SK4272001A3

SK4272001A3 - Methods for therapeutic vaccination

Info

Publication number: SK4272001A3
Application number: SK427-2001A
Authority: SK
Inventors: Lucilla Steinaa; Soren Mouritsen; Anand Gautam; Iben Dalum; Jesper Haaning; Dana Leach; Klaus Gregorius Nielsen; Gunilla Karlsson; Peter Birk Rasmussen
Original assignee: Pharmexa As
Priority date: 1998-10-05
Filing date: 1999-10-05
Publication date: 2003-02-04
Also published as: ATE269100T1; US7005498B1; HK1039749A1; HUP0103976A3; EP1117421A2; CZ20011049A3; HUP0103976A2; PT1117421E; AU751709B2; HK1039749B; CA2345817C; PL202399B1; MXPA01003503A; KR20010085894A; EA200100425A1; US20040141958A1; DE69918146D1; DE69918146T2; AU5851099A; US7820633B2

Description

Imunogénna kompozícia a spôsob selekcie imunogénneho analógu

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka nových spôsobov boja proti chorobám, napríklad rakovine, pre ktoré je charakteristická prítomnosť produktov bunkovej génovej expresie, ktoré nevyvolávajú žiadnu alebo len slabú imunitnú reakciu. Predovšetkým sa vynález týka spôsobov indukovania imunitnej odpovedi organizmu riadenej cytotoxickými T-lymfocytmi (CTL), pomocou ktorej sú bunky nesúce epitopy z produktov génovej expresie napadané a hubené CT lýmfocytmi. Vynález sa tiež týka spôsobu prípravy imunogénnych modifikovaných polypeptídových antigénov, ktoré sú odvodené zo slabých imunogénnych antigénov.

Vynález sa ďalej týka sérií aplikácií technológie autovakcinácie (Applicants AutoVac technology, ktorá je predmetom patentu WO 95/05849) V oblasti terapeutickej vakcinácie proti rakovine.

Doterajší stav techniky

Myšlienka uskutočniť očkovanie proti rakovine je stará viac než sto rokov a v priebehu celého tohoto obdobia, zvlášť od konca dvadsiateho storočia, sa jej venuje opakovane až výbušná aktivita.

Behom posledných 10 rokov však došlo k výraznému rozvoju porozumenia základným molekulovým mechanizmom imunitnej odozvy. Medzi najdôležitejšie medzníky tohoto obdobia patria objavy stále sa rozširujúceho zoznamu cytokínov a rastových faktorov, pochopenie mechanizmu interakcie medzi T a B bunkami, ako aj určenie ciest spracovávania bunkového antigénu, vrátane úlohy a štruktúry molekúl MHC triedy I a II pri prezentácii antigénu. Dôležitým objavom v oblasti nádorovej imunológie, aj keď dodnes nie celkom pochopeným, bolo vysvetlenie mechanizmov tvoriacich základ indukcie imunologickej tolerancie v hostiteľovi. Všetky tieto výskumy vychádzali z obrovského úsilia vyvinúť nové liečebné postupy pre rakovinu.

Podľa toho, ako pacient získava nádorovú imunitu, sa režim imunoterapie delí na pasívny a aktívny. Pri pasívnych imunoterapeutických režimoch pacient dostáva imúnitné zložky, napríklad cytokíny, protilátky, cytotoxické T-bunky alebo lymfocytmi aktivované usmrcovacie bunky (LAK). Naproti tomu protokoly pre aktívnu špecifickú imunoterapiu zahrnujú aktívnu indukciu nádorovej imunity vakcináciou nádorovej bunky alebo jej antigénových zložiek. Táto forma liečenia je výhodná, pretože imunita trvá dlhšie.

Pasívne a aktívne nádorové vakcíny sa zameriavali na indukciu buď humorálnej alebo celulárnej imunitnej odozvy. Pre aktívne vakcíny je spoľahlivo určené, že indukcia CD4 pozitívnych T pomocných buniek je potrebná, aby sa sekundárne indukovali buď protilátky alebo cytotoxické CD8 pozitívne T bunky.

Pasívna vakcinácia protilátkami

Od objavu technológie monoklonovej protilátky v polovine sedemdesiatych rokov sa vyvinul celý rad terapeutických monoklonových protilátok namierených proti špecifickému nádoru alebo s ním spojeným antigénom. Monoklonová protilátková terapia však so sebou prináša niekolko vážnych problémov:

- Injekčná aplikácia cudzích látok vyvolá u pacienta imunitnú reakciu na vpichnuté protilátky, ktorá môže viesť ku zníženiu liečebného účinku, rovnako ako aj k vážnym alergickým vedľajším účinkom.

- Monoklonové protilátky sa musia obvykle podávať vo veľkom množstve. To je problém, pretože výrobné ceny monoklonových protilátok sú obrovské.

- Monoklonové protilátky sa musia podávať parenterálne a vzhladom k tomu, že je potrebné relatívne veľké množstvo, pacienti musia byť behom liečby často hospitalizovaný.

- Injekčná aplikácia monoklonových protilátok sa musí opakovať v relatívne krátkom intervale (týždne), aby sa zachoval liečebný účinok.

- Monoklonové protilátky nie sú obvykle schopné aktivovať sekundárne efektorové systémy imunitného systému, napríklad komplement, NK-bunky alebo makrofágy usmrcujúce nádorové bunky.

Posledne menovaná nevýhoda je zvlášť dôležitá pri terapii rakoviny a môže byť významnou príčinou toho, prečo nie je monoklonová protilátková terapia rakoviny v niektorých prípadoch práve úspešná. Takzvané „poľudštené monoklonové protilátky používané v súčasnosti mnohými spoločnosťami sú menej imunogénne, ale bohužiaľ sú aj menej schopné aktivovať sekundárne imunitné efektorové systémy. Naviac sa vyskytli príklady sekundárneho rastu nádorov, ktoré nemali antigén pôvodného nádoru, pretože tieto protilátky rozhodne nie sú z hľadiska pôsobenia na nádorové bunky „neškodnými divákmi, ktorý by neniesli nádorový antigén.

Nízka efektorová schopnosť monoklonových protilátok viedla k vývoju monoklonových protilátok chemicky viazaných na rôzne toxíny a rádioizotopy. Spoločnosť Pharmacia Upjohn AB napríklad vyvinula konjugát medzi nádorovo špecifickou monoklonovou protilátkou a toxínom A Staphylococcus aureus s cieľom aktivovať T bunky v nádore. Medarex Inc. vyvinul bišpecifické monoklonové protilátky obsahujúce nádorovo špecifický fragment Fab, ako aj fragment protilátky špecifický k Fc-receptoru, s cielom aktivovať makrofág hubiaci nádorové bunky. Obidva prípravky sú účinnejšie než samotná monoklonová protilátka, ale sú tiež drahšie a viac imunogénne. Protilátky konjugované na rádioizotopy sú tiež drahé a imunogénne, naviac sa u nich prejavujú iné obecne toxické vedľajšie účinky.

Objavenie technológie monoklonovéj protilátky bolo významným krokom vpred, ktorý umožnil výrobu dobre definovaných molekúl s vysokou väzobnou afinitou. Vzhľadom k tomu, že sú tieto protilátky monoklonové, reagujú len s jedným typom epitopu na nádorovom antigéne. To je hlavná príčina, prečo nie sú obvykle schopné aktivovať systém komplementu alebo sa viazať na Fc-receptory NK-buniek a makrofágov. Tieto velmi mocné systémy efektorov obvykle vyžadujú spoločné umiestenie rozmanitých fragmentov Fc protilátok vystupujúcich z antigénu.

Iný výskumný pracovníci sa pokúsili použiť kombináciu dvoch monoklonových protilátok, čo viedlo ku zlepšeniu účinnosti postupu. Miesto napadania nádorových buniek vysoko špecifickými polyklonovými protilátkami sa však zdá oveľa rozumnejšie sa zamerať na vlastné zvláštnosti nádoru alebo na nádorové antigény (so zvýšenou expresiou) alebo na receptory rastového faktoru. Takéto protilátky by boli schopné naplno aktivovať už zmienené sekundárne efektorové systémy. Okrem toho je pravdepodobné, že lokálna zápalová reakcia indukovaná týmito efektorovými systémami môže viesť ¹ k sekundárnym účinkom na bunkách („neškodných divákoch), expresiu príslušného nádorového antigénu, k aktivácii nádorovo špecifických TIL (nádor prestupujúcich lymfocytov) v nádorovom tkanive. Takéto účinky zaznamenali u Medarex Inc. pri použití svojich bi-špecifických konjugátov monoklonových protilátok.

ktoré nemajú rovnako ako

Od objavu technológie monoklonovej protilátky sa potencionálne využitie polyklonových protilátok k liečbe rakoviny príliš nerozvíjalo (s výnimkou nižšie opísaných antigénov). Jedným z hlavných dôvodov je, že dobre definované nádorové špecifiky alebo s nádorom spojené povrchové antigény boli charakterizovane až v posledných rokoch, ale hlavne u mnohých z nich sa ukázalo, že sú vlastnými antigénmi, a preto sú neimunogénne. Preto by sa mali xenogénne polyklonové protilátky nevyhnutne používať pre štúdium týchto účinkov. Avšak takéto protilátky indukujú silnú imunitnú odozvu proti injektovaným cudzím polyklonovým protilátkam, ktorá rýchlo odstraňuje terapeutické účinky.

Aktívna vakcinácia pre indukciu protilátok

Nedávne pokusy indukovať terapeutické polyklonové protilátky aktívnou vakcináciou pacientov s rakovinou boli úspešné. Boli vyvinuté vakcíny proti vlastným uhľovodíkovým antigénom viazaným na membráne (napríklad cez kyslík viazané anomálne exprimované antigény Tn a sTn a gangliové liposacharidy GM2 a GD3). Tieto malé uhľovodíkové štruktúry sú však veľmi slabými antigénmi, preto sa musia použiť konjugáty týchto molekúl s nosičovými molekulami, ako je hemokyanín kliešťov (KHL) alebo ovčie mucíny (obsahujúce Tn a sTn) . U pacientov s melanómom viedla indukcia anti-GM2 protilátok k predĺženiu obdobia bez choroby a celkové prežitie potom dosiahlo minimálne 51 mesiacov. Tiež štúdie fáze II uskutočnené na náhodne vybraných pacientkách s rakovinou prsníka s použitím konjugátu sTn a KLH v adjuvans DETOX-B (BIOMIRA, Inc.) ukázali, že sTn imúnne pacientky mali výrazne dlhší priemerný čas prežitia než kontrolné pacientky. Ďalším príkladom aktívnej indukcie polyklonových protilátok proti rakovine je použitie idiotypickej špecifickej vakcinácie proti B-bunkovým lymfómom, ktoré, akokoľvek slubné, je účinné len proti tomuto typu rakoviny.

Konečne americká spoločnosť Aphton Inc. vyvinula aktívnu konjugovanú vakcínu proti hormónu uvoľňujúcemu gonadotropín (GnRH) a gastrínu. Ukázalo sa, že táto vakcína je schopná regulovať biologickú aktivitu uvedených hormónov, ktoré môžu tiež fungovať ako autokrinné rastové faktory pre určité nádorové bunky. Úspešná II. fáza klinických skúšok sa uskutočňovala na pacientoch s gastrointestinálnou rakovinou a III. fáza klinických skúšok prebieha.

Cytotoxické T-bunky

Niekolko skupín jasne demonštrovalo, že nádorovo špecifické cytotoxické T bunky (CTL*) sú prítomné v mnohých nádoroch. Tieto CT lymfocyty sa nazývajú nádor prestupujúce lymfocyty (TIL). Avšak tieto bunky prejavujú akúsi necitlivosť alebo sú anergické pri niektorých odlišných možných mechanizmoch, vrátane sekrécie imunosupresívnych cytokínov nádorovými bunkami, nedostatku spolustimulujúcich signálov, zníženia (down-regulation) počtu molekúl MHC triedy I atd.

Uskutočnilo sa veľa pokusov izolovať nádorovo špecifické peptidy viazané HLA triedy I rozpoznané TIL lymfocytmi, a niektoré z nich boli úspešné (napr. peptidy z melanómových antigénov). Takéto peptidy sa používajú k indukcii

I nádorovo špecifickej imunitnej odozvy v tele hostiteľa, ale praktické využitie nádorovo špecifických peptidov vo vakcínach sa obmedzuje na ohraničenú časť populácie, vzhľadom k tomu, že HLA triedy I sú z hľadiska väzby peptidov úzko špecifické. Naviac je obvykle relatívne obtiažne vyvolať CTL odozvu in vivo použitím syntetických peptidov, pretože tieto látky majú malý biologický polčas, ako aj kvôli ťažkostiam s exogénnou iniciáciou molekúl MHC triedy I.

Rad iných prístupov sa zameral na vyvolanie nádorovo špecifickej imunitnej odozvy CTL, vrátane použitia cytokínov (napr. IL-2, IFN-γ, IL-6, IL-4, IL-10 alebo GM-CSF) alebo spolustimulujúcich molekúl (B7), či už v rozpustnej forme alebo expresiou transfektovanej nádorovej bunky. S rôznym úspechom sa ďalej použila imunizácia celými alogénnymi alebo autológnymi bunkami alebo nádorovými antigénmi pripravenými vo špeciálnych adjuvans určenými pre prezentáciu antigénu spôsobom prezentácie antigénu cez MHC triedy I alebo nádorovými antigénmi exprimovanými v napr. vektoroch kiahní atd. Medzi nádorovými imunológmi preto stále prevláda presvedčenie, že jedna z najlepších ciest eliminácie nádorov je vyvolať silnú špecifickú proti nádorovú odozvu CTL.

Odhliadnuc od toho, že tieto liečby sú obvykle velmi drahé a obtiažne reprodukovateľné, ukazuje sa tiež, že je ťažké získať dobrú imunitnú odozvu proti nádoru, pretože mnohé nádorové antigény sú pravé vlastné proteíny, voči ktorým sa zdá byť väčšina T buniek tolerantná. Zdá sa preto nevyhnutné indukovať v pacientovi riadený bunkový autoimunitný stav.

Podstata vynálezu

Predmetom predkladaného vynálezu je poskytnutie vylepšených spôsobov a činidiel pre indukciu imunitných reakcií v organizme hostitela proti nežiadúcim antigénom, napr. nádorovým antigénom. Ďalej je predmetom vynálezu spôsob prípravy polypeptidových analógov takýchto nežiaducich antigénov, analógov, ktoré sú schopné indukovať účinnú imunitnú odozvu práve proti nežiadúcemu antigénu.

Súhrn

Antigény sa do istej miery dogmaticky predstavujú dvomi úplne oddelenými cestami: exogénnou (trieda II) a endogénnou (trieda I) .

Stručne povedané, cudzí proteín z vonkajšieho priestoru bunky alebo z bunkovej membrány sa absorbuje na APC ako endozóme, ktorý fúzuje s intracelulárnym kompartmentom, ktorý obsahuje proteolytické enzýmy a molekuly MHC triedy II. Niektoré z produkovaných peptidov sa viažu k triede II, ktoré sa potom premiestnia do bunkovej membrány.

Pre endogénnu cestu triedy I je charakteristická prevaha prezentácie cytosolických proteínov. Predpokladá sa, že dochádza k štiepaniu sprostredkovanému proteázou a následnému transportu peptidov do endoplazmatického retikula (ER) prostredníctvom molekúl TAP umiestnených v membráne ER. V ER sa peptidy viažu k triede I a následne sa transportujú do plazmatickej membrány.

Tieto dve cesty však nie sú úplne odlišné. Napríklad je známe, že dendritické bunky, a do určitej miery makrofágy, sú schopné endocytózy (pinocytózy) extracelulárnych proteínov a následne ich prezentovať v kontexte s MHC triedy I. Skôr sa tiež ukázalo, že použitím špecifických spôsobov podania, napríklad spojením s peletkami oxidu železitého, sú exogénne antigény schopné postupovať cestou triedy I (Rock, 1996). Tento mechanizmus sa zdá byť ústredný vzhladom k dôležitosti sprievodnej expresie tak triedy I ako aj triedy II na rovnakej APC na vyvolanie klastra troch bunkových typov. Interakcie tohoto klastra troch bunkových typov navrhol Mitchison (1987) a pozdnejšie iný autori. Ukázali dôležitosť súbežnej prezentácie epitopov triedy I a triedy II na tej istej APC. Podľa nedávno opísaného mechanizmu aktivácie CTL (porovnaj Lanzavecchia: Náture, 393, 1998, 413; Matzinger:

Náture Med., 5, 1999, 616; Ridge et al.: Náture, 393, 1998,

478; Schoenberger et al.: Náture, 393, 1998, 480; Ossendrop et al. : J. Exp. Med., 187, 1998, 693 a Mackey et al.: J. Immunol., 161, 1998, 2094) sú špecializované APC prezentujúce antigén na MHC triedy II rozpoznané T pomocnými bunkami. Výsledkom je aktivácia ACP (sprostredkovaná interakciou CD40L na T pomocnej .bunke a CD40 na APC). To umožňuje APC priamo stimulovať CT lymfocyty, ktoré sa týmto aktivujú (porovnaj tiež obr. 2).

Už skôr bolo demonštrované, že vloženie cudzej MHC triedy II, ktoré obmedzuje epitop T pomocnej bunky na vlastný antigén, poskytuje antigén schopný indukovať silné odozvy krížovo reagujúcich protilátok zamerané proti nemodifikovanému vlastnému antigénu (porovnaj patent žiadateľa WO 95/05849). Ukázalo sa, že indukcia autoprotilátok je spôsobená pomocou špecifickej T bunky indukovanej vloženým cudzím epitopom.

Dospeli sme však k záveru, že modifikované vlastné antigény by mali byť schopné - pomocou vhodných adjuvans - tiež indukovať silné odozvy CTL proti vlastným epitopom obmedzeným MHC triedy I, a preto sa technológia opísaná v patente WO 95/05849 môže tiež použiť pre uskutočnenie vakcinácie proti intracelulárnym a iným bunkovým antigénom, ktorých epitopy sa prezentujú v kontexte MHC triedy I.

Technológia autovakcinácie opísaná v patente WO 95/05849 má účinok, že pri aplikácii modifikovaného vlastného antigénu na vyvolanie cesty spracovávania antigénu cez MHC triedy II, je poskytnutá pomoc .špecifickej T bunky samoreaktivným B bunkám, (porovnaj obr. 1 a Dalum I. et al.: J. Immunol., 157, 1996, 4796-4804, a tiež Dalum I. et al.: Náture Biotechnol., 17, 1999, 666-669). Bolo ukázané, že potencionálne samoreagujúce B lymfocyty rozoznávajúce vlastné proteíny sú fyziologicky prítomné u normálnych jedincov. K tomu, aby tieto B lymfocyty boli indukované k skutočnej produkcii protilátok, ktoré reagujú s relevantnými vlastnými proteínmi, je však potrebná asistencia T-pomocných lymfocytov produkujúcich cytokín (T_Hbunky alebo T_H-lymfocyty). Obyčajne sa táto pomoc neuskutoční, pretože T-lymfocyty obecne nerozoznajú epitopy T-buniek odvodené z vlastných proteínov, keď sú prezentované bunkami prezentujúcimi antigén (APC). Zavedením „cudzieho elementu do vlastného proteínu (to je zavedením imunologický signifikantnej modifikácie) sa však T-bunky rozoznávajúce cudzí prvok aktivujú práve rozpoznaním cudzieho epitopu na APC (sprvu napríklad mononukleárnej bunky). Polyklonové Blymfocyty (prezentujúce T-bunkový epitop) schopné rozpoznať vlastné epitopy na modifikovanom vlastnom proteíne si tiež internalizujú antigén a následne prezentujú jeho epitop alebo jeho epitopy cudzej T-bunky a aktivované T-lymfocyty potom zaistia cytokínovú pomoc týmto samoreaktivným polyklonovým Blymfocytom. Vzhladom k tomu, že protilátky produkované týmito polyklonovými B-lymfocytmi reagujú s rôznymi epitopmi na modifikovanom polypeptide, aj s tými, ktoré sú obsiahnuté v natívnom polypeptide, indukuje sa protilátka krížovo reaktívna s nemodifikovaným vlastným proteínom. Záverom, Tlymfocyty je možné viesť k tomu, aby jednali akoby populácia polyklonových B-lymfocytov rozpoznávala úplne cudzí antigén, aj keď vo skutočnosti len vložený epitop/epitopy je/sú cudzie pre hostiteľa. Tým sa indukujú protilátky schopné krížovej reakcie s nemodifikovanými vlastnými antigénmi.

Ako už bolo povedané,. CTL* lymfocyty tiež vyžadujú pomoc špecifickej T-bunky, ale mechanizmus tohoto procesu nie je dosial objasnený.

Predkladaný vynález vychádza z našej novej teórie, že vlastné proteíny obsahujúce cudzie epitopy MHC triedy II, následkom exogénnej absorpcie, môžu získať prístup k ceste spracovávania antigénu MHC triedy I, napríklad ceste makrofágov a dendritických .búniek. Týmto spôsobom by sa mohla indukovať silná odozva CTL proti subdominantným epitopom vo vlastnom proteíne. Alebo sa môžu aplikovať gény kódujúce modifikované nádorové antigény ako vakcíny nukleových kyselín, ktoré nakoniec tiež vedú k imunitným odozvám sprostredkovaným MHC triedy II, ako aj MHC triedy I.

Nádorové bunky sú velmi slabými bunkami prezentujúcimi antigén v dôsledku nedostatočnej expresie MHC triedy I, nedostatku spolustimulačných molekúl alebo sekrécie imunosupresívnych cytokínov apod. Použitím autovakcinačných prípravkov a vakcinačného protokolu zmieneného vyššie môže byť modifikovaný nádorový antigén prezentovaný molekulami MHC triedy I ako aj MHC triedy II na špecializovaných bunkách prezentujúcich antigén. Spoločná prezentácia subdominantných vlastných epitopov na molekulách MHC triedy I a imunodominantných cudzích epitopov na molekulách MHC triedy II by sprostredkovala priamu cytokínovú pomoc od T-pomocných buniek obmedzených aktivovanými MHC triedy I až po ČT lymfocyty obmedzené MHC triedy II (obr. 2) . Podlá nášho názoru to povedie ku špecifickému narušeniu autotolerancie T-bunky voči nádorovému antigénu, čím sa dosiahne presne to, čo vyžaduje imunoterapia rakoviny.

Záverom je možné povedať, že vakcína pripravená vyššie naznačenou technológiou indukuje odozvu humorälnych autoprotilátok so sekundárnou aktiváciou komplementu a na protilátke závislú bunkovú cytotoxickú aktivitu (ADCC) . Tiež sa očakáva, že sa indukuje odozva cytotoxickéj T-bunky namierená proti napr. nádorovo špecifickému membránovému antigénu.

Predmetom predloženého vynálezu je preto v najširšom a najobecnejšom rámci spôsob indukovania imunitnej reakcie proti polypeptidovému antigénu u živočícha, vrátane človeka, pričom zmienený polypeptidový antigén je v živočíchovi slabo imunogénny alebo neimunogénny, spôsob zahrnujúci účinnú simultánnu prezentáciu v imunologický účinnom množstve

1) aspoň jedného CTL epitopu odvodeného z polypeptidového antigénu a/alebo aspoň jedného B-bunkového epitopu odvodeného z bunkového polypeptidového antigénu a

2) aspoň jedného epitopu prvej pomocnej T-bunky (T_Hepitopu), ktorý je pre živočícha cudzí, pomocou buniek prezentujúcich antigén (APC), ktoré sú prítomné v imunologickom systéme živočícha.

Vo špecifickejšom variante nového spôsobu je predmetom vynálezu spôsob zníženia zastúpenia bunkového polypeptidového človeka, pričom zmienený je v živočíchovi slabo pomocou indukcie odozvy antigénu v živočíchovi, vrátane bunkový polypeptidový antigén imunogénny alebo neimunogénny, špecifického cytotoxického T-lymfocytu (CTL) proti bunkám nesúcim bunkový polypeptidový antigén na svojom povrchu alebo skrývajúcim bunkový polypeptidový antigén vo svojom intracelulárnom kompartmente, spôsob zahrnujúci uskutočnenie simultánnej prezentácie

1) aspoň jedného CTL epitopu odvodeného z bunkového polypeptidového antigénu a

2) aspoň jedného epitopu prvého T-pomocného lymfocytu (T_H), ktorý je pre živočícha cudzí, v živočíchovi pomocou vhodnej, bunky prezentujúcej antigén (APC) .

Súčasťou predkladaného vynálezu je tiež nová stratégia prípravy imunogénnych činidiel. Táto nová stratégia zahrnuje výber a výrobu analógov slabých bunkových antigénov, kde cieľom je zachovať podstatnú časť známych a predpovedaných CTL epitopov a súčasne zaviesť aspoň jeden cudzí T_H epitop.

Predmetom vynálezu sú ďalej určité špecifické imunogénne prípravky založené na známych nádorových antigénoch ako aj zloženie týchto prípravkov.

Konečne, predmetom vynálezu sú fragmenty nukleových kyselín, vektory, transformované bunky a iné nástroje molekulárne biologických postupov pre prípravu analógov nádorových antigénov.

Podrobný opis vynálezu

Definície

Pre objasnenie možností predkladaného vynálezu sa ďalej podrobne definuje a vysvetľuje rad pojmov používaných v predkladanom opise vynálezu a v patentových nárokoch.

„Bunkový polypeptidový antigén znamená v opise vynálezu a v patentových nárokoch polypeptid obmedzený na bunku, ktorá sa akosi vzťahuje k patologickému procesu. Okrem toho bunka prezentuje na svojom povrchu CTL epitopy polypeptidového antigénu viazaného na molekuly MHC triedy I. Bunkové polypeptidové antigény môžu byť preto skutočnými intracelulárnymi antigénmi (a tým sú nedostupné pre humorálnu imunologickú odozvu) alebo antigénmi viazanými na povrch buniek. Bunkový polypeptidový antigén môže byť produktom expresie génu vlastnej bunky, intracelulárneho parazita, vírusu alebo inej bunky. V posledne menovanou prípade je polypeptidový antigén následne spojený s bunkou, ktorá je súčasťou patologického procesu.

Výrazy „T-lymfocyt a „T-bunka sa používajú zameniteľné pre lymfocyty pochádzajúce z týmusu, ktoré odpovedajú za rôzne bunkou sprostredkované imunitné odozvy a tiež za efektorové funkcie, akou je napríklad pomocná aktivita v humorálnej imunitnej odozve. Obdobne sa výrazy „B-lymfocyt a „B-bunka používajú zameniteľné pre lymfocyty produkujúce protilátky.

„Bunka prezentujúca antigén (APC) je bunka, ktorá prezentuje epitopy T-bunkám. Typickými bunkami prezentujúcimi antigén sú makrofágy, dendritické bunky a iné fagocytické a pinocytické bunky. Malo by sa uviesť, že B-bunky tiež fungujú ako APC tým, že prezentujú T_H epitopy viazané na molekuly MHC triedy II T_H bunkám, ale keď sa obecne vo špecifikácii a v patentových nárokoch používa výraz APC, znamená to vyššie uvedené fagocytické a pinocytické bunky.

„Pomocné T-lymfocyty alebo „T_H bunky označujú CD4 pozitívne T-bunky, ktoré pomáhajú B-bunkám a cytotoxickým Tbunkám rozpoznať T_H epitopy viazané na molekuly MHC triedy II na bunkách prezentujúcim antigén.

Výraz „cytotoxický T-lymfocyt (CTL) sa použije pre CD8 pozitívne T-bunky, ktoré vyžadujú k aktivácii asistenciu T_Hbuniek.

„Špecifická imunitná odozva označuje v predkladanom kontexte polyklonovú imunitnú odozvu prevážne zameranú proti molekule alebo skupine kváziidentických molekúl alebo alternatívne proti bunkám prezentujúcim CTL epitopy molekuly alebo skupiny kváziidentických molekúl.

„Slabo imunogénny alebo neimunogénny polypetidový antigén sa tu používa na označenie polypeptidov, ktoré majú aminokyselinovú sekvenciu slabých bunkových proteínových antigénov odvodených z príslušného živočícha (napr. človeka), ale tento výraz tiež zahŕňa polypeptidy s identickou aminokyselinovou sekvenciu ako majú analógy takýchto proteínov izolovaných z iných druhov. Pod tento výraz spadajú aj formy polypeptidov, ktoré majú odlišné glykozylačné profily, pretože sa produkujú v heterológnych systémoch (napr. v kvasinkách alebo v iných než cicavčích eukaryotických systémoch expresie alebo dokonca v prokaryotických systémoch). Malo by sa však uviesť, že použitím tohoto výrazu sa ^r myslí, že diskutovaný polypeptid je obyčajne neimunogénny alebo len slabo imunogénny vo svojej prirodzenej lokalite v tele živočícha, ktorý sa má liečiť.

Výrazom „polypeptid sa v predloženom kontexte označujú tak krátke polypeptidy s 2 až 10 aminokyselinovými zvyškami, oligopeptidy s 11 až 100 aminokyselinovými zvyškami, ako aj polypeptidy s viac ako 100 aminokyselinovými zvyškami. Okrem toho sa tiež pod tento výraz zahrnujú proteíny, t.j. funkčné biomolekuly obsahujúce aspoň jeden polypeptid; keď obsahujú aspoň dva polypeptidy, môžu tvoriť komplexy viazané kovalentne alebo nekovalentne. Polypeptid (polypeptidy) v proteíne je glykozylovaný a/alebo lipidovaný a/alebo obsahuje protetické skupiny.

Výraz „subsekvencia znamená akýkoľvek spojitý úsek aspoň 3 aminokyselín alebo prípadne aspoň troch nukleotidov, odvodených priamo z prírodnej aminokyselinovej sekvencie, resp. sekvencie nukleových kyselín.

Výraz „živočích v predkladanom kontexte obecne označuje živočíšne druhy (predovšetkým cicavcov), napr. Homo sapiens, Canis domesticus atd. a nie jednotlivého živočícha. Výraz však tiež označuje populáciu takýchto živočíšnych druhov, pretože je dôležité, že všetci jednotlivci imunizovaný spôsobom podľa tohto vynálezu prechovávajú u seba v podstate rovnaký slabý bunkový polypeptidový antigén umožňujúci imunizáciu živočíchov rovnakým imunogénom (imunogénmi). Keď sa napríklad vyskytujú genetické varianty polypeptidov v rozdielnych ľudských populáciách, môže byť potrebné použiť pre tieto populácie odlišné imunogény, aby sa podarilo v každej populácii narušiť autotoleranciu voči slabému bunkovému polypeptidovému antigénu.

Výrazom „zníženie (down-regulation) bunkového polypeptidového antigénu sa v tomto dokumente rozumie pokles množstva a/alebo aktivity príslušného antigénu v živom organizme. Zníženie je možné docieliť niekoľkými mechanizmami. Najjednoduchší z nich je prostý zásah do aktívneho miesta väzbou protilátky. Do rámca predloženého vynálezu tiež spadá, že výsledkom väzby protilátky je odstránenie polypeptidu pomocou čistiacich buniek (napr. makrofágov a iných fagocytických buniek), a čo je ešte dôležitejšie, že bunky nesúce alebo skrývajúce antigén sú likvidované živočíšnymi CT lymfocytmi.

Vyjadrenie „uskutočnenie simultánnej prezentácia vhodnou APC znamená, že živočíšny imunitný systém podlieha riadenej imunitnej výzve, výsledkom ktorej je simultánna prezentácia príslušných epitopov pomocou APC. Ako sa ukáže ďalej, takéto vyprovokovanie imunitného systému sa môže uskutočniť mnohými spôsobmi, z ktorých je najdôležitejšia vakcinácia polypeptidom obsahujúcim „farmacíny (t.j. vakcína, ktorá sa podáva pre liečbu alebo na zlepšeniu prebiehajúcej choroby) alebo „farmacínom nukleovej kyseliny. Dôležité je dosiahnuť, aby sa imunitné kompetentné bunky v živočíchovy konfrontovali s APC bunkami, ktoré zobrazujú príslušné epitopy imunologický účinným spôsobom.

Výraz „imunologický účinné množstvo má bežný význam v obore, t.j. množstvo imunogénu schopné indukovať imunitnú odozvu, ktorá významne angažuje patogénnych činiteľov, ktorý sa spoločne s imunogénom podieľajú na imunologických rysoch.

Keď sa použije výraz, že sa slabé bunkové polypeptidové antigény „modifikujú, myslí sa chemická modifikácia toho polypeptidu, ktorý tvorí hlavný reťazec príslušného polypeptidu. Takouto modifikáciu môže byť napr. derivatizácia (napr.

alkylácia) kyselinovej modifikácie kyselinovej určitých sekvencii, zahŕňajú sekvencie.

aminokyselinových zvyškov v aminoako sa však ukáže ďalej, výhodné zmeny primárnej štruktúry aminoKeď sa hovorí o „tolerancii a „autotolerancii, rozumie sa tým, že priemerný jedinec v populácii nezaháji imunitnú odozvu proti polypeptidu, pretože polypeptidy, ktoré sú terčmi spôsobu podía predkladaného vynálezu, sú vlastné proteíny populácie, ktorá má byť vakcinovaná alebo proteíny, ktoré nevyvolávajú účinnú imunitnú odozvu. Nie je však možné vylúčiť, že tu a tam niektorý jednotlivci v živočíšnej populácii môžu byť schopný produkovať protilátky proti natívnemu polypeptidovému antigénu, napr. ako súčasť poruchy autoimunity. V každom prípade, obyčajne bude živočích autotolerantný len voči vlastnému polypeptidovému antigénu, ale nie je možné vylúčiť, že bude tiež tolerantný aj k analógom odvodeným z iných živočíšnych druhov alebo z populácie s rozdielnym fenotypom.

„Cudzí T-bunkový epitop je peptid schopný sa viazať na molekulu MHC a stimulovať T-bunky v živočíšnom druhu. Výhodnými cudzími epitopmi sú „promiskuitné epitopy, t.j. tie epitopy, ktoré sa viažu k prevážnej časti molekúl MHC triedy II v živočíšnom druhu alebo populácii. Týchto promiskuitných epitopov je známy len velmi obmedzený počet a budú detailne diskutované ďalej. K tomu, aby boli imunogény, ktoré sa používajú podía predloženého vynálezu, účinné v čo možná najväčšej časti živočíšnej populácie, môže byť potrebné 1) vložiť niekolko cudzích T-bunkových epitopov do jedného analógu alebo 2) pripraviť niekolko analógov, kde každý z nich má vložený iný promiskuitný epitop. Koncepcia cudzích T-bunkových epitopov zahrnuje aj použitie kryptických

T-bunkových epitopov, t.j. epitopov, ktoré sú odvodené od vlastného proteinu a ktoré sa imunologický prejavujú len vtedy, keď existujú v izolovanej forme a nie ako súčasť príslušného vlastného proteinu.

„Cudzí epitop T pomocného lymfocytu (cudzí T_H epitop) je cudzí T bunkový epitop, ktorý sa viaže na molekulu MHC triedy II a môže byť prezentovaný na povrchu bunky prezentujúcej antigén (APC) vzťahujúcej sa k molekule MHC triedy II.

„CTL epitop je peptid schopný sa viazať na molekulu MHC triedy I.

„Funkčnou časťou (bio)molekuly sa v predloženom kontexte myslí časť molekuly, ktorá je zodpovedná za aspoň jeden biochemický alebo fyziologický účinok molekuly. V obore je dobre známe, že mnoho enzýmov a iných efektorových molekúl obsahuje aktívne miesto, ktoré je zodpovedné za účinky príslušnej molekuly. Ostatné časti molekuly môžu mať stabilizačnú úlohu alebo zvyšujú rozpustnosť, a nemusia sa brať do úvahy, ak táto ich úloha nie je relevantná v kontexte určitého uskutočnenia predloženého vynálezu. Napríklad je možné použiť určité cytokíny ako modifikujúci podiel analógu (porovnaj nižšie uvedenú podrobnú diskusiu) a v tamto prípade je otázka stability nepodstatná, pretože potrebnú stabilitu' poskytuje spojenie s analógom.

Výraz „adjuvans má svoj obvyklý význam v obore vakcinačnej technológie, t.j. ide o látku alebo zmes látok, ktoré 1) nie sú samy o sebe schopné zvyšovať špecifickú imunitnú odozvu proti imunogénu vakcíny, ale ktoré 2) sú však schopné posilovať imunitnú odozvu proti imunogénu. Alebo ináč povedané, vakcinácia samotným adjuvans nemôže vyvolať imunitnú odozvu proti imunogénu, vakcinácia imunogénom môže alebo nemusí vyvolať imunitnú odozvu voči imunogénu, ale kombinovaná vakcinácia imunogénu s adjuvans indukuje imunitnú odozvu proti imunogénu, ktorá je silnejšia než odozva vyvolaná samotným imunogénom.

„Zacielenie molekuly v predloženom kontexte znamená, že sa molekula po zavedení do živočíšneho organizmu prednostne objaví v určitom tkanive (tkanivách) alebo sa prednostne spojí s určitými bunkami alebo typmi buniek. Tento účinok je možné dosiahnuť radom spôsobov, vrátane prípravy molekuly v zmesi, ktorá uľahčuje zacielenie alebo, že sa do molekuly vložia skupiny, ktoré uľahčujú zacielenie. Tieto otázky budú detailne diskutované ďalej.

„Stimulácia imunitného systému znamená, že látka alebo zmes vykazuje všeobecný, nešpecifický imunostimulačný účinok. Rad adjuvans a predpokladaných adjuvans (napr. určité cytokíny) sa podieľa na schopnosti stimulovať imunitný systém. Výsledkom použitia imunostimulačného · činidla je zvýšená „pohotovosť imunitného systému, čo znamená, že súčasná alebo následná imunizácia imunogénom indukuje podstatne účinnejšiu imunologickú odozvu v porovnaní s použitím samotného imunogénu.

Výhodné prípady uskutočnenia

Pre indukciu odozvy CTL proti bunke prezentujúcej na svojom povrchu epitopy odvodené z polypeptidového antigénu je obyčajne potrebné, aby sa aspoň jeden CTL epitop, ak je prítomný, spojil s molekulou MHC triedy I na povrchu APC. Ďalej je výhodné, aby sa aspoň jeden prvý cudzí T_H epitop, ak je prítomný, spojil s molekulou MHC triedy II na povrchu APC.

Výhodnými APC bunkami prezentujúcimi epitopy sú dendritické bunky a makrofágy, ale podľa predloženého vynálezu sa dáva prednosť pino- alebo fágocytickým APC, ktoré sú schopné simultánne prezentovať 1) CTL epitopy viazané na molekuly MHC triedy I a 2) T_H epitopy viazané na molekuly MHC triedy II.

Podľa predloženého vynálezu je bunkový polypeptidový antigén výhodne vybraný z nádorových antigénov a iných vlastných proteínov, ktoré súvisia s patologickými procesmi, ale tiež z vírusových antigénov a antigénov odvodených z intracelulárnych parazitov alebo baktérie will. V obore je dobre známe, že práve tieto patogénne antigény sú často relatívne slabými imunogénmi (napr. antigény z mykobaktérií, ako Mycobacterium tuberculosis a Mycobacterium leprae, ale tiež z prvokov, napr. Plasmodium spp.) Veríme, že spôsob podľa vynálezu, odhliadnuc od toho, že zavádza možnosť tvorby protilátky a odozvy CTL proti pravým vlastným antigénom, je schopný zvýšiť často nedostatočnú imunitnú odozvu vedenú organizmom proti takýmto intracelulárnym antigénom.

Obyčajne je výhodné konfrontovať imunitný systém s velkou frakciou aminokyselinovej sekvencie polypeptidového antigénu, ktorý je terčom vakcíny. Preto vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa prezentácia CTS epitopu a prvého cudzieho T_Hepitopu pomocou APC uskutočňuje tým, že sa živočíšnemu imunitnému systému prezentuje aspoň jeden prvý analóg bunkového polypeptidového antigénu, pričom tento prvý analóg obsahuje obmenu aminokyselinovej sekvencie bunkového polypeptidového antigénu, pričom tato obmena obsahuje aspoň CTL epitop a prvý cudzí T_H epitop. To je v kontraste napr. so stratégiou vakcinácie DNA, kde je expresia CTL a T_H epitopov na jednej a tej istej bunke, ale ako častí oddelených polypeptidov; takáto DNA stratégia vakcinácie je tiež predmetom uskutočnenia tohoto vynálezu, ale veríme, že dva epitopy ako súčasť toho istého polypeptidu obvykle zvýšia imunitnú odozvu a že každopádne bude potrebné zaistiť len jeden produkt expresie.

Pre maximalizáciu šancí zahájenia účinnej imunitnej odozvy je výhodné, aby vyššie zmienený prvý analóg obsahoval podstatný podiel známych a predpokladaných CTL epitopov bunkového polypeptidového antigénu, t.j. podiel známych a predpovedaných CTL epitopov, ktoré viažu dostatočné podiely molekúl MHC triedy I zastúpené v populácii. Napríklad je výhodné, keď podstatný podiel známych a predpokladaných CTL epitopov v aminokyselinovéj sekvencií analógu je rozpoznaný aspoň 50-tými percentami MHC-I haplotypmi, ktoré rozpoznávajú všetky známe a predpokladané CTL epitopy v bunkovom polypeptidovom antigéne, ale ešte výhodnejšie je vyššie percento, napríklad aspoň 60, 70, 80 a aspoň 90 %. Zvlášť výhodné je použitie analógov, v ktorých sú prítomné všetky známe CTL epitopy bunkového polypeptidového antigénu, t.j. blízko 100 % známych CTL epitopov. Preto je tiež zvlášť výhodné, keď v podstate všetky predpovedané CTL epitopy bunkového polypeptidového antigénu sú prítomné v aspoň prvom analógu.

Metódy prognózy prítomnosti CTL epitopov sú v obore dobré známe (porovnaj napr. Rothbard et al.: EMBO J., 7 (1988), 93100) .

Ako bude zrejmé z tejto špecifikácie a patentových nárokov, očakáva sa, že tu popisované nové spôsoby umožnia účinnú indukciu odoziev CTL proti bunkovým polypeptidovým antigénom.

V prípadoch čisto intracelulárneho bunkového polypeptidového antigénu je indukcia odoziev CTL proti bunkám skrývajúcim antigén jedinou cestou k dosiahnutiu ich zníženia špecificky imunologickými prostriedkami. V prípade membránových antigénov je však výhodné indukovať odozvu proti slabému bunkovému polypeptidovému antigénu. Keď sa však zvýši humorálna imunitná odozva proti slabému bunkovému antigénu, je výhodné podstatne obmedziť protilátkovú odozvu na interakciu s tými časťami antigénu, ktoré sú obyčajne vystavené možnej interakcii s protilátkami. Ináč by to najskôr viedlo k indukcii protilátkovej odozvy proti častiam antigénu, ktoré obyčajne nezamestnávajú humorálny imunitný systém, ale to opäť zvyšuje riziko zavedenia krížovej reaktivity s antigénmi, ktoré nemajú nič spoločného s žiadnou patológiou. Jednou elegantnou cestou k dosiahnutiu tohto obmedzenia je vakcinácia nukleovou kyselinou s analôgom slabého bunkového antigénu, ktorého extracelulárna časť je buď nezmenená alebo obsahuje T_H epitop, ktorý zásadne nemení trojrozmernú štruktúru extracelulárnej časti antigénu. Imunizácia sa môže, ako jedna možná alternatíva, uskutočniť tak s imunogénom adresovaným CTL, ako aj s imunogénom adresovaným B-bunke, pričom imunogén adresovaný B-bunke nie je v podstate schopný ovplyvniť imunizáciu proti intracelulárnej časti terčového antigénu (imunogén adresovaný B-bunke by napríklad nemusel mať žiadnu neextracelulárnu látku z antigénu).

Indukcia odozvy protilátok sa môže dosiahnuť radom spôsobov dobre známych odborníkom v technike. Napríklad aspoň jeden prvý analóg môže obsahovať časť skladajúcu sa z modifikácie štruktúry bunkového polypeptidového antigénu, pričom v dôsledku tejto modifikácie imunizácia živočícha prvým analôgom indukuje v živočíchovy tvorbu protilátok proti bunkovému polypeptidovému antigénu - tento variant je zvlášť vhodný pri vakcinácii nukleovej kyseliny, ako sa uvádza vyššie. Alternatívne môže spôsob podía tohto vynálezu zahrnovať prezentáciu imunitnému systému živočícha imunogenicky účinného množstva aspoň jedného druhého analógu bunkového polypeptidového antigénu, ktorý obsahuje takúto modifikáciu. Vyhovujúci spôsob k dosiahnutiu žiaduceho účinku modifikácie je zahrnutie aspoň jedného druhého cudzieho T_Hepitopu do druhého analógu, t.j. stratégia podobná tej, ktorá sa použila pre prvý analóg.

V prípadoch, v ktorých je žiaduce tiež zahájiť účinnú humorálnu imunitnú odozvu, je výhodné, keď prvý a/alebo druhý analóg(y) obsahuje podstatný podiel epitopov B-bunky bunkového polypeptidového antigénu, zvlášť podstatný podiel takých epitopov B-bunky, ktoré sú v prirodzenej forme antigénu v príslušnom živočíchovi extracelulárne.

Vyššie diskutované obmeny a modifikácie slabého antigénu bunkového polypeptidu sa môžu vyskytovať v rôznych formách. Je výhodné, keď obmena a/alebo modifikácia zahrnuje substitúciu a/alebo odstránenie a/alebo vloženie a/alebo adíciu aminokyseliny. Tieto základné operácie vzťahujúce sa k manipulácii, s aminokyselinovou sekvenciou by mali pokryť tak zmeny jednotlivých aminokyselín, ako aj operácie zahŕňajúce väčšie úseky aminokyselín (ako je posúvanie amínokyselinových úsekov vnútri polypeptidového antigénu; to je zvlášť zaujímavé, keď antigén je pravý intracelulárny antigén, pretože len úvahy týkajúce sa zachovania CTL epitopov sú relevantné). Pochopíme, že zavedenie jednej samotnej aminokyseliny, napr. vložením alebo odstránením, môže spôsobiť, že sa objaví cudzí T_H epitop v sekvencii analógu, t.j. objavenie sa sekvencie, ktorá viaže molekulu MHC triedy II. Väčšinou je však výhodné (a dokonca potrebné) zaviesť známy cudzí T_H epitop a takáto operácia bude vyžadovať substitúciu a/alebo vloženie kyseliny (alebo niekedy adíciu formou buď konjugácie k nosnému proteínu alebo fúzie polypeptidu pomocou metód molekulárnej biológie). Je výhodné, aby počet aminokyselinových vložení, odstránení, substitúcií alebo adícií bol najmenej 2, napríklad 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 a 25 vložení, substitúcií, adícií alebo odstránení. Ďalej je výhodné, aby počet aminokyselinových substitúcií nepresahoval 150, napríklad najviac 100, 90, 80 a najviac 70. Zvlášť je výhodné, aby počet substitúcií, vložení, odstránení' alebo adícií nepresahoval 60 a obzvlášť by počet nemal presiahnuť 50 alebo dokonca 40. . Najvýhodnejší je počet, ktorý nepresahuje 30.

Výhodné prípady uskutočnenia vynálezu zahrnujú modifikáciu zavedením prinajmenšom jedného cudzieho imunodominantného T_Hepitopu. Pochopíme, že otázka imunitnej dominancie epitopu Tbunky závisí na príslušnom živočíšnom druhu. Výraz „imunodominancia, ako je tu požitý, jednoducho označuje epitopy, ktoré u vakcinovaného jedinca alebo populácie spôsobia významnú imunitnú odozvu, ale je dostatočne známe, že epitop T-bunky, ktorý je imunodominantný u jedného jedinca, nie je nutne imunodominantný u iného jedinca toho istého druhu, aj napriek tomu, že v ňom môže byť schopný viazať molekuly MHCII. Ideálne imunodominantné T_H epitopy sú tie, ktoré nezávisle na polypeptide, na ktorom vytvárajú subsekvenciu, spôsobia aktiváciu T_H buniek - inými slovami, pravým rysom niektorých T_H epitopov je to, že v podstate nikdy nie sú skryté, pretože takmer vždy sú spracované bunkami APC a prezentované v kontexte molekuly MHC-II na povrchu APC.

Iným dôležitým bodom je problém MHC reštrikcie epitopov Tbunky. Prirodzene sa vyskytujúce epitopy T-bunky sú obecne obmedzené MHC, t.j. určité peptidy tvoriace epitop T-bunky sa účinne viažu iba k podskupine molekúl MHC triedy II. To má zase ten účinok, že v mnohých prípadoch použitie jedného špecifického epitopu T-bunky poskytne vakcinačnú zložku, ktorá je účinná iba na časť populácie a podía velkosti tejto časti môže byť potrebné začleniť viac T-bunkových epitopov do tej istej molekuly, alebo alternatívne pripraviť multikomponentnú vakcínu, v ktorej sú zložky obmenami antigénu, ktoré sú jedna od druhej odlíšitelné povahou zavádzaného Tbunkového epitopu.

Keď je MHC reštrikcia použitých T-buniek úplne neznáma (napr. pri nedostatočne definovanom zložení MHC u vakcinovaného živočícha), podiel populácie pokrytý zložením špecifickej vakcíny sa môže určiť podľa vzorca n

f popuká i=l kde pi je početnosť jedincov v populácii s odozvou na i-tý cudzí epitop T-bunky prítomný v zložení vakcíny a n je celkový počet cudzích epitopov T-bunky v zložení vakcíny. Potom vakcína, ktorá obsahuje 3 cudzie T-bunkové epitopy a má početnosť odozvy v populácii 0,8, 0,7 a 0,6 dáva

- 0,2 x 0,3 x 0,4 = 0,976

t.j. 97,6 % populácie štatisticky vykáže odozvu na vakcínu sprostredkovanú MHC-II.

Vyššie uvedený vzorec nie je upotrebiteľný v situáciách, kde je viac či menej presne známy profil MHC reštrikcie použitých peptidov. Ak napríklad určitý peptid viaže iba molekuly ludskej MHC-II kódované HLA-DR alelami DRI, DR3, DR5 a DR7, potom sa pri použití tohoto peptidu spoločne s iným peptidom, ktorý viaže zvyšné molekuly MHC-II kódované HLA-DR alelami, dosiahne 100 % pokrytie v danej populácii. Podobne, ak druhý peptid viaže len DR3 a DR5, jeho pridaním sa pokrytie danej populácie vôbec nezvýši. Ak sa výpočet citlivosti populácie založí čisto na MHC reštrikcii epitopov T-bunky vo vakcíne, potom sa podiel populácie pokrytý kompozíciou špecifickej vakcíny určí podía vzorca:

(III) kde cpj je suma početností alelických haplotypov kódujúcich MHC molekuly v populácii, ktoré viažu každý ' jeden z epitopov T-bunky vo vakcíne a ktoré náležia k j-tému z 3 známych HLA miest (DP, DR a DQ) ; v praxi sa najprv určí, ktoré molekuly MHC rozpoznajú každý epitop T-bunky vo vakcíne a potom sa tieto molekuly zaradia podía typu (DP, DR a DQ) následne sa jednotlivé početnosti odlišne zaradených alelických haplotypov sčítajú pre každý typ, čím sa získajú epi, <p₂ a φ₃.

Môže dôjsť k tomu, že hodnota pi vo vzorci II prevyšuje odpovedajúcu teoretickú hodnotu Πχ:

(IV) kde Vj je suma početností alelického haplotypu kódujúceho MHC molekuly v populácii, ktoré viažu i-tý epitop T-bunky vo vakcíne a ktoré náležia k j-tému z 3 známych HLA miest (DP, DR a DQ) . Znamená to, že u l-m populácie je početnosť respondentov f_Zbyt*. i = (Pi - Πχ)/(1- πχ) . Vzorec III je potom (V) možné previesť na tvar V:

' n f populácie = ¹ Π (¹ “ P, )+ ¹ “ Π (¹ “ ftbytk.i ) ;=i /=1 kde sa výraz 1 - f_Zbytk. í položí = 0, ak má zápornú hodnotu. Je zrejmé, že vzorec V vyžaduje, aby boli všetky epitopy z hľadiska haplotypu zmapované voči identickým skupinám haplotypov.

Keď sa teda majú vybrané T-bunkové epitopy zaradiť do analógu, je dôležité pracovať so všetkými dostupnými znalosťami o epitopoch: 1) populačná početnosť respondentov pre každý epitop, 2) údaje o MHC reštrikcii a 3) populačná početnosť relevantných haplotypov.

Existuje rad prírodných „promiskuitných T-bunkových epitopov, ktoré sú aktívne u mnohých jedincov nejakého živočíšneho druhu alebo živočíšnej populácie a ich použitie vo vakcíne je výhodné, pretože sa zníži potreba veľkého množstva rôznych analógov v jednej a tej istej vakcíne.

Promiskuitný epitop môže byť podlá vynálezu prírodné sa vyskytujúci ludský T-bunkový epitop, ako sú epitopy z tetanového toxoidu (napr. epitopy P2 a P30), záškrtový toxoid, chrípkový vírus hemaglutinínu (HA) a P. falciparum CS antigén.

V priebehu rokov sa identifikoval rad iných promiskuitných T-bunkových epitopov. Zvlášť peptidy schopné viazať vo velkom rozsahu molekuly HLA-DR kódované rozdielnymi alelami HLA-DR, ktoré všetky predstavujú možné T-bunkové epitopy pre zavedenie do analógov použitých podlá predloženého vynálezu.

Porovnaj tiež epitopy diskutované v nasledujúcich odkazoch, ktoré sú tu všetky zahrnuté ako referencie: WO 98/23635 (Frazer I.H. et al., prihlásený na univerzite v Queenslande) ; Southwood S. et al., J. Immunol. 160 (1998), 33633373; Sinigaglia F. et al., . Náture 336 (1988), 778-780;

Rammensee H.G. et al., Immunogenetics 41:4 (1995), 178-228;

Chicz R.M. et al., J.Exp. Med. 178 (1993), 27-47; Hanuner J. et al., Celí 14 (1993), 197-203; Falk K. et al.,

Immunogenetics 39 (1994), 230-242. Ďalšie odkazy sa zaoberajú tiež HLA-DQ a -DP ligandmi. Všetky epitopy zahrnuté v týchto piatych odkazoch sú relevantné ako kandidáti prírodných epitopov pre použitie v predkladanom vynáleze, pretože sa jedná o epitopy so spoločným námetom.

Alternatívne epitopom môže byť akýkolvek umelý T-bunkový epitop, ktorý je schopný viazať vo veľkom rozsahu haplotypy. V tejto súvislosti peptidy pan DR epitopu („PÄDRE) opísané v patente WO 95/07707 a v odpovedajúcom článku Alexander, J. et al., ' Immunity 1 (1994), 751-761 (obidve práce sú tu zahrnuté ako odkazy) sú zaujímavými kandidátmi na použitie podľa predloženého vynálezu. Za pozornosť stojí, že najúčinnejšie PADRE peptidy objavené v zmienených textoch nesú D-aminokyseliny s C- a N-koncami, aby sa zlepšila stabilita pri podaní. Cieľom predkladaného vynálezu je však predovšetkým začlenenie relevantných epitopov ako častí modifikovaného antigénu, ktorý by sa potom následne mal enzymaticky rozštiepiť vnútri lyzozómového kompartmentu APC, aby umožnil následnú prezentáciu v súvislosti s molekulou MHC-II, a preto nie je výhodné začleňovať D-aminokyseliny k epitopom používaným v tomto vynáleze.

Jedným zvlášť výhodným peptidom PADRE je ten, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu ÄKFVAAWTLKAAA alebo jej imunologický účinnú subsekvenciu. Tento a iné epitopy, ktoré rovnako nemajú MHC reštrikciu sú výhodné T-bunkové epitopy, ktoré by mali byť prítomné v analógoch použitých vo spôsoboch podlá tohoto vynálezu. Takéto superpromiskuitné epitopy umožnia najjednoduchšie prípady uskutočnenia vynálezu, kedy sa len jeden samotný analóg prezentuje vakcinovanému živočíšnemu imunitnému systému.

