ES2222728T3 - Procedimiento de vacunacion terapeutica. - Google Patents

Procedimiento de vacunacion terapeutica.

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ES2222728T3 ES99945967T ES99945967T ES2222728T3 ES 2222728 T3 ES2222728 T3 ES 2222728T3 ES 99945967 T ES99945967 T ES 99945967T ES 99945967 T ES99945967 T ES 99945967T ES 2222728 T3 ES2222728 T3 ES 2222728T3
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Klaus Gregorius Nielsen
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Dana Leach
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Anand Gautam
Peter Birk Rasmussen
Gunilla Karlsson
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Abstract

Uso de 3) al menos un epítopo de CTL que se deriva de un antígeno polipeptídico asociado a células que es débilmente inmunógeno o que no es inmunógeno en un animal y 4) al menos un primer epítopo de linfocito T cooperador (TH) que es exógeno al animal, o de 3) al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica un epítopo de CTL que se deriva de un antígeno polipeptídico asociado a células que es débilmente inmunógeno o que no es inmunógeno en un animal y 4) al menos un primer fragmento de ácido nucleico que codifica un epítopo de linfocito T cooperador (TH) que es exógeno al animal, o de un microorganismo o virus no patógeno que porta un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa 3) al menos un epítopo de CTL que se deriva de un antígeno polipeptídico asociado a células que es débilmente inmunógeno o que no es inmunógeno en un animal y 4) al menos un primer epítopo de linfocito T cooperador (TH) que es exógeno al animal, para la preparación de una composición inmunógena para tratar un proceso patológico que se selecciona de un tumor, una infección vírica y una infección provocada por un parásito intracelular o una bacteria provocando, en el animal, la presentación simultánea por una célula presentadora de antígeno (APC) adecuada del al menos un epítopo de CTL y del al menos un epítopo primero de TH y de este modo inducir en el animal una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos contra las células que portan el antígeno polipeptídico asociado a células en su superficie o que albergan el antígeno asociado a células en sus compartimiento intracelular, en el que el antígeno polipeptídico asociado a células se selecciona de un antígeno polipeptídico asociado a tumores, una proteína autóloga, un antígeno polipeptídico vírico y un antígeno polipeptídico que se deriva de un parásito intracelular o una bacteria.

Description

Procedimientos de vacunación terapéutica.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procedimientos novedosos para combatir enfermedades, tales como cáncer, que se caracterizan por la presencia de productos de expresión génica asociados a células que no son inmunógenos o son poco inmunógenos. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria conducida por linfocitos T citotóxicos (CTL), por lo que las células que portan epítopos de los productos de expresión génica son atacados y destruidos por los CTL. La invención se refiere también a un procedimiento para preparar antígenos polipeptídicos modificados, inmunógenos que se derivan de antígenos con capacidad inmunógena débil.
La invención se refiere además a una serie de aplicaciones de la tecnología AutoVac del solicitante (que es el sujeto del documento WO 95/05849) en el campo de la vacunación terapéutica contra el cáncer.
Antecedentes de la invención
La idea de la vacunación contra el cáncer ha estado presente durante más de cien años y ha disfrutado de recurrentes periodos de gran actividad, en particular desde el inicio de este siglo.
Sin embargo, durante los últimos 10 años, la comprensión de los mecanismos moleculares fundamentales de la respuesta inmunitaria ha mejorado considerablemente. Entre los hitos más importantes logrados durante este periodo ha estado el descubrimiento de la lista de citoquinas y factores de crecimiento que todavía sigue aumentando, la comprensión de los mecanismos de interacción entre los linfocitos T y B así como el establecimiento de las rutas de procesamiento de los antígenos celulares que incluyen el papel y estructura de las moléculas de MHC de clase I y II en la presentación de antígenos. Descubrimientos importantes con respecto a la inmunología del cáncer - aunque todavía no se comprenden completamente - fueron también el esclarecimiento de los mecanismos que subyacen la inducción de la tolerancia inmunológica en un huésped. Toda esta investigación ha provocado un enorme esfuerzo para desarrollar nuevos tratamientos para el cáncer humano.
Dependiendo de cómo adquiera el paciente inmunidad contra el tumor, los regímenes de inmunoterapia pueden clasificarse como pasivos o activos. En los regímenes de inmunoterapia pasiva, el paciente recibe pasivamente los componentes inmunitarios tales como citoquinas, anticuerpos, linfocitos T citotóxicos o linfocitos citolíticos activados por linfocitos (LAK). Por el contrario, los protocolos de inmunoterapia específica activa comprenden inducir activamente la inmunidad contra el tumor mediante vacunación con la célula tumoral o sus componentes antígenos. Esta última forma de tratamiento es la preferida porque prolonga la inmunidad.
Las vacunas pasivas y activas contra el cáncer se han centrado en inducir respuestas inmunitarias humorales o celulares. Para las vacunas activas está bien establecido que es necesaria la inducción de linfocitos T cooperadores positivos para CD4 para inducir de forma secundaria anticuerpos o linfocitos T citotóxicos positivos para CD8.
Vacunación pasiva con anticuerpos
Desde el descubrimiento de la tecnología de anticuerpos monoclonales a mediados de los setenta, se ha desarrollado un gran número de anticuerpos monoclonales terapéuticos dirigidos contra antígenos específicos de tumores o asociados a tumores. El tratamiento con anticuerpos monoclonales, sin embargo, produce varios problemas graves:
- La inyección de estas sustancias exógenas induce una respuesta inmunitaria en el paciente contra los anticuerpos inyectados que puede provocar un tratamiento menos eficiente así como efectos secundarios alérgicos graves en los pacientes.
- Los anticuerpos monoclonales habitualmente se deben administrar en grandes cantidades. Esto es un problema, dado que los costes de producción de los anticuerpos monoclonales son enormes.
- Los anticuerpos monoclonales se deben administrar por vía parenteral y debido a las cantidades relativamente grandes que se necesitan, con frecuencia debe hospitalizarse a los pacientes durante el tratamiento.
- Las inyecciones de anticuerpos monoclonales se deben repetir en intervalos relativamente cortos (semanas) para mantener el efecto terapéutico.
- Los anticuerpos monoclonales normalmente no son capaces de activar los sistemas efectores secundarios del sistema inmunitario tales como destrucción de las células tumorales por complemento, células NK o macrófagos.
Este último inconveniente es de importancia particular en el tratamiento del cáncer y puede ser una razón importante por la que el tratamiento del cáncer con anticuerpos monoclonales no ha sido particularmente exitoso en varios casos. Los denominados anticuerpos monoclonales humanizados que muchas compañías usan ahora son menos inmunógenos, pero desafortunadamente son incluso menos capaces de activar los sistemas efectores inmunitarios secundarios. Además, se han observado ejemplos de crecimientos secundarios de tumores que carecen del antígeno tumoral original, dado que estos anticuerpos no inducen efectos en las células tumorales "espectadoras inocentes" que no portan el antígeno tumoral.
La escasa capacidad efectora de los anticuerpos monoclonales ha llevado al desarrollo de anticuerpos monoclonales conjugados químicamente con toxinas y radioisótopos diferentes. Pharmacia Upjohn AB ha desarrollado, por ejemplo, un conjugado entre un anticuerpo monoclonal específico de tumor y la toxina A de Staphylococcus aureus con el fin de activar los linfocitos T del tumor. Medarex Inc. ha desarrollado anticuerpos monoclonales biespecíficos que contienen un fragmento Fab específico de tumor así como un fragmento de anticuerpo específico del receptor Fc con el fin de activar la destrucción por macrófagos de las células tumorales. Ambas construcciones son más efectivas que el anticuerpo monoclonal sólo, pero son también más caras e inmunógenas. Los anticuerpos conjugados con radioisótopos son también caros además de inmunógenos y se observan otros efectos secundarios tóxicos
generales.
La aparición de la tecnología de anticuerpos monoclonales fue un paso adelante fundamental que permitió la producción de moléculas bien definidas, con unión de afinidad elevada. Sin embargo, estos anticuerpos, al ser monoclonales, sólo reaccionan con un único tipo de epítopo en un antígeno tumoral. Esta es la razón principal por la que normalmente no son capaces de activar el sistema de complemento o de unirse a los receptores Fc de las células NK y a los macrófagos. Estos sistemas efectores muy poderosos habitualmente requieren la localización simultánea de múltiples fragmentos Fc de anticuerpo que sobresalen del antígeno.
Por lo tanto, otros investigadores han intentado usar dos anticuerpos monoclonales combinados y esto ha producido un efecto mejorado. Por lo tanto, usando otra estrategia, parece muy razonable atacar a las células tumorales con anticuerpos policlonales altamente específicos dirigidos contra antígenos específicos de tumor, o contra antígenos asociados al tumor o receptores de factores de crecimiento (hiperexpresados). Los anticuerpos de ese tipo serían totalmente capaces de activar los sistemas efectores secundarios mencionados anteriormente. Además, es probable que la reacción de inflamación local inducida por estos sistemas efectores pudiera provocar efectos secundarios en las células "espectadoras inocentes" que no expresan el antígeno tumoral en cuestión así como activar los TIL (linfocitos infiltradores de tumores) específicos de tumor en el tejido tumoral. Efectos de ese tipo han sido observados por Medarex Inc. usando sus conjugados de anticuerpos monoclonales biespecíficos.
Desde el descubrimiento de la tecnología de los anticuerpos monoclonales, no se ha explorado mucho el uso de anticuerpos policlonales para el tratamiento del cáncer (a excepción de los antígenos que se describen más adelante). Una razón principal es que ha sido únicamente en los últimos años que se han caracterizado antígenos específicos de tumor bien definidos o antígenos de superficie asociados a tumores pero, lo más importante, es que muchos de estos han resultado ser antígenos autólogos y por lo tanto no inmunógenos. En consecuencia tendrían que haberse usado anticuerpos policlonales xenógenos para estudiar los efectos. Sin embargo, los anticuerpos de ese tipo inducen una respuesta inmunitaria vigorosa hacia los anticuerpos policlonales exógenos inyectados que rápidamente eliminan los efectos terapéuticos.
Vacunación activa para inducir anticuerpos
Las tentativas recientes de inducir anticuerpos autólogos policlonales terapéuticos en pacientes de cáncer mediante vacunación activa han tenido éxito. Se han desarrollado vacunas contra antígenos autólogos de carbohidrato unidos a la membrana (tales como los antígenos Tn y sTn de expresión aberrante unidos por O y los lipopolisacáridos gangliosídicos GM2 y GD3). Estas pequeñas estructuras de carbohidrato son, sin embargo, antígenos muy deficientes de forma que deben usarse conjugados de estas moléculas con moléculas portadoras tales como hemocianina de lapa californiana (KLH) o mucinas de oveja (que contienen Tn- y sTn). En los pacientes de melanoma, la inducción de anticuerpos contra GM2 se asoció a un intervalo sin enfermedad y de supervivencia general prolongados después de un seguimiento mínimo de cincuenta y un meses. También se han realizado estudios aleatorios en fase II en pacientes de cáncer de mama usando un conjugado de sTn y KLH en el adyuvante DETOX-B (BIOMIRA Inc.) que demuestra que los pacientes inmunes a sTn tenían una mediana de supervivencia significativamente mayor comparada con los controles. Otro ejemplo de la inducción activa de anticuerpos policlonales en el cáncer es el uso de vacunación específica de idiotipo contra linfomas de linfocitos B que, aunque han sido prometedoras - se limita únicamente a este tipo de cáncer.
Finalmente, la compañía estadounidense Aphton Inc. ha desarrollado vacunas conjugadas activas contra la hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) y contra gastrina. Se ha demostrado, que esta vacuna tiene capacidad de controlar la actividad biológica de estas hormonas, que pueden funcionar también como factores de crecimiento autocrinos para ciertas células tumorales. Se han realizado ensayos clínicos en fase II exitosos en pacientes de cáncer gastrointestinal y están realizándose estudios clínicos en fase III.
Linfocitos T citotóxicos
Varios grupos han demostrado claramente que hay linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos de tumor presentes en muchos tumores. Estos CTL se denominan linfocitos infiltradores de tumores (TIL). Sin embargo, estas células de alguna forma dejan de responder o se vuelven anérgicas mediante diferentes mecanismos posibles que incluyen la secreción de citoquinas inmunosupresoras por las células tumorales, la falta de señales estimuladoras concomitantes, la regulación por disminución de moléculas de MHC de clase I, etc.
Ha habido muchas tentativas de aislar los péptidos que se unen a HLA de clase I específicos de tumores que reconocen los TIL y, en algunos casos, también han tenido éxito (por ejemplo péptidos de los antígenos asociados a melanomas). Se han usado péptidos de ese tipo para inducir una respuesta inmunitaria específica en el huésped, pero el uso práctico de los péptidos específicos de tumores en vacunas está restringido a un segmento limitado de la población debido a la restringida especificidad de unión de HLA de tipo I. Además, normalmente es relativamente difícil provocar una respuesta de los CTL in vivo usando péptidos sintéticos debido a la reducida semivida biológica de estas sustancias así como a las dificultades con el cebado exógeno de las moléculas de MHC de clase I.
Se han intentado muchas otras estrategias para provocar una respuesta de los CTL específica de tumor, que incluyen el uso de citoquinas (por ejemplo, IL-2, IFN-\gamma, IL-6, IL-4, IL-10 o GM-CSF) o moléculas estimuladoras concomitantes (B7) ya sea en forma soluble o expresada por la célula tumoral transfectada. Además, se han usado inmunizaciones con células vivas heterólogas o autólogas, o de antígenos tumorales preparados en adyuvantes especializados diseñados para presentar el antígeno mediante la ruta de presentación de antígenos de MHC de clase I, o los antígenos tumorales que se expresan, por ejemplo en vectores vaccinia, etc. con éxito variable. Todavía la creencia general entre los inmunólogos tumorales es, por lo tanto, que una de las mejores formas de eliminar los tumores sería inducir una respuesta antitumoral específica y potente de los CTL.
Aparte del hecho de que estos tratamientos habitualmente son muy caros y difíciles de reproducir, también ha resultado que es difícil obtener una respuesta inmunitaria buena contra el tumor debido a que muchos de los antígenos asociados a los tumores son proteínas autólogas verdaderas a las que la mayoría de los linfocitos T parecen ser tolerantes. Por lo tanto, parece necesario inducir una afección autoinmunitaria celular controlada en el paciente.
Objeto de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar procedimientos y agentes mejorados para inducir respuestas inmunitarias en organismos hospedadores contra antígenos indeseables, por ejemplo antígenos tumorales. Un objeto adicional es proporcionar un procedimiento para preparar análogos polipeptídicos de antígenos indeseables de ese tipo, análogos que sean capaces de inducir una respuesta inmunitaria efectiva contra el antígeno indeseado.
Sumario de la invención
De forma dogmática se ha pensado en la presentación de antígenos como dos rutas diferentes, una ruta exógena de clase II y una endógena de clase I.
De forma abreviada, una proteína exógena del exterior de la célula o de la membrana celular es captada por la APC en forma de endosoma que se fusiona con un compartimiento intracelular que contiene enzimas proteolíticas y moléculas de MHC de clase II. Algunos de los péptidos producidos se unen a la clase II, que después se trasloca a la membrana celular.
La ruta endógena de clase I se caracteriza por la presentación predominante de las proteínas del citosol. Se cree que esto ocurre mediante escisión mediada por proteosomas seguida de transporte de los péptidos al retículo endoplasmático (ER) mediante moléculas TAP localizadas en la membrana del ER. En el ER los péptidos se unen a la clase I seguido de transporte a la membrana plasmática.
Sin embargo, estas 2 rutas no están completamente separadas. Por ejemplo, se sabe que los dendrocitos y en algún grado los macrófagos son capaces de endocitar (pinocitar) proteínas extracelulares y subsiguientemente presentarlas en el contexto del MHC de clase I. También se ha demostrado previamente que, usando vías de administración especializadas, por ejemplo mediante acoplamiento a perlas de óxido de hierro, los antígenos exógenos son capaces de entrar en la ruta de la Clase I (Rock, 1996). Este mecanismo parece central, debido a la importancia de una expresión concomitante tanto de la clase I como de la clase II en la misma APC para provocar una agregación tipo tricelular. Esta agregación tipo tricelular ha sido propuesta por Mitchison (1987) y después por otros autores. Demostraron la importancia de la presentación concomitante de epítopos de la clase I y la clase II en la misma APC. De acuerdo con el mecanismo descrito recientemente para la activación de los CTL (véase Lanzavecchia, 1998, Nature 393: 413, Matzinger, 1999, Nature Med. 5: 616, Ridge y cols., 1998, Nature 393: 478, Schoenberger y cols., 1998, Nature 393: 480, Ossendrop y cols., 1998, J. Ex. Med. 187: 693 y Mackey y cols., 1998, J. Immunol 161: 2094), las APC profesionales que presentan antígenos en el MHC de clase II son reconocidas por los linfocitos T cooperadores. Esto provoca una activación de la APC (mediada por la interacción de CD40L en el linfocito T cooperador y CD40 en la APC). Esto permite a la APC estimular directamente los CTL que son activados de ese modo. Véase también Fig. 2.
Se ha demostrado anteriormente que la inserción de un epítopo de un linfocito T cooperador restringido al MHC de clase II exógeno en un antígeno autólogo proporciona un antígeno capaz de inducir respuestas de anticuerpos de reactividad cruzada potentes que se dirigen contra el antígeno autólogo no modificado (véase el documento WO 95/05849 del solicitante). Se demostró que la inducción de anticuerpos autólogos es provocada por un linfocito T cooperador inducido por el epítopo exógeno insertado.
En Dalum y cols. 1997, Molecular Immunology 34, 16-17, páginas 1113-1120, se demostró también que la inducción de anticuerpos autólogos podría inducirse mediante un epítopo exógeno insertado y se demostró que la delicada especificidad y posiblemente el isotipo de los anticuerpos podría manipularse como consecuencia de la posición del epítopo insertado.
Sin embargo, los autores han llegado a la conclusión de que los antígenos autólogos, con ayuda de los adyuvantes apropiados, deberían ser capaces de inducir también respuestas potentes de CTL contra epítopos autólogos restringidos al MHC de clase I y por lo tanto, la tecnología que se describe en el documento WO 95/05849 puede adaptarse para proporcionar también vacunación contra antígenos intracelulares y otros asociados a células que tienen epítopos que se presentan en el contexto de MHC de clase I.
La tecnología de la vacuna autóloga que se describe en el documento WO 95/05849 tiene el efecto de que se proporciona cooperación de linfocitos T específica para los linfocitos autorreactivos cuando se administra un antígeno autólogo modificado para su captación en la ruta de procesamiento de antígenos de MHC de clase II (véase la Fig. 1 y Dalum I y cols., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804 así como Dalum I y cols., 1999, Nature Biotechnol. 17: 666-669). Se demostró que los linfocitos B potencialmente autorreactivos que reconocían las proteínas autólogas están presentes fisiológicamente en los individuos normales. Sin embargo, para que estos linfocitos B sean inducidos para que realmente produzcan anticuerpos que reaccionen con las proteínas autólogas relevantes, se necesita la colaboración de los linfocitos T cooperadores que producen citoquinas (células T_{H} o linfocitos T_{H}). Normalmente, esta colaboración no se proporciona porque los linfocitos T, en general, no reconocen los epítopos de los linfocitos T que se derivan de las proteínas autólogas cuando son presentadas por las células presentadoras de antígeno (APC). Sin embargo, al proporcionar un elemento de "exogeneidad" en una proteína autóloga (es decir, al introducir una modificación inmunológicamente significativa), los linfocitos T que reconocen el elemento exógeno se activan al reconocer el epítopo exógeno en una APC (tal como, inicialmente, un monocito). Los linfocitos B policlonales (que presentan epítopos de linfocito T) que son capaces de reconocer los epítopos autólogos de la proteína autóloga modificada también interiorizan el antígeno y subsiguientemente presentan su(s) epítopo(s) del linfocito T exógeno y los linfocitos T activados subsiguientemente proporcionan colaboración de citoquinas a estos linfocitos B policlonales autorreactivos. Dado que los anticuerpos producidos por estos linfocitos B policlonales son reactivos con diferentes epítopos del polipéptido modificado, incluyendo los que están también presentes en el polipéptido nativo, se induce un anticuerpo con reactividad entrecruzada con la proteína autóloga no modificada. En conclusión, los linfocitos T pueden llevarse a actuar como si la población de linfocitos B policlonales hubiera reconocido un antígeno completamente exógeno aunque, de hecho, sólo el/los epítopo(s) insertados es/son exógenos para el hospedador. De este modo, se inducen anticuerpos capaces de reaccionar entrecruzadamente con antígenos autólogos no modificados.
Tal como se menciona anteriormente, los CTL requieren también colaboración de los linfocitos T, aunque el mecanismo para ello no está claro todavía.
Los autores han basado la presente invención en su teoría novedosa de que las proteínas autólogas que contienen epítopos de MHC de clase II exógenos, tras la captación exógena, pueden tener acceso a la ruta de procesamiento de antígenos del MHC de clase I por ejemplo de macrófagos y dendrocitos. De este modo podría inducirse una potente respuesta de los CTL contra los epítopos subdominantes en la proteína autóloga. De forma alternativa, podrían administrarse genes que codifican antígenos tumorales modificados en forma de vacunas de ácidos nucleicos que eventualmente también darán lugar a respuestas inmunitarias mediadas por MHC de clase II y MHC de
clase I.
Las células tumorales son células presentadoras de antígeno muy deficientes debido a la insuficiente expresión de MHC de clase I, carencia de moléculas estimuladoras concomitantes o la secreción de citoquinas inmunosupresoras, etc. Usando de las construcciones de vacuna autóloga y el protocolo de vacunación que se menciona anteriormente, el antígeno tumoral modificado podría ser presentado por moléculas de MHC de clase I así como por las de MHC de clase II en células presentadoras de antígeno profesionales. La presentación concomitante de epítopos autólogos subdominantes en las moléculas de MHC de clase I y los epítopos exógenos inmunodominantes en las MHC de clase II mediaría una colaboración directa mediante citoquinas de desde los linfocitos T cooperadores restringidos al MHC de clase I activados a los CTL restringidos al MHC de clase I (Fig. 2). Esto, en nuestra opinión provocará una anulación específica de la tolerancia autóloga de los linfocitos T hacia el antígeno tumoral y esto es exactamente lo que se desea en la inmunoterapia del cáncer.
En conclusión, una vacuna construida usando la tecnología que se describe anteriormente inducirá una respuesta humoral contra anticuerpos autólogos con activación secundaria de complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Se espera también que inducirá una respuesta de linfocitos T citotóxicos dirigida contra, por ejemplo, un antígeno de membrana específico de tumor.
Por lo tanto, dentro del alcance más amplio y más general, la presente invención se refiere al uso de
1) al menos un epítopo de CTL que se deriva de un antígeno polipeptídico asociado a células que es débilmente inmunógeno o que no es inmunógeno en un animal y 2) al menos un primer epítopo de linfocito T cooperador (T_{H}) que es exógeno al animal, o de 1) al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica un epítopo de CTL que se deriva de un antígeno polipeptídico asociado a células que es débilmente inmunógeno o que no es inmunógeno en un animal y 2) al menos un primer fragmento de ácido nucleico que codifica un epítopo de linfocito T cooperador (T_{H}) que es exógeno al animal, o de un microorganismo o virus no patógeno que porta un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa 1) al menos un epítopo de CTL que se deriva de un antígeno polipeptídico asociado a células que es débilmente inmunógeno o que no es inmunógeno en un animal y 2) al menos un primer epítopo de linfocito T cooperador (T_{H}) que es exógeno al animal,
para la preparación de una composición inmunógena para tratar un proceso patológico que se selecciona de un tumor, una infección vírica y una infección provocada por un parásito intracelular o una bacteria, provocando, en el animal, la presentación simultánea por una célula presentadora de antígeno (APC) adecuada del al menos un epítopo de CTL y del al menos un epítopo primero de T_{H} y de este modo inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos en el animal contra las células que portan el antígeno polipeptídico asociado a células en su superficie o que albergan el antígeno asociado a células en sus compartimiento intracelular, en el que el antígeno polipeptídico asociado a células se selecciona de un antígeno polipeptídico asociado a tumores, una proteína autóloga, un antígeno polipeptídico vírico y un antígeno polipeptídico que se deriva de un parásito intracelular o una bacte-
ria.
También, la estrategia novedosa para preparar un agente inmunógeno es parte de la invención. Esta estrategia novedosa abarca la selección y producción de análogos de antígenos asociados a células débiles, en la que el objetivo es la conservación de una fracción sustancial de epítopos de CTL conocidos y previstos mientras que, al mismo tiempo, se introduce al menos un epítopo de T_{H} exógeno.
Además, la invención se refiere a ciertas construcciones inmunógenas específicas que se basan en antígenos asociados a tumores conocidos así como a composiciones que contienen estas construcciones.
Finalmente, la invención se refiere a fragmentos de ácidos nucleicos, vectores, células transformadas y otras herramientas de utilidad en procedimientos biológicos moleculares para la producción de los análogos de los antígenos asociados a tumores.
Leyendas de las figuras
Fig. 1: El concepto tradicional de AutoVac. A: Los epítopos autólogos tolerodominantes que se presentan en el MHC de clase II en una célula presentadora de antígeno (APC) son ignorados debido al agotamiento del repertorio del linfocito T cooperador (T_{H}) (el linfocito T cooperador está indicado por líneas discontínuas). Los epítopos inmunodominantes exógenos insertados de linfocitos T que se presentan en el MHC de clase II activa los linfocitos T cooperadores y los linfocitos B (B) específicos de las partes nativas de la proteína autóloga que presenta epítopos inmunodominantes exógenos de linfocitos T en el MHC de clase II son activados mediante la cooperación de citoquinas que proporciona el linfocito T cooperador.
Fig. 2: El concepto de AutoVac para inducir una respuesta de CTL. Los epítopos inmunodominantes exógenos insertados de linfocitos T que se presentan en el MHC de clase II activan los linfocitos T. Los CTL que reconocen los epítopos autólogos subdominantes que se presentan en el MHC de clase I son activados por el linfocito T cooperador activado adyacente.
Fig. 3: Una representación esquemática del polipéptido Her2 con indicaciones de regiones epitópicas y sitios de glucosilación en N. Los 4 dominios extracelulares, el dominio transmembrana (TM) y los 2 dominios intracelulares se representan con indicaciones de los sitios con grados variables de homología y sitios que contienen epítopos putativos/determinados de los CTL.
Fig. 4: Una representación esquemática del polipéptido PSM humano con indicaciones de las regiones de inserción de los epítopos P2 y P30.
Fig. 5: Los genes y proteínas FGF. A: Estructura de exones e intrones de los genes de FGF8 humanos y murinos. Debajo se ilustran las ocho formas diferentes de procesamiento (de Gemel 1996). B: Secuencia de aminoácidos de las diferentes isoformas de FGF8. Los tramos polipeptídicos que son exclusivos de FGF8b, FGF8f y FGF8e se indican en negrita y cursiva o subrayado. FGF8a es la variante más corta que no contiene ninguna de estas secuencias destacadas. Se espera que el péptido de señal sea escindido en el extremo C para dar Ala22. Los dos residuos de cisteína que se encuentran en FGF8 maduras (todas las isoformas) se indican mediante un subrayado grueso. Los dos sitios potenciales de glucosilación en N de FGF8b se indican mediante Ñ. La numeración es de acuerdo con FGF8b.
Fig. 6: Ilustraciones de las cuatro variantes diferentes de FGF8b diseñadas para la vacunación autóloga. Panel superior: Modelos teóricos de los puntos de inserción de los epítopos que usan la estructura cristalina de FGF2 como molde. Panel inferior: secuencias de aminoácidos de FGF8b natural (WT) y las cuatro variantes F30N, F2I, F30I y F2C. El péptido de señal está marcado con un subrayado simple. Los péptidos insertados están marcados con subrayado doble. La secuencia del extremo N (MetAla) de todas las variantes es debida a la generación de una secuencia Kozak (Kozak 1991) para una traducción mejor en los sistemas eucariotas.
Descripción detallada de la invención Definiciones
A continuación se definirán y explicarán en detalle varios términos que se usan en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones para clarificar las metas y límites de la invención.
Un "antígeno polipeptídico asociado a células" en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones se pretende que denote un polipéptido que está confinado a una célula que está de algún modo relacionada con un proceso patológico. Además, la célula presenta epítopos de CTL del antígeno polipeptídico que se une a moléculas de MHC de clase I en su superficie. Los antígenos polipeptídicos asociados a células pueden por lo tanto ser antígenos intracelulares verdaderos (y por lo tanto no alcanzables para una respuesta inmunitaria humoral) o antígenos que se unen a la superficie de las células. El antígeno asociado a la célula puede ser producto de la propia expresión génica de la célula, o de un parásito intracelular, de un virus o de otra célula. En este último caso, el antígeno polipeptídico se asocia subsiguientemente con la célula que está implicada en el proceso patológico.
Los términos "linfocito T" y "célula T" se utilizarán de forma intercambiable para los linfocitos de origen tímico que son responsables de diversas respuestas inmunitarias mediadas por células así como de las funciones efectoras tales como la actividad de cooperador en la respuesta inmunitaria humoral. Del mismo modo, los términos "linfocito B" y "célula B" se usarán de forma intercambiable para los linfocitos que producen anticuerpos.
Una "célula presentadora de antígeno" (APC) es una célula que presenta epítopos a los linfocitos T. Las células presentadoras de antígeno típicas son los macrófagos, dendrocitos y otras células fagocitantes y pinocitantes. Debería resaltarse que los linfocitos B también funcionan como APC al presentar epítopos de T_{H} unidos a moléculas de MHC de clase II a los linfocitos T_{H} pero cuando se usa el término APC de forma general en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, se pretende que se refiera a las células fagocitantes y pinocitantes que se mencionan anteriormente.
"Linfocitos T cooperadores" o "linfocitos T_{H}" denota los linfocitos T positivos para CD4 que cooperan con los linfocitos B y con los linfocitos T citotóxicos mediante el reconocimiento de los epítopos de T_{H} que se unen a las moléculas de MHC de clase II en las células que presentan antígenos.
El término "linfocito T citotóxico" (CTL) se usará para los linfocitos T positivos para CD8 que requieren la colaboración de los linfocitos T_{H} para activarse.
Una respuesta inmunitaria "específica" en el presente contexto se pretende que denote una respuesta inmunitaria policlonal que se dirige predominantemente contra una molécula o un grupo de moléculas casi idénticas o, de forma alternativa, contra células que presentan epítopos de CTL de la molécula o del grupo de moléculas casi idénticas.
Un "antígeno polipeptídico débilmente inmunógeno o no inmunógeno" en la presente memoria se pretende que denote polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de los antígenos proteínicos asociados a células débiles que se derivan del animal en cuestión (por ejemplo, un ser humano), pero el término también engloba los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos idéntica a los análogos de las proteínas de ese tipo que se aíslan de otras especies. También están incluidas en los límites del término las formas de los polipéptidos que tienen patrones de glucosilación que difieren debido a su producción en sistemas heterólogos (por ejemplo levaduras u otros sistemas de expresión eucariótica no mamíferos o incluso sistemas procarióticos). Sin embargo, debería resaltarse que, cuando se usa el término, se pretende que el polipéptido en cuestión sea normalmente no inmunógeno o sólo débilmente inmunógeno en su localización natural en el animal a tratar.
El término "polipéptido" en el presente contexto se pretende que signifique tanto péptidos cortos de 2 a 10 residuos aminoacídicos, como oligopéptidos de 11 a 100 residuos aminoacídicos y polipéptidos de más de 100 residuos aminoacídicos. Además, se pretende que el término incluya también proteínas, es decir, biomoléculas funcionales que comprenden al menos un polipéptido; cuando comprenden al menos dos polipéptidos, estos pueden formar complejos, estar unidos de forma covalente o pueden estar unidos de forma no covalente. El/los polipéptido(s) de una proteína pueden estar glucosilados y/o lipidados y/o comprender grupos prostéticos.
El término "subsecuencia" quiere decir cualquier tramo consecutivo de al menos 3 aminoácidos o, cuando sea relevante, de al menos 3 nucleótidos, que se derivan directamente de una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácidos nucleicos natural, respectivamente.
El término "animal" en el presente contexto se pretende en general que denote una especie animal (preferiblemente mamífero), tal como Homo sapiens, Canis domesticus, etc. y no únicamente un solo animal. Sin embargo, el término también denota una población de una especie animal de ese tipo, dado que es importante que los individuos que se inmunizan de acuerdo con la invención alberguen todos sustancialmente el mismo antígeno polipeptídico débil asociado a células que permita la inmunización de los animales con el/los mismo(s) inmunógenos. Si, por ejemplo, existen variantes genéticas de polipéptidos en diferentes poblaciones humanas, puede ser necesario usar inmunógenos diferentes en estas poblaciones diferentes para poder anular la tolerancia autóloga hacia el antígeno polipeptídico asociado a células débil en cada población.
Mediante el término "regulación por disminución de un antígeno polipeptídico asociado a células" en la presente memoria se quiere decir reducción en el organismo vivo de la cantidad y/o actividad del antígeno en cuestión. La regulación por disminución puede obtenerse por diversos mecanismos: de estos, la simple interferencia con el sitio activo en el antígeno mediante unión al anticuerpo es el más simple. Sin embargo, también está dentro del alcance de la presente invención que la unión del anticuerpo provoque la eliminación del polipéptido por las células limpiadoras (tales como macrófagos y otras células fagocitantes), e incluso más importante, que las células que portan o albergan el antígeno sean destruidas por los CTL del animal.
La expresión "efectuando una presentación simultánea por una APC adecuada" se pretende que denote que el sistema inmunitario del animal se somete a una provocación inmunógena de forma controlada que provoque la presentación simultánea por las APC de los epítopos en cuestión. Como será aparente a partir de la descripción siguiente, una provocación de ese tipo del sistema inmunitario se puede efectuar de varias formas de las que la más importantes son la vacunación con "farmacunas" (es decir, una vacuna que se administra para tratar o mejorar una enfermedad en curso) que contienen polipéptidos o la vacunación con "farmacuna" de ácidos nucleicos. El resultado importante a lograr es que las células competentes inmunitarias del animal se confronten con las APC que presentan los epítopos relevantes de una forma inmunológicamente efectiva.
El término "cantidad inmunógenamente eficaz" tiene su significado habitual en la técnica, es decir, una cantidad de un inmunógeno que tiene capacidad de inducir una respuesta inmunitaria que de forma significativa implica agentes patógenos que comparten características inmunológicas con el inmunógeno.
