EA016326B1 - Вакцина - Google Patents
Вакцина Download PDFInfo
- Publication number
- EA016326B1 EA016326B1 EA200900795A EA200900795A EA016326B1 EA 016326 B1 EA016326 B1 EA 016326B1 EA 200900795 A EA200900795 A EA 200900795A EA 200900795 A EA200900795 A EA 200900795A EA 016326 B1 EA016326 B1 EA 016326B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- agd
- yee
- rgo
- run
- azr
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 210
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 191
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 109
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 109
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 109
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 83
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 43
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 43
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 claims abstract 4
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 claims abstract 4
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 claims abstract 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 104
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 60
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 55
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 46
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 39
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 36
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 18
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 17
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 17
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 16
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 claims description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 14
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 14
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 9
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 9
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 claims description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 claims description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 claims description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 claims 81
- 235000012907 honey Nutrition 0.000 claims 11
- 241000182988 Assa Species 0.000 claims 2
- 101150018711 AASS gene Proteins 0.000 claims 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims 1
- 208000017897 Carcinoma of esophagus Diseases 0.000 claims 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims 1
- 101710119265 DNA topoisomerase 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101100405117 Homo sapiens NR4A1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 claims 1
- 102100022679 Nuclear receptor subfamily 4 group A member 1 Human genes 0.000 claims 1
- 101100377454 Rattus norvegicus Serpina10 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100186386 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) nak1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims 1
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 claims 1
- 201000005619 esophageal carcinoma Diseases 0.000 claims 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 claims 1
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 claims 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 abstract 1
- 102000036673 PRAME Human genes 0.000 abstract 1
- 108060006580 PRAME Proteins 0.000 abstract 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 150
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 67
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 67
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 27
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 23
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 20
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 13
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 230000004044 response Effects 0.000 description 9
- 235000009421 Myristica fragrans Nutrition 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000001115 mace Substances 0.000 description 8
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 7
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 6
- 101710150593 Protein beta Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- -1 as described herein Proteins 0.000 description 4
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 3
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 3
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 3
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 3
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 3
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 3
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 101100322030 Drosophila melanogaster Abl gene Proteins 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical group [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 2
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dimethoxybenzidine Chemical compound C1=C(N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C(N)=CC=2)=C1 JRBJSXQPQWSCCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102100027236 Adenylate kinase isoenzyme 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040350 B family Human genes 0.000 description 1
- 108091072128 B family Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100309447 Caenorhabditis elegans sad-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 101100523490 Dictyostelium discoideum rab8A gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000392831 Pharyngostrongylus lambda Species 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102100026436 Regulator of MON1-CCZ1 complex Human genes 0.000 description 1
- 101710180672 Regulator of MON1-CCZ1 complex Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100037253 Solute carrier family 45 member 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102000000763 Survivin Human genes 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100039094 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 108010066695 adenylate kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 101150064974 ass1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150044395 dda1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- QUSQOXBLTWQHMU-UHFFFAOYSA-H dialuminum hexahydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3].[Al+3] QUSQOXBLTWQHMU-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006872 enzymatic polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical class O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical group O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010079891 prostein Proteins 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
- A61K39/001189—PRAME
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим антиген, имеющий происхождение от так называемого антигена отторжения опухоли PRAME (также известного как DAGE), связанный с иммунологическим партнером слияния, который дает эпитопы Т-хелперов, таким как, например, белок D из Haemophilus influenzae В, к белкам-партнерам слияния, содержащим фрагменты белка D, к способам их получения и приготовления вакцин и к их применению для лечения целого ряда раковых заболеваний.
Description
Настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим антиген, имеющий происхождение от так называемого антигена отторжения опухоли РКАМЕ (антиген, преимущественно экспрессирующийся в меланоме) (также известного как ИАСЕ), связанный с иммунологическим партнером слияния, который дает эпитопы Т-хелперов, таким как, например, белок И из НаеторЫ1и8 шПиепхае В, к способам их получения и приготовления вакцин и к их применению для лечения целого ряда раковых заболеваний, включая, без ограничения, меланому, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак легкого, такой как Ы8СЕС (немелкоклеточный рак легкого), саркому, рак яичника, рак в области головы и шеи, рак почки, колоректальную карциному, множественную миелому, лейкоз, включая острый лейкоз, и карциному пищевода.
В другом воплощении настоящее изобретение относится к белкам-партнерам слияния, содержащим производные белка И, и к способам их получения.
Среди разных групп антигенов, ассоциированных с опухолями, раково-тестикулярные антигены представляют интерес для иммунотерапии благодаря их широкой опухолеспецифичной экспрессии и благодаря тому, что эти антигены обычно не экспрессируются в здоровых клетках. К настоящему времени описано более 50 раково-тестикулярных антигенов, и для многих из них были идентифицированы эпитопы, распознаваемые Т-лимфоцитами. РКАМЕ является раково-тестикулярным антигеном и исследуется в качестве потенциального иммунотерапевтического средства.
При иммунотерапии раковый антиген вводят пациенту обычно в виде вакцины, например вакцины, содержащей антиген в виде белка или его иммуногенного фрагмента, или в виде ДНК, кодирующей белок, или в виде вектора, содержащего указанную ДНК, который стимулирует иммунную систему пациента атаковать опухоли, экспрессирующие тот же самый антиген.
Если стимулируется соответствующий ответ, то Т-лимфоциты (Т-клетки) непосредственно атакуют антигены и обеспечивают контроль иммунного ответа. Развиваются В-клетки и Т-клетки, которые специфичны к одному типу антигена. Когда иммунная система подвергается воздействию другого антигена, образуются другие В-клетки и Т-клетки. По мере развития лимфоцитов они обычно учатся распознавать собственные ткани организма (свое) как отличающиеся от тканей и частиц, которые обычно не встречаются в организме (чужое). Как только В-клетки и Т-клетки образовались, некоторые из этих клеток будут размножаться и обеспечивать память иммунной системы. Это дает возможность иммунной системе отвечать быстрее и более эффективно в следующий раз, когда она подвергнется воздействию того же самого антигена.
Некоторые эксперименты указывают на то, что раково-тестикулярные антигены могут стимулировать механизмы памяти в иммунной системе.
Выдвинута гипотеза, что РКАМЕ вовлечен в гибель клеток или в клеточные циклы. Было показано, что он экспрессируется в меланоме и в различных опухолях, включая опухоли легкого, почки и в области головы и шеи. Интересно то, что он, по всей вероятности, также экспрессируется в 40-60% случаев лейкоза, такого как острый лимфоидный лейкоз и острый миелоидный лейкоз (см., например, Ехр. Нета1о1. 2000 Иее.; 28(12):1413-22). У пациентов наблюдалась сверхэкспрессия РКАМЕ, которая, по всей вероятности, связана с более высокой выживаемостью и с меньшими показателями рецидивов по сравнению с пациентами, у которых нет сверхэкспрессии данного белка.
Данный антиген и его получение описаны в патенте США № 5830753.
РКАМЕ находится в аннотированной базе данных человеческих генов Н-Ιην ИВ под инвентарными номерами И65011.0, ВС022008.1, АК129783.1, ВС014974.2, СК608334.1, АЕ025440.1, СК591755.1, ВС039731.1, СК623010.1, СК611321.1, СК618501.1, СК604772.1, СК456549.1 и СК620272.1.
Белок И представляет собой поверхностный белок грамотрицательной бактерии НаеторЫ1и8 шПиепхае В. Информацию по иммунологическим партнерам слияния, имеющим происхождение от белка И, можно получить в ЖО 91/18926.
Иногда получают слитые белки из участка антигена и гетерологичного партнера слияния для увеличения иммуногенности данного антигена, и/или для облегчения продуцирования белка в подходящих количествах, и/или для очистки (см., например, ЖО 99/40188), где описан слитый белок МАСЕ и, например, белок И, поверхностный белок грамотрицательной бактерии НаеторЫ1и8 тПиеп/ае В. Слитый белок получают рекомбинантно, и в слитый белок может быть включена секреторная последовательность белка И для потенциального содействия секреции и солюбилизации конечного продукта.
- 1 016326
Краткое описание
Фиг. 1 | Анализ 808-РАСЕ (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) конструкции 3 и 4. |
Фиг. 2 | Анализ 808-РАСЕ конструкции За и 4а. |
Фиг. 3 | Ответ СО4 (адъювант А801 В) |
Фиг. 4 | Ответ Οϋ8 (адъювант А801В - 20070499) |
Фиг. 5 | Ответ СО4 (адъювант А815) |
Фиг. 6 | Ответ Οϋ8 (адъювант А315) |
Фиг. 7 | Размеченная аминокислотная последовательность примеров конструкций по настоящему изобретению |
Фиг. 8 | Выравнивание между 1_ίροΟ-ΜΑΟΕ3-Ηϊδ (8ЕО Ю N0:43) и ΡΟ1/3-ΡΚΑΜΕ-ΗΪ8 (8ЕО Ю N0:10) |
Фиг. 9 | Выравнивание между общей последовательностью исходного белка ϋ из Наетор11Ииз 1'пНиепгае (8ЕО Ю N0:45) и ЫроО-МАСЕЗ-Н|5 (8ЕО Ю N0:43) |
Фиг. 10 | Выравнивание между общей последовательностью исходного белка ϋ из НаеторНПиз /пЛиепгае (8Е0 Ю N0:41), ρϋ-ΜΑΟΕ3-ΗΪ5 (8ΕΩ Ю N0:45) и конструкцией ρΟΙ/3-ΡΡΑΜΕ-Ηίδ, которая не включает аминокислоты 2-Ώ и 3-Р (8Е0 Ю N0:44) |
Фиг. 11 | Анализ 808-РАСЕ ρϋ1/3-ΡΙ4ΑΜΕ с или без сигнала секреции (88) и Ηΐδ-хвоста (Ηίδ) в векторе рЕТ21. |
Фиг. 12 | Последовательность белка 0 1/3 ΜΑΘΕ3-Α3-Ηϊδ (8Е0 Ю N0:44) |
Конструкция 1 | ΜϋΡ-20-127 - Белок ϋ - РРАМЕ - Т8СНННННН |
- 2 016326
(Пример 1) | (плазмида ТСМР14) (нуклеотидная последовательность 8ΕΩ ΙΩ N0: 1; аминокислотная последовательность 8ΕΩ ΙΩ N0: 2) |
Конструкция 2 (Пример 2) | ΜΩΡ-20-127 - Белок Ω - РКАМЕ - нет Ηΐδ-хвоста (плазмида ТСМР14) (нуклеотидная последовательность 8ΕΩ ΙΩ N0: 3; аминокислотная последовательность 8ΕΩ ΙΩ N0: 4) |
Конструкция 3 (Пример 3) | ΜΩΡ-20-127 - Белок Ω - РПАМЕ - 1_ЕНННННН (плазмида рЕТ21) (нуклеотидная последовательность 8ΕΩ ΙΩ N0: 5; аминокислотная последовательность 8ΕΩ ΙΩ ΝΩ: 6) |
Конструкция 4 (Пример 4) | ΜΩΡ-20-127 - Белок Ω - РКАМЕ - нет Ηΐδ-хвоста (плазмида рЕТ21) (нуклеотидная последовательность 8ΕΩ ΙΩ N0: 7; аминокислотная последовательность 8ΕΩ ΙΩ ΝΩ: 8) |
Конструкция За (Пример За) | ΜΩΡ-20-127 - Белок Ω - РРАМЕ - НННННН (плазмида рЕТ26) (нуклеотидная последовательность 8ΕΩ ΙΩ ΝΩ: 9; аминокислотная последовательность 8ΕΩ ΙΩ ΝΩ: 10) |
Конструкция 4а (Пример 4а) | ΜΩΡ-20-127 - Белок Ω - РКАМЕ - нет Ηΐδ-хвоста (плазмида рЕТ26) (нуклеотидная последовательность 8ΕΩ ΙΩ ΝΩ: 11; аминокислотная последовательность 8ΕΩ ΙΩ ΝΩ: 12) |
Последовательность 1 (8ΕΩ ΙΩ N0: 1) | представляет собой последовательность ДНК для Примера 1 |
Последовательность 2 (8ΕΩ ΙΩ N0: 2) | представляет собой аминокислотную последовательность для Примера 1 |
Последовательность 3 (8ΕΩ ΙΩ N0: 3) | представляет собой последовательность ДНК для Примера 2 |
Последовательность 4 (8ΕΩ ΙΩ N0: 4) | представляет собой аминокислотную последовательность для Примера 2 |
Последовательность 5 (8ΕΩ ΙΩ N0: 5) | представляет собой последовательность ДНК для Примера 3 |
- 3 016326
Последовательность 6 (8ΕΩ Ю N0: 6) Последовательность 7 (8ΕΩ Ю N0: 7) Последовательность 8 (8Е0 Ю N0: 8) Последовательность 9 (8Е0 Ю N0: 9) Последовательность 10(8ΕΟΙΟΝΟ: 10) Последовательность (8Е0 Ю N0: 11) Последовательность (8Е0 Ю N0: 12) (8Е0 Ю N0: 13) (8Е0 Ю N0: 14) (8Е0 Ю N0: 15) (8ΕΩ Ю N0: 16) (8Е0 Ю N0: 17) 8Е0 Ю N0: 18-35 представляет собой аминокислотную последовательность для Примера 3 представляет собой последовательность ДНК для Примера 4 представляет собой аминокислотную последовательность для Примера 4 представляет собой последовательность ДНК с оптимизированными кодонами для Примера За представляет собой аминокислотную последовательность для Примера За представляет собой последовательность ДНК с оптимизированными кодонами для Примера 4а представляет собой аминокислотную последовательность для Примера 4а УЮОЮУкк (РКА100'108)
ЗкУбРРЕРЕА (РКА142'151) АкУУОЗкРРк (ρρΑ3ϋϋ'3υ9) кУУОЗкРРк (РКАзи™) ЗккОНЫСк (РКА426'433) Олигонуклеотиды, использованные в примерах по настоящему изобретению
ТСС АТС АСС ТТС СТС АСС ТТ (СрС 1826;)
8Е0 Ю N0: 36
8Е0 Ю N0: 37 ТСТ ССС АСС СТС ССС САТ (СрС 1758)
8Е0 Ю N0: 38 АСС САТ САС СТС ССС СОТ САС ССС АСС АСС
8Е0 Ю N0: 39
8Е0 Ю N0: 40
8Е0 Ю N0:41
8ΕΩ Ю N0: 42
8Е0 Ю N0: 43
8ΕΩ Ю N0: 44 тсс тсс ттт тот сет ттт стс етт (СрС 2006)
ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ (СрС 1668)
ТСС АСС ТТТ ТСС ССС ССС ССС С (СрС 5456) от АК (аминокислота) 1 до 127 Белка ϋ из НаеторМиз /пЛиепгае
-Ме1; 2-Азр; З-Рго; с последующими АК 20-127 Белка ϋ
Аминокислотная последовательность белка ϋ 1/3 МАСЕ-АЗ-Ηϊβ
Аминокислоты из Белка ϋ из НаеторРПиз ΐηίΙυβηζβΘ для применения в последовательности рО1/3-РКАМЕΗΪ5
8Е0 Ю N0:45
Аминокислоты из белка ϋ из НаеторМиз /пЛиепгае для применения в последовательности рО1/3-МАСЕΗΪ3
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно настоящему изобретению предложен слитый белок, содержащий:
а) РКЛМЕ или его иммуногенный фрагмент и
б) гетерологичный партнер слияния, имеющий происхождение от белка Ό, где указанный слитый белок не включает в себя секреторную последовательность (сигнальную последовательность) белка Ό.
Согласно настоящему изобретению предложен также белок-партнер слияния, как описано здесь, имеющий происхождение от белка Ό, в котором белок-партнер слияния не включает в себя секреторную последовательность или сигнальную последовательность белка Ό.
Согласно настоящему изобретению предложен также слитый белок, как описано здесь, и его антиген или фрагмент.
Согласно настоящему изобретению предложен также белок-партнер слияния, имеющий происхождение от белка Ό, в котором белок-партнер слияния содержит или состоит из аминокислот 20-127 белка Ό. В одном из воплощений настоящего изобретения одна или более аминокислот из белка-партнера слияния белка Ό, как описано здесь, может быть удалена или может быть заменена заменой. Аминокислоты могут быть заменены консервативными заменами, как определено здесь, или могут быть использо
- 4 016326 ваны другие аминокислоты. В одном из воплощений могут быть заменены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислот.
Белок-партнер слияния белка I), как описано здесь, дополнительно или альтернативно может содержать делеции или вставки в аминокислотной последовательности по сравнению с последовательностью белка Ώ дикого типа. В одном из воплощений могут быть вставлены или удалены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислот.
В контексте этой заявки термины секреторная последовательность, или сигнальная последовательность, или сигнал секреции белка Ώ относятся к приблизительно аминокислотам 1-16, 17, 18 или 19 встречающегося в природе белка. В одном из воплощений секреторная или сигнальная последовательности или сигнал секреции белка I) относятся к Ν-концевым 19 аминокислотам белка Ώ. В настоящем описании изобретения термины секреторная последовательность, или сигнальная последовательность, или сигнал секреции используются взаимозаменяемо.
Белок-партнер слияния по настоящему изобретению может содержать остаточный полноразмерный белок I) или может содержать приблизительно остаточную Ν-концевую треть белка Ώ. Например, остаточная Ν-концевая треть белка Ώ может содержать приблизительно или примерно аминокислоты 20-127 белка Ώ. В одном из воплощений последовательность белка Ώ для использования в настоящем изобретении содержит аминокислоты 20-127 белка I). В другом воплощении настоящее изобретение включает или состоит из любой из последовательностей, начиная с любой из следующих аминокислот последовательности белка Ώ: 17, 18, 19, 20, 21 или 22 и заканчивая любой из следующих аминокислот последовательности белка I): 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 или 140.
В контексте данного описания под остаточным(ой) подразумевается последовательность белка белка Ώ без секреторной или сигнальной последовательности, как описано здесь.
В одном из воплощений настоящего изобретения, в котором слитый белок содержит РЕАМЕ или его иммуногенный фрагмент, производное белка I) по настоящему изобретению содержит приблизительно первую 1/3 данного белка, более конкретно аминокислоты 20-127. В альтернативном воплощении настоящего изобретения, в котором слитый белок содержит РЕАМЕ или его иммуногенный фрагмент, белок I) содержит приблизительно первую 1/3 данного белка, в которой используются 109 Ν-концевых аминокислот белка Ώ. В одном из воплощений настоящего изобретения часть белка Ώ не включает в себя секреторную последовательность данного белка. В одном из воплощений настоящего изобретения производное белка I) является нелипидизированным.
В одном из воплощений настоящего изобретения предложена конструкция белка I), как описано здесь, в виде белка-партнера слияния. Данная конструкция белка Ώ может представлять собой белокпартнер слияния для конструкции, дополнительно содержащей конструкцию РЕАМЕ или МАОЕ А3, как описано здесь, или может представлять собой белок-партнер слияния для конструкции, дополнительно содержащей другой раковый антиген или любой другой антиген.
Представляется, что для слитых белков, содержащих РЕАМЕ или его иммуногенный фрагмент и белок I), или для слитых белков, содержащих белок Ώ, или для белка-партнера слияния, содержащего белок I), присутствие секреторной последовательности (или сигнальной последовательности) может вредно влиять на количество продуцированного слитого белка.
РЕАМЕ.
В одном аспекте слитый белок по настоящему изобретению содержит белок-партнер слияния, как описано здесь, и антиген РЕАМЕ или его иммуногенный фрагмент. Обычно белок РЕАМЕ имеет 509 аминокислот, и в одном из воплощений могут быть использованы все 509 аминокислот РЕАМЕ. На РЕАМЕ было идентифицировано несколько эпитопов цитотоксических Т-лимфоцитов (СТЬ), например νΐ_ΟΘΙ_θνΐ± (РКА100'108; 5ΕΩ Ю N0:13);
8Ι_Υ8ΕΡΕΡΕΑ (РКА142’151; 8ΕΩ Ю N0:14); ΑΙ_Υν08Ι_ΕΕ1_ (РВА300’309: 8ЕО Ю N0:15); Ι_Υν08Ι_ΕΕΙ_ (РВА301'309; 8ΕΩ Ю N0:16) и ЗНОНЫСЬ (РВА425’433; 8ΕΩ Ю N0:17).
Обычно желательно включать в антиген как можно больше этих эпитопов для генерации сильного иммунного ответа и чтобы антиген был как можно более иммуногенным. Хотя существует возможность компенсировать пониженную иммуногенность данной конструкции за счет использования препарата с мощным иммунологическим адъювантом. Сильные адъюванты более подробно обсуждаются ниже.
В одном аспекте данного изобретения предложен участок РЕАМЕ слитого белка, содержащий, состоящий или по существу состоящий из полноразмерного белка.
Тем не менее, данное изобретение также распространяется на конструкции РЕАМЕ с консервативными заменами. В одном из воплощений могут быть заменены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более аминокислот. Конструкция РЕАМЕ, как описано здесь, дополнительно или альтернативно может содержать в аминокислотной последовательности делеции или вставки по сравнению с последовательностью РЕАМЕ дикого типа. В одном из воплощений могут быть вставлены или удалены 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или боль
- 5 016326 ше аминокислот.
Консервативные замены общеизвестны и обычно установлены по умолчанию в виде оценочных матриц в компьютерных программах выравнивания последовательностей. Эти программы включают РАМ250 (Наукой М.О. е! а1., (1978), А то!е1 οί еуоЫюпагу сйапдез ΐη рго1етз, Ιη Айаз οί Рго!ет зернепсе ап! зйисШге 5(3) М.О. Наукой (ей.), 345-352), \аОопа1 Вютей1са1 Еезеагсй Еоипйайоп, ХСазЬтд1оп и В1озит 62 (81еуеп Неткой ап! ,1ог|а О. Неткой (1992), Атто асМ зиЪзШийоп та!лсез Йот рго!ет Ыоскз) Ргос. N11. Аса!. 8ск ϋ8Α 89 (Вюсйет1з1гу): 10915-10919.
В общепринятом понимании замены в пределах указанных ниже групп представляют собой консервативные замены, но замены между группами считаются неконсервативными. Эти группы следующие:
1) аспартат/ аспарагин/ глутамат/глутамин,
2) серин/треонин,
3) лизин/аргинин,
4) фенилаланин/тирозин/триптофан,
5) лейцин/изолейцин/валин/метионин,
6) глицин/аланин.
Обычно последовательность/аминокислоты РЕАМЕ, используемые в слитых белках по изобретению, более чем на 80%, например на 85, 90, 95 и более конкретно на 99% идентичны природному РЕАМЕ. Однако специалистам в данной области известно, что аминокислотные остатки, образованные в результате процесса клонирования, могут сохраняться в рекомбинантно синтезированных белках. Если они не оказывают вредного влияния на характеристики продукта, то удалять или не удалять их является необязательным.
В одном аспекте изобретения предложен слитый белок, как описано здесь, включающий, состоящий из или по существу состоящий из полноразмерного белка РЕАМЕ. В другом аспекте часть РЕАМЕ слитого белка по настоящему изобретению включает, состоит или по существу состоит из одного или более из следующих эпитопов:
νΐ_ΟΟΙ_ϋνΐ_Ι_ (РКА100'108; 8ΕΩ Ю N0:13); δίΥδΕΡΕΡΕΑ (РКА142’151; 8ΕΩ Ю N0:14); ΑΙ_ΥνθδΙ_ΡΕΙ_ (РКА300'309; δΕΟ Ю N0:15); 1_Υνθδ!_ΕΕΙ_ (РКА301’309; δΕΩ Ю N0:16) и бИОНИбк (РВА425'433; δΕΩ Ю N0:17).