Charakteristika vyššie uvedenej obmeny alebo modifikácie výhodne zahrnuje, že:

- aspoň jeden prvý podiel je zahrnutý do prvého a/alebo druhého analógu/analógov, pričom tento prvý podiel zacieli analóg na bunku prezentujúcu antigén (APC) a/alebo

- aspoň jeden 'druhý podiel je zahrnutý do prvého a/alebo druhého analógu/analógov, pričom tento druhý podiel stimuluje imunitný systém a/alebo

- aspoň jeden tretí podiel je zahrnutý do prvého a/alebo druhého analógu/analógov, pričom tento tretí podiel optimalizuje prezentáciu analógu imunitnému systému.

funkčných a štrukturálnych rysoch týchto prvých, druhých a tretích podielov je možné povedať, že môžu byť prítomné ako postranné skupiny viazané kovalentne alebo nekovalentne k vhodným chemickým skupinám v aminokyselinovej sekvencií bunkového polypeptidového antigénu alebo v jej subsekvencii. Je dôležité, aby úseky aminokyselinových zvyškov odvodené z polypeptidového antigénu boli derivatizované bez zmeny primárnej aminokyselinovej sekvencie alebo pri najmenšom bez zavedenia zmien do peptidových väzieb medzi jednotlivými aminokyselinami v reťazci.

Podiely tiež môžu byť vo forme fúznych partnerov amino31 kyselinovej sekvencie bunkového polypeptidového antigénu. V tejto súvislosti je treba zmieniť, že obidve možnosti zahrnujú možnosť konjugácie aminokyselinovéj sekvencie k nosičovi (porovnaj nižšie uvedenú diskusiu). Inými slovami, v predloženom kontexte výraz „fúzny proteín nie je vyhradený len fúznemu konštruktu pripravenému pomocou expresie DNA fragmentu kódujúceho tento konštrukt, ale tiež konjugátu medzi dvomi proteínmi, ktoré sú spojené pomocou peptidovej väzby v následnej chemickej reakcii.

Ako už bolo povedané, analóg môže tiež zahrnovať zavedenie prvého podielu, ktorý smeruje analóg k APC alebo k Blymfocytu. Napríklad, prvý podiel môže byť špecificky viazaný partner pre B-lymfocytový špecifický povrchový antigén alebo pre APC špecifický povrchový antigén. V technike je známych vela takýchto špecifických povrchových antigénov. Podielom môže byť napríklad uhlovodík, pre ktorý existuje receptor na B-lymfocyte alebo na APC (napr. manán alebo manóza). Inokedy druhým podielom môže byť haptén. Ako prvý podiel sa tiež môže použiť fragment protilátky, ktorá špecificky rozpoznáva povrchové molekuly na APC bunkách alebo lymfocytoch (povrchovou molekulou môže byt napr. FCy receptor makrofágov a monocytov, napríklad FCy RI , alebo inokedy každý iný špecifický povrchový marker, napríklad CD40 alebo CTLA-4). Je dobré si uvedomiť, že všetky tieto príkladné zacielené molekuly sa môžu použiť ako súčasť adjuvans (viď ďalej) . CD40 ligand, protilátky proti CD40 alebo ich varianty, ktoré viažu CD40, smerujú analóg k dendritickým bunkám. Posledné výsledky súčasne ukázali, že interakcia s molekulou CD40 spôsobí, že pre získanie odozvy CTL nie sú T_H bunky podstatné. Z toho vyplýva predpoklad, že obecné použitie molekúl, ktoré viažu CD40, ako prvý podiel (alebo ako adjuvans, viď ďalej) podstatne zvýši odozvu CTL; použitie takýchto molekúl viazajúcich CD40 ako adjuvans a ako „prvých podielov vo zmysle predkladaného vynálezu považujeme za pôvodný, úplne nový prínos.

Ako alternatívu alebo doplnok k zacieleniu analógu k určitému typu bunky pre dosiahnutie zvýšenej imunitnej odozvy je možné zvýšiť úroveň citlivosti imunitného systému zahrnutím vyššie zmieneného druhého podielu, ktorý stimuluje imunitný systém. Typickými príkladmi takýchto druhých podielov sú cytokíny, proteíny tepelného šoku a hormóny, vrátane ich účinných zložiek.

Vhodnými cytokínmi pre použitie podlá vynálezu sú tie, ktoré v zložení vakcíny obvykle poslúžia tiež ako adjuvans, napr. interferón y (IFN-γ), Flt3 ligand ,(Flt3L), interleukín 1 (IL-1), interleukín 2 (IL-2), interleukín 4 (IL-4), interleukín 6 (IL-6), interleukín 12 (IL-12), interleukín 13 (IL-13), interleukín 15 (IL-15) a faktor stimulujúci granulocyto.vo-makrofágovú kolóniu (GM-CSF) ; ako druhý podiel ináč stačí aj funkčná časť cytokínovej molekuly. Otázka využitia týchto cytokínov ako adjuvans sa diskutuje ďalej.

Druhým podielom môže byť tiež toxín, ako napríklad listeriolycín (LLO) ,. lipid A a tepelne nestály enterotoxín. Zaujímavé možnosti poskytuje tiež rad mykobakteriálnych derivátov, napríklad MDP (muramyl dipeptid), CFA (úplné Freundové adjuvans) a diestery trihalózy TDM a TDE.

Vhodné proteíny tepelného šoku použité ako druhé podiely podlá tohoto vynálezu môžu byť HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 a kalretikulín (CRT).

Dôležitým prípadom uskutočnenia tohoto vynálezu je tiež možnosť zavedenia tretieho podielu, ktorý posiluje prezentáciu analógu imunitnému systému. V technike bolo opísaných niekolko príkladov tohoto princípu. Napríklad sa vie, že lipidačné ukotvenie palmitoylu v proteíne OspA Borrelia burgdorferi sa môže využiť tak, aby poskytlo seba posilujúce polypeptidy (viď napr. WO 96/40718) . Zdá sa, že lipidované proteíny tvoria štruktúry podobné micelám s jadrom skladajúcim sa z lipidačné ukotvených časti polypeptídov a zvyšných časti molekuly z neho vyčnievajúcich, výsledkom čoho sú násobné prezentácie antigénových determinantov. Toto použitie a s ním súvisiace prístupy využívajúce rôzne lipidačné ukotvenia (napr. skupiny myristylu, farnezylu, geranyl-geranylu, N-acyl diglyceridu a GPI ukotvenie) sú preto výhodnými prípadmi uskutočnenia vynálezu, zvlášť preto, že získanie takéhoto lipidačného ukotvenia v rekombinantne pripravovanom proteíne je dosť priamočiare a vyžaduje len napríklad prírodné sa vyskytujúcu signálnu sekvenciu ako fúzneho partnera pre analóg. Inou možnosťou je použitie C3d fragmentu komplementového faktoru C3 alebo samotného C3 (porovnaj Dempsey et al.: Science 271 (1996), 348-350 a Lou a Kohler: Náture Biotechnology 16 (1998), 458-462).

Je dôležité poznamenať, že pri pokuse použiť spôsob podía tohoto vynálezu proti napr. membránovo viazaným polypeptidovým antigénom, ktoré sú vystavené extracelulárnemu kompartmentu, je najvýhodnejšie, aby prvý a/alebo druhý analóg (analógy) mal celkovú terciárnu štruktúru bunkového polypeptidového antigénu. V predkladanom popise a v patentových nárokoch to znamená, že celková terciárna štruktúra tej časti polypeptidového antigénu, ktorá je extracelulárne vystavená sa zachováva, pretože, ako sa uvádza vyššie, terciárna štruktúra obligátnych intracelulárnych polypeptídov neangažuje humorálny imunitný systém. Vo skutočnosti, ako súčasť vakcinačnej stratégie je často žiaduce sa vyhnúť tomu, aby bol extracelulárnemu kompartmentu vystavený predpokladaný B-bunkový epitopu odvodený od intracelulárnej časti polypeptidových antigénov; týmto spôsobom sa minimalizujú potencionálne nepriaznivé účinky spôsobené krížovou reaktivitou s inými antigénmi.

Pre účely predloženého vynálezu je však dostačujúce, keď obmena/modifikácia (či už zaradenie, adícia, odstránenie alebo substitúcia) vedie k vzniku cudzieho T-bunkového epitopu a súčasne zachová podstatný počet CTL epitopov v polypeptidovom antigéne (a niekedy tiež podstatný počet Bbunkových epitopov).

Nasledujúci vzorec opisuje konštrukty obecne pokryté týmto vynálezom:

(MODi) _sl ( PAGel) nl (MOD₂) s2 (PAG_e2) n2........... (MOD_X) _sx (PAGex) nx (I) kde PAGei-PAG_ex sú x-té GTL a/alebo B-bunkové epitopy obsahujúce sekvencie dôležitého polypeptidového antigénu, ktoré nezávisle môžu a nemusia byť identické a ktoré obsahujú alebo neobsahujú cudzie postranné skupiny, x je celé číslo > 3, nl - nx sú x-té celé čísla > 0 (aspoň jedno > 1), MODi-MOD_x sú xté modifikácie zaradené medzi zachované epitopy a sl-sx sú xté celé čísla £ 0 (aspoň jedno je >1, keď sa žiadna postranná skupina nezaradí do sekvencií). Vymedzením obecných funkčných obmedzení imunogenity konštruktov vynález pamätá na všetky druhy permutácií pôvodnej antigénovej sekvencie aj na ich všetky modifikácie. Do vynálezu sú takto zahrnuté analógy získané vypustením častí sekvencie polypeptidového antigénu, ktoré napríklad vykazujú nepriaznivé účinky in vivo alebo vypustením častí, ktoré sú obyčajne íntracelulárne, a tak môžu spôsobiť nežiaduce imunologické reakcie (viď detailnú diskusiu ďalej).

Ďalšie rozpracovanie vyššie uvedeného princípu zahrnuje použitia CTL a/alebo B-bunkových epitopov s viac než jedným antigénom súvisiacim s patológiou. Existuje napríklad niekolko antigénov súvisiacich s rakovinou, ktoré prejavujú svoje onkogenické účinky len v mutovanej forme - príkladom sú mutované K-ras a P53, ktoré obidva patria k základným proteínom regulácie normálneho bunkového cyklu a ktoré obidva sú produktmi, expresie v absolútne normálnych bunkách. V niektorých prípadoch sa ukázalo, že CTL rozoznajú mutované peptidy z týchto antigénov. Preto je dôležité, že imunitný systém reaguje len na mutované peptidy a nie na nemutované časti, ak sa ponúka antigénová špecifická imunoterapia.

Navrhli sme stratégiu, pri ktorej sa sekvencie 8-25 aminokyselín proteínov súvisiacich s ochorením môžu použiť ako ďalšie epitopy v konštrukte autovakcíny - vo výhodnom prípade uskutočnenia vložené epitopy súčasne umožňujú vznik T_H epitopov v konečnom konštrukte, viď vyššie uvedenú diskusiu. Epitopy použité k tomuto účelu by mali obsahovať mutovanú oblasť proteínu súvisiaceho s ochorením. Použitím takéhoto prístupu by malo byť možné generovať CTL lymfocyty (a eventuálne protilátky, kde je to vhodné) len proti mutovanej forme antigénu súvisiaceho s ochorením. V prípadoch, kedy antigén súvisiaci s ochorením umožňuje tvorbu T_H epitopu, použitie skutočne cudzieho T_H epitopu sa môže úplne vynechať. Uskutočnením tohto princípu môže byť napr. vakcinácia vakcínou nukleovej' kyseliny, ktorá kódujú analóg polypeptidového antigénu (napr. Her2 alebo PSM), do ktorej sa zaraďuje aspoň jeden T_H epitop a aspoň jeden peptid odvodený z iného antigénu súvisiaceho s ochorením (napr.

peptid z mutovanej časti nejakého onkogénneho proteínu). Vo výhodnom uskutočnení sa zavedie aspoň jeden T_H epitop, ako dôsledok zavedenia peptidu.

Ďalej je výhodné, keď obmena a/alebo modifikácia obsahuje aplikovateľnú duplicitu, keď je to vhodné, aspoň jedného Bbunkového epitopu alebo aspoň jedného CTL epitopu bunkového polypeptidového antigénu. Výsledkom tejto stratégie je, že sa imunitnému systému prezentujú násobné kópie výhodných epitopických oblastí, a takto maximalizujú pravdepodobnosť účinnej imunitnej odozvy. Toto uskutočnenie vynálezu teda zužitkováva početných prezentácií epitopov odvodených z polypeptidového antigénu (t.j. vzorec I, kde sa aspoň jeden B-bunkový epitop vyskytuje vo dvoch polohách).

Tohoto účinku sa dosiahne radom postupov, napríklad jednoducho prípravou fúznych polypeptidov obsahujúcich štruktúru (PAG) _m, kde m je celé číslo > 2, a potom zavedením vyššie diskutovaných modifikácii do aspoň jednej zo sekvencií polypeptidového antigénu.

Alternatívnym uskutočnením vynálezu, ktorého výsledkom je tiež výhodná prezentácia viacerých (napr. aspoň dvoch) kópií dôležitých epitopických oblastí antigénu imunitnému systému, je kovalentné párovanie antigénu, jeho subsekvencie alebo jeho obmien s určitými molekulami. Môžu sa použiť napríklad polyméry, ako uhľovodíky, napr. dextrán (viď Lees A. et al.·. Vaccine 12 (1994), 1160-1166; Lees A. et al. : J. Tmmunol. 145 (1990), 3594-3600), ale tiež manóza a manán sú vhodnými alternatívami. Integrálne membránové proteíny z napr. E. coli a iných baktérii sú tiež užitočnými konjugačnými partnermi. Výhodnými a užitočnými konjugačnými partnermi sú aj tradičné molekuly nosičov, ako kliešťový hemokyanín (KLH), tetanový toxín, záškrtový toxín a hovädzie albumínové sérum (BSA) .

Zachovanie niekedy prospešnej podstatnej časti B-bunkových epitopov alebo dokonca celkovej terciárne štruktúry proteínu, ktorý je predmetom modifikácie, ako sa tu popisuje, je možné dosiahnuť niekoľkými spôsobmi. Jednou z možností je jednoducho pripraviť polyklonové antisérum smerované proti polypeptidovému antigénu (napr. antisérum pripravené v králikovi) a potom ho použiť ako testovací reagent (napr. v konkurenčnej ELISA) proti modifikovaným proteinom, ktoré sa produkujú. Modifikované verzie (analógy), ktoré reagujú s antisérom v rovnakom rozsahu ako polypeptidový antigén, sú považované za tie, ktoré majú zachovanú tú istú celkovú ťerciárnu štruktúru ako polypeptidový antigén, zatiaľ čo analógy vykazujúce obmedzenú (ale stále významnú a špecifickú) reaktivitu s takýmto antisérom sú považované za také, ktoré majú zachovanú podstatnú časť pôvodných Bbunkových epitopov.

Alebo sa môže pripraviť a použiť testovacia tabulka na základe výberu monoklonových protilátok reaktívnych s rozdielnymi epitopmi na polypeptidovom antigéne. Tento postup má výhodu v tom, že umožňuje 1) epitopické mapovanie príslušného polypeptidového antigénu, a 2) mapovanie epitopov, ktoré sa udržujú v pripravených analógoch.

Treťou možnosťou by samozrejme bolo vylúštiť trojrozmernú štruktúru polypeptidového antigénu alebo jeho biologicky aktívnej skrátenej časti (viď vyššie) a toto porovnať s rozriešenou trojrozmernou štruktúrou pripravených analógov. Trojrozmerná štruktúra sa môže určiť štúdiom RTG difrakcií a NMR spektroskopiou. Ďalšie informácie týkajúce sa trojrozmernej štruktúry sa môžu do istej miery získať štúdiom cirkulárneho dichroizmu, ktorého výhodou je potreba len malého množstva čistého polypeptidu (zatiaľ čo RTG difrakcia vyžaduje kryštalický polypeptid a NMR vyžaduje obstaranie izotopových variant polypeptidu) na získanie užitočných informácií o terciárnej štruktúre danej molekuly. Pre získanie rozhodujúcich údajov je však potrebná RTG difrakčná analýza a/alebo NMR spektroskopia, pretože cirkulárny dichroizmus môže poskytnúť len neprime potvrdenie správnej trojrozmernej Štruktúry prostredníctvom informácií o sekundárnych štruktúrnych prvkoch.

V súčasnosti existujú v zásade tri uskutočniteľné spôsoby ako získať prezentáciu relevantných epitopov imunitnému systému: tradičná podjednotková vakcinácia polypeptidovými antigénmi, aplikácia geneticky modifikovanej živej vakcíny a vakcinácia nukleovej kyseliny. Tieto tri možnosti sa diskutujú oddelene v nasledujúcom texte.

.1

Polypeptidová vakcinácia

Tento spôsob , vyžaduje aplikovať do príslušného živočícha imunologický účinné množstvo aspoň jedného prvého analógu a pokiaľ je to relevantné, aj imunologický účinné množstvo aspoň jedného druhého analógu. Je výhodné, keď sa aspoň jeden prvý a/alebo druhý analóg/analógy formulujú spoločne s farmaceutický, a imunologický prijateľným nosičom a/alebo vehikulom a voliteľne s adjuvans.

Pri uskutočňovaní prezentácie analógu živočíšnemu imunitnému systému pomocou jeho podania živočíchovi, prebieha príprava polypeptidu podľa obecne uznávaných princípov v technike.

Príprava vakcín, ktoré obsahujú peptidové sekvencie ako aktívne zložky, je v technike obecne dobre známa, príkladom čoho sú US patenty 4608251; 6601903; 4599231; 4599230; 4596792 a 4578770, ktoré všetky sú tu zahrnuté ako odkazy. Typicky sa tieto vakcíny pripravujú k injekčnej aplikácii buď ako roztoky alebo ako suspenzie, ale tiež sa môžu pripraviť v pevnej forme vhodnej pre rozpustenie alebo suspendovanie v kvapaline pred vlastnou aplikáciu injekcie. Preparáty môžu byť tiež emulziíikované. Aktívna imunogénna zložka sa často mieša s farmaceutický prijateľným základom, ktorý je s ňou kompatibilný. Vhodnými základmi sú napríklad voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, etanol a ich kombinácia. Naviac, ak je to žiaduce, vakcína môže obsahovať malé množstvo pomocných látok, ako sú zvlhčovadlá a emulgátory, pH pufre alebo adjuvans podporujúce účinok vakcíny (viď detailnú diskusiu o adjuvans ďalej).

Vakcíny sa obvykle aplikujú parenterálne pomocou injekcie, napríklad buď subkutánne, intradermálne, subdermálne alebo intramuskulárne. Ďalšou vhodnou aplikačnou formou sú čipky a v niektorých prípadoch orálne, . bukálne, podjazykové, intraperitoneálne, intravaginálne, análne a intrakraniálne formy. Tradičné vehikulá a nosiči pre čipky môžu zahrnovať napríklad polyalkalénové glykoly alebo triglyceridy; čipky sa môžu pripraviť zo zmesí obsahujúcich 0,5 až 10 % aktívnej zložky, výhodne 1-2 %. Orálne formy obsahujú obvykle používané základy, ako napríklad farmaceutický čistý manit, laktózu, škrob,. stearát horečnatý, sacharín sodný, celulózu, uhličitan horečnatý a pod. Tieto zmesi majú formu roztokov, suspenzií, tabliet, piluliek, kapsúl, spojito sa uvoľňujúcich látok a práškov a obsahujú 10-95 % aktívnej zložky, výhodne 25-70 %. Pre orálne prípravky je zaujímavým partnerom toxín cholery (a tiež možným konjugačným partnerom). Polypeptidy pre vakcíny môžu byť v neutrálnej forme alebo ako soli.

Farmaceutický prijateľné soli zahrnujú adičné soli kyselín (utvorené s voľnými aminoskupinami peptidu), ktoré sú pripravené s anorganickými kyselinami, ako napríklad kyselina chlorovodíková alebo fosforečná, alebo s organickými kyselinami, ako octová, šťavelóvá, vínna, mandlová a podobne. Soli tvorené s voľnými karboxylovými skupinami sa tiež môžu získať z anorganických zásad, napríklad hydroxidu sodného, draselného, amónneho, vápenatého alebo železitého a z organických zásad, ako sú izopropylamín, trimetylamín, 2etylamino etanol, histidín, prokain a podobne.

Vakcíny sa aplikujú spôsobom, ktorý odpovedá dávkovanému prípravku a v takom množstve, ktoré bude terapeuticky účinné a imunogénne. Velkosť aplikovanej dávky závisí na liečenom subjekte, vrátane napríklad schopnosti imunitného systému jednotlivca zahájiť imunitnú odozvu alebo vrátane stupňa požadovanej ochrany. Vhodné dávkovanie sa pohybuje v rozsahu niekolko stoviek mikrogramov aktívnej zložky na vakcináciu, prednostne v rozsahu okolo 0,1 až 2000 pg (dokonca sa zvažujú vyššie množstvá v rozsahu 1-10 mg), napríklad v rozsahu asi 0,5 až 1000 pg, výhodne v rozsahu 1 až 500 pg a najmä v rozmedzí 10 až 100 pg. Vhodné režimy pre prvé podanie a druhé injekcie sú tiež variabilné, ale je ich možné odhadnúť pomocou prvej aplikácie nasledovanou postupnými očkovaniami alebo inými aplikáciami.

Spôsob aplikácie sa môže široko meniť. Použiteľný je každý z obvyklých spôsobov aplikácie vakcíny. Zahrnuje orálne podanie fyziologicky prijateľnej pevnej látky alebo fyziologicky prijateľnej disperzie, parenterálne podanie, pomocou injekcie a podobne. Dávkovanie vakcíny závisí na aplikačnej ceste a bude sa meniť s vekom osoby, ktorá má byť vakcinovaná a na formulácii antigénu.

Niektoré polypeptidy vakcíny sú vo vakcíne dostatočne imunogénne, ale u niektorých iných sa zvýši imunitná odozva pridaním adjuvans. Zvlášť výhodný je adjuvans, ktorý preukázateľne uľahčuje narušenie autotolerancie k vlastným antigénom.

Sú známe rôzne spôsoby, ktorými sa docieľuje posilujúceho účinku vakcíny. Obecné princípy a spôsoby sa detailne popisujú v The Theory and Practical Application of Adjuvants, Duncan E.S. Stewart-Tull (red.), Jon Wiley & Sons, Ltd., 1995, ISBN 0-471-95170-6, a tiež v Vaccines: New Generation Immunological Adjuvats, Gregoriadis G. et al. (red.), Plénum Press, New York, 1995, ISBN 0-306-45283-9; obidve publikácie sú tu týmto zahrnuté ako odkazy.

Výhodné adjuvans uľahčujú absorpciu vakcínových molekúl APC bunkami, ako sú dendritické bunky a ich aktiváciu. Príklady, ktoré nemajú byť obmedzujúce, sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej adjuvans: zameraných na imunitu; imunomodulačné .adjuvans, · napríklad toxín, cytokín · a mykobakteriálne deriváty;' olejový prípravok; polymér; adjuvans tvoriaci micely; saponín; matrix imunostimulačného komplexu (ISCOM matrix); častice; DDA; hliníkový adjuvans; DNA adjuvans; γinulín; a obalové adjuvans. Obecne by malo byť zaznamenané, že vyššie uvedené popisy, ktoré sa týkajú zlúčenín a činidiel užitočných ako prvý, druhý a tretí podiel v analógoch tiež odkazuje mutatis mutandis na ich využitie v adjuvans vakcíny tohoto vynálezu.

Aplikácia adjuvans zahrnuje použitie činidiel ako sú hydroxid hlinitý alebo fosforečnan hlinitý (alum), obyčajne používané ako 0,05 až 0,1 percentný roztok v pufrujúcom fyziologickom roztoke, s primiešanými syntetickými polymérmi cukrov (napr. Carbopol®) používanými v 0,25 % roztoke, agregácia proteínu vo vakcíne zahrievaním pri teplote 70 101 °C po dobu od 30 sekúnd do 2 minút a tiež agregácia prostredníctvom sieťovacích činidiel. Tiež sa môže využiť agregácia k albumínu pomocou reaktivácie s protilátkami upravenými pepsínom (Fab fragmenty), zmes s bakteriálnymi bunkami, napríklad C. parvum alebo endoxíny alebo liposacharidové zložky gramnegatívnych baktérii, emulzia vo fyziologicky prijateľnom olejovom vehikule, napríklad manid monooleát (Aracel A) alebo emulzia s 20 % roztokom perfluóruhlíka (Fluosol-DA) používaným ako bloková náhrada. Prímesky s olejmi, napr. skvalénom a IFA sú tiež výhodné.

Podlá tohoto vynálezu sú zaujímavými kandidátmi na adjuvans DDA (dimetyldioktadecylamónium bromid), DNA a γ-inulín, ale tiež Freundové úplné a neúplné adjuvans, rovnako ako saponíny z druhu Quillaja, ako QuilA a QS21. Ďalšími možnosťami sú monofosforyl lipid A (MPL) a vyššie uvedené C3 a C3d.

Aj o lipozómových prípravkoch sa vie, že majú posilujúce účinky, preto patria podľa tohoto vynálezu k výhodným adjuvans.

Ďalšími výhodnými volbami adjuvans podľa tohto vynálezu sú matrixy imunostimulačných komplexov (ISCOM® matrix) zvlášť preto, že bolo ukázané, že tieto typy adjuvans sú schopné zvyšovať aktiváciu expresie MHC triedy II pomocou APC buniek. Matrix ISCOM® sa skladá z (voliteľne frakcionovaných) saponínov (triterpénoidov) z Quillaja saponaria, cholesterolu a fosfolipidu. Po zmiešaní s imunogénnym proteínom vzniká časticový prípravok, známy ako ISCOM častica, kde saponín tvorí podľa hmotnosti 60-70 %, cholesterol a fosfolipid 10-15 % a proteín 10-15 %. Detaily týkajúce sa zloženia a využitia imunostimulačných komplexov je možno nájsť v už zmienených publikáciách týkajúcich sa adjuvans, ale aj v Morein B. et al.: Clin Immunother. 3 (1995), 461-475, alebo v Bar I.G. and Mitchell G.F.: Immunol. And Celí Biol. 74 (1996), 8-25 (obidve sú tu zahrnuté ako referencie), kde sú užitočné inštrukcie k príprave úplných imunostimulačných komplexov.

Ďalšou velmi zaujímavou (a teda výhodnou) možnosťou, ako dosiahnuť posilujúceho účinku, je použitie techniky opísanej v Gosselin · et al., 1992 (ktorá je tu zahrnutá ako odkaz). Stručne povedané, prezentácia relevantného antigénu, ako je antigén predloženého vynálezu, sa môže zvýšiť konjugáciou antigénu s protilátkou (alebo antigénom, ktorý viaže fragmenty protilátky) proti Fcy receptorom na monocytoch/makrofágoch. Zvlášť u konjugátov medzi antigénom a anti-FcyRI bolo. ukázané, že zvyšujú imunogenicitu pre vakcinačné účely.

Iné možnosti sa týkajú použitia zacielených a imunomodulačných látok (t.j. cytokínov), zmienených vyššie, ako kandidátov na prvé a druhé podiely v modifikovaných analógoch. V tejto súvislosti do úvahy tiež prichádzajú syntetické činidlá indukujúce cytokíny, ako poly I:C.

Vhodné mykobakteriálne deriváty sa vyberajú zo skupiny zloženej z muramyl dipeptidov, úplného Freundovho adjuvans, RIBI a diesteru trihalózy, napríklad TDM a TDE.

Vhodnými, na imunitu zameranými adjuvans sú látky zo skupiny pozostávajúcej z CD40 ligandu a CD40 protilátok alebo ich špecificky viazaných fragmentov (porovnaj vyššie uvedenú diskusiu), manózy, Fab fragmentu a CTLA-4.

Vhodné polymérne adjuvans sú zo skupiny pozostávajúcej z uhlovodíkov, ako je dextrán> PEG, škrob, manán a manóza, plastických polymérov a latexu, ako sú latexové guličky.

Ďalším iným zaujímavým spôsobom modulácie imunitnej odozvy je začlenenie imunogénu (volitelne spolu s adjuvans a farmaceutický prijatelnými nosičmi a vehikulmi) do „virtuálnej lymfatickej uzliny (VLN) (patentované lekárske zariadenie vyvinuté ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (tenučké trubičkovité zariadenie) napodobuje štruktúru a funkciu lymfatickej uzliny. Vložením VLN pod kožu sa vytvorí lokálny sterilný zápal s prudkým vzrastom cytokínov a chemokínov. T- a B-bunky, rovnako ako APC bunky, rýchlo reagujú na signály nebezpečenstva, presťahujú sa do zapáleného miesta a hromadia sa vnútri pórovitého matrixu VLN. Ukázalo sa, že potrebná dávka antigénu na zahájenie imunitnej odozvy voči antigénu sa pri použití VLN zníži a že vakcináciou poskytnutá imunitná ochrana prevyšuje konvenčnú imunizáciu s použitím RIBI ako adjuvans. Technológia sa stručne popisuje v Gelber C. et al.: Elicitation o f Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node, v „From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12^th - 15^th 1998, Seascape Resort, Aptos, Kalifornia.

Posledné výsledky výskumu ukázali, že spolupodávanie H2 agonistov zvyšuje prežitie NK buniek a CT lymfocytov v nádore. Preto sa zvažuje zahrnúť H2 agonistov ako adjuvans do spôsobov tohoto vynálezu.

Predpokladá sa, že by sa vakcína mala aplikovať aspoň raz za rok, napríklad aspoň 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 12-krát ročne.

Špecifickejšie sa očakáva 1-12 krát ročne, napríklad 1, 2,

3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 alebo 12-krát za rok jedincovi, ktorý to potrebuje. Skôr bolo ukázané, že imunitná pamäť indukovaná použitím výhodných autovakcín podľa tohto vynálezu nie je trvalá, a preto sa imunitný systém musí periodicky podnecovať analógmi.

Vzhladom ku genetickej variabilite môže imunitný systém rôznych jedincov reagovať na ten istý peptid odlišne. Vakcína podía tohoto vynálezu preto môže zahrnovať niekolko rozdielnych polypeptídov, aby sa zvýšila imunitná odozva (porovnaj tiež vyššie uvedenú diskusiu o volbe pri zavádzaní cudzích T-bunkových epitopov). Vakcína môže obsahovať dva alebo viacej polypeptídov, ako boli definované vyššie.

Vakcíny môžu preto obsahovať 3 až 20 rôznych modifikovaných alebo nemodifikovaných polypeptídov, napríklad 3-10 rôznych polypeptídov. Obvykle je však snaha udržať počet peptidov na minimu, napríklad 1 alebo 2 peptidy.

Živé vakcíny

Druhou alternatívou, ako uskutočniť prezentáciu imunitnému systému, je technológia živej vakcíny. Pri živej vakcinácii sa prezentácia imunitnému systému uskutoční tým, že sa živočíchovi podá nepatogénny mikroorganizmus, ktorý sa transformuje fragmentom nukleovej kyseliny, ktorý kóduje potrebné epitopické oblasti alebo kompletný prvý a/alebo druhý analóg. Inou možnosťou je transformácia mikroorganizmus vektorom, ktorý obsahuje takýto fragment nukleovej kyseliny. Nepatogénnym organizmom môže byť akýkoľvek vhodne oslabený bakteriálny druh (oslabený pomocou vynechania alebo pomocou odstránenia produktov patogénnej expresie technológiou rekombinantnej DNA), napr. Myco-bacterium bovis BCG., nepatogénny Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella atd. Prehľady, ktoré pojednávajú o príprave známych živých vakcín, je možné napríklad nájsť v Saliou P.: Rev. Prat. 45 (1995), 1492-1496 a Walker P.D.:

I

Vaccine 10 (1992), 977-990, ktoré sú tu obidva zahrnuté ako odkazy. Detaily týkajúce sa fragmentov nukleových kyselín a vektorov používaných v tomto vynáleze sa diskutujú ďalej.

U polypeptidovej vakcíny môžu býť T_H epitop a/alebo prvý a/alebo druhý á/alebo tretí podiel, ak sú prítomné, vo forme fúznych partnerov aminokyselinovej sekvencie odvodenej z bunkového polypeptidového antigénu.

Ako alternatíva k bakteriálnym živým vakcínam sa môže fragment nukleovej kyseliny vynálezu, diskutovaný ďalej, začleniť do nezhubného vírusového vektora vakcíny. Jednou z možností je kiahňový vírus, napr. ovčie kiahne, MVA (modifikovaný vírus ovčích kiahní), kiahne kanárikov, vtáctva, kurčiat atd. Alebo sa môže použiť, obmena vírusu prostého oparu.

Obvykle sa-nepatogénny mikroorganizmus alebo vírus aplikuje živočíchovi iba raz, ale v niektorých prípadoch môže byť potrebná viac ako jedna aplikácia za život.

Mikroorganizmus sa tiež môže transformovať nukleovou kyselinou (kyselinami), ktorá obsahujú oblasti kódujúce prvé, druhé a/alebo tretie podiely, napr. vo forme imunomodulačných látok popísaných vyššie, ako sú cytokíny diskutované ako užitočné adjuvans. Výhodný prípad tohto uskutočnenia je, keď kódovaná oblasť pre analóg a kódovaná oblasť pre imunomodulátor majú rozdielne úseky otvoreného záznamu alebo sú aspoň riadené rozdielnymi promótormi. Tým je vylúčené, aby sa analóg alebo epitopy produkovali ako fúzny partneri k imunomodulátoru. Alebo sa ako transformačné činidlá môžu použiť dva rozdielne nukleotidová fragmenty.

Vakcinácia nukleovej kyseliny

Technológia vakcinácie nukleovej kyseliny (známa tiež ako „imunizácia nukleovou kyselinou, „genetická imunizácia, „génová imunizácia a „DNA vakcinácia) ponúka, ako alternatíva ku klasickej aplikácii peptidovej vakcíny, rad atraktívnych rysov.

Predne, na rozdiel od tradičnej vakcinácie, vakcinácia nukleovou kyselinou nevyžaduje zdroj spotrebovávajúci veľké množstvo pripravovaných imunogénnych činidiel (napríklad vo forme priemyslovo fermentovaných mikroorganizmov produkujúcich analógy potrebné k polypeptidovej vakcinácii). Okrem toho nie je potrebné zariadenie na čistenie a posttranslačnú úpravu imunogénu. A nakoniec, pretože vakcinácia nukleovou kyselinou sa opiera o biochemickú výbavu .vakcinovaného jedinca, aby produkovala expresný produkt zavedenej nukleovej kyseliny, očakáva sa, že nastane optimálna posttranslačná úprava produktu expresie; to je zvlášť dôležité pri autovakcinácii, pretože, ako sa uvádza vyššie, by sa mala zachovať podstatná časť pôvodných B-bunkových epitopov v analógoch odvodených z polypeptidových sekvencii vystavených extracelulárnemu vplyvu, a pretože B-bunkové epitopy sa spravidla môžu vytvárať z častí lubovolných (bio)molekúl (napr. uhľovodíkov, lipidov, proteínov atd.). Preto natívne glykozylačné a lipidačné profily imunogénu môžu byť dosť dôležité pre celkovú imunogenicitu a to je najlepšie zaistené hostiteľom produkujúcim imunogén.

Dôležitá forma uskutočnenie spôsobu podlá vynálezu sa preto týka uskutočnenia prezentácia tým, že sa do APC zavedie in vivo aspoň jeden fragment nukleovej kyseliny, ktorý kóduje a exprimuje aspoň jeden CTL epitop a/alebo aspoň jeden Bbunkový epitop a aspoň jeden prvý cudzí Th epitop (alternatívne sa aplikujú aspoň dva rozdielne fragmenty nukleovej kyseliny, kde jeden kóduje aspoň jeden CTL epitop a druhý aspoň jeden cudzí T_H epitop). Výhodne sa to urobí použitím fragmentu nukleovej kyseliny, ktorý kóduje a exprimuje vyššie diskutovaný prvý analóg. Ak je prvý analóg vybavený už detailne opísanými T_H epitopmi a/alebo prvým a/alebo druhým a/alebo tretím podielom, potom sú tieto vo forme fúznych partnerov k aminokyselinovej sekvencii odvodenej z bunkového polypeptidového antigénu a fragmentom nukleovej kyseliny bude kódovaný tento fúzny konštrukt.

Podobne, ako u tradičného vakcinačného prístupu, sa vakcinácia nukleovou kyselinou môže kombinovať s tým, že sa do APC zavedie in vivo aspoň jeden fragment nukleovej kyseliny, ktorý kóduje a exprimuje druhý analóg. Úvahy týkajúce sa prvého, druhého a tretieho podielu a T_H epitopov sa vzťahujú aj na tento prípad.

Zavádzanou nukleovou kyselinou je pri tejto forme uskutočnenia vynálezu výhodne DNA, ktorá môže byť vo forme prostej DNA, DNA s nabitými alebo elektroneutrálnymi lipidmi, DNA tvorenej v lipozómoch, DNA zahrnutej do vírusového vektora, DNA pripravenej s proteínom alebo polypeptidom uľahčujúcim indikáciu, DNA pripravenej s zacieleným proteínom alebo polypeptidom, DNA pripravenej s činidlami zrážajúcimi vápnik, DNA spojenej s molekulou inertného nosiča a DNA pripravenej s adjuvans. V tejto súvislosti stojí za zmienku, že prakticky všetky úvahy týkajúce sa použitia adjuvans v tradičnom vakcinačnom prípravku platia pre prípravu DNA vakcín. Preto všetky tu opísané význaky, ktoré sa týkajú použitia adjuvans v súvislosti s polypeptidovými vakcínami, platia mutatis mutandis pri ich použití v technológii vakcinácie nukleovej kyseliny. To isté platí pre ostatné úvahy týkajúce sa prípravy, formy a spôsobu aplikácie vakcíny, a preto tiež vyššie uvedené úvahy v súvislosti s tradičnou vakcináciou platia mutatis mutandis na ich použitie v technológii vakcinácie nukleovej kyseliny.

Zvlášť výhodným typom prípravku vakcíny nukleovej kyseliny sú mikročastice obsahujúce DNA. Vhodné mikročastice sú napr. opísané v WO 98/31398.

Okrem toho môže nukleová kyselina (nukleové kyseliny) použitá ako imunizačné činidlo obsahovať oblasti kódujúce prvé, druhé a/alebo tretie podiely, napr. vo forme imunomodulačných látok opísaných vyššie, napríklad cytokíny, diskutované ako užitočné adjuvans. Výhodná forma tohoto uskutočnenia je, keď kódovaná oblasť pre analóg a kódovaná oblasť pre imunomodulátor majú rozdielne úseky otvoreného záznamu alebo sú aspoň riadené rozdielnymi promótormi. Tým je vylúčené, aby sa analóg alebo epitopy produkovali ako fúzny partneri imunomodulátora. Alebo sa môžu použiť dva rozdielne nukleotidové fragmenty, ale to je menej výhodné vzhľadom k výhode, ktorú má spoločná expresia, keď sú obidve kódujúce oblasti obsiahnuté v jednej a tej istej molekule.

Obvykle sa nukleová kyselina vakcíny zavádza ako vektor, v ktorom je expresia riadená vírusovým promótorom. Detailnejšia diskusia týkajúca sa vektorov podía tohto vynálezu sa uvádza ďalej. Podrobnejšie závery týkajúce sa formy a použitia vakcín nukleových kyselín sú dostupné napr.

v Donnelly J. J. et al: Annu. Rev. Immunol. 15 (1997) , 6187648 a Donnelly J.J. et al: Life Sciences 60 (1997), 163-172. Obidva tieto odkazy sú tu zahrnuté ako odkazy.

Dôležitá časť tohoto vynálezu patrí novému spôsobu výberu vhodných imunogénnych analógov bunkového polypeptidového antigénu, ktorý je v živočíchovi slabo imunogénny alebo neimunogénny, pričom imunogénny analóg je schopný v živočíchovi indukovať odozvu CTL proti bunkám zobrazujúcim MHC molekulu triedy I viazanú na epitop odvodený z bunkového polypeptidového antigénu. Tento spôsob zahrnuje kroky:

a) identifikáciu aspoň jednej subsekvencie aminokyselinovej sekvencie bunkového polypeptidového antigénu, kde príslušná subsekvencia neobsahuje známe alebo predpokladané CTL epitopy,

b) prípravu aspoň jedného predpokladaného imunogénneho analógu bunkového polypeptidového antigénu vložením do aminokyselinovej sekvencie bunkového polypeptidového antigénu aspoň jedného pre živočícha cudzieho T_H epitopu vo vnútri aspoň jednej subsekvencie určenej v kroku a) a

c) výber analógu alebo analógov pripravených v kroku b) , u ktorých sa overila schopnosť indukcie CTL odozvy v živočíchovi.

Ináč, uvedený spôsob výberu zahrnuje prípravu fragmentu nukleovej kyseliny pre účely vakcinácie nukleovou kyselinou. Za tejto situácie sa požaduje, aby kódovaný peptid obsahoval aspoň jeden T_H epitop.

Keď je analóg odvodený z antigénu, ktorý je vystavený extracelulárnej fázy, je výhodné, aby sekvencia určená v kroku a) ďalej neobsahovala cysteínové zvyšky alebo ináč, aby T_H epitop vložený v kroku b) podstatne nemenil charakter cysteínových zvyškov. Tento prístup uľahčuje zachovanie priestorových B-bunkových epitopov vo výslednom prípravku, ktoré sú podobné B-bunkovým epitopom v slabom bunkovom polypeptidovom antigéne.

Z rovnakých dôvodov je výhodné, aby subsekvencia určená v kroku a) ďalej neobsahovala známe alebo predpokladané glyk'ozýlačné miesta alebo ináč, aby T_H epitop vložený v kroku b) podstatne nemenil glykozylačný charakter.

Určité slabé bunkové polypeptidové antigény uplatňujú nežiaduce účinky patofyziologickou funkciou. Je žiaduce, aby sa tieto účinky neprejavovali u vakcinačných prípravkov, a preto je výhodné, aby subsekvencia identifikovaná v kroku a) podstatne prispievala k patofyziologickému účinku bunkového polypeptidového antigénu a aby zavedenie T_H epitopu v kroku b) redukovalo alebo eliminovalo zmienený patofyziologický účinok. Príkladom tohto prístupu je odstránenie aktívneho miesta v enzýme, v hormóne alebo v cytokíne a jeho zámena za cudzí T_H epitop.

Ďalšia dôležitá úvaha patrí otázke imunologickej krížovej reaktivite polypeptidového produktu vakcíny s inými vlastnými proteínmi, ktoré nesúvisia s patológiou. Tejto krížovej reaktivite je lepšie sa vyhnúť, preto jedno dôležité uskutočnenie spôsobu tohto vynálezu je to, kde subsekvencia určená v kroku a) je homologická k aminokyselinovej sekvencií odlišného proteínového antigénu živočícha a kde zavedenie T_Hepitopu v kroku b) tuto homológiu reálne odstraňuje.

S týmto uskutočnením súvisí uskutočnenie, kde akékoľvek aminokyselinové sekvencie, ktoré 1) nie sú obvykle vystavené extracelulárnej fázy a 2) ktoré môžu tvoriť B-bunkové epitopy slabého bunkového polypeptidového antigénu, nie sú zachované v analógu. Môže sa to dosiahnuť výmenou takýchto aminokyselinových sekvencií za Th epitopy, ktoré netvoria Bbunkové epitopy, ich úplným odstránením alebo ich čiastočným odstránením.

Na druhej strane je výhodné, aby sa všetky „pravé Bbunkové epitopy slabého bunkového polypeptidového antigénu čo najviac zachovali, a preto dôležité uskutočnenie spôsobu výberu podlá vynálezu sa týka toho, aby zavedenie cudzieho T_Hepitopu v kroku b) malo za výsledok zachovanie podstatného podielu B-bunkových epitopov bunkového polypeptidového antigénu. Zvlášť je výhodné, keď si analóg uchová celkovú terciárnu štruktúru bunkového polypeptidového antigénu.

Príprava v kroku b) sa výhodne uskutočňuje prostriedkami molekulárnej biológie alebo syntézou peptidov v pevnej alebo kvapalnej fázy. Kratšie peptidy sa výhodne pripravujú bežnými technológiami syntézy v pevnej alebo kvapalnej fázy. Súčasný pokrok v tejto technológii však umožňuje týmito prostriedkami vyrobiť polypeptidy a proteíny v plnej dĺžke, a preto spadá do rámca predloženého vynálezu tiež príprava dlhých konštruktov syntetickými prostriedkami.

Potom, čo boli vyššie diskutovaným spôsobom identifikované užitočné analógy, je potrebné vyrábať analóg vo veľkom merítku. Polypeptidy sa pripravujú spôsobmi dobre známymi v technike.

Je to možné uskutočniť prostriedkami molekulárnej biológie, ktoré v prvom kroku zahrnujú prípravu transformovanej bunky tak, že sa do vektora zavedie šekvencia nukleovej kyseliny kódujúca analóg, ktorý bol vybraný uvedeným spôsobom, a že sa vektorom transformuje vhodná hostitelská bunka. Nasledujúcim krokom je kultivácia transformovanej bunky za podmienok ulahčujúcich expresiu fragmentu nukleovej kyseliny kódujúceho analóg bunkového antigénu a následne spätné získanie analógu z kultivačného supernatantu alebo priamo z buniek, napríklad vo forme lyzátu. Ináč sa môže analóg pripraviť vo velkom rozsahu syntézou peptidov v pevnej alebo kvapalnej fázy.

Nakoniec sa produkt môže podía zvolenej hostitelské bunky alebo podía použitej metódy syntézy podrobiť umelým posttranslačným modifikáciám. Tými môžu byť schémy „refolding (nariasenia) známe v technike, spracovanie s enzýmami (aby sa dosiahlo glykozylácie alebo odstránenie nežiaducich fúznych partnerov), chemická modifikácia (opäť je možná glykozylácia) a konjugácia, napr. s tradičnými nosičovými bunkami.

Malo by sa poznamenať,,že výhodné analógy tohoto vynálezu (a tiež relevantné analógy používané v spôsoboch tohto vynálezu) zahrnujú modifikácie, ktorých výsledkom sú peptidy aspoň zo 70 % sekvenčne identické s polypeptidovým antigénom alebo s jeho subsekvenciou o dĺžke aspoň 10 aminokyselín. Vyššia sekvenčná identita je výhodnejšie, napríklad aspoň 75 % alebo dokonca aspoň 80 % alebo 85 %. Sekvenčná identita proteínov a nukleových kyselín sa môže vypočítať ako (N_re_f-Ndi.f) * 100/N_ref, kde Ndif je celkový počet neidenťických zvyškov vo dvoch zoradených sekvenciách a N_ref je počet zvyškov v jednej zo sekvencií. Podľa toho DNA sekvencia AGTCAGTC je zo 75 % sekvenčne identická so sekvenciou AATCAATC (N_dif=2 a N_ref=8) .

Príklady špecifických cieľov pre spôsob podľa vynálezu

Ako už bolo povedané, výhodnými slabými bunkovými polypeptidovými antigénmi sú nádorové antigény. Ich zoznam, ktorý nie je obmedzujúci, uvádza nasledujúca tabulka.

Antigén Odkazy

5-a reduktáza Délos, S., Carsol, J.L., Fina, F.,

Raynaud, J.P., Martin, P.M.: 5alphareductase and 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase expression in epithelial cells from hyperplastic and malignant human prostate. Int. J. Cancer, Mar 16, 75:6 (1998), 840-846.

a -fetoproteín Esteban, C., Terrier, P., Frayssinet,

C., Uriel, J.: Expression of the a -

fetoproteín	gene in	human breast
cancer. Tumour. Biol.,	17:5 (1996),
2999-305.
Harada, Y.,	Ohuchi, N.	, Masuko, T.,
Funaki, Y.,	Mori, S .,	Satomi, S.,

Hasimoto, Y.: Characterization of a new breast cancer-associated antigén and its relationship to MUC1 and TAG-

72 antigéns.	Toho ku J. Exp. Med.,	Nov
180:3 (1996),	273-288.
Dihlmann, S.,	Amler, L.C.,	Schwab,	M.,
Wenzel, A. :	Variations	in	the
expression	of the	adenomatous
polyposis coli (APC) tumor	suppressor

9:3 (1997), 119-127.

gene in human cancer celí lines of different tissue origin. Oncol. Res.,

APRÍL

BAGE β-katenín

Bcl2

Bcr-abl (b3a2)

L.E., Sordat, B., Rimoldi, D., Tschopp, J. : APRÍL, a new ligand of the tumor necrosos factor family, stimulates tumor celí growth. J. Exp. Med., Sep 21, 188:6 (1998), 1185-1190. Bôel, P., Wildmann, C., Sensi, M.L., Brasseur, R., Renauld, J.C., Coulie, P., Boon, T and Van der Bruggen, P.: BAGE: a new gene encoding an antigén recognized on human melanomas by čytolytic lymphocytes. Immunity, 2 (1995), 167-175.

Hugh, TJ., Dillon, S.A., O'Dowd, G., Getty, B., Pignatelli, M.,Poston,

G.J., Kinsela, A.R.: beta-catenin expression in primary and metastatic colorectal carcinoma. Int. J. Cancer, Aug 12, 82:4 (1999), 504-511.

Kóty, P.P., Zhang, H., Levitt, M.L.: Antisense . bcl-2 treatment increases programmed celí death in non-small celí lung cancer celí lines. Lung Cancer, Feb 23:2 (1999), 115-127. Verfaillie, C.M., Bhatia, R., Miller, W., Mortari, F., Roy, V., Burger, S., Mc Cullough, J., Stieglbauer, K., Dewald, G.,Heimfeld, S., Miller, J.S., Mc Glave, P.B.: BCR/ABL-negative promitive progenitors suitable for.

transplantation can be selected from the marrow of most early-chronic phase but not accelerated-phase chronic myelogenous leukémia patiens. Blood,

CA-125

CASP-8/FLICE

Katepsíny

CD19

CD20

Jun 1, 87:11 (1996), 4770-4779.

Bast, R.C, Jr., Xu, F.J., Yu Y.H., Barnhill, S., Zhang, Z., Mills, G.B.: CA 125: the pást and the future. Int. J. Biol. Markers, Oct-Dec 13:4 (1998),

179-187.

Mandruzzato, S., Brasseur, F., Andry, G., Boon, T., van der Bruggen, P.: A CASP-8 mutation recognized by cytolytic T lymphocytes on a human head and neck carcinoma. J. Exp. Med., Aug 29, 186:5 (1997), 785-793.

Thomssen, C., Schmitt, M., Goretzki, L., Oppelt, P., Pache, L., Dettmar, P., Jänicke, F., Graeff, H.: Prognostic value of the cysteine proteases cathepsins B.and cathepsin L in human breast cancer. Clin. Cancer Res., Jul 1:7 (1995), 741-746. Scheuermann, R.H., Racila, E.: CD19 antigén in leukémia and lymphoma diagnosis and immunotherapy. Leuk. Lymphoma, Aug 18:5-6 (1995), 385-397. Knox, S.J., Goris, M.L., Trisler, K., Negrin, R., Davis, T., Liles, T.M., Grillo-López, A., Chinn, P., Varns, C., Ning, S.C., Fowler, S., Deb, N., Becker, M., Marquez, C., Levy, R.: Yttrium-90-labeled anti-CD20 monoclonal antibody therapy of recurrent B-cell lymphoma. Clin.

Cancer res., Mar 2:3 (1996), 457-470.

Shubinsky, G., Schlesinger, M.,

CD21

CD23

CD22

CD33

CD35

Polliack, A., Rabinowitz, R.: Pathways controlling the expression of surface CD21 (CR2) and CD23 (Fc (epsilon) IIR) proteins in human malignant B cells. Leuk. Lymphoma, May 25:5-6 (1997),

521-530.

Shubinsky, G., Schlesinger, M., Polliack, A., Rabinowitz, R.: Pathways controlling the expression of surface CD21 (CR2) and CD23 (Fc (epsilon) IIR) proteins in human malignant B cells. Leuk. Lymphoma, May 25:5-6 (1997),

521-530.

French, R.R., Penney, C.A., Browning, A.C., Stirpe, F., George, A.J., Glennie, M.'J.: Delivery of the ribosome-inactivating protein, gelonin, tolymphoma cells via CD22 and CD38 using bispecific antibodies. Br. J. Cancer, May 71:5 (1995), 986-994. Nakase, K., Kita, K., Shiku, H., Tanaka, I., Našu, k., Dohy, H., Kyo, T., Tsutani, H., Kamada, N.: Myeloid antigén, CD13,CD14, and/or CD33 expression is restricted to certain lymphoid neoplasms. Am. J. Clin. Pathol., Jun 105:6 (1996), 761-768. Yamakawa, M., Yamada, K., Tsuge, T., Ohrui, H., Ogata, T., Dobashi, M., Imai, Y.: Protection of thyroid cancer cells by complement-regulatory factors. Cancer, Jun 1 73:11 (1994),

2808-2817.

CD4 4

CD4 5

CD4 6

CD5

Naot, D., Sionov, R.V., Ish-Shalom,

D.: CD44: structure, function, and association with the malignant process. Adv. Cancer Res., 71 (1997),

241-319.

Buzzi, M., Lu, L., Lombardi, A. J. Jr., Posner, M.R., Brautigan, D.L.,

Fast, L. D., Frackelton, A.R. Jr. : Dif ferent iation-induced changes in proteintyrosin phosphatase activity and commensurate expression of CD45. in human. leukémia celí lines. Cancer Res., Jul 15, 52:14 (1992), 4027-4035. Yamakawa, M., Yamada, K., Tsuge, T., Ohrui, H., Ogata, T., Dobashi, M., Imai, Y.: Protection of thyroid cancer cells by complement-regulatory factors. Cancer, Jun 1 73:11 (1994),

2808-2817.

Stein, R., Witz, I.P., Ovadia, J., Goldenberg, D.M., Yron, I.: CD5+B cells and naturally occurring autoantibodies in cancer patiens. Clin. Exp. Immunol., Sep 85:3 (1991),

418-423.

CD52

Ginaldi, L., De Martinis, M., Matutes,

E., Farahat, N., Morilla, R., Dyer,

M.J., Catovsky, D.: Levels of expression of CD52 in normál and leukémie B and T cells: correlation with in vivo therapeutic responses to

Campath-1H. Leuk. Res., Feb 22:2 (1998), 185-191.

CD55

CD59

CDC27

CDK4

CEA (791Tgp72) Spendlove, I., Li, L., Carmichael, J.

and Durrant, L.G.: Decay accelerating factor (CD55): A target for cancer vaccine? Cancer Res., 59 (1999), 22822286.

Jarvis, G.A., Li, J., Hakulinen, J., Brady, K.A., Nordling, S., Dahyia, R., Meri, S.: Expression and function of the complement membráne attack complex inhibitor protectin (CD59) in human prostate cancer. Int. J. Cancer, Jun 11, 71:6 (1997), 1049-1055.

Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A. C., Topalian, S.L., Rosenberg, S.A.: Cloning genes encoding MHC class IIrestricted antigens: mutated CDC27 as a tumor antigén. Science, May 21, 284:5418 (1999), 1351-1354.

Wôlfel, T., Hauer, M., Schneider, J., Serrano, M., Wôlfel, C., KlehmannHieb, .E., de Plaen, E.,Hankeln, T., Meyer zum Btischenfelde, K., and Beach, D. : A pl6lNK4a-insensitive CDK4 mutant targeted by cytolytic T lymphocytes in a. human melanoma. Science, Sep 1, 269:5228 (1995), 1281-1284.

Kass, E., Schlom, J., Thompson, J,, Guadagni, F., Graziano, P., Greiner, J.W. : Induction of protective host immunity to carcinoembryonic antigén (CEA), a self-antigen in CEA transgenic mice, by immunizing with a recombinant vaccinia-CEA virus. Cancer c-myc

Cox-2

DCC

DcR3

E6 / E7

Res., Feb 1, 59:3 (1999), 676-683. Watson, P.H., Pon, R.T., Shiu, R.P.: Inhibition of c-myc expression by phpsphorothioate antisense oligonucleotide identifies a critical role for c-myc in the growth of human breast cancer. Cancer Res., Aug 1, 51:15, (1991), 3996-4000.

Tsujii, M. et al.: Cycloxygenase regulates antiogenesis induced by colon cancer cells. Celí, 93 (1998),

705-716.