Cuando se usa de la expresión de que los antígenos polipeptídicos asociados a células débiles han sido sometidos a "modificación", en la presente memoria se quiere decir una modificación química del polipéptido que constituye el esqueleto del polipéptido en cuestión. Una modificación de ese tipo puede ser por ejemplo derivatización (por ejemplo alquilación) de ciertos residuos aminoacídicos de la secuencia de aminoácidos pero, como se apreciará a partir de la descripción más adelante, las modificaciones preferidas comprenden cambios de la estructura primaria de la secuencia de aminoácidos.
Cuando se describe "tolerancia" y "tolerancia autóloga" se entiende que, dado que los polipéptidos que son las dianas del presente procedimiento inventivo son proteínas autólogas en la población a vacunar o proteínas que no provocan la inducción de una respuesta inmunitaria efectiva, los individuos normales de la población no desarrollan una respuesta inmunitaria contra el polipéptido. No puede excluirse, sin embargo, que individuos ocasionales de una población animal puedan ser capaces de producir anticuerpos contra el antígeno polipeptídico nativo, por ejemplo como parte de un trastorno autoinmunitario. En cualquier caso, un animal normalmente sólo será autotolerante hacia su propio antígeno polipeptídico, pero no puede excluirse que dicho animal pueda tolerar también análogos que se deriven de otras especies animales o de una población que tenga un fenotipo diferente.
Un "epítopo de un linfocito T exógeno" es un péptido que tiene capacidad de unirse a una molécula de MHC y estimular los linfocitos T en una especie animal. Los epítopos exógenos preferidos son epítopos "promiscuos", es decir, epítopos que se unen a una fracción sustancial de las moléculas de MHC de clase II en una especie o población animal. Únicamente se conoce un número muy limitado de epítopos de linfocitos T promiscuos de ese tipo y se describirán en detalle más adelante. Debería resaltarse que, para que los inmunógenos que se usan de acuerdo con la presente invención sean efectivos en una fracción de una población animal lo más amplia posible, puede ser necesario 1) insertar varios epítopos exógenos de linfocitos T en el mismo análogo o 2) preparar varios análogos en los que cada análogo tiene insertado un epítopo promiscuo diferente. Debería resaltarse que el concepto de epítopos exógenos de linfocitos T engloba también el uso de epítopos de linfocitos T crípticos, es decir, epítopos que se derivan de una proteína autóloga y que únicamente ejerce su conducta inmunógena cuando existe en forma aislada sin ser parte de la proteína autóloga en cuestión.
Un "epítopo de los linfocitos T cooperador exógeno" (un epítopo de T_{H} exógeno) es un epítopo exógeno de linfocito T que se une a una molécula de MHC de clase II y puede presentarse en la superficie de una célula presentadora de antígeno (APC) unido a la molécula de MHC de clase II.
Un epítopo de "CTL" es un péptido que tiene capacidad de unirse a una molécula de MHC de clase I.
Una "parte funcional" de una biomolécula en el presente contexto se pretende que signifique la parte de la molécula que es responsable de al menos uno de los efectos bioquímicos o fisiológicos que ejerce la molécula. Es notorio en la técnica que muchas enzimas y otras moléculas efectoras tienen un sitio activo que es responsable de los efectos que ejerce la molécula en cuestión. Otras partes de la molécula pueden tener un fin de estabilización o de potenciación de la solubilidad y pueden por lo tanto excluirse si estos fines no son relevantes en el contexto de una realización particular de la presente invención. Por ejemplo, es posible usar ciertas citoquinas como un resto modificador en el análogo (véase la descripción detallada a continuación) y, en un caso así, el tema de la estabilidad puede ser irrelevante dado que el acoplamiento al análogo proporciona la estabilidad necesaria.
El término "adyuvante" tiene el significado habitual en la técnica de la tecnología de vacunas, es decir, una sustancia o una composición de materia que es 1) incapaz en sí misma de inducir una respuesta inmunitaria específica contra el inmunógeno de la vacuna, pero que 2) sin embargo tiene capacidad de potenciar la respuesta inmunitaria contra el inmunógeno. O, en otras palabras, la vacunación con el adyuvante solo no proporciona una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno, la vacunación con el inmunógeno puede dar lugar o no a una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno, pero la vacunación combinada con inmunógeno y adyuvante induce una respuesta inmunitaria contra el inmunógeno que es más potente que la que induce el inmunógeno solo.
"Rastrear" una molécula en el presente contexto se pretende que denote la situación en la que una molécula, al ser introducida en el animal, aparecerá preferencialmente en cierto(s) tejido(s) o se asociará preferentemente con ciertas células o tipos celulares. El efecto se puede lograr de varias formas que incluyen la formulación de la molécula en una composición que facilita el rastreo o introduciendo en la molécula grupos que facilitan el rastreo. Estos temas se describirán en detalle más adelante.
"Estimulación del sistema inmunitario" quiere decir que una sustancia o composición de materia exhibe un efecto inmunoestimulador general, no específico. Varios adyuvantes y adyuvantes putativos (tales como ciertas citoquinas) comparten la capacidad de estimular el sistema inmunitario. El resultado de usar un agente inmunoestimulador es aumentar el "estado de alerta" del sistema inmunitario, lo que quiere decir que la inmunización simultánea o subsiguiente con un inmunógeno induce una respuesta inmunitaria significativamente más eficaz que el uso aislado del inmunógeno.
Realizaciones preferidas
Para inducir una respuesta de CTL contra una célula que presenta epítopos que se derivan del antígeno polipeptídico de su superficie, es normalmente necesario que al menos un epítopo de CTL, cuando se presenta, esté asociado a una molécula de MHC de clase I en la superficie de la APC. Además se prefiere que al menos un primer epítopo de T_{H} exógeno, cuando se presenta, esté asociado con una molécula de MHC de clase II en la superficie de la APC.
Las APC que presentan los epítopos preferidas son los dendrocitos y los macrófagos, pero una APC preferida de acuerdo con al invención es cualquier ACP pinocitante o fagocitante que sea capaz de presentar simultáneamente 1) epítopos de CTL unidos a las moléculas de MHC de clase I y 2) epítopos de T_{H} unidos a las moléculas de MHC de clase II.
De acuerdo con la invención, el antígeno polipeptídico asociado a células se selecciona preferiblemente de antígenos asociados a tumores y otras proteínas autólogas que están relacionadas con procesos patológicos pero también antígenos víricos y antígenos que se derivan de un parásito intracelular o bacteria. Es notorio en la técnica que los antígenos asociados a patógenos de ese tipo son a menudo inmunógenos relativamente deficientes (por ejemplo antígenos de micobacterias tales como Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, pero también de protozoos tales como Plasmodium spp.). Se cree que la invención, además de hacer posible la producción de respuestas en forma de anticuerpos y CTL contra antígenos de proteínas autólogas verdaderas, tiene capacidad de potenciar la, a menudo insuficiente, respuesta inmunitaria que desarrolla el organismo contra los antígenos intracelulares de ese tipo.
Normalmente, será ventajoso confrontar el sistema inmunitario con una gran fracción de la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico que es la diana de la vacuna. Por lo tanto, en una realización preferida, la presentación por las APC del epítopo de los CTL y el primer epítopo de T_{H} exógeno se efectúa presentando al sistema inmunitario del animal al menos un análogo primero del antígeno polipeptídico asociado a células, comprendiendo dicho análogo primero una variación de la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a células, conteniendo dicha variación al menos el epítopo de los CTL y el primer epítopo de T_{H} exógeno. Esto contrasta, por ejemplo, con una estrategia de vacunación con ADN en la que los epítopos de los CTL y de los T_{H} son expresados por la misma célula pero como partes de polipéptidos distintos; una estrategia de vacunación con ADN de ese tipo es también una realización de la invención, pero se cree que tener los dos epítopos como parte del mismo polipéptido normalmente potenciará la respuesta inmunitaria y, en cualquier caso, será necesario proveer únicamente un producto de expresión.
Para maximizar las oportunidades de desarrollar una respuesta inmunitaria eficaz, se prefiere que el análogo primero mencionado anteriormente contenga una fracción sustancial de epítopos de CTL conocidos y previstos del antígeno polipeptídico asociado a células, es decir, una fracción de los epítopos de CTL conocidos y previstos que se une a suficientes fracciones de moléculas de MHC de clase I en una población. Por ejemplo, se prefiere que una fracción sustancial de epítopos de CTL conocidos y previstos en la secuencia de aminoácidos del análogo sea reconocido al menos por el 50% de los haplotipos de MHC-I que reconocen todos los epítopos conocidos y previstos de los CTL en el antígeno polipeptídico asociado a células, pero se prefieren porcentajes mayores, tales como al menos 60, al menos 70, al menos 80 y al menos 90%. Se prefiere especialmente el uso de análogos que sustancialmente conserve todos los epítopos de CTL conocidos del antígeno polipeptídico asociado a células que estén presentes en el análogo, es decir, cerca del 100% de los epítopos de los CTL conocidos. En consecuencia, se prefiere también especialmente que sustancialmente todos los epítopos de CTL previstos del antígeno polipeptídico asociado a células estén presentes al menos en el análogo primero.
Los procedimientos para predecir la presencia de epítopos de CTL son notorios en la técnica, véase por ejemplo Rothbard y cols. EMBO J. 7: 93-100 (1988).
Como será aparente a partir de la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, se espera que el procedimiento inventivo que se describe en la presente memoria haga posible la inducción eficaz de respuestas de CTL contra antígenos polipeptídicos asociados a células.
En los casos en los que el antígeno polipeptídico es verdaderamente intracelular, la inducción de una respuesta de CTL contra células que albergan el antígeno es la única forma de lograr su regulación por disminución por medios inmunológicos específicos. Sin embargo, en el caso de antígenos asociados a la membrana, es ventajoso inducir una respuesta de anticuerpos contra el antígeno polipeptídico asociado a células débil. Sin embargo, cuando se induce una respuesta inmunitaria humoral contra un antígeno asociado a células débil, se prefiere restringir sustancialmente la respuesta de los anticuerpos a la interacción con las partes del antígeno que están normalmente expuestas a la posible interacción con anticuerpos. De otro modo, el resultado sería muy probablemente, la inducción de una respuesta de anticuerpos contra partes del antígeno que normalmente no se implican en el sistema inmunitario humoral y esto a su vez aumentará el riesgo de inducir la reactividad cruzada con antígenos no relacionados con ninguna patología. Una forma elegante de obtener esta restricción es realizar una vacunación con ácidos nucleicos con un análogo del antígeno asociado a células débil, en el que la parte extracelular del mismo está inalterada o incluye un epítopo de T_{H} que no altera sustancialmente la estructura tridimensional de la parte extracelular del antígeno. Como posible alternativa, se puede realizar una inmunización con un inmunógeno dirigido a los CTL y un inmunógeno dirigido a los linfocitos B, donde el inmunógeno dirigido a los linfocitos B sea sustancialmente incapaz de efectuar la inmunización contra la parte intracelular del antígeno diana (el inmunógeno dirigido a los linfocitos B podría por ejemplo carecer del material no extracelular del antígeno).
La inducción de respuestas de anticuerpos puede lograrse de varias formas conocidas por una persona experta en la técnica. Por ejemplo, el al menos un análogo primero puede comprender una parte que consiste en una modificación de la estructura del antígeno polipeptídico asociado a células, provocando dicha modificación que la inmunización del animal con el análogo primero induzca la producción de anticuerpos en el animal contra el antígeno polipeptídico asociado a células - esta variante, tal como se menciona anteriormente, es especialmente adecuada para la vacunación con ácidos nucleicos. De forma alternativa, el procedimiento de la invención puede implicar efectuar la presentación al sistema inmunitario del animal de una cantidad inmunógenamente eficaz de al menos un análogo segundo del antígeno polipeptídico asociado a células que contiene una modificación de ese tipo. Una forma conveniente de lograr que la modificación tenga el efecto inductor de anticuerpos deseado es incluir al menos un segundo epítopo de T_{H} exógeno en el análogo segundo, es decir, una estrategia como la que se usa para el análogo primero.
En los casos en los que se desea inducir también una respuesta inmunitaria humoral eficaz, es ventajoso que el/los análogo(s) primero y/o segundo comprenda(n) una fracción sustancial de los epítopos de los linfocitos B del antígeno polipeptídico asociado a células, especialmente una fracción sustancial de epítopos de linfocitos B de ese tipo que son extracelulares en la forma natural del antígeno en el animal pertinente.
Las variaciones y modificaciones del antígeno polipeptídico asociado a células que se describen anteriormente pueden adoptar formas diferentes. Se prefiere que la variación y/o modificación implique la sustitución y/o eliminación y/o inserción y/o adición de aminoácidos. Estas operaciones fundamentales que se refieren a la manipulación de una secuencia de aminoácidos se pretende que cubran tanto cambios de aminoácidos únicos como operaciones que impliquen tramos de aminoácidos (reordenación de tramos de aminoácidos en el antígeno polipeptídico; esto es especialmente interesante cuando el antígeno es un antígeno intracelular verdadero, dado que únicamente son relevantes las consideraciones que implican la conservación de los epítopos de los CTL). Se entenderá que la introducción de, por ejemplo, una inserción o eliminación de un aminoácido único puede dar lugar a la emergencia de un epítopo de T_{H} exógeno en la secuencia del análogo, es decir, la emergencia de una secuencia de unión a una molécula de MHC de clase II. Sin embargo, en la mayoría de las situaciones es preferible (e incluso necesario) introducir un epítopo de T_{H} exógeno conocido y una operación de ese tipo requerirá la sustitución y/o inserción de aminoácidos (o algunas veces la adición en forma de conjugación con una proteína transportadora o la provisión de un polipéptido de fusión mediante procedimientos de biología molecular). Se prefiere que el número de inserciones, eliminaciones, sustituciones o adiciones de aminoácidos sea de al menos 2, tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 25 inserciones, sustituciones, adiciones o eliminaciones. Se prefiere además que el número de sustituciones de aminoácidos no exceda 150, tal como, como máximo 100, como máximo 90, como máximo 80 y como máximo 70. Se prefiere especialmente que el número de sustituciones, inserciones, eliminaciones o adiciones no exceda 60 y, en particular, el número no debería exceder 50 o incluso 40. Lo que más se prefiere es un número de no más de 30.
Realizaciones preferidas de la invención incluyen modificaciones mediante la introducción de al menos un epítopo de T_{H} inmunodominante. Se entenderá que la cuestión de la inmunodominancia de un epítopo de linfocito T depende de la especie animal en cuestión. Tal como se usa en la presente memoria, el término "inmunodominancia" simplemente se refiere a epítopos que, en el individuo/población vacunados provoca una respuesta inmunitaria significativa, pero es un hecho notorio que un epítopo de linfocito T que es inmunodominante en un individuo no es necesariamente inmunodominante en otro individuo de la misma especie, aunque pueda se capaz de unirse a moléculas de MHC-II en éste último individuo. Los epítopos de T_{H} inmunodominantes verdaderos son aquellos que, independientemente del polipéptido en el que forman una subsecuencia, provocan la activación de linfocitos T_{H} - en otras palabras, algunos epítopos de T_{H} tienen, como característica intrínseca, la característica de que sustancialmente nunca son crípticos dado que sustancialmente son siempre procesados por APC y se presentan en el contexto de una molécula de MHC II en la superficie de la APC.
Otro punto importante es el tema de la restricción de MHC de los epítopos de linfocitos T. En general, los epítopos de linfocitos T naturales presentan restricciones de MHC, es decir, ciertos péptidos que constituyen un epítopo de linfocito T únicamente se unen de forma efectiva a un subconjunto de moléculas de MHC de clase II. Esto a su vez tiene el efecto de que, en la mayoría de los casos, el uso de un epítopo de linfocito T dará como resultado un componente de vacuna que sólo es efectivo en una fracción de la población y dependiendo del tamaño de esa fracción, puede ser necesario incluir más epítopos de linfocitos T en la misma molécula o, de forma alternativa, preparar una vacuna de componentes múltiples en la que los componentes sean variantes del antígeno que se distinguen las unas de las otras por la naturaleza del epítopo de linfocito T que se introduce.
Si la restricción de MHC de los linfocitos T que se usan es completamente desconocida (por ejemplo en una situación en la que el animal vacunado tiene una composición de MHC definida deficientemente), la fracción de la población que cubre una composición de vacuna específica puede determinarse mediante la siguiente fórmula
(II)f_{población}= 1- \prod\limits^{n}_{i=1} (1-P_{i})
donde p_{i} es la frecuencia de la población que responde al epítopo exógeno de linfocito T iº presente en la composición de la vacuna y n es el número total de epítopos exógenos de linfocitos T en la composición de la vacuna. De este modo, una composición de vacuna que contiene 3 epítopos de linfocito T exógeno que tiene frecuencias de respuesta en la población de 0,8, 0,7 y 0,6 respectivamente, daría
1 - 0,2 x 0,3 x 0,4 = 0,976
es decir el 97,6 por ciento de la población estadísticamente desarrollará una respuesta mediada por MHC-II a la vacuna.
La fórmula anterior no es de aplicación en las situaciones en las que se conoce un patrón de restricción de MHC más o menos preciso de los péptidos que se usan. Si, por ejemplo, un cierto péptido sólo se une a las moléculas de de MHC-II humanas que codifican los alelos de HLA-DR DR1, DR3, DR4 y DR7 entonces, el uso de este péptido junto con otro péptido que se una al resto de las moléculas de MHC-II codificadas por los alelos de HLA-DR logrará cubrir al 100% de la población en cuestión. Del mismo modo, si el segundo péptido únicamente se une a DR3 y DR5, la adición de este péptido no aumentará en nada la población a la que cubre. Si se basa el cálculo de respuesta de la población solamente en la restricción de MHC de los epítopos de los linfocitos T de la vacuna, la fracción de la población que cubre una composición de vacuna específica puede determinarse mediante la siguiente fórmula:
(III)f_{población}= 1-\prod\limits^{3}_{j=1} (1-\varphi_{j})^{2}
en la que \varphi_{j} es la suma de las frecuencias de la población de las moléculas de MHC que codifican los haplotipos de los alelos que se unen a uno cualquiera de los epítopos de los linfocitos T de la vacuna y que pertenecen al jº de los 3 locus de HLA conocidos (DP, DR y DQ); en la práctica, primero se determina qué moléculas de MHC reconocerán cada epítopo de los linfocitos T de la vacuna y después estos se relacionan de acuerdo con su tipo (DP, DR y DQ) - después, se suman las frecuencias de los diferentes haplotipos de alelos que se relacionan para cada tipo, dando así \varphi_{1}, \varphi_{2} y \varphi_{3}.
Puede ocurrir que el valor de p_{i} de la fórmula II supere el valor teórico \pi_{i}:
(IV)\pi_{i}= 1- \prod\limits^{3}_{j=1} (1-v_{j})^{2}
en la que U_{j} es la suma de las frecuencias en la población de las moléculas de MHC que codifican los haplotipos de los alelos que se unen al epítopo iº de los linfocitos T en la vacuna y que pertenecen al jº de los 3 locus de HLA conocidos (DP, DR y DQ). Esto quiere decir que en 1-\pi_{i} de la población hay una frecuencia de individuos que responden de f_{residual\_i} = (p_{i} - \pi_{i})/(1-\pi_{i}). Por lo tanto, la fórmula III puede ajustarse de forma que proporcione la fórmula V:
(V)f_{población}=1-\prod\limits^{3}_{j=1} (1-\varphi_{j})^{2}+\left[1-\prod\limits^{n}_{i=1} (1-f_{residual\_i})\right]
donde se da el valor de cero al término 1 - f_{residual\_i} cuando es negativo. Debería resaltarse que la fórmula V requiere que se haya realizado una cartografía de los haplotipos de todos los epítopos comparada con conjuntos idénticos de haplotipos.
Por lo tanto, cuando se seleccionan epítopos de linfocitos T para introducirlos en el análogo, es importante incluir todo el conocimiento de los epítopos que esté disponible: 1) la frecuencia de los individuos que responden a cada epítopo en la población, 2) los datos de restricción de MHC y 3) la frecuencia en la población de los haplotipos relevantes.
Existen varios epítopos de linfocitos T "promiscuos" naturales que están activos en una gran proporción de individuos de una especie animal o de una población animal y preferiblemente estos se introducen en la vacuna, reduciendo así la necesidad de introducir un gran número de análogos diferentes en la misma vacuna.
El epítopo promiscuo puede, de acuerdo con la invención, ser un epítopo de linfocito T humano natural tal como los epítopos del toxoide del tétanos (por ejemplo los epítopos P2 y P30), del toxoide de la difteria, de la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe y del antígeno CS de P. falciparum.
A lo largo de los años se han identificado varios otros epítopos de linfocitos T promiscuos. Especialmente se han identificado péptidos capaces de unirse a una gran proporción de moléculas de HLA-DR codificado por los diferentes alelos de HLA-DR y estos son todos epítopos de linfocitos T que se pueden introducir en análogos que se usan de acuerdo con la presente invención. Véanse también los epítopos que se describen en las siguientes referencias: documento WO 98/23635 (Frazer IH y cols., adjudicada a The University of Queensland); Southwood S y cols., 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F y cols., 1988, Nautre 336: 778-780; Rammensee HG y cols., 1995, Immunogenetics 41; 4 178-228; Chicz RM y cols., 1993, J. Exp. Med. 178: 27-47; Hammer J y cols., 1993, Cell 74: 197-203; y Falk K y cols., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. La última referencia también versa sobre ligandos de HLA-DQ y -DP. Todos los epítopos que se refieren en estas 5 referencias son relevantes como epítopos naturales candidatos para su uso en la presente invención, igual que los epítopos que comparten motivos comunes con estos.
De forma alternativa, el epítopo puede ser cualquier epítopo de linfocito T artificial que sea capaz de unirse a una gran proporción de haplotipos. En este contexto, los péptidos del epítopo pan DR ("PADRE") que se describe en el documento WO 95/07707 y en la correspondiente publicación de Alexander J y cols., 1994, Immunity 1: 751-761 son ambos candidatos interesantes a epítopos a usar de acuerdo con la presente invención. Debería resaltarse que los péptidos PADRE más efectivos que se describen en estas publicaciones portan aminoácidos D en los extremos C y N para mejorar la estabilidad cuando se administran. Sin embargo, la presente invención primordialmente pretende incorporar los epítopos relevantes como parte del antígeno modificado que debería subsiguientemente descomponerse enzimáticamente en el lisosoma de las APC para permitir la subsiguiente presentación en el contexto de una molécula de MHC-II y por lo tanto no es oportuno incorporar aminoácidos D a los epítopos que se usan en la presente invención.
Un péptido PADRE especialmente preferido es el que tiene la secuencia de aminoácidos AKFVAAWTLKAAA o una subsecuencia inmunológicamente eficaz de la misma. Éste y otros epítopos que tienen la misma carencia de restricción de MHC son epítopos de linfocitos T preferidos que deberían estar presentes en los análogos que se usan en el procedimiento de la invención. Los epítopos superpromiscuos de ese tipo permitirán una realización más sencilla de la invención en la que sólo se presenta un análogo único al sistema inmunitario del animal vacunado.
La naturaleza de la variación/modificación que se describe anteriormente preferiblemente comprende que
- se incluye al menos un resto primero en el/los análogo(s) primero y/o segundo, efectuando dicho resto primero el rastreo del análogo a una célula presentadora de antígeno (APC) y/o
- se incluye al menos un resto segundo en el/los análogo(s) primero y/o segundo, estimulando dicho resto segundo el sistema inmunitario y/o
- se incluye al menos un resto tercero en el/los análogo(s) primero y/o segundo, optimizando dicho resto tercero la presentación del análogo al sistema inmunitario.
Las características funcionales y estructurales que se refieren a estos restos primero, segundo y tercero se describirán a continuación:
Pueden estar presentes en forma de grupos laterales que se unen de forma covalente o no covalente a grupos químicos adecuados en la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a células o una subsecuencia de la misma. Esto quiere decir que tramos de los residuos aminoacídicos que se derivan del antígeno polipeptídico se derivan sin alterar la secuencia de aminoácidos primaria o, al menos, sin introducir cambios en los enlaces peptídicos entre los aminoácidos individuales de la cadena.
Los restos pueden estar también en forma de compañeros de fusión de la secuencia de aminoácidos que se deriva del antígeno polipeptídico asociado a células. A este respecto debería mencionarse que ambas posibilidades incluyen la opción de conjugar la secuencia de aminoácidos con un vehículo, véase la descripción de éstas más adelante. En otras palabras, en el presente contexto, el término "proteína de fusión" no se restringe meramente a una construcción de fusión preparada mediante la expresión de un fragmento de ADN que codifica la construcción sino también a un conjugado entre dos proteínas que se unen mediante un enlace peptídico en una reacción química subsiguiente.
Tal como se menciona anteriormente, el análogo puede incluir también la introducción de un resto primero que rastrea el análogo a una APC o a un linfocito B. Por ejemplo, el resto primero puede ser un compañero de fusión específico para un antígeno de superficie específico de linfocito B o para un antígeno de superficie específico de APC. En la técnica se conocen muchos de esos antígenos de superficie específicos. Por ejemplo, el resto puede ser un carbohidrato para el que existe un receptor en el linfocito B o la APC (por ejemplo manano o manosa). De forma alternativa, el resto segundo puede ser un hapteno. También puede usarse un fragmento de anticuerpo que reconoce específicamente una molécula de la superficie de las APC o linfocitos como resto primero (la molécula de la superficie puede ser por ejemplo un receptor FC\gamma de macrófagos y monocitos, tal como FC\gammaRI o, de forma alternativa, cualquier otro marcador de superficie específico tal como DC40 o CTLA-4). Debería resaltarse que todas estas moléculas rastreadoras ejemplares pueden usarse como parte de un adyuvante, véase más adelante. El ligando de CD40, anticuerpos contra CD40 o sus variantes que se unen a CD40 rastrearán el análogo a los dendrocitos. Al mismo tiempo, resultados recientes han demostrado que la interacción con la molécula CD40 hace que los linfocitos T_{H} no sean esenciales para obtener una respuesta de los CTL. Por lo tanto, se contempla que el uso general de las moléculas que se unen a CD40 como resto primero (o como adyuvantes, véase más adelante) potenciará la respuesta de los CTL de forma considerable; de hecho, el uso de moléculas de unión a CD40 de ese tipo como adyuvantes y "restos primeros" con el significado de la presente invención se cree posee altura inventiva por derecho propio.
Como alternativa o suplemento al rastreo del análogo a un cierto tipo de células para lograr una respuesta inmunitaria potenciada, es posible aumentar el nivel de respuesta del sistema inmunitario incluyendo el resto segundo mencionado anteriormente que estimula el sistema inmunitario. Ejemplos típicos de restos segundos de ese tipo son citoquinas, proteínas de choque término y hormonas, así como partes efectivas de las mismas.
Las citoquinas adecuadas para usarse de acuerdo con la invención son aquellas que normalmente funcionan también como adyuvantes en una composición de vacuna, por ejemplo interferón \gamma (IFN-\gamma), ligando de Flt3 (Flt3L), interleuquina 1 (IL-1), interleuquina 2 (IL-2), interleuquina 4 (IL-4), interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 12 (IL-12), interleuquina 13 (IL-13), interleuquina 15 (IL-15) y factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF); de forma alternativa, la parte funcional de la molécula de citoquina puede ser suficiente como resto segundo. Con respecto al uso de citoquinas de ese tipo como sustancias adyuvantes, véase la descripción más adelante.
De forma alternativa, el resto segundo puede ser una toxina, tal como listeriolicina (LLO), lípido A y una enterotoxina termolábil. También son posibilidades interesantes varios derivados de micobacterias tales como MDP (dipéptido de muramilo), CFA(adyuvante completo de Freund) y los diésteres de trehalosa TDM y TDE. De acuerdo con la invención, proteínas de choque término adecuadas que se usan como resto segundo pueden ser HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 y calreticulina (CRT).
También es una realización importante para la invención la posibilidad de introducir un resto tercero que potencia la presentación del análogo al sistema inmunitario. La técnica ha demostrado varios ejemplos de este principio. Por ejemplo, se sabe que el anclaje de lipidación con palmitoilo en la proteína OspA de Borrelia burgdorferi puede utilizarse para proporcionar polipéptidos adyuvantes autólogos (véase por ejemplo el documento WO 96/40718). Parece que las proteínas lipidadas forman estructuras tipo micela con un núcleo que consiste en las partes del anclaje de lipidación de los polipéptidos y las partes restantes de la molécula que sobresalen de la misma, dando como resultado presentaciones múltiples de los determinantes de antígenos. Por lo tanto, el uso de esta estrategia y de estrategias relacionadas usando anclajes de lipidación diferentes (por ejemplo un grupo miristilo, un grupo farnesilo, un grupo geranilgeranilo, un anclaje de GPI y un grupo N-acildiglicérido) son realizaciones preferidas de la invención, especialmente dado que la provisión de un anclaje de lipidación de ese tipo en una proteína producida de forma recombinante es relativamente sencilla y únicamente requiere del uso por ejemplo de una secuencia de señal natural como compañero de fusión para el análogo. Otra posibilidad es el uso del fragmento C3d del factor de complemento C3 o C3 en si (véase Dempsey y cols., 1996, Science 271, 348-350 y Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).
Es importante resaltar que cuando se intenta usar el procedimiento de la invención contra, por ejemplo, antígenos polipeptídicos unidos a la membrana que están expuestos al espacio extracelular, se prefiere más que el/los análogo(s)
primero y/o segundo tenga(n) sustancialmente la estructura terciaria global del antígeno polipeptídico asociado a células. En la presente memoria descriptiva y reivindicaciones, se pretende que esto signifique que la estructura terciaria global de la parte del antígeno polipeptídico que está expuesta al medio extracelular se conserve, dado que, como se menciona anteriormente, la estructura terciaria de los polipéptidos intracelulares obligados no participan en el sistema inmunitario humeral. De hecho, como parte de la estrategia de vacunación se desea a menudo evitar la exposición al espacio extracelular de los epítopos de los linfocitos B que se derivan de la parte intracelular de los antígenos polipeptídicos; de este modo, pueden minimizarse los efectos potencialmente adversos provocados por la reactividad cruzada con otros antígenos.
Para los fines de la presente invención, es sin embargo suficiente si la variación/modificación (sea una inserción, adición, eliminación o sustitución) da lugar a un epítopo exógeno de linfocito T y al mismo tiempo conserve un número sustancial de los epítopos de CTL en el antígeno polipeptídico (y algunas veces también un número sustancial de epítopos de linfocitos B).
La siguiente fórmula describe las construcciones que la invención cubre de forma general:
(I)(MOD_{1})_{s1} (PAG_{e1})_{n1} (MOD_{2})_{s2} (PAG_{e2})_{n2}.... (MOD_{x})_{sx} (PAG_{ex})_{nx}
donde PAG_{e1}- PAG_{ex} son x subsecuencias que contienen epítopos de CTL y/o de linfocitos B del antígeno polipeptídico relevante que independientemente son idénticos o no idénticos y que pueden contener o no contener grupos laterales exógenos, x es un número de longitud completa \geq 3, n1-nx son x números de longitud completa \geq 0 (al menos uno es \geq 1), MOD_{1}-MOD_{x} son x modificaciones introducidas entre los epítopos conservados y s1-sx son x números de longitud completa \geq 0 (al menos uno es \geq 1 si no se introducen grupos laterales en las secuencias). De este modo, dadas las restricciones funcionales generales de la capacidad inmunógena de las construcciones, la invención permite toda clase de permutaciones de la secuencia de antígenos original y todo tipo de modificaciones en ella. Por lo tanto, en la invención se incluyen análogos obtenidos por omisión de las partes de la secuencia de antígeno polipeptídico que por ejemplo exhiben efectos adversos in vivo o la omisión de partes que normalmente son intracelulares y por lo tanto pueden dar lugar a reacciones inmunológicas no deseadas, véase la descripción detallada más adelante.
Una elaboración adicional del principio anterior incluye el uso de epítopos de CTL y/o linfocitos B de más de un antígeno relacionado con la patología. Por ejemplo, hay diversos antígenos relacionados con el cáncer que ejercen sus efectos oncógenos únicamente cuando están en una forma mutada - ejemplos son K-ras y P53 mutados que son ambas proteínas cruciales en la regulación del ciclo celular normal y que ambas son productos de expresión en la mayoría de las células normales. En algunos casos, se ha demostrado que los CTL reconocen péptidos mutados de estos antígenos. Es por lo tanto importante que el sistema inmunitario responda únicamente al péptido mutado y no a las partes no mutadas, si se instiga una inmunoterapia específica de antígeno.
Los autores han diseñado una estrategia en la que podrían usarse las secuencias de 8-25 aminoácidos de las proteínas relacionadas con la enfermedad de ese tipo como epítopos adicionales en una construcción de AutoVac - en realizaciones preferidas, los epítopos que se introducen proporcionarían al mismo tiempo la emergencia de epítopos de T_{H} en la construcción final, véase la descripción anterior. Los epítopos que se usan para este fin serían los que comprenden la región mutada de la proteína relacionada con la enfermedad. Al usar una estrategia de ese tipo, sería posible generar CTL (y posiblemente anticuerpos, cuando sea pertinente) únicamente contra la forma mutada del antígeno relacionado con la enfermedad. En los casos en los que el antígeno relacionado con la enfermedad proporciona la emergencia de un epítopo de T_{H}, podría omitirse completamente el uso de un epítopo de T_{H} exógeno. Una realización de este principio podría ser por ejemplo la vacunación con una vacuna de ácidos nucleicos que codifican un análogo de un antígeno polipeptídico (por ejemplo Her2 o PSM) en el que se ha introducido al menos un epítopo de T_{H} y al menos un péptido que se deriva de otro antígeno relacionado con la enfermedad (por ejemplo un péptido de la parte mutada de una proteína oncógena). En una realización preferida, el al menos un epítopo de T_{H} se introduce como consecuencia de la introducción del péptido.
Se prefiere además que la variación y/o modificación incluya la duplicación, cuando sea pertinente, del al menos un epítopo de linfocito B, o de al menos un epítopo de CTL del antígeno polipeptídico asociado a células. Esta estrategia proporcionará el resultado de que se presentan al sistema inmunitario copias múltiples de las regiones epitópicas preferidas y así se maximiza la probabilidad de una respuesta inmunitaria eficaz. Por lo tanto, esta realización de la invención utiliza presentaciones múltiples de epítopos que se derivan del antígeno polipeptídico (es decir la fórmula I en la que al menos un epítopo de linfocito B esté presente en dos posiciones).