Слитые белки
В другом воплощении настоящего изобретения в слитом белке, как он описан здесь, можно использовать опухолевый антиген, отличающийся от РЕАМЕ или в дополнение к РЕАМЕ. В одном из воплощений предложен слитый белок, содержащий белок-партнер слияния, как он описан здесь, и один или более из следующих опухолевых антигенов, или производных опухолевых антигенов, или их иммуногенных участков, которые способны направлять иммунный ответ на данный антиген: антиген МАОЕ, например антиген МАОЕ А, такой как МАОЕ 1, МАОЕ 2, МАОЕ 3, МАОЕ 4, МАОЕ 5, МАОЕ 6, МАОЕ 7, МАОЕ 8, МАОЕ 9, МАОЕ 10, МАОЕ 11, МАОЕ 12. Эти антигены известны также как МАОЕ А1, МАОЕ А2, МАОЕ А3, МАОЕ А4, МАОЕ А5, МАОЕ А6, МАОЕ А7, МАОЕ А8, МАОЕ А9, МАОЕ А10, МАОЕ А11 и/или МАОЕ А12 (семейство МАОЕ А). В одном из воплощений может быть использован антиген из одного или двух других семейств МАОЕ: группа МАОЕ В и группа МАОЕ С. Семейство МАОЕ В включает МАОЕ В1 (также известный как МАОЕ Хр1 и ЭАМ 10), МАОЕ В2 (также известный как МАОЕ Хр2 и ЭАМ 6), МАОЕ В3 и МАОЕ В4, семейство Маде С в настоящее время включает МАОЕ С1 и МАОЕ С2.
Антиген МАОЕ для использования в настоящем изобретении может содержать полноразмерный антиген МАОЕ. Альтернативно, антиген МАОЕ может содержать иммуногенный участок МАОЕ, в котором 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот в аминокислотной последовательности могут быть удалены или заменены. В одном из воплощений настоящего изобретения 2 аминокислоты могут быть удалены из Ν-конца последовательности МАОЕ. В одном из воплощений настоящего изобретения, в котором антиген представляет собой МАОЕ А3 или его иммуногенный участок, последовательность МАОЕ А3 может состоять из аминокислот 3-314 МАОЕ А3.
В еще одном воплощении опухолевый антиген или его производное для использования в настоящем изобретении может представлять собой РЕАМЕ, ВАОЕ, ЕАОЕ 1, ЕАОЕ 2 (также известный как ΝΥЕ8О-1), 8АОЕ, НАОЕ, ХАОЕ, Р8А, РАР, Р8СА, Р5018 (также известный как простеин), НА8Н1, НА8Н2, Спр1о, В726, NΥ-ВЕ1.1, Р510, МиС-1, простазу, 8ТЕАР, тирозиназу, теломеразу, сурвивин, СА8В616, Р53 и/или Нег-2/пеи, или их иммуногенный участок, который способен направлять иммунный ответ на данный антиген.
В другом воплощении данного изобретения опухолевый антиген может включать или состоять из одного из следующих антигенов или его иммуногенного участка, который способен направлять иммун
- 6 016326 ный ответ на антиген: 88Х-2; 88Х-4; 88Х-5; ΝΑ17; МЕ1.АХ-А; Р790; Р835; Β305Ό; В854; СА8В618 (как описано в \\'О 00/53748); СА8В7439 (как описано в \\'О 01/62778); С1491; С1584 и С1585.
В одном из воплощений антиген для использования в настоящем изобретении может содержать или состоять из Р5018. Р5018, также называемый простеином (Хи е! а1., Сапсег Век. 61, 2001, 1563-1568), известен как 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 113 в \УО 98/37814 и представляет собой белок из 553 аминокислот. Его иммуногенные фрагменты и участки, содержащие по меньшей мере 20, предпочтительно 50, более предпочтительно 100 заменимых аминокислот, как раскрыто в патентной заявке, ссылка на которую приведена выше, могут быть использованы в слитых белках по настоящему изобретению. Предпочтительные фрагменты раскрыты в \УО 98/50567 (антиген Р8108) в качестве белка, ассоциированного с раком простаты (8ΕΟ ΙΌ NΟ: 9 \УО 99/67384). Другими предпочтительными фрагментами являются аминокислоты 51553, 34-553 или 55-553 полноразмерного белка Р5018.
В одном из воплощений антиген может содержать или состоять из ^Т-1, экспрессируемого геном опухоли Вильма, или его иммуногенного участка, который способен направлять иммунный ответ на антиген, или Ν-концевого фрагмента ^Т-1Е, содержащего примерно или приблизительно аминокислоты 1249 фрагмента ЭД'Т-Е
В еще одном воплощении антиген может содержать или состоять из антигена, экспрессируемого геном Нег-2/пеи, или его фрагмента либо его иммуногенного участка, который способен направлять иммунный ответ на антиген. В одном из воплощений антиген Нег-2/пеи может представлять собой один из слитых белков, описанных в \УО 00/44899.
Антиген для использования в настоящем изобретении может содержать или состоять из слитого белка Нег-2/пеи ΕΟΩ-ΙΟΩ. имеющего также название ΈΟΌ-ΙΟΩ или слитый белок ΕΟΩ-ΙΟΩ. который относится к слитому белку (или его фрагментам), содержащему внеклеточный домен (или его фрагменты) и внутриклеточный домен (или его фрагменты) белка НЕВ-2/пеи. В одном из воплощений этот слитый белок ЕСП-КП не включает в себя значительный участок трансмембранного домена НЕВ-2/пеи или вообще не включает в себя трансмембранный домен НЕВ-2/пеи.
В другом воплощении антиген может содержать или состоять из слитого белка НЕВ-2/пеи ЕСЭРО, имеющего также название ЕСЭ-РЭ или слитый белок ЕСЭ-РЭ, или слитый белок НЕВ-2/пеи ЕСО-АРЭ, также называемый ЕСЭ-АРЭ или слитый белок ЕСЭ-АРЭ, который относится к слитым белкам (или их фрагментам), содержащим внеклеточный домен (или его фрагменты) и домен фосфорилирования (или его фрагменты, например АРЭ) белка НЕВ-2/пеи. В одном из воплощений слитые белки ЕСЮ-РЭ и ЕСЭ-АРЭ не включают в себя значительную часть трансмембранного домена НЕВ-2/пеи или вообще не включают в себя трансмембранный домен НЕВ-2/пеи.
Слитые белки антигена РВАМЕ и белка-партнера слияния белка Ό, как описано здесь, могут быть химически конъюгированными, но они предпочтительно экспрессируются в виде рекомбинантных слитых белков, которые могут обеспечить продуцирование повышенных уровней белка РВАМЕ в системе экспрессии по сравнению с одним РВАМЕ без партнера слияния, такого как белок Ό или модифицированные белки белка Ό.
Дополнительно или альтернативно, описанные здесь опухолевые антигены и белок-партнер слияния по настоящему изобретению могут быть химически конъюгированными или могут экспрессироваться в виде рекомбинантных слитых белков, которые могут обеспечить продуцирование повышенных уровней белка РВАМЕ или другого опухолевого антигена в системе экспрессии по сравнению с одним РВАМЕ или одним другим опухолевым антигеном без партнера слияния, такого как белок Ό или модифицированные белки белка Ό.
Слитые белки по настоящему изобретению, как они описаны здесь, могут дополнительно содержать одну или более линкерных последовательностей между белком-партнером слияния и опухолевым антигеном или его иммуногенным участком, или между белком-партнером слияния и Нщ-хвостом или другой аффинной меткой (если она присутствует), или между опухолевым антигеном или его иммуногенным участком и Н18-хвостом или другой аффинной меткой (если она присутствует). Аминокислоты в линкерных последовательностях могут быть неродственными последовательностям антигена и/или партнера слияния.
Слитые белки по настоящему изобретению, как они описаны здесь, могут дополнительно содержать аминокислоты Ме1-Акр-Рго на Ν-конце последовательности слитого белка. Аминокислота Ме! может иметь происхождение от последовательности исходного белка Ό или может иметь происхождение от неродственной последовательности.
Партнер слияния может содействовать экспрессии белка (энхансер экспрессии) с более высокими выходами, чем нативный рекомбинантный белок. Белок Ό-партнер слияния благодаря его чужеродной природе может быть особенно иммуногенным ίη νίνο и может содействовать слитому белку, содержащему РВАМЕ или другой опухолевый антиген, предоставляя эпитопы Т-хелперов, предпочтительно эпитопы Т-хелперов, распознаваемые Т-клетками 0Ό4. Считается, что такие Т-клетки 0Ό4 могут вносить вклад в генерацию благоприятного иммунного ответа, в частности ответа цитолитических Т-клеток 0Ό8.
В одном из воплощений партнер слияния может действовать и как партнер, усиливающий экспрес
- 7 016326 сию, и как иммунологический партнер слияния.
В одном аспекте данного изобретения предложен слитый белок, где Ν-концевой участок белка Ό (как описано выше или здесь) слит с Ν-концом РКАМЕ или его иммуногенным фрагментом. Более конкретно, слияние с фрагментом белка Ό и Ν-концом РКАМЕ осуществляется так, что РКАМЕ заменяет Сконцевой фрагмент белка Ό, который был вырезан. Таким образом, Ν-конец белка Ό становится Νконцом слитого белка.
В другом аспекте изобретения предложен слитый белок, где Ν-концевой участок белка Ό (как описано выше или здесь) слит с Ν-концом или с другим участком опухолевого антигена или его иммуногенным фрагментом. Более конкретно, слияние с фрагментом белка Ό и Ν-концом или другим участком опухолевого антигена может быть осуществлено так, что РКАМЕ или другой опухолевый антиген или его производное, как они описаны здесь, заменяет С-концевой фрагмент белка Ό, который был вырезан. Таким образом, Ν-конец белка Ό становится Ν-концом слитого белка.
Другие партнеры слияния или их фрагменты могут быть включены в слитые белки по изобретению или могут заменять элемент белка Ό по настоящему изобретению, например, в воплощениях, включающих антиген РКАМЕ или его фрагмент или участок, как описано здесь. Примеры других партнеров слияния включают неструктурный белок из вируса гриппа, Ν81 (гемагглютинин) - обычно используются Ν-концевые 81 аминокислот, хотя могут быть использованы и другие фрагменты при условии, что они включают эпитопы Т-хелперов;
БУТА, имеющий происхождение от 81тер1ососсик рпеишошае, который синтезирует Ν-ацетил-Баланинамидазу, амидазу БУТА (кодируемую геном 1у1А (Сепе, 43 (1986) с. 265-272)), например повторяющаяся область молекулы Бу1а, находящаяся на С-конце, например, начиная с остатка 178, например остатки 188-305.
Очистка гибридных белков, содержащих фрагмент С-БУТА на их аминоконцах, была описана (Вю1ес1то1оду 10, (1992) с. 795-798).
Слитые белки по изобретению могут включать в себя аффинную метку, такую как, например, гистидиновый хвост, содержащий от 5 до 9, например 6, гистидиновых остатков. Эти остатки могут находиться, например, на концевом участке белка Ό (например, на Ν-конце белка Ό) и/или они могут быть слиты с концевым участком антигена РКАМЕ или его производного, или опухолевого антигена, или его производного, как описано здесь. Как правило, однако, гистидиновый хвост будет находиться на концевом участке антигена РКАМЕ или его производного, или опухолевого антигена, или его производного, как они описаны здесь, например на С-конце антигена РКАМЕ или его производного, или опухолевого антигена, или его производного, как описано здесь. Гистидиновые хвосты могут быть полезны в очистке.
Согласно настоящему изобретению предложена также нуклеиновая кислота, кодирующая белки по настоящему изобретению. Такие последовательности могут быть вставлены в подходящий вектор экспрессии и использованы для ДНК/РНК-вакцинации или могут быть экспрессированы в подходящем хозяине. Микробные векторы, экспрессирующие нуклеиновую кислоту, могут быть использованы в качестве вакцин. Такие векторы включают, например, вирус оспы, аденовирус, листерию и монофаг.
Последовательность ДНК, кодирующая белки по настоящему изобретению, может быть синтезирована с использованием стандартных методик синтеза ДНК, таких как ферментативное лигирование, как описано Э.М. КоЬейк е! а1. в ВюсйетШгу 1985, 24, 5090-5098, методами химического синтеза, ферментативной полимеризации ίη νίΙΐΌ или ПЦР-технологии (полимеразная цепная реакция) с использованием, например, термостабильной полимеразы или с использованием комбинации этих методов.
Ферментативная полимеризация ДНК может быть осуществлена ίη νίΙΐΌ с использованием ДНКполимеразы, такой как ДНК-полимераза I (фрагмент Кленова), в подходящем буфере, содержащем нуклеозидтрифосфаты бАТР, бСТР, бСТР и бТТР, как требуется, при температуре 10°-37°С, обычно в объеме 50 мкл или менее. Ферментативное лигирование фрагментов ДНК может быть осуществлено с использованием ДНК-лигазы, такой как ДНК-лигаза Т4, в подходящем буфере, таком как 0,05 М Тпк (рН 7,4), 0,01 М МдС12, 0,01 М дитиотрейтола, 1 мМ спермидина, 1 мМ АТР и 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, при температуре от 4°С до температуры окружающей среды, обычно в объеме 50 мл или менее. Химический синтез ДНК-полимера или фрагментов может быть осуществлен в результате традиционной фосфотриэфирной, фосфитной или фосфорамидитной химической реакции с использованием твердофазных технологий, таких как технологии, описанные в Сйеш1са1 апб Еп/утабс 8упШек1к оГ Сепе ЕгадтегИк - А БаЬога1огу Мапиа1 (еб. Н.С. Саккеп апб А. Бапд), Ует1ад Сйетэе, ХУешйеип (1982) или в других научных публикациях, например М.1. Саб, НАУ.Э. Мабйек, М. 8шдй, В.8. 8ртоа1, апб К.С. Тйшак, М.1с1е1с Ас1бк Кекеатсй, 1982, 10, 6243; В.8. 8ртоа1 апб ВаптсаПк Те1га11ебгоп Бебетк, 1983, 24, 5771; М.Э. Майеисс1 апб М.Н. СатиШегк, Те1гайебгоп Бебетк, 1980, 21, 719; М.Э. Мабеиса апб М.Н. СатиШегк, 1оитпа1 оГ 1Пе Атепсап СЬет1са1 8оае!у, 1981, 103, 3185; 8.Р. Абатк е! а1., 1оигпа1 оГ 1Пе Атепсап Сйетэса1 8ос1е!у, 1983, 105, 661; Ν.Ό. 8шба, 1. В1егпа1, 1. МсМаппик апб Н. Коек!ег, №с1ею Ас1бк Кекеатск, 1984, 12, 4539 апб Н.^.Э. Маббек е! а1., ЕМВО 1оитпа1, 1984, 3, 801.
Способ по изобретению может быть осуществлен с использованием традиционных рекомбинантных технологий, таких, которые описаны в Машабк е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд - А БаЬота1оту Мапиа1; Со1б
- 8 016326
8рйид НагЬог, 1982-1989.
В частности, способ может включать следующие стадии:
1) получение реплицируемого или интегрирующего вектора экспрессии, способного экспрессировать в клетке-хозяине ДНК-полимер, содержащий нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок или его иммуногенное производное;
2) трансформирование клетки-хозяина указанным вектором;
3) культивирование указанной трансформированной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию указанного ДНК-полимера с продуцированием указанного белка; и
4) выделение указанного белка.
Используемый здесь термин трансформирование означает введение чужеродной ДНК в клеткухозяин. Этого можно достичь, например, в результате трансформации, трансфекции или инфицирования подходящей плазмидой или вирусным вектором с использованием, например, общепринятых методов, как описано в Сеиейс Епщпссппд; Ебк. 8.М. Кшдктаи апб ЛЭ. Кшдктаи; В1аск\\'е11 8οίοηΙίΓίο РиЬНсайоик; ОхГогб. Еид1аиб, 1988. Термин трансформированный или трансформант далее применяется к образующейся клетке-хозяину, содержащей и экспрессирующей интересующий чужеродный ген.
Векторы экспрессии являются новыми и также являются частью данного изобретения.
Реплицируемые векторы экспрессии могут быть получены в соответствии с изобретением путем расщепления вектора, совместимого с клеткой-хозяином, с получением линейного сегмента ДНК, имеющего интактный репликон, и объединения указанного линейного сегмента с одной или более молекулами ДНК, которые вместе с указанным линейным сегментом кодируют целевой продукт, такой как ДНК-полимер, кодирующий белок по изобретению или его производное в лигирующих условиях.
Таким образом, ДНК-полимер может быть образован заранее или может быть образован в процессе конструирования вектора, по желанию.
Выбор вектора отчасти будет определяться клеткой-хозяином, которая может быть прокариотической или эукариотической, но обычно представляет собой клетки Е. сой или СНО (клетки яичника китайского хомячка). Подходящие векторы могут включать плазмиды, например ТМСР14, или рЕТ21, или рЕТ26, рсЭ№А3, бактериофаги, космиды и рекомбинантные вирусы.
Получение реплицируемого вектора экспрессии может быть осуществлено традиционно с использованием подходящих ферментов для рестрикции, полимеризации или лигирования ДНК по методикам, описанным, например, в Машайк е! а1., процитированном выше.
Рекомбинантную клетку-хозяин получают в соответствии с изобретением путем трансформирования клетки-хозяина реплицируемым вектором экспрессии по изобретению в условиях трансформации. Подходящими условиями трансформации являются общепринятые условия, описанные, например, в Маи1аЙ8 е! а1., процитированном выше, или в ΌΝΑ С1ошид νο1. II, Э.М. С1отег еб., 1ВЬ Ргекк Ыб., 1985.
Выбор условий трасформации определяется клеткой-хозяином. Так, бактериальный хозяин, такой как Е. сой, может быть обработан раствором СаС12 (Сойеи е! а1., Ргос. №а1. Асаб. 8ск, 1973, 69, 2110) или раствором, содержащим смесь КЬС1, МиС12, ацетата калия и глицерина, и затем 3-[Νморфолино]пропансульфоновой кислотой, КЬС1 и глицерином. Клетки млекопитающих в культуре могут быть трансформированы соосаждением с кальцием векторной ДНК на клетки. Изобретение также распространяется на клетку-хозяина, трансформированную реплицируемым вектором экспрессии по изобретению.
ДНК может быть кодон-оптимизирована по стандартным методикам с целью дальнейшего облегчения экспрессии у релевантного хозяина. В одном из воплощений настоящего изобретения предложена ДНК, кодирующая слитый белок, содержащий антиген РКАМЕ или его участок или фрагмент, как они описаны здесь, в котором нуклеотидная последовательность антигена РКАМЕ или его участка либо фрагмента кодон-оптимизирована. В одном из воплощений нуклеотидная последовательность белка Ό не является кодон-оптимизированной.
Культивирование трансформированной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих экспрессию ДНК-полимера, обычно проводят, как описано, например, в Машайк е! а1. и в ΌΝΑ С1ошид, процитированных выше. Так, предпочтительно клетку помещают в питательную среду и культивируют при температуре менее 50°С.
Белки по настоящему изобретению могут экспрессироваться в прокариотах или в эукариотах, таких как дрожжи, но часто экспрессируются в Е. сой. Можно использовать конкретные штаммы Е. сой, такие как АК58 и ВЬВ ΌΕ3.
Обычно для облегчения идентификации успешного включения рекомбинантного гена/конструкции в систему экспрессии включают маркер селекции, например устойчивости к канамицину или устойчивости к ампициллину.
Продукт выделяют общепринятыми способами согласно клетке-хозяину и согласно локализации продукта экспрессии (внутриклеточный или секретируемый в культуральную среду или в периплазму клетки). В одном из воплощений настоящего изобретения продукт экспрессии является внутриклеточным. В одном из воплощений настоящего изобретения продукт экспрессии является нерастворимым белком. Таким образом, когда клетка-хозяин является бактериальной клеткой, такой как клетка Е. сой, тогда
- 9 016326 она может быть лизирована, например, физически, химически или ферментативно, и белковый продукт может быть выделен из полученного лизата. Если клетка-хозяин является клеткой млекопитающего, то обычно продукт может быть выделен из питательной среды или из экстрактов, не содержащих клеток. Общепринятые методы выделения белков включают селективное осаждение, адсорбционную хроматографию и аффинную хроматографию, включая хроматографию на аффинной колонке с моноклональными антителами.
В одном из воплощений изобретения предложен способ получения слитого белка, как он описан здесь, включающий стадию экспрессии в клетке слитого белка, содержащего белок-партнер слияния, как он описан здесь. Клеткой может быть бактерия. В одном из воплощений, в котором клеткой является бактерия, этой бактерией может быть Е. сой. Способ по настоящему изобретению может включать стадию экспрессии слитого белка, как он описан здесь, в клетке в виде нерастворимого белка. Способ может дополнительно включать стадию лизирования клетки и очистки экспрессированного слитого белка из лизированных клеток.
В одном из воплощений изобретения предложен слитый белок, полученный или получаемый методом или способом, описанным здесь.
Белки по настоящему изобретению предоставляются либо в жидкой форме, либо в лиофилизированной форме.
Ожидается, что каждая доза для человека будет содержать от 1 до 1000 мкг белка и предпочтительно 30-300 мкг.
Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, такая как вакцина, содержащая слитый белок по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемом эксципиенте.
Вакцина, возможно, может содержать один или более других ассоциированных с опухолью антигенов или полипептидов или предпочтительно может быть объединена с другими противораковыми вакцинами на основе ассоциированного с опухолью антигена. Например, эти ассоциированные с опухолью антигены могут представлять собой антигены, как они описаны здесь, и/или могут быть членами семейств МЛОЕ, ЬЛОЕ и СЛОЕ или νΤ-1. В одном из воплощений ассоциированный с опухолью антиген может содержать или состоять из антигена МАСЕ А3.
Получение вакцин, в общем, описано в Уассте Эс5щп (Тйе киЬипй апб афщуаШ арртоасй (ебк. Ро\ге11 М.Б. & Ые^тап М.1). (1995) Р1епит Рге55 Ыете Уогк). Инкапсулирование в липосомах описано в патенте США 4235877, БиНейоп.
В вакцинном препарате по изобретению белки по настоящему изобретению предпочтительно могут присутствовать вместе с адъювантами. Подходящие адъюванты могут включать соль алюминия, такую как гидроксид алюминия в виде геля (алюм) или фосфат алюминия, но также могут представлять собой соль кальция, железа или цинка, или могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина, или ацилированные сахара, катионно или анионно дериватизированные полисахариды, или полифосфазены. Другие известные адъюванты включают СрС-содержащие олигонуклеотиды. Олигонуклеотиды характеризуются тем, что динуклеотид СрС не метилирован. Такие олигонуклеотиды общеизвестны и описаны, например, в νθ 96/02555.
Может быть желательным, чтобы в препарате по изобретению адъювантная композиция индуцировала иммунный ответ предпочтительно ТН1-типа. В одном из воплощений предложена адъювантная система, включающая, например, комбинацию монофосфориллипида А, предпочтительно 3-де-Оацилированного монофосфориллипида А (30-МРБ). вместе с солью алюминия. С целью индуцирования ТН1-ответа адъювант предпочтительно, возможно, может включать также олигонуклеотиды СрС.
Улучшенная система, которая может быть использована в настоящем изобретении, содержит комбинацию монофосфориллипида А и производного сапонина, конкретно комбинацию 0821 и 3П-МРЬ, как раскрыто в νθ 94/00153, или, например, менее реактогенную композицию, где 081 гасится холестерином, как описано в νθ 96/33739.
