BRPI0806463A2 - proteìna de fusão, seqüência de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, vacina, uso de uma proteìna ou ácido nucleico ou vetores, processo para a produção de uma proteìna de fusão, e, método para tratar um paciente que sofre de cáncer - Google Patents

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Abstract

PROTEINA DE FUSãO, SEQUêNCIA DE áCIDO NUCLEICO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, VACINA, USO DE UMA PROTEìNA OU áCIDO NUCLEICO OU VETORES, PROCESSO PARA A PRODUçãO DE UMA PROTEìNA DE FUSãO, E, METODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE CáNCER. A presente invenção diz respeito a proteínas de fusão que compreende um antígeno derivado do denominado antígeno de rejeição de tumor PRAME (também conhecido como DAGE) ligado a um parceiro de fusão imunológico que fornece epítopos auxiliares T, tais como, por exemplo, proteína D de Haemophilus influenzae B, proteínas parceiras de fusão que compreendem fragmentos de proteína D, métodos para preparar os mesmos e para formular vacinas e uso dos mesmos para o tratamento de uma variedade de cânceres.

Description

"PROTEÍNA DE FUSÃO, SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, VACINA, USO DE UMA PROTEÍNA OU ÁCIDO NUCLEICO OU VETORES, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO, E, MÉTODO PARA TRATAR UM PACIENTE QUE SOFRE DE CÂNCER"
A presente invenção diz respeito a proteínas de fusão que compreendem um antígeno derivado do denominado antígeno de rejeição de tumor PRAME (também conhecido como DAGE) ligado a um parceiro de fusão imunológica que fornece epítopos auxiliares T, tais como, por exemplo, proteína D de Haemophilus influenzae B, métodos para a preparação dos mesmos e para formular vacinas e uso dos mesmos para ratar uma variedade de cânceres, que inclui, mas não limita-se a melanoma, mama, bexiga, câncer de pulmão, tal como NSCLC, sarcoma, câncer ovariano, câncer de cabeça e pescoço, câncer renal, carcinoma colorretal, mieloma múltiplo, leucemia incluindo leucemia aguda e carcinoma esofágico.
Em uma outra forma de realização, a presente invenção diz respeito a proteínas parceiras de fusão que compreendem derivados de proteína D e métodos para a preparação dos mesmas.
Entre os grupos diferentes de antígenos associados com o tumor, antígenos de testículos com câncer são de interesse para a imunoterapia por causa de sua expressão específica de tumor ampla e o fato que, no geral, estes antígenos não são expressados em células saudáveis. Mais do que 50 antígenos de câncer/testículos foram descritos até agora e, para muitos destes, os epítopos reconhecidos por linfócitos T foram identificados. PRAME é um antígeno de testículo com câncer e está sob investigação como uma imunoterapia potencial.
Na imunoterapia, o antígeno cancerígeno é introduzido no paciente usualmente como uma vacina, por exemplo, contendo um antígeno como uma proteína ou um fragmento imunogênico do mesmo ou como codificação de DNA para a proteína ou como um vetor contendo o dito DNA, que estimula o sistema imune do paciente a atacar tumores que expressam o mesmo antígeno.
Se a resposta apropriada for estimulada, os linfócitos T (células T) atacam os antígenos diretamente e fornecem controle da resposta imune. As células B e as células T que se desenvolvem são específicas para um tipo de antígeno. Quando o sistema imune é exposto a um antígeno diferente, as células B e células T diferentes são formadas. Quando os linfócitos desenvolvem-se, estes, normalmente, aprendem a reconhecer os tecidos do próprio corpo (de si mesmo) como diferentes de tecidos e partículas não encontrados normalmente no corpo (não de si mesmo). Uma vez que as células B e células T são formadas, algumas daquelas células multiplicarão e fornecerão "memória" para o sistema imune. Isto deixa o sistema imune responder de maneira mais rápida e mais eficiente ao período seguinte em que é exposto ao mesmo antígeno.
Certos experimentos buscam indicar que os antígenos de testículos com câncer podem estimular os mecanismos de memória no sistema imune.
E hipotetizado por alguns que o PRAME está envolvido na morte celular ou ciclos celulares. Este foi mostrado por alguns grupos ser expressado em melanoma em uma variedade de tumores incluindo pulmão, rim e cabeça e pescoço. De maneira interessante, este também parece ser expressado em 40 a 60% de leucemia, tal como leucemia linfóide aguda e leucemia mielóide aguda, ver, por exemplo, Exp Hematol. dezembro de 2000;28(12): 1413-22. Em pacientes, foi observado que a super-expressão de PRAME parece estar associada com sobrevivência mais alta e taxas mais baixas de reincidência em comparação com aqueles que não expressam a proteína.
O antígeno e sua preparação são descritas na patente US N0 5.830.753. O PRAME é observado no Annotated Human Gene Database H- Inv DB sob os números de acessão: U65011.1, BC022008.1, AK129783.1, BC014974.2, CR608334.1, AF025440.1, CR591755.1, BC039731.1, CR623010.1, CR611321.1, CR618501.1, CR604772.1, CR456549.1 e CR620272.1.
A proteína D é uma proteína de superfície da bactéria de gram- negativo, Haemophilus influenza Β. A informação nos parceiros de fusão imunológica derivados da proteína D pode ser obtida a partir do WO 91/18926.
As proteínas de fusão de uma porção de um antígeno e um parceiro de fusão heterólogo são, algumas vezes, preparados para aumentar a imunogenicidade do antígeno e/ou produção auxiliar da proteína em quantidades e/ou pureza apropriadas, ver, por exemplo, o WO 99/40188 que descreve uma proteína de fusão de MAGE e, por exemplo, proteína D, por exemplo, uma proteína de superfície da bactéria de gram-negativo, Haemophilus influenza Β. A proteína de fusão é preparada de maneira recombinante e a seqüência de secreção de proteína D pode ser incorporada na proteína de fusão para auxiliar potencialmente a secreção e a solubilização do produto final.
Breve Descrição das Figuras e Construções/Sequências
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Sumário da invenção
A presente invenção fornece uma proteína de fusão que compreende:
a) PRAME ou um fragmento imunogênico do mesmo, e
b) um parceiro de fusão heterólogo derivado da proteína D, em que a dita proteína de fusão não inclui a seqüência de secreção (seqüência sinalizadora) de proteína D.
A presente invenção ainda fornece uma proteína de fusão parceira como descrito neste derivado da proteína D, em que a proteína de fusão parceira não inclui a seqüência de secreção ou seqüência sinalizadora de proteína D.
A presente invenção ainda fornece uma proteína de fusão como descrito neste e um antígeno ou fragmento desta.
A presente invenção ainda fornece uma proteína de fusão parceira derivada da proteína D, em que a proteína de fusão parceira compreende ou consiste de aminoácidos 20 a 127 de proteína D. Em uma forma de realização da presente invenção, um ou mais aminoácidos da proteína de fusão parceira de proteína D como descrito neste podem ser anulados ou podem ser substituídos por substituição. Os aminoácidos podem ser substituídos por substituições conservativas como definido neste ou outros aminoácidos podem ser usados. Em uma forma de realização, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais aminoácidos podem ser substituídas.
A proteína de fusão parceira de proteína D como descrito neste pode conter adicional ou alternativamente anulações ou inserções dentro da seqüência de aminoácido em comparação com a seqüência de proteína D do tipo selvagem. Em uma forma de realização, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais aminoácidos podem ser inseridos ou anulados.
O termo "seqüência de secreção" ou "seqüência sinalizadora" ou "sinal de secreção" de proteína D, no contexto deste pedido, é pretendido referir-se aproximadamente aos aminoácidos Ia 17, 18 ou 19 da proteína de ocorrência natural. Em uma forma de realização, a secreção ou seqüência sinalizadora ou sinal de secreção de proteína D refere-se aos 19 aminoácidos de terminal N de proteína D. Os termos "seqüência de secreção" ou "seqüência sinalizadora" ou "sinal de secreção" são usados de maneira intercambiável no presente pedido.
A proteína de fusão parceira da presente invenção pode compreender a proteína de proteína D de comprimento total remanescente ou pode compreender aproximadamente o terceiro terminal N remanescente de proteína D. Por exemplo, o terceiro terminal N remanescente de proteína D pode compreender aproximadamente ou em torno de aminoácidos 20 a 127 de proteína D. Em uma forma de realização, a seqüência de proteína D para o uso na presente invenção compreende os aminoácidos 20 a 127 de proteína D. Em uma outra forma de realização, a presente invenção compreende ou consiste de qualquer uma das seqüências que começam em qualquer um dos seguintes aminoácidos de uma seqüência de proteína D: 18, 19, 20, 21, ou 22 e terminação em qualquer um dos seguintes aminoácidos de uma seqüência de proteína D: 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 ou 140.
Por "remanescente" neste contexto é entendida a seqüência da proteína D sem a secreção ou seqüência sinalizadora como descrito neste.
Em uma forma de realização da presente invenção em que a proteína de fusão compreende PRAME ou um fragmento imunogênico do mesmo, o derivado de proteína D da presente invenção compreende aproximadamente o primeiro 1/3 da proteína, mais especificamente os aminoácidos 20 a 127. Em uma forma de realização alternativa da presente invenção em que a proteína de fusão compreende PRAME ou um fragmento imunogênico do mesmo, a proteína D compreende aproximadamente o primeiro 1/3 da proteína em que os 109 aminoácidos de proteína D de terminal D são usados. Em uma forma de realização da presente invenção a porção de proteína D não inclui a seqüência de secreção da proteína. Em uma forma de realização da presente invenção o derivado de proteína D não é lipidado.
Em uma forma de realização, a presente invenção fornece uma construção de proteína D, como descrito neste, como uma proteína de fusão parceira. A construção de proteína D pode ser uma proteína de fusão parceira para uma construção que compreende adicionalmente uma construção de a PRAME ou MAGE-A3 como descrito neste ou pode ser uma proteína de fusão parceira para uma construção que compreende adicionalmente um outro antígeno de câncer ou qualquer outro antígeno.
Parece que para proteínas de fusão que compreendem PRAME ou um fragmento imunogênico do mesmo e proteína D ou para proteínas de fusão que compreendem proteína D ou para uma proteína de fusão parceira que compreende proteína D, que a presença da seqüência de secreção (ou seqüência sinalizadora) pode afetar nocivamente a quantidade de proteína de fusão produzida.
PRAME
Em um aspecto a proteína de fusão da presente invenção compreende uma proteína de fusão parceira como descrito neste e um antígeno PRAME ou fragmento imunogênico do mesmo. No geral, a proteína PRAME tem 509 aminoácidos e em uma forma de realização todos os 509 aminoácidos de PRAME podem ser usados. Diversos epítopos de linfócito T citotóxicos (CTL) foram identificados em PRAME, por exemplo, VLDGLDVLL (PilA100"108; SEQ ID N°: 13); SLYSFPEPEA (PRA142"151; SEQ ID N°: 14); ALYVDSLFFL (PRA300"309; SEQ ID N°: 15);
LYVDSLFFL (PRA301"309; SEQID N°: 16) e
SLLQHLIGL (PRA425"433; SEQ ID N°: 17). No geral, é desejável incluir tanto destes epítopos quanto possível no antígeno para a geração de uma resposta imune forte e garantir que o antígeno seja tão imunogênico quanto possível, embora, possa ser possível compensar uma imunogenicidade inferior de uma dada construção utilizando-se uma formulação com um adjuvante imunológico potente. Os adjuvantes fortes são debatidos abaixo em mais detalhes.
Em um aspecto, a invenção fornece a porção de PRAME de uma proteína de fusão que compreende, consistir de ou consistir essencialmente de proteína de comprimento total.
Entretanto, a invenção também estende-se a construções de PRAME por substituições conservativas. Em uma forma de realização, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais aminoácidos podem ser substituídos. A construção de PRAME como descrito neste pode conter, alternativa ou adicionalmente anulações ou inserções dentro da seqüência de aminoácido em comparação com a seqüência de PRAME do tipo selvagem. Em uma forma de realização, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais aminoácidos pode ser inseridos ou anulados.
As substituições conservativas são bem conhecidas e são, no geral, ajustadas como as matrizes de registro padrão em programas de computador de alinhamento de seqüência. Estes programas incluem PAM250 (Dayhoft M. O. et al., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", Em "Atlas of protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345- 352), National Biomedical Research Foundation, Washington e Blosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matricies from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919.
Em termos gerais, a substituição dentro dos seguintes grupos são substituições conservativas, mas substituições entre os grupos são consideradas não conservadas. Os grupos são:
proteínas de fusão da invenção serão mais do que 80%, tal como 85, 90, 95 e mais especificamente 99% idêntico ao PRAME de ocorrência natural.
Entretanto, aqueles habilitados na técnica estão cientes que os resíduos de aminoácido gerados como um resultado do processo de clonagem podem ser retidos nas proteínas recombinantemente sintetizadas. Se este não afetar nocivamente as características do produto, é opcional se ou não estes são removidos.
Em um aspecto a invenção fornece uma proteína de fusão como descrito neste que compreende, consiste de ou consiste essencialmente de proteína de PRAME de comprimento total. Em um outro aspecto, a porção de PRAME da proteína de fusão da presente invenção compreende, consiste de ou consiste essencialmente de um ou mais dos seguintes epítopos:
i) Aspartato/asparagina/glutamato/glutamina
ii) Serina/treonina
iii) Lisina/arginina
iv) Fenilalanina/tirosina/triptofano
v) Leucina/isoleucina/valina/metionina
vi) Glicina/alanina
No geral, a seqüência de PRAME/aminoácidos usada nas
VLDGLDVLL (PRA100"108; SEQ ID N°: 13);
SLYSFPEPEA (PRA14Z-,M; SEQ ID N°: 14); ALYVDSLFFL (PRA300"309; SEQ ID N°: 15); LYVDSLFFL (PRA301"309; SEQ ID N°: 16) e
142-151.
300-309
SLLQHLIGL (PRA'
425-433.
; SEQ ID N°: 17). Proteínas de fusão
Em uma outra forma de realização da presente invenção, um outro antígeno tumoral que não PRAME ou além do PRAME pode ser usado em uma proteína de fusão como descrito neste. Em uma forma de realização, uma proteína de fusão é fornecida compreendendo uma proteína de fusão parceira como descrito neste e um ou mais dos seguintes antígenos de tumor ou derivados de antígeno de tumor ou uma porção imunogênica dos mesmos que é capaz de direcionar uma resposta imune ao antígeno: um antígeno MAGE, por exemplo, um antígeno MAGE-A, tal como MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12. Estes antígenos são algumas vezes conhecidas como MAGE Al, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, AlAGE A10, MAGE Al 1 e/ou MAGE A12 (a família MAGE A). Em uma forma de realização, um antígeno de uma de duas famílias MAGE adicionais pode ser usado: o grupo MAGE B e MAGE C. A família MAGE B inclui MAGE Bl (também conhecido como MAGE Xpl e DAM 10), MAGE B2 (também conhecido como MAGE Xp2 e DAM 6) MAGE B3 e MAGE B4 - a família de Mage C correntemente inclui MAGE Cle MAGE C2.
O antígeno MAGE para o uso na presente invenção pode compreender o antígeno MAGE de comprimento total. Alternativamente, o antígeno MAGE pode compreender uma porção imunogênica de MAGE em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos podem ser anulados de ou substituídos na seqüência de aminoácido. Em uma forma de realização da presente invenção, 2 aminoácidos podem ser anulados a partir do terminal N da seqüência de MAGE. Em uma forma de realização da presente invenção em que o antígeno é MAGE-A3 ou uma porção imunogênica do mesmo, a seqüência de MAGE-A3 pode ser de aminoácido 3 a 314 de MAGE-A3.
Em uma outra forma de realização, o antígeno tumoral ou derivado para o uso na presente invenção pode ser PRAME, BAGE, LAGE 1, LAGE 2 (também conhecido como NY-ESO-1), SAGE, HAGE, XAGE, PSA, PAP, PSCA, P501S (também conhecido como proteína), HASH1, HASH2, Cripto, B726, NY-BR1.1, P510, MUC-1, Prostase, STEAP, tirosinase, telomerase, survivin, CASB616, P53 e/ou Her-2/neu ou uma porção imunogênica dos mesmos que é capaz de direcionar uma resposta imune ao antígeno.
Em uma outra forma de realização da invenção, o antígeno tumoral pode compreender ou consistir de um dos seguintes antígenos, ou uma porção imunogênica dos mesmos que é capaz de direcionar uma resposta imune ao antígeno: SSX-2; SSX-4; SSX-5; NAl7; MELAN-A; P790; P835; B305D; B854; CASB618 (como descrito em WO00/53748); CASB7439 (como descrito em WO01/62778); C1491; C1584 e C1585.
Em uma forma de realização, o antígeno para o uso na presente invenção pode compreender ou consistir de P501S. P501S, também denominado prosteína (Xu et al., Cancer Res. 61, 2001, 1563-1568), é conhecido como SEQ ID N° 113 do W098/37814 e é uma 553 proteína de aminoácido. Os fragmentos imunogênicos e porções destes que compreende pelo menos 20, preferivelmente 50, mais preferivelmente 100 aminoácidos contíguos como divulgado no pedido de patente referido acima pode ser usado nas proteínas de fusão da presente invenção. Os fragmentos preferidos são divulgados em WO 98/50567 (antígeno PS108) e como proteína associada com o câncer de próstata (SEQ ID N°: 9 de WO 99/67384). Outros fragmentos preferidos são aminoácidos 51-553, 34-553 ou 55-553 da proteína P501S de comprimento total.
Em uma forma de realização, o antígeno pode compreender ou consistir de WT-1 expressado pelo gene de tumor de Wilm ou uma porção imunogênica do mesmo que é capaz de direcionar uma resposta imune ao antígeno ou o fragmento de terminal N WT-1F que compreende cerca de ou aproximadamente 1 a 249 aminoácidos de WT-1.
Em uma outra forma de realização, o antígeno pode compreender ou consistir do antígeno expressado pelo gene Her-2/neu ou um fragmento deste ou uma porção imunogênica do mesmo que é capaz de direcionar uma resposta imune ao antígeno. Em uma forma de realização, o antígeno de Her-2/neu pode ser uma das seguintes proteínas de fusão que são descritas no WOOO/44899.
O antígeno para o uso na presente invenção pode compreender ou consistir de "proteína de fusão HER-2/neu ECDICD," também referido como "ECD-ICD" ou "proteína de fusão ECD-ICD" que refere-se a uma proteína de fusão (ou fragmentos destes) que compreendem o domínio extracelular (ou fragmentos destes) e o domínio intracelular (ou fragmentos destes) da proteína HER-2/neu. Em uma forma de realização, esta proteína de fusão ECD-ICD não inclui uma porção substancial do domínio de transmembrana de HER-2/neu ou não inclui qualquer um dos domínios transmembrana HER-2/neu.