Este efecto puede lograrse de formas diversas, por ejemplo, simplemente preparando polipéptidos de fusión que comprenden la estructura (PAG)_{m}, donde m es un número de longitud completa \geq 2 y después introduciendo las modificaciones que se describen en la presente memoria en al menos una de las secuencias de antígenos polipeptídicos.
Una realización alternativa de la invención que también produce la presentación preferida de copias múltiples (por ejemplo al menos 2) de las regiones epitópicas importantes del antígeno al sistema inmunitario es el acoplamiento covalente del antígeno, subsecuencia o variantes de la misma a ciertas moléculas. Por ejemplo pueden usarse polímeros, por ejemplo carbohidratos tales como dextrano, véase por ejemplo Lees A y cols., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A y cols., 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600, pero también manosa y manano son alternativas útiles. Las proteínas de membrana integrales por ejemplo de E. coli y otras bacterias son también compañeros de conjugación útiles. Las moléculas portadoras tradicionales tales como la hemocianina de la lapa californiana (KLH), toxoide del tétanos, toxoide de la difteria y albúmina de suero bovina (BSA) son también compañeros de conjugación preferidos y de utilidad.
El mantenimiento de la, a veces ventajosa, fracción sustancial de los epítopos de los linfocitos B o incluso de la estructura terciaria global de una proteína que se somete a modificación tal como se describe en la presente memoria puede lograrse por varias vías. Una es simplemente preparar un antisuero policlonal que se dirige contra el antígeno polipeptídico (por ejemplo un antisuero que se prepara en un conejo) y después usar este antisuero como reactivo de experimentación (por ejemplo en un ELISA competitivo) contra las proteínas modificadas que se producen. Las versiones modificadas (análogos) que reaccionan con la misma intensidad con el antisuero que el antígeno polipeptídico debe considerarse que tienen la misma estructura terciaria global que el antígeno polipeptídico mientras que los análogos que exhiben una reactividad limitada (pero todavía significativa y específica) con un antisuero de ese tipo se considera que han mantenido una fracción sustancial de los epítopos de los linfocitos B originales.
De forma alternativa, pueden prepararse y usarse una selección de anticuerpos monoclonales que reaccionan con distintos epítopos del antígeno polipeptídico en las pruebas de experimentación. Esta estrategia tiene la ventaja de que permite 1) una cartografía de los epítopos del antígeno polipeptídico en cuestión y 2) una cartografía de los epítopos que se mantienen en los análogos que se preparan.
Por supuesto, una tercera estrategia sería resolver la estructura tridimensional del antígeno polipeptídico o de un truncado biológicamente activo del mismo (véase más arriba) y comparar ésta con la estructura tridimensional resuelta de los análogos preparados. La estructura tridimensional puede resolverse con ayuda de estudios de difracción por rayos X y espectroscopia por RMN. Puede obtenerse alguna información adicional que se refiere a la estructura terciaria a partir de estudios de dicroismo circular que tienen la ventaja de requerir únicamente el polipéptido en forma pura (mientras que la difracción por rayos X requiere la provisión de polipéptido cristalizado y la RMN requiere la provisión de variantes isotópicas del polipéptido) para proporcionar información útil sobre la estructura terciaria de una molécula dada. Sin embargo, al final son necesarios los datos de difracción por rayos X y/o RMN para obtener datos concluyentes dado que el dicroismo circular sólo puede proporcionar indicios indirectos de la estructura tridimensional correcta mediante información de los elementos de la estructura secundaria.
En esencia, actualmente hay tres medios posibles de obtener la presentación de los epítopos relevantes al sistema inmunitario: la vacunación tradicional en subunidades con antígenos polipeptídicos, la administración de una vacuna viva modificada genéticamente y la vacunación con ácidos nucleicos. Estas tres posibilidades se describirán por separado a continuación:
Vacunación con polipéptidos
Esto implica la administración al animal en cuestión de una cantidad inmunógenamente eficaz del al menos un análogo primero y, cuando sea relevante, la administración de una cantidad inmunógenamente eficaz del al menos un análogo segundo. Preferiblemente, el al menos un análogo(s) primero y/o segundo se formula(n) junto con un transportador y/o vehículo farmacéutica e inmunológicamente aceptable y, opcionalmente, un adyuvante.
Cuando se efectúa la presentación del análogo al sistema inmunitario de un animal mediante la administración del mismo al animal, la formulación del polipéptido sigue los principios que generalmente se reconocen en la técnica.
La preparación de vacunas que contienen secuencias peptídicas como ingredientes activos generalmente está bien entendida en la técnica, como ejemplifican las patentes de Estados Unidos nº 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792; y 4.578.770. Típicamente, las vacunas de ese tipo se preparan en forma de inyectables ya sea en forma de soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para su solución o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación puede también emulsionarse. El ingrediente inmunógeno activo a menudo se mezcla con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y sus combinaciones. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores de pH o adyuvantes que potencian la efectividad de las vacunas; véase la descripción detallada de los adyuvantes más adelante.
Las vacunas se administran convencionalmente por vía parenteral, mediante inyección, por ejemplo, por vía subcutánea, intradérmica, subdérmica o intramuscular. Formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales, bucales, sublinguales, intraperitoneales, intravaginales, anales e intracraneales. Para los supositorios, los aglutinantes y vehículos tradicionales pueden incluir, por ejemplo, polialcanoglicoles o triglicéridos; los supositorios de ese tipo pueden formarse a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo de 0,5% a 10%, preferiblemente 1-2%. Las formulaciones orales incluyen excipientes que se emplean normalmente tales como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato magnésico y similares. Estas composiciones toman forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones o polvos de liberación mantenida y contienen de 10-95% de ingrediente activo, preferiblemente de 25-70%. Para las formulaciones orales, la toxina del cólera es un compañero de formulación interesante (y también un posible compañero de conjugación).
Los polipéptidos pueden formularse en la vacuna en formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos (que se forman con los grupos amino libres del péptido) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales que se forman con los grupos carboxilo libres pueden derivarse también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.
Las vacunas se administran de forma compatible con la formulación de administración y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz e inmunógena. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, que incluye, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunitario del individuo de desarrollar una respuesta inmunitaria y el grado de protección que se desee. Los intervalos de dosis adecuados son del orden de varios cientos de microgramos de ingrediente activo por vacunación con un intervalo preferido desde aproximadamente 0,1 \mug a 2000 \mug (aunque se contemplan cantidades mayores en el intervalo de 1-10 mg), tal como en el intervalo desde aproximadamente 0,5 \mug a 1000 \mug, preferiblemente en el intervalo desde 1 \mug a 500 \mug y especialmente en el intervalo desde aproximadamente 10 \mug a 100 \mug. También son variables los regímenes adecuados para las inyecciones de administración inicial y de recuerdo pero se tipifican con una administración inicial seguida de inoculaciones subsiguientes u otras
administraciones.
La forma de aplicación puede variar ampliamente. Son aplicables cualquiera de los procedimientos convencionales para la administración de una vacuna. Estos incluyen aplicación oral en una base sólida fisiológicamente aceptable o en una dispersión fisiológicamente aceptable, por vía parenteral mediante inyección o similares. La dosis de la vacuna dependerá de la vía de administración y variará de acuerdo con la edad de la persona a vacunar y la formulación del antígeno.
Algunos de los polipéptidos de la vacuna son suficientemente inmunógenos en una vacuna, pero para algunos de los otros la respuesta inmunitaria se potenciará si la vacuna comprende además una sustancia adyuvante. Se prefiere especialmente usar un adyuvante que pueda demostrarse que facilita la anulación de la tolerancia autóloga a los antígenos autólogos.
Se conocen varios procedimientos para lograr un efecto adyuvante para la vacuna. Los principios y procedimientos generales se detallan en "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E.S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN -471-95170-6 y también en "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G y cols. (editores), Plenum Press, Nueva York, ISBN 0-306-45283-9.
Los adyuvantes preferidos facilitan la captación de las moléculas de vacuna por las APC, tales como los dendrocitos y las activan. Ejemplos no limitantes se seleccionan del grupo que consiste en un adyuvante rastreador inmunitario; un adyuvante inmunomodulador tal como una toxina, una citoquina y un derivado micobacteriano; una formulación oleaginosa; un polímero; un adyuvante que forma micelas; una saponina; una matriz de complejo inmunoestimulador (matriz ISCOM); una partícula; DDA; adyuvantes de aluminio; adyuvantes de ADN; \gamma-inulina; y un adyuvante encapsulante. En general debería reseñarse que las descripciones anteriores que se refieren a compuestos y agentes útiles como restos primero, segundo y tercero en los análogos también se refieren mutatis mutandis a su uso en el adyuvante de una vacuna de la invención.
La aplicación de adyuvantes incluye el uso de agentes tales como hidróxido o fosfato de aluminio (alumbre), que se usa comúnmente en forma de solución del 0,05 al 0,1 por ciento en solución salina tamponada, mezclada con polímeros sintéticos de azúcares (por ejemplo Carbopol®) usados en forma de solución al 0,25 por ciento, agregación de la proteína de la vacuna mediante tratamiento térmico con temperaturas que varían entre 70ºC y 101ºC durante periodos de 30 segundos a 2 minutos respectivamente y también es posible la agregación mediante agentes de reticulación. También pueden emplearse la agregación mediante reactivación con anticuerpos (fragmentos Fab) que se tratan con pepsina a albúmina, la mezcla con células bacterianas tales como C. parvum o endotoxinas o componentes lipopolisacáridos de bacterias gram negativas, la emulsión en vehículo oleaginosos fisiológicamente aceptables tales como monooleato de manida (Aracel A) o emulsión con solución al 20 por ciento de un perfluorocarbono (Fluosol-DA) que se usa como sustituto de bloque. También se prefiere la mezcla con aceites tales como escualeno e IFA.
De acuerdo con la invención DDA (bromuro de dimetildioctadecilamonio) es un candidato interesante a adyuvante tal como lo son ADN y \gamma-inulina, pero también son interesantes los adyuvantes completo e incompleto de Freund así como las saponinas de Quillaja tales como QuilA y QS21. Posibilidades adicionales son monofosforilo lípido A (MPL) y los C3 y C3d mencionados anteriormente.
Se sabe también que las formulaciones en liposomas confieren efectos adyuvantes y por lo tanto se prefieren adyuvantes en liposomas de acuerdo con la invención.
También son opciones preferidas los adyuvantes tipo matriz de complejo inmunoestimulador (matriz ISCOM®) de acuerdo con la invención, especialmente desde que se ha demostrado que este tipo de adyuvantes son capaces de regular por aumento la expresión de MHC de clase II por las APC. Una matriz ISCOM® consiste en saponinas (triterpenoides) (opcionalmente fraccionadas) de Quillaja saponaria, colesterol y fosfolípido. Cuando se mezclan con la proteína inmunógena, la formulación particulada resultante es lo que se conoce como una partícula ISCOM en la que la saponina constituye el 60-70% p/p, el colesterol y el fosfolípido el 10-15% p/p y la proteína el 10-15% p/p. Los detalles que se refieren a la composición y uso de complejos inmunoestimuladores puede por ejemplo encontrarse en los libros de texto que se mencionan anteriormente que tratan sobre adyuvantes, pero también Morein B y cols., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475 así como Barr IG y Mitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 proporcionan instrucciones útiles para la preparación de complejos inmunoestimuladores completos.
Otra posibilidad muy interesante (y por lo tanto preferida) de lograr el efecto adyuvante es emplear la técnica que se describe en Gosselin y cols., 1992. De forma abreviada, la presentación de un antígeno relevante tal como un antígeno de la presente invención puede potenciarse conjugando el antígeno con anticuerpos (o fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos) contra los receptores Fc\gamma en monocitos/macrófagos. Se ha demostrado especialmente que los conjugados entre antígeno y anti-Fc\gammaRI potencian la capacidad inmunógena para los fines de la vacunación.
Otras posibilidades implican el uso de las sustancias rastreadoras e inmunomoduladoras (es decir citoquinas) que se mencionan anteriormente como candidatos a los restos primero y segundo en los análogos modificados. A este respecto, también son posibilidades los inductores sintéticos de citoquinas tales como poli I:C.
Los derivados de micobacterias adecuados se seleccionan del grupo que consiste en dipéptido de muramilo, adyuvante completo de Freund, RIBI y un diéster de trehalosa tal como TDM y TDE.
Los adyuvantes inmunorrastreadores adecuados se seleccionan del grupo que consiste en ligando de CD40 y anticuerpos de CD40 o específicamente sus fragmentos de unión (véase la descripción anterior), manosa, un fragmento Fab y CTLA-4.
Los adyuvantes poliméricos adecuados se seleccionan del grupo que consiste en un carbohidrato tal como dextrano, PEG, almidón, manano y manosa; un polímero plástico; y látex tal como perlas de látex.
Todavía otra forma interesante de modular una respuesta inmunitaria es incluir el inmunógeno (opcionalmente junto con adyuvantes y transportadores y vehículos farmacéuticamente aceptables) en un "nódulo linfático virtual" (VLN) (un dispositivo médico registrado desarrollado por ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, Nueva York, NY 10017-6501). El VLN (un dispositivo tubular fino) imita la estructura y función de un nódulo linfático. La inserción de un VLN bajo la piel crea un sitio de inflamación estéril con un aumento vertiginoso de citoquinas y quimioquinas. Los linfocitos T y B así como las APC rápidamente responden a las señales de peligro, campo del sito inflamado y se acumulan dentro de la matriz porosa del VLN. Se ha demostrado que la dosis de antígeno necesaria para desarrollar una respuesta inmunitaria a un antígeno se reduce cuando se usa el VLN y que la protección inmunitaria que confiere la vacunación usando un VLN mejoraba la inmunización convencional usando Ribi como adyuvante. La tecnología se describe brevemente en Gelber C y cols., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node" en "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October, 12th -15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California".
Hallazgos recientes han demostrado que la administración concomitante de agonista de H2 potencia la supervivencia de los linfocitos citolíticos naturales y los CTL dentro del tumor. Por lo tanto, también se contempla la inclusión de agonistas de H2 como adyuvantes en los procedimientos de la invención.
Se espera que la vacuna se administre al menos una vez al año, tal como por lo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 12 veces al año. Más específicamente se esperan de 1-12 veces al año, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 veces al año a un individuo que lo necesite. Se ha demostrado anteriormente que la memoria de la inmunidad inducida por el uso de las vacunas autólogas preferidas de acuerdo con la invención no es permanente y por lo tanto el sistema inmunitario tiene que ser expuesto periódicamente a los análogos.
Debido a la variación genética, los diferentes individuos pueden reaccionar con respuestas inmunitarias de potencia variable al mismo polipéptido. Por lo tanto, la vacuna de acuerdo con la invención puede comprender diversos polipéptidos diferentes para aumentar la respuesta inmunitaria, véase también la descripción anterior que se refiere a la elección de epítopos exógenos de linfocitos T a introducir. La vacuna puede comprender dos o más polipéptidos, donde todos los polipéptidos son tal como se define anteriormente.
En consecuencia, la vacuna puede comprender 3-20 polipéptidos modificados o no modificados diferentes, tal como 3-10 polipéptidos diferentes. Sin embargo, normalmente el número de péptidos se intentará mantener al mínimo tal como 1 ó 2 péptidos.
Vacunas vivas
La segunda alternativa para efectuar la presentación al sistema inmunitario es el uso de tecnología de vacunas con microbios vivos. En la vacunación con microbios vivos, la presentación al sistema inmunitario se efectúa administrando, al animal, un microorganismo no patógeno que ha sido transformado con un fragmento de ácido nucleico que codifica las regiones epitópicas necesarias o un análogo 1º y/o 2º completo. De forma alternativa, el microorganismo se transforma con un vector que incorpora un fragmento de ácido nucleico de ese tipo. El microorganismo no patógeno puede ser cualquier cepa bacteriana atenuada adecuada (atenuada mediante pases o mediante la eliminación de los productos de expresión patógenos mediante ingeniería genética), por ejemplo Mycobacterium Bovis BCG., Streptococcus spp no patógeno, E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, etc. Las reseñas que tratan de la preparación de vacunas de última generación con microbios vivos pueden encontrarse, por ejemplo, en Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 y Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990. Para los detalles sobre los fragmentos de ácido nucleico y vectores que se usan en las vacunas con microbios vivos de ese tipo, véase la descripción más
adelante.
En lo que se refiere a la vacuna polipeptídica, el epítopo de T_{H} y/o los restos primero y/o segundo y/o tercero pueden, si están presentes, estar en forma de compañeros de fusión de la secuencia de aminoácidos que se deriva del antígeno polipeptídico asociado a células.
Como alternativa a las vacunas con bacterias vivas, el fragmento de ácido nucleico de la invención que se describe más adelante puede incorporarse en un vector de vacuna viral no virulento. Una posibilidad es un virus de viruela tal como vaccinia, MVA (virus vaccinia modificado), viruela de canario, viruela aviar, varicela, etc. De forma alternativa, puede usarse una variante de virus herpes simples.
Normalmente, el microorganismo o virus no patógeno se administra sólo una vez al animal, pero en ciertos casos puede ser necesario administrar el microorganismo más de una vez en la vida.
También puede transformarse el microorganismo con ácidos nucleicos que contienen regiones que codifican los restos 1º, 2º y/o 3º, por ejemplo en forma de las sustancias inmunomoduladoras que se describen anteriormente tales como las citoquinas que se describen como adyuvantes útiles. Una versión preferida de esta realización comprende incorporar la región codificadora para el análogo y la región codificadora para el inmunomodulador en marcos de lectura abiertos diferentes o al menos controladas por promotores diferentes. Así se evita que el análogo o los epítopos se produzcan en forma de compañeros de fusión del inmunomodulador. De forma alternativa, pueden usarse dos fragmentos de nucleótidos diferentes como agentes transformantes.
Vacunación con ácidos nucleicos
Como alternativa a la administración clásica de una vacuna con base peptídica, la tecnología de la vacunación con ácidos nucleicos (también conocida como "inmunización con ácidos nucleicos", "inmunización genética", "inmunización génica" y "vacunación con ADN") ofrece varias propiedades atractivas.
Primero, al contrario que la estrategia tradicional de las vacunas, la vacunación con ácidos nucleicos no requiere una producción del agente inmunógeno a gran escala que consume recursos (por ejemplo en forma de fermentación a escala industrial de microorganismos que producen los análogos necesarios para la vacunación con polipéptidos). Además, no es necesario diseñar esquemas de purificación y plegamiento del inmunógeno. Y finalmente, dado que la vacunación con ácidos nucleicos depende del aparato bioquímico del individuo vacunado para producir el producto de expresión del ácido nucleico introducido, se espera que ocurra el procesamiento post-traduccional óptimo del producto de expresión; esto es especialmente importante en el caso de la vacunación autóloga, dado que, tal como se menciona anteriormente, debe conservarse una fracción significativa de los epítopos de los linfocitos B en los análogos que se derivan de secuencias de polipéptidos expuestas extracelularmente y dado que los epítopos de los linfocitos B en principio pueden estar constituidos por partes de cualquier (bio)molécula (por ejemplo carbohidrato, lípido, proteína, etc.). Por lo tanto, los patrones de glucosilación y lipidación nativos del inmunógeno pueden muy bien ser de importancia para la capacidad inmunógena global y esto puede asegurarse de la mejor forma posible cuando el hospedador produce el inmunógeno.
Por lo tanto, una realización importante del procedimiento de la invención implica que la presentación se efectúe introduciendo in vivo, en las APC, al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el al menos un epítopo de CTL y/o el al menos un epítopo de linfocito B y el al menos un epítopo de T_{H} exógeno (una alternativa comprende la administración de al menos 2 fragmentos de ácidos nucleicos diferentes, donde uno codifica el al menos un epítopo de CTL y el otro codifica el al menos un epítopo de T_{H} exógeno). Preferiblemente, esto se realiza usando un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el análogo primero que se describe anteriormente. Si el análogo primero está provisto de los epítopos de T_{H} que se detallan anteriormente y/o los restos primero y/o segundo y/o tercero, entonces estos están presentes en forma de compañeros de fusión de la secuencia de aminoácidos que se deriva del antígeno polipeptídico asociado a células, estando la construcción de fusión codificada por el fragmento de ácido nucleico.
En lo que se refiere a la estrategia tradicional de vacunación, la vacunación con ácidos nucleicos puede combinarse con la introducción in vivo, en las APC, de al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el análogo segundo. Las consideraciones que se refieren a los restos 1º, 2º y 3º y a los epítopos de T_{H} también son de aplicación en este caso.
En esta realización, el ácido nucleico que se introduce es preferiblemente ADN que puede estar en forma de ADN desnudo, ADN formulado con lípidos con carga o sin carga, ADN formulado en liposomas, ADN incluido en un vector vírico, ADN formulado con una proteína o polipéptido que facilita la transfección, ADN formulado con una proteína o polipéptido rastreador, ADN formulado con agentes que precipitan el calcio, ADN acoplado a una molécula de vehículo inerte y ADN formulado con un adyuvante. En este contexto se destaca que, para la formulación de vacunas de ADN, son de aplicación prácticamente todas las consideraciones que se refieren al uso de adyuvantes en formulaciones de vacunas tradicionales. Por lo tanto, todas las descripciones de la presente especificación que se refieren al uso de adyuvantes en el contexto de vacunas con base de polipéptidos son de aplicación mutatis mutandis a su uso en la tecnología de vacunación con ácidos nucleicos. Lo mismo es cierto para otras consideraciones que se refieren a la formulación y modo y vía de administración y, por lo tanto, también estas consideraciones que se describen anteriormente relacionadas con una vacuna tradicional son de aplicación mutatis mutandis a su uso en la tecnología de vacunación con ácidos nucleicos.
Un tipo de formulación de vacunas de ácidos nucleicos especialmente preferida son las micropartículas que contienen el ADN. Micropartículas adecuadas se describen por ejemplo en el documento WO 98/31398.
Además, el/los ácido(s) nucleico(s) que se usa(n) como agente de inmunización pueden contener regiones que codifican los restos 1º, 2º y/o 3º, por ejemplo en forma de las sustancias inmunomoduladoras que se describen anteriormente tales como las citoquinas que se describen como adyuvantes de utilidad. Una versión preferida de esta realización comprende poseer la región codificadora del análogo y la región codificadora del inmunomodulador en marcos de lectura abiertos diferentes o al menos controladas por promotores diferentes. Por lo tanto, se evita que el análogo o epítopo se produzca como compañero de fusión del inmunomodulador. De forma alternativa, pueden usarse dos fragmentos de nucleótidos distintos, pero esto es menos preferido debido a la ventaja de la expresión concomitante asegurada cuando ambas regiones codificadoras están incluidas en la misma molécula.
En circunstancias normales, el ácido nucleico de la vacuna se introduce en forma de un vector en el que la expresión está controlada por un promotor vírico. Para descripciones más detalladas de los vectores de acuerdo con la invención, véase la descripción más adelante. Además, hay disponibles descripciones detalladas que se refieren a la formulación y uso de vacunas de ácidos nucleicos, véase Donnelly JJ y cols., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 y Donnelly JJ y cols., 1997, Life Sciences 60: 163-172. Ambas referencias se incorporan a la presente memoria como referencia.
Una parte importante de la invención se refiere a un procedimiento novedoso para seleccionar un análogo inmunógeno apropiado de un antígeno polipeptídico asociado a células débil que es levemente inmunógeno o no inmunógeno en un animal, siendo capaz dicho análogo inmunógeno de inducir una respuesta de CTL en el animal contra las células que presentan una molécula de MHC de clase I unida a un epítopo que se deriva del antígeno polipeptídico asociado a células. Este procedimiento comprende las etapas de
a) identificar al menos un subsecuencia de la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a células, en la que dicha subsecuencia no contiene epítopos de CTL conocidos ni previstos,
b) preparar al menos un análogo putativamente inmunógeno del antígeno polipeptídico asociado a células introduciendo, en la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a células, al menos un epítopo de T_{H} exógeno al animal en una posición dentro de la al menos una subsecuencia que se identifica en la etapa a), y
c) seleccionar el/esos análogos que se prepararon en la etapa b) que son verificablemente capaces de inducir una respuesta de CTL en el animal.
De forma alternativa, el procedimiento de selección anterior implica la preparación de un fragmento de ácido nucleico con el fin de la vacunación con ácidos nucleicos. En esa situación, es necesario que el péptido codificado incluya al menos un epítopo de T_{H}.
Cuando el análogo se deriva de un antígeno que está expuesto a la fase extracelular, se prefiere que la subsecuencia que se identifica en la etapa a) además no contenga residuos de cisteína o, de forma alternativa, que el epítopo de T_{H} que se introduce en la etapa b) no altere sustancialmente el patrón de residuos de cisteína. Esta estrategia facilita la conservación de epítopos de linfocitos B en el espacio en la construcción resultante que son similares a los epítopos de los linfocitos B en el antígeno polipeptídico asociado a células débil.
Por las mismas razones se prefiere que la subsecuencia que se identifica en la etapa a) además no contenga sitios de glucosilación conocidos o previstos o, de forma alternativa, en la que el epítopo de T_{H} que se introduce en la etapa b) no altere sustancialmente el patrón de glucosilación.
Ciertos antígenos polipeptídicos asociados a células débiles ejercen efectos indeseados al desempeñar un papel patofisiológico. Se desea que estos efectos no sean ejercidos por las construcciones de vacunación y, por lo tanto, se prefiere que la subsecuencia que se identifica en la etapa a) contribuya de forma significativa a un efecto patofisiológico ejercido por el antígeno polipeptídico asociado a células y que la introducción en la etapa b) del epítopo de T_{H} exógeno reduzca o anule dicho efecto patofisiológico. Un ejemplo de esta estrategia es eliminar el sitio activo en una enzima, hormona o citoquina e intercambiarlo por el epítopo de T_{H} exógeno.
Otra consideración importante se refiere a la cuestión de la reactividad cruzada inmunológica del producto polipeptídico de la vacuna con otras proteínas autólogas que no se refieren a una patología. Una reactividad cruzada de ese tipo debería preferiblemente evitarse y, por lo tanto, una realización importante de este procedimiento de la invención es una en la que la subsecuencia que se identifica en la etapa a) sea homóloga a una secuencia de aminoácidos de un antígeno proteínico diferente del animal y en la que la introducción del epítopo de T_{H} en la etapa b) sustancialmente elimine la homología.
Relacionada con esta realización está una realización en la que cualesquiera secuencias de aminoácidos que 1) no se exponen normalmente a la fase extracelular y 2) que pueden constituir epítopos de los linfocitos B del antígeno polipeptídico asociado a células débil, no se conservan en el análogo. Esto puede lograrse intercambiando las secuencias de aminoácidos de ese tipo por epítopos de T_{H} que no constituyen epítopos de linfocitos B, eliminándolos completamente o eliminándolos parcialmente.
Por otra parte, se prefiere que cualesquiera epítopos de linfocitos B "verdaderos" del antígeno polipeptídico asociado a células se conserven en un grado elevado y, por lo tanto, una realización importante del procedimiento de selección de la invención implica que la introducción en la etapa b) del epítopo de T_{H} exógeno dé como resultado la conservación de una fracción sustancial de epítopos de linfocitos B del antígeno polipeptídico asociado a células. Se prefiere especialmente que el análogo conserve la estructura terciaria global del antígeno polipeptídico asociado a células.
La preparación de la etapa b) se logra preferiblemente por medios de biología molecular o mediante síntesis peptídica de fase sólida o líquida. Los péptidos más cortos se preparan preferiblemente mediante técnicas notorias de síntesis de péptidos en fase sólida o líquida. Sin embargo, avances recientes de esta tecnología han hecho posible la producción de polipéptidos y proteínas de longitud completa por estos medios y, por lo tanto, también está dentro del alcance de la presente invención preparar construcciones largas por medios sintéticos.
Después de haber identificado los análogos útiles de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, es necesario producir el análogo a mayor escala. Los polipéptidos se preparan de acuerdo con procedimientos notorios en la técnica.
Esto se puede realizar por medios de biología molecular que comprenden una primera etapa de preparar una célula transformada introduciendo, en un vector, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un análogo que se ha seleccionado de acuerdo con el procedimiento y transformando una célula hospedadora adecuada con el vector. La siguiente etapa es cultivar la célula transformada en condiciones que facilitan la expresión del fragmento de ácido nucleico que codifica el análogo del antígeno asociado a células y, subsiguientemente recuperar el análogo del sobrenadante de cultivo o directamente de las células, por ejemplo en forma de lisado). De forma alternativa, el análogo puede prepararse mediante síntesis de péptidos a gran escala en fase sólida o líquida, véase más arriba.
Finalmente, el producto puede, dependiendo de la célula que se elija como célula hospedadora o el procedimiento de síntesis utilizado, someterse a modificaciones post-traduccionales artificiales. Éstas pueden ser estrategias de plegamiento conocidas en la técnica, tratamiento con enzimas (para obtener glucosilación o eliminación de compañeros de fusión indeseados, modificaciones químicas (de nuevo la glucosilación es una posibilidad) y conjugación, por ejemplo con moléculas tradicionalmente transportadoras.
Debería resaltarse que los análogos preferidos de la invención (y también los análogos relevantes que se usan en los procedimientos de la invención) comprenden modificaciones que dan como resultado un polipéptido que tiene una identidad de secuencia de al menos el 70% con el antígeno polipeptídico o con una subsecuencia del mismo de al menos 10 aminoácidos de longitud. Se prefieren identidades de secuencia mayores, por ejemplo al menos 75% o incluso al menos 80% o 85%. La identidad de la secuencia para las proteínas y ácidos nucleicos puede calcularse como (N_{ref}-N_{dif}) \cdot 100/N_{ref}, en la que N_{dif} es el número total de residuos que no son idénticos en las dos secuencias cuando se alinean y en la que N_{ref} es el número de residuos en una de las secuencias. Por lo tanto, la secuencia AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencia del 75% con la secuencia AATCAATC (N_{dif} = 2 y N_{ref} = 8).
Dianas ejemplares específicas para la invención
Tal como se describe anteriormente, los antígenos polipeptídicos asociados a células débiles preferidos son los antígenos asociados a tumores. En la siguiente tabla se proporciona una lista no limitante de ellos.
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A continuación, se describirán en detalle varios antígenos asociados a tumores específicos.
Antígeno de membrana específico de próstata, PSM
En los EE.UU., el cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte por cáncer (aprox. 40.000 al año) y se diagnostica 200.000 pacientes al año (Boring 1993). Aproximadamente 1 de cada 11 hombres desarrollará cáncer de próstata en algún momento. Además, aproximadamente 40-60% de los pacientes con cáncer de próstata desarrollarán en algún momento una extensión extraprostática de la enfermedad (Babaian 1994). La estrategia principal en la presente invención es usar una vacuna terapéutica como tratamiento suplementario a la prostatectomía para eliminar el tejido tumoral residual y las metástasis.
Diversas afecciones patológicas se localizan en la glándula prostática, incluyendo el crecimiento benigno (BPH), infección (prostatitis) y neoplasia (cáncer prostático).
La agresividad biológica del cáncer prostático es variable. En algunos pacientes el tumor detectado permanece como tumor histológico latente y nunca se vuelve clínicamente significativo. En otros pacientes, el tumor progresa rápidamente, forma metástasis y mata al paciente en un periodo de tiempo relativamente corto (2-5 años).
El tratamiento primario actual del cáncer de próstata es la prostatectomía. Sin embargo, debido a la extensa propagación de las células de cáncer de próstata la mayoría de los pacientes de cáncer de próstata no se curan mediante cirugía local. Los pacientes con enfermedad no confinada en algún momento reciben tratamiento de ablación sistémica de andrógenos, pero la tasa de muerte anual de cáncer de próstata no ha disminuido en absoluto durante los 50 años desde que la ablación de andrógenos se convirtió en tratamiento estándar para la enfermedad metastática.
PSM es una proteína de membrana que es altamente específica para los tejidos prostáticos, benignos así como malignos, aunque la expresión de PSM se ha observado también en otros tejidos tales como tejido renal y tumor renal, intestino delgado, cerebro y neovascularización tumoral. Por lo tanto, si la cirugía tuviera éxito, los pacientes de cáncer prostatectomizados deberían teóricamente expresar PSM en tejido tumoral de próstata maligno residual o en las metástasis que se originaran a partir del tumor. Al inducir una respuesta potente de CTL y/o una respuesta potente de anticuerpos policlonales contra PSM, se espera que pueda eliminarse el tejido tumoral residual.
De forma interesante, se ha observado la regulación por aumento de la expresión de PSM tras el tratamiento de privación de andrógenos de pacientes con cáncer de próstata (Wright 1996). Esto haría que un tratamiento con PSM como diana estuviera muy bien adaptado para después del tratamiento de privación de andrógenos tradicional.
PSM se identificó primero en 1987 como resultado de la generación de un anticuerpo monoclonal, 7E11-C5.3, que se desarrolló contra una célula de cáncer de próstata humano aislada, LNCaP (Horoszewicz 1987). El anticuerpo reconoció tanto el epitelio prostático normal como maligno y se usó en 1993 para purificar y determinar la secuencia de aminoácidos de la proteína PSM y finalmente para clonar el gen (Israeli 1993).
PSM es una glucoproteína transmembrana de tipo II con un peso molecular de 84 kD tal como se previó a partir de la secuencia de ácidos nucleicos mientras que la versión glucosilada tiene un peso molecular observado de 100-120 kD. La secuenciación del gen que codifica PSM reveló una región que atraviesa la membrana putativa relacionada con tres residuos de anclaje citosólicos de arginina. La parte extracelular de PSM constituye 707 del total de 750 aminoácidos de la proteína, mientras que el dominio citoplasmático se prevé que tiene 19 aminoácidos de largo (Israeli 1993). Se ha detectado ARNm específico de PSM en tejido tumoral prostático (Israeli 1994), lo que indica que el antígeno tumoral no es una proteína glucosilada de forma aberrante, que es el caso por ejemplo de antígenos de tumor Tn- o sTn-.
El ADNc de PSM de longitud completa se ha transferido y se ha expresado en una línea celular de cáncer de próstata humano negativo para PSM, PC-3 (Kahn 1994). Además, el ADNc de longitud completa (2,65 kilobases) ha sido trascrito y traducido in vitro (Kahn 1994).
Se ha demostrado recientemente que PSM posee actividad hidrolítica que se asemeja a la de la dipeptidasa ácida con enlace \alpha N-acetilada (NAALADasa) - de hecho se ha demostrado que las dos proteínas son idénticas. NAALADasa es una hidrolasa unida a la membrana del sistema nervioso, que cataboliza el neuropéptido N-acetilaspartilglutamato (NAAG) para afectar a los procesos de señalización glutamatérgicos. Todavía se desconoce si esta actividad de PSM tiene cualquier función biológica relevante.
