CZ20011049A3 - Imunogenní kompozice a způsob selekce imunogenního analogu - Google Patents

Description

Imunogenní kompozice a způsob selekce imunogenního analogu

Oblast techniky

Předkládaný chorobám, jako charakteristická vynález se například přítomnost boje proti které je nebo slabě týká nových metod rakovině, pro neimunogenních imunogenních genových látek vázaných na vynález zabývá organismu kdy buňky a hubeny immunogeních se získávají buňku.

Především, -se imunitní odpověď T-lymfocytů (CTL), látek jsou napadány přípravy které metodami vyvolávajícími prostřednictvím cytotoxických odvádějící epitopy z genových

CTL. Vynález se také zabývá způsobem modifikovaných polypeptidových antigenů, ze slabě imunogenních antigenů.

Vynález se dále

AutoVac technology v oblasti terapeutické týká sérií aplikací „Applicants' (je předmětem patentu WO 95/05849) vakcinace proti rakovině.

Dosavadní stav techniky <

Ϊ

Myšlenka uskutečnit očkování proti rakovině je více než

sto leť stará a však ve dvacátém aktivita.	v průběhu století se	celého tohoto období, jí věnuje opakovaně až	nejvíce výbušná
Během posledních	10	let	však došlo k výraznému	posunu

v pochopení základních molekulových mechanismů imunitní schopnosti organismu. Mezi nejdůležitější mezníky tohoto (vakcinace-a.doc) • ·

období patři objev stále se rozšiřujícího seznamu cytokinů a růstových faktorů, pochopení mechanismu interakce mezi T a B buňkami, a také stanoveni postupu výroby funkce molekul MHC buněčného včetně struktury a působení imunologie, objasnění antigenu.

i když

Důležitým objevem třídy I v oblasti tolerance dodnes ne zcela pochopeným, mechanismu vyvolání základní u hostitele. Všechny z obrovského úsilí vyvinout nové antigenu, a II při nádorové bylo imunologické tyto výzkumy vycházely léky proti rakovině.

Podle toho, jak pacient získává nádorovou imunitu, se režim imunoterapie děli na pasivní a aktivní. Při pasivním imunoterapeutickém režimu pacient přijímá složky vyvolávající imunitu, jako cytokiny, protilátky, cytotoxické

T-buňky nebo lymfocyty aktivované hubící buňky (LAK).

Naproti tomu aktivní specifická imunoterapie představuje aktivní vyvolání nádorové imunity vakcinací látkou s nádorovou buňkou nebo její antigenní složkou. Tato forma léčby se preferuje především pro delší trvání imunity organismu.

Pasivní a aktivní nádorové vakciny se zaměřují na vyvolání jak humorální tak celulární imunitní odezvy. U aktivních vakcin se prokázalo, že indukce CD4 pozitivních T pomocných buněk je nezbytná k sekundární indukci jak protilátek, tak cytotoxických CD8 pozitivních T buněk.

Pasivní vakcinace protilátkami

Od objevu technologie monoklonální protilátky v polovině sedmdesátých let se vyvinula monoklonálních protilátek přímo nebo s ním spojeným antigenům. terapie však s sebou nese několi celá řada terapeutických proti specifickému nádoru Monoklonální protilátková vážných problémů:

(vakcinace-a.doc) • · • 9

-Injekční aplikace cizích látek vyvolá u pacienta imunitní reakci na vpichnuté protilátky, která může vést ke snížení léčebného účinku, právě tak jako k vážným alergickým reakcím u pacienta.

-Monoklonální protilátky se musí obvykle připravit ve velkém množství. To je velký problém, protože výrobní cena monoklonálních protilátek je tím pádem vysoká.

-Monoklonální protilátky se musí podávat parenterální cestou a vzhledem k tomu, že je potřeba relativně velké množství, pacienti musí být často během léčby hospitalizováni.

-Injekční aplikace monoklonálních protilátek se musí opakovat v relativně krátkém intervalu (týdny) aby se zachoval léčebný efekt.

-Monoklonální protilátky obvykle nejsou schopné aktivovat sekundární efektorové systémy imunitního systému jako komplementární NK-buňky nebo makrofágy hubící nádorové buňky.

Poslední nevýhodou je specifický význam této metody v léčbě rakoviny, který může být příčinou toho, že monoklonální protilátková terapie rakoviny není v některých případech úspěšná. Takzvané „polidštěné monoklonální protilátky nyní používané mnoha společnostmi jsou méně imunogenní, ale bohužel jsou i méně schopny aktivovat sekundární imunitní efektorové systémy. Navíc se vyskytly příklady sekundárního růstu nádorů postrádajících antigen původního nádoru, (vakcinace-a.doc) • · « · • « · · protože monoklonálni protilátky rozhodně nejsou z hlediska působení na nádorové buňky „neškodnými diváky, kteří nejsou nosiči nádorového antigenu.

Nízká efektorová kapacita monoklonálních protilátek vedla k vývoji monoklonálních protilátek chemicky vázaných na různé toxiny a radioizotopy. Společnost Pharmacia Upjohn AB například vymyslela spojení mezi nádorově specifickou monoklonálni protilátkou a toxinem A Staphylococcus aureus s důvodem aktivovat T buňky v nádoru. Medarex lne. vyvinul bispecifické monoklonálni protilátky obsahující nádorově specifický podíl Fab a také specifický podíl protilátek Fcreceptoru za účelem aktivace makrofágu hubícího nádorové buňky.

Oba mechanismy jsou účinnější než samotná monoklonálni protilátka, ale jsou také dražší a více imunogenní.

Protilátky vázané na radioizotopy jsou také drahé a imunogenní, navíc se u nich projevují jiné toxické vedlejší účinky.

Objevení technologie monoklonálni protilátky bylo významným krokem vpřed, který umožnil výrobu přesně stanovených molekul s vysokou vazebnou afinitou. Vzhledem k tomu, že jsou tyto protilátky monoklonálni, reagují pouze s jedním typem epitopu na nádorovém antigenu. To je hlavním důvodem toho, že obvykle nejsou schopné aktivovat doplňkový systém nebo vazbu na Fc-receptory NK-buněk a makrofágů. Tyto velmi silné systémy efektorů obvykle vyžaduji spoluumístěn! četných fragmentů Fc protilátek vystupujících z antigenu.

Jiní výzkumní pracovníci se pokusili použít kombinaci dvou monoklonálních protilátek, což vedlo ke zvýšení efektivnosti metody. Nicméně se zdá být velmi vhodné místo napadání nádorových buněk vysoce specifickými polyklonálními (vakcinace-a.doc) « · • · · • ·· • · • · · · · · protilátkami bojovat proti proti jemu přidruženým faktoru. Tomu aktivovat již je možné, že specifickému nádoru, případně antigenům nebo receptorům růstového odpovídající protilátky jsou schopné plně zmíněné sekundární efektorové systémy. Mimoto lokální zánětlivá reakce vyvolaná těmito sekundárním efektorovými systémy může vést „nezúčastněných buňkách, které nádorový antigen, stejně jako k aktivaci specifických TIL* (nádor prostupující lymfocyty) tkáni. Takový efekt pozorovali u Medarex lne. při jejich bi-specifického konjugátu monoklonální protilátky.

nespecifikuj i účinkům na příslušný nádorově nádorové použití

Od objevu technologie monoklonální protilátky se potencionální využití polyklonálních protilátek k léčbě rakoviny příliš nerozvíjelo (vyjma níže popsaných antigenů). Jedním z hlavních důvodů je to, že přesně stanovené nádorově specifické nebo přiřazené v posledních povrchové antigeny se letech, ale hlavně - mnohé charakterizovaly až z nich se ukázaly být vlastními neimunogenní. V souladu s tím xenogenní polyklonální protilátky jsou nutně dobře využitelné ke studijním účelům, ale je třeba zdůraznit, že právě tyto protilátky vyvolávají antigeny, které jsou tudíž silnou imunitní odezvu na vpíchnuté cizí polyklonální protilátky, čímž rychle snižují terapeutický účinek.