Gotley, D.C., Reeder, J.A., Fawcett, J., Walsh, M.D., Bates, P., Simmons, D.L., Antalis, T.M.: The deleted in colon cancer (DDC) gene i.s consistently expressed in colorectal cancers and metastases. Oncogene, Aug 15, 13:4 (1996), 787-795.

Pitti, R. et al.: Genomic amplif ication of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer. Náture, .396 (1998), 699-703.

Steller, M.A., Zou, Z., Schiller, J.T., Baserga, R.: Transformation by human papillomavirus 16 E6 and E7: role of the insulin-like growth factor 1 receptor. Cancer Res., Nov 1, 56:21 (1996), 5087-5091.

Yang, X.D., Jia, X.C., Corvalan, J.R.,

Wang, P., Davis, C.G., Jakobovits, A.:

Eradication of established tumors by a fully human monoclonal antibody to the

EGFR

ΕΜΒΡ

Ena78 farsyl transferáza

FGF8b a FGF8a

FLK-l/KDR epidermal growth factor receptor without comcomitant chemotherapy. Cancer Res., 59 (6), 1999, 1236-1243. Shiina, H., Igawa, M., Ishibe, T.: Clinical study on estramustine binding protein (EMBP) in human prostate. Prostate, Sep29:3 (1996), 169-176. Arenberg, D.A. et al.: Epithelialneutrophil activating peptide (ENA-78) is an important angiogenic factor in

non-small	celí lung cancer.	J.	Clin.
Invest.,	102 (1998), 465·	-472.
Dorkin,	TJ., Robinson,	M.C.	Z	Marsh,
C.,
Bjartell,	A., Neal, D.E.	, Leung,	H.Y. :
FGF8 over-expression	in	prostate

cancer is associated with decreased patient survival and. persists in androgen independent disease. Oncogene, Apr 29, 18:17 (1999), 27552761.

Fong, T. Annie, T. et al.: SU5416 is a potent and selective inhibítor of the vascular endothelial growth factor receptor. (Flk-1/KDR) that inhibits tyrosine kinase catalysis, tumor vacularization and growth of multiple tumor type. Cancer Res., 59 (1999),

99-106.

Kys. listová

Dixon, K.H., Mulligan, T., Chung,

K.N., Elwood, P.C., Cowan, K.H.:

Effects of folate receptor expression following stable -transfection into

G250

Skupina GAGE

Gastrín 17 wild type and methotrexatetransport deficient ZR- human breast cancer cells. J. Biol. Chem._z Nov 25, 267:33 (1992), 24140-24147.

Divgi, C.R., Bander, N.H., Scott, A.M., O'Donoghue, J.A., Sgouros, G., Welt, S., Finn, R.D., Morrissey, F., Capitelli, P., Williams, J.M., Deland, D., Nakhre, A., Oosterwijk, E., Gulec, S.,Graham, M.C., Larson, S.M., Old, L.J.: Phase I/II radioimmunotherapy trial with iodine-131-labeled monoclonal antibody G250 in metastatic renal celí carcinoma. Clin. Cancer Res., Nov 4:11 (1998), 2729-2739.

De Backer, O., 10 others,Boon, T., van der Bruggen, P.: Characterization of the GAGE genes that are expressed in various human cancers and in normál testis. Cancer Res., Jul 1:59 (13) (1999), 3157-3165.

Watson, S.A., Michaeli, D., Grimes,

S., Morris,	T.M.,	Crosbee, D.,
Wilkinson,	M.,	Robinson, ' G.,
Robertson,	J.F.,	Steele, R.J.,
Hardcastle,	J.D. :	Anti-gastrin
antibodies	raised	by gastrimmune
inhibit growth of the	human colorectal
tumour AP5.	Int. J.	Cancer, Apr 10,

Hormón uvolňujúci Gastrín

61:2 (1995), 233-240.

Wang, Q.J., Knezetic, J.A., Schally,

A.V., Pour, P.M., Adrián, T.E.:

(Bombesin)

GD2 / GD3

GM2

GnRH

GnTV

Bombesin may> stimulate proliferation of human pancreatic cancer cells through an autocrine pathway. Int. J. Cancer, Nov 15, 68:4 (1996), 528-534.

Wiesner, D.A., Sweeley, C.C. : Circulating gangliosides of breastcancer patiens. Int. J. Cancer, Jan 27, 60:3 (1995), 294-299.

Bahk, J. Y., Hyun, J. S., Lee, H., Kim, M.O.,Cho, G.J., Lee, B.H., Choi, W.S.: Expression of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and GnRH receptor mRNA in prostate'cancer cells and effect of GnRH on the proliferation of prostate cancer cells. Urol. Res., 26:4 (998), 259-264.

Hengstler, J.G., Arand, M., Herero, M.E.,Oesch, F.: Polymorphism of Nacetyltransferases, glutathione, Stransferases, microsomal epoxide hydrolase and sulfotransferases: influence of cancer susceptibility. Recent Results Cancer Res., 154 (1998), 47-85.

GP1 gplOO/Pmel g

Wagner, S.N., Wagner, C.,

Schulterwolter, T., Goos, M.: Analysis of Pmel 17/gpl00 expression in primary human tissue specimens: implications for melanoma immuno- and gene-therapy. Cancer Immunol. Immunother., Jun 44:4 (1997), 239-247.

Kirkin, A.F., Dzhandzhugazyan, K.,

Zeuthen, J.:

gp-100-in4

Melanoma-associated gpl5 gp75 / TRP-1 antigens recognized by cytotoxic Tlymphocytes. APMIS, Jul 106:7 (1998),

665-679.

Maeurer, M. J. et al.: New treatment options for patients with melanoma: review of melanoma-derived T-cell epitope-based peptide vaccines.

Melanoma Res., Feb 6 (1), 1996, 11-24. Lewis, J.J., Houghton, A.N.: Definition of tumor antigens suitable for vaccine construction. Semin. Cancer Biol., Dec 6:6 (1995), 321-327.

hCG

Hoermann, R., Gerbes, A.L., Spoettl,

G., JUungst, D., Mann, K.: Immunoreactive human chorionic gonadotropin and its free beta subunit in sérum and ascites of patiens with malignant tumors. Cancer Res., Mar 15,

52:6 (1992), 1520-1524.

Heparanáza

Vlodavsky, I., Friedmann, Y., Elkin, M., Aingorn, H., Atzmon, R., IshaiMichaeli, R., Bitan, M., Pappo, O., Peretz, T., Michal, I., Spector, L., Pecker, I.: Mammalian heparanase:

gene cloning, expression and function in tumor progression and metastasis (viz poznámky). Nat.Med., Jul 5:7 (1999), 793-802.

Her2 / neu

6:6 (1995), 321-327.

Lewis, J.J., Houghton, A.N.: Definition of tumor antigens suitable for vaccine cinstruction. Semin. Cancer Biol., Dec

HMTV

Hsp70 hTERT(telomeráza)

IGFR1

IL-13R

ÍNOS

Kahl, L.P., Carroll, A.R., Rhodes, P., Wood, J., Read, N.G.: An evaluation of the putative human mammary tumour retrovirus associated with peripheral blood monocytes. Br. J. Cancer, Apr 63:4 (1991), 534-540.

Jaatela, M. et al.: Hsp70 exerts itsanti-apoptotic function downstream of caspase-3-like proteases. EMBO J., Nov 2, 17(21), 1998, 6124-6134. Vonderheide, R.H., Hahn, W.C.,

Schultze, J.L., Ňadier, L.M.:The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated antigén recognized by cytotoxic Tlymphocytes. Immunity June, 10 (1999),

673-679.

Ellis, M.J. et al.: Insulin-like growth factors in human breast cancer. Breast Cancer Res. Treat., 52 (1998), 175-184. Murata, T., Obiri, N.I., Debinski, W., Puri, R.K. : Structure of IL-13 receptor: analysis of subunit composition in cancer and immune cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., Sep 8, 238:1 (1997), 90-94.

Klotz, T., Bloch, W., Volberg, C., Engelmann, U., Addicks, K.: Selective expression of inducible nitric oxide synthase in human prostate carcinoma. Cancer, May 15, 82:10 (1998), 18971903.

Ki 67

KIAA0205

Gerdes, J., Schwab, U., Lemke, H. a Stein, H. : Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigén associated with celí proliferation. Int. J. Cancer, 31 (1983), 13-20.

Gueguen, M., Patard, J.J., Gaugler, B., Brasseur, F., Renauld, J.C., Van Cangh, P.J., Boon, T., Van den Eynde, B.J.: An antigén recognized by autologous CTLs on a human bladder carcinoma. J. Immunol., Jun 15, 160:12 (1998), 61886194.

K-ras,H-ras,N

ras Abrams,	S.I.,	Hand, P.H., Tsang K. Y.,
Schlom,	J.:	Mutant ras epitopes as
targets	for	cancer vaccines. Semin.

KSA (C017-1A)

LDLR-FUT

Oncol., Feb 23:1 (1996), 118-134.

Zhang, S., Zhang, H.S., Reuter, V.E., Slovin, S.F., Scher, H.I., Livingston, P.O.: Expression of potential target antigens for immunotherapy on primary and matastatic prostate cancers. Clin. Cancer Res., Feb 4:2 (1998), 295-302. Caruso, M.G., Osella, A.R.,

Notarnicola, M., Berloco, P., Leo, S., Bonfiglio, C., Di Leo, A.: Prognostic value of low density lipoprotein receptor expression in colorectal carcinoma. Oncol. Rep., Jul-Aug 5:4 (1998), 927-930.

Marchand, M. et al.: Tumor regressions observed in patients with (MAGE1,

MAGE3) metastatic melanoma

Skupina MAGE

Mammaglobín

Mapl7

Melan-A / MART-1

Mezotelín

MIC A/B

MT-MMP, ako napr. MMP2, MMP3, MMP7 treated with an antigenic peptide encoded by Gene MAGE-3 and presented by HLA-A1. Int. J. Cancer, Jan 18:80

S., Darrow, Persio, J., (2), 1999, 219-230.

Watson, M.A., Dintzis,

C.M., Voss, L.E., . Di

Jensen, R., Fleming, T.P.: Mammaglobin expression in primary, metastatic and occult breast cancer. Cancer Res., Jul

1, 59:13 (1999), 3028-3031.

Kocher, O., Cheresh, P., Lee, S.W.: Identification and partial characterization of a novel membraneassociated protein (MAP17) up-regulated in human carcinomas and modulating celí replication and tumor growth. Am. J. Pathol., Aug 149:2 (1996), 493-500. Lewis, J.J., Houghton, A.N.: Definition of tumor antigens suitable for vaccine construction . Semin. Cancer Biol., Dec 6: (1995), 321-327.

Chang, K. et al.: Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigén present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Jan 9:93 (1), 1996, 136-140. Groh, V., Steinle, A., Bauer, S. a Spies, T.: Recognition of stressinduced MHC molecules by intestinal epithelial gammadelta T cells. Science,

279 (1998), 1737-1740.

Sato, H., Seiki, M.: Membrane-type matrix metalloproteinases in a MMP9

Moxl

Mucin ako napr. MUC-1, MUC-2, MUC-3 a MUC-4

MUM1

NY-ESO-1

Osteonektín

Tumormetastasis (MT-MMPs). J.

Biochem. (Tokyo) , Feb 119 (2), 1996, 209-215.

Candia, A.F., Hu, J., Crosby, J., Lalley, P.A., Noden, D.,Nadeau, J.H., Wright, C.V.: Mox-1 and Mox-2 define a novel homeobox gene subfamily and are differentially expressed during early mesodermal patterning in mouse embryos. Development, Dec 116:4 (1992), 1123-1136.

Lewis,J.J., Houghton, Α.Ν.: Definition of tumor antigens suitable for vaccine construction. Semin. Cancer Biol., Dec 6:6 (1995), 321-327.

Kirkin, A.F., Dzhandzhugazyan, K., Zeuthen, J. : Melanoma- associated antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes. APMIS, Jul 106:7 (1998), 665-679.

Jáger, E. et al·.: Simultaneous humoral and cellular immune response against cancer-testis antigén NY-ESO-1: definition of human histocompatibility leukocyte antigén (HLA)-A2-binding peptide epitopes. J. Exp. Med., 187 (1998), 265-270.

Graham, J.D., Balleine, R.L., Milliken, J.S., Bilous, A.M., Ckarke, C.L.: Expression of osteonectin mRNA in human breast tumours is inversely correlated with oestrogen receptor p 15

P170 / MDR1 p53 p97 / melanotransferín

PAI-1 content. Eur. J. Cancer, Sep 33:10 (1997), 1654-1660.

Yoshida, S., Todoroki, T., Ichikawa, Y., Hanai, S., Suzuki, H., Hori, M., Fukao, K., Miwa, M., Uchida, K.: Mutations of pl6Ink4/CDKN2 and pl5Ink4B/MTS2 genes in biliary tract cancers. Cancer Res., Jul 1, 55:13 (1995), 2756-60.

Trock, B.J., Leonessa, F., Čiarke, R.: Multidrug resistance in breast cancer: a meta-analysis of MDRl/gpl70 expression and its possible functional significance. J. Natl. Cancer ínst., Jul 2, 89:13 (1997), 917-931.

Roth, J., Dittmer, D., Rea, D.,

Tartaglia, J., Paoletti, E., Levine, A.J.: p53 as a target for cancer vaccines: recombinant canarypox vírus vector expressing p53 protect mice against lethal tumor celí challenge. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, May 14, 93:10 (1996), 4781-4786.

Furukawa, K.S., Furukawa, K., Reál,

F.X., Old,L.J., Lloyd, K.O.: A unuque antigenic epitope of human melanoma is carried on the common melanoma glycoproteingp95/p97. J. Exp. Med., eb 1, 169:2 (1989), 585-590.

Grondahl-Hansen, J., Christensen,

I.J., Rosenquist, C., Brunner, N., Mouridsen, H.T., Dano, K., BlichertToft, M. : High levels of urokinaseΊΟ

PDGF

Plazminogén (uPA)

PRÁME

Probazín

Progenipojetín PSA type plasminogen activator and its inhibítor PAI-1 in cytosolic extracts of breast carcinomas are associated with poor prognosis. Cancer Res., Jun

1, 53:11 (1993), 2513-2521.

Vassbotn, F.S., Andersson, M., Westermark, B., Heldin, C. H., Ostman, A. : Reversion of autocrine transformation by a dominánt negatíve platelet-derived growth factor mutant. Mol.' Celí Biol., Jul 13:7 (1993),

4066-4076.

Naitoh, H., Eguchi, Y., Ueyama, H., Kodama, M., Hattori, T.: Localization of urokinase-type plasminogen activator inhibitor-1, 2 a plasminogen in colon cancer. Jpn. J. Cancer Res., Jan 86:1 (1995), 48-56.

Dzhandzhugazyan, K., Melanoma-associated antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes. APMIS, Jul 106:7 (1998),

665-679.

Kirkin, A.F., Zeuthen, J.

Matuo, Y., Nishi, N., Muguruma, Y., Yoshitake, Y., Kurata, N., Wada, F.: Localization of prostatic basic protein („probasin) in the rat prostates by use of monoclonala antibody. Biochem. Biophys. Res. Commun., Jul 16, 130:1 (1985), 293300.

Sanda, M.G., Smith, D.C., Charles,

L.G., Hwang, C., Pienta, K.J., Schlom,

PSM

RAGE-1

Rb

RCAS1

J., Milenic,D., Panicali, D., Montie, J. E.: Recombinant vaccinia - PSA (PROSTVAC) can induce a prostatespecific immune response in androgenmodulated human prostate cancer. Urology, Feb 53:2 (1999), 260-266. Kawakami, M., Nakayama, J.: Enhanced expression of prostate-specific membráne antigén gene in prostate cancer as revealed by in situ hybridization. Cancer Res., Jun 15, 57:12 (1997), 2321-2324.

Gaugler, B., 7 ostatní ch, Van den

Eynde, B.J.: A new gene coding for an antigén recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on a human renal carcinoma. Immunogenetics, 44(5), 1996, 323-330.

Dosaka-Akita, H., Hu, S.X., Fujino, M., Harada, M., Kinoshita, I.,. Xu,

H. J., Kuzumaki, N., Kawakami, Y., Benedict, W.F.: Altered retinoblastoma protein expression in nonsmall celí lung cancer: its synergistic effects with altered ras and p53 protein status on prognosis. Cancer, Apr 1, 79:7(1997), 1329-1337.

Sonoda, K., Nakashima, M., Kaku, T., Kamura, T., Nakano, H., Watanabe, T.: A novel tumor-associated antigén expressed in human uterine and ovarian carcinomas. Cancer, Apr 15, 77(8),

1996, 1501-1509.

SART-1

Kikuchi M., Nakao, M., Inoue, Y., Matsunaga, K., Shichijo, S., Yamana,

H., Itoh, K·: Identification of a SART-l-derived peptide capable of inducing HLA-A24-restricted and tumorspecific cytotoxic T lymphocytes. Int. J. Cancer, May 5, 81:3 (1999), 459466.

Skupina SSX génu

Gure, A.O., Tuureci, 0., Sahin, U., Tsang, S., Scanlan, M.J., Jäger, E., Knuth, A., Pfreundschuh, M., Old, L.J., Chen, Y.T.: SSX: a multigene family with several .members transcribed in normál testis and human cancer. Int. J. Cancer, Sep 17, 72:6

S TAT 3

STn(skup.mucínu) (1997), 965-971.

Bromberg, J.F., Wrzeszczynska, M.H., Devgan, G., Zhao, Y., Pestell, R.G., Albanese, C., Darnell, J.E. Jr.: Stat3 as an oncogene. Celí, Aug 6, 98(3) , 1999, 295-303.

Sandmaier, B.M., Oparin, D.V.,

Holmberg, L.A., Reddish, M.A., macLean, G.D., Longenecker, B.M.: Evidence of a cellular immune response against sialyl-Tn in breast and ovarian cancer patients after highdose chemotherapy, stem celí rescue, and immunization with Theratope STnKLH cancer vaccine. J. Immunother, Jan

TAG-72

22:1 (1999), 54-66.

Kuroki, M., Fernsten, P.D.,

Wunderlich, D., Colcher, D., Simpson,

TGF-α

TGF-β

J.F., Poole, D.J., Schlom, J.: Serological mapping of the TAG-72 tumor-associated antigén using 19 distinct monoclonal antibodies. Cancer Res., Aug 15, 50:16 (1990), 4872-4879. Imanishi, K., Yamaguchi, K., Suzuki, M., Honda, S., Yanaihara, N., Abe, K.: Production of transforming growth factor-'alpha in human tumour celí lines. Br. J. Cancer, May 59:5 (1989),

761-765.

Picon, A., Gold, L.I., Wang, J., Cohen, A., Friedman, E.: A subset of metastatic human colon cancers elevated growth

Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., Jun 7:6 (1998), 497-504.

Bao, L., Loda, .M., Janmey, P.A., Stewart, R., Anand-Apte, B., a Zetter, B.R.: Thymosin beta 15: a novel regulátor of tumor celí upregulated in metastatic cancer. Náture Medicíne 2(12), 1996,

1322-1328.

Moradi, M.M., Carson, L.F., Weinberg, A.F., Twiggs, L.B.,

S.: Sérum and ascitic of interleukin-1,

Tymozín β 15 levels of factor betal.

expresses transforming

TNF- a motility prostate

B., Haney, Ramakrishnan, fluid levels interleukin-6 and tumor necrosos factor-alpha in patiens with ovarian epithelial cancer. Cancer, Oct 15,

72:8 (1993), 2433-2440.

ΤΡΑ

ΤΡΙ

TRP-2

Týrozináza

VEGF

ZAG

Maulard, C., Toubert, M.E., Chretien, Y., Delanian, S., Dufour, B., Housset, M.: Sérum tisue polypeptide antigén (S-TPA) in bladder cancer as a tumor marker. A prospective study. Cancer, jan 15, 73:2 (1994), 394-398.

Nishida, Y., Sumi, H., Mihara, H.: Athiol prothease inhibitor released from cultured human malignant melanoma cells. Cancer Res., Aug 44:8 (1984),

3324-3329.

Parkhurst, M.R., Fitzgeald E.B., Southwood, S., Sette, A., Rosenberg S.A., Kawakami, Y.: Identification of a shared HLA-A*0201-restricted T-cell epitope from the melanoma antigén tyrosinase-related protein 2 (TRP2). Cancer Res., Nov 1, 58:21 (1998),

4895-4901.

Kirkin, A.F., Dzhandzhugazyan, K., Zeuthen, J.: Melanoma-associated antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes. APMIS, Jul 106:7 (1998),

665-679.

Hyodo, I., Doi, T., Endo, H., Hosokawa, Y., Nishikawa, Y., Tanimizu, M., Jinno, K., Kotani, Y.: Clinical significance of plasma vascular endothelial growth factor in gastrointestinal cancer. Eur. J. Cancer, Dec 34:13 (1998), 2041-2045. Sanchez, L.M., Chirino, A.J.,

Bjorkman, P.J.: Crystal structure of pl6lNK4

Glutatión S-transferáza human ZAG, a fat-depleting factor related to MHC molecules. Science, 19, 283 (5409),1999, 1914-1919.

Quelle, D.E., Ashmun, R.A., Hannon,

G. J., Rehberger, P.A., Trono, D., Richter, K.H., Walker, C., Beach, D., Sherr, C.J., Serrano, M.: Cloning and characterization of murine pl6INK4a and pl5INK4b genes. Oncogene, Aug 17, 11(4), 1995, 635-645.

Hengstler, J.G., Arand, M., Herrero,

M.E., Oesch, F.: Polymorphisms of Nacetyltransferases, glutathione Stransfeŕases, microsomal epoxide hydrolase ainfluence on cancer susceptibility. Recent Results Cancer Res., 154 1998, 47-85.

V nasledujúcej časti sa podrobne popisuje rad špecifických nádorových antigénov.

Špecifický membránový antigén prostaty, PSM

V USA je rakovina prostaty druhou najrozšírenejšou príčinou úmrtia následkom rakoviny (približne 40 000 ročne), a 200 tisíc pacientov ročne je diagnostikovaných (Boring 1993) . Asi každý jedenásty muž ochorie rakovinou prostaty. Okrem toho sa približne u 40 - 60 % pacientov rakoviny prostaty nakoniec choroba rozšíri mimo oblasť prostaty (Babaian 1994) . Hlavnou stratégiou v predkladanom vynáleze je využitie terapeutickej vakcinácie ako doplnkovej liečby k prostatektómii, aby sa eliminovalo reziduálne nádorové tkanivo a metastáze.

Niektoré patologické stavy sa lokalizujú v predstojnej žľaze, vrátane benígneho rastu (BPH), infekcie (prostatitis) a neoplazie (rakovina prostaty).

Biologická agresívnosť rakoviny prostaty je premenlivá. U niektorých pacientpv zostáva objavený nádor latentným histologickým tumorom a nikdy sa nestane klinicky významný. U iných pacientov nádor rýchlo rastie, metastázuje a zahubí pacienta v relatívne krátkom čase (2-5 rokov).

Bežnou primárnou liečbou rakoviny prostaty je prostatektómia. Vzhladom k rozsiahlemu rozptylu rakovinných buniek sa však väčšina pacientov s rakovinou prostaty nelieči lokálnym chirurgickým zákrokom. Pacienti s neohraničenou chorobou sa nakoniec liečia systémovou abláciou androgénu, ale ročná úmrtnosť v dôsledku rakoviny prostaty vôbec neklesla v priebehu 50 rokov, od kedy sa ablácia androgénu stala štandardnou terapiou metastazujúcej choroby.

PSM je membránový proteín vysoko špecifický pre prostatické tkanivá, tak benígne ako aj malígne, napriek tomu bola expresia PSM pozorovaná tiež v iných tkanivách, napríklad v obličkovom tkanive a v obličkových tumoroch, v tenkom čreve, v mozgu a v nádorových neovaškularizáciach. Preto, aj keď bola operácia úspešná, by sa u pacientov s odstránenou predstojnou žľazou mohla teoreticky prejaviť expresia PSM na reziduálnom nádorovom tkanive prostaty alebo v metastázach vzniklých z tohoto nádoru. Od vyvolania silnej CTL odozvy a/alebo silnej polyklonovej protilátkovej odozvy proti PSM sa očakáva eliminácia reziduálneho nádorového tkaniva.

Je zaujímavé, že po deprivačnej terapii androgénu pacientov s rakovinou prostaty je následne pozorovaná zvýšená aktivácia expresia PSM (Wright 1996) . Tým by sa po deprivačnej terapii androgénu stala liečba zameraná na PSM velmi vhodnou.

Prvý raz bol PSM identifikovaný v roku 1987 ako výsledok výroby monoklonovej protilátky 7E11-C5.3, použitej proti izolovanej ludskej bunke rakoviny prostaty LNCaP (Horoszewicz 1987). Protilátka rozpoznala tak normálny ako aj malígny prostatický epitel a použila sa v roku 1993 na čistenie a určenie aminokyselinovej sekvencie proteínu PSM a konečne na klonovanie génu (Israeli 1993) .

PSM je transmembránový glykoproteín typu II s molekulovou hmotnosťou 84 kD, ako sa predpokladá zo sekvencie nukleovej kyseliny, zatial čo glykozylovaná forma má pozorovanú molekulovú hmotnosť 100 - 120 kD. Sekvenovanie génu kódujúceho PSM odkrylo predpokladanú membránovú oblasť v súvislosti s tromi zvyškami cytosolického arginínového ukotvenia. Extracelulárnu časť PSM'tvorí 707 z celkových 750 aminokyselín proteínu, zatial čo v cytoplazmatickej doméne sa predpokladá dĺžka 19 aminokyselín (Israeli 1993). Pre PSM špecifická mRNA detegovaná v prostatickom nádorovom tkanive indikuje, že nádorový antigén nie' je nenormálne glykozylovaný proteín, ako tomu je v prípade napr. Tn- alebo sTnnádorových antigénov.

Celá dĺžka PSM cDNA bola transfektovaná do PSM negatívnej ludskej prostatickej rakovinnéj bunkovej línii PC-3 a v nej exprimovaná (Kahn 1994) . Okrem toho sa cDNA v plnej dĺžke (2,65 kilobáz) podrobila transkripcii a translácii in vitro (Kahn 1994) .

Nedávno bolo demonštrované, že PSM má hydrolytickú aktivitu podobnú N-acylovanej α-viazanej kyslej dipeptidáze (NAALADáza) - tým sa vo skutočnosti demonštrovalo, že tieto dva proteíny sú identické. NAALADáza je membránovo viazaná hydroláza nervového systému, ktorá katabolizuje neuropeptid N-acetylaspartyl glutamátu (NAAG), aby ovplyvnila glutamatergické signálne procesy. Zatial nie je známe, či tato aktivita PSM má nejakú relevantnú biologickú funkciu.

Tiež je pomerne dôležité predpovedať, či je možné očakávať nežiaducu krížovú reaktivitu s inými proteínmi dostupnými pre CTL alebo protilátky, ktorá by nasledovala po liečbe autovakcínou, ktorá indukuje PSM špecifické imunitné odozvy. Bolo ukázané, že časť kódujúcej oblasti PSM génu (pozície aminokyselín 418-567) má 54 % homológiu s ľudským receptorom transferínu (Israeli 1993) . Tiež sa našla úplná sekvenčná identita s enzýmom NAALADázy (viď vyššie). Žiadna funkčne relevantná podobnosť s inými známymi peptidázami nebola identifikovaná.

Homológia s receptorom transferínu je veľmi nízka a bude prednostne narušená v niektorom z konštruktov tohoto vynálezu. Neočakáva sa, že pozorovaná sekvenčná identita s ľudskou NAALADázou bude prekážkou pre PSM vakcínu, čiastočne kvôli nízkej schopnosti protilátok a CTL prenikať cez hematoencefalickú bariéru. Vôbec sa teda neočakáva, dokonca ani u konštruktov veľmi podobných PSM, že u pacientov dôjde ku krížovej reaktivite s inými proteínmi, ktorá by znemožnila túto aplikáciu.

Zo skorších štúdií je zrejmé, že PSM má expresiu na väčšine prostatických nádorových bunkách a na testovaných metastázach pochádzajúcich z prostaty. Ďalej, väčšina iných testovaných nádorov, napríklad karcinómy, sarkómy a melanómy rôznych tkanív, ako aj rozsiahly rad neprostatických ľudských nádorových buniek, sa ukázali ako PSM negatívne.

Naviac, velmi mnoho iných tkanív sa tiež ukázalo ako PSM negatívnych. Do tejto skupiny patrí tlsté črevo, prsia, pľúca, vaječníky, pečeň, močový mechúr, deloha, priedušnice, slezina, slinivka, jazyk, pažerák, žalúdok, štítna žľaza a prištítne telieska, nadobličky, lymfatické uzliny, aorta, dutá žila, pokožka, mliečna žľaza a placenta. Metódou RT-PCR sa však objavila existencia PSM mRNA aj u niektorých z uvedených tkanív.

Aj keď sa PSM nachádza prevážne ako molekula membránovo viazaná na prostatickom tkanive, malé množstvo PSM môže byť detegované aj v sére normálnych jedincov a zvýšené hladiny u pacientov s rakovinou prostaty (Rochon 1994, Murphy 1995) . Hladina cirkulujúcej PSM u týchto pacientov preto umožňuje sérologický monitoring účinnosti PSM vakcíny.

.Na základe všetkých dosial dostupných údajov je možné záverom konštatovať, že PSM je velmi špecifický antigén ludského prostatického tkaniva a z neho pochádzajúcich nádorov. To znamená, že u pacientov, ktorý podstúpili prostatektómiu, predstavuje PSM nádorovo kvazišpecifický vlastný antigén. Účinná PSM vakcína preto pravdepodobne zasiahne hlavne prostatické alebo z prostaty pochádzajúce metastázové tkanivo.

Ako bude zrejmé z príkladu 1, spôsob tohoto vynálezu prednostne vyžaduje, aby sa cudzí T_H-bunkový epitop zaviedol do časti PSM aminokyselinovej sekvencie definovanej pomocou sekvenčného identifikačného čísla: dve pozície z 16-52 a/alebo 87-108 a/alebo 210-230 a/alebo 269-289 a/alebo 29880

324 a/alebo 442-465 a/alebo 488-514 a/alebo 598-630 a/alebo 643-662 a/alebo 672-699. Súčasťou vynálezu je okrem toho tiež modifikovaná molekula PSM, ktorá má cudzí T_H-epitop vložený v týchto pozíciách.

Podľa toho je predmetom predkladaného vynálezu tiež analóg ľudskej PSM, ktorý je u ľudí imunogénny, pričom tento analóg zahrnuje podstatnú časť všetkých známych a predpokladaných CTL a B-bunkových epitopov PSM a zahrnuje aspoň jeden cudzí T_H epitop, ako sa tu diskutuje. Výhodnými analógmi PSM sú tie, v ktorých aspoň jeden cudzí T_H epitop je prítomný ako vložený do aminokyselinovej sekvencie PSM alebo ako náhrada časti aminokyselinovej sekvencie PSM alebo ako výsledok odstránenia časti aminokyselinovej sekvencie PSM a najvýhodnejšími analógmi sú tie, v ktorých sa cudzí T_H— bunkový epitop zavedie do časti aminokyselinovej sekvencie PSM definovanej pomocou sekvenčného identifikačného čísla: 2 pozície 16-52 a/alebo 87-108 a/alebo 210-230 a/alebo 269-289 a/alebo 298-324 a/alebo 442-465 a/alébo 488-514 a/alebo 598630 a/alebo 643-662 a/alebo 672-699.

Ľudský choriónický gonadotropín (HCG)

Súvislosť medzi embryonálnymi markermi a malígnymi fenotypmi sa diskutuje už po mnoho desaťročí. Narastajúci objem údajov naznačuje,' že aspoň jeden takýto marker, ľudský choriónický gonadotropín beta (hCGP), je súhlasne detegovaný v rakovinných bunkách najrôznejšieho histologického pôvodu, a že expresia týchto proteínov je často v korelácii so vzrastajúcimi metastatickými vlastnosťami. Humorálna imunitná odozva zameraná proti tomuto rozpustnému proteínu môže redukovať riziká šírenie nádoru a/alebo znížiť recidívu nového primárneho rastu v pooperačnom období.

Ľudský choriónický gonadotropín patrí do skupiny glykoproteínových hormónov, vrátane hormónu stimulovaného folikulom (FSH), hormónu stimulovaného štítnou žľazou (TSH) a hormónu žltého telieska (LH), ktoré všetky sú dôležitými regulátormi génovej expresie v reprodukčnom procese a prežitia plodu. Členovia tejto rodiny hormónov sú heterodiméry zdielajúce spoločný a-reťazec. β-reťazec je jedinečný pre každý hormón a dáva mu špecifičnosť, ktorá sa u β-reťazca LH prejavuje najsilnejšou sekvenčnou homológiou k ϊιΟΘβ (okolo 80 %) . Zdanlivá molekulová hmotriosť celého hCG je 37 kD, z ktorej. jednu tretinu tvoria uhľovodíky.· Posttranslačné sacharidové modifikácie zahrnujú uhľovodíky viazané tak cez N, ako aj cez O. Prítomnosť početných zvyškov sialovej kyseliny dáva proteínu silný záporný náboj. Kryštalická štruktúra celkového hCG bola vyriešená (Lapthorn et al.,

1994).

Na základe kryštalickej štruktúry sa ukázalo, že hCG vykazuje homológiu k rodine rastových faktorov vrátane PDGF a ΤβΕβ (Lapthorn et al., 1994). To naznačuje, že expresia hCG môže pomôcť regulovať rast rakovinnej. bunky.

Ľudský choriónický gonadotropín je glykoproteínový hormón produkovaný placentárnymi syncytiotrofoblastmi skoro po oplodnení a je podstatný pre zdarný priebeh tehotenstva u žien.

Patofyziologická úloha embryonálnych markerov pre rozvoj alebo udržaní rakovinnej hmoty nie je známa. Je však zaujímavé si Všimnúť, že trofoblasty (ktoré tieto proteíny obyčajne produkujú) majú tak angiogenické ako aj invazívne vlastnosti, ktoré sú obidve potrebné pre rakovinnú bunku. Ďalej bolo naznačené, že hCG (alebo jeho subjednotky) môžu inhibovať imunitnú reakciu materských buniek na tkanivo plodu. Štúdie napríklad ukázali, že hCG priamo potlačuje odozvy T buniek (Jacoby et al., 1984) a je pravdepodobné, že v dôsledku imunitné potlačeného odčerpávanie (v tomto prípade) primárneho melanómu lymfatickými uzlinami, vzniká priaznivejšie prostredie pre vytváranie nádorových metastáz. V dôsledku toho môže expresia hCG3 napomôcť šíreniu rakovinných buniek do sekundárnych miazgových orgánov. Konečne, ako už bolo zmienené, preukázala sa štruktúrna homológia medzi hCG a radom rastových faktorov. Inou možnosťou preto je, že sekrécia hCG rakovinnými bunkami môže podporovať rast nádoru.

Expresia hCG£ bola pozorovaná u mnohých rôznych typov rakoviny, napríklad: a) adenokarcinóm prostaty: pozitívny nález hCGP v tkanivových sekciách bol pozorovaný u pacientov so špatnou prognózou, bez ohladu na histologický typ nádoru (Sheaff et al., 1996); b) rôzne druhy plúcnych nádorov: dlaždiove bunky (SQCC), adenokarcinóm (AC) a velké bunky (LLC), všetky vykazujú vysoké percento reaktivity voči hCGp (Boucher et al., 1995); c) adenokarcinóm pankreasu (Syrigos et al., 1998); d) neuroblastómy, rakoviny mozgu,, retinoblastómy (Acevedo et al.,. 1997); e) malígny melanóm (Doi et al., 1996); f) rakovina močového mechúra (Lazar et al., 1995). Nedávny článok opisuje DNA prístup, v ktorom sa myši imunizovali prípravkami s expresiou hCG3 (Geissler et al., 1997) . U tohoto modelu in vivo inhibícia rastu nádoru silne súvisela s aktivitou CTL, ale boli tiež detegované aj vysoké hladiny protilátok (ktoré neutralizujú biologický účinok intaktného hCG na jeho bunkový receptor).

Použitie hCG ako imunogénu sa popisuje v niekoľkých publikáciách so zameraním na jeho využitie ako anti83 koncepčnej vakcíny (Talwar et al., 1976 a Talwar et al.,

1994) . Klinická skúška zamedzujúca plodnosti s využitím vakcíny proti celému hCG sa ukázala ako vysoko účinná a spolahlivá (Talwar et al., 1994). Bola tiež uskutočnená prvá fáza klinických skúšok na pacientoch trpiacimi rakovinou s vakcínou proti syntetickému peptidu hCGp ukončenému karboxylovou skupinou konjugovaného na záškrtový toxoid (Triozzi et al., 1994) a druhá fáza skúšok prebieha. Napriek tomu, že myšlienka využiť hCGp ako cielenú vakcínu proti rakovine sa už nejaký čas objavuje, nebola nikdy skúmaná v súvislosti s technológiou äutovakcinácie.

Je známe, že bunky z neembryonálneho tkaniva alebo benígnych nádorov nemajú expresiu hCGp.. Preto by vakcinácia proti tejto molekule nemala mať prípadné vedľajšie účinky (odhliadnuc od účinkov na tehotenstvo) . Pretože má expresiu na toľkých rozdielnych druhoch rakoviny, označuje sa táto molekula ako „rozhodný rakovinný biomarker (Acevedo et al., 1995 a Regelson W., 1995) a ako taká je atraktívnym cieľom ďalšieho výskumu.

Vhodné živočíšne modely pre ďalšie štúdie efektívnosti vakcíny na báze hCG je možné nájsť v Acevedo et al. : Cancer Det. and Prev. Supí. 1, (1987), 477-^48 6 a v Kellen et al. :

Cancer Immunol. Imun. Ther. 13 (1982), 2-4.

Her2

Predpokladá sä, že receptory tyrozín kinázy Her2 a EGFr hrajú zásadnú úlohu v malígnej transformácii normálnych buniek a v pokračujúcom raste rakovinných buniek. Zvýšená expresia väčšinou vedie k špatným prognózam. V priebehu niekoľkých minulých rokov sa veľa publikácií zaoberalo využitím protilátok proti týmto receptorom k liečbe rakoviny pri zvýšenej expresii jedného z nich alebo obidvoch receptorov. Genentech Inc. ukončil niekoľko úspešných klinických skúšok u pacientov s rakovinou prsníka s použitím monoklonovej protilátky proti Her2 a nedávno získal oprávnenie FDA na predaj preparátu monoklonovej protilátky proti Her2, Herceptinu®.

Technológia autovakcinácie opísaná v tomto vynáleze by pri aplikácii na Her2 vyvolala polyklonové protilátky, ktoré by prevážne reagovali s Her2. Od týchto protilátok sa očakáva, že napadnú a eliminujú nádorové bunky, ako aj zabránia metastatickým bunkám sa rozvinúť do metastáz. Efektorový mechanizmus tohoto protinádorového účinku by bol sprostredkovaný cez komplement a bunkovú cytotoxicitu závislú na protilátke.

V závislosti na výbere prípravkov by vyvolané autoprotilátky mohli tiež inhibovať rast rakovinných buniek pomocou inhibície oligo-dimerizácie závislej na rastovom faktore a internalizáciou receptorov. Čo však je najdôležitejšie, od analógov Her2 sa očakáva, že budú schopné indukovať odozvy CTL proti známym a/alebo predpokladaným Her2 epitopom zobrazeným nádorovými bunkami.

Her2 patrí do skupiny receptorov epidermálnych rastových faktorov (c-erbB), ktorá k dnešku pozostáva zo štyroch rozdielnych receptorov označovaných: c-erbB-Ι (EGFr), c-erbB2 (Her2, c-Neu), c-erbB3 a c-erbB-4 (Salomon et al., 1995). C-erbB-3 a c-erbB-4 nie sú charakterizované tak dobre ako EGFr a Her2. Her2 je integrálny glykoproteín. Hotový protein má molekulovú hmotnosť 185 kD so štruktúrnymi rysmi, ktoré sa veľmi podobajú EGFr receptoru (Prigent et al., 1992). EGFr je tiež integrálny membránový receptor pozostávajúci z jednej subjednotky. Má zdanlivú molekulovú hmotnosť 170 kD a pozostáva z povrchovej ligandy viažucej domény 621 aminokyselín, z jedinej hydrofóbnej transmembránovej domény 23 aminokyselin a z velmi zachovanej cytoplazmatickéj tyrozin kinázovej domény 542 aminokyselín. Proteín je N-glykozylovaný (Prigent et al., 1994).

Všetky proteíny tejto skupiny sú tyrozin kinázy. Interakcia s ligandom vedie k dimerizácii receptora, ktorá zvyšuje katalytickú aktivitu tyrozin kinázy (Bernard, 1995, Chantry,

1995). Proteíny tejto skupiny sú schopné homo- a heterodimerizácie, ktorá je dôležitá pre ich aktivitu. EGFr prenáša účinky podporujúce rast a stimuluje absorpciu glukózy a aminokyselin bunkami (Prigent et al., 1992). Her2 tiež prenáša signály podporujúce rast. Len EGFr viaže EGF a TGF-a. Tieto ligandy sa neviažu na iné receptory z tejto skupiny (Prigent et al., 1992). Ligandy pre Her2 nie sú úplne určené. Bolo však ukázané, že heregulín indukuje fosforyláciu pomocou aktivácie Her2. Nezdá sa, že by to bolo spôsobené priamou väzbou na receptor, ale predpokladá sa, že heregulín je ligandom pre erbB-3 a erbB-4, ktorý potom aktivuje Her2 pomocou oligodimerizácie (Solomon e.t al., 1995).

Homológia medzi proteínmi skupiny EGF receptoru je najvýraznejšia v doméne tyrozin kinázy v cytoplazmatickej časti molekúl (82 % medzi EGFr a Her2). V extracelulárnej oblasti je homológia nižšia - od 41 % do 46 % v rôznych doménach (Prigent et al., 1992).

Epidermálny receptor rastového faktoru je na normálnom tkanive exprimovaný v malom množstve, ale má zvýšenú expresiu u mnohých typov nádorov. EGFr má zvýšenú expresiu u rakoviny prsníka (Earp et al., 1993, Eppenberger, 1994), u gliómov (Schlegel et al., 1994), u rakoviny žalúdka (Tkunaga et al.,

1995), u nádoru horných kožných vrstiev (Fujii 1995), u rakoviny vaječníkov (van Dam et al., 1994) a u iných. Her2 je tiež exprimovaný na niekoľkých normálnych ľudských tkanivách v malom množstve, najtypickejšie na sekrečnom epiteli. Zvýšená expresia Her2 nastáva u asi 30 % rakovín prsníka, žalúdka, slinivky, močového mechúra a vaječníkov.

Expresia týchto receptorov sa mení v závislosti na stupni diferenciácie nádorov a na type nádoru, napr. u rakoviny prsníka majú primárne nádory zvýšenú expresiu obidvoch receptorov, zatial čo u rakoviny žalúdka sa zvýšená expresia objaví až v pozdnejšom štádiu v metastázových nádoroch (Salomon et al., 1995). Počet receptorov so zvýšenou expresiou na rakovinných bunkách je vyšší než 10⁶/bunku pre niekoľko nádorov rakoviny hlavy a krku, vulvy, .prsníka a vaječníkov, ako sa zistilo izoláciou týchto buniek z tkaniva pacientov (Dean et al., 1994).

Existuje niekoľko dôvodov, pre ktoré skupina EGFr receptorov predstavuje vhodný ciel nádorovej imunoterapie. Po prvé, tieto receptory majú zvýšenú expresiu u mnohých typov rakoviny, čo by malo smerovať imunitnú odozvu proti nádoru. Po druhé, nádory často exprimujú alebo zvýšene exprimujú ligandy pre túto skupinu receptorov a niektoré sú hypercitlivé na účinky bujnenia sprostredkované ligandmi. Po tretie, pacienti s nádormi, ktoré majú zvýšenú expresiu receptorov rastového faktoru, majú často velmi špatnú prognózu. Zvýšená expresia je úzko spojené so špatnou prognózou predovšetkým u rakoviny prsníka, pľúc a močového mechúra a zrejme súvisí s invazivnými/metastatickými fenotypmi, ktoré sú prakticky necitlivé na konvenčnú liečbu (Eccles et al., 1994).

Zvýšená expresia Her2 je v niektorých prípadoch výsledkom zosilnenia génu a v iných prípadoch výsledkom zvýšenej transkripcie a translácie. Zvýšená expresia Her2 je spojená so špatnou prognózou u rakoviny prsníka, vaječníkov, žalúdka, močového mechúra, prípadne aj pri rozsiahlejšej rakovine plúc (Solomon et al., 1995).

Fáza I klinických skúšok sa uskutočňovala s bišpecifickou protilátkou u pacientov s pokročilou rakovinou prsníka a vaječníkov. Protilátka bola bišpecifická proti Her2 a FcyRI (Weiner et al., 1995). Účinný rozpad nádorových buniek so zvýšenou expresiou Her2 sa pozoroval u bišpecifickej protilátky proti Her2 a CD3 (Zhu et al., 1995).

Liečba myší so štiepom ludského karcinómu žalúdka monoklonovou protilátkou proti Her2 predĺžila život myší (Ohniski et al., 1995). Protinádorové aktivity monoklonových protilátok proti Her2 in vitro a in vivo neprebiehajú rovnakým mechanizmom; môžu pôsobiť ako čiastočné ligandové agonisty, meniť premenu receptora Her2 a fosforyláciu alebo môžu ovplyvniť dimerizáciu (Lupu et al., 1995).

Podobne bolo ukázané, že protilátky k EGFr tiež narušujú interakcie s rastovým faktorom (Baselga et al., 1994, Modjahedi et al., 1993a, Wu et al., 1995, Modjahedi et al., 1993b, Tosi et al., 1995, Dean et .al., 1994, Bier et al., 1995, Modjahedi et al., 1996, Valone 1995).

Jedno z dôležitých uskutočnení tohoto vynálezu spočíva preto v tom, že sa cudzí T-bunkový epitop zavedie do časti aminokyselinovej sekvencie Her2 definovanej pomocou číslovania v sekvenčnom identifikačnom čísle: 3 pozície 5-25 a/alebo 59-73 a/alebo 103-117 a/alebo 149-163 a/alebo 210-224 a/alebo 250-264 a/alebo 325-339 a/alebo 369-383 a/alebo 465479 a/alebo 579-593 a/alebo 632-652 a/alebo 653-667 a/alebo 661-675 a/alebo 695-709 a/alebo 710-730, viď príklady uskutočnenia vynálezu.

Predmetom vynálezu je preto tiež analóg ludského Her2, ktorý je u ludí imunogénny a ktorý zahrnuje podstatnú časť všetkých známych a predpokladaných CTL a B-bunkových epitopov Her2 a obsahuje aspoň jeden cudzí T_H epitop, ako sa tu diskutuje. Je výhodné, keď je tento aspoň jeden cudzí T_Hepitop prítomný ako vložený do aminokyselinovej sekvencie Her2 alebo ako náhrada časti aminokyselinovej sekvencie Her2 alebo ako výsledok odstránenia časti aminokyselinovej sekvencie Her2. Najvýhodnejšími analógmi sú tie, ktoré boli definované vyššie, t.j. v ktorých sa cudzí T_H-bunkový epitop zavedie do časti aminokyselinovej sekvencie Her2 definovanej pomocou sekvenčného identifikačného čísla: 3 pozície 5-25 a/alebo 59-73 a/alebo 103-117 a/alebo 149-163 a/alebo 210-224 a/alebo 250-264 a/alebo 325-339 a/alebo 369-383 a/alebo 465479 a/alebo 579-593 a/alebo 632-652 a/alebo 653-667 a/alebo 661-675 a/alebo 695-709 a/alebo 710-730.

FGF8b

Niekolko výskumníkov ukázalo, že FGF8b môže vyvolať bujnenie, transformáciu, diferenciáciu a v niektorých prípadoch silno zvýšiť tvorbu nádorov z materských buniek a tkanív (Tanaka 1992, Kouhara 1994, Lorenzi 195, MacArthur 1995a, Crossley 1996a, 1996b, Ghosh 1996, Ohuchi 1997a, RudraGanguly 1998). Tieto účinky sú primárne sprostredkované väzbou FGF8b k fibroblastovým receptorom rastového faktoru

FGFR2, FGFR3 a FGFR4 (MacArthur 1995b, Blunt 1997, Tanaka

1998) . Ukázalo sa teda, že bunky s expresiou jedného z týchto receptorov a FGF8b poskytujú autokrinnú kaskádu signalizujúcu rast, ktorá vedie k bujneniu'. Najpravdepodobnejšie je biologický účinok FGF8b sprostredkovaný cestou JAK/STAT3, pretože sme my aj iný autori pozorovali, že prídavok FGF8b do rastového média určitých buniek vyvolá fosforyláciu STAT3, rys podozrivý z toho, že urobí bunky odolné, voči zániku (Catlett - Falcone 1999).

K vyššie zmienenému pozorovaniu in vitro bolo naviac nedávno dokázané, že expresia FGF8(b) je významne viac aktivovaná u rakoviny prostaty a prsníka (Marsh 1999, Dorkin

1999) . Veríme preto, že autovakcína proti FGF8(b) bude velmi účinným prostriedkom k liečbe radu nádorov s expresiu FGF8 alebo snáď zvýši ich citlivosť na látky indukujúce ich zánik.

Rakovina prostaty

Biologická agresivita prostatických karcinómov je rôzna. U niektorých pacientov zostane objavený nádor latentným histologickým nádorom a nikdy sa nestane klinicky významným. U iných pacientov má nádor rýchlu progresiu, metastázuje a usmrtí pacienta v relatívne krátkom čase (2-5 rokov).

K diagnostickým účelom a k sledovaniu odozvy na terapiu rakoviny prostaty sa primárne používa stanovenie cirkulujúcich hladín dvoch proteínov: prostatickej kyslej fosfatázy (PAP) a prostatického špecifického antigénu (PSA) (Nguyen 1990, Henntu 1989). Vzhľadom k narušeniu normálnej stavby prostatickej žľazy v dôsledku vývoja karcinómu sa tieto rozpustné proteíny dostanú do obehu, kde môžu byť stanovené ako markery pre napr. šírenie metastáz.

' Bežnou primárnou liečbou rakoviny prostaty je prostatektómia. Vzhladom k rýchlemu šíreniu rakovinných buniek však väčšina pacientov s rakovinou prostaty nie je lokálnym chirurgickým zákrokom vyliečená. Pacienti s neomrzeným priebehom choroby podstúpia liečbu systémovou abláciou androgénu, ale ročná úmrtnosť na rakovinu prostaty za posledných 50 rokov, kedy sa ablácia androgénu stala štandardnou liečbou metastatickej choroby, nepoklesla.

RT-PCR analýza ukázala, že FGF8 mRNA je produkovaná líniami ľudských prostatických epiteliálnych nádorových buniek LNCaP, PC-3, ALVA-31 a DU145, pričom FGF8b je najvýznačnej šou izoformou (Tanaka 1995, Ghosh 1996). Rast LNCaP buniek citlivých na androgén sa stimuluje prídavkom rekombinantného FGF8b (Tanaka 1995), zatial čo rast DU145 buniek by sa mohol inhibovať pomocou transfekcie vírusom s expresiu „antisense FGF8b (Rudra-Ganguly 1998). Toto, spoločne s dôkazom z vývojových štúdií diskutovaným ďalej, ukazuje úlohu FGF8b pri udržiavaní karcinogénneho stavu týchto bunkových línií.

Použitím FGF8a cDNA k hybridizačným experimentom in situ Leung so spolupracovníkmi ukázali, že vysoký podiel (80 % (n=106) a 71 % (n=31)) prostatických karcinómov produkuje FGF8 mRNA a že množstvo FGF8 mRNA koreluje so závažnosťou nádorov (P<0,0016, resp. P<0,05)(Leung 1996, Dorkin 1999). Použitie monoklonovej anti-FGF8b protilátky ukázalo, že práve tato izoforma je zodpovedná za zvýšenú expresiu FGF8b (Dorkin 1999) . Naviac, ľudia s nádormi s expresiou vysokých hladín FGF8 majú horšie vyhliadky na prežitie (P=0,034) a táto expresia FGF8 pretrváva v prostatických nádoroch nezávislých na androgéne (Dorkin 1999). Podía výsledkov uvádzaných Dorkinom a spolupracovníkmi expresia FGF8b v prostatickom karcinóme môže predpovedať pacientovo prežitie.

Imunohistochemická analýza s použitím monoklonovej protilátky proti FGF8 detegovala proteín v 93 % (n=43) ľudských prostatických karcinómoch (Tanaka 1998) . Normálne prostatické. tkanivo alebo benígna prostatická hyperplazia produkuje nízke hladiny FGF8 mRNA a neobsahuje stanovitelné množstvo proteínu FGF8 (Leung 1996, Yoshimura 1996, Ghosh 1996, Tanaka 1998, Dorkin 1999).

Z týchto výsledkov vyplýva, že autovakcína proti FGF8(b) by bola reaktívna proti prostatickému nádorovému tkanivu, a tým nesmierne cenná pre liečbu rakoviny prostaty.

Rakovina prsníka

Bežnou liečbou rakoviny prsníka je chirurgický zákrok. Vzhľadom k rozsiahlemu šírenia buniek rakoviny prsníka nie je však značná časť pacientov s rakovinou prsníka vyliečená lokálnym chirurgickým zákrokom.

Pacienti 's neohraničenou chorobou sa nakoniec liečia abláciou androgénu, chemoterapiou a/alebo ožarovaním. Úmrtnosť pri ochorení rakovinou prsníka je však stále relatívne vysoká.

FGF8 sa pôvodne izoloval z bunkovej línie myšieho karcinómu prsníka (SC-3), z ktorej mohla byť indukovaná expresia pridaním androgénu do média (Nonomura 1990). O proteínu je tiež známe, že vyvoláva bujnenie týchto, aj iných cicavčích buniek. V poslednom čase sa preukázalo, že FGF8b mRNA sa vyskytuje v ôsmych (n=8) bunkových líniách ludského karcinómu prsníka (MDA-MB-231, MDA-MB-415, ZR 75-1, T-47-D, SK-BR-III, PMC-42, HBL-100 a MCF-7) (Tanaka 1995, Payson 1996, Wu 1997, Marsh 1998).

U transgenetických myší Wnt-1 infikovaných vírusom myšieho nádoru prsníka (MMTV) sa rozvinuli prsníkové nádory. Transkripcia FGF8 sa aktivovala v 50 % týchto nádorov (MacArthur 1995c, Kapoun 1997).

Transgenetické myši, ktoré nesú FGF8b cDNA riadenú promótorom velmi špecifického myšieho prsníkového nádorového vírusu (MMTV) vykazovali spontánny rozvoj FGF8b s expresiou prsníkových nádorov (Coombes, osobná diskusia).

Najnovšie údaje ukazujú, že expresia FGF8(b) je u rakoviny prsníka nadmerne aktivovaná (Tanaka 1998, Marsh 1999). Tanaka a spolupracovníci použili v imunohistochemických štúdiách novú monoklonovú protilátku FGF8. Ukázali, že FGF8 sa vyskytoval v 67 % (n=12) prípadov rakoviny, prsníka a že androgénové receptory sa vyskytli v 89 % prípadov ochorenia prsníka pozitívnych na FGF8 (hyperplazia, fibroadenóm, intraduktálny papilóm a karcinómy), čo by umožnilo zapojenie slučky podporujúcej autokrinný rast do progresie karcinómov prsníka (Tanakaka 1998). S použitím semikvantitatívnej metódy RT-PCR sa ukázalo, že zvýšené hladiny FGF8 mRNA sa našli v malígnych pri porovnaní s nemalígnymi tkanivami prsníka. Významne viac malígnych tkanív malo expresiu FGF8 (p=0,019) vo významne vyšších hladinách (p=0,031) (68 karcinómov prsníka a 24 nemalígnych tkanív prsníka) (Marsh 1999).