Es de alguna importancia predecir si podría esperarse una reactividad cruzada no deseada con otras proteínas accesibles para los CTL o para los anticuerpos tras el tratamiento con una vacuna autóloga que induce respuestas inmunitarias específicas de PSM. Se ha demostrado que una parte de la región codificadora del gen PSM (posiciones de aminoácidos 418-567) tiene una homología del 54% con el receptor de transferrina humana (Israelí 1993). También, se ha encontrado una identidad completa de secuencias con la enzima NAALADasa, véase más arriba. No fue posible identificar una similitud funcionalmente relevante con otras peptidasas conocidas.
La homología con el receptor de transferrina es muy baja y preferiblemente se alterará en algunas de las construcciones de la invención. La identidad de secuencia observada con NAALADasa no se espera que sea un obstáculo para una vacuna contra PSM, en parte debido a la escasa capacidad de los anticuerpos y CTL de penetrar a través de la barrera hematoencefálica. En conjunto, incluso con la construcción más parecida a PSM, no se espera que se experimenten reactividades cruzadas prohibitivas con otras proteínas de los pacientes.
A partir de estudios anteriores, está claro que PSM se expresa en la mayoría de las células de cáncer de próstata y de las metástasis que se originan en la próstata analizadas. Además, la mayoría de los otros cánceres analizados, tales como carcinomas, sarcomas y melanomas de tejidos diferentes así como un amplio conjunto de líneas celulares de cáncer humano no prostático han demostrado que son negativos para PSM.
Además de esto, se ha observado que un gran número de otros tejidos son negativos para PSM. Estos incluyen colon, mama, pulmón, ovario, hígado, vejiga urinaria, útero, bronquio, bazo, páncreas, lengua, esófago, estómago, tiroides, paratiroides, suprarrenal, nódulo linfático, aorta, vena cava, piel, glándula mamaria y placenta. Sin embargo, la RT-PCR ha demostrado la existencia de ARNm de PSM en algunos de estos tejidos.
Aunque PSM se encuentra de forma predominante en forma de una molécula unida a membranas en el tejido de la próstata, también pueden detectarse cantidades pequeñas de PSM en el suero de individuos normales y en niveles elevados en pacientes de cáncer de próstata (Rochon 1994, Murphy 1995). El nivel de PSM en circulación en estos pacientes por lo tanto permite un control serológico de la efectividad de una vacuna contra PSM.
En conclusión, basándose en la cantidad completa de datos disponibles hasta la fecha, PSM es un antígeno con una especificidad elevada para el tejido de próstata humano y los tumores que se originan a partir del mismo. Esto quiere decir que en pacientes que han sufrido prostatectomía, PSM es un antígeno autólogo casi específico de tumor. Por lo tanto, una vacuna contra PSM efectiva es probable que rastree principalmente el tejido prostático o metastático de origen prostático.
Como estará claro a partir del Ejemplo 1, la invención preferiblemente implica que un epítopo exógeno de linfocito T_{H} se introduce en parte de la secuencia de aminoácidos de PSM definida por la SEC ID Nº: 2 posiciones 16-52 y/o 87-108 y/o 210-230 y/o 269-289 y/o 298-324 y/o 442-465 y/o 488-514 y/o 598-630 y/o 643-662 y/o 672-699. Además, también es parte de la invención, una molécula de PSM modificada que tiene un epítopo de T_{H} exógeno introducido en estas posiciones.
En consecuencia, la invención se refiere también a un análogo de PSM humana que es inmunógeno en los seres humanos, dicho análogo comprende una parte sustancial de todos los epítopos conocidos y previstos de CTL y linfocitos B de PSM e incluye al menos un epítopo de T_{H} exógeno tal como se describe en la presente memoria. Los análogos de PSM preferidos son aquellos en los que hay presente al menos un epítopo de T_{H} exógeno por inserción en la secuencia de aminoácidos de PSM o por sustitución de parte de la secuencia de aminoácidos de PSM o como resultado de la eliminación de parte de la secuencia de aminoácidos de PSM y los análogos más preferidos son aquellos en los que se introduce un epítopo exógeno de linfocito T_{H} en una parte de la secuencia de aminoácidos de PSM que se define por la SEC ID Nº: 2 posiciones 16-52 y/o 87-108 y/o 210-230 y/o 269-289 y/o 298-324 y/o 442-465 y/o 488-514 y/o 598-630 y/o 643-662 y/o 672-699.
Gonadotropina coriónica humana (HCG)
Las relaciones entre marcadores embrionarios y fenotipos malignos se han estado describiendo durante muchas décadas. Un creciente corpus de datos sugiere que al menos uno de los marcadores de ese tipo, gonadotropina coriónica humana beta (hCG\beta), se detecta de forma consistente en células de cáncer de muchos orígenes histológicos diferentes y que la expresión de esta proteína a menudo se correlaciona con propiedades metastáticas aumentadas. Una respuesta inmunitaria humoral dirigida contra esta proteína soluble puede reducir las posibilidades de que el tumor se extienda y/o puede inhibir la reaparición de crecimientos primarios nuevos tras la cirugía.
La gonadotropina coriónica humana pertenece a una familia de hormonas glucoproteínicas, que incluyen la hormona estimuladora de folículos (FSH), hormona estimuladora tiroidea (TSH) y hormona luteinizante (LH), todas las cuales son reguladores importantes de la expresión reproductiva y de la supervivencia fetal. Los miembros de esta familia de hormonas son heterodímeros, que comparten una cadena \alpha común. La cadena \beta es única para cada hormona y proporciona la especificidad, y la cadena \beta de LH exhibe la homología de secuencia más fuerte con hCG\beta (aproximadamente el 80%). El peso molecular aparente de hCG-holo, es 37 kD, de los que un tercio los aporta el carbohidrato. Las modificaciones de azúcares post-traduccionales incluyen tanto carbohidratos ligados en N como ligados en O. Hay presentes abundantes residuos de ácido sialico y estos proporcionan a la proteína una gran carga negativa. La estructura cristalina de hCG-holo ha sido resuelta (Lapthorn y cols., 1994).
Basándose en la estructura cristalina se encontró que hCG presenta homología con una familia de factores de crecimiento, que incluyen PDGF y TGF\beta (Lapthorn y cols., 1994). Esto sugiere que la expresión de hCG puede ayudar a regular el crecimiento de las células cancerosas.
La gonadotropina coriónica humana es una hormona glucoproteínica, que se produce en los sincitiotrofoblastos de la placenta poco después de la concepción y es esencial para la gestación exitosa en la mujer embarazada.
No se conoce el papel patofisiológico de los marcadores embrionarios para el desarrollo o mantenimiento de una masa cancerosa. Sin embargo, es interesante resaltar que los trofoblastos (donde normalmente se producen estas proteínas) tienen tanto características angiógenas como invasivas, ambas de las cuales son también propiedades necesarias para una célula cancerosa. Además, se ha sugerido que hCG (o sus subunidades) pueden inhibir las respuestas inmunitarias celulares maternales contra el tejido fetal. Por ejemplo, los estudios han demostrado que hCG directamente suprime las respuestas de los linfocitos T (Jacoby y cols., 1984) y se ha propuesto que debido a que los nódulos linfáticos que drenan (en este caso) un tumor de melanoma primario, están inmunosuprimidos, puede darse un entorno más favorable para que se establezcan los tumores metastáticos. Como consecuencia, la expresión de hCG\beta puede ayudar a las células cancerosas a extenderse a los órganos linfoides secundarios. Finalmente, tal como se menciona anteriormente, se ha demostrado la homología estructural entre hCG y varios factores de crecimiento. Otra posibilidad es por lo tanto que la secreción de hCG por las células cancerosas pueda proporcionar al tumor una ventaja de crecimiento.
La expresión de hCG\beta se ha demostrado en muchos tipos diferentes de cáncer, por ejemplo: a) adenocarcinoma de próstata: se observó hCG\beta positivo en secciones de tejido para pacientes con un pronóstico desfavorable, independientemente del grado histológico del tumor (Sheaff y cols., 1996), b) clases diferentes de carcinomas de pulmón; de células escamosas (SQCC), adenocarcinoma (AC) y macrocítico (LCC), demostraron todas un porcentaje elevado de reactividad por hCG\beta (Boucher y cols. 1995), c) adenocarcinoma pancreático (Syrigos y cols., 1998), d) neuroblastomas, cánceres de cerebro, retinoblastomas (Acevedo y cols., 1997), e) melanoma maligno (Doi y cols., 1996), f) carcinomas de vejiga (Lazar y cols., 1995). Un artículo reciente describe una estrategia de ADN, en la que los ratones se inmunizaron con una construcción de expresión de hCG\beta (Geissler y cols., 1997). En este modelo in vivo la inhibición del crecimiento tumoral se asociaba fuertemente con la actividad de CTL, sin embargo se detectaron también valoraciones elevadas de anticuerpos (que neutralizaban el efecto biológico de hCG en su receptor celular).
El uso de hCG como inmunógeno ha sido descrito en diversos artículos, que se centran en su uso como vacuna anticonceptiva (Talwar y cols., 1976 y Talwar y cols., 1994). Se ha observado un grado muy elevado de eficacia y seguridad en un estudio clínico antifertilidad, usando una vacuna contra hCG-holo (Talwar y cols., 1994). También se han realizado ensayos clínicos en fase I en pacientes de cáncer con una vacuna contra un péptido sintético del extremo carboxi de hCG\beta conjugado con toxoide de difteria (Triozzi y cols., 1994) y están realizándose ensayos en fase II. A pesar del hecho de que la idea de usar hCG\beta como diana de vacuna contra el cáncer ha estado barajándose durante algún tiempo, no se ha explorado de forma conjunta con la tecnología de AutoVac.
Se sabe que las células de tejido distinto del embrionario, o los neoplasmas benignos no expresan hCG\beta. Por lo tanto, no debería haber efectos secundarios potenciales por la vacunación contra esta molécula (aparte de los efectos sobre el embarazo). Debido a que esta molécula es expresada por muchas clases diferentes de cánceres, ha sido propuesta como el "biomarcador definitivo del cáncer" (Acebedo y cols., 1995 y Regelson W., 1995) y como tal sería una diana atractiva a perseguir.
Pueden encontrarse modelos animales adecuados para estudios ulteriores sobre la eficacia de una vacuna basada en hCG en Acevedo y cols., Cancer Det. and Prev. Suppl. (1987) 1: 477-486 y en Kellen y cols., Cancer Immunol. Immun. Ther. (1982) 13: 2-4.
Her2
Se cree que los receptores de tirosina quinasa Her2 y EGFr desempeñan un papel crucial en la transformación maligna de las células normales y en el crecimiento continuado de células cancerosas. La hiperexpresión está normalmente ligada a un pronóstico muy desfavorable. Durante los últimos años ha habido muchas reseñas sobre el uso de anticuerpos contra estos receptores como tratamiento para cánceres que hiperexpresan cualquiera de los dos o ambos receptores. Genentech Inc. ha terminado varios ensayos clínicos exitosos en pacientes con cáncer de mama usando un anticuerpo monoclonal contra Her2 y ha obtenido recientemente aprobación de la FDA para la comercialización de la preparación de anticuerpos monoclonales contra Her2, Herceptin®.
La tecnología de vacunación autóloga que se describe en la presente memoria aplicada en la molécula Her2 induciría anticuerpos policlonales que reaccionarían predominantemente con Her2. Los anticuerpos de ese tipo se espera que ataquen y eliminen células tumorales así como que prevengan que las células metastáticas desarrollen metástasis. El mecanismo efector de este efecto antitumoral se mediaría mediante complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
Dependiendo de la elección de construcciones, los anticuerpos autólogos inducidos podrían inhibir también el crecimiento de células cancerosas mediante la inhibición de la oligodimerización e internalización, dependientes de los factores de crecimiento, de los receptores. Y, lo más importante, se espera que los análogos de Her2 sean capaces de inducir respuestas de CTL dirigidas contra epítopos de Her2 conocidos y/o previstos que presentan las células tumorales.
Her2 es miembro de la familia de receptores de factores de crecimiento epidérmico (c-erbB) que consiste en cuatro receptores diferentes hasta la fecha: c-erbB-1 (EGFr), c-erbB-2 (Her2, c-Neu), c-erbB-3 y c-erbB-4 (Salomón y cols., 1995). C-erbB-3 y c-erbB-4 están peor caracterizados que EGFr y Her2. Her2 es una glucoproteína integral. La proteína madura tiene un peso molecular de 185 kD con características estructurales que se parecen mucho al receptor de EGFr (Prigent y cols., 1992). EGFr es también un receptor integral de membrana que consiste en una subunidad. Tiene un peso molecular aparente de 170 kD y consiste en un dominio superficial de unión a ligandos de 621 aminoácidos, un único dominio transmembrana hidrófobo de 23 aminoácidos y un dominio de tirosina quinasa citoplásmico altamente conservado de 542 aminoácidos. La proteína está glucosilada en N (Prigent y cols., 1994).
Todas las proteínas de esta familia son tirosina quinasas. La interacción con el ligando provoca la dimerización del receptor, que aumenta la acción catalítica de la tirosina quinasa (Bernard. 1995, Chantry 1995). Las proteínas de la familia son capaces de homo y heterodimerizarse lo que es importante para su actividad. El EGFr transmite efectos que promueven el crecimiento y estimula la captación de glucosa y aminoácidos por las células (Pringent y cols. 1992). Her2 también transmite señales que promueven el crecimiento. Únicamente EGFr se une a EGF y TGF-alfa. Estos ligandos no se unen a los otros receptores de la familia (Pringent y cols., 1992). Los ligandos de Her2 no se han determinado completamente. Sin embargo, se ha demostrado que herregulina induce la fosforilación al activar Her2. Esto no parece deberse a una unión directa al receptor sino que se cree que herregulina es un ligando de erbB-3 y erbB-4 que después activa Her2 por oligodimerización (Solomon y cols., 1995).
La homología entre las proteínas de la familia de receptores EGF es la más pronunciada en el dominio de la tirosina quinasa en la parte citoplásmica de las moléculas (82% entre EGFr y Her2). La homología es menor en la parte extracelular - del 41% al 46% en dominios diferentes (Pringent y cols., 1992).
El receptor del factor de crecimiento epidérmico se expresa en los tejidos normales en cantidades pequeñas, pero se hiperexpresa en muchos tipos de cánceres. EGFr se hiperexpresa en cánceres de mama (Earp y cols., 1993, Eppenberger 1994), gliomas (Schlegel y cols., 1994), cáncer gástrico (Tkunaga y cols., 1995), carcinoma escamoso cutáneo (Fujii 1995) cáncer de ovario (van Dam y cols., 1994) y otros. Her2 se expresa también en algunos tejidos humanos normales en cantidades pequeñas, de forma más característica en el epitelio secretor. La hiperexpresión de Her2 se produce en aproximadamente el 30% de los cánceres de mama, gástricos, pancreáticos, de vejiga y de ovario.
La expresión de estos receptores varía dependiendo del grado de diferenciación de los tumores y del tipo de cáncer, por ejemplo, en el cáncer de mama, los tumores primarios hiperexpresan ambos receptores; mientras que en el cáncer gástrico, la hiperexpresión se produce en una etapa posterior en los tumores metastáticos (Salomón y cols., 1995). El número de receptores hiperexpresados en las células de carcinoma es superior a 10^{6}/célula para diversas líneas de cáncer de cabeza y cuello, vulva, mama y ovario aislados de pacientes (Dean y cols., 1994).
Hay varias razones por las que la familia EGFr de receptores constituye dianas adecuadas para la inmunoterapia tumoral. Primero, se hiperexpresan en muchos tipos de cánceres, lo que debería dirigir la respuesta inmunitaria hacia el tumor. Segundo, los tumores a menudo expresan o hiperexpresan los ligandos para esta familia de receptores y algunos son hipersensibles a los efectos proliferativos mediados por estos ligandos. Tercero, los pacientes con tumores que hiperexpresan los receptores de factores de crecimiento a menudo tienen un pronóstico desfavorable. La hiperexpresión se ha relacionado íntimamente con un pronostico desfavorable especialmente en el cáncer de mama, cáncer de pulmón y cáncer de vejiga (2) y aparentemente se asocia a fenotipos invasivos/metastáticos, que son bastante insensibles a las terapias convencionales (Eccles y cols., 1994).
La hiperexpresión de Her2 en algunos casos es resultado de la amplificación del gen y en otros casos de una transcripción y traducción aumentadas. La hiperexpresión de Her2 se asocia a un diagnóstico desfavorable en los cánceres de mama y ovario, cáncer gástrico, cáncer de vejiga y posiblemente en los cánceres de pulmón amicrocíticos (Solomon y cols.,1995).
Se han realizado ensayos clínicos en fase I con un anticuerpo biespecífico en pacientes con cánceres de mama y ovario avanzados. El anticuerpo era biespecífico contra Her2 y Fc\gammaRI (Weiner y cols., 1995). Se observó la lisis eficiente de las células tumorales que hiperexpresan Her2 con un anticuerpo biespecífico contra Her2 y CD3 (Zhu y cols., 1995).
El tratamiento con anticuerpo monoclonal contra Her2 de ratones scid xenoinjertados con cáncer gástrico humano prolongó la supervivencia de los ratones (Ohniski y cols., 1995). Las actividades antitumorales de los anticuerpos monoclonales contra Her2, in vitro e in vivo no se deben a un mecanismo idéntico; pueden actuar como agonistas parciales de ligandos, alterar el recambio de los receptores Her2 y la fosforilación o pueden afectar a la dimerización (Lupu y cols., 1995).
De forma similar, se ha demostrado que los anticuerpos contra EGFr pueden interferir también con interacciones de factores de crecimiento. (Baselga y cols., 1994, Modjahedi y cols., 1993a, Wu y cols., 1995, Modjahedi y cols., 1993b, Tosi y cols., 1995, Dean y cols., 1994, Bier y cols., 1995, Modjtahedi y cols., 1996, Valone 1995).
Por lo tanto, una realización importante de los procedimientos de la invención es una en la que el epítopo de los linfocitos T exógenos se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos de Her2 que se define por la numeración de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 posiciones 5-25 y/o 59-73 y/o 103-117 y/o 149-163 y/o 210-224 y/o 250-264 y/o 325-339 y/o 369-383 y/o 465-479 y/o 579-593 y/o 632-652 y/o 653-667 y/o 661-675 y/o 695-709 y/o 710-730, véanse los ejemplos.
En consecuencia, la invención se refiere también a un análogo de Her2 humana que es inmunógeno en los seres humanos, comprendiendo dicho análogo una parte sustancial de todos los epítopos conocidos y previstos de CTL y linfocito B de Her2 e incluyendo al menos un epítopo de T_{H} exógeno tal como se describe en la presente memoria. Se prefiere que el al menos un epítopo de T_{H} exógeno esté presente por inserción en la secuencia de aminoácidos de Her2 o por sustitución de parte de la secuencia de aminoácidos de Her o como resultado de la eliminación de parte de la secuencia de aminoácidos de Her2. Los análogos más preferidos son los que se definen anteriormente, es decir, aquellos en los que se introduce un epítopo exógeno de linfocito T_{H} en una parte de la secuencia de aminoácidos de Her2 que se define por la SEC ID Nº: 3 posiciones 5-25 y/o 59-73 y/o 103-117 y/o 149-163 y/o 210-224 y/o 250-264 y/o 325-339 y/o 369-383 y/o 465-479 y/o 579-593 y/o 632-652 y/o 653-667 y/o 661-675 y/o 695-709 y/o
710-730.
FGF8b
Varios autores han demostrado anteriormente que FGF8b puede inducir la proliferación, transformación, diferenciación y en algunos casos aumentar mucho la capacidad tumorígena de las células y tejidos de mamíferos (Tanaka 1992, Kouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArthrur 1995a, Crossley 1996a, 1996b, Gosh 1996, Ohuchi 1997a, Rudra-Ganguly 1998). Estos efectos están mediados principalmente por la unión de FGF8b a miembros de los receptores de los factores de crecimiento de fibroblastos FGFR2, FGFR3 y FGFR4 (MacArthur 1995b, Blunt 1997, Tanaka 1998). De este modo, se ha demostrado que las células que expresan uno de estos receptores y FGF8 (b) proporcionan una cascada de señalización de crecimiento autocrina que provoca la proliferación. El efecto biológico de FGF8b muy probablemente está mediado en parte por la ruta de JAK/STAT3, dado que los autores y otros han observado que la adición de FGF8b al medio de crecimiento de ciertas células promueve la fosforilación de STAT3, una característica que se sospecha que hace que las células se vuelvan resistentes a la apóptosis (Catlett-Falcone 1999).
Además de las observaciones in vitro que se mencionan anteriormente, se ha demostrado recientemente que la expresión de FGF8 (b) se regula por aumento significativamente tanto en los cánceres de próstata como de mama (Marsh 1999, Dorkin 1999). Los autores, por lo tanto, creen que una vacuna autóloga contra FGF8 (b) será un medio muy eficiente de tratar varios tumores que expresan FGF8, o quizás de aumentar su sensibilidad hacia los agentes inductores de apóptosis.
Cáncer de próstata
La agresividad biológica del cáncer de próstata es variable. En algunos pacientes, el tumor detectado permanece como tumor histológico latente y nunca se vuelve clínicamente significativo. En otros pacientes, el tumor progresa rápidamente, se metastatiza y mata al paciente en un tiempo relativamente corto (2-5 años).
Para los fines de diagnóstico y para seguir la respuesta al tratamiento del cáncer de próstata, se ha usado primordialmente la determinación de los niveles en circulación de dos proteínas: fosfatasa del ácido prostático (PAP) y antígeno específico de próstata (PSA) (Nguyen 1990, Henttu 1989). Debido a la alteración de la arquitectura normal de la glándula prostática como respuesta al desarrollo del cáncer, estas proteínas solubles se liberan a la circulación donde pueden detectarse como marcadores, por ejemplo de la extensión metastática.
El tratamiento primario actual del cáncer de próstata es la prostatectomía. Sin embargo, debido a la extensa propagación de las células de cáncer de próstata la mayoría de los pacientes de cáncer de próstata no se curan mediante cirugía local. Los pacientes con enfermedad no confinada en algún momento reciben tratamiento de ablación sistémica de andrógenos, pero la tasa de muerte anual de cáncer de próstata no ha disminuido en absoluto durante los 50 años desde que la ablación de andrógenos se convirtió en tratamiento estándar para la enfermedad metastática.
El análisis por RT-PCR ha demostrado que el ARNm de FGF8 es producido por las líneas de células tumorales humanas de epitelio prostático LNCaP, PC-3, ALVA-31 y DU145 respectivamente, siendo FGF8b la isoforma más prominente (Tanaka 1995, Ghosh 1996). El crecimiento de las células LNCaP que responden a andrógenos es estimulado por la adición de FGF8b recombinante (Tanaka 1995), mientras que podría inhibirse el crecimiento de las células DU145 mediante transfección con virus que expresen FGF8b antisentido (Rudra-Ganguly 1998). Esto, junto con los indicios de estudios de desarrollo que se describen más adelante, indica un papel de FGF8b en el mantenimiento del estado canceroso de estas líneas celulares.
Usando el ADNc de FGF8a para los experimentos de hibridación in situ, Leung y colaboradores han demostrado que una proporción elevada (80% (n = 106) y 71% (n = 31) de los cánceres de próstata producen ARNm de FGF8 y que la cantidad de ARNm de FGF8 se correlaciona con la gravedad de los tumores (P< 0,0016 y P<0,05, respectivamente) (Leung 1996, Dorkin 1999). Usando un anticuerpo monoclonal contra FGF8b, se demostró que esta isoforma era responsable de la hiperexpresión de FGF8b (Dorkin 1999). De forma adicional, los hombres con tumores que expresaban niveles elevados de FGF8 mostraban una supervivencia peor (P = 0,034) y esa expresión de FGF8 persistía en los cánceres de próstata independientes de andrógenos (Dorkin 1999). De acuerdo con los datos que presentan Dorkin y colaboradores, la expresión de FGF8b en el cáncer de próstata podría predecir la supervivencia del paciente.
El análisis inmunohistoquímico usando un anticuerpo monoclonal contra FGF8 ha detectado la proteína en el 93% (n = 43) de los cánceres de próstata humanos (Tanaka 1998). El tejido prostático normal o la hiperplasia prostática benigna producen niveles reducidos de ARNm de FGF8 y no contienen cantidades detectables de proteína FGF8 (Leung 1996, Yoshimura 1996, Ghosh 1996, Tanaka 1998, Dorkin 1999).
Estos resultados indican que una vacuna autóloga contra FGF8(b) sería reactiva contra el tejido tumoral prostático y por lo tanto, sería extremadamente valiosa en el tratamiento del cáncer de próstata.
Cáncer de mama
El tratamiento actual del cáncer de mama es la cirugía. Sin embargo, debido a la extensa propagación de las células de cáncer de mama, la mayoría de los pacientes de cáncer de mama no se curan mediante cirugía local. Los pacientes con enfermedad no confinada en algún momento reciben tratamiento de ablación de andrógenos, quimioterapia y/o radioterapia. Sin embargo, la tasa de muerte anual por cáncer de mama es todavía relativamente elevada.
FGF8 se aisló originariamente de una línea celular de carcinoma de mama de ratón (SC-3), de la que pudo inducirse la expresión añadiendo andrógeno al medio (Nonomura 1990). Se sabe también que la proteína induce la proliferación de estas así como de otras células de mamífero. Recientemente se ha demostrado que el ARNm de FGF8b está presente en ocho (n = 8) líneas celulares de cáncer de mama humano (MDA-MB-231, MDA-MB-415, ZR 75-1, T-47-D, SK-BR-III, PMC-42, HBL-100 y MCF-7) (Tanaka 1995, Payson 1996, Wu 1997, Marsh 1998).
Los ratones transgénicos Wnt-1 infectados con virus de tumor de mama de ratón (MMTV) desarrollan tumores de mama. La trascripción de FGF8 es activada en el 50% de estos tumores (MacArthur 1995c, Kapoun 1997).
Se ha demostrado que los ratones transgénicos que portan el ADNc de FGF8b controlado por el promotor muy específico del virus de tumor de mama de ratón (MMTV) desarrollan espontáneamente tumores de mama que expresan FGF8b (Coombes, comunicación personal).
Datos muy recientes demuestran que la expresión de FGF8(b) está regulada por aumento en el cáncer de mama (Tanaka 1998, Marsh 1999). Tanaka y colaboradores usaron un anticuerpo monoclonal nuevo contra FGF8 en estudios inmunohistoquímicos. Demostraron que FGF8 estaba presente en el 67% (n = 12) de los cánceres de mama y que los receptores de andrógenos estaban presentes en el 89% de las enfermedades de mama positivas para FGF8 (hiperplasia, fibroadenoma, papiloma intraductal y cánceres) que permitirían que el bucle promotor de crecimiento autocrino estuviera implicado en la progresión de los cánceres de mama (Tanaka 1998). Usando un procedimiento de RT-PCT semicuantitativo, se demostró que se encontraron niveles elevados de ARNm de FGF8 en tejidos de mama malignos comparados con los no malignos. De forma significativa, más tejidos malignos expresaban FGF8 (p = 0,019) a niveles significativamente más elevados (p = 0,031) (68 cánceres de mama y 24 tejidos de mama no malignos) (Marsh 1999).
Todavía no se ha establecido completamente que FGF8(b) funcione como factor de crecimiento autocrino. Sin embargo, el hecho de que un gran número de tumores hiperexpresen FGF8b es un potente argumento de que una vacuna contra FGF8b sería efectiva contra un gran porcentaje de cánceres de mama y próstata. Los datos comunicados por Marsh, Dorkin y Tanaka indican que podría usarse una vacuna autóloga contra FGF8(b) para el tratamiento tanto del cáncer de mama como de próstata y los datos bastante vagos que presentan Dorkin y cols., apoyan adicionalmente la opinión de que FGF8 está implicada en la proliferación de las células de cáncer humanas.
Descripción de FGF8b
FGF8 pertenece a la familia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Estas proteínas que regulan el crecimiento son proteínas pequeñas con \sim200 residuos aminoacídicos que están todas implicadas en la inducción de la proliferación y diferenciación de una gran variedad de células. Para una reseña reciente de la implicación de los factores de crecimiento de fibroblastos en el desarrollo de los miembros de vertebrados, véase Johnson 1997. Los miembros de la familia de FGF están relacionados evolutivamente y comparten una identidad de las secuencias de aminoácidos del 20-50%.
FGF8b es una variante de procesamiento de FGF8, que originariamente se denominó factor de crecimiento inducido por andrógenos (AIGF). El AIGF se identificó al principio como una proteína secretada por una línea celular derivada de carcinoma de mama murino (SC-3) al ser estimulada con andrógeno (Nonomura 1990). El gen FGF8 murino contiene 6 exones, que potencialmente codifican ocho isoformas de FGF8 diferentes (FGF8a-h), que se diferencian únicamente en la parte del extremo N de las moléculas (Crossley 1995, MacArthur 1995b). FGF8 humana tiene la misma estructura génica que el gen murino. Sin embargo, debido a un codón de terminación en el exón 1B, la FGF8 humana puede existir posiblemente en cuatro isoformas diferentes específicamente FGF8a, FGF8b, FGF8e y FGF8f (Gemel 1996). Las estructuras génicas y las secuencias de aminoácidos de las cuatro isoformas humanas se ilustran en la figura 5.
La FGF8b madura contiene 193 residuos aminoacídicos y tiene un peso molecular calculado de 22,5 kDa. La proteína fuertemente básica contiene 21 residuos de arginina y 14 residuos de lisina que dan como resultado un punto isoeléctrico calculado de 10,84 y una carga positiva calculada de 19,8 a pH 7,0. Contiene dos residuos de cisteína y tiene dos sitios potenciales de glucosilación en N. Debido a la naturaleza de las investigaciones realizadas que implican FGF8b se conoce muy poco sobre el resto proteínico de FGF8b. Sin embargo, se ha expresado de forma heteróloga en bacterias, se ha purificado usando una marca de seis histidinas en el extremo C y se ha plegado in vitro para proporcionar un estado biológicamente activo (MacArthur 1995a, Blunt 1997).
Actividad biológica de FGF8b
Tal como se menciona anteriormente, FGF8(b) se aisló primero como un factor liberado por una línea celular de tumor de mama de ratón dependiente de andrógenos y se ha demostrado que esta proteína puede inducir la proliferación de estas células. Los cambios morfológicos imitan los que induce la testosterona, que se sabe también que induce la síntesis de ARNm de FGF8(b) (Tanaka 1992). La proliferación puede inhibirse mediante oligopéptidos antisentido de FGF8(b) (Nonomura 1990, Tanaka 1992 y Yamanishi 1994). De hecho, pudo inhibirse el crecimiento de una línea de células de cáncer de próstata DU415 mediante transfección con virus que expresaban FGF8b antisentido (Rudra-Ganguly 1998). Datos recientes demuestran que FGF8b induce la fosforilación de STAT3 - una proteína que se sospecha que está implicada en la resistencia a la apóptosis (Catlett-Falcone 199, Johnston, C.L., resultados sin publicar).
Varios autores han demostrado que FGF8b es muy eficiente en la inducción de la transformación de las células NIH3T3 o SC115 (Miyashita 1994, Kouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArthur 1995a). Al usar proteínas que se expresan de forma recombinante, se ha demostrado también que esta inducción de cambios morfológicos es mucho más eficiente con FGF8b que cuando se usa FGF8a o FGF8c (MacArthur 1995a, Ghosh 1996). De forma interesante, se demostró que la mitad del extremo N de la molécula FGF8b sola era suficiente para la transformación de las células NIH3T3, e incluso el pequeño péptido específico de FGF8b (QVTVQSSPNFT) podía permitir que las células crecieran 2-3 veces más tiempo que las normales en suero al 0,1% (Rudra-Ganguly 1998). Además, se ha reseñado que las células NIH3T3 transfectadas de forma estable con un vector de expresión que codifica FGF8b son muy tumorígenas cuando se inyectan intraocularmente en ratones atímicos (Kouhara 1994, Ghosh 1996).
In vivo, se sabe que FGF8b se expresa en ciertas etapas del desarrollo en los vertebrados. En la Tabla 1 se muestra un resumen de los papeles biológicos asignados a FGF8(b). Para reseñas de la implicación de FGF8 en el desarrollo de los vertebrados, véase Goldfarb 1999 y Johnson 1997.
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TABLA Diversos sitios/tejidos que se sabe que producen FGF8 y el/los papel(es) biológico(s) propuesto(s) 
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Se cree que FGF8(b) media su acción uniéndose a los receptores de los factores de crecimiento de fibroblastos (FGFR). Especialmente, se sabe que FGF8b tiene capacidad de activar FGFR2c, FGFR3c, FGFR4c y en algún grado también FGFR1c, pero no FGFR1b, -2b ni -3b (MacArthur 1995b, Blunt 1997). En el caso de la inducción del crecimiento ectópico de los miembros de pollos, está implicado que FGF10, FGFR2 y FGF8 interactúan y que esto podría ser suficiente para la crecimiento (Kuwana 1997, Xu 1998).
Estos resultados apoyan la hipótesis de que FGF8(b) puede actuar de forma autocrina y paracrina, provocando el crecimiento y patrón normales de diversas estructuras anatómicas durante el desarrollo de los vertebrados. De forma importante, los ratones con FGF8 "totalmente inactivado" no sobreviven muy probablemente debido a la elaborada implicación de la proteína en el desarrollo del embrión.
Homología con otras proteínas
Es de importancia significativa predecir si se podría esperar una reactividad cruzada indeseada con otras proteínas accesibles para los anticuerpos tras el tratamiento con una vacuna autóloga que induzca anticuerpos autólogos específicos contra FGF8b. Debido al elevado grado de identidad de las secuencias de FGF8b y de las otras moléculas de FGF8, es de esperar que una vacuna autóloga reaccione entrecruzadamente con estas proteínas. Sin embargo, esto será presumiblemente ventajoso, dado que no se ha reseñado que ninguna de estas proteínas se expresen en tejidos o en líneas celulares que no expresaran FGF8b anteriormente.
Los residuos aminoacídicos 55 a 175 de FGF8b demuestran un grado relativamente bajo pero significativo de identidad de las secuencias con las otras FGF. Se acepta comúnmente (y se ha comprobado varias veces) que un grado significativo de identidad de secuencias entre dos dominios de proteínas se refleja también en un grado elevado de similitud entre las estructuras terciarias. Por lo tanto, generalmente se espera que los miembros de la familia de FGF sean todos estructuralmente similares. La estructura tridimensional de FGF2 ha sido resuelta a partir de cristales además de en solución (Ago 1991, Zhang 1991, Zhu 1991, Eriksson 1993, Blazer 1996, Moy 1996). FGF2 se compone de longitud completamente de una estructura de lámina beta, que comprende una repetición de tres veces de un meandro beta antiparalelo cuadracaternario. Esta estructura de barril beta está totalmente conservada en interleuquina 1, FGF2 (o FGF básica) y FGF1 (o FGF ácida). El análisis de resonancia magnética nuclear de FGF2 en solución ha demostrado que la parte del extremo N de la molécula forma una estructura relativamente flexible. La parte restante de FGF8b (residuos aminoacídicos 1-54 y 176-215) únicamente muestra un grado reducido de identidad de secuencias con las proteínas conocidas.
Basándose en los datos estructurales y de alineamiento, se asume generalmente que el núcleo estructural tridimensional de los otros factores de crecimiento de fibroblastos se asemeja mucho a los de FGF1 y FGF2. Estas consideraciones estructurales son factores importantes para el diseño de los autores de las moléculas de la vacuna autóloga de FGF8b mutante.
De forma importante, debido al grado relativamente bajo de identidad de secuencias entre FGF8 y cualquiera de los otros miembros de la familia de FGF, la superficie de FGF8 sería muy diferente de la de las otras FGF, minimizando así la reactividad cruzada de los anticuerpos generados por la vacuna autóloga contra FGF8b con otros miembros de la familia de FGF. Debido al grado muy reducido de homología con otras proteínas distintas de los factores de crecimiento de los fibroblastos, los autores no esperan que una vacuna autóloga contra FGF8b reaccione entrecruzadamente con ninguna otra proteína.
Debería recalcarse, sin embargo, que una vacuna contra FGF8b probablemente reaccionaría entrecruzadamente con todas las isoformas de FGF8. Esto, sin embargo, presumiblemente no será un problema dado que no se espera que ninguna de las isoformas de FGF8 se exprese a niveles significativos en el adulto. Es incluso posible que esta reacción entrecruzada sea beneficiosa en el tratamiento del cáncer, dado que se ha demostrado que al menos algunas líneas de células cancerosas expresan otras isoformas además de FGF8b.
Distribución en los tejidos de FGF8b
De forma ideal, los anticuerpos autólogos inducidos y los mecanismos efectores subsiguientes así como la respuesta de los CTL esperada inducidos por la vacunación autóloga deberían dirigirse únicamente a los tejidos que deben eliminarse en el paciente. Por lo tanto, la distribución en los tejidos del antígeno, que es rastreado por una vacuna autóloga, es un tema de importancia capital en lo que se refiere a la seguridad de la vacuna.
TABLA Expresión de FGF8b en diversos tejidos y células
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La tabla anterior muestra una amplia selección de datos de distribución tisular y de líneas celulares de la expresión de FGF8b. Tal como se observa a partir de la tabla, la mayoría de los datos que se refieren a la distribución tisular se generan usando el procedimiento de RT-PCT sensible. Esto es debido a que el análisis por transferencia Northern no detecta nada de ARNm de FGF8b en ningún tejido normal excepto en el riñón fetal. A partir de estos datos escasos, se asume de forma general que la expresión del ARNm de FGF8b en el adulto está muy limitada y, por lo tanto, una vacuna autóloga contra FGF8b presumiblemente no sería reactiva contra el tejido normal. Debido al hecho de que pequeñas cantidades de FGF8b podrían interactuar en sistemas desconocidos en el adulto, la distribución tisular de la proteína necesita análisis adicionales. En opinión de los autores, sin embargo, no hay indicaciones de que una vacuna autóloga contra FGF8b pudiera resultar en efectos graves no deseados en los pacientes.
Efectos de anticuerpos contra FGF8b
Hasta la fecha, no se han publicado tentativas de tratamiento del cáncer de próstata usando anticuerpos monoclonales. Sin embargo, se están llevando a cabo ensayos clínicos con anticuerpos monoclonales en estudios de tratamiento del cáncer de mama.
Los anticuerpos contra FGF8b probablemente bloquearán la interacción entre FGF8b y sus receptores, lo que inhibirá el fruncimiento de la membrana y la proliferación celular, muy probablemente disminuyendo la motilidad e invasividad de las células cancerosas.
Por lo tanto, la invención se refiere también a realizaciones de los procedimientos que se describen en la presente memoria, en los que el epítopo de los linfocitos T exógenos se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos de FGF8b que se define por la SEC ID Nº: 6 1-54 y/o 178-215 y/o 55-58 y/o 63-68 y/o 72-76 y/o 85-91 y/o 95-102 y/o 106-111 y/o 115-120 y/o 128-134 y/o 138-144 y/o 149-154 y/o 158-162 y/o 173-177. Debería resaltarse que se prefiere especialmente no introducir variaciones o modificaciones en las posiciones 26-45 ni en el extremo C que se inicia en los aminoácido 186-215, dado que estos tramos muestran la menor homología con una proteína descubierta recientemente, FGF-18, que parece que se expresa en una variedad de tejidos no tumorales.
En consecuencia, la invención se refiere también a un análogo de FGF8b humana/murina que es inmunógeno en los seres humanos, comprendiendo dicho análogo una parte sustancial de todos los epítopos conocidos y previstos de CTL y linfocitos B de FGF8b e incluyendo al menos un epítopo de T_{H} exógeno tal como se describe en la presente memoria. Se prefiere que el al menos un epítopo de T_{H} exógeno esté presente por inserción en la secuencia de aminoácidos de FGF8b o por sustitución de parte de la secuencia de aminoácidos de FGF8b o como resultado de la eliminación de parte de la secuencia de aminoácidos de FGF8b. Los análogos más preferidos en esta realización son aquellos en los que se introduce el epítopo exógeno de linfocito T_{H} en una parte de la secuencia de aminoácidos de FGF8b que se define por la SEC ID Nº: 6 posiciones 1-54 y/o 178-215 y/o 55-58 y/o 63-68 y/o 72-76 y/o 85-91 y/o 95-102 y/o 106-111 y/o 115-120 y/o 128-134 y/o 138-144 y/o 149-154 y/o 158-162 y/o 173-177.
Mucinas
La invención se refiere también a procedimientos de la invención que emplean versiones específicamente modificadas de las mucinas humanas, especialmente cualquiera de MUC-1 a MUC-4, preferiblemente MUC-1. Los análogos comprenden la siguiente estructura
TR(-S-P-S-(TR)_{m})_{n}
donde TR es una repetición en tándem que se deriva de la mucina natural, P es un epítopo exógeno de T_{H} tal como se describe en la presente memoria, S es un péptido espaciador inerte que tiene de 0 a 15 residuos aminoacídicos, preferiblemente entre 0 y 10 residuos aminoacídicos y n es un número de longitud completa de 1 a 30 y m es un número de longitud completa de 1 a 10, preferiblemente de 3 a 5.
Cuando se produce un análogo de mucina de ese tipo por ejemplo en una línea celular humana o por purificación de un tejido, el resultado directo normalmente no tendrá un patrón de glucosilación tal como se desea, es decir, un patrón de glucosilación aberrante parecido al de una mucina derivada de un tumor. Sin embargo, es posible producir el análogo de forma recombinante por ejemplo en E. coli o por medios sintéticos y subsiguientemente glucosilar el producto enzimáticamente de forma que se consiga un patrón de glucosilación en Tn o S-Tn específico de la MUC-1 que se expresa en los tumores. De forma alternativa, el polipéptido podría prepararse en una línea celular de mamífero o en una línea celular de insecto, por ejemplo células de Drosophila, que carezca de la enzima relevante o por expresión de la proteína intracelularmente (omitiendo un péptido de señal de secreción) cuando no se produce la glucosilación.
Fragmentos de ácidos nucleicos y vectores de la invención
Se apreciará a partir de la descripción anterior que los análogos pueden prepararse mediante ingeniería genética pero también por síntesis o semisíntesis química; las dos últimas opciones son especialmente relevantes cuando la modificación consiste en el acoplamiento a transportadores proteínicos (tales como KLH, toxoide de difteria, toxoide del tétanos y BSA) y moléculas no proteináceas tales como polímeros carbohidratados y por supuesto también cuando la modificación comprende la adición de cadenas laterales o grupos laterales a una cadena peptídica derivada de polipéptidos.
Para los fines de la ingeniería genética, y por supuesto también para los fines de la inmunización con ácidos nucleicos, los fragmentos de ácidos nucleicos que codifican las regiones epitópicas y análogos necesarios son productos químicos importantes. Por lo tanto, una parte importante de la invención se refiere a un fragmento de ácido nucleico que codifica un análogo descrito anteriormente de cualquiera de los polipéptidos específicos de tumores relevantes, preferiblemente un polipéptido en el que se ha introducido un epítopo exógeno de linfocito T_{H} mediante inserción y/o adición, preferiblemente mediante sustitución y/o eliminación. Los fragmentos de ácidos nucleicos de la invención son fragmentos de ADN o ARN.
Los fragmentos de ácidos nucleicos de la invención normalmente se insertarán en vectores adecuados para formar vectores de clonación o expresión que portan los fragmentos de ácidos nucleicos de la invención; los vectores novedosos de ese tipo son también parte de la invención. Los detalles que se refieren a la construcción de estos vectores de la invención se describirán en el contexto de las células y microorganismos transformados más adelante. Los vectores, dependiendo de los fines y tipo de aplicación, pueden estar en forma de plásmidos, macrófagos, cósmicos, minicromosomas o virus, pero también es un vector importante el ADN desnudo que se expresa sólo de forma transitoria en ciertas células. Los vectores de clonación y expresión preferidos de la invención son capaces de replicarse de forma autónoma, permitiendo así unos números elevados de copias con el fin de obtener una expresión de nivel elevado o una replicación de nivel elevado para la clonación subsiguiente.
El esquema general de un vector de la invención comprende las siguientes características en la dirección 5'-3' y en enlace operable: un promotor para dirigir la expresión del fragmento de ácido nucleico de la invención, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido director que permite la secreción o la integración en la membrana del fragmento de polipéptido, el fragmento de ácido nucleico de la invención y una secuencia de ácido nucleico que codifica un terminador. Cuando se opera con vectores de expresión en cepas o líneas celulares productoras se prefiere, con el fin de una estabilidad genética de la célula transformada, que el vector, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integre en el genoma de la célula hospedadora. Por el contrario, cuando se trabaja con vectores a usar para efectuar una expresión in vivo en un animal (es decir, cuando se usa el vector en la vacunación con ADN) se prefiere, por razones de seguridad, que el vector no sea capaz de integrarse en el genoma de la célula hospedadora; típicamente se usa ADN desnudo o vectores víricos que no se integran, cuyas elecciones son notorias para el experto en la técnica.
Los vectores de la invención se usan para transformar células hospedadoras para producir el análogo de la invención. Las células transformadas de ese tipo, que son también parte de la invención, pueden ser células o líneas celulares cultivadas que se usan para la propagación de los fragmentos de ácido nucleico y de los vectores de la invención, o se usan para la producción recombinante de los análogos de la invención. De forma alternativa, las células transformadas pueden ser cepas de vacuna vivas adecuadas en las que se ha insertado el fragmento de ácido nucleico (una única copia o copias múltiples) de forma que se efectúe la secreción o la integración en la membrana bacteriana o pared celular del análogo.
Las células transformadas preferidas de la invención son microorganismos tales como bacterias (tales como la especie Escherichia [por ejemplo E. coli], Bacillus [por ejemplo Bacillus subtilis], Salmonella o Mycobacterium [preferiblemente no patógenos, por ejemplo M. bovis BCG]), levaduras (tales como Saccharomyces cerevisiae) y protozoos. De forma alternativa, las células transformadas se derivan de un organismo multicelular tal como un hongo, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula de mamífero. Las más preferidas son las células que se derivan de un ser humano, véase la descripción de líneas celulares y vectores más adelante.
Para los fines de clonación y/o expresión optimizadas, se prefiere que la célula transformada sea capaz de replicar el fragmento de ácido nucleico de la invención. Las células que expresan el fragmento nucleico son realizaciones útiles preferidas de la invención; pueden usarse para la preparación a pequeña escala o a gran escala del análogo o, en el caso de bacterias no patógenas, como constituyentes de vacunas en una vacuna viva.
Cuando se produce el análogo de la invención mediante células transformadas, es conveniente, aunque ni mucho menos esencial, que el producto de expresión se exporte al medio de cultivo o se transporte a la superficie de la célula transformada.
Cuando se ha identificada una célula productora efectiva, se prefiere, basándose en ella, establecer una línea celular estable que porte el vector de la invención y que exprese el fragmento de ácido nucleico que codifica el análogo. Preferiblemente, esta línea celular estable segrega o transporta el análogo de la invención, facilitando así su
purificación.
En general, los vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicación y de control que se derivan de especies compatibles con la célula hospedadora se usan en relación con los hospedadores. El vector ordinariamente porta un sitio de replicación, así como secuencias testigo que son capaces de proporcionar una selección por razón de fenotipo a las células transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma típicamente usando pBR322, un plásmido que se deriva de una especie de E. coli (véase, por ejemplo Bolivar y cols., 1977). El plásmido pBR322 contiene genes de resistencia a ampicilina y a tetraciclina y de ese modo proporciona un medio fácil de identificar las células transformadas. El plásmido pBR, u otro plásmido microbiano o macrófago deben contener también, o modificarse para que contengan, promotores que pueden ser usados por el microorganismo procariota para su expresión.
Los promotores que se usan más comúnmente en la construcción de ADN recombinante incluyen los sistemas de promotores de la \beta-lactamasa (penicilinasa) y de la lactosa (Chang y cols., 1978; Itakura y cols., 1977; Goeddel y cols., 1979) y un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y cols., 1979; documento EP-A-0 036 776). Aunque estos son los que se usan más comúnmente, se han descubierto y utilizado otros promotores microbianos y se han publicado los detalles que se refieren a sus secuencias de nucleótidos que permiten a un investigador experto ligarlos funcionalmente con vectores plasmídicos (Siebwenlist y cols., 1980). Ciertos genes de los procariotas pueden expresarse de forma eficiente en E. coli a partir de sus propias secuencias de promotores, obviando la necesidad de añadir otro promotor por medios artificiales.
Además de los procariotas, también pueden usarse microbios eucariotas, tales como cultivos de levaduras y en este caso el promotor debería ser capaz de inducir la expresión. Saccharomyces cerevisiase, o la levadura de repostería común es la que se usa más comúnmente entre los microorganismos eucariotas, aunque comúnmente hay disponibles varias otras cepas tales como Pichia pastoris. Para la expresión en Saccharomyces, se usa comúnmente el plásmido YRp7, por ejemplo (Stinchcomb y cols., 1979; Kingsman y cols., 1979; Tschemper y cols., 1980). Este plásmido ya contiene el gen trpl que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano por ejemplo ATCC nº 44076 o PEP4-1 (Jones, 1977). La presencia de la lesión de trpl como característica del genoma de la célula de levadura hospedadora proporciona después un entorno efectivo para detectar la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano.
Las secuencias promotoras adecuadas en los vectores de las levaduras incluyen los promotores de 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzman y cols., 1980) u otras enzimas glicolíticas (Hess y cols., 1968; Holland y cols., 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3- fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. En la construcción de plásmidos de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas a estos genes están también ligadas en el vector de expresión en posición 3' de la secuencia que se desea expresar para proporcionar la poliadenilación del ARNm y terminación.
Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada mediante condiciones de crecimiento son la región del promotor de la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas de degradación asociadas al metabolismo del nitrógeno y la anteriormente mencionada gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Es adecuado cualquier vector plasmídico que contiene secuencias de un promotor compatible con levaduras, un origen de replicación y una terminación.
Además de los microorganismos, pueden usarse como hospedadores cultivos de células que se derivan de organismos multicelulares. En principio, cualquier cultivo celular de ese tipo puede ser operable, ya sea de un cultivo de vertebrado o de invertebrado. Sin embargo, ha sido mayor el interés en las células de vertebrados y la propagación de células vertebradas en cultivo (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento rutinario en los últimos años (Tissue Culture, 1973). Ejemplos de líneas celulares hospedadoras son las células VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) y las líneas celulares W138, BHK, COS-7 293 y MDCK.
Los vectores de expresión para las células de ese tipo ordinariamente incluyen (cuando es necesario) un origen de replicación, un promotor localizado delante del gen a expresar, junto con cualesquiera sitios necesarios de unión de ribosomas, sitos de procesamiento de ARN, sitio de poliadenilación y secuencias de terminación de la transcripción.
Para su uso en las células de mamífero, las funciones de control de los vectores de expresión son proporcionadas a menudo por material vírico. Por ejemplo, los promotores que se usan comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2 y lo más frecuentemente del virus de simio 40 (SV40). Los promotores temprano y tardío del virus SV40 son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente a partir del virus en forma de fragmento que también contiene el origen de replicación vírico de SV40 (Fiers y cols., 1978). También pueden usarse fragmentos de SV40 menores o mayores, con la condición de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio HindIII hacia el sitio Bg1I que se localiza en el origen de replicación vírico. Además, es también posible y a menudo deseable, utilizar secuencias de promotor o de control que normalmente se asocian a la secuencia génica que se desea, con la condición de que las secuencias de control de ese tipo sean compatibles con los sistemas de células hospedadoras.
Puede proporcionarse un origen de replicación ya sea construyendo el vector para incluir un origen exógeno, tal como el que puede derivarse de SV40 u de otros virus (por ejemplo, Polyoma, Adeno, VSV, BPV) o pueden ser proporcionados por el mecanismo de replicación cromosómico de la célula hospedadora. Si el vector se integra en el cromosoma de la célula hospedadora, a menudo este último es suficiente.
Composición de la invención
La invención se refiere también a una composición inmunógena que comprende, como agente inmunógeno efectivo al menos uno de los análogos que se describen en la presente memoria mezclado con un transportador, vehículo, diluyente o excipiente farmacéutica e inmunológicamente aceptable y opcionalmente un adyuvante, véase también la descripción de estas entidades en la descripción de la invención anterior.
Además, la invención se refiere también a una composición para inducir la producción de anticuerpos contra cualquiera de los antígenos tumorales que se describen anteriormente, comprendiendo la composición
- un fragmento de ácido nucleico o un vector de la invención y
- un diluyente y/o vehículo y/o transportador y/o excipiente y/o adyuvante farmacéutica e inmunológicamente aceptables.
La formulación y otros detalles que se refieren a composiciones de ese tipo se describen en la sección relevante que se refiere a la inmunización con ácidos nucleicos más arriba.
Ejemplo 1 Vacunación contra PSM
A continuación se describirá como puede desarrollarse una vacuna autóloga humana contra PSM mediante modificación de la molécula por inserción de uno o más epítopos exógenos promiscuos de linfocitos T para revelar un grupo de moléculas de PSM inmunogenizadas.
Las construcciones se analizarán para determinar su capacidad de inducir respuestas de CTL específicas contra las células tumorales que portan PSM. Además, las construcciones se analizarán para determinar su capacidad de inducir anticuerpos que muestran reactividad cruzada con las partes nativas de la molécula de PSM. Subsiguientemente, en diversos ensayos in vitro y modelos animales in vivo se evaluará la eficacia de las diferentes construcciones. Los anticuerpos inducidos se analizarán para determinar su capacidad de activar el complemento mediante la ruta clásica e iniciar la ADCC mediante los receptores Fc. Finalmente, se analizarán las diferentes moléculas en modelos animales de cáncer de próstata humano.
Estrategia para diseñar una vacuna autóloga contra PSM
De forma breve, el plan de vacunación de PSM conlleva las siguientes tareas experimentales.
Diseño y producción de un grupo de mutantes de PSM humana
- Clonación de las secuencias de PSM de ser humano y de rata/ratón.
- Operaciones de mutación para generar moléculas de hPSM inmunogenizadas.
- Expresión de moléculas de hPSM naturales e inmunogenizadas en E. coli y/o Pichia pastoris y/o células de mamífero y/o células de insecto (tales como la línea de células S_{2}).
- Purificación, plegamiento y caracterización de las moléculas de hPSM inmunogenizadas.
Vacunación con ADN contra PSM
- Generación de vectores de vacunación con ADN de hPSM que codifican moléculas de hPSM inmunogenizadas.
- Análisis de los vectores de vacunación de hPSM en experimentos in vitro e in vivo.
Selección de candidatos de hPSM
- Inmunización de ratones/conejos.
- ELISA
- Análisis por FACS.
- En caso de respuesta de anticuerpos: ensayo proliferativo de células tumorales.
- Ensayos de linfocitos T.
Análisis de los mutantes de hPSM in vivo
- Modelo de tumor sólido/metástasis in ratones.
Estudio conceptual: inducción de CTL mediante la vacunación autóloga
- Construcción de PSM de ratón/rata inmunogenizadas que corresponden a los candidatos de hPSM seleccionados (por ejemplo en forma de vacunas de ADN).
- Análisis de la respuesta inmunitaria inducida por los mutantes de PSM de ratón/rata en ensayos in vitro: ensayos inmunoquímicos, ELISA, análisis por FACS, ensayos celulares, lisis de células que portan PSM mediante complemento, ensayo de ADCC, ensayo de actividad de CTL, ensayo proliferativo de células tumorales, ensayos de presentación a linfocitos T.
- Análisis de los mutantes de mPSM in vivo en un modelo de tumor sólido/metástasis en ratones.
Nomenclatura de las construcciones de hPSM
PSM es una proteína de membrana de tipo II de 750 aminoácidos, véase la SEC ID Nº: 2 que presenta la secuencia natural con la excepción de que Gly sustituye a Trp en la posición 2 debido a la introducción de un sitio NcoI y una secuencia Kozad en la SEC ID Nº: 1; donde ggt sustituye a tgg en las posiciones 4-6. Sin embargo, también se ha usado la PSM nativa (es decir, PSM que tiene Trp en la posición 2) para algunas construcciones para vacunas autólogas basadas en PSM humana.
En PSM, la parte extracelular constituye los 707 aminoácidos del extremo C, mientras que se prevé que el dominio citoplasmático tiene 19 aminoácidos y la parte transmembrana de la proteína consiste en 24 aminoácidos (aa 20-43).
Como punto inicial para las construcciones, también se ha usado la variante de procesamiento PSM'. La versión de los autores de esta variante de procesamiento tiene la secuencia de aminoácidos que corresponde a los residuos 58-750 en la SEC ID Nº: 2. Para facilitar la nomenclatura, las regiones en PSM' se numeran de acuerdo con la numeración de PSM (lo que quiere decir que por ejemplo, la región 2 consiste en los aminoácidos 87-108 de PSM y los aminoácidos 30-51 de PSM'), véase también la descripción de las regiones más adelante.
Todas las construcciones genéticas de PSM humana se denominan hPSM_\cdot_ (o hPSM'_\cdot_ si se usa PSM' como punto de partida), donde el primer _ es la región de inserción que se usa para la inserción de P2 y la segunda _ es la región de inserción que se usa para P30. Si no están presentes P2 o P30 en la proteína, se asigna el número 0 (cero). La hPSM natural de longitud completa se denomina hPSM0.0 y la hPSM natural que carece de las partes citoplasmáticas y de transmembrana se denomina hPSM\div0.0. Los genes de hPSM inmunogenizada que contienen todos un epítopo P2 y un epítopo P30 se denominarán hPSM1.1, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSM10.1, hPSM1.6, hPSM1.8, hPSM1.10, hPSM1.2, hPSM1.3, hPSM1.5, hPSM2.1, hPSM3.1, hPSM10.3, hPSM6.3, hPSM'10.3, hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM'8.3 y
hPSM5.1, véanse los detalles más adelante.
En hPSM1.1, los dos epítopos P2 y P30 están insertados en tándem en la región de inserción nº 1 (la región que atraviesa la membrana). En teoría, este mutante, hPSM1.1, puede considerarse un candidato muy atractivo para la vacuna para inducir la producción de anticuerpos, debido a que todo el dominio extracelular de esta molécula está intacto. Para la inducción de respuestas de CTL usando inmunización con ácidos nucleicos, se consideran útiles construcciones tales como hPSM10.3 y hPSM6.3.
Para facilitar los procedimientos de clonación y mutagénesis, gran parte del trabajo de construcción molecular se realiza usando la parte del extremo N (aminoácido 1-436) o la parte del extremo C (aminoácidos 437-750) del gen hPSM como material inicial. Estas dos partes del gen hPSM se denominan hPSMI _\cdot_ y hPSMII _\cdot_ respectivamente, donde el primer _ es la región de inserción que se usa para la inserción de P2 y la segunda _ es la región de inserción que se usa para P30. De nuevo, si no están presentes P2 o P30 en la proteína, se asigna el número 0 (cero) y las naturales se denominan hPSMI0.0 y hPSMII0,0, respectivamente. Una variante especial de hPSMI0.0 sin la parte citoplasmática de hPSM se denomina hPSMI\div0.0.
Prácticamente, la mayor parte de las operaciones de mutagénesis se realizan usando hPSMI0.0 y hPSMII0.0 como material inicial.
Las proteínas mutantes de hPSM expresadas se denominarán PROS _\cdot_, donde el primer _ es la región de inserción que se usa para la inserción de P2 y la segunda _ es la región de inserción que se usa para P30. Si no están presentes P2 o P30 en la proteína, se asigna el número 0 (cero). La hPSM natural se designa PROS0.0. PROSII0.0 es el producto proteínico de los aminoácidos 437-750 de hPSM. Las proteínas marcadas con HIS se denominan HIS-PROS_\cdot_. La SEC ID Nº: 21 se ha usado para la expresión en levaduras y bacterias, mientras que la SEC ID Nº: 23 se ha usado para la expresión en células de mamíferos.
Clonación de la secuencia de PSM humana
La línea celular LNCaP que se origina a partir de una lesión metastática del adenocarcinoma prostático se compró de American Type Culture Collection (ATCC). El ARNm se aisló de esta línea celular y se transcribió inversamente usando un kit estándar para obtener ADNc que codifica la secuencia de PSM humana. Usando conjuntos diferentes de cebadores específicos de hPSM, se obtuvieron productos de PCR que codificaban PSM (437-750) y se clonaron adicionalmente en pUc19 (número de plásmido pMR300) y se verificó mediante secuenciación del ADN. Esta parte del extremo C de PSM natural se denomina parte II de hPSM (hPSMII0.0).
De forma similar, la parte I de hPSM natural (hPSMI0.0) se clonó en pUc19 usando cebadores para amplificar la parte I con (hPSMI0.0) y sin (hPSMI\div0.0) los dominios citoplásmicos transmembrana. Los clones se secuenciaron con un control y hPSMI0.0 y hPSMII0.0 se fusionaron usando el ligado en el sitio EcoRI. Los clones resultantes de hPSM0.0 (SEC ID Nº: 2) y hPSM\div0.0 se han subclonado en varios vectores de expresión procariotas y eucariotas y de nuevo se verificó su secuencia. También se ha construido la forma que se expresa intracelularmente de PSM humana (que se denomina hPSM' - aminoácidos 58-750 de la SEC ID Nº: 2) usando el ADNc como material inicial. Esta secuencia se subclonó también en vectores de expresión de mamífero y se usó como material inicial para algunas de las construcciones de vacuna autóloga de hPSM, por ejemplo hPSM'10.3 y hPSM'6.3.
Clonación de secuencias de PSM de rata y ratón
Se compraron dos secuencias de ADNc de PSM murina (de riñón murino fetal y macrófagos murinos, respectivamente) que contenían dos clones EST (marca de secuencia expresada) de American Type Culture Collection (ATCC). Juntas, estas EST comprendían la secuencia de ADNc de PSM de ratón y así se subclonaron tanto PSM de ratón de longitud completa (SEC ID Nº: 7 y 8) así como PSM' murina (SEC ID Nº: 9 y 10) en vectores bacterianos y vectores de expresión de mamíferos. También se han preparado construcciones de AutoVac de PSM murinas mediante inserción de P30 en el ADNc de PSM de ratón.
Expresión de hPSM natural en E. coli
La parte del extremo C (aminoácidos 437-750) de hPSM, hPSMII0.0, se ha clonado en el vector de expresión bacteriano pET28b para obtener un producto con una cola de poli-histidina (HIS) en el extremo N que facilita la purificación e identificación con anticuerpos contra poli-HIS a gran escala de forma fácil. El producto proteínico de hPSMII0.0 marcado con poli-HIS (producto proteínico denominado HIS-PROSII0.0) se expresó en E. coli.
El ADN que codificaba la PSM humana natural truncada hPSM\divcyt0.0 se expresó también a partir de pET28b en la cepa de E. coli BL21 (DE3) donde el producto de expresión está localizado en los corpúsculos de inclusión. El análisis por SDS-PAGE del lisado bacteriano mostró un producto con la migración esperada y la transferencia Western con anticuerpos de conejo contra HIS-PROSII0.0 también dio la banda esperada. Además, la secuenciación del extremo N de cinco aminoácidos de este producto eluido de un gel de SDS-PAGE dio la secuencia de aminoácidos que se esperaba.
Las construcciones de hPSM naturales hPSM0.0, hPSM\div0.0 (así como dos mutantes de hPSM, hPSM1.1 y hPSM6.1, véase más adelante) han sido clonadas en diferentes vectores de expresión en E. coli para permitir una expresión más eficiente y algún grado de plegamiento de las proteínas recombinantes en E. coli. Los sistemas de expresión elegidos son:
pMCT6 que genera versiones marcadas con His en el extremo N de las proteínas recombinantes expresadas,
pGH433 que expresa las proteínas recombinantes junto con una secuencia directora pe1B de 22 aminoácidos que debería dirigir la proteína al espacio periplasmático de la bacteria E. coli y
pMa1-p2 en la que las proteínas recombinantes se expresan en forma de fusiones en el extremo C a la proteína de unión a maltosa (MBP) que contiene la secuencia directora periplasmática MBP natural. Pueden usarse anticuerpos contra MBP para la detección de las proteínas de fusión y puede usarse una columna de acoplamiento a carbohidratos para la purificación del producto por afinidad.
Sin embargo, los experimentos de expresión en E. coli de las proteínas de hPSM naturales de estos vectores únicamente demostraron un nivel de expresión aceptable a partir con pMCT6. Los problemas de la obtención periplasmática de las proteínas hPSM naturales no se han resuelto hasta la fecha.
Expresión de hPSM natural en Pichia pastoris
Debido al peso molecular relativamente elevado de la proteína de PSM y su grado relativamente alto de glucosilación (aproximadamente 16% del peso molecular) y para facilitar la purificación eliminando la etapa de plegamiento, se ha decidido implementar una tecnología alternativa para la expresión en eucariotas de las proteínas recombinantes. Se evaluaron varios sistemas de expresión en eucariotas bien caracterizados y para la detección inicial de mutantes de hPSM, se eligió la levadura Pichia pastoris como alternativa a la expresión de E. coli.
Se ha aplicado un sistema de expresión basado en la levadura Pichia pastoris a las construcciones de PSM. El patrón de glucosilación de las proteínas recombinantes que se expresan en este organismo se espera que se parezca a los patrones de glucosilación de mamíferos más que por ejemplo a las de Saccharomyces cerevisiae debido a una manosilación ramificada menor de la proteína recombinante. Se ha demostrado que la captación por los dendrocitos de antígenos mediada por receptores de manosa da como resultado una presentación aproximadamente 100 veces más eficiente a los linfocitos T comparada con la captación por endocitosis en fase fluida. Por lo tanto, la manosilación podría desempeñar un papel para la capacidad como antígeno (y especialmente la capacidad de inducir respuestas de CTL) de los mutantes de hPSM y otros antígenos contra los que se desea una respuesta de CTL.
Una cepa de Pichia pastoris así como dos vectores de expresión diferentes se han comprado de Invitrogen. El vector pPICZ\alphaA porta un promotor inducible por metanol aguas arriba del sitio de policlonación, mientras que el vector pGAPZ\alphaA expresa las proteínas de forma constitutiva. Ambos receptores codifican la señal de secreción del factor \alpha para exportar las proteínas recombinantes al medio. El sistema de selección de estos vectores es la resistencia a la zeocina. Las secuencias que codifican hPSM0.0 y hPSM\div0.0 (así como un mutante de hPSM, hPSM1.1, véase más adelante) se subclonaron en estos vectores (en marco con un epítopo de identificación c-myc en el extremo C, SEC ID Nº: 27).
Se transformaron cuatro cepas Pichia pastoris (X-33, SMD1168, GS115 y KM71) que se diferenciaban, por ejemplo, en sus requisitos de crecimiento con cada uno de estos plásmidos (linearizados) usando electroporación. El procedimiento de transformación se repitió varias veces con cambios menores para obtener un gran número de clones resistentes a zeocina. La expresión de hPSM\div0.0 natural (así como hPSM1.1, véase más adelante) se obtuvo en el sistema de Pichia pastoris. Los productos expresados podían detectarse mediante transferencia Western de lisados de transformantes de Pichia pastoris usando tanto un anticuerpo monoclonal contra hPSM como un anticuerpo monoclonal contra c-myc como primario. Sin embargo, los productos recombinantes se detectaron intracelularmente.
Expresión de hPSM natural en células de mamíferos
También se implementará un sistema de expresión usando células de CHO (ovario de hámster chino) para el análisis y la producción finales de las moléculas seleccionadas.
Hasta la fecha, las células de CHO han sido transfectadas con hPSM natural y hPSM1.1 con/sin secuencias directoras en marco en el vector de expresión en mamíferos pcDNA3.1. Se obtuvieron células resistentes a la geneticina. En las células COS transfectadas de forma transitoria con las mismas construcciones, se detectó tanto hPSM0.0 como hPSM1.1 mediante transferencia Western de sedimentos celulares usando un anticuerpo monoclonal contra hPSM.
Distribución tisular de hPSM
Se compró un kit comercial para determinar si la expresión de hPSM podía detectarse en diversos tejidos humanos que incluyen próstata, sangre y cerebro. El procedimiento se basa en una detección por transferencia de siembras de ARNm que contenía poliA extraído de 50 tejidos humanos diferentes. Los resultados preliminares no indican una hiperexpresión de hPSM en tejidos tales como la sangre o el cerebro. Sin embargo, después de la fecha de prioridad de la presente solicitud de patente, otros han demostrado la presencia de PSM en otros tejidos, véase más arriba.