Aktivní vakcinace pro tvorbu protilátek

Nedávné aktivní pokusy vyvolat léčivé vakcinaci pacienta s se vyvinout vakciny polyklonální protilátky rakovinou byly úspěšné, proti membránové vazbě uhlovodíků vlastních antigenů (jako například proti O-vazným odchylkám Tn a sTn-antigenů a gangliosidním liposacharidům

Podařilo

GM2 a GD3). Tyto malé uhlovodíkové struktury jsou však velmi slabými antigeny, proto se musí jejich molekuly konjugovat (vakcinace-a.doc) • <

na nosičích, jako je hemokyanin klíšťat(KHL) nebo ovčí muciny (obsahující Tn a sTn) . U melanomatických pacientů je vyvolání anti-GM2 protilátek spojeno s prodloužením délky života - minimální sledovaná doba je padesát jeden měsíc. Také náhodně sebrané studie fáze II zaměřené na pacientky s rakovinou prsu užívajících konjugáty sTn a KLH v pomocné látce DETOX-B (BIOMIRA, lne.) ukázaly, že sTn imunní pacientky přežily výrazně déle. Dalším příkladem aktivní indukce polyklonálních protilátek proti rakovině je použití idiotypické specifické vakcinace proti B-buněčným lymfomům, které, jak se zdá, jsou účinné pouze proti tomuto typu rakoviny.

A konečně americká společnost Aphton lne. vyvinula aktivní konjugovanou vakcinu proti gonadotropinu uvolňujícímu hormon (GnRH) a gastrin. Prokázalo se, že tato vakcina je schopna regulovat biologickou aktivitu uvedených hormonů, které fungují také jako autokrinní růstové faktory určitých nádorových buněk. Úspěšná II. fáze klinických zkoušek se prováděla na pacientech s rakovinou žaludku a

III. fáze klinických zkoušek se připravuje.

Cytotoxické T-buňky

V několika případech se jasně prokázalo, že nádorově specifické T buňky (CTL*) jsou přítomny v mnoha nádorech. Tyto CTL buňky se nazývají nádor prostupující lymfocyty (TIL). Uvedené buňky jsou však jakoby necitlivé nebo zcela nefunkční při některých jiných mechanismech zahrnujících sekreci imunosupresivních cytokinů nádorových buněk, nedostatek spolustimulujících signálů, pokles regulace molekul MHC třídy I atd.

Provedlo se mnoho pokusů izolovat nádorově specifické (vakcinace-a.doc) • · • · • · · · · · · ···♦ ··· ♦·· · · · ·· » · · · · ♦ · · · «··· «· ·· *· ·» ···· vázané peptidy HLA třídy I identifikované u TIL a některé z nich byly úspěšné (například izolace peptidů z antigenů provázejících melanom). Tyto peptidy se používají k vyvolání nádorově specifické imunitní odezvy v těle hostitele, ale praktické využití nádorově specifických peptidů ve vakcině se omezuje na určitou část populace vzhledem k úzké vazebné specifičnosti peptidů HLA třídy I. Navíc je obvykle relativně obtížné při použití syntetických peptidů vyvolat CTL odezvu „in vivo, protože tyto látky mají malý biologický poločas a mimoto jsou obtíže s exogenní přípravou molekul MHC třídy I.

Řada jiných postupů se zaměřila na vyvolání nádorově specifické imunitní odezvy CTL za použití cytokinů (například IL-2, IFN-γ, IL-6, IL-4, IL-10 nebo GM-CSF) nebo molekul kostimulátorů (B7) buď v rozpustné formě nebo přes infikovanou nádorovou buňku. Imunizace celými alogeními nebo autologickými buňkami nebo nádorovými antigeny připravenými ve speciální formě nasvědčující o přítomnosti antigenů pomocí cesty antigenů MHC třídy I, nebo nádorové antigeny vyjádřené například bacilonosičem neštovic atd. bylo různě úspěšné. Ohledně nádorové imunologie se obecně stále věří tomu, že jedna z nej lepších cest eliminace nádorů je vyvolat silnou specifickou protinádorovou reakci CTL.

Nehledě na to, že tyto léčby jsou obvykle velmi drahé a obtížně reprodukovatelné, ukazuje se také, že je těžké vyvolat dobrou imunitní reakci proti nádoru, poněvadž mnoho s nádorem souvisejících antigenů jsou vlastní proteiny, vůči nimž je většina T buněk odolná. Proto se zdá být nezbytné vyvolat u pacienta řízený buněčný autoimunitní stav.

Podstata vynálezu (vakcinace-a.doc)

Předmětem předkládaného vynálezu činidel schopných vyvolat reakce proti nežádoucím antigenům. Dále je vylepšených metod a hostitele imunitní například nádorovým poskytnutí v organismu antigenům, je předmětem vynálezu metoda přípravy polypeptidových analogů těch nežádoucích antigenů, jejichž analogy jsou schopné indukovat účinnou imunitní reakci právě proti tomuto antigenů.

Souhrn

Antigeny se poněkud dogmaticky popisují dvěma zcela oddělenými cestami - exogenní (typ II) a endogenní (typ I).

Stručně řečeno, cizí protein z prostoru vně buňky nebo z buněčné membrány se zachytí na APC jako endosomu, který se spojí s vnitřní částí buňky obsahující proteolytické enzymy a molekuly MHC typu II. Některé z vytvořených peptidů se váží k typu II a přemisťuji se pak do buněčné membrány.

Pro endogenní cestu typu I je charakteristická při převaze cytosolických proteinů. Předpokládá se, že dochází k proteázou přenášenému štěpení a následnému transportu peptidů do endoplasmatického retikula (ER) prostřednictvím TAP molekul umístěných v membráně ER. V ER se peptidy váži k typu I a následně se transportují do plasmatické membrány.

Tyto dvě známo, že cesty však nejsou zcela odlišné, dendritické buňky k některým

Například je prodlouženým jsou schopny makrofágům extracelulárních proteinů, které endocytózy pak uvádějí s MHC typu I. Dříve se také prokázalo, že (pinocytózy) do při kontextu použití specifických postupů, například při spojení s oxidem (vakcinace-a.doc) • · železitým, exogenní antigeny jsou schopny postupovat cestou typu I (Rock, 1996) . Tento mechanismus se zdá být hlavní, protože k dosažení clusteru tří buněčných typů dochází na stejných APC k souběžné expresi jak typu I tak typu II. Interakce tohoto clusteru tří buněčných typů popisuje Mitchison (1987) a později jiní autoři. Poukazovali na důležitost souběžné prezentace epitopů typu I a typu II na témže APC. Na základě nedávno popsaného mechanismu aktivace CTL (srovnej Lanzavecchia: Nátuře, 393, 1998, 413; Matzinger: Nátuře Med., 5, 1999, 616; Ridge et al.: Nátuře, 393, 1998, 478; Schoenberger et al.: Nátuře, 393, 1998, 480; Ossendrop et al.: J. Exp. Med., 187, 1998, 693 a Mackey et al.: J. Immunol., 161, 1998, 2094) se profesionální APC prezentující antigen na MHC typu II zkoumají na T pomocných buňkách. Výsledkem je aktivace ACP (prostřednictvím interakce CD40L na T pomocnou buňku a CD40 na APC) . To umožňuje APC přímo stimulovat CTL, které se tímto aktivují (srovnej také obr. 2).