Em uma outra forma de realização, o antígeno pode compreender ou consistir de "proteína de fusão HER-2/neu ECD-PD," também referido como "ECD-PD" ou "proteína de fusão ECD-PD" ou uma "proteína de fusão HER-2/neu ECD-APD", também referido como "ECD- APD" ou "proteína de fusão de ECD-APD", que refere-se à proteínas de fusão (ou fragmentos destas) que compreendem o domínio extracelular (ou fragmentos destes) e domínio de fosforilação (ou fragmentos destes, por exemplo, APD) da proteína HER-2/neu. Em uma forma de realização, as proteínas ECD-PD e ECD-APD de fusão não incluem uma porção substancial do domínio de transmembrana HER-2/neu ou não inclui qualquer um dos domínios de transmembrana HER-2/neu.
As proteínas de fusão do antígeno PRAME e proteína de fusão parceira de proteína D como descrito neste pode ser quimicamente conjugado, mas são preferivelmente expressados como proteínas de fusão recombinantes, que podem permitir níveis aumentados de proteína PRAME a ser produzida em um sistema de expressão em comparação com PRAME sozinho sem parceiro de fusão, tal como proteína D ou proteínas D de proteína modificada.
Adicional ou alternativamente, os antígenos tumorais descritos neste e a proteína de fusão parceira da presente invenção pode ser qumicamente conjugado ou podem ser expressados como proteínas de fusão recombinantes, que pode permitir níveis aumentados de proteína PRAME ou um outro antígeno tumoral a ser produzido em um sistema de expressão em comparação com PRAME ou um outro antígeno tumoral sozinho sem parceiro de fusão, tal como proteína D ou proteínas D de proteína modificada.
Proteínas de fusão da presente invenção, como descrito neste, pode compreender adicionalmente uma ou mais seqüências ligadoras entre uma proteína de fusão parceira e o antígeno tumoral ou porção imunogênica deste ou entre uma proteína de fusão parceira e uma cauda His ou outro rótulo de afinidade (se presente) ou entre o antígeno tumoral ou porção imunogênica deste e uma cauda His ou outro rótulo de afinidade (se presente). Os aminoácidos nas seqüências ligadoras pode não ser relacionadas às seqüências do antígeno e/ou parceiro de fusão.
Proteínas de fusão da presente invenção, como descrito neste, pode compreender adicionalmente aminoácidos Met-Asp-Pro na extremidade de terminal N da seqüência de proteína de fusão. O aminoácido Met pode ser da seqüência de proteína D original ou pode ser de uma seqüência não relacionada.
O parceiro de fusão pode auxiliar na expressão de uma proteína (intensificador de expressão) em rendimentos mais alto do que a proteína recombinante natural. A proteína de fusão parceira D, devido à sua natureza estranha, pode ser particularmente imunogênica in vivo e auxiliar a proteína de fusão que compreende PRAME ou um outro antígeno tumoral fornecendo-se os epítopos auxiliares T, preferivelmente epítopos auxiliares T reconhecidos por células CD4 T. Acredita-se que tais células CD4-T podem contribuir para a geração de uma resposta imune favorável, em particular, uma resposta de célula T citolítica de CD8.
Em uma forma de realização, o parceiro de fusão pode atuar tanto como um parceiro de intensificação de expressão e um parceiro de fusão imunológica.
Em um aspecto a invenção fornece uma proteína de fusão em que a porção de terminal N de proteína D (como descrito acima ou neste) é fundido ao terminal N de PRAME ou um fragmento imunogênico do mesmo. Mais especificamente, a fusão com um fragmento de proteína Deo terminal N de PRAME é realizado tal que o PRAME substitui o fragmento de terminal C de proteína D que foi excisado. Desta maneira, o terminal N de proteína D torna-se o terminal N da proteína de fusão.
Em um outro aspecto, a invenção fornece uma proteína de fusão em que a porção de terminal N de proteína D (como descrito acima ou neste) é fundido ao terminal N ou uma outra porção de um antígeno tumoral ou um fragmento imunogênico do mesmo. Mais especificamente a fusão com um fragmento de proteína Deo terminal N ou outra porção de um antígeno tumoral pode ser afetado, tal que o PRAME ou outro antígeno tumoral ou derivado destes como descrito neste substitui o fragmento de terminal C de proteína D que foi excisado. Desta maneira, o terminal N de proteína D torna- se o terminal N de uma proteína de fusão.
Outros parceiros de fusão ou fragmentos destes podem ser incluídos nas proteínas de fusão da invenção ou pode substituir o elemento de proteína D da presente invenção, por exemplo, nas formas de realização que compreendem o antígeno PRAME ou um fragmento ou porção deste como descrito neste. Os exemplos de outros parceiros de fusão incluem:
• a proteína não estrutural do vírus influenza, NSl (hemaglutinina) - tipicamente os 81 aminoácidos de terminal N são utilizados, embora fragmentos diferentes podem ser usados contanto que estes incluam epítopos auxiliares T,
• Derivado de LYTA de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza um N-acetil-L-alanina amidase, amidase LYTA, (codificado pelo gene IytA gene {Gene, 43 (1986) página 265-272} tal como a porção de repetição da molécula de Lyta encontrado na extremidade de terminal C, por exemplo, começando no resíduo 178, tal como os resíduos 188 a 305.
A purificação de proteínas híbridas contendo o fragmento Ο- LYTA em seu terminal amino foi descrito {Biotechnology: 10, (1992) páginas 795-798.
As proteínas de fusão da invenção podem incluir um rótulo de afinidade, tal como, por exemplo, uma cauda de histidina que compreende entre 5 a 9, tais como 6 resíduos de histidina. Estes resíduos podem, por exemplo, estar na porção de terminal de proteína D (tal como o terminal N de proteína D) e/ou pode ser fundido à porção de terminal do antígeno PRAME ou seu derivado ou o antígeno tumoral ou derivado deste como descrito neste. No geral, a cauda de histidina pode estar localizada na porção de terminal do antígeno PRAME ou derivado deste ou o antígeno tumoral ou derivado deste como descrito neste tal que a extremidade de terminal C do antígeno PRAME ou seu derivado ou o antígeno tumoral ou derivado deste como descrito neste. As caudas de histidina podem ser vantajosas no auxílio da purificação.
A presente invenção também fornece um ácido nucleico que codifica as proteínas da presente invenção. Tais seqüências podem ser inseridas em um vetor de expressão adequado e usado para a vacinação de DNA/RNA ou expressado em um hospedeiro adequado. Os vetores microbianos que expressam o ácido nucleico pode ser usado como vacinas. Tais vetores incluem por exemplo, poxvírus, adenovírus, alfavírus, listeria e monofago. Uma seqüência de DNA eu codificam as proteínas da presente invenção podem ser sintetizados usando-se as técnicas de síntese de DNA padrão, tal como pela ligação enzimática como descrito por D. M. Roberts et al. em Biochemistiy 1985, 24, 5090-5098, pela síntese química, pela polimerização enzimática in vitro ou pela tecnologia de PCR que utiliza, por exemplo, uma polimerase estável de calor ou por uma combinação destas técnicas.
A polimerização enzimática de DNA pode ser realizada in vitro usando-se uma DNA polimerase, tal como DNA polimerase I (fragmento Klenow) em um tampão apropriado contendo os trifosfatos de nucleosídeo dATP, dCTP, dGTP e dTTP como requerido em uma temperatura de 10° a 37°C, no geral em um volume de 50 μΐ ou menos. A ligação enzimática de fragmentos de DNA pode ser realizada usando-se uma DNA ligase tal como T4 DNA ligase em um tampão apropriado, tal como 0,05 M 15 de Tris (pH 7,4), 0,01 M de MgCl2, 0,01 M de ditiotreitol, 1 mM de espermidina, 1 mM de ATP e 0,1 mg/ml de albumina de soro bovino, em uma temperatura de 4°C até a ambiente, no geral, em um volume de 50 ml ou menos. A síntese química do polímero de DNA ou fragmentos pode ser realizada pelo fosfotriéster convencional, fosfito ou química de fosforamidita, usando-se as técnicas de fase sólida, tais como aqueles descritos em 'Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual1 (ed. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), ou em outras publicações científicas, por exemplo M. J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B. S. Sproat e R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B. S. Sproat e W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M. D. Matteucci and Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M. D. Matteucci and Μ. H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al, Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus e H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539 e Η. W. D. Matthes et al, EMBO Journal, 1984, 3, 801.
O processo da invenção pode ser realizada pelas técnicas recombinantes convencionais, tal como técnicas recombinantes convencionais, tais como descrito em Maniatis et al, Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.
Em particular, o processo pode compreender as etapas de:
i) preparação de um vetor de expressão replicável ou de integração capaz, em uma célula hospedeira, de expressar um polímero de DNA que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína ou um derivado imunogênico deste;
ii) transformar uma célula hospedeira com o dito vetor;
iii) cultivar a dita célula hospedeira transformada sob condições que permitem a expressão do dito polímero de DNA para produzir a dita proteína e
iv) recuperar a dita proteína.
O termo 'transformação' é usado neste para significar a introdução de DNA estranho em uma célula hospedeira. Isto pode ser atingido, por exemplo, pela transformação, transfecção ou infecção com um plasmídeo apropriado ou vetor viral usando-se por exemplo, técnicas convencionais como descrito em Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman and A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, Inglaterra, 1988. O termo 'transformado' ou 'transformante' será a seguir apropriado à célula hospedeira que contém e que expressa o gene estranho de interesse.
Os vetores de expressão são novos e também formam parte da invenção.
Os vetores de expressão replicáveis podem ser preparados de acordo com a invenção, pela clivagem de um vetor compatível com a célula hospedeira para fornecer um segmento de DNA linear tendo um replicon intacto e combinando-se o dito segmento linear com uma ou mais moléculas de DNA que, junto com o dito segmento linear que codifica o produto desejado, tal como o polímero de DNA que codifica a proteína da invenção ou derivado deste, sob condições de ligação.
Desta maneira, o polímero de DNA pode ser pré-formado ou formado durante a construção do vetor, como desejado.
A escolha do vetor será determinada em parte pela célula hospedeira pela célula hospedeira, que pode ser procariótica ou eucariótica mas são, no geral células de E. coli ou CHO. Os vetores adequados podem incluir plasmídeos, por exemplo, TMCP14 ou pET21 ou pET26, pcDNA3, bacteriófagos, cosmídeos e vírus recombinantes.
A preparação do vetor de expressão replicável pode ser realizada convencionalmente com enzimas apropriadas para restrição, polimerização e ligação do DNA, pelos procedimentos descritos em, por exemplo, Maniatis et al. citado acima.
A célula hospedeira recombinante é preparada de acordo com a invenção, pela transformação de uma célula hospedeira com um vetor de expressão replicável da invenção sob condições transformantes. As condições transformantes adequadas são convencionais e são descritas em, por exemplo, por exemplo, Maniatis et al. citado acima ou "DNA Cloning" Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985.
A escolha de condições de transformação é determinada pela célula hospedeira. Desta maneira, um hospedeiro bacteriano, tal como o E. coli pode ser tratado com uma solução de CaCl2 (Cohen et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) ou com uma solução que compreende uma mistura de RbCl, MnCl2, acetato de potássio e glicerol e então com ácido 3- [N-morfolino]-propano-sulfônico, RbCl e glicerol. As células de mamífero na cultura podem ser transformadas pela co-precipitação de cálcio do DNA do vetor nas células. A invenção também estende-se a uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão replicável da invenção.
O DNA pode ser otimizado por códon pelas técnicas padrões ainda para facilitar a expressão do hospedeiro relevante. Em uma forma de realização da presente invenção aqui é fornecido o DNA que codifica uma proteína de fusão que compreende um antígeno PRAME ou porção ou fragmento deste como descrito neste, em que a seqüência de nucleotídeo do antígeno PRAME ou porção ou fragmento deste é otimizado por códon. Em uma forma de realização, uma seqüência de nucleotídeo da proteína D não é otimizada por códon.
A cultura da célula hospedeira transformada sob condições permite a expressão do polímero de DNA seja realizado convenientemente, como descrito em, por exemplo, Maniatis et al. e "DNA Cloning" citado acima. Deste modo, preferivelmente a célula é fornecida com nutriente e cultivado em uma temperatura abaixo de 50°C.
As proteínas da presente invenção podem ser expressados em procariotas ou eucariotas tal como levedura mas são freqüentemente expressados em cepas particulares de E. coli de E. coli tal como AR58 e BLR DE3 pode ser utilizado.
No geral um marcador de seleção de, por exemplo resistência à canamicina ou resistência à ampicilina é incorporado para facilitar a identificação da incorporação bem sucedida do gene recombinante/construção no sistema de expressão.
O produto é recuperado pelos métodos convencionais de acordo com a célula hospedeira e de acordo com uma localização do produto de expressão (intracelular ou secretado no meio de cultura ou no periplasma celular). Em uma forma de realização da presente invenção o produto de expressão é intracelular. Em uma forma de realização da presente invenção o produto de expressão é uma proteína insolúvel. Deste modo, onde a célula hospedeira é bacteriana, tal como E. coli este pode, por exemplo, ser lisado fisicamente, quimicamente ou enzimaticamente e um produto da proteína isolado a partir de lisado resultante. Onde a célula hospedeira é mamífero, o produto pode ser no geral isolado a partir de meio nutriente ou a partir dos extratos livres celulares. As técnicas de isolamento da proteína convencional inclui precipitação seletiva, cromatografia de absorção e cromatografia de afinidade incluindo uma coluna de afinidade de anticorpo monoclonal.
Em uma forma de realização da invenção aqui é fornecido um processo para a produção de uma proteína de fusão como descrito neste que compreende a etapa da expressão em uma célula de uma proteína de fusão que compreende uma proteína de fusão parceira como descrito neste. A célula pode ser uma bactéria. Em uma forma de realização em que a célula é uma bactéria, a bactéria pode ser E. coli. O processo da presente invenção pode compreender a etapa da expressão de uma proteína de fusão como descrito neste na célula como uma proteína insolúvel. O processo ainda pode compreender a etapa lisando uma célula e purificando a proteína de fusão expressada a partir das células lisadas.
Em uma forma de realização da invenção aqui é fornecido uma proteína de fusão obtida por ou obtenível por um método ou processo descrito neste.
As proteínas da presente invenção são fornecidos solúvel em uma forma líquida ou em uma forma liofilizada.
Este é no geral esperado que cada dose humana compreenderá 1 a 1000 μg de proteína e preferivelmente 30 a 300 μg.
A presente invenção também fornece a composição farmacêutica tal como vacina que compreende uma proteína de fusão da presente invenção em um excipiente farmaceuticamente aceitável.
A vacina pode opcionalmente conter um ou mais outros antígenos associados com o tumor ou polipeptídeos, ou preferivelmente ser combinado com outras vacinas contra câncer com base em um antígeno associado ao tumor. Por exemplo, estes antígenos associados com o tumor pode ser antígenos como descrito neste e/ou pode ser membros pertencentes às famílias MAGE, LAGE e GAGE ou WT-1. Em uma forma de realização o antígeno associado ao tumor pode compreender ou consistir do antígeno MAGE- A3.
A preparação da vacina é no geral descrito em Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds. Powell M.F. & Newman M.J). (1995) Plenum Press New York). A encapsulação dentro dos lipossomas é descrito por Fullerton, Patente U.S. 4.235.877.
As proteínas da presente invenção podem ser preferivelmente submetidos à adjuvante na formulação da vacina da invenção. Os adjuvantes adequados podem incluir um sal de alumínio tal como gel hidróxido de alumínio (alum) ou fosfato de alumínio, mas também pode ser um sal de cálcio, ferro ou zinco, ou pode ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares aciladas, polissacarídeos derivados cationicamente ou anionicamente, ou polifosfazenos. Outros adjuvantes conhecidos inclui oligonucleotídeos contendo CpG. Os oligonucleotídeos são caracterizados em que o dinucleotídeo CpG não é metilado. Tais oligonucleotídeos são bem conhecidos e são descritos em, por exemplo WO 96/02555.
Na formulação da invenção pode ser desejável que a composição adjuvante induz uma resposta imune preferivelmente do tipo THl. Em uma forma de realização aqui é fornecido um sistema adjuvante incluindo, por exemplo uma combinação de lipídeo A de monofosforila, preferivelmente lipídio 3-de-O-acilado de monofosforila (3D-MPL) junto com um sal de alumínio. O adjuvante também pode opcionalmente incluir os oligonucleotídeos CpG para induzir preferivelmente uma resposta TH1.
Um sistema intensificado que pode ser usado na presente invenção compreende a combinação de um lipídeo A de monofosforila e um derivativo de saponina particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como divulgado em WO 94/00153, ou, por exemplo uma composição menos reatogênica onde o QS21 é apagado com colesterol como divulgado em WO 96/33739.
Uma formulação que pode ser usado nas formulação da presente invenção, que compreende QS21 3D-MPL & tocoferol, por exemplo uma emulsão de água em óleo, é descrito em WO 95/17210.
Uma outra formulação adjuvante que pode ser usado na formulação da presente invenção é QS21, 3D-MPL & CpG ou equivalente deste, por exemplo uma emulsão de água em óleo ou como uma formulação lipossômica.
Consequentemente em uma forma de realização da presente invenção aqui é fornecido a vacina que compreende uma proteína de fusão ou proteína de fusão parceira como descrito neste e um adjuvante, por exemplo como descrito acima.
Combinação de PRAME e MA GE
Em uma forma de realização da presente invenção aqui é fornecido uma composição que compreende (a) um componente antígeno que compreende um antígeno PRAME ou proteína de fusão como descrito neste e (b) um componente antígeno que compreende um antígeno MAGE ou proteína de fusão como descrito neste. Em uma forma de realização, a composição ainda pode compreender um adjuvante como descrito neste.
O antígeno MAGE para o uso na combinação pode compreender o antígeno MAGE de comprimento total. Alternativamente, o antígeno MAGE pode compreender uma porção imunogênica de MAGE em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos podem ser anulados de ou substituídos na seqüência de aminoácido. Em uma forma de realização da presente invenção, 2 aminoácidos podem ser anulados a partir do terminal N da seqüência de MAGE. Em uma forma de realização da presente invenção em que o antígeno é MAGE-A3 ou uma porção imunogênica do mesmo, a seqüência de MAGE-A3 pode ser de 3 aminoácidos por 314 de MAGE-A3.
Para a combinação descrito acima, cada um ou ambos dos antígenos PRAME e/ou MAGE podem ser parte de uma proteína de fusão ou proteínas como descrito neste, ou os antígenos podem estar presentes em outras proteínas de fusão ou pode estar apresentado como antígeno sozinho.