Diseño de los mutantes de hPSM
Cuando se diseñan las operaciones de mutación de PSM, es muy importante que se conserven algunas regiones de la proteína en las construcciones modificadas, por ejemplo los epítopos de los linfocitos T potenciales e identificados, los epítopos de los linfocitos B y los residuos de cisteína con puentes disulfuro. Por lo tanto, se han identificado las regiones "prohibidas" de ese tipo en la secuencia de PSM dejando un número limitado de regiones "abiertas" de 20 aminoácidos o más disponibles para intercambiar con los epítopos de los linfocitos T cooperadores P2 y/o P30. Por definición, la región transmembrana se considera también una región "abierta" dado que los anticuerpos autólogos que se dirigen contra esta región son irrelevantes y se cree que la eliminación de esta secuencia potencia la solubilidad de las proteínas PSM mutadas pero no puede excluirse que esta región contenga epítopos de CTL importantes, de ahí la conservación de la región transmembrana por ejemplo en hPSM10.3.
De acuerdo con las expectativas de los autores de que la vacuna autóloga inducirá una respuesta de CTL, debería ser importante identificar y conservar epítopos de CTL potencialmente subdominantes en las construcciones. En la bibliografía ya se conocen dos epítopos de ese tipo: 1) el péptido que comprende los aminoácidos de PSM 4-12 (LLHETDSAV) puede presentarse en la molécula de MHC de clase I HLA-A2.1 (Tjoa 1996) y 2) la PSM (711-719) (ALFDIESKV) también se une a HLA-A2.1 (ref 25). Los autores han buscado también la secuencia de aminoácidos de PSM para identificar los residuos de anclaje primario de HLA de clase I tal como describen Rammensee y cols. (Rammensee, 1995) para los tipos de HLA de clase I más abundantes (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A23, HLA-A24 y HLA-A28), que juntos constituyen el 80% de los tipos de HLA-A de la población humana. Del mismo modo se han identificado epítopos potenciales de HLA-B y HLA-C potenciales y se han designado como áreas "prohibidas".
Debido a que la intención inicial era usar ratones híbridos F1 C57/negro x SJL en el caso de que se decidiera usar ratones transgénicos para analizar las construcciones de vacuna autóloga, se han identificado ciertos epítopos potenciales de linfocitos T colaboradores H-2^{b} y H-2^{s} de ratón y se han considerado regiones "prohibidas" (Rammensee 1995).
Es también importante conservar regiones de unión a anticuerpos conocidas en la molécula de PSM, debido a que podrían ser importantes en la inducción de anticuerpos autólogos específicos contra PSM. Hasta la fecha se han descrito cinco regiones de ese tipo: PSM(63-68), PSM(132-137), PSM(482-487) (documento WO 94/09820); PSM(716-723) y PSM(1-7) (Murphy, 1996). Usando el procedimiento informatizado de Hopp y Woods para la predicción de los determinantes antígenos, se predicen cinco regiones: PSM(63-69), PSM(183-191), PSM(404-414), PSM(479-486) y PSM(716-723) (Hoop 1983), algunas de estas coinciden con los epítopos de los linfocitos B que se han encontrado experimentalmente. Estas regiones se conservarán también en las moléculas candidatas a vacunas contra PSM.
La proteína de PSM contiene 4 residuos de cisteína (posiciones de aminoácidos 22, 196, 466 y 597) que se conservarán en las construcciones inmunogenizadas debido a su potencial importancia en la formación de puentes disulfuro.
Basándose en las regiones "prohibidas" y "abiertas" mencionadas anteriormente de la proteína hPSM, se identificaron 10 regiones adecuadas para la inserción de epítopos exógenos de linfocitos T:
Regiones de inserción en hPSMI (desde el sitio de iniciación al sitio EcoRI, aa 1-437):
Región 1: aa 16-52 de PSM (4 aa antes de TM, TM (24 aa) y 9 aa después de TM = 37 aa)
Región 2: aa 87-108 de PSM, aa 30-51 de PSM' (22 aa)
Región 3: aa 210-230 de PSM, aa 153-173 de PSM' (21 aa)
Región 4: aa 269-289 de PSM, aa 212-232 de PSM' (21 aa)
Región 5: aa 298-324 de PSM, aa 241-267 de PSM' (27 aa)
Regiones de inserción en hPSMII (desde el sitio EcoRI hasta el sitio de terminación, aa 437-750):
Región 6: aa 442-465 de PSM, aa 385-408 de PSM' (24 aa)
Región 7: aa 488-514 de PSM, aa 431-457 de PSM' (27 aa)
Región 8: aa 598-630 de PSM, aa 541-573 de PSM' (33 aa)
Región 9: aa 643-662 de PSM, aa 586-605 de PSM' (20 aa)
Región 10: aa 672-699 de PSM, aa 615-642 de PSM' (28 aa)
Las regiones de inserción así como las regiones "prohibidas" se representan gráficamente en la figura 4.
Se prepararán varias construcciones de PSM inmunogenizadas diferentes mediante sustitución de un segmento de los aminoácidos de dos de las regiones de inserción que se listan anteriormente por P2 o P30. Cada proteína mutante contendrá así tanto P2 como P30, aunque las construcciones de ese tipo son únicamente ejemplares - los mutantes de una única posición están también incluidos en el alcance de la presente invención. De forma experimental, las mutaciones se prepararán en clones de ADNc de hPSMI y hPSMII respectivamente y las dos partes mutadas se combinarán subsiguientemente mediante ligado (en el sitio EcoRI). Los epítopos P2 y P30 se han insertado inicialmente en las regiones de inserción 1, 2, 3, 5, 6, 8 y 10 para crear los mutantes.
Las secuencias de P2 y P30 son:
P2: QYIKANSKFIGITEL (SEC ID Nº: 12, 15 aa), en este caso codificada por la secuencia de nucleótidos cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg (SEC ID Nº: 11, 45 nucleótidos), donde la secuencia en negrita es un sitio SacI. Pueden elegirse otros codones, dependiendo de la elección del sistema de vector de clonación y del sistema de expresión.
P30: FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEC ID Nº: 14, 21 aa), en este caso codificada por la secuencia de nucleótidos ttc aac aac ttc acc gta agc ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt agc g CT AGC ca c ctg g aa (SEC ID Nº: 13, 63 nucleótidos), donde la secuencia en negrita indica un sitio hindIII, el subrayado simple indica un sitio Eco47III, las letras mayúsculas indican un sitio BstNI y el subrayado doble indica un sitio NheI.
La siguiente tabla resume las construcciones de PSM humana que se usan en la presente memoria:
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Construcciones moleculares de los mutantes de hPSM
Se han realizado mutaciones para insertar las secuencias que codifican p2 y P30 usando hPSMI0.0 y hPSMII0.0 como material inicial.
Para generar una mayoría de los mutantes de hPSM, se insertaron inicialmente P2 y P30 en hPSMI0.0 en la posición de inserción 1. El material resultante (hPSMI1.0 y hPSMI0.1, respectivamente) se usó subsiguientemente como material inicial para la mutagénesis para insertar P2 y P30 en las posiciones 2, 3 y 5 para ligar con hPSMII con epítopos mutados. Se construyó hPSMI1.0 usando PCR por SOE (extensión de superposición única) y subsiguientemente se verificó la secuencia. Se construyó hPSMI0.1 usando la técnica de "Cambio Rápido" y subsiguientemente se verificó la secuencia.
El epítopo P2 se insertó en las posiciones 2, 3 y 5 de hPSMI1.0 usando PCR por SOE para crear hPSMI1.2, hPSMI1.3 y hPSMI1.5. Estas construcciones se combinaron con hPSMII0.0 para crear hPSM1.2, hPSM1.3 y hPSM1.5.
hPSMI2.1, hPSMI3.1 y hPSMI5.1 se construyeron mediante PCR por SOE usando hPSMI0.1 como material inicial. Este material se ha ensamblado con hPSMII0.0 mediante ligado en el sitio EcoRI para crear los mutantes de longitud completa hPSM2.1, hPSM3.1 y hPSM5.1.
El epítopo P2 se insertó en tres posiciones diferentes de hPSMII0.0 para crear hPSMII6.0, hPSMII8.0 y hPSMII10.0 usando la técnica de "Cambio Rápido" y subsiguientemente se verificó la secuencia de estos clones.
Subsiguientemente, se ligó hPSMI0.1 con hPSMII6.0, hPSMII 8.0 y hPSMII10.0 para obtener hPSM6.1, hPSM8.1 y hPSM10.1 y se verificó la secuencia de los clones.
Actualmente se está realizando la inserción del epítopo P30 en hPSMII para generar hPSMII0.6, hPSMII0.8 y hPSMII0.10 usando PCR por SOE.
hPSM1.1 se construyó usando dos mutaciones por PCR en dos etapas seguido de ligado en un sitio HindIII en la secuencia de epítopos. Se verifica la secuencia de la construcción de longitud completa.
hPSM10.3, hPSM'10.3 y hPSM6.3 se han construido usando PCR por SOE. Actualmente se están construyendo diversas variantes más de hPSM tanto con P2 como con P30 insertados en la parte extracelular de hPSM (hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM'8,3).
Además de los mutantes que se contemplan originariamente, que cada uno contiene P2 y P30, se han construido cuatro mutantes que únicamente contienen un epítopo exógeno único y se ha verificado su secuencia: hPSM1.0, hPSM8.0, hPSM10.0 y hPSM0.1.
Expresión de mutantes de hPSM en E. coli
En los experimentos a pequeña escala, se expresaron siete mutantes de hPSM, hPSM1.1, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSM10.1, hPSM2.1, hPSM3,1 y hPSM5.1 se expresaron a partir de pET28b en la cepa de E. coli BL21 (DE3) y se identificaron productos inducibles por IPTG del tamaño esperado en geles de SDS- PAGE teñidos con azul de Coomasie. Sin embargo, no pudo detectarse un producto de hPSM1.1. Los niveles de expresión de estos mutantes de hPSM eran muy bajos comparados con el producto de la construcción natural hPSM\div0.0. En este punto, parece imposible conseguir un nivel de expresión aceptable de los mutantes de hPSM usando el sistema de pET en E. coli y, por lo tanto es necesario el uso de otros sistemas de expresión en E. coli y/o otros organismos hospedadores.
Tal como se menciona anteriormente, se han subclonado hPSM6.1 y hPSM1.1 en diferentes vectores de expresión en E. coli para generar
- versiones marcadas con His en el extremo N de las proteínas recombinantes expresadas usando el vector pMCT6,
- versiones de las proteínas expresadas con la secuencia directora de pe1B que dirige la proteína al espacio periplásmico de la bacteria E. coli usando el vector pGH433 y
- versiones de las proteínas recombinantes expresadas en forma de proteína de fusión en el extremo C a la proteína de unión a maltosa (MBP) usando el vector pMa1-p2.
Hasta la fecha, no se ha obtenido un nivel de expresión suficiente de ninguna de estas construcciones.
Dado que hPSM0.0 se expresa adecuadamente en E. coli aunque no se ha obtenido un nivel de expresión similar de hPSM0.0 de longitud completa ni de los mutantes de hPSM, es posible que la presencia de la parte citoplásmica de la molécula de hPSM pueda, de algún modo, "inhibir" la expresión de las construcciones de hPSM de longitud completa en E. coli. Para analizar esta hipótesis, los autores inicialmente prepararon dos construcciones genéticas de hPSM1.1 y hPSM6.1 sin dominios citoplasmáticos. Sin embargo, en los experimentos de expresión en E. coli únicamente se obtuvo una expresión débil de estos productos génicos \divcit.
Expresión de mutantes de hPSM en Pichia pastoris
Para expresar la proteína mutante de hPSM1.1 en la levadura Pichia pastoris, se ha subclonado la secuencia de hPSM1.1 (en marco con un epítopo de identificación de c-myc en el extremo C, SEC ID Nº: 27) en dos diferentes vectores de expresión diferentes pPICZ\alphaA y pGAPZ\alphaA y se han verificado las secuencias. Se detectó la expresión intracelular de hPSM1.1 (así como hPSM\div0.0, véase más arriba) en los transformantes de Pichia pastoris.
Expresión de mutantes de hPSM en células de mamífero
Tal como se menciona anteriormente, se ha subclonado hPSM1.1 en los vectores de expresión de mamíferos pcDNA3.1(+) y pZeoSV2 y estas construcciones (y otras) podrían usarse para la expresión por ejemplo en células CHO. La expresión transitoria de hPSM1.1 así como hPSM0.0 se ha obtenido en células COS tal como se verifica mediante transferencia Western.
Vacunación con ADN
La vacunación con ADN, si es efectiva, sería muy adecuada para la vacuna autóloga con PSM - especialmente porque se ha demostrado que esta forma de administración promueve tanto reacciones inmunitarias mediadas por CTL como la producción de anticuerpos. Por lo tanto, la intención era realizar un estudio paralelo con el objetivo de investigar el efecto de la vacunación con ADN de ratones con vectores apropiados que codifican ubiquitina de ratón y/o TNF\alpha de ratón inmunogenizadas. Se realizará también la vacunación con ADN desnudo que codifica hPSM (y/o mutantes).
Estudio de viabilidad usando ubiquitina inmunogenizada para la vacunación con ADN
Se realizó un estudio de viabilidad que demostraba el efecto de la vacunación con ADN con una proteína autóloga inmunogenizada usando ubiquitina con un epítopo de linfocito T cooperador de ovoalbúmina (UbiOVA) insertado como proteína modelo. La secuencias que codifican UbiOVA así como ubiquitina natural se subclonaron en el vector de expresión en mamíferos pcDNA3.1 (-).
Se inmunizaron grupos de 5 ratones BALB/c con 40 \mug de una construcción de pcDNA-UbiOVA o pcDNA-ubiquitina por vía intramuscular en el cuadriceps o por vía intradérmica. Un grupo de control recibió proteína UbiOVA en adyuvante completo de Freund. Tres y seis semanas después, se repitieron las inmunizaciones con la única diferencia de que la proteína UbiOVA se emulsionó en adyuvante incompleto de Freund.
Se extrajo sangre de los ratones de forma regular y se determinaron las valoraciones de anticuerpos contra ubiquitina. En los grupos vacunados con ADN de UbiOVA, únicamente se obtuvieron valoraciones de anticuerpos contra ubiquitina muy débiles. Subsiguientemente, se administró un recuerdo con proteína UbiOVA en adyuvante incompleto de Freund a todos los grupos y se extrajo sangre para determinar si la vacunación con ADN de UbiOVA (y no de ubiquitina) podría potenciar la respuesta de anticuerpos hacia la proteína UbiOVA. Los resultados de este experimento demostraron que no había diferencias significativas entre los grupos con UbiOVA y los grupos de control, todos los ratones desarrollaron anticuerpos contra ubiquitina potentes con este único recuerdo de UbiOVA/FIA.
Vacunación con ADN usando construcciones de hPSM
Actualmente, se están llevando a cabo varios experimentos de vacunación con ADN usando construcciones de hPSM. Se han subclonado varias construcciones de PSM natural y AutoVac (tales como por ejemplo hPSM0.0, hPSM\div0.0, hPSM'0.0, hPSM1.1, hPSM10.3) en vectores de vacunación con ADN (tales como pcDNA3.1(+),
pcDNA3.1(-), pVAX y ZeoSV2). En algunas de las construcciones, se han incluido diferentes secuencias directoras (tales como las secuencias directoras de CD11A, tPA e IL-5; SEC ID Nº: 29, 25 y 31 respectivamente) directamente en el extremo N y en marco para permitir la secreción de las proteínas de hPSM expresadas in vivo. Todas las construcciones de los vectores de vacunación con ADN han sido verificadas mediante secuenciación de ADN y traducción in vivo.
Se han inyectado ratones de diferentes cepas (tales como Balb/cA, Balb/cJ, DBA/2 y A/J) con las vacunas de ADN de hPSM descritas anteriormente bien por vía intradérmica o por vía intramuscular y se administraron recuerdos varias veces usando las mismas construcciones.
Se han obtenido muestras de suero durante el periodo de inmunización y se almacenaron a -20ºC. Estas muestras se analizarán para determinar la presencia de anticuerpos reactivos contra hPSM natural.
También se están estableciendo los ensayos para controlar las respuestas de proliferación de CTL y linfocitos T cooperadores en estos ratones.
Los resultados preliminares sugieren que puede lograrse la inducción de respuestas de CTL así como de anticuerpos contra PSM.
Purificación/caracterización de hPSM marcada con HIS (437-750) (HIS-PROSII0.0)
Se expresó hPSMII natural marcada con HIS (HIS-PROSII0.0) a partir de pET28b y se aplicaron corpúsculos de inclusión solubilizados a una columna de FPLC de filtración en gel y se eluyeron en un tampón que contenía urea 8 M. Las fracciones que contenían hPSMII de forma predominante se sometieron a diversas condiciones de plegamiento para optimizar el procedimiento. Usando un SDS-PAGE teñido con plata se estimó que el producto solubilizado dializado con un tampón de Tris era puro en más del 90%. Los conejos se inmunizaron con el HIS-PROSII0.0 purificado para usar el antisuero resultante para la posterior detección y posible purificación por afinidad de los mutantes de hPSM.
Purificación/caracterización de hPSM soluble (PROS\div0.0)
La hPSM natural que carecía de las partes citoplásmica y de transmembrana, PROS\div0.0, se ha expresado en la cepa de E. coli BL21(DE3) al ser inducida con IPTG y podría detectarse en los corpúsculos de inclusión. La SDS-PAGE de este lisado bacteriano seguida de transferencia Western con anticuerpos de conejo contra HIS-PROSII0.0 mostró un producto con la migración esperada. La secuenciación desde el extremo N de los primeros cinco aminoácidos de este producto eluido de un gel de SDS-PAGE demostró la secuencia esperada que correspondía a PSM humana. El producto se sometió a una gran serie de experimentos de solubilización y plegamiento. Puede obtenerse un producto que permanecerá en solución que en un tampón de Tris sin desnaturalizante ni reductor, pero el análisis por SDS-PAGE revela que el material probablemente forma agregados grandes. Ratones y conejos han sido inmunizados con este material para obtener anticuerpos contra hPSM por ejemplo para fines analíticos - el antisuero no reaccionó con hPSM de LNCap.
Se ha preparado un lote de corpúsculos de inclusión de PROS\div0.0 de E. coli lavados para la inmunización de conejos para generar un antisuero policlonal contra PSM. Aproximadamente el 50% del contenido en proteína del material sedimentado en húmedo era PROS\div0.0. El antisuero no reaccionó con hPSM de LNCaP en una transferencia Western.
Preparación de péptidos hPSM conjugados con KLH para inmunización
Se sintetizaron péptidos 15-meros para preparar un conjugado inmunógeno de epítopos de linfocitos B de hPSM conocidos con una molécula transportadora inmunológica para obtener un antisuero policlonal que puede reconocer hPSM. Estos péptidos contienen el epítopo del linfocito B de PSM más 5-6 aminoácidos de PSM flanqueando cada extremo.
Los péptidos se prepararon mediante síntesis automática, se purificaron por HPLC y se secuenciaron con control usando degradación de Edman.
Se preparó un conjugado ligado químicamente mediante reacción entrecruzada del epítopo de linfocito B que contenía péptidos de hPSM y KLH usando un procedimiento de 1 etapa estándar con glutaraldehído como agente de entrecruzamiento.
Síntesis de péptidos P2 y P30 con secuencias de hPSM en ambos lados
Se han diseñado seis péptidos que corresponden a los epítopos P2 y P30 con 5 aminoácidos de hPSM flanqueando en cada extremo. Los aminoácidos de los extremos corresponden a los sitios de inserción de epítopos 6, 8 y 10. Los péptidos se usarán por ejemplo en ensayos de proliferación de linfocitos T, pero también para otros fines tales como ensayos ELISA u otros ensayos in vitro. Las secuencias de péptidos son:
PSMpep007 P2 insertado en hPSM en la posición de inserción 6
QERGVQYIKANSKFIGITELRVDCT (SEC ID Nº: 15)
PSMpep008 P2 insertado en hPSM en la posición de inserción 8
AVVLRQYIKANSKFIGITELEMKTY (SEC ID Nº: 16)
PSMpep009 P2 insertado en hPSM en la posición de inserción 10
MFLERQYIKANSKFIGITELHVIYA (SEC ID Nº: 17)
PSMpep0010 P30 insertado en hPSM en la posición de inserción 6
NSRLLFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEVDCTP (SEC ID Nº: 18)
PSMpep0011 P30 insertado en hPSM en la posición de inserción 8
VVLRKFNNFTVSFWLRVPKVSASHLESFDSL (SEC ID Nº: 19)
PSMpep0012 P30 insertado en hPSM en la posición de inserción 10
LMFLEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEPSSHN (SEC ID Nº: 20)
Los epítopos P2 y P30 están subrayados. Los péptidos se prepararon mediante síntesis automática y se sometieron al proceso de purificación por HPLC seguido de secuenciación con control usando degradación de Edman.
Ensayos de inmunogenidad
Se han iniciado planteamientos experimentales diferentes para producir materiales y establecer ensayos de capacidad inmunógena para el futuro análisis y selección entre las construcciones de PSM mutada.
Generación de antisueros policlonales de conejo contra conjugados peptídicos de HIS-PROSII0.0 y KLH-PSM
Se inmunizó a dos conejos con HIS-PROSII0.0 purificada, la parte del extremo C de la proteína hPSM (aminoácidos 437-750) marcada con HIS se emulsionó 1:1 con adyuvante completo de Freund y se administraron recuerdos dos veces (los días 28 y 55) con el mismo antígeno emulsionado en adyuvante incompleto de Freund.
Se inmunizó a dos conejos con un cóctel que consistía en el conjugado peptídico KLH-PSM más cada uno de los tres péptidos libres. Estos tres péptidos contenían cada uno un epítopo de linfocito B de hPSM definido previamente. El cóctel se emulsionó 1:1 con adyuvante completo de Freund. Se administraron recuerdos dos veces (los días 28 y 55) a los conejos con el mismo antígeno emulsionado en adyuvante incompleto de Freund.
Se demostró reactividad cruzada entre los anticuerpos contra HIS-PROSII0.0 y PSMpep005 y reactividad cruzada entre los anticuerpos contra conjugado peptídico KLH-PSM más péptidos y HIS-PROSII0.0 en ensayos de ELISA.
El anticuerpo contra HIS-PROSII0.0 tiene la capacidad de reconocer hPSM nativa en los lisados de células LNCaP en transferencia Western.
Inmunización de ratones con hPSM0.0 expresado retroviralmente
En esta etapa del proyecto de PSM, un obstáculo grave es todavía la carencia de anticuerpos que sean capaces de reconocer hPSM nativa plegada correctamente. Por lo tanto, se realizó un experimento de inmunización usando hPSM0.0 expresado por medio de retrovirus.
Se inmunizaron seis grupos de ratones Balb/c con: 1) células de fibrosarcoma de BALB/c tratadas con mitomicina C (79.24.H8) transducidas con ADNc de hPSM0.0 (CMV-Koz-hPSM), 2) células de fibrosarcoma de BALB/c tratadas con mitomicina C (79.24.H8) transducidas con un vector vacío (CMVBipep), 3) células de concentración (BOSC) transfectadas con ADNc de hPSM0.0 (CMV-Koz-hPSM), 4) células de concentración (BOSC) transfectadas con vector vacío (CMVBipep), 5) solución madre de retrovirus que expresa ADNc de hPSM0.0 (CMV-Koz-hPSM) o 6) solución madre de retrovirus con vector vacío (CMVBipep).
En varios tiempos, se extrajo sangre de los ratones y se analizaron los sueros obtenidos en ELISA para determinar la reactividad contra HIS-PROS0.0. Desafortunadamente, ninguno de los ratones desarrolló anticuerpos capaces de reconocer específicamente la preparación de HIS-PROSII0.0.
Establecimiento de un ELISA contra hPSM
Se usó HIS-PROSII0.0 purificada para recubrir placas de microtitulación de poliestireno (Maxisorp) con el fin de establecer un ensayo ELISA para analizar, por ejemplo sobrenadantes de hibridomas o antisueros de ratón y conejo. Los sueros de ratones BALB/c inmunizados con la misma preparación de HIS-PROSII0.0 eran reactivos con la HIS-PROSII0.0 inmovilizada a 0,5 \mug por pocillo usando Ig de conejo contra ratón marcada con peroxidasa de rábano como anticuerpo secundario.
Tal como se menciona anteriormente, se demostró la capacidad de un antisuero desarrollado en conejos contra el conjugado de KLH-PSMpep004- PSMpep005-PSMpep0006 mezclado con los péptidos libres para reaccionar con HIS-PROSII0.0 inmovilizado usando este ensayo ELISA.
Usando placas de microtitulación AquaBind® (véase la descripción en el documento WO 94/03530 que describe superficies de microtitulación recubiertas con dextrano activado con tresilo que ahora se comercializan con el nombre comercial registrado de AquaBind), se estableció un ELISA usando péptidos de PSM inmovilizados (PSMpep004, PSMpep005 y PSMpep006). Las placas de AquaBind® recubiertas con estos péptidos podrían detectar un antisuero de conejo inducido contra la misma preparación de antígenos. Tal como se menciona anteriormente, podría detectarse el antisuero de conejo contra HIS-PROSII0.0 en placas AquaBind® recubiertas con PSMpep005.
Establecimiento de una transferencia Western contra hPSM usando células LNCaP y anticuerpo monoclonal 7E11C5
Se compraron de ATCC hibridomas de linfocitos B 7E11C5 que segregan anticuerpo monoclonal IgG2a de ratón contra un epítopo intracelular de PSM humana. Se recolectó el sobrenadante del cultivo de aproximadamente 90% de células muertas y se usó en una transferencia Western para detectar PSM humana en preparaciones enriquecidas de membrana de células LNCaP así como de lisados de células LNCaP. Este anticuerpo se purificó usando columnas de proteína G y se verificó su reactividad con LNCaP en una transferencia Western.
Establecimiento de procedimiento de FACS para detectar hPSM en células LNCaP
Los autores han establecido dos procedimientos de FACS mutuamente independientes para detectar hPSM en células LNCaP. Se están intentando resolver varios problemas: Las células LNCaP crecen muy despacio y en conglomerados irregulares y por lo tanto debería optimizarse el procedimiento para preparar suspensiones monocelular. Segundo, el epítopo que reconoce el mAb 7E11C5 se define en la bibliografía como que está en el dominio citoplásmico de hPSM. Por lo tanto, se ha desarrollado el procedimiento para fijar y permeabilizar las células. Con este fin, se han conjugado mediante FITC el anticuerpo 7E11C5 purificado y proteína G y por lo tanto pueden usarse sin anticuerpo secundario en un análisis por FACS.
También se ha establecido un procedimiento de FACS usando el anticuerpo monoclonal contra hPSM J591 que reconoce un epítopo en la parte extracelular de hPSM. El anticuerpo se obtuvo de BZL Biologicals y se conjugó mediante FITC y subsiguientemente se usó para análisis por FACS y para la separación por ejemplo de células LNCaP y de células transfectadas con hPSM (véase más adelante).
Establecimiento de un ensayo de citotoxicidad
Se ha implementado un procedimiento para purificar dendrocitos a partir de médula ósea de ratón. Usando proteínas modelo, se ha optimizado la inmunización de ratones con dendrocitos pulsados con a péptidos de clase I y proteínas modelo. También se han inmunizado ratones con una proteína modelo (\beta-galactosidasa) formulada en forma de ISCOMS. Se han reestimulado in vitro linfocitos T purificados de ratones inmunizados con formas diferentes de los antígenos correspondientes. Subsiguientemente se midió la capacidad de estos CTL reestimulados de lisar clases diferentes de células diana (incluyendo dendrocitos pulsados así como células transfectadas que expresan el péptido de clase I citosólico expresado de forma retroviral). Se han establecido dos ensayos in vitro diferentes que miden la actividad de CTL, usando la liberación de cromo o/y la fragmentación de ADN (procedimiento JAM) como medidas de toxicidad. Se obtuvieron resultados muy alentadores con la proteína modelo \beta-galactosidasa y con varias combinaciones de péptidos modelo de unión a MHC de clase I y clase II.
Establecimiento de herramientas para estudiar la anulación de la tolerancia autóloga hacia PSM de ratón en ratones
La intención es estudiar si puede anularse la tolerancia autóloga a PSM de ratón en ratones mediante inmunización y/o vacunación con ADN contra PSM murino usando moléculas de AutoVac de PSM.
Tal como se menciona anteriormente, se ha obtenido ADNc que codifica PSM murino (mPSM) y se secuenció el ADN. Se están generando cuatro moléculas de variantes de mPSM mediante inserción de P30 en sitios bien definidos en mPSM o mPSM' de longitud completa. Las construcciones son las siguientes:
18
Inicialmente, la mPSM natural y las moléculas análogas se subclonan en vectores de vacunación de ADN y se usaron para la vacunación con ADN de ratones.
La intención es analizar las respuestas inmunitarias tales como las respuestas de CTL y la eliminación de tumores en los ratones. Para ello, se transfectarán líneas de células tumorales murinas con PSM murina natural (fusionada en marco con una marca de identificación, por ejemplo el epítopo c-myc, SEC ID Nº: 27, para la detección).
Modelos tumorales con PSM in vivo Ensayos de proliferación de linfocitos T de ratón con P2 y P30
Se ha realizado una serie de experimentos de proliferación de linfocitos T para establecer la capacidad inmunógena de los linfocitos T de los péptidos P2 y P30 en varias cepas de ratón (BALB/Ca (H-2^{d}), C3H/Hen (H-2^{k}), DBA/1 (H-2^{q}) y C57BL/G (H-2^{b})). Es notorio que estos epítopos son promiscuos en los seres humanos, pero la promiscuidad de los linfocitos T debía confirmarse también en los ratones usando un diseño experimental de MyE. De este modo se demostró que P30 es inmunógeno para los linfocitos T en las cepas BALB/cA y C57BL/6 mientras que no se demostró que ni P2 ni P30 fueran inmunógenas para los linfocitos T en la cepa C3H/Hen. En DBA/1, fue posible desarrollar linfocitos T contra P2.
Generación de células tumorales de ratón que expresan hPSM
También se está estableciendo un conjunto de células tumorales que expresan hPSM para usar un modelo de tumor específico de hPSM en ratones así como para el uso en ensayos de proliferación de células tumorales.
Una estrategia es generar estas líneas celulares transduciendo las líneas de células tumorales murinas con vectores retrovirales que codifican el ADNc de hPSM0.0 natural de longitud completa.
Se construyeron tres construcciones diferentes que incluían ADNc natural de longitud completa que codificaba PSM humana insertada en el sitio de policlonación del vector retroviral CMVBipep, dos de ellas contenían una secuencia Kozak corta aguas arriba del codón de inicio.
Estas construcciones se transdujeron en tres líneas de células tumorales de ratón diferentes: P815 (mastocitoma, H-2^{d}), B16-F10 (melanoma, H-2^{b}) y 79.24.H8 (fibrosarcoma, H-2^{d}) usando la línea de células de concentración BOSC. Se han obtenido clones resistentes a geneticina para los tres tipos de células y se verificó en un análisis por PCR en una plantilla de ADN genómico que las construcciones retrovirales se integraban en las células hospedadoras. Todavía no ha sido posible detectar un producto génico expresado de PSM en transferencia Western o análisis por FACS usando el anticuerpo monoclonal 7E11C5.
Mediante transfección se han establecido dos líneas de células tumorales de ratón estables que albergan PSM humana natural unida a la membrana. Esto se realizó usando ADNc de hPASM0.0 subclonado en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.1(\div)controlado por el promotor del CMV y que contenía una secuencia Kozak aguas arriba del codón de inicio.
El plásmido resultante se transfectó en dos líneas de células tumorales de ratón: 79.24.H8 (fibrosarcoma, derivada de Balb/c) y Sa1N (fibrosarcoma, derivada de A/J). Se obtuvieron cultivos resistentes a geneticina y se sometieron a transferencia Western y análisis por FACS usando los anticuerpos monoclonales J591 y 7E11C5 contra hPSM. Usando el anticuerpo J591, las células se separaron mediante FACS en varios ciclos hasta que se obtuvo una población que daba positivo para hPSM. La expresión de hPSM se verificó otra vez mediante tinción intracelular FACS usando el anticuerpo 7E11C5. También se comprobó mediante análisis por FACS que los niveles de expresión de MHC de clase I estaban al mismo nivel que los niveles de las líneas celulares parentales.
Se clonaron cultivos de líneas celulares 79.24.H8 y Sa1N que expresaban hPSM mediante dilución limitante. Se obtuvieron varios clones y se analizaron mediante FACS para determinar los diferentes niveles de expresión de hPSM usando el anticuerpo monoclonal contra hPSM J591.
Las células 79.24.H8 que expresaban hPSM se transfectaron con el gen que codificaba B7.1 para usar por ejemplo en ensayos in vitro para controlar las respuestas de CTL específicas de hPSM y/o la liberación de interferón-\gamma. Las células se separaron por FACS una vez usando un antisuero contra B7.1.
Establecimiento de un modelo tumoral específico de hPSM en ratones
Se ha decidido establecer al menos dos modelos de tumores in vivo en ratones inmunocompetentes para determinar el efecto antitumoral de anticuerpos inducidos en ratones contra las moléculas de hPSM inmunogenizadas. Esperanzadoramente, esto se realizará inyectando líneas de células tumorales de ratón singénicas modificadas para expresar hPSM natural en la membrana superficial. En este modelo se usarán las células que forman tumores sólidos y/o las células que pueden implantarse en ratones singénicos sin ser rechazadas debido a la presencia de la molécula de hPSM exógena. Se usará la capacidad de las vacunas contra hPSM de eliminar las células tumorales de ese tipo para seleccionar los candidatos a vacuna contra hPSM.
Para evaluar el crecimiento de las células Sa1N transfectadas con la PSM humana de longitud completa, se inyectaron por vía subcutánea dosis diferentes (2 x 10^{6} y 5 x 10^{6}) de las células Sa1N transfectadas con hPSM (S-PSM, separadas 5 veces) en el flanco derecho inferior de grupos de ratones A/J. sin embargo, no se establecieron tumores sólidos. Subsiguientemente, se inyectaron por vía subcutánea tres clones de células S-PSM con diferentes niveles de expresión de hPSM a 3 grupos de ratones A/J con una dosis de 10^{7} células/ratón. Los tamaños de los tumores establecidos se midieron con un calibre que medía dos diámetros diferentes que se multiplicaron para dar el tamaño del tumor en mm^{2}. Estos valores se compararon para los tres grupos. En 3-6 días, todos los ratones desarrollaron una estructura tipo tumor sólido que desapareció otra vez para el día 15. Esto probablemente se deba a la presencia de PSM humana en las superficies de las células tumorales, aunque todavía no se ha verificado. Las células Sa1N transfectadas únicamente con el vector pcDNA3.1 continuaron creciendo en forma de tumores sólidos en los ratones.
Se observó una situación similar en ratones a los que se inyectaron 10^{6}, 5 x 10^{6} o 10^{7} células 79.24.H8 transfectadas con hPSM y separadas varias veces con el criterio de expresión de hPSM. Estas células (que se denominan 79-PSM) tampoco se establecieron en forma de tumores ni en los ratones Balb/c ni en DBA/2. Sin embargo, cuando se inyectó un clon de 79.24.H8 transfectadas con hPSM, 79-PSM.3, en ratones Balb/c o DBA/2, los ratones desarrollaron estructuras tipo tumor sólido que desaparecieron de nuevo para el día 10-20. Las 79.24.H8 transfectadas con vectores continuaron creciendo en los ratones Balb/c.
Todavía debe evaluarse si estos "tumores" son tratables, o si puede establecerse un mejor modelo de tumor basándose en las líneas celulares S-PSM y 79-PSM y los clones descritos.
Conclusiones
En las operaciones de construcción molecular, los autores han tenido éxito en la clonación del gen de PSM humana y en la obtención del ADNc de PSM de ratón. Se han producido un conjunto de construcciones de vacuna autóloga contra hPSM inmunogenizada secuenciadas completamente. Los mutantes de hPSM así como las diferentes moléculas de hPSM naturales se han expresado en E. coli y se ha observado y verificado que el nivel de expresión en E. coli es muy bajo. Se han inducido anticuerpos policlonales contra la mitad del extremo C de hPSM en conejos. Se han realizado esfuerzos para implementar marcas de expresión diferentes (fusión de marca de His y proteína de unión a maltosa) así como de sistemas de expresión alternativos a los corpúsculos de inclusión de E. coli. Se ha detectado hPSM recombinante natural y/o de vacuna autóloga en Pichia pastoris transfectadas y en células de mamíferos. Se han planteado consideraciones útiles con respecto a la tecnología de vacunación con ADN y se ha realizado un estudio preliminar de viabilidad. Los experimentos de vacunación con ADN con moléculas de vacuna autóloga contra hPSM están en proceso y muestran resultados preliminares prometedores. Se han establecido diferentes ensayos in vitro de utilidad para el análisis y la selección entre las construcciones de PSM mutada que incluyen los ensayos inmunoquímicos y el análisis por FACS. Se han transfectado de forma estable células tumorales de ratón con hPSM natural de longitud completa y se han separado por FACS de acuerdo con la expresión en su superficie. Se han obtenido clones de estas líneas celulares. Se están evaluando modelos de tumores xenógenos in vivo en ratones usando estas células de tumor de ratón singénicas que portan hPSM. Se ha realizado un conjunto de ensayos de proliferación de linfocitos T para seleccionar las cepas de ratones para los modelos de tumores. Se están optimizando los ensayos de CTL y se han obtenido resultados convincentes con antígenos modelo usando diferentes procedimientos de inmunización y condiciones de ensayo. Además, se están estableciendo las herramientas necesarias para estudiar la anulación de la tolerancia a PSM de ratón mediante inmunización con vacunas autólogas contra PSM de ratón.
Ejemplo 2 Producción de una vacuna autóloga contra Her2
Puede desarrollarse una vacuna autóloga humana contra Her2 a través de la modificación de la molécula insertando uno o más epítopos exógenos de linfocitos T promiscuos para revelar un grupo de moléculas Her2 inmunogenizadas. Estas proteínas modificadas se analizarán para determinar su capacidad de inducir anticuerpos que presenten reactividad cruzada con las partes nativas de la molécula de Her2. Subsiguientemente, en varios ensayos in vitro y modelos animales in vivo, se evaluará la eficacia de las diferentes construcciones (según sea el caso con la vacunación con ADN) y proteínas modificadas. Se analizará la inducción de respuestas de CTL específicas contra las células tumorales que portan Her2. También se analizarán los anticuerpos inducidos para determinar su capacidad de activar complemento mediante la ruta clásica y de iniciar la ADCC mediante receptores Fc. Finalmente, se analizarán las diferentes moléculas modificadas en modelos animales de cáncer de mama humano para examinar sus efectos en el tratamiento de tumores.
Se construirán moléculas de rata y humanas inmunógenas con epítopos promiscuos de linfocitos T en posiciones diferentes en la molécula.
Durante la vacunación contra el dominio extracelular completo de Her2 hay una posibilidad de algún grado de reactividad cruzada de los anticuerpos con otros receptores de EGFr dado que algunos de estos receptores son homólogos hasta un 40-46% en los dominios extracelulares. Por lo tanto, se planea que las regiones conservadas de Her2 serían alteradas mediante la inserción de epítopos exógenos de linfocitos T al menos en algunas de las proteínas modificadas (para los detalles véase más adelante).
Las regiones de Her2 que pueden ser potencialmente epítopos de CTL o de linfocitos B que se evitan en el diseño de construcciones se observan en la figura 3. El fundamento para usar estas posiciones es el siguiente:
La secuencia de Her2 humana se puede dividir en varios dominios basándose únicamente en la estructura primaria de la proteína.
Parte extracelular (receptor)
1-173: Dominio I (dominio del extremo N del polipéptido maduro).
174-323: Dominio II (dominio rico en cisteínas, 24 residuos de cisteína).
324-483: Dominio III (dominio de unión a ligando en el receptor de EGF homólogo).
484-623: Dominio IV (dominio rico en cisteínas, 20 residuos de cisteína).
624-654: Dominio transmembrana (residuos TM de 654-675).
Parte intracelular (quinasa)
655-1010: Dominio de la tirosina quinasa (dominio del núcleo de TK en 725-992).
1011-1235: Dominio del extremo C
Se ha realizado la selección de los sitios de la secuencia de aminoácidos de HER2 a desplazar por los epítopos de linfocitos T cooperadores humanos P2 o P30 considerando los siguientes parámetros (priorizados de forma
laxa):
1. Epítopos de CTL conocidos y previstos
2. Homología con receptores relacionados (en particular EGFR)
3. Conservación de residuos de cisteína
4. Estructuras previstas de horquilla, hélice \alpha y lámina \beta
5. Sitios potenciales de glucosilación en N
6. Predicción de residuos aminoacídicos expuestos y enterrados
7. Organización de los dominios
Los epítopos de CTL parecen estar agrupados en el dominio I, en el dominio III, en el dominio TM y en dos o tres "puntos calientes" del dominio TK. De acuerdo con la invención, estos deberían conservarse en gran medida.
Las regiones con un gran grado de homología con otros receptores tienenprobabilidades de ser estructuralmente importantes para la estructura terciaria "global" de Her2 y por lo tanto para el reconocimiento por los anticuerpos, mientras que las regiones con homología reducida posiblemente pueden intercambiarse con la única consecuencia de alteraciones locales de la estructura.
Los residuos de cisteína están a menudo implicados en la formación de puentes disulfuro intramoleculares y son por lo tanto cruciales para la estructura terciaria y preferiblemente no deberían cambiarse.
Las regiones que se prevé que forman estructuras de hélice \alpha o de lámina \beta deberían preferiblemente evitarse como puntos de inserción de epítopos exógenos, dado que estas regiones son probablemente importantes para el plegamiento de la proteína.
Los sitios de glucosilación en N potenciales deberían preferiblemente conservarse también porque es deseable la manosilación de la proteína (por ejemplo mediante la expresión en levadura), véase la presencia de receptores de manosa en las APC.
Preferiblemente se deberían conservar las regiones que se prevé (debido a sus propiedades hidrófobas) que están en el interior de la molécula, ya que éstas podrían estar implicadas en el plegamiento. Por el contrario, las regiones expuestas a los disolventes podrían servir como posiciones candidato para la inserción de los epítopos modelo P2 y P30 de T_{H}.
Finalmente, también se ha considerado la organización de los dominios de la proteína debido a su relevancia para la estructura y función proteínicas.
El énfasis de la estrategia ha sido conservar la estructura de la parte extracelular de Her2 lo más posible, debido a que esta es la parte de la proteína que es relevante como diana para los anticuerpos neutralizadores. Por el contrario, la parte intracelular de Her2 nativa unida a la membrana en la superficie de las células de cáncer es inaccesible para el sistema inmunitario humoral.
Por lo tanto, únicamente la presencia de epítopos de CTL proporciona razones para incluir esta parte en una vacuna. Es por lo tanto obvio situar uno o más epítopos aquí. Si resulta que es imposible expresar la molécula de Her22 de longitud completa en E. coli o en levaduras, la parte intracelular podría truncarse después del primer "punto caliente" del epítopo de CTL (alrededor de la posición 800). Después pueden añadirse epítopos de CTL adicionales al extremo C de la molécula truncada.
La región transmembrana probablemente es una unidad de plegamiento independiente y la sustitución de ésta por epítopos de T_{H} tales como P2 o P30 probablemente no afectará a la estructura ni al plegamiento de HER2. Además, el dominio de TM puede provocar grandes problemas para la expresión en levadura y coli y, en cualquier caso, debería sustituirse. De este modo, preferiblemente debería colocarse un epítopo en este dominio en todas las construcciones (quizá dejándolo intacto en la construcción 1 ya que contiene varios epítopos de CTL y porque está implicado de algún modo en la transmisión de señales al unirse a ligandos).
El dominio extracelular se podría mantener principalmente intacto colocando P2 y P30 en los dominios intracelular y transmembrana, maximizando así el número de epítopos potenciales de linfocitos B e interfiriendo lo menos posible con la estructura. Sin embargo, el elevado grado de homología con EGFR y Her-3 y Her-4 supone un riesgo de reactividad cruzada con estos receptores que podrían ser indeseables (o no). Además, se han descrito algunos anticuerpos monoclonales que funcionan como agonistas para el receptor (quizá mediante estimulación de la heterodimerización o de la unión a ligandos) y aumentan el tamaño del tumor, in vivo. Por lo tanto, se han seleccionado posiciones del dominio extracelular que se espera que así reduzcan estos riesgos.
Esta selección ha implicado todos los parámetros mencionados anteriormente y se ha basado en dos supuestos diferentes: (i) la inserción en regiones no conservadas (con respecto a receptores relacionados) ayudará a mantener la estructura terciaria y podría reducir la activación indeseada por los anticuerpos. (ii) La inserción en las regiones bien conservadas puede alterar la estructura, pero puede al mismo tiempo reducir el riesgo de reactividad cruzada al destruir las secuencias más relacionadas. Ambos supuestos son especulaciones, pero dado que es muy difícil predecir el efecto de situar un epítopo en cualquier posición de la proteína, algunas de estas posiciones han sido incluidas en las construcciones.
Se ha especulado que podría ser ventajoso eliminar los dos dominios ricos en cisteínas completamente. Se prevé que estos formarán estructuras en horquilla expuestas a disolventes y podrían formar unidades de plegamiento independientes que tal vez estén implicadas en la dimerización (tal como indican las muchas cisteínas que podrían servir para mantener una estructura rígida necesaria para formar un dominio de dimerización). La eliminación de estas estructuras podría por lo tanto eliminar el riesgo de activación por los anticuerpos así como reducir el número de anticuerpos que reaccionarían entrecruzadamente ya que estos dominios son los mejor conservados de la parte extracelular de la proteína. Además, los dominios ricos en cisteína de ese tipo podrían ser problemáticos de producir en células de E. coli o de levaduras.
Los detalles de las construcciones son tal como sigue, usando los epítopos P2 y P30 como ejemplos no limitantes: el epítopo P2 se situará primordialmente en el dominio extracelular de Her2 combinado con la parte que sustituye el epítopo P30 o con toda la región que atraviesa la membrana. El epítopo P2 se situará en las regiones basándose en los criterios que se describen anteriormente. Las construcciones preferidas tienen las estructuras siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
19
La posición del epítopo indica las posiciones de aminoácidos primera y última del epítopo relativo al punto inicial de Her2 maduro. La longitud es la longitud en aminoácidos de la construcción completa. En todas las construcciones excepto en aquellas en las que la posición se indica mediante *, el epítopo sustituye un tramo de aminoácidos de la misma longitud que el epítopo. "*" indica que el epítopo se inserta en lugar de sustituir en Her2. Todas las construcciones que se refieren anteriormente son por lo tanto truncadas de Her2 madura, donde la parte omitida es a partir del extremo C.
La mayoría de las construcciones existen en versiones diferentes, por ejemplo en el vector pcDNA3.1+ en fusión con la secuencia peptídica de señal HER2 natural, en el vector pMT/BiP/V5-His-A en forma de fusión con el péptido director BiP para la expresión en células de Drosophila y sin secuencia directora en el vector pET28b para la expresión en las células de E. coli.
A continuación se describen los modelos que se pretenden para el uso en la detección y selección de proteínas Her2 modificadas.
1. Se investigará la inducción de anticuerpos en ratones transgénicos para Her2 de rata y en conejos contra Her2 de rata y humana, respectivamente, mediante tecnología de ELISA convencional después de al menos tres inmunizaciones. Se usarán anticuerpos disponibles en el mercado contra Her2 humana y de rata como controles positivos.
2. Estos anticuerpos de conejo se usarán para estudiar la inhibición putativa del crecimiento de células tumorales humanas y de ratón transgénico que hiperexpresan Her2 en un modelo in vitro.
3. Se investigará por procedimientos convencionales la proliferación de linfocitos T de PBL en pacientes inmunizados contra el tétanos hacia moléculas de Her2 humana seleccionada.
4. Se estudiará la capacidad de moléculas de Her2 de rata modificadas de inducir respuestas de CTL en ratones transgénicos para Her2 de rata usando tumores de estos ratones como dianas.
5. Se pretende sintetizar un grupo selecto de péptidos en la región de transmembrana de Her2 humana que comprende los epítopos P2 y P30. Estos péptidos se analizarán en la proliferación de PBL en seres humanos previamente inmunizados contra toxoide del tétanos para determinar si los epítopos P2 y P30 podrían extraerse de forma eficiente de las secuencias de Her2 y presentarse a linfocitos T.
6. Es bastante posible que se analicen las proteínas Her2 modificadas humanas seleccionadas para generar anticuerpos neutralizadores en un ratón que haya sido modificado genéticamente para expresar únicamente genes VDJ humanos. Un ratón de ese tipo está disponible de Abgenix, Fremont, CA, EE.UU. como colaboración.
Se han descrito cuatro modelos de ratón transgénico bien caracterizados para el cáncer de mama que contienen el oncogén Her2 de rata. Los tres primeros ratones transgénicos expresan el oncogén Her2 activado mientras que el cuarto modelo utiliza Her2 inactivado. Todos los modelos utilizan un promotor de MMTV para dirigir la expresión en las glándulas mamarias.
Los autores han decidido usar dos modelos de ratones transgénicos: 1) un modelo de tumor más agresivo descrito por Muller y cols usando el oncogén Her2 activado (Muller y cols., 1989) y 2) un modelo de tumor menos agresivo en el que se usa Her2 inactivado para crear tumores de mama focales con un periodo de latencia largo (Guy y cols., 1992). Ambos ratones transgénicos se compran en Jackson y/o Charles River Laboratories.
En los experimentos iniciales, se deja que estos ratones produzcan anticuerpos y respuestas de CTL mediante la inmunización y administración de recuerdos de proteínas Her2 modificadas de rata. Después se investigará la incidencia de los tumores tal como han descrito otros (Muller y cols., 1989; Guy y cols., 192; Katsumata y cols., 1995). Se medirán los niveles de anticuerpos mediante un ensayo ELISA. La actividad de los CTL se determinaría generando células diana que expresen Her2 de rata tal como se menciona anteriormente.
De forma alternativa, se puede usar el modelo de carcinoma por xenoinjerto en ratones atímicos para los experimentos de vacunación pasiva. Los ratones atímicos pueden ser transplantados con tumores humanos y podría intentarse la inhibición de tumores mediante la transferencia pasiva de suero de ratones normales o humanizados inmunizados con proteínas Her2 modificadas. Aunque esto sería útil para estudiar el papel de los anticuerpos en la supresión de tumores, en este sistema, no puede medirse directamente la actividad de los CTL.
En el segundo modelo in vivo, los tumores en ratones se generarían también transplantando líneas de células tumorales de los ratones transgénicos descritos anteriormente. Las líneas celulares que se generan en estos ratones se transferirían a una cepa de ratón relevante y se establecería la localización usando protocolos estándar.
Transferencia de células de tumores de ratón que hiperexpresan Her2 de rata: en este sistema, las células se transfectarán con genes de rata y se transferirán a ratones con MHC compatible. La inhibición del crecimiento tumoral se lograría generando respuestas contra Her2.
\newpage
En estos sistemas se usarían proteínas Her2 modificadas como vacuna en adyuvantes para generar anticuerpos y respuestas de CTL.
La vacunación con ADN se ha usado con éxito en varios sistemas para inducir una respuesta inmunitaria efectiva. Actualmente, los autores están investigando medios para la administración de ADN usando proteínas autólogas modificadas. Su intención es utilizar la estrategia de vacunación con ADN para determinar los efectos de las construcciones de Her2 modificadas sobre la inhibición de tumores en ratones transgénicos modelos del cáncer de mama. Después posiblemente pueda aplicarse una estrategia similar en seres humanos para el tratamiento de esta enfer-
medad.
Ejemplo 3 Producción de una vacuna contra FGF8b
A continuación se describirá como puede desarrollarse una vacuna autóloga humana contra FGF8b modificando la molécula mediante inserción de uno o más epítopos exógenos promiscuos de linfocitos T para obtener un grupo de moléculas "FGF8b" inmunogenizadas. Las construcciones se analizarán para determinar su capacidad de inducir anticuerpos que presentan reactividad cruzada con las partes auténticas de la molécula FGF8b. Subsiguientemente, se evaluará la eficacia de las diferentes construcciones en diversos ensayos in vitro y en modelos animales in vivo. Los anticuerpos inducidos se analizarán para determinar su capacidad de activar complemento mediante la ruta clásica y para iniciar la ADCC mediante receptores Fc. Finalmente, se analizarán las diferentes moléculas en modelos animales de cánceres de próstata y mama humanos.
Construcción de una vacuna autóloga contra FGF8b
Debido a la completa identidad entre los polipéptidos FGF8b murino y humano, todas las construcciones pueden usarse para experimentos tanto en seres humanos como en ratones.
Los epítopos P2 y P30 de los linfocitos T cooperadores del toxoide del tétanos que se usan con éxito en la vacuna contra TNF\alpha humana se insertarán en el polipéptido FGF8b. Debido al reducido tamaño de FGF8b, las construcciones se prepararán con un epítopo por molécula. También se considerarán otros epítopos promiscuos de linfocitos T cooperadores tales como el epítopo de hemaglutinina de la gripe HA(307-319) y otros epítopos de linfocitos T que se describen en la presente memoria (O'Sullivan 1991).
Se han preparado 4 construcciones de FGF8b inmunogenizadas diferentes, con los epítopos distribuidos a lo largo de la molécula. Estas cuatro construcciones se preparan basándose en alineaciones múltiples y pareadas de la familia FGF de las proteínas. Se usa una alineación en pares de FGF2 y FGF8b como base de un análisis de la estructura secundaria que se presume (es decir, una distribución en lámina beta) a lo largo de la molécula FGF8b. Los residuos conservados en FGF2 y FGF8b no se agrupan en ninguna parte de la estructura tridimensional, lo que indica que no hay regiones particulares de la molécula que no puedan ser sustituidas sin tener efectos perjudiciales sobre la capacidad de plegamiento. Los residuos aminoacídicos de FGF2 que se alinean con los residuos de cisteína de FGF8b se posicionan muy cerca los unos de los otros tridimensionalmente, lo que indica que forman un enlace disulfuro en FGF8b y que la alineación es correcta. También se consideró la flexibilidad de la parte del extremo N de FGF2.
La variante de FGF8b con el epítopo P30 en el extremo N (F30N) se diseñó basándose en alineaciones sin espacios de los residuos aminoacídicos de la proteína FGF8b y del epítopo P30 (SEC ID Nº: 14) y calificando las diferentes posiciones con respecto a las propiedades químicas de cada residuo aminoacídico. Únicamente se consideró la región del extremo N de la estructura de barril beta prevista. En el caso de F30N, hay 9 residuos similares de 21. Usando este pseudo-algoritmo, sería de esperar que las sustituciones dieran como resultado cambios estructurales globales mínimos. Las secuencias de las cuatro construcciones diferentes, así como de las representaciones tridimensionales de los aminoácidos sustituidos se muestran en la Figura 6.
La variante de FGF8b con el epítopo P2 (SEC ID Nº: 12) en el extremo C (F2C) se denominó inicialmente F30N. Sin embargo, se ha previsto un buen epítopo Kd en las posiciones 195-203. Por lo tanto, el epítopo P2 se inserta justo en el extremo C de este epítopo. De nuevo, sólo se consideró la región del extremo C de la estructura de barril beta prevista.
Las variantes internas de FGF8b (F30I y F2I) se construyeron sustituyendo las horquillas externas de la estructura de FGF2 por los epítopos P2 y P30, respectivamente, por lo que el esqueleto estructural en barril beta de la estructura de FGF presumiblemente no sufrirá cambios.
Las moléculas de FGF8b inmunogenizadas se han expresado en Escherichia coli, lo que facilita la producción a gran escala de las proteínas con costes mínimos. Aunque FGF8b contiene dos sitios de glucosilación en N potenciales (Asn31 y Asn177), se ha demostrado que FGF8b recombinante expresado en bacterias es biológicamente activo (MacArthur 1995a, Blunt 1997). Para facilitar la purificación y el plegamiento, se han producido variantes de FGF8b en una versión marcada con His, haciendo así posible el acoplamiento a una columna cargada con Ni.
La purificación de las moléculas se ha realizado utilizando la carga positiva elevada de las moléculas proteínicas de la marca His y el plegamiento se realizará usando procedimientos estándar tomando en cuenta la formación del puente disulfuro.
Las cuatro moléculas inmunogenizadas se han insertado también junto con el ADNc de FGF8b natural en los vectores de vacunación de ADN.
Detección y selección de las moléculas de FGF8b modificadas
Se han expresado las cuatro moléculas de FGF8b inmunogenizadas en bacterias y subsiguientemente se han purificado a partir de corpúsculos de inclusión. En paralelo, las construcciones se usarán como vacunas de ADN. Después se compararán las diferentes construcciones para determinar su capacidad de inducir diversos efectos, que se desean en el tratamiento de los pacientes de cáncer de próstata y de mama. Las investigaciones de ese tipo se realizarán usando varios ensayos in vitro e in vivo. Finalmente, los resultados de los experimentos formarán la base de la selección final de uno o dos candidatos para una vacuna contra FGF8b en seres humanos.
Modelos in vitro Análisis en el sistema murino
Se inmunizarán ratones de haplotipos diferentes así como conejos con las diferentes construcciones de FGF8b en adyuvante completo de Freund y subsiguientemente se administrarán recuerdos al menos dos veces con los mismos antígenos emulsionados en adyuvante incompleto de Freund. De este modo puede compararse la capacidad de las diferentes construcciones de anular la tolerancia de los linfocitos B. La vacunación con ADN se realizará en otros animales usando ADN purificado en adyuvante completo de Freund/adyuvante incompleto de Freund inyectado por vía intramuscular con un intervalo de 14 días.
Se obtendrán muestras de suero en varios tiempos durante la pauta de inmunización y se determinará la capacidad de las diferentes construcciones de inducir anticuerpos específicos para FGF8b usando un procedimiento de ELISA convencional (Rochon 1994). Se usarían un antisuero policlonal comercial así como un anticuerpo monoclonal comercial inducido contra FGF8b (R&D) como controles positivos. La proteína FGF8b está disponible en el mercado (R&D) pero también se producirá junto con las otras construcciones de FGF8b y subsiguientemente se purificará/plegará. Este producto puede usarse entonces para recubrir las placas en un ELISA directo para analizar el suero de ratones/conejos inmunizados con proteínas variantes de FGF8b.
Una herramienta valiosa para investigar los efectos de la vacunación contra FGF8b será una línea de células cancerosas dependiente de FGF8b. Se describen varias líneas de células cancerosas positivas para FGF8b, por ejemplo MCF-7 o SC-3 en la bibliografía. Una línea de células cancerosas murinas dependiente de FGF8b de ese tipo se identificará usando RT-PCR cuantitativa, experimentos de proliferación de células y ensayos de fosforilación STAT-3.
La presencia de FGF8b ligado a un receptor FGF de la superficie celular será detectada por anticuerpos específicos contra FGF8b en un análisis por FACS o por ELISA. Los anticuerpos que se dirigen contra varios de los diferentes receptores de FGF están disponibles en el mercado (R&D).
Las construcciones se compararán con respecto a su capacidad de inducir anticuerpos capaces de activar la lisis por complemento de las células que producen/portan FGF8b. Esto puede detectarse con una de las líneas de células tumorales de ratón que expresan FGF8b que se describen anteriormente o, de forma alternativa, usando células cargadas con FGF8b por osmosis. Los sueros de ratones normales o transgénicos (véase más adelante) inmunizados con las construcciones de FGF8b humana se incubarán con la línea celular y subsiguientemente se incubarán con complemento de cobaya reciente. La lisis de las células por complemento mediado por anticuerpos puede detectarse por procedimientos estándar.
La capacidad de los anticuerpos inducidos de mediar la ADCC puede estudiarse midiendo la liberación de ^{51}Cr por las células que expresan FGF8b marcadas. Las células efectoras serán PBMC de ratones singénicos. Para establecer el ensayo, puede ser conveniente usar una línea de células de ratón capaz de mediar la ADCC (positivo para los receptores de Fc) como células efectoras con un anticuerpo contra FGF8b humana.
Para demostrar que las vacunas candidatas contra FGF8b no promueven el crecimiento tumoral inducido por anticuerpos autólogos, los autores también realizarán un ensayo de proliferación de tumores. Se incubarán muestras de suero de ratones inmunizados con células tumorales que expresen FGF8b. La proliferación de las células tumorales puede detectarse después por su capacidad de incorporar 3H-timidina que subsiguientemente se añade a las células.
Dado que se sabe que FGF8b induce la proliferación de una variedad de células de mamífero, será también necesario examinar los efectos que promueven el crecimiento de las variantes de proteínas. Esto se puede realizar usando ensayos de proliferación celular como el que usó Marsh 1999.
El efecto biológico de FGF8b sobre las células de mamífero debería ser neutralizado por los anticuerpos autólogos. Esto se puede demostrar usando FGF8b recombinante y por ejemplo NIH3T3 en los estudios de proliferación celular (y cambios morfológicos). La adición de los anticuerpos autólogos debería anular la actividad transformante de FGF8b.
Protocolo de inmunización
El número de animales que deben incluirse en un experimento de inmunización de AutoVac con FGF8b debe depender de la penetración esperada de la enfermedad en el modelo y, por lo tanto, de los números necesarios para obtener información estadísticamente significativa. El protocolo de inmunización debe basarse en la experiencia que tienen los autores del proyecto de AutoVac con TNFa. Se han usado varios protocolos de inmunización para inmunizar ratones con los varios análogos de TNFa para fines específicos, pero la mayoría de los experimentos se realizaron usando el siguiente protocolo:
1. Los ratones se deben marcar individualmente mediante marcas en las orejas o mediante transpondedores, 10 animales en cada jaula. Presumiblemente, los machos y las hembras deben evaluarse por separado, pero en cualquier caso, los autores no mantendrán ambos sexos en la misma jaula. Los animales deben dejarse reposar durante al menos 3 días después del transporte y marcado.
2. Se emulsionó el antígeno 1 mg/ml en tampón de PBS con un volumen igual de adyuvante completo de Freund (CFA) (Difco o Sigma). La emulsión se comprueba colocando una gota de la emulsión sobre una superficie de agua y se observa si la gota se mantiene unida o se dispersa. Se sigue mezclando hasta que la gota no se dispersa.
3. La dosis de inmunización estándar es de 100 \mug de antígeno en un volumen de 100 \mul + 100 \mul de adyuvante. De este modo, el volumen de inmunización total es de 200 \mul, administrado s.c. (subcutáneamente) en el lomo del
animal.
4. Los recuerdos se administran 2-3 semanas después de la inmunización primaria y subsiguientemente con intervalos de 2-3 semanas. El material de recuerdo/inmunización se prepara y administra exactamente igual que el material de inmunización, pero se usa adyuvante incompleto de Freund. Probablemente tres recuerdos inducirán la valoración máxima. De este modo, las valoraciones más altas se obtendrán 6-9 semanas después de la primera inmunización.
5. Las extracciones de sangre son extracciones orbitarias de 50-100 \mul usualmente extraídos antes de la primera inmunización y una semana después de cada recuerdo. También se usan las extracciones de sangre de la cola y 10-20 \mul pueden ser suficientes para la determinación de las valoraciones.
El punto de iniciación del programa de inmunización dependerá del desarrollo de la enfermedad y de la estrategia que los autores quieren adoptar. Inicialmente, sugerimos que se intente generar la inmunidad máxima lo antes posible, pero es difícil iniciar las inmunizaciones antes de aproximadamente las 5 semanas de edad. A partir de ese momento, se deberían mantener valoraciones elevadas administrando recuerdos con intervalos de 6-8 semanas, después de los tres recuerdos iniciales. Existe un problema potencial si la FGF8b es necesaria para el desarrollo potencial del ratón joven y por lo tanto se podría argumentar a favor de iniciar las inmunizaciones más tarde en el ratón adulto.
Análisis en el sistema humano
Para seleccionar entre las diferentes construcciones de FGF8b, se investigará la capacidad de las células presentadoras de antígeno humanas de presentar, a los linfocitos T, los epítopos inmunógenos insertados de los linfocitos T. Esto se realizará usando los mismos ensayos de procesamiento in vitro para la presentación de P2 y P30 que se usaron para la vacuna de TNFa. Se establecerán líneas de linfocitos T humanos, que son específicas para P2 y P30, a partir de donantes vacunados contra el tétanos. Se incubarán células presentadoras de antígeno (PBMC) de los mismos donantes con las diferentes construcciones y se añadirán líneas de linfocitos T. El nivel de presentación de los epítopos de linfocitos T insertados puede compararse después midiendo la estimulación de las líneas de linfocitos T.
Modelos animales in vivo
Pueden usarse al menos tres sistemas diferentes para controlar si los anticuerpos inducidos contra FGF8b son capaces de controlar un efecto in vivo dependiente de FGF8b.
Se transplantarán células tumorales que expresan FGF8 murina a ratones y se ensayará la inhibición de la progresión del tumor mediante vacunación autóloga usando las proteínas FGF8b modificadas o las vacunas de ADN de FGF8b. El sistema ideal implica el uso de células aisladas de tumores murinos. De forma alternativa, los autores usarán otras líneas de células tumorales murinas (por ejemplo Balb/3T3) transfectadas de forma estable con el ADNc de FGF8b en un vector de expresión.
El modelo de carcinoma por xenoinjerto en ratón se usará para experimentos de vacunación pasiva. Se transplantarán tumores humanos a ratones atímicos y se intentaría la inhibición de tumores mediante la transferencia de suero de ratones normales o humanizados inmunizados con proteínas FGF8b modificadas o con vacunas de ADN de FGF8b. Esto sería muy útil para estudiar la capacidad de los anticuerpos inducidos para suprimir los tumores.
Otra estrategia para lograr probar el concepto implicará el uso de ratones transgénicos para FGF8b. Se ha demostrado que estos ratones, que portan el ADNc de FGF8b controlado por el promotor muy específico del virus de tumor de mama de ratón (MMTV), desarrollan tumores de mama que expresan FGF8b de forma espontánea (Coombes, comunicación personal). La vacunación autóloga de estos ratones con las proteínas variantes de FGF8b o con vacunas de ADN de FGF8b permitiría a los autores demostrar si la vacuna autóloga permitirá a los ratones suprimir o rechazar los tumores.
Una estrategia posible para probar el concepto sería usar el ratón transgénico Wnt-1 (MacArthur 1995c). Se ha reseñado que la inducción de cánceres de mama por el virus MMTV activa la expresión de FGF8 en más de la mitad de los ratones que desarrollan tumores. Podría establecerse la dependencia de FGF8b de los tumores si la(s) vacuna(s) autóloga(s) de los autores pudiera suprimir la incidencia o la velocidad de crecimiento de los tumores.
El hecho de que los ratones transgénicos a menudo demuestran patrones de tolerancia inmunológica no fisiológicos muy probablemente no afectará a este proyecto dado que los polipéptidos FGF8b son idénticos para seres humanos y ratones.
Cuando eventualmente se haya demostrado un efecto beneficioso de las inmunizaciones con FGF8b en el modelo de ratón y se hayan seleccionado candidatos para vacunación humanos, será posible realizar un número limitado de estudios toxicológicos. Subsiguientemente, pueden realizarse estudios de la vacuna en pacientes de cáncer de mama y de próstata para obtener una prueba final del concepto.
De forma importante, si los investigadores que usen modelos in vivo obtienen un resultado positivo, se construirán más mutantes basándose en los datos disponibles.
Ejemplo 4 Preparación del análogo de MUC-1
Únicamente se ha preparado una molécula de MUC-1 de AutoVac. Ésta comprende, en total, nueve repeticiones de mucina que tiene cada una la SEC ID Nº: 33. La construcción se inicia con tres secuencias de ese tipo, seguidas de un epítopo P2, seguido de tres secuencias más de mucina, seguidas de un epítopo P30, terminado en tres secuencias de mucina.
La construcción se ha preparado con y sin una marca de UNI-his en el extremo N (SEC ID Nº:23). Ambas variantes se han expresado en E. coli. La identidad de la proteína expresada ha sido confirmada tanto por transferencia Western como por secuenciación desde el extremo N. La proteína se expresa en forma soluble, pero en forma de dímero, lo que es bastante sorprendente.
La molécula MUC-1 marcada con HIS ha sido purificada mediante cromatografía de afinidad metálica. La cantidad de proteína pura y la pureza se desconocen actualmente.
Ejemplo 5 Anulación de la tolerancia autóloga en un sistema de modelo murino
Anteriormente los experimentos con CTL en los que los ratones habían sido inmunizados con dendrocitos pulsados con un epítopo de clase I y uno de clase II han demostrado una inducción potenciada de CTL en la inmunización así como en la reestimulación in vitro con un péptido de clase I y uno de clase II comparada con una inmunización y reestimulación sólo con un epítopo de clase I. Esta situación es comparable a la inmunización con una vacuna autóloga, en la que el epítopo de clase II exógeno se inserta en una proteína autóloga. La captación y procesamiento de estas moléculas por células presentadoras de antígenos profesionales tales como dendrocitos, provoca la presentación del epítopo exógeno de clase II junto con algunos epítopos autólogos de clase I. Es sabido que es posible provocar CTL autorreactivas pero la presencia de un epítopo colaborador de clase II exógeno muy probablemente debería potenciar esta inducción de CTL.
La ventaja potencial de la presente invención para inducir CTL autorreactivas está siendo investigada actualmente en ratones transgénicos para ovoalbúmina. Existen cuatro líneas transgénicas diferentes con diferentes niveles de expresión y estados de tolerancia a la ovoalbúmina, véase Kurts C y cols., 1997, J. Exp. Med. 186: 239-245 que describen el ratón transgénico RIP-mOVA (que expresa ovoalbúmina en el páncreas, riñón y timo y que tiene un grado de tolerancia elevado) y Kurts C y cols., 1998, J. Exp. Med. 188: 409-414 que describen los ratones transgénicos RIP-OVA^{low}y RIP- OVA^{high}, que tienen una expresión reducida y elevada de ovoalbúmina, respectivamente. La última línea, RIP-OVA^{int}, que expresa ovoalbúmina en un nivel intermedio ha sido obtenida del Dr. William R. Heath, coautor de las dos referencias mencionadas anteriormente.
En el cuerpo hay grados diferentes de tolerancia a antígenos diferentes. Uno de los grados de tolerancia menores se encuentra en los antígenos en que circulan cantidades grandes. Estos antígenos entrarán todos en el timo, donde se eliminan los linfocitos T con autorreactividad. Estos antígenos están en "tolerancia central". Los antígenos específicos de tejido, por otra parte, no entran directamente en el timo y están generalmente en la "tolerancia periférica" ejercida, por ejemplo, por la energía de los linfocitos T.
Se han producido dos construcciones AutoVac contra ovoalbúmina. Ambas se refieren a la secuencia con el número de acceso: J00845 en EMBL donde se ha insertado la secuencia de P30 (SEC ID Nº: 14) en dos posiciones diferentes.
En la construcción "OVA 3.1", P30 se inserta en la posición que corresponde a los aminoácidos nº 272-292 en la ovoalbúmina. En la construcción "OVA 3.2", P30 se inserta en la posición que corresponde a los aminoácidos nº 321-341 en la ovoalbúmina. Estas construcciones han sido insertadas en el vector pVax1 y se han usado para la inmunización con ADN.
Los ratones han sido inmunizados por vía intradérmica una vez con 100 \mug de ADN cada uno. Tres semanas después de esta inmunización, se extrajeron los bazos y se estableció un ensayo de CTL usando células diana que expresaban el epítopo de ovoalbúmina dominante SIINFEKL y el péptido reordenado FILKSINE como control. Las inmunizaciones proporcionaron una inducción clara de CTL en ratones C57BL/6 naturales - tal como se esperaba, dado que tanto la ovoalbúmina como P30 son exógenos en estos ratones.
Los autores pretenden ahora inmunizar las cuatro líneas de ratones transgénicos para ovoalbúmina con estas construcciones de AutoVac. Los RIP-OVA^{low}, RIP-OVA^{int} y RIP-OVA^{high} expresan cantidades crecientes de ovoalbúmina y tienen grados diferentes de tolerancia y, tal como se menciona anteriormente, también RIP-mOVA tiene un grado de tolerancia elevado.
En estas 4 líneas de ratones transgénicos, únicamente P30 será exógeno. Ovoalbúmina es un antígeno autólogo en estos ratones y esta situación constituirá por lo tanto una verdadera vacunación autóloga para la inducción de CTL contra la ovoalbúmina.
Los resultados preliminares obtenidos en los ratones RIP-OVA^{low}que tienen el grado de "tolerancia periférica" menor a la ovoalbúmina demostró que tanto la ovoalbúmina con P30 insertado como las moléculas de ovoalbúmina naturales eran capaces de inducir respuestas de CTL - es de esperar que los ratones transgénicos con grados más elevados de tolerancia únicamente sean capaces de desarrollar una respuesta de CTL contra las moléculas de ovoalbúmina modificadas y no contra la forma natural.
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<110> M&E Biotech A/S
\hskip1cm
STEINAA, Lucilla 
\hskip1cm
NIELSEN, Klaus Gregorius 
\hskip1cm
DALUM, Iben 
\hskip1cm
HAANING, Jesper 
\hskip1cm
LEACH, Dana 
\hskip1cm
BIRK, Peter 
\hskip1cm
MOURITSEN, Soren 
\hskip1cm
GAUTAM, Anand 
\hskip1cm
KARLSSON, Gunilla 
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTOS NOVEDOSOS PARA VACUNACIÓN TERAPEUTICA
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> 22113 PC 1
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<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 2.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2253
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (2253)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (58) .. (2253)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> PSM'humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Característica misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> ggt o tgg que codifican Gly y Trp, respectivamente
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 1
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21
22
23
24
25 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 750
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
26
27
28
29 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3768
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1).. (3768)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
30
31
32
33
34
35
36 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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37
38
39
40
41 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
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<211> 648
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<400> 5
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42
43 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 215
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 6
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44
45 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2256
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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46
47
48
49
50 
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<210> 8
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<211> 752
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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52
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<210> 9
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<212> ADN
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<213> Mus musculus 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(2082)
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
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54
55
56
57 
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 694
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<212> PRT
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<213> Mus musculus 
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<400> 10
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58
59
60
61 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 11
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<211> 45
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<212> ADN
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<213> Clostridium tetani 
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(45)
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<400> 11
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg 
\hfill
45 
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\sa{Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu}
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<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> PRT
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<213> Clostridium tetani 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 63
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<212> ADN
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<213> Clostridium tetani 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(63)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
62 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Clostridium tetani 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser}
\sac{Ala Ser His Leu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Fusión del epítopo del toxoide del tétanos y PSM
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<400> 15
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\sa{Gln Glu Arg Gly Val Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly}
\sac{Ile Thr Glu Leu Arg Val Asp Cys Thr}
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<210> 16
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<211> 25
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Fusión del epítopo del toxoide del tétanos y PSM
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<400> 16
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\sa{Ala Val Val Leu Arg Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly}
\sac{Ile Thr Glu Leu Glu Met Lys Thr Tyr}
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Fusión del epítopo del toxoide del tétanos y PSM
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<400> 17
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\sa{Met Phe Leu Glu Arg Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly}
\sac{Ile Thr Glu Leu His Val Ile Tyr Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 18
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<211> 31
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: Fusión del epítopo del toxoide del tétanos y PSM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
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\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Ser Arg Leu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg}
\sac{Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Val Asp Cys Thr Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Fusión del epítopo del toxoide del tétanos y PSM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Leu Arg Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg}
\sac{Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Ser Phe Asp Ser Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: Fusión del epítopo del toxoide del tétanos y PSM
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Met Phe Leu Glu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg}
\sac{Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Pro Ser Ser His Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: marca de His artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (18)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cat cat cat cat cat cat 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His His His His His His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: marca de His artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{His His His His His His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia artificial: marca de His artificial
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1) .. (42)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia artificial: marca de His artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln His Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1) .. (69)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
63 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly}
\sac{Ala Val Phe Val Ser Pro Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(33)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gaa caa aaa ctc atc tca gaa gag gat ctg aat 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn}
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(75)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
100 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Asp Ser Cys Ile Thr Val Met Ala Met Ala Leu Leu Ser Gly}
\sac{Phe Phe Phe Phe Ala Pro Ala Ser Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(60)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
101 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Arg Arg Met Leu Leu Mis Leu Ser Val Leu Thr Leu Ser Cys Val}
\sac{Trp Ala Thr Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 33
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\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala}
\sac{Pro Asp Thr Arg }

Claims (88)

1. Uso de
3) al menos un epítopo de CTL que se deriva de un antígeno polipeptídico asociado a células que es débilmente inmunógeno o que no es inmunógeno en un animal y
4) al menos un primer epítopo de linfocito T cooperador (T_{H}) que es exógeno al animal,
o de
3) al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica un epítopo de CTL que se deriva de un antígeno polipeptídico asociado a células que es débilmente inmunógeno o que no es inmunógeno en un animal y
4) al menos un primer fragmento de ácido nucleico que codifica un epítopo de linfocito T cooperador (T_{H}) que es exógeno al animal,
o de un microorganismo o virus no patógeno que porta un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa
3) al menos un epítopo de CTL que se deriva de un antígeno polipeptídico asociado a células que es débilmente inmunógeno o que no es inmunógeno en un animal y
4) al menos un primer epítopo de linfocito T cooperador (T_{H}) que es exógeno al animal,
para la preparación de una composición inmunógena para tratar un proceso patológico que se selecciona de un tumor, una infección vírica y una infección provocada por un parásito intracelular o una bacteria provocando, en el animal, la presentación simultánea por una célula presentadora de antígeno (APC) adecuada del al menos un epítopo de CTL y del al menos un epítopo primero de T_{H} y de este modo inducir en el animal una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos contra las células que portan el antígeno polipeptídico asociado a células en su superficie o que albergan el antígeno asociado a células en sus compartimiento intracelular, en el que el antígeno polipeptídico asociado a células se selecciona de un antígeno polipeptídico asociado a tumores, una proteína autóloga, un antígeno polipeptídico vírico y un antígeno polipeptídico que se deriva de un parásito intracelular o una bacteria.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el animal es un ser humano.
3. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la APC es un dendrocito o un macrófago.
4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la presentación por la APC del epítopo de CTL y el epítopo exógeno primero de T_{H} se efectúa presentando al sistema inmunitario del animal al menos un análogo primero del antígeno polipeptídico, comprendiendo dicho análogo primero una variación de la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico, conteniendo dicha variación al menos el epítopo de CTL y el epítopo exógeno primero de T_{H}.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el al menos un análogo primero contiene una fracción sustancial de epítopos de CTL conocidos y previstos del antígeno polipeptídico asociado a células.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la fracción sustancial de epítopos de CTL conocidos y previstos en la secuencia de aminoácidos del al menos un análogo primero son reconocidos por al menos el 90% de los haplotipos de MHC-I que reconocen todos los epítopos de CTL conocidos y previstos en el antígeno polipeptídico asociado a células.
7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que sustancialmente todos los epítopos de CTL conocidos del antígeno polipeptídico asociado a células están presentes en el al menos un análogo primero y/o en el que sustancialmente todos los epítopos de CTL previstos del antígeno polipeptídico asociado a células están presentes en el al menos un análogo primero.
8. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que el al menos un análogo primero comprende además una parte que consiste en una modificación de la estructura del antígeno polipeptídico asociado a células, teniendo como resultado dicha modificación que la inmunización del animal con el análogo primero induce la producción de anticuerpos en el animal contra antígeno polipeptídico asociado a células.
9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que además comprende el uso de al menos un análogo segundo del antígeno polipeptídico o de un fragmento de ácido nucleico que codifica un análogo segundo del antígeno polipeptídico o de al menos un microorganismo o virus no patógeno que porta un fragmento de ácido nucleico que codifica al menos un análogo segundo del antígeno polipeptídico para la preparación de una composición inmunógena para efectuar la presentación al sistema inmunitario del animal de una cantidad inmunológicamente eficaz del al menos un análogo segundo del antígeno polipeptídico, conteniendo dicho análogo segundo una modificación de la estructura del antígeno polipeptídico, dando como resultado dicha modificación que la inmunización del animal con el análogo segundo induce la producción de anticuerpos contra el antígeno polipeptídico asociado a células.
10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la modificación comprende que ese al menos un epítopo exógeno segundo de T_{H} esté incluido en el análogo segundo.
11. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-10, en el que el/los análogo(s) primero y segundo comprende(n) una fracción sustancial de los epítopos de linfocito B del antígeno polipeptídico asociado a células.
12. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-11, en el que la variación y/o modificación implica la sustitución y/o eliminación y/o inserción y/o adición de aminoácidos.
13. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-12, en el que la variación y/o modificación comprende que
- al menos un resto primero está incluido en el/los análogo(s) primero y/o segundo, efectuando dicho resto primero el rastreo del análogo a una célula presentadora de antígeno (APC) y/o
- al menos un resto segundo está incluido en el/los análogo(s) primero y/o segundo, estimulando dicho resto segundo el sistema inmunitario y/o
- al menos un resto tercero está incluido en el/los análogo(s) primero y/o segundo, optimizando dicho resto tercero la presentación del análogo al sistema inmunitario.
14. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-13, en el que la variación y/o modificación incluye la duplicación de al menos un epítopo de linfocito B o de al menos un epítopo de CTL del antígeno polipeptídico asociado a células.
15. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-14, en el que la variación y/o modificación incluye la introducción de un hapteno.
16. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el/los epítopo(s)
exógeno(s) primero y/o segundo de T_{H} es/son inmunodominante(s).
17. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el/los epítopo(s)
exógeno(s) primero y/o segundo de T_{H} es/son promiscuo(s).
18. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-17, en el que el/los epítopo(s) exógeno(s) primero y/o segundo de T_{H} se selecciona(n) de un epítopo natural de T_{H} y una secuencia peptídica de unión a MHC-II artificial.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el epítopo natural de T_{H} se selecciona de un epítopo de toxoide del tétanos tal como P2 o P30, un epítopo de toxoide de la difteria, un epítopo de hemaglutinina del virus de la gripe y un epítopo CS de P. falciparum.
20. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10-19, en el que el/los epítopo(s) primero y/o segundo de T_{H} y/o el/los resto(s) primero y/o segundo y/o tercero están presentes en forma de
- grupos laterales unidos covalentemente o no covalentemente a grupos químicos adecuados en la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a células o una subsecuencia del mismo y/o
- compañeros de fusión de la secuencia de aminoácidos que se deriva del antígeno polipeptídico asociado a células.
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que el resto primero es un compañero de unión sustancialmente específico para un antígeno de superficie específico de APC tal como un carbohidrato para el que existe un receptor en la APC, por ejemplo manano o manosa.
22. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-21 en el que el resto segundo es una citoquina que se selecciona de interferón \gamma (IFN-\gamma), Flt3L, interleuquina 1 (IL-1), interleuquina 2 (IL-2), interleuquina 4 (IL-4), interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 12 (IL-12), interleuquina 13 (IL-13), interleuquina 15 (IL-15) y factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), o una parte efectiva de los mismos; o una proteína de choque térmico que se selecciona de HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 y calreticulina (CRT) o una parte efectiva de las mismas; o una hormona.
23. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-22, en el que el resto tercero es un lípido tal como un grupo palmitoilo, un grupo miristilo, un grupo farnesilo, un grupo geranil-geranilo, un anclaje de GPI y un grupo de diglicérido de N-acilo.
24. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-23, en el que el/los análogo(s) primero y/o segundo tiene(n) sustancialmente la estructura terciaria global del antígeno polipeptídico asociado a células.
25. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-24, en el que la presentación por las APC se efectúa administrando al animal, una cantidad inmunológicamente eficaz del al menos un análogo primero.
26. El uso de acuerdo con la reivindicación 25, en el que también se administra una cantidad inmunológicamente eficaz del al menos un análogo segundo.
27. El uso de acuerdo con la reivindicación 25 ó 26, en el que dicho al menos un análogo(s) primero y/o segundo se formula(n) junto con un transportador y/o vehículo farmacéutica e inmunológicamente aceptable y, opcionalmente, un adyuvante.
28. El uso de acuerdo con la reivindicación 27, en el que dicho adyuvante facilita la captación por las APC, tales como los dendrocitos, del al menos un análogo(s) primero y/o segundo.
29. El uso de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en un adyuvante rastreador inmunitario; un adyuvante inmunomodulador tal como una toxina, una citoquina y un derivado micobacteriano; una formulación oleaginosa; un polímero; un adyuvante que forma micelas; una saponina; una matriz de complejo inmunoestimulador (matriz ISCOM); una partícula; DDA; adyuvantes de aluminio; adyuvantes de ADN; \gamma-inulina; y un adyuvante encapsulante.
30. El uso de acuerdo con la reivindicación 29, en el que la citoquina es tal como se define en la reivindicación 22, o una parte efectiva de la misma, en el que la toxina se selecciona del grupo que consiste en listeriolicina (LLO), Lípido A (MPL, L180.5/RaILPS) y una enterotoxina termolábil, en el que el derivado micobacteriano se selecciona del grupo que consiste en dipéptido de muramilo, adyuvante completo de Freund, RIBI y un diéster de trehalosa tal como TDM y TDE, en el que el adyuvante inmunorrastreador adecuado se selecciona del grupo que consiste en ligando de CD40 y anticuerpos de CD40 o específicamente sus fragmentos de unión, manosa, un fragmento Fab y CTLA-4, en el que la formulación oleaginosa comprende escualeno o adyuvante incompleto de Freund, en el que el polímero se selecciona del grupo que consiste en un carbohidrato tal como dextrano, PEG, almidón, manano y manosa; un polímero plástico; y látex tal como perlas de látex, en el que la saponina es saponina de Quillaja saponaria, Quil A y QS21 y en el que la partícula comprende látex o dextrano.
31. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-30, en el que el al menos un análogo primero se administra por una vía que se selecciona de la vía oral y de la vía parenteral tal como las vías intradérmica, la subdérmica, la intracutánea, la subcutánea; la peritoneal, la bucal, la sublingual, la epidural, la espinal, la anal y la intracraneal.
32. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-31, en el que el al menos un análogo primero se administra al menos una vez al año, tal como al menos 2, 3, 4, 5, 6 y 12 veces al año.
33. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la presentación se efectúa administrando, al animal, el microorganismo o virus no patógeno que porta un fragmento de ácido nucleico que codifica y que expresa el al menos un epítopo de CTL y el al menos un epítopo de T_{H}.
34. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-12, en el que la presentación se efectúa administrando, al animal, el microorganismo o virus no patógeno que porta al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa al menos el análogo primero.
35. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-24, en el que el epítopo de T_{H} y/o los restos primero y/o segundo y/o tercero están presentes en forma de compañeros de fusión de la secuencia de aminoácidos que se deriva del antígeno polipeptídico asociado a células y en el que la presentación se efectúa administrando, al animal, el microorganismo o virus no patógeno que porta al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el análogo primero y/o segundo.
36. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-12 ó 34, en el que la presentación se efectúa administrando, al animal, el microorganismo o virus no patógeno que porta al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa al menos el análogo segundo.
37. El uso de acuerdo con la reivindicación 36, en el que el microorganismo o virus no patógeno se administra una vez al animal.
38. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la presentación se efectúa introduciendo in vivo, en las APC, el al menos un fragmento de ácido nucleico.
39. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-12, en el que la presentación se efectúa introduciendo in vivo, en las APC, el al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el análogo primero.
40. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13-24, en el que el epítopo de T_{H} y/o los restos primero y/o segundo y/o tercero están presentes en forma de compañeros de fusión de la secuencia de aminoácidos que se deriva del antígeno polipeptídico asociado a células y en el que la presentación se efectúa introduciendo in vivo, en las APC, el al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el análogo primero y/o segundo.
41. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9-12 y 39, que comprende además el uso del al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el análogo segundo para la preparación de una composición farmacéutica para la introducción in vivo, en las APC, del al menos un fragmento de ácido nucleico que codifica y expresa el análogo segundo.
42. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la presentación se efectúa introduciendo de forma concomitante, en las APC, al menos dos fragmentos de ácido nucleico, en el que uno codifica y expresa el al menos un epítopo de CTL y en el que otro codifica y expresa el al menos un epítopo de T_{H}exógeno y en el que el epítopo exógeno primero de T_{H} es tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y
19-22.
43. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38-42, en el que el/los fragmento(s) de ácido nucleico introducido(s) se selecciona(n) de ADN desnudo, ADN formulado con lípidos con carga o sin carga, ADN formulado en liposomas, ADN incluido en un vector vírico, ADN formulado con una proteína o polipéptido que facilita la transfección, ADN formulado con una proteína o polipéptido rastreador, ADN formulado con un carbohidrato rastreador, ADN formulado con agentes que precipitan el calcio, ADN acoplado a una molécula de vehículo inerte y ADN formulado con un adyuvante.
44. El uso de acuerdo con la reivindicación 43, en el que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en los adyuvantes que se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 28-30.
45. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 38-44, en el que el modo de administración es tal como se define en la reivindicación 31 ó 32.
46. Un procedimiento para la selección de un análogo inmunógeno de un antígeno polipeptídico asociado a células que es débilmente inmunógeno o que no es inmunógeno en un animal, siendo capaz dicho análogo inmunógeno de inducir una respuesta de CTL en el animal contra las células que presentan una molécula de MHC de clase I unida a un epítopo que se deriva del antígeno polipeptídico asociado a células, comprendiendo este procedimiento
a) identificar al menos un subsecuencia de la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a células, que no contiene epítopos de CTL conocidos ni previstos,
b) preparar al menos un análogo putativamente inmunógeno del antígeno polipeptídico asociado a células introduciendo, en la secuencia de aminoácidos del antígeno polipeptídico asociado a células, al menos un epítopo de T_{H} exógeno al animal en una posición dentro de la al menos una subsecuencia que se identifica en la etapa a), y
c) seleccionar el/esos análogos que se prepararon en la etapa b) que son verificablemente capaces de inducir una respuesta de CTL en el animal,
en el que el antígeno polipeptídico asociado a células se selecciona de un antígeno polipeptídico asociado a tumores, una proteína autóloga, una antígeno polipeptídico vírico y un antígeno polipeptídico que se deriva de un parásito intracelular o una bacteria.
47. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 46, en el que
1) la subsecuencia que se identifica en la etapa a) además no contiene residuos de cisteína o, de forma alternativa, en el que el epítopo de T_{H} que se introduce en la etapa b) no altera sustancialmente el patrón de residuos de cisteína.
2) la subsecuencia que se identifica en la etapa a) además no contiene sitios de glucosilación conocidos o previstos o, de forma alternativa, en el que el epítopo de T_{H} que se introduce en la etapa b) no altera sustancialmente el patrón de glucosilación y/o
3) la subsecuencia que se identifica en la etapa a) contribuye de forma significativa a un efecto patofisiológico ejercido por la antígeno polipeptídico asociado a células y en la que la introducción en la etapa b) del epítopo de T_{H} exógeno reduce o anula dicho efecto patofisiológico y/o
4) la subsecuencia que se identifica en la etapa a) es homóloga a una secuencia de aminoácidos de un antígeno proteínico diferente del animal y en la que la introducción del epítopo de T_{H} en la etapa b) sustancialmente elimina la homología y/o
5) la introducción en la etapa b) del epítopo de T_{H} exógeno da como resultado la conservación de una fracción sustancial de epítopos de linfocitos B del antígeno polipeptídico asociado a células.
48. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 47 cuando incluye la variante 5, en el que el análogo tiene la estructura terciaria global del antígeno polipeptídico asociado a células.
49. Un procedimiento para la preparación de una célula que produce un análogo de un antígeno polipeptídico asociado a células, comprendiendo el procedimiento la introducción, en un vector, de una secuencia de ácido nucleico que codifica un análogo que ha sido seleccionado de acuerdo con el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 46-48 y la transformación de una célula hospedadora adecuada con el vector.
50. Un procedimiento para la preparación de un análogo de un antígeno polipeptídico asociado a células, comprendiendo el procedimiento el cultivo de la célula obtenida de acuerdo con el procedimiento de la reivindicación 49 en condiciones que facilitan la expresión de la secuencia de ácido nucleico que codifica el antígeno asociado a células y la recuperación del análogo del sobrenadante del cultivo o de las células.
51. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 50 que además comprende la etapa de purificar el análogo recuperado y, opcionalmente, someter el producto purificado a modificaciones post-traduccionales artificiales tales como plegamiento, tratamiento con enzimas, modificación química y conjugación.
52. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-45, en el que el antígeno asociado a células débil se selecciona del grupo que consiste en 5 alfa-reductasa, \alpha-fetoproteína, AM-1, APC, APRIL, BAGE, \beta-catenina, Bcl2, bcr-abl (b3a2), CA-125, CASP-8/FLICE, Catepsinas, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33, CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55 (791Tgp72), CD59, CDC27, CDK4, CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DcR3, E6/E7, EGFR, EMBP, Ena78, farsil transferasa, FGF8a o FGF8b, FLK-1/KDR, receptor del ácido fólico, G250, familia de GAGE, gastrina 17, hormona liberadora de gastrina (bombesina), GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gp100/PmeI 17, gp-100-in4, gp15, gp75/TRP-1, hCG, Heparanasa, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT (telomerasa), IGFR1, IL-13R, INOS, Ki 67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA (CO17-1A), LDLR-FUT, familia MAGE (MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, etc.), Mamaglobina, MAP17, Melan-A/MART-1, mesotelina, MIC A/B, MT-MMP, Mox1, Mucina tal como MUC-1, MUC-2, MUC-3 y MUC-4 con glucosilaciones aberrantes, MUM-1, NY-ESO-1, Osteonectina, p15, P170/MDR1, p53, p97/melanotransferrina, PAI-1, PDGF, Plasminógeno (uPA), PRAME, Probasina, Progenipoyetina, PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, familia génica SSX, STAT3, STn (asoc. a mucina), TAG-72, TGF-\alpha, TGF-\beta, Timosina \beta 15, TNF-\alpha, TPA, TPI, TRP-2, Tirosinasa, VEGF, ZAG, p16INK4 y glutationa S-transferasa.
53. El uso de acuerdo con la reivindicación 52, en el que el antígeno polipeptídico asociado a células es PSM humana.
54. El uso de acuerdo con la reivindicación 53, en el que el epítopo del linfocito T exógeno se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos de PSM que se define por la SEC ID Nº: 2 posiciones 16-52 y/o 87-108 y/o 210-230 y/o 269-289 y/o 298-324 y/o 442-465 y/o 488-514 y/o 598-630 y/o 643-662 y/o 672-699.
55. El uso de acuerdo con la reivindicación 53 ó 54 en el que la composición farmacéutica se usa en el tratamiento o mejora del cáncer de próstata.
56. El uso de acuerdo con la reivindicación 52, en el que el antígeno polipeptídico asociado a células es el factor de crecimiento de fibroblastos 8b (FGF8b).
57. El uso de acuerdo con la reivindicación 56, en el que el epítopo del linfocito T exógeno se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos de FGF8b que se define por la SEC ID Nº: 6 posiciones 1-54 y/o 178-215 y/o 55-58 y/o 63-68 y/o 72-76 y/o 85-91 y/o 95-102 y/o 106-111 y/o 115-120 y/o 128-134 y/o 138-144 y/o 149-154 y/o 158-162 y/o 173-177 y en el que la introducción preferiblemente no implica sustancialmente a los aminoácidos 26-45 ni a los aminoácidos 186-215.
58. El uso de acuerdo con la reivindicación 56 ó 57 en el que la composición farmacéutica se usa en el tratamiento o mejora del cáncer tal como cáncer de próstata y cáncer de mama.
59. El uso de acuerdo con la reivindicación 52, en el que el antígeno polipeptídico asociado a células es Her2.
60. El uso de acuerdo con la reivindicación 59, en el que el epítopo del linfocito T exógeno se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos de Her2 que se define por la SEC ID Nº: 3 posiciones 5-25 y/o 59-73 y/o 103-117 y/o 149-163 y/o 210-224 y/o 250-264 y/o 325-339 y/o 369-383 y/o 465-479 y/o 579-593 y/o 632-652 y/o 653-667 y/o 661-675 y/o 695-709 y/o 710-730.
61. El uso de acuerdo con la reivindicación 59 ó 60 en el que la composición farmacéutica se usa en el tratamiento o mejora del cáncer de mama.
62. Un análogo de PSM humana que es inmunógeno en los seres humanos, comprendiendo dicho análogo una parte sustancial de todos los epítopos de CTL y de linfocito B conocidos y previstos de PSM y que incluyen al menos un epítopo de T_{H} exógeno tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 16-19.
63. El análogo de acuerdo con la reivindicación 62, en el que el al menos un epítopo de T_{H} exógeno está presente en forma de una inserción en la secuencia de aminoácidos de PSM o en forma de una sustitución de parte de la secuencia de aminoácidos de PSM o como resultado de la eliminación de parte de la secuencia de aminoácidos de PSM.
64. El análogo de acuerdo con la reivindicación 63, en el que el epítopo de T_{H} exógeno se introduce en las posiciones que se definen en la reivindicación 54.
65. Un análogo de Her2 humana que es inmunógeno en los seres humanos, comprendiendo dicho análogo una parte sustancial de todos los epítopos de CTL y de linfocito B conocidos y previstos de Her2 y que incluyen al menos un epítopo de T_{H} exógeno tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 16-19.
66. El análogo de acuerdo con la reivindicación 65, en el que el al menos un epítopo de T_{H} exógeno está presente en forma de una inserción en la secuencia de aminoácidos de Her2 o en forma de una sustitución de parte de la secuencia de aminoácidos de Her2 o como resultado de la eliminación de parte de la secuencia de aminoácidos de Her2.
67. El análogo de acuerdo con la reivindicación 66, en el que el epítopo de T_{H} exógeno se introduce en las posiciones que se definen en la reivindicación 60.
68. Un análogo de FGF8b humana/murina que es inmunógeno en los seres humanos, comprendiendo dicho análogo una parte sustancial de todos los epítopos de CTL y de linfocito B conocidos y previstos de FGF8b y que incluyen al menos un epítopo de T_{H} exógeno tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 16-19.
69. El análogo de acuerdo con la reivindicación 68, en el que el al menos un epítopo de T_{H} exógeno está presente en forma de una inserción en la secuencia de aminoácidos de FGF8b o en forma de una sustitución de parte de la secuencia de aminoácidos de FGF8b o como resultado de la eliminación de parte de la secuencia de aminoácidos de FGF8b.
70. El análogo de acuerdo con la reivindicación 69, en el que el epítopo de T_{H} exógeno se introduce en las posiciones que se definen en la reivindicación 57.
71. Una composición inmunógena que comprende, como un agente inmunógeno efectivo el análogo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 62-70 mezclado con un transportador o vehículo farmacéutica e inmunológicamente aceptable y, opcionalmente, un adyuvante.
72. Un fragmento de ácido nucleico que codifica un análogo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 62-70.
73. Un vector que porta el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 72.
74. El vector de acuerdo con la reivindicación 73 que tiene capacidad de replicación autónoma.
75. El vector de acuerdo con la reivindicación 73 ó 74 que se selecciona del grupo que consiste en un plásmido, un macrófago, un cósmico, un minicromosoma y un virus.
76. El vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 73-75, que comprende en la dirección 5'\rightarrow 3' y en enlace operable: un promotor para dirigir la expresión del fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 72, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido director que permite la secreción o la integración en la membrana del fragmento de polipéptido, el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 72 y una secuencia de ácido nucleico que codifica un terminador.
77. El vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 73-76 que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de la célula hospedadora o no tiene capacidad de ser integrado en el genoma de la célula hospedadora.
78. Una célula transformada que porta el vector en una cualquiera de las reivindicaciones 73-77.
79. Una composición para inducir la producción de anticuerpos contra PSM, Her2 o FGF8b, comprendiendo la composición
1) un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 72 o un vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 73-77 y
2) un diluyente y/o vehículo y/o adyuvante farmacéutica e inmunológicamente aceptable.
80. Una línea celular estable que porta el vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 73-77 y que expresa el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 72 y que opcionalmente segrega o porta el análogo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 62-70 en su superficie.
81. Un procedimiento para la preparación de la célula de acuerdo con la reivindicación 78, comprendiendo el procedimiento la transformación in vitro de una célula hospedadora con el fragmento de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 72 o con el vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 73-77.
82. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 46-51 en el que el antígeno asociado a células débil se selecciona del grupo que consiste en 5 alfa-reductasa, \alpha-fetoproteína, AM-1, APC, APRIL, BAGE, \beta-catenina, Bcl2, bcr-abl (b3a2), CA-125, CASP-8/FLICE, Catepsinas, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33, CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55 (791Tgp72), CD59, CDC27, CDK4, CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DcR3, E6/E7, EGFR, EMBP, Ena78, farsil transferasa, FGF8a o FGF8b, FLK-1/KDR, receptor del ácido fólico, G250, familia de GAGE, gastrina 17, hormona liberadora de gastrina (bombesina), GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gp100/PmeI 17, gp-100-in4, gp15, gp75/TRP-1, hCG, Heparanasa, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT (telomerasa), IGFR1, IL-13R, INOS, Ki 67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA (CO17-1A), LDLR-FUT, familia MAGE (MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, etc.), Mamaglobina, MAP17, Melan-A/MART-1, mesotelina, MIC A/B, MT-MMP, Mox1, Mucina tal como MUC-1, MUC-2, MUC-3 y MUC-4 con glucosilaciones aberrantes, MUM-1, NY-ESO-1, Osteonectina, p15, P170/MDR1, p53, p97/melanotransferrina, PAI-1, PDGF, Plasminógeno (uPA), PRAME, Probasina, Progenipoyetina, PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, familia génica SSX, STAT3, STn (asoc. a mucina), TAG-72, TGF-\alpha, TGF-\beta, Timosina \beta 15, TNF-\alpha, TPA, TPI, TRP-2, Tirosinasa, VEGF, ZAG, p16INK4 y glutationa S-transferasa.
83. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 82, en el que el antígeno polipeptídico asociado a células es PSM humana.
84. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 83, en el que epítopo del linfocito T exógeno se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos de PSM que se define por la SEC ID Nº: 2 posiciones 16-52 y/o 87-108 y/o 210-230 y/o 269-289 y/o 298-324 y/o 442-465 y/o 488-514 y/o 598-630 y/o 643-662 y/o 672-699.
85. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 82, en el que el antígeno polipeptídico asociado a células es el factor de crecimiento de fibroblastos 8b (FGF8b).
86. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 85, en el que el epítopo del linfocito T exógeno se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos de FGF8b que se define por la SEC ID Nº: 6 posiciones 1-54 y/o 178-215 y/o 55-58 y/o 63-68 y/o 72-76 y/o 85-91 y/o 95-102 y/o 106-111 y/o 115-120 y/o 128-134 y/o 138-144 y/o 149-154 y/o 158-162 y/o 173-177 y en el que la introducción preferiblemente no implica sustancialmente a los aminoácidos 26-45 ni a los aminoácidos 186-215.
87. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 82, en el que el antígeno polipeptídico asociado a células es Her2.
88. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 87, en el que el epítopo del linfocito T exógeno se introduce en una parte de la secuencia de aminoácidos de Her2 que se define por la SEC ID Nº: 3 posiciones 5-25 y/o 59-73 y/o 103-117 y/o 149-163 y/o 210-224 y/o 250-264 y/o 325-339 y/o 369-383 y/o 465-479 y/o 579-593 y/o 632-652 y/o 653-667 y/o 661-675 y/o 695-709 y/o 710-730.
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