Композиция, которая может быть использована в препаратах по настоящему изобретению, содержащая 0821, 30-МРБ и токоферол, например, в виде эмульсии масло-в-воде, описана в νθ 95/17210.
Другая адъювантная композиция, которая может быть использована в препаратах по настоящему изобретению, представляет собой 0821, 30-МРБ и СрС или его эквивалент, например, в виде эмульсии масло-в-воде или в виде липосомного препарата.
Соответственно в одном из воплощений настоящего изобретения предложена вакцина, содержащая слитый белок или белок-партнер слияния, как описано здесь, и адъювант, например, как описано выше.
Комбинация РЕАМЕ и МАСЕ.
В одном из воплощений настоящего изобретения предложена композиция, содержащая: (а) антигенный компонент, содержащий антиген РЕАМЕ или слитый белок, как описано здесь, и (б) антигенный компонент, содержащий антиген МАСЕ или слитый белок, как описано здесь. В одном из воплощений композиция дополнительно может содержать адъювант, как описано здесь.
Антиген МАСЕ для использования в комбинации может содержать полноразмерный антиген МАСЕ. Альтернативно, антиген МАСЕ может содержать иммуногенный участок МАСЕ, в котором 1, 2,
- 10 016326
3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более аминокислот в аминокислотной последовательности могут быть удалены или заменены. В одном из воплощений настоящего изобретения 2 аминокислоты могут быть удалены из Ν-конца последовательности МАОЕ. В одном из воплощений настоящего изобретения, в котором антиген представляет собой МЛОЕ А3 или его иммуногенный участок, последовательность МЛОЕ А3 может состоять из аминокислот от 3 до 314 МАОЕ А3.
Для комбинации, описанной выше, любой из или оба антигена РКАМЕ и/или МАОЕ могут быть частью слитого белка или белков, как описано здесь, или эти антигены могут присутствовать в других слитых белках или могут присутствовать как один антиген.
В одном из воплощений настоящего изобретения предложена композиция, содержащая слитый белок, содержащий антиген РКАМЕ и белок-партнер слияния, как описано здесь, и слитый белок, содержащий антиген МАОЕ А3 и белок-партнер слияния, как описано здесь. В альтернативном воплощении слитый белок, содержащий антиген МАОЕ А3, содержит или состоит из антигена МАОЕ А3 и белкапартнера слияния, содержащего приблизительно первые 109 аминокислот белка Ό, в котором одна или две либо более аминокислот из белка Ό, возможно, заменены и в котором, возможно, присутствует сигнальная последовательность белка Ό в дополнение к первым 109 аминокислотам белка Ό.
Слитые белки по настоящему изобретению дополнительно, возможно, могут содержать одну или более аминокислот в качестве линкеров между последовательностями антигена и белка-партнера слияния или между антигеном и Ηίδ-хвостом, если он присутствует. Данные аминокислоты могут быть неродственными последовательностям антигена и/или партнера слияния.
Слитые белки по настоящему изобретению, как описано здесь, могут дополнительно содержать аминокислоты Ме!-Азр-Рго на Ν-конце последовательности слитого белка. Аминокислота Ме! может иметь происхождение от исходной последовательности белка Ό или может иметь происхождение от неродственной последовательности.
В одном из воплощений последовательность слитого белка, содержащего МАОЕ А3 и белок Ό для использования в настоящем изобретении, показана на фиг. 12, 8Е^ ΙΌ ΝΟ: 43.
Настоящее изобретение также распространяется на способы получения указанных вакцин/композиций.
Примеры
Были получены четыре слитых конструкции, и здесь они будут называться примеры/конструкции 1, 2, 3 и 4. Кодон-оптимизированная конструкция была получена из конструкции примера 3, и здесь она обозначена как пример 3 а. Кодон-оптимизированная конструкция была получена из конструкции примера 4, и здесь она обозначена как пример 4а.
В примерах 3 а и 4а последовательность, относящаяся к участку белка Ό молекулы, одна и та же. Однако некоторые кодоны в области РКАМЕ были модифицированы для дальнейшего улучшения экспрессии и в примере 3а линкер между РКАМЕ и Н18-хвост были удалены.
Таблица А
Структуры слитых белков и плазмиды примеров/конструкций 1-4
Ν-конец---------------------------------------------------С-конец
№ Примера/ Конструкции | аминокислоты, вставленные в процессе клонирования | партнер слияния | раковый антиген | аминокислотная последовательность линкера/Ηΐδхвоста | использованная плазмида |
1 | ΜϋΡ | 20-127 белок β | РКАМЕ | Т8СНННННН | ТСМР14 |
2 | ΜβΡ | 20-127 белок β | РКАМЕ | ТСМР14 | |
3 | ΜβΡ | 20-127 белок β | РКАМЕ | ЬЕНННННН | рЕТ21 |
4 | ΜβΡ | 20-127 белок β | РКАМЕ | рЕТ21 | |
За | ΜβΡ | 20-127 белок β | РКАМЕ | НННННН | рЕТ26 |
4а | ΜβΡ | 20-127 белок β | РКАМЕ | рЕТ26 |
Слитые белки в приведенных выше примерах содержат аминокислоты 20-127 белка Ό. Аминокислоты Ме!, Азр и Рго были включены на Ν-конце фрагмента белка Ό (т.е. аминокислоты МОР-20-127 бел- 11 016326 ка Б). Считается, что эти три дополнительные аминокислоты могут способствовать стабильности белка и/или увеличивать уровень экспрессии белка. Аминокислота 127 белка Б слита с Ν-концом полноразмерного РКАМЕ (т.е. аминокислота 127 белка Б слита с Ν-концом РКАМЕ). В трех из шести белков включена метка гистидиновый хвост для способствования очистке. Точная последовательность этого хвоста зависит от использованной плазмиды.
Было сконструировано три разных типа плазмид, ТСМР14 и рЕТ21 или рЕТ26: для каждой плазмиды была включена ДНК, кодирующая слитый белок с гистидиновым хвостом и без него.
Если не указано иное, для получения каждого из примеров/конструкций использовали общую стратегию, приведенную ниже.
Стратегия клонирования для образования рекомбинантного белка РБ1/3-РКАМЕ (с или без Н18метки) с использованием вектора ТСМР14.
Амплификацию последовательностей, присутствующих в плазмиде ТСМР14, выполняли с использованием стратегии трехстадийной ПЦР. Вектор рН1С348, содержащий последовательность ДНК, кодирующую целый ген белка Б, был получен от Бг. А. Богадгеп, Берайшеп! οί Меб1са1 М1сгоЬю1оду, Ишуег5Йу οί Ьипб, Ма1шб Сепега1 Но5рйа1, Ма1шб, 8^ебеп. Последовательность ДНК белка Б была опубликована 1ап5оп е! а1. (1991) (Н. 1ап8оп, Ь.О. Небеп, А. СгиЬЬ, М. Риап. & А. Богадгеп, 1991, 1пГес1. 1ттип. 59:119-125). Вектор экспрессии рМС81 представляет собой производное рВК322, в который были введены контрольные элементы для транскрипции и трансляции чужеродных вставленных генов, являющиеся производными бактериофага λ (811з1/1изп е! а1., 1983) (А. 81131/111311 Υ.8. Но, & М. КозепЬегд, 1983, Ехрептеп1а1 МашрикШоп оГ Сепе Ехргеббюп. 1поиуа (еб), р. 1-14. Асабетю ΝΥ). Кроме того, ген устойчивости к ампициллину заменяли геном устойчивости к канамицину. Кодирующую последовательность для участка белка Ν81 (аминокислоты 4-81) заменяли множественными клонирующими сайтами с получением рМС81 МС8. Кодирующую последовательность для 1/3 белка Б (аминокислоты 20-127) клонировали в рМС81 МС8, используя сайты рестрикции ВатН1 и №о1, с получением рМС81-1/3РБ. Сначала выполняли ПЦР-амплификацию отрезка, соответствующего аминокислотам 20-127 белка Б, с использованием вектора рМС81-1/3РБ в качестве матрицы и смыслового олигонуклеотида
5' АТАТААСАТАТССАТССААССАСССАТТСАТСАААТ 3' (САЖ08; 81Т) 1Б N0: 18) и антисмыслового олигонуклеотида
5' ССАСАААССССТТССТТССАТССТТТСАААСТТТТСТСТС 3' (САЖ37; 8ЕС 1Б N0: 19).
кДНК РКАМЕ, полученную из Еиб\ущ 1пбШи1е, Вшббек, Ве1дшт, вставляли в сайты В81х1-№11 вектора рС^NА1 Цпуйтодеп) для образования рекомбинантного вектора рС^NА-1-ΡКАМΕ. ПЦРамплификацию отрезка, соответствующего аминокислотам белка РКАМЕ, выполняли с использованием вектора рс^NА-1-ΡКАМΕ (С8КВю) в качестве матрицы и смыслового олигонуклеотида
5' САСАСААААСТТТСАААССАТССААССААССССТТТСТСС 3' (САЖ36; 8ЕС 1Б N0: 20) и антисмыслового олигонуклеотида
5' АСАСАСАСТАСТСТАСТТАСССАТСАААСАСССССАСАС 3' (САЖ29; 8ЕС 1Б N0: 21) или
5' ССАССААСТАСТСТТАСССАТСАААСАСССССАСАС 3' (САЖ02; 8ЕС 1Б N0: 22) в зависимости от того, был добавлен Н18-хвост (САМ)02) или нет (САМ)29). Конечную последовательность РКАМЕ, вставленную в плазмиду ТСМР14, получали после ПЦР-амплификаций с использованием матриц генов 1/3РБ и РКАМЕ, которые образовывались на предварительных стадиях для матрицы и смыслового олигонуклеотида САМ)08 и антисмыслового олигонуклеотида САМ)29 или САННА в зависимости от того, присутствовал Н18-хвост (САМ)02) или нет (САМ)29). Для клонирования фрагмента в вектор ТСМР14 также добавляли сайты №е1 на 5'-конце и 8ре1 на 3'-конце.
Конструирование вектора для экспрессии рекомбинантного белка 1/3РБ-РКАМЕ с или без Н18метки с использованием вектора рЕТ21.
Использовали рекомбинантную кДНК плазмиду, названную рс^NА1 -РКАМЕ (как описано в предыдущей стратегии), содержащую кодирующую последовательность гена РКАМЕ, и вектор РМС811/3РБ (как описано в предыдущей стратегии), содержащий Мконцевую часть кодирующей последовательности белка Б. Стратегия клонирования включала следующие стадии.
а. Сначала последовательность 1/3РБ без сигнала секреции (секреторная или сигнальная последовательность) ПЦР-амплифицировали из плазмиды РМС81-1/3РБ с использованием смыслового олигонуклеотида
5' АСАСАССАТАТСАССАСССАТТСАТСАААТАТСССС (САЖ40; 8ЕС 1Б N0: 22) и антисмыслового олигонуклеотида
5' АССТССССССССССССТТТСАААСТТТТСТСТСАТТТСТАА (САЖ32; 8ЕС 1Б N0: 23); добавляли также сайты №е1 на 5'-конце и №11 на 3'-конце для клонирования фрагмента в вектор рЕТ21Ь(+).
б. Последовательность РКАМЕ ПЦР-амплифицировали из плазмиды рс^NА1-ΡКАМΕ с использованием смыслового олигонуклеотида
5' ТТСТТСССССССССААТССААССААССССТТТСТССССТ (САМАу 8ЕС 1Б N0: 25) и антисмыслового олигонуклеотида
5' ССАССАСТССАССТТАСССАТСАААСАСССССАСАС (СА№34; 8ЕС 1Б N0: 26);
- 12 016326 добавляли также сайты Νο!1 на 5'-конце и Х1ю1 на З'-конце для клонирования фрагмента в вектор рЕТ21Ь. Эта амплификация привела к добавлению на С-конце белка из двух аминокислот, Ьеи и С1и. с последующими 6 Ηίδ в плазмиде рЕТ21Ь(+). Для образования белка без Ηίδ-метки на З'-конце гена РКАМЕ добавляли стоп-кодон (ТАС) с использованием ΟΑΝ033 и ΟΑΝ035 (антисмысловой 5' ССАС6АСТС6А6СТА6ТТА66САТ6АААСА6666САСА6 (ΟΑΝ035; 8ЕО ΙΌ ΝΟ: XX) вместо ΟΑΝ033 и ΟΑΝ034.
в. Клонирование в плазмиду рЕТ21Ь(+) (Ιπνίίτο^π) вышеуказанных амплифицированных фрагментов.
г. Удаление сайта Νοΐ1 между 1/3ΡΌ и РКАМЕ с использованием набора ОшкСНапде II 8йе-01тес!еб Ми!а§епе818 Κίΐ (81га1адепе) и смыслового олигонуклеотида
5' СА6ААААСТТТ6АААССАТ66ААС6АА66С6 (САМ06; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX) и антисмыслового олигонуклеотида
5' С6ССТТС6ТТССАТ66ТТТСААА6ТТТТСТ6 (САЫ107; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX).
д. Добавление двух аминокислот А8р и Рго, затем Ме! по положению 1 на Ν-конце белка Ό 1/3 посредством мутагенеза и с использованием смыслового олигонуклеотида
5' 66А6АТАТАСАТАТ66АТССАА6СА6ССАТТСАТСАААТАТ66 (САХ 104; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX) и антисмыслового олигонуклеотида
5' ССАТАТТТСАТСААТСССТССТТССАТССАТАТСТАТАТСТСС (САЫ 105; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX).
Конструирование вектора для экспрессии кодон-оптимизированного рекомбинантного белка 1/3ΡΌРКАМЕ (с или без Ηίδ-метки) в векторе РЕТ26.
Ген РКАМЕ кодон-оптимизировали и клонировали в каркас рСА4 с добавлением сайтов Νοΐ1 и X11ο1 соответственно на 5'-конце и 3'-конце оптимизированного гена.
Эту плазмиду, названную 0606420рСА4, использовали для клонирования гена в слиянии с РЭ1/3 в векторе рЕТ26 с использованием приведенных ниже стадий.
а. Удаление фрагмента Νοί 1^^1, соответствующего оптимизированной последовательности РКАМЕ со стоп-кодоном на 3'-конце гена, из плазмиды 0606420рСА4.
б. Клонирование оптимизированного фрагмента РКАМЕ в плазмиду рЕТ26Ь(+), которая содержит 1/3РЭ, ранее клонированный Nάе1/Nο!1, с использованием олигонуклеотидов САМ)40 и СА^32, как описано выше, и где аминокислоты Αδр и Рго добавляли в Ν-конец методом мутагенеза с использованием олигонуклеотидов ί.ΆΝ104 и ί.ΆΝ105.
в. Удаление сайта Νοΐ1 посредством мутагенеза с использованием олигонуклеотидов:
смыслового
5' САСАСААААСТТТСАААССАТССААССТССТССТСТСТСС (САЫ123; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX) и антисмыслового
5' ССАСАСАССАССАССТТССАТССТТТСАААСТТТТСТСТС (САЫ124; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX).
Это дало слитый кодон-оптимизированный белок 1/3РЭ-РКАМЕ без Ηίδ-хвоста.
г. Плазмиду затем использовали в качестве матрицы для образования кодон-оптимизированного 1/3РЭ-РКАМЕ с 6 Ηίδ. ПЦР-амплификацию слитого белка выполняли с использованием смыслового олигонуклеотида
5' ССААТТССАТАТССАТССААССАСССАТТС (САЫ199; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX) и антисмыслового олигонуклеотида
5' ССАССТСТССАСТСАСТССТССТССТССТССТССТТССССАТАААССАССССС (САЫ198; 8ЕЕ) ΙΌ ΝΟ: XX);
добавляли также сайты ΝώΠ на 5'-конце, X1ю1 на 3'-конце, затем 6 Ηίδ и стоп-кодон для клонирования фрагмента в вектор рЕТ26Ь(+).
д. Клонирование амплифицированного фрагмента в плазмиде рЕТ26Ь(+) от Ιπνίίτο^π.
Для получения слитого белка конструкцию ДНК клонировали в вектор экспрессии ТСМР14. В этой плазмиде используются сигналы из ДНК фага лямбда для стимуляции транскрипции и трансляции вставленных чужеродных генов. Вектор содержит промотор РЬ лямбда РЬ, оператор ΟΕ и два сайта утилизации (МаБ и ΝιιΐΒ) для ослабления эффектов транскрипционной полярности, когда предусмотрен белок Ν (Οτοδδ е! а1., 1985. Мο1. & Се11. ΒίοΙ. 5:1015).
Плазмиду, экспрессирующую слитый белок рП-РКАМЕ, конструировали так, чтобы аминокислоты РКАМЕ были добавлены к С-концу 108-аминокислотного производного рО без его сигнальной последовательности (секреторная или сигнальная последовательность) (т.е. остатки 20-127). В эту конструкцию в Ν-конец производного рО добавляли три неродственные аминокислоты (Ме!, Αδр и Рго), и для некоторых конструкций включали Ηίδ-хвост на С-конце аминокислот РКАМЕ (см. табл. А, приведенную выше). Альтернативно, эта конструкция может быть описана как содержащая производное рО из 109 аминокислот, если Ν-концевой Ме! рассматривать как Ме! из последовательности рЭ.
Штамм клеток-хозяев и трансформация.
Клетки-хозяева из штамма АК58 Е. отН ^οΙΙ е! а1., Ргос. Ναίΐ. Асаб. 8с1. И8А, νοί. 82, р. 88-92, 1апиагу 1985, Β^οсйет^δ!^у) трансформировали плазмидной ДНК для примеров/конструкций 1 и 2.
Лизогенный штамм АК58 Е. той, использованный для получения примеров/конструкций 1 и 2,
- 13 016326 представляет собой производное стандартного штамма N99 Е. сой К12 ΝΙΗ (Национальный институт здоровья (США)) (Е- ки- да1К2. 1ас2- 1йт-). Он содержит дефектный лизогенный фаг лямбда (даШ::ТМ0.
К11- с1857 ΌΗ1). Фенотип К11 предотвращает выключение макромолекулярного синтеза. Мутация с1857 дает чувствительное к температуре повреждение репрессора с1. Делеция ΌΗ1 удаляет правый оперон фага лямбда и локусы Ью. иут3 и сй1А хозяина. Штамм АК58 генерировали путем трансдуцирования N99 исходным раствором фага лямбда Р. ранее выращенного на производном 8А500 (β;·ι1Ε::ΤΝ1(). 1 Кй- с1857 ΌΗ1). Выбирали введение дефектного лизогена в N99 с тетрациклином в силу присутствия транспозона ΤΝ10. кодирующего устойчивость к тетрациклину. в соседнем гене даШ. N99 и 8А500 представляют собой штаммы Е. сой К12. полученные из лаборатории доктора Мартина Розенберга в Национальном институте здоровья (США).
Векторы. содержащие промотор РЬ. вводят в лизогенные клетки-хозяева Е. сой для стабилизации плазмидной ДНК. Лизогенные штаммы клеток-хозяев содержат ДНК фага лямбда. дефектного по репликации. интегрированную в геном (81ι;·ιΙζιη;·ιη с1 а1.. 1983; Ιη Ехрсптсп1а1 Машри1айоп οί Оепе Бхргеккюп. 1поиуа (ей) р. 1-14. Асайеиис Ргекк NΥ). ДНК фага лямбда управляет синтезом белка-репрессора с1. который связывается с репрессором ОБ вектора и предотвращает связывание РНК-полимеразы с промотором РБ и соответственно транскрипцию вставленного гена. Ген с1 штамма экспрессии АК58 содержит чувствительную к температуре мутацию так. что РБ-направленная транскрипция может регулироваться температурным сдвигом. т. е. увеличение температуры культуры инактивирует репрессор и синтез чужеродного белка инициируется. Эта система экспрессии обеспечивает контролируемый синтез чужеродных белков. особенно белков. которые могут быть токсичными для клетки (8Ыта1ака & КокепЬегд. 1981. №Иие 292:128).
Клетки-хозяева из штамма Е. сой ВБК (ΌΕ3) Шсадеп. ^1. И8А (каталожный номер: 69053-4). который является гесА- производным ВБ21. который улучшает выход плазмидных мономеров и может способствовать стабилизации целевых плазмид. содержащих повторяющиеся последовательности. или чьи продукты могут вызвать потерю профага ΌΕ3 (1. 2). трансформировали плазмидной ДНК из примеров/конструкций 3 и 4.
Каждую трансформацию проводили стандартными способами с СаС12-обработанными клетками Щапайап Ό. Р1акт1й йапкГоттайоп Ьу 81ташк 1п О1оуег. Ό.Μ. (Ей). ^NА с1ошпд. 1КБ Ргекк Бопйоп. (1985): р. 109-135).
Культивирование и индуцирование штамма бактериальных клеток-хозяев.
Культура.
Бактерии выращивали на 20 мл бульона Луриа-Бертани (Била-ВеПаш) (БВ) (ΒΌ) + 1% (мас./об.) глюкозы (БаЬотайэйе МАТ. каталожный номер: СК-0101) + антибиотик (карбенициллин 100 мкг/мл для рЕТ21Ь. канамицин 40 мкг/мл для ТСМР14). Культуры инкубировали при 33°С для клеток АК58 и при 37°С для клеток ВБК (ΌΕ3) до достижения О.Э.600НМ (оптическая плотность при длине волны 600 нм) около 0.8.
Индукция.
При Ο.Ό.600ΗΜ около 0.8 культуры ВБК (ΌΕ3) индуцировали 1 мМ изопропил-3-Э-1тиогалактопиранозидом (1РТС; ΕΜΌ Сйет1са1к 1пс.. каталожный номер: 5815) и инкубировали в течение или 3 ч при 37°С. хотя растворимость может быть увеличена. если использовать более низкую температуру.
При Ο.Ό.600ΗΜ около 0.8 культуры АК58 индуцировали путем активации нагреванием при 37°С и инкубировали в течение 7 ч.
Для двух систем экспрессии бактериальный рост был адекватным.
Экстракция и очистка белка.
При экспрессии полипептида в культуре клетки обычно собирают центрифугированием. затем разрушают физическими или химическими методами (если экспрессируемый полипептид не секретируется в среду) и полученный неочищенный экстракт сохраняют. чтобы выделить интересующий полипептид. Реактив для экстракции белка ВидВик1ег™ используют в условиях. рекомендованных поставщиками (№уадеп).
Очистка белка Р^1/3-РКАΜΕ-Η^к.
Пасту из клеток Е. сой ресуспендировали в 20 мМ Тпк буфере. рН 8.5. затем пропускали через систему гомогенизатора (Рапйа от №то 8оау1 8.р.А. - 2 пропускания - 750 бар (75 МПа)). После добавления 2 мМ МдС12 и бензоназы (Ве^опаке) (50 Ед./мл) гомогенат инкубировали 1 ч при комнатной температуре при слабом перемешивании. затем центрифугировали 30 мин при 15900 д и при комнатной температуре. Полученный осадок ресуспендировали в 20 мМ Тпк буфере. рН 8.5. содержащем 1% додецилсульфата натрия (8Ό8) и 60 мМ глутатиона. и инкубировали 30 мин при комнатной температуре при слабом перемешивании. После центрифугирования в течение 30 мин при 15900 д и комнатной температуре осадок отбрасывали.