Em uma forma de realização da presente invenção aqui é fornecido uma composição que compreende uma proteína de fusão que compreende um antígeno PRAME e proteína de fusão parceira como descrito neste e uma proteína de fusão que compreende um antígeno MAGE-A3 e proteína de fusão parceira como descrito neste. Em uma forma de realização alternativa, a proteína de fusão que compreende o antígeno MAGE-A3 compreende ou consiste do antígeno MAGE-A3 e uma proteína de fusão parceira que compreende aproximadamente os primeiros 109 aminoácidos de proteína D, em que um ou dois ou mais aminoácidos a partir da proteína D são opcionalmente substituídos e em que a seqüência sinalizadora de proteína D está opcionalmente presente, em adição aos primeiros 109 aminoácidos de proteína D.
As proteínas de fusão da presente invenção pode adicionalmente compreender opcionalmente um ou mais aminoácidos como "ligadores" entre as seqüências do antígeno e a proteína de fusão parceira ou entre o antígeno e uma cauda His, se presente. Os aminoácidos podem ser não relacionados às seqüências do antígeno e/ou parceiro de fusão.
As proteínas de fusão da presente invenção, como descrito neste, pode adicionalmente compreender os aminoácidos Met-Asp-Pro no fmal do terminal N da seqüência da proteína de fusão. O aminoácido Met pode ser a partir da seqüência da proteína D original ou pode ser a partir de uma seqüência não relacionada.
Em uma forma de realização, a seqüência de uma proteína de fusão que compreende MAGE-A3 e proteína D para o uso na presente invenção é mostrada na Figura 12 e SEQ ID N°: 43.
A presente invenção também estende-se aos métodos de preparação das ditas vacinas/ composições.
EXEMPLOS
Quatro construções de fusão foram preparadas e serão referidas neste como Exemplos/construções 1, 2, 3 e 4. Uma construção otimizada por códon foi preparada a partir do exemplo 3 e é indicado como o exemplo 3a neste. Uma construção otimizada por códon foi preparada a partir do exemplo 4 e é indicado como o exemplo 4a neste.
Nos exemplos 3a e 4a a seqüência à respeito da porção da proteína D da molécula é a mesma. Entretanto, certos códons na região PRAME foram modificados, por ainda melhorar a expressão e, no exemplo 3a, o ligador entre PRAME e sua cauda foram removidos.
TABELA A Estruturas da proteína de fusão e Detalhes de plasmídeos dos exemplos/Construções 1 a 4
N-terminal---------------------------------------------C-terminal
<table>table see original document page 25</column></row><table> As proteínas de fusão dos exemplos acima compreende os aminoácidos 20 a 127 da proteína D. Os aminoácidos Met, Asp e Pro foram incluídos no terminal N do fragmento da proteína D (isto é aminoácidos da proteína D MDP-20-127). Esta é a idéia que estes três aminoácidos adicionais podem ajudar a estabilidade da proteína e/ou aumento no nível da expressão da proteína deste. O aminoácido 127 da proteína D é fundido ao terminal N do PRAME de comprimento total (isto é aminoácido 127 da proteína D é fundido ao terminal N do PRAME). Uma cauda de rótulo de histidina, para ajudar a purificação, foi incluída em três das seis proteínas. A seqüência exata da cauda é dependente do plasmídeo usado.
Três tipos diferentes de plasmídeos, TCMP14 e pET21 ou pET26 foram construídos: para cada plasmídeo, DNA codificado para a proteína de fusão foi incluído com ou sem uma cauda de histidina.
A não ser de outra maneira estado a estratégia geral abaixo foi usada na preparação de cada um dos exemplos.
Estratégia de clonagem para a geração de proteína recombinante PD1/3- PRAME (com ou sem His-tag) usando vetor TCMPl4:
A amplificação das seqüências apresentadas no plasmídeo TCMP14 foram feitas usando uma das três etapas da estratégia de PCR. O vetor pHIC348 contendo a seqüência de DNA que codifica o gene de proteína D inteiro foram obtidos de Dr. A. Forsgren, Department of Medicai Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Suécia. A seqüência de DNA da proteína D foram publicados por Janson et al. (1991) {Janson H, LO Heden, A Grubb, M Ruan, & A Forsgren. 1991. Infect Immun 59:119-125}. O vetor de expressão pMG81 é um derivado de pBR322, em que os elementos de controle derivados do bacteriófago X para a transcrição e tradução dos estranhos genes inseridos foram introduzidos (Shatzman et al., 1983) {Shatzman A, YS Ho, & M Rosenberg. 1983. Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) página 1 a 14. Academic NY}. Além disso, o gene de resistência à ampicilina foi trocado com o gene de resistência à canamicina. A seqüência codificadora para a porção da proteína NSl (aminoácido 4 a 81) foi substituído pelos locais de clonagem múltiplos para obter pMG81 MCS. A seqüência codificadora para 1/3 da proteína D (aminoácido 20 a 127) foi clonado em pMG8 1 MCS usando locais de restrição BamHI e NcoI para obter pMG81-l/3PD. Primeiro, a amplificação por PCR da seção corresponde aos aminoácidos 20 a 127 da proteína D e foi feito usando o vetor pMG81-1/3 PD como modelo e sentido de oligonucleotídeo:
5' ATA TAA CAT ATG GAT CCA AGC AGC CAT TCA TCA AAT 3' (CAN008; SEQ ID N°: 18) e anti-sentido: 5' CCA CAA ACG CCT TCG TTC CAT GGT TTC AAA GTT TTC TGT C 3' (CAN037; SEQ ID N°: 19).
O cDNA de PRAME obtido do Ludwig Institute, Bruxelas, Bélgica, foi inserido nos locais Bstxl-Notl do vetor pCDNAl (Invitrogen) para gerar o vetor recombinante pCDNA-l-PRAME.
A amplificação por PCR da seção corresponde ao aminoácido da proteína PRAME e foi feita usando o vetor pcDNA-I-PRAME (GSKBio) como modelo e sentido de oligonucleotídeo: 5' GAC AGA AAA CTT TGA AAC CAT GGA ACG AAG GCG TTT GTG G3' (CAN036; SEQ ID N°: 20) e anti-sentido: 5' AGA GAG ACT AGT CTA GTT AGG CAT GAA ACA GGG GCA CAG 3' (CAN029; SEQ ID N°: 21) ou
5' GGA GGA ACT AGT GTT AGG CAT GAA ACA GGG GCA CAG 3' (CAN002; SEQ ID N°: 22) dependendo se uma cauda de histidina (CAN002) ou não (CAN029) for adicionado. A seqüência PRAME final inserida no plasmídeo TCMP14 foi obtido seguindo uma amplificação de PCR usando os modelos dos genes 1/3 PD e PRAME que foram gerados nas etapas preliminares para o modelo e sentido de oligonucleotídeo: CAN008, e anti- sentido: CAN029 ou CAN002 dependendo se uma cauda de histidina está presente (CAN002) ou não (CAN029). NdeI na extremidade final de 5' e SpeI nos locais da extremidade final de 3' foram também adicionados para a clonagem do fragmento no vetor TCMP14.
Construção do projeto do vetor para expressar a proteína recombinante 1/3PD-PRAME com ou sem proteína recombinante His-tag usando o vetor pET21:
Um plasmídeo cDNA recombinante denominado pcDNAl- PRAME (como descrito na prévia estratégia) contendo uma seqüência codificadora para o gene PRAME e o vetor PMG81-1/3PD (como descrito na prévia estratégia) contendo uma porção do terminal N da seqüência codificadora da proteína D foram usados. A estratégia de clonagem inclui as seguintes etapas.
a) Primeiro, a seqüência 1/3PD sem sinal de secreção (secreção ou seqüência de sinal) foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo PMG81-1/3PD usando o sentido de oligonucleotídeo: 5' AGAGAGCATATGAGCAGCCATTCATCAAATATGGCG (CAN040; SEQ ID N°: 22),
e o anti-sentido:
5' ACGTGGGCGGCCGCGGTTTCAAAGTTTTCTGTCATTTCTAA (CAN032; SEQ ID N°: 23);
Ndel nos locais da extremidade final 5' e Notl na extremidade final de 3' foram também adicionados para a clonagem do fragmento no vetor pET21b(+).
b) A seqüência PRAME foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo pcDNAI-PRAME usando o sentido de oligonucleotídeo:
5' TTGTTGGCGGCCGCAATGGAACGAAGGCGTTTGTGGGGT
(CAN033; SEQID N°: 25), e o anti-sentido:
5' GGAGGACTCGAGGTTAGGCATGAAACAGGGGCACAG (CAN034; SEQ ID Ν°: 26); Notl nos locais da extremidade final 5' e Xhol na extremidade final de 3' foram também adicionados para a clonagem do fragmento no vetor pET21b. Esta amplificação resultou na adição no terminal C da proteína de dois aminoácidos, Leu e Glu, seguido por 6 His no plasmídeo pET21b(+). Para a geração da proteína sem His-tag, um códon interrompido (TAG) foi adicionado na extremidade final de 3' do gene PRAME pelo uso de CAN033 e CAN035 (anti-sentido: 5' GGAGGACTCGAGCTAGTTAGGCATGAAACAGGGGCACAG (CAN035; SEQ ID N°: XX) em vez de CAN033 e CAN034.
c) A clonagem no plasmídeo pET21b(+) (Invitrogen) dos fragmentos amplificados acima.
d) Remoção do local de Notl entre 1/3 PD e PRAME pelo uso do kit de mutagênese direcionado ao local QuikChange II (Stratagene) e o sentido de oligonucleotídeo:
5' CAGAAAACTTTGAAACCATGGAACGAAGGCG (CAN106; SEQ ID N°: XX), e o anti-sentido:
5' cgccttcgttccatggtttcaaagttttctg (CAN107; SEQ ID N°: XX).
e) Adição de dois aminoácidos Asp e Pro seguindo o Met na posição 1 no terminal N da proteína D 1/3 pela mutagênese e usando o sentido de oligonucleotídeo:
5' GGAGATAT AC ATATGG ATCC AAGC AGCC ATTC ATC AAAT ATGG (CAN 104; SEQ ID N°: XX) e o anti-sentido:
5' CC ATATTTG ATGAATGGCTGCTTGG ATCC AT ATGT ATATCTCC (CAN 105; SEQ ID N°: XX).
Construção do projeto do vetor para expressar o códon 1/3PD-PRAME da proteína recombinante otimizado (sem ou com His tag) no vetor pET26:
O gene PRAME foi otimizado por códon e clonado na cadeia principal pGA4 com a adição de locais Notl e Xhol na extremidade final 5' e na extremidade final 3' do gene otimizado respectivamente.
Este plasmídeo, denominado 0606420pGA4, foi usado para clonar o gene em fusão com o PD1/3 no vetor pET26 usando as seguintes etapas.
a) Remoção do fragmento Not1 / Xho1 corresponde à seqüência PRAME otimizada com um códon interrompido na extremidade final 3' do gene a partir do plasmídeo 0606420pGA4.
b) Clonagem do fragmento PRAME otimizado em um plasmídeo pET26b(+) que contém o 1/3 PD previamente clonado Ndel/Notl com os oligonucleotídeos CAN040 e CAN032 como descrito acima e onde os aminoácidos Asp e Pro foram adicionados no terminal N pelo método da mutagênese com oligonucleotídeos CANl 04 e CANl 05.
c) Remoção do local de Notl pela mutagênese com oligonucleotídeos: sentido
5' GACAGAAAACTTTGAAACCATGGAACGTCGTCGTCTGTGG
(CAN123; SEQ ID N°: XX) e anti-sentido
5' CCACAGACGACGACGTTCCATGGTTTCAAAGTTTTCTGTC
(CAN124; SEQ ID N°: XX). Este resultou na proteína de fusão 1/3PD- PRAME otimizada por códon sem Cauda de histidina.
d) O plasmídeo foi então usado como um modelo para a geração de 1/3PD-PRAME otimizado por códon com plasmídeo 6 His. A amplificação por PCR da proteína de fusão foi feita com oligonucleotídeos sentido
5' GGAATTCCATATGGATCCAAGCAGCCATTC (CAN 199; SEQ ID N°: XX) e a anti-sentido
5GGAGCTCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTTCGGCATAA AGCACGGGC (CAN 198; SEQ ID N°: XX); NdeI nos locais da extremidade final 5', Xhol na extremidade final de 3' seguido por 6 His e um códon interrompido foi também adicionado para a clonagem do fragmento no vetor pET26b(+).
e) Clonagem do fragmento amplificado no plasmídeo pET26b(+) a partir de Invitrogen.
Para a produção da proteína de fusão, a construção de DNA foi clonado no vetor de expressão TCMP14. Este plasmídeo utiliza os sinais a partir do DNA de fago lambda para levar a transcrição e tradução de genes estranhos inseridos. O vetor contém o promotor PL lambda PL5 operador OL e dois locais de utilização (NutL e NutR) para aliviar os efeitos da polaridade trancripcional quando a proteína N é fornecida (Gross et al., 1985. Mot. & Cell. Biol. 5:1015).
O plasmídeo que expressa a proteína de fusão pD-PRAME foi indicada de modo que os aminoácidos PRAME foram adicionados ao terminal C de 108 aminoácidos derivados de pD sem esta seqüência de sinal (secreção ou seqüência de sinal) (isto é resíduos 20 a 127). Para esta construção, três aminoácidos não relacionados (Met e Asp e um Proline) foram adicionados no terminal N do derivado de pD, e para certas construções de sua cauda no terminal C dos aminoácidos PRAME foi incluído (ver tabela A acima). Esta construção pode ser alternativamente descrito como contendo 109 aminoácidos derivados de pD, se o terminal N Met é considerado vir da seqüência pD.
Cepa hospedeira e Transformação
Os hospedeiros da cepa de E. Coli AR58 (Mott et at, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol 82, pp 88-92, janeiro de 1985, Biochemistry) foram transformados com DNA de plasmídeos para os Exemplos/ construções 1 e 2.
A cepa de E. Coli lisogênica AR58 usada para a produção dos Exemplos/construções 1 e 2 é um derivado da cepa Kl2 E. Coli NIH padrão N99 (F- su- galK2, lacZ- thr-). Este contém um fago lambda lisogênico defeituoso (galE::TN10,l Kil- cI857 DHl). O fenótipo Kil evita o corte da síntese macromolecular hospedeira. A mutação cI857 confere uma lesão sensível a temperatura ao repressor ei. A anulação DHl remove o operon direito do fago lambda e os bio hospedeiros, uvr3, e local chi A. A cepa AR58 foi gerado pela transdução de N99 com um estoque de fago lambda P previamente desenvolvido em um derivado de SA500 (galE::TN10,l Kit- cI857 DHl). A introdução do lisogênio defeituoso em N99 foi selecionado com tetraciclina pela virtude da presença de um transposon TNlO codificado pela resistência da tetraciclina no gene galE adjacente. Os N99 e SA500 são cepas de E.coli Kl2 derivadas do Dr. Martin Rosenberg's laboratory at the National Institutes of Health.
Os vetores contendo um promotor PL, são introduzidos em um hospedeiro lisogênico de E. coli para estabilizar o DNA de plasmídeos. As Cepas hospedeiras lisogênicas contém DNA de fago lambda defeituoso por replicação integrado no genoma (Shatzman et al., 1983; In Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) páginas 1 a 14. Academic Press NY). O DNA de fago lambda direciona a síntese da proteína regressora cl que liga-se ao regressor OL do vetor e evita a ligação de polimerase de RNA ao promotor PL e portanto a transcrição do gene inserido. O gene cl da cepa da expressão AR58 contém uma mutação sensível à temperatura de modo que a transcrição direcionada por PL pode ser regulada pela mudança da temperatura, isto é um aumento na temperatura de cultura inativa o repressor e a síntese da proteína estranha seja iniciada. Este sistema de expressão deixa as proteínas estranhas da síntese controlada especialmente aquelas que podem ser tóxicas às células (Shimataka & Rosenberg, 1981. Nature 292:128).
Os hospedeiros da cepa de E. Coli BLR (DE3) Novagen, WI, USA (número de catálogo: 69053-4) BLR (DE3) Novagen, WI, USA (número de catálogo: 69053-4) BLR é um derivado recA BL21 que melhora o monômero do plasmídeo produzido e pode ajudar a estabilizar os plasmídeos alvos contendo as seqüências repetitivas ou cujo os produtos podem causar a perda do pró-fago DE3 (1,2) foram transformados com DNA de plasmídeos a partir do exemplos/construções 3 e 4.
Cada uma da transformação foi realizada pelos métodos padrões com células tratadas com CaCl2 (Hanahan D. «Plasmid transformation by Simanis.» In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.)·
Desenvolvimento e indução da cepa bacteriana hospedeira
• Cultura
As bactérias foram desenvolvidas em 20 ml de caldo Luria- Bertani (LB) (BD) + 1% de glicose p/v (Laboratoire MAT5 número de catálogo: GR-0101) + antibiótico (Carbenicilina 100 μg/ml por pET21b, canamicina 40 μg/ml por TCMP14). As culturas foram incubadas a 330C5 por células AR58 e a 37°C, por células BLR (DE3) atém um O.D.60onm de cerca de 0,8.
• Indução
Em O.D.6oonm de cerca de 0,8, as culturas BLR (DE3) foram induzidas em 1 mM de isopropila β-D-l-tiogalactopiranosídeo (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815) e incubado por 2 horas ou 3 horas a 37°C embora a solubilidade possa ser aumentada se uma temperatura inferior for usada.
Em O.D.600nm de cerca de 0,8, as culturas AR58 foram induzidas pela ativação de calor a 37°C e incubado por 7 horas.
O desenvolvimento bacteriano foi adequado para os dois sistemas de expressões.
• Extração e Purificação da proteína
Na expressão do polipeptídeo em cultura, as células são tipicamente coletadas pela centrifugação então rompidas por meios químicos ou físicos (se o polipeptídeo expressado não é secretado no meio) e o extrato bruto resultante retido para isolar o polipeptídeo de interesse. O reagente de extração de proteína BugBuster™ é usado sob condições recomendados pelos fornecedores (Novagen).
Purificação da proteína Prame-his PD1/3
A pasta de células de E. coli foi recolocada em suspensão em 20 mM de tampão de Tris pH 8,5 então passado através do sistema homogeneizador (Panda de Niro Soavi S.p.A. - 2 passagens - 750 bars). Após a adição de 2 mM de MgCl2 e Benzonase (50 U/ml), o homogêneo foi incubado 1 hora em temperatura ambiente (RT) sob suave agitação então centrifugada 30 minutos a 15900 g e temperatura ambiente. O grânulo resultante foi recolocado em suspensão em 20 mM de tampão de Tris pH 8,5 contendo 1% de sulfato de dodecila sódica (SDS) e 60 mM de Glutationa e incubados 30 minutos em temperatura ambiente sob suave agitação. Após a centrifugação 30 minutos a 15900 g e temperatura ambiente, o grânulo foi descartado.