Již dříve se prokázalo, že vložení cizí MHC typu II omezuje epitop T pomocné buňky na vlastní antigen, čímž- se následně zajistí schopnost antigenu vyvolat silnou protireakci zaměřenou proti nemodifikovanému vlastnímu antigenu (srovnej patent žadatele WO 95/05849). Ukázalo se, že k indukci autoprotilátek dochází pomocí specifické T buňky a je vyvolána vloženým cizím epitopem.

Dospěli jsme však k závěru, že modifikované vlastní antigeny jsou schopné - prostřednictvím vhodných pomocných látek také vyvolat silnou reakci CTL zaměřenou proti MHC typu I omezující vlastní epitopy, a proto technologie popsaná v patentu WO 95/05849 se může také upravit pro provádění vakcinace proti intracelulárním a jiným buněčným antigenům, (vakcinace-a.doc) jejichž epitopy se vyskytuji sv souvislosti s MHC typu I.

Efekt technologie autovakcinace popsané v patentu WO 95/05849 spočívá v tom, že jestliže se postup výroby modifikovaného vlastního antigenu řídí absorpcí v MHC typu II, pomocí specifické T buňky vznikají vlastní reaktivní B buňky (srovnej obr.l a Dalum I. et al.: J. Immunol·., 157, 1996, 4796-4804, a také Dalum I. et al.: Nátuře Biotechnol., 17, 1999, 666-669). Ukázalo se, že normální jedinci fyziologicky obsahují potenciálně samoreagující B-lymfocyty rozeznávající vlastní proteiny. K tomu, aby tyto lymfocyty skutečně vyvolaly tvorbu protilátek, které reagují s příslušnými vlastními proteiny, je však nutná asistence Tpomocných lymfocytů produkujících cytokin (T_H-buňky nebo T_H~ lymfocyty). Normálně se tato pomoc neuskuteční, protože Tlymfocyty obecně nereagují na epitopy T-buněk vlastních proteinů, jestliže jsou ve formě buněk představujících antigen (APC). Při zavedení „cizího elementu (to je zavedením imunologicky signifikantní modifikace) do vlastního proteinu T-buňky zaznamenávající cizí prvek se aktivizují právě zaznamenáním cizího epitopu na APC (tedy na mononukleární buňce). Polyklonální B-lymfocyty (představující T-buněčný epitop) schopné zaznamenat vlastní epitopy na modifikovaném vlastním proteinu také ukládají antigen a následně představují epitop nebo epitopy cizí Tbuňky, a aktivované T-lymfocyty pak podpoří cytokinem tyto samoreagující polyklonální B-lymfocyty. Vzhledem k tomu, že protilátky tvořené těmito polyklonálními B-lymfocyty reagují s různými epitopy na modifikovaném polypeptidu, i s těmi, které jsou obsaženy v přírodním polypeptidu, indukují se protilátky schopné reagovat proti nemodifikovanému vlastnímu proteinu.

(vakcinace-a.doc) • · • ·

Jak již bylo řečeno, CTL* také vyžaduji pomoc specifické Tbuňky, ale mechanismus tohoto procesu není dosud objasněn.

Předkládaný vynález vychází z naší nové teorie, že vlastní proteiny obsahující cizí epitopy MHC typu II mohou následkem exogennního vstupu zabránit vzniku antigenů MHC typu I, například antigenů makrofágů a dendritických buněk. Touto cestou se vyvolá silná odezva CTL proti subdominantním epitopům ve vlastním proteinu. Alternativně se mohou aplikovat geny kódující modifikované nádorové antigeny jako vakciny nukleových kyselin, které nakonec také vedou k imunitní reakci zprostředkované MHC typu II a MHC typu I .

Nádorové buňky slabými buňkami, jsou z hlediska působení antigenů velmi v důsledku nedostatečného výskytu

MHC typu spolustimulačních molekul nebo imunosupresivních cytokinů apod. Při použití výše složení autovakciny a vakcinačního protokolu představují molekuly MHC typu I i MHC typu II na buňkách profesionálně připraveného antigenů modifikovaný nádorový antigen. Spolupřítomnost subdominantnich vlastních molekulách MHC

I, nedostatku sekrece uvedeného molekulách MHC epitopů na typu I a imunodominantních cizích epitopů na umožní přímou cytokinovou pomoc buněk vymezených MHC MHC typu I (obr. 2) . specifické poruše autotolerance T-buňky k nádorovému antigenů, čímž se dosáhne přesně toho, typu II aktivovaných T-pomocných vycházející z typu II k určitým CTL buňkám vymezeným To vede podle našeho mínění ke co vyžaduje imunoterapie rakoviny.

Závěrem lze říci, technologií sekundární vyvolá aktivací že vakcina připravená reakci humorálních komplementu a na výše naznačenou autoprotilátek se protilátku vázané (vakcinace-a.doc) • 9 • ·

buněčné cytotoxické aktivity (ADCC). Lze také předpokládat, že se vyvolá reakce cytotoxické T-buňky proti například nádorově specifickému membránovému antigenu.

Takže z co nej širšího a obecného hlediska, předkládaný vynález se týká metody vyvolání imunitní reakce proti polypeptidovému antigenu u živočichů včetně člověka, přičemž tento polypeptidový antigen je u živočichů slabě imunogenní nebo neimunogenní; metoda zahrnuje účinné simultánní působení buněk antigenu (APC) imunitního systému živočichů v imunologicky účinném množství

1) alespoň jednoho CTL epitopu odvozeného od polypeptidového antigenu a (nebo) alespoň jednoho Bbuněčného epitopu odvozeného od buněčného polypeptidového antigenu, a

2) alespoň jednoho epitopu první pomocné T-buňky (T_Hepitopu), který je pro živočichy cizí.

Ve speciálnějších případech se předkládaný vynález zabývá způsobem sestupné regulace buněčného polypeptidového antigenu u živočichů včetně člověka, přičemž zmíněný buněčný polypeptidový antigen je u živočichů slabě imunogenní nebo neimunogenní v důsledku vyvolané reakce specifického cytotoxického T-lymfocytu (CTL) proti buňkám nesoucím buněčný polypeptidový antigen na povrchu nebo uvnitř buněčné struktury; metoda zahrnuje účinné simultánní působení vhodné živočišné buňky představující antigen (APC)

1) alespoň jednoho CTL epitopu odvozeného od buněčného polypeptidového antigenu, a

2) alespoň jednoho prvního epitopu T-pomocného lymfocytu (T_H) , který je pro živočicha cizí.

(vakcinace-a.doc)

		- 13 -	·· ·· · 4 ♦ · · 4 • · · · · · · • ·> 444 • 4 444 4 4 · 4 4 4 4 * 4 · 4444 44 4* ♦·	44 *· 4 · · 4 4 · 4 4 4· 4 4 4 • 4 ····
Součástí	předkládaného	vynálezu	je také způsob	přípravy
imunogenních látek. Tento nový	způsob obsahuje	výběr a
přípravu	analogů slabých	buněčných	antigenu, kdy se	zachová

základní frakce známého a předem určeného epitopu a současně se zavede alespoň jeden cizí T_H epitop.

Vynález se dále zabývá určitými specifickými imunogenními strukturami založenými na známých nádorových antigenech a také složením těchto struktur.

Vynález se ještě zabývá fragmenty nukleových kyselin, bacilonosiči, transformovanými buňkami a jinými prostředky využitelnými v molekulárních biologických metodách k přípravě analogů nádorových antigenu.