Funkcia FGF8(b) ako autokrinného rastového faktora sa ešte úplne nepreukázala. Avšak skutočnosť, že velké množstvo nádorov má zvýšenú expresiu FGF8b, hovorí silne pre to, že autovakcína proti FGF8b by mohla byť účinná proti vysokému percentu karcinómov prsníka a prostaty. Údaje uvádzané Marshom, Dorkinom a Tanakom nasvedčujú tomu, že autovakcína proti FGF8(b) by mohla byť použitá pre liečbu rakoviny tak prsníka ako aj prostaty a do istej miery menej presné údaje uvádzané Dorkinom a kol. sú ďalšou podporou názoru, že FGF8 je zapojený do progresívneho rastu ľudských rakovinných buniek.

Popis FGF8b

FGF8 patrí do skupiny fibroblastických rastových faktorov (FGFs). Tieto proteíny regulujúce rast sú proteíny malých amínokyselinových zvyškov «200, ktoré všetky sa podieľajú na vyvolaní bujnenia a diferenciácii širokej oblasti buniek. Posledný prehľad, ako sa podieľajú fibroblastické rastové faktory na vývoji končatín stavovcov, priniesol Johnson 1997. Členovia skupiny FGF sú evolučné príbuzný a zdieľajú identitu aminokyselinovej sekvencie z 20 - 50 %.

FGF8b je strihovým variantom FGF8, pôvodne nazývaným androgénom indukovaný rastový faktor (AIGF). AIGF sa prvýkrát identifikoval ako proteín vylučovaný bunkovou líniou (SC3) myšieho karcinómu prsníka pri stimulácii androgénom (Nonomura 1990). U myší obsahuje gén FGF8· 6 exónov potenciálne kódovaný pre osem rôznych FGF8-izoforiem (FGF8ah), ktoré sa odlišujú len v N-koncoch molekúl (Crossley 1995, MacArthur 1995b). Ľudský FGF8 má rovnakú génovú štruktúru ako gén u čeľadi myšovitých. Avšak kvôli stop kodónu v exóne IB môže ludský FGF8 existovať vo štyroch rôznych izoformách, totiž FGF8a, FGF8b, FGF8e a FGF8f (Gemel 1996). Génové štruktúry a aminokyselinové sekvencie štyroch ľudských izoforiem znázorňuje obrázok 5.

Hotový FGF8b obsahuje 193 aminokyselinových zvyškov a má vypočítanú molekulovú hmotnosť 22,5 kDa. Vysoko zásaditý proteín obsahuje 21 arginínových a 14 lyzínových zvyškov, výsledkom čoho je vypočítaný izoelektrický bod 10,84 a vypočítaný pozitívny náboj 19,8 pri pH « 7,0. Obsahuje dva cysteínové zvyšky a má dve možné N-glykozylačné polohy. Vzhladom k povahe uskutočnených výskumov týkajúcich sa FGF8b sa veľmi málo vie o proteínovej časti FGF8b. Bol však heterológne exprimovaný z baktérie, vyčistený s použitím hexahistidínového značenia s C-koncom a potom in vitro prevedených do rozpustného a biologicky aktívneho stavu (MacArthur 1995a, Blunt 1997).

Biologická aktivita FGF8b

Ako už bolo povedané, FGF8 (b) sa prvý raz izoloval ako faktor uvoľňovaný bunkovou líniou myšieho prsného nádoru závislom na androgéne a bolo ukázané, že tento proteín môže indukovať bujnenie týchto buniek. Morfologické zmeny imitujú tie, ktoré indukuje testosterón, o ktorom sa tiež vie, že indukuje syntézu FGF8(b) mRNA (Tanaka 1992). Bujnenie sa môže inhibovať antisense oligoproteínmi FGF8(b) (Nonomura 1990, Tanaka 1992 a Yamanishi 1994). Skutočne, rast bunkovej línie DU145 ľudského karcinómu prostaty sa môže inhibovať transfekciou vírusom s expresiou antisense FGF8b (RudraGanguly 1998). Najnovšie údaje ukazujú, že FGF8b indukuje fosforyláciu STAT3 - proteínu, o ktorom sa predpokladá, že sa podieľa na obrane proti odumretiu (Catlett-Falcone 1999, Johnston, C.L., nepublikované výsledky).

Niekolko výskumníkov ukázalo, že FGFŠb je velmi účinný pri indukcii transformácie buniek NIH3T3 alebo SC115 (Miyashita 1994, Kouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArthur 1995a). Použitím rekombinantne exprimovaných proteínov sa tiež ukázalo, že táto indukcia morfologických zmien je omnoho účinnejšia s FGF8b než s FGF8a alebo FGF8c (MacArthur 1995a, Ghosh

1996). Je zaujímavé, že samotná N-koncová polovica molekuly FGF8b sa ukázala ako dostačujúca pre transformáciu NIH3T3 buniek, a dokonca malý FGF8b špecifický peptid (QVTVQSSPNFT) umožňuje v koncentráciiO,1% séru, aby bunky rástli 2-3krát pomalší odpovedá normálu (Rudra-Ganguly 1998) . Naviac bolo opísané, že NIH3T3 bunky stabilne transfektované vektorom kódujúcim FGF8b sú v prípade vnútroočnej injekčnej aplikácii do holých myší silne nádorotvorné (Kouhara 1994, Ghosh 1996).

Je známe, že in vivo má FGF8b expresiu v určitých štádiách vývoja stavovcov. Biologické úlohy pripisované FGF8b zhrňuje tabuľka 1. Pre prehľad zapojenie FGF8(b) do vývoja stavovcov viď. Goldfarb 1999 a Johnson 1997.

Tabuľka 1: Rozličné miesta/tkanivá produkujúce FGF8 a navrhnutá biologická úloha, prípadne úlohy

Dej/mechanizmus/výskyt (druh)_

Prítomnosť vo vyvíjajúcich sa zárodkoch končatín (myši)

Výrastky krídiel zárodkov (kurčatá)

Indukcia tvorby ektopických končatín z mezodermu (kurčatá)

Indukcia tvorby stredného mozgu z kaudálneho medzimozgu (kurčatá)

Iniciácia výrastkov krídiel u bezkrídelného mutantu (kurčatá)

Úloha pri dorzoventrálnej modelácii gastruly (danio páskované)

Potrebný behom gastrulačného, kardiálneho, kraniofaciálneho, predomozgového, stredomozgového a celeberálneho vývoja (tkanivo špecificky knockoutovaných myší)

Úloha v morfogenézii zubov (myši)

Odkazy

Heikinheimo 1994, Ohuchi 1994

Kuwana 1997,

Xu 1998

Crossley 1996b

Crossley 1996a

Ohuchi 1997a

Furthauer 1997

Meyers 1998

Kettunen 1998

Predpokladá sa, že FGF8b pôsobí prostredníctvom väzieb na receptory fibroblastického rastového faktoru (RGFR). 0 FGF8b je zvlášť známe, že je schopný aktivovať FGFR2c, FGFR3c, FGFR4c a do určitej miery tiež FGFRlc, ale nie FGFRlb, -2b alebo -3b (MacArthur 1995b, Blunt 1997). V prípade indukcie rastu ektopických kuracích končatín to implikuje interakcie FGF10, FGFR2 a FGF8, a že to by mohlo pre rast stačiť (Kuwana 1997, Xu 1998). Tieto výsledky podporujú hypotézu, že FGF8 (b) môže pôsobiť v auto- a parakrinnom režime, ktoré vedie k normálnemu rastu a formovaniu niektorých anatomických štruktúr béhom vývoja stavovcov. Je dôležité, že FGF8 „úplne knokoutovaných myší neprežije najskôr vďaka komplikovanému zapojeniu proteínu v embryonálnom vývoji.

Homológia k iným proteínom

Velmi dôležité je predpovedať, či je možné očakávať nežiaducu krížovú reaktivitu s inými proteínmi prístupnými pre protilátky, ktorá by nastala po liečbe s autovakcínou indukujúcou FGF8 špecifické autoprotilátky. Vďaka vysokej sekvenčnej identite medzi FGF8b a ostatnými molekulami FGF8 je možné očakávať krížové reakcie autovakcíny s týmito proteínmi. Podlá všetkého by to však bolo vhodné, lebo o žiadnom z týchto proteínov nie je známa expresia v tkanivách alebo bunkových líniách, v ktorých už nie je expresia FGF8b.

Aminokyselinové zvyšky 55 - 175 FGF8b ukazujú relatívne nízky, ale významný stupeň sekvenčnej identity s ostatnými FGF. Obecne je prijaté (a niekoľkokrát dokázané), že významný stupeň sekvenčnej identity medzi dvomi proteínovými doménami sa tiež zobrazí vo velmi podobnej terciárnej štruktúre. Predpokladá sa takto, že všetci členovia FGF skupiny sú si obecne štruktúrne blízky. Trojrozmerná štruktúra FGF2 sa vyriešila z kryštalickej formy, ako aj v roztoku (Ago 1991,

Zhang 1991, Zhu 1991, Eriksson 1993, Blaber 1996, Moy 1996) . FGF2 je zložený výhradne z beta-sheet štruktúry zahrnujúcej trojité opakovanie štvoršraubového antiparalelné betameandru. Tato beta-barelová štruktúra je úplne zachovaná medzi interkleukinom 1, FGF2 (alebo bázickým FGF) a FGFl (alebo kyslým FGF). Nukleárna magnetická rezonancia FGF2 v roztoku ukázala, že N-koncová časť molekuly tvorí relatívne flexibilnú štruktúru. Ostávajúca časť FGF8b (aminokyselinové zvyšky 1-54 a 176-215) len ukazuje nízky stupeň sekvenčnej identity k známym proteínom.

Na základe štruktúrnych a iných dostupných údajov je obecne prijímané, že trojrozmerný štruktúrny skelet ostatných fibroblastických rastových faktorov je velmi podobný štruktúre FGFl a FGF2. Tieto štruktúrne úvahy sú dôležitými faktormi nášho návrhu molekúl mutantnej autovakcíny FGF8b.

Dôležité je, že vďaka relatívne nízkej sekvenčnej identite medzi FGF8 a akýmkoľvek iným členom skupiny FGF bude povrch FGF8 veľmi rozdielny od iných FGF, čím sa minimalizujú krížové reakcie autovakcínou FGF8b generovaných protilátok s inými členmi skupiny FGF. Vzhľadom k.veľmi nízkej homológii s inými proteínmi, než sú fibroblastické rastové faktory, neočakávame, že autovakcína proti FGF8b bude krížovo reagovať s akýmikoľvek inými proteínmi.

Je však treba zdôrazniť, že autovakcína proti FGF8b bude pravdepodobne krížovo reagovať so všetkými izoformami FGF8. Nepredpokladá sa, že by to robilo ťažkosti, pretože žiadna z izoforiem FGF8 sa u dospelých jedincov nevyskytuje vo významnom množstve. Je dokonca možné, že tieto krížové reakcie budú prospešné pri liečbe rakoviny, pretože sa ukázalo, že aspoň niektoré rakovinné bunkové línie obsahujú okrem FGF8b ešte iné izoformy.

Rozloženie FGF8b v tkanivách

Bolo by optimálne, keby sa indukované autoprotilátky a následné efektorové mechanizmy, ako aj očakávaná odozva CTL zvýšená autovakcináciou zamerali len na tkanivo, ktoré má byť u pacienta eliminované. Preto je tkanivové rozloženie antigénu, ktorý je terčom autovakcíny, veľmi dôležité z hľadiska bezpečnosti vakcíny.

Tabuľka 2: Expresia FGF8b v rôznych tkanivách a bunkách

Človek

Bunkové línie rakoviny prsníka (MDA-MB-231, MDA-MB-415, ZR 75-1, T-47-D, SK-BR-HI, PMC-42, HBL-100 a MCF-7)

Nádory prsníka

Normálne tkanivo prsníka

Rakovina prostaty (93 %)

Choroby prsníka

Pro statické nádorové bunky (LNCaP,

PC-3, DU145 a ALVA 31)

Obličky plodu

Dospelá prostata, semenníky, obličky, neuróny

Teratokarcinomatické bunky (Tera-2)

Čeľaď myšovitých

Bunkové línie rakoviny prsníka (SC-115, RENCA)

Hypotalamus, semenníky

Nádory prsníka (Wnt-1, transgénny) ((RT-PCR) Tanaka 1995, Payson 1996, Wu 1997,

Marsh 1999) ((mAb) Tanaka 1998, (RT-PCR) Marsh 1999) ((RT-PCR) Wu 1997, Marsh 1999, (mAb) Tanaka 1998) ((in situ hyb.) Leung 1996,

Dorkin 1999, (mAb)

Tanaka 1998) ((mAb) Tanaka 1998) ((RT-PCR) Tanaka 1995, Ghosh 1996, Schmitt 1996) ((NB) Ghosh 1996) ((RT-PCR) Ghosh 1996, Wu

1997, Dorkin 1999) ((RT-PCR) Wu 1997) ((RT-PCR) Yoshimura 1996) ((RT-PCR) Yoshimura 1996) ((NB) MacArthur 1995c)

Mozog embrya

Vaječníky, semenníky

Vývoj tváre a a zárodkov končatín

Gastrula

Kurčatá

Mozog embrya

Vývoj končatín ((in situ hyb.) Crossley 1995, Heikinheimo 1994, Ohuchi 1994, Shimamura 1997, (RT-PCR) Blunt 1997) (NB) Valve 1997) ((pAb) MacÁrthur 1995b, (insitu hyb.) Heikinheimo 1994, Ohuchi 1994, Crossley 1995) ((in situ hyb.) Crossley 1995) ((in situ hyb.) Crossley 1996a) ((in situ hyb.) Ohuchi 1997a,b)

Potkan

Prostata a semenníky ((RT-PCR) Schmitt 1996)

Tabulka ukazuje široký výber tkanivového rozloženia a bunkových línií s expresiou FGF8b. Tiež z nej vyplýva, že väčšina údajov týkajúcich sa rozloženia v tkanivách bolo získaných citlivou metódou RT-PCR. To preto, že NB analýza nezachytí FGF8b mRNA v žiadnom normálnom tkanive s výnimkou obličiek plodu. Z týchto obmedzených údajov sa obecne prijíma, že expresia FGF8b mRNA u dospelých jedincov je velmi obmedzená, a tak autovakcína proti FGF8b by pravdepodobne nemala byť reaktívna proti normálnemu tkanivu. Ďalšie analýzy tkanivového rozloženia proteínu sú potrebné preto, že malé množstvo FGF8b by mohlo mať reakcie v neznámych systémoch u dospelých. Podía nášho názoru však nič nenasvedčuje tomu, že autovakcína proti FGF8b by mala pôsobiť vážne nežiaduce účinky na pacientov.

100

Účinky protilátok proti FGF8b

Doposiaľ neboli publikované žiadne pokusy liečiť rakovinu prostaty použitím monoklonových protilátok. V liečbe rakoviny prsníka monoklonovými protilátkami však prebiehajú klinické skúšky.

Protilátky proti FGF8b budú pravdepodobne blokovať interakcie medzi FGF8b a jeho receptormi, čím budú inhibovať dráždenie bunkových membrán a bujnenie buniek a velmi pravdepodobne znížia pohyblivosť a invazívnosť rakovinných buniek.

Predmetom vynálezu sú preto tiež uskutočnenia tu opísaných spôsobov, kedy sa cudzí T-bunkový epitop zavedie do časti aminokyselinovej sekvencie FGF8b definovanej pomocou sekvenčného identifikačného čísla: šesť pozícií z 1-54 a/alebo 178215 a/alebo 55-58 a/alebo 63-68 a/alebo 72-76 a/alebo 85-91 a/alebo 95-102 a/alebo 106-111 a/alebo 115-120 a/alebo 128134 a/alebo 138-144 a/alebo 149-154 a/alebo 158-162 a/alebo 173-177. Malo by sa poznamenať, že je zvlášť nevýhodné zaraďovať obmeny alebo modifikácie do pozícií 26-45, a do Ckoncov počínajúc aminokyselinami 186-215, pretože tieto úseky majú najmenšiu homológiu s nedávno objaveným proteínom FGF18, ktorý zrejme má expresiu v rade nenádorových tkanív.

Predmetom vynálezu je preto tiež analóg ludského/myšieho FGF8b, ktorý je u ludí imunogénny a ktorý zahrnuje podstatnú časť všetkých známych a predpokladaných CTL a B-bunkových epitopov FGF8b a obsahuje aspoň jeden cudzí T_H epitop, ako sa tu diskutuje. Je výhodné, keď je tento aspoň jeden cudzí T_Hepitop prítomný ako vložený do aminokyselinovej sekvencie FGF8b alebo ako náhrada časti aminokyselinovej sekvencie FGF8b alebo ako výsledok odstránenia časti aminokyselinovej

101 sekvencie FGF8b. Najvýhodnejšími analógmi v tomto uskutočnení sú tie, v ktorých sa cudzí T_H-bunkový epitop zavedie do časti aminokyselinovej sekvencie FGF8b definovanej pomocou sekvenčného identifikačného čísla: šesť pozícií z 1-54 a/alebo 178-215 a/alebo 55-58 a/alebo 63-68 a/alebo 72-76 a/alebo 85-91 a/alebo 95-102 a/alebo 106-111 a/alebo 115-120 a/alebo 128-134 a/alebo 138-144 a/alebo 149-154 a/alebo 158162 a/alébo 173-177.

Mucíny

Predmetom vynálezu sú tiež spôsoby vynálezu, ktoré využívajú špecificky modifikované obmeny ľudských mucínov (hlienov), zvlášť ktoréhokoľvek z MUC-1 až MUC-4, výhodne MUC-1. Analógy zahrnujú nasledujúcu štruktúru

TR (-S-P-S-(TR) _m) _n kde TR je tandemové opakovanie odvodené z prirodzene sa vyskytujúceho mucínu, P je cudzí T_H-epitop, ako sa o ňom pojednáva v tomto dokumente, S je inertný vložkový peptid, ktorý má od 0 do 15, aminokyselinových zvyškov, výhodne medzi 0 a 10 aminokyselinovými zvyškami, n je celé číslo od 1 do 30 a m je celé číslo od 1 do 10, výhodne od 3 do 5.

Keď sa takýto mucínový analóg produkuje v napr. línii ľudských buniek alebo prečistením z tkaniva, priamy výsledok obvykle nemá požadovanú glykozylačnú štruktúru, t.j. anomálna mucíne analóg pochádzajúcom rekombinantne a následne produkt glykozylačná štruktúra svedčí o z nádoru. Je však možné pripraviť v napr. E. coli alebo synteticky glykozylovať enzymaticky tak, aby sa dosiahla Tn alebo S-Tn glykozylačná štruktúra špecifická pre expresiu MUC-1

102 v nádoroch. Ináč by polypeptid mohol byť pripravený v cicavčej bunkovej línii alebo bunkovej línii hmyzu, t.j. v bunkách Drosophila, ktorým chýba relevantný enzým, alebo intracelulárnou expresiou proteínu (pri vylúčení sekrečného signálneho peptidu), kde sa nevyskytuje glykozylácia.

Fragmenty nukleových kyselín a vektory vynálezu

Z vyššie uvedeného opisu oceníme, že sa analógy môžu pripravovať technológiou rekombinantných génov, ale tiež chemickými syntézami alebo semisyntézami; druhé dva výbery sú zvlášť relevantné, keď sa modifikácia týka pripojenia k proteínovým nosičom (napr. KLH, záškrtový toxoid, tetanový toxoid a BSA) a k neproteínovým molekulám, napríklad uhľovodíkové polyméry, a samozrejme tiež v prípade, keď modifikácia zahrnuje adíciu postranných reťazcov alebo postranných skupín na peptidový reťazec polypeptidu.

Z hladiska rekombinantnej génovej technológie a samozrejme aj z hladiska imunizácie nukleovou kyselinou sú dôležitými chemickými produktmi fragmenty nukleových kyselín kódujúce potrebné epitopické oblasti a analógy. Preto významná časť tohoto vynálezu sa týka fragmentu nukleovej kyseliny, ktorý kóduje vyššie opísaný analóg každého z relevantných nádorovo špecifických polypeptidov, výhodne polypeptid, do ktorého bol zavedený cudzí T_H-bunkový epitop vložením a/alebo adíciou, výhodne substitúciou a/alebo odstránením. Fragmenty nukleových kyselín tohto vynálezu sú buď fragmenty DNA alebo RNA.

Fragmenty nukleových kyselín tohto vynálezu budú obvykle vložené do vhodných vektorov, aby vytvorili vektory nesúceho príslušné fragmenty nukleových kyselín tohto vynálezu pre

103 klonovanie alebo expresiu; takéto nové vektory sú tiež časťou tohoto vynálezu. Detaily, ktoré sa týkajú stavby týchto vektorov tohto vynálezu, sa budú diskutovať v súvislosti s transformovanými bunkami a mikroorganizmami. Vektory môžu byť, podľa účelu a typu aplikácie, vo forme plazmidov, fágov, kozmidov, minichromozómov alebo vírusov, ale dôležitým vektorom je aj prostá DNA, ktorá má v určitých bunkách len prechodnú expresiu. Výhodné klonovacie a expresné vektory tohto vynálezu sú schopné autonómnej replikácie, tým umožňujú velký počet kópii vyžitelných pre vysokú expresiu alebo pre vysokú replikáciu pre následné klonovanie.

Obecný profil vektora tohto vynálezu zahrnuje nasledujúce charakteristické rysy vo smere 5' - 3' a v uskutočniteľnom spojovaní: promótor riadiaci expresiu fragmentu nukleovej kyseliny vynálezu, voliteľne sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej hlavný peptid, ktorý umožňuje sekréciu fragmentu nukleovej kyseliny vynálezu alebo jeho začlenenie do membrány polypeptidového fragmentu a sekvenciu nukleovej kyseliny, kódujúcej terminátor. Keď sa operuje s expresnými vektormi v producentských kmeňoch alebo bunkových líniách, je z hľadiska génovej stability transformovaných buniek výhodné, aby sa vektor pri zavádzaní do hostiteľskej bunky začlenil do jej genómu. Naopak, keď sa pracuje s vektormi, ktoré ša majú použiť na ovplyvnenie expresie in vivo (t.j. pri použití vektora v DNA vakcinácii), je z bezpečnostných dôvodov výhodnejšie, aby sa vektor nemohol integrovať do genómu hostitelskej bunky; typickým príkladom je použitie prostej DNA alebo neintegrovaných vírusových vektorov, ktorých volba je veľmi dobre známa odborníkovi v technike.

Vektory tohto vynálezu sa používajú k transformácii hostitelských buniek tak, aby produkovali analóg vynálezu.

104

Takéto transformované bunky, ktoré sú tiež predmetom tohoto vynálezu, môžu byť kultivované bunky alebo bunkové línie používané k rozmnožovaniu fragmentov nukleových kyselín a vektorov vynálezu, alebo k produkcii rekombinantných analógov tohoto vynálezu. Ináč transformované bunky môžu byť vhodné živé vakcinačné kmene, do ktorých sa fragment nukleovej kyseliny (jeden jediný alebo násobné kópie) vloží tak, aby ovplyvnil sekréciu alebo integráciu do membrány baktérie alebo bunkovej steny analógu.

Výhodnými transformovanými bunkami vynálezu sú mikroorganizmy, ako baktérie [napríklad druhy Escherichia (napr. E. coli), Bacillus (napr. Bacillus subtilis), Salmonella alebo Mycobacterium (predovšetkým nepatogénne, napr. M. bovis BCG)], kvasinky (napr. Saccharomyces cerevisiae) a prvoci. Ináč sa transformované bunky odvodzujú od multicelulárnych organizmov, ako sú bunky húb, hmyzu, rastlín alebo cicavcov. Najvýhodnejšie sú ľudské bunky, viď diskusiu o bunkových líniách a vektoroch ďalej.

Z hľadiska klonovania a/alebo optimalizovanej expresie je výhodné, aby transformované bunky boli schopné replikovať fragment nukleovej kyseliny tohoto vynálezu. Výhodnými užitočnými uskutočneniami vynálezu sú bunky s expresiou nukleového fragmentu; môžu sa použiť pre prípravu analógu v malom alebo veľkom merítku alebo v prípade nepatogénnej baktérie ako zložky vakcíny pre živú vakcínu.

Pri príprave analógu tohto vynálezu pomocou transformovaných buniek je výhodné, aj keď rozhodne nie podstatné, keď sa produkt expresie buď vyexportuje do kultivačného média alebo sa nanesie na povrch transformovanej bunky.

105

Keď sa identifikuje účinná producentská bunka, je výhodné na jej základe ustaviť stabilnú bunkovú liniu, ktorá nesie vektor vynálezu a ktorá má expresiu fragmentu nukleovej kyseliny kódujúceho analóg. Tato stabilná bunková línia výhodne vylučuje alebo nesie analóg vynálezu, a tým sa uľahčuje jeho čistenie.

Plazmidové vektory obsahujúce replikačné a riadiace sekvencie, ktoré sú odvodené z druhov kompatibilných s hostiteľskou bunkou sa obecne používajú v spojení s hostiteľmi. Vektor obvykle nesie replikačné miesto, rovnako ako značkujúce sekvencie, ktoré sú schopné uskutočniť fenotypovú selekciu v transformovaných bunkách. Napríklad E. coli sa typicky transformuje pomocou pBR322, plazmidom odvodeným z druhov E. coli (viď napr. Bolivar et al., 1977). Plazmid pBR322 obsahuje gény pre rezistenciu voči ampicilínu a tetracyklínu, a tak je jednoduchým prostriedkom k identifikácii transformovaných buniek. Plazmid pBR alebo iný mikrobiálny plazmid alebo fág musí tiež obsahovať alebo sa modifikuje, aby obsahoval, promótory ktoré môžu byť použité prokaryotickými mikroorganizmami pre expresiu.

Najbežnejšie používané promótory pri konštrukcii rekombinantnej DNA zahrnujú B-laktamázu (penicilinázu) a systémy laktózového promótoru (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) a systém tryptofánového promótoru (trp) (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 036 776). Aj keď sú uvedené promótory najčastejšie používané, boli objavené a využité aj ďalšie mikrobiálne promótory a detaily týkajúce sa ich nukleotidových sekvencií boli publikované, čo odborníkovi umožňuje ich funkčne spojiť s plazmidovými vektormi (Siebwenlist et al., 1980). Určité gény z prokaryotických buniek môžu mať účinnú expresiu v E. coli

106 zo svojich vlastných promótorových sekvencii, čím sa dopredu vylúči potreba pridávať umelo iný promótor.

Okrem prokaryotických sa môžu použiť tiež eukaryotické mikróby, napríklad kvasinkové kultúry, kde by promótor bol schopný riadiť expresiu. Saccharomyces cerevisiase alebo bežné pekárske kvasinky sú najčastejšie používané eukaryotické mikroorganizmy, ale rad iných kmeňov je obecne dostupný, napríklad Pichla pastoris. Pre expresiu v Saccharomyces sa obvykle používa napríklad plazmid YRp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al.,1979; Tschemper et al., 1980). Tento plazmid už obsahuje gén trpí, ktorý poskytuje selekčný markér pre mutantný kmeň kvasiniek, ktorý nie je schopný rásť v tryptofáne, napríklad ATCC č. 44076 alebo PEP4-1 (Jones, 1977). Prítomnosť lézie trpí, ako charakteristického genómu kvasinkovej hostiteľskej bunky, potom poskytuje účinné prostredie pre detegovanie transformačného rastu v neprítomnosti tryptofánu.

Vhodné promótorové sekvencie v kvašinkových vektoroch zahrnujú promótory 3-fosfoglycerát kinázy (Hitzman et al., 1980) alebo iných glykolytických enzýmov (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), ako sú enoláza, glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza, hexokináza, pyruvát dekarboxyláza, fosfofruktokináza, glukóza-6-fosfát izomeráza, 3-fosfoglycerát mutáza, pyruvát kináza, trifosfát izomeráza, fosfoglukóza izomeráza a glukokináza. Pri konštruovaní vhodných plazmidov expresie sú terminačné sekvencie súvisiace s týmito génmi tiež napojené do expresného vektora 3' sekvencie, ktorá sa má exprimovať, aby poskytla polyadenyláciu mRNA a termináciu.

Iné promótory, ktoré majú ešte naviac výhodu transkripcie riadenej podmienkami rastu, sú promótorové oblasti pre

107 alkohol dehydrogenázu 2, izocytochrómu C, kyslú fosfatázu, degradačné enzýmy súvisiace s metabolizmom dusíka a skôr zmienenú glyceraldehyd-3-fosfát dehydogenázu a enzýmy zodpovedné za využitie maltózy a galaktózy. Vhodný je každý plazmidový vektor obsahujúci s kvasinkami kompatibilný promótor, začiatok replikácie a terminačné sekvencie.

Okrem mikroorganizmov sa ako hostitelia tiež môžu použiť bunkové kultúry odvodené z mnohobunkových organizmov. V podstate sa dá pracovať s každou takou bunkovou kultúrou, či už zo stavovcov alebo bezstavovcov. Najväčší záujem je však o bunky stavovcov a ich rozmnožovanie v kultúrach (tkanivová kultúra) sa stalo v posledných rokoch rutinným procesom (Tissue Culture, 1973). Príklady takýchto užitočných hostiteľských bunkových línii sú bunky VERO a HeLa, bunkové línie z vaječníkov čínskych chrčkov (CHO) a bunkového línie W138, BHK, COS-7 293 a MDCK.

Expresné vektory pre tieto bunky obvykle zahrnujú (pokial je to potrebné) začiatok replikácie, promótor umiestnený pred génom, o expresiu ktorého ide, spolu s akýmikoľvek potrebnými miestami, ktoré viažu ribosóm, strihové miesta RNA, polyadenylačné miesta a transkripčné terminátorové sekvencie.

Pre využitie . v bunkách cicavcov sú často riadiace funkcie vektorov expresie z vírusového materiálu. Napríklad obecne používané promótory sú odvodené z polyómu, z Adenovírusu 2 a najčastejšie zo Simian vírusu 40 (SV40). Prvotné a pozdnejšie promótory vírusu SV40 sú zvlášť užitočné, pretože sa obidva lahko získajú z vírusu ako fragment, ktorý tiež obsahuje SV40 vírusový začiatok replikácie (Fiers et al., 1978). Tiež sa môžu použiť menšie alebo väčšie fragmenty SV40 za predpokladu, že je zahrnutých približne 250 bp sekvencie

108 rozkladajúcej sa od miesta HindlII smerom k miestu BglI umiestnenému vo vírusovom začiatku replikácie. Ďalej je tiež možné, a často žiaduce, využiť promótorické alebo riadiace sekvencie obvykle súvisiace s požadovanou génovou sekvenciou za predpokladu, že tieto riadiace sekvencie sú kompatibilné so systémami hostiteľskej bunky.

Začiatok replikácie môže byť zaistený buď konštrukciou vektora s vloženým exogénnym začiatkom, ktorý napríklad môže byť získaný z SV40 alebo z iného vírusu (napr. Polyom, Adeno, VSV, BPV), alebo mechanizmom chromozornáInej replikácie hostitelskej bunky. Keď sa vektor integruje do chromozómu hostiteľskej bunky, druhý spôsob často stačí.

Kompozície vynálezu

Predmetom vynálezu je tiež imunogenická kompozícia, ktorá zahrnuje ako účinné imunogénne činidlo aspoň jeden z tu opísaných analógov vo zmesi s farmaceutický a imunologický prijateľným nosičom, · vehikulom, riedidlom, základom a voliteľné adjuvans, porovnaj tiež pojednanie o týchto entitách vo vyššie uvedenom opise spôsobov tohoto vynálezu.

Ďalej je predmetom vynálezu tiež zloženie kompozície pre indukciu produkcie protilátok proti akémukoľvek z vyššie uvedených nádorových antigénov; kompozícia zahrnuje

- fragment nukleovej kyseliny alebo vektor vynálezu a

- farmaceutický a imunologický prijatelné riedidlo a/alebo vehikulum a/alebo nosič a/alebo základ a/alebo adjuvans.

Príprava a iné zvláštnosti týkajúce sa týchto kompozícii sa už vyššie diskutovali v príslušnej časti tákajúcej sa imunizácie nukleovou kyselinou.

109

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1: Tradičné chápanie autóvakcinácie.

A: Tolerančné dominantné vlastné epitopy prezentované na MHC triedy II na nejakej bunke prezentujúcej antigén (APC) sú ignorované v dôsledku vyčerpania repertoáru T-pomocných buniek (Th) (T-pomocné bunky sú vyznačené bodkovanými čiarami). Vložené cudzie imunodominantné T-bunkové epitopy prezentované na MHC triedy II aktivujú T-pomocné bunky a Bbunky.

B: T-pomocné bunky a B- bunky špecifické pre natívne časti vlastného proteínu prezentujúceho cudzie imunodominantné T bunkové epitopy na . MHC triedy II sa aktivujú pomocou cytokínovej pomoci poskytovanej T pomocnou bunkou.

Obr. 2: Princíp autóvakcinácie pre vyvolanie reakcie CTL.

Vložené cudzie imunodominantné T bunkové epi.topy prezentované na MHC triedy II aktivujú T-pomocné bunky. CT lymfocyty rozpoznávaním subdominantných vlastných epitopov prezentovaných na MHC triedy I sa aktivujú priľahlými aktivovanými T-pomocnými bunkami.

Obr. 3: Schematické znázornenie polypeptidu Her2 s vyznačením epitopických oblastí a N-glykozylačných miest.

Sú predstavené 4 extracelulárne domény, transmembránová doména (TM) a 2 intracelulárne domény s vyznačením miest s rôznymi stupňami homológie a miest obsahujúcich predpokladané/určené CTL epitopy.

110

Obr.4: Schematické znázornenie ľudského PSM polypeptidu s vyznačením oblastí pre vloženie epitopov P2 a P30.

i

Obr. 5: FGF gény a proteíny.

A: Exón-intrónová štruktúra génov ľudského a myšieho FGF8.

Dole je znázornených osem rožných strihových foriem (z práce Gemel, 1996).

B: Aminokyselinová sekvencia rôznych izoforiem FGF8.

Polypeptidové časti jedinečné pre FGB8b, FGB8f a FGB8e sú vyznačené tučné, kurzívou alebo podtrhnutím písma. FGF8 je najkratším variantom, ktorý neobsahuje žiadnu z týchto zvýraznených sekvencii. Od signálneho peptidu sa očakáva, že sa pripojí cez C-koniec k Ala22. Dva cysteínové zvyšky nájdené vo hotovom FGF8 (všetky izoformy) sú vyznačené tučným podtrhnutím. Dve miesta možnej N-glykozylácie FGF8b sú označené Ň. Číslovanie odpovedá FGF8b.

Obr.’6: Znázornenie štyroch rôznych variantov FGF8b navrhnutých pre autovakcináciu.

Vrchný panel: Teoretické modely bodov vloženia epitopov používajúce ako chemický vzorec kryštálovú štruktúru FGF2.

Spodný panel: Aminokyselinové sekvencie divokého typu FGF8b (WT) a štyri varianty F30N, F2I, F30I a F2C. Signálny peptid je vyznačený jednoduchým podtrhnutím. Vložené peptidy sú podtrhnuté dvakrát. N-koncová sekvencia (MetAla) všetkých variantov je pre generovanie Kozákovej sekvencie (Kozák 1991) pre lepšiu transláciu v eukaryotických systémoch.

111

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Vakcinácia proti PSM

V nasledujúcom texte sa opíše, ako je možné vyvíjať ludskú autovakcína proti PSM modifikáciou molekuly vložením jedného alebo viacerých promiskuitných cudzích T bunkových epitopov, aby sa odkrylo pole imunogenizovaných PSM molekúl.

Prípravky budú testované z hľadiska schopnosti vyvolať špecifické odozvy CTL proti PSM nesúcim nádorové bunky. Ďalej budú prípravky testované z hľadiska schopnosti indukovať protilátky, ktoré sú krížovo reaktívne s natívnymi časťami molekuly PSM. Následne sa Vyhodnotí účinnosť rôznych prípravkov v niekolkých skúškach in vitro a v živočíšnych modeloch in vivo. Indukované protilátky sa budú testovať na ich schopnosť aktivovať komplement klasickou cestou a iniciovať ADCC cez Fc-receptory. Nakoniec sa budú rozdielne molekuly testovať na živočíšnych modeloch ľudského karcinómu prostaty.

Stratégia navrhovania PSM autovakcíny

V krátkosti, vakcinačný plán PSM vyžaduje tieto experimentálne úlohy:

Návrh a vytvorenie tabuľky ludských PSM mutantov

Klonovanie ludských a potkaních/myších PSM sekvencií. Mutačná práca pre vytvorenie imunogenizované hPSM molekúl.

Expresia divokých a imunogenizovaných hPSM molekúl v E. coli a/alebo Pichia pastoris a/alebo cicavčích bunkách a/alebo bunkách hmyzu (ako je bunková línia S₂) .

112

Čistenie, refolding a charakterizácia imunogenizovaných hPSM molekúl.

Vakcinácia DNA proti PSM

Vytvorenie hPSM DNA vakcinačných vektorov kódujúcich imunogenizované hPSM molekuly.

Testovanie hPSM vakcinačných vektorov v experimentoch in vitro a in vivo.

Výber kandidátov hPSM

Imunizácia myší/králikov.

- ELISA.

FACS analýza.

V prípade odozvy protilátky: skúška bujnenia nádorovej bunky.

Skúšky T-buniek.

Testovanie hPSM mutantov in vivo

- Model pevný nádor/metastáza v myšiach.

Koncepčná štúdia: indukcia CTL autovakcináciou

Zostavenie imunogenizovaných myších/potkaních PSM odpovedajúcich vybraným hPSM kandidátom (napr. vo forme DNA vakcín).

Testovanie imunitnej odozvy vyvolanej myšími/potkaními PSM mutantmi skúškami in vitro·. imunochemické skúšky, ELISA, FACS analýza, bunkové analýzy, komplementová lýzia buniek nesúcich PSM, skúška ADCC, skúška aktivity CTL, skúška bujnenia nádorovej bunky, skúšky prezentácie T-buniek.

Testovanie mPSM mutantov „in vivo v modeli pevný nádor/metastáza u myší.

113

Názvoslovie konštruktov hPSM

PSM je typom II membránového proteínu 750 aminokyselín, porovnaj sekvenčné identifikačné číslo: 2, ktoré dáva štyri sekvencie divokého typu s výnimkou, že Gly nahradzuje Trp v polohe 2 následkom zavedenia Ncol miesta a Kozákovej sekvencie do sekvenčného identifikačného čísla: 1, kde ggt nahradzuje tgg v polohách 4-6. Pre niektoré prípravky ludskej autovakcíny založenej na PSM sa však môže použiť aj natívny PSM (t.j. PSM majúci Trp v polohe 2).

Extracelulárnu časť PSM tvorí 707 aminokyselín s C-koncom, zatial čo o cytoplazmatickej oblasti sa. predpokladá, že má dĺžku 19 aminokyselín a transmembránová časť proteínu pozostáva z 24 aminokyselín (aminokyseliny 20 - 43) .

Ako východzí bod pre prípravky môže byť tiež použitý strihový variant PSM'. Naša verzia tohto strihového variantu má aminokyselinovú sekvenciu odpovedajúcu zvyškom 58 - 750 v sekvenčnom identifikačnom čísle: 2. Pre jednoduchosť názvoslovia sa oblasti v PSM' číslujú podľa číslovania v PSM (to znamená, že napr. oblasť 2 pozostáva z aminokyselín 87108 v PSM a aminokyselín 30-51 v PSM'), zrovnaj tiež nižšie uvedenú diskusiu týkajúcu sa sekvenčných oblastí.

Všetky genetické prípravky ludského PSM sa označujú hPSM . (alebo hPSM' . , ak sa ako východzí bod použije

PSM'), kde prvá je vstupná oblasť použitá pre vloženie P2 a druhá _ je vstupná oblasť pre P30. Keď P2 a P30 nie sú v proteíne, označuje sa číslom 0 (nula). Úplná dĺžka divokého typu hPSM sa označuje hPSMO.O a divoký typ hPSM bez cytoplazmatickej a transmembránovej časti sa označuje hPSM-^0.0. Trinásť plánovaných imunogenizovaných génov hPSM,

114

ktoré všetky obsahujú jeden P2 epitop a	jeden P30	epitop sa
pomenujú	hPSMl.l,	hPSM6.1, hPSM8.1,	hPSMI0.1,	hPSMI.6,
hPSMI.8,	hPSMI.10,	hPSMI.2, hPSMI.3,	hPSMI.5,	hPSM2.1,
hPSM3.1,	hPSMI0.3,	hPSM6.3, hPSM'10.3,	hPSM'6.3,	hPSM8.3,

hPSM'8.3 a hPSM5.1, detaily viď nižšie,

V hPSMl.l sa obidva epitopy P2 a P30 vložili v tandeme do vstupnej oblasti č. 1 (membránu pokrývajúca oblasť) . Teoreticky sa o tomto mutantovi hPSMl.l môže uvažovať ako o veľmi atraktívnom kandidátovi pre indukciu produkcie protilátky, pretože celá extracelulárna doména tejto molekuly je intaktná. Pre indukciu odoziev CTL s použitím imunizácie nukleovou kyselinou sú považované za užitočné také prípravky ako sú hPSM10.3 a hPSM6.3.

Pre uľahčenie postupov klonovania a mutagenézie sa urobilo mnoho molekulárnej konštrukčnej práce za použitia časti buď s N-koncom (aminokyseliny 1-436) alebo s C-koncom (aminokyseliny 437-750) génu hPSM ako východzieho materiálu. Tieto dve časti génu hPSM sa označujú hPSMI a hPSMII kde prvá _ je vstupná oblasť používaná pre vloženie ’P2 a druhá _ je vstupná oblasť pre P30. Opäť, keď P2 alebo P30 nie sú v proteíne, použije sa číslo 0 (nula) a divoké typy sa označujú hPSMIO.O a hPSMIIO.0. Špeciálny variant hPSMlO.O bez cytoplazmatickej časti hPSM sa označuje hPSMI-í-0.0.

Väčšina mutagenéznej práce sa prakticky uskutočnila s použitím hPSMIO.O a hPSMIIO.O ako východzieho materiálu.

Exprimované hPSM mutantné proteíny sa budú označovať

PROS_._, kde; prvá _ je vstupná oblasť používaná pre vloženie P2 a druhá _ je vstupná oblasť pre P30. Keď P2 alebo P30 nie sú v proteíne, označuje sa ako 0 (nula). Divoký

115 typ hPSM sa označujú PROS.O. Pre proteínový produkt hPSM aminokyselín 437-750 je označenie PROSIIO.O. Proteíny s HIS značením sa nazývajú HIS-PROS_._. Ako His značenie sa použilo sekvenčné identifikačné číslo: 21 pre expresiu v kvasinkách a baktériách, zatial čo sekvenčné identifikačné č.: 23 pre expresiu v bunkách cicavcov.

Klonovanie ludskej sekvencie PSM

Bunková línia LNCaP, ktorá má svoj pôvod v metastázových léziách ludského prostatového adenokarcinómu sa zakúpila od American Type Culture Collection (ATCC). Z tejto bunkovej línie sa izoluje mRNA a podrobí sa reverznej transkripcii s použitím štandardnej súpravy, aby sa získala cDNA kódujúca ľudskú PSM sekvenciu. S použitím rozdielnych sád špecifických primerov hPSM sa získajú PCR produkty kódujúce PSM(437-750) a ďalej sa klonujú do pUcl9 (plazmid č. pMR300) a overujú sa sekvenovaním DNA. Tato C-koncová časť divokého typu PSM sa označuje hPSM časť II (hPSMIIO.O).

Podobne sa klonuje divoký typ hPSM časť I (hPSMIO.O) do pUcl9 s použitím primárov pre zosilnenie časti I tak s (hPSMIO.O) ako aj bez (hPSMIIO.O) transmembránových a cytoplazmatických domén. Klony sa riadene sekvenujú a hPSMIO.O a hPSMIIO.O sa fúzujú pomocou ligácie v mieste EcoRI. Výsledné klony hPSMO.O (sekv. id. č.: 2) a hPSMIO.O sa subklonujú do radu prokaryotických a eukaryotických expresných vektorov a sekvencie sa opäť overia. Intracelulárne exprimované formy ľudskej PSM (označené hPSM' - aminokyseliny 58-750 sekv. id. č. : 2) sa tiež konštruujú s použitím cDNA ako východzím materiálom. Tato sekvencia sa tiež subklonuje do cicavčích expresných vektorov a použije sa ako východzí materiál pre

116 niektoré konštrukty hPSM autovakcín, napr. hPSM'10.3 a hPSM'6.3.

Klonovanie potkaních a myších PSM sekvencií

Dva klony EST (expressed sekvence tag) obsahujúce cDNA sekvencie myších PSM (z obličiek plodov myší a myších makrofágov) sa zakúpili od American Type Culture Collection (ATCC). Tieto EST klony spolu pokrývajú myšiu sekvenciu PSM cDNA, a tým tak celú dĺžku myšieho PSM (sekv. id. č.: 7 a 8) ako aj. myší PSM'(sekv. id. č.: 9 a 10) a subklonujú sa do bakteriálnych vektorov a cicavčích expresných vektorov. Myšie PSM autovakcínové konštrukty sa môžu tiež pripraviť vložením P30 do cDNA myšieho PSM.

Expresia divokého typu hPSM v E. coli

C-koncová časť (aminokyseliny 437-750) hPSM, hPSMIIO.O sa klonuje do bakteriálneho expresného vektora pET28b, aby sa získal produkt s N-koncovým polyhistidínovým chvostom (HIS), ktorý ' napomáha jednoduchému čistenie vo veľkom merítku a identifikácii s protilátkami anti-poly-HIS. Proteínový produkt označený poly-HIS, hPSMIIO.O (proteínový produkt budúceho HIS-PROSIIO.0), sa exprimuje v E. coli.

DNA kódujúca skrátený divoký typ ludskej PSM, hPSM-s-cytO.0 sa tiež exprimovala z pET28b kmeňa E. coli BL21(DE3), kde sa produkt expresie lokalizuje v inklúznych telieskach. SDS-PAGE analýza bakteriálneho lyzátu ukázala produkt s očakávanou migráciou a Western blotting analýza s králičím anti-HISPROSIIO.O tiež dáva predpokladaný pás. Ďalej N-koncové sekvenovanie piatych aminokyselín tohoto produktu eluovaného z SDS-PAGE gélu dáva očakávané aminokyselinové sekvencie.

117

Konštrukty divokého typu hPSM, hPSMO.O, hPSMAO.O (rovnako ako dva hPSM mutanty, hPSMl.l a hPSM6.1, viď ďalej)' sa klonovali do rôznych expresných vektorov E. coli, aby sa umožnila účinnejšia expresia a určitý stupeň posttranslačnej úpravy („folding) rekombinantných proteínov v E. coli. Vybrané systémy expresie sú:

PMCT6, ktorý vytvára obmeny N-koncových HIS označených expresných rekombinantných proteínov,

PGH433, ktorý exprimuje rekombinantné proteíny v súvislosti s 22 aminokyselinami pelB vedúcej sekvencie, ktorá by mala smerovať proteín do periplazmatického priestoru baktérie E. coli a

PMal-p2, v ktorom sú rekombinantné proteíny exprimované ako C-koncové fúzie proteínu viažuceho maltózu (MBP) obsahujúce prírodnú MBP periplazmatickú vedúcu sekvenciu. Protilátky proti MBP sa môžu použiť k detekcii fúzie proteínov a uhlovodíkový pripojený stĺpec sa môže použiť na afinitné čistenie produktu.

Avšak experimenty expresie divokých typov proteínov hPSM z týchto vektorov na E. coli ukázali zreteľnú úroveň expresie len z pMCT6. Problémy získania periplazmatickej expresie divokých typov proteínov hPSM nie sú dnes ešte vyriešené.

Expresia divokého typu hPSM v Pichia pastoris

Vzhladom k relatívne vysokej molekulovej hmotnosti proteínu PSM a relatívne vysokému stupňu jeho glykozylácie (približne 16 % molekulovej hmotnosti) a preto, aby sa uľahčilo čistenie bez stabilizačného kroku, rozhodlo sa použiť alternatívnu

118 technológiu pre eukaryotickú expresiu rekombinantných proteínov. Niekolko dobre charakterizovaných eukaryotických expresných systémov sa vyhodnotilo a pre počiatočný screening hPSM mutantov sa vybrali kvasinky Pichia pastoris ako alternatíva k expresii na E. coli.

Systém expresie založený na kvasinkách Pichia pastoris sa aplikuje na PSM konštrukciách. Očakáva sa, že sa glykozylačný profil rekombinantných proteínov exprimovaných v tomto organizme viacej podobá cicavčiemu glykozylačnému profilu než napr. Saccharomyces cerevisiae vzhladom k menej rozvetvenej mänozylácii rekombinantného proteínu. Ukázalo sa, že absorpcia antigénov dendritickými bunkami sprostredkovaná receptormi manózy dáva asi stokrát účinnejšiu prezentáciu T bunkám v porovnaní s endocytickou absorpciou v kvapalnej fázy. Preto manozylácia môže hrať úlohu v antigenicite (a predovšetkým v schopnosti vyvolať CTL odozvu) u hPSM mutantov a iných antigénov, proti ktorým je CTL odozva žiaduca.

Kmeň Pichia pastoris, rovnako ako aj dva rôzne expresné vektory sa zakúpili od Invitrogénu. Vektor pPICZo/A nesie metanolom indukovatelný promótor, ktorý sa nachádza pred polyklonovým miestom, zatial čo vektor pGAPZaA exprimuje proteíny nezávisle. Obidva vektory kódujú sekrečný signál afaktoru, aby sa rekombinantné proteíny exportovali do média. Selekčný systém týchto vektorov je odolný voči zeocínu. Sekvencie kódujúce hPSMO.O a hPSM-^O.O (rovnako ako jeden mutant hPSM, hPSM.l, porovnaj ďalej) sa subklonovali do týchto vektorov (v skladbe s C-koncovým c-myc identifikačným epitopom, sekv. ident. č.: 27).

Štyri kmene Pichia pastoris (X-33, SMD1168, GS115 a KM71) odlišujúce sa napríklad podmienkami rastu sa transformovali

119 s každým z týchto (linearizovaných) plazmidov s využitím elektroporácie. Transformačný proces sa niekoľkokrát opakoval s menšími obmenami, aby sa získal veľký počet klonov rezistentných k zeocínu. Expresia divokého typu hPSM-^0.0 (rovnako ako hPSMl.l, viď ďalej) sa získala v systéme Pichia pastoris. Produkty expresie by sa mohli primárne detegovať vo Western blotting lyzátoch transformantov Pichia pastoris tak s použitím monoklonovej protilátky anti-hPSM, ako aj monoklonovej protilátky anti-c-myc. Rekombinantné produkty sa však detegovali intracelulárne.

Expresia divokého typu hPSM v cicavčích bunkách

Ku konečnému testovaniu a produkcii vybraných molekúl sa tiež zavedie expresný systém CHO (chinese hamster ovary vaječníky čínskych chrčkov) buniek.

Doposiaľ sa CHO. bunky transfektovali typom hPSM a hPSMl.l v rámci hlavných sekvencii (prípadne bez nich) v cicavčom expresnom vektore pcDNA3.1. Získali sa bunky rezistentné voči geneticínu. V bunkách COS prechodne transfektovanými tými istými konštruktmi boli detegované tak hPSMO.O ako aj hPSMl.l vo Western blotting analýze bunkových peliet s použitím monoklonovej protilátky anti-hPSM.

Tkanivové rozloženie hPSM

K určeniu, či hPSM expresia môže byť detegovaná v rôznych ľudských orgánoch, vrátane prostaty, krvi a mozgu, sa kúpil komerčný súbor. Metóda je založená na detekcii bodovej škvrny polyA, ktorá obsahuje mRNA extrahovanú z 50 rôznych ľudských tkanív. Predbežné výsledky neukazujú hyperexpresiu hPSM v tkanivách, ako je krv alebo mozog. Avšak po dátumu priority

120 predloženej prihlášky iný autori demonštrovali prítomnosť PSM v iných tkanivách (porovnaj vyššie).

Návrh hPSM mutantov

Pri navrhovaní mutačného postupu s PSM je velmi dôležité zachovať niektoré oblasti proteínu v modifikovaných konštruktoch, napríklad potencionálne a identifikované T bunkové epitopy, B bunkové epitopy a disulfidové môstiky cysteínových zvyškov. Preto, po určení takýchto „zakázaných oblastí vnútri sekvencie PSM, zostane obmedzený počet „otvorených oblastí 20 alebo viacej aminokyselín, ktoré sú vhodné pre výmenu s cudzími T pomocnými epitopmi P2 a/alebo P30. Podľa definície sa tiež transmembránová oblasť považuje za „otvorenú, pretože autoprotilátky zamerané proti tejto oblasti nie sú relevantné a predpokladá sa, že eliminácia tejto sekvencie zvýši rozpustnosť mutovaných PSM proteínov, ale nie je možné vylúčiť, že tato oblasť obsahuje dôležité CTL epitopy, a preto sa transmembránová oblasť uchováva v napr. hPSM10.3.

Podľa nášho očakávaním, že autovakcína indukuje odozvu CTL, by bolo dôležité identifikovať a zachovať potenciálne subdominantné CTL epitopy v konštruktoch. Dva takéto epitopy sú známe z literatúry: 1) peptid zahrnujúci PSM aminokyseliny

4-12 (LLHETDSAV) môže byť prezentovaný na Iudskej molekule MHC triedy I HLA-A2.1 (Tjoa 1996) a 2) PSM(711-719) (ALFDIESKV) tiež viaže HLA-A2.1 (Earp 1995). Podrobne sme tiež skúmali PSM aminokyselinovú sekvenciu, aby sme hlavne identifikovali zakotvené zvyšky HLA triedy I, ako opisujú Rammensee a kol. (Rammensee 1995), pre najrozšírenejšie typy HLA triedy I (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A23, HLA-A24 a HLAA28), ktoré dovedna tvoria 80 % HLA-A typov v Iudskej

121 populácii. Podobne sa identifikovali potenciálne HLA-B a HLAC epitopy a označili ich ako „zakázané oblasti.

Pretože pôvodným zámerom bolo použiť C57/black x SJL F1 hybridnú myš, po rozhodnutí používať pre testovanie PSM autovakcínových konštruktov transgenetické myši, boli určité T pomocné epitopy potencionálnych myší H-2^b a H-2^Sidentifikované a označené ako „zakázané oblasti (Rammensee 1995).

Dôležité je tiež zachovať známe väzobné oblasti protilátok v molekule PSM, pretože by mohli byť dôležité pre indukciu špecifických vlastných protilátok proti PSM. Bolo už opísaných päť takých oblastí: PSM(63-68), PSM(132-137), PSM(482-487) (WO 94/09820), PSM(716-723) a PSM(l-7) (Murphy

1996). S použitím počítačovej metódy Hoppa a Woodsa k prognóze antigénových determinantov bolo predpovedaných päť oblastí: PSM(63-69), PSM(183-191) , PSM(404-414), PSM(479-486) a PSM(716-723) (Hopp 1983), z ktorých sa niektoré prekrývali s experimentálne nájdenými B bunkovými epitopmi. Tieto oblasti sa tiež zachovávajú v molekulách kandidujúcich na PSM vakcínu.

PSM proteín obsahuje 4 cysteínové aminokyselín 22, 196, 466 a 597), ktoré v imunogenizovaných konštruktoch kvôli ich významu pri tvorbe disulfidových môstikov.

zvyšky (pozície budú zachované . potencionálnemu

Na základ vyššie uvedených „zakázaných a „otvorených oblastí v hPSM proteíne sa určilo 10 oblastí vhodných pre vstup cudzích T pomocných epitopov:

Vstupné oblasti v hPSMI (od iniciačného miesta do miesta

122

EcoRI, aminokyseliny (aa) 1-437):

Oblasť	1:	aa po	16-52 v PSM (4 TM = 37 aa).	aa pred TM,	TM (24 aa) a
Oblasť	2:	aa	87-108 v PSM, aa 30-51 v PSM' (22 aa)
Oblasť	3:	aa	210-230 v PSM,	aa 153-173 v	PSM' (21 aa)
Oblasť	4:	aa	269-289 v PSM,	aa 212-232 v	PSM' (21 aa)
Oblasť	5:	aa	298-324 v PSM,	aa 241-267 v	PSM' (27 aa)
Vstupné	oblasti v hPSMII (od	EcoRI do konečného miesta
437-750)
Oblasť	6:	aa	442-465 v PSM,	aa 385-408 v	PSM' (24 aa)
Oblasť	7:	aa	488-514 v PSM,	aa 431-457 v	PSM' (27 aa)
Oblasť	8:	aa	598-630 v PSM,	aa 541-573 v	PSM' (33 aa)
Oblasť	9:	aa	643-662 v PSM,	aa 586-605 v	PSM' (20 aa)
Oblasť	10	: . aa	l 672-699 v PSM,	aa 615-642 v PSM' (28 aa)

Vstupné oblasti, rovnako ako „zakázané oblasti, znázorňuje obr. 4.