O sobrenadante da centrifugação foi 10 vezes diluído em 20 mM de tampão de Tris contendo 6,66 M de uréia, 0,333 M de cloreto de sódio (NaCl) e 11,11 mM de Imidazol e então submetido à separação cromatográfica em uma coluna pela afinidade metálica do íon de níquel (Sefarose IMAC 6 FF GE Healthcare) equilibrado em um 20 mM de tampão de Tris pH 8,5 contendo 0,1% de SDS, 6,0 M de uréia, 0,3 M de NaCl e 10 mM de Imidazol. Após a lavagem da coluna com 20 mM de tampão de Tris pH 8,5 contendo 0,5% de Sarcosila, 6,0 M de uréia, 0,3 M de NaCl e 10 mM de Imidazol, o antígeno foi eluído a partir da coluna pelo aumento da concentração de imidazol até 40 mM no mesmo tampão de lavagem. Após a adição de fosfato até 50 mM, o antígeno positivo eluído foi passado através de uma coluna de tipo II de Hidroxiapatita Macro-Prep Ceramic (Bio-Rad) equilibrado em um 20 mM de tampão de Tris pH 8,5 contendo 50 mM de fosfato, 0,5% de Sarcosila, 6,0 M de uréia e 0,3 M de NaCl. O fluxo de Hidroxiapatita direto contendo um antígeno foi então diafiltrado contra 5 mM de tampão de borato pH 9,8 contendo 3,15% de sacarose em uma membrana Omega 30 kDa (Pall). A retenção da ultrafiltração foi esterilizada pela filtração direta de uma membrana de acetato de celulose 0,45/0,22 μm (Sartorius). O material purificado foi armazenado a -70°C.
Um processo de purificação alternativo também foi usado, que difere-se do processo acima nas seguintes etapas:
- Nenhum tratamento de benzonase
- Nenhuma mudança de SDS por sarcosila na coluna IMAC (SDS a partir da extração até a etapa HA)
- O tampão usado para a diafiltração foi de 5 mM de tampão de Tris pH 8,5 - 0,5 M de Arginina. Este processo de purificação alternativo resultou em remoção SDS incompleta com valor residual de cerca de 0,05 e 0,085%.
• Purificação
As proteínas recombinantes expressadas foram purificadas a partir de frações sobrenadantes obtidas após a centrifiigação de E. coli induzida usando uma reina de quelação metálica His-Bind (QIAgen, Chatsworth, CA) de acordo com as instruções do fabricante da resina. Caracterização da proteína SDS-Page:
Gel: NuPAGE 4 a 12% de Bis-Tris Gel 1,0 mm 15 ou 26 reservatórios (número de catálogo Invitrogen: NP0323BOX)
Ver Figura 1 e 2 abaixo, que mostram a análise SDS page do Exemplo 3 e 4 e 3a e 4a respectivamente, em que as proteínas 1/3 pD- PRAME recombinantes diferentes com ou substituição page 30 sem his-tag migram em gel em um peso molecular aparente de -70 kDa. As proteínas recombinantes são observadas como um corpo de inclusão no lisado celular de E. coli, após a indução. Substituição pág. 30
As preparações das amostras, tampões e condições de migração foram feitas sob condições recomendadas pelos fornecedores (Invitrogen). 10 μl de todas as preparações foram carregados (antes da indução (BI) e após a indução (AI)) em reservatórios corresponde aos 100 μl de cultura equivalente.
Legenda da Figura 1: Análise SDS page após o tingimento Coomassie-blue de 1/3PD-PRAME recombinante após indução IPTG da cepa de E. coli BLR DE3 transformada com pET21 recombinante. Um equivalente de 100μl de cultura após 2 horas de indução na cepa BLR DE3 com 1 mM de IPTG a 25, 30 ou 37°C foram carregados em gel. Clone #3 (1/3PD-PRAME / pET21) e Clone #4 (1/3PD-PRAME-His / pET21) são apresentados em gel antes (BI) e após (AI) as induções em frações solúveis (sobrenadante) e não solúveis (grânulo). Linha 1 e 10: Pré-tingimento da faixa ampla padrão (BioRad Cat#161-0318), linha 2 (clone #3, BI, sobrenadante), linha 3 (clone #3, BI, grânulo), linha 4 (clone #3, AI, 25°C, sobrenadante), linha 5 (clone #3, Al, 25°C, grânulo), linha 6 (clone #3, Al, 30°C, sobrenadante), linha 7 (clone #3, Al, 30°C, grânulo), linha 8 (clone #3, Al, 37°C, sobrenadante), linha 9 (clone #3, AT, 37°C, grânulo), linha 11 (clone #4, BI, sobrenadante), linha 12 (clone #4, BI, grânulo), linha 13 (clone #4, Al, 25°C, sobrenadante), linha 14 (clone #4, Al, 25°C, grânulo), linha 15 (clone #4, Al, 30°C, sobrenadante), linha 16 (clone #4, AI, 30°C, grânulo), linha 17 (clone #4, AI, 37°C, sobrenadante), linha 18 (clone #4, AI, 37°C, grânulo).
Legenda da Figura 2: Análise SDS page após o tingimento Coomassie-blue de 1/3PD-PRAME recombinante após a indução IPTG da cepa de E. coli BLR DE3 transformada com pET26 recombinante. Um equivalente de 100 µL de cultura após 2 horas de indução na cepa BLR DE3 com ImM de IPTG a 25, 30 ou 37°C foram carregados em gel. Clone #3a (1/3PD-PRAME otimizado por códon / pET26) e Clone #4a (1/3 PD-PRAME- His otimizado por códon / pET26) são apresentados em gel antes (BI) e após (AI) as induções em frações solúveis (sobrenadante) e não solúveis (grânulo). Linha 2 e 10: Pré-tingimento da faixa ampla padrão (BioRad Cat# 161-0318), linha 1 (clone #3a, BI, sobrenadante), linha 3 (clone #3a, BI, grânulo), linha 4 (clone #3a, Al, 25°C, sobrenadante), linha 5 (clone #3a, AI, 25°C, grânulo), linha 6 (clone #3a, AI, 30°C, sobrenadante), linha 7 (clone #3a, AI, 30°C, grânulo), linha 8 (clone #3a, AI, 37°C,
Substituição de page 30a
sobrenadante), linha 9 (clone #3a, Al, 37°C, grânulo), linha 11 (clone #4a, BI, sobrenadante), linha 12 (clone #4a, BI, grânulo), linha 13 (clone #4a, Al, 25°C, sobrenadante), linha 14 (clone #4a, Al, 25°C, grânulo), linha 15 (clone #4a, AI, 30°C, sobrenadante), linha 16 (clone #4a, AI, 3 0°C, grânulo), linha 17 (clone #4a, AI, 37°C, sobrenadante), linha 18 (clone #4a, Al, 37°C, grânulo). Western Blot
As membranas foram bloqueadas por 30 minutos a 37°C, 60 RPM usando 3% de solução fresca de leite/PBS IX. Após a incubação de bloqueamento, os anticorpos primários foram adicionados (PRAME anti- coelho; GSK Biologicals SA) em diluição de 1:5000 ou a-6X His tag (AbCam) em diluição de 1:3000 em 3% de solução fresca de leite/PBS IX por 1 hora a 37°C, 60RPM. Depois que, as membranas foram lavadas três vezes por 5 minutos em temperatura ambiente usando 0,02% de Tween20/PBS IX. Os anticorpos secundários foram adicionados (perox donkey anti-IgG (H+L) rabbit (Jackson laboratory) em diluição de 1:20 000 usando 3% de solução fresca de leite/PBS IX. As membranas foram incubadas por 1 hora a 37°C, 60 RPM. Depois que, as membranas foram lavadas três vezes por 5 minutos em temperatura ambiente usando 0,02% de Tween20/PBS IX antes das exposições das membranas pelo substrato de peroxidase (KH2PO4, 10 mM; (NH4)2SO4, 10 mM; O-dianisidina, 0,01% & peróxido de hidrogênio 0,045%) ou substrato de fosfatase alcalina (Sigma Fast) seguindo as recomendações dos fornecedores. Análise molecular:
Exemplo/construção 1
<table>table see original document page 38</column></row><table>
Exemplo/construção 2
<table>table see original document page 38</column></row><table>
Exemplo/construção 3
<table>table see original document page 38</column></row><table>
Exemplo/construção 4
<table>table see original document page 38</column></row><table> Exemplo 5:Avaliação da produção das proteínas com ou sem o sinal de secreção (secreção ou seqüência de sinal) da proteína D 1/3 na proteína de fusão.
Tabela B
Proteína Nível de expressão
PD1/3-PRAME com sinal de secreção +
PD1/3-PRAME sem sinal de secreção
Figura 11: Análise SDS page após o tingimento Coomassie- blue de 1/3 PD-PRAME recombinante com ou sem sinal de secreção após a indução IPTG da cepa E. coli BL21 DE3 transformada com pET21 recombinante. Um equivalente de 100 μι de cultura após 3 horas de indução na cepa BL21 DE3 com 1 mM de IPTG a 37°C foram carregados em gel. Aquelas construções são apresentadas em gel antes (BI) e após (AI) as induções em frações solúveis (sobrenadante) e não solúveis (grânulo). Linha 1: Pré-tingimento da faixa ampla padrão (BioRad Cat# 161-0318), linha 2 (pDl/3-PRAME + SS5 BI, sobrenadante), linha 3 (pD 1 /3-PRAME + SS, BI, grânulo), linha 4 (pDl/3-PRAME + SS, AI, sobrenadante), linha 5 (pDl/3- PRAME + SS, AI, grânulo), linha 6 (pDl/3-PRAME + SS + His, BI, sobrenadante), linha 7 (pDl/3-PRAME + SS + His, BI, grânulo), linha 8 (pDl/3-PRAME + SS + His, AI, sobrenadante), linha 9 (pDl/3-PRAME + SS + His, AI, grânulo), linha 10 (pDl/3-PRAME w/o SS, BI, sobrenadante), linha 11 (pDl/3-PRAME w/o SS, BI, grânulo), linha 12 (pDl/3-PRAME w/o SS5 AI, sobrenadante), linha 13 (pDl/3-PRAME w/o SS, AI, grânulo), linha 14 (pDl/3-PRAME w/o SS + His, BI, sobrenadante), linha 15 (pDl/3-PRAME w/o SS + His, BI, grânulo), linha 16 (pDl/3-PRAME w/o SS + His, AI, sobrenadante), linha 17 (pDl/3-PRAME w/o SS + His, AI, grânulo). Exemplo 6: Imunogenicidade de PD-PRAME-His formulado em ASOlB ou AS15: faixa de dosagem do antígeno em uma dose constante do adjuvante.
Objetivo: faixa de dosagem do antígeno para selecionar a melhor dosagem para o uso nos experimentos pré-clínicos. Protocolo:
6 grupos de 12 camundongos CB6F1 que receberam injeções intra muscular (IM) no dia Oe 14 de:
1. PBS
2. PRAME (50*μg) em ASO IB ou AS15
3. PRAME (10 μg) em ASOlB ou AS15
4. PRAME (2 em AS01B ou AS15
5. PRAME (0,4 μg) em ASOIB ou AS15
6. PRAME (0,08 μ§) em AS01B ou AS15
* 44,7 μg atualmente administrado em vez de 50 μg da dose pretendida.
AS01B é uma formulação adjuvante lipossômica que compreende QS21 e 3D-MPL; AS15 é uma formulação adjuvante lipossômica que compreende QS21, 3D-MPL e CpG.
A construção usado neste exemplo foi Exemplo/Construção 3 a (pET26 com a sua cauda), fornecido em 5 mM de tampão de Tris pH 8,5 - 0,5 M de Arginina. A proteína fornecida em um tampão de borato com sacarose também pode ser usado. Leituras:
• Tingimento de citocina intracelular (ICS) 14 dias pós 2 injeções, após a reestimulação in vitro das células do baço (4 grupos de 3 camundongos por grupo) com o grupo de peptídeos PRAME em 1 μg/ml/peptídeo (15-mer) Resposta CD4 (adjuvante AS01B)
Os resultados de ICS para as citocinas DC4 pelo adjuvante ASOlB são mostrados na Figura 3. Neste experimento este pode ser concluído que a melhor dosagem do antígeno PRAME para induzir uma resposta CD4 em ASOlB sob estas condições vistas ser 2μg. Resposta CD8 (Adjuvante AS01B)
Os resultados de ICS para as citocinas CD8 pelo adjuvante ASOlB são mostrados na Figura 4. Os dados parecem mostrar uma resposta CD8 muito baixa e heterogenicidade do intra-grupo de resposta. Resposta CD4 (adjuvante AS15)
Os resultados de ICS para as citocinas DC4 pelo adjuvante AS15 são mostrados na Figura 5. Este dados parecem mostrar que uma similar Resposta CD4 foi induzida com 441 μg, 101 μg, 21 μg e 0,41 μg do PRAME formulado em AS15; com uma resposta diminuída induzida com 0,08 μg PRAME
Resposta CD8 (adjuvante AS15)
Os resultados de ICS para as citocinas CD8 pelo adjuvante AS15 são mostrados na Figura 6. Este dados parecem mostrar nenhuma resposta CD8 (fundamento no grupo PBS)
Exemplo 7: Em resumo, para as invenções descritas neste, o seguinte resumo pode ser usado para descrever as construções específicas de PD1/3-PRAME que até agora foram geradas:
Construções usadas pelo PD1/3-PRAME. - Nenhuma seqüência de sinal da proteína D são incluídas (aminoácidos 2 a 19 da proteína D)
- A metionina da proteína D é incluída. (AA 1 da proteína D)
- Dois AA não relacionados (Asp e Pro) são substituídos por aminoácidos 2-Lys e 3-Leu da proteína D.
- O primeiro 109 AA da proteína D após a seqüência de sinal da proteína D são incluídos (109 aminoácidos incluindo o primeiro Met no termo N + AA20 por 127 da proteína D)
- AA 1 - 509 do PRAME são incluídos (seqüência original de comprimento total do PRAME)
- Com ou sem a sua cauda composta por um dos seguintes:
• Três aminoácidos não relacionados (Thr, Ser e Gly) + 6 His resíduos para a clonagem no plasmídeo TCMP14; ou • Dois aminoácidos não relacionados (Leu e Glu) + 6 His resíduos para a clonagem no pET21 plasmídeo; ou
• 6 His resíduos para a clonagem no plasmídeo pET26. pDl/3 - PRAME +/- proteína da cauda de His:
pD m 20 - 127 : PRAME t - 509 MDPtermo N pD 1/3 PRAME Termo C MDPtermo N pD 1/3 PRAME TSG 6xHis(fo TCMP14) Teimo C MDPtermo N pDl/3 PRAME LE 6xHÍS (ín pET21) Termo C MDPtermo N pD 1/3 PRAMB 6xHis fin pE'T26) Teimo C
Uma seqüência de aminoácido marcada dos Exemplos das construções da presente invenção é mostrada na Figura 7.
Alinhamentos das seguintes construções são mostradas na Figures 8, 9 e 10:
Alinhamento entre LipoD-MAGE3-His e D1/3-PRAME-His (Figura 8) Alinhamento entre a seqüência formada da proteína D original da Haemophilus influenzae e o LipoD-MAGE3-His (Figura 9).
Alinhamento entre a seqüência formada da proteína D original da Haemophilus influenzae, o LipoD-MAGE3-His e o pDl/3-PRAME-His (Figura 10).
Formulação da preparação da vacina usando as proteínas de fusão:
As proteínas de fusão da invenção podem ser formuladas nas vacinas que são submetidas à adjuvante ou não. Em uma forma de realização, como um adjuvante, a formulação pode compreender uma mistura de 3 de -O- lipídeo A de monofosforila acilado (3D-MPL) e QS21 em uma emulsão água/óleo. O sistema de adjuvante SBAS2 foram previamente descrito no WO 95/17210. O adjuvante para o uso na presente invenção pode alternativamente compreender 3 de -O-lipídeo A de monofosforila acilado (3D-MPL), QS21 e CpG em uma formulação água em óleo ou em uma formulação lipossômica.
3D-MPL: é um imunoestimulante derivado de lipopolissacarídeos (LPS) da bactéria Gram-negativo Salmonella minnesota. O MPL foram desacilados e é necessitado de um grupo fosfato na metade do lipídeo A. Este tratamento químico dramaticamente reduz a toxicidade enquanto preserva as propriedades imunoestimulantes (Ribi, 1986).
Este é acreditado que 3 D-MPL combinado com vários veículos pode fortemente intensificar tanto um tipo humoral quanto THl da imunidade celular.
QS21: é uma molécula de saponina natural extraída da casca da árvore Sul Americana Quillaja saponaria Molina. Uma técnica de purificação desenvolvida para separar as saponinas individuais a partir dos extratos brutos da casca, deixando o isolamento da saponina particular, QS21, que é um triterpeno glicosídeo que demonstra a atividade adjuvante mais forte e toxicidade inferior como comparado com o componente original. O QS21 foi mostrado ativar a classe IMHC restrita por CTLs em diversas subunidades Ags, bem como estimular a proliferação linfocítica específica por Ag (Kensil, 1992).
Esta é a idéia que aqui pode ser um efeito sinergístico de combinações de MPL e QS21 na indução de respostas imunes celulares tanto humorais quanto TH1.
A emulsão água/óleo compreende uma fase orgânica feita de 2 óleos
(um tocoferol e esqualeno), e uma fase aquosa de PBS contendo Tween 80 como emulsificador. a emulsão compreendida de 5% de esqualeno 5% de tocoferol 0,4% de Tween 80 e tem um tamanho média da partícula de 180 nm e é conhecido como SB62 (ver WO 95/17210). Os dupletos de óleo resultante devem ter um tamanho de aproximadamente 180 nm.
O adjuvante para o uso na presente invenção pode ser formulado como uma combinação de MPL e QS21, em uma emulsão água/óleo ou em uma formulação lipossômica. Esta preparação deve ser liberada em frascos de 0,7 ml a ser misturado com antígeno liofilizado ou proteína de fusão (frascos contendo de 30 a 300 μg de antígeno).
Os oligonucleotídeos imunoestimuladores também podem ser usados. Os exemplos de oligonucleotídeos para o uso em adjuvantes ou vacinas da presente invenção incluem oligonucleotídeos contendo CpG, no geral dois ou mais motivos de dinucleotídeos CpG separados por pelo menos três, mais freqüentemente pelo menos seis ou mais nucleotídeos. Um motivo CpG é um nucleotídeo de citosina seguido por um nucleotídeo de guanina. Os oligonucleotídeos CpG são tipicamente deoxinucleotídeos. Em uma forma de realização os internucleotídeos nos oligonucleotídeos é fosforoditioato, ou mais preferivelmente uma ligação de fosforotioato, apesar do fosfodiéster e outras ligações de internucleotídeos estão dentro do escopo da invenção. Também incluído dentro do escopo da invenção são os oligonucleotídeos com as ligações de internucleotídeos misturados. Os métodos para a produção de fosforotioato de oligonucleotídeos ou fosforoditioato são descritos em US 5.666.153, US 5.278.302 e WO 95/26204.
Exemplos dos oligonucleotídeos são como os seguintes:
TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826; SEQ ID N°: 36)
TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758; SEQ ID N°: 37)
ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT
(CpG 2006; SEQID N°: 38)
TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668; SEQ ID N°: 39)
TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456; SEQ ID N°: 40),
as seqüências podem conter fosforotioato modificados pelas ligações de internucleotídeos.
Os oligonucleotídeos CpG alternativos podem compreender um ou mais seqüências acima em que estes tem anulações ou adições inconsequenciais destes.
Os oligonucleotídeos CpG podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo ver EP 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador automático.
Em uma forma de realização da presente invenção uma combinação de adjuvante para o uso na invenção inclui um ou mais dos seguintes componentes: 3D-MPL e QS21 (EP 0 671 948 BI); emulsões água em óleo que compreendem 3D-MPL e QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414); ou 3D-MPL formulados com outros carregadores (EP 0 689 454 BI). Outros sistemas de adjuvantes que podem ser usados na presente invenção compreendem uma combinação de 3D-MPL, QS21 e um oligonucleotídeo CpG como descrito em US 6558670 e US 6544518.
A vacina final pode ser obtida após a reconstituição da formulação liofilizada. Referências:
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Seqüência de DNA para o Exemplo 1 a tf gateeaagesf eea ttea Seaaatatigegaetaeccae atgaa á fccagacaaaafceattafctgct<s accgtggfcgctageggfctafcttaceagagGafc^^ tgatfcattfcagagcaagãfcfctagçaat^ gatpgeÊJEgaetgafcg-ttgegaa&a^
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SgcttteggnAggpggafeg tgafcgeatefcg teeeagagíeeeageg £cag EeagcfeaagtgtcctgiLg te t aãgtggrggfc Cat gètg&cegatgt aágtecCgagcecctecaâglc tc fegc tggagágSgcct etgccaec
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ccfcgcagcacctcatçgggctgagcaatcEgacccacgtgetgtatcctgtccGcctggagagttatgag
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SEQ ID NO: 2
Seqüência de aminoácidos para o Exemplo 1 mPSSHSSNMMrTQMKSDKI 11 BQLTDVAKKfFHSiS®^
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SEQ ID NO: 3
Seqüência de DNA para o Exemplo 2
atggatccaageagccâttcatcaaatatggcgaatacccaaatgaa2CcagaçaaaatcaCEattgefeC accgtggtgctagcggttatttâccagagcataegttagaatctaísagcacttgcgtttgcacaacaggc tQattatttagagcaagatttagcaatgacta3§gatggtcgcttastqgttattcaegatcacctttca gatggcttgactga£gtCgcgaaaaaattcccacatcgtcatcgtaaagatggccgttactatgtcatcg áctt tacct taaaagaaat tcaaagtCtagaaatgacagaaaactttgaaaccatggaacgaaggcgttt gtggggtcccatt:cagagccgatacatc«gcatgÃgtgtgtggac«agcccacg3agacttgtggagctg gçagggcagagcctgctgaaggacgaggeecfeggccattgccgccctgg&gttfctgcccagggegctct
EcccgccactcttcãtâgGágccKttgacggãagacacagccagaccctáaággcaatggtgcaggcctg gccefctcaectgcctccctctgggagtgctgatgaagggacaacatcttcaectggagaccttcaaagct gçgcttgatggacttgatgtgctcçttgçccaggaggttcgçeccaggaggtggaaacttcaagtgctgg atttacgga.agaacCcccaKcaggactteCggsctgtatggtctggaaaeagggceagtctgtactcatt tccagagccagaagcagctcagcccatgaeaaagaagcgaaaagtagatggEttgagcacagaggcagsg cagcccttcá t ε ceagtagaggtgct cgt agaccfcgt tect cáaggaaggtfceegtgatga.ategtfect cctacctcattgagaaagtgaagcgaaagaáaaatgtactácgôcCgtgctgtâágáágctgaagatttt tgcaatgcccatgcaggatatcaagatgatcctgaaaatggtgcagctggactctattgaagatttggaa gtgace tgtacctggaagctacccacct tggcgaaattttctccttacctgggccagatgattaatctgc gtagactcctcctctcccacat ccatgcatc ttcet&ca et tecccggagaaggaagag esge at atcgc ccagttcacctctcãgttcctcagtctgcagtgcctgcággcteteeatajtggaetettEa111.Ct Ccfct agaggccgçctggatcagttgctcaggcacgEgatgaaccccctggaaaccctctcaataactaactgcc ggctttc^aaggggatgsgatg;çatct9teecagagtçcçagçgfecagtcagcfcaagtgtçctgagt.ct aá.gtggggtcatgctgaccgatgeaagÊcdcgagicccctccaagctctgctggagagagcçtctgccacc cEccaggacctggt cettgatgagtgtgggafecacggátgâfccagcÊccStgCçctCctgccttccCtíga gccactgctçccagettacaaccttaagcttctacgggaatfe ccatctccaE at ctgccttgcagagtct cctgcagcacctcatcgggctgagcaatctgacccacgcgctgtatcctgtccccctggagâgttatgag gaca fc ceatggtaeeetcea eçtggagagget fcgççta tçtgça tg ccaggctcagggagt tgc fcgtgtg agttggggcggcccagcatggtctggcttagtgccâácccctgtcctcactgtggggacagaacettcta tgweefgegwmee tgtgceec tgt ttca tgç<? t aae
SEQ ID NO: 4
Seqüência de aminoácidos para o Exemplo 2
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DGLTDVAKKFPHRHR IOXmVYVIDFTI<KEI<ÍSI«Sre^^ AGSSLLKDEALATAALIXLPR^FPPLFMAAPDCT
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Seqüência de DNA para o Exemplo 3
afeggatceaagcageeafctcatcaaatatggcgaataeceaaatgasstcaeacaaaatcat6atfcgctc accgtggtgctãgcggttáfctt âcrcagâgüataügttagáatct&ââgcâcttgügtttgcacaàcâggc tgattatttagageaagátttagcaatgactaaggatggtcgtttagtggttatCcacgatcactEttta gatggcttgactgatgttgcgaaaaaattecçacatcgtcatcgtaôagatggccgttactatgtcatçg ,actttaecttaaaagaaattcaaagtttagaaatgaeagaaaactttgaaaccaCggaacgaaggcgttt gtggggfcteça Èteagag eegata ca 6e®,gce tgagtf tgtggacaagc eçacggagaçt t gfcggage 6g gcaggg.c8í§agcctgctflaaggatgaggccctggccatt.gecç5ecct^a.gtfcgctgcccag;ggagotct tecógécãctctfccatggcâgcctetÉíá^
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t Ccagagc cagaagcagctcagcceatgadãaagáagcgaaaágtagatggtítgâgcíicá.gijageagag oagcccttcattccagtagaggtgctcgtagacctgttectcaaggaaggtgcctgtgatgaattgttct cctaccteattgagaaagtgaagçgaaagaaaaatgtactacgectgtgctgtaagaagctgaagatttt
cgcaaegcccatgcaggatat caagatgsxcctgaaaatggtgcagc tggactctattgaagattCggaa gtòacttgtacctegaag«tacccaccttggcgâaàttttctccttacet^ggccíigatgattaatctgc gtagaetcctcctctcccaeateeatgcatcttcctacatttccecggagaaggaagagcagtatatcgc ceagttcacctetcagttcctcagtctgcagtgectgcaggctctctatgtggactetttattfcttcett agaggccgcctggatcagttgetcaggcacgtgatgaaccccttggaaaccctetcaataactaaetgcc ggctt tcgg««ggfga fcg tga tgcatctgccccagagfccccagcg feeag fc ca^ic taagtgtec tgagt ct áa^tg^ggtcãtgctgaccgátgtaágtccegágcc^ çt^ceggaect^gtçtttgatgagtgtgggatçM
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SEQ ID NO: 6
Seqüência de aminoácidos para o Exemplo 3
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Seqüência de DNA para o exemplo 4
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tceagagccagaagcagctcagcCGafcgacaaagaagcgaaaagtagaiggtttgageaeagaggçagag cagccct tcattccagt agaggtgctcgtagacctgt t ccc caaggaaggtgcc tgtgatgaat tgttct cetacctcattgagaaagtgaagcgaaagaaaaatgtactacgcctgtgctgtaagaagctgaagatttt tgcaatgcccatgcaggatatcaagatgatcctgaaaaíggtgcagctggactctattgaagatttggaa gtgacttgtacet9gaa.gctacceaeettgsgegaaat'tteetectf;acetgggceagatgattaatetgc gtagactcctCGtcteceacacecatgcatctteciacattfcccccggagaaggaag«gcagtatatcgc ccagttcacctctcagttccteagtctgcagtgcctgcaggctctctatgtggactctttatttttccfct agaggecgcctggateagttgctcaggcaegtgatgaacccctíggaaaccctctcaataactaactgcc ggcttccggaaggggatgcgiitgcatctgtcecagagteceaacgteagtcagctaagtgtectgagtct aagtg^gtt.eatgcfcgacçfaegtisag^
ctccaggacctggtcCttgatgagtgtgggatcaeggatgatcagctccttgccçtcçtgccttccctga gcc^vgctcccagc£t3caaccttaagcttct4cgggaattccatctccata£ctgccttgcagagtct ectgcagcaecteategggctgagcaatctgacceaegtgctgtateetgtceccctggagagttatgag gacatccatggtaccctecacetggagaggcttgçctatctgcatgecaggctcagggagttgctgtgfcg agttggggcggcccagcatggectggcttagtgecaaceectgtcctcactgtggggacagaacettcta tgacccggagcecatcetgtgeccctgtttcátgcctaac
SEQ ID NO: 8
Seqüência de aminoácidos para o exemplo 4
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Bt= Ii^VjMCKFf1 WJ^E KSORríYVID^^ SMBWTSPRRLVÉL
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OPiIPVEVLVDLPLKEGACiiEli^Syiil iKVK^KilVtiRliCCKKLKlF^FKODIKMILroiVOLDSIFDLiE VTgTWJCIiPTmKPS PTft1GQMJfHiRELliLSHrHAS SYISPEKEEQYI ACrESCFLS^O^M^VBSLFFL RGRLDQLkRHVTOTPLETLS ITÍÍCRLSECDVMHLSQSPSV^ LODLVFDECGITODGLLALiPSLSHCSOLTTLSFVi^^ DiHCTLHLERliAttLilM LRELtCS^ SEQ ID NO: 9
Seqüência de DNA otimizada por códon para o exemplo 3a
atggatecaagcdgccattcatcaaatatggcgaatacecaaatgaaatcagacaaaatcaCtatCgctc «ccgtggtgGtagcggtt^tttacçsgagccítaegtt^gaatctaaagcíiCttgogtttgcíicáíiceiggc tgât fcãt ttâgagcaágat tfcágcââEgacíáâggãÊggt Cgt ttagtgf t ÈãÊ tcâCgãteactt tt ta gatggcfefcgactgatgfctgcgaaaaaattcccacatcgtcatcsgtaaagâtggcogttactatgtcatcg actttaecttaaaagaaattcaaagtttagaaatgacagaaaactttgaaaccatggaacgtcgtegtçt gtggggcagcactcagagccgttacettagcaEgagcgtgtggaccagcccgcgccgcctsgtcgagctg gccggccagagcctgctgaaagatgâagcgctggccattgcggcgctggagctgctgccgcgtgagctgt CtecgcegeCgtttatggcggegtttgatggeogtcatagccagaccetgaaagcgatggtgcaggcgtg gccgt Ct acctgt-ctgccgçtgggcgtgctgatgaaaggccagcatctgcatctggaaacctt casagcg gtgctggatggcctggstgtgctgctggcccsogaagttogtccgegtcgtCggaaectgcaagtgctgg atctgcgtaaaaacagccatcaggatttttggaccgtgtggagcggcaatcgtgcgagcctgtatagctt tccggaaccggaagçggcgcagccgatga.ccaaaaaacgtaâagtggatggcctgagcaccgaágcggaa cagcegtt Eat tccggtggaagtgctggttgacctgt ttctgaaagaaggcgcc tgcgacgagctgt tta gcCatctgatcgaaaaagtgaaacgcaaaaaaaacgtgcCgcgtctgtgcEgcaaaaaacCgaaaatctt cgcgatgcçgatgcaggatattaeaatgatcctgaaaat^tgcagctggacagcattgaggacccggaa
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gcca fetgCagccâgc bgaccácectg.ágicfc t fe ta fcggcâácágcá t tagcát tagcgcgctegcaaagcct gcCgcaacatcCgattggcctgagcaacctgacccãCgtgcCgtatccggtgccgctggaaagctatgaa
gatattcatggcaccctgcatctggaacgtctggcctatctgcacgçgcgtctgcgtgagctgctgtgcg
agctgggcçgtçcgagçatggtfetggctgtcfegcgaatífcgtgçccgcattgcggcgiãLtcgtaccttt ta tgatccggaaccgftfefcctgtgcccgtgctttatgccgaaccaccaccseeaccaccac
SEQ ID NO: 10
Seqüência de aminoácidos para o exemplo 3a
«TOPSSHSSlMMmjMKSDKIIIJffiRGfcSG^ DatXpVAiaCFMIRHJU®^
VfoDGLDVLIAOEVRPRRWKLOVLDLRKNSH^^ QFFIPVEVLVDLPLKEGACDELFSYLIEKVÍ<KKXOT
JjQOL VFDECOI TDDQLlALLpSLSHCSOLrTLS FYGNSIS l SALQSLLQHLIGLSNLTHVLYPVPLE3YE DIHGTLKLfiR IAYLHARLRELLCELGRPSMVViLSAffPCPHCGDP.^ SEQ ID NO: 11
Seqüência de DNA otimizada por códon para o exemplo 4a
atggatccaagcagccattcatcaaatatggcgaatacecaaatgaaatcagacaaaatcattattgcte aççaÇggtgcÇagçggttattt^ccagagcata^ktaga^tctasagcacEtgegtttgçacaaçaggc tgattattcegageaagatttagcaacgactaaggatggtegtttagt^gttattcacgatcaettttea ga tggct tgactgatgtt9cgaaaaaatteccaentcge cá tcgtaa ^gatQgecgttaetetg Cceitcg sctttaccttaaaagaaat tcââágtttagaaa tgacagaaaact t tgaaaeeatggaacgtcgtcgtct gtggggcagcattcagagccgttatattagcatgagcgtgtggaccagcccgcgtcgtccggttgagctg gccggccaçagçctgctgaaagfltgaagcgccggccattgcggcQçtggagctgetgccgcgtgagctgt ttccgccgctgtttatggcggcgtttgatggscgtcacagcc^gaccctgaaagcgatggtgcaggcgtg gccgtttacesgtctgccgetgggcgtgctgatgaaaggccagcafcctgcat etggaaaeeettaaageg gtgctggatggcctggatgtgctgctggcccaggaagttcgtccgcgtcgttggaaactgcaagtgctgg atctgcgtaaaaaca.gçcatçaggatttttggaccgtgtggagcggcaatcgtgcgagcctgtatagctt tccggaaccggaagcggcgcagccgatgaccaaaaaacgtaaagtggatggcctgagcaccgaagcggsa
ccgtttaetecsftggassgcfc Cggttgaecegt ^eggfcgcctgcgacgasctgteta
gctatctgatcgaaaaâgtgâaácgcaaaa«aaa.cgtgctgcgtctgtgct9caaaaaactg9âaatetc cgcgatgccgatgcaggatattaaaatgatcctgaaaatg3tgcagctggatagc9ttga9gacet;gg3a gtgacctgcacctggaaactgcegaccrtggccaaatttagcccgtatctgggccagatgsttaacctgc gtcgtctgctgctgtctcatatCcatgcgagcagctatattagcccggaaaaagaagaacagtatatcgc gcagfcttaecageeagtttctgagcetgcaaegcctgcaagcgctgtatgtggatagcctgttttttetg
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gtctgagcganggcgatgtgntgcacccgagccagagcccgagcgttagccagctgtctgttctgagcct gagcggcgtgatgctgaeegaKgtgflgcccggaaccgetgeaagccctgctggaacgtgcgagegcgacc ctgcaagacctggtgtttgat.gaatgcggcattaccgatgatcíigctgctggccctgctgçcgagcctga gcçattgcagceagctgaccaeçEtgagcttttatggcaacageatEagcattagcgegctgeaaagcct gctgcaacatccgattggcctgagcaacctgacccatgtgctgtatcçggtgccgctggaaagçtatgaa fatafctcatggcacccegeatcEggaacgictggicet at etgea cgegcgtcegcgtgagetfetgtgeg agcEgggccgtccgagcatggtttggctgtctgcgaatcGgtgcccgcattgc.ggegatcgtacetttta tgatccggaaccgattctgtgccrgtgctttatgccgaac
SEQ ID NO 12
Seqüência de aminoácidos para o exemplo 4a
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<22 0>
<2:231» MDP- 20-127 - proteínaD - PRAME - TSGHHHttHH (plasmídeo TCMPl4)
<400> 1 atggstccaa geagccãttc atcaaátatg gcgaatáccc áaatgaaatc agacaaaate 60 aüfcattgctc accgtggfcgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg eaeaacaggc tgattattta gagcaagatt tageaatgae taaggatggt 180 cgtttagtgg ttâttcacga tCactttttâ gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgtc afecgtaaaga tggccgfctac tatgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accatggaac gaaggegttt gtggggttcc 360 attcagagcc gatacatcag catgagtgtg tggacaagcc cacggagact tgtggagctg 420 gcagggcaga gectgetgaa ggatgaggcc ctggccattg ccgccctgga gttgctgccc 480 agggagctct tcccgecact ctteatggca gcctctgacg ggagacacag ccagaccctg 540 aaggeaatgg tgcaggeetg gceetteaec tgcctcectc tgggagtgct gatgaaggga 600 eaaeâtcttc acçtggâgat; çttcaaagct gtgcttgatg gacttgatgt gctcettgce 660 caggaggttc gccccaggag gtggaaactfc caagtgctgg atttacggaa gaactctcat 12 0 caggacttct ggactgtatg gtetggaaac agggccagtc tgtactcatt tccagageca 780 gaagcagetc agcecàtgac aaagaagcga aaagtagatg gtttgagesc agaggcagag 84 0 cageccttca ttccagtaga ggtgctcgta gacctgttcc ccaaggaagg tgcctgtgat 900 gaattgttct eetaccteat tgagaaâgcg ââgcgãáagâ aaaatgtact acgcctgtge 960 tgtaagaagç tgaagatttfc tgcaatgçcc atgcaggata tcaagatgat cctgaaaatg 1020 gtgcagctgg ãctctãttga agatttggaa gtgacttgta ccCggaagct açccaççttg IOtO gcgaaatttt çtcettacct gggecagatg attaatctgc gtagact-cct cctctcccac 1140 atccatgeat ettcctacât ttccccggag aaggaagagc agtâtatcgc ccagttcacc 1200 ectcagttcc tcagtctgea gtgcetgcag gctçtetatg tggaetcfctt atttttectt 1260 agaggccgcc tggatcagtt gçtcaggcac gtgatgââcc ecttggâãsc cctctcaata 1320 actaactgcc ggctttcgga aggggat-gtg atgcatctgt cccagagtcc cagcgtcagt 1360 eagctaagtg teçfcgagtct aagtggggte atgctgaccg atgtaagtce cgagcccctc 1440 caagctctgc tggagagagc ctctgccâce ctccaggacc tggtctttga tgagtgtggg IS 00 atcacggatg atcagctcct tgccctcctg ccttccctgâ gccáctgctc ccágcttaca 1560 âccttaagct tctaegggaa ttceatçtçc atatctgcct tgcagagtct cçtgcagcaç IS20 ctcatcgggc tgagcaatct gacccacgtg ctgtatcctg tccccctgga gagttatgag 1680 gacatccatg gtaccctcca cctggagagg cttgcctatc tgcâtgccãg gctcagggag 1740 ttgctgtgtg agttggggcg gcccagcatg gtcCggctta gtgccaaccc ctgtcctcac ιβοο tgtggggaca gãáccfetcta tgaccroggag cecatcctgt gcccotgfctt catgcctaac 1.860 acCagtggcc aceatcacca tcaccat 1887
<210> 2 <211» 629
<2lâ> SRT
<233> Seqüência Artificial
c220>
<223> HDP- 20-127 - ProtemaD - PRMffi - TSGKHHHKH (plasmideo TCMP14)
<400;· 2
Met Aep Pro Ser Ser His Ser Ser Asn Mec Ãla Asn Thr Gln Met Lys
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu PrO
20 25 30
Glu His Thr Leu Qlu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Glrs AXa Asp
3S 40 45
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
SO SS 60
Ile His Asp His Phe fceu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 65 70 IS eo
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Αβπ Phe Glu Thr Met
100 105 110
Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln ser Arg Tyr Ile Ser Het 115 12Ô 125
Ser Vâl Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Cln Ser
110 135 140
Leu Leu Lys Asp 61 u Alâ. Lêu. Ãiã Xl £ Alô A.l-3. I^ü G!li Léii LeM Ptò
145 150 IBS 160
Arg Glu. Leu Phe Pro Pro Leu Phs Met Ala Ala Phe Asp Gly Asg His
165 170 175
Ser Cln Thr Leú Lys Ala Het Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu
180 ISS 190
Pro Leu Gly V«1 Leu Het Lys Gly Gln Hie Leu Mis Leu Glu Thr Phe
195 20 0 205
Lys Ala, Val Leu Asp Gly Leu Aáp Val Le« teu Ala Glft Glu Val Arg
210 215 220
Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Assa Ser His
225 230 235 240
Glrt Asp Phe Trp Thr Vãl Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser
245 250 255
Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arcj Lya Val
260 265 270
Asd Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gla Pro Phe lie Sro Val Glu Val
275 290 285
Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe Ser
290 395 300
Tyr Leu Ile Glu Lys Val LyB Arg Lys Lyg Asn Vàl Leu Arg Leu, Cye
305 310 315 320
Cys Lys Lya LeU Lye Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Abq Ile Lys Met
325 330 335
He Lesi Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val Thr
340 345 350
Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Léu Ala Lys Phe Ser Fro Tyr Leu Gly
355 350 365
Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu ser His Ile His Ala ser
370 375 380
Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu GIn Tyr Tle Ala Gln Phe Thr
385 390 395 400
Ser Glu Pbe Leu Ser Ley Gln Cye Leu <31» Ala Leu Tyr Val Asp Ser
405 410 4I5
Leu Pbe Pbe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val Met
420 425 430
Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Lea Ser Glu Gly
435 440 445
Agp vai Ket His Leu Ser Glrt ser Pro ser vai Ser Gla Leu ser vai
450 4SS 460
Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro Leu 465 476 475 480
Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr teu Qln Asp Leu Val Phe
485 490 495
Asp Glu Cys Gly lie Tlir Asp Asp Gla Iieu Leu Ala Leu Leu Pro Ser
500 505 510
Leu Ser JSis Cys Ser Gln Leu Tiir Thr teu Ser Phe Tyr Gly Asn ser
515 520 525
Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln Mis Leu Ile Gly Leu
530 535 540
Ser Asn Lêu Thr His vai Leu Tyr Pro Val Pro Leu Giu Ser Tyr Glu 545 550 555 560
Asp Xle Hig Gly Thr Leii Hie Glu Arg Leu Ala iye Leu Kie Ala
565 570 575
Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp
580 585 590
Leu Ser Aia Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp
595 600 605
Pro Glu Pro Xle Leu cys Pro Cys Phe Met Ρχο Aan Thr ser Gly Hls
610 615 620
His His His His His 625
<210> 3
<211> 1860
<212> DKA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> MDP- 20-127 - ProteinaD - PRAME - no His tail (plasmideo XCMP14)
<400> 3 atggatccaa gcagccafcte atçaâatatg gcgaataccc aaatgaaatc agaeaaaate 60 attattgstc aeegtggtgc tagcggttat ttaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgegtttg cacaacaggc tgattattta gageaagatt tagcaatgae taaggatggt 180 cgtttagtgg ttattcacga teaettttfca gatggettga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ccacatcgte atcgtaaaga tggcegttac Catgtcatcg actttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgaeaga aaactttgaa accatggaac gaaggcgttt gtggggttcc 360 atteagágéè gatacâtcag çatgagtgtg tggâcaagce caeggagact tgtggagctg 420 gcagggcaga gectgctgaa ggatgaggcc ctggccattg ccgccctgga gttgctgecc 480 agggagctct teecgccaet cttcatggca gcctttgacg ggagacacag ccagaccctg 540 aággcâatgg tgcaggçctg gecctteaco tgectGcetc tgggagtget gatgaaggga 600 caacatcttc acctqgaqac cttcaaaqct qtqcttqafcq gacttqatgt getccttgec 660 caggaggttc gccccaggag gtggaaactt cággácttct ggactgtatg gtctggaaac gaagcagctc agcecatgae aaagaagcga cagcccttca ttccagtaga ggtgctcgta gaafctgttet ectacctcat tgagaaagtg tgtaagaagc tgaagatítt tgcaatgccc gtgeagçtgg aetctattga agatttggaa gcgaáatttt Ctccttacct gggccagatg atccatgcat cttcctacat ttccccggag tctcagttcc tcagtcfcgca gtgcctgcag agaggccgcc tggatcagtt getcaggcac actaaetgcc ggctttogga aggggatgtg cagctaagtg tcctgagtct aagtggggtc caagctctgc tggagagagc ctctgccacc atcacggatg atcagctcefc tgccetcctg accttaagct tctacgggaa ttccatctee ctcatcgggc tgagcaatct gacccacgtg gaeatceatg gtaecctcca cctggagagg ttgctgtgtg agttggggcg gcccagcatg tgtggggaca gaaccttcta tgacceggag
caagtgctgg atttaçggaa gaactctcat 720 agggccâgfcc tgtãctcàtt tceagagcca ?8Ó aaagtagatg gtttgagcac agãggcagag 640 gacctgttcç Ceaaggaagg tgcctgtgat 900 aagcgaaaga aaaatgtact acgcetgtgc 960 atgcaggata tcaagatgat cctgaaaatg 102 gtgacttgta cctggaagct acccaecttg 108 attaatctgc gtágactcct cctctcceac 114 aaggaagagc agtat&tcgc ccagttcacc 120 gctctctatg tggactcttt atfctttcctt 126 gtgatgaacc cettggaaac cctctcaata 132 atgcatctgt ççcagagtcc cagcgtcagt 13 B atgctgaccg atgtaagtcc cgagcccctc 144 ctccaggacc tggtcfcttga tgagtgtggg 15Õ cctfcccctga gccactgctc ccagcttaca 15Ô atátctgcct tgcagagtet CCtgeagGaq ISZ ctgtatcctg tccccctgga gagtfcatgag 168 cttgcetatc tgcatgccag gctcagggag 174 gtetggctfca gtgccaaccc ctgtcctcac 180 ccCatcctgt gccCCtgttt eatgcetáâc 186
<210> 4
<2ll> 620 <212> í»RT
<213 > Seqüência. Artificial
<320>
<221> mp- 20-127 - ProteinaD - HSAME - no His taíl IpIasmideo TCMP14)
<400> 4
Met Asp Pro se Ser Hla ser ser Asn Met Ala. Aan Tbt Qla Met Lys
1 5 10 15
Ser Asp Lys fie Xle lie Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
20 25 30
Gla His Thr Leu Ôlu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
35 40 4S
Tyr teia Glu Gln Asp Leu Ala Met lThr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
50 55 SO
Ile His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thx Asp Vai Ala Lye Lye Phe 63 70 75 80
Pro His Arg Hie Arg Lye Asp Qly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 85 90 95 Lsu Lys Glu He OIr» Ser Leu Glu «et Thr Glu Asn Pfee Glw Thr Ket
100 J05 110
Glu Aig Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gls Ser Arg Tyr lie Ser Ket
115 120 125
Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln Ser
130 135 140
Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala lie Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro 145 150 155 160
Arg Glu Leu Pbe Pro Pro Leu Phe Ket Ala Ala Phe Asp Gly Arg His
165 110 175
Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Qln Ala Trp Pro Phe Thr Cy$ leu
100 185 190
Pro Leu Gly Val Leu Ket Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr Phe
Í9S 200 205
Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Lew Leu Ala Gln Glu Val Ajrg
21Ô 21S 220
Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser His 225 230 235 240
Gln -Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Aga Arg Ala Ser Leu Tyr ser
245 2SÔ 255
Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lya Arg Lys vai
260 265 270
Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe lie Pro Val Glu Val
275 2β© 285
Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe Ser
290 295 300
Tyr Lew Ilé Glu Lye Val Lys Asg Lys Lys Asn Va3 Leu Arg Leu Cys 3 05 3Ift JlS 320
Cys Lys Lys Leu Lys lie Phe Ala Met Pro Met Gla Asp Ile Lys Met
325 330 335
Ile Leu Lys Met Val GIn· Leu Asp Ser Ile Glu Aap Leu Glu Val Thr
340 34S 350
Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly
355 360 36S
Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu ser His He Kie Ala Ser
370 375 380
Ser Tyr He Ser Fro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe Thr 3B5 390 395 400
Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cye Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp Ser
405 410 415
Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Ãsp Gln Leu Leu Arg His Val Met
420 425 430
Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asii Cys ,Arg Leu Ser Glu Gly 435 440 44S AiSp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln fceu Ser Val
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Gly Val Met teu Thr Asp Vai Ser Pro Qlu Pro teu 465 470 AlS 480
Gin Ala Leu Lêu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu βΐη Asp Leu Val Phe
48S 490 495
Asp Glu Cys Gly Ile Thx Asp Asp Gln Leu Le« Ala Leu Leu Pro Ser
SOO 505 Sld
Leu Ser Mie Cys Ser Gla Leu Tljr Thr Leu Ser Pbe Tyr Gly Asu s«í
515 520 525
Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gla aís Leu Ile Gly Leu
530 535 540
ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu S45 SSO SSS Sêõ
Asp lie Hls Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr LeU His Ala
565 570 575
Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp
580 585 590
Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Pbe Tyr Asp
595 €00 605
Pro Glu pro Ile Leu Cyfi Pro Cys phe Het Pro Asn 610 615 620
«2x0> S <2H> 1804 <2l2> DNA
<213 > Seqüência Artificial
<220>
<223 > MDP - 2 0-127 - ProieinaD - PRAME - LEHHHHKtti (plasmideo 0ET21)
<4üÔ> S atggatccaa gcagecatte atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaate agaeaaaatc SO attâttgctc acegtggtgc tagcggttat Ctaccagagc átácgttaga atctaaagea 120 cttgcgtttg cacaacaggc tgattattta gagçaagatt tsgcraatgae Çaaggafcggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga Ctgatgttge gaaaaaattc 240 ccacatcgtc afccgtâaaga tggccgttac tatgtcatcg actttaeett aáaagaaatt 300 eaaagtttag aaatgacaga aaactttgaa accatggaac gaaggcgttt gtggggttcc 360 atteagagec gatacatcag eatgagtgtg tggaeaagce caeggagact cgtggagctg 420 gcagggcaga gcctgctgaa ggatgaggcc ctggecattg ecgcectgga gttgctgccc 480 ágggagctct tcccgccact cttcatggoa gcctttgacg gga.gaeacag ccagaccctg 540 aaggcaatgg tgcaggcctg gcecttcaee tgcçtcçctç tgggagtgct gatgaagggá €00 caacafccttc acctggagac ctEcaaagct caggaggttc gccccaggag gtggaaâctt Gaggacttct ggactgtatg gtctggaaac gaagcagctc agcecãtgac aaagaagcga cagcccttca ttccagtaga ggfcgcfccgta gaattgttct cctaccteat tgagaaagtg tgtaagaagc tgaagatttt tgçaatgecc gtgcagcegg actctattga agâtttggaa gcgaaattct ctccttacct gggccagatg atccatgcat cttcctacat ttccccggag tcfccagttcc tcágtctgca gtgcctgcag agaggccgcc tggatcagtt gctcaggcac actaactgec ggctttcgga aggggatgtg cagctaagtg tcctgâgtct aagtggggtc caagctctgc tggagagagc cfectgccacc atcacggatg atcagctcct tgccctcctg aççfctaagçt tctacgggaa ttcçatctcc cfccatcgggc tgagcaatct gacccacgtg gacatccatg gtaccctcca ccfcggagagg ttgctgtgtg agttggggcg gcccagcatg tgtggggaca gaaccttcta tgacccggag ctegagcacc accaccaeca. ccac
gtgcttgatg gacttgatgc getcettgcc 660 caagtgctgg atttacggaa gaactctcat 720 agggccagtc tgtaeteatt tccagagcca 780 aaagtagatg gtttgagcac agaggcagag StO gaoctgttcç tcaaggaagg tgcctgtgat 900 aagcgaaaga aaaatgfcact acgcctgfcgc 96 0 atgçaggata tcaagatgat cctgaaaatg 1020 gtgacttgtà cctggaagct aeccaccttg 1080 attaatctcc gtagactcct cctctcccác 1140 aaggaagagc agtatatcgc ccagttcacc 1200 gctctctatg fcggactcttt ãtttttcctt 1260 gtgatgaacc ccttggaaac cctctcaata 1320 atgcatetgt CCcagagtcc cagcgtcagt 1380 átgctgáccg ãfcgtaagtcc Cgagcccctc 1440 ctccaggacc feggtctttga tgagtgtggg 1500 çcttccçtga gccactgctc ccagcttaca 15S0 atatctgcct tgcagagtct cctgcagcaC 1520 ctgtatcctg tccccctgga gagttatgag Í6Ô0 cttgccfcatc tgcatgccag gctcagggag 1740 gtctgfctta gtgecaacGG ctgtccteac 1800 cccatcctgt gcccctgttt catgcctaac JSSO 1384
<210> 6 <211> 628 *212> PRT
<213 * Seqüência Artificial
<220>
<223> MDJP- 20-127 - ProteinaD - PRAME - LEHHHHHH (plasmídeo pET21)
<400> 6
Met Asp Pro ser ser His ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Het Lys
1 5 10 15
Ser Asp Ly3 Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyx Leu Pro
20 25 30
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
35 40 45
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Ãrg Leu VaI Val
50 55 60
Ile Jíis Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe 65 TO 7S 80
Pro Hig Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val He Asp Phe Thr 85 90 95
Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Gla Met Thr Glu Asu Piie Glti Thr Met
100 IOS IlO
Glvi Arg Ar^ Arg Leu Trp Qly Ser Ile Oln Ser Arg Tyr Ile Ser Het
IlS 120 125
Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln Ser
130 135 14 0
Leii Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala lie Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pró 145 150 ISS 160
Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His
165 170 175
Ser Gin Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Tbr Cys Leu
180 185 190
Pro Lext Gly Val Leu Ket Lys Gly Gln Hie Leu Kis Leu Glu Thr Phe
19S 200 205
Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val Arg
210 215 220
Pro Arg Arg TJfp Lys Leu Gln vai Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser His 225 230 235 240
Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser
245 250 255
Phe Fro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys Val
260 265 270
Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu Val
275 260 2&5
Leu vai Asp Leu Phe Leii Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe ser
290 295 300
Tyr Leu Ile Glit Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu Cys 305 310 315 320
Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Het Gln Asp Ile Lys Met
325 330 33S
Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser lie Glu Asp Leu Glu Val Thr
340 345 350
Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala, Lys Phe Ser Pro Tyx Leu Gly
355 360 365
Glrt Ket Ue ASri Leu Arg Arg Lsu Lêu Leu ser His Ile Hls Ala Ser
370 375 380
Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Qlu Glu Gln Tyr Xle Ala Gln Phe Thr 385 390 395 400
Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp Ser
405 410 415
Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val Met
420 425 430
Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser lie Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu Gly 435 440 445
Ãàp Val Met His Lêu Ser Gla Ser Pro Ser Val Ser Gln Itea Sec Val
450 455 460
Leu Sèr Léu Ser Qly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro Leu 465 470 475 4Θ0
Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Lea Gln Asp Leu Val Phe
485 490 495
Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ser
500 505 510
Leu Sêr His Cys Ser Gln Lew Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser
510 520 525
Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gls ser Leu Leu Gla Hie Leu Ile Gly Leu
530 535 540
Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu 545 550 555 5β0
Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg teu Ala Tyr Leu Hie Ala
565 570 575
Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp
580 5S5 590
Leu Ser Ala Asn Fro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Ttor Phe Tyr Aep
595 600 6O5
Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn Leu Glu Hls Hls
610 615 620
HiS Ris Hie His 625
c210> 7 <211> 1860 <212> DNA
<213 > Seqüência Artificial
<220>
<223> ftt>MDP- 20-127 - Proteina D - PRAME - no His tail (plasmideo pET21)
<400> 7
atggatccaa gcagccattc atcaaataeg gcgaataccc aaaEgaaatc agacaaaatc 60 attattgcte accgtggtge tageggttat tfcaccagagc atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg cacaâcaggc tgattatttã gâgcaegatt tágcaatgae Caaggaeggt 180 cgtttagtgg ttattcacga tcacttttta gatggcttga ctgatgttgc gaaaaaattc 240 ceaeatcgtc atcgtaaaga tggcegtEac tatgteateg aetttacctt aaaagaaatt 300 caaagtttag aaatgacaga aaactfctgaa aecatggaac gaaggcgttt gtggggttcc 360 attcagagcc gatacatcag catgagtgtg tggacaagcc cacggagact tgtggagçtg 420 gcagggcaga gcctgctgaa ggafcgaggcc agggagetct tcccgccact ettcatggca aaggcaatgg tgcaggcctg gcccttcacc cãacatcttc aectggágãc cfctcãáagct caggaggtte gccccaggag gtggaaaett caggaettct ggactgtatg gtctggaaac gaagcageCc agcccatgac aaagaagcga cagceettea Ctecagtaga ggtgeecgta gaattgttcfc cctacctcat tgagaaagtg Cgtaagaagc tgaagatttt tgcaatgccc gtgcagctgg actetattga agattfcggaa gcgaaatttt ctccttacct gggccagatg atceatgcat çttcctacat fecccccggag fectcagttcc tcagtctgca gtgcctgcag agaggccgcc tggatcagtt gctcaggcac actaactgcc ggctttcgga aggggatgtg çagccaagtg tcetgagtct aagtggggtc caagctctgc tggagagagc etctgeeace atcacggatg atcagctcct tgccctcctg aeeetaagct fcctacgggaa tcccatctcc ctçatcgggc tgagcaatet gaeeeacgtg gacatccatg gtacectcca cctggagagg ttgetgtgtg agttggggcg gcccagcatg tgtggggaea gaaccttcta tgaeceggag
ctggccattg ccgccctgga gfctgctgccc 480 gcçtttgacg ggagacacag ccagaccctg 540 fcgcctcccte tgggagfcgct gatgaaggga 600 gtgcttgatg gâcttgafcgt gctccttgcc €60 eaagtgctgg atttaeggaa gaactcteat 720 agggccagtc tgtactcatt tccagagcca 780 aaagtagatg gtttgageac agaggcagag 840 gaeetgttcc fceaaggaagg tgcctgcgat 900 aagcgaaaga aaaatgfcact acgcctgtgc 960 atgcaggata tcaagatgat cctgaaaatg 102 gtgacttgta cctggaagçt âceçaecfctg 108 attaatctgc gtágactcet cctctcccac 114 aaggaagagc agtatatcgc çcagttcacfc 120 getetctatg tggactettt atttttCCtfc 126 gtgafcgsace ccttggaaac cetcteaata 132 atgcatctgt cccagagtcc cagcgtcagt 138 atgetgaccg atgtaagtec egagcecctc 144 cteeaggaec tggtctttga tgagtgtggg ISO cettccctga gccactgctc ccagcttaca 156 atatetgcct tgcagagtct cctgcagcac 162 çtgt&ecetg teeccctgga gagtfeatgag 160 cttgcctate tgcatgccag gctcagggag 174 gtctggctta gfcgeeaaccc ctgtccteae 180 cceatectgt gcçcctgttt catgcctaac 186
<210> β <21l> 6?0 <212> PHT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> MDP- 20-12? - ProteinaD - PRAMB - nO Hie tail
(p lasmideo pERl) <4O0> 8
Met Asp Pro Ser ser His Ser ser Asn KeE Ala Asn Thr Qln Met Lys
1 5 10 IS
Ser Asp Lye Ile He Ile Ala His Arg Gly Ala ser Gly Tyr Leu Pro
20 25 30
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Alá Leu Ala Phe Ala Gln Sln Alá Asp
35 40 45
Tyr líéu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val SO SS 60 Ila Hie Asp Kis Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Phe
65 70 75 80
PrO His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Aep Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Glti ser Leu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr Het
100 105 110
Glw Arg Arg Arg Leu Trp Qly Ser lie Gln Ser Ârg Tyr Ile Ser Mat
115 120 125
Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln Ser
130 135 140
Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro
145 I5O I55 160
Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg His
165 170 175
Ser Gln Thr Leu Lys Ala MeC Val Gla Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu
180 185 190
Ptó Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr Phe
195 200 205
Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val Arg
210 215 220
Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser Mis
225 230 235 240
Gln ASp Phe Trp Thr VaI Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyt Ser
245 250 255
Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Wet Thr Lyg Lys Arg Lys Val
260 65S 270
Asp Gly Lsu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu Val
275 280 285
Leu Val Asp Leu Phe Leu Lyg Glu Gly Ala Cys Asp Giu Leu Phe Ser
290 295 300
Tyr Leu He Glu Lys vai Lys Arg Lys Lys Asn vai Lea Arg teu cys 305 310 315 320
Cys Lys Lys Leu Lys lie Phe Ala Met Pro Met Gln Asp lie Lys Met
325 330 335
lie Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val Thr
340 345 350
Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly
355 360 365
Gln Met lie Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala Ser
370 375 380
Ser Tyr He Ser Pro Giu Lys Glu Glu Gln Tyr He AXa Gln Phe Thr 385 350 395 400
Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp Ser 405 410 415 Lea phe Phe teu Arg Gly Arg I«eu Asp Gla Leu Leu Arg His Val Mêt
O 425 430
Asn Pro Leu Gla Thr Leu ser Ile THr Aãn Cye Asrg Mtí Set Glu Gly
415 440 445
AMp vai Met His Lew Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln teu Set Val
450 455 4«Õ
Leu ser Leu Ser Gly Va 1 Met Lea Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro Lett 465 410 475 4fiO
Gln Ala !seu Leu Glu Arg Al& ser Ala Tbjr Lêu Gln Asp Leu vai Phe
485 430 435
Asp Glu Cya Gly Ile Tbr Asp Aep Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro Ser
500 505 510
Lew Ser His Cys Ser Glln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn Ser
SlS 520 525
Ile ser He ser Alá Leu Gln Set Leu ela Hie Leu Ile Gly tóu
530 S3S 54 0
Ser Asn Leu Thr Mis Val Leu Tyr pro Val Pxo Leu Glu Ser Tyr Slu 545 550 555 560
Asp lie His Gly Th.r Lea His teu Glu Arg Leu Ala Tyr Lem His Ala
5«5 570 575
Arg Leu Arg Glu Leu Leu Çy§ Slu Leu Gly Arg Pro Ser Mefc Val Trp
58© 58S S90
Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe iTyr Asp
595 600 605
Pro Glu Pro lie Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn 6X0 615 620
<210> 9 <2il> 1878 <212> OilA
<213 » Seqüência Artificial
<220>
<223> NDP- 20-127 - ProtemaD - PHAME - HHHHHH (plasmídeo pET26)
e400> 9
atggátccââ gcagccítee atcaaatatg
attatfcgctc accgtggtgc tageggttat cttgcgtttg cacaacaggc fcgafctattta Cgtttagtgg Stattcacga tCacttttfcâ. ccacatcgtc atcgtaaaga tggccgttac caaagtttag aaatgaeaga aaacttEgaa
gcgaataccc aaatgaaatc agacaaaatc 60 ttaccagagc aCacgttaga atctaaagca 120 gagcaagatt tagcaatgae taaggatggt 180 gâtgfcttga ctgafcgttge gaaaaaatte 240 tatgtcatcg aetttacett aaaagaaatt 300 accatggaac gtcgtcgtce gtggggcagc 360 atteagagec gttatattag çatgagcgcg tggaccagcc cgcgtcgtct ggttgagctg 420 gccggccaga gectgetgaa agatgaagcg ceggccattg eggçgctgga gctgctgceg 480 cgtgagctgt ttccgccgcfc gtttatggcg gcgttegatg gccgCcatag ceagaccctg 54 0 aaagcgatgg tgcaggcgtg gccgfcttacc tgtctgccgc tgggcgtgct gatgaaaggc 600 cagcatctgc atctggaaac ctttaaagcg gtgctggatg gcCtggatgt gctgctggcc 66 o caggaagttc gtçegcgteg ttggaaactg caagtgctgg atctgcgtaa aaacagccat 720 caggattttt ggaccgtgtg gagcggeaat cgtgcgagcc tgtatagctt tccggaaccg 780 gaagcggcgc agecgatgae caaaaaacgt aaágtggacg gcctgagcac cgaagcggaa 340 câgccgtttâ ttccggtgga agtgctggtt gacctgtttc tgãaagaagg cgcctgcgac 900 gagçtgttta getatetgat cgaaaaagtg aaacgcaaaa aaaacgtgct gcgtctgtgc 960 tgcaaaaaac tgaaaãtçtt cgcgatgccg atgcaggata ttaaaafcgat cctgaaaatg 1020 gtgcagctgg atagcattga ggacctggaa gtgacctgca cctggááact gccgsccctg IOSD gccaaattta gcccgtatcç gggccagatg attaacctgc gtcgtctgct gctgtctcat 1140 attcâtgcga gcagctatat tagcçcggaa aaagaagaaç agtatafccgc gçagtttacc 1200 agccagtttc tgagcctgca átgtctgcaa gcgctgtatg tggatagcct gttttttetg 1260 cgtggccgtc tggatcagct gctgcgtcat gtgatgaatc cgctggáaac cctgãgcatt 1320 accaactgee gtctgagcga aggegatgcg atgcatctga gccagagccc gagcgttagc 1380 cagctgtctg ttetgagcct gageggcgtg atgetgâçcg atgtgageec ggaaccgctg 1440 caagccctgc tggeacgtgc gagégcgacc Ctgcaagacc tggtgtttga tgaatgeggc 1500 afctaccgatg atcagctgct ggccctgctg ccgagcctga gccattgcag ccagctgacc 1560 ôCCetgagcfc tttatggçaa eagcattagc attagcgcgc tgcaaagcet gctgcaacat 1620 ctgattggcc tgagcascct gacccatgfcg ctgtatccgg tgccgetgga aagctatgaa 1680 gatattcatg gcaccctgca tctggaacgt. ctggcctatc tgcacgcgcg tctgcgtgag 1740 ctgctgtgcg ^getgggeeg tccgagcatg gtttggctgt ctgcgaatcc gtgeccgcat 1800 tgcggcgatc gtacctttta tgatccggaa ccgattctgt gcccgtgctt tatgccgaac 1860 caeeaceacc açcaccac 1878
<;2ίΟ> 10 <211> 626 <2V2> PRiT
<213? Seqüência Artificial
<223> MDP- 20-127 - PioleinaD < I1RAME - HHHffiffl (plasmídeo pET26)
<400> 10
Met Asp Pro Ser Ser Hie Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Ket Lys
1 5 10 15
Ser Asp Lys Ile He Ile Ala His Arg GXy Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
20 25 30
Glti His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Glti Ala Asp
35 40 45
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala PSet Thr Lys Asp Gly Axg LeW Val Val 50 55 SO
Ile His Aap His Phe leu Αβρ Gly Leu Hit Asp VaI Ala Lys Lys Ptie 65 70 75 80
Piro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glw MeC Tbr Glu Asn Phe Glu Ihr Hst
10Õ 105 HO
Glu Arg Airg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Glii Ser Arg Tyr Ile Ser Met
115 120 125
ser vai Trp Thr ser Pro Arg Arg Leu vai Glu Leu Ala Gly Gln Ser
130 135 140
Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro 145 150 155 160
Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Alá Phe Asp Gly Arg Hig
l65 170 175
Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met vai Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu
180 185 190
Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Ihr Phe
195 200 205
Lys Ala Val Leu Agp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val Arg
210 215 220
Pró Arg Arg Trp Lya Leu Glti vai Leu Asp Leu Arg Lys Asn ser Hls 225 230 235 240
Glri Asp Ptoe Trp Thr vai Trp Ser Gly Aen Arg Ala Ser Leu Tyr Ser
245 250 255
Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Mefe Thr Lys Lys Arg Lys Val
260 265 270
Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Giu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glú Val
275 200 285
l»eu vai Asp Leu Piie Leu Byg Qlu Giy Ala Cyg Asp Olu Leu Phe ser
290 295 300
Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu Cys 305 310 315 320
Cys Lys Lyg Leu Lyg Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile LyS Met
325 330 335
Ile Leu Lys Met Val Glri Leu Asp Ser lie Glu Asp Leu Glu Val Thr
340 345 350
Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly
355 360 365
Gla Mefc Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala ser
370 375 380
Ser Tyr Ile ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr lie Ala Gln Phe Thr 385 390 395 400
Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp Ser 405 410 4X5
Leu Phe Ptie Leu. Arg Gly Arg Leu Aep Gln Leu Leu Arg His Val Met
420 425 431?
Aen Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu Gly
435 440 445
Asp Val Kêt His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Vsl Ser Gln teu Ser Val
450 4SS 450
Leu ser Leu ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glti Pro Leu 4S5 470 475 480
Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ma Ser Ala Tkr Leu Gln Asp Leu Val Phe
485 490 495
Asp Glu Cys Gly Ue Thr Asp A&p Gln LeU Leu Ala Leu Leu Pro Ser
500 SOS 510
Leu ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn ser
515 520 S25
Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Jjeu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu
530 S 3· S 540
Ser Aen Lea Thr His Val Leu Tyr Pra vai Pro Leu Glu Ser Tyr Glu 545 550 5S5 560
Asp Ile Hls Gly Thr Leu Mis Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu Mis Ala
565 570 575
Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg PrO Ser Met Val Trp
58Q S85 590
Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp
SSS SOQ €0S
PrO Gltt Pro Ile L»u Cyg Pto Cys Phe Met Pro Aen ffis His His His
610 615 620
HiS HiS 625
<2l0> 11 <211> 1850 <212> DUA
<213 > Seqüência Artificial
<220>
<223 > MDP- 20-127 - ProteinaD , PRAME - sem cauda de His (p lasmideo pET26)
<400> 11
atggatccaa geagceattc atcaaatatg gcgaataccc aaatgaaatrc agacaaaatc €0 âtfcattçfcte âccgtggtgc tagcggttafc ttaccagagç atacgttaga atctaaagca 120 cttgcgtttg cacaácággc tgáttattta gagcaagátt tãgcaatgac taaagatggt 180 çgtttágtgg ttattcacga tcacttttta ccaçatçgtc ategtaaaga tggecgttac caaagtttag aaatgacaga aaactttgaa attcagagcc gttafcattag catgagcgtg gccggccaga gcctgctgaa agatgaagcg egtgagctgt ttccgccgct gtttatggcg aaagcgatgg tgcaggcgtg gccgtttace cagcatctge atctggaaac çtttaaagcg caggaágttc gtccgcgccg ttggaaactg caggatEttt ggaccgtgcg gagcggcaat gââgcggcgc ágccgatgac caaaaaacgt cagccgttta ttccggtgga agtgctggtt gagetgttta gctatcrgat egaaaaagtg tgcaaaaaac tgaaaaeett cgcgátgccg gtgcagctgg átagcáctga ggacctggaa gccaaattta gcccgtatct gggccagatg attcatgcga gcagetatat tageccggaá agccagtttc tgagcctgea atgcctgcaa cgtggccgte tggateagct getgcgtcat âccaactgcc gtctgagega aggcgatgtg cagctgtctg tfcctgagcct gagcggcgtg caagccctgc tggaaegtgc gagcgcgacç attaccgatg àtcãgctget ggccctgctg accçtgagct tttatggcaa eagcattage ctgattggcc tgagcaacct gacccatgtg gatattcatg gcaccccgca tctggaacgt ctgctgtgeg agçtgggçcg tccgagcatg tgcggcgatc gtacctttta tgatccggaa
gatggectga CtgaegttgG gaaaaaattc 24 0 tafcgtcatcg actttacett aaaagaaatt 300 aecatggaac gtcgfccgfcce Stggggeagc 360 tggaccagcc cgcgtcgtct ggtCgagctg 420 ctggccattg eggcgctgga gctgctgceg 480 gcgtttgàtg gccgtcatâg ccâgaccctg 540 tgtctgccgc tgggcgtgct gatgaaaggc SOO gtgctggatg gcctggatgt gctgetggcc 660 caagtgctgg acctgcgtaa ãaacágccat 720 cgtgcgagcc tgtatagctt Cccggaacçg 780 âáagtggatg gcetgagcaç cgaagcggaa 840 gacctgttfcc tgaaagaagg cgcctgcgac 90Ô aaacgcaaaa aaaacgtgct gcgtctgtgc 960 atgcaggata teaaaatgat cctgaaaatg 1020 gtgacctgca cctggaaact gccgaccctg 1080 attaacctgc gtcgtctgct gctgtctcat 1140 aaagaagaae ag çatatrcgc fcagfcttacç 1200 gcgctgtatg tggátagcct gttttttctg 1260 gfcgatgaacc egctggaaac cctgagcatt 1320 atgcatetga gccagagcec gagçgttagc 1380 atgctgaccg atgtgagccc ggaaccgctg 1440 Ctgçaagacc tggtgtttga tgaatgcggc 1500 ccgagcctgã gccãttgcag çcãgetgãcc 1560 attagcgcgc tgcaaagcct gctgcaacat 1620 ctgtatccgg tgccgctgga aagctatgaa 168Ό ctggcctatc cgcacgcgcg tctgcgtgag 1740 gtttggctgt c ^gicgaat cc gtgcccgcat ISOO cegattctgt geccgtgctt Catgccgaae 1860
<210> 12 <2li? 620 <212> PRT
<213» Seqüência Artificial
<22Ô>
<223> I4DP- 20-127 - ProteinaD - PMME - sem cauda de His (plasmídeo pÈT2õ)
<400> 12
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1 5 10 IS
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Als His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Giu Mis Thr Leu OIu ser Lya Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
35 40 ' 45
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
50 55 60
Ile His Asp His Pte Lew Asp Gly Leu Tbr Asp Val Ala Lys Lys Phe 65 70 75 80
Pro His Arg His Argr Lys Asp Gly Arg Tyr lyr Val Ile Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Qlu Ile Glii Sei Leu Glu Mêt Thx Glu Asn Phe Glu Thr Met
100 · 105 110
Olu Arg Arg Arg Lea ττρ Gly Ser Ile GJn Ser Arg Tyr He Ser Ket
IlS 120 12S
Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Olu Leu Ala Qly Gln Ser
130 135 140
Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu Pro 145 150 155 160
Arg Glu Leti Phe Fro Pro La» Phe Met Ala Ala Phe Aep Gly Arg Hjs
165 170 175
Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys Leu
isô 185 19Ô
Pro Leu Gly VaI Leu Met Lys Gly Gln His Leu Hig Leu Glu Thr Phe
195 200 2QS
Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Aep Val Leu Leu Ala Gln Glu vai Arg
210 2IS 220
Pro Atg Arg Trp Lys Leu Glft vai Leu Αερ Leu Arg Lys Asn ser His 225 230 235 240
Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr Ser
245 250 255
Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala GIn Pro Met Thr Lys Lye Arg Lys Val
2 60 265 270
Αερ Gly Leu Ser Thr Olu Ala <3Jtt Gln py© Phe lie Fro Val Glu Val
275 28 0 285
Leu Val Aep Leu Phe Leu Lye Glu Gly Ala Gys Asp Glu Leu Phe Ser
290 295 300
Tyr Leu lie Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu Cys 305 310 315 320
Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Ket Pró Met Gln Aep Ile Lys Met
325 330 335
Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Vãl Thr
340 345 350
Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu Gly
35S 360 365
Gln Met lie Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His lie Sis Ala Ser 370 375 380 Ser Tyir Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Fhe Thr 3SS 390 395 4OO
Ser Gln Pbe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp Ser
4OS 410 415
Leu Pbe Phe Leu Arg Gly Arg teu Asp Gln Leu Leu Arg His Val Met
420 425 4Í0
Asn Pro Leu Glu Thr Leu ser He Thr Asn Cys Arg Levs Ser Glu Gly
43S 440 445
Asp Val Met His Leu Ser Gln ser Pro Ser Val Ser Gln Leu ser vai
450 455 460
Leu Ser Leu Ser Gly Val MeE Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro Leu 465 470 475 400
Cln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val Phe
4β5 490 495
Asp Glu cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro ser
500 505 510
Le« Ser Mis Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asm Ser
515 520 525
Ue Ser He ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu He Gly Leu
530 535 540
Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu 545 55Ô 555
Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu Mis Ala
5 SS 570 575
Arg Leu Arg Glu Leu LeU Cys Glu Leu Gly Arg Pro Sec Mec Vel Trp
580 585 590
Leu. Ser Ala Asn Pro cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp
595 500 605
Fro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Het Pro Asn 610 615 620
<210> 13
<2H> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<4003- 13
Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu 1 5
<210> 14 <211> 10 <212> PST
<213> Homo sapiens
<400> 14
Ser Leu Tyr Ser Phe Pro Qlu Pro Glu Ala 1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ala Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu 1 5 10
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu
1 5
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Ser Leu Leu Gln His Leu lie Gly Leu l 5
<210> lô
<211> ae
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
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atataaeafca tggatccaâg cagccâttoa tcaaat
<210> 19 <2115- 40 <212> DHA
<213> Sequeiucia Artificial
<220>
<223> antisense oXigoKUcleofcíde CWWJ7 <400> 19
ccacaaaegc ctecgctcca tggtttcaaa gttttctgtc
<210> 20 <211> 40 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Oligoilucleotuleo CAN036 de sexiüde
<400> 20
gacagaaaac tttgaaacca tggaacgaag gcgcttgtgg
<210> 21 <211> 39 <212> ONA <213>
<220>
<223> O ligonut leotídeo CAN029 anti-sentido
<400> 21
agagagacta gtctagttag gcatgaaaca ggggcacag
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> Seqüência Artifirial
<220> <223 > Oligonucleotideo anti sentido CAN002
<400> 22
ggaggaacta gtgtfcaggca tgaaacsggg gcacag
<2tO> 23 <2ll> 36 <2X2 > IDMA
<213 > Seqüência Artificial
<22G>
<223> O ligo mu leotídeo CAN040 de sentido
400 23
agagacjcatâ tgagcagcca ttcatcaaat atggcg
c210> 24 <211> 41 <312> PWA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Oligonucleotideo CAN032 anti-sentido
<400> 24
aegtgggcgg ccgcggtfctc aaagttttct gtcatctcta
<210» 25 <211» 39 <212> PI-Ift
c 213 > Seqüência Artificial
<220 >
<223> Olisonucleotideo CANÜ33 de sentido
<400> 2S
Ctgttggcgg ccgcaatgga acgaaggcgt ttgtggggfc
<210> 2S <211> 36 <212> DNA
<213> SeqüênciaArrifirial
<220> <223> O ligo núcleo tídeo CAN034 anti-sentido
<400> 26
ggaggacteg aggttaggca tgaaacaggg gcacag
<2105· 27 39
<212> DNA
<2l3> Seqüência Artificial
<220>
<223> Olisonucleoiideo CAN035 anti-sentido
<400> 2T
ggaggacteg agctagttag gcatgaaaca ggggcacag
<210> 28 <2ll> 31 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223 > Oligonucleotideo CAN106 de sentido
<400> 2a
cagaaaactt tgaaaccatg gaacgaaggc g
<210> 29 <211> 31 <212> PSA
<215 > Seqüência Artificial
<220>
<223 > O ligonuc leotideo CAN107 anti-sentido
<400> 29
cgcettçgtt ccatggtttc aaagttttct g
<210> 30
<211> 43
<212> DHA
<213> Seqüência Artificial <223> Oligomicleotideo CAN104 de sentido
<400> 30
ggagatatac atatggatcc aagcagccat tcatcaâata tgg 43
<210> 31 <211> 43 <212> DNA
<213>Seqüência Artificial
<220> Oligonucleotideo CAN105 anti-sentido <223 > Seqüência Artificial
<400> 31
ccatátttga tgaatggctg cttggatcca tatgtatatc tec 43
<210> 32 <211> 40 <212> BNA
<213? Seqüência Artificial
<220>
<223 > O ligo núcleo tídeo CAN123 de sentido
<400> 32
gacagaaaac tttgaaacca tggaacgtcg tcgtctgtgg 40
<210> 33 <211> 40
<212> DKA
<213>Seqüência Artificial
<220>
<223> Oligonucleotídeo CAN124 anti-sentido
<400> 33
ccacagacga. cgacgttcca cggtccc-aaa gttttcfcgtc 40
<310> 34 <211> 30 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220> <223> Oligonucleotideo CAN199 de sentido
<400> 34
ggaactccat atggatccaa gcagccattc
<210> 55 <211> 53 <212> DHA
<213 > Seqüência Artificial
<220>
<223> Oügomicleotídeo CAN19 anti-sentido
<40Ó> 35
ggagetctcg agtcagtggt ggtggtggtg gtggttcggc ataaagcacg ggc
<210> 36 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo CpG 1826 inuinoestiimilatórin
<400> 36
fcccatgacgt tectgaçgtfc
<210> 3?
<211> IB
<212 > DHA
<213 » Seqüência Artificial
<220>
<223> Oligonucleotideo CpC 1758 imunoestinvulatório
<4O0> 37
tctcccágcg cgcgccac
<210> 38
<211> 54 <212> ONk
<213> Seqüência Artificial
<220> 26
<223> Oligonucleotídeo CpG2006 imunoestimulatório
<400> 38
accgatgacg tcgccggtga eggcaccacg tcgtcgtttt gtcgttttgt cg Ct
<21Ó> 39 <211> 20 <212j. WA
<213» Seqüência Artificial
<220>
<223 > Oligonucleotideo CpG1668 ϊηνιιηοestiimilatório
<400 > 39
tecatgacgt tcctgatget
<210> 40 <211> 22 <212> tmh
<213 > Seqüência Artificial
<220> <223> Oligonucleotideo CpG5456 imunoestrmulatório
<400> 40
tcgacgtttfc cggegcgcgc cg
<21O> 41
<211> 127 <212> PRT
<223> Haemophilus ínfIaenzae b <40Õ> 41.
Met Lys Leu Lys Thr Leu Ala teu
1 5
Ala Gly Cys Ser Ser His Ser ser 20
Ser Asp Lys lie lie lie Ala His
15 40
Glu Hls Thr Leu Qlu Ser i»ys Ala
50 55
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met 65 70
Xle Hls Asp His Phe Leu Asp Gly
Ser Leu Leu Ala 10
Aan Met Ala Asn 25
&rg Gly Ala. Ser
Leu Ala Phe Ala 60
Thr Lys Aep GJy 75
Lèü Thr Asp Val
Ala Gly Vã! Leu 15
Thir Gln MeC LyS 30
Gly Tyr Leu Pro 45
Gln ©In Ala Asp
Arg {«eu Val vai 80
Ala Iiys Lys Phe 85 90 95
Pro His Arg Mis Arg Lys Asp Qly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
100 105 110
Iteu Lys Glu Ile Gla Ser Leu Glw Mat Thr Gla Asa Phe Glu Thr 115 120 125
<210> 42
<211> 111
<212> PRT
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> I-Met; 2-ASp; 3-PrO; seguido por AA 20 a 127de proteína D
<400> 42
Met Asp Pro Sei: Ser His Ser Ser Asn Ket Ala Asn Thr Gla Het Lys
1 S 10 15
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala Eis Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro
20 25 30
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gln Gln Ala Asp
35 40 45
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val
50 55 60
IXe His Aep Hia Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp VaI Ala Lys Lys Phe «5 70 75 80
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr
85 &0 SS
Leu Lys Glu Ile Gln Ser Leu Glu Met Thr Glu Asa Pfee Glu Thr 100 105 110
<210> 43
<211> 450
<212> PRT
<213> Seqüência Arrtfirial
<220>
<223> Proteína D -MAGE-A3 «His
<400> 43
Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu 15 10 15 Alã Gly Cys Ser Ser Bis Ser Ser Asrt Met Ala Asn Thr Gln Met Lys
20 25 30
Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Iyr Leu Pró
35 40 4S
Glu His Tfar Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Phe Ala Gla Gln AJa Aep
50 55 60
Tyr Lew Glu Gln Asp Leu Ala MeC THr Lys Asp Gly Ar^ Xseu Vsil Vü 1 65 70 75 80
Ilê His ASp His Phe tóu Asp Gly Leii Tkr Asp Val Ala Lys LyS Phe
85 90 95
Pro Sle Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Tlir
100 105 110
Leu Lys Glu Ile Glft Ser Lêu Glu Met Thr Glu Asrt Phe Glu Thr Wet
115 120 125
Aep Leu Glu Glft Arg Ser Glis His Cyg Lys Pjtq <jJo Glti Gly Leu Glu
130 135 140
Ala Arg Gly Glu Alã Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala Thr 145 150 155 160
Glti Glu Gln GJu Ala Ala Ser ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val Thnr
165 170 175
Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Fro Asp Pro Pro Gln Ser Pro
180 Í8S 190
Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp Ser
195 200 205
GIji ser Tyr Glu Asp Ser ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro ser Thr
210 215 220
Phe Pro Asp Leu Glu ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys Val 225 230 235 240
Alã Glu Lou Val His Phe Leu Leu Leu Lya Tyr Atgf Ala Arg Glu Pro
245 250 255
Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln Tyr
260 265 270
Phe Phe Fro Va1 Ile Fhe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu Val
275 280 285
Phe Gly He Glu Leu Met Glu V3I Asp Pro lie Gly His Leu Tyr Jle
290 295 300
Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Ley Lêu Qly Asp Asn 305 310 315 320
Glp He Het Pro Lys Ala Gly Leu Lew He Ile Val Leu Ala Ile Ile
325 330 335
Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys lie Trp Glu Glu Leu
340 345 350
Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly Asp 355 360 365 Pro Lys Lys Leu 37 0
Tyr Arg αϊ» Val 3 65
Gly Pro Arg Ala
Met Val Lys Ile 420
Olu Trp Val Leu 43S
His Hie 450
Dea Thr Glβ His 375
Pro Sly ser Rsp 3S&
Lea Val Slu Hir 405
Ser Gly Gly Pro
Arg Glti Gly Glw 440
Phe vai Gln Glu 380
Pro Ala çys Tyr 39S
Ser Tyr Val Iiys 410
His Ile Ser Tyr 425
Glw Gly Gly His
Asn Tyr Ley Glu
Glu Phô Leu Trp 400
Val Leu His Hlã 415
Pro Pro Leu Hls 430
Has His His His 445
<210> 44 <211> 109 <212> PRT
< 213 > Seqüência Artificial
<22 0>
<2 2 3 > ft aa Aa prafatn» Π <Tp H»mqihflM Sgflwra» para uso cm imia «equêntia pDl/3-KâSE-ffis
<400> 44
Met Ser ser His Ser Ser Asu Met Ala Asn Thr Gl.a Wet Lys ser Asp
1 5 10 15
Lys Ile Ile Ile Ala Hls Arg Gly Aia Ser Gly Tyr leu Pro Glu His
20 25 30
Thr Leu. Glu Smt hys Ala Leti Ala Kie Ala Gln Gln Ala Asp Tyr Lêu
3S 40 45
Glu Gln Asp Leu Ala Ilet Tlir Lys Asp Gly Arg Leu Val Val Ile His
SO 55 60
Aep His Phe Leu Asp Gly Leo Tbr Asp vai Alá Lys Lyg Phe Pro Hás 6S fê Θ0
Arg Hie Atg Lye Asp Gly Atg Tyr Tyr VaI Ue Asp phe Thr Leu Lys
85 90 95
Glu He GIn Ser Leu Glu Ket TJir Glu Asn Phe Glu Thr 100 105
<210> 45
<2 Jl> 127
<212 > PitT
<213? Seqüência Artifiefel <220>
<223 > ο aa da proteína D de Haemophilus inílueinae para uso em uma seqüência ρ Dl/3-MAGE-His
<400> 45
Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Val Leu 1 5 10 15
Ala Gly Cys Ser ser Mis Ser ser Asn Met Ala Asn Thr Gln Met Lys 20 25 30
Ser Asp Lys Ile Ilè Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro 35 40 45
Glu His Thr Leu Glu Ser Lys Ala Leu Ala Plie Ala Gln Gln Ala Aso 50 55 60
Tyr Leu Glu Gln Asp Leu Ala Met Thr Lys Asp Gly Arg Leu Val Val 65 70 75 80
lle His Asp His Phe Leu Asp Gly Leu Thr Asp Val Ala Lys Lys Fhe 85 90 95
Pro His Arg His Arg Lys Asp Gly Arg Tyr Tyr Val Ile Asp Phe Thr 100 105 110
Leu Lys Glu Ile Gln ser &eu Glu Met Thr Glu Asn Phe Glu Thr 115 120 125

Claims (35)

1. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) PRAME ou um fragmento imunogênico do mesmo, e (b) um parceiro de fusão heterólogo proteína derivado da proteína D, em que o dito parceiro da proteína de fusão não inclui a seqüência de secreção ou seqüência sinalizadora de proteína D.
2. Proteína de fusão parceira derivada da proteína D, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão parceira compreende aminoácidos Met-Asp-Pro em ou dentro do terminal N da seqüência de proteína de fusão e em que a proteína de fusão parceira não inclui a seqüência de secreção ou seqüência sinalizadora de proteína D.
3. Proteína de fusão parceira de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a seqüência de proteína D compreende ou consiste de aproximadamente ou exatamente dos aminoácidos 17 a 127, 18 a 127, 19 a 127 ou 20 a 127 de proteína D.
4. Proteína de fusão parceira de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que um ou mais aminoácidos da proteína de fusão parceira de proteína D são anulados ou substituídos pela substituição.
5. Proteína de fusão parceira de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que os aminoácidos são substituídos por substituições conservativas.
6. Proteína de fusão parceira de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais aminoácidos são substituídos.
7. Proteína de fusão parceira de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a seqüência de secreção ou seqüência sinalizadora de proteína D refere-se aproximadamente aos aminoácidos 1 a 16, 17, 18 ou 19 da proteína de ocorrência natural.
8. Proteína de fusão parceira de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que a secreção ou seqüência sinalizadora de proteína D é o terminal N de 19 aminoácidos de proteína D.
9. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de fusão parceira como definida em qualquer uma das reivindicações de 2 a 8.
10. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de fusão parceira como definida em qualquer uma das reivindicações de 2 a 8 e um ou mais antígenos tumorais ou porções imunogênicas dos mesmos.
11. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que compreende o antígeno tumoral PRAME ou uma porção imunogênica dos mesmos.
12. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou 11, caracterizada pelo fato de que o fragmento imunogênico ou porção de PRAME compreende ou consiste de um ou mais dos seguintes epítopos: VLDGLDVLL (PRA100"108; SEQ ID N°: XX); SLYSFPEPEA (PRA142"151; SEQ ID N0: XX); ALYVDSLFFL (PRA300'309; SEQ ID N°: XX); LYYDSLFFL (PRA301"309; SEQ ID N°: XX) e SLLQHLIGL (PRA425"433; SEQ ID N°: XX).
13. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais dos seguintes antígenos de tumor ou derivados de antígeno de tumor ou uma porção imunogênica dos mesmos: MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE -5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE -12, MAGE Bi, MAGE B2, MAGE B3, KlAGE B4, MAGE Cl, MAGE C2.
14. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos podem ser anulados de ou substituídos na seqüência de aminoácido do antígeno MAGE.
15. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que os 2 aminoácidos são anulados a partir do terminal N da seqüência de MAGE.
16. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 13, 14 ou -15, caracterizada pelo fato de que o antígeno é MAGE-A3 ou uma porção imunogênica do mesmo, em que o antígeno de MAGE-A3 compreende ou consiste do aminoácido 3 a 314 de MAGE-A3.
17. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pela fato de que o antígeno tumoral ou derivado do mesmo é selecionado de um dos seguintes antígenos ou uma porção imunogênica dos mesmos que é capaz de direcionar uma resposta imune ao antígeno: WT-1. WT-1F, BAGE, LAGE 1, LAGE 2 (também conhecido como NY-ESO-1), SAGE, HAGE, XAGE, PSA, PAP, PSCA, P501S (também conhecido como prosteína), HASHl, HASH2, Cripto, B726, NYBR1.1, P510, MUC-1, Prostase, STEAP, tirosinase, telomerase, survivin, CASB616, P53 e/ou Her- -2/neu, SSX-2; SSX-4; SSX-5; NAl7; MELAN-A; P790; P835; B305D; B854; CASB618 (como descrito em WOOO/53748); CASB7439 (como descrito em WOOl/62778); C1491; C1584 e C1585.
18. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou de 9 a 17, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um rótulo de afinidade.
19. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 ou 10 a 18, caracterizada pelo fato de que, adicionalmente, compreende uma ou mais seqüências ligadoras entre a proteína de fusão parceira e o antígeno tumoral ou porção imunogênica deste e/ou entre a proteína de fusão parceira e uma cauda His ou outro rótulo de afinidade e/ou entre o antígeno tumoral ou porção imunogênica deste e uma cauda His ou outro rótulo de afinidade.
20. Seqüência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína de fusão ou proteína de parceiro de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19.
21. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de ácido nucleico como definida na reivindicação 20.
22. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser transformada com o vetor como definido na reivindicação 21.
23. Vacina, caracterizada pelo fato de que contém uma proteína de fusão ou proteína de parceiro de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 19 ou um ácido nucleico como definido na reivindicação 20 ou um vetor como definido na reivindicação 21.
24. Vacina de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um adjuvante e/ou citocina ou quimiocina imunoestimuladoras.
25. Vacina de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o adjuvante compreende 3D-MPL, QS21 e/ou um oligonucleotídeo CpG.
26. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações de -23 a 25, caracterizada pelo fato de que é para o uso na medicina.
27. Uso de uma proteína ou ácido nucleico ou vetores como definidos aqui, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma vacina para o tratamento imunoterapêutico de um paciente que sofre de câncer.
28. Processo para a produção de uma proteína de fusão, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de expressar, em uma célula, uma proteína de fusão que compreende uma proteína de fusão parceira de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8.
29. Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a célula é uma bactéria.
30. Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a bactéria é E. coli.
31. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 30, caracterizado pelo fato de que a proteína de fusão é expressada em uma célula como uma proteína insolúvel.
32. Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de lisar a célula e purificar a proteína de fusão expressada a partir das células lisadas.
33. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que é obtida por ou obtenível pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 32.
34. Método para tratar um paciente que sofre de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar uma proteína, ácido nucleico, vetor ou vacina de acordo com a reivindicação aqui.
35. Uso de acordo com a reivindicação 27 ou o método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de melanoma, mama, bexiga, câncer de pulmão, tal como NSCLC, sarcoma, câncer ovariano, câncer de cabeça e pescoço, câncer renal, carcinoma colorretal, mieloma múltiplo, leucemia incluindo leucemia aguda e carcinoma esofágico.
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