Podrobný popis vynálezu

Definice

V následující části se z důvodu jasného vymezení a zaměření předkládaného vynálezu podrobně definuje a vysvětluje řada termínů používaná ve specifikaci vynálezu a v patentových nárocích.

„Buněčný polypeptidový antigen znamená v této specifikaci a nárocích polypeptid uvnitř buňky, která nějak souvisí s patologickým procesem. Kromě toho buňka poskytuje CTL epitopy polypeptidového antigenu vázaného na molekuly MHC typu I na jejím povrchu. Buněčné polypeptidové antigeny proto mohou být skutečnými intracelulárními antigeny (a tím jsou nedostupné pro humorální imunologickou odezvu), nebo antigeny vázanými na buněčném povrchu. Buněčný polypeptidový antigen může být produktem buněčné vlastní exprese genu intracelulárního parazita, viru nebo jiné buňky. V posledním (vakcinace-a.doc) případě je polypeptidový antigen spojený s buňkou, která je součástí patologického procesu.

Výrazy „T-lymfocyt a „T-buňka se používají zaměnitelně pro lymfocyty brzlíkového základu, které odpovídají za různé buňkami vyvolané imunitní reakce, a také pro efektorové funkce, jakou je například pomocná aktivita v humorální imunitní reakci. Obdobně výrazy „B-lymfocyt a „B-buňka se používají zaměnitelně pro lymfocyty produkující protilátky.

„Buňka předávající antigen (APC) je buňka, která předává epitopy T-buňkám. Typickými buňkami předávajícími antigen jsou makrofágy, dendritické buňky a jiné fagocytické a pinocytické buňky. Ukázalo se, že B-buňky také fungují jako APC v přítomnosti T_H epitopů vázaných na molekuly MHC typu II k T_H buňkám, ale obecně, jestliže se použije ve specifikaci předkládaného vynálezu a patentových nárocích výraz APC, znamená to výše uvedené fagocytické a pinocytické buňky.

„Pomocné T-lymfocyty nebo „T_H buňky označují CD4 pozitivní T-buňky, které pomáhají B-buňkám a cytotoxickým T-buňkám rozpoznat T_H epitopy vázané k molekulám MHC typu II na buňkách předávajících antigen.

Výraz „cytotoxický T-lymfocyt (CTL) se používá pro CD8 pozitivní T-buňky, které vyžadují k aktivaci asistenci T_H buněk.

„Specifická imunitní odezva v kontextu předkládaného vynálezu vyjadřuje polyklonální imunitní odezvu zaměřenou převážně proti molekule nebo skupině přibližně identických molekul, nebo alternativně proti buňkám předávajícím CTL (vakcinace-a.doc)

epitopy molekuly nebo skupiny přibližně identických molekul.

„Slabě imunogenní nebo neimunogenní polypetidový antigen se slabých (například k označení identickou jiných látek.

polypeptidů, které mají buněčných proteinových lidských), nebo polypeptidů s analogy K uvedenému se tohoto ma j ících těchto termínu se sekvenci antigenů termínu sekvenci proteinů vážou i používá pro označení aminokyseliny živočišných používá také aminokyselin izolovaných z formy polypetidů, které vykazují různé glykosilační typy z důvodu jejich vzniku v heterologních systémech (například kvasinky nebo jiné nesavčí eukaryotické systémy nebo dokonce prokaryotické systémy). Znamená to tedy, že použijeli se tento termín, pak zmíněný polypeptid je normálně neimunogenní nebo jen slabě imunogenní ve své přirozené lokalizaci v těle léčeného živočicha.

Výrazem „polypeptid se v tomto kontextu označují krátké polypeptidy ze 2 až 10 aminokyselinových zbytků, oligopeptidy z 11 až 100 aminokyselinových zbytků a polypeptidy s více než 100 aminokyselinových zbytků. Navíc se výraz používá pro proteiny, tj. funkční biomolekuly obsahující alespoň jeden polypeptid; obsahují-li tyto molekuly alespoň dva polypeptidy, mohou tvořit komplexy kovalentně nebo nekovalentně vázané. Polypeptid (polypeptidy) v proteinu je glykosy.lovaný a (nebo) lipidovaný a (nebo) obsahuje protetické skupiny.

Výraz „subsekvence znamená jakýkoliv spojitý úsek alespoň 3 aminokyselin nebo případně alespoň tří nukleotidů, odvozených přímo z přírodní aminokyselinové sekvence, resp. sekvence nukleových kyselin.

(vakclnace-a.doc) ·· ·♦··

Výraz „živočich v kontextu předkládaného vynálezu obecně znamená živočišné druhy (především savce), jako Homo sapiens, Canis domesticus atd.

a ne jednotlivé živočichy.

Výraz se však používá také pro populaci zmíněných živočišných druhů vzhledem k důležitému faktu, že všichni j ednotlivci imunizovaní metodou uvedenou v tomto vynálezu mají v sobě v podstatě stejný buněčný polypeptidový antigen umožňující imunizaci živočichů stejným imunogenem (imunogeny). Jestliže například genetické varianty polypeptidů existují v rozdílných lidských populacích, je nezbytné použít v případě těchto populací rozdílné imunogeny, aby byly schopné narušit vlastní odolnost každé populace proti slabému buněčnému polypeptidovému antigenu.

Výrazem „sestupná regulace buněčného polypetidového antigenu se v tomto případě rozumí pokles množtví a (nebo) aktivity příslušného antigenu v živém organismu. Sestupné regulace se může docílit několika způsoby: Nejjednodušší z nich je prostý zásah do aktivního místa vazbou protilátky. V rámci předkládaného vynálezu se také zjistilo, že po vazbě protilátky následuje odstranění polypeptidů pomocí čistících buněk (makrofágů a jiných fagocytických buněk) a co je ještě důležitější, že buňky nesoucí nebo obsahující antigen jsou likvidované živočišnými CTL.

Výraz „účinná simultánní prezentace vhodným APC znamená, že se živočišný imunitní systém podřídí určitým způsobem imunogenní výzvě a výsledkem je simultánní prezentace příslušných epitopů APC. Jak se ukáže dále, výzva imunitního systému může proběhnou mnoha cestami, z nichž nejdůležitější je vakcinace polypeptidem obsahujícím farmaciny (tj . vakcina, která přispívá k léčbě nebo zlepšení probíhajícího onemocněni) nebo farmacinem nukleové kyseliny. Důležité je (vakcinace-a.doc)

ΦΦ ·· ·· φφφφ ·· ΦΦ • · · · ·· · · · · φ -1/- ···♦·· · · · · φ • · · φ · φ φ φφφ ΦΦΦ· Φ· ·Φ ·« ΦΦ φφφφ dosáhnout toho, aby se imunogenní živočišné buňky konfrontovaly s APC zobrazujícími příslušné epitopy imunologicky účinným způsobem.

Výraz „imunologicky účinné množství má běžný význam, t j . množství imunogenu schopné indukovat imunitní odezvu, která významně ovlivňuje patogenní látky podílející se na imunologických rysech s imunogenem.

Jestliže se použije výraz, že se slabé buněčné polypeptidové antigeny „modifikují, znamená to chemickou modifikaci toho polypeptidů, který tvoří hlavní řetězec příslušného polypeptidů.

Takovou modifikací může být například derivatizace (např. alkylace) určitých aminokyselinových zbytků v sekvenci aminokyselin, ale jak vyplyne dále, nej významnější jsou modifikace, při nichž dochází ke změnám primární struktury aminokyselinové sekvence.

Jestliže se diskutuje „odolnost a „samoodolnost, rozumí se tím, že u normálních jedinců v populaci nestoupá imunitní odezva proti polypeptidů, protože polypeptidy, kterých se týká metoda používaná v předkládaném vynálezu, jsou vlastními proteiny vakcinované populace nebo proteiny, které nevyvolávají účinnou imunitní odezvu. Nemělo by se však opomenout, že někteří jedinci živočišné populace jsou schopní produkovat protilátky proti přírodnímu polypeptidovému antigenu, například v rámci poruchy autoimunity. V každém případě, normálně je živočich samoodolný pouze proti vlastnímu polypeptidovému antigenu, ale nelze vyloučit, že bude odolný i proti analogům odvozeným od jiných živočišných druhů nebo z populace mající rozdílný fenotyp.

(vakcinace-a.doc) ·· ·· a* ··«· 99 >« • · · · · 9 · 9 9 9« • ·· · · · 9« 9 • V 9 9 9 * 999 · 9 · 9 9999 999

999« 99 99 *9 «9 9999

- 18 „Cizí T-buněčný epitop je peptid schopný vázat se na molekulu MHC a stimulovat T-buňky živočišného druhu. Preferovanými cizími epitopy jsou „smíšené epitopy, tj . ty epitopy,· které se vážou ke značné části molekul MHC typu II v živočišném druhu nebo populaci. Těchto smíšených epitopů je znám pouze velmi omezený počet a budou detailně diskutovány dále.

Ukázalo se, že proto, aby imunogeny používané v předkládaném vynálezu byly účinné v co nejširší oblasti živočišné populace, je nutné 1) vložit několik analogických cizích Tbuněčných epitopů, nebo 2) připravit několik analogů, kdy každý z nich má vložený jiný smíšený epitop. Je zřejmé, že koncepce cizích T-buněčných epitopů zahrnuje i použití kryptických T-buněčných epitopů, tj. epitopů, které se odvozují od vlastního proteinu a které projevují imunogenní chování pouze tehdy, existují-li v izolované formě a nejsou součástí příslušného vlastního proteinu.

„Cizí T pomocný lymfocytický epitop (cizí T_H epitop) je cizí T buněčný epitop vázaný na molekulu MHC typu II a vyskytuje se na povrchu buňky představující antigen (APC) vázané na molekulu MHC typu II.

„CTL epitop je peptid schopný vázat se na molekulu MHC typu I.

„Funkční část (bio)molekuly znamená v kontextu tohoto vynálezu část molekuly, která je odpovědná za alespoň jeden biochemický nebo fyziologický účinek molekuly. Je známé, že mnoho enzymů a jiných efektorových molekul obsahuje aktivní místo, které je zodpovědné za efekty produkované příslušnou molekulou. Ostatní části molekuly splňují úlohu stabilizační (vakcinace-a.doc) ·· ΦΦ • · · · • ·· Φ · Φ Φ ΦΦΦ ΦΦΦΦ >·

*0	····	4Φ	ΦΦ
Φ	Φ	Φ	Φ	•	• Φ
to Φ	9	Φ	•	•
Φ	Φ	» Φ	Φ	Φ	•
	Φ	Φ ·	Φ	Φ	Φ
ΦΦ	ΦΦ	ΦΦ	ΦΦΦΦ

nebo zvyšují rozpustnost a mohou se proto vynechat, jestliže nejsou v přímém kontextu s předkládaným vynálezem. Například se může použít určitých cytokinů jako modifikující části analogu (srovnej podrobnou diskusí níže), a v takovém případě je otázka stability nepodstatná vzhledem k vazbě na analog, která stabilitu nezbytně poskytuje.

Výraz „pomocná látka v oblasti vakcinační technologie obvykle znamená látku nebo směs látek, které 1) nejsou samy o sobě schopné zvyšovat specifickou imunitní odezvu proti vakcinovanému imunogenu, ale které 2) jsou nicméně schopné zvyšovat imunitní odezvu proti imunogenu jako takovému. Nebo jinak řečeno, vakcinace samotnou pomocnou látkou nemůže vyvolat imunitní odezvu proti imunogenu, vakcinace imunogenem může nebo nemusí přinést zvýšení imunitní odezvy proti imunogenu, ale kombinovaná vakcinace imunogenem a pomocnou látkou vyvolá imunitní reakci proti imunogenu, která je silnější než reakce vyvolaná samotným imunogenem.

„Směrování molekuly znamená v kontextu tohoto vynálezu označení situace, kdy se molekula bude při vstupu do živočišného organismu vyskytovat převážně v určité tkáni (tkáních) nebo bude pedevším součástí určitých buněk nebo buněčných typů. Tohoto efektu se může dosáhnout řadou cest včetně formulace molekuly se může dosáhnout řadou cest včetně formulace molekuly se může dosáhnout řadou cest včetně vytvořením molekuly ve složení usnadňujícím směrování nebo zavedením molekul usnadňujících směrování. Tyto otázky se budou detailně diskutovat dále.

„Stimulace imunitního systému znamená, že látka nebo směs vzkazuje všeobecný, nespecifický imunostimulační efekt. Řada pomocných látek a předpokládaných pomocných látek (jako (vakcinace-a.doc)

určité cytokiny) se podílejí na schopnosti stimulovat imunitní systém. Výsledkem používání imunostimulačního činidla je zvýšená „pohotovost imunitního systému, což znamená, že současná nebo následná imunizace imunogenem vyvolává podstatně efektivnější imunologickou odezvu ve srovnání s použitím samotného imunogenu.

Důležité body

Aby se vyvolala odezva CTL proti buňce nesoucí epitopy odvozené od polypeptidového antigenů na jeho povrchu, je nutné, aby se alespoň jeden CTL epitop, je-li přítomný, spojil s molekulou MHC typu I na povrchu APC. Dále je důležité, aby se alespoň jeden první cizí T_H epitop, je-li přítomen, spojil s molekulou MHC typu II na povrchu APC.

Preferovanými APC představujícími epitopy jsou dendritické buňky a makrofágy, ale v předkládaném vynálezu se preferuje jakýkoliv APC schopný simultánně představovat 1) CTL epitopy vázané na molekuly MHC typu I a 2) T_H epitopy vázané na molekuly MHC typu II.

Podle předkládaného vynálezu buněčný polypeptidový antigen je převážně ze skupiny nádorových antigenů a jiných vlastních proteinů, které souvisejí s patolgickým procesem, ale také z virových antigenů a antigenů intracelulárních parazitů nebo bakterií will. Je všeobecně známé, že právě tyto patogenní antigeny jsou často relativně slabými imunogeny (například antigeny z mykobakterií, jako Mycobacterium tuberculosis a Mycobacterium leprae, nebo také z prvoků, např. Plasmodium spp.) Předpokládá se, že metoda předkládaná v tomto vynálezu je kromě uvedení možnosti výroby účinné protilátky a CTL proti skutečným antigenům schopna zvýšit často nedostatečnnou imunitní schopnost (vakcinace-a.doc)

organismu odolávat právě intracelulárnim antigenům.

Za normálních okolnosti je výhodné porovnat imunitní systém s velikosti frakce aminokyselinové sekvence polypeptidového antigenu, na který se vakcinace zaměřuje. Působení CTL a prvního cizího T_H epitopu prostřednictvím APC umožňuje působení živočišného imunitního systému s alespoň jedním prvním analogem buněčného polypeptidového antigenu, přičemž první analog obsahuje řadu aminokyselinových sekvencí buněčného polypeptidového antigenu, kde tato řada sekvencí obsahuje alespoň CTL epitop a první cizí T_H epitop. To je v kontrastu například se strategií vakcinace DNA, kde CTL a T_H epitopy představuje jedna a tatáž buňka, ale jako části oddělených polypeptidů; způsob vakcinace DNA je také předmětem předkládaného vynálezu, ale předpokládá se, že dva epitopy jako součást stejného polypeptidu budou za normálních okolností zvyšovat imunitní reakci a v každém případě bude nutné zajistit pouze jeden zástupný produkt.

Aby byly změny zvyšující imunitní odezvu organismu maximální, obsahuje zmíněný první analog převážnou část známých a předpokládaných CTL epitopů buněčného polypeptidového antigenu, například tu část, která váže vhodné frakce molekul MHC typu I určité populace. Například je dobré, když se podstatné části známých a předpokládaných

CTL epitopů v aminokyselinové sekvenci analogu zaznamenají prostřednictvím alespoň 50 % MHC-I haplotypů, které rozpoznají všechny známé a předpokládané CTL epitopy v buněčném polypeptidovém antigenu, ale ještě lepší je vyšší procento, alespoň 60, 70, 80 a 90 %. Nejlepší je využití analogů, které uchovají v podstatě všechny známé CTL epitopy buněčného polypeptidového antigenu přítomné v analogu, tj . zahrnují 100 % známých CTL epitopů. Současně (vakcinace-a.doc) • · • · · · je výhodné, když v podstatě všechny předpokládané CTL epitopy buněčného polypeptidového antigenu jsou v alespoň prvním analogu.

Metody prognózy přítomnosti CTL epitopů jsou dobře známé (viz např. Rothbard et al·.: EMBO J., 7 (1988), 93-100).

Jak vyplývá ze specifikace a patentových nároků předkládaného vynálezu, předpokládá se, že nové metody poskytnou vyvolání účinné reakce CTL proti buněčným polypeptidovým antigenům.

V případech čistě intracelulárního buněčného polypeptidového antigenu je vyvolání reakce CTL proti buňkám skrývajícím antigen jedinou cestou k dosažení jeho snižování specifickými imunologickými prostředky. V případě membránových antigenu je však výhodné vyvolat reakci proti slabému buněčnému polypeptidovému antigenu. Jestliže se zvýší humorální imunitní odezva proti slabému buněčnému antigenu, je prioritní podstatně omezit odezvu na interakci s těmi částmi antigenu, které jsou normálně vystavené možné interakci s protilátkami. Jinak je nej lepším výsledkem vyvolání reakce proti částem antigenu, které nejsou normálně součástí humorálního imunitního systému, ale to na oplátku zvyšuje riziko přenesené reaktivity se zcela nepatologickými antigeny. Elegantní cestou ke získání požadovaného efektu je provést vakcinaci nukleové kyseliny s analogem slabého buněčného antigenu, kde jeho extracelulární část zůstává nezměněná nebo obsahuje T_H epitop zásadně se nelišící od 3D struktury zmíněné extracelulární části antigenu. Při jakékoliv alternativě se imunizace provádí jak s CTL řízeným imunogenem, tak s B-buněčným řízeným imunogenem, přičemž B-buněčný řízený imunogen v podstatě není schopen (vakcinace-a.doc) • · účinné imunizace proti intracelulární části cílového antigenů ( B-buněčnému řízenému imunigenu může například chybět jakákoliv jiná látka než je extracelulární hmota z antigenů).

Vyvolání reakce protilátek se může dosáhnout řadou způsobů, které jsou v odborných kruzích dobře známé. Například alespoň jeden první analog může obsahovat část tvořenou modofikací struktury buněčného polypeptidového antigenů, kde v důsledku této modifikace imunizace živočišného organismu prvním analogem vyvolá tvorbu protilátek proti buněčnému polypetidovému antigenů - jak se uvádí výše, tato varianta je zvlášť vhodná pro vakcinaci nukleové kyseliny. Jinak metoda předkládaného vynálezu zahrnuje aplikaci imunologicky účinného množství alespoň jednoho druhého analogu buněčného polypeptidového antigenů obsahujícího takovou modifikaci do živočišného imunitního systému. Uspokojivou cestou k dosaženi modifikace vykazující požadovaný účinek je zahrnutí alespoň jednoho druhého cizího T_H epitopu v druhém analogu, což je metoda, kterou lze použít i pro první analog.

V případech, kde se vyžaduje také nárůst účinné humorální imunitní odezvy, je výhodné, když první a (nebo) druhý analog (analogy) obsahuj e (obsahuji) podstatnou část Bbuněčného epitopu buněčného polypeptidového antigenů, především toho B-buněčného epitopu, který je v přírodní formě antigenů vhodného živočicha extracelulární.

Výše diskutované varianty a modifikace slabého buněčného polypeptidového antigenů se mohou vyskytovat v různých formách. Nejlepší je, když varianta a (nebo) modifikace zahrnuje substituci a (nebo) smazání a (nebo) vložení a (vakcinace-a.doc) • · ·· · · • · (nebo) adici aminokyseliny. Tyto základní operace související s manipulací aminokyselinové sekvence by měly pokrýt jak jednotlivé změny aminokyselin, tak operace zahrnující větší úseky aminokyselin (jako je míchání aminokyselinových řetězců s polypeptidovým antigenem; to je především zajímavé v případě, že antigen je čistě intracelulární, protože jsou důležité pouze ty možnosti, kdy se uchrání CTL epitopy). Ukázalo se, že vložení nebo odnětí například jedné samostatné aminokyseliny může zvýšit vznik cizího T_H epitopu v sekvenci analogu, tj . vznik molekuly MHC typu II vázané sekvencí. Ale v mnoha případech je důležité (a dokonce nezbytné) vložit známý cizí T_H epitop a takový proces vyžaduje substituci a (nebo) vložení kyseliny (nebo někdy adici ve formě konjugace na proteinový nosič nebo formou polypeptidové fúze realizované metodami molekulární biologie). Je důležité, aby počet vložených, odebraných, substituovaných nebo adovaných aminokyselin byl nejméně 2, ale také 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 a 25. Dále je důležité, že počet aminokyselinových substitucí nepřesáhne 150, takže je jich nejvíce 100, 90, 80 a 70. Zejména je důležité, že počet substitucí, vložení, odebrání nebo adicí nepřesáhne 60, nebo lépe 50 a dokonce 40. V optimálním případě nepřekročí uvedený počet 30.

Nejdůležitějšími pro předkládaný vynález jsou ty varianty, které zahrnují modifikaci se vstupem alespoň jednoho cizího imunodominantního T_H epitopu. Je zřejmé, že otázka imunitní převahy T-buněčného epitopu závisí na příslušném živočišném druhu. V tomto vynálezu používaný výraz „imunodominance jednoduše označuje epitopy, které při vakcinaci jedince nebo populace zvyšují podstatně imunitní reakci, ale je dobře známá skutečnost, že T-buněčný epitop, který je (vakcinace-a.doc)

- 25 imunodominantni v jednom jedinci, nemusí být nutně imunodominantni v v něm schopný imunodominantními polypeptidu, kde jiném jedinci téhož vázat molekuly

T_H epitopy jsou ty, tvoří subsekvence, druhu, přestože je

MHC-II. Pravými které nezávisle na zvyšují aktivitu T_H buněk jinými slovy, vnitřní vlastností některých T_H epitopů je to, že v podstatě nikdy nejsou skryté, protože téměř vždy jsou tvořeny APC a vystupují v souvislosti s molekulami MHC-II na povrchu APC.

Jiným důležitým bodem je problém restrikce MHC u T-buněčných epitopů. Obecně u přírodních T-buněčných epitopů jsou MHC omezené, tj . určité peptidy tvořící T-buněčný epitop se účinně vážou pouze k podskupině molekul MHC typu II. To vede v mnoha případech k tomu, že výsledkem použití jednoho specifického T-buněčného epitopů je vakcinační složka, která účinkuje pouze na část populace a podle toho, o jak velkou část se jedná, je nezbytné začlenit více T-buněčných epitopů do jedné molekuly, nebo alternativně připravit vícesložkovou vakcinu, kde jednotlivé složky jsou variantami antigenu, vzájemně se lišícími podstatou Tbuněčného epitopů.

Jestliže je restrikce

MHC použitých T-buněk zcela neznámá (například v situaci, kde u vakcinovaného živočicha je nedostatečně definované složení MHC), část populace pokrytá vakcinou specifického složení se stanoví podle následujícího vzorce

Yl /populace = 1 ~ Π (¹ ~ P·) z=l kde pí je frekvence v populaci odpovídající i-tému cizímu T buněčnému epitopů ve vakcině a n celkový počet cizích T (vakcinace-a.doc) '♦ · • · buněčných epitopů ve vakcině. Takže vakcína obsahující 3 cizí T-buněčné epitopy při odpovídající frekvenci v populaci 0,8, 0,7 a 0,6 pak dává

- 0,2 x 0,3 x 0,4 = 0,97 6 tj. 97,6 procenta populace budou staticky prostřednictvím

MHC-II citliví na vakcinu.

Výše uvedený vzorec nelze použít nebo méně přesně známé rozdělení

Jestliže například určitý peptid lidského MHC-II kódované HLA-DR alelami DR1, situacích, kde

MHC použitých pouze váže je více peptidů.

molekuly

DR3, DR5 a DR7, pak se při použití tohoto peptidu který váže zbývající molekuly jiným peptidem, společně s kódované HLA-DR

MHC-II alelami, dosáhne 100% pokrytí váže zmíněné jestliže druhý peptid pokrytí dané populace citlivosti populace založí buněčných epitopů ve vakcině, vakcinou specifického složení vůbec populace. Obdobně jeho přidáním se nezvýší. Jestliže se čistě na rozdělení

DR3 a DR5, výpočet

MHC Tpokrytá pak se část populace stanoví podle následujícího vzorce:

² fpopulace

J=1 kde q>j je suma populačních frekvencí alelických haplotypů kódujících MHC molekuly, které vážou jakýkoliv z T-buněčných epitopů ve vakcině a které náleží k j-té ze 3 známých HLA (DP, DR a DQ); v praxi se nejpve stanoví, které molekuly MHC zaznamenají každý T-buněčný epitop ve vakcině, a pak se tyto molekuly sestaví podle typu (DP, DR a DQ) - následně se indviduální frekvence různých zaznamenaných alelických haplotypů sečtou pro každý typ, čímž se získá hodnota φι, φ₂ (vakcinace-a.doc) • · • · a φ₃.

Může dojít k tomu, že hodnota pí ve vzorci II převyšuje odpovídající teoretickou hodnotu ni:

^=i-fl(i-v,.) (IV) j=i kde Vj je suma populačních frekvencí alelického haplotypu kódujícího MHC molekuly, které vážou i-tý T-buněčný epitop ve vakcině a které náleží k j-té ze 3 známých HLA (DP, DR a DQ) . To znamená, že u 1- πχ části populace je frekvence respondentů f_Zbytk- i = (Pí ~ ni)/(l- ni) . Pak se tedy vzorec III dá převést do tvaru V:

fpopulace (V)

7=1 /=1 kde se výraz 1 - f_Zbytk-i položí = 0, jestliže má zápornou hodnotu. Je zřejmé, že vzorec V předpokládá, že se všechny epitopy z hlediska haplotypu zobrazí vůči identickým skupinám haplotypů.

Takže když se mají vybrané T-buněčné epitopy zařadit do analogu, je důležité zahrnout všechny dostupné znalosti o epitopech: 1) populační frekvenci respondentů pro každý epitop, 2) data o rozdělení MHC a 3) populační frekvenci příslušných haplotypů.

Existuje řada přírodně se vyskytujících „smíšených Tbuněčných epitopů, které jsou aktivní u mnoha jedinců nějakého živočišného druhu nebo živočišné populace a jejich použití ve vakcině se preferuje, protože se sníží potřeba velikého množství různých analogů v jedné a té samé vakcině.

(vakcinace-a.doc) « · ····

Smíšeným epitopem podle předkládaného vynálezu je přírodně se vyskytující lidský T-buněčný epitop, jako jsou epitopy z tetanového toxinu (tj. epitopy P2 a P30), záškrtový toxin, chřipkový virus hemaglutinin (HA) a P. falciparum CS antigen.

V průběhu buněčných vázat let se identifikovala řada jiných smíšených Tpeptidy schopné HLA-DR kódované epitopů. Jedná se ve velkém rozsahu především o molekuly rozdílnými buněčnými alelami

HLA-DR a tyto peptidy epitopy, předkládaného vynálezu které se mohou jsou všechny Tzařadit do použitelných analogů. Viz podle také následujících odkazech, které j sou epitopy diskutované v všechny zahrnuty v přiložených citacích: WO 98/23635 (Frazer

I.H. et al., přihlášen k univerzitě ve Queenslandu); Southwood S. et al., J. Immunol. 160(1998), 3363-3373; Sinigaglia F. et al., Nátuře 336 (1988), 778-780; Rammensee H.G. et al., Immunogenetics 41:4 (1995), 178-228; Chicz R.M. et al., J.Exp. Med. 178 (1993), 27-47; Hammer J. et al., Cell 74 (1993), 197-203; Falk K. et al., Immunogenetics 39 (1994), 230-242. Další odkazy se zabývají také HLA-DQ a -DP ligandy.

Všechny epitopy seřazené v uvedených 5 publikacích jsou důležitými kandidáty v oblasti přírodních epitopů, které lze použít v předkládaném vynálezu, stejně jako ty, které s nimi sdílejí běžné vlastnosti.

Alternativním epitopem může být i jakýkoliv umělý T-buněčný epitop, který je schopný vázat ve velkém rozsahu haplotypy. V této souvislosti peptidy pan DR epitopů („PADRE) popsané v patentu WO 95/07707 a v odpovídající publikaci Alexander, J. et al., Immunity 1 (1994), 751-761 (oba odkazy jsou zahrnuty v přiložených citacích) jsou zajímavými kandidáty (vakcinace-a.doc) • ·

na použiti v tomto vynálezu. Ukázalo se, že nejúčinnějši PADRE peptidy uvedené v tomto textu nesou D-aminokyseliny

v C- a

N-zakončenich ke zvýšení stability. Cílem

předkládaného vynálezu je však především začlenění důležitých epitopů jako součást' modifikovaného antigenu, který se může následně enzymaticky rozbít uvnitř lysosomální části APC, aby se dále projevil v souvislosti s molekulou

MHC-II;

proto není výhodné začleňovat D-aminokyseliny

k epitopům používaným v tomto vynálezu.

Zvláště preferovaným peptidem PADRE je ten, který má aminokyselinovou sekvenci AKFVAAWTLKAAA nebo její imunologicky účinnou subsekvenci. Tento a jiné epitopy se

stejným	rozdělením MHC jsou vyhledávanými T-buněčnými
epitopy,	které se mohou vyskytovat v analogách používaných
v metodě	tohoto vynálezu. Tyto perfektně smíšené epitopy
umožňuj i	nejjednodušší realizaci vynálezu, kdy se do

živočišného imunitního systému vakcinuje pouze jeden samotný analog.

Podstata	výše uvedené modifikace především spočívá v tom,
že:	alespoň jeden první podíl je součástí prvního a (nebo) druhého analogu (analogů), přičemž první podíl účinně směruje analog k buňce nesoucí antigen (APC) a (nebo) alespoň jeden druhý podíl je součástí prvního a (nebo) druhého analogu (analogů), přičemž druhý podíl stimuluje imunitní systém a (nebo) alespoň jeden třetí podíl je součástí prvního a (nebo) druhého analogu (analogů), přičemž třetí

(vakcinace-a.doc) podíl optimalizuje působení analogu v imunitním systému).

Funkční a strukturní rysy týkající se těchto prvních, druhých a třetích podílů se diskutují v následujícím textu. Mohou se vyskytovat ve formě okrajových skupin vázaných kovalentně nebo nekovalentně ke vhodným chemickým skupinám v aminokyselinové sekvenci buněčného polypeptidového antigenů nebo v její subsekvenci. Je zřejmé, v rozložení aminokyselinových zbytků antigenů probíhají beze změny primární že změny polypeptidového aminokyselinové sekvence nebo alespoň bez zásahu do peptidových vazeb mezi jednotlivými aminokyselinami v řetězci.

Podíly mohou mít také formu fúzních partnerů aminokyselinové sekvence buněčného polypeptidového antigenů. V této souvislosti je třeba zmínit, že obě varianty zahrnují možnost konjugace aminokyselinové sekvence k nosiči (srovnej dále). Jinými slovy, v kontextu tohoto vynálezu termín „fúzní protein není vyhrazený pouze fúznímu seskupení připravenému působením fragmentu DNA kódujícího toto seskupení, ale odpovídá také konjugaci mezi dvěma proteiny, které se vážou peptidovou vazbou v následné chemické reakci.

Jak již bylo řečeno, analog může obsahovat první podíl, který směruje analog k APC nebo B-lymfocytu. Například, první podíl je specifickým vazebným partnerem pro specifický povrchový antigen B-lymfocytu nebo specifický povrchový antigen APC. V odborných kruzích je známo mnoho takových specifických povrchových antigenů. Podílem může být například uhlovodík, jehož receptor je na B-lymfocytu nebo APC (např. manan nebo manóza). Jindy může být druhým podílem hapten. Jako první podíl se může použit část protilátky, (vakcinace-a.doc)

Φ· • · · · která specificky rozeznává povrchové molekuly APC nebo lymfocytů (povrchovou molekulou může být např. FCy receptor makrofágů a monocytů, jako je FCy RI nebo případně jiný specifický povrchovýv markér, jako CD40 nebo CTLA-4). Ukázalo se, že všechny tyto typické směrující molekuly se mohou použít jako součást adjuvans (viz dále). CD40 ligandy, protilátky proti CD40 nebo jejich varianty, které vážou CD40, směrují analog k dendritickým buňkám. Současně poslední výsledky ukázaly, že interakcí s molekulou CD40 se T_H buňky stávájí nepodstatnými pro získání odezvy CTL. Z toho vyplývá, že obecné použití molekul, které vážou CD40, jako prvního podílu (nebo jako adjuvans, viz dále) podstatně zvýší odezvu CTL; předpokládá se, že použití vazných molekul CD40 jako adjuvans nebo jako „prvních podílů v souvislosti s tímto vynálezem bude původním, zcela novým přínosem.

Alternativou nebo náhražkou směrování analogu k určité buňce, aby se dosáhlo zvýšené imunitní reakce, je zvýšení hladiny citlivosti imunitního systému zahrnutím výše zmíněného druhého podílu, který stimuluje imuntní systém. Typickými příklady druhých podílů jsou cytokiny, proteiny teplotního šoku a hormony, včetně účinných složek těchto látek.

Vhodnými cytokiny pro použití v předkládaném vynálezu jsou ty, které normálně fungují také jako adjuvans ve složení vakciny, například interferon γ (IFN-γ) , Flt3 ligand (Flt3L), interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15) a faktor stimulující granulocyt-makrofágovou kolonu (GM-CSF); jinak stačí jako druhý podíl i funkční část cytokinové molekuly. Otázka využití těchto cytokinů jako adjuvans se (vakcinace-a.doc)

···* diskutuje dále.

Druhým podílem může být eventuálně toxin, jako například listeriolycin (LLO), lipid A a tepelně nestálý enterotoxin. Zajímavou možnost využití skýtá také řada mykobakteriálních derivátů, jako ,MDP (muramyl dipeptid), CFA (úplné Freundovo adjuvans) a diestery trihalózy TDM a TDE.

Podle tohoto vynálezu jsou vhodnými proteiny tepelného šoku, které se použijí jako druhé podíly, HSP 70, HSP90, HSC70, GRP94 a kalretikulin (CRT).

Důležitým bodem tohoto vynálezu je také možnost zařazení třetího podílu, který zvyšuje působení analogu na imunitní systém. Je známo několik příkladů tohoto postupu, například se ví, že lipidační ukotvení palmitoylu v proteinu OspA Borrelia burgdorferi působí na vznik sebeposilujících polypeptidů (viz např. WO 96/40718). Zdá se, že lipidované proteiny podporují tvorbu micelového typu struktur se středem obsahujícím lipidační ukotvení části polypeptidů a vystupující zbytky molekuly, vedoucí k mnohonásobnému působení antigenních determinantů. Takže použití tohoto principu a s tím související přístupy využívající různé lipidační ukotvení (například skupinu myristylu, farnesylu, geranyl-geranylu, GPI-anchor a N-acyl diglyceridovou skupinu) jsou z hlediska předkládaného vynálezu významné především proto, že lipidační ukotvení se hromadí v podstatě přímo v rekombinovaně tvořeném proteinu a potřebuje jenom například určitě se vyskytující signální sekvenci jako fúzního partnera analogu. Jinou možností je použití C3d fragmentu komplementačního faktoru C3 nebo samotného C3 (viz Dempsey et al·.: Science 271 (1996), 348-350 a Lou a Kohler: Nátuře Biotechnology 16 (1998), 458-462).

(vakcinace-a.doc)

- 33 Je důležité poznamenat, že jestliže se metoda tohoto vynálezu použije proti membránově vázaným polypeptidovým antigenům, které jsou vystaveny mimobuněčnému prostředí, preferuje se první a (nebo) druhý analog (analogy) mající v podstatě celkovou terciární strukturu buněčného polypeptidového antigenu. V předkládaném popisu a patentových nárocích to znamená, že celková terciární struktura té části polypeptidového antigenu, která je vystavena vnějšímu mimobuněčnému působení, se chrání, protože jak se uvádí výše, terciární struktura nezbytných vnitrobuněčných polypeptidů neangažuje imunitní systém. Ve skutečnosti je často součásti vakcinační strategie snaha neohrozit mimobuněčnou část uvažovaného B-buněčného epitopu odvozeného od intracelulární části polypeptidových antigenů; touto cestou se minimalizuje nežádoucí efekt vyvolaný vzájemnou reaktivitou s jinými antigeny.

Pro účely tohoto vynálezu je však vhodná taková modifikace (vřazení, adice, odstranění nebo substituce), která zvýší účinek cizího T-buněčného epitopu a současně chrání podstatné množství CTL epitopů v polypeptidovém antigenu (a někdy také podstatné množství B-buněčných epitopů).

Následující vzorec popisuje zobecňuje pojmy skryté v tomto vynálezu:

(MODU _S1 (PAGei) m (