Rad rôznych imunogenizovaných PSM konštruktov sa pripraví substitúciou segmentu aminokyselín z dvoch vyššie uvedených oblastí za P2 alebo P30. Každý mutantný proteín bude teda obsahovať P2 ako aj P30 a hoci takéto konštrukty slúžia len ako príklady - predmetom predkladaného vynálezu sú tiež jednotlivé mutanty. Experimentálne sa mutácie pripravia v klonoch hPSMI, resp. HPSMII cDNA a dve mutované časti budú následne kombinované pomocou ligácie (v polohe EcoRI). Epitopy P2 a P30 sa najprv vložia do vstupných oblastí 1, 2, 3, 5, 6, 8 a 10, aby sa vytvorili mutanty.

P2 a P30 sekvencie sú:

123

Ρ2: QYIKANSKFIGITEL (sekv. id. č.: 12, 15 aminokys.), v tomto prípade kódovanom nukleotidovou sekvenciou cag tac atc aaa get aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg (sekv. id. č.: 11, 45 nukleotidov), kde tučné vyznačená šekvencia je miesto Sací. V závislosti na voľbe klonového vektora a systému expresie môžu nastať aj iné voľby kodónov.

P30: FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (sekv. id. č.: 14, 21 aminokys.), v tomto prípade kódovanom nukleotidovou sekvenciou ttc aac aac ttc acc gta agc ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt agc gCT AGC cag_gig gaa (sekv. id. č.: 13, 63 nukleotidov), kde tučné označenie odpovedá miestu HindlII, jednoduché podtrhnutie miestu £co47III, veľké písmená miestu BstNI a dvojité podtrhnutie miestu Nhel.

Nasledujúca tabuľka zhrňuje ľudské PSM prípravky používané v tomto vynáleze:

Konštrukt	pozícia P2 v proteíné	pozícia P30 v proteíne
hPSMO.0	4-	4-
hPSM4-0.0	4-	4-
hPSM'0.0	4-	4-
hPSMl.1	17-31	32-52
hPSM6.1	448-462	21-41
hPSM8.1	606-620	21-41
hPSMl0.1	674-688	21-41
hPSMl.6	24-38	443-463
hPSMl.8	24-38	607-627
hPSMl.10	24-38	673-693
hPSMl.2	24-38	87-107
hPSMl.3	24-38	210-230
hPSMl.5	24-38	301-321
hPSM2.1	91-105	21-41

124

hPSM3.1	213-227	21-41
hPSM5.1	305-319	21-41
hPSM8.0	606-620	-?
hPSMIO.O	674-688	-ŕ
hPSMO.1	-?	21-41
hPSMl.O	24-38	-ť
hPSM6.3	448-462	210-230
hPSM8.3	606-620	210-230
hPSM10.3	674-688	210-230
hPSM'6.3	391-405	153-173
hPSM'8.3	549-563	153-173
hPSM'10.3	617-631	153-173

Molekulové konštrukcie hPSM mutantov

Mutácie pre vloženie sekvencií kódujúcich P2 a P30 sa pripravili s použitím tak hPSMIO.O ako aj hPSMIIO.O ako východzieho materiálu.

Pre vytvorenie väčšiny hPSM mutantov sa P2 a P30 najprv vložia do hPSMIO.O vo vstupnej pozícii 1. Výsledný materiál (hPSMIl.O, resp. HPSMIO.l) sa následne použije ako východzí materiál pre mutagenéziu, aby sa P2 a P30 vložili do pozícií 2, 3 a 5 a pre ligáciu s epitopom mutujúcim hPSMII. HPSMIl.O sa konštruoval použitím SOE (single overlap extension) PCR a následným overením sekvencie. hPSMIO.l sa konštruoval použitím technikou „Quick Change a následným overením sekvencie.

P2 epitop sa vloží do hPSMIl.O v polohách 2, 3 a 5 s použitím SOE-PCR za vzniku hPSMI1.2, hPSMI1.3 a hPSMI1.5. Tieto konštrukcie sa kombinujú s hPSMIIO.O za vzniku hPSM1.2,

125 hPSM1.3 a hPSM1.5.

HPSMI2.1, hPSMI3.1 a hPSMI5.1 sa konštruovali pomocou SOEPCR s použitím hPSMIO.l ako východzím materiálom. Tento materiál sa zhromaždil s hPSMIO.O pomocou ligácie v mieste

EcoRI, aby sa vytvorili mutanty s úplnou dĺžkou hPSM2.1, hPSM3.1 a hPSM5.1.

P2 epitop sa vložil do troch rôznych pozícií hPSMIIO.O, aby sa vytvorili hPSMII6.0, hPSMII8.0 a hPSMIIlO.O technikou „Quick Change a sled týchto klonov sa následne overil.

Následne bol hPSMIO.l spojený s hPSMII6.0, hPSMII8.0 a hPSMIIlO.O, aby sa získali hPSM6.1, hPSM8.1 a hPSMIO.l a klony boli sekvenčne overené.

Zaradenie P30 epitopu do hPSMII sa uskutoční súčastne, aby sa vytvorili hPSMII0.6, hPSMII0.8 a hPSMIIO.10 s použitím SOE-PCR.

HPSM1.1 bol konštruovaný použitím dvoch dvoj krokových mutácií PCR nasledovaných ligáciou na HindlII mieste vnútri sekvencie epitopu. Úplná dĺžka konštruktu sa sekvenčne overila.

hPSM10.3, hPSM'10.3 a hPSM6.3 sa zostavujú s použitím SOEPCR. Niektoré iné varianty hPSM s P2 a P30 zaradenými do extracelulárnej časti hPSM sa bežne konštruujú (hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM'8.3).

Okrem pôvodne uvažovaných mutantov, z ktorých každý obsahuje tak P2 ako aj P30, sa zostavili štyri mutanty obsahujúce len jeden cudzí epitop a ich sled sa overil:

126 hPSMl.O, hPSM8.0, hPSMIO.O a hPSMO.1.

Expresia hPSM mutantov v E. coli

V experimentoch v malom merítku sa podrobilo sedem hPSM mutantov, hPSMl.l, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSMIO.l, hPSM2.1, hPSM3.1 a hPSM5.1 expresii z pET28b v kmeni E. coli BL21 (DE3) a IPTG indukovatelné produkty s očakávanou veľkosťou boli identifikované pomocou Coomassie Blue zafarbenými SDSPAGE gélmi. Produkt hPSMl.l však nebol detegovatelný. Hladiny expresie týchto mutantov boli veľmi nízke pri porovnaní s produktmi konštruktu divokého typu hPSMri-0.0. Z tohoto dôvodu sa nedá očakávať uspokojujúca úroveň expresie hPSM mutantov s použitím pET systému v E. coli, preto je potrebné použiť iné systémy expresie E. coli a/alebo iný hostiteľský organizmus.

Ako sa uvádza vyššie, hPSM6.1 a hPSMl.l sa subklonujú do rozdielnych expresných vektorov E.coli, aby sa vytvorili

- N-konové His-značkované obmeny exprimovaných rekombinantných proteínov s použitím vektora pMCT6,

- obmeny proteínov exprimované s pelB vedúcou sekvenciou, ktorá smeruje proteín do periplazmického priestoru baktérie E. coli s použitím vektora pGH433 a

- obmeny rekombinantných proteínov exprimovaných ako Ckoncový fúzny proteín k proteínu viažucemu maltózu (MBP) s použitím vektora pMal-p2.

Doposiaľ sa nepodarilo získať dostatočnú úroveň expresie zo žiadneho z týchto prípravkov.

Pretože hPSMO.0 má zreteľnú expresiu v E. coli, zatial čo podobná úroveň expresie hPSMO.0 s úplnou dĺžkou alebo hPSM

127 mutantov nebola pozorovaná, je možné, že prítomnosť cytoplazmatickej časti hPSM molekuly môže nejakým spôsobom „inhibovať expresiu prípravkov hPSM s úplnou dĺžkou v E. coli. Pre overenie tejto hypotézy sme najprv pripravili dva genetické prípravky hPSMl.1 a hPSM6.1 bez cytoplazmatických domén. Pri experimentoch v E. coli však tieto -^cyt génové produkty mali len slabú expresiu.

Expresia mutantov hPSM v Pichia pastoris

Pre expresiu hPSMl.1 mutantného proteín z kvasiniek Pichia pastoris, sa sekvencia hPSMl.l subklonuje (v rámci s c-myc Ckoncovým identifikačným epitopom, sekv. id. č: 27) do dvoch rôznych expresných vektorov pPICZaA a pGAPZaA a sekvencie sa overia. Expresia hPSMl.l (ako aj hPSM+O.O, viď vyššie) sa deteguje intracelulárne v transformantoch Pichia pastoris.

Expresia mutantov hPSM v cicavčích bunkách

Ako už bolo zmienené vyššie, hPSMl.l sa subklonoval do cicavčích expresných vektorov pcDNA3.1(+) a pZeoSV2 a tieto (aj iné) prípravky môžu byť použité pre expresiu v napr. CHO bunkách. Prechodná expresia hPSMl.l ako aj hPSMO.O bola získaná v COS bunkách, ako sa overilo metódou Western blotting.

DNA vakcinácia

DNA vakcinácia, pokial je účinná, sa velmi dobre hodí pre PSM autovakcínu - zvlášť preto, lebo sa ukázalo, že táto forma podania podporuje tak imunitné reakcie sprostredkované CTL, ako aj tvorbu protilátok. Preto bolo zámerom uskutočniť paralelnú štúdiu s cieľom vyskúmať účinok DNA vakcinácie myší

128 s vhodnými vektormi kódujúcimi ubiquitín imunogenizovaných myší a/alebo myší TNFoí. DNA vakcinácia s hPSM (a/alebo s mutantmi) kódujúca DNA ako takú sa tiež uskutoční.

Štúdium uskutočnitelnosti s použitím imunogenizovaného ubiquitínu pre DNA vakcináciu

Štúdium uskutočniteľnosti stanovujúce účinok DNA vakcinácie s imunogenizovaným vlastným proteínom sa uskutočnila s použitím ubiquitínu s vloženým T pomocným epitopom z vaječného albumínu (UbiOVA) ako modelovým proteínom. Sekvencie kódujúce UbiOVA ako aj divoký typ ubiquitínu sa subklonovali do cicavčieho expresného vektora pcDNA3.1(-).

Skupiny myší 5 BALB/c sa imunizovali 40 pg pcDNA-UbiOVA alebo pcDNA-ubiquitínového prípravku buď intramuskulárne do kvadriceptu alebo intradermálne. Kontrolná skupina dostávala proteín UbiOVA v úplnom Freundovom adjuvans. Po troch a šiestych týždňoch sa imunizácia opakovala len s tým rozdielom, že UbiOVA proteín sa emulgoval v neúplnom Freudovom adjuvans.

Myšiam sa pravidelne odoberala krv a stanovoval sa titer protilátky proti ubiquitínu. Vo skupine UbiOVA vakcinovanej DNA sa získal len veľmi slabý titer protilátky proti ubiquitínu. Následne boli všetky skupiny podporené UbiOVA proteínom v neúplnom Freundovom adjuvans a odoberali sa vzorky krvi, aby sa zistilo, či vakcinácia UbiOVA a (a nie ubiquitínom) znásobí odozvu protilátok proti UbiOVA proteínu. Výsledky tohoto experimentu ukázali, žé nie je podstatný rozdiel medzi UbiOVA skupinou a kontrolnou skupinou, u všetkých myší sa silno vyvíjali protilátky proti ubiquitínu na základe tejto jedinej podpory UbiOVA/FIA.

129

DNA vakcinácia s použitím hPSM prípravkov

Priebežne sa uskutočňujú rôzne experimenty s použitím hPSM prípravkov. Rôzne divoké typy ľudskej PSM a autovakcinačných prípravkov (ako napr. hPSMO.O, hPSM-?0.0, hPSM'0.0, hPSMl.l, hPSM10.3) sa subklonovali do DNA vakcinačných vektorov (ako pcDNA3.1( + ), pcDNA3.1(-), pVAX a p'ZeoSV2). Do niektorých konštrukcií sa zahrnuli rôzne vedúce sekvencie (ako CDlla, tPA a IL5 vedúca sekvencia; sekv. id. č: 29, 25 a 31) priamo cez N-konce a do kostry, aby sa umožnila sekrécia exprimovaných hPSM proteínov in vivo. Všetky konštrukcie v DNA vakcinačných vektoroch sa overili sekvenovaním DNA a transláciou in vitro.

Rôzne druhy myší (ako Balb/cA, Balb/cJ, DBA/2 a A/J) boli naočkované vyššie opísanou hPSM DNA vakcínou buď intradermálne alebo intramuskulárne a vakcinácia sa niekoľkokrát podporila rovnakými prípravkami.

Vzorky séra sa odoberajú behom imunizačnej doby a skladujú sa pri -20 °C. Tieto vzorky sa potom budú analyzovať na prítomnosť protilátok reaktívnych s divokým typom hPSM.

U týchto myší sa tiež zaviedla skúška na monitorovanie rýchlosti množenia CTL a T pomocných buniek.

Predbežné výsledky naznačujú, že vyvolanie odoziev tak CTL ako aj protilátok proti PSM je možné uskutočniť.

130

Čistenie/charakterizácia hPSM s HIS-značkovaním (437-750) (HIS-PROSIIO.0)

Divoké hPSMII s HIS-značkovaním (HIS-PROSIIO.0), sú exprimované z pET28b a solubilizované inklúzne telieska sa nanesú na stĺpec FPLC gélovej filtrácie a eluujú sa pufrom, ktorý obsahuje 8 M močovinu. Pre optimalizáciu postupu sa frakcie, ktoré prevážne obsahujú hPSM, podrobia rôznym refolding podmienkam. U rozpusteného produktu dialyzovaného proti Tris pufru sa s použitím strieborne zafarbenej SDS-PAGE určila čistota vyššia než 90 %.

Králiky sa imunizovali prečisteným HIS-PROSIIO.0, aby sa výsledné antisérum použilo k pozdnejšej detekcii a prípadnému afinitnému čisteniu hPSM mutantov.

Čistenie/charakterizácia rozpustných hPSM (PROS-ŕO.O)

Divoký typ hPSM bez cytoplazmatickej a transmembránovej časti, PROS+0.0, sa exprimuje v kmeni E. coli BL21 (DE3) na základe indukcie s IPTG a mohol byť detegovaný v inklúznych telieskach. SDS-PAGE tohoto bakteriálneho lyzátu a následná Western blotting s králičím anti-HIS-PROSIIO.0 ukázali produkt s očakávanou migráciu. N-koncové sekvenovanie prvých piatych aminokyselín tohoto produktu eluovaného z SDS-PAGE gélu ukázalo očakávanú sekvenciu odpovedajúcu ľudskému PSM. Produkt sa podrobil rozsiahlym sériám solubilizačných a refolding experimentov. Produkt, ktorý zostane v roztoku, sa môže získať v Tris pufri bez denaturantov alebo reduktantov, ale SDS-PAGE analýza odhalila, že materiál pravdepodobne vytvára velké agregáty. Myši a králičí sa imunizovali týmto materiálom, aby sa získala protilátka proti hPSM, napríklad pre analytické účely - antiséra nereagujú

131 s LNCap hPSM.

Pripravila sa dávka premytých inklúznych teliesok E. coli k imunizácii králikov, aby sa vytvorilo polyklonálne antisérum proti PSM. Približne 50 % obsahu proteínu vo vlhkom peletizovanom materiále tvoril PROSTO.0. Antiséra nereagujú s LNCap hPSM vo Western blotting.

Príprava peptidov hPSM konjugovaných s KLH pre imunizáciu

Tri pentadekamérne peptidy sa syntetizovali, aby sa pripravili imunogénne konjugáty B bunkových epitopov známeho hPSM s molekulou imunologického nosiča, a tak sa získalo polyklonálne antisérum schopné rozpoznať hPSM. Tieto peptidy obsahujú na každom konci B-bunkový epitop PSM a 5-6 ohraničujúcich PSM aminokyselín.

Peptidy sa pripravujú automatickou syntézou, HPLC čistením a kontrolným sekvenovaním Edmanovou degradáciu.

Chemicky viazané konjugáty sa pripravujú sieťovaním epitopu B bunky obsahujúceho hPSM peptidy KLH v štandardnom jednokrokovom procese s glutáraldehydom ako sieťovadlom.

Syntéza peptidov P2 a P30 s ohraničujúcimi hPSM sekvenciami

Bolo navrhnutých šesť peptidov, ktoré odpovedajú P2 a P30 epitopom s 5 ohraničujúcimi hPSM aminokyselinami na každom konci. Ohraničujúce aminokyseliny odpovedajú vstupným miestam epitopu 6, 8 a 10. Peptidy sa použijú napríklad v testoch množenia T-buniek, ale tiež pre iné účely, ako ELISA a iné skúšky in vitro. Peptidové sekvencie sú:

132

PSMpep007	P2 vložený v pozícii 6
QERGVQYIKANSKFIGITELRVDCT (sekv.	id. č. :	15)
PSMpepOO8	P2 vložený v pozícii 8 AWLRQYIKANSKFIGITELEMKTY (sekv.	id. č.:	16)
PSMpep009	P2 vložený v pozícii 10 MFLERQYIKANSKFIGITELHVIYA (sekv.	id. č.:	17)
PSMpepOlO	P30 vložený v pozícii 6 NSRLLFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEVDCTP	(sekv. id	. č. :
PSMpepOll	18) P30 vložený v pozícii 8 WLRKFNN FTVŠ FWLRVPKVS AS HLE S FDS L	(sekv. id	. č. :
PSMpep012	19) P30 vložený v pozícii 10 LMFLEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEPSSHN	(sekv. id	. č:
Epitopy P2	20) a P30 sú podtrhnuté. Peptidy	sa pripravili
automatickou	syntézou a podrobili sa procesu	HPLC čistenia,
po ktorom	nasledovalo kontrolné sekvenovanie Edmanovou

degradáciou.

Testy imunogenity

Rôzne experimentálne projekty boli iniciované pre výrobu materiálu a pre zavedenie skúšok imunogenicity určené pre budúce testovanie a výber medzi mutovanými PSM prípravkami.

Vytváranie polyklonových králičích anti-HIS-PROSIIO.0 a antiKHL-PSM-peptidových konjugovaných antisér

Dva králiky sa imunizovali prečisteným HIS-PROSIIO.0, Ckoncovou časťou hPSM proteinu s HIS-značkovaním

133 (aminokyseliny 437-750) emulgovanou 1:1 s kompletným Freundovým adjuvans a dvakrát, podporenou (v 28. a 55. dni) rovnakým antigénom emulgovaným v neúplnom Freundovom adjuvans.

Dva králičí sa imunizovali koktailom pozostávajúcim z konjugátu peptidu KLH-PSM plus každý z troch volných peptidov. Každý z týchto volných peptidov obsahoval skôr definovaný Bbunkový epitop hPSM. Koktail sa emulgoval 1:1 s úplným Freundovým adjuvans. Králičí sa preočkovali dvakrát (v 28. a

55. dni) rovnakým antigénom emulgovaným v neúplnom Freundovom adjuvans.

Krížová reaktivita medzi anti-HIS-PROSIIO.0 a PSMpepOO5 a krížová reaktivita medzi konjugátom anti-KLH-PSM peptidu plus peptidmi a HIS-PROSIIO.0 sa demonštrovala testom ELISA. AntiHIS-PROSIIO . 0 protilátka má schopnosť rozpoznať prirodzené hPSM v lyzátoch buniek LNCaP vo Western blotting.

Imunizácia myší retrovírusovo exprimovaným hPSMO.O

V súčasnom stave PSM projektu je stále vážnou prekážkou nedostatok protilátok, ktoré sú schopné rozpoznať správne posttranslačne upravené natívne hPSM. Preto sa uskutočnil imunizačný experiment s použitím retrovírusovo exprimovaného hPSMO.O.

Šesť skupín Balb/c myší sa imunizovalo buď: 1) mitomycínom C spracovaným BALB/c bunkami 'f ibrosarkómu (79.24.H8), prenášaným hPSMO.O cDNA (CMV-Koz-hPSM), 2) mitomycínom C spracovaným BALB/c bunkami fibrosarkómu (79.24.H8), prenášaným prázdnym vektorom (CMVBipep) , 3) bunkami v balení BOSC transfektovanými hPSMO.O cDNA (CMV-Koz-hPSM), 4) bunkami

134 v balení BOSC transfektovanými prázdnym vektorom (CMVBipep), 5) retrovírusovým kmeňom exprimujúcim hPSMO.O cDNA (CMV-KozhPSM ) , alebo 6) retrovírusový kmeň, prázdny vektor (CMVBipep). ¹

V niekolkých časových intervaloch sa myšiam odobrala krv a získané séra sa testovali na reaktivitu proti HIS-PROIIO.O (ELISA). Bohužiaľ, žiadna z myší nevyvíjala protilátky schopné špecificky rozpoznať preparát HIS-PROSIIO.0.

Zavedenie anti-hPSM metódy ELISA

Prečistený HIS-PROSIIO.0 sa použil na potiahnutie polystyrénových mikrotitračných doštičiek (Maxisorp) pre vytvorenie skúšky ELISA pre testovanie napr. supernatantu hybridómu alebo myšie a králičie antiséra. Séra z BALB/c myší imunizovaných rovnakým preparátom HIS-PROSIIO.0 reagovali s imobilizovaným HIS-PROSIIO.0 pri 0,5 pg na často používaný chrenovou peroxidázou označený králičí anti-myší Ig ako sekundárnou protilátkou.

Použitím tejto ELISA analýzy sa demonštrovala už zmienená schopnosť antiséra, vyvolaná u králikov proti konjugátu KHLPSMpep004-PSMpep005-PSMpep006 vo zmesi s voľnými peptidmi, reagovať s imobilizovaným HIS-PROSIIO.

Použití AquaBind® mikrotitračných doštičiek (viď údaje v patente WO 94/03530, kde sa opisujú mikrotitračné povrchy potiahnuté trezylom aktivovaným dextránom, ktoré sa teraz označujú registrovanou ochrannou známkou AquaBind), sa ELISA analýzou stanovili imobilizované PSM peptidy (PSMpep004, PSMpep005 a PSMpep006). AquaBind® doštičky potiahnuté týmito peptidmi môžu detegovať králičie antisérum vyvolané proti

135 rovnakému antigénovému preparátu. Ako sa uvádza vyššie, králičie anti-HIS-PROSIIO.0 sa môže detegovat na AquaBind® doštičkách potiahnutých PSMpep005.

Zavedenie anti-hPSM „Western blot použitím LNCaP buniek a monoklonovej protilátky 7E11C5

B bunkový hybridom 7E11C5, ktorý vylučuje myšiu monoklonovú protilátku IgG2a proti intracelulárnemu epitopu ludského PSM, bol kúpený od ATCC. Kultivačný supernatant z asi 90 % mŕtvych buniek sa zozbieral a použil v metóde Western blotting pre detekciu ľudského PSM tak v membránovo obohatených preparátoch LNCaP buniek, ako aj v bunkových lyzátoch LNCaP. Tato protilátka sa čistila za použitia proteínových G stĺpcov a jej reaktivita s LNCaP sa overovala metódou Western blotting.

Zavedenie metódy FACS k detekcii hPSM na LNCaP bunkách

Zaviedli sme dve vzájomne nezávislé FACS metódy pre detekciu hPSM na LNCaP bunkách. Bolo potrebné sa vyrovnať s niekoľkými problémami: LNCaP bunky rastú velmi pomaly a v nepravidelných zhlukoch, preto musela byť optimalizovaná metóda prípravy suspenzií jednotlivých buniek. Po druhé, epitop rozpoznaný mAb 7E11C5 sa v literatúre definuje ako súčasť cytoplazmatickej domény hPSM. Bol preto vyvinutý spôsob fixácie a permeabilizácie buniek. Za týmto účelom sa proteín G prečistený protilátkou 7E11C5 konjugoval s FITC a potom sa mohol použiť v FACS analýze bez sekundárnej protilátky.

Bola tiež zavedená metóda FACS využívajúca anti-hPSM monoklonovú protilátku J591, ktorá rozoznáva epitop na

136 extracelulárnej časti hPSM. Protilátka sa získala od BZL Biologicals and FITS konjugated a následne sa použila k FACS analýze a triedeniu napríklad LNCaP buniek a hPSM transfektantov (viď ďalej).

Zavedenie testov cytotoxicity

Zaviedol sa spôsob čistenia dendritických buniek z kostnej dréne myší. S použitím modelových proteínov sa optimalizovala imunizácia myší dendritickými bunkami s modelovými peptidmi triedy I, ako aj proteín. Okrem toho sa myši tiež imunizovali modelovým proteínom (β-galaktozidázou) vo forme ISCOMS. Prečistené T-bunky z imunizovaných myší sa in vitro restimulovali rôznymi formami odpovedajúcich antigénov. Následne sa u týchto restimulovaných CT lymfocytov merala schopnosť lýzie rôznych druhov delových buniek (vrátane dendritických buniek s modelovými peptidmi triedy I, rovnako ako transfektantov exprimujúcich retrovírusovo exprimovaný cytozólický peptid triedy I). Zaviedli sa dve rôzne in vitro skúšky na meranie CTL aktivity s použitím buď uvolňovania chrómu alebo DNA fragmentácie (metóda JAM) ako miery cytotoxicity. Velmi pekné výsledky sa získali s modelovým proteínom β-galaktózidázy a s rôznymi kombináciami MHC triedy I a triedy II viažucimi modelové peptidy.

Zavedenie nástrojov narušujúcich autotoleranciu voči myšiemu PSM v myšiach

Zámerom je študovať, či sa môže narušiť autotolerancia k myšiemu PSM v myšiach pomocou imunizácie a/alebo DNA vakcinácie proti myšovitým PSM použitím autovakcinačných myšovitých PSM molekúl.

137

Ako sa uvádza vyššie, bola získaná cDNA kódujúca PSM myšovitých (mPSM) a DNA sekvenovaná. Vytvorili sa štyri varianty mPSM molekúl vložením P30 do dobre definovaných pozícii buď do mPSM s úplnou dĺžkou alebo do mPSM'. Prípravky sú uvedené v nasledujúcej tabulke:

mPSM aminokyseliny dĺžka molekuly substituované P30 (počet aminokyselín)

mPSMO.0		4-			752
mPSM'0.0		4-			694
mPSMX	255-271	(sekv.	id.	č. : 8)	756
mPSMY	689-700	(sekv.	id.	č. : 8)	760
mPSM'X	197-213	(sekv.	id.	č.: 10)	698
mPSM'Y	631-642	(sekv.	id.	č.: 10)	702
Najprv	sa divoký	typ mPSM a	analógové	molekuly subklonujú

do DNA vakcinačných vektorov a použijú sa k DNA vakcinácii myší.

Úmyslom je analyzovať imunitné odozvy, napríklad odozvy CTL a eliminovať nádor u myši. Preto budú nádorové bunkové línie myšovitých transfektované s divokým typom PSM myšovitých (fúzovaných spolu s identifikačným značením, napr. c-myc epitop, sekv. id. č.: 27, pre detekčné účely).

PSM nádorové modely in vivo

Skúšky množenia T buniek s P2 a P30 u myší

Uskutočnili sa série experimentov množenia T buniek, aby sa určila T bunková imunogenicita P2 a P30 peptidov u rôznych druhov myší (BALB/cA (H-2^d) , C3H/Hen (H-2^k) , DBA/1 (H-2^q) a

138

C57BL/6 (H-2^b) ) . Je dobre známe, že tieto epitopy sú u ludi promiskuitné, ale promiskuitu T buniek bolo potrebné tiež potvrdiť použitím M&Es experimentálneho usporiadania. Týmto sa ukázalo, že P30 je imunogénny k T bunkám u druhov BALB/cA a C57BL/6, zatial čo ani P2 ani P30 nie sú imunogénne pre T bunky u C3H/Hen. U DBA/1 je možné vyvolať T bunky proti P2.

Vytvorenie hPSM exprimujúceho myšie nádorové bunky

Vytvorila sa tabulka hPSM exprimujúcich nádorové bunky pre použitie hPSM špecifického nádorového modelu u myší, ako aj pre skúšky množenia nádorových buniek.

Jedným prístupom je vytvorenie bunkových línii prenosom nádorových bunkových línii myšovitých s retrovírusovými vektormi kódujúcimi úplný divoký typ hPSMO.O cDNA.

Skonštruovali sa tri rôzne prípravky kódujúce úplný divoký typ cDNA kódujúcej ludský PSM vložený do polyklonálneho miesta retrovírusového vektora CMVBipep. Z týchto prípravkov dva obsahovali krátku Kozákovu sekvenciu umiestnenú pred východzím kodónom.

Tieto prípravky sa preniesli do troch rôznych myších nádorových bunkových línií: P815 (mastocytóm, H-2^d) , B16-F10 (melanóm, H-2^b) a 79.24.H8 (fibrosarkóm, H-2^d) s použitím bunkovej línie v balení BOSC. Zo všetkých troch typov buniek sa získali klony rezistentné voči geneticínu a PCR analýzou génomickej vzorky DNA sa overilo, že retrovírusové prípravky boli integrované do hostitelských buniek. Dosial nebolo možné detegovať exprimovaný PSM génový produkt metódou Western blot alebo FACS analýzou s použitím 7E11C5 monoklonovej protilátky.

139

Transfekciou sa vytvorili dve stabilné myšie nádorové bunkové línie uchovávajúce membránovo viazaný divoký typ ludského PSM. Ta sa uskutočnila pomocou hPSMO.O cDNA subklonovanej do cicavčieho expresného vektora pcDNA3.1(-?) . riadeného CMV promótorom a obsahujúceho Kozákovu sekvenciu umiestnenú pred východzím kodónom.

Výsledný plazmid sa transfektoval do dvoch rôznych myších línií nádorových buniek: 79.24.H8 (fibrosarkóm odvodený z BALB/c) a SalN (fibrosarkóm odvodený z A/J) . Získali sa kultúry rezistentné voči geneticínu a podrobili sa Western blotting a FACS analýzami s použitím J591 a 7E11C5 anti-hPSM monoklonových protilátok. Použitím J591 pri FACS boli bunky triedené niekoľkokrát, až sa získala hPSM pozitívna populácia. Expresia hPSM sa opäť overila intracelulárnym FACS farbením s použitím 7E11C5 protilátky. FACS analýzou sa tiež kontrolovalo, že hladiny expresie MHC triedy I sú rovnaké ako hladiny materských bunkových línií.

Kultúry 79.24.H8 a SalN bunkových línií exprimujúce hPSM sa klonovali pri obmedzenom riedení. Získalo sa niekoľko klonov a tie boli testované pre rozdielne hladiny hPSM expresie FACS analýzou s použitím anti-hPSM monoklonovej protilátky J591.

Bunky 79.24.H8 s expresiou kódujúcim B7.1 pre použitie pre monitorovanie špecifických uvoľňovania gama-interferónu.

pomocou FACS s použitím anti-B7.1

Zavedenie špecifických nádorových hPSM sa transfektovali génom v napr. analýzach in vitro CTL odoziev na hPSM a/alebo Bunky sa raz roztriedili antiséra.

modelov hPSM u myší

Bolo rozhodnuté zaviesť aspoň dva nádorové modely in vivo u

140 imunitné vyhovujúcich myší, aby sa určil protinádorový účinok protilátok vzniklých v myšiach proti molekulám imunogenizovaného hPSM. Dúfajme, že sa to podarí injektovaním syngenetických myších nádorových bunkových línií modifikovaných, aby exprimovali divoký typ hPSM na povrch membrány. Použijú sa bunky tvoriace pevné nádory a/alebo tie, o ktorých sa vie, že metastázujú. V modelu sa použijú bunkové línie, ktoré sa môžu implantovať do syngenetických myší bez toho, aby boli odmietnuté kvôli prítomnosti cudzích hPSM molekúl. Schopnosť hPSM vakcín eliminovať takéto nádorové bunky sa využije pre výber kandidátov na hPSM vakcínu.

Pre vyhodnotenie rastu SalN buniek transfekovaných úplným ludským PSM, sa rôzne dávky (2.10⁶ a 5.10⁶) hPSM transfektujúce SalN bunky (S-PSM, päťkrát triedené) injektovali subkutánne do dolnej časti pravej slabiny skupiny myší A/J. Pevné nádory sa však nezistili. Následne sa injektovali tri klony S-PSM buniek s rôznou úrovňou expresie hPSM subkutánne do troch skupín A/J myší v dávke 10⁷ buniek na 1 myš. Veľkosť zistených nádorov sa merala dvojrozmerne, a tak sa vo výsledku získala veľkosť nádoru v mm². Tieto hodnoty sa porovnali pre tri sledované skupiny. V rozmedzí 3 - 6 dní sa u všetkých myší vyvinula štruktúra podobná pevnému nádoru, ktorá približne do 15 dní zase zmizla. Je to zrejme dané prítomnosťou ľudského PSM na povrchu nádorových buniek, aj keď to zatiaľ nebolo overené. Bunky SalN transfektované iba pcDNA3.1 vektorom pokračujú u myší v raste ako pevné nádory.

Podobný priebeh sa pozoroval u myší injektovaných ΙΟ⁶, 5.10⁶alebo ΙΟ⁷ 79.24.H8 buniek transfektovaných hPSM a niekoľkokrát triedených z hľadiska expresie hPSM. Tieto bunky (nazývané 79-PSM) tiež netvoria nádor ani u Balb/c, ani

141 u DBA/2. Ak sa však klonom hPSM transfektované 79.24.H8 bunky, 79-PSM.3, injektujú do myší Balb/c alebo DBA/2, vyvíjajú myši štruktúry podobné pevným nádorom, ktoré behom 10-20 dní zase.zmizli. Vektorom transfektované bunky 79.24.H8 rastú v myšiach Balb/c ďalej.

Zostáva ešte zhodnotiť, či sú tieto „nádory liečiteľné, alebo či sa zavedie lepší nádorový model založený na opísaných S-PSM a 79-PSM bunkových líniách a klonoch.

Závery

Pri molekulárne konštrukčnej práci sme boli úspešný pri klonovaní ľudského génu PSM a pri získaní myšieho PSM cDNA. Vyrobila sa séria úplne sekvenovaných imunogenizovaných hPSM autovakcínových prípravkou. Mutanty hPSM, rovnako ako rôzne divoké typy molekúl hPSM, boli exprimované v E. coli a zistilo sa, a tiež overilo, že úroveň expresie v E. coli je veľmi nízka. Polyklonálne protilátky proti polovine hPSM s Ckoncom sa indukovali u králikov. Značné úsilie sa venovalo realizácii rôznych expresných značení (His značenie a proteínová fúzia viažuca maltózu), rovnako ako alternatívnym expresným Systémom k E. coli. Rekombinantný divoký typ a/alebo autovakcína hPSM boli detegované v transfektovanej Pichia . pastoris a v.bunkách cicavcov. Urobili sa užitočné úvahy týkajúce sa technológie DNA vakcinácie a uskutočnili sa predbežné štúdie uskutočniteľnosti. Prebiehajúce experimenty DNA vakcinácie s auto-vakcinačnými molekulami hPSM ukazujú sľubné predbežné výsledky. Zaviedli sa rôzne skúšky in vitro užitočné pre testovanie a výber medzi mutovanými PSM prípravkami, vrátane imunochemických skúšok a FACS analýz. Myšie nádorové bunky sa stabilne transfektovali úplným divokým typom . hPSM a pomocou FACS sa roztriedili podľa

142 povrchovej expresie hPSM. Získali sa klony týchto bunkových línii. Xenogénne nádorové modely in vivo u myší sa vyhodnocujú s použitím týchto hPSM nesúcich syngenetické myšie nádorové bunky. Uskutočnila sa séria skúšok množenia T buniek, aby sa vybrali druhy myší vhodné pre nádorové modely. Optimalizovali sa skúšky CTL a získali sa uspokojivé výsledky s modelovými antigénmi pri použití rôznych imunizačných spôsobov a podmienok týchto skúšok. Okrem toho sa zaviedli nástroje potrebné pre štúdium narušovania tolerancie k myšiemu PSM pomocou imunizácie proti myším PSM autovakcínam.

Príklad 2

Výroba autovakcíny Her2

Ľudská autovakcína proti Her2 sa môže vyvinúť modifikáciou molekuly vložením jedného alebo viacerých promiskuitných cudzích T bunkových epitopov, aby sa odkryl úsek imunogenízovaných Her2 molekúl. Tieto modifikované proteíny sa testujú na schopnosť indukovať, protilátky, ktoré sú krížovo reaktívne s natívnymi časťami molekuly Her2. Následne sa v niekoľkých skúškach in vitro a v živočíšnych modeloch in vivo vyhodnotí efektívnosť rôznych konštruktov (to sa môže týkať DNA vakcinácie) a modifikovaných proteínov. Bude sa analyzuje indukcia špecifických CTL odoziev proti Her2 nesúcemu nádorové bunky. Bude sa tiež testovať schopnosť indukovaných protilátok aktivovať komplement klasickou cestou a iniciovať ADCC prostredníctvom Fc-receptorov. Nakoniec sa rôzne modifikované molekuly budú testovať v živočíšnych /

modeloch ľudskej rakoviny prsníka, aby sa vyskúšala ich účinnosť pri liečbe nádorov.

Imunogénne potkanie a ľudské molekuly sa budú konštruovať

143 s promiskuitnými T-bunkovými epitopmi v rôznych polohách v molekule.

Behom vakcinácie proti celej extracelulárnej doméne Her2 môže do určitej miery dochádzať ku krížovým reakciám protilátok s inými EGFr receptormi, pretože niektoré z týchto receptorov sú v extracelulárnej doméne homologické až zo 4046 %. Preto sa plánuje, že sa zachované oblasti Her2 porušia vložením cudzích T bunkových epitopov aspoň ^L do niektorých modifikovaných proteínov (detaily viď ďalej).

Oblasti Her2, ktoré môžu byť potencionálne CTL alebo Bbunkovými epitopmi, zostanú pri navrhovaní konštruktov zachované a sú ukázané na obr. 3. Odôvodnenie pre využitie týchto polôh je nasledujúce:

Sekvencie ludského Her2 je možné rozdeliť na rad domén, základom ktorých je výhradne primárna štruktúra proteínu.

Extracelulárna (receptorová) časť:

1-173: Doména I (N-koncová doména hotového polypeptidu).

174-323: Doména II (doména bohatá na cysteín, 24 cysteínových zvyškov).

324-483: Doména III (doména, ktorá viaže ligand v homologickom EGF receptore).

484-623: Doména IV (doména bohatá na cysteín, 20 cysteínových zvyškov).

624-654: Transmembránová doména (TM zvyšky 654-675).

Intracelulárna (kinázová) časť:

144

655-1010: Doména tyrosín kinázy (jadro TK domény 725992) .

1011-1235: Doména C-koncov.

Výber miest v aminokyselinovej sekvencii Her2, ktoré majú byt nahradené buď P2 alebo P30 ľudskými T pomocnými epitopmi berie do úvahy nasledujúce parametre (bez ohladu na prioritu):

1. Známe a predpokladané CTL epitopy

2. Homológia príbuzných receptorov (zvlášť EGFR)

3. Zachovanie cysteínových zvyškov

4. Predpovedané špirálové, α-helixové a β-sheet štruktúry·

5. Potencionálne miesta N-glykozylácie

6. Predikcia exponovaných a skrytých aminokyselinových' zvyškov

7. Organizácia domény

CTL epitopy sa vyskytujú ako klastry v doménach I, III, TM, a vo dvoch alebo troch „horúcich bodoch v doméne TK. V súlade s vynálezom sa majú tieto domény z veľkej časti zachovať.

Oblasti s vysokým stupňom homológie s inými receptormi sú pravdepodobne štruktúrne významné pre „celkovú terciárnu štruktúru Her2, a teda pre rozpoznanie protilátkou, zatial čo oblasti s nízkou homológiou je preto potencionálne možné obmeňovať len lokálnymi zmenami štruktúry.

Cysteínové zvyšky sa často zapojujú do intramolekulárnych disulfidových môstikov, a sú preto velmi dôležité pre

145 terciárnu štruktúru a nemali by sa meniť. Oblasti, u ktorých sa predpokladá, že tvoria a-helixovú a β-sheet štruktúru, je výhodné nevyužívať ako vstupné body pre cudzie epitopy, pretože tieto oblasti sú pravdepodobne dôležité pre posttranslačnú úpravu proteínu (folding).

Tiež by sa prednostne mali zachovať potenciálne Nglykozylačné miesta, pretože je velmi žiaduca manozylácia proteínu (napríklad expresiou v kvasinkách), porovnaj prítomnosť receptorov manózy na APC bunkách.

Oblasti, u ktorých sa predpokladá (podľa ich hydrofóbnych vlastností), že sú vnútri molekuly, by bolo výhodné zachovať, pretože by mohli byť zapojené do posttranslačnej úpravy (folding). Na rozdiel od toho oblasti vystavené rozpúšťadlu ponúkajú polohy pre vstup modelových T_H epitopov P2 a P30.

A konečne sa berie do úvahy tiež organizácia proteínových domén, pretože je relevantná pre štruktúru a funkciu proteínu.

Stratégia sa zameriava na zachovanie štruktúry extracelulárnej časti Her2, ako je len možné, pretože sa jedná o tú časť proteínu, ktorá je relevantná ako ciel pre neutralizáciu protilátok. Naproti tomu intracelulárna časť natívnej membrány, ktorá viaže Her2 na povrchu rakovinných buniek, je pre humorálny imunitný systém nedostupná.

Dôvodom pre začlenenie tejto časti do vakcíny je preto len prítomnosť CTL epitopov. Je preto pochopiteľné, že sem sa umiestni jeden alebo viacej epitopov. Keď sa ukáže, že nie je možné exprimovať úplnú molekulu Her2 v E. coli alebo v kvasinkách, intracelulárna časť sa môže skrátiť za prvým

146 „horúcim bodom CTL epitopu (okolo polohy 800) . Ďalšie CTL epitopy sa potom môžu pridať k C-koncovej časti skrátenej molekuly.

Transmembránová oblasť je pravdepodobne nezávislá jednotka posttranslačnéj úpravy a jej nahradenie T_H epitopmi, napríklad P2 alebo P30, pravdepodobne neovplyvní štruktúru Her2 a posttranslačnú úpravu. Naviac TM doména môže pôsobiť velké problémy pre expresiu v kvasinkách a E. coli a mala by byť v každom prípade substituovaná. Vo všetkých prípravkoch by sa preto mal epitop prednostne umiestniť do tejto domény (možná ju nechať nedotknutú v konštrukcii 1, pretože obsahuje niekolko CTL epitopov a pretože je akýmsi spôsobom zapojený do prenosu signálov na viazanie ligandu).

Extracelulárna doména sa v princípe môže držať nezmenená tým, že sa P2 a P30 umiestnia do intracelulárnych a transmembránových domén, čím sa maximalizuje počet potenciálnych Bbunkových epitopov a interferencia so štruktúrou je čo možná najmenšia. Vysoký stupeň homológie k EGFR, Her-3 a Her-4 však vytvára riziko krížovej reaktivity k týmto receptorom, 'ktorá môže (i keď nemusí) byť nežiaduca. Naviac boli opísané niektoré monoklonové protilátky, ktoré fungujú ako antagonisty receptorov (pravdepodobne stimuláciou heterodimerizácie alebo ligandovej väzby) a zväčšujú velkost nádoru in vivo. Preto sa v extracelulárnej doméne vyberajú také pozície, u ktorých je nádej, že znížia tieto riziká.

Výber zahrnuje všetky už skôr zmienené parametre a zakladá sa na dvoch rôznych predpokladoch:

(i) Zaradenie do oblastí, ktoré sa nezachovávajú (s ohľadom na príslušné receptory), pomôže udržať terciárnu štruktúru a môže znižovať nechcenú aktiváciu protilátkami.

147 (ii) Zaradenie do zachovaných oblastí môže zmeniť štruktúru, ale súčasne môže znížiť riziko krížovej reaktivity narušením sekvencií, ktoré s ňou najviac súvisia.

Obidva predpoklady sú špekulatívne, ale pretože je veľmi ťažké predpovedať účinok umiestnenia epitopu v každej pozícii proteínu, niektoré z týchto pozícií byli zahrnuté do prípravkov.

Uvažovalo sa o tom, že by mohlo byť výhodné úplne odstrániť dve domény bohaté na cysteín. Predpovedalo sa vytvorenie špirálovitej štruktúry vystavenej rozpúšťadlu a možnosť vytvoriť nezávislé jednotky posttranslačnej úpravy (folding) zrejme zapojené do dimerizácie (ako svedčí veľa cysteínov, ktoré mohli slúžiť na udržanie pevnej štruktúry potrebnej pre vytvorenie dimerizačnej domény). Odstránenie týchto štruktúr môže preto eliminovať riziko aktivácie protilátkami, ako aj znížiť počet krížovo reagujúcich protilátok, pretože tieto domény sú najlepšie zachovanou extracelulárnou časťou proteínu.' Produkcia takýchto domén bohatých na cysteín by mohla byť naviac problematická v E. coli alebo kvasinkových bunkách.

Nasledujúce podrobnosti konštruktov, ktoré používajú P2 a P30 epitopy, nie sú obmedzujúcimi príkladmi: P2 epitop sa primárne umiestni do extracelulárnej domény Her2 v kombinácii s P30 epitopom, ktorý substituuje časť alebo celú membránovú oblasť. P2 epitop sa umiestni podľa vyššie uvedených

kritérií. Výhodné konštrukty majú	nasledujúcu	štruktúru:
Názov konštruktov	Poloha P2	Poloha P30	Dĺžka
hHER2MA2-lA	59-73	632-652	795
hHER2MA2-2A	103-117	632-652	795
hHER2MA2-3A	149-163	632-652	795

148

hHER2MA2-4A	210-224	632-652	795
hHER2MA2-5A	250-264	632-652	795
hHER2MA2-6A	325-339	632-652	795
hHER2MA2-7A	369-383	632-652	795
hHER2MA2-8A	465-489	632-652	795
hHER2MA2-9A	579-593	632-652	795
hHER2MA2-lB	59-73	661-675	795
hHER2MA2-2B	103-117	661-675	795
hHER2MA2-3B	149-163	661-675	795
hHER2MA2-4B	210-224	661-675	795
hHER2MA2-5B	250-264	661-675	795
hHER2MA2-6B	325-339	661-675	795
hHER2MA2-7B	369-383	661-675	795
hHER2MA2-8B	465-479	661-675	795
hHER2MA2-9B	579-593	661-675	795
hHER2MA2-lY	59-73	710-730	795
hHER2MA2-2Y	103-117	710-730	795
hHER2MA2-3Y	149-163	710-730	795
hHER2MA2-4Y	210-224	710-730	795
hHER2MA2-5Y	250-264	710-730	795
hHER2MA2-6Y	325-339	710-730	795
hHER2MA2-7Y	369-383	710-730	795
hHER2MA2-8Y	465-479	710-730	795
hHER2MA2-9Y	579-593	710-730	795
hHER2MA2-Z	695-709	710-730	795
hHER2MA2-C	653-667	632-652	795
hHER2MA2-BX	695-709	661-675	795
hHER2MA2-AX	695-709	632-652	795
hHER2MA2-4E	210-224	5-25	795
hHER2MA2-6E	325-339	5-25	795
hHER2MA2-8E	465-479	5-25	795
hHER2MA5-4D	210-224	632-652*	666
hHER2MA5-6D	325-339	632-652*	666

149 hHER2MA5-8D hHER2MA6-C

465-479

632-652

666

653-667

632-652 702

Poloha epitopu označuje prvú a poslednú aminokyselinovú polohu epitopu vzhladom k východziemu bodu zrelého Her2. DÍžka znamená dĺžku aminokyselín úplného konštruktu. Vo všetkých prípravkov, okrem tých, ktorých pozícia je označená *, epitop nahradzuje úsek aminokyseliny s rovnakou dĺžkoú.

znamená, že epitop je skôr vložený do Her2, než aby substituoval jeho časť. Všetky vyššie uvedené konštrukty sú preto skrátené obdoby zrelého Her2, kde vynechaná časť je z C-konca.

Väčšina prípravkov existuje v rôznych obmenách, napríklad vo vektore pcDNA3.1+, vo fúzii s prírodnou signálnou peptidovou sekvenciou Her2, vo vektore pMT/BiP/V5-His-A ako fúzia s BiP hlavným peptidom pre expresiu v bunkách Drosophila a bez vedúcej sekvencie vo vektore pET28b pre expresiu v bunkách E. coli.

Nižšie sa opisujú modely, ktoré majú slúžiť pre screening a výber modifikovaných Her2 proteínov.

1. Indukcia protilátok v transgenetickej myši s potkaním Her2 a v králikoch vzhladom k potkaniemu a ľudskému Her2 sa bude skúmať konvenčnou technológiou ELISA po aspoň troch imunizáciách. Komerčne dostupné protilátky k ľudskému a potkaniemu Her2 budú použité ako pozitívne kontroly.

2. Tieto králičie protilátky sa použijú na štúdium predpokladanej inhibície rastu ľudských a transgenetikých myších nádorových buniek so zvýšenou expresiou Her2 v in vitro modeli.

3. T bunkové množenie PBL od pacientov imunizovaných tetanom

150 smerom k vybraným ľudským molekulám Her2 bude skúmané konvenčnými spôsobmi.

4. Schopnosť modifikovaných potkaních molekúl Her2 indukovať odozvy CTL v transgenetických myšiach s potkaním Her2 sa bude študovať použitím nádorov z týchto myší, ako cielov.

5. Zamýšľa sa syntéza vybranej sady peptidov, ktorá v transmembránovej oblasti ľudského Her2 zahrnuje P2 a P30 epitopy. Tieto peptidy sa budú testovať z hľadiska množenia PBL získaných z ludí dopredu imunizovaných tetanovým toxoidom, aby sa zistilo, či P2 a P30 epitopy sa môžu účinne spracovávať mimo sekvencie vnútri Her2 a prezentovať sa T bunkám.

6. Je dosť možné, že vybrané ľudské modifikované proteíny Her2 sa budú testovať na tvorbu neutralizačných protilátok v myši, ktorá sa geneticky vybaví tak, aby exprimovala len ludské VDJ gény. Taká myš je dostupná u spolupracujúcej firmy Abdenix, Fremont, CA, USA.

Boli opísané štyri dobre definované transgenetické myšie modely pre rakovinu prsníka, ktoré obsahujú potkaní onkogén Her2. Prvé tri skupiny transgenetických myší exprimujú aktivovaný onkogén Her2, zatial čo štvrtý model využíva neaktivovaný Her2. Všetky modely používajú MMTV promótor na riadenie expresie v prsníkových žľazách.

Rozhodli sme sa použiť dva modely transgenetických myší: 1) model agresívnejšieho nádoru opísaného Mullerom a spol., ktorý vyžíva aktivovaný onkogén Her2 (Muller et al, 1989) a 2) model menej agresívneho nádoru, v ktorom inaktivovaný Her2 tvorí ložisko nádorov prsníkovej žľazy s dlhou latenciou (Guy et al, 1992). Obidve skupiny transgenetických myší boli kúpené od Jackson a/alebo Charles Rivers Laboratories.

151

V počiatočných experimentoch sa tieto myši ponechajú, aby produkovali protilátky a CTL odozvy pomocou imunizácie a podporou modifikovanými potkaními Her2 proteínmi. Incidencia nádorov sa potom búde sledovať opísanými postupmi (Muller et al, 1989; Guy et al, 1992; Katsumata et al, 1995). Hladina protilátok sa zmeria ELISA analýzou. Aktivita CTL sa určí pomocou vytvorenia delových buniek exprimujúcich potkaní Her2, ako bolo uvedené vyššie.

Alternatívne sa pre pokusy pasívnej vakcinácie môže použiť model xenograftu karcinómu u holých myší. Holým myšiam sa môžu transplantovať ľudské nádory a ich inhibíciu sa je možné pokúsiť pasívnym prenosom séra z normálnych alebo humanizovaných myší imunizovaných modifikovanými Her2 proteínmi. Zatiaľ čo toto by mohlo byť užitočné pre štúdium úlohy protilátok na potlačenie nádorov, aktivitu CTL nie je možné v tomto systéme priamo merať.

.V druhom modeli in vivo by sa nádory v myšiach tiež vytvárali pomocou transplantácie bunkových línií z nádorov transgenetických myší opísaných vyššie. Bunkové línie generované z týchto myší by sa preniesli do odpovedajúceho druhu myší a boli by lokalizované podľa štandardných protokolov.

Prenos myších nádorových buniek so zvýšenou expresiou potkanieho Her2:

V tomto systéme sa budú bunky transfektovať potkaními génmi a prenesú sa do MHC kompatibilných myší. Inhibícia rastu nádoru by sa dosiahla vytvorením odoziev proti Her2.

V týchto systémoch modifikované Her2 proteíny by sa použili

152 ako vakcína v adjuvans pre vytvorenie protilátok a CTL odoziev.

DNA vakcinácia sa môže úspešne použiť v niekoľkých systémoch na zahájenie účinnej imunitnej odozvy. Priebežne sme sledovali prostriedky uvoľňovania DNA použitím modifikovaných vlastných proteínov. Našim zámerom je využiť prístup DNA vakcinácie na stanovenie účinkov modifikovaných Her2 konštruktov na inhibíciu nádorov v transgenetických myších modeloch rakoviny prsníka. Podobný prístup môže byť potom aplikovaný na liečenie tohoto ochorenia u ludí.

Príklad 3

Výroba vakcíny proti FGF8b

Nasledujúca časť popisuje ako je možné vyvinúť ludskú autovakcínu proti FGF8b modifikáciou molekuly vložením jedného alebo viacerých promiskuitných cudzích T bunkových epitopov, aby sa odkrylo pole imunogenizovaných „FGF8b molekúl. Prípravky sa budú testovať z hľadiska schopnosti indukovať protilátky, ktoré sú krížovo reaktívne s autentickými časťami molekuly FGF8b. Následne sa v niekoľkých skúškach in vitro a v živočíšnych modeloch in vivo vyhodnotí účinnosť rôznych 'konštruktov. Indukované protilátky sa budú testovať z hľadiska ich schopnosti aktivovať komplement klasickou cestou a iniciovať ADCC cez Fc-receptory. Nakoniec sa budú rôzne molekuly testovať v živočíšnych modeloch ľudskej rakoviny prostaty a prsníka.

153

Konštrukcia autovakcíny proti FGF8b

Vďaka úplnej identite myších a ľudských FGF8b polypeptidov sa všetky prípravky môžu použiť k experimentom tak u ľudí ako aj u myší.

Promiskuitný tetanový toxoid T pomocných bunkových epitopov P2 a P30 úspešne používaný v ludskej TNFa vakcíne sa vloží do FGF8b polypeptidu. Vzhľadom k malej veľkosti FGF8b budú prípravky vyrobené s jedným epitopom na molekulu. Iné promiskuitné T pomocné bunkové epitopy, ako je chrípkový hemoglutinínový epitop HA (307-319) a iné tu diskutované Tbunkové epitopy je možné tiež vziať do úvahy (O'Sullivan 1991).

Pripravili sa 4 rôzne imunogenizované FGF8b konštrukty s epitopmi rozmiestenými pozdĺž molekuly. Tieto štyri prípravky sa urobia na základe viacnásobných a párových zoradení FGF skupiny proteínov. Párové zoradenie FGF2 a FGF8b sa použije ako základ pre analýzu predpokladanej sekundárnej štruktúry v celej molekule FGF8b (t.j. β-sheet rozloženie). Zvyšky, ktoré sa zachovajú medzi FGF2 a FGF8b, netvoria klastry na žiadnom mieste trojrozmernej štruktúry, čo indikuje, že molekula nemá žiadne jednotlivé oblasti, ktoré nie je možné nahradiť bez zhubných účinkov na schopnosť posttranslačných úprav. Aminokyselinové zvyšky v FGF2, ktoré sú v jednej línií s cysteínovými zvyškami v FGF8b, sú trojrozmerne umiestnené veľmi tesne jeden k druhému, čo naznačuje, že tvoria v FGF8b disulfidovú väzbu, a že zoradenie je správne. Tiež sa počíta s flexibilitou Nkoncovej časti FGF2.

Obmena FGF8b s P30 epitopom v N-konci (F30N) sa navrhla,

154 aby nezostala medzera v zoradení aminokyselinových zvyškov FGF8b proteínu a P30 epitopu (sekv. id. č: 14) a na základe vyhodnotenia rôznych pozícii s ohladom na chemické vlastnosti každého aminokyselinového zvyšku. Uvažovali sa len N-koncové oblasti predpokladanej β-barrelovej štruktúry. V prípade F30N je podobných 9 z 21 zvyškov. S využitím tohoto pseudoalgoritmu je možné očakávať, že substitúciami dôjde k minimálnym zmenám celkovej štruktúry. Sekvencie štyroch rôznych prípravkov, rovnako ako aj trojrozmerné znázornenia nahradených aminokyselín ukazuje obr. 6.

Obmena FGF8b s epitopom P2 (sekv. id. č: 12) v C-konci (F2C) bola pôvodne navrhovaná ako F30N. Tam však už existuje predpokladaný dobrý epitop Kd v pozíciách 195-203. Preto sa P2 epitop vkladá presne do C-konca tohto epitopu. Do úvahy opäť prichádzajú len C-koncové oblasti predpokladanej βbarrelovej štruktúry.

Vnútorné obmeny FGF8b (F30I a F2I) boli konštruované nahradením vonkajších špirál v štruktúre FGF2 epitopmi P2 a P30, pričom β-barrelová štruktúrna podstata FGF zostane podía všetkého nezmenená.

Imunogenizované molekuly FGF8b boli exprimované v Eschericia coli, čo uľahčuje produkciu proteínov vo velkom merítku za minimálnu cenu. Aj keď FGF8b obsahuje dve potenciálne glykozylačné miesta (Asn31 a Asnl77), bakteriálne exprimovaný rekombinantný FGF8b sa ukázal ako biologicky aktívny (MacArthur, 1995a; Blunt, 1997).

čistenia a posttranslačnej úpravy boli pripravované v His označenej verzii, čo umožňuje väzbu k Ninabitej kolóne.

Pre uľahčenie obmeny FGF8b

155

Čistenie molekúl sa uskutočňuje využívaním vysokého kladného náboja proteínových molekúl alebo His značenia a refolding sa uskutoční štandardnými postupmi, ktoré počítajú s tvorbou disulfidových môstikov.

I

Štyri imunogenizované molekuly sa môžu tiež spoločne s divokým typom FGF8b cDNA vložiť do DNA vakcinačných vektorov.

Mapovanie a výber modifikovaných molekúl FGF8b

Štyri imunogenizované molekuly FGF8 boli exprimované v baktériách a následne sa čistili od inklúznych teliesok. Paralelne sa prípravky použijú ako DNA vakcíny. Rozdielne prípravky sa potom porovnajú z hladiska ich schopnosti indukovať rôzne účinky, ktoré sú žiadané pre liečbu pacientov s rakovinou prostaty a prsníka. Tento výskum sa uskutoční s využitím niekoľkých rozdielnych skúšok in vitro a in vivo. Experimentálne výsledky nakoniec vytvoria základ pre konečný výber jedného alebo dvoch kandidátov pre ľudskú FGF8b vakcínu.

Modely in vitro

Analýzy v systéme myšovitých

Myši rôznych haplotypov, ako aj králiky sa imunizujú rôznymi konštruktmi FGF8b v kompletnom Freundovom adjuvans a následne sa podporia aspoň dvakrát rovnakým antigénom emulzifikovaným v neúplnom Freundovom adjuvans. Tým sa môže porovnať schopnosť rôznych konštruktov narušiť B-bunkovú toleranciu. DNA vakcinácia sa uskutoční na iných živočíchoch s použitím prečistenej DNA v úplnom Freundovom adjuvans/

156 neúplnom Freundovom adjuvans intramuskulárnou injekciou v 14 denných intervaloch.

Vzorky séra sa získajú v niekoľkých časových etapách behom imunizačného rozvrhu a schopnosť rozdielnych konštruktov indukovať protilátky špecifické pre FGF8b sa určí konvenčnou ELISA metódou (Rochon, 1994). Komerčné polyklonové antisérum, ako aj komerčná monoklonová protilátka vyvolaná proti FGF8b (R&D) by sa použili pre pozitívnu kontrolu. Proteín FGF8b je komerčne dostupný (R&D), ale tiež sa bude vyrábať vedia s inými FGF8b konštruktmi a následným čistením/refolding. Tento produkt sa potom použije na potiahnutie platničiek v priamej ELISA metóde pre testovanie myšieho/králičieho séra imunizovaného obmenami FGF8b proteínu.

Cenným nástrojom pre skúmanie účinkov vakcinácie proti FGF8b bude rakovinná bunková línia závislá na FGF8b. Niekolko pozitívnych FGF8b rakovinných bunkových línií, napr. MCF-7 alebo SC-3 sa opisujú v literatúre. Taká myšia rakovinná bunková línia závislá na FGF8b bude identifikovaná použitím kvantitatívnej RT-PCR, experimentmi bunkového množenia a skúškami fosforylácie STAT-3.

Prítomnosť FGF8b viazaných na FGF receptor na bunkovom povrchu sa bude detegovať s protilátkami špecifickými na FGF8b v FACS alebo ELISA analýzach. Protilátky zamerané proti niekoľkým rôznym FGF receptorom sú komerčne dostupné (R&D).

Konštrukty budú porovnané s ohľadom na ich schopnosť indukovať protilátky schopné aktivovať komplementovú lýziu buniek produkujúcich/nesúcich FGF8b. Môže to byť detegované jednou z myších nádorových bunkových línií, ktorá má skôr opísanú expresiu FGF8b alebo alternatívne použitím buniek

157 osmoticky naplnených FGF8b. Séra z normálnych alebo transgenetických myši (viď ďalej) imunizovaných ľudskými FGF8b konštruktmi budú inkubované s bunkovou líniou a následne s čerstvým komplementom morčaťa. Protilátka sprostredkujúca komplementovú lýziu buniek môže byť detegovaná štandardnými postupmi. Schopnosť indukovaných protilátok sprostredkovať ADCC sa môže študovať meraním uvoľňovania 51Cr z označených buniek exprimujúcich FGF8b. Efektorovými bunkami budú PBMC zo syngenetických myší. Pre zavedenie skúšky môže byť vhodná myšia bunková línia schopná sprostredkováť ADCC (pozitívna ná Fc-receptory) ako efektorová bunka s protilátkou proti ludskému FGF8b.

Uskutočníme tiež skúšku šírenia nádoru, aby sa ukázalo, že kandidáti na FGF8b vakcíny nijak nepodporujú autoprotilátkou indukovaný rast nádoru. Vzorky séra z imunizovaných myší budú inkubované s FGF8b exprimujúceho nádorové bunky. Šírenie nádorových buniek sa potom môže detegovať podlá ich schopnosti inkorporovať 3H-tymidín, ktorý sa následne pridá k bunkám.

Pretože FGF8b je známy tým, že indukuje množenie radu buniek cicavcov, bude tiež potrebné vyskúšať rast podporujúce účinky rôznych proteínov. To sa môže uskutočnilo použitím proliferačných skúšok, ktoré použil Marsh, 1999.

Biologický účinok FGF8b na bunky cicavcov by sa mal neutralizovať autoprotilátkami. To je možné demonštrovať použitím rekombinantného FGF8b a napr. NIH3T3 v štúdiách množenia buniek (a ich morfologických zmien). Prídavok autoprotilátok by mal odstrániť transformačnú aktivitu FGF8b.

158

Imunizačný protokol

Počet živočíchov, ktorý sa zúčastní FGF8b autovakcinačného imunizačného experimentu, musí závisieť na očakávanej penentrácii choroby v modeli, a tým na počtu potrebnému na získanie štatisticky významnej informácie. Imunizačný protokol musí byť založený na skúsenosti, ktorú máme z projektu TNFa autovakcinácie. Rôzne imunizačné protokoly sa používali k imunizácii myší s rôznymi TNFa analógmi pré špecifické účely, ale najviac pokusov sa uskutočnilo s nasledujúcim protokolom:

1. Myši by sa mali individuálne označiť značkou buď v uchu alebo transpondérmi, 10 zvierat v každej klietke. Samce a samičky sa podlá všetkého musia vyhodnocovať oddelene, ale my v žiadnom prípade nebudeme mať obidve pohlavia v jednej a tej istej klietke. Zvieratá by sa mali ponechať v kľude aspoň 3 dni po transporte a,značkovaniu.

2. Antigén o koncentrácii 1 mg/ml v PBS pufri sa emulzifikuje s rovnakým objemom Freundovho kompletného antigénu (CFA) (Difco alebo Sigma). Emulzia sa kontroluje umiestnením kvapky emulzie na vodnú hladinu a sledovaním, či kvapka drží pohromade alebo disperguje. V miešaní sa pokračuje dokiaľ kvapka nedisperguje.

3. Štandardnou imunizačnou dávka je 100 pg antigénu y objeme 100 μΐ + 100 μΐ adjuvans. Tak celkový imunizačný objem je 200 μΐ, podávaný subkutánne (s.c.), do chrbta zvieraťa.

4. Podpory sa aplikovali v 2 - 3 týždenných intervaloch.

Podporný imunizačný materiál sa pripravuje presne rovnako ako imunizačný, ale použije sa Freundov neúplný adjuvans. Asi tri podporné dávky indukujú maximálny titer. A tak sa najvyššie titry získajú po 6 - 9 týždňoch od prvej imunizácie.

159

5. Krv sa odoberá kapilárne z oka v množstve 50 - 100 μΐ, obvykle pred prvou iminuzáciou a týždeň po každej podpore. Tiež sa môže použiť krv z chvosta a pre stanovenia titru môže stačiť 10 - 20 μΐ.

Počiatok imunizačného programu závisí na vývoji choroby a na prijatej stratégii. Pôvodne sme sa chceli pokúsiť vytvoriť maximálnu imunitu čo najskôr, ale je obtiažne zahájiť imunizácie skôr, ako vo veku asi 5 týždňov. Potom by sa mali vysoké titre udržovať podporou v 6 - 8 týždenných intervaloch, po troch počiatočných podporách. Je tu však potencionálny problém, ak je FGF8b potrebný pre normálný vývoj mladej myši, a to hovorí v prospech pozdnejšieho zahájenia imunizácie u dospelej myši.

Analýzy v ludskom systéme

Pri výbere medzi rôznymi FGF8b konštruktmi sa bude skúmať schopnosť ľudských buniek prezentujúcich antigén prezentovať vložené imunogénne T-bunkové epitopy ľudským T bunkám. To sa uskutoční použitím rovnakých in vitro skúšok pre P2 a P30, ako sa použili pre TNFa vakcínu. Ľudské T bunkové línie, ktoré sú špecifické pre P2 a P30, sa získajú od donorov vakcinovaných proti tetanu. Antigén prezentujúce bunky (PBMC) z tých' istých donorov sa budú inkubovať s rôznymi konštruktmi a pridajú sa T bunkové línie. Úroveň prezentácie vložených T bunkových epitopov sa potom môže porovnať meraním stimulácie T bunkových línií.

Živočíšne modely in vivo

Aspoň tri rozdielne systémy môžu byť použité pre monitorovanie, či sú indukované FGF8b protilátky schopné

160 riadiť na FGF8b závislý účinok in vivo.

Myšiam sa bude transplantovať myší FGF8 exprimujúci nádorové bunky a inhibícia progresie nádoru sa bude skúšať akutovakcináciou používajúcou modifikované FGF8b proteíny alebo FGF8b DNA vakcíny. Ideálny systém zahrnuje použitie buniek izolovaných z myších nádorov. Alternatívne použijeme iné bunkové línie myšovitých (napr. Balb/3T3) trvalo transfektovaných s FGF8b DNA v expresnom vektore.

Na experimenty s pasívnou vakconáciou sa použije model myšieho xenograftového karcinómu. Holým myšiam sa budú transplantovať ludské nádory a o inhibíciu nádorov sa budeme pokúšať prenosom séra z normálnych alebo humanizovaných myší imunizovaných modifikovanými FGF8b proteínmi alebo FGF8b DNA vakcínami. Mohlo by to byť veľmi užitočné pre štúdium schopnosti vyvolanie protilátok na potlačenie nádorov.

Iný prístup pre overenie koncepcie zahrnuje použitie myši transgenetickej pre FGF8b. U týchto myši, ktoré nesú FGF8b cDNA riadenú velmi špecifickým promótorom myšieho prsníkového nádorového vírusu (MMTV), sa ukázalo, že spontánne vyvíjajú FGF8b exprimujúci prsníkové nádory (Coombes, osobná diskusia). Autovakcinácia týchto myší rôzne obmenenými FGF8b proteínmi alebo FGF8b DNA vakcínami nám ukáže, či autovakcína umožní myši potlačiť alebo odmietnuť nádory.

Možnou cestou pre overenie koncepcie by bolo použitie Wnt-1 transgenetickej myši (MacArthur, 1995c). O indukcii rakoviny prsníku vírusom MMTV sa uvádza, že aktivuje expresiu FGF8 vo viac ako polovine myších vyvíjajúcich sa nádorov. Závislosť nádorov na FGF8b by sa mohla zaviesť, keď naša autovakcína (autovakcíny) potlačí výskyt alebo rýchlosť rastu nádorov.

161

Skutočnosť, že transgenetické myši často vykazujú nefyziologické imunologické obrazy tolerancie, neovplyvní príliš tento projekt, pretože FGF8b polypeptidy sú u ľudí a myší identické.

Keby sa nakoniec ukázal priaznivý účinok FGF8b imunizácie na myšom modeli a vybrali sa vhodný kandidáti pre ľudskú vakcínu, bolo by možné uskutočniť obmedzený počet toxikologických štúdii. Pre získanie konečného potvrdenia koncepcie sa môžu následne uskutočniť vakcinačné štúdie u pacientov s rakovinou prsníka a prostaty.

Významné je to, že v prípade pozitívnych výsledkov experimentov na modeloch in vivo, sa na základe dostupných údajov zostaví viacej mutantov.

Príklad 4

Príprava analógu MUC-1

Pripravila sa len jedna autovakcinačná molekula MUC-1. Ta obsahuje celkom deväť opakovaní mucínu, z ktorých každé má sekvenciu sekv. id. č: 33. Prípravok začína tromi týmito sekvenciami, , nasleduje P2 epitop, tri ' ďalšie mucínové sekvencie, P30 epitop a ukončujú ho tri mucínové sekvencie.

Prípravok sa pripravil s N-koncom označeným UNI-HIS (sekv. id. č: 23) alebo bez neho. Obidve varianty boli exprimované v E. coli. Identita exprimovaných proteínov sa potvrdila tak Western blotting ako aj N-koncovým sekvenovaním. Proteín sa exprimujú v rozpustnej forme, ale ako dimér, čo je trochu prekvapujúce.

162 f

HIS označená MUC-1 molekula sa prečistila kovovou afinitnou chromatografiou. Množstvo čistého proteínu a jeho čistota nie sú v súčasnosti známe.

Príklad 5

Narušenie autotolerancie v modelovom systéme myšovitých

V CTL experimentoch, v ktorých sa myši imunizujú dendritickými bunkami pulzujúcimi s epitopmi tak triedy I ako aj triedy II, bola predbežne vykázaná zvýšená CTL indukcia, keď sa imunizujú ako aj restimulujú in vitro peptidom triedy

I a triedy II, v porovnaní s imunizáciou a restimuláciou iba s epitopom triedy I. Táto situácia je porovnateľná s imunizáciou autovakcínou, u ktorej sa cudzí epitop triedy

II vloží do vlastného proteínu. Absorpcia a spracovanie týchto molekúl špecializovanými bunkami prezentujúcimi antigén, napríklad dendritickými bunkami, vedie k prezentácii cudzieho epitopu triedy II spoločne s niektorými vlastným epitopmi triedy I. Je známe, že je možné vyvolať autoreaktívne CT lymfocyty, ale prítomnosť cudzích pomocných epitopov triedy II môže velmi pravdepodobne zvýšiť túto CTL indukciu.

Potenciálna výhoda predkladaného vynálezu spočívajúca v indukcii vlastných reaktívnych CTL sa v súčasnosti skúma vo vaječnom albumíne transgenetických myši. Existujú štyri rôzne transgenetické línie s rozdielnou úrovňou expresie vaječného albumínu a tolerančných stavov, porovnaj Kurts C et alz J. Exp. Med. 186 (1997), 239-245, ktorý opisujú RIP-mOVA transgenetické myši (exprimujúce vaječný albumín v pankrease, obličke a týmuse, a ktoré majú vysoký stupeň tolerancie)

163 a Kurts C et al: J. Exp. Med. 188 (1998), 409-414, opisujúci RIP-0VA^nízky a RIP-OVA^vysoký transgenetické myší s nízkou a vysokou expresiou vaječného albumínu. Posledná línia, RIP0VA^stredný, ktorá exprimuje vaječný albumín na prostrednej úrovni sa získala od Dr. Williama R. Heatha, spoluautora dvoch vyššie uvedených odkazov.

V tele sa vyskytujú rôzne stupne tolerancie voči rôznym antigénom. Jeden z najmenších stupňov tolerancie sa našiel vo veľkom množstve na cirkulujúcich antigénoch. Tieto antigény všetky vstúpia do týmusu, kde sa odstránia vlastné reaktívne T-bunky. Tieto antigény spadajú pod „centrálnu toleranciu. Na druhej strane tkanivovo špecifické antigény nevstupujú priamo do týmusu a sú obecne pod „periférnou toleranciou, ktorá sa napríklad prejavuje T-bunkovou anergiou.

Vyrábajú sa dva autovakcinačné prípravky vaječného albumínu. Obidve sa vzťahujú k sekvencií s prístupovým č: J00845 v EMBL, kde sa sekvencie z P30 (sekv. id. č: 14) vkladajú do dvoch rôznych pozícií.

V prípravku „0VA3.1 sa P30 vkladá do pozície odpovedajúcej aminokyseline č. 272-292 vo vaječnom albumíne. V prípravku „OVA3.2 sa P30 vkladá do pozície odpovedajúcej aminokyseline č. 321-341 vo vaječnom albumíne. Tieto prípravky sa vložili do vektora pVaxl a použili k DNA imunizácii.

Myši sa imunizujú intradermálne raz, každá so 100 pg DNA. Tri týždne po tejto imunizácii sa odstráni slezina a urobia sa CTL skúšky s použitím delových buniek exprimujúcich dominantný epitop vaječného albumínu SIINFEKL a zmiešaný peptid FILKSINE ako kontrola. Imunizácie podlá očakávania poskytujú zreteľnú indukciu CTL v divokom type C57BL/6 myší,

164 pretože tak vaječný albumín, ako aj P30 sú v týchto myšiach cudzie.

Teraz máme v úmysle imunizovať 4 línie vaječných albumínových transgenetických myší týmito autovakcinačnými konštruktmi. RIP-OVA^nizky, RIP-OVA^stredný a RIP-OVA^vysoký exprimujú zvyšujúce sa množstvá vaječného albumínu a majú rôzne stupne tolerancie a ako už bolo povedané, RIP-mOVA má vysoký stupeň tolerancie.

V týchto štyroch líniách transgenetických myší bude cudzí len P30. Vaječný albumín je u týchto myší vlastným antigénom, a preto sa jedná o pravú autovakcináciu pre indukciu CTL voči vaječnému albumínu.

Predbežné výsledky získané pre myši RIP-OVA^nizky, ktoré majú najnižší stupeň „periférnej tolerancie k vaječnému albumínu, ukazujú, že tak vaječný albumín s vloženým P30 ako aj prírodné sa vyskytujúce molekuly vaječného albumínu sú schopné indukovať odozvy CTL - očakáva, sa, že len transgenetické myši majúce vysoký stupeň tolerancie budú schopné pozdvihnúť odozvu CTL proti modifikovaným molekulám vaječného albumínu a nie proti prírodnej forme.

Zoznam publikácii

Ago H et al. (1991) J. Biochem (Tokyo), 110, 360-3

Abdel-Nabi H et al. (1992) Sem. Urol. 10, 45-54

Acevedo et al. (1995) Cancer 76, 1467-1475

Acavedo et al. (1997) Cancer Detect. Prev. 21, 295-303 Adelstein S et al. (1991) Science 251, 1223-1225

Babian RJ et al. (1994) J. Urol. 152, 1952-1955 Bernard JA et al. (1995) Gastroenterol. 108 (2) 564-580

165

Bier H et al. (1995) Eur. Árch. Otorhinolaryngol. 252 (7)

433-439

Bouchard L et al. (1989) Celí 57 (6) 931-36

Blaber M et al. (1996) Biochemistry 35, 2086-94

Blunt AG et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 3733-8

Boring CC et al. (1993) CA Cancer J. Clin. 43, 7-26

Boucher et al. (1995) Hum. Pathol. 26, 1201-1206

Callahan R (1996) Breast Cancer Res. Treat. 39, 33-44 Carter RE (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 749-753 Chang et al. (1981) Fertil. Steril. 36, 659-663

Chantry A (1995) J. Biol. Chem. 270 (7) 3068-73

Crossley PH et al. (1996b) Celí 84, 127-36

Crossley PH et al. (1995) Development 121, 439-51

Crossley PH, Martinez, S. and Martin, G.R. (1996a) Midbrain development induced by FGF8 in chick embryo. Náture 380, 66-8

Dean C et al. (1994) Int. J. Cancer, suppl 8, 103-107

Dillioglugil Q et al. (1995) Eur. Urol. 28, 85-101

Doi et al. (1996) Int. J. Cancer 65, 454-459

Douglas TH et al. (1995) J. Surg. Oncol. 59 (4) 246-250 .

Earp HS et al. (1995) Breast Cancer Res. Treat 35 (1) 115-32

Eccles SA (1994) Invasion Metastasis 14 (1-6) 337-48

Eppenberger U et al. (1994) J. Neurooncol. 22 (3) 249-54

Dorkin TJ et al. (1999) Oncogene 18, 2755-2761

Eriksson AE et al. (1993) Protein. Sci. 2, 1274-84

Fernadez-Teran M et al. (1997) Dev. Biol. 189, 246-55

Fujii K et al. (1995) Exp. Celí. Res. 216 (1) 261-72

Furst J et al. (1994) Urol. Res. 22, 107-113

Furthauer et al. (1997) Development 124, 4253-64

Geissler et al. (1997) Lab. Invest. 76, 859-871

Gemel J et al. (1996) Genomics 35, 253-7

Ghosh AK et al. (1996) Celí Growth Differ 7, 1425-34

Goldfarb M et al. (1996) Cytokine Growth Factor Rev 7, 311166

325
Goodnow CC	et	al
Goodnow CC	et	al
Greenberg	NM	et

(1988) Náture 334, 676-682 (1991) Náture 352, 532-536 il. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92

3439-3443

Guy CT et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10578-82

Heikinheimo M et al. (1994) Mech. Dev. 48, 129-138

Henttu P and Vihko P (1989) Bioch. Biophys. Res. Com. 160

903-910

Hop TP and Woods KR (1983) Mol. Immunol. 20, 483-489 Horoszewicz JSH et al. (1983) Cancer Res. 43, 1803-1818 Horoszewicz JSH et al. (1987) Anticancer Res. 7, 927-936 Hishikawa M et al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Com. 244

258

'-191	al.	(1996)	Cytokine Growth	Factor Rev. 7,
I	et
RS	et	al.	(1994)	Cancer Res. 54,	1807-1811
RS	et	al.	(1993)	Cancer Res. 53,	227-230
RS	ét	al.	(1994)	Cancer Res. 54,	6306-6310

Jacoby et al. (1984) Adv. Immunol. 35, 157-208

Johnosn RL and Tabin CJ (1997) Celí 90, 979-990

Kahn D et al. (1994) J. Urol. 152, 1490-1495

Kapoun AM and Shackleford GM (1997) Oncogene 14, 2985-9 Kettunen P and Thesleff I (1998) Dev. Dyn. 211, 256-268 Koga M et al. (1995) J. Steroid Biiochem. Mol. Biol. 54, 1-6 Kouhara H et al. (1994) Oncogene 9, 455-462

Kozák M (1991) J. Celí Biol. 115, 887-903

Lapthorn et al. (1994) Náture 369, 455-461

Lazar et al. (1995) Cancer Res. 55, 3735-3738

Leek J et al. (1995) British j. Cancer 72, 583-588

Leung HY et al. (1996) Oncogene 12, 1833-1835

Lopes AD (1990) Cancer Res. 50, 6423-6429

Loric S et al. (1995) Clin. Chem. 41 (12) 1698-1704

167

Lupu R et al. (1995) Semin. Cancer. Biol. 6, 135-145

MacArthur CA et al. (1995a) Celí Growth Differ. 6, 817-825

MacArthur CA et al. (1995b) Development 121, 3603-3613

MacArthur CA et al. (1995c) J Virol 69, 2501-7

Manabe et al. (1985) Gastroenterology 89, 1319-1325

Marsh SK et al. (1999) Oncogene 18, 1053-1060

Martin L et al. (1993) J. Immunol. 150 (49) 1234-43

Mattei MG et al. (1995) Mamm Genome 6, 196-197

McDonnell WM and Askari FD (1996) New Engl. J. Med. 334, 4245

Meyers EN et al. (1998) Nat. Genet 18, 136-141

Milich DR et al. (1994) J. Immunol. 153 (1) 429-435

Milner PG et al. (1989) Biochem Biophys. Res. Comm. 165, 1096-1103

Miyashita Y et al. (1994) Jpn. J. Cancer Res. 85, 1117-1123 (1993a) Br. J. Cancer 67 (2) 254-261 (1993b) Celí. Biophys. 22 (1-3) 129-146 (1996) Br. J. Cancer 73 (2) 228-235

Moy FJ et al. (1996) Biochemistry 35, 13552-13561 Muller WJ et al. (1988) Celí 54 (1) 105-115 (1996) Prostate 28, 266-271 (1995) Prostate 26, 164-168 (1995) Anticancer Research 15 (4) 1473-79 :1990) Clin. Chem. 35, 1450-1455

Nonomura N et al. (1990) Cancer Res. 50, 2316-21 O'Sullivan D et al. (1991) J. Immunology 147, 2663-9 Ohnishi Y et al. (1995) Br. J. Cancer 71 (5) 969-73 Ohuchi H et al. (1997a) Development 124, 2235-44 Ohuchi H et al. (1997b) Mech. Dev. 62, 3-13

Ohuchi H et al. (1994) Biochem Biophys Res. Commun. 204, 8828

Payson RA et al. (1996) Oncogene 13, 47-53

Pillai et al. (1996) FEBS Lett. 387, 23-26

Modjtahedi H et al. Modjtahedi H et al. Modjtahedi H et al.

Murphy GP et al. Murphy GP et al. Murphy GP et al. Nguyen L et al.

168

Pollard M and Luckert PH (1994) Anticancer Res. 14, 901-903 Prigent SA and Lemoine NR (1992) Progress in Growth Factor

Research 4, 1-24

R&D focus, Drug News (1966) 5, 21, 9 ¹

Rammensee H-G et al. (1995) Immunogenetics 41, 178-228 Regelson W (1995) Cancer 76, 1299-1301

Rieš LAG et al. (1996) SEER Cancer Statistics Review, 1973 1993: Tables and Graphs, National Cancer Inštitúte,

Bethesda, MD

Rinker-Schaeffer CW et al. (1995) Genomics 30 (1) 105-108

Rochon YP et al. (1994) Prostate 25, 219-223

Rock KL et al. (1996). Vaccine 14, 1560-1568

Rock KL and Clark K (1996) J. Immunol. 156, 3721-3726

Rudra-Ganguly N et al. (1998) Oncogene 16, 1487-92

Salomon DS et al. (1995) Critical reviews in

Oncology/Hematology 19, 183-232

Sato B et al. (1993) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 47, 91-98 Schlegel J et al. (1994) J. Neurooncol. 22 (3) 249-254

Schmitt JF et al. (1996) J. Steroid Biochem. Mol. Bio. 57,

173-178

Sheaff et al. (1996) J. Clin. Pathol. 49, 329-332

Sherman L et al. (1998) Genes Dev. 12, 1058-71

Shimamura K and Rubenstein JL (1997) Development 124, 27092718

Shirai A and Klinman DM (1993) AIDS Res. Hum. Retroviruses 9, 979-983

Sokoloff M et al. (1996) Cancer 77 (9) 1862-1872

Steinhoff U et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24 (3) 773-776

Stevens VC (1986) Ciba Found. Symp. 119, 200-225 Su SL et al. (1995) Cancer Res. 55, 1441-1443

Syrigos	et	al.	(1998)	1 Gut	42,	88-91
Talwar	et	al.	(1976)	PNAS	73,	218-222
Talwar	et	al.	(1994)	PNAS	91,	8532-8536

169

Tanaka A et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 89288932

Tanaka A et al. (1998) Cancer Research 58, 2053-2056

Tanaka A et al. (1995) FEBS Lett. 363, 226-230

Thomas H et al. (1996) Br. J. Cancer 73 (1) 65-72

Tjoa B et al. (1996) Prostate 28, 65-69

Tjoa B et al. (1995) Prostate 27, 63-69

Tokunaga A et al. (1995) Cancer 75 (6 suppl.) 1418-1425 Tosi E et al. (1995) Int. J. Cancer 62 (5) 643-650 Triozzi et al. (1994) Int. J. One. 5, 1447-1453 Troyer JK et al. (1995) Int. J. Cancer 62, 552-558 Valone FH et al. (1995) J. Clin. Oncol. 13 (9) 2281-2292 Valve E et al. (1997) Biochem Biophys Res. Commun. 232, 173177 van Dam PA et al. (1994) J. Clin. Pathol. 47 (10) 914-919 Weiner LM et al. (1995) Cancer Res. 55 (20) 4586-4593 Wright GL Jr et al. (1996) Urology 48, 326-334

Wu J et al. (1997) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 62, 1-10

Wu X, Fan Z, Masui H, Rosen N, Mandelsohn J. : Apoptosis induced by an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody in a human colorectal carcinoma celí line and its delay by insulin

Wynant GE et al. (1991) Prostate 18, 229-241

Xu X et al. (1998) Development 125, 753-765

Yamanishi H et al. (1995) J'. Steroid Biochem. Mol. Biol. 52, 49-53

Yoshimura K et al. Yoshimura K et al.

Yogeeswaran and Salk (1981) Science 212, 1514-1516 Yokoyama H et al. (1998) Dev. Biol. 196, 1-10 (1996) Cancer Lett 103, 91-97 (1997) Am. J. Med. Genet. 72, 354-362

Yung RA and Davis RW (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1194-1198

Zhang JD et al. (1991) [published erratum appears in Proc.

170

Natl. Acad. Sci USA 88 (12): 5477], Proc. Natl. Acad

Sci. USA 88, 3446-3450

Zhu Z et al. (1995) Int. J. Cancer 62 (3) 319-324

Zhu X et al. (1991) Science 251, 90-93

171

ZOZNAM SEKVENCII <110> M&E Biotech A/S STEINAA, Lucilla NIELSEN, Klaus Gregorius DALUM, Iben HAANING, Jesper LEÁCH, Dana .BIRK, Peter MOURITSEN, Soren GAUTAM, Anand KARLSSON, Gunilla <120> NOVÉ SPÔSOBY TERAPEUTICKEJ VAKCINÁCIE <130> 22113 PC 1 <140>

<141>

<160> 33 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2253 <212> DNA <213> Horno sapiens <220>

<221> CDS . .

<222> (1)..(2253) <220>, <221> misc_feature <222> (58)..(2253) <223 > Ľudská PSM' <220> ' .

<221> misc^feature <222> (4). . .(6) , ,, <223> Ggt alebo tgg kódujúci Gly, resp. Trp <400> 1 atg ggt aat ctc ctt cac gaa acc gac tcg get gtg gcc acc gcg ege

172

Met Gly 1 -

Asn

Leu

Leu His 5

Glu Thr Asp

Ser 10

Ala.Val

Ala

Thr

Ala 15

Arg

cgc

ccg

cgc

tgg

ctg

tgc

get

ggg

gcg

ctg

gtg

ctg

gcg

ggt

ggc

ttc

96

Arg

Pro

Arg

Trp

Leu

Cys

Ala

Gly

Ala

Leu

Val.

Leu

Ala

Gly

Phe

20

25

30

ttt

ctc

ggc

ttc

ctc

ttc

ggg

tgg

ttt

ata

aaa

tcc

aat

gaa

144

Phe

Leu

Gly

Phe

Leu

Phe

Gly

Trp

Phe

íle

Lys

Ser

Asn

Glu

35

40

45

get

act

aac

att

act

cca

aag

cat

aat

atg

aaa

gca

ttt

ttg

gat

gaa

192

Ala

Thr

Asn

íle

Thr

Pro

Lys

His

Asn

Met

Lys

Ala

Phe

Leu

Asp

Glu

50

55

60

ttg

aaa

get

gag

aac

atc

aag

ttc

tta

tat

aat

ttt

aca

cag·

ata

240

Leu

Lys

Ala

Glu

Asn

íle

Lys

Phe

Leu

Tyr

Asn

Phe

Thr

Gin

íle

65

70

75

80

cca

cat

tta

gca

gga

aca

gaa

caa

aac

ttt

cag

ctt

gca

aag

caa

att

288

Pro

His

Leu

Ala

Gly

Thr

Glu

Gin

Asn

Phe

Gin

Leu

Ala

Lys

Gl'n

íle

85

90

95

.caa

tcc

cag

tgg

aaa

gaa

ttt

ggc

ctg

gat

tct

gtt

gag

cta

gca

cat

336

Glň

Ser

Gin

Trp

Lys

Glu

Phe

Gly

Leu

Asp

Ser

Val

Glu

Leu

Alá

His

100

105

110

tat

gat

gtc

ctg

ttg

tcc

tac

cca

aat

aag

act

cat

ccc

aac'

tac

atc

384

Tyr

Asp

Val

Leu

Ser

Tyr

Pro

Asn

Lys

Thr

His

Pro

Asn

Tyr

íle

115

120

125

tca

ata

att

aat

gaa

gat

gga

aat

gag

att

ttc

aac

aca

tca

tta

ttt

432

Ser

íle

Asn

Glu

Asp

Gly

Asn

Glu

íle

Phe

Asn

Thr

Ser

Leu

Phe

130

135

140

gaa

cca

cct

cca

gga

tat

gaa

aat

gtt

tcg

gat

att

gta

cca

cct

480

Glu

Pro.

Pro

Gly

Tyr

Glu

Asn

Val

Ser

Asp

íle

Val

Pro

Pro '

.145

150

155

160

ttc

agt

get

ttc

tct

cct

caa

gga

atg

cca

gag

ggc

gat

cta

gtg

tat

528

Phe

Ser

Alá

Phe

Ser

Pro

Gin

Gly

Met

Pro

Glu

Gly

Asp

Leu

val

Tyr

165

170

175

gtt

aac

tat

gca

ega

act

gaa

gac

ttc

ttt

aaa

ttg

gaa

cgg

gac

atg

57 6

Val

Asn

Tyr-

Ala

Arg

Thr

. Glu

Asp

Phe

Lys

Leu

Glu

•Arg

Asp

Met

173

180 185 190

aaa atc aat

tgc Cys

tct Ser

ggg aaa

att íle 200

gta Val

att íle

gcc . Ala

aga tat ggg

aaa Lys

gtt Val

624

Lys

íle Asn 195

Gly

Lys

Arg

Tyr 205

Gly

ttc

aga

gga

aat

aag

gtt

aaa

aat

gcc

cag

ctg

gca

ggg

gcc

aaa

gga

672

Phe

Arg.

Gly

Asn

Lys

Val

Lys

Asn

Ala

Gin

Leu

Ala

Gly

Ala

Lys

Gly

210

215

220

gtc

att

ctc

tac

tcc

gac

cct

get

gac

tac

ttt

get

cct

ggg

gtg

aag

720

Val

íle

Leu

Tyr

Ser

Asp

Pro

Ala

Asp

Tyr

Phe

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

225

230

235

240

tcc

tat

cca

gat

ggt

tgg

aat

ctt

cct

gga

ggt

gtc

cag

cgt

gga

768

Ser

Tyr

Pro

Asp

Gly

Trp

Asn

Leu

Pro

Gly

Val

Gin

Arg

Gly

245

250

255

aat

atc

cta

aat

ctg

aat

ggt

gca

gga

gac

cct

ctc

aca

cca

ggt

tac

816

Asn

íle

Leu

Asn

Leu

Asn

Gly

Ala

Gly

Asp

Pro

Leu

Thr

Pro

Gly

Tyr .

260

265

270

cca

gca

aat

gaa

tat

get

tat

agg

cgt

gga

att

gca

gag

get

gtt

ggt

864

Pro

Ala

Asn

Glu

Tyr

Ala

Tyr

Arg

Gly

íle

Ala

Glu

Ala

Val

Gly

275

280

285

ctt

cca

agt

att

cct

gtt

cat

cca

att

gga

tac

tat

gat

gca

cag

aag

912

Leu

Pro

Ser

íle

Pro

Val

His

Pro

íle

Gly

Tyr

Asp

Ala

Gin

Lys

290

295

300

ctc

cta

gaa

aaa

atg

ggt

ggc

tca

gca

cca

cca.

gat

. agc

agc

tgg

aga

960

Leu

Glu

Lys

Met

Gly

Ser

Ala

Pro.

Pro

Asp

Ser

Trp

Arg

305

310

315

320

gga

agt

ctc

aaa

gtg

ccc

tac

aat

gtt

gga

cct

ggc

ttt

act

gga

aac

1008

Gly

Ser

Leu

Lys

Val

Pro

Tyr

Asn

Val

Gly

' Pro

Gly

Phe

Thr

Gly

Asn

325

330

335

ttt

tct

aca

caa

aaa

gtc

aag

atg

cac

atc

cac

tct

acc

aat

gaa

gtg

1056

Phe

Ser

Thr

Gin

Lys

Val

Lys

Met

His

íle

His

Ser

Thr

Asn

Glu

Val

340

345

350

aca

aga

att

tac

aat

gtg

ata

ggt

act

ctc

aga

gga

gca

.gtg

gaa

cca

1104

Thr

Arg

íle

Tyr

Asn

Val

íle

Gly

Thr

Leu

Arg

Gly

Ala

Val

Glu

Pro

355

360

365

gac

aga

tat

gtc

att

ctg

gga

ggt

cac

cgg

gac

tca

tgg

gtg

ttt

ggt

1152

Asp

Arg

Tyr

Val

íle

Leu

Gly

His

Arg

Ásp

' Ser

Trp

Val

Phe

Gly

370

375

380

174

ggt Gly 385

att íle

gac cct

cag Gin

agt Ser 390

gga Gly

gca get Ala Ala

gtt Val

g t ť. Val 395

cat His

gaa Glu

att íle

gtg Val

agg Arg 40Ô .

1200

Asp

Pro

age

ttt

gga

aca

ctg

aaa

aag

gaa ggg

tgg

aga'

cct

aga

aca

att

1248

Ser

Phe

Gly

Thr

Leu

Lys

Glu Gly

Trp

Arg

Pro

Arg

Thr

íle

405

410

415

ttg

ttt

gca

age

tgg.

gat

gca

gaa gaa

ttt

ggt

ctt.

ctt

ggt

tet

act

1296

Leu

Phe

Ala

Ser

Trp

Asp

Ala

Glu Glu

Phe

Gly

Leu

Gly

Ser

Thr

420

425

430

gag

tgg

gca

gag

aat

tca

aga ctc

ctt

caa

gag

cgt

ggc

gtg

get

1344

Glu

Trp

Ala

Glu

Asn

Ser

Arg Leu

Leu

Gin

Glu

Arg

Gly

Val

Ala

435

440

445

tat

att

aat

get

gac

tca

tet

ata gaa

gga

aac

tac

act

ctg'

aga

gtt

1392

Tyr

íle

Asn

Ala

Asp

Ser

íle .Glu

Gly

Asn

Tyr

Thr

Leu

Arg

Val

450

455

460

gat

tgt

aca.

ccg

ctg

atg

tac

age ttg

gta

cac

aac

cta

aca

aaa

gag

1440

Asp

Cys

Thr

Pro

Leu

Met

Tyr

Ser Leu

Val

His

Asn

Leu

Thr

Lys

Glu

465

470

475

480

ctg

aaa

age

cct

gat

gaa

ggc

ttt gaa

ggc

aaa

tet

ctt

tat

. gaa

agt

1488

Leu

Lys

Ser

Pro

Asp

Glu

Gly

Phe Glu

Gly

Lys

Ser

Leu

Ty_r

Glu.

Ser

485

490

495

tgg

act

aaa

agt

cct

tcc

cca gag

ttc

agt

ggc

atg

ccc

agg

ata

1536

Trp

Thr

Lys

Ser

Pro

Ser

Pro Glu

Phe

Ser

Gly

Met

Pro

Arg

íle

500

505

510

age

aaa

ttg

gga

tet

gga

aat

gat ttt

gag

gtg

ttc

caa

ega

ctt

1584

Ser

Lys

Leu

Gly

Ser

Gly

Asn

Asp Phe

Glu

Val

Phe

Gin

Arg

Leu .

' 515

520

525

gga

att

get

tca.

ggc.

aga

gca

cgg tat

act

aaa

aat

tgg

gaa

aca

aac

1632

Gly

íle

Ala

Ser

Gly

Arg

Ala

Arg Tyr

Thr

Lys

Asn

Trp

Glu

Thr

Asn

530

535

540

aaa

ttc

age

ggc

tat

cca

ctg

tat cac.

agt.

gtc-

tat

.gaa

aca

tá t

gag

1680

Lys

Phe

Ser

Gly

Tyr

Pro

Leu

Tyr His

Ser

Val

Tyr'

Glu

•.Thr

Tyr

Glu .

545:

550

555 '

560

ttg

gtg

gaa

aag

ttt

tat

gat

cca atg

ttt

aaa

tat

cac

ctc

act

gtg

1728

Leu

Val

Glu

Lys

Phe

Tyr

Asp

Pro . Met

Phe

Lys

Tyr

His

Leu

Thr

Val

565

570

575

175

gcc Ala.

cág gtt

ega Arg 580

gga Gly

ggg Gly

atg gtg

ttt Phe 585

gag Glu

cta gcc aat

tcc Ser 590

ata íle

gtg Val

1776

Gin

Val

Met

Val

Leu

Ala Asn

ctc

cct

ttt

gat

tgt

ega

gat

tat

get

gta

gtt

tta

aga

aag .

tat

get

1824

Leu

Pro

Phe

Asp

Cys.

Arg

Asp

Tyr

Ala

Val

Leu

Arg.

Lys

Tyr.

Ala

595

600

605

gac

aaa

atc

tac

agť

att

tet

atg

aaa

cat

cca

cag

gaa

atg

aag

aca

1872

Asp

Lys

íle

Tyr

Ser

íle

Ser

Met

Lys

His

Pro

Gin

Glu

Met

Lys

Thr

610

615

620

tac

agt

gta

tca

ttt

gat

tca

ctt

ttt

tet

gca

gta

aag

aat

ttt

aca

1920

Tyr'.

Ser

Val

Ser

Phe

Asp

Ser.

Leu

Phe,

Ser

Ala

Val

Lys

Asn

Phe'

Thr

625

630

635

640

gaa

att

get

tcc

aag

ttc

agt

gag

aga

ctc

cag

gac

ttt

gac

aaa

age

1968

Glu

íle

Ala

Ser

Lys

Phe

Ser

Glu

Arg

Leu

Gin

Asp

Phe

Asp

Lys

Ser

645

650

655

aac

cca

ata

gta

tta

aga

atg

aat

gat

caa

ctc

atg

ttt

ctg

gaa

2016

Asn

Pro

íle

Val

Leu

Arg

Met

Asn

Asp

Gin

Leu

Met

Phe

Leu

Glu

660

665

670

aga

gca

ttt

att

gat

cca

tta

ggg

tta

cca

gac

agg

cct

ttt

tat

agg

2064

Arg

Ala

Phe

íle

Asp

Pro

Leu

Gly

Leu

Pro

Asp

Arg·

Pro

Phe

Tyr

Arg

675

680

685

cat

gtc

atc

tat

get

cca

age

cac

aac

aag

tat

gca

. ggg

gag

tca

2112

His

Val

íle

Tyr

Ala

Pro

Ser

His

Asn

Lys

Tyr

Ala

Gly

Glu

Ser

690

695

700

ttc

cca

gga

att

tat

gat

get

ctg

ttt

gat

att

gaa.

age

aaa

gtg

gac

2160

Phe

Pro

Gly

íle

Tyr

Asp

Ala

Leu

Phe

Asp

íle

Glu

Ser

Lys

Val

Asp

705

710

715

720

cct

tcc

aag

gcc

tgg

. gga

gaa

gtg

aag

aga

'cag

att

tat

gtt

gca

gcc

2208

Pro

Ser

Lys

Ala

Trp

Gly

Glu

Val

Lys

Arg.

Gin

íle'

Tyr

Val

Ala

725

730

73.5

ttc

aca

gtg'

cag

gca

get

gca

•gag

.act

ttg

agt

gaa

gta

gcc.

taa

225 3

Phe

Thr

Val

Gin

Ala

Glu

Thr

Leu

Ser

Glu

Val

Ala

740

745

750

176 <210> 2 <211> 750 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Gly Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg

1

5

10

15

Arg

Pro

Arg

Trp

Leu

Cys

Ala

Gly

Ala

Leu

Val

Leu

Ala

Gly

Phe

20

25

30

Phe

Léu

Leu

Gly

Phe

Leu

Phe

Gly

Trp

Phe

íle

Lys

Ser

Asn

Glu

35

40

45

Ala

Thr

Asn

íle

Thr

Pro

Lys

His

Asn

Met

Lys

Ala

Phe .

Leu

Asp

Glu

50

55

60

Leu

Lys

Ala

Glu

Asn

íle

Lys

Phe

Leu

Tyr

Asn

Phe

Thr

Gin

íle

65

70

75

80

Pro

His

Leu

Ala

Gly

Thr

Glu

Gin

Asn

Phe

Gin

Leu

Ala

Lys

Gin

íle

85

90

95

Gin

Ser

Gin

Trp

Lys

Glu

Phe

Gly

Leu

Asp

Ser

Val

Glu

Leu

Ala

His

100

105

110

Tyr

Asp

Val

Leu

Lev

Ser

Tyr

Pro

Asn

Lys

Thr

His

Pro

Asn

Tyr

íle

115

120

¹²⁵

Ser

. íle

íle

Asn

Glu

Asp

Gly

Asn

Glu

íle

Phe

Asn

Thr

Sér

Leu

Phe

130

135

140

Glu

Pro

Gly

Tyr

Glu

Asn

Val

Ser

Asp

íle

Val

Pro

145

150

155

160

Phe

Ser

Ala

Phe

Ser

Pro

Gin

Gly

Met

Pro

Glu

Gly

Asp

Leu

Val

Tyr

165

170

175

Val

Asn

Tyr

Ala

Arg

Thr

Glu

Asp

Phe

Lys

Leu

Glu

Arg·

Asp

Met

180

185

190

Lys

íle

Asn

Cys

Ser

Gly

Lys

íle

Val

íle

Ala-

Arg

Tyr

Gly

Lys

Val

195

200

205

Phe

Arg

Gly

Asn

Lys

Val

Lys

Asn

Ala

Gin

Leu

Ala

Gly

Ala

Lys

Gly

210

215

2.20

Val

íle

Leu

Tyr_:

Ser

Asp

Pro

Ala

Ašp.

Tyr

Phe

Ala

Pro

Gly

Val

Lys

177

225

230

235 240

Ser

Tyr

Pro

Asp

Gly 245

Trp

Asn

Leu

Pro

Gly 250

Gly

Val

Gin

Arg 255

Gly

Asn

íle

Leu

Asn 260

Leu

Asn

Gly

Ala

Gly 265

Asp

Pro

Leu

Thr

Pro 270

Gly

Tyr

Pro

Ala

Asn 275

Glu

Tyr

Ala

Tyr

Arg 280

Arg

Gly

íle

Ala

Glu 285.

Ala

Val

Gly

Leu

Pro 290

Ser

íle

Pro

Val

His 295

Pro

íle

Gly

Tyr

Tyr 300

Asp

Ala

Gin

Lys

Leu 305

Leu

Glu

Lys

Met

Gly 310

Gly

Ser

Ala

Pro

Pro 315

Asp

Ser

Trp

Arg 320.

Gly

Ser

Leu

Lys

Val 325

Pro

Tyr

Asn

Val

Gly 330

Pro

Gly

Phe

Thr

Gly 335

Asn

Phe

Ser

Thr

Gin 340

Lys

Val

Lys

Met

His 345

íle

His

Ser

Thr

Asn 350

Glu

Val

Thr

Arg

He 355'

Tyr

Asn

Val

íle

Gly 360

Thr

Leu

Arg

Gly

Ala 365

Val

Glu

Pro

Asp. Arg . 370

Tyr

Val

íle

Leu

Gly 375

Gly

His

Arg

Asp

Ser .380

Trp

Val

Phe

Gly

Gly 385

íle

Asp

Pro

Gin

Ser 390

Gly

Ala

Val

Val 395

His

Glu

íle

Val

Arg 400

Ser

Phe'

Gly

Thr

Leu 405

Lys

Glu

Gly.

Trp 410

Arg

Pro

Arg

Thr 415

íle

Leu

Phé

Ala

Ser. 420

Trp

Asp_;

Ala

Glu

Glu 425

Phe

Gly

Leu

Gly 430

Ser

Thr

Glu.

Trp

Ala 435.

Glu

Asn

Sér

Arg 4 40

Leu

Gin

Glu

Arg 445

Gly

Val

Ala

Tyr

íle .450

Asn

Ala

Asp

Ser

Ser 455

íle

Glu

Gly

Asn

Ty_r 460

. Thr

Leu

Arg

Val

Asp

Cys

Thr

Pro

Leu

Met

Tyr

Ser

Leu

Val

His.

Asn

Leu

Thr

Lys

Glu

465

470 475 480

178

Leu Lys

Ser

Pro

Asp 485

Glu Gly Phe Glu Gly 490

Lys

Ser Leu

Tyr

Glu 495

Ser

Trp

Thr

Lys

Ser

Pro

Ser

Pro

Glu

Phe

Ser

Gly

Met

Pro

Arg

íle

500

505

510

Ser

Lys

Leu.

Gly

Ser

Gly

Asn

Asp

Phe

Glu

Val

Phe

Gin

Arg

Leu

515

520

525

Gly

íle

Ala

Ser

Gly

Arg

Ala

Arg

Tyr

Thr

Lys

Asn

Trp

Glu

Thr

Asn

530

535

540

Lys

Phe

Ser

Gly

Tyr

,Pro

Leu

Tyr

His

Ser

Val

Tyr

Glu

Thr

Tyr

Glu

545

550

555

560

Leu

Val-

Glu

Lys

Phe

Tyr

Asp

Pro

Met

Phe

Lys

Tyr

His

Leu

Thr

Val

565

570

575

Ala

Gin

Val

Arg

Gly

Met

Val

Phe

Glu

Leu

Ala

Asn

Ser

íle

Val

580

585

590

Leu

Pro

Phe

Asp

Cys

Arg

Asp

Tyr

Ala

Val

Leu

Arg

Lys

Tyr

Ala

595

600

605

Asp

Lys

íle

Tyr

Ser

íle

Ser

Met

Lys

His

Pro

Gin

Glu

Met

Lys

Thr

610

615

620.

Tyr

Ser

Val

Ser

Phe

Asp

Ser

Leu

Phe

Ser

Ala

Val·

Lys

Asn

Phe.

Thr

625

630

⁶³⁵

640

Glu

íle

Ala

Ser

Lys

Phe

Ser

Glu

Arg

Leu

Gin

Asp

Phe

Asp

Lys

Ser

645

650

655

Asn

Pro

íle

Val

Leu

Arg

Met

Asn

Asp

Gin

Leu

Met

Phe

Leu

Glu

660

665

670

Arg

Ala

Phe

íle

Asp

Pro

Leu·:

Gly.

Leu

Pro

Asp

Arg

Pro

Phe

Ty_X

Arg

675

680

685

His

Val

íle

Tyr

Ala

Pro

Ser

His

Asn

Lys

Tyr

Ala

Gly

' Gl.u'

Ser

.690

695

700.

Phe

Pro.

Gly

íle

Tyr

Asp

Ala

Leu

Phe

Asp

íle

Glu

Ser

.Lys

Val

Asp

705

710

715

720

Pro.

Ser-

Lys

Ala

Trp.

. Gly

Glu

vár

Lys

Arg

Gin

íle

Tyr

Val

Ala

;725.

730

735

Phé

.Thr

Val

Gin

Ala

.Ala

Glu

Thr

Leu

Ser

Gl.u

Val.

Ala

179

740

745

750

<210> 3

<211> 3768

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222>.(1)..ι

13768):

<400> 3

atg gag

ctg

gcg.

gcc

ttg

tgc

ege

tgg

ggg

ctc

ctc·

gcc

ctc

ttg

4.8

Met Glu

Leu

Ala

Leu

Cys

Arg

Trp

Gly

Leu

Ala

Leu

-20

-15

-10

ccc ccc

gga

gcc

gcg

age

acc

caa

gtg

tgc

acc

.ggc

aca

gac

atg

aag

96

Pro Pro

Gly

Ala

Ser

Thr

Gin

Val

Cys

Thr

Gly

Thr

Asp

Met

Lys

-5

-1

ľ

5

ctg cgg

ctc

cct

gcc

agt

ccc

gag

acc

cac

ctg

gac

atg

ctc

ege

cac ..

144

Leu Arg

Leu

Pro

Ala

Ser

Pro

Glu

Thr

His

Leu

Asp

Met

Leu

Arg

His

10 .

15

'20

25

ctc tac

cag

ggc

tgc

cag

gtg

cag

gg^a

aac

ctg

gaa

ctc

acc

tac

192

Leu Tyr

Gin-

Gly

Cys

Gin

Val

Gin

Gly

Asn.

Leu

Glu

Leu

Thr

Tyr

30

35

40

ctg ccc

acc

aat

gcc

age

ctg

.tcc

ttc

ctg.

cag

gat

atc

cag

gag

gtg

240

Leu Pro

Thr

Asn

Ala

Ser

Léu

Ser

Phe

Leu

Gin.

Asp

. íle

Gin

Glu'

Val

45

. ⁵⁰

. 55

cag ggc

tac

gtg

ctc

atc

get

cac

áac

caa

gtg

agg

cag.

gtc

cca

ctg

288

Gin Gly

Tyr

Val.

Leu

íle

Ala

His

Ašn

Gin

Val

Arg

Gin

Val

Pro.

Leu'

60

65

70

cag agg

ctg

cgg

att

gtg

ega

ggc

acc

cag

ctc

ttť

gag.

gac

aac

'.t á t

336

Gin Arg

Léu.

Arg

íle.

Val:

Arg

Gly.

Thr

Gin

Leu

Phé:

Glu

Asp

Asn

Tyr

75

.80

85.

gcc' čtg

gcc

gtg

cta

gac

aat

gga

gac

ccg

ctg

aac

aat

acc

cct

384

Ala Leu

'Ala

Val.·.

Leu'

Asp

Asn

Gly

Asp

Pro

Leu

Asn

Thr

Pro

90

. '95

100

. 105

180

gtc Val

aca ggg gcc Thr Gly Ala

tcc Ser .110

cca Pro

gga ggc ctg cgg

gag Glu

ctg cag

ctt' Leu

ega Arg 120

agc Ser

432

Gly

Leu

Arg 115

Leu

Gin

ctc

aca

gag

atc

ttg

aaa

gga

ggg

gtc

ttg.

atc

cag

cgg

aac

ccc

cag

480

Leu

Thr

Glu

íle

Leu

Lys

Gly

Val

Leu

íle

Gin

Arg.

Asn

Pro

Gin

125

130

135

ctc

tgc

tac

cag

gac

acg

att

ttg

tgg

aag

gac

atc

ttc

cac

aag

aac

528

Leu

Cys

Tyr

Gin

Asp

Thr

íle

Leu

Trp

Lys

Asp

íle

Phe

His

Lys

Asn

140

145

150

aac

cag

ctg

get

ctc

aca

ctg

ata

gac

acc

aac

ege

tet

cgg

gcc

tgc

576

Asn

Gin

Leu

Ala

Leu

Thr

Leu

íle

Asp

Thr

Asn

Arg

Ser

Arg

Ala

Cys

155

160

165

cac

ccc

tgt

tet

ccg

atg

tgt

aag

ggc

tcc.

ege

tgc

tgg

gga

gag

agt

624

His

Pro

Cys

Ser

Pro

Met

Cys.

Lys.

Gly

Ser

Arg

Cys

Trp

Gly

Glu

Ser

170.

175

180

185

tet

gag

gat

tgt

cag

agc

ctg

acg

ege

act

gtc

tgt

gcc

ggt

ggc

tgt

672

Ser

. Glu

Asp

Cys,

Gin

Ser.

Leu

Thr

Arg

Thr

Val

Cys

Ala

Gly

Cys

190

195

200

gcc

ege

tgc

aag

ggg

cca

ctg

ccc

act

gac

.tgc .tgc

cat

gag

cag

tgt

720

Ala

. Arg

Cys

Lys

Gly

Pro

Leu

Pro

Thr.

Asp

Cys

His

Glu

Gin

Cys

205

·?’

210

215

get

gcc

,ggc

tgc

acg

ggc

ccc

aag

cac

tet

gac

tgc

ctg

gcc

tgc

ctc

7 68'

Ala

Gly

Cys

Thr

Gly

Pro

Lys

His

Ser

Asp

Cys

Leu

Ala

Cys

Leu

.220

225

230

cac

ttc

aac

cac

agt

ggc

atc

tgt

gag

ctg

cac

tgc

cca

gcc

ctg

gtc

.816.

His

Phe

Asn

His

Ser

Gly

Tie

Cys

Glu

Leu.

His

Cys

Pro'

Ala

Leu

Val

235

240

245

acc

tac

aac

aca

gac

acg

ttt

gag

tcc

. atg'

ccc

aat

cc.c

gag

ggc.

cgg

. 864

Thr

Tyr

Asn

Thr

Asp

Thr

Phe

Glu

Ser

Meť

Pro

Asn

Pro

Glú

Gly Arg·

250

255

260

265

tat'

aca

ttc

ggc

gcč

agc

tgt

gtg

act

gcc

tgt

ccc

tac

aac

tac

ctt

912

Tyr

Thr

. Phe

Gly'

Ala

Ser

Cys

Val

Thr

Ala

Cys

Pro

Tyr

Ásn

Tyr

Leu ·

270

275

280

tet

acg

gac

gtg

gga

tcc

tgc

acc

ctc

gtc

tgc

ccc

ctg

Cac

aac

caa

960.

Ser

T.hr

Asp

Val

Gly

Ser

Cys

Thr.

Leu

Vaľ

Cys

Pro

Leu

His

Asn

Gin-

285.

290

295

181

gag gtg aca

gca Ala

gag Glu

gat Asp

gga aca Gly Thr 305

cag cgg Gin Arg

tgt gag aag Cys Glu Lys 310

tgc Cys

age Ser

aag Lys

1008

Glu

Val

Thr. 300.

ccc

tgt

gcc

ega

gtg

tgc

tat

ggt-

ctg'

ggc

atg

gag

cac

ttg

ega

gag

1056

Pro

Cys

Ala-

Arg

Val

Cys

Tyr

Gly

Leu

Gly

Met

Glu

His

Leu

Arg

Glu

315

320

325

gtg

agg

gca

gtt

acc

agt

gcc

aat

atc

cag

gag

ttt

get

ggc.

tgc

aag

1104

Val

Arg

Ala

Val

Thr

Ser

Ala

Asn

íle

Gin

Glu

Phe

Ala

Gly

Cys

Lys

330

335

340

345

aag

atc

ttt.

ggg

age

ctg

gca

ttt

ctg

ccg

gag

age

ttt

gat

ggg

gac

1152

Lys

.íle

Phe

Giy

Ser

Leu

Ala.

Phe

Leu

Pro

Glu

Ser

Phe

Asp

Gly

Asp

350

355

360

cca

gcc

tcc

aac

act

gcc

ccg

ctc

cag

cca

gag

cag

ctc

caa

gtg

ttt

1200

Pro

Ala

Ser

Asn

Thr

Ala

Pro

Leu

Gin

Pro

Glu

Gin

Leu

Gin

Val

Phe

365

370

375

gag

act

ctg

gaa

gag

atc

aca

ggt

tac

cta

tac

atc

tca

gca

tgg

ccg

1248

Glu

Thr

Leu

Glu

He

Thr

Gly

Tyr

Leu

Tyr

íle

Ser

Ala

Trp

Pro

380

385

390

gac

age

ctg

cct.

gac

ctc

age

gtc.

ttc

cag

aac

ctg

caa

.gta

atc

cgg

1296

Asp

Ser

Leu

Pro

Asp

Leu

Ser

val

Phe

Gin

Asn

Leu

Gin

Val

íle

Arg

395

'400

405

gga

ega

att

ctg

cac

aat

ggc

gcc

tac

tcg

ctg

acc

ctg

caa

ggg

ctg

1344

Gly

Arg

íle

Leu

His

Asn

Gly

Ala

Ty_X

Ser

Leu

Thr

Leu

.Gin

Gly

Leu

410

415

420

425

ggc

atc

age

tgg

cťg

ggg

ctg

ege

tca

ctg

agg

gaa

ctg

ggc

ágt

gga

1392

Gly

íle’

Ser

Trp

Leu

Gly.

Leu

Arg

Ser

Leu

Arg

Glu

Leu

Gly

Ser

Gly

430

435

•4 40.

ctg

gcc

ctc

atc

cac

cat

aac

acc

cac

ctc;

tgc

ttc·

gtg

cac

.acg

gtg

1440

Leu

Ala;

Leu

íle.

His'

His

Asn

Thr

His

Leu

Cýs.

Phe

Val

His.

Thr

Val

• 'i

445

450

455

CCC

tgg

gac

cag

ctc

ttt

cgg

aac

ccg

cac

caa

get

ctg

čtc

cac

act

'.1488

Pro

Trp

Äšp

Gin

Leu

Ph.e

Arg

Asn

Pro

His

Gin

'Ala

Leu

His

Thr'

460

.4 65

470

gcc

aac

cgg

cca

.gag

gac

gag

tgt

gtg

ggc

gág.

ggc

' čtg

gcc

tgc

cac

1536

182

1584 atc íle 650 ·

Ala cag

Gin

490 gtc

Val ega

Arg ttg

Leu ttt

Phe cct

Pro

570 tcc

Ser' cct

Pro ggc

Glý gcg

Ala-

Asn 475

Arg

Pro

Glu

Asp

Glu Cys Val Gly 480

Glu Gly 485

Leu Ala Cys

His

ctg

tgc

gcc

ega

ggg

cac

tgc

tgg

ggt

cca

ggg

ccc

áčc

cag

tgt

Leu

Cys

Ala

Arg

Gly

. His

Cys

Trp

. Gly

Pro

Gly

Pro

Thr

Gin

Cys

495

500

505

aac

tgc

agc

cag

ttc

Ctt

cgg

ggc

cag

gag

tgc

gtg

gag

gaa

tgc

Asn

Cys

Ser

Gin

Phe

Leu

Arg

Gly

Gin

Glu

Cys

Val

Glu

Cys

510

515

520

gta

ctg

cag

ggg

ctc

ccc

agg

gag

tat

gtg

aat

gcc

agg

cac

tgt

Val

Leu

Gin

Gly

Leu

Pro

Arg

Glu

Tyr

Val

Asn

Ala

Arg

His

Cys.

525

530

v*.-

535

ccg

tgc

cac.

cct

gag

tgt

cag

ccc

cag

aat

ggc

tca

gtg

acc

tgt

Pro

Cys

His

Pro

Glu

Cys

Gin

Pro

Gin

Asn

Gly

Ser

Val

Thr

Cys

540

545

550

gga Gly

ccg

. gag

get

gac

cag

tgt

gtg

gcc

tgt

gcc

cac

tat

aag

gac

Pro

'^r'Glu

Ala

Asp

Gin

Cys

Val

Ala

Cys

Ala.

His

Tyr

Lys

Asp

555

560

565

ccc

ttc

tgc-

gtg

gcc

ege

tgc

ccc

agc

ggt

gtg

aaa

cct

gac

ctc.

Pro

Phe

Cys

Val

Ala

Arg

Cys

Pro

Ser

Gly

Val

Lys

Pro

Asp

Leu

.575

580

585

tac Tyr

atg

ccc

atc

tgg

aag

ttt

cca

gat

gag

ggc

gca

tgc

cag

Met

Pro

íle

Trp

Lys

Phe

Pro

Asp

Glu

Glu.

Gly

Ala

Cys

Gin

590

595

600

tgc

ccc

atc

aac

tgc

acc

cac

tcc

tgt

gtg

gac

ctg

gat

gac

aag

Cys

.Pro

íle

A^h;,

•Cys

Thr

His

Ser.

Cys

Val

Asp

Leu

Asp

Lýs

605

610

615.

tgc

ccc

gcc

gag-

cag

aga

gcc .

agc

cct

ctg

acg

tcc

atc

gtc

tet :

Cys

Pro

Ala

Glu

Gin

Arg

Ala

Ser.

Pro

Leu

Thr ·

Ser

íle

Vaľ·

Ser

620

⁶²⁵

.63.0

gtg

gtt '

ggc-

att

ctg. ctg

gtc

gtg..

gtc

ttg

ggg'

gtg

gtc^:

ttt;

ggg

Val

.Val

Gly

íle

Leu

Leu '

Val:

Val.

Val

Leu·

Glý. Val ·

Val

Phé:

Gly

.635

640

645 .

ctc

atc

aag'

ega.

cgg

cag

aag .

atc

cgg

aag

tac

acg

atg

cgg

Leu

íle.

Lys '

Arg Arg.i

Gin ;

Gin-Lys

íle ,

Arg

Lýs

Tyr..

Thr

Met

Arg'

655 . · 660 ·. 665

163.2

1680

1728

1776

1824

1872

1920

1968

2064

2016 aga ctg ctg cag gaa acg gag ctg .gtg gag . Arg. Leu Leu Gin Glu Thr Glu Leu -.Vaľ Glu ccg ctg· aca cct acc ega Pro Leu Thr Pro Ser Gly .

. 2112

183

670 675 680

gcg atg ccc aac

cag gcg cag atg

cgg atc ctg aaa

gag Glu.

acg Thr 695 '

gag Glu

ctg Leu

2160

Ala

Met

Pro Asn 685

Gin

Ala

Gin Met

Arg íle 690 '

Leu

Lys

agg

aag

gtg

aag.

gtg

ctt

gga

tet

ggc

get

ttt

ggc

aca

gtč

tac

aag

2208.

Arg

..Lýs

Val

Lys

Val

Leu

Gly

Ser

Gly

Ala

Phe

Gly

Thr

Val

Tyr

Lys

700

705

710

ggc

atc

tgg

atc

cct

gat

ggg

gag

aat

gtg

aaa

att

cca

gtg

gcc

atc

2256

Gly

íle.

Trp

íle.

Pro

Asp

Gly

Glu

Asn

Val

Lys

íle

Pro

Val

Ala

íle.

715

720

725

aaa

gtg

ttg

agg

gaa

aac

aca

tcc

ccc

aaa

gcc

aac

aaa

gaa.

atc

tta

2304

Lys

Val

Leu

Arg.

Glu

Asn

Thr

Ser'

Pro

Lys

Ala

Asn

Lys

Glu

íle

Leu

730

735

740

745

gac

gaa

gca

tac

gtg

atg

get

ggt

gtg

ggc

tcc

cca

tat

gtc

tcc

ege

• 2352

Asp

Glu

Ala

Tyr

Val

Met

Ala

Gly

Val

Gly

Ser

Pro

Tyr

Val

Ser

Arg

750

755

760

ctt.

ctg

ggc

atc

tgc

ctg

aca

tcc

acg

gtg

cag

ctg

gtg

aca

cág

ctt

2400

Leu

Gly

íle.

Cys

Leu

Thr

Ser

Thr

Val

Gin

Leu

Val

Thr

Gin

Leu

765

770

775

atg

ccc

tat

ggc

tgc

ctc

tta

gac

cat

gtc

cgg

gaa

aac

ege

gga.

ege

2448

Met

Pro

Tyr

Gly

Cys

Leu

Äsp

His

Val

Arg

Glu

Asn

Arg

Gly.

Arg

780

785

790

ctg

ggc

tcc

cag

gac

ctg

aac

tgg

tgt.

atg

cag

att

gcc

aag

ggg.

2496

Leu

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Asn

Trp

Cys

Met

Gin.

íle

Ala

Lys

Gi.y

'795

800

805

atg

age

tác

. ctg

gag

gat

gtg

cgg

ctc

gta

cac

agg

gac

ttg

gcc

get

2544

Met

Ser

Tyr

Leu

Glu

Asp

Val

Arg·

Leu

Val

His

Arg Asp

Leu’

Ala

81Ó

815

820

825

cgg

aac

gtg

ctg

gtc

aag

agt

ccc

aac

cat

gtc

aaa

att

aca

gac

ttc

2592

Arg

Asn

Val

Leu

Val

Lys

Ser

Pro

Asn

His

Val

Lys

íle

Thr

Asp'

Phe

830

835

840

ggg.

ctg

get

cgg

ctg

gac

att

gac

gag

aca

gag

tac

cat

gca

gat

. 2640

Gly-

Leu

Ala

Arg

Leu

Asp

íle

Asp

Glu

Thr

Glu

Tyr

His.

Ala

Asp

8 45

850

855

184

ggg ggc aag gtg

ccc Pro

atc íle

aag Lys

tgg atg gcg

ctg gag tcc att ctc

cgc Arg

2688

Gly

Lys Val 860

Trp 865

Met

Ala

Leu

Glu

Ser 870.

íle

Leu

cgg

ttc acc

cac

cag

agt

gat

gtg

tgg

agt

tat

ggt·

gtg

act

gtg

2736

Arg

Arg 875

Phe Thr

His

Gin

Ser 880

Asp

Val

Trp

Ser

Tyr 885

Gly

Val

Thr

Val

tgg

gag

ctg atg

act

ttt

ggg

gcc

aaa

cct

tac

gat

ggg

atc

cca

gcc

2784

.Trp 890

Glu

Leu Met

Thr

Phe 895

Gly

Ala

Lys

Pro

Tyr 900

Asp

Gly

íle

Pro

Ala 905

cgg

gag

atc cct

gac

ctg

gaa

aag

ggg

gag

cgg

ctg

ccc

cag

ccc

2832

Arg

Glu

íle Pro

Asp 910

Leu

Glu

Lys

Gly 915

Glu

Arg

Leu

Pro

Gin 920

Pro

ccc

atc

tgc acc

att

gat

gtc

tac

atg

atc

atg

gtc

aaa

tgt

tgg

atg

2880

Pró

íle

Cys Thr ' 925

íle

Asp

Val

Tyr

Met 930

íle

Met

Val

Lys

Cys 935

Trp

Met

att

gac

tet gaa

tgt

cgg

cca

aga

ttc

cgg

gag

ttg

gtg

tet

gaa

ttc

2928

íle

Asp

Ser Glu 940

Cys

Arg

Pro

Arg 945

Phe

Arg

Glu

Leu

Val 950

Ser

Glu

Phe

tcc

cgc

atg gcc

agg

gac

ccc

cag

cgc

ttt

gtg

gtc

atc

cag

aat

gag

2976

Ser

Arg 955

Met Ala

Arg

Asp

Pro 960

Gin

Arg

Phe

Val

Val 965

íle

Gin

Asn

Glu

gac

ttg

ggc cca

gcc

agt

ccc

ttg

gac

age

acc

ttc

tac

cgc

tca

ctg

' 3024

Asp 970

Leu

Gly. Pro

Ala

Ser 975

Pro

Leu

Asp

Ser

Thr 980

Phe

Tyr

Arg

Ser

Leu 985 ..·

ctg

gag

gac gat

gac

atg

ggg

gac.

ctg

gtg

gat

get

gag

tat.

ctg

3072

Leu

Glu

Asp Asp

Asp 990

Met

Gly

Asp

Leu

Val 995

Asp

Ala

Glu

Glu Tyr 1000

Leu

gta

ccc

cag cag.

ggc

ttc.

ttc

tgt

cca

gac

cct

gcc.

ccg

ggc.

get

ggg

3120

Val

Pro

Gin Gin 1005

Gly

Phe

Cys Pro . 1010

Asp

Pro

Ala

Pro Gly 1015

Ala

Gly

ggc

atg

gtc cac

cac

agg

cac

cgc

age

tca-

tet

acc

agg'

agt

ggc

ggt.

3168

Gly

Met Val His. 1020

His

Arg

His Arg . . 1025

Ser

Sér

Thr Arg 1030

•Ser

Gly

Gly ·

ggg

gac

ctg aca

cta

ggg

ctg

gag

ccc

tet

gaá-

gag

i gag

gcc

ccc

agg

3216

Gly

Asp L035

Leu Thr

Leu

Gly Leu 1040

Glu

Pro

Ser

Glu

Glu L045

Glu

Ala

. Pro

Arg

185

·. tet cca Ser Pro 1050

ctg Leu

gca Ala

ccc tcc Pro Ser 1055

gaa Glu

ggg Gly

get Ala

ggc tcc Gly Ser 1060

gat Asp

gta Val

ttť Phe

gat ggt Asp Gly ' 1065

3264.

gac ctg

gga

atg

ggg gca

gcc

aag

.999

ctg caa

age

ctc

ccc

aca cat

3312

Asp Leu

Gly

Meť

Gly Ala

Ala

Lys

Gly

Leu Gin

Ser

Leu

Pro

Thr His

1070'

1075

1080

gac ccc

age

cct

cta cag

cgg

tac

agt

gag gac

CCC

aca

gta

ccc ctg

3360

Asp Pro

Ser

Pro

Leu Gin

Arg

Tyr

Ser

Glu Asp

Pro

Thr

Val

Pro Leu

1085

1090

1095

ccc tet.

gag

act

gat ggc

tac

gtt

gcc

ccc ctg

acc

tgc

age

ccc cag

3408

.Pro Ser

Glu

Thr.

Asp Gly

Tyr

Val.

Ala

Pro Leu

Thr

Cys

Ser

Pro Gin

1100

' 1105

1110

•cct gaa'

tat

gtg

aac cag

cca

gat

gtt

cgg ccc

cag

ccc

ccť

tcg ccc

3456

Pro Glu

Tyr

Val

Asn^:Gin

Pro

Asp

Val

Arg Pro

Gin

Pro

Ser Pro

1115

1120

1125

ega gag

ggc

cct

ctg cct

get

gcc

ega

cct get

ggt.

gcc

act

ctg gaa

3504

Arg Glu

Gly

Pro

Leu Pro

Ala

Arg

Pro Ala

Gly

Ala

Thr

Leu Glu

1130 .

1135

¹¹⁴⁰

1145

agg.gcc

aag

act

ctc tcc

cca

ggg

aag

aat ggg

gtc

gtc.

aaa

gac gtt

3552

Arg Ala

Lys

Thr

Leu Ser

Pro

Gly

Lys

Asn Gly

Val

Lys

Asp'Val

.1150

1155

: 160. .

ttt gcc

ttt

ggg

ggt gcc

gtg

gag

aac

ccc gag

tac

ttg

aca

ccc cag

3600

Phe Ala

Phe

Gly

Gly Ala

Val

Glu

Asn

Pro Glu

Tyr

Leu-

Thr

Pro Gin .

1165

1170

1175

gga gga

get

gcc

cct cag

ccc

cac

cct

ccť· cct

gcc

ttc

agč

cca gcc

3648

. Gly Gly

Ala

Pro Gin

Pro

His

Pro.

Pro Pro

Ala

Phe

Ser

Pro^: Ala

1180

1185

1190

ttc gac

aac

ctc

tat tac

. tgg

gac

cag

gac.· cca

cca

gag

cgg

ggg get

3696

Phe Ásp

Asn

Leu

Tyr Tyr

Trp

Asp

Gin

Asp Pro

• Pró

Glu

Arg

’Gly Ala

1195

1200

' 1205

cca ccc

age

•acc

ttc .aaa

ggg

aca

cct

acg gca

. gag

aac

cca

gag tac'

37 4 4

P-ro Pro

Ser

Thr·

Phe Lys'

Gly

Thr

Pro

•Thr Ala

Glu

Asn.

Pro

Glu Tyr

.1210

1215

1220

' 1225

ctg ggt

ctg

gac

gtg cca

gtg

tga

3768

Leu Gly

Leu

Asp

Val Pro

Val

1230

186 <210> 4 <211> 1255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met Glu Leu Ala Ala • 1 5

Pro'Pro Gly Ala Ala 20

Leu Arg Leu Pro Ala 35

Leu Tyr Gin Gly Cys 50

Leu Pro Thr Asn Ala 65

Gin Gly Tyr Val Leu 85

Gin Arg Leu Arg íle 100

Ala Leu Ala Val Leu ¹¹⁵

Val Thr Gly Ala Ser 130

Leu Thr Glu íle Leu 145

Leu Cys Tyr Gin Asp 165

Asn Gin Leu Ala Leu 180- .

His Pro Cys Ser Pro .195

Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 10 15

Ser Thr Gin Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 25 30

Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 40' 45

Gin Val Val Gin Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 55 60

Ser Leu Ser Phe Leu Gin Asp íle Gin Glu Val 70 ' 75 80 íle Ala His Asn Gin Val Arg Gin Val Pro. Leu

95

Val Arg Gly Thr Gin Leu Phe Glu Asp Asn Tyr . 105 110

Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asri Asn Thr Thr Pro 120 . 125

Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gin Leu Arg Ser 135 . 140 .

Lys Gly Gly Val Leu íle Gln_; Arg Asn Pro Gin 150 155. 160

Thr íle Leu Trp Lys Asp íle Phe His Lys Asn 170 175

Thr. Leu íle Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala-Cys 185 190 . Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser

200 . 205

187

Ser Glu Asp

Cys Gin Ser

Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

210

215

220

Ala

Arg

Cys

Lys

Gly

Pro

Leu

Pro

Thr

Asp

Cys

His

Glu

Gin

Cys'

225

230

235

240

Ala

Gly

Cys

Thr

Gly

Pro

Lys

His

Ser

Asp

Cys

Leu

Ala

Cys

Leu

245

250

255

His

Phe

Asn

His

Ser

Gly

íle

Cys

Glu

Leu

His

Cys

Pro

Ala

Leu

Val

260

265

270

Thr

Tyr

Asn

Thr

Asp·

Thr

Phe

Glu

Ser

Met

Pro

Asn

Pro

Glu

Gly

Arg

275

280

285

Tyr

Thr'

.Phe

Gly

Ala

Ser

Cys

Val

Thr

Ala

Cys

Pro

Tyr

Asn

Tyr

Leu

290

295

300

Ser

Thr

Asp

Val

Gly

Ser

Cys

Thr

Leu

Val

Cys

Pro'

Leu

His

Asn

Gin

305

.310

315

320·

Glu

Val

Thr

Ala

Glu

Asp

Gly

Thr

Gin

Arg

Cys

Glu

Lys

Cys

Ser

Lys

325

330

335

Pro

Cys

Ala

Arg

Val

Cys

Tyr

Gly

Leu

Gly

Met

Glu

His

Leu

Arg

Glu

340

345

350

Val

Arg

Ala

Val

Thr

Ser

Ala

Asn

íle

Gin

Glu

Phe

Ala

Gly

Cys

Lys

355

360

365

Lys

íle

Phe

Gly

Ser

Leu

Ala

Phe

Leu

Pro

Glu

Ser

Phe

Asp.

Gly

Asp

370

375

380

Pro

Ala

Ser

Asn

Thr

Ala

Pro

Leu

Gin

Pro

Glu

Gin

Leu

Gin

Val

Phe

385

390

395

400

Glu

Th'r

Leu

Glu

íle

Thr

Gly

Ty_r

Leu

Tyr dle

Ser

Ala

Trp

Pro

405

410

415

Asp

Ser

Leu

Pro

Asp

Leu

Ser

Val

Phe

Gin

Asn

Leu

Gin

Val

Iíe

Arg

420

425

430

Gly

Arg

íle

Leu

His

Asn

Gly

Ala

Tyr

Ser

Leu

Thr

Leu

Gin

Gly

Leu

435

4 4 0.

.4 45

Gly

íle

Ser

Trp

Leu

Gly

Leu. Arg

Ser

Leu

Arg

Glu

Leu

Gly

Ser

Gly

450

455

460

Leu

Ala

Leu

íle

His

Asn

Thr

His

Leu

Cys

Phe

Val

His

Thr

Val

465

470

475

480

188

Pro Trp Asp Gin Leu

Phe

Arg

Asn

Pro His Gin Ala Leu Leu His

Thr

485

490

495

Ala

Asn

Arg

Pro

Glu

Asp

Glu

Cys

Val

Gly

Glu

Gly

Leu

Ala

Cys

His

500

505

510

Gl.n

Leu

Cys

Ala

Arg

Gly

His

Cys

Trp

Gly

Pro

Gly

Pro

Thr

Gin

Cys

515

520

525

Val

Asn

Cys

Ser

Gin

Phe

Leu

Arg

Gly

Gin

Glu

Cys

Val

Glu

Cys

530

535

540

Arg

Val

Leu

Gin

Gly

Leu

Pro

Arg

Glu

. Tyr

Val

Asn

Ala

Arg

His

Cys

545

550

555

560

Leu

Pro

Cys

His

Pro

Glu

Cys

Gin

Pro

Gin

Asn

Gly

Ser

Val

Thr

Cys

565

570

575

Phe

Gly

Pro

Glu

Ala

Asp

Gin

Cys

Val

Ala

Cys

Ala

His

Tyr

Lys

Asp

580

585

590

Pro

Phe

Cys

Val

Ala

Arg

Cys

Pro

Ser

Gly

Val

Lys

pro

Asp

Leu

595

600

605

Ser

Tyr

Met.

Pro

íle

Trp

Lys

Phe·

Pro

Asp

Glu

Gly

Ala

Cys

Gin

610

615

620

Pro

Cys

Pro

íle

Asn

Cys

Thr

His

Ser

Cys

Val

Asp

Leu

Asp

Lys

625

630

635

640

Gly

Cys

Pro.

Ala

Glu

Gin

Arg

Ala

Ser

Pro

Leu

Thr'

Ser

íle

Val

Ser

645·

650

655

Ala

Val

Gly

íle

Leu

Val

Leu

Gly

Val

Phe

Gly

660

665

670

íle

Leu

íle

Lys

Arg

Gin

Lys

íle

Arg

Lys

Tyr

Thr

Met

Arg

675

680

685.

Arg

Leu

Gin

Glu

Thr

Glu

Leu

Val

Glu

Pro

Leu

Thr

P.ro

Ser

Gly

690

695

700

Ala

Met

Pro

Asn

Gin

Ala

Gin

Met'

Arg

íle

Leu

Lys

Glu

Thr

Glu

Leu

705

710

.715

720

189

Arg Lys Val Lys Val

Leu

Gly

Ser

Gly Ala 730

Phe

Gly

Thr

Vaľ

Tyr 735

Lys

725

Gly

íle

Trp

íle

Pro

Asp

Gly

Glu

Asn

Val

Lys

íle

Pro

Val

Ala

íle

740

745

750

Lys

Val.

Leu

Arg

Glu

Asn

Thr

Ser

Pro

Lys

Ala

Asn

Lys

Glu

íle

Leu

755

760

765

Asp

Glu

Ala

Tyr

Val

Met

Ala

Gly

Val

Gly

Ser

Pro

Tyr

Val

Ser

Arg

770

775

780

Leu

Gly

íle

Cys

Leu

Thr

Ser

Thr

Val

Gin

Leu

Val

Thr

Gin

Leu

785

790

795

800

Met

Pro

Tyr

Gly

Cys

Leu

Asp.

His

Val

Arg

Glu

Asn

Arg Gly

Arg

805

810

815

Leu

Gly

Ser

Gin

Asp

Leu

Asn

Trp

Cys

Met

Gin

íle

Ala

Lys

Gly

820

825

830

Met

Ser

Tyr

Leu

Glu

Asp

Val

Arg

Leu

Val

His

Arg

Asp

Leu

Ala

835

840

845

Arg

Asn

Val

Leu

Val

Lys

Ser

Pro

Asn

His

Val

Lys

íle

Thr

Asp

Phe

850

855

860

Gly

Leu

Ala

Arg

Leu

Asp

íle

Asp

Glu

Thr

Glu

Tyr.

His

Ala

Ásp

865

870

875

880

Gly

Lys

Val

Pro

íle.

Lys

Trp

Met

Ala

Leu

Glu

Ser

íle

Leu

Arg

885

890.

895

Arg

Phe

.Thr

His

Gin

Ser

Asp

Val

Trp

Ser

Tyr

Gly

Val

Thr

Val

900

905

910

Trp

Glu

Leu

Met

Thr-

Phe

Gly

Ala

Lys

Pro

Tyr

Asp

Gly

He

Pro

Ala

915

920

925

Arg

Glu

íle

Pro

Asp

Leu

Glu

Lys

Gly

Glu

Arg

Leu

Pro

Gin

Pro

930

935

940

Pro

íle

Cys

Thr

íle

Asp

Val

Tyr

Met

íle

Met

Val

Lys

Cys

Trp

Met

945

950

955

960

íle

Asp

Ser

Glu

Cys

Arg

Pro

Arg

Phe

Arg

Glu

Leu

Val

Sér

Glu

Phe

965

970

975

Ser

Arg

Met-

Ala

Arg

Asp

Pro

Gin

Arg

Phe

Val

íle.

Gin

Asn

Glu

980 985 . ' 990

190

Asp Leu Gly	Pro	Ala	Ser	Pro Leu Asp . 1000	Ser	Thr	Phe Tyr 1005	Arg	Ser	Leu
	995
Leu Glu	Asp	Asp	Asp	Met	Gly Asp Leu	Val	Asp	Ala Glu	Glu	Tyr	Leu
1010				1015		1020
Val Pro	Gin	Gin	Gly	Phe	Phe Cys Pro	Asp	Pro	Ala Pro	Gly	Ala	Gly
025			1030		1035			1040
Gly Met	Val	His	His	Arg	His Arg Ser	. Ser	Ser	Thr Arg	Ser	Gly.	Gly
		1045		1050			1055
Gly Asp	Leu	Thr.	Leu	Gly	Leu Glu Pro	Ser	Glu	Glu Glu	Ala	Pro	Arg
	1060			1065			1070
Ser Pro	Leu	Ala	Pro	Ser	Glu Gly Ala	Gly	Ser	Asp Val	Phe	Asp	Gly
1075				1080			1085.
Asp Leu	Gly	Met	Gly	Ala	Ala Lys Gly	Leu	Gin	Ser Leu	Pro	Thr	His
1090				' 1095		1100
Asp Pro	Ser	Pro	Leu	Gin	Arg Tyr Ser	Glu	Asp	’Pro Thr	Val	Pro	Leu
105			1110		1115			1120
Pro Ser	Glu	Thr	Asp	Gly	Tyr Val Ala	Pro	Leu	Thr Cys	Ser	Pro	Gin
		1125		1130			1135
Pro.Glu	Tyr	'.Val	Asn	Gin	Pro Asp Val	Arg	Pro	Gin Pro	Pro	Ser	Pro
	114 0			1145			1150
Arg Glu	Gly	Pro	Leu	Pro	Ala Ala Arg	Pro	. Ala	Gly Ala	Thr	Leu'	Glu
1155				1160			1165
Arg Ala	Lys	Thr	Leu	Ser	Pro Gly Lys	Asn	•Gly	Val Val	Lys.	Asp	Val
1170				1175		1180
Phe Ala	Phe	Gly	Gly	Ala	Val Glu Asn	Pro	Glu	Tyr Leu	Thr	Pro	Gin
185			1190		• 1195			1200
Gly Gly	Ala	Alä	Pro	Gin	Pro'·His Pro	Pro	Pro	Ala Phe	Ser	Pro.	Ala
		1205		1210.				1215
Phe Asp	Asn	Leu	Tyr	Tyr	Trp Asp Gin Asp	Pro	Pro Glu	Arg	Gly	Äla

1220 1225 1230.

191

Pro Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr 1235 1240 1245

Leu Gly Leu Asp Val Pro Val 1250 1255 <210> 5 <211> 648 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)..(648) <400> 5

atg ggc

agc ccc

cgc Arg 5

tcc gcg

ctg Leu

agc Ser

tgc Cys ¹⁰

ctg ctg ttg cac ttg

ctg Leu

48

Met 1

Gly

Ser

Pro

Ser

Ala

Leu

His

Leu 15

gtt

ctc

tgc

ctc

caa

gcc

cag

gta

act

gtt

cag

tcc

tca

cct

aat

ttt

96

Val

Leu

Cys

Leu

Gin

Ala

Gin

Val

Thr

Val

.Gin

Ser

Pro

Asn

Phe

20

25

30

aca

cag

cat

gtg.

agg

gag

cag

agc

ctg

gtg

acg

gat

cag

ctc

agc

cgc

144

Thr

Gin

His

Val

Arg

Glu

Gin

Ser

Leu

Val

Thr

Asp

Gin

Leu

Ser

Arg

35

40

45

cgc

ctc

atc

cgg

acc

tac

cag

ctc

tac

agc

cgc

acc

agc

ggg

aag

cac

192

Arg

Leu

íle

Arg

Thr

Tyr

Gin

Leu

Tyr

Ser

Arg

Thr

Ser

Gly

Lys

His

50

55

. 60

'gtg

cag

. gtc

ctg

gcc

aac

aag

cgc

atc

aac

gcc.

atg

gca

gaa

gac

gga

240

Val

Gin

Val

Leu

Ala

Asn

Lys

Arg

íle

Asn

AÍa

Met

Ala

'Glu

Asp

Gly

65

70

75

80

gac

ccc

ttc

gcg

aag

ctc

att

gtg

gag

.acc

gat

act

ttt

gga

agc

aga

288

Asp

Pro

Phe

Ala

Lys

Leu

íle

Val

Glu

Thr

Asp

Thr

Phe

Gly

Ser

Arg

v

85

90

95

gtc

ega

gtt

cgc

ggc

gca

gag

aca

ggt

ctc

tac

atc

tgc

atg

aac

aag

336

Val

Arg

Val

Arg

Gly

Ala

Glu

Thr

Gly

Leu

Tyr

íle

Cys

Met

Asn

Lys

100

105

110

aag

ggg

aag

cta

att

gcc

aág

agc

aac

ggc

aaa

ggc

aag

gac

tgc

gta

384

Lys

Gly

Lys

Leu

íle

Ala

Lys

Ser

. Asn

Gly

Lys

Gly

Lys

Asp

Čys

Val

115

120

125

192

ttc Phe

aca Thr 130

gag Glu

atc íle

gtg Val

ctg Leu

gag Glu 135

aac Asn

tac Tyr

acg Thr

gcg Ala 140-

ctg. Leu

cag Gin

aac Asn

gcc Ala

432

aag

tac

gag

ggc

tgg

tac

atg

gcc

ttt

acc

cgc

aag

ggc

cgg

ccc

cgc

480

Lys

Tyr

Glu

Gly

Trp

Tyr

Met

Ala

Phe

Thr

Arg

Lys

Gly

Arg

Pro

Arg

¹⁴⁵

150

155

160

aag

ggc

tcc

aag

acg

cgc

cag

cat

cag

cgc

gag

gtg

cac

ttc

atg

aag

528

Lys

Gly

Ser

Lys

Thr

Arg

Gin

His

Gin

Arg

Glu

Val

His

Phe

Met

Lys

165

170

175

cgc

ctg

ccg

cgg

ggc

cac

acc

gag

cag

agc

ctg

cgc

ttc

gag

576

Arg

Leu

Pro

Arg

Gly

His

Thr

Glu

Gin

Ser

Leu

Arg

Phe

Glu

180

185

190

ttc

ctc

aac

tac

ccg

ccc

ttc

acg

cgc

agc

ctg

cgc

ggc

agc

cag

agg

. 624

Phe

Leu

Asn

Tyr

Pro

Phe

Thr

Arg

Ser

Leu

Arg

Gly

Ser

Gin

Arg

195

200

205

act

tgg

gcc

ccg

gag

ccc

ega

tag

648

Thr

Trp

Ala

Pro

Glu

Pro

Arg

210. 215 <210> 6 <211> 215’ <212> PRT

<213> Homo

sapiens

<400> 6.

Met

Gly

Ser

Pro

Arg

Ser

Ala

Leu

Ser

Cys

Leu·

Leu

His

Leu

' 1

5'

10

15

Val

Leu

Cys

Leu

Gin

Ala

Gin

Val

Thr

Val

Gin.

Ser

Pro

Asn

Phe

20

25

30.

Thr

Gin

His

Val

Arg

Glu

Gin

Ser

Leu

Val

Thr

Asp

Gin

Leu

Ser

Arg

35

40

45

Arg

Leu

íle

Arg

Thr

Tyr

Gin

Leu

Tyr

Ser

Arg

Thr

Ser

Gly

Lys

His

50

55

. 60

Val

Gin

Val

Leu

Ala

Asn

Lys

Arg

Tie

Asn

Ala

Met

Ala

Glu

Asp

Gly

193

65

70 .

. 75

.80

Asp

Pro

Phe

Ala

Lys

Leu

íle

Val

Glu

Thr

Asp

Thr

Phe

Gly

Ser

Arg

85

90

95

Val

Arg

Val

Arg

Gly

Ala

Glu

Thr

Gly

Leu

Tyr

íle

Cys

Met

Asn

Lys

100

105

110

Lys

Gly

Lys

Leu

íle

Ala

Lys

Ser

Asn

Gly

Lys

Gly

Lys

Asp

Cys

Val

115

120

125

Phe

Thr

Glu

íle

Val

Leu

Glu

Asn

Tyr

Thr

Ala

Leu

Gin

Asn

Ala

130

135

140

Lys

Tyr

Glu

Gly

Trp

Tyr

Met

Ala

Phe

Thr

Arg

Lys

Gly

Arg

Pro

Arg

145

150

'155

160

Lys

Gly

Ser

Lys

Thr

Arg

Gin

His

Gin

Arg

Glu

Val

His

Phe

Met

Lys

165

170

175

Arg.

Leu

Pro

Arg

Gly

His

Thr

Glu

Gin

Ser

Leu

Arg

Phe

Glu

180

185

190

Phe

Leu

Asn

Tyr

Pro

Phe

Thr

Arg

Ser

Leu

Arg

Gly

Ser

Gin

Arg

195

200

205

Thr

Trp

Ala

Pro

.Glu

Pro

Arg

210 215

<210>	7
<211>	2256
<212>	DNA
<213>	Mus	musculus
<220>
<221>	CDS
<222>	(D ·	. (225.6)
<400>	7 ··.

atg

tgg

aac

gca

ctg

cag

gac

aga

gac

tcc

gcg

gag

gtc

ctg

gga

cac

Met

Trp

Asn

Ala

Leu

Gin

Asp

Arg

Asp

Ser

Ala

Glu

Val

Leu

Gly

His

1

5

10

15

cgc

cag

cgc

tgg

ctc

cgt

gtt·

ggg

aca

ctg

gtg

ctg-

get

tta

acc

gga

194

Arg Gin

Arg

Trp 20

Leu Arg Val

Gly

Thr 25

Leu

Val

Leu

Ala

Leu 30

Thr

Gly

acc

ttc

ctc

att

ggc

ttc

ctc

ttt

ggg

tgg

ttt

ata

aaa

cct

tcc

aat

144

Thr

Phe

Leu

íle

Gly

Phe

Leu

Phe

Gly

Trp

Phe

íle

Lys

Pro

Ser

Asn

35

40

45

gaa

get

ačt

ggt

aat

gtt

tcc

cat

tet

ggc·

atg

aag

gag

ttt

ttg

192

Glu

Ala

Thr

Gly

Asn

Val

Ser

His

Ser

Gly

Met

Lys

Glu

Phe

Leu

50

55

60

cat

gaa

ttg

aag

. get

gag

aac

atc

aaa

ttt

tta

tác

aat

ttc

aca

240

His

Glu

Leu

Lys

Ala

Glu

Asn

íle

Lys

Phe

Leu

Tyr

Asn

Phe

Thr

65

70

75

80

cgg

aca'

cca

cac

ttg

gca

gga

aca

caa

aat

ttt

gag

ctt

gca

aag

288

Arg

Thr

Pro

His

Leu

Ala

Gly

Thr

Gin

Asn

Phe

Glu

Leu

Ala

Lys

85

90

95

caa

att

cat

gac

cag

tgg

aaa

gaa

ttt

ggc

ctg

gat

ttg

gtt

gag

tta

336

Gin

íle

His

Asp

Gin

Trp

Lys

Glu

Phe

Gly

Leu

Asp.

Leu

Val

Glu

Leu

100

105

110

teč

cat

tac

gat

gtc

ttg

ctg

tcc

tat

cca

aat

aaa

act

cat

cct

aac

384

Ser

His

Tyr

Asp

Val

Leu

Ser

Tyr

Pro

Asn

Lys

Thr

His

Pro

Asn

115

120

125

tat

atc

tca

ata

att

aat

gaa

gat

gga

aat

gag

att

ttc

aaa.

aca

tca

432

Tyr

íle

Ser

íle

Asn

Glu

Asp

Gly

Asn

Glu

íle

Phe

Lys

Thr

Ser

130

135

140·

tta

tet

gaa

cag

cca

ccc

cca

gga

tat·'

gag

aat

ata

tca

gat

gta

gtg

480

Leu

Ser

Glu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Glu

Asn

íle

Ser

Asp

Val

145

150

1

155

160

cca

tac

agt

gcc

ttc

tet

cca

caa

ggg

aca

cca

gag

ggt

gat

cta

528

Pro

Tyr

Ser

Ala

Phe

Ser

Pro

Gin

Gly

Thr.

Pro

Glu

Gly

Asp

Leu

165

170

175

gtg

tat

gtc

aac

tat

gca

ega

act

gaa

gac

ttc

ttt

aaa

ctg

gaa

cgg

576

Val.

Tyr

Val

Asn

Tyr

Ala

Arg

Thr

Glu

Asp

Phe

Lys

Leu

Glu

Arg .

180

185

190

gaa

atg

aag

atc

agt

tgt

tet

ggg

aag

att

gtg

att

gcc

aga

tat

ggg

624

Glu

Met

Lys'

íle

Ser

Cys

Ser

Gly

Lys

íle

Val

íle

Ala

Arg

Tyr

Gly

195

200

205

aaa

gtg

ttc

aga

gga

aat

atg

gtt

aaa

aat

get

caa

ctg

gca

ggg

gca

672

Lys

Val

Phe

Arg

Gly

Asn

Met·

Val

Lys

Asn

Ala

Gin

Leu

Ala

Gly

Ala

195

210

215

220

aaa

gga

atg

att

ctg

tac

tca

gac

cct

get

gac

tac

ttt

gtt

cct

gcg

720

Lys

Gly

Met

íle

Leu

Tyr

Ser

Asp

Pro

Ala

Asp

Tyr

Phe

Val

Pro

Alä

225

230

235

240

gtg

aag

tcc

tat

cca

gat

ggc

tgg

aac

ctc

cct'

gga

ggt

gtc

caa

768

Val

Lys

Ser

Tyr

Pro

Asp

Gly

Trp

Asn

Leu

Pro

Gly

Val

Gin

245

250

255

cgt

gga

aat

gtc

tta

aat

ctt

aat

ggt

gca

ggt

gac

ccg

ctc

aca

cca

816

Arg

Glý

Asn

Val

Leu

Asn

Leu

Asn

Gly

Ala

Gly

Asp

Pro

Leu

Thr

Pro

260

265

270

ggt

tac

cca

gca

aat

gaa

cat

get

tat

agg

cat;

gag

ttg

aca

aac

get

864

Gly

Tyr

Pro

Ala

Asn

Glu

His

Ala

Tyr

Arg

His

Glu

Leu

Thr

Asn

Ala

275

280

285

gtt

ggc

ctt

. cca

agt

att

cct

gtc

cat

cct

att

gga

tat

gat

gca

912

Val

Gly

Leu

Pro

Ser

íle

Pro

Val

His

Pro

íle

Gly

Tyr

Asp

Ala

290

295

300

cag

aaa

ctc

tta

gaa

cac

atg

ggt

cca

gca

ccc

cct

gac

agt

agc

960

Gin

Lys

Leu

Glu

His

Met

Gly

Pro

Ala

Pro

Asp

Ser

305

310

315

320

tgg.

aag

gga

tťá

aaa

gtg

cct

tac

aac

gtg

gga

cct

ggc

ttt

get

1008

Trp

Lys

Gly

Leu

Lys

Val

Pro

Tyr

Asn

Val

Gly

Pro

Gly

Phe

Ala

325

330

335

gga

aac

ttt

tca

aca

caa

aag

gtc

aag

atg

cat

att

cac·

tet

tac

act

1056

Gly

Asn

Phe

Ser

Thr

Gin

Lys

Val

Lys

Met

His

íle.

His

. Ser

Tyr

Thr

340

345

350

aaa

gtg

aca

aga

atc

tat

aat

gtc

att

ggc

acc

ctc

aaa

gga

get

ctg

.· 1104

Lys

Val

Thr

Arg

íle

Tyr

Asn

Val

íle

Gly

Thr

Leu

Lys

Gly

Ala

Leu

355

360

365

gaa

cca

gac

aga

tat

gtt

att

ctt

gga

ggt

cac

ega.

gac.

get

tgg

gta

1152

Glu

Pro

Asp

Arg

Tyr

Val

íle

Leu

Gly

His.

Arg

Asp

Ala

Trp

Val

370.

375

380

ttt

ggt

ggc

att

gac

cct

cag

agť

gga

gca.

get

gtt

cat

gaa

att

1200

Phe

Gly

íle

Asp

Pro

Gin.

Ser

Gly

Ala

Val

His

Glu

íle

385

390

395

400

196

gtg cgg agc

ttt Phe

gga Gly 405

acc Thr

ctg Leu

aag aag aaa

gga Gly

cgg Arg

agg Arg

cct Pro

aga Arg 415

agg Arg

1248

Val

Arg

Ser

Lys

Lys 410

aca

att

ttg

ttt'

gca

agc

tgg

gat

gca

gaa

ttt

ggc

ctt

ggt

1296

Thr

íle

Leu

Phe

Ala

Ser

Trp

Asp

Ala

Glu

Phe

Gly

Leu

Gly

420

425

430

tet

act

gag

tgg

gca

gag

gaa

cat

tca

aga

ctc

cta

caa

gag

ega

ggt

1344

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Glu

His

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Arg

Gly

435

440

445

gtg

get

tat

att

aat

get

gat

tet

tcc

ata

gaa

gga

aat

tac

act

cta.

1392

Val

Ala

Tyr

íle

Asn

Ala

Asp

Ser

íle

Glu'

Gly

Asn

Tyr

Thr

Leu

450

455

460

aga

gtt

gat

tgc

aca

cca

ctg

atg

tac

agc

tta

gtg

tac

aac

cta

aca

1440

Arg

Val

Asp

Cys

Thr

Pro

Leu

Met

Tyr

Ser

Léu

Val

Tyr

Asn

Leu

Thr

465

470

475

480

aaa

gag

ctg

caa

agc

cca

gat

gaa

ggt

ttt

gaa

gga

aaa

tet

ctt

tat

1488

Lys

Glu

Leu

Gin

Ser

Pro

Asp

Glu

Gly

Phe

Glu

Gly

Lys

Ser

Leu

Tyr

485

490

495

gac

agc

tgg

aaa

gaa

aag

agt

cct

tca

cct

gag

ttc

att

gga

atg

ccc

1536

Asp

Ser

Trp

Lys

Glu

Lys

Ser

Pro

Ser

Pro

Glu

Phe

íle

Gly

Met

Pro

500

505

510

aga

att

agc

aag

ctg

ggg

tet

ggc

aat

gat

ttt

gaa

gtg

. ttc

ttc

caa '·

1584

Arg

íle

Ser

Lys

Leu

Gly

Ser

Gly

Asn

Asp

Phe

Glu

Val

Phe

Gin

515

520

525

aga

ctt.

gga

att

get

tca

ggc

aga

gcc

ega

tat

act

aaa

aat

tgg

aaa

1632

Arg

Leu

Čly

íle

Ala

Ser

Gly

Arg

Ala

Arg

Tyr

Thr

Lys

Asn

Trp

Lys

•

530

535

540

act

aac

aaa

gtc

agc

tat

cct

ctc

tat

cac

agt

gtc

tat

gaa

aca.' ..

. 1680

Thr

Asn

Lyš

Val

Ser

Tyr

Pro

Leu

Tyr

His

Ser

Val

Tyr

Glu

Thr

5 45

550

'555

560

tat

gag

ctg

gta

aaa

ttt

tat

gac

cca

aca

ttt

aaa

tac

cac

ctc

1728

Tyr

Glu

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr

Asp

Pro

Thr

Phe

Lys'

Tyr

His

Leu

565

570

575

act

gtg

gcc

cag

gtt

ega

gga

gcg

atg

gta

ttt

.gaa

ctt

gcc

aat

tet..

177 6

Thr

Val

Ala

Gin

Val

Arg·

Gly

Ala

Me.t

Val

Phe

Glu

Leu

Ala

Asn

Ser

580 ' 585· . 590

197

ata íle

gtg Val

ctt ccc

ttt Phe

gac Asp

tgc Cys

caa Gin 600

agt Ser

tat Tyr

get gta

get Ala 605

ctg Leu

aag Lys

1824

Leu 595

Pro

Ala

Val

tat

get

gac

act

atc

tac

aat

att

tca

atg

aaa

cat

cca

caa

gaa

atg

1872

Tyr

Ala

Asp

Thr

íle

Tyr

Asn

íle

Ser

Met

Lys

His

Pro

Gin

Glu

Met

610

61.5

620

aag

get

tac

atg

ata

tca

ttt

gat

tca

ctg

ttt

tet

gca

gtc

aat

1920

Lys

Ala

Tyr

Met

íle

Ser

Phe

Asp

Ser

Leu

Phe

Ser

Ala

Val

Asn

625

630

635

640

ttt

aca

gat

gtt

gca

tet

aag

ttc

aat

cag

aga

ctg

caa

gag

tta

gac

1968

Phe

Thr

Asp

Val

Ala

Ser

Lys

Phe

Asn

Gin

Arg

Leu

Gin

Glu

Leu

Asp

645

650

655

aaa.

age

aac

ccc

ata

tta

ctg

aga

att

atg

aat

gac

cag

ctg

atg

tat

2016

Lys

Ser

Asn

Pro

íle

Leu

Arg

íle

Met

Asn

Asp

Gin

Leu

Met

Tyr

660

665

670

ctg

gaa

cgt

gca

ttc

att

gat

cct

tta

ggc

tta

cca

gga

agg

cct

ttc

2064

Leu

Glu

Arg

Ala

Phe

íle

Asp

Pro

Leu

Gly

Leu

Pro

Gly

Arg

Pro

Phe.

675

680

685

tac

. agg

cat

acc

atc

tat

get

cca

age

cac

aac

aag

tat

gča

gga

2112

Tyr

Arg

His

Thr

íle

Tyr

Ala

Pro

Ser

His

Asn

Lys

Tyr

Ala

Glý

690

695

700

gaa

tca

ttc

cct

ggg

att

tat

gat

gcc

ctt

ttt

gät

ata

agt

age

aaa

2160

Glu

Ser

Phe

Pro

Gly

íle

Tyr

Asp

Ala

Leu

Phe

Asp

íle

Ser

Lys'

705

710

715

720

gtc

aat

get

tet

aag

gcc

tgg

aac

gaa

gtg

aag

aga

cag

att

tet

att

2208

Val

Asn

Ala

Ser

Lys

Ala

Trp

Asn

Glu

Val

Lys

Arg

Gin

íle

Ser

íle

725

730

735

gca

acc

ttt

aca

gtg

caa

get

gca

gag

act

ctg

agg

gaa

gta.

get

2256

Ala

Thr

Phe

Thr

Val

Gin

Ala

Glu

Thr

Leu

Arg

Glu

Val

Ala

740

745

750

<210> 8 <211> 752 <212> FRT <213> Mus musculus <400> 8

Met Trp Asn Ala Leu Gin Asp Arg Asp Ser Ala Glu Val Leu Gly His 1 5 . 10 15 '

198

Arg Gin Arg Trp Leu. Arg Val Gly Thr Leu Val Leu Ala Leu Thr Gly

²⁰

25

30

Thr

Phe

Leu

íle

Gly

Phe

Leu

Phe

Gly

Trp

Phe

íle

Lys

Pro

Ser

Asn

35

40

45

Glu

Ala

Thr

Gly

Asn

Val

Ser

His

Ser

Gly

Met

Lys

Glu

Phe

Leu

50

55

60

His

Glu

Leu

Lys

Ala

Glu

Asn

íle

Lys

Phe

Leu

Tyr

Asn

Phe

Thr

65

70

75

80

Arg

Thr

Pro

His

Leu

Ala

Gly

Thr

Gin

Asn

Phe

Glu

Leu

Ala

Lys

85

90

95

Gin

íle

His

Asp

Gin

Trp

Lys

Glu

Phe

Gly

Leu

Asp

Leu

Val

Glu

Leu

100

105

110

Ser

His

Tyr

Asp

Val

Leu

Ser

Tyr

Pro

Asn

Lys

Thr

His

Pro

Asn

115

120

125

Tyr

íle

Ser

íle

Asn

Glu

Asp

Gly

Asn

Glu

íle

Phe

Lys

Thr

Ser

130

135

140

Leu

Ser

Glu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Glu

Asn

íle

Ser

Asp

Val

145

150

155

160

Pro

Tyr

Ser

Ala

Phe

Ser

Pro.

Gin

Gly

Thr

Pro

Glu

Gly

Asp

Leu

165

170

175

Val

Tyr

Val

Asn

Tyr

Ala

Arg

Thr

Glu

Asp

Phe

Lys

Leu

Glu

Arg

180

185

190.

Glu

Met

Lys

íle

Ser

Cys

Ser

Gly.

Lys

íle

Val

He

Äla

Arg.

Tyr

Gly

195

200

205

Lys

Val

Phe

Arg

Gly

Asn

Met

Val

Lys

Asn

Ala

Gin·

Leu

Ala

Gly

Ala

210

215

22 0

Lys

Gly

Met

.íle

Leu

Tyr

Ser

Asp

Pro

Ala

Asp

Tyr.

Phe

Val

Pro

Ala

225

230

235

240

Val

Lys

Ser

Tyr

Pro

Asp

Gly

Trp

Asn

Leu

Pro

Gly

Val

Gin

245 250 255

199

Arg Gly Asn

Val 260

Leu Asn Leu

Asn Gly , 2 65

Ala

Gly Asp

Pro

Leu 270

Thr

Pro

Gly

Tyr

Pro

Ala

Asn

Glu

His

Ala

Tyr

Arg

His.

Glu

Leu

Thr

Asn

Ala

275.

280

285

¹

-

Val

Gly

Leu

Pro

Ser

íle

Pro

Val

His

Pro

íle

Gly

Tyr

Asp

Ala

290

295

300

Gin

Lys

Leu

Glu

His

Met

Gly

Pro

Ala

Pro

Asp

Ser

305

310

315

320

Trp

Lys

Gly

Leu

Lys

Val

Pro

Tyr

Asn

Val

Gly

Pro

Gly

Phe

Ala

325

330

335

Gly

Asn

Phe

Ser

Thr.

Gin

Lys

Val

Lys

Met

His

íle

His

Ser

Tyr

Thr

340

345

350

Lys

Val

Thr

Arg

íle

Tyr

Asn

Val

íle

Gly

Thr

Leu

Lys

Gly

Ala

Leu

355

360

365

Glu

Pro

Asp

Arg

Tyr

Val

íle

Leu

Gly

His

Arg

Asp

Ala

Trp

Val

370

375

380

Phe

Gly

íle

Asp

Pro

Gin

Ser

Gly

Ala

Val

His

Glu

íle

385

390

395

400

Val

Arg

Ser

Phe

Gly

Thr

Leu

Lys

Gly

Arg

Pro

Arg

405

410

415

Thr

íle

Leu

Phe

Ala

Ser

Trp

Asp

Ala

Glu

Phe

Gly

Leu

Gly

420

425

43Ó

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Glu

His

Ser

Arg

Leu

Gin

Glu

Arg

Gly

435

440

4 45

Val

Ala

Tyr

íle'

Asn

Ala

Asp

Ser

.Iie

Glu

Gly

Asn

Tyr

Thr

Leu

450

455

460

Arg

Val

Asp

Cys

Thr

Pro

Leu

Met

Tyr

Ser

Leu

Val

Tyr

Asn

Leu-

.Thr

465

470

475

480

Lys

Glu

Leu

Gin

Ser

Pro

Asp

Glu

Gly

Phe

Glu

Gly

Lys

Ser

Leu

Tyr

485

490

495

Asp

Ser

Trp

Lys

Glu

Lys

Ser

Pro

Ser

Pro

Glu

Phe

íle

Gly Met

Pro

500

505

510

Arg

íle

Ser

Lys

Leu

Gly

Ser

Gly

Asn

Asp

Phe

Glu

Val

Phe

Gin

515 520 525

200

Arg Leu Gly íle Ala .530

Thr Asn Lys Val Ser 549

Tyr Glu Leu Val Val 565

Thr Val Ala Gin Val 580 íle Val Leu Pro Phe 595

Tyr Ala Asp Thr íle 610

Lys Ala Tyr Met íle 625

Phe Thr· Asp Val Ala 645

Lys Ser Asn Pro íle 660

Leu Glu Arg Ala Phe 675

Tyr Arg His Thr íle 690

Glu Ser Phe Pro Gly 705 . . Val Asn Ala Ser Lys 725

Ala- Thr Phe Thr Val 740

Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp 535 540

Ser Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu 550 555

Lys Phe Tyr Asp Pro Thr Phe Lys Tyr His 570 ' 575

Arg Gly Ala Met Val Phe Glu Leu Ala. Asn 585 590

Asp Cys Gin Ser Tyr Ala Val Ala Leu Lys 600 605

Tyr Asn íle Ser Met Lys His Pro Gin Glu 615 620

Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Asn 630 635

Ser Lys Phe Asn Gin Arg Leu Gin Glu Leu 650 655

Leu Leu Arg íle Met Asn Äsp Gin Leu Met 665 670 íle Asp Pro Leu Gly Leu Pro Gly Arg Pro .680 685

Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala 695 700 íle Tyr Asp Ala Leu Phe Asp íle Ser Ser 710 715 '

Ala.Trp Asn Glu Val Lys Arg Gin íle Ser 730 7.35

Gin Ala Ala Ala Glu Thr Leu Arg Glu Val 745 -750.

Lys

Thr 5 60··

Leu

Ser

Lys

Met

Asn

640

Asp

Tyr .Phe

Gly

Lys

720 íle

Ala

201 <210> 9 <211Χ 2082 .

<212> DNA <213> Mus musculus ,<220>

<221> CDS <222> (1)..(2082) <400> 9

atg Met 1

aag Lys

aag gag ttt

ttg cat Leu His

gaa Glu

ttg Leu

aag get gag

aac atc aaa

aaa Lys

48

Lys

Glu

Phe 5

Lys 10

Ala

Glu

Asn

íle

Lys 15

ttt

tta

tac

aat

ttc.

aca

cgg

aca

cca

cac

ttg

gca

gga

aca

caa

aat

96

Phe

Leu

Tyr

Asn

Phe

Thr

Arg

Thr

Pro

His

Leu ·

Ala

Gly

Thr

Gin

Asn

20

25

. .30

aat

ttt

gag-

ctt

gca

aag

caa

att

cat

gac

cag

tgg

aaa

gaa

ttt

ggc

144

Asn

Phe

Glu

Leu

Ala

Lys

Gin

íle

His

Asp

Gin

Trp

Lys

Glu

Phe

Gly

35

40

45

ctg

gat

ttg

gtt

gag

tta

tcc

cat

tac

gat

gtc

ttg

ctg

tcc

tat.

cca

192

Leu

Asp

Leu.

Val

Glu

Leu

Ser

His

Tyr

Asp

Val

Leu

Ser

Tyr

Pro

50

55

60

aat

aaa

act

cat

ccť

aac

tat

atc

tca

ata

att

aat

gaa

gat

gga

aat

240

Asn

Lys

Thr

His

Pro

Asn

Tyr

íle

. Ser

íle

Asn

Glu

Asp

Gly

Asn

65

70

75

80

gag

att

ttc

aaa

aca

tca

tta

tet

gaa

cag

cca

ccc

cca

gga

tat

gag

288.

Glu

íle'

Phe

Lys

Thr

Ser

Leu·

Ser

Glu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Glu

85

90

9.5

aat

ata

tca

gat

gta

gtg

cca

tac

agt

gcc

ttc

tet

cca

caa

ggg

336

Asn

íle

Ser

Asp

Val

Pro

Tyr

Ser

Ala

Phe

Ser

Pro

Gin

Gly

100

105

110

aca

cca

gag

ggt

gat

cta

gtg

tat

gtc

aac

tat

gca

ega

act

gaa.

gac

38.4

Thr

Pro

Glu

Gly

Asp

Leu

Val

Tyr

Val

Asn

^Ty.^r

Ala

Arg

Thr

Glu

Asp

115

120

125

' '.

ttc

ttt

aaa

ctg

gaa

cgg

gaa

atg

' aag

atc

agt

tgt

tet

. ggg

aag

. att

432

Phe

Lys

Leu

Glu

Arg

Glu

Met

Lys'

íle

Šer

Cys

Ser

Gly.

Lys

íle

130

135

'140

gtg

att

gcc

aga

tat

ggg

aaa

gtg

ttc

aga

gga

aat

atg

gtt

aaa

aat .

480

Val

íle

Ala

Arg

Tyr

Gly

Lys

Val

Phe

Arg

Gly

Asn

Met

Val

Lys

Asn

145

150

155

160

202

get Ala

caa Gin

ctg gca ggg gca

aaa Lys

gga Gly

atg Met

att íle 170

ctg Leu

tac Tyr

tca Ser

gac Asp

cct Pro 175

get Ala i

528

Leu

Ala

Gly 165

Ala

gac

tac

ttt

gtt

cct

gcg

gtg

aag

tcc

tat

cca

gat

ggc

tgg

aac

ctc

576

Asp

Tyr

Phe

Val

Pro

Ala

Val

Lys

Ser

Tyr

Pro

Asp

Gly

Trp

Asn

Leu

180

185

190

cct

gga

ggt

gtc

caa

cgt

gga

aat

gtc

tta

aat

ctt

aat

ggt

gca

624

Pro'

Gly

Val

Gin

Arg

Gly

Asn

Val

Leu

Asn

Leu

Asn

Gly.

Ala

195

200

205

ggt

gac'

ccg

ctc

aca

cca

ggt

tac

Cca

gca

aat

gaa

cat

get

tat

agg

672

Gly

Asp

Pro

Leu

Thr

Pro

Gly

Tyr

Pro

Ala

Asn

Glu

His

Ala

Tyr

Arg .

210

215

220

cat

gag

ttg

aca

aac

get

gtt

ggc

ctt

cca

agt

att

cct

gtc

cat

cct

⁷²⁰

His

Glu

Leu

Thr

Asn

Ala

Val

Gly

Leu

Pro

Ser

íle

Pro

Val

His

Pro

225

230

235

240

att

gga

tat

gat

gca

cag

aaa

ctc

tta

gaa'

cac

atg

ggt

cca

768

íle

Gly

Tyr

Asp

Ala

Gin

Lys

Leu

Glu

His

Met

Gly

Pro

245

250

255

gca

ccc

cct

gac

agt

agc

tgg

aag

gga

tta

aaa

gtg

cct

. tac

aac

816

Ala

Pro

Asp

Ser

Trp

Lys

Gly

Leu

Lys

Val

Pro

Tyr

Asn

260

265

270

gtg

gga

cct

ggc

. ttt.

get

gga

aac

ttt

tca

aca

caa

aag

gtc

aag

atg

864

Val

Gly

Pro.

Gly

Phe

Ala

Gly

Asn

Phe

Ser.

Thr

Gin

Lys

Val

Lys

Met.

275

280

285

cat

att

cac

tct

tac

act

aaa

gtg.

aca

aga

atc

tat

aat

gtc

att

ggc

912

His

íle

His

Ser

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

Arg

íle

Tyr

Asn

Val

íle

Gly

290

295

300

acc

ctc

aaa

gga

get

ctg

gaa

cca

gac

aga

tat

g t.ť

att

ctt

gga

ggt

. 960

Thr

Leu

Lys

Gly

Ala

Leu

Glu

Pro

Asp-

Arg

Tyr

Val

íle

Leu

Gly

305

31Ό

315

320

cac

ega

gac

get

tgg

gta

ttt

ggt

ggc

att

gac

cct

cag

agt

gga

gca

1008

His

Arg

Asp

Ala

Trp

Val

Phe

Gly

íle

Asp

Pro

Gin

Ser

Gly

Ala.

325 330 335

203

get Ala

gtt.gtt

cat His 340

gaa Glu

att íle

gtg cgg Val Arg

age Ser 345

ttt Phe

gga Gly

acc Thr

ctg aag aag

aaa Lys

1056

Val

Leu

Lys 350

Lys

gga.

cgg

agg

cct

aga

agg

aca

att

ttg

ttt.

gca

age

tgg

gat

gca

gaa

1104

Gly

Arg

Pro

Arg

Thr

íle

Leu

Phe

Ala

Ser

Trp

Asp

Ala

Glu

355

360

365

gaa

ttt

ggc

ctt

ggt

tet

act

gag

tgg

gca

gag

gaa

cat

tca

aga.

1152

Glu

Phe

Gly

Leu

Gly

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Glu

His

Ser

Arg

370

375

380

ctc

cta

caa

gag

ega

ggt

gtg

get

tat

att

aat

get

gat

tet

tcc

ata

1200

Leu

Gin

Glu

Arg

Gly

Val

Ala

Tyr

íle

Asn

Ala

Asp

Ser

íle

385

390

395

400

gaa

gga

aat

tac

act

cta

aga

gtt

gat

tgc

aca

cca

ctg

atg

tac

age

1248

Glu

Gly

Asn

Tyr

Thr

Leu

Arg

Val

Asp

Cys

Thr

Pro

Leu

Met

Tyr

Ser

405

410

415

tta

gtg

tac

aac

cta

aca

aaa

gag

ctg

caa

age

cca

gat

gaa

ggt

ttt

1296

Leu

Val

Tyr

Asn

Leu

Thr

Lys

Glu

Leu

Gin

Ser

Pro

Asp

Glu

Gly

Phe

420

425

430

gaa

gga

aaa

tet

ctt

tat

gac

age

tgg

aaa

gaa

aag

agt

cct

tča.

cct.

. 1344

Glu

Gly

Lys

Ser

Leu

Tyr

Asp

Ser

Trp

Lys

Glu

Lys

Ser

Pro

Ser

Pro ·

435

440

445

gag

ttc

att

gga

atg

ccc

aga

att

age

aag

ctg

ggg

tet

ggc

aat

gat

1392

Glu

Phe

íle

Gly

Met

Pro

Arg

íle

Ser

Lys

Leu

Gly

Ser

Gly

Asn

Asp

450

455

460

ttt

gaa

gtg

ttc

caa

aga

ctt

gga

att

get

tca

ggc

aga

gcc

ega

1440

Phe

Glu

Val

Phe

Phé

Gin

Arg

Leu

Gly

íle

Ala

Ser

Gly Arg

Ala

Arg

465

470

475.

480'

tat

act

aaa

aat

tgg

aaa

act

aac

aaa

gtc

age

tat

cct

ctc

tat

14 88

Tyr

Thr

Lys

Asn

Trp

Lys

Thr

Asn

Lys

Val

Ser

Tyr

Pro

Leu

Tyr

4 85

490

495

cac

agt

gtc

tat

gaa

aca

tat

gag

ctg

gta

aaa

ttt

tat

gac

cca

1536

His

. Ser

Val

Tyr

Glu

Thr

Tyr

. Glu

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr

Asp

Pro

500

505

510

aca

ttt

aaa

tac

cac

ctc

act

gtg

gcc

cag

gtt

ega

gga

gcg

atg

gta

1584

Thr

Phe

Lys

Tyr

His

Leu

Thr

Val

Ala

Gin

Val

Arg

Gly

Ala

Met

Val’

515

520

525

ttt

gaa

ctt

gcc

aat

tet

ata

gtg

ctt

ccc

ttt

gac

tgc

caa

agt

tat

1632

204

Phe

Glu Leu 530

Ala

Asn

Ser

íle 535

Val

Leu

Pro

Phe

Asp 540

Cys

Gin

Ser

Tyr

get

gta

get

ctg

aag

tat

get

gac

act

atc

tac

aat ·

att.

tca

atg

1680

Ala

Val

Ala

Leu

Lys

Tyr

Ala

Asp

Thr

íle

Tyr

Asn

íle·

Ser

Met

545

550

555

560

aaa

cat

cca

caa

gaa

atg

aag

get

tac

atg

ata

tca

ttt

gat

tca

ctg

1728

Lys

His

Pro

Gin

Glu

Met

Lys

Ala

Tyr

Met

íle

Ser

Phe

Asp

Ser

Leu

565

570

575

ttt

tet

gca

gtc

aat

ttt

aca

gat

gtt

gca

tet

aag

ttc

aat

Cag

1776

Phe

Ser

Ala

Val

Asn

Phe

Thr

Asp

Val

Ala

Ser

Lys

Phe

Asn'

Gin

580

585

590

aga

ctg

caa

gag

tta

gac

aaa

agc

aac

ccc

ata

tta

ctg

aga

att

atg

1824

Arg

Leu

Gin

Glu

Leu

Asp

Lys

Ser

Asn

Pro

íle

Leu

Arg

íle

Met

595

600

605

aat

gac

cag

ctg

. atg

tat

ctg

gaa

cgt

gca

ttc

att

gat·

cct

tta

ggc

1872

Asn

Asp

Gin

Leu, Met

Tyr

Leu

Glu

Arg

Ala

Phe

íle

Asp

Pro

Leu

Gly

610

615

620

tta

cca

gga

agg

cct

ttc

tac

agg

cat

acc

atc

tat

get

cca

agc

1920

Leu

Pro

Gly

Arg

Pro

Phe

Tyr

Arg

His

Thr

íle

Tyr

Ala

Pro

Ser

625

630

635

640

cac

aac

aag

tat

gca

gga

gaa

tca

ttc

cct

ggg

att

tat

gat

gcc

ctt

1968

His

Asn

Lys

' Tyr

Ala

Gly

Glu

Ser

Phe

Pro

Gly

íle

Tyr

Asp

Ala

Leu

645

650

655

ttt

gat

ata

agt

agc

aaa

gtc

aat

get

tet

aag

gcc

tgg

aac

gaa

gtg

2016

Phe

Asp

íle

Ser

Lys

Vaľ

Asn

Ala

Ser

Lys

Ala

Trp

Asn

Glu

Val

660

665

670

aag

aga

cag

att

tet

att

gca

acc

ttt

aca

gtg

caa

get

gca'

gča

gag

2064

Lys

Arg

Gin

íle

Ser

íle

Ala

Thr

Phe

Thr

Val

Gin.

Ala

Glu

675

680

685

act

ctg

agg

gaa

gta

get

2082

Thr

Leu

Arg

Glu

Val

Ala

690 <210> 10

205

<211> 694 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 10

Met

Lys

Glu

Phe

Leu

His

Glu

Leu

Lys

'Ala

Glu

Asn

íle

Lys

1

5

10

15

Phe

Leu

Tyr

Asn

Phe

Thr

Arg

Thr

Pro

His

Leu

Ala

Gly

Thr

Gin

Asn

20

25

30

Asn

Phe

Glu

Leu

Ala

Lys

Gin

íle

His

Asp

Gin

Trp

Lys

Glu

Phe

Gly

35

40

45

Leu

Asp

Leu

Val

Glu

Leu

Ser

His

Tyr

Asp

Val

Leu

Ser

Tyr

Pro

50'

55

60

Asn

Lys

Thr

His

Pro

Asn

Tyr

íle

Ser

íle

Asn

Glu

Asp

Gly

Asn

65

70

75

80

Glu

íle

Phe

Lys

Thr

Ser

Leu

Ser

Glu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Glu

Λ

85

90

95

Asn

íle

Ser

Asp

Val

Pro

Tyr

Ser

Ala

Phe

Ser

Pro

Gin

Gly

-

100

105

110

Thr

Pro

Glu

Gly

Asp

Leu

Val

Tyr

Val

Asn

Tyr

Ala

Arg

Thr

Glu

Asp

115

120

125

Phe

Lys

Leu

Glu

Arg

Glu

Met

Lys

íle

Ser

Cys

Ser

Gly

Lys

íle

130

135

140

Val

íle

Ala

Arg

Tyr

Glý

Lys

Val

Phe

Arg

Gly

Asn

Met

Val

Lys

Asn

145

150

¹⁵⁵

160

Ala

Gin

Leu

Ala

Gly

Ala

Lys

Gly

Met

Tie’

Leu

Tyr

Ser

Asp

Pro

Ala

165

170

175

Asp

Tyr

Phe

Val

Pro

Ala

Val

Lys

Ser

Tyr

Pro

Asp

Gly

Trp

Asn

Leu

180

185

190

Pro

Gly

Val

Gin

Arg

Gly

Asn

Val

Leu

Asn

Leu

Asn

Gly

Ala

195

200

205

Gly

Asp

Pro

Leu

Thr

Pro

Gly

Tyr

Pro

Ala

Asn

Glu

His

Ala

Tyr

Arg

210

215

220

His

Glu

Leu

Thr

Asn

Ala

Val

Gly

Leu

Pro

Ser

íle

Pro

Val

His

Pro

225

230'

235

240

206

íle Gly Tyr Asp Asp

Ala

Gin Lys

Leu Leu'Glu His Met Gly Gly

Pro

245

250 .

255

Ala

Pro

Asp

Ser

Trp

Lys

Gly

Leu

Lys

Val

Pro

Tyr

Asn

260

265

270

Val

Gly

Pro

Gly

Phe

Ala

Gly

Asn

Phe

Ser

Thr

Gin

Lys

Val

Lys

Met

275

280

285

His

íle

His'

Ser

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

Arg

Tie

Tyr

Asn

Val

íle

Gly

290

295

300

Thr

Leu

Lys

Gly

Ala

Leu

Glu

Pro

Asp

Arg

Tyr

Val

íle

Leu

Gly

305

310

315

320

His

Arg

Asp

Ala

Trp

Val

Phe

Gly

íle

Asp

Pro

Gin

Ser

Gly

Ala

325

330

335

Ala

Val

His

Glu

íle

Val

Arg

Ser

Phe

Gly

Thr

Leu

Lys

340

345

350

Gly

Arg

Pro

Arg

Thr

. íle

Leu

Phe

Ala

Ser

Trp

Asp

Ala

Glu

355'

360

365

Glu

Phe

Gly

Leu

Gly

Ser

Thr

Glu

Trp

Ala

Glu

His

Ser

Arg

370

375

380

Leu

Gin

Glu

Arg

Gly

Val

Ala

Tyr

íle.

Asn

Ala

Asp

Ser

íle

385

390

395

400

Glu

Gly

Asn

Tyr

Thr

Leu

Arg

Val

Asp

Cys

Thr

Pro

Leu

Met

Tyr

Ser

405

410

415

Leu

Val

Tyr

Asn

Leu

Thr

Lys

Glu

Leu

Gin

Ser

Pro

Asp

Glu

Gly

Phe

420

425'

430

Glu

Gly

Lys

Ser

Leu

Tyr

Asp

Ser

Trp

Lys

Glu

Lys

Ser

Pro

Ser

Pro

435

440

445

Glu

Phe

íle

Gly

Met

Pro

Arg

íle

Ser

Lys^:

Leu

Giy

. Ser

Gly

Asn

Asp

450

455

460

Phe

Glu

Val

Phe

Gin

Arg

Leu

Gly

íle

Ala

Ser

Gly

Arg

Ala

Arg

465

470

475

4 80

207

Tyr

Thr

Lys Asn

Trp 485

Lys

Thr

Asn Lys

Val 490

Ser

Tyr

Pro

Leu . 495

Tyr

His

Ser

Val

Tyr

Glu

Thr

Tyr

Glu

Leu

Val

Lys

Phe

Tyr

Asp·

Pro

500

505

510

Thr

Phe

Lys

Tyr

His

Leu

Thr

Val

Ala

Gin

Val

Arg

Gly

Ala

Met

Val

515

520

525

Phe

Glu

Leu

Ala

Asn

Ser

íle

Val

Leu

Pro

Phe

Asp

Cys

Gin

Ser

Tyr

.530

535

540

Ala

Val

Ala

Leu

Lys

Tyr

Ala

Asp

Thr

íle

Tyr

Asn

íle

Ser

Met

545

550

555

560

Lys

His

Pro

Gin

Glu

Met

Lys

Ala

Tyr

Met

íle

Ser

Phe

Asp

Ser

Leu

565

570

575

Phe

Ser

Ala

Val

Asn

Phe

Thr

Asp

Val

Alá

Ser

Lys

Phe

Asn

Gin

580

585

590

Arg

Leu

Gin

Glu

Leu

Asp

Lys

Ser

Asn

Pro

Tie

Leu

Arg

íle

Met

595

600

605

Asn

Asp

Gin

Leu

Met

Tyr

Leu

Glu

Arg

Ala

Phe

íle

Asp

Pro

Leu

Gly

610

615

620

Leu

Pro

Gly

Arg

Pro

Phe

Tyr

Arg

His

Thr

íle

Tyr

Ala

Pro

Ser

625

630

635

640

His

Asn

Lys

Tyr

Ala

Gly

Glu

Ser

Phe

Pro

Gly

íle

Tyr

Asp

Ala

Leu

645

650

655

Phe

Asp

íle

Ser

Lys

Val

Asn

Ala

Ser.

Lys

Ala

Trp

Asn

Glu

Val

660

665

670

Lys

Arg

Gin

íle

Ser

íle

Ala

Thr

Phe

Thr

Val

Gin

Ala

Glu

675

680

685

Thr Leu Arg Glu Val Ala . 690 <210> 11 <211>.45 <212> DNA <213> Clostridium tetani <220>

208

<221> CDS ·

<222> (l)..i

(45)

<400> 11

cag tac atc

aaa

get

aac

tcc

aaa

ttc

atc

ggt

atc

acc

gag

ctg

45

Gin Tyr íle

Lys

Ala

Asn

Ser

Lys

Phe

íle

Gly

íle

Thr

Glu

Leu

1	5	¹⁰	15
<210> <211>	12 15
<212>	PRT
<213>	Clostridium tetani
<400>	12
Gin Tyr íle Lys Ala Asn Ser Lys	Phe íle Gly	íle Thr Glu Leu
1	5	.10	15

<210>	13
<211>	63
<212>	DNA

<213> Clostridium tetani· <220>

<221> CDS

<222> (1)..(63)

<4Ó0> 13

ttc aac.aac

ttc

acc

gta

agc

ttc

tgg

ctg.

cgt

gtt

ccg

aaa

gtt

agc

Phe Asn Asn

Phe

Thr

Val

Ser

Phe

Trp

Leu

Arg

Val

Pro

Lys.

Val

Ser

1

5

10

. 15

get agc cac ctg gaa 63

Ala Ser His Leu Glu_. _

	20
<210>	14
<211>	21
<212>	PRT
<213>	Clostridium tetani
<400>	14

209

Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser 1 5 10' 15

Ala Ser His Leu Glu 20 <210> 15 <211> 25 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Popis umelej sekvencie: Fúzia epitopu tetánového toxínu a PMS <400> 15

Gin Glu Arg Gly Val Gin Tyr íle Lys Ala Asn Ser Lys Phe íle Gly 1 5. 10 15 íle Thr Glu Leu Arg Val Asp Cys Thr 20 25 <210> 16 <211>. 25 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Popis umelej sekvencie: Fúzia epitopu tetánového toxínu a PMS <400> 16 .

Ala Val Val Leu Arg Gin Tyr íle Lys Ala Asn Ser Lys Phe íle Gly 1 5 .10 15 .

íle Thr.Glu Leu Glu Met Lys Thr Tyr 20 25 <210> 17

210

PMS <211> 25 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Popis umelej sekvencie: Fúzia epitopu tetánového toxínu <400> 17

Met Phe Leu Glu Arg Gin Tyr íle Lys Ala Asn Ser Lys Phe íle Gly 1 5 10 ' '15 íle Thr Glu Leu His Val íle Tyr Ala 20 25 <210> 18 <211> 31 <212> PRT .

<213> Umelá sekvencia <220>

<223> Popis umelej sekvencie: Fúzia epitopu tetánového toxínu <400> 18

Asn Ser . Arg Leu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val . Ser. Phe Trp Leu Arg 15 10 .15

Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Val Asp Cys Thr Pro 20 25 30 <210> 19 <211> 31' <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Popis umelej sekvencie: Fúzia epitopu tetánového toxínu <400> 19

Val Val .Leu Arg Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg 1 ... 5 10 15

PMS

Val Pro Lys Val

Ser Ala Ser His Leu Glu Ser.Phe Asp Ser Leu

211

25 30 <210> 20 <211> 31 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Popis umelej sekvencie: Fúzia epitopu tetánového toxínu a PMS <400> 20

Leu Met Phe Leu Glu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg

5 10 15

Val. Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Pro Ser Ser His Asn

25 30 .

<210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>.

<223> Popis umelej sekvencie: Umelé His zakončenie <220>

<221> CDS <222> (1) . . (18) <400> 21 cat čat cat cat cat cat 18

His His His His His His

1	5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT <213> Umelá	sekvencia

212 <223> Popis umelej sekvencie: Umelé His zakončenie <400> 22

His His His His His His 1 5 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Popis umelej sekvencie: Umelé His zakončenie <220>

<221> CDS <222> (1)..(42) <400> 23 atg aaa cac caa cac caa cat caa cat caa cat caa cat caa 42

Met Lys His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin His Gin '5 10 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <223> Popis umelej sekvencie: Umelé His zakončenie <400> 24 . .

Met Lys His. Gin His Gin' His Gin His Gin His Gin His Gin 1., 5' 10 <210> 25 <211> 69 <212> DNA <213> MuS' musculuš

213 <220>

<221> CDS <222> (1)..(69) <400> 25 atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg ctg ctg tgt gga. 48

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu. Leu Cys Gly

5 10 15 gca gtc ttc gtt tcg Ala Val Phe Val Ser ccc agc Pro Ser <210> 26 <211> 23 <212> PRT <213> Mus- musculus <400> 26

Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser. Pro Ser . . 20

<210> 27 <211> 33
<212> DNA <213> Homo	sapiens
<220> <221> CDS <222> (1)..	.(33)
<400> 27

gaa caa aaa ctc atc Glu Gin Lys Leu íle

5 tca gaa gag gat ctg aat Ser.Glu Glu Asp Leu Asn <210> 28

214 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28

Glu Gin Lys Leu íle Ser Glu Glu Asp Leu Asn 1 5 10 <210> 29 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS

<222> (1)..

(75)

<400> 29

atg aag gat

tcc

tgc

atc

act

gtg

atg

gcc

atg

gcg

ctg

tet

Met Lys Asp

Ser

Cys

íle

Thr

Val

Met

Ala

Met

Ala

Leu

Ser

1

5

10

15

ttc ttt ttc

ttc

gcg

ccg

gcc

tcg

age

Phe Phe Phe

Phe.

Ala

Pro

Ala

Ser

20

25

<210> 30 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30

Met Lys Asp Ser Cys íle Thr Val Met Ala· Met Ala Leu Leu Ser Gly 1 5 10 15

Phe Phe Phe Phe Ala Pro Ala Ser Ser

		²⁰
<210>	31
<211>	60
<212>	DNA
<213>	Mu s	musculus
<220>

215

t- <221>

CDS

<222>

{1)..(

[60)

<400>

31

atg aga agg

atg

ctt

ctg

cac

ttg

agt

gtt

ctg

act

ctc

age

tgt

gtc

Met Arg Arg

Met

Leu

His

Leu

Ser

Val

Leu

Thr

Leu

Ser

Cys

Val

1

5

10

15

tgg gcc act gcc 60.

Trp Ala Thr Ala <210> 32 <211> 20 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32

Met Arg Arg Met Leu Leu His Leu Ser Val Leu Thr Leu Ser Cys Val 1 5 10 . 15

Trp Ala Thr Ala 20 <210> 33 <211> 20 <212> PRT

<213> Homo sapiens
<400> 33
Pro Ala Pro	Gly Ser Thr Ala Pro	Pro Ala His Gly Val	Thr Ser Ala
1	5	10	15

Pro Asp Thr Arg

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

1. Použitie

1) aspoň jedného CTL epitopu odvodeného od s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu, ktorý je v živočíchovi slabo imunogénny alebo neimunogénny a
2) aspoň jedného prvého T-pomocného lymfocytického (T_H) epitopu, ktorý je pre živočícha cudzí, alebo

1) aspoň jedného fragmentu nukleovej kyseliny kódujúceho CTL epitop odvodený od s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu, ktorý je v živočíchovi slabo imunogénny alebo neimunogénny a

2) aspoň jedného fragmentu nukleovej kyseliny kódujúceho T-pomocný lymfocytický (T_H) epitop, ktorý je pre živočícha cudzí alebo nepatogénneho mikroorganizmu alebo vírusu, ktorý nesie fragment nukleovej kyseliny kódujúci alebo exprimujúci

1) aspoň jeden CTL epitop odvodený od s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu, ktorý je v živočíchovi slabo imunogénny alebo neimunogénny a

2) aspoň jeden prvý T-pomocný lymfocytický (T_H) epitop, ktorý je pre živočícha cudzí, prvého T_Hcytotoxická na prípravu imunogénnej kompozície na negatívnu reguláciu buniek exprimujúcich s bunkou asociovaný polypeptídový antigén tým, že sa prostredníctvom vhodnej antigénprezentujúcej bunky (APC) v živočíchovi vyvolá simultánna prezentácia aspoň jedného CTL epitopu a aspoň jedného epitopu, a tým sa indukuje špecifická T-lymfocytová (CTL) odpoveď v živočíchovi

216 proti bunkám nesúcim na svojom povrchu s bunkou asociovaný polypeptidový antigén alebo obsahujúcim s bunkou asociovaný antigén vo svojom intracelulárnom kompartmente.

2. Použitie podľa nároku 1, kde živočích je človek.

3. Použitie podľa nároku 1 alebo, kde uvedený aspoň jeden CTL epitop, ak je prezentovaný, je spojený s molekulou MHC typu I na povrchu APC a/alebo kde uvedený aspoň jeden prvý cudzí T_H epitop, ak je prezentovaný, je spojený s molekulou MHC typu II na povrchu APC.

4. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde APC je dendritická bunka alebo makrofág.

5. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde polypeptidový antigén je vybraný z nádorového polypeptidového antigénu, vlastného proteínu, vírusového polypeptidového antigénu a polypeptidového antigénu, ktorý pochádza z vnútrobunkového parazita alebo baktérie.

6. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde rezentácia CTL epitopu a prvého cudzieho T_H epitopu prostredníctvom APC sa uskutočňuje tým, že sa imunitnému systému živočícha prezentuje aspoň jeden prvý analóg polypeptidového antigénu, pričom menovaný prvý analóg obsahuje obmenu aminokyselinovej sekvencie polypeptidového antigénu, pričom uvedená obmena obsahuje aspoň CTL epitop a prvý cudzí T_H epitop.

7. Použitie podľa nároku 6, kde aspoň prvý analóg obsahuje podstatnú časú známych a predpokladaných CTL epitopov s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu.

217

8. Použitie podľa nároku 7, kde podstatná časť známych a predpokladaných CTL epitopov v aminokyselinovéj sekvencii aspoň jedného prvého analógu je rozpoznávaná aspoň 90 % haplotypov MHC-I, ktoré rozpoznávajú všetky známe a predpokladané CTL epitopy v s bunkou asociovanom polypeptídovom antigéne.

9. Použitie podľa ktoréhokolvek z nárokov 6 až 8, kde v podstate všetky známe CTL epitopy s bunkou asociovaného polypeptídového antigénu sú prítomné v aspoň jednom prvom analógu a/alebo kde v podstate všetky predpokladané CTL epitopy s bunkou asociovaného polypeptídového antigénu sú prítomné v aspoň jednom prvom analógu.

10. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 9, kde aspoň jeden prvý analóg ďalej modifikovanej štruktúry polypeptídového modifikácie je, vyvolá v tele pozostávajúcu z asoc iovaného zahŕňa čast s bunkou antigénu, pričom výsledkom tejto že imunizácia živočícha prvým analógom živočícha produkciu protilátok proti s bunkou asociovanému polypeptídovému antigénu.

11. Použitie podľa ktoréhokolvek z predchádzajúcich nárokov, ktoré ďalej zahŕňa použitie aspoň jedného druhého analógu polypeptídového antigénu alebo fragmentu nukleovej kyseliny kódujúceho druhý analóg polypeptídového antigénu alebo aspoň jedného nepatogénneho mikroorganizmu alebo vírusu nesúceho fragment nukleovej kyseliny kódujúci aspoň jeden druhý analóg polypeptídového antigénu na prípravu imunogénnej kompozície na zaistenie prezentácie imunogenicky účinného množstva aspoň jedného druhého analógu polypeptídového antigénu imunitnému systému

218 živočícha, pričom tento druhý analóg obsahuje modifikáciu štruktúry polypeptidového antigénu a výsledkom tejto modifikácie je, že imunizácia živočícha druhým analógom vyvolá produkciu protilátok proti s bunkou asociovanému polypeptídovému antigénu.

12. Použitie podľa nároku 11, kde sa pri modifikácii do druhého analógu včlení aspoň jeden druhý cudzí T_H epitop.

13. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 12, kde prvý a/alebo druhý analóg (analógy) obsahuje (obsahujú) podstatnú časť B-bunkového epitopu s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu.

14. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 13, kde variácia a/alebo modifikácia zahŕňa substitúciu a/alebo deléciu a/alebo inzerciu a/alebo adíciu aminokyseliny.

15. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 14, kde variácia a/alebo modifikácia zahŕňa začlenenie aspoň jednej prvej časti do prvého a/alebo druhého analógu (analógov), pričom uvedená prvá časť efektívne smeruje analóg k bunke prezentujúcej antigén (APC) a/alebo začlenenie aspoň jednej druhej časti do prvého a/alebo druhého analógu (analógov), pričom uvedená druhá časť stimuluje imunitný systém, a/alebo začlenenie aspoň jednej tretej časti do prvého a/alebo druhého analógu (analógov), pričom zmienená tretia časť optimalizuje prezentáciu analógu imunitnému systému.

219

16. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 15, kde variácia a/alebo modifikácia zahŕňa duplikáciu aspoň jedného B-bunkového epitopu alebo aspoň jedného CTL epitopu s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu.

17. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 16, kde variácia a/alebo modifikácia zahŕňa zavedenie hapténu.

18. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde prvý a/alebo druhý cudzí T_H epitop (epitopy) je (sú) imunodominantný (imunodominantné).

19. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde prvý a/alebo druhý cudzí T_H epitop (epitopy) je (sú) promiskuitný (promiskuitné).

20. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 19, kde prvý a/alebo druhý cudzí T_H epitop (epitopy) sa vyberie (vyberú) z prírodného T_H epitopu a umelej peptídovej sekvencie, ktorá viaže MHC-II.

21. Použitie podľa nároku 20, kde. prírodný T_H epitop sa vyberie z epitopu tetanového toxoidu, ako je P2 alebo P30, epitopu záškrtového toxoidu, hemaglutinínového epitopu vírusu chrípky a CS epitopu P. falciparum.

22. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 12 až 21, kde prvý a/alebo druhý T_H epitop (epitopy) a/alebo prvá a/alebo druhá a/alebo tretia časť je prítomná vo forme vedľajších skupín viazaných kovalentnou alebo nekovalentnou väzbou k vhodným chemickým skupinám v amínokyselinovej sekvencií s bunkou asociovaného

220 polypeptidového antigénu alebo jej subsekvencii a/alebo fúznych partnerov aminokyselinovéj sekvencie odvodených s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu.

23. Použitie podľa nároku 22, kde je prvá častí v podstate špecifickým väzbovým partnerom pre APC špecifický povrchový antigén, ako sacharid, pre ktorý na APC existuje špecifický receptor, napr. manán alebo manóza.

24. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 23, kde druhá je cytokín vybraný z interferónu γ (IFN-γ) , Flt3L, interleukínu 1 (IL-1), interleukínu 2 (IL-2), interleukínu

4 (IL-4), interleukínu 6 (IL-6), interleukínu 12 (IL-12), interleukínu 13 (IL-13), interleukínu 15 (IL-15) a faktoru stimulujúceho granulocyt-makrofágové kolónie (GM-CSF) alebo jeho účinná časť; proteín tepelného šoku vybraný z HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 a kalretikulínu (CRT) alebo jeho účinná častí; alebo, hormón.

25. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 24, kde je tretia častí lipid, ako napríklad palmitoylová skupina, myristylová skupina, farnezylová skupina, geranylgeranylová skupina, GPI-kotva a N-acyl diglyceridová skupina.

26. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 25, kde prvý a/alebo druhý analóg (analógy) má (majú) v podstate výslednú celkovú terciárnu štruktúru s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu.

221

27. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 26, kde sa prezentácia prostredníctvom APC uskutoční podaním imunogénne účinného množstva aspoň jedného prvého analógu živočíchovi.

28. Použitie podľa nároku 27, kde sa tiež podáva imunologický účinné množstvo aspoň jedného druhého analógu.

29. Použitie podľa nároku 27 alebo 28, kde menovaný aspoň jeden prvý a/alebo druhý analóg (analógy) je formulovaný spoločne s farmaceutický a imunologický vhodným nosičom a/alebo vehikulom a prípadne adjuvantom.

30. Použitie podľa nároku 29, kde zmienený adjuvant umožňuje príjem aspoň prvého a/alebo druhého analógu (analógov) APC bunkami, ktorými sú napríklad dendritické bunky.

31. Použitie podľa nároku 30, kde je zmienený adjuvant zvolený zo skupiny pozostávajúcej z adjuvantu zameraného na imunitu; adjuvantu modulujúceho imunitu, ako je toxín, cytokín a mykobakteriálny derivát; olejového preparátu; polyméru; adjuvantu formujúceho micely; saponínu; imunostimulačný komplexný matrix (ISCOM matrix); častice; DDA; alumíniových adjuvantov; DNA adjuvantov; γ-inulínu a zapuzdrujúceho adjuvantu.

32. Použitie podľa nároku 31, kde cytokínom je cytokín definovaný v nároku 24 alebo jeho účinná časú, kde toxín je zvolený zo skupiny pozostávajúcej z listeriolycínu (LLO), lipidu A (MPL, L180.5/RaILPS) a tepelne nestáleho enterotoxínu a ďalej kde mykobakteriálny derivát je zvolený zo skupiny pozostávajúcej z muramyl · dipeptídu,

222 úplného Freundovho adjuvans, RIBI a diesteru trehalózy, ako TDM a TDE, a ďalej kde adjuvant zameraný na imunitu je zvolený zo skupiny pozostávajúcej z ligandu CD40, protilátky CD40 alebo ich špecificky sa viažúcich fragmentov, manózy, Fab fragmentu a CTLA-4 a ďalej kde olejový preparát obsahuje skvalén alebo neúplné Freundovo adjuvans, a ďalej kde polymér je zvolený zo skupiny pozostávajúcej zo sacharidu, ako dextránu, PEG, škrobu, manánu a manózy, plastického polyméru, ako latexu, ako latexových guličiek, a ďalej kde saponín je z Quillaja saponaria, Quil A a QS21, a kde častice obsahujú latex alebo dextŕán.

33. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 32 zahŕňajúce podanie lieku formou vybranou z orálnej, parenterálnej, intradermálnej, subdermálnej, intrakutánnej, subkutánnej, peritoneálnej, bukálnej, sublingválnej , epidurálnej, spinálnej, análnej a intrakraniálnej formy.

34. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 27 až 33 zahŕňajúce aspoň jedno podanie ročne, ako aspoň 2, 3, 4, 5, 6 a 12 podaní ročne.

35. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde sa prezentácia uskutoční podaním nepatogénneho mikroorganizmu alebo vírusu nesúceho fragment nukleovej kyseliny, ktorý kóduje a exprimuje aspoň jeden CTL epitop a aspoň jeden T_Hepitop živočíchovi.

36. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 14, kde sa prezentácia uskutočni podaním nepatogénneho mikroorganizmu alebo vírusu, ktorý nesie aspoň jeden fragment nukleovej

223 kyseliny, ktorý kóduje a exprimuje aspoň prvý analóg živočíchovi.

37. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 26, kde T_Hepitop a/alebo prvá a/alebo druhá a/alebo tretia časé (časti) sú vo forme fúznych partnerov aminokyselinových sekvencií odvodených od s bunkou asociovaného polypeptídového antigénu, a ďalej kde sa prezentácia uskutoční podaním nepatogénneho mikroorganizmu alebo vírusu, ktorý nesie aspoň jeden fragment nukleovej kyseliny kódujúci a exprimujúci prvý a/alebo druhý analóg živočíchovi.

38. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 14 alebo 36, kde sa prezentácia uskutoční podaním nepatogénneho mikroorganizmu alebo vírusu, ktorý nesie aspoň jeden fragment nukleovej kyseliny kódujúci a exprimujúci aspoň druhý analóg živočíchovi.

39. Použitie podľa nároku 38, kde sa nepatogénny mikroorganizmus alebo vírus podá živočíchovi raz.

40. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde sa prezentácia uskutoční in vivo zavedením do APC aspoň jedného fragmentu nukleovej kyseliny.

41. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 14, kde sa prezentácia uskutoční in vivo zavedením do APC aspoň jedného fragmentu nukleovej kyseliny kódujúceho a exprimujúceho prvý analóg.

42. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 až 26, kde T_Hepitop a/alebo prvá a/alebo druhá a/alebo tretia čast

224 (časti) sú vo forme fúznych partnerov aminokyselinových sekvencii odvodených od s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu, a ďalej kde sa prezentácia uskutoční in vivo zavedením do APC aspoň jedného fragmentu nukleovej kyseliny kódujúceho a exprimujúceho prvý a/alebo druhý analóg.

43. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 14 a 41, ktoré ďalej zahŕňa použitie aspoň jedného fragmentu nukleovej kyseliny kódujúceho a exprimujúceho druhý analóg na výrobu farmaceutickej kompozície na in vivo zavedenie do APC aspoň jedného fragmentu nukleovej kyseliny kódujúceho a exprimujúceho druhý analóg.

44. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5, kde sa prezentácia uskutoční in vivo spoločným zavedením do APC aspoň dvoch fragmentov nukleovej kyseliny, kde jeden kóduje a exprimuje aspoň jeden CTL epitop a kde druhý kóduje a exprimuje aspoň jeden prvý cudzí T_H epitop, a ďalej kde prvý cudzí T_H epitop sa definuje podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1, 2 a 21 až 24.

45. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 40 až 44, kde sa zavádzaný fragment (fragmenty) nukleovej kyseliny vyberá (vyberajú) z čistej DNA, DNA formulovanej s nabitými alebo nenabitými lipidmi, DNA formulovanej v lipozómoch, DNA obsiahnutej vo vírusovom vektore, DNA formulovanej s proteínom alebo polypeptídom, ktorý umožňuje transfekciu, DNA formulovanej so zameriavacím proteínom alebo polypeptídom, DNA formulovanej so zameriavacím sacharidom, DNA formulovanej so zrážadlom vápnika, DNA kopulovanej s molekulou inertného nosiča a DNA formulovanej s adjuvantom.

225

46. Použitie podľa nároku 45, kde je adjuvant zvolený zo skupiny pozostávajúcej z adjuvantov uvedených v ktoromkoľvek z nárokov 30 až 32.

47. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 40 až 46, kde spôsob podávania je definovaný v nárokoch 33 alebo 34.

48. Spôsob výberu imunogénneho analógu s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu, ktorý je v živočíchovi slabo imunogénny alebo neimunogénny, kde zmienený imunogénny analóg je schopný vyvolať v živočíchovi reakciu CTL proti bunkám vykazujúcim molekulu MHC typu I viazanú na epitop odvodený od s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa

a) identifikáciu aspoň jednej subsekvencie amínokyselinovej sekvencie s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu, ktorý neobsahuje známe alebo predpokladané CTL epitopy,

b) prípravu aspoň jedného predpokladaného imunogénneho analógu s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu zavedením aspoň jedného T_H epitopu cudzieho pre živočícha do aminokyselinovej sekvencie s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu v polohe ležiacej v aspoň jednej subsekvencie identifikovanej v bode a) , a

c) selekciu toho (tých) analógu (analógov) pripravených v bode b) , ktorý je (sú) preukázateľne schopný vyvolať reakciu CTL u živočíchov.

226

4 9. Spôsob podľa nároku 48 vyznačujúci sa tým, že

1) subsekvencia identifikovaná v bode a) ďalej neobsahuje cysteínové zvyšky alebo alternatívne, T_H epitop zavedený v bode b) v podstate nemení usporiadanie cysteínovych zvyškov a/alebo

2) subsekvencia identifikovaná v bode a) ďalej neobsahuje známe alebo predpokladané glykozylačné miesta, alebo alternatívne, T_H epitop zavedený v bode b) v podstate nemení charakter glykozylácie a/alebo
3) subsekvencia , identifikovaná v bode a) sa významne podieľa na patofyziologickom efekte spôsobenom s bunkou asociovaným polypeptídovým antigénom a kde zavedenie cudzieho T_H epitopu v bode b) redukuje alebo ruší zmienený patofyziologický efekt a/alebo
4) subsekvencia identifikovaná v bode a) je homologická k aminokyselinovéj sekvencii rozdielneho proteínového antigénu živočícha a zavedenie T_H epitopu v bode b) v podstate odstráni homológiu a/alebo
5) zavedenie cudzieho T_H epitopu v bode b) má za následok zachovanie podstatnej časti B-bunkových epitopov s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu.

50. Spôsob podľa nároku 49, variantu 5, vyznačuj úci sa tým, že analóg má celkovú terciárnu štruktúru s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu.

51. Spôsob prípravy bunky produkujúcej analóg s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu, vyznačuj ú ci sa tým, že zahŕňa zavedenie sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej analóg do vektoru, pričom analóg sa

227 volí spôsobom opísaným v ktoromkoľvek z nárokov 48 až 50, a vhodná hostiteľská bunka sa transformuje týmto vektorom.

52. Spôsob prípravy analógu s bunkou asociovaného polypeptidového antigénu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu bunky získanej metódou podľa nároku 51 za podmienok uľahčujúcich expresiu sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej s bunkou asociovaný polypeptidový antigén a získanie analógu z kultivačného supernatantu alebo z buniek.

53. Spôsob podľa nároku 52, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa krok čistenia získaného analógu a prípadne podrobenie prečisteného produktu umelým posttranslačným modifikáciám ako je refolding, úprava enzýmami, chemická modifikácia a konjugácia.

54. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 47 alebo spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 48 až 53, kde slabý s bunkou asociovaný antigén sa vyberie zo skupiny skladajúcej sa z 5-a-reduktázy, α-fetoproteínu, AM-1, APC, APRÍL, BAGE, β-katenínu, Bcl2, bcr-abl (b3a2), CA-125,

CASP-8/FLICE, katepsínov, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22,

CD33, CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55 (791Tgp72), CD59, CDC27, CDK4, CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DcR3, E6/E7, EGFR, EMBP, Ena78, farzyl transferázy, FGF8a alebo FGF8b, FLK-l/KDR, receptora kyseliny listovej, G250, rodiny GAGE, gastrínu 17, hormónu uvoľňujúceho gastrín (Bombezín), GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gplOO/Pmel 17, gpl00-in4, gpl5, gp75/TRP-l, hCG, heparanázy, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT (telomerázy), IGFR1, IL-13R, iNOS, Ki 67, KIAA0205,

K-ras, H-ras, N-ras, KSA (CO17-1A), LDLR-FUT, rodiny MAGE (MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3 atď.), mamaglobínu, MAP17, Melan228

A/MART-1, mezotelínu, MIC A/B, MT-MPP, Moxl, mucínu, ako je MUC-1, MUC-2, MUC-3 a MUC-4, ktoré sú anomálne glykozylované, MUM-1, NY-ESO-1, osteonektínu, pl5, P170/MDR1, p53, p97/ melanotransferínu, PAI-1, PDGF, plazminogénu (uPA), PRÁME, probazínu, , progenipoietínu, PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, génovej rodiny SSX, STAT3, STn (asociovaného s mucínom), TAG-72, TGF-a, TGF-β, tymozínu β 15, TNF-a, TPA, TPI, TRP2, tyrozinázy, VEGF, ZAG, pl6INK4 a glutatión S-transferázy.

55. Použitie alebo spôsob podľa nároku 54, kde s bunkou asociovaný polypeptídový antigén je ľudský PSM.

56. Použitie alebo spôsob podľa nároku 55, kde cudzí T-bunkový epitop sa zavádza v oblasti aminokyselinovej sekvencie PSM definovanej ako SEQ ID č. 2, pozície 16-52 a/alebo 87-108 a/alebo 210-230 a/alebo 269-289 a/alebo 298-324 a/alebo 442-465 a/alebo 488-514 a/alebo 598-630 a/alebo 643-662 a/alebo 672 - 699.

57. Použitie podľa nároku 55 alebo 56, kde sa farmaceutická kompozícia používa na liečbu alebo zlepšenie stavu rakoviny prostaty.

58. Použitie alebo spôsob podľa nároku 54, kde s bunkou asociovaný polypeptídový antigén je fibroblastový rastový faktor 8b (FGF8b).

59. Použitie alebo spôsob podľa nároku 58, kde sa cudzí Tbunkový epitop zavádza v oblasti aminokyselinovej sekvencie FGF8b definovanej ako SEQ ID č. 6, pozície 1-54 a/alebo 178-215 a/alebo 55-58 a/alebo 63-68 a/alebo 72-76 a/alebo 85-91 a/alebo 95-102 a/alebo 106-111 a/alebo 115120 a/alebo 128-134 a/alebo 138-144 a/alebo 149-154 a/alebo 158-162 a/alebo 173-177, pričom toto zavedenie

229 prednostne nepostihuje aminokyseliny 26-45 a aminokyseliny 186-215.

60. Použitie podľa nároku 58 alebo 59, kde sa farmaceutická kompozícia používa na liečbu alebo zlepšenie stavu rakoviny, ako je rakovina prostaty a rakovina prsníka.

61. Použitie alebo spôsob podľa nároku 54, kde s bunkou asociovaný polypeptídový antigén je Her2.

62. Použitie alebo spôsob podľa nároku 61, kde sa cudzí Tbunkový epitop zavádza v oblasti aminokyselinovéj sekvencie Her2 definovanej ako SEQ ID č. 3, pozície 5-25 a/alebo 59-73 a/alebo 103-117 a/alebo 149-163 a/alebo 210224 a/alebo 250-264 a/alebo 325-339 a/alebo 369-383 a/alebo 465-479 a/alebo 579-593 a/alebo 632-652 a/alebo 653-667 a/alebo 661-675 a/alebo 695-709 a/alebo 710-730.

63. Použitie alebo spôsob podľa nároku 61 alebo 62, kde sa farmaceutická kompozícia používa na liečbu alebo zlepšenie stavu rakoviny prsníka.

64. Analóg ľudského PSM, ktorý je u ľudí imunogénny, pričom tento analóg obsahuje podstatnú čast všetkých známych a predpokladaných CTL a B-bunkových epitopov PSM a ďalej obsahuje aspoň jeden cudzí T_H epitop definovaný podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 21.

65. Analóg podľa nároku 64, kde aspoň jeden cudzí T_H epitop je prítomný ako inzert do aminokyselinovéj sekvencie PSM alebo ako substitúcia časti aminokyselinovéj sekvencie PSM alebo ako výsledok delécie časti aminokyselinovéj sekvencie PSM.

66. Analóg podľa nároku 65, kde je cudzí T_H epitop zavedený v pozíciách definovaných v nároku 56.

230

67. Analóg ľudského Her2, ktorý je u ľudí imunogénny, pričom tento analóg obsahuje podstatnú čast všetkých známych a predpokladaných CTL· a B-bunkových epitopov Her2 a ďalej obsahuje aspoň jeden cudzí T_H epitop definovaný podľa ktoréhokoľvek z nárokov 18 až 21.

68. Analóg podľa nároku 67, kde aspoň jeden cudzí T_H epitop je prítomný ako inzert do aminokyselinovej sekvencie PSM alebo ako substitúcia časti aminokyselinovej sekvencie PSM alebo ako výsledok delécie časti aminokyselinovej sekvencie PSM.

69. Analóg podľa nároku 68, kde je cudzí T_H epitop zavedený v pozíciách definovaných v nároku 62.

70. Analóg ľudského/myšacieho FGF8b, ktorý je u ľudí imunogénny, pričom obsahuje podstatnú čast všetkých známych a predpokladaných CTL a B-bunkových epitopov FGF8b a ďalej obsahuje aspoň jeden cudzí T_H epitop definovaný v ktoromkoľvek z nárokov 18 až 21.

71. Analóg podľa nároku 70, kde aspoň jeden cudzí T_H epitop je prítomný ako inzert v aminokyselinovej sekvencií FGF8b alebo ako substitúcia časti aminokyselinovej sekvencie FGF8b alebo ako výsledok delécie časti aminokyselinovej sekvencie FGF8b.

72. Analóg podľa nároku 71, kde je cudzí T_H epitop zavedený v pozíciách definovaných v nároku 59.

73. Imunogénna kompozícia, vyznačujúca sa tým, že ako účinné imunogénne činidlo obsahuje analóg podľa ktoréhokoľvek z nárokov 64 až 72 v zmesi s farmaceutický a imunologický vhodným nosičom alebo vehikulom a prípadne adjuvantom.

231

Ί4. Fragment nukleovej kyseliny kódujúci analóg podľa ktoréhokoľvek z nárokov 64 až 72.

75. Vektor nesúci fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 74.

76. Vektor podľa nároku 75, ktorý je schopný autonómnej replikácie.

77. Vektor podľa nároku 75 alebo 76 zvolený zo skupiny pozostávajúcej z plazmidu, fágu, kozmidu, minichromozómu a vírusu.

78. Vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 75 až 77, ktorý obsahuje v smere 5'-> 3' a v operabilnom spojení promotor na poháňanie expresie fragmentu nukleovej kyseliny podľa nároku 74, prípadne sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu vedúci peptid, ktorý umožňuje sekréciu polypeptidového fragmentu alebo jeho integráciu do membrány, fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 74 a prípadne sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej terminátor.

79. Vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 75 až 78, ktorý sa, zavedený do hostiteľskej bunky, integruje do genómu hostiteľskej bunky alebo nie je schopný integrácie do genómu hostiteľskej bunky.

80. Transformovaná bunka nesúca vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 75 až 79.

81. Kompozícia na indukciu produkcie protilátok proti PSM, Her2 alebo FGF8b, vyznačujúca sa tým, že obsahuj e

1) fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 74 alebo vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 75 až 79 a

2) farmaceutický a imunologický vhodné riedidlo a/alebo vehikulum a/alebo adjuvans.

232

82. Stabilná bunková línia nesúca vektor podl'a ktoréhokoľvek z nárokov 75 až 79, ktorá exprimuje fragment nukleovej kyseliny podľa nároku 74 a ktorá prípadne na svojom povrchu vylučuje alebo nesie analóg podľa ktoréhokoľvek z nárokov 64 až 72.

83. Spôsob prípravy bunky podľa nároku 80, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa transformáciu hostiteľskej bunky fragmentom nukleovej kyseliny podľa nároku 74 alebo vektorom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 75 až 79.