Супернатант после центрифугирования 10-кратно разводили в 20 мМ Тпк буфере. содержащем 6.66 М мочевины. 0.333 М хлорида натрия (№1С1) и 11.11 мМ имидазола и затем подвергали хроматографиче
- 14 016326 скому разделению на никель-ионной аффинной колонке (1МАС ЗерЕагозе 6 ЕЕ - СЕ НеаИЕсаге), уравновешенной в 20 мМ Тп8 буфере, рН 8,5, содержащем 0,1% 8И8, 6,0 М мочевины, 0,3 М ИаС1 и 10 мМ имидазола. После промывки колонки 20 мМ Тп8 буфером, рН 8,5, содержащим 0,5% саркозила, 6,0 М мочевины, 0,3 М №1С1 и 10 мМ имидазола, антиген элюировали из колонки, увеличивая концентрацию имидазола до 40 мМ в том же самом промывочном буфере. После добавления фосфата до 50 мМ антигенпозитивный элюат пропускали через колонку Масго-Ргер с керамическим гидроксиапатитом типа II (В1о-Каб), уравновешенную в 20 мМ Тп8 буфере, рН 8,5, содержащем 50 мМ фосфата, 0,5% саркозила, 6,0 М мочевины и 0,3 М ИаС1. Элюат с гидроксиапатитовой колонки, содержащий антиген, затем подвергали диафильтрации против 5 мМ боратного буфера, рН 9,8, содержащего 3,15% сахарозы, на мембране Отеда 30 кДа (Ра11). Ультраконцентрат стерилизовали фильтрацией через мембрану из ацетата целлюлозы 0,45/0,22 мкм (Зайогшз). Очищенное вещество хранили при -70°С.
Был использован также альтернативный способ очистки, который отличается от приведенного выше способа следующим:
нет обработки бензоназой, нет перехода от 8И8 к саркозилу на колонке 1МАС (8И8 от экстракции до стадии пропускания через гидроксиапатит), буфер, используемый для диафильтрации, представлял собой 5 мМ Тп8 буфер, рН 8,5-0,5 М аргинин.
Результатом этого альтернативного способа очистки было неполное удаление 8И8 с остаточным значением около 0,05 и 0,085%.
Очистка.
Экспрессируемые рекомбинантные белки очищали из фракций супернатантов, полученных после центрифугирования индуцированной Е. со11, с использованием металл-хелатирующей смолы Н18-Вшб (О1Адеп. С11а18\\'ог111. СА) согласно инструкциям производителя этой смолы.
Характеризация белка.
8И8-РАСЕ.
Гель: ИиРАСЕ 4-12% В18-Тп8 Се1, 1,0 мм, 15 или 26 лунок (каталожный номер ЕгхНгодеп: ИР0323ВОХ).
На фиг. 1 и 2 ниже показан анализ 8И8-РАСЕ соединений примера 3 и 4 и 3а и 4а соответственно, где разные рекомбинантные белки 1/3рИ-РКАМЕ с Н18-меткой или без нее мигрируют на геле с кажущейся молекулярной массой ~70 кДа. Рекомбинантные белки обнаружены в виде тел включения в клеточном лизате Е. сой после индукции.
Подготовка образцов, буферов и условий миграции была выполнена в соответствии с рекомендациями поставщиков (1п\'бгодеп). По 10 мкл всех препаратов загружали (до индукции (ДИ) и после индукции (ПИ)) в лунки, что соответствует 100 мкл культурального эквивалента.
Пояснения к фиг. 1: анализ 8И8-РАСЕ после окрашивания Кумасси синим рекомбинантного 1/3РИРКАМЕ после 1РТС-индукции штамма ВЬК ИЕ3 Е. со11, трансформированного рекомбинантным рЕТ21. Эквивалент 100 мкл культуры после 2 ч индукции в штамме ВЬК ИЕ3 1 мМ с использованием 1РТС (изопропил-бета-б-тиогалактопиранозид) при 25, 30 или 37°С наносили на гель. Клон #3 (1/3РИРКАМЕ/рЕТ21) и клон #4 (1/3РИ-РКАМЕ-Н18/рЕТ21) присутствуют на геле до (ДИ) и после (ПИ) индукций в растворимой (супернатант) и в нерастворимой (осадок) фракциях. Дорожки 1 и 10: предварительное окрашивание стандартов масс в широком диапазоне (ВюКаб Са1#161-0318), дорожка 2 (клон #3, ДИ, супернатант), дорожка 3 (клон #3, ДИ, осадок), дорожка 4 (клон #3, ПИ, 25°С, супернатант), дорожка 5 (клон #3, ПИ, 25°С, осадок), дорожка 6 (клон #3, ПИ, 30°С, супернатант), дорожка 7 (клон #3, ПИ, 30°С, осадок), дорожка 8 (клон #3, ПИ, 37°С, супернатант), дорожка 9 (клон #3, ПИ, 37°С, осадок), дорожка 11 (клон #4, ДИ, супернатант), дорожка 12 (клон #4, ДИ, осадок), дорожка 13 (клон #4, ПИ, 25°С, супернатант), дорожка 14 (клон #4, ПИ, 25°С, осадок), дорожка 15 (клон #4, ПИ, 30°С, супернатант), дорожка 16 (клон #4, ПИ, 30°С, осадок), дорожка 17 (клон #4, ПИ, 37°С, супернатант), дорожка 18 (клон #4, ПИ, 37°С, осадок).
Пояснения к фиг. 2: анализ 8И8-РАСЕ после окрашивания Кумасси синим рекомбинантного 1/3РИРКАМЕ после 1РТС-индукции штамма ВЬК ИЕ3 Е. со11, трансформированного рекомбинантным рЕТ26. Эквивалент 100 мкл культуры после 2 ч индукции в штамме ВЬК ИЕ3 1 мМ 1РТС при 25, 30 или 37°С наносили на гель. Клон #3а (кодон-оптимизированный 1/3РИ-РКАМЕ/рЕТ26) и клон #4а (кодоноптимизированный 1/3РИ-РКАМЕ-Н18/рЕТ26) присутствуют на геле до (ДИ) и после (ПИ) индукций в растворимой (супернатант) и в нерастворимой (осадок) фракциях. Дорожка 2 и 10: предварительное окрашивание стандартов масс в широком диапазоне (ВюКаб Са1#161-0318), дорожка 1 (клон #3а, ДИ, супернатант), дорожка 3 (клон #3а, ДИ, осадок), дорожка 4 (клон #3а, ПИ, 25°С, супернатант), дорожка 5 (клон #3а, ПИ, 25°С, осадок), дорожка 6 (клон #3а, ПИ, 30°С, супернатант), дорожка 7 (клон #3а, ПИ, 30°С, осадок), дорожка 8 (клон #3а, ПИ, 37°С, супернатант), дорожка 9 (клон #3а, ПИ, 37°С, осадок), дорожка 11 (клон #4а, ДИ, супернатант), дорожка 12 (клон #4а, ДИ, осадок), дорожка 13 (клон #4а, ПИ, 25°С, супернатант), дорожка 14 (клон #4а, ПИ, 25°С, осадок), дорожка 15 (клон #4а, ПИ, 30°С, супернатант), дорожка 16 (клон #4а, ПИ, 30°С, осадок), дорожка 17 (клон #4а, ПИ, 37°С, супернатант), дорожка
- 15 016326 (клон #4а, ПИ, 37°С, осадок).
Вестерн- блоттинг.
Мембраны блокировали в течение 30 мин при 37°С, 60 об/мин, используя свежий раствор 3% молока/РВ8 1Х (фосфатно-солевой буферный раствор). После блокирующей инкубации добавляли первичные антитела (кроличьи антитела против РВАМЕ, Θ8Κ Вю1од1еа18 8Ά) в разведении 1:5000 или а-6Х Ηΐδметку (АЪСаш) в разведении 1:3000 в свежем растворе 3% молока/РВ8 IX в течение 1 ч при 37°С, 60 об/мин. После этого мембраны промывали трижды в течение 5 мин при комнатной температуре, используя 0,02% Т^ееп20/РВ8 1Х. Добавляли вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена антитела осла против 1§О (Н+Ь) кролика (1аекзоп 1аЪога1огу) в разведении 1:20000, используя свежий раствор 3% молока/РВ81Х. Мембраны инкубировали в течение 1 ч при 37°С, 60 об/мин. После этого мембраны промывали трижды в течение 5 мин при комнатной температуре, используя 0,02% Т^ееп20/РВ8 1Х, затем мембраны подвергали воздействию пероксидазного субстрата (КН2РО4, 10 мМ; (ΝΗ4)28Θ4, 10 мМ; О-дианизидин, 0,01% и перекись водорода, 0,045%) или щелочного фосфатазного субстрата (Вщша Раз!), следуя рекомендациям поставщика.
Молекулярный анализ.
Пример/конструкция^___________________________________________
Анализ | Целый белок |
Длина | 629 АК |
Молекулярная масса | 71629,96 |
1 микрограмм= | 13,961 пмоль |
Молярный коэффициент экстинкции | 67680 |
1 А[280] соответствует | 1,06 мг/мл |
А[280] 1 мг/мл | 0,94 а.е. |
Изоэлектрическая точка | 6,41 |
Заряд при рН 7 | -5,84 |
Пример/конструкция 2
Анализ | Целый белок |
Длина | 620 АК |
Молекулярная масса | 70561,90 |
1 микрограмм= | 14,172 пмоль |
Молярный коэффициент экстинкции | 67680 |
1 А[280] соответствует | 1,04 мг/мл |
А[280] 1 мг/мл | 0,96 а.е. |
Изоэлектрическая точка | 6,28 |
Заряд при рН 7 | -6,36 |
Пример/конструкция 3
Анализ | Целый белок |
Длина | 628 АК |
Молекулярная масса | 71627,01 |
1 микрограмм= | 13961 пмоль |
Молярный коэффициент экстинкции | 67680 |
1 А[280] соответствует | 1,06 мг/мл |
А[280] 1 мг/мл | 0,94 а.е. |
Изоэлектрическая точка | 6,34 |
Заряд при рН 7 | -6,84 |
- 16 016326
Пример/конструкция 4
Анализ | Целый белок |
Длина | 620 АК |
Молекулярная масса | 70561,90 |
1 микрограмм= | 14,172 пмоль |
Молярный коэффициент | 67680 |
экстинкции | |
1 А[280] соответствует | 1,04 мг/мл |
А[280] 1 мг/мл | 0,96 а.е. |
Изоэлектрическая точка | 6,28 |
Заряд при рН 7 | -6,36 |
Пример 5.
Оценка продуцирования белков с или без секреторного сигнала (секреторная или сигнальная последовательность) белка И 1/3 в слитом белке
Таблица Б Белок Уровень экспрессии
РО1/3-РКАМЕ с секреторным сигналом +
РО1/3-РКАМЕ без секреторного сигнала +++
Фиг. 11: анализ 8Ώ8-ΡΆΘΕ после окрашивания Кумасси синим рекомбинантного 1/3ΡΏ-ΡΚΆΜΕ с или без секреторного сигнала (88) после ΙΡΤΘ-индукции штамма ВЕ21 ΏΕ3 Е. со11, трансформированного рекомбинантным рЕТ21. Эквивалент 100 мкл культуры после 3 ч индукции в штамме ВЕ21 ΏΕ3 1 мМ ΙΡΤΘ при 37°С наносили на гель. Эти конструкции присутствуют на геле до (ДИ) и после (ПИ) индукций в растворимой (супернатант) и в нерастворимой (осадок) фракциях. Дорожка 1: предварительное окрашивание стандартов масс в широком диапазоне (ВюКаб Са1#161-0318), дорожка 2 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88, ДИ, супернатант), дорожка 3 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88, ДИ, осадок), дорожка 4 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88, ПИ, супернатант), дорожка 5 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88, ПИ, осадок), дорожка 6 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88 + Ηΐδ, ДИ, супернатант), дорожка 7 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88 + Ηΐδ, ДИ, осадок), дорожка 8 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88 + Ηΐδ, ПИ, супернатант), дорожка 9 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ + 88 + Ηΐδ, ПИ, осадок), дорожка 10 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88, ДИ, супернатант), дорожка 11 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88, ДИ, осадок), дорожка 12 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88, ПИ, супернатант), дорожка 13 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88, ПИ, осадок), дорожка 14 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88 + Ηΐδ, ДИ, супернатант), дорожка 15 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88 + Ηΐδ, ДИ, осадок), дорожка 16 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88 + Ηΐδ, ПИ, супернатант), дорожка 17 (ρΏ1/3-ΡΚΆΜΕ без 88 + Ηΐδ, ПИ, осадок).
Пример 6.
Иммуногенность ΡΏ-ΡΚΆΜΕ-Ηΐδ, приготовленного в А801В или в А815: дозовый диапазон антигена в постоянной дозе адъюванта.
Цель: дозовый диапазон антигена для выбора наилучшей дозы для использования в доклинических экспериментах.
Протокол: 6 группам по 12 мышей СВ6Е1 в день 0 и день 14 делали внутримышечные (ВМ) инъекции:
1) ΡВ8,
2) ΡΚΑΜΕ (50* мкг) в А801В или в А815,
3) ΡΚΛΜΕ (10 мкг) в А801В или в А815,
4) ΡΚΛΜΕ (2 мкг) в А801В или в А815,
5) ΡΚΛΜΕ (0,4 мкг) в А801В или в А815,
6) Ρ^ΜΕ (0,08 мкг) в А801В или в А815, * в действительности вводили 44,7 мкг вместо запланированной дозы 50 мкг.
А801В представляет собой липосомный адъювантный препарат, содержащий Р821 и 3Ώ-ΜΡΕ; А815 представляет собой липосомный адъювантный препарат, содержащий Р821, 3Ώ-ΜΡΕ и СρΘ.
Конструкция, использованная в этом примере, представляла собой пример/конструкцию 3а (рЕТ26 с Ηΐδ-хвостом), представленную в 5 мМ Ττΐδ буфере с 0,5М аргинином. Можно использовать также белок, представленный в боратном буфере с сахарозой.
Выдаваемые данные.
Окрашивание внутриклеточных цитокинов (18С) через 14 суток после 2 инъекций после ΐπ νίίτο рестимуляции клеток селезенки (4 пула по 3 мыши на группу) с использованием пула пептидов ΡΚАΜΕ в концентрации 1 мкг/мл/пептид (15-мер).
Ответ СИ4 (адъювант А801В).
Результаты 1С8 для цитокинов СИ4 для адъюванта А801В показаны на фиг. 3. Из этого экспери
- 17 016326 мента можно сделать вывод, что наилучшая доза антигена РЕАМЕ для индукции ответа СЭ4 в А801В в этих условиях по всей вероятности составляет 2 мкг.
Ответ СЭ8 (адъювант А801В).
Результаты 1С8 для цитокинов СЭ8 для адъюванта А801В показаны на фиг. 4. Данные демонстрируют весьма низкий ответ СЭ8 и низкую гетерогенность ответа внутри группы.
Ответ СЭ4 (адъювант А815).
Результаты 1С8 для цитокинов СЭ4 для адъюванта А815 показаны на фиг. 5. Видно, что аналогичный ответ СЭ4 был индуцирован с использованием 44, 10, 2 и 0,4 мкг РЕАМЕ, приготовленного в А815; с пониженным ответом, индуцированным 0,08 мкг РЕАМЕ.
Ответ СЭ8 (адъювант А815).
Результаты 1С8 для цитокинов СЭ8 для адъюванта А815 показаны на фиг. 6. Эти данные показывают отсутствие ответа СЭ8 (фон в группе РВ8).
Пример 7.
В итоге, для описанных здесь изобретений можно применить следующее обобщенное описание конкретных конструкций РЭ1/3-РЕАМЕ, которые были получены.
Конструкции, использованные для РЭ1/3-РЕАМЕ.
Сигнальная последовательность белка Ό не включена (аминокислоты 2-19 белка Ό).
Включен метионин белка Ό (АК 1 белка Ό).
Две неродственные аминокислоты (Азр и Рго) заменяют аминокислоты 2-Ьуз и 3-Ьеи белка Ό.
Включены первые 109 аминокислот белка Ό после сигнальной последовательности белка Ό (109 аминокислот, включая первый Ме! в Ν-конце + аминокислоты 20-127 белка Ό).
Включены аминокислоты 1-509 РЕАМЕ (полноразмерная исходная последовательность РЕАМЕ).
С или без Ηίδ-хвоста, состоящего из одного из следующих:
три неродственные аминокислоты (ТЬг, 8ег и О1у) + 6 остатков ΗΪ8 для клонирования в плазмиде ТСМР14; или две неродственные аминокислоты (Ьеи и О1и) + 6 остатков ΗΪ8 для клонирования в плазмиде рЕТ21; или остатков ΗΪ8 для клонирования в плазмиде рЕТ26.
Белок рЭ1/3-РЕАМЕ +/- Ηίδ-хвост
ρβ 1/3 20-127 | ΡΕΑΜΕ 1-509 | ||
Ν-конец ΜβΡ | ρβ 1/3 | ΡΕΑΜΕ | С-конец |
Ν-конец ΜβΡ | ρβ 1/3 | ΡΕΑΜΕ | Т8С 6χΗΐδ (в ТСМР14) С-конец |
Ν-конец ΜβΡ | ρβ 1/3 | ΡΕΑΜΕ | Ι_Ε 6χΗΐδ (в ρΕΤ21) С-конец |
Ν-конец ΜβΡ | ρβ 1/3 | ΡΕΑΜΕ | 6χΗΐ3 (в ρΕΤ26) С-конец |
На фиг. 7 показана размеченная аминокислотная последовательность примеров конструкций по настоящему изобретению.
На фиг. 8-10 показано выравнивание следующих конструкций: выравнивание между ЫроЭМАΟЕ3-Η^8 и ^1/3-РЕАМЕ-Η^8 (фиг. 8); выравнивание между общей последовательностью исходного белка Ό из ΗаеторЫ1и8 тйиеп/ае и ^^ро^-МАОЕ3-Η^8 (фиг. 9); выравнивание между общей последовательностью исходного белка Ό из ΗаеторЫ1и8 тйиеп/ае, ^^ро^-МАОЕ3-Η^8 и р^1/3-РЕАМЕ-Η^8 (фиг. 10).
Приготовление вакцинного препарата с использованием слитых белков.
Слитые белки по изобретению могут быть приготовлены в виде вакцинных препаратов с добавлением адъюванта или без адъюванта. В одном из воплощений в качестве адъюванта препарат может содержать смесь 3-де-О-ацилированного монофосфориллипида А (3В-МРЬ) и ^821 в эмульсии типа масло-в-воде. Адъювантная система 8ВА82 была ранее описана в ШО 95/17210. Альтернативно, адъювант для использования в настоящем изобретении может содержать 3-де-О-ацилированный монофосфориллипид А (3В-МРЬ), ^821 и СрО в виде эмульсии масло-в-воде или в виде липосомного препарата.
3В-МРЬ представляет собой иммуностимулятор, имеющий происхождение от липополисахарида (ЬР8) грамотрицательной бактерии 8а1топе11а ттпезо!а. МРЬ деацилирован и не имеет фосфатной группы на группировке липида А. Эта химическая обработка значительно снижает токсичность при сохранении иммуностимулирующих свойств (Е1Ы, 1986).
Считается, что 3В-МРЬ совместно с различными носителями может сильно увеличивать как гуморальный иммунитет, так и клеточный иммунитет ТН1-типа.
^821 представляет собой молекулу природного сапонина, экстрагированного из коры южноамериканского дерева ^и^11а^а заропапа МоНпа. Методика очистки, разработанная для выделения индивидуальных сапонинов из неочищенных экстрактов коры, позволила выделить конкретный сапонин, ^821, который представляет собой тритерпеновый гликозид, демонстрирующий более сильную адъювантную активность и меньшую токсичность по сравнению с родительским компонентом. Было показано, что ^821 активирует СТЬ (цитотоксические Т-лимфоциты), ограниченные классом I МНС (главного ком
- 18 016326 плекса гистосовместимости), к нескольким антигенам, а также стимулирует антигенспецифичную пролиферацию лимфоцитов (Кепзй, 1992).
Представляется, что может иметь место синергетический эффект комбинаций МНР и ^821 в индуцировании как гуморальных, так и клеточных иммунных ответов ТН1-типа.
Эмульсия типа масло/вода содержит органическую фазу из 2 масел (токоферол и сквален) и водную фазу из РВ8, содержащего Тмееп 80 в качестве эмульгатора. Эта эмульсия содержала 5% сквалена, 5% токоферола, 0,4% Тмееп 80 и имела средний размер частиц 180 нм, и она известна как 8В62 (см. νθ 95/17210). Образовавшиеся капельки масла должны иметь размер приблизительно 180 нм.
Адъювант для использования в настоящем изобретении может быть приготовлен в виде комбинации МРР и ^821 в эмульсии масло/вода или в липосомном препарате. Этот препарат следует поставлять в сосудах 0,7 мл для смешивания с лиофилизированным антигеном или слитым белком (сосуды, содержащие от 30 до 300 мкг антигена).
Также можно использовать иммуностимулирующие олигонуклеотиды. Примеры олигонуклеотидов для использования в адъювантах или вакцинах по настоящему изобретению включают олигонуклеотиды, содержащие СрС, обычно содержащие два или более динуклеотидных мотива СрС, разделенных по меньшей мере тремя, чаще по меньшей мере шестью или более нуклеотидами. Мотив СрС представляет собой нуклеотид цитозин, за которым следует нуклеотид гуанин. Олигонуклеотиды СрС обычно являются дезоксинуклеотидами. В одном из воплощений промежуточным нуклеотидом в данном олигонуклеотиде является фосфородитиоат или более предпочтительно фосфоротиоатная связь, хотя фосфодиэфирная связь и другие межнуклеотидные связи входят в объем изобретения. В объем изобретения также входят олигонуклеотиды со смешанными межнуклеотидными связями. Способы получения фосфоротиоатных олигонуклеотидов или фосфородитиоата описаны в И8 5666153, И8 5278302 и νθ 95/26204.
Примерами олигонуклеотидов являются следующие олигонуклеотиды:
ТСС АТС АСС ТТС СТС АСС ТТ (СрС 1826; 8ΕΩ Ю ΝΟ: 36)
ТСТ ССС АСС СТС ССС САТ (СрС 1758; 8ΕΩ Ю ΝΟ: 37)
АСС САТ САС СТС ССС ССТ САС ССС АСС АСС ТСС ТСС ТТТ ТСТ ССТ ТТТ
СТС СТТ (СрС 2006; 8ΕΩ Ю ΝΟ: 38)
ТСС АТС АСС ТТС СТС АТС СТ (СрС 1668; 8ΕΩ Ю ΝΟ: 39)
ТСС АСС ТТТ ТСС ССС ССС ССС С (СрС 5456; 8ЕО Ю ΝΟ: 40), и эти последовательности могут содержать межнуклеотидные связи, модифицированные фосфоротиоатом.
Альтернативно, олигонуклеотиды СрС могут содержать одну или более вышеуказанных последовательностей, в которых они имеют несущественные делеции или добавки.
Олигонуклеотиды СрС могут быть синтезированы любым способом, известным в данной области (см., например, ЕР 468520). Такие олигонуклеотиды удобно синтезировать, используя автоматический синтезатор.
В одном из воплощений настоящего изобретения адъювантная комбинация для использования в изобретении включает один или более из следующих компонентов: 3О-МРЬ и ^821 (ЕР 0671948 В1); эмульсии типа масло-в-воде, содержащие 3В-МРЬ и ^821 (νθ 95/17210, νθ 98/56414); или 3В-МРЬ, приготовленный с другими носителями (ЕР 0689454 В1). Другие адъювантные системы, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, содержат комбинацию 3В-МРЬ, ^821 и олигонуклеотида СрС, как описано в И8 6558670 и И8 6544518.
Конечная вакцина может быть получена после растворения лиофилизированного препарата. Ссылки.
1. А.Еоса (и. о£ V^8соη8^η), личные контакты.
2. 81иб1ег, Б/ν (1991) I. Мо1. Вю1. 219, 37-44.
3. 1ап Н. Ке881ега е! а1. ТНе 1оигпа1 о£ Ехрег1теп1а1 Мебкте, уо1. 193, ЫитЬег 1, 1апиагу 1, 2001, 7388.
4. !кеба Н. е! а1. !ттипйу, БеЬ.; 6(2): 1997, 199-208.
- 19 016326
81-'Ο ΙΌ N0: 1.
Последовательность ДНК для примера 1 аеддаессаадсадссаЬЪсаЪсаааеаЬддсдааЪасссаааедааабсадасаааабсабЪаЬедсЪс ассдЬддедсеадсддеЬаееЬассададсаеасдебадааесЬааадсасеедсдьеЬдсасаасаддс ЪдаеЕаг.геададсаадаЕЪЬадсааг.дасеааддаПддСсдЬЪЪадЬддеЕаЪЪсасдаесасЕС'еьЪа даеддсеьдаседаСдеедсдааааааЪЬсссасаесдЪсаЬсдЪааадаеддссдгЬасбаЬдбсаЪсд асееЬассЬСаааадаааеесааадбЬЬадаааедасадаааасеьсдааассаЬддаасдааддсдЪЫ: ЗбддддЬЬссаеЕсададссдаЪасаЪсадсаедадедедбддасаадсссасддадасЕЪдЬддадсЬд дсадддсададссЬдсбдааддаЬдаддсссЬддссаЬгдссдссседдадеьдседсссадддадсесЕ ЬсссдссасЬсЬЬсаЪддсадссЫЛдасдддадасасадссадасссЪдааддсаагддЬдсаддссЪд дсссЬгсассЬдссЕсссбсЬдддадЕдсгдаЕдаадддасаасабсСбсассСддадассСЪсааадсб дЬдсегдаеддасеЬдабдЕдсЬссЬЪдсссаддаддЬЬсдссссаддаддЬддааасЬЕсаадЪдсЬдд аЬЬеасддаадаасЬсСсаЬсаддасЬЬсЪддасЬдЪаИддЪсЪддааасадддссадбсЬдсасбсасе ЬссададссадаадсадсесадсссаСдасааадаадсдаааадбадабддбеЬдадсасададдсадад садсссЬесаеессадбададдкдсгсдСадасседССссбсааддааддЬдссбдЬдаЪдааеъдбЬсе ссгассгсаЬЬдадааадедаадсдааадаааааЪдгасЬасдссгдЬдсЬдЕаадаадсСдаадаЬЪЫ: гдсааедсссаСдсаддаеаесаадаедаЪсседааааъддЪдсадсгддасЪсеаеСдаадасхсддаа дЬдасеьдеассЬддаадсеасссассЪСддсдаааегсссЪссЬЬассБдддссадаЬдаСЬааесСдс дгадасЪссЪссИсесссасагссаедсаЬсСПссеасаЬсессссддадааддаададсадбаЪаСсдс ссадСЬсассЪсЬсадеессесадЬсЪдсадЬдсседсаддсесЬсгабдбддасбсебгаСССбессЫ: ададдссдссЬддаЬсадЫхдсЬсаддсасдЬдаЬдаассссбЬддааасссЪсЬсааЬаасгаасЬдсс ддсЕЬЬсддааддддаЬдЬдаЪдсаЬсЬдЬсссададЕсссадсдгсадЬсадсЬаадСдгссЪдадгсъ аадгддддесаЬдсЬдассдаЬдЬаадЬсссдадссссЬссаадсЪсбдсбддадададссЕсЬдссасс сгссаддасседдгсЬеедаЬдадЬдЬдддаЬсасддаСдаесадсбссббдсссЬссЬдссгесссЬда дссасЕдсесссадсееасаассЬЪаадсЕЬсгасдддааЬСссаХсЬссаЕагсЪдссесдсададЬсг ссЬдсадсассЬсаЬсдддсЬдадсааЬсЬдасссасдгдсЬдЁаЪссЬдСсссссЬддададгьаьдад дасаЬссаЪддеасссессассЬддададдссСдссбаСсСдсабдссаддсесадддадСсдсСдбдед адсСддддсддсссадсаеддесЪддсбСадЬдссаассссбдСссбсаседЪддддасадаассЪесеа едасссддадсссаесседгдссссЬдЬегсаСдссСаасасеадеддссассаИсассагсассаЬ 8ЕЛ II) N0: 2.
Аминокислотная последовательность для примера 1 МПРЗЗНЗЗМГ4АЦТОМКЗОК111АНРСАЗСУЬРЕНТЬЕЗКАЪАЕАООАОУЬЕОПЬАМТЮЗСКЬУУ1НОНРЬ ϋαΕΤϋνΑΚΚΡΡΗΚΗΚΚθαΚΥΥνΐ0ΡΤΕΚΕΙ03ΕΕΜΤΕΝΡΕΤΜΕΚΚΚΕΗα5Ι03ΚΥΙ3Μ3νΚΤ3ΡΚΡϋνΞ6 АаСЗЫиКОЕАЬА1ААЬЕЫ>РРЕЬЕРРСРМААРПаННЗОТЬКАМУОАНРРТСЬРЬС7ЬМКСОНЬНЬЕТРКА УЬОаЬОУЬЬАОЕУРРРКИКЬОУЬОЬНКЫЗНОПРИТУИЗСЫЯАЗЬУЗРРЕРЕААОРМТККККУПСЬЗТЕАЕ 0РР1РУЕ7ЬУОЬРЬКЕаАСОЕЕЕЗУЫЕК7ККККМУЬКЕССККЬК1РАМРМ0П1КМ1ЬКМУ0ЬС31ЕПЬЕ 7ТСТИКЬРТЬАКЕЗРУЬа0М1М1Лг&ЬЬЬ8Н1НА38У13РЕКЕЕ<ЭУ1А<ЭЕТ30РЬ8Ъ0СЬ0АЬ¥УО8ЬРЕЪ РайЬЕОЬШНУМЫРЬЕТЬЗХТЫСРЦЗЕвОУМНЬЗОЗРЗбЗОЬЗУЬЗЬЗаУМСТОУЗРЕРИЗАСЬЕЯАЗАТ ЬОСЬУГОЕСа1ТПССЬЕАЬЬР8ЬЗНС80ЬТТЕЗРУО№1818АЬОЗЬЬОНЫСЬЗМЬТН7ЬУРУРЬЕЗУЕ ОТНСТЪНЬЕКЪАУЪНАНЪНЕЬЬСЕЬСВРЗМУИЪЗАНРСРНССОЙТРУПРЕРШСРСРМРПТЗаНННННН
- 20 016326
8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 3.
Последовательность ДНК для примера 2 аЬддаессаадсадссаЪЬсаЬсаааЪаЬддсдааЬасссаааЬдааайсадасааааЬсаЬЬаседсЪс ассдЪддедсЬадсддеЬаЬеЬассададсаЪасдЬеадааЬсЬааадсасЪЬдсдЬЪЬдсасаасаддс ЪдаЪЪакЬЬададсаадаЬЬЪадсааЪдасСааддабддбсдйЬЪадЪддЬйаЫгсасдаЬсасееЕЬЬа даеддсЬЪдасЪдаедЬЕдсдааааааССсссасаЬсдесаЬсдЬааадаеддссдеЬасйаЕдЪсаЕсд асЬЕЬассЬЪаааадаааЬСсааадЬЬЬадаааЬдасадаааасЬЬЬдааассаЬддаасдааддсдьЫ: дЬддддЬЬссаЕЬсададссдаьасаЬсадсаСдадЬдьдЬддасаадсссасддадасСЬдЬддадсЬд дсадддсададссЬдсЕдааддаЕдаддсссЪддссаЬЬдссдсссЬддадЪСдсЬдсссадддадсЪсй ЬсссдссасЬсЫхсаЬддсадссиъЪдасдддадасасадссадасссЪдааддсааЬддЬдсаддссСд дсссЕЬсасседссСсссСсЬдддадЬдсСдаСдаадддасаасаЬсЕбсассйддадассЪЬсааадсЪ дЕдсЬЪдаСддасСйдаЬдЬдсЕсскЬдсссаддаддЫгсдссссаддаддЕддааасЕксаадЪдсЪдд а!:ееасддаадаасЬсСса1:саддасЫ:с1:ддас1:д1:а<:дд1:сгддааасадддссад1:с1:дЬас<:са1:1: ессададссадаадсадсСсадсссаЬдасааадаадсдаааадеадаЬддЬЬЬдадсасададдсадад садсссЬйсаЪЬссадеададдедсЬсдЪадассЬдЬЬссЕсааддааддЬдссСдЬдаЬдааЪЬдЪЬсе ссЬассЬсаЪЕдадааадЪдаадсдааадаааааЬдЪасЕасдссСдСдсЬдСаадаадсЬдаадаЬЬСС ЬдсааедсссаЬдсаддаЬаксаадаедаЬссЬдааааеддЬдсадсЪддасесЪаеЬдаадаЪЬЪддаа дСдасйСдсасседдаадсЬасссассеъддсдааайЫХссссСЪассЬдддссадаЕдаЬЬааЬсЪдс дЬадасЬссЬссЬсЕсссасаессаЬдсаЬсеьссЪасаСЬЪссссддадааддаададсадеаЬаЬсдс ссадьесассйсЬсадеЬссЬсадЬсЬдсадЪдссЬдсаддсЬсЬсЪаЬдЬддасЪсЪЬкакЬЫзЬссЬЬ ададдссдссЪддаЬсадЬЪдаЬсаддсасдЬдаСдаассссъеддааасссесКсааеаасеаасЬдсс ддсС+ЪсддааддддаЬдЕдаЕдсаЬседЕсссададЬсссадсдЕсадЪсадсЕаадкдЪссЕдадксЪ аадЬддддЬсаЕдсЪдассдаЬдЪаадЕсссдадссссЬссаадсЬсЪдСЬддадададссЪсЕдссасс сЬссаддассЬддЬсЪЬЬдаЬдадЬдСдддаЬсасддаЬдаЬсадсЪссЬЪдсссСссЬдсссЬссседа дссасЬдсгсссадсеЬасаассеЬаадсЬЬсЬасдддааЫзссаЕсессаЪаЬсЬдссЕЬдсададЬсЬ сседсадсассЬсаЬсдддсЪдадсааЬсСдасссасдЬдсЪдЬаЬссЬдбсссссЬддададЬЬаЬдад дасаЕссаЬддЕасссЬссассЬддададдсЕЬдссИаЕсЬдсаЬдссаддсЪсадддадььдсЬдЬдЬд адесддддсддсссадсаЕддЪсЪддсеЪадЬдссаасссседЪссЬсасЕдЕддддасадаассЬЬсЪа едасссддадсссаЬссбдЬдссссЬдеьесаЬдссеаас
8ΕΟ II) ΝΟ: 4.
Аминокислотная последовательность для примера 2
ΜΟΡ38Η33ΝΜΑΝΤ0ΜΚ3ΟΚΙ11АНКСА8СУЬРЕНТЬЕ8КАЬАГАООАСУЬЕООЬАМТКоаКЬУ71НОНЕЬ ОСЬТОУАККРРНйННгаЗОЯУУУШРТЬКЕЮЭЬЕМТЕКРЕТМЕКННЬМСЗЮЗНУТЗМЗУИТЗРККЬУЕЬ АЗОЗЬЬГОЕА11А1ААЬЕЬЬРЙЕЬГРРЕРМААГОСЙНЗОТЬКАМУОАНРЕТСЬРЬ<Э7ЬМКС<2НЬНГ1ЕТБ’КА УЬОаЬОУЕЬАОЕУКРЙНИКЬатЬПЬККПЗНаОГНТТтезаЫКАЗЬУЗГРЕРЕААОРМТККВКУЕСЪЗТЕАЕ ОРР1РУЕ7ЬУСЬГЪКЕаАСПЕЬЕЗУЫЕКУКйКЮЛ7ЫгЬССККЬК1РАМРМ0Е1КМ1ЬКМУ0ЬО31ЕОЬЕ 7ТСТМКЬРТЬАКГЗРУЬа0М1МЬЙКЬЬЬЗН1НА38У13РЕКЕЕ0У1А0ЕТ30РЬ8Ь0С1,0АЬУУ1)ЗЬГГЬ вайЬСОЬЕЙНТММРЬЕТЬЗХТЫСКЬЗЕСПУМНЬЗОЗРЗУЗОЬЗУЬЗЬЗаТМЬТОУЗРЕРЬОАЬЪЕКАЗАТ Ь00Ь7ГОЕСС1ТОСаЫАЬЬР8ЬЗНС50ЬТТЬЗРУСМ31813АЬ05ЬЬ0НЫОЬЗМЬТНУЬУР7РЬЕ8УЕ 01НСТЬНЬЕКЬАУЬНАКЬЙЕЬЬСЕЬСЙР8М7ИЬЗАНРСРНСС0КТРУ0РЕР1ЬСРСРМРЫ
- 21 016326
Μ-'Ο ΙΌ ΝΟ: 5.
Последовательность ДНК для примера 3 аЕддаЕссаадсадссаЕЕсаЬсаааЕаЕддсдааЪасссаааЪдаааЕсадасааааЕсаЪЬаЕЪдсЕс ассдЪддЕдсЪадсддеъаеЕЬассададсаЕасдсеадааксеааадсасЫхдсдЕЪкдсасаасаддс ЕдаЪЪаЫхЕададсаадаЪЪЕадсааедасЪааддаЕддЕсдЕЪЪадЬддСЬаСЕсасдаЕсасеьъеЕа даЪддсЕЕдасЕдаЕдЕЕдсдааааааЕЪсссасаЕсдЬсаЪсдЪааадакддссдЕЕаСкаЕдЕсаЪсд асЕЪЕассЕСаааадаааСЬсааадПИСадаааСдасадаааасСГЕдааассаЕддаасдааддсдЬЕС дЕддддеЕссаЕЪсададссдаЪасаесадсаЕдадЕдЕдеддасаадсссасддадасЕЬдЕддадсЕд дсадддсададссСдсЕдааддаСдаддсссЕддссаЬЕдссдсссЕддадЕЕдсЕдсссадддадс^сЪ ЕсссдссасЕсЪЕсаСддсадссеекдасдддадасасадссадасссЕдааддсааЬддЬдсаддссйд дсссСЕсассЪдссЕсссСсЪдддадЕдсЕдаЪдаадддасаасаьсЬЕсассЬддадассессааадс!: дЕдсЕЕдаЬддасеедаЪдЕдсЕссЕЕдсссаддаддСЕсдссссаддаддкддааас^ксаадЕдсЕдд аЕЬСасддаадаасЪсксаксаддаскесЕддаседЪаеддСсЪддааасадддссадЕсЕдЪасесаЕЪ ^ссададссадаадсадсЕсадсссаЕдасааадаадсдаааадЪадаЪддЪЕЬдадсасададдсадад садсссЪЕсаСЕссадЁададдкдсСсдЪадасскдкЪссксааддааддЕдсскдЪдаЪдааЕЕдЕЕс!: ссЕассЕсаЕЕдадааадЕдаадсдааадааааакдЬасЕасдссЕдЕдсЕдЕаадаадсЬдаада!:!:!:»: ЕдсааЕдсссаЕдсаддаЕаесаадаЕдаСссЕдааааЕддЪдсадсЕддасЕсЕаЕЕдаадаЪеЪддаа дЕдасЪедЪассСддаадсСасссассЕЪддсдаааееекскссесассЬдддссадаедаебааесЕдс дЬадасЕссЬссЕсЕсссасаЕссаЬдсаСсЕЬссЬасаЫЛссссддадааддаададсадИаЕаЬсдс ссадСЬсассесЕсадЕйссесадЕсЬдсадЬдссЕдсаддсксЪсСаЪдЕддасЕсЕЪЕаЪСЫхЪссее ададдссдсс1:дда1:сад<:1:дс1:саддсасд1:даЕдаасссс4±ддааасссЪсЕсааС.аас1:аас£.дсс ддсЕеЪсддааддддаЕдЕдакдсаСсЕдСсссададЕсссадсдЕсадЕсадсЕаадЕдЕссЕдадСсС аадЕддддЕсаЕдсЕдассдакдЕаадЕсссдадссссЬссаадсЕсЪдскддадададссЕскдссасс сЕссаддассЕддСсСЕЕдаЕдадЕдЬдддаЪсасддаЕдаЕсадсЪссЕСдсссЕссЕдссЕЕсссЕда дссасЬдсЬсссадсСЪасаассГХаадсЕЕсЕасдддааЕСссаесЬссаЕаЕсЕдссЫздсададЕсЕ сседсадсассЕсаЕсдддсЕдадсааЬсбдасссасдЕдсЬдЕаЪссЪдСсссСсЪддададЕЕаСдад дасаессаЪддЕасссЪссассЕддададдскЕдссЕаЕсЕдсаСдссаддсЪсадддадЕкдсЬдЕдЕд адЕЕддддсддсссадсаЕддСсЕддсЕЕадЕдссаассссБдЬссСсасЕдЕддддасадаассЬЬСЕа едасссддадсссаЬссЕдЬдссссЕдЕЪЕсаЕдссСаассСсдадсассассассассассас
М'Л ΙΌ ΝΟ: 6.
Аминокислотная последовательность для примера 3
МОР35Н55ЫМАИТОМКЗСКИ1АНЙСАЗСУЬРЕНТЬЕЗКА1<АРАООАОУЬЕ<201АМТКОСЙЬУУ1НОНРЬ ОСЬТОУАККЕРНЙНККСаКУУУГПЕТЬКЕЮЗЬЕМТЕМЕЕТМЕКККЬНОЗЮЗПУТЗМЗУИТЗРККЬУЕЬ АСОЗЬЬКОЕАЬА1ААЬЕЬЬРЙЕЬРР₽ЬГМААГООКНЗОТЬКАМУОАНРРТСЬРЬОУЬМК<ЗОНЬНЬЕТРКА УЬОаЬЕУЬЬАОЕУКРНЙИКЬОУ1Д)ЬККМЗНаСРИТУИ5С№АЗЬУ8РРЕРЕААОРМТКККК7ЛОЬЗТЕАЕ 0РР1РУЕУЬУСЪГЬКЕСАСЕЕЬГ8УЪ1ЕКУККККЫУЬКЬССККЬК1ЕАМРМ0П1КМ1ЬКМУ<21|О31ЕОЬЕ 7ТСТИКЪРТЪАКР5РУЬС0тКЬКЯЬЪЬ5Н1НАЗЗУ18РЕКЕЕ0У1А0РТ50ГЪЗЬ0СЬ0А11УУСЭЪРРЪ НСКЬООЬЬКНУТШРЬЕТЬЗ1ТКСКЬЗЕОПУМНЬЗОЗ Р 8 УЗОЬЗ УЬЗЬЗОУМЬТОУЗ РЕРЬОАЬЬЕКАЗ АТ ЬООЬУГСЕСаГТОСОЬЬАЪЬРЗЬЗНСЗОЬТТЬЗГУСНЗХЗГЗАЬОЗЬЬОНЫСЬЗЫЬТНУЬУРУРЬЕЗУЕ ОТНаТЬНЬЕКЬАУЬНАЯЬКЕЬЬСЕЬаКРЗМУИЬЗАЫРСРНСОПКТГУОРЕРТЬСРСГМРКЬЕНННННН
- 22 016326
8ЕО ΙΌ \О: 7.
Последовательность ДНК для примера 4 аСддаессаадсадссаЬЬсаСсаааЪаБддсдааЪасссаааСдаааЪсадасааааЕсаЬБаЬЕдсЬс ассдбддЬдсЬадсддЪЬаЪЬСассададсаеасдкЬадааЬсеааадсасеедсдйЪЬдсасаасаддс ЬдаЬЪаЬееададсаадаеьеадсааЕдасЬааддаеддЬсдЬЪЪадЪддЬеаЕЪсасдаЬсасеЕЪЕЬа даеддсеедасЬдаЬдЕЪдсдааааааЬЬсссасаесдЬсаЬсдЬааадаЬддссдЬЬасЬаСдЬсаесд асеЬБассеЪаааадаааеЪсааадЪьеадаааедасадаааасЫХдааассаеддаасдааддсдЫхЪ дСддддЪессаЬесададссдаЬасаЪсадсаЪдадедЬдЪддасаадсссасддадасЬЬдЬддадсЪд дсадддсададссЪдсЪдааддаЬдаддсссЬддссаСЪдссдсссЪддадЪЪдсЪдсссадддадсЪсЬ ЬсссдссасСсексаЪддсадссеЫхдасдддадасасадссадасссйдааддсааЬддЬдсаддссЬд дсссЬесассЪдссесссесЪдддадЕдс(:да!:даадддасаасаес!:ЬсассС.ддадасс1:Бсааадс1: дЬдсьедаЪддасЬЬдаЪдЬдсЬссЫхдсссаддаддсесдссссаддаддСддааасЬЪсаадЬдскдд аьЬЪасддаадаасбсЬсаЬсаддаскксЬддасБдеаЪддЪсЬддааасадддссадЬсЬдЬасЪсаЬЪ ЬссададссадаадсадсйсадсссаЪдасааадаадсдаааадЕадаЬддСЪЬдадсасададдсадад садсссБЪсаЬЕссадЬададдЪдсЬсдкадассЬдЕСссесааддааддСдссСдьдабдааСИдЪЬсС ссбассЪсаЬЬдадааадЬдаадсдааадаааааСдеасЕасдссБдЬдсСдЬаадаадскдаадаЬесе. СдсааедсссакдсаддаЬаЪсаадасдаЪссЕдааааЪддедсадсСддасесЬаЕедаадаееьддаа дедасекдкассЪддаадсЪасссассЕеддсдаааеьеъсЬсссеассЬдддссадаЪдаЬЕааЬседс дЬадасЬссЕссЬсЪсссасакссаЬдсаесеЬссеасаЬъессссддадааддаададсадЬаЬаесдс ссадеесасс1:с1:сад1:есс1:садЬс1:дсадЬдсседсаддсЬс!:с1:аедг:ддас1:сес1:аееЫ:1-сс!:с ададдссдссЬддаесадБЬдсесаддсасдЪдаедаассссЪЪддааасссесесааЬаасБааседсс ддсСЬСсддааддддаЬдедаедсаЕсЕдЪсссададЕсссадсдисадЕсадсЬаадЪдЪссБдадЪсЬ аадбддддЬсаЬдсЬдассдаСдСаадесссдадссссЪссаадсеседседдадададссЬседссасс сЬссаддассЪддЕсЕЪЬдаЬдадБдЬдддаЬсасддаСдаЬсадсЕссЩ-дсссЪссЪдссЬЪСссЬда дссаседсЪсссадсебасаассЪЬаадсЬЪсЪасдддааЬЬссаЪсЬссаЬаСскдсскЪдсададЪсС сседсадсассесассдддсЪдадсааесЬдасссасдедсЪдЬаессЬдСссссседдададЬЪаБдад дасаЪссаЪддЕасссессасседдададдсЪедссеаЪсЬдсаедссаддсЪсадддадЪЬдсЬдедед адЬЪддддсддсссадсаеддесЬддсЪЪадедссаассссЪдЪссЪсасЕдЬддддасадаассЬЬсЬа СдасссддадсссаесссдЬдссссЬдСБЬсаЬдсскаас
81-'О II) \О: 8.
Аминокислотная последовательность для примера 4
МОР55Н35ЫМАЫТ0МК5ОК111АНКаА5аУЬРЕНТЬЕЗКАЬАРА<2<аАСУЬЕасЬАМТК0СЯЬУУ1НОНРЬ
ВСЬТаУАККРРНВННга)СКУУ71ПРТЬКЕ1СЗЬЕМТЕНРЕТМЕРКЙЬИС31<23КУ13МЗУИТЗРЙКЕУЕЬ
АЗОЗЬЬКОЕАЬА1ААЬЕЬЬРКЕЬРРРЬРМААРСС1гнЗСТЬКАМУаАИРРТСЬРЬаУЬМКа(ЭНЕНЬЕТРКА
УЬОаьОУЬЬАОЕУКРВКИКЫЭУЬОЬККЫЗНаПРМТУИЗбЫКАЗЪУЗРРЕРЕААаРМТККККУРОЬЗТЕАЕ
0РГ1РУЕ7ЬТОЬРЬКЕаАСОЕЬР5¥ЫЕК7КйКЮЛ7ЫгЬССККЬК1РАМРМаО1КМ1ЬКМУ0ЬП31ЕОЬЕ
1/ТСТ«КЪРТЬАКРЗРУЬ<ЗаМ1НЪККЬЪЬЗН1НА88УГЗРЕКЕЕОУ1АОРТЗОЕЪЗЬОСЕОАЬУ71)5ЬРРЬ
К<ЗйЬО2ЬЬЕН7МИРЬЕТЬ31ТЫСЕЬЗЕСПУМНЬЗОЗРЗУЗОЬЗУЬЗЬЗаУМЬТОУЗРЕРЬаАЬЬЕЙАЗАТ
Ь00ЬУР0ЕС<31ТСП0ЬЬАЬЬРЗЬЗНС50ЬТТЪЗРУ(Зи31318АЬОЗЬЬ0НЫОЬЗЫЪТНУЪУРУРЬЕЗ¥Е
Б ПКЗТЬНЬЕКЪ АУЬНАЕЬНЕЬЬСЕЫЗЕ РЗМУИЬЗАЙРСРНССОЕТРТО РЕРIЬС ΡΟΡΜΡΝ
- 23 016326
8Е9 ΙΌ ΝΟ: 9.
Кодон-оптимизированная последовательность ДНК для примера 3 а аЕддаессаадсадссаеЪсаесаааеаЕддсдааеасссаааСдаааесадасааааЕсаеЕаеедсЪс ассдеддедсеадсддееаЫхЪассададсаЬасдеьадааЬсЕааадсасЕЕдсдЕЪЪдсасаасаддс Еда1:1:аЪ!:1:ададсаада1:1;еадсаа1:дас1:ааддаЬдд1:сдееьадЪддеъа1:1:сасда!:сас1:1:еЫ:а даЕддсЕЬдаседаедЬЬдсдааааааеесссасаесдЪсаЪсдЬааадаеддссдеъасеаЬдЪсаЬсд асЕЕЕассеЪаааадаааеЪсааадЕЬЕадаааЕдасадаааасЬЬЬдааассаЕддаасдЪсдЕсдСсЬ д^ддддсадсаеЕсададссдеГаЪаЪЕадсаЪдадсдЪдьддассадсссдсдЬсдЪсЪддЪЕдадсЬд дссддссададссЬдсЪдааадаЪдаадсдсЪддссаСЪдсддсдседдадсЪдсЪдссдсдедадседЬ еесСдссдседЬЬЬаеддсддсдЬЪЬдаЕддссдЪсаЕадссадассседааадсдаЬддЪдсаддсдЬд дссдеееасседеседссдсбдддсдЪдседаСдаааддссадсаесЪдсаесЪддааассеъеааадсд дЬдсЪддаЬддссЕддаЕдЪдсЬдсЬддсссаддаадЕЕсдессдсдЪсдеЕддааасЕдсаадЪдсЕдд аесЕдсдеааааасадссаесаддаееееЪддассдЕдеддадсддсааЕсдЪдсдадссЕдеаЬадсее ессддаассддаадсддсдсадссдаЕдаСсаааааасдЬааадЬддаЪддссЬдадсассдаадсддаа садссдЪЬЕаЕессддЕддаадЕдсЕддЕЕдассЕдЕЕЕседааадааддсдссЪдсдасдадсЪдЬЪеа дсЕаеседаесдааааадедааасдсаааааааасдедсЬдсдЪсЬдЬдсСдсаааааасЪдааааСсЕЕ сдсдаедссдаСдсаддаеаЪЪааааедаСсседааааЪддЪдсадсЪддаЕадсаССдаддассЕддаа дИдассЬдсассЕддааасЪдссдасссЪддссаааСЬЕадсссдеаесЪдддссадаедаЬЕаассЕдс десдеседсЪдсЪдесесаеаЪесаЪдсдадсадсЪаЪаьеадсссддааааадаадаасадеаеаСсдс дсадЕЕЬассадссадЕЪЕсЕдадссЕдсааедссЪдсаадсдсЪдЬаЕдЕддаеадссЬдЕЕеЬЕСсЪд сдЕддссдЬсЬддаесадседсЪдсдЬсаедЕдаЬдааЬссдседдааасссЬдадсаеЕассаасЕдсс десЕдадсдааддсдаЕдЬдаЬдсаСсЕдадссададсссдадсдееадссадсЕдеседЬСсЬдадссЪ дадсддсдЪдаедсЬдассдаЪдедадсссддаассдседсаадсссЕдседдаасдЕдсдадсдсдасс сЬдсаадассЬддЬдеЕедаЕдааЕдсддсаЕЬассдаЪдаесадседседдссседсГдссдадссЬда дссаеЕдсадссадсЬдассасссЕдадсЕЪЬеаеддсаасадсаеЕадсаЕЕадсдсдседсааадсс!: дседсаасаеседагеддссЪдадсаассЬдасссасдЕдседеаЕссддЕдссдседдааадсеаедаа даСаЕесаеддсасссЕдсаесЬддаасдбсЕддссЬаесЕдсасдсдсдесЬдсдЬдадсЕдсбдЪдсд адсЬдддссдбссдадсаеддееъддседеседсдааСссдедсссдсаеедсддсдаЬсдЪассЬЪЬЬа ЕдаЬссддаассдаеьсЕдЬдсссдбдсЬЫгабдссдаассассассассассассас
8Е9 ΙΌ ΝΟ: 10.
Аминокислотная последовательность для примера 3 а
МОР85Н53ЫМАМТ0МК8ОК111АННОА8СУЪРЕНТЪЕ8КАЪАРА00АЕУЬЕ0ПЪАМТ1ФСЭНЬУУ1НОНРЬ ООЬТОУАККРРНКНККСОКУУУХСРТЬКЕКЭЗЬЕМТЕМРЕТМЕКйКЬНаЗПЭЗКУХЗМЗУИТЗРККЬУЕЬ АС08ЬЬКЕЕАЬА1ААЬЕЬЬРКЕЬГРРЬРМААГОСКН50ТЬКАМУ0АИРРТСЪ₽ЬСУЬМК<3<ЭНЬНЬЕТРКА УЬССЬОУЫАОЕУКРККНКЬОУЬОЬКККЗНООРИТУНЗСЗЫКАЗЬУЗГРЕРЕААСРМТККВКУОСЬЗТЕАЕ 0РР1Р7ЕУЬ7ЕЬРЬКЕОАСОЕЬР5УЫЕКУККККМУЪНЬССККЬК1РАМРМ0П1КМ1ЬКМУ0ЬО31ЕОЬЕ 7ТСТИКЬРТЬАКР8РУЬа0М1ЫЬККЬЬЬЗН1НА88У13РЕКЕЕ(ЭУ1АаРТЗСРЬ8Ь0СЬ0АЬУУЦ5ЬРРЪ НОКЬСОЬЬННУМЫРЬЕТЬЗХТКСНЬЗЕСПТМНЬЗОЗРЗУЗСЬЗУЬЗЬЗаУМЬТОУЗРЕРЪОАЬЬЕКАЗАТ ЬС0ЬУРОЕСО1ТОО0ЫЛЫ,Р8Ь8НС30ЬТТЬ8РУСН81315АЬ05ЬЬаНЫСЬЗМЬТНУЬУРУРЬЕ5УЕ ОТНОТЬНЬЕНЬАУЬНАЙЬЯЕЬЬСЕЬСКРЗМУНЬЗАЫРСРНСаПНТРУОРЕРХЬСРСРМРКНННННН
- 24 016326
8ЕЛ ΙΌ N0: 11.
Кодон-оптимизированная последовательность ДНК для примера 4а аеддаЬссаадсадссаЪбсаЪсаааЬаЬддсдааСасссаааЪдааабсадасааааЪсаСбаЪЪдсбс ассдСддЪдсСадсддСБаЪССассададсабасдЬСадаабсЪааадсасеЪдсдЪбедсасаасаддс СдаЬСаЬЪЪададсаадаСбСадсаабдасЪааддаСддЬсдЬбЁадкддССаСксасдаБсасЬСкЬЬа даЪддсЫгдасЪдаСдСбдсдааааааРЬсссасаЪсдЪсабсдЬааадабддссдЪбасбаЬдЬсаЬсд аск^еасскБаааадаааЪЪсааадЬБСадаааЪдасадааааскЪЬдааассаЪддаасдесдЬсдксЬ дЬддддсадсаЪСсададссдббабаЬБадсаЬдадсдСдЕддассадсссдсдксдЪсСддЪЪдадсСд дссддссададссСдсЬдааадаЬдаадсдскддссаЬЬдсддсдскддадсбдсЬдссдсдЪдадсЪдЪ еессдссдседессаСддсддсдьеедаЬддссдСсаСадссадассскдааадсдаЬддЪдсаддсдед дссдРЫгассЬдЪсЪдссдсЪдддсдбдсЪдаЬдаааддссадсаЪсЪдсабсбддааассЬЪЬааадсд дСдседдаБддссСддаедСдсЪдскддсссаддаадБЪсдИссдсдксдЬкддаааскдсаадкдсЬдд аеседсдИааааасадссаСсаддаЪебЪЬддассдедбддадсддсааесдЪдсдадссбдЪаЬадсЕС СссддаассддаадсддсдсадссдаЬдассаааааасдЪааадЪддаБддссСдадсассдаадсддаа садссдРСБаеессддсддаадЪдсЬддЪбдассЪдЬЬЪсЪдааадааддсдсссдсдасдадсЪдбЕЬа дсСаесСдаСсдааааадЬдааасдсаааааааасдЪдсЬдсдЪсЪдЬдсЬдсаааааасЪдааааЪсЫ: сдсдаЬдссдаСдсаддаЬабеааааедаЪсседааааЪддЪдсадсбддаЬадсаеЪдаддассБддаа дЬдассЪдсассбддааасбдссдасссЪддссааасебадсссдГабсЬдддссадаСдабСаассСдс дЬсдЪсЪдскдскдЬсбсаЬаЪбсаЬдсдадсадсЬабабеадсссддааааадаадаасадеаЪабсдс дсадкЫзассадссадеъЬсЬдадссбдсааЬдсседсаадсдсЕдЬаБдеддаСадссЪдЬЬЬЪЬСсЬд сдСддссдЬскддаЬсадсЬдсЬдсдЬсаСдЬдабдааЬссдсСддааассскдадсаЬСассааскдсс дксЪдадсдааддсдаЬдедаЪдсаесЬдадссададсссдадсдЬСадссадсЪдкседГбсЬдадссб дадсддсдЬдабдсЪдассдаЬдбдадсссддаассдсбдсаадсссРдседдаасдСдсдадсдсдасс сГдсаадассЪддБдЬЬЪдаЬдааЪдсддсаЬБассдаЪдаЪсадскдсЕддсссЪдсЬдссдадссЪда дссаеЬдсадссадсЁдассасссЁдадссссСаЬддсаасадсаееадсабСадсдсдсЪдсааадсс!: дседсаасаЪседаееддссЬдадсаасседасссаЬдСдсСдеаессддедссдседдааадсеаСдаа даЬаСЬсаеддсасссЪдсаРсСддаасдессддссеаЪсСдсасдсдсдСсЬдсдЪдадсЪдсСдЬдсд адсбдддссдессдадса1:ддег:(:ддс»:д<:с1:дсдааессдедсссдсаС1:дсддсда1:сд1:асс1:1:е1:а едаессддаассдаБЪседЬдсссдбдсЬЬеаедссдаас
8ЕЛ II) N0: 12.
Аминокислотная последовательность для примера 4а
МОРЗЗНЗЗММАЫТСМКЗОКШАНРСАЗСУЬРЕНТЬЕЗКАЬАРАООАОУЬЕОПЬАМТКССКЬУУХНСНГЬ ОСЬТОУАККРРНКНККОСНУУУЮРТЬКЕЮЗЬЕМТЕМРЕТМЕКККЬИСЗЮЗКУХЗМЗУ^ТЗРККЬУЕЬ АССЗЬЬКСЕАЬАХААЬЕЬЬРРЕЬРРРЬГМААРВСРНЗОТЪКАМУОАМРРТСЬРЬОУЪМКеОНЬНЪЕТРКА УЬПСЬОУЪЬАОЕУРРКНИКЬСУЬОЬКгаЯ5НООРКТУНЗС*1НАЗЬУ8РРЕРЕААСРМТККККУО(ЗЬЗТЕАЕ 0РР1РУЕУЬ7ПЬРЬКЕОАСПЕЬРЗУЫЕКУККККЫУЬРЬССККЬК1РАМРМ0П1КМ1ЬКМУ0ЬП31ЕПЬЕ \П'СТИКЬРТЕАКРЗРУ14ССМ1ЫЬККЬЬЬЗН1НАЗЗУ13РЕКЕЕ0У1А0РТЗСРЬЗЬ0СЬ0АЪУУОЗЬРРЬ РаКЬО0ЬЪКН7МКРЬЕТЬ31ТКСЙЬЗЕСС¥МНЕ503РЗУ30ЬЗУЬЗЬЗаУМЬТПУ8РЕРЬ0АЬЬЕИА8АТ ЬООЬУРОЕССХТЕЕОЬЬАЬЕРЗЬЗНСЗОЬТГЬЗРУСЫЗХЗХЗАЬОЗЕЬОНЫСЗЬЗКЬТНУЬУРУРЬЕЗУЕ П1Н0ТЬНЬЕР14АУЬНАЯЬНЕЪЬСЕЬСКРЗМУМЬЗАМРСРНССС1гТРУПРЕР1ЬСРСРМРЫ
Claims (20)
1. Слитый белок, содержащий:
(а) РКЛМЕ (антиген, преимущественно экспрессирующийся в меланоме);
(б) гетерологичный белок-партнер слияния, имеющий происхождение от белка И, где белокпартнер слияния содержит аминокислоты 20-127 белка И; и (в) дополнительные аминокислоты МеЕАзр-Рго на Ν-терминальном конце последовательности слитого белка, где гетерологичный белок-партнер слияния, имеющий происхождение от белка И (б), слит с Νконцом РКАМЕ.
2. Слитый белок по п.1, дополнительно содержащий аффинную метку.
3. Слитый белок по п.2, где аффинная метка представляет собой гистидиновый хвост.
4. Слитый белок по любому из пп.1-3, дополнительно содержащий одну или более линкерных последовательностей между белком-партнером слияния и РКАМЕ; или между белком-партнером слияния и аффинной меткой; или между РКАМЕ и другой аффинной меткой.
5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп.1-4.
6. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по п.5.
7. Выделенная клетка-хозяин, трансформированная вектором по п.6.
8. Вакцина, содержащая слитый белок по любому из пп.1-4.
9. Вакцина, содержащая нуклеиновую кислоту по п.5 или вектор по п.6.
10. Вакцина по п.8 или 9, дополнительно содержащая адъювант и/или иммуностимулирующий цитокин или хемокин.
11. Вакцина по п.10, где адъювант содержит 3О-МРЕ, 0821 и/или олигонуклеотид СрО.
12. Применения вакцины по любому из пп.8-11 в медицине.
13. Применение белка по любому из пп.1-4, или нуклеиновой кислоты по п.5, или вектора по п.6
- 25 016326 для изготовления вакцины для иммунотерапевтического лечения пациента, страдающего раковым заболеванием.
14. Применение по п.13, где раковое заболевание выбрано из меланомы, рака молочной железы, рака мочевого пузыря, рака легкого, такого как №СЬС (немелкоклеточный рак легкого), саркомы, рака яичника, рака в области головы и шеи, рака почки, колоректальной карциномы, множественной миеломы, лейкоза, включая острый лейкоз, и карциномы пищевода.
15. Способ получения слитого белка, включающий стадию экспрессии в выделенной клетке слитого белка по любому из пп.1-4.
16. Способ по п.15, в котором клетка представляет собой бактерию.
17. Способ по п.16, в котором бактерия представляет собой Е. со11.
18. Способ по любому из пп.15-17, дополнительно включающий стадию лизирования клетки и очистки экспрессированного слитого белка из лизированных клеток.
19. Слитый белок, полученный или получаемый способом по любому из пп.15-18.
Анализ 8Ο8-ΡΑΘΕ 1/ЗРО-РРАМЕ с или без Ηϊδ-хвоста в векторе рЕТ21 (Примеры/конструкции №№ 3 и 4)
1 2 3 4 5 6 7 8 5 1011 12 13 14 15 16 17 18
I» 195 >
Фиг. 1
Анализ 808-РАСЕ кодон-оптимизированного 1/ЗРО-РКАМЕ с или без ΗΪ8хвоста в векторе рЕТ26 (Примеры/конструкции №№ За и 4а)
1 2 3 4 3 6 7 8 9 ΙΟ 11 12 13 14 15 16 17 18
Фиг. 2
Фиг. 3
- 26 016326
Ответ СО8 (адъювант А801В - 20070499)
Фиг. 4
Ответ 0ϋ4 (адъювант А815 - 20070502)
Фиг. 5
Ответ Οϋ8 (адъювант А315 - 20070502)
Фиг. 6
-27016326
ΜΠί>3ΞΗ53ΝΜ ΑΝΤ0ΜΚ3ΡΚΙ
ЕОЛЬАМТХЛО КЪУУПЮНРЪ
ОЗЬЕМТЕИРЕ ТМЕКЙКЬИОЗ
101
151
ИАНКСАЗСУ ЬРЕНТЬЕЗКА ЬАРАООАОУЬ ЛСЗЬТОУАККР ΡΗΚΗΚΚϋΟΗΥ ΥνίυΡΊΊ,ΚΕΙ ЮЗКУТЗМЗУ ИТЗРННЬУЕЬ АСОЗЬЬКРЕА
ЬА1ААЬЕЪЬР НЕЬРРРЬРМА АРРСННЗОТЬ КАМУОАИРРТ СЬРЬОУЬМКС
251 ΚΑ5Ι/Υ5ΡΡΕΡ ЕААОРМТККК КУРОЬЗТЕАЕ ОРРТРУЕУЬУ РЬРЬКЕОАС!
351 УТСТМКЬРТЬ АКРЗРУЬСОМ ГЫЬКНЬЬЬЗН ΙΗΆ53ΥΙ5ΡΕ ΚΕΕΟΥΙΑΟΡΤ
401 ЗОРЬЗЬОСЬО АЬУУРЗЬРРЬ КСКЬРОЬЬРН УМЫРЬЕТЬЗ! ТЫСКЬЗЕСРУ
451 МНЬЗОЗРЗУЗ ОЬЗУЬЗЬЗСУ МЬТРУЗРЕРЬ ОАЬЬЕЯАЗАТ ЬОРЬУРРЕСО
501 1ТРР0Ы.АЫ. РЗЬЗНСЗОЬТ ТЬ5РУС№13 15АТ.05Ы.0Н ЫСЬЗМЬТНУ
551 ЬУРУРЬЕЗУЕ РТНСТЬНЬЕЯ ЬАУЬНАКЬКЕ ЬЬСЕЬОКРЗМ УМЬЗАКРСРН
601 ССРЯТРУРРЕ РГЬСРСРМРЫ (ТЗС) / (ЬЕ) / НННННН
Для этих конструкций сигнальная последовательность не использовалась
Черный = АК (аминокислоты) 20-127 белка ϋ
Выделено черным = 1-Ме(, 2-Азр и З-Рго
Двойное подчеркивание = белок РКАМЕ; аминокислоты 1-509 РКАМЕ (всего
509 АК)
Подчеркнуто черной линией = хвост из 6 Ηΐδ с линкерной последовательностью, показанной в скобках, которая варьировала или присутствовала в зависимости от клона.
Фиг. 7
Выравнивание между Ι_ϊροΟ-ΜΑ(3Ε3-Ηίδ (ЗЕО Ю N0:43) и ρΟ1/3-ΡΚΑΜΕ-Ηίδ (ЗЕО Ю N0:10)
1 60
МОРКТ1ЛРЗЬ1ЛАСУЬАОСЙЗНЯ.'?НМА'ЫТдМК90Х111ЛНН(ЗА80УЬргКТЬг:я.ЧЛЬ1РЛ МОР- ------- ЯЯНЗЯМГЛАОТ^МУЯПКГГГГЗЗШЗАЯСПРЕЛТПЕЯКЛЫРА
61 120 ^ΡΥυ3ςυ^νΐΤΚΙΧ3ΒΙάννΐΗΕίΐΡΐ4ΧϊΜ15νΛΚΚΡΡΗΗ1!ΚΚβ(3ΒΥΥνΐΕΡΤ1,ΚΕΧ051/3 СО;и>'ЛЕ00£ЛЕ'Л’КРс;ПЬУУГНРНР1ДХ1Х.ТОУАК?Й’РНКНйКПСНУ¥У1аР'ГЬХЕ1«Я1П«
121 180 даИЧРЕТИДЬЕ...... ОНЗОНСКРЕЕбДЙАНаЕЯГХЗЬУСАОАРАТЕЗ- - -ОБ- Ш.’ЕЫРЕ’1^|КЕКЬК<3 51 <23 ΚΥIЗМЯУЧТЗ РЯКЬДЕГАООЙШаЭ ΕΑΟΑΙ ААБЕЫ.Р ЯЕЬ?
181240
- - .....аДЗЗЯЗТЬУеЭт-.....-13...... 3νΡΑΑΕ3₽β
РРЬРМААРРдкНвОТЬКАВУОАИРРТСЬРЬОУЬМКСОНЬНЬЕТРКАУЬРСЬвУЫАаЕУВ
241300
Р-----------Р0-ЦРДОА8^₽|ТМЫУРТ1803УЕ]§И|ЭЕЕ----- -----ЕДРЙТРР
РНЙИКЪ0'УЪСЬЯКЫЙН<{ОРН|НидвМНАаГ^|ЙРРЕРД8®РМТККНКТО<ЗЬ8Т’^|Е0РРГ
301360
Е1КЗЕЕ0ААЬЗЯКУА|141НГЬЬДКУЙАКЕР- - гР^ЙУЬУРЬР1(КЕаАСЙЕДГЗУ1^ЕКУКЙКЮтлКЬССККЬК1РАМРМдО1КМ1ЬКМУ0ЬО
361420
--------νχ.χ------А-ЕМ1ЙЗ^СЫИ0¥ГЕРу1Е^кДзЗё------1431АДГб1ЕЬД 31ЕОЬЕУТСТИКЬРТ1ЛКЕЯРУЫ10{^ЬКК1ЬЪ8Н1Н||53У13РЕКЕЕОУ1М!ЕТ80Г| 421480
Е5ррЗСНЫ^г8тСЬСЬЗУРСЫХЗОЫО1МРКАСЬЫ1УЬА31АКЙСРСАРЕЕК1ИЕ31<87 зЯОСЙОАЫфаЕГЕЕКСНЕООЬЬКНУЗыРЬЕТЬЗ.ТТЫСкДЗЕСДУМНЕЗОЗРЗУЗОЬЗУ
481540
ЬЕдрЕОКЕСЗДиэЙРККЬЬТС}--------------НРУрайУЬЕУЙОУРаЗОРАСУЕРЬЯ
Т1535СУМЬТОЙЗРДрЬ0А11ЬЕВА5АТЕ<}ПГ1УРПЕСа1ТРЙ|иАЬЬРЗЬЗНС50ЬТТЬЗД
541600 арк^УЕ.?3¥Укдьннй|к1^асрн38Урр......-..... ьнхидьк
УСК^£1а|Ьр35Ь0Н|ЯсД5ЫЫТ1||ЕТРУРЕЕЗ¥ЕП1НСТЕНЕЕКЬА¥1,НАК11КЕЬЙСЕ
601642
Е
БОЕ..........-......Е------------(ЗСНИННИЯН
ЬаКР8МУИЬ8АЫРСРНСОТНТРУПРЕР1ЬСРСГМР«ННИННН
Фиг. 8
- 28 016326
Выравнивание между общей последовательностью исходного белка Ω из
НаеторМиз тПиепгае (8ΕΩ Ю N0:41), Ι_ΐροϋ-ΜΑΟΕ3-Ηΐδ (8ЕО Ю N0:45) для применения в качестве белков-партнеров слияния по настоящему изобретению
М КТЬАЬЗЫААСУЬАаСЗЗНЗЗЫМАИТОМКЗОК! 11АНКСАЗаУЬРЕН
100
ТЬЕ9КМЛРАООАГ1¥1ЕОП1АМТИЗОВ1>з«йг1Л1ЙГ!Д:ОЬТ131/АРКГРННН
ТЬЕЗКАЬАРА<20АПУЬЕ0О1ЛМТКПаНЬУУ1НОНРЬПСЬТСУАККРРНКН
101
127
ККГЮКУУУ101П’БКЕХ®1.ЕИГЕМЕЕТ
ΗΚ0αΚΥΥνΐΠΡΤΙ.ΚΕΙ<23ΕΕΜΤΕΝΡΕΤ
Фиг. 9
Выравнивание между общей последовательностью исходного белка Ω из
НаеторЬИиз /пПиетае (8ЕО Ю N0:41), ЫроО-МАОЕЗ-Ηίδ (8ЕО Ю N0:45) и ρΩΙ/3-ΡΚΑΜΕ-Ηΐδ (8ЕО Ю N0:44) для применения в качестве белков-партнеров слияния по настоящему изобретению
ОАЗЯУЬРВН
-------------------М3 3433ΝΜΑΝΤ0?«<3ΐ2ΚΙΪΪΑί·Π?ΰΑ3Ο1ΓΙ.ΡΕΗ М КТЬАЬЗШААаУГЛаСЗЗНЗЗММАЙТОМКЗОК! 11 АНааАЗСУЬ РЕН 51 100 ттдатаодАооАсхпвопммтквсйЪУ-и'.тйснрг.орхлптахкррнйн Т1.ЙакАЬАрад’АСУ1ЛСПЩМйТКГХ!ШдуУТЯ0£Й;12Ю1/Гй№КМ,Р!НЕП ТЬЕЗКАЬАРА00А£ГГЬ20ОМИТКПСНШ.У1НЕНгги®ЬТПУЛККРР1£ЙН ТЬЕЗКАГАРАОаАОУЬЕОПМОТКПСНЬУУТНдаРЬГЮЬТОУАККГРНПН 101 127
ПЧТЮНУГ/ЦЗИЪКЗГЧЗЬРМТгЫР?!’!!
НКЙСК’/У УХВРТЬКЕ ГдвЬЕМСЕМГЕ·®
ΕΚΙΧ3ΡΛ’Ύνΐυί-ΓΕΚΕΧ08ΕΕΜΤ3ΝΡ®ή
ΚΚΙΧ3ΚΥΥνΐΟΡΤΕΚΕΙ05Ι,ΕΜΤΕΝΡΕΤ
Фиг. 10
Анализ δϋδ-ΡΑΟΕ ρΩΙ/3-ΡΗΑΜΕ с или без секреторного сигнала (88) и Ηΐδхвоста (Ηΐδ) в векторе рЕТ21
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13 14 15 16 17
Фиг. 11
- 29 016326
Последовательность белка ϋ 1/3 МАСЕ-АЗ-Ηΐδ (8ΕΩ Ю ΝΩ:43) | Ν-конец МРР) белок Р 1/3 | Ме1А5р | Ма§еЗ | О1уО1у7хН15 С-конец{
2 124 3 314
МР РКТЬАЬ 8 ЬЬААСУЫкССЗ ЗН5 5^1ΑΝΤΩΜΚ3ρΚΙ II АН_4 О
ЕСАЗОТЬРЕНТЬЕЗКадРАйОАРУЬЁСрТ^ТКРСКруУ 8 0
1НРНРЬРСЬТРУАККРРНКНККЬОЕУУУ1РРТЪКЁ10'ЗЬЕ 12 0
МТЕЦЕЕТмрЪЁОЕЗСНСКРЁЕСЬЁАЁОЕАЬОЬУСАСАРАТ......1(50
ЁЁдЕААЗЗЗЗТЪУЁУТЬОЕУР^
ΤΜΝΥΡίΝ3Ω3ΫΕ^
АЁЬУНРЬЪЬКУКАкЁРУТ&кЕМШ^
А335Ь0ЬУЁО1ЁЬМЁУРР1СНЬУ1РАТСЬОРЗ¥РСЬЬСРЦ''32б
01МР^ОЬЬ11У1А11АЕЁёРСАРЁЁК1НЁЁЬЗУЬЁУРЁёЗбО
ЁЁР31'ьдРРККЬЬТ0НРУ0ЁЫ¥ЬЁУЁ0УРаЗРРАСУЁРЬН4б0
СРЁАЬУЁТЗУУкУЬННМУК18ОёРН13УРРЪНЁМУЬЁЁСЁ''440
Ёсёшшйннн 451.............................................................................................
Подчеркнуто = сигнальная последовательность белка Ω, включая 1-Ме1 и замены 2-Азр и З-Рго вместо нативных АК 2-1_уз и З-ТЬг белка Р.
Подчеркнуто двумя линиями = аминокислоты 20-127 белка Ω.
МР = неродственные аминокислоты Ме1-Азр в положениях АК 128-129 для создания сайта клонирования.
СС = неродственные аминокислоты С1у-С1у в положениях 442-443. .Прдчеркнуто..пунюгирной..лиш®й = фрагмент ΜΑΩΕ3; аминокислоты 3-314 МАСЕЗ (всего 312 АК)
ННННННН = хвост из 7 Ηίδ.
Фиг. 12
- 30 016326
Список последовательностей <110> с1ахо5пп’гЬк11пе В1о1од1са1з БА <120> Вакцина <130> νΒ62293 <150> 0700760.2 <151> 2007-01-15 <150> 0701262.8 <151> 2007-01-23 <160> 45 <170> Ра515Е0 для 1Л/1 ηάονν$ уегзтоп 4.0 <210> 1 <211> 1887 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - Т5СНННННН (плазмида ТСМР14) <400> 1 агддаТссаа дсадссаТТс аТсаааТаТд дсдаатассс ааагдааатс адасааааТс60 аттаттдстс ассдтддтдс тадсддттат тгассададс аТасдТТада аТсгааадса120 сггдсдтггд сасаасаддс гдатгагтта дадсаадаТТ тадсаатдас ТааддаТддг180 сдтгтадтдд ттаттсасда ГсасТИТТа датддсттда стдагдтгдс дааааааттс240 ссасатсдтс агсдгааада тддссдГГас татдтсатсд астттасстт аааадааагг300 сааадтттад ааагдасада ааасГЬЬдаа ассатддаас дааддсдтгг дтддддгтсс360 аггсададсс дагасатсад сатдадгдтд тддасаадсс сасддадаст тдгддадстд420 дсадддсада дсстдстдаа ддаГдаддсс сТддссаггд ссдсссгдда дттдстдссс480 адддадсгст гсссдссаст сттса1ддса дсстттдасд ддадасасад ссадассстд540 ааддсаатдд ТдсаддссТд дсссттсасс тдсстссстс ТдддадТдсТ датдааддда600 саасатсттс асстддадас стгсааадст дтдсттдатд дасттдатдт дстссттдсс660 саддаддттс дссссаддад дгддааасгг саадтдстдд атттасддаа даастстсат720 саддасттсг ддастдтагд дтстддааас адддссадтс гдтастсатт Тссададсса780 даадсадстс адсссатдас ааадаадсда ааадтадатд дгттдадсас ададдсадад840 садсссттса ТТссадТада ддгдсЬсдта дасстдттсс Тсааддаадд гдсстдтдат900 дааттдттст сстасстсат гдадааадгд аадсдааада аааагдтасг асдсстдтдс960 тдтаадаадс тдаадатттт тдсаатдссс атдсаддата тсаадатдат сстдаааатд1020 дтдсадстдд астстаттда адатттддаа дтдасттдта сстддаадст асссасстгд1080 дсдааатттт сгссттасст дддссадатд атгаатстдс дтадастсст сстсгсссас1140 атссатдсат стгсстасат тгссссддад ааддаададс адтататсдс ссадттсасс1200 тстсадтгсс тсадтсгдса дтдссьдсад дстстсгагд гддастсттт атттттссгг1260 ададдссдсс ТддаТсадГГ дстсаддсас дтдатдаасс ссТГддааас сстстсаата1320 астаастдсс ддстттсдда аддддагдтд атдсатстдт сссададтсс садсдтсадг1380 садсгаадтд тсстдадтст аадтддддтс атдстдассд атдтаадтсс сдадссссгс1440 саадстстдс гддадададс сгстдссасс сгссаддасс тддтсгттда гдадтдгддд1500 атсасддатд атсадстсст тдссстсстд ссттссстда дссастдсгс ссадсттаса1560 ассттаадст ТсТасдддаа ттссатстсс ататсгдсст тдсададтст сстдсадсас1620 стсатсдддс гдадсаагст дасссасдтд сгдгатссЬд ТсссссТдда дадттатдад1680 дасатссатд дтасссгсса сстддададд сттдссгатс Гдсатдссад дстсадддад1740 ттдсгдтдгд адттддддсд дсссадсагд дгстддстта дтдссаассс стдтссгсас1800 тдтддддаса даассттста гдасссддад сссагссгдг дссссгдгтт сатдсстаас1860 асгадгддсс ассагсасса гсассаг1887 <210> 2 <211> 629 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РЯАМЕ - Т5СНННННН (плазмида ТСМР14)
- 31 016326 <400> 2
- 32 016326
625 <210> 3 <211> 1860 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> МРР- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - нет Нт 5-хвоста (плазмида ТСМР14) <400> 3 а!дда!ссаа дсадсса!!с а!сааа!а!д дсдаа!ассс ааа!дааа!с адасаааа!с60 а«а!!дс!с ассд!дд!дс тадсддттат «ассададс атасдггада атсгааадса120 с!!дсд!!!д сасаасаддс !да!!а!!!а дадсаадатт !адсаа!дас !аадда!дд!180 сд!!!ад!дд !!а!!сасда !сас!!!!!а да!ддс!!да с!да!д!!дс дааааааттс240 ссасатсдгс атсдгааада гддссдггас !а!д!са!сд ас!!!асс!! аааадааа!!300 сааадгттад ааатдасада ааас!!!даа асса!ддаас дааддсд!!! д!дддд!!сс360 аИсададсс дагасагсад са!дад!д!д Тддасаадсс сасддадас! !д!ддадс!д420 дсадддсада дсс!дс!даа дда!даддсс с!ддсса!!д ссдссс!дда д!!дс!дссс480 адддадс!с! тсссдссас! с!!са!ддса дсс!!!дасд ддадасасад ссадасссгд540 ааддсаа!дд !дсаддсс!д дсссТТсасс !дсс!ссс!с !дддад!дс! датдааддда600 сааса!с!!с асс!ддадас с!!сааадс! д!дс!!да!д дас!!да!д! дс!сс!!дсс660 саддаддггс дссссаддад д!ддааас!! саад!дс!дд атттасддаа даас!с!са!720 саддастгст ддасгдгатд д!с!ддааас адддссадгс !д!ас!са!! !ссададсса780 даадсадс!с адссса!дас ааадаадсда ааад!ада!д д!!!дадсас ададдсадад840 садсссГТса !!ссад!ада дд!дс!сд!а дассТдГТсс тсааддаадд !дсс!д!да!900 даа!!д!!с! сс!асс!са! !дадааад!д аадсдааада аааа!д!ас! асдсс!д!дс960 !д!аадаадс тдаада!!!! тдсаагдссс агдсаддага !саада!да! сс!даааа!д1020 д!дсадс!дд ас!с!а!!да ада!!!ддаа д!дас!!д!а сс!ддаадс! асссассТГд1080 дсдааа!!!! с!сс!!асс! дддссадатд а!!аа!с!дс д!адас!сс! сс!с!сссас1140 а!сса!дса! с!!сс!аса! !!ссссддад ааддаададс ад!а!а!сдс ссадгтсасс1200 !с!сад!!сс !сад!с!дса д!дсс!дсад дс!с!с!а!д !ддас!с!!! аПШссИ1260 ададдссдсс 1дда!сад!! дс!саддсас д!да!даасс сс!!ддааас сс!с!саа!а1320 ас!аас!дсс ддсггтсдда аддддатд!д а!дса!с!д! сссадад!сс садсд!сад!1380 садс!аад!д !сс!дадтс! аад!дддд!с а!дс!дассд а!д!аад!сс сдадсссс!с1440 саадсгсгдс гддадададс сгсгдссасс стссаддасс !дд!с!!!да !дад!д!ддд1500 а!сасдда!д а!садс!сс! !дссс!сс!д сс!!ссс!да дссасгдсгс ссадсттаса1560 ассттаадс! тстасдддаа !!сса!с!сс агатстдсст !дсадад!с! сстдсадсас1620 с!са!сдддс !дадсаа!с! дасссасд!д с!д!а!сс!д !ссссс!дда дадТТаТдад1680 даса!сса!д дгасссгсса сс!ддададд с!!дсс!а!с !дса!дссад дсгсадддад1740 !!дс!д!д!д адТГддддсд дсссадса!д д!с!ддс!!а дтдссаассс с!д!сс!сас1800 !дтддддаса даасс!!с!а тдасссддад ссса!сс!дт дсссс!д!!! са!дсс!аас1860 <210> 4 <211> 620 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - нет Нт 5-хвоста (плазмида ТСМР14) <400> 4 мен Авр рго Бег Бег нтв Бег Бег Азп Ме1 А1а А5П тЬг б1п ме! Ьув 15 10 15
Бег А5р Ьу5 11е 11е 11е А1а нт‘5 Агд С1у А1а Бег С1у туг 1_еи Рго
- 33 016326
20 25 30
- 34 016326
580 585590 ьеи 5ег А1а азп Рго суз Рго Нтз суз С1у Азр Агд тНг РНе туг Азр
595 600605
Рго 01 и Рго 11е Ьеи Суз Рго суз РНе Мег Рго Аэп
610 615620 <210> 5 <211> 1884 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> МДР- 20-127 - Белок Д - РКАМЕ - Ι.ΕΗΗΗΗΗΗ (плазмида рЕТ21) <400> 5 атддатссаа дсадссаттс атсааататд дсдааТассс аааТдаааТс адасааааТс60 аттаттдстс ассдтддтдс тадсддттат ттассададс атасдттада атстааадса120 сттдсдтттд сасаасаддс тдаттаттта дадсаадатт тадсаатдас ТааддаТддТ180 сдтттадтдд ТТаТТсасда тсасттттта датддсттда стдатдттдс дааааааттс240 ссасатсдтс атсдтааада тддссдттас татдтсатсд астттасстт аааадааатт300 сааадтттад ааатдасада ааасТТТдаа ассатддаас дааддсдттт дтддддттсс360 аттсададсс датасатсад сатдадтдтд тддасаадсс сасддадаст ТдТддадсТд420 дсадддсада дсстдстдаа ддатдаддсс стддссаттд ссдссстдда дттдстдссс480 адддадстст тсссдссаст сТТсаТддса дссТТТдасд ддадасасад ссадассстд540 ааддсаатдд тдсаддсстд дсссттсасс тдсстссстс тдддадтдст датдааддда600 саасатсттс асстддадас сттсааадст дтдсттдатд дасттдатдт дсТссТТдсс660 саддаддттс дссссаддад дтддааастт саадтдстдд атттасддаа даастстсат720 саддасттст ддастдтатд дтстддааас адддссадтс тдтастсатт тссададсса780 даадсадстс адсссатдас ааадаадсда ааадтадатд дтттдадсас ададдсадад840 садсссттса ттссадтада ддтдстсдта дасстдттсс тсааддаадд тдсстдтдат900 дааттдттст сстасстсат тдадааадтд аадсдааада аааатдтаст асдсстдтдс960
ТдТаадаадс тдаадатттт тдсаатдссс атдсаддата тсаадатдат сстдаааатд1020 дтдсадстдд астстаттда адатттддаа дтдасттдта сстддаадст асссассттд1080 дсдааатттт стссттасст дддссадатд аттаатстдс дтадастсст сстстсссас1140 атссатдсат сттсстасат ттссссддад ааддаададс адтататсдс ссадттсасс1200 тстсадттсс тсадтстдса дтдсстдсад дстстстатд тддастсттт атттттсстт1260 ададдссдсс тддатсадтт дстсаддсас дтдатдаасс ссТТддааас сстстсаата1320 астаастдсс ддстттсдда аддддатдтд атдсатстдт сссададтсс садсдтсадт1380 садстаадтд тсстдадтст аадтддддтс атдстдассд атдтаадтсс сдадсссстс1440 саадстстдс тддадададс стстдссасс стссаддасс тддтстттда тдадтдтддд1500 атсасддатд атсадстсст тдссстсстд ссттссстда дссастдстс ссадсТТаса1560 ассттаадст тстасдддаа ттссатстсс ататстдсст тдсададтст сстдсадсас1620 стсатсдддс тдадсаатст дасссасдтд стдтатсстд тссссстдда дадттатдад1680 дасатссатд дтассстсса сстддададд сттдсстатс тдсатдссад дстсадддад1740 ттдстдтдтд адттддддсд дсссадсатд дтстддстта дтдссаассс стдтсстсас1800 тдтддддаса даассттста тдасссддад сссатсстдт дсссстдттт сатдсстаас1860 стсдадсасс ассассасса ссас1884 <210> 6 <211> 628 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> МДР- 20-127 - Белок Д - РКАМЕ - ЬЕНННННН (плазмида рЕТ21) <400> 6
- 35 016326
610 615 620
НТЗ НТЗ НТЗ Ηΐ 2
625
- 36 016326 <210> 7 <211> 1860 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - нет нт 5-хвоста (плазмида ρΕΤ21) <400> 7 атддатссаа дсадссаттс атсааататд дсдаатассс ааатдааатс адасаааатс60 аттаттдстс ассдтддтдс тадсддттат ТТассададс атасдттада атстааадса120 сттдсдтттд сасаасаддс тдаттаттта дадсаадаТТ тадсаатдас тааддатддт180 сдтттадтдд ттаттсасда тсасттттта датддсттда стдатдттдс дааааааттс240 ссасатсдтс атсдтааада тддссдттас татдтсатсд астттасстт аааадааатт300 сааадтттад ааатдасада ааастттдаа ассатддаас дааддсдттт дтддддттсс360 аттсададсс датасатсад сатдадтдтд тддасаадсс сасддадаст тдтддадстд420 дсадддсада дссТдсТдаа ддатдаддсс стддссаттд ссдсссТдда дттдстдссс480 адддадстст ТсссдссасТ сттсатддса дссТТТдасд ддадасасад ссадассстд540 ааддсаатдд тдсаддсстд дсссттсасс тдсстссстс тдддадтдст датдааддда600 саасатсттс асстддадас сттсааадст дтдсттдатд дасттдатдт дстссттдсс660 саддаддттс дссссаддад дтддааастт саадтдстдд атттасддаа даастстсат720 саддасттст ддастдтатд дтстддааас адддссадтс тдтастсатт тссададсса780 даадсадсТс адсссаТдас ааадаадсда ааадтадатд дТТТдадсас ададдсадад840 садсссТТса ттссадтада ддтдстсдта дасстдттсс тсааддаадд тдсстдтдат900 дааТТдТТсТ ссТассТсаТ тдадааадтд аадсдааада ааааТдТасТ асдсстдтдс960 тдтаадаадс тдаадатттт тдсаатдссс атдсаддата тсаадатдат сстдаааатд1020 дтдсадстдд астстаттда адатттддаа дтдасттдта сстддаадст асссассттд1080 дсдааатттт стссттасст дддссадатд аттаатстдс дтадастсст сстстсссас1140 атссатдсат сттсстасат ттссссддад ааддаададс адтататсдс ссадттсасс1200 тстсадттсс тсадтстдса дтдсстдсад дстстстатд тддастсттт атттттсстт1260 ададдссдсс тддатсадтт дстсаддсас дтдатдаасс ссТТддааас сстстсаата1320 астаастдсс ддстттсдда аддддатдтд атдсатстдт сссададтсс садсдтсадт1380 садсТаадТд тсстдадтст аадтддддтс атдсТдассд атдтаадтсс сдадссссТс1440 саадстстдс тддадададс сТсТдссасс сТссаддасс тддтстттда ТдадТдТддд1500 аТсасддаТд аТсадсТссТ тдссстсстд ссттссстда дссастдстс ссадсТТаса1560 ассттаадст тстасдддаа ттссатстсс ататстдсст тдсададтст сстдсадсас1620 стсатсдддс тдадсаатст дасссасдтд стдтатсстд тссссстдда дадттатдад1680 дасатссатд дтассстсса сстддададд сттдсстатс тдсатдссад дстсадддад1740 ттдстдтдтд адттддддсд дсссадсатд дтстддстта дтдссаассс стдтсстсас1800
ТдТддддаса даассттста тдасссддад сссатсстдт дссссТдТТТ сатдсстаас1860 <210> 8 <211> 620 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - нет Нт 5-хвоста (плазмида рЕТ21) <400> 8
- 37 016326
<210> 9 <211> 1878 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 38 016326 <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - нннннн (плазмида
РЕТ26) <400> 9 а!дда!ссаа дсадсса!!с а!сааа!а!д дсдаа!ассс ааа!дааа!с адасаааа!с60 а!!а«дс!с ассд!дд!дс гадсддггаг «ассададс а!асд!!ада аисгааадса120 с!!дсд!!!д сасаасаддс !да!!а!!!а дадсаада!! !адсаа!дас !аадда!дд!180 сд!!!ад!дд !!а!!сасда !сас!!!!!а да!ддс!!да с!да!д!!дс даааааа!!с240 ссаса!сд!с а!сд!ааада !ддссд!!ас !а!д!са!сд ас!!!асс!! аааадааа!!300 сааад!!!ад ааа!дасада ааас!!!даа асса!ддаас д!сд!сд!с! д!ддддсадс360 а!!сададсс д!!а!а!!ад са!дадсд!д !ддассадсс сдсд!сд!с! дд!!дадс!д420 дссддссада дсс!дс!даа ада!даадсд с!ддсса!!д сддсдс!дда дс!дс!дссд480 сд!дадс!д! «ссдссдс! д!!!а!ддсд дсд!!!да!д дссд!са!ад ссадассс!д540 ааадсда!дд !дсаддсд!д дссд!!!асс !д!с!дссдс !дддсд!дс! да!даааддс600 садса!с!дс а!с!ддааас с!!!ааадсд д!дс!дда!д дсс!дда!д! дс!дс!ддсс660 саддаад!!с д!ссдсд!сд !!ддааас!д саад!дс!дд а!с!дсд!аа ааасадсса!720 садда!!!!! ддассд!д!д дадсддсаа! сд!дсдадсс !д!а!адс!! !ссддаассд780 даадсддсдс адссда!дас саааааасд! ааад!дда!д дсс!дадсас сдаадсддаа840 садссд!!!а !!ссдд!дда ад!дс!дд!! дасс!д!!!с !дааадаадд сдсс!дсдас900 дадс!д!!!а дс!а!с!да! сдааааад!д ааасдсаааа аааасд!дс! дсд!с!д!дс960 !дсаааааас !даааа!с!! сдсда!дссд а!дсадда!а !!аааа!да! сс!даааа!д1020 д!дсадс!дд а!адса!!да ддасс!ддаа д!дасс!дса сс!ддааас! дссдассс!д1080 дссааа!!!а дсссд!а!с! дддссада!д а!!аасс!дс д!сд!с!дс! дс!д!с!са!1140 а!!са!дсда дсадс!а!а! !адсссддаа ааадаадаас ад!а!а!сдс дсад!!!асс1200 адссад!!!с !дадсс!дса а!дсс!дсаа дсдс!д!а!д !дда!адсс! д!!!!!!с!д1260 сд!ддссд1с !дда!садс! дс!дсд!са! д!да!даа!с сдс!ддааас сс!дадса!!1320 ассаас!дсс д!с!дадсда аддсда!д!д а!дса!с!да дссададссс дадсд!!адс1380 садс!д!с!д !!с!дадсс! дадсддсд!д а!дс!дассд а!д!дадссс ддаассдс!д1440 саадссс!дс !ддаасд!дс дадсдсдасс с!дсаадасс !дд!д!!!да !даа!дсддс1500 а!!ассда!д а!садс!дс! ддссс!дс!д ссдадсс!да дсса!!дсад ссадс!дасс1560 ассс!дадс! !!!а!ддсаа садса!!адс а!!адсдсдс !дсааадсс! дс!дсааса!1620 с!да!!ддсс !дадсаасс! дассса!д!д с!д!а!ссдд !дссдс!дда аадс!а!даа1680 да!а!!са!д дсассс!дса !с!ддаасд! с!ддсс!а!с !дсасдсдсд !с!дсд!дад1740 с!дс!д!дсд адс!дддссд !ссдадса!д д!!!ддс!д! с!дсдаа!сс д!дсссдса!1800 !дсддсда!с д!асс!!!!а !да!ссддаа ссда!!с!д! дсссд!дс!! !а!дссдаас1860 сассассасс ассассас1878 <210> 10 <211> 626 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок э - РКАМЕ - нннннн (плазмида рЕТ26) <400> 10
- 39 016326
610 615 620
Ηί 5 Ηί 5
625 <210> 11 <211> 1860 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - ΡΚΑΜΕ - нет Ηί5-хвоста (плазмида ρΕΤ26) <400> 11
- 40 016326 агддагссаа дсадссаггс аггаггдсгс ассдгддгдс сггдсдгггд сасаасаддс сдгггадгдд ггаггсасда ссасагсдгс агсдгааада сааадгггад ааагдасада аггсададсс дггагаггад дссддссада дссгдсгдаа сдгдадсгдг ггссдссдсг ааадсдагдд гдсаддсдгд садсагсгдс агсгддааас саддаадггс дгссдсдгсд саддаггггг ддассдгдгд даадсддсдс адссдагдас садссдггга ггссддгдда дадсгдггга дсгагсгдаг гдсаааааас гдаааагсгг дгдсадсгдд агадсаггда дссаааггга дсссдгагсг аггсагдсда дсадсгагаг адссадгггс гдадссгдса сдгддссдгс гддагсадсг ассаасгдсс дгсгдадсда садсгдгсгд ггсгдадссг саадсссгдс гддаасдгдс аггассдагд агсадсгдсг асссгдадсг гггагддсаа сгдаггддсс гдадсаассг дагаггсагд дсасссгдса сгдсгдгдсд адсгдддссд гдсддсдагс дгассгггга агсааагагд дсдаагассс гадсддггаг ггассададс гдаггаггга дадсаадагг гсасггггга дагддсггда гддссдггас гагдгсагсд ааасгггдаа ассагддаас сагдадсдгд гддассадсс адагдаадсд сгддссаггд дгггагддсд дсдгггдагд дссдгггасс гдгсгдссдс сгггааадсд дгдсгддагд ггддааасгд саадгдсгдд дадсддсааг сдгдсдадсс саааааасдг ааадгддагд адгдсгддгг дассгдгггс сдааааадгд ааасдсаааа сдсдагдссд агдсаддага ддассгддаа дгдассгдса дддссадагд аггаассгдс гадсссддаа ааадаадаас агдссгдсаа дсдсгдгагд дсгдсдгсаг дгдагдаагс аддсдагдгд агдсагсгда дадсддсдгд агдсгдассд дадсдсдасс сгдсаадасс ддсссгдсгд ссдадссгда садсаггадс аггадсдсдс дасссагдгд сгдгагссдд гсгддаасдг сгддссгагс гссдадсагд дгггддсгдг гдагссддаа ссдаггсгдг ааагдааагс агасдггада гадсаагдас сгдагдггдс асгггассгг дгсдгсдгсг сдсдгсдгсг сддсдсгдда дссдгсагад гдддсдгдсг дссгддагдг агсгдсдгаа гдгагадсгг дссгдадсас гдааадаадд аааасдгдсг ггаааагдаг ссгддааасг дгсдгсгдсг адгагагсдс гддагадссг сдсгддааас дссададссс агдгдадссс гддгдгггда дссаггдсад гдсааадссг гдссдсгдда гдсасдсдсд сгдсдаагсс дсссдгдсгг адасаааагс 60 агсгааадса 120 гааддагддг 180 дааааааггс 240 аааадааагг 300 дгддддсадс 360 ддггдадсгд 420 дсгдсгдссд 480 ссадасссгд 540 дагдаааддс 600 дсгдсгддсс 660 ааасадссаг 720 гссддаассд 780 сдаадсддаа 840 сдссгдсдас 900 дсдгсгдгдс 960 ссгдаааагд 1020 дссдасссгд 1080 дсгдгсгсаг 1140 дсадгггасс 1200 дггггггсгд 1260 ссгдадсагг 1320 дадсдггадс 1380 ддаассдсгд 1440 гдаагдсддс 1500 ссадсгдасс 1560 дсгдсаасаг 1620 аадсгагдаа 1680 гсгдсдгдад 1740 дгдсссдсаг 1800 гагдссдаас 1860 <210> 12 <211> 620 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <22О>
<223> ΜϋΡ- 20-127 - Белок ϋ - РКАМЕ - нет Н15-хвоста (плазмида рЕТ26) <400> 12
- 41 016326
<210> 13 <211> 9 <212> ПРТ пиши οαμίΕΐιο <400> 13
Уа1 ьеи Азр С1у Ьеи Азр Уа1 ьеи ьеи
1 5 <210> 14 <211> 10 <212> ПРТ <213> Ното зар1епз <400> 14
5ег ьеи Туг Зег РНе Рго С1и Рго С1и А1а
- 42 016326
<210> 18 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> смысловой олигонуклеотид САЫ008 <400> 18 ататаасата тддадссаад садссаттса тсааат 36 <210> 19 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид СА1\1037 <400> 19 ссасааасдс сгтсдттсса тддттдсааа дттттстдтс 40 <210> 20 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> смысловой олигонуклеотид САЫОЗб <400> 20 дасадаааас ГТТдааасса гддаасдаад дсдДДТдддд 40 <210> 21 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 43 016326 <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САЫ029 <400> 21 адададаста дтстадгТад дсатдаааса ддддсасад 39 <210> 22 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САЫ002 <400> 22 ддаддааста дтдттаддса тдааасаддд дсасад 36 <210> 23 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> смысловой олигонуклеотид саи040 <400> 23 адададсата тдадсадсса ттсатсааат агддсд 36 <210> 24 <211> 41 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид саиОЗ?
<400> 24 асдтдддсдд ссдсддмтс ааадттттст дТсаТТГста а 41 <210> 25 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> смысловой олигонуклеотид САНОЗЗ <400> 25 ттдттддсдд ссдсаатдда асдааддсдт ттдтддддт 39 <210> 26 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <22О>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САМ034 <400> 26 ддаддастсд аддттаддса гдааасаддд дсасад 36 <210> 27 <211> 39 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид СДК1О35
-44016326 <400> 27 ддаддасгсд адсьадььад дсагдаааса ддддсасад 39 <210> 28 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> смысловой олигонуклеотид СА1Ч106 <400> 28 садаааасгг тдааассабд даасдааддс д 31 <210> 29 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САМ107 <400> 29 сдссХИсдтг ссатддбттс ааадььгюг д 31 <210> 30 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> .
<223> смысловой олигонуклеотид СА1М104 <400> 30 ддадатагас аьагддатсс аадсадссаь Хсагсааата Ьдд 43 <210> 31 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САИ105 <400> 31 ссатагттда гдаабддсгд ст1дда1сса 1а1дга1а1с 1сс 43 <210> 32 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> смысловой олигонуклеотид СА1Ч123 <400> 32 дасадаааас ттгдааасса тддаасдтсд 1сдГстдГдд 40 <210> 33 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САИ124 <400> 33 ссасадасда сдасдггсса тддшсааа дттттсгдтс 40 <210> 34
- 45 016326 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> смысловой олигонуклеотид САИ199 <400> 34 ддааттссат атддагссаа дсадссаттс 30 <210> 35 <211> 53 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> антисмысловой олигонуклеотид САИ 19 <400> 35 .
ддадстстсд адтсадтддт ддгддгддгд дтддттсддс атааадсасд ддс 53 <210> 36 <211> 20 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> иммуностимулирующий олигонуклеотид Срб 1826 <400> 36 тссатдасдт тсстдасдгг 20 <210> 37 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> иммуностимулирующий олигонуклеотид Срб 1758 <400> 37 тстсссадсд гдсдссат 18 <210> 38 <211> 54 <212> ДНК <213> искусственная последовательность <220>
<223> иммуностимулирующий олигонуклеотид Срб2006 <400> 38 ассдатдасд тсдссддтда сддсассасд тсдтсдтттт дтсдттттдт сдТТ 54 <210> 39 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> иммуностимулирующий олигонуклеотид Срб1668 <400> 39 тссатдасдт тсстдатдст 20 <210> 40 <211> 22 <212> ДНК <213> искусственная последовательность
- 46 016326 <220>
<223> иммуностимулирующий олигонуклеотид Срб5456 <400> 40 тсдасдтттт сддсдсдсдс сд 22 <210> 41 <211> 127 <212> ПРТ <213> НаеторНПиз тпЛиепгае Ь <400> 41
<210> 42 <211> 111 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> 1-мет; 2-Азр; З-Рго; с последующими аминокислотами 20-127 Белка ϋ <400> 42
<210> 43 <211> 450 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Белок ϋ-ΜΑ6Ε-Α3-ΗΤ5 <400> 43
- 47 016326
Ηΐ5 НТ 5
450 <210> 44 <211> 109 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> аминокислота из Белка ϋ из наеторЫ1и5 тпЕТиепгае для использования в последовательности ρϋ1/3-ΜΑ6Ε-Ητ5
- 48 016326
<210> 45 <211> 127 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> аминокислота из Белка ϋ из наеторНПиз ιггНиепгае для использования в последовательности ροΐ/3-МАбЕ-нт5 <400> 45
О Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB0700760A GB0700760D0 (en) | 2007-01-15 | 2007-01-15 | Vaccine |
GB0701262A GB0701262D0 (en) | 2007-01-23 | 2007-01-23 | Vaccine |
PCT/EP2008/050290 WO2008087102A1 (en) | 2007-01-15 | 2008-01-11 | Vaccine |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA200900795A1 EA200900795A1 (ru) | 2010-02-26 |
EA016326B1 true EA016326B1 (ru) | 2012-04-30 |
Family
ID=39300029
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA200900795A EA016326B1 (ru) | 2007-01-15 | 2008-01-11 | Вакцина |
Country Status (32)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20080187535A1 (ru) |
EP (1) | EP2114993B1 (ru) |
JP (1) | JP5391080B2 (ru) |
KR (1) | KR20090101313A (ru) |
CN (1) | CN101668770B (ru) |
AR (1) | AR064862A1 (ru) |
AU (1) | AU2008207025B2 (ru) |
BR (1) | BRPI0806463A2 (ru) |
CA (1) | CA2674552A1 (ru) |
CL (1) | CL2008000104A1 (ru) |
CO (1) | CO6210757A2 (ru) |
CR (1) | CR10971A (ru) |
CY (1) | CY1113760T1 (ru) |
DK (1) | DK2114993T3 (ru) |
DO (1) | DOP2009000167A (ru) |
EA (1) | EA016326B1 (ru) |
ES (1) | ES2393812T3 (ru) |
HK (1) | HK1138853A1 (ru) |
HR (1) | HRP20120828T1 (ru) |
IL (1) | IL199663A0 (ru) |
JO (1) | JO2840B1 (ru) |
MA (1) | MA31093B1 (ru) |
MX (1) | MX2009007571A (ru) |
MY (1) | MY153679A (ru) |
NZ (1) | NZ578285A (ru) |
PE (2) | PE20130324A1 (ru) |
PL (1) | PL2114993T3 (ru) |
PT (1) | PT2114993E (ru) |
SI (1) | SI2114993T1 (ru) |
TW (1) | TWI434697B (ru) |
WO (1) | WO2008087102A1 (ru) |
ZA (1) | ZA200904923B (ru) |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20090122426A (ko) * | 2007-01-15 | 2009-11-30 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 종양 거부 항원 ny-eso-1 및 lage-1을 포함하는 융합 단백질 |
JP2012520663A (ja) | 2009-03-17 | 2012-09-10 | エムディーエックスヘルス エスエー | 遺伝子発現の改良された検出 |
US20100322977A1 (en) * | 2009-06-05 | 2010-12-23 | The Ohio State University Research Foundation | Biomaterials, compositions, and methods |
GB0910046D0 (en) | 2009-06-10 | 2009-07-22 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel compositions |
GB201008682D0 (en) * | 2010-05-25 | 2010-07-07 | Vib Vzw | Epitope tag for affinity based applications |
GB201101331D0 (en) * | 2011-01-26 | 2011-03-09 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Compositions and uses |
BR112014001052A2 (pt) * | 2011-07-22 | 2017-02-21 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | método para reduzir a agregação de uma proteína, uso de uma composição polianiônica, composição, e, método e processo para a produção de uma composição |
GB201114919D0 (en) * | 2011-08-30 | 2011-10-12 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Method |
GB201116248D0 (en) | 2011-09-20 | 2011-11-02 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Liposome production using isopropanol |
RU2590701C2 (ru) * | 2013-04-29 | 2016-07-10 | Общество с ограниченной ответственностью "ГеноТехнология" | Антигенная композиция и ее терапевтическое применение для профилактики и лечения онкологических заболеваний, рекомбинантная плазмидная днк, обеспечивающая синтез гибридного белка, а также способ получения белка |
US20160367651A1 (en) | 2013-10-01 | 2016-12-22 | Mie University | T cell inducing vaccine containing an interepitope sequence that promotes antigen presentation |
CN105254767A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-01-20 | 重庆科润生物医药研发有限公司 | 一种Protein D与HER2融合蛋白及其制备方法和应用 |
EP3548623A4 (en) | 2016-11-30 | 2020-11-25 | Advaxis, Inc. | IMMUNOGENIC COMPOSITIONS TARGETING RECURRENT CANCER MUTATIONS AND THEIR USE PROCEDURES |
CN108264550B (zh) * | 2017-01-04 | 2021-04-23 | 香雪生命科学技术(广东)有限公司 | 一种识别源自于prame抗原短肽的tcr |
CN108948184B (zh) * | 2017-05-22 | 2021-04-23 | 香雪生命科学技术(广东)有限公司 | 一种识别衍生自prame抗原短肽的t细胞受体 |
CN109400697B (zh) * | 2017-08-17 | 2021-04-23 | 香雪生命科学技术(广东)有限公司 | 一种识别prame抗原短肽的tcr及其相关组合物 |
WO2019061297A1 (zh) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | 苏州工业园区唯可达生物科技有限公司 | 一种cd4辅助性t细胞表位融合肽及其疫苗 |
WO2019094607A2 (en) * | 2017-11-08 | 2019-05-16 | Advaxis, Inc. | Immunogenic heteroclitic peptides from cancer-associated proteins and methods of use thereof |
CN109879957B (zh) * | 2017-12-06 | 2022-03-18 | 香雪生命科学技术(广东)有限公司 | 针对prame的高亲和力t细胞受体 |
US20230190902A1 (en) * | 2020-05-29 | 2023-06-22 | Children's National Medical Center | Identification of hla-restricted prame peptide epitopes, prame-specific t cells suitable for "off-the-shelf" treatment of cancer expressing prame |
KR20240004935A (ko) | 2021-05-05 | 2024-01-11 | 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하 | Prame에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999010375A2 (en) * | 1997-08-22 | 1999-03-04 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccine against hpv |
WO1999040188A2 (en) * | 1998-02-05 | 1999-08-12 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccinations |
WO2000050077A1 (en) * | 1999-02-25 | 2000-08-31 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Immunogens comprising a peptide and a carrier derived from h.influenzae protein d |
WO2001000232A2 (en) * | 1999-06-29 | 2001-01-04 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Use of cpg as an adjuvant for hiv vaccine |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE466259B (sv) * | 1990-05-31 | 1992-01-20 | Arne Forsgren | Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal |
AU1217395A (en) * | 1993-12-23 | 1995-07-10 | GFF Gesellschaft zur Forderung der industrie-orientierten Forschung | Immunological response potentiation process |
US5830753A (en) | 1994-09-30 | 1998-11-03 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor dage and uses thereof. |
JP2003504074A (ja) * | 1999-07-08 | 2003-02-04 | ストレスゲン バイオテクノロジーズ コーポレイション | インビトロでのTh1様応答の誘導 |
-
2008
- 2008-01-11 AU AU2008207025A patent/AU2008207025B2/en not_active Ceased
- 2008-01-11 BR BRPI0806463-6A patent/BRPI0806463A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-01-11 PE PE2012001372A patent/PE20130324A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-01-11 DK DK08701434.6T patent/DK2114993T3/da active
- 2008-01-11 WO PCT/EP2008/050290 patent/WO2008087102A1/en active Application Filing
- 2008-01-11 CA CA002674552A patent/CA2674552A1/en not_active Abandoned
- 2008-01-11 EA EA200900795A patent/EA016326B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-01-11 US US12/013,011 patent/US20080187535A1/en not_active Abandoned
- 2008-01-11 MX MX2009007571A patent/MX2009007571A/es active IP Right Grant
- 2008-01-11 ES ES08701434T patent/ES2393812T3/es active Active
- 2008-01-11 PL PL08701434T patent/PL2114993T3/pl unknown
- 2008-01-11 CN CN2008800078884A patent/CN101668770B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-01-11 EP EP08701434A patent/EP2114993B1/en not_active Not-in-force
- 2008-01-11 NZ NZ578285A patent/NZ578285A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-01-11 AR ARP080100127A patent/AR064862A1/es active IP Right Grant
- 2008-01-11 KR KR1020097017027A patent/KR20090101313A/ko not_active Application Discontinuation
- 2008-01-11 MY MYPI20092932A patent/MY153679A/en unknown
- 2008-01-11 PT PT08701434T patent/PT2114993E/pt unknown
- 2008-01-11 TW TW097101177A patent/TWI434697B/zh not_active IP Right Cessation
- 2008-01-11 SI SI200830787T patent/SI2114993T1/sl unknown
- 2008-01-11 PE PE2008000124A patent/PE20081686A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-01-11 JP JP2009545186A patent/JP5391080B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-01-13 JO JO200815A patent/JO2840B1/en active
- 2008-01-14 CL CL200800104A patent/CL2008000104A1/es unknown
-
2009
- 2009-07-02 IL IL199663A patent/IL199663A0/en unknown
- 2009-07-02 DO DO2009000167A patent/DOP2009000167A/es unknown
- 2009-07-10 MA MA32087A patent/MA31093B1/fr unknown
- 2009-07-14 ZA ZA2009/04923A patent/ZA200904923B/en unknown
- 2009-07-15 CO CO09073705A patent/CO6210757A2/es not_active Application Discontinuation
- 2009-08-07 CR CR10971A patent/CR10971A/es unknown
-
2010
- 2010-05-03 HK HK10104329.2A patent/HK1138853A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2012
- 2012-10-15 HR HRP20120828AT patent/HRP20120828T1/hr unknown
- 2012-11-09 CY CY20121101065T patent/CY1113760T1/el unknown
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1999010375A2 (en) * | 1997-08-22 | 1999-03-04 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Vaccine against hpv |
US20020182221A1 (en) * | 1997-08-22 | 2002-12-05 | Smithkline Beecham Biologicals | Recombinant papillomavirus vaccine and method for production and treatment |
WO1999040188A2 (en) * | 1998-02-05 | 1999-08-12 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccinations |
EP1584685A2 (en) * | 1998-02-05 | 2005-10-12 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination |
WO2000050077A1 (en) * | 1999-02-25 | 2000-08-31 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Immunogens comprising a peptide and a carrier derived from h.influenzae protein d |
WO2001000232A2 (en) * | 1999-06-29 | 2001-01-04 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Use of cpg as an adjuvant for hiv vaccine |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
HALLEZ SOPHIE ET AL.: "Phase I/II trial of immunogenicity of a human papillomavirus (HPV) type 16 E7 protein-based vaccine in women with oncogenic HPV-positive cervical intraepithelial neoplasia", CANCER IMMUNOLOGY, IMMUNOTHERAPY: CII JUL. 2004, vol. 53, no. 7, July 2004 (2004-07), pages 642-650, XP002477749, ISSN: 0340-7004, the whole document * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EA016326B1 (ru) | Вакцина | |
JP4768121B2 (ja) | Mageファミリーからの腫瘍関連抗原及びそれらをコードする核酸配列、融合タンパク質の及びワクチン接種のための組成物の調製のための使用 | |
ES2675825T3 (es) | Vacunación tumoral que involucra una respuesta inmunitaria contra la proteína propia CLDN18.2 | |
ES2398492T3 (es) | Proteínas de fusión que comprenden los antígenos de rechazo tumoral NY-ESO-1 y LAGE-1 | |
CN109575142B (zh) | 一种cd4辅助性t细胞表位融合肽及其疫苗 | |
US8309096B2 (en) | Fusion protein | |
EA020617B1 (ru) | Конструкции casb7439 | |
JP2003530856A (ja) | 融合タンパク質に対する免疫応答に関する物質および方法 | |
Wang et al. | Preparation of a peptide vaccine against GnRH by a bioprocess system based on asparaginase | |
US20160136287A1 (en) | Conjugated vaccine | |
WO2009127766A1 (es) | Sistema para la expresión de péptidos sobre la superficie bacteriana | |
AU2008206463B2 (en) | Fusion proteins comprising the tumor rejection antigens NY-ESO-1 and LAGE-1 | |
ES2367998T3 (es) | Derivados antígenos asociados a tumores de la familia mage, y secuencias de ácidos nucleicos que los codifican, usados para la preparación de proteínas de fusión y de composiciones para vacunación. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |