
ТАЕТСССАААУАККНЕКЕКЫКУКЬУНЬСРОАЪК<2НУРНССА5ККЬ5КУЕТЬР5АЙЕУ1РА]1<2КЬ
ЬАЕНОАУКНАЬАССЬРРОАУКРЗАРРСРРСТТРУААЗРЗКАЗЗЗРСРССЗЗЕРСЗРРЗАУЗЗОО
ЗССЕСАЪЗРАЕКЕЬЬОГЗЗИЬСбУ
5ЕО Ю N0:16
ДНК Ι_νΐ_007 айдддссайсайсаЬсайсаксайсайсаксайсасадсадсддссайайсдасдасдасдаса адсайайддасддсддсасасСдсссаддйссдсдсссссйдсдссссссдйссййдйсддсйд сдсЬдсссддсддадасссдсдЬссссддаасЬдЬйдсдсЬдсадссддсддсддсдассддсс ассдсададассддаддсддсдсадсддссдйадсдсддсдсаайдадсдсдадсдсаассдсд
СдаадсйддйдаасЬйдддсййссаддсдсйдсддсадсасдйдссдсасддсддсдссадсаа даадсйдадсааддЬддадасдсйдсдсйсадссдйддадйасайссдсдсдсйдсадсдссйд сйддссдадсасдасдссдйдсдсаасдсдсйддсдддадддсйдаддссдсаддссдйдсддс сдйсйдсдссссдсдддссдссадддассассссддйсдссдссйсдсссйсссдсдсййсййс дЬссссдддссдсдддддсадсйсддадсссддсйссссдсдййссдссйасйсдйсддасдас адсддсйдсдааддсдсдсйдадйссйдсддадсдсдадсйасйсдасййсйссадсйддййад ддддсЬасйда
8Е0 ΙϋΝ0:17
Белок Ι_νΐ_010
МСННННННННННЗЗОНЮОООКНМЛССТЬРКЗАРРАРРУРУССААКККРАЗРЕЪЬКСЗККККРА
ΤΑΕΤΟΘΘΑΑΑνΑΚΚΝΕΚΕΚΝΚνΚΙ,νΝΙιΘΕ0ΑΙ,Κ0ΗνΡΗΘΘΑ5ΚΚΙ.5ΚνΕΤΙ,Κ8ΑνΕΥΙΚΑΙ,<2ΚΙ,
ЬАЕН0АУВ.МАЬАССЬРРаА7КР5АРКСРРСТТРУАА5Р5КА353РСЖСС35Е?С5РК5АУ5300
ЗССЕСАЬЗРАЕРЕЬЬОЕЗЗИЬССУ
ЗЕО ΙϋΝ0:18
ДНКЬУЬОЮ айдддссаЁсаЁсаЁсайсайсайсайсайсайсасадсадсддссайайсдасдасдасдаса адсайайддасддсддсасасйдсссаддйссдсдсссссйдсдссссссдйсссйдйсддсйд сдсйдсссддсддадасссдсдкссссддаасйдййдсдсйдсадссддсддсддсдассддсс ассдсададассддаддсддсдсадсддссдбадсдсддсдсаайдадсдсдадсдсаассдсд йдаадсйддйдаасййдддсййссаддсдсйдсддсадсасдедссдсасддсддсдссадсаа даадсйдадсааддйддадасдсйдсдсйсадссдйддадйасайссдсдсдсЬдсадсдссйд сйддссдадсасдасдссдйдсдсаасдсдсЬддсдддадддсйдаддссдсаддссдйдсддс сдйсйдсдссссдсдддссдссадддассассссддйсдссдссйсдсссйсссдсдсййсййс дйссссдддссдсдддддсадсСсддадсссддсйссссдсдСйссдссйасйсдйсддасдас адсддсйдсдааддсдсдсйдадйссЁдсддадсдсдадсЬасйсдасЁйсЬссадсйддйСад ддддсйасйда
- 33 020617
ЗЕО ΙϋΝΟ:19
Белок Ι_νΐ_060
МСННННННННННЗЗСНЮЛООКНМОССТЬРКЗАРРАРРУРУССААКККРАЗРЕЬЪКСЗКРККРА
ТАЕТСССАААУАККЫЕКЕКККУКЪ7ЫЬСЕСАЬК<2НУРНеСА5ККЬ5КУЕТЬК5АУЕУ1КАЬаКЬ
Ι,ΑΕΗΌΑνΚΝΑΣΑ60ΙιΚΡ0ΑνΚΡ5ΑΡΚβΡΡ6ΤΤΡνΑΑ8Ρ8ΚΑ553ΡΘΚβ055ΕΡ65ΡΚ.5ΑΥ350ϋ
ЗССЕСАЪЗРАЕКЕЬЬОЕЗЗМЬССУ
ЗЕО Ю N0:20
ДНК 13/1_060 аЬдддссаЕсаЕсаЕсаЕсаЕсаПсаЕсаЕсаЕсасадсадсддссаЕаЕсдасдасдасдаса адсаЪаЪддаЕддЬддсасссЕдссдсдЪадсдсЕссдссддсассдссддЕЕссддЕЕддЕЪд ЕдсддсдсдЬсдЬсдЬссддсдадсссддаасЕдсЕдсдЫздсадссдЬсдЕсдссдЕссддсс ассдсддааассддЕддЕддЪдсддсадсддЪЬдсдсдЕсдРаасдаасдЕдаасдЬаассдЪд ЪдааасЕддЬдаассЪдддсЕЕЕсаддсдсЕдсдЕсадсаЕдЕдссдсаЕддсддЕдсдадсаа аааасЬдадсааадЕддааасссЕдсдЕадсдсддЕддааЕаЪаЕСсдЕдсдсЕдсаасдСсЪд сЕддссдаасаЪдаЕдсддЕдсдЕаасдсдсЕддссддЕддЪсЬдсдЕссдсаддсддЬЕсдЬс сдадсдсассдсдЕддЬссдссдддЕасдасдссддЕЕдсадсдадсссдадссдПдсдадсад сЪсЕссдддЕсдЬддЕддЕадсадсдаассдддЕадсссдсдЪадсдссЕаЪадсадсдаЕдаЪ адсддсЕдсдааддЕдсссТдЕсЕссддсддаасдСдаасЕдсЕддаЕЕИТадсадсТддсЕдд дсддсбаЪЕаа
ЗЕО Ю N0:21
Белок СопзМ
МСНННННННННН85СН10000КНМАТАЕТ6С6АААУАККЫЕКЕЫ1НУКЬУЬ1ЬСГ<2АЫ<<2НУРНС
САЗККЬЗКУЕТЬРЗАУЕУРРАЬОРЪЪАЕНОАУРЫАЬАССЬРРОАУРРЗАРРбРРСТТРУААЗРЗ
КА533РСКСС55ЕРС5РКЗАУ580ЛЗССЕ6АЬ5РАЕКЕЫ,0Г58ИЬ6СУЬЕ0РААИКАККЕАЕ1,
АААТАЕО
ЗЕО Ю N0:22
ДНК СопзМ аЕдддссаЕсаЕсаЕсаЕсаЕсаТсаЕсаЕсаЕсасадсадсддссаЕаЕсдасдасдасдаса адсаЬаЕддссассдсддааассддЕддЕддЕдсддсадсддЕЕдсдсдЕсдПаасдаасдЕда асдЬаассдЕдЕдааасЁддЁдаассЕдддсЕЕЕсаддсдсЁдсдЬсадсаЕдЕдссдсаЕддс ддЕдсдадсаааааасЕдадсааадЬддааасссЕдсдЬадсдсддЕддааЕаЕаЕЬсдЕдсдс
ЕдсаасдЬсЕдсЕддссдаасаЕдаЕдсддЕдсдЕаасдсдсЕддссддЕддЕсЕдсдЕссдса ддсддЬЕсдСссдадсдсассдсдЪддЕссдссдддЕасдасдссддТСдсадсдадсссдадс сдЕдсдадсадсЕсЕссдддЕсдЕддПддЕадсадсдаассдддЬадсссдсдЕадсдссЕаЕа дсадсдаЕдаЬадсддсЕдсдааддЕдсссЕдЬсЬссддсддаасдТдаасЕдсЕддаЕЕЬЕад садсЬддсЕдддсддсЬаЕсЕсдаддаЬссддсЬдсЕаасааадсссдаааддаадсЬдадЕЬд дсЕдсЕдссассдсЕдадсааПаа
- 34 020617
ЗЕО ГО N0:23
Белок 1_νΐ_056
МСНННННННННН55СН10000КНМККУК1ЖГЬСГОА1ЛОНУРНС6А5ККЬ8КУЕТ1,К2АУЕУ1К
АЪ<2КЬЕАЕН0А7ККАЬАС6ЬКР(2АУКР5АРКЗРРСТТРУАА5Р5КА555РСКСС55ЕРС5РК5А
УЗЗООЗССЕСАЬЗРАЕЕЕЬЬОЕЗЗИЬССУ
ЗЕО ГО N0:24
ДНК 13/1.056 аЕдддссаЕсаЕсайсайсаЕсайсаЕсаЕсаЬсасадсадсддссайайсдасдасдасдаса адсаЕаЕдаассдЕдЕдааасЬддЬдаассЬдддсЕЕЕсаддсдсЬдсдЕсадсаЬдЬдссдса йддсддЬдсдадсаааааасЬдадсааадйддааасссйдсдЬадсдсддйддаайаЬаййсдЁ дсдсйдсаасдйсйдсйддссдаасайдайдсддйдсдйаасдсдсСддссддйддйсйдсдйс сдсаддсддЬйсдйссдадсдсассдсдйддйссдссдддЁасдасдссддЕЬдсадсдадссс дадссдйдсдадсадсЕсйссдддйсдйддЕддйадсадсдаассдддйадсссдсдйадсдсс
ЕаЬадсадсдайдаЕадсддсЬдсдааддйдсссЕдйсйссддсддаасдЕдаасЕдсйддаЁЁ ййадсадсйддсйдддсддсйаййаа δΕΟ ГО N0:25
Белок ί.νΐ.057
МСННННННННННЗЗСНЮОООКНМАААУАКЕЫЕКЕРЫЕУКЕУИЬСЕОАЬЕОНУРНССАЗККЬЗК νΕ ТЬЕЗАУЕΥIЕАЬОКЬЬАЕ НОАУЕЫАЬА δΕΟ ГО N0:26
ДНК 13/1.057 аЬдддссаЬсаЬсаЬсаЬсаЬсаЬсаЬсаЬсаЬсасадсадсддссайаЬсдасдасдасдаса адсаЬаЬддсддсадсддЬЬдсдсдЬсдЬаасдаасдЬдаасдЬаассдйдедааасЬддЬдаа ссЬдддсЬЬЬсаддсдсЬдсдЬсадсаЬдЬдссдса'ЬддсддЬдсдадсаааааас'Ьдадсааа дЬддааасссЬдсдЬадсдсддйддааЬаЬаЬЬсдЬдсдсЬдсаасдЬсЬдсЬддссдаасаЬд аЬдсддЬдсдйаасдсдсЬддссЬаа δΕΟ ГО N0:27
Белок 1_νΐ_088
МОССТЬРКЗАРРАРРУРУССААЕЕЕРАЗРЕЬЬКСЗКЕЕЕРАТАЕТСССАААУАЕЕМЕЕЕЕЫЕУК
ЬУЫЬСЕ0АЬЕСНУРНССАЗККЬЗКУЕТЬЕЗАУЕУ1ЕАЬ0ЕЬЬАЕН0АУЕЫАЬАесЬЕР0АУЕР5
АРЕССЗЗЕРСЗРЕЗАУЗЗООЗССЕбАЬЗРАЕЕЕЬЬОЕЗЗКЬЗСУНННННН δΕΟ ГО N0:28
ДНК 13/1.088
- 35 020617 аЬддаСддЬддсасссСдссдсдкадсдсассдссддскссдссддСкссддССддкЬдЕдсдд сдсдЬсдЬсдЪссддсдадсссддаасЕдсЬдсдЬЬдсадссдЬсдЬсдссдЬссддссассдс ддааассддкддЬддЬдсддсадсддЬЁдсдсдЬсдЬаасдаасдЬдаасдЬаассдЬдЬдааа сЪддЕдаассЬдддсЫШсаддсдсЬдсдксадсаЬдЬдссдсакддсддЪдсдадсаааааас
ЬдадсааадЬддааасссЬдсдЬадсдсддЬддааЬаЬаЬесдЬдсдскдсаасдЬсСдсЬддс сдаасакдаЕдсддкдсдЕаасдсдсЬддссддЬддЬсЬдсдЕссдсаддсддЕСсдкссдадс дсдссдсдЬддЕддЕадсадсдаассдддЕадсссдсдЕадсдссЕаЕадсадсдаЕдаЕадсд дсЬдсдааддЬдсссЬдадсссддсддаасдЬдаасЕдсЬддаЬЬЬЪадсадсЕддсЬдддсдд сЬаксаксаЬсаЕсассаЬсаЕкаа
ЗЕО Ю N0:29
Белок 13/1_016
МОРЗЗНЗЗНМАНТОМКЗОКШАНКСАЗСУЬРЕНТЬЕЗКАЬАРАООАОУЬЕООЬАМТКОеКЬУУ
1Н0НРЬ0СЪТ0УАККГРНК.НКК0СНУУУ10РТЬКЕ1а8ЬЕМТЕЫРЕТАААМ0ССТЬРЯ8АРРАР
РУРУОСААРККРАЗРЕЬЕКСЗККРКРАТАЕТСбСАААУАККЫЕКЕГШКУКЪУМЬСГОАЬРОНУР
НССА5ККЬЗКУЕТЕ,Р5АУЕУ1КАЬ<2КЬЬАЕН0АУКЫАЪАССЬКР12АУК.РЗАРКСРРСТТРУААЗ
РЗКАЗЗЗРСКССЗЗЕРСЗРНЗАУЗЗООЗССЕбАЕЗРАЕКЕЬЕЕЕЗЗЧЬССУЬЕНННННН
ЗЕО Ю N0:30
ДНК [_νΐ_016 аЕддаЕссаадсадссаЕЕсаЕсаааЬаЪддсдааЕасссаааЪдаааЕсадасааааЕсаЕЬа ЕХдсЬсассдСддСдсСадсддЪЪаЪЬЬассададсаЬасдСЬадааСсЬааадсасСЬдсдЬС ЬдсасаасаддсЪдаЬЬаЪЪСададсаадаЪЪЬадсааЬдасЕааддаЬддЕсдЬЬЕадЪддЫ; аЕЕсасдаЕсасЕЕЕЕЕадаЬддсЕЕдасЕдаЕдЕЕдсдааааааЕЕсссасаЕсдЕсаЕсдка аадаЕддссдЕЪасЕаЕдЕсаЪсдасЪЪЪассЕЪаааадаааЕЕсааадЕЪЪадаааЪдасада ааасЕЕЕдааассдсддссдсааЕддаЕддЕддсасссЕдссдсдЕадсдсЕссдссддсассд ссддЕЕссддЕЕддЕЕдЕдсддсдсдЕсдЕсдЕссддсдадсссддаасЕдсЕдсдЕЕдсадсс дЕсдЬсдссдЕссддссассдсддааассддЕддЬддЬдсддсадсддЕЬдсдсдЬсдЕаасда асдЕдаасдЕаассдЕдЬдааасЕддедаассЕдддсЕЬЕсаддсдсЕдсдЬсадсаЕдЕдссд саЕддсддЕдсдадсаааааасЬдадсааадЬддааасссЕдсдЕадсдсддЕддааЕаЕаЕЕс дЕдсдсЕдсаасдЕсЬдсЕддссдаасаЬдаЕдсддЬдсдЬаасдсдсЕддссддЬддЕсЕдсд ЕссдсаддсддЕЬсдЕссдадсдсассдсдЕддЕссдссдддЕасдасдссддЕЬдсадсдадс ссдадссдЕдсдадсадсСсЬссдддЬсдЬддЕддЕадсадсдаассдддЬадсссдсдЕадсд ссСаЕадсадсдаЬдакадсддсЕдсдааддЬдсссДдСсЬссддсддаасдЬдаасСдсЕдда ЬСЬЕадсадсЕддсСдддсддсЬаЕсЕсдадсассассассассассасЕда
ЗЕО Ю N0:31
Белок 13/1.018
- 36 020617
МОССТЬРКЗАРРАРРУРУбСААКККРАЗРЕЬЬКСЗККККРАТАЕТСббАААУАКЕЫЕКЕКЫЕУК
Ь'УЫЬСЕОАЬКОН'УРН6САЗККЪ5КУЕТЬРЗАУЕУ1КАЬОКРРАЕНОА7РЫАЬАССЪНР<2АУЕР5
АРЕСРРСТТР\/ААЗР5КА888РСЕСС53ЕР58РК.5АУ35Е056СЕСАЬ5РАЕК.Е1,Ь0Е85КЬСС
УЬЕНННННН
ЗЕО ГО N0:32
ДНК 13/1.018 аЬддаЪддТддсасссбдссдсдЬадсдсЕссдссддсассдссддТЬссддЬЬддЕЕдЪдсдд сдсдЕсдЕсдЕссддсдадсссддаасЕдсЬдсдЕЁдсадссдЁсдЕсдссдЕссддссассдс ддааассддСддСддСдсддсадсддСЕдсдсдбсдСаасдаасдСдаасдСаассдСдЕдааа сЬддЬдаассСдддсСЕЬсаддсдсЬдсдбсадсаЪдСдссдсаЕддсддЪдсдадсаааааас
ЕдадсааадЬддааасссСдсдЬадсдсддЬддааЕаЕаЬЕсдЕдсдсЕдсаасдЬсЬдсЕддс сдаасаЕдаедсддЬдсдЕаасдсдсСддссддЬддЕсЕдсдТссдсаддсддСЕсдЕссдадс дсассдсдЬддЬссдссдддЬасдасдссддЬЬдсадсдадсссдадссдЬдсдадсадсЬсЬс сдддЕсдЪддСддЕадсадсдаассдддбадсссдсдСадсдссЕаЪадсадсдаЪдаЕадсдд сЬдсдааддЬдсссЬдЕсЕссддсддаасдЕдаасЕдсЕддаЕЕЕЕадсадсЕ.ддсЕдддсддс
ЕаСсЕсдадсассассассассассасЕда
ЗЕО ГО N0:33
Белок 13/1.138
МННННННЕССТЬРК8АРРАРРУРУССААККНРА5РЕЬЬКС5К.ЕККРАТАЕТеССАААУАКЕМЕК
ЕЕНЕУКЬ7ЛЬ6Е2АЕКРНУРНССА8ККЪ5КУЕТЬР5А7ЕУ1ЕАЪ0ВЬЬАЕН0А7ГО2АЪАССЬР.Р
ОАУКРЗАРКССЗЗЕРбЗРКЗАУЗЗОЛЗССЕСАЬЗРАЕКЕЬЬОЕЗЗИЬССУ
ЗЕО ГО N0:34
ДНК 13/1.138 абдсассабсассаСсассаТдабддЬддсасссбдссдсдТадсдсассдссддсбссдссдд
ЬЬссддЬЬддЬЬдЬдсддсдсдЬсдБсдЬссддсдадсссддаасТдсЬдсдЬЬдсадссдЬсд
ЬсдссдЬссддссассдсддааассддЬддбддЬдсддсадсддбЬдсдсдЬсдбаасдаасдЬ даасдЪаассдЪдЕдааасЕддЕдаассЁдддсЕЕЕсаддсдсЕдсдСсадсабдбдссдсаЕд дсддТдсдадсаааааасЬдадсааадЬддааасссЬдсдЬадсдсддЬддааЬабаЬЬсдЬдс дсЬдсаасдбсбдсЬддссдаасабдаЬдсддЬдсдЬаасдсдсбддссддЬддЬсЬдсдЬссд саддсддЬЬсдЪссдадсдсдссдсдЬддбддЬадсадсдаассддд-ЬадсссдсдТадсдссЬ аРадсадсдаЬдаЬадсддсЬдсдааддЬдсссЕдадсссддсддаасдбдаасЬдсЬддаЬЬЬ
ЕадсадсЁддсЕдддсддсЕаЕЕаа
ЗЕО ГО N0:35
Модифицированный линкер ДНК аЬдсаЬсаЬсаЬсаЬсаЬсаЬдас
ЗЕО ГО N0:36
- 37 020617 ^модифицированный линкер ДНК аЪдсассаЕсассаЬсассаЪдаЬ
ЗЕО ГО N0:37
Белок Ι_νΐ_160
МННННННОССТЬРКЗАРРАРРУРУССААКККРАЗРЕЬЪКСЗКРККРАТАЕТСССАААУАККЫЕК
ЕКННУКЪУМЬеГ0АЬК0НУРНСеАЗККЬ5К7ЕТЬЯЗАУЕУ1КАЬСКЬЕАЕНОАУКЫАЬАебЬКР
ОАУКРЗАРКСеЗЗЕРеЗРКЗАУЗЗОРЗССЕСАЪЗРАЕКЕЕЪОРЗЗИЪеСУ
ЗЕО ГО N0:38
ДНК 1_\/1_160 акдсаксаксаксаксаксакдасддкддсассскдссдсдкадсдсассдссддсйссдссдд кЪссддРкддкТдкдсддсдсдксдксдкссддсдадсссддааскдскдсдЪкдсадссдксд йсдссдкссддссассдсддааассддкддкддЬдсддсадсддЁЬдсдсдксдкаасдаасдк даасдкаассдЬдкдаааскддкдаасскдддскЬксаддсдскдсдксадсакдЬдссдсаЬд дсддЬдсдадсааааааскдадсааадЬддааасссЪдсдЪадсдсддкддааТаЬакксдЬдс дсЬдсаасдксЬдсЬддссдаасакдаЬдсддЬдсдЬаасдсдсЬддссддкддкскдсдкссд саддсддЬГсдЬссдадсдсдссдсдЬддкддкадсадсдаассдддЬадсссдсдЬадсдссЬ аЪадсадсдакдаЪадсддскдсдааддкдссскдадсссддсддаасдкдаасЪдсЪддакек кадсадсТддсЬдддсддскайЬаа
ЗЕО ГО N0:39
Белок 1/3ρϋ
ΜΟΡ58Η85ΝΜΑΝΤζ2ΜΚ5ΠΚΙΙΙΑΗΚΟΑ56ΥΕΡΕΗΤΙιΕ5ΚΑΙιΑΓΑΟΟΑϋΥΕΕΟΟΙιΑΜΤΚΟ(3ΚΕνν
ХНОНРЬОбЬТОУАККГРНКНККОСКУУУЮГТЬКЕЮЗЬЕМТЕЫГЕТ
ЗЕО ГО N0:40
ДНК 1/3ρϋ аЪддайссаадсадссаЪЪсаЬсаааЪакддсдааЪасссаааЪдаааЪсадасааааЪсаЪЪа дЪдсксассдкддЬдсЪадсдддЬакддассададсаЪасдЬЬадааЪсЬааадсасЬддсдЪЪ ЬдсасаасаддсЬдаккаЪЪЬададсаадаЬЬЬадсааЬдасЬааддаЬддЬсдкЬЬадЬддкЪ акксасдаЪсасЪЬЪЪЬадаЬддскЪдасЪдаЪд^кдсдааааааЬ'ЬсссасаксдЬсаЬсдЪа аадакддссдЬЪаскакдЪсаЬсдасЫЩассЬЬаааадаааЬксааадЬЪЪадаааЬдасада ааасЬЬЪдааасс
ЗЕО ГО N0:41
Белок ϋ Н. тЛиепгае
- 38 020617
МКЬКТЬАЬЗЬЬААбУЬАССЗЗНЗЗЫМАЫТОМКЗОКШАНЕСАЗСУЬРЕНТЬЕЗКАЬАЕАООАО
УЬЕООЬАМТКОЙНЬ'Т’ЛНПНГЬОСЬТОУАККЕРНКНККОЙНУУУЮГТЬКЕТОЗЬЕМТЕМГЕТК
ОСК0АСУУРККЕРЬЮК5НГК1НТЕЕОЕ1ЕЕ10СЬЕК8ТСККУС1УРЕ1КАР1ЙГНН<2ЫСКО1ААЕ
ТЬК7ЬККУ6УОККТОМУУЬОТЕОЕМЕЪКР1КТЕЬРРОМеМОЬКЪУаЫАУТОВДКЕТОЕКОРКеУ ΐίνΝΥΝΥΌΜΜΕΚΡΘΑΜΑΕννΚΥΑ0ΘνΘΡΘΝΥΜΕνΝΚΕΕ5ΚΡ0ΝΐνΥΤΡΕνΚΕΒΑ0ΥΝνΕνΗΡΥΤν
ΚΚϋΑΣΡΕΕΕΤ0νΝί2ΜΥ0ΑΙΑΝΚ5σΑΤ6νΕΤ0ΕΡϋΤ5νΕΕΡΚ0ΙΚ
ЗЕО ГО N0:42
Длинная полигистидиновая концевая последовательность мсннннннннннззснюлоокн
ЗЕО ГО N0:43
Белок 13/1.090
МОРЗЗНЗЗПМАЫТОМКЗОКШАНЕСАЗСУЬРЕНТЬЕЗКАЬАГАООАОУЬЕООЬАМТКОСКЬТУ
1Н0НЕЬ06ЬТ0УАККЕРНКНКК06КУУУ10ГТЬКЕ105ЬЕМТЕЫЕЕТК06К0А0УУРЫКЕРЬИК
3ΗΓΚΙΗΤΕΕΟΕΙΕΕΙΟΟΤΕΚ3ΤΟΚΚνθΙΥΡΕΙΚΑΡΝΓΗΗΟΝΟΚΟΙΑΑΕΤΕΚνΕΚΚΥΘΥΟΚΚΤΟΜ
УУЬ0ТЕОЕЫЕЬКР1КТЕЬЬР0МСМОЬКЬУ0ЫАУТОИКЕТ0ЕКОРКСУ1т1УКУОИМРКРСАМА
ΕννΚΥΑ06ν6Ρ6ΜΥΜΐνΝΚΕΕ5ΚΡ0ΝΐνΥΤΡΤνΚΕΤΑ<2ΥΝνΕνΗΡΥΤνΡΚ0ΑΕΡΑΓΕΤ0νΝ<2ΜΥ
ОЧЪЬМКЗСАТСУЕТЕЕРОТСУЕРЪКСТКАААМПССТЪРКЗАРРАРРУРУССААЕЕЕРАЗРЕЬЬЕ
СЗЕЕЕЕРАТАЕТСССАААУАЕЕЫЕЕЕКНЕУКЬТЫЬСГОАЪЕОНУРНССАЗККЬЗКУЕТЬКЗАУЕ
УТЕАЬСЕЬЬАЕНОАУЕЫАЪАССЬЕРОАУЕРЗАРЕСРРСТТРУААЗРЗКАЗЗЗРСЕССЗЗЕРСЗР
ЕЗАУЗЗООЗбСЕбАЬЗРАЕЕЕЬЪОЕЗЗМЪССУЬЕНННННН
5Е0 ГО N0:44
ДНК 13/1.090
- 39 020617 аЕддаЕссаадсадссаЬЕсаЬсаааЕаЕддсдааЕасссаааЕдаааксадасааааЕсаЕЕа ккдсИсассдЬддкдскадсддккакккассададсакасдккададксСааадсаскЪдсдкк ЪдсасаасаддсЪдаккакккададсаадаЪкСадсаакдаскааддакддксдЪСЪадкддМ: акксасдаксасккЕкЬадакддскЪдасЬдаЬдЕЬдсдаааааакЪсссасаЪсдЬсассдка аадаСддксдккаскаедксаксдаскЪЬассЬкаааадаааЪксааадкЪкадааакдасада ааасккЪдааассааадакддсааасаадсдсаадРккаЬсскааРсдЪкЬсссасЪкЪддааа ЕсасаЕЕЪкадааЪксаЕассЬЬкдаадаЬдаааЕЕдааЬЪЬакссааддсЬкадаааааЬсса сЕддсаааааадЕадддаЕЕЬаЬссадаааЕсааадсассЕЕддЕЕссассаЕсаааакддЬаа адаЕаЬЕдскдсЕдааасдсЕсааадкдЬЕаааааааЕаЕддсЬаЬдаЕаадаааассдаЬаЕд дкЫзаскЪасааасккЬсдаЪЪЬкаакдааЪкаааасдЪаксаааасддааккаскЬссасааа кдддаакддакЬкдаааккадЕЬсааккааккдскОакасадаккддааадааасасаадаааа адасссааадддккаккдддСааасГаЪааккасдакЪддакдккЪааассЪддкдсаакддса даадСддккааакакдссдакддЪдккддсссаддкЪддкакакдккадЬкаакааадаадаак ссааасскдакаакакедкдкасаскссдЬкддкаааадаасккдсасаакакаакдкддаадк дсакссЕЕасассдЕдсдЪааадаЕдсасЕасссдсдЕЬЕЕЕсасадасдЬаааЕсаааЕдЬаЕ даЕдЕсЕЕаЕЕдааЕаааЕсаддддсаасаддЬдЬаЕЕЬасЕдаЕЬЕсссадаЕасЕддсдЬдд аакксЬкааааддааЪаааадсддссдсаакддаЬддкддсасссЪдссдсдкадсдскссдсс ддсассдссддккссддЬкддЪЪдкдсддсдсдЬсдксдЪссддсдадсссддааскдскдсдк кдсадссдксдксдссдкссддссассдсддааассддЬддкддкдсддсадсддккдсдсдкс дЪаасдаасдкдаасдеаассдкдкдаааскддЪдаасскдддсккксаддсдскдсдксадса ЕдкдссдсакддсддЁдсдадсааааааскдадсааадкддааассскдсдкадсдсддкддаа ЬакакксдкдсдсЕдсаасдЕсЕдскддссдаасаЕдаЕдсддЕдсдкаасдсдсЕддссддЕд дкскдсдЪссдсаддсддкксдкссдадсдсассдсдкддкссдссдддЪасдасдссддЬСдс адсдадсссдадссдкдсдадсадсксЕссдддксдкддкддкадсадсдаассдддЪадсссд сдЕадсдссЕакадсадсдакдакадсддскдсдааддЕдсссЕдкскссддсддаасдЁдаас кдскддакккЬадсадскддсЕдддсддсЕаксЕсдадсассассассассассас δΕΟ Ю N0:45
Белок 1_νΐ_112
МСННННННС305ЕАШ0ЕАКРЕУКРЕУКРЕТН1ЫЪКУ50С35Е1ГГК1ККТТРЬКЯЬМЕАГАКНС
СКЕМОЗЬЯЕЬУОС1К1<2АО(2АРЕОЬОМЕОЫО11ЕАНКЕ<21еООССТЬРЯ5АРРАРРУРУССААК
ККРАЗРЕЬЬКСЗКККЯРАТАЕТСССАААУАМДОЕКЕгаКУКЪУКЬСЕОАЬКОНУРНССАЗККЬЗ
КУЕТЬН5АУЕУ1ЯАЬ0ЯЬЬАЕН0А7ЯНАЬАССЬНР0АУКРЗАРЯСРРСТТРУААЗРЗКАЗЗЗРС
РССЗЗЕРСЗРРЗАУЗЗОЕЗССЕСЛЕЗРАЕНЕЬЬОЕЗЗИЕССУ δΕΟ Ю N0:46
ДНК 1_У1_112
- 40 020617 аЕдддЬсаРсассаРсаЬсаРсасдддЕсддасРсадаадЬсаабсаадаадсРаадссададд ЕсаадссадаадЕсаадссЬдадасЕсасабсаабЬЕаааддбдЕссдаЕддаЕсбЕсададаЬ сбЬсбЬсаадабсааааадассасЕссЬЬбаадааддсбдабддаадсдбЕсдсбаааадасад ддбааддааабддасбссЬЬаадаббсЬЬдбасдасддбабЬадааЬбсаадсбдабсаддссс сЬдаадабббддасабддаддабаасдаЬаббабЁдаддсбсассдсдаасадаббддаддбда бддбддсасссбдссдсдбадсдсЬссдссддсассдссддббссддббддЬбдбдсддсдсдб сдЬсдбссддсдадсссддаасЕдсбдсдЕЕдсадссдбсдбсдссдЕссддссассдсддааа ссддбддбддбдсддсадсддбСдсдсдЬсдбаасдаасдбдаасдбаассдбдбдааасбддб даассбдддсбЕЕсаддсдсбдсдбсадсаЬдбдссдсаУддсддУдсдадсаааааасбдадс ааадбддааасссЕдсдЬадсдсддбддааЕаЕаббсдбдсдсУдсаасдУсЬдсЕддссдаас абдабдсддбдсдбаасдсдсбддссддЬддбсбдсдбссдсаддсддббсдбссдадсдсасс дсдбддЬссдссдддЬасдасдссддббдсадсдадсссдадссдбдсдадсадсбсбссдддб сдбддЕддбадсадсдаассдддЕадсссдсдЕадсдссбаЕадсадсдаЕдаРадсддсЕдсд ааддЕдсссбдбсЕссддсддаасдбдаасЕдсбддаЪббЬадсадсЬддсбдддсддсбаб
ЗЕО ГО N0:47 Белок Ι_νΐ_113
ΜεΗΗΗΗΗΗΟδϋ5Εν№ΕΑΚΡΕνΚΡΕνΚΡΕΤΗΙΝΣΚν5ΌΟ55ΕΙΚΚΚΙΚΚΤΤΡΣΚΚΣΜΕΑΚΑΚΚ0
ΕΚΕΜΟ5ΕΡΕΕΥθεΐΚΙ<2Α0<2ΑΡΕ0ΕΟΜΕΟΝΡΙΙΕΑΗΚΕ<2ΙΕΕΟΡ55Η55ΝΜΑΝΤ<2ΜΚ5ΟΚΙΙΙΑ
НЕОАЗбУЬРЕНТЬЕЗКАЬАЕАООАОУЬЕООЬАМТКОСКЬУУтОНЕЬОСЬТОУАККЕРНКНККО
СКУУУЮЕТЬКЕЮЗЬЕМТЕЫЕЕТАААМРССТЬРКЗАРРАРРУРУбСААКККРАЗРЕЬЬКСЗКК
ККРАТАЕТСССАААУАККНЕКЕКЫКУКЬУЫЪСЕ0АЬК0НУРН6СА5ККЬ5КУЕТЬК5АУЕУ1КА
ЬОРЫАЕНРАУР^АЬАССЬРРОАУРРЗАРРСРРСТТРУААЗРЗРАЗЗЗРСРСеЗЗЕРеЗРКЗАУ
ЗЗООЗеСЕСАЕЗРАЕКЕЕЬОЕЗЗИЬССУ
ЗЕО ГО N0:48 ДНК БУИ 13 аЕдддЕсабсассабсаЬсабсасдддбсддасУсадаадЬсаабсаадаадсЕаадссададд
ЬсаадссадаадЬсаадссЬдадасЪсасаЬсааЬЪЬаааддЬдбссдаЬддаЬсббсададаб сЪЬсЬЬсаадаЬсааааадассасЬссЪЬбаадааддсбдаЪддаадсдЬЪсдсЪаааадасад ддЬааддаааРддасЬссЕЬаадаЕЕсбЬдЕасдасддЕаЕЕадааЬЬсаадсЬдабсаддссс сЕдаадаЕЬЕддасаСддаддабаасдаСаСЕаЕСдаддсСсассдсдаасадабСддаддЕда
ЬссаадсадссаЬЬсаЬсаааЬаЬддсдааЕасссаааЕдаааЕсадасааааСсаУЕаЬбдсР сассдЪддЪдсЕадсддЕЕаЕЬЕассададсаЬасдЬЕадаабсЬааадсасббдсдббСдсас аасаддсРдаРРаРьРададсаадаЗРРадсааРдасРааддаРддРсдРРЗадРддРРаРРса сдабсасЕбббЕадаЬддсЕЕдасбдабдбЕдсдааааааЕЕсссасаЪсдЬсаЬсдбааадаб ддссдЕЕасЬаЬдЕсаЕсдасбЕРассРЕаааадаааЕЕсааадЕЕбадаааЕдасадаааасЕ
ЬЕдааассдсддссдсааЕддаРддРддсасссЕдссдсдЬадсдсРссдссддсассдссддЕ
ЕссддЕ-ЬддЕЕдЕдсддсдсдЕсдЕсдЪссддсдадсссддаасЬдсЪдсдЬЕдсадссдбсдб сдссдбссддссассдсддааассддЬддЕддЬдсддсадсддЕЬдсдсдбсдЬаасдаасдЬд аасдЬаассдбдбдааасбддЬдаассбдддсЬббсаддсдсбдсдРсадсабдбдссдсабдд сддбдсдадсаааааасбдадсааадЬддааасссбдсдбадсдсддбддаабабаббсдбдсд сРдсаасдЪсРдсЬддссдаасаРдаЕдсддЕдсдЕаасдсдсЕддссддЕддЕсЕдсдЕссдс аддсддУРсдРссдадсдсассдсдбддСссдссдддУасдасдссддЕЬдсадсдадсссдад ссдЕдсдадсадсЪсЕссдддЬсдЕддУддЕадсадсдаассдддЕадсссдсдЕадсдссбаб адсадсдаС.даСадсддсбдсдааддЬдсссбдУсУссддсддаасдС.даасЕдсЕддабЪбЕа дсадсЕддсЕдддсддсбаЬ
ЗЕО ГО N0:49
Белок БУИ 14
Μ5ΗΗΗΗΗΗε303ΕνΝ0ΕΑΚΡΕνΚΡΕνΚΡΕΤΗΙΝΕΚν3ϋε33ΕΙΕΕΚΙΚΚΤΤΡΕΚΚΕΜΕΑΕΑΚΡ2
СКЕМО8ЬКЕЬУПС1Р12АЕСАРЕОЕОМЕ0ЫО11ЕАНРЕ01ССРССТЕРР5АРРАРРУРУССААР
ККРАЗРЕЬЬКСЗККККРАТАЕТСССАААУАККЫЕКЕКМКУКЬУМЬСГОАЬКОНУРНЕСАЗККЬЗ
КУЕТЬК5АУЕУ1Ю\Ь<2КЬЪАЕН0АУКМАЬА
ЗЕО ГО N0:50
ДНК БУИ 14
- 41 020617 акдддТсаксассаЕсаЕсаксасдддЬсддасЕсадаадЕсааксаадаадсЕаадссададд есаадссадаадТсаадссЪдадасТсасаксааЪСкаааддкдессдаСддаСсеЪсададаЪ сТксЬТсаадаТсааааадассаскссЕЕкаадааддскдакддаадсдТксдсЕаааадасад ддЬааддаааЕддасЬссЕЕаадаТЕсРТдЕасдасддкаЕТадаакксаадсЕдаТсаддссс сЕдаадайЕЕддасакддаддакаасдаЪаЪкаккдаддсксассдсдаасадайЕддаддеда
ЕддЕддсасссЕдссдсдкадсдсЕссдссддсассдссддЕЕссддЕЪддЬЁдЕдсддсдсдк сдЕсдЕссддсдадсссддаасЕдседсдЕЕдсадссдесдЕсдссдЕссддссассдсддааа ссддЕддЕддЬдсддсадсддЬЕдсдсдЕсдкаасдаасдЕдаасдкаассдЕдЪдааасЕддк даассТдддсЕЪЕсаддсдскдсдЕсадсаЕдкдссдсаТддсддТдсдадсааааааскдадс ааадкддааасссЕдсдкадсдсддЕддаакаЬаЕЁсдкдсдскдсаасдЬсЬдскддссдаас акдаЕдсддСдсдкаасдсдсЕддсс
ЗЕО ГО N0:51
Белок 13/1.115
ΜΟΗΗΗΗΗΗΟ5Ο5ΕνΝΰΕΑΚΡΕνΚΡΕνΚΡΕΤΗΙΝΏΚν5ϋΟ55ΕΙΡΓΚΙΚΚΤΤΡ1ϊ<Ρ1ΜΕΑΡΑΚΚ0
СКЕМОЗЬКРЬ¥ПС1К10АО0АРЕОЬОМЕОЫО11ЕАНКЕ01ССОССТЬРК5АРРАРРУРУССААК
РКРА8РЕЬЬКСЗРРКР?АТАЕТСС6АААУАР1РЫЕКЕМШ\Т<ЬУЫЬСГ<2АЬР<2НУРНСС-А8ККЬ5
КУЕТЬР.ЗА¥ЕУ1РАЬ0НЪЬАЕНОАУРЫАЬАеСЕЕР0АУКРЗАРРеСЗЗЕРС5РЕ5АУЗЗООЗСС
ЕСАЬЗРАЕРЕЬЪОРЗЗМТССУ
ЗЕО ГО N0:52
ДНК 1_У1_115 аТдддЕсайсассаЕсаЬсаЬсасдддксддасксадаадТсааТсаадаадсТаадссададд
ЕсаадссадаадЕсаадссЕдадасЕсасаЁсааЬЬЕаааддЕдТссдаЕддаЕсЕЕсададаЕ сТЕсТЬсаадаЕсааааадассасЕссЬЕЬаадааддсЕдайддаадсдТТсдсТаааадасад ддТааддаааТддасЬссЕЕаадаЬЕсЕЬдЬасдасддЬаТЕадааТТсаадсТдаЪсаддссс сТдаадаЕЕЪддасаТддаддаЕаасдаЕаЕЕаЕЕдаддсТсассдсдаасадаТТддаддТда
ТддйддсасссЕдссдсдСадсдсассдссддсЬссдссддТТссддТТддТТдТдсддсдсдЬ сдТсдйссддсдадсссддаасЬдскдсдЬЬдсадссдЕсдТсдссдЕссддссассдсддааа ссддЬддТддЬдсддсадсддЬТдсдсдЬсдкаасдаасдйдаасдЕаассдТдЕдаааскддТ даассЪдддсЕТТсаддсдсЬдсдксадсакдЬдссдсакддсддТдсдадсаааааасЪдадс ааадТддааасссЕдсдЬадсдсддкддааЬаЬайЬсдЕдсдсТдсаасдТсТдсТддссдаас акдаТдсддТдсдТаасдсдсйддссддЕддкскдсдЬссдсаддсддТТсдТссдадсдсдсс дсдЕддЕддЕадсадсдаассдддЕадсссдсдРадсдссЬаТадсадсдаЕдаРадсддсЕдс дааддЕдссскдадсссддсддаасдкдааскдсЕддаЬЕЕТадсадсТддсТдддсддскай
ЗЕО ГО N0:53 Пептид 1 М0ССТ1_РП5АРРАРР
ЗЕО ГО N0:54 Пептид 2 ТкРПЗАРРАРРУРУС
ЗЕО ГО N0:55 Пептид 3 ЗАРРАРРУРУОСААР
- 42 020617
ЗЕО ГО N0:56 Пептид 4 АРРУРУССААРРРРА ЗЕО ГО N0:57 Пептид 5 РУеСААРРРРАЗРЕЬ ЗЕО ГО N0:58 Пептид 6 ААПРПРАЗРЕ1_1_РС5 ЗЕО ГО N0:59 Пептид 7 ПРА5РЕ1_1_РС5ПППП ЗЕО ГО N0:60 Пептид 8 РЕИРСЗРРРРРАТА ЗЕО ГО N0:61 Пептид 9 РСЗРРРРРАТАЕТОО ЗЕО ГО N0:62 Пептид 10 РРРРАТАЕТСССААА ЗЕО ГО N0:63 Пептид 11 АТАЕТОООАААУАРР ЗЕО ГО N0:64 Пептид 12 ΤΟΟΟΑΑΑνΑΡΡΝΕΡΕ ЗЕО ГО N0:65 Пептид 13 ΑΑΑνΑΡΡΝΕΡΕΡΝΡν ЗЕО ГО N0:66 Пептид 14 ΑΡΡΝΕΡΕΡΝΡ\/ΚΙ_νΝ ЗЕО ГО N0:67 Пептид 15 ΕΡΕΡΝΡνΚΙ_νΝΙ_ΟΡΟ ЗЕО ГО N0:68 Пептид 16 ΝΡνΚΙ_νΝ1.0Ρ0ΑΙ_Ρ0 ЗЕО ГО N0:69 Пептид 17 Ι,νΝΙ-ΘΡΟΑΙ-ΚΟΗνΡΗ ЗЕО ГО N0:70 Пептид 18 ОРОАЬРОНУРНСОАЗ ЗЕО ГО N0:71 Пептид 19 Ι_ΡΟΗνΡΗΟΟΑ5ΚΚΙ_5 ЗЕО ГО N0:72 Пептид 20 УРНООАЗККЬЗКУЕТ ЗЕО ГО N0:73 Пептид 21 0АЗКК1_5КУЕТ1_Р5А ЗЕО ГО N0:74 Пептид 22 КЬЗКУЕТЬРЗАУЕУ! ЗЕО ГО N0:75 Пептид 23 νΕΤΙ_Ρ5ΑνΕΥΙΡΑΙ_0 ЗЕО ГО N0:76 Пептид 24 Ρ5ΑνΕΥΙΡΑΙ_ΟΡΙ_Ι_Α ЗЕО ГО N0:77 Пептид 25 ЕУ1РА1_0РЫ_АЕРГОА ЗЕО ГО N0:78 Пептид 26 ΑΙ_ΟΡΙ_Ι_ΑΕΗϋΑνΡΝΑ ЗЕО ГО N0:79 Пептид 27 ΙίΑΕΗΟΑνΚΝΑίΑΘΘ ЗЕО ГО N0:80 Пептид 28 ΗϋΑνΠΝΑΙ_ΑΟΟΙ_ΡΡΟ ЗЕО ГО N0:81 Пептид 29 ΡΝΑΙ_ΑΟΟΙ_ΡΡΟΑνΡΡ ЗЕО ГО N0:82 Пептид 30 Α00Ι_ΡΡ0ΑνΡΡ5ΑΡΡ ЗЕО ГО N0:83 Пептид 31 РРОАУРРЗАРРСРРС ЗЕО ГО N0:84 Пептид 32 УРРЗАРРСРРСТТРУ ЗЕО ГО N0:85 Пептид 33 АРРОРРСТТРУААЗР ЗЕО ГО N0:86 Пептид 34 РРОТТРУААЗРЗРАЗ ЗЕО ГО N0:87 Пептид 35 ТРУААЗРЗРАЗЗЗРС ЗЕО ГО N0:88 Пептид 36 АЗРЗРАЗЗЗРСРОСЗ
ЗЕО ГО N0:89 Пептид 37 РА533РСРСС35ЕРС ЗЕО ГО N0:90 Пептид 38 3Ρ0Ρ0053ΕΡ03ΡΡ5 ЗЕО ГО N0:91 Пептид 39 0033ΕΡ03ΡΡ3ΑΥ33 ЗЕО ГО N0:92 Пептид 40 ΕΡ63ΡΡ3ΑΥ530050 ЗЕО ГО N0:93 Пептид 41 РРЗАУЗЗООЗССЕСА ЗЕО ГО N0:94 Пептид 42 Υ5500500ΕΘΑΙ_5ΡΑ ЗЕО ГО N0:95 Пептид 43 036СЕСА1.5РАЕРЕ1_ ЗЕО ГО N0:96 Пептид 44 Е0А1.3РАЕРЕШРЗ ЗЕО ГО N0:97 Пептид 45 5РАЕРЕ1_1ГОРЗЗ\Л/1_С ЗЕО ГО N0:98 Пептид 46 АЕРЕ1_ШР35\Л/1_ССУ
- 43 020617

Claims (13)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Белковая конструкция для индукции иммунного ответа против СА8В7439, включающая модифицированный полипептид СА8В7439 (8ЕО ГО N0: 13) и выбранная из:
    (а) ЬУЬ055 (8ЕО ГО N0: 1);
    (б) ЬУЬШ (8ЕО ГО N0: 3);
    (в) ЬУЬ137 (8ЕО ГО N0: 5);
    (г) ЬУЬ141 (8ЕО ГО N0: 7);
    (д) ЬУЬ144 (8ЕО ГО N0: 9);
    (е) ЬУЬ168 (8ЕО ГО N0: 11).
  2. 2. Иммуногенная композиция, содержащая белковую конструкцию по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, где носитель или эксципиент могут, возможно, содержать буфер.
  3. 3. Иммуногенная композиция по п.2, дополнительно содержащая адъювант.
  4. 4. Иммуногенная композиция по п.3, где адъювант содержит по меньшей мере одно из следующего: агонист ТЬК-4 (То11-подобный рецептор), иммунологически активная фракция сапонина, агонист ТЬК-9.
  5. 5. Иммуногенная композиция по п.4, где указанный агонист ТЬК-4 представляет собой 3И-МРЬ (монофосфориллипид), и/или указанный агонист ТЬК-9 представляет собой СрО олигонуклеотид, и/или указанная иммунологически активная фракция сапонина представляет собой 0821.
  6. 6. Иммуногенная композиция по п.5, содержащая 3И-МРЬ, и/или СрО, и/или 0821.
  7. 7. Иммуногенная композиция по п.6, дополнительно содержащая холестерин.
  8. 8. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотидную последовательность, кодирующую белковую конструкцию по п.1.
  9. 9. Способ индукции иммунного ответа на СА8В7439 у человека или животного, отличного от человека, при котором человеку или животному, отличному от человека, вводят эффективное количество композиции, содержащей адъювант и белок, включающий полипептидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
    (а) полипептидной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 9; и (б) полипептидной последовательности, представленной в 8Е0 ГО N0: 11.
  10. 10. Способ лечения человека или животного, отличного от человека, при котором осуществляют следующие стадии:
    (а) выбор человека или животного, отличного от человека, имеющего раковые клетки, экспрессирующие СА8В7439; и (б) введение этому человеку или животному, отличному от человека, эффективного количества композиции, содержащей адъювант и белок, включающий полипептид, выбранный из группы, состоящей из:
    (1) конструкции, представленной в 8Е0 ГО N0: 9; и (2) конструкции, представленной в 8Е0 ГО N0: 11.
  11. 11. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.2-7 в способе индукции иммунного ответа на СА8В7439 у человека или животного, отличного от человека, где указанный способ включает введение эффективного количества указанной иммуногенной композиции.
  12. 12. Применение по п.11, где иммуногенная композиция содержит белок, включающий полипептид, выбранный из группы, состоящей из:
    (а) конструкции, представленной в 8Е0 ГО N0: 9; и (б) конструкции, представленной в 8Е0 ГО N0: 11.
  13. 13. Применение иммуногенной композиции по пп.2-7 в изготовлении лекарственного средства для использования в способе индукции иммунного ответа на СА8В7439 у человека или животного, отличного от человека, где указанный способ включает введение эффективного количества указанной иммуногенной композиции.
EA201190274A 2009-05-27 2010-05-25 Конструкции casb7439 EA020617B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18138009P 2009-05-27 2009-05-27
US22039609P 2009-06-25 2009-06-25
PCT/EP2010/057141 WO2010136443A1 (en) 2009-05-27 2010-05-25 Casb7439 constructs

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201190274A1 EA201190274A1 (ru) 2012-06-29
EA020617B1 true EA020617B1 (ru) 2014-12-30

Family

ID=42556967

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201190274A EA020617B1 (ru) 2009-05-27 2010-05-25 Конструкции casb7439

Country Status (19)

Country Link
US (1) US8916514B2 (ru)
EP (1) EP2435469A1 (ru)
JP (1) JP2012528106A (ru)
KR (1) KR20120014054A (ru)
CN (1) CN102459324B (ru)
AU (1) AU2010252012A1 (ru)
BR (1) BRPI1012078A2 (ru)
CA (1) CA2763486A1 (ru)
CL (1) CL2011002994A1 (ru)
CO (1) CO6400229A2 (ru)
DO (1) DOP2011000348A (ru)
EA (1) EA020617B1 (ru)
IL (1) IL216351A0 (ru)
MA (1) MA33409B1 (ru)
MX (1) MX2011012623A (ru)
NZ (1) NZ596501A (ru)
PE (1) PE20120400A1 (ru)
SG (1) SG176220A1 (ru)
WO (1) WO2010136443A1 (ru)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1650221T3 (da) 2000-02-23 2012-09-03 Glaxosmithkline Biolog Sa Nye forbindelser
PL211151B1 (pl) * 2000-10-18 2012-04-30 Glaxosmithkline Biolog Sa Kompozycja immunogenna oraz zastosowanie połączenia saponiny, oligonukleotydu immunostymulującego i lipopolisacharydu
US20140171626A1 (en) * 2012-12-19 2014-06-19 Glaxosmithkline Llc Protein purification
GB201520592D0 (en) * 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520550D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd & Adaptimmune Ltd Peptides
GB201520568D0 (en) 2015-11-23 2016-01-06 Immunocore Ltd Peptides
KR20190057345A (ko) * 2016-09-21 2019-05-28 아말 테라퓨틱스 에스에이 암 치료를 위한, 세포 투과 펩타이드, 멀티 에피토프 및 tlr 펩타이드 작용제를 포함하는 융합체

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993015763A1 (en) 1992-02-18 1993-08-19 Smithkline Beecham Corporation Vaccinal polypeptides
WO1995014772A1 (fr) 1993-11-12 1995-06-01 Kenichi Matsubara Signature genique
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
ES2366201T3 (es) 1994-07-15 2011-10-18 University Of Iowa Research Foundation Oligonucleótidos inmunmoduladores.
US6030945A (en) * 1996-01-09 2000-02-29 Genentech, Inc. Apo-2 ligand
PL188457B1 (pl) 1996-02-09 2005-02-28 Smithkline Beecham Biolog Kompozycje farmaceutyczne, białko genu IE 63 orazjego zastosowanie
JP4768121B2 (ja) 1998-02-05 2011-09-07 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｍａｇｅファミリーからの腫瘍関連抗原及びそれらをコードする核酸配列、融合タンパク質の及びワクチン接種のための組成物の調製のための使用
US6551795B1 (en) 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
IL137998A0 (en) 1998-03-09 2001-10-31 Smithkline Beecham Biolog Combined vaccine compositions
US6087168A (en) 1999-01-20 2000-07-11 Cedars Sinai Medical Center Conversion of non-neuronal cells into neurons: transdifferentiation of epidermal cells
JP2002538787A (ja) 1999-03-11 2002-11-19 スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 新規化合物
WO2001002828A2 (en) 1999-07-07 2001-01-11 Tularik Inc. Diagnosis of cancer by detecting ash2 polypeptides or polynucleotides
WO2001057251A2 (en) 2000-02-04 2001-08-09 Aeomica, Inc. Methods and apparatus for predicting, confirming, and displaying functional information derived from genomic sequence
DK1650221T3 (da) * 2000-02-23 2012-09-03 Glaxosmithkline Biolog Sa Nye forbindelser
US7811574B2 (en) * 2000-02-23 2010-10-12 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Tumour-specific animal proteins
UA79735C2 (ru) * 2000-08-10 2007-07-25 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Очищение антигенов вируса гепатита b (hbv) для использования в вакцинах
WO2002061085A2 (en) 2000-10-31 2002-08-08 Ryan James W Isolated genomic polynucleotide fragments from the p15 region of chromosome 11
GB0104259D0 (en) 2001-02-21 2001-04-11 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
GB0111974D0 (en) * 2001-05-16 2001-07-04 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel Compounds
EP1575515A4 (en) 2002-08-29 2007-08-08 Genentech Inc ACHAETE-SCUTE-SIMILAR 2 POLYPEPTIDES AND CODING NUCLEIC ACIDS AND METHOD FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF A TUMOR
CA2662915A1 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Corixa Corporation Methods, compositions, and kits for the detection and monitoring of colon cancer
GB0700284D0 (en) * 2007-01-08 2007-02-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Combination therapy

Also Published As

Publication number Publication date
CL2011002994A1 (es) 2012-07-20
KR20120014054A (ko) 2012-02-15
CO6400229A2 (es) 2012-03-15
CN102459324B (zh) 2014-07-09
EP2435469A1 (en) 2012-04-04
MA33409B1 (fr) 2012-07-03
US8916514B2 (en) 2014-12-23
SG176220A1 (en) 2011-12-29
WO2010136443A1 (en) 2010-12-02
PE20120400A1 (es) 2012-05-04
DOP2011000348A (es) 2012-01-15
AU2010252012A1 (en) 2011-12-22
NZ596501A (en) 2013-11-29
US20120070491A1 (en) 2012-03-22
CA2763486A1 (en) 2010-12-02
JP2012528106A (ja) 2012-11-12
EA201190274A1 (ru) 2012-06-29
IL216351A0 (en) 2012-01-31
CN102459324A (zh) 2012-05-16
MX2011012623A (es) 2011-12-14
BRPI1012078A2 (pt) 2019-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2222728T3 (es) Procedimiento de vacunacion terapeutica.
US10166276B2 (en) Compositions and methods for treatment of non-hodgkins lymphoma
ES2342416T3 (es) Procedimiento de purificacion o produccion de una proteina mage.
TWI285648B (en) Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
ES2373055T3 (es) Péptido antígeno de rechazo de cáncer derivado de glipican-3 (gpc3) para uso en pacientes positivos a la hla-a2 y producto farmacéutico que comprende el antígeno.
ES2311027T3 (es) Composiciones y metodos para la inmunoterapia especifica de wt1.
EA020617B1 (ru) Конструкции casb7439
KR102044948B1 (ko) 동종이합체 단백질 구조물
PT2155243E (pt) Composição e métodos compreendendo os antigénios klk3, psca ou folh1
TW202206444A (zh) 用於預防或治療SARS-CoV-2感染的疫苗組成物
EA012037B1 (ru) Поливалентные вакцины, содержащие рекомбинантные вирусные векторы
EA016326B1 (ru) Вакцина
ES2398492T3 (es) Proteínas de fusión que comprenden los antígenos de rechazo tumoral NY-ESO-1 y LAGE-1
US20100029912A1 (en) Fusion Protein
JP2008188018A (ja) 組換えインフルエンザ菌アドヘシンタンパク質
US20180264093A1 (en) Immunogenic glycopeptide compounds, pharmaceutical compositions and uses thereof
JP2003517845A (ja) 核酸ワクチン接種の改良
RU2747296C2 (ru) Вакцинация с использованием альфа3 домена mica/b для лечения рака
KR20210084125A (ko) 신규 사이토메갈로바이러스 dna 백신 컨스트럭트 및 그의 용도
ITMI950676A1 (it) Vaccini polinucleotidici
JP4549666B2 (ja) 抗体の製造方法
CN108440669B (zh) 一种融合蛋白及治疗非小细胞肺癌的重组病毒疫苗和制备方法
AU2008206463B2 (en) Fusion proteins comprising the tumor rejection antigens NY-ESO-1 and LAGE-1
BR112012032922A2 (pt) construções de proteína homodimérica

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU