ES2393812T3 - Vacuna - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende: a) un antígeno tumoral PRAME; b) una pareja de fusión heteróloga derivada de proteína D, en la que la proteína de fusión comprende los aminoácidos 20 a 127 de proteína D; y c) adicionalmente aminoácidos Met-Asp-Pro en el extremo N-terminal de la secuencia de la proteína de fusión, en la que la proteína de pareja de fusión heteróloga derivada de la proteína O (b) se funde con el N-terminal dePRAME.

Description

Vacuna

La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden un antígeno derivado del así llamadoantígeno PRAME de rechazo a tumores (también conocido como DAGE) unido a una pareja de fusión inmunológica

5 derivada de proteína D de Haemophilus influenzae B, procedimientos para preparar las mismas y para formular vacunas y usar las mismas para tratar un intervalo de cánceres, que incluyen, pero no se limitan a melanoma,cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de pulmón tal como NSCLC, sarcoma, cáncer ovárico, cáncer de cabezay cuello, cáncer renal, carcinoma colorrectal, mieloma múltiple, leucemia que incluye leucemia aguda y carcinomaesofágico.

Entre los diferentes grupos de antígenos asociados a tumores, los antígenos del cáncer de testículo son de interéspara inmunoterapia debido a su expresión específica de tumores amplia y al hecho de que generalmente estosantígenos no se expresan en células sanas. Se han descrito tantos como más de 50 antígenos de cáncer detestículo y, para muchos de ellos, se han identificado epítopes reconocidos por linfocitos T. PRAME es un antígeno de cáncer de testículo y está bajo investigación como una inmunoterapia potencial.

15 En inmunoterapia el antígeno de cáncer se introduce al paciente usualmente como una vacuna, por ejemplo que contiene un antígeno como una proteína o un fragmento inmunógeno de la misma, o como ADN que codifica para laproteína o como un vector que contiene dicho ADN, que estimula el sistema inmunitario del paciente para atacartumores que expresan el mismo antígeno.

Si se estimula la respuesta apropiada, los linfocitos T (células T) atacan antígenos directamente, y proporcionancontrol de la respuesta inmune. Se desarrollan células B y células T que son específicas para un tipo de antígeno.Cuando el sistema inmune se expone a un antígeno diferente, se forman células B diferentes y células T diferentes.Según se desarrollan los linfocitos, aprenden normalmente a reconocer los tejidos propios del cuerpo (propios) comodiferentes de los tejidos y partículas no encontrados normalmente en el cuerpo (no propios). Una vez se forman lascélulas B y las células T, unas pocas de esas células se multiplicarán y proporcionarán "memoria" para el sistema

25 inmune. Esto permite al sistema inmune responder más rápido y más eficientemente la vez siguiente que se exponga al mismo antígeno. Ciertos experimentos parecen indicar que los antígenos de cáncer de testículo puedenestimular mecanismos de memoria en el sistema inmune

Se teoriza por algunos que PRAME está implicado en muerte celular o ciclos celulares. Se ha mostrado por algunosgrupos que se expresa en melanoma y una amplia diversidad de tumores que incluyen de pulmón, de riñón, y decabeza y cuello. De forma interesante también parecen expresarse en el 40-60% de leucemias tal como leucemialinfoide aguda y leucemia mieloide aguda, véase por ejemplo Exp. Hematol. diciembre de 2000; 28(12):1413-22. Enpacientes se ha observado que la sobreexpresión de PRAME parece estar asociada con supervivencia más alta y tasas menores de recaída en comparación con aquellos quienes no sobreexpresan la proteína.

El antígeno y su preparación se describen en la Patente de los Estados Unidos N.º: 5.830.753. PRAME se encuentra

35 en la Base de Datos de Genes Humanos Comentada H-Inv DB bajo los números de acceso: U65011.1, BC022008.1, AK129783.1, BC014974.2, CR608334.1, AF025440.1, CR591755.1, BC039731.1, CR623010.1, CR611321.1, CR618501.1, CR604772.1, CR456549.1, y CR620272.1.

La proteína D es una proteína de superficie de la bacteria gram-negativa, Haemophilus influenzae B. La información sobre las parejas de fusión inmunológicas derivadas de proteína D se puede obtener a partir del documento WO91/18926.

Las proteínas de fusión de una parte de un antígeno y una pareja de fusión heteróloga se preparan algunas vecespara incrementar la inmunogenicidad del antígeno y/o para ayudar a la producción de la proteína en cantidades y/opureza apropiadas, véase por ejemplo el documento WO 99/40188 que describe una proteína de fusión de MAGE y,por ejemplo proteína D una proteína de superficie de la bacteria gram-negativa, Haemophilus influenzae B. La

45 proteína de fusión se prepara recombinantemente y la secuencia de secreción de proteína D se puede incorporar dentro de la proteína de fusión para potencialmente ayudar a la secreción y solubilización del producto final.

El documento WO00/50077 describe un número de péptidos inmunogénicos unido a un vehículo, en el que elvehículo se deriva de Haemophilus influenzae proteína D o fragmentos de la misma. El documento WO99/10375describe proteínas de fusión del Virus del Papiloma Humano (VPH), unidas a una pareja de fusión inmunológica que proporciona epítopes de células T auxiliares al antígeno de VPH

Breve Descripción de las Figuras y Constructos/Secuencias

Figura 1

Análisis por SDS-page de Constructos 3 y 4

Figura 2

Análisis por SDS-page de Constructos 3a y 4a

Figura 3

Respuesta de CD4 (coadyuvante AS01B)

Figura 4

Respuesta de CD8 (coadyuvante AS01B -20070499)

Figura 5

Respuesta de CD4 (coadyuvante AS15)

Figura 6

Respuesta de CD8 (coadyuvante AS15)

(continuación) (continuación)

Figura 7

Una secuencia aminoacídica destacada de ejemplos de constructos de la presente invención

Figura 8

Alineación entre LipoD-MAGE3-His (SEC ID N.º: 43) y pD1/3-PRAME-His (SEC ID N.º: 10)

Figura 9

Alineación entre la secuencia compartida de la proteína D original de Haemophilus influenzae (SEC ID N.º: 45) y la LipoD-MAGE3-His (SEC ID N.º: 43)

Figura 10

Alineación entre la secuencia compartida de la proteína D original de Haemophilus influenzae (SEC ID N.º: 41), la pD-MAGE3-His (SEC ID N.º: 45) y un constructo de pD1/3-PRAME-His, que no incluye los aminoácidos 2-D y 3-P (SEC ID N.º: 44)

Figura 11

Análisis por SDS page de pD1/3-PRAME con o sin señal de secreción (SS) y marca de His(His) en el vector pET21.

Figura 12

Secuencia de proteína D 1/3 MAGE-A3-His (SEC ID N.º: 44)

Constructo 1 (Ejemplo 1)

MDP-20-127 -Proteína D – PRAME – TSGHHHHHH (plásmido TCMP14) (secuencia de nucleótidos SEC ID N.º: 1; secuencia de aminoácidos SEC ID N.º: 2)

Constructo 2 (Ejemplo 2)

MDP-20-127 -Proteína D – PRAME – sin marca de His (plásmido TCMP14) (secuencia de nucleótidos SEC ID N.º: 3; secuencia de aminoácidos SEC ID N.º: 4)

Constructo 3 (Ejemplo 3)

MDP-20-127 -Proteína D – PRAME – LEHHHHHH (plásmido pET21) (secuencia de nucleótidos SEC ID N.º: 5; secuencia de aminoácidos SEC ID N.º: 6)

Constructo 4 (Ejemplo 4)

MDP-20-127 -Proteína D – PRAME – sin marca de His (plásmido pET21) (secuencia de nucleótidos SEC ID N.º: 7; secuencia de aminoácidos SEC ID N.º: 8)

Constructo 3a (Ejemplo 3a)

MDP-20-127 -Proteína D – PRAME – HHHHHH (plásmido pET26) (secuencia de nucleótidos SEC ID N.º: 9; secuencia de aminoácidos SEC ID N.º: 10)

Constructo 4a (Ejemplo 4a)

MDP-20-127 -Proteína D – PRAME – sin marca de His (plásmido pET26) (secuencia de nucleótidos SEC ID N.º: 11; secuencia de aminoácidos SEC ID N.º: 12)

Secuencia 1 (SEC ID N.º: 1)

es la secuencia de ADN para el ejemplo 1

Secuencia 2 (SEC ID N.º: 2)

es la secuencia de aminoácidos para el ejemplo 1

Secuencia 3 (SEC ID N.º: 3)

es la secuencia de ADN para el ejemplo 2

Secuencia 4 (SEC ID N.º: 4)

es la secuencia de aminoácidos para el ejemplo 2

Secuencia 5 (SEC ID N.º: 5)

es la secuencia de ADN para el ejemplo 3

Secuencia 6 (SEC ID N.º: 6)

es la secuencia de aminoácidos para el ejemplo 3

Secuencia 7 (SEC ID N.º: 7)

es la secuencia de ADN para el ejemplo 4

Secuencia 8 (SEC ID N.º: 8)

es la secuencia de aminoácidos para el ejemplo 4

Secuencia 9 (SEC ID N.º: 9)

es la secuencia de ADN de codón optimizado para el ejemplo 3a

Secuencia 10 (SEC ID N.º: 10)

es la secuencia de aminoácidos para el ejemplo 3a

Secuencia 11 (SEC ID N.º: 11)

es la secuencia de ADN de codón optimizado para el ejemplo 4a

Secuencia 12 (SEC ID N.º: 12)

es la secuencia de aminoácidos para el ejemplo 4a

SEC ID N.º: 13

VLDGLDVLL (PRA100–108)

SEC ID N.º: 14

SLYSFPEPEA (PRA142–151)

SEC ID N.º: 15

ALYVDSLFFL (PRA300–309)

SEC ID N.º: 16

LYVDSLFFL (PRA301-309)

SEC ID N.º: 17

SLLQHLIGL (PRA425–433)

SEC ID N.º: 18 a 35

Oligonucleótidos usados en los ejemplos de la presente invención

SEC ID N.º: 36

TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826);

SEC ID N.º: 37

TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)

SEC ID N.º: 38

ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)

SEC ID N.º: 39

TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)

SEC ID N.º: 40

TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456)

SEC ID N.º: 41

Los aminoácidos 1 a 127 de la Proteína D de Haemophilus influenzae

SEC ID N.º: 42

Aminoácidos 1-Met; 2-Asp; 3-Pro; seguidos por los aminoácidos 20 a 127 de proteína D

SEC ID N.º: 43

Secuencia de aminoácidos de Proteína D 1/3-MAGE-A3-His

SEC ID N.º: 44

Aminoácidos de proteína D de Haemophilus influenzae para usar en una secuencia pD1/3-PRAME-His

SEC ID N.º: 45

Aminoácidos de proteína D de Haemophilus influenzae para usar en una secuencia pD1/3MAGE-His

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una proteína de fusión que comprende:

5 a) PRAME;

b) Una pareja de fusión heteróloga derivada de proteína D,

en la que la proteína de fusión comprende los aminoácidos 20 a 127 de proteína D; y c) adicionalmente aminoácidosMet-Asp-Pro en el extremo N-terminal de la secuencia de la proteína de fusión, en la que la proteína de pareja de fusión heteróloga derivada de la proteína O (b) se funde con el N-terminal de PRAME.

10 Parece que para las proteínas de fusión que comprenden PRAME o un fragmento inmunogénico del mismo y proteína D, o para proteínas de fusión que comprenden proteína D, o para una proteína pareja de fusión quecomprende proteína D, que la presencia de la secuencia de secreción (o secuencia señal) puede afectar detrimentalmente la cantidad de proteína de fusión producida.

PRAME

15 En un aspecto la proteína de fusión de la presente invención comprende una proteína pareja de fusión como se describe en el presente documento y un antígeno PRAME o fragmento inmunogénico del mismo. Generalmente la proteína PRAME tiene 509 aminoácidos y en una realización se pueden usar todos los 509 aminoácidos de PRAME. Se han identificado varios epítopes de linfocitos T citotóxicos (CTL) en PRAME, por ejemplo:

VLDGLDVLL (PRA100–108; SEC ID N.º: 13);

SLYSFPEPEA (PRA142–151; SEC ID N.º: 14);

ALYVDSLFFL (PRA300–309; SEC ID N.º: 15);

LYVDSLFFL (PRA301-309; SEC ID N.º: 16) y

SLLQHLIGL (PRA425–433; SEC ID N.º:17).

Generalmente es deseable incluir tantos de estos epítopes como sea posible dentro del antígeno para generar unarespuesta inmune fuerte y asegurar que el antígeno es tan inmunogénico como sea posible. Aunque, puede serposible compensar una menor inmunogenicidad de un constructo dado empleando una formulación con un coadyuvante inmunológico potente. Los coadyuvantes fuertes se discuten más adelante en mayor detalle.

En un aspecto la invención proporciona la parte de PRAME de la proteína de fusión que comprende, está constituida

o consiste esencialmente en la proteína de longitud total.

Sin embargo, la invención también se extiende a constructos de PRAME con sustituciones conservadoras. En una realización, pueden estar sustituidos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más aminoácidos. El constructo de PRAME como sedescribe en el presente documento puede contener adicionalmente o alternativamente deleciones o inserciones enla secuencia de aminoácidos cuando se compara con la secuencia de PRAME de tipo salvaje. En una realización, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más aminoácidos se pueden insertar o eliminar.

Las sustituciones conservadoras se conocen bien y se establecen generalmente como las matrices de registro pordefecto en los programas de ordenador de alineación de secuencias. Estos programas incluyen PAM250 (Dayhoft

M.O.

y col., (1978), “A model of evolutionary changes in proteins”, en “Atlas of Protein sequence and structure” 5(3)

M.O.

Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, y Blosum 62 (Steven Henikofty Jorja G. Henikoft (1992), “Amino acid substitution matricies from protein blocks”), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(Biochemistry): 10915-10919.

En términos generales, las sustituciones dentro de los siguientes grupos son sustituciones conservadoras, pero lassustituciones entre grupos se consideran no conservadas. Los grupos son:

i) Aspartato/asparragina/glutamato/glutamina

ii) Serina/treonina

iii) Lisina/arginina

iv) Fenilalanina/tirosina/triptófano

v) Leucina/isoleucina/valina/metionina

vi) Glicina/alanina

Generalmente la secuencia de PRAME/los aminoácidos de PRAME usados en las proteínas de fusión de la

invención serán más del 80%, tal como el 85, 90, 95 y más específicamente el 99% idénticos al PRAMEಞque se da en la naturaleza. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica son conscientes de que los restos de aminoácidosgenerados como un resultado del proceso de clonación se pueden mantener en las proteínas sintetizadas recombinantemente. Si éstos no afectan detrimentalmente a las características del producto, es opcional si seeliminan o no.

En un aspecto la invención proporciona una proteína de fusión como se describe en el presente documento quecomprende, consta de o consiste esencialmente en proteína PRAME de longitud total. En un aspecto adicional laparte de PRAME de la proteína de fusión de la presente invención comprende, está constituida o consiste esencialmente en uno o más de los siguientes epítopes:

VLDGLDVLL (PRA100–108; SEC ID N.º: 13);

SLYSFPEPEA (PRA142–151; SEC ID N.º: 14);

ALYVDSLFFL (PRA300–309; SEC ID N.º: 15);

LYVDSLFFL (PRA301-309; SEC ID N.º: 16) y

SLLQHLIGL (PRA425–433; SEC ID N.º: 17).

Las proteínas de fusión del antígeno PRAME y la proteína pareja de fusión proteína D como se describen en elpresente documento pueden estar químicamente conjugadas, pero se expresan preferiblemente como proteínas defusión recombinantes, que pueden permitir niveles incrementados de proteína PRAME en un sistema de expresiónsegún se compara con PRAME solo sin pareja de fusión, tal como las proteínas proteína D o proteína D modificada.

Las proteínas de fusión de la presente invención, como se describen en el presente documento, pueden comprenderadicionalmente una o más secuencias de engarce entre la proteína pareja de fusión y el antígeno tumoral o parteinmunogénica del mismo; o entre la proteína pareja de fusión y una marca de His u otra marca de afinidad (si estápresente); o entre el antígeno tumoral o parte inmunogénica del mismo y una marca de His u otra marca de afinidad(si está presente). Los aminoácidos en las secuencias de engarce pueden no estar relacionados con las secuenciasdel antígeno y/o pareja de fusión.

La pareja de fusión puede ayudar en expresar la proteína (potenciador de expresión) a rendimientos más altos quela proteína recombinante nativa. La proteína pareja de fusión D, debido a su naturaleza foránea, puede ser particularmente inmunogénica in vivo y ayudar a la proteína de fusión que comprende PRAME u otro antígeno tumoral proporcionando epítopes T auxiliares, preferiblemente epítopes T auxiliares reconocidos por células T CD4. Se puede creer que tales células T-CD4 contribuyen a generar una respuesta inmune favorable, en particular, una respuesta de células T citolíticas CD8.

En una realización, la pareja de fusión puede actuar tanto como una pareja que potencia la expresión como en formade una pareja de fusión inmunológica.

En un aspecto la invención proporciona una proteína de fusión en la que la parte N-terminal de la proteína D (comose describe anteriormente o en el presente documento) se condensa al extremo N-terminal de PRAME. Más específicamente la fusión con el fragmento de la proteína D y el extremo N-terminal de PRAME se lleva a cabo de tal forma que el PRAME reemplaza el fragmento C-terminal de la proteína D que se ha escindido. Así el extremo Nterminal de la proteína D llega a ser el extremo N-terminal de la proteína de fusión.

Las proteínas de fusión de la invención pueden incluir un marcador de afinidad, tal como por ejemplo, una marca dehistidina que comprende entre 5 -9 restos de histidina tal como 6 restos de histidina. Estos restos pueden, porejemplo estar en la parte terminal de la proteína D (tal como en la parte terminal de la proteína D) y/o pueden estar condensados a la parte terminal del antígeno PRAME o derivado del mismo, o al antígeno tumoral o al derivado delmismo como se describen en el presente documento. Generalmente sin embargo la marca de histidina puede localizarse en la parte terminal del antígeno PRAME o derivado del mismo, o el antígeno tumoral o derivado delmismo como se describe en el presente documento tal como el extremo C-terminal del antígeno PRAME o derivadodel mismo, o el antígeno tumoral o derivado del mismo como se describe en el presente documento. Las marcas dehistidina pueden ser ventajosas a la hora de ayudar en la purificación.

La presente invención también proporciona un ácido nucleico que codifica las proteínas de la presente invención.Tales secuencias se pueden insertar dentro de un vector de expresión adecuado y usarse como vacunación ADN/RNA o se pueden expresar en un huésped adecuado. Los vectores microbianos que expresan el ácido nucleicose pueden usar como vacunas. Tales vectores incluyen por ejemplo, poxvirus, adenovirus, alfavirus, listeria y monofago.

Una secuencia de ADN que codifica las proteínas de la presente invención se puede sintetizar usando técnicas desíntesis de ADN convencionales, tales como mediante ligado enzimático como se describe por D.M. Roberts y col.en Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, mediante síntesis química, mediante polimerización enzimática in vitro, o mediante tecnología de PCR que utiliza por ejemplo una polimerasa térmicamente estable, o mediante una combinación de estas técnicas.

La polimerización enzimática de ADN se puede llevar a cabo in vitro usando una ADN polimerasa tal como ADNpolimerasa I (fragmento Klenow) en un tampón apropiado que contiene los nucleósidos trifosfato dATP, dCTP, dGTPy dTTP según se requieren a una temperatura de 10°-37°C, generalmente en un volumen de 50 µl o menos. El ligado enzimático de fragmentos de ADN se puede llevar a cabo usando una ligasa de ADN tal como una ligasa deADN T4 en un tampón apropiado, tal como Tris 0,05 M (pH 7,4), MgCl2 0,01M, ditiotreitol 0,01 M, espermidina 1 mM, ATP 1mM y seroalbúmina bovina a 0,1 mg/ml, a una temperatura de 4°C a temperatura ambiente, generalmente enun volumen de 50 ml o menos. La síntesis química del polímero de ADN o fragmentos de ADN se pueden llevar acabo mediante química de fosfotriéster, fosfito o forforamidita convencional, usando técnicas de fase sólida talescomo aquellas descritas en ‘Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments -A Laboratory Manual’ (ed. H.G.Gassen y A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), o en otras publicaciones científicas, por ejemplo M.J. Gait,

H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, y R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat, y W.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci y M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci y M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams ycol., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, y H. Koester,Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539; y H.W.D. Matthes y col., EMBO Journal, 1984, 3, 801.

El proceso de la invención se puede llevar a cabo mediante técnicas recombinantes convencionales tales como lasdescritas en Maniatis y col., Molecular Cloning -A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.

En particular, el proceso puede comprender las etapas de:

i) preparar un vector de expresión replicable o de integración capaz, en una célula huésped, de expresar unpolímero de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína o un derivadoinmunógeno de la misma;

ii) transformar una célula huésped con dicho vector;

iii) cultivar dicha célula huésped transformada bajo condiciones que permiten expresión de dicho polímero de ADN para producir dicha proteína; y

iv) recuperar dicha proteína.

El término ‘transformar’ se usa en el presente documento para querer decir la introducción de ADN foráneo en unacélula huésped. Esto se puede lograr por ejemplo mediante transformación, transfección o infección con un plásmido

o vector viral apropiado usando por ejemplo técnicas convencionales como se describen en Genetic Engineering;Eds. S.M. Kingsman y A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, Inglaterra, 1988. El término‘transformado’ o ‘transformante’ se aplicará de ahora en adelante a la célula huésped resultante que contiene y expresa el gen foráneo de interés.

Los vectores de expresión son novedosos y también forman parte de la invención.

Los vectores de expresión replicables se pueden preparar de acuerdo con la invención, escindiendo un vectorcompatible con la célula huésped para proporcionar un segmento lineal de ADN que tiene un replicón intacto, y combinando dicho segmento lineal con una o más moléculas de ADN que, conjuntamente con dicho segmento linealcodifican el producto deseado, tal como el polímero de ADN que codifica la proteína de la invención, o derivado de lamisma, bajo condiciones de ligado.

Así, el polímero de ADN se puede preformar o formar durante la construcción del vector, según se desee.

La elección del vector se determinará en parte mediante la célula huésped, que puede ser procariota o eucariotapero son generalmente células de E. coli o células CHO. Los vectores adecuados pueden incluir plásmidos porejemplo TMCP14 o pET21 o pET26, pcDNA3, bacteriófagos, cósmidos y virus recombinantes.

La preparación del vector de expresión replicable se puede llevar a cabo convencionalmente con enzimas apropiados para restricción, polimerización y ligado del ADN, mediante procedimientos descritos en, por ejemplo,Maniatis y col. citado anteriormente.

La célula huésped recombinante se prepara, de acuerdo con la invención, transformando una célula huésped con unvector de expresión replicable de la invención bajo condiciones de transformación. Las condiciones de transformación adecuadas son convencionales y se describen en, por ejemplo, Maniatis y col. citado anteriormente,

o “DNA Cloning” vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985.

La elección de condiciones de transformación se determina por la célula huésped. Así, un huésped bacteriano tal como E. coli se puede tratar con una solución de CaCl2 (Cohen y col., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) o con una solución que comprende una mezcla de RbCl, MnCl2, acetato de potasio y glicerol, y después con ácido 3-[Nmorfolino]-propano-sulfónico, RbCl y glicerol. Las células de mamífero en cultivo se pueden transformar mediantecoprecipitación con calcio del ADN vector sobre las células. La invención también se extiende a una célula huéspedtransformada con un vector de expresión replicable de la invención.

El ADN puede haber experimentado optimización de codones mediante técnicas estándar para facilitaradicionalmente la expresión del huésped relevante. En una realización de la presente invención se proporciona ADNque codifica una proteína de fusión que comprende un antígeno PRAME o parte o fragmento del mismo como sedescribe en el presente documento, en el que la secuencia de nucleótidos del antígeno PRAME o parte o fragmentodel mismo tiene los codones optimizados. En una realización, la secuencia de nucleótidos de proteína D no tiene loscodones optimizados.

Cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones que permiten la expresión del polímero de ADN se lleva acabo convencionalmente, como se describe en, por ejemplo, Maniatis y col. y “DNA Cloning” citados anteriormente.Así, preferiblemente la célula se suministra con nutriente y se cultiva a temperatura por debajo de 50°C.

Las proteínas de la presente invención pueden expresarse en procariotas o eucariotas tales como levadura pero seexpresan a menudo en E. coli. Se pueden emplear cepas particulares de E. coli tales como AR58 y BLR DE3.

Generalmente un marcador de selección de, por ejemplo resistencia a kanamicina o resistencia a ampicilina seincorpora para facilitar identificación de la incorporación exitosa del gen/constructo recombinante dentro del sistemade expresión.

El producto se recupera mediante procedimientos convencionales de acuerdo con la célula huésped y de acuerdocon la localización del producto de expresión (intracelular o segregado dentro del medio de cultivo o dentro delperiplasma celular). En una realización de la presente invención el producto de expresión es intracelular. En una realización de la presente invención el producto de expresión es una proteína insoluble. Así, la célula huésped esbacteriana, tal como E. coli ella puede, por ejemplo, lisarse físicamente, químicamente o enzimáticamente y elproducto proteico aislarse del lisado resultante. Cuando la célula huésped es de mamífero, el producto puedegeneralmente aislarse a partir del medio del nutriente o a partir de extractos libres de células. Las técnicas deaislamiento de proteínas convencionales incluyen precipitación selectiva, cromatografía de adsorción, ycromatografía de afinidad que incluyen una columna de afinidad a anticuerpo monoclonal.

En una realización de la invención se proporciona un proceso para producir una proteína de fusión como se describeen el presente documento que comprende la etapa de expresar en una célula una proteína de fusión que comprendeuna proteína pareja de fusión como se describe en el presente documento. La célula puede ser una bacteria. En una realización en la que la célula es una bacteria, la bacteria puede ser E. coli. El procedimiento de la presente invención puede comprender la etapa de expresar una proteína de fusión como se describe en el presentedocumento en una célula como una proteína insoluble. El procedimiento puede comprender adicionalmente la etapade lisar la célula y purificar la proteína de fusión expresada a partir de las células lisadas.

En una realización de la invención se proporciona una proteína de fusión obtenida mediante u obtenible mediante unprocedimiento o proceso descrito en el presente documento.

Las proteínas de la presente invención se proporcionan bien solubles en una forma líquida o bien en una formaliofilizada.

Se espera generalmente que cada dosis humana comprenderá 1 a 1000 µg de proteína, y preferiblemente 30 -300 µg.

La presente invención también proporciona composición farmacéutica tal como vacuna que comprende una proteínade fusión de la presente invención en un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La vacuna puede contener opcionalmente uno o más antígenos o polipéptidos asociados a tumores distintos, opreferiblemente puede combinarse con otras vacunas de cáncer basadas en un antígeno asociado a tumores. Porejemplo, estos antígenos asociados a tumores podrían ser antígenos como los que se describen en el presentedocumento y/o pueden ser miembros que pertenecen a las familias MAGE, LAGE y GAGE o WT-1. En una realización el antígeno asociado a tumor puede comprender o estar constituido por el antígeno MAGE-A3.

La preparación de vacuna se describe generalmente en Vaccine Design (”The subunit and adjuvant approach” (eds.Powell M.F. & Newman M.J). (1995) Plenum Press Nueva York). La encapsulación dentro de liposomas se describe por Fullerton, Patente de los Estados Unidos 4.235.877.

Las proteínas de la presente invención pueden estar preferiblemente coadyuvadas en la formulación de vacunas dela invención. Los coadyuvantes adecuados pueden incluir una sal de aluminio tal como un gel de hidróxido dealuminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero pueden ser también una sal de calcio, hierro o cinc, o pueden ser unasuspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos catiónicamente o aniónicamente derivatizados, o polifosfacenos. Otros coadyuvantes conocidos incluyen oligonucleótidos que contienen CpG. Losoligonucleótidos se caracterizan en que el dinucleótido CpG está no metilado. Tales oligonucleótidos son bienconocidos y se describen en, por ejemplo el documento WO 96/02555.

En la formulación de las invenciones puede ser deseable que la composición coadyuvante induzca una respuestainmune preferencialmente del tipo TH1. En una realización hay proporcionado un sistema coadyuvante que incluye,por ejemplo una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monofosforil lípido A 3-de-O-acilado (3D-MPL) conjuntamente con una sal de aluminio. El coadyuvante puede incluir opcionalmente también oligonucleótidosCpG para inducir preferencialmente una respuesta TH1.

Un sistema potenciado que se puede usar en la presente invención comprende la combinación de un lípido A monofosforilo y un derivado de saponina, particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en eldocumento WO 94/00153, o, por ejemplo una composición menos reactógena donde el QS21 se desactiva concolesterol como se describe en el documento WO 96/33739.

Una formulación que se puede usar en formulaciones de la presente invención, que comprende QS21 3D-MPL y tocoferol, por ejemplo en una emulsión de aceite en agua, se describe en el documento WO 95/17210.

Otra formulación coadyuvante que se puede usar en formulaciones de la presente invención es QS21, 3D-MPL y CpG o equivalente de las mismas, por ejemplo en una emulsión de aceite en agua o como una formulaciónliposómica.

De acuerdo con ello en una realización de la presente invención hay proporcionada una vacuna que comprende unaproteína de fusión o una proteína pareja de fusión como se describe en el presente documento y un coadyuvante,por ejemplo como se describe anteriormente.

Combinación de PRAME y MAGE

En una realización de la presente invención se proporciona una composición que comprende (a) un componente deantigénico que comprende un antígeno PRAME o proteína de fusión como se describe en el presente documento y

(b) un componente antigénico que comprende un antígeno MAGE o proteína de fusión como se describe en elpresente documento. En una realización, la composición puede comprender adicionalmente un coadyuvante comose describe en el presente documento.

El antígeno MAGE para usar en la combinación puede comprender el antígeno MAGE de longitud total.Alternativamente, el antígeno MAGE puede comprender una parte inmunogénica de MAGE en la que 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9, 10 o más aminoácidos se pueden eliminar de o sustituir en la secuencia de aminoácidos. En una realizaciónde la presente invención, se pueden borrar 2 aminoácidos del extremo N-terminal de la secuencia MAGE. En una realización de la presente invención en la que el antígeno es MAGE-A3 o una parte inmunogénica del mismo, lasecuencia de MAGE-A3 puede ser del aminoácido 3 al 314 de MAGE-A3.

Para la combinación descrita anteriormente, bien uno o bien ambos de los antígenos de PRAME y/o MAGE puedenser parte de una proteína o proteínas de fusión como se describe en el presente documento, o los antígenos puedenestar presentes en otras proteínas de fusión o se pueden presentar como antígeno solo.

En una realización de la presente invención se proporciona una composición que comprende una proteína de fusiónque comprende un antígeno PRAME y proteína pareja de fusión como se describe en el presente documento y unaproteína de fusión que comprende un antígeno MAGE-A3 y proteína pareja de fusión como se describe en elpresente documento. En una realización alternativa, la proteína de fusión que comprende el antígeno MAGE-A3comprende o consiste en el antígeno MAGE-A3 y una proteína pareja de fusión que comprende aproximadamentelos primeros 109 aminoácidos de proteína D, en los que están opcionalmente sustituidos uno o dos o más aminoácidos de la proteína D, y en los que la secuencia señal de proteína D está opcionalmente presente, ademásde los primeros 109 aminoácidos de proteína D.

Las proteínas de fusión de la presente invención pueden comprender adicionalmente opcionalmente uno o másaminoácidos como “engarces” entre las secuencias del antígeno y la proteína pareja de fusión o entre el antígeno y una marca de His, si está presente. Los aminoácidos pueden no estar relacionados con las secuencias del antígenoy/o pareja de fusión.

5 Las proteínas de fusión de la presente invención, como se describen en el presente documento, pueden comprender adicionalmente los aminoácidos Met-Asp-Pro en el extremo N-terminal de la secuencia de la proteína de fusión. Elaminoácido Met puede ser de la secuencia de la proteína D original o puede ser de una secuencia no relacionada.

En una realización, la secuencia de una proteína de fusión que comprende MAGE-A3 y proteína D para usar en lapresente invención se muestra en la Figura 12 y la SEC ID N.º: 43.

10 La presente invención también se extiende a procedimientos de preparar dichas vacunas/composiciones.

EJEMPLOS

Se prepararon cuatro constructos de fusión y se referirán en el presente documento como ejemplos/constructos 1, 2, 3 y 4. Se preparó un constructo de codón optimizado a partir del ejemplo 3 y se designó como ejemplo 3a en elpresente documento. Se preparó un constructo de codón optimizado a partir del ejemplo 4 y se designó como

15 ejemplo 4a en el presente documento.

En los ejemplos 3a y 4a la secuencia con respecto a la parte de la proteína D de la molécula es la misma. Sinembargo, se modificaron ciertos codones en la región de PRAME, mejorando adicionalmente la expresión y, en elejemplo 3a, el engarce entre PRAME y la marca de His se ha eliminado.

TABLA A Estructuras de Proteína de Fusión y Detalles de Plásmidos de los Ejemplos/Constructos 1 a 4

N-terminal --------------------------------------------------------------------------------------C-Terminal

Ejemplo/ Constructo N.º

aminoácidos insertados mediante procesode clonación pareja de fusión antígeno de cáncer Secuencia de aminoácidos de engarce/marca de His plásmido usado

1

MDP 20-127 deproteína D PRAME TSGHHHHHH TCMP14

2

MDP 20-127 deproteína D PRAME -TCMP14

3

MDP 20-127 deproteína D PRAME LEHHHHHH pET21

4

MDP 20-127 de proteína D PRAME -pET21

3a

MDP 20-127 deproteína D PRAME HHHHHH pET26

4a

MDP 20-127 deproteína D PRAME -pET26

Las proteínas de fusión de los ejemplos anteriores comprenden los aminoácidos 20-127 de la proteína D. Los aminoácidos Met, Asp y Pro están incluidos en el extremo N-terminal del fragmento de proteína D (es deciraminoácidos MDP-20-127 de proteína D). Se piensa que estos tres aminoácidos adicionales pueden ayudar a laestabilidad de la proteína y/o incrementar el nivel de la expresión de proteína de los mismos. El aminoácido 127 de la proteína D se condensa al extremo N-terminal de PRAME de longitud total (es decir el aminoácido 127 de proteínaD se condensa al extremo N-terminal de PRAME). Se incluyó una marca marcadora de histidina, ayudando a la purificación, en tres de las seis proteínas. La secuencia exacta de la marca es dependiente del plásmido usado.

Se construyeron tres tipos diferentes de plásmidos, TCMP14 y pET21 o pET26: para cada plásmido, se incluyó elADN que codifica la proteína de fusión con o sin una marca de histidina.

A menos que se establezca lo contrario la siguiente estrategia general se usó en la preparación de cada uno de losejemplos.

Estrategia de clonación para la generación de proteína recombinante PD1/3-PRAME (con o sin marca de His) que usa vector TCMP14:

La amplificación de las secuencias presentadas en el plásmido TCMP14 se hizo usando una estrategia de PCR detres etapas. El vector pHIC348 que contiene la secuencia de ADN que codifica el gen de la proteína D entero se haobtenido del Dr. A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmö General Hospital,Malmö, Suecia. La secuencia de ADN de proteína D se ha publicado por Janson y col. (1991) { Janson H, LO Heden, A Grubb, M Ruan, & A Forsgren. 1991. Infect Immun 59:119-125}. El vector de expresión pMG81 es un derivado de pBR322, en el que se introdujeron los elementos de control derivados del bacteriófago A para transcripción y traducción de genes insertados foráneos (Shatzman y col., 1983) {Shatzman A, YS Ho, & M Rosenberg. 1983. Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) páginas 1-14. Academic NY}. Además, el gen de resistencia a ampicilina se intercambió con el gen de resistencia a kanamicina. La secuencia quecodifica para la parte de proteína NS1 (aminoácidos 4 a 81) se sustituyó por múltiples sitios de clonación lograndopMG81 MCS. La secuencia que codifica para el 1/3 de proteína D (aminoácidos 20 a 127) se clonó dentro de pMG81MCS usando sitios de restricción de BamHI y NcoI consiguiendo pMG81-1/3PD. Primero, la amplificación por PCRde la sección que corresponde a los aminoácidos 20-127 de la proteína D se hizo usando vector pMG81-1/3PDcomo plantilla y oligonucleótido de polaridad positiva:

5’ ATA TAA CAT ATG GAT CCA AGC AGC CAT TCA TCA AAT 3’ (CAN008; SEC ID N.º: 18) y antisentido:

5’ CCA CAA ACG CCT TCG TTC CAT GGT TTC AAA GTT TTC TGT C 3’ (CAN037; SEC ID N.º: 19).

El cADN de PRAME obtenido del Ludwig Institute, Bruselas, Bélgica se insertó en los sitios Bstx1-Not1 del vectorpCADN1 (Invitrogen) generando vector recombinante pCADN-1-PRAME. La amplificación por PCR de la secciónque corresponde a aminoácido de la proteína PRAME se hizo usando vector de pcADN-1-PRAME (GSKBio) comoplantilla y oligonucleótido de polaridad positiva:

5’ GAC AGA AAA CTT TGA AAC CAT GGA ACG AAG GCG TTT GTG G 3’ (CAN036; SEC ID N.º: 20) y

antisentido:

5’ AGA GAG ACT AGT CTA GTT AGG CAT GAA ACA GGG GCA CAG 3’ (CAN029; SEC ID N.º: 21) o

5’ GGA GGA ACT AGT GTT AGG CAT GAA ACA GGG GCA CAG 3’ (CAN002; SEC ID N.º: 22) dependiendo de si se añadió (CAN002) o no (CAN029) una marca de His .La secuencia final de PRAME insertada en el plásmidode TCMP14 se obtuvo tras amplificaciones por PCR usando las plantillas de gen de 1/3PD y de gen de FRAMEque se generan en las etapas preliminares para plantilla y oligonucleótido de polaridad positiva: CAN008, yantisentido: CAN029 o CAN002 dependiendo si estuvo presente una marca de His (CAN002) o no (CAN029). Se añadieron también los sitios Ndel en los sitios del extremo 5’ y SpeI en el extremo 3’ para clonación delfragmento dentro del vector de TCMP14.

Construcción del diseño del vector para expresar la proteína recombinante 1/3PD-PRAME con o sin proteínarecombinante de marca de His usando vector pET21:

Se usaron un plásmido de cADN recombinante llamado pcADN1-PRAME (como se describe en la estrategia previa)que contiene la secuencia que codifica para el gen PRAME y el vector PMG81-1/3PD (como se describe en laestrategia previa) que contiene la parte N-terminal de la secuencia codificante de la proteína D. La estrategia declonación incluyó las siguientes etapas.

a) Primero, la secuencia de 1/3PD sin señal de secreción (secuencia secreción o señal) se amplificó por PCR a

partir de plásmido PMG81-1/3PD usando el oligonucleótido de polaridad positiva: 5’

AGAGAGCATATGAGCAGCCATTCATCAAATATGGCG (CAN040; SEC ID N.º: 22), y el antisentido:

5’ ACGTGGGCGGCCGCGGTTTCAAAGTTTTCTGTCATTTCTAA (CAN032; SEC ID N.º: 23);

se añadieron también los sitios Nde1 del extremo 5’ y Not1 en el extremo 3’ para clonación del fragmento dentro

del vector pET21b(+).

b) La secuencia de PRAME se amplificó por PCR a partir de plásmido pcADN1-PRAME usando el

oligonucleótido de polaridad positiva:

5’ TTGTTGGCGGCCGCAATGGAACGAAGGCGTTTGTGGGGT (CAN033; SEC ID N.º: 25), y el antisentido:

5’ GGAGGACTCGAGGTTAGGCATGAAACAGGGGCACAG (CAN034; SEC ID N.º: 26); se añadierontambién los sitios Not1 en el extremo 5’ y Xho1 en sitios del extremo 3’ para clonación del fragmentodentro del vector pET21b. Esta amplificación dio como resultado la adición en la parte C-terminal de laproteína de dos aminoácidos, Leu y Glu, seguidos por 6 His en el plásmido pET21b(+). Para la generaciónde la proteína sin marca de His, se añadió un codón de parada (TAG) en el extremo 3’ del gen de PRAMEusando CAN033 y CAN035 (antisentido: 5’ GGAGGACTCGAGCTAGTTAGGCATGAAACAGGGGCACAG (CAN035; SEC ID N.º: XX)) en vez de CAN033 y CAN034.

c) Clonación dentro de plásmido pET21b(+) (Invitrogen) de los fragmentos amplificados anteriores.

d) Eliminación de sitio Not1 entre 1/3PD y PRAME usando Kit de Mutagénesis Dirigida a Sitio QuikChange II(Stratagene) y el oligonucleótido de polaridad positiva:

5’ CAGAAAACTTTGAAACCATGGAACGAAGGCG (CAN106; SEC ID N.º: XX), y el antisentido:

5’ cgccttcgttccatggtttcaaagttttctg (CAN107; SEC ID N.º: XX).

e) Adición de dos aminoácidos Asp y Pro tras el Met en posición 1 en el N-terminal de 1/3 de la proteína Dmediante mutagénesis y usando el oligonucleótido de polaridad positiva:

5’ GGAGATATACATATGGATCCAAGCAGCCATTCATCAAATATGG (CAN104; SEC ID N.º: XX) y el antisentido:

5’ CCATATTTGATGAATGGCTGCTTGGATCCATATGTATATCTCC (CAN105; SEC ID N.º: XX).

Construcción del diseño de vector para expresar la proteína recombinante 1/3PD-PRAME de coón optimizado (sin o con marca de His) en vector pET26:

El gen PRAME experimentó optimización de codón y se clonó en armazón de pGA4 con la adición de sitios Not1 y Xho1 en el extremo 5’ y el extremo 3’ del gen optimizado respectivamente.

Este plásmido, llamado 0606420pGA4, se usó para clonar el gen en fusión con el PD1/3 en el vector pET26 usandolas siguientes etapas.

a) Eliminación del fragmento Not1 / Xho1 que corresponde a la secuencia de PRAME optimizada con un codónde parada en el extremo 3’ del gen del plásmido 0606420pGA4.

b) Clonación del fragmento de PRAME optimizado dentro de un plásmido pET26b(+) que contiene el Nde1/Not1 clonado previamente de 1/3PD con oligonucleótidos CAN040 y CAN032 como se describe anteriormente y dondelos aminoácidos Asp y Pro se añadieron en la parte N-terminal mediante procedimiento de mutagénesis con oligonucleótidos CAN104 y CAN105.

c) Eliminación del sitio Not1 mediante mutagénesis con oligonucleótidos: de polaridad positiva

5’ GACAGAAAACTTTGAAACCATGGAACGTCGTCGTCTGTGG (CAN123; SEC ID N.º: XX) y antisentido

5’ CCACAGACGACGACGTTCCATGGTTTCAAAGTTTTCTGTC (CAN124; SEC ID N.º: XX). Esto dio como resultado la proteína de fusión de codón optimizado 1/3PD-PRAME sin marca de His.

d) El plásmido se usó después como una plantilla para la generación de 1/3PD-PRAME de codón optimizado con plásmido de 6 His. La amplificación por PCR de la proteína de fusión se hizo con oligonucleótidos de polaridad positiva

5’ GGAATTCCATATGGATCCAAGCAGCCATTC (CAN199; SEC ID N.º: XX) y un

5’ GGAGCTCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCGGCATAAAGCACGGGC (CAN198; SEC ID N.º:XX); se añadieron también los sitios Nde1 en el extremo 5’, Xho1 en el extremo 3’ seguidos por 6 His y un codón de parada para la clonación del fragmento dentro del vector de pET26b(+).

e) Clonación del fragmento amplificado en plásmido pET26b(+) de Invitrogen.

Para la producción de la proteína de fusión, se ha clonado el constructo de ADN dentro del vector de expresión TCMP14. Este plásmido utiliza señales del ADN del fago lambda para dirigir la transcripción y traducción de genes foráneos insertados. El vector contiene el promotor PL lambda, el operador OL y dos sitios de utilización (NutL y NutR) para mitigar los efectos de polaridad transcripcional cuando se proporciona la proteína N (Gross y col., 1985.Mol. & Cell. Biol. 5:1015).

El plásmido que expresa la proteína de fusión pD-PRAME se diseñó de forma que los aminoácidos de PRAME seañadieron a la parte C-terminal de un derivado de 108 aminoácidos de pD sin su secuencia señal (secuencia desecreción o secuencia señal) (es decir restos 20-127). A esta construcción, se añadieron tres aminoácidos norelacionados (Met y Asp y una prolina) en el extremo N-terminal del derivado de pD, y para ciertas construcciones seincluyó una marca de His en el extremo C-terminal de los aminoácidos de PRAME (véase tabla A anteriormente).Este constructo podría describirse alternativamente como derivado que contiene 109 aminoácidos de pD, si la MetN-terminal se considera que viene de la secuencia de pD.

Cepa del Huésped y Transformación

Se transformaron los huéspedes de cepa de E. coli AR58 (Mott y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82, páginas88-92, enero de 1985, Biochemistry) con ADN plasmídico para ejemplos/ constructos 1 y 2.

La cepa de E. coli lisogénica AR58 usada para la producción de Ejemplos/constructos 1 y 2 es un derivado de la cepa K12 N99 de E.coli NIH estándar (F-su-galK2, lacZ-thr-). Ella contiene un fago lambda lisogénico defectivo(galE::TN10, 1 Kil-cI857 DH1). El fenotipo Kil-evita el término de la síntesis macromolecular del huésped. Lamutación cI857 confiere una lesión sensible a temperatura al represor cI. La deleción de DH1 elimina el operónderecho del fago lambda y los locis bio, uvr3, y chlA del huésped. La cepa AR58 se generó mediante transducciónde N99 con una reserva de fago lambda P previamente dejada crecer en un derivado de SA500 (galE::TN10, 1 KilcI857 DH1). Se seleccionó la introducción del lisógeno defectivo dentro de N99 con tetraciclina en virtud de la presencia de un transposón de TN10 que codifica para la resistencia a tetraciclina en el gen galE adyacente. N99 y SA500 son cepas K12de E. coli derivadas del laboratorio del Dr. Martin Rosenberg en el National Institutes of Health.

Los vectores que contienen el promotor PL, se introducen dentro de un huésped lisogénico E. coli estabilizando el ADN plasmídico. Las cepas de huésped lisogénico contienen ADN del fago lambda defectivo en replicaciónintegrado dentro del genoma (Shatzman y col., 1983; en Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed)páginas 1-14. Academic Press NY). El ADN del fago lambda dirige la síntesis de la proteína represora cl que se uneal represor OL del vector y evita la unión de RNA polimerasa al promotor de PL y de este modo la transcripción delgen insertado. El gen de cI de la cepa de expresión AR58 contiene una mutación sensible a temperatura tal que latranscripción dirigida a PL se puede regular mediante cambio de temperatura, es decir un incremento en la temperatura de cultivo inactiva el represor y se inicia la síntesis de la proteína foráneas. Este sistema de expresiónpermite la síntesis controlada de proteínas foráneas especialmente de aquellas que pueden ser tóxicas para la célula(Shimataka & Rosenberg, 1981. Nature 292:128).

Los huéspedes de cepa de E. coli BLR (DE3) Novagen, WI, EE.U.U. (número de catálogo: 69053-4) BLR (DE3)Novagen, WI, USA (número de catálogo: 69053-4), BLR es un derivado recA de BL21 que incrementa los rendimientos de monómeros de plásmidos y puede ayudar a estabilizar plásmidos objetivo que contienen secuenciasrepetitivas o cuyos productos pueden causar la pérdida del profago DE3 (1, 2), se transformaron con ADN deplásmidos de los ejemplos/constructos 3 y 4.

Cada una de las transformaciones se llevó a cabo mediante procedimientos estándar con células tratadas con CaCl2 (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » en Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985):

p. 109-135.).

Crecimiento e inducción de cepa del huésped bacteriano

• Cultivo

Las bacterias se dejaron crecer en 20 ml de caldo (BD) de Luria-Bertani (LB) + glucosa al 1% (p/v) (LaboratoireMAT, número de catálogo: GR-0101) + antibiótico (100 µg/ml de carbenicilina para pET21b, 40 µg/ml de kanamicinapara TCMP14). Se incubaron cultivos a 33°C, para células AR58 y a 37°C, para células BLR (DE3) hasta una

D.O.600 nm alrededor de 0,8.

• Inducción

A D.O. 600 nm alrededor de 0,8, los cultivos BLR (DE3) se indujeron a �-D-1-tiogalactopiranósido de isopropilo 1 mM(IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815) y se incubaron durante 2 horas o 3 horas a 37°C aunque la solubilidad se puede incrementar si se usa una temperatura menor.

A D.O. 600 nm alrededor de 0,8, los cultivos AR58 se indujeron mediante activación por calor a 37°C y se incubaron durante 7 horas.

El crecimiento bacteriano fue adecuado para los dos sistemas de expresión.

• Extracción y Purificación de la Proteína

Tras la expresión del polipéptido en cultivo, las células se recogen típicamente mediante centrifugación después serompen por medios físicos o químicos (si el polipéptido expresado no es secretado al medio) y el extracto en brutoresultante se retiene para aislar el polipéptido de interés. El Reactivo de Extracción de Proteínas BugBusterTM se usa bajo condiciones recomendadas por los suministradores (Novagen).

Purificación de Proteína PD1/3-Prame-his

Se resuspendió pasta de células de E. coli en tampón de Tris 20 mM de pH 8,5 después se hizo pasar a través desistema homogeneizador (Panda de Niro Soavi S.p.A. -2 pases – 75000000 pascales (750 bar)). Después de adición de MgCl2 2 mM y Benzonasa (50 U/ml), se incubó el homogenado 1 hora a temperatura ambiente (TR) bajoagitación suave después se centrifugó 30 minutos a 15900 g y TR. El sedimento resultante se resuspendió entampón de Tris 20 mM a pH 8,5 que contiene dodecil sulfato sódico (SDS) al 1% y glutatión 60 mM y se incubó 30minutos a TR bajo agitación suave. Después de 30 minutos de centrifugación a 15900 g y TR, se eliminó el sedimento.

El sobrenadante de centrifugación se diluyó 10 veces en tampón de Tris 20 mM que contiene urea 6,66 M, cloruro desodio 0,333 M (NaCl) e imidazol 11,11 mM y después se sometió a separación cromatográfica en una columna deafinidad con ion metálico de níquel (Sefarosa IMAC 6 FF -GE Healthcare) equilibrada en un tampón de Tris 20 mM de pH 8,5 que contiene SDS al 0,1%, urea 6,0 M, NaCl 0,3 M e imidazol 10 mM. Después del lavado de la columnacon tampón de Tris 20 mM de pH 8,5 que contiene sarcosilo al 0,5%, urea 6,0 M, NaCl 0,3 M e imidazol 10 mM, seeluyó el antígeno de la columna incrementando la concentración de imidazol hasta 40 mM en el mismo tampón delavado. Después de la adición de fosfato hasta 50 mM, se hizo pasar el eluato positivo en antígeno a través de unacolumna de Hidroxiapatita Cerámica para Macro-Prep de tipo II (Bio-Rad) equilibrada en un tampón de Tris 20 mM a pH 8,5 que contiene fosfato 50 mM, sarcosilo al 0,5%, urea 6,0 M y NaCl 0,3 M. El flujo través de hidroxiapatita que contenía el antígeno se diafiltró frente a tampón de borato 5 mM de pH 9,8 que contenía sacarosa al 3,15% en una membrana Omega de 30 kDa (Pall). El retentato de ultrafiltración se esterilizó mediante filtración a través de unamembrana de acetato de celulosa de 0,45/0,22 µm (Sartorius). El material purificado se almacenó a –70°C.

Se ha usado también un proceso de purificación alternativo, que difiere del anterior proceso en las siguientes etapas:

-

Sin tratamiento con benzonasa

-

Sin cambio de SDS a sarcosilo en columna IMAC (SDS de extracción hasta la etapa HA)

-

El tampón usado para la diafiltración fue tampón de Tris 5 mM de pH 8,5 -arginina 0,5 M.

Este proceso de purificación alternativo dio como resultado eliminación de SDS incompleta con valor residualalrededor del 0,05% y el 0,085%.

• Purificación

Las proteínas recombinantes expresadas se purificaron a partir de fracciones de sobrenadante obtenidas despuésde centrifugación de E. coli inducida usando una resina de quelación de metales His Binol(QIAgen, Chatsworth, CA)de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la resina.

Caracterización de la Proteína

SDS-Page:

Gel: gel de Bis-Tris al 4-12% de NuPAGE 15 ó 26 pocillos1,0 mm (número de catálogo de Invitrogen: NP0323BOX)

Véanse figuras 1 y 2 más adelante, que muestran análisis por SDS page de ejemplo 3 y 4 y 3a y 4arespectivamente, en las que las proteínas 1/3pD-PRAME recombinantes diferentes con o sin marca de His migransobre el gel a un peso molecular aparente de �70 kDa. Las proteínas recombinantes se encuentran como cuerpos de inclusión en el lisado de células de E. coli, después de inducción.

La preparación de muestras, tampones y condiciones de migración se realizaron bajo condiciones recomendadaspor los suministradores (Invitrogen). Se cargaron 10 µl de todas las preparaciones (antes de inducción (BI) y después de inducción (AI)) en pocillos que corresponden a 100 µl de equivalente de cultivo.

Leyenda de la fig. 1: análisis por SDS page después de tinción con azul de Coomassie de 1/3PD-PRAME recombinante después de inducción con IPTG de cepa BLR DE3 de E. coli transformada con pET21 recombinante.

Se ha cargadoen gel unequivalente de 100 1l decultivo despu

és de 2 horas de inducción en cepa BLR DE3 conIPTG 1 mM a 25, 30 ó 37°C. Clon nº3 (1/3PD-PRAME / pET21) y Clon nº4 (1/3PD-PRAME-His / pET21) estánpresentes en gel antes (BI) y después (AI) de inducciones en fracciones soluble (sobrenadante) y no soluble(sedimento). Carriles 1 y 10: pretinción de Intervalo Amplio Estándar (BioRad Cat nº161-0318), carril 2 (clon nº3, BI,sobrenadante), carril 3 (clon nº 3, BI, sedimento), carril 4 (clon nº 3, AI, 25°C, sobrenadante), carril 5 (clon nº 3, AI,25°C, sedimento), carril 6 (clon nº 3, AI, 30°C, sobrenadante), carril 7 (clon nº 3, AI, 30°C, sedimento), carril 8 (clonnº 3, AI, 37°C, sobrenadante), carril 9 (clon nº 3, AI, 37°C, sedimento), carril 11 (clon nº 4, BI, sobrenadante), carril12 (clon nº 4, BI, sedimento), carril 13 (clon nº 4, AI, 25°C, sobrenadante), carril 14 (clon nº 4, AI, 25°C, sedimento),carril 15 (clon nº 4, AI, 30°C, sobrenadante), carril 16 (clon nº 4, AI, 30°C, sedimento), carril 17 (clon nº 4, AI, 37°C,sobrenadante), carril 18 (clon nº 4, AI, 37°C, sedimento).

Leyenda de la figura 2: análisis por SDS page después de tinción con azul de Coomassie de 1/3PD-PRAMErecombinante después de inducción con IPTG de cepa BLR DE3 E. coli transformada con pET26 recombinante. Un equivalente de 100 1l de cultivo después de 2 horas de inducción en cepa BLR DE3 con IPTG 1 mM a 25, 30 o 37°Cse ha cargado en gel. Clon nº 3a (1/3PD-PRAME de codón optimizado / pET26) y Clon nº 4a (1/3PD-PRAME-His decodón optimizado / pET26) están presentes en gel antes (BI) y después (AI) de inducciones en fracciones soluble(sobrenadante) y no soluble (sedimento). Carriles 2 y 10: pretinción de Intervalo Amplio Estándar (BioRad Cat nº161-0318), carril 1 (clon nº 3a, BI, sobrenadante), carril 3 (clon nº3a, BI, sedimento), carril 4 (clon #3a, AI, 25°C,sobrenadante), carril 5 (clon #3a, AI, 25°C, sedimento), carril 6 (clon nº 3a, AI, 30°C, sobrenadante), carril 7 (clon nº3a, AI, 30°C, sedimento), carril 8 (clon nº 3a, AI, 37°C, sobrenadante), carril 9 (clon nº 3a, AI, 37°C, sedimento), carril 11 (clon nº 4a, BI, sobrenadante), carril 12 (clon nº 4a, BI, sedimento), carril 13 (clon nº4a, AI, 25°C, sobrenadante),carril 14 (clon nº 4a, AI, 25°C, sedimento), carril 15 (clon nº 4a, AI, 30°C, sobrenadante), carril 16 (clon nº 4a, AI,30°C, sedimento), carril 17 (clon nº 4a, AI, 37°C, sobrenadante), carril 18 (clon nº 4a, AI, 37°C, sedimento).

Transferencia Western

Las membranas se bloquearon durante 30 minutos a 37°C, 60 RPM usando solución reciente de leche al 3%/PBS1X. Después de la incubación de bloqueo, se añadieron los anticuerpos primarios (anti-PRAME de conejo; GSKBiologicals S.A.) a dilución 1:5000 o marca de His a-6X (AbCam) a dilución 1:3000 en solución reciente de leche al 3%/PBS 1X durante 1 hora a 37°C, 60 RPM. Después de eso, las membranas se lavaron tres veces 5 minutos atemperatura ambiente usando Tween20 al 0,02%/PBS 1X. Se añadieron anticuerpos secundarios (anti-IgG (H+L) de conejo de asno perox (Jackson laboratory)) a dilución 1:20000 usando solución reciente de leche al 3%/PBS 1X. Se incubaron las membranas durante 1 hora a 37°C, 60 RPM. Después de eso, se lavaron tres veces las membranas 5minutos a temperatura ambiente usando Tween20 al 0,02%/PBS 1X antes de las exposiciones de membranas asustrato de peroxidasa (KH2PO4, 10 mM; (NH4)2SO4, 10 mM; O-dianisidina, al 0,01% y peróxido de hidrógeno al0,045%) o sustrato de fosfatasa alcalina (Sigma Fast) siguiendo las recomendaciones del suministrador.

Análisis molecular:

Ejemplo/constructo 1

Análisis

Proteína Completa

Longitud

629 aa

Peso Molecular

71629,96 p.m.

1 microgramo =

13,961 pMoles

Coeficiente de

67680

Extinción Molar

1 A[280] a

1,06 mg/ml

Corr. a

A[280] de 1 mg/ml

0,94 UA

Punto isoeléctrico

6,41

Carga a pH 7

-5,84

Ejemplo/constructo 2

Análisis

Proteína

Completa

Longitud

620 aa

Peso Molecular

70561,90 p.m.

1 microgramo =

14,172 pMoles

Coeficiente de

67680

Extinción Molar

1 A[280] a

1,04 mg/ml

Corr. a

A[280] de 1 mg/ml

0,96 UA

Punto isoeléctrico

6,28

Carga a pH 7

-6,36

10 Ejemplo/constructo 3 (continuación)

Análisis

Proteína Completa

Longitud

628 aa

Peso Molecular

71627,01 p.m.

1 microgramo =

13,961 pMoles

Coeficiente de Extinción Molar

67680

Ejemplo/constructo 4

1 A[280] a

1,06 mg/ml

Corr. a

A[280] de 1 mg/ml

0,94 UA

Punto isoeléctrico

6,34

Carga a pH 7

-6,84

Análisis

Proteína Completa

Longitud

620 aa

Peso Molecular

70561,90 p.m.

1 microgramo =

14,172 pMoles

Coeficiente de

67680

Extinción Molar

1 A[280]

1,04 mg/ml

Corr. a

A[280] de 1 mg/ml

0,96 UA

Punto isoeléctrico

6,28

Carga a pH 7

-6,36

5 Ejemplo 5

Evaluación de la producción de proteínas con o sin la señal de secreción (secuencia de secreción o secuencia señal) de 1/3 de la proteína D en la proteína de fusión.

Tabla B

Proteína Nivel de Expresión

PD1/3-PRAME con señal de secreción (SS) +

PD1/3-PRAME sin señal de secreción (SS) +++

Fig. 11: análisis por SDS page después de tinción por azul de Coomassie de 1/3PD-PRAME recombinante con o sin

10 señal de secreción después de inducción con IPTG de cepa BL21 DE3 E. coli transformada con pET21 recombinante. Se ha cargado sobre gel un equivalente de 100 1l de cultivo después de 3 horas de inducción encepa BL21 DE3 con IPTG 1 mM a 37°C. Aquellos constructos se presentan en gel antes (BI) y después (AI) deinducciones en fracciones soluble (sobrenadante) y no soluble (sedimento). Carril 1: pretinción de Intervalo AmplioEstándar (BioRad Cat161-0318), carril 2 (pD1/3-PRAME + SS, BI, sobrenadante), carril 3 (pD1/3-PRAME + SS, BI,

15 sedimento), carril 4 (pD1/3-PRAME + SS, AI, sobrenadante), carril 5 (pD1/3-PRAME + SS, AI, sedimento), carril 6 (pD1/3-PRAME + SS + His, BI, sobrenadante), carril 7 (pD1/3-PRAME + SS + His, BI, sedimento), carril 8 (pD1/3-PRAME + SS + His, AI, sobrenadante), carril 9 (pD1/3-PRAME + SS + His, AI, sedimento), carril 10 (pD1/3-PRAMEsin SS, BI, sobrenadante), carril 11 (pD1/3-PRAME sin SS, BI, sedimento), carril 12 (pD1/3-PRAME sin SS, AI, sobrenadante), carril 13 (pD1/3-PRAME sin SS, AI, sedimento), carril 14 (pD1/3-PRAME sin SS + His, BI,

20 sobrenadante), carril 15 (pD1/3-PRAME sin SS + His, BI, sedimento), carril 16 (pD1/3-PRAME sin SS + His, AI, sobrenadante), carril 17 (pD1/3-PRAME sin SS + His, AI, sedimento).

Ejemplo 6: Inmunogenicidad de PD-PRAME-His formulada en AS01B o AS15: intervalo de dosis de antígenoen una dosis constante de coadyuvante.

Propósito: intervalo de dosificación de antígeno para seleccionar la mejor dosis a usar en experimentos preclínicos

25 Protocolo:

6 grupos de 12 ratones CB6F1 recibieron inyecciones intra-musculares (IM) en el día 0 y el día 14 de:

1.

PBS

2.

PRAME (50* µg) en AS01B o AS15

3.

PRAME (10 µg) en AS01B o AS15

4.

PRAME (2 µg) en AS01B o AS15

5.

PRAME (0,4 µg) en AS01B o AS15

6.

PRAME (0,08 µg) en AS01B o AS15

* 44,7 µg realmente administrados en lugar de la dosis pretendida de 50 µg

AS01B es una formulación coadyuvante liposómica que comprende QS21 y 3D-MPL; AS15 es una formulacióncoadyuvante liposómica que comprende QS21, 3D-MPL y CpG.

El constructo usado en este ejemplo era ejemplo/constructo 3a (pET26 con una marca de His), proporcionado entampón de Tris 5 mM de pH 8.5 -Arginina 0,5 M. La proteína proporcionada en un tampón borato con sacarosa se puede usar también.

Lecturas:

• Tinción de Citoquina Intracelular (ICS) 14 días tras 2 inyecciones después de restimulación in vitro de células del bazo (4 reservas de 3 ratones por grupo) con la reserva de péptidos PRAME a 1 µg/ml/péptido (15-mero)

Respuesta de CD4 (coadyuvante AS01B) Se muestran resultados de ICS para citoquinas CD4 para el coadyuvante AS01B en la figura 3. En este experimento se puede concluir que la mejor dosis de antígeno PRAME para inducir una respuesta de CD4 en AS01B bajo estas condiciones parece ser 2 µg.

Respuesta de CD8 (coadyuvante AS01B)

Se muestran resultados de ICS para citoquinas CD8 para el coadyuvante AS01B en la figura 4. Los datos parecen mostrar una respuesta de CD8 muy baja y una heterogeneidad de la respuesta intra-grupo. Respuesta de CD4 (coadyuvante AS15) Se muestran resultados de ICS para citoquinas CD4 para el coadyuvante AS15 en la figura 5. Estos datos parecen

mostrar que se indujo una respuesta de CD4 similar con 44 1g, 10 1g, 21g Y0,, Ig de PRAME formulado en AS15; con una respuesta decrecida inducida con 0,08 µg de PRAME

Respuesta de CD8 (coadyuvante AS15) Se muestran resultados de ICS para citoquinas CD8 para el coadyuvante AS15 en la figura 6. Estos datos parecen no mostrar ninguna respuesta de CD8 (valor de fondo en el grupo de PBS)

Ejemplo 7

En resumen, para las invenciones descritas en el presente documento, se puede usar el siguiente sumario paradescribir constructos específicos de PD1/3-PRAME que se han generado hasta el momento:

Constructos usados para PD1/3-PRAME

-No se incluye ninguna secuencia señal de proteína D (aminoácidos 2 a 19 de proteína D) -Se incluye la metionina de proteína D (AA 1 de la proteína D) -Dos AA no relacionados (Asp y Pro) sustituyen a los aminoácidos Lys-2 y Leu-3 de proteína D -Se incluyen los primeros 109 AA de proteína D después de la secuencia señal de proteína D (109 aminoácidos

que incluyen la primera Met en extremo N-terminal + AA20 a 127 de la proteína D) -Se incluyen AA 1 -509 de PRAME (secuencia original de longitud total de PRAME) -Con o sin una marca de His compuesta de uno de los siguientes:

•

Tres aminoácidos no relacionados (Thr, Ser y Gly) + 6 residuos de His para clonar en plásmido TCMP14; o

•

Dos aminoácidos no relacionados (Leu y Glu) + 6 residuos de His para clonar en plásmido de pET21; o

•

6 residuos de His para clonar en plásmido pET26.

Proteína pD1/3 -PRAME +/-marca de His :

pD 1/3

20 -127 PRAME 1 -509

Extremo N Terminal MDP

pD 1/3 PRAME C terminal

Extremo N Terminal MDP

pD 1/3 PRAME TSG 6xHis (en TCMP14) extremo C terminal

Extremo N Terminal MDP

pD 1/3 PRAME LE 6xHis (en pET21) extremo C terminal

M Extremo N Terminal MDP

pD 1/3 PRAME 6xHis (en pET26) extremo C terminal

Se muestra una secuencia de aminoácidos destacada de ejemplos de constructos de la presente invención en lafigura 7.

Se muestran alineaciones de los siguientes constructos en figuras 8, 9 y 10:

Alineación entre LipoD-MAGE3-His y D1/3-PRAME-His (figura 8)

Alineación entre la secuencia compartida de la proteína D original de Haemophilus influenzae y la LipoD-MAGE3-His (figura 9)

Alineación entre la secuencia compartida de la proteína D original de Haemophilus influenzae, la LipoD-MAGE3-His y la pD1/3-PRAME-His (figura 10).

Formulación de preparación de vacuna usando proteínas de fusión:

Las proteínas de fusión de la invención se pueden formular dentro de vacunas que bien están conducidas o bien no.En una realización, como un coadyuvante, la formulación puede comprender una mezcla de minofosforil lípido A 3des-O-acilado (3D-MPL) y QS21 en una emulsión de aceite en agua. El sistema coadyuvante SBAS2 se ha descritopreviamente en el documento WO 95/17210. El coadyuvante para usar en la presente invención puede comprender alternativamente monofosforil lípido A 3 de-O-acilado (3D-MPL), QS21 y CpG en una formulación de aceite en agua

o en una formulación liposómica.

3D-MPL: es un inmunoestimulante derivado del lipopolisacárido (LPS) de la bacteria gram-negativa Salmonella minnesota. MPL se ha desacilado y carece de un grupo fosfato en el resto de lípido A. Este tratamiento químicoreduce drásticamente la toxicidad mientras que mantiene las propiedades inmunoestimuladoras (Ribi, 1986).

Se cree que 3D-MPL combinada con diversos vehículos puede potenciar fuertemente tanto la inmunidad humoralcomo un tipo TH1 de inmunidad celular.

QS21: es una molécula de saponina natural extraída de la corteza del árbol sudamericano Quillaja saponaria Molina. Una técnica de purificación desarrollada para separar las saponinas individuales de los extractos en bruto de lacorteza, permitió el aislamiento de la saponina particular, QS21, que es un glicósido triterpeno que demuestra actividad coadyuvante más fuerte y toxicidad menor comparado con el componente parental. QS21 ha mostrado activar los CTL restringidos del MHC de clase I a Ag de varias subunidades, así como estimular proliferaciónlinfocítica específica de Ag (Kensil, 1992).

Se cree que puede haber un efecto sinérgico de combinaciones de MPL y QS21 en la inducción tanto de respuestasinmunes celulares de tipo TH1 como de respuestas inmunes humorales.

La emulsión de aceite en agua comprende una fase orgánica hecha de 2 aceites (un tocoferol y escualeno), y unafase acuosa de PBS que contiene Tween 80 como emulsionante. La emulsión comprendió escualeno al 5%tocoferol al 5% Tween 80 al 0,4% y tuvo un tamaño de partícula promedio de 180 nm y se conoce como SB62(véase documento WO 95/17210). Las gotitas del aceite resultante tendrían un tamaño de aproximadamente 180 nm.

El coadyuvante para usar en la presente invención se puede formular como una combinación de MPL y QS21, en una emulsión de aceite en agua o en una formulación liposómica. Esta preparación debería transportarse en vialesde 0,7 ml para mezclarse con antígeno liofilizado o proteína de fusión (viales que contienen de 30 a 300 µg deantígeno).

Se pueden usar también oligonucleótidos inmunoestimuladores. Los oligonucleótidos de ejemplo para usar en coadyuvantes o vacunas de la presente invención incluyen oligonucleótidos que contienen CpG, que contienengeneralmente dos o más motivos de dinucleótido CpG separados por al menos tres, más frecuentemente al menosseis o más nucleótidos. Un motivo de CpG es un nucleótido de citosina seguido por un nucleótido de guanina. Los oligonucleótidos CpG son típicamente desoxinucleótidos. En una realización el internucleótido en el oligonucleótido es fosforoditioato, o más preferiblemente un enlace de fosforotioato, aunque fosfodiéster y otros vínculos internucleótido están dentro del alcance de la invención. También están incluidos dentro del alcance de la invención oligonucleótidos con vínculos internucleótido mixtos. Procedimientos para producir oligonucleótidos de fosforotioato

o fosforotioato se describen en los documentos US 5.666.153, US 5.278.302 y WO 95/26204.

Ejemplos de oligonucleótidos son como sigue:

TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826; SEC ID N.º: 36)

TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758; SEC ID N.º: 37)

ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006; SEC

ID N.º: 38)

TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668; SEC ID N.º: 39)

TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456; SEC ID N.º: 40), las secuencias pueden contener enlaces internucleótido modificados por fosforotioato. Los oligonucleótidos CpG alternativos pueden comprender una o más secuencias anteriores en que tienen deleciones o adiciones a las mismas inconsecuentes. Los oligonucleótidos CpG se pueden sintetizar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica (por ejemplo

véase el documento EP 468520). Convenientemente, tales oligonucleótidos se pueden sintetizar utilizando un

sintetizador automatizado. En una realización de la presente invención una combinación coadyuvante para usar en la invención incluye uno omás de los componentes siguientes: 3D-MPL y QS21 (EP 0 671 948 B1); emulsiones de aceite en agua que comprenden 3D-MPL y QS21 (documento WO 95/17210, documento WO 98/56414); o 3D-MPL formulado con otrosvehículos (documento EP 0 689 454 B1). Otros sistemas coadyuvantes que se pueden usar en la presente invencióncomprenden una combinación de 3D-MPL, QS21 y un oligonucleótido CpG como se describe en los documentosUS6558670 y US6544518.

La vacuna final se puede obtener después de la reconstitución de la formulación liofilizada. Referencias:

1.

A. Roca (U. de Wisconsin), comunicación personal.

2.

Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219, 37–44.

3.

Jan H. Kesslera y col. The Journal of Experimental Medicine, volumen 193, número 1, 1 de enero de 2001 7388,

4.

Ikeda H et al Immunity, Feb; 6(2): 1997, 199-208

SEC ID N.º: 1

Secuencia de ADN para ejemplo 1

SEC ID N.º: 2 Secuencia de aminoácidos para ejemplo 1 SEC ID N.º: 3 Secuencia de ADN para ejemplo 2 SEC ID N.º: 4 SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS EJEMPLO 2 SEC ID N.º:5 Secuencia de ADN para ejemplo 3 SEC ID N.º: 6 Secuencia de aminoácidos: para ejemplo 3

SEC ID N.º: 7. Secuencia de ADN para ejemplo 4:

SEC ID N.º: 8 Secuencia de aminoácidos para ejemplo 4 SEC ID N.º: 9 Secuencia de ADN de codón optimizado para ejemplo 3a

SEC ID N.º: 10 Secuencia de aminoácidos para ejemplo 3a SEC ID N.º: 11 Secuencia de ADN de codón optimizado para ejemplo 4a

SEC ID N.º: 12 Secuencia de aminoácidos para ejemplo 4a

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> GlaxoSmithKline Biologicals S.A.

<120> Vacuna

<130> VB62293

<150> 0700760.2

<151> 15-1-2007

<150> 0701262.8

<151> 23-1-2007

<160> 45

<170> FastSEC para Windows Versión 4.0

<210> 1

<211> 1887

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> MDP-20-127 -Proteína D -PRAME – TSGHHHHHH (plásmido TCMP14)

<400> 1

5 <210> 2

<211> 629

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

10 <220>

<223> MDP-20-127 -Proteína D -PRAME – TSGHHHHHH (plásmido TCMP14)

<400> 2

<210> 3

<211> 1860

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> MDP-20-127 -Proteína D -PRAME -sin marca de His (plásmido TCMP14)

<400> 3

<210> 4 5 <211> 620

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> MDP-20-127 -Proteína D -PRAME -sin marca de His (plásmido TCMP14)

<400> 4

<210> 5

<211> 1884

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> MDP-20-127 -Proteína D -PRAME – LEHHHHHH (plásmido pET21)

<400> 5

<210> 6 5 <211> 628

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220> 10 <223> MDP-20-127 -Proteína D -PRAME – LEHHHHHH (plásmido pET21)

<400> 6

<210> 7

<211> 1860

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> MDP-20-127 -Proteína D -PRAME -sin marca de His(plásmido pET21)

10 <400> 7 <210> 8

<211> 620 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> MDP-20-127 -Proteína D -PRAME -sin marca de His(plásmido pET21) 10

<400> 8

<210> 9

<211> 1878

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> MDP-20-127 -Proteína D -PRAME -HHHHHH (plásmido pET26)

10 <400> 9 <210> 10

<211> 626 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> MDP-20-127 -Proteína D -PRAME -HHHHHH (plásmido pET26) 10

<400> 10

<210> 11

<211> 1860

<212> ADN 5 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> MDP-20-127 -Proteína D -PRAME -sin marca de His (plásmido pET26)

10 <400> 11 <210> 12

<211> 620 5 <212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> MDP-20-127 -Proteína D -PRAME -sin marca de His (plásmido pET26) 10

<400> 12

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13 <210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

15 <210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

20 <400> 16

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido de polaridad positiva CAN008

<400> 18

<210> 19

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido antisentido CAN037

<400> 19

<210> 20

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido de polaridad positiva CAN036

<400> 20

<210> 21

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido antisentido CAN029

<400> 21

<210> 22

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido antisentido CAN002

<400> 22

<210> 23

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido de polaridad positiva CAN040

<400> 23

<210> 24

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido antisentido CAN032

<400> 24

<210> 25

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido de polaridad positiva CAN033

<400> 25

<210> 26

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido antisentido CAN034

<400> 26

<210> 27

<211> 39

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido antisentido CAN035

<400> 27

<210> 28

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido de polaridad positiva CAN106

<400> 28 <210> 29

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido antisentido CAN107

<400> 29

<210> 30

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido de polaridad positiva CAN104

<400> 30

<210> 31

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido antisentido CAN105

<400> 31

<210> 32

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido de polaridad positiva CAN123

<400> 32

<210> 33

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido antisentido CAN124

<400> 33

<210> 34

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido de polaridad positiva CAN199

<400> 34

<210> 35

<211> 53

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido antisentido CAN19

<400> 35

<210> 36

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido inmunoestimulador CpG 1826

<400> 36

<210> 37

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido inmunoestimulador CpG 1758

<400> 37

<210> 38

<211> 54

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido inmunoestimulador CpG2006

<400> 38

<210> 39

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido inmunoestimulador CpG1668

<400> 39

<210> 40 <211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> oligonucleótido inmunoestimulador CpG5456

<400> 40

10 <210> 41

<211> 111

<212> PRT

<213> Haemophilus influenzae b

15 <400> 41

<210> 42

<211> 111

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> 1-Met, 2-Asp; 3-Pro; seguido por los aminoácidos 20 al 127 de la proteína D

<400> 42

<210> 43

<211> 450

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Proteína D-MAGE-A3-His

<400> 43

<210> 44

<211> 109

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Los aminoácidos de la proteína D de Haemophilus influenzae para usar en una secuencia pDI/3-PRAME-His

<400> 44

<210> 45

<211> 127

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Los aminoácidos de la proteína D de Haemophilus influenzae para usar en una secuencia pDI/3-MAGE-His

<400> 45

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una proteína de fusión que comprende: a) un antígeno tumoral PRAME; b) una pareja de fusión heteróloga derivada de proteína D, en la que la proteína de fusión comprende los

   aminoácidos 20 a 127 de proteína D; y c) adicionalmente aminoácidos Met-Asp-Pro en el extremo N-terminal de la secuencia de la proteína de fusión, en la que la proteína de pareja de fusión heteróloga derivada de la proteína O (b) se funde con el N-terminal dePRAME.

2. 2.

   Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente una marca de afinidad.

3. 3.

   Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la marca de afinidad es una marca dehistidina

   Una proteína de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprendeadicionalmente una o más secuencias de engarce entre la proteína pareja de fusión y PRAME; o entre laproteína pareja de fusión y una marca de afinidad; o entre PRAME y una marca de afinidad.

4. 5.

   Una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de fusión como se reivindica en cualquiera de lasreivindicaciones 1 a 4.

5. 6.

   Un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 5.

6. 7.

   Una célula huésped aislada transformada con el vector de la reivindicación 6.

7. 8.

   Una vacuna que contiene una proteína de fusión o proteína pareja de fusión como se reivindica en cualquiera delas reivindicaciones 1 a 4 o un ácido nucleico como se reivindica en la reivindicación 5 o un vector como se reivindica en la reivindicación 6.

8. 9.

   Una vacuna como se reivindica en la reivindicación 8 que comprende adicionalmente un coadyuvante, y/ocitoquina o quimioquina inmunoestimuladora.

9. 10.

   Una vacuna como se reivindica en la reivindicación 9 en la que el coadyuvante comprende 3D-MPL, QS21 y/o unoligonucleótido CpG.

10. 11.

    Una vacuna como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 para usar en medicina.

11. 12.

    Uso de una proteína o ácido nucleico o vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6 para laelaboración de una vacuna para tratar inmunoterapéuticamente a un paciente que sufre de cáncer.

12. 13.

    Un procedimiento para producir una proteína de fusión que comprende la etapa de expresar en una célula unaproteína de fusión que comprende una proteína pareja de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

13. 14.

    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 en el que la célula es una bacteria.

14. 15.

    Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14 en el que la bacteria es E. coli.

15. 16.

    Un proceso de acuerdo con la reivindicación 16 que comprende adicionalmente la etapa de lisar la célula y purificar la proteína de fusión expresada a partir de las células lisadas.

16. 17.

    Una proteína de fusión obtenida mediante u obtenible mediante el procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.

17. 18.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 21 en la que el cáncer se selecciona de melanoma, cáncer de mama,cáncer de vejiga, cáncer de pulmón tal como NSCLC, sarcoma, cáncer ovárico, cáncer de cabeza y cuello,cáncer renal, carcinoma colorrectal, mieloma múltiple, leucemia que incluye leucemia aguda y carcinoma esofágico.

    Fig. 1 –Análisis por SDS page de 1/3PD-PRAME con o sin marca de His en vector de pET21 (ejemplo/constructoNºs.: 3 y 4)

    Fig 2 –Análisis por SDS page de 1/3PD-PRAME de codón optimizado con o sin marca de His en vector pET26 (ejemplos/constructos números 3a y 4a)

    Figura 3

    Respuesta de CD4 (coadyuvante AS01B)

    Figura 4 Respuesta de CD8 (coadyuvante AS01B -20070499)

    Figura 5

    Respuesta de CD4 (coadyuvante AS15 -20070502)

    Figura 6 Respuesta de CD8 (coadyuvante AS15 -20070502)

    Figura 7

    1

    MDPSSHSSNM ANTQMKSDKI IIAHRGASGY LPEHTLESKA LAFAQQADYL

    51

    EQDLAMTKDG RLVVIHDHFL DGLTDVAKKF PHRHRKDGRY YVIDFTLKEI

    101

    QSLEMTENFE TMERRRLWGS IQSRYISMSV WTSPRRLVEL AGQSLLKDEA

    151

    LAIAALELLP RELFPPLFMA AFDGRHSQTL KAMVQAWPFT CLPLGVLMKG

    201

    QHLHLETFKA VLDGLDVLLA QEVRPRRWKL QVLDLRKNSH QDFWTVWSGN

    251

    RASLYSFPEP EAAQPMTKKR KVDGLSTEAE QPFIPVEVLV DLFLKEGACD

    301

    ELFSYLIEKV KRKKNVLRLC CKKLKIFAMP MQDIKMILKM VQLDSIEDLE

    351

    VTCTWKLPTL AKFSPYLGQM INLRRLLLSH IHASSYISPE KEEQYIAQFT

    401

    SQFLSLQCLQ ALYVDSLFFL RGRLDQLLRH VMNPLETLSI TNCRLSEGDV

    451

    MHLSQSPSVS QLSVLSLSGV MLTDVSPEPL QALLERASAT LQDLVFDECG

    501

    ITDDQLLALL PSLSHCSQLT TLSFYGNSIS ISALQSLLQH LIGLSNLTHV

    551

    LYPVPLESYE DIHGTLHLER LAYLHARLRE LLCELGRPSM VWLSANPCPH

    601

    CGDRTFYDPE PILCPCFMPN (TSG) / (LE) / HHHHHH

    No se usó ninguna secuencia señal para esas construcciones Negro = los primeros 109 aminoácidos de proteína D (AA 20-127 de proteína D) Negro – marcado = aminoácidos insertados (Asp y Pro en aa 2 y 3) Doble subrayado = proteína PRAME; aminoácidos 1-509 de PRAME (509 aa totales) Negro -subrayado = marca de 6 His que varía dependiendo del clon

    Figura 8 Alineación entre LipoD-MAGE3-His y pD1/3-PRAME-His Figura 9

    Alineación entre la secuencia compartida de la proteína D original de Haemophilus influenzae y la LipoDMAGE3-His

    Proteína D_H influenzae LipoD-MAGE3-His

    Consenso

    Proteína D_H influenzae LipoD-MAGE3-His Consenso

    Proteína D_H influenzae LipoD-MAGE3-His

    Consenso

    Figura 10

    Alineación entre la secuencia compartida de la proteína D original de Haemophilus influenzae, la LipoDMAGE3-His y la pD1/3-PRAME-His

    Proteína D_H influenzae LipoD-MAGE3-His pD1/3-PRAME Consenso

    Proteína D_H influenzae LipoD-MAGE3-His pD1/3-PRAME Consenso

    Proteína D_H influenzae LipoD-MAGE3-His pD1/3-PRAME Consenso

    Figura 11

    Análisis por SDS page de pD1/3-PRAME con o sin señal de secreción (SS) y marca de His (His) en el vector pET21.

    Figura 12 Secuencia de proteína D 1/3 MAGE-A3-His

    Extremo N Terminal MDP

    Proteína D1/3 Met Asp Mage 3 GlyGly 7xHis terminal Extremo C

    Subrayado = secuencia señal de proteína D que incluye Met-1 y las sustituciones Asp-2 y Pro-3 Subrayado doble = primeros 109 aminoácidos de proteína D de 20 a 129 MD = aminoácidos no relacionados Met-Asp en aa 128-129 para crear un sitio de clonación GG = aminoácidos Gly-Gly no relacionados en 442-443 Subrayado con puntos = fragmento de MAGE3; aminoácidos 3-314 de MAGE3 (312 aa totales) HHHHHHH = marca de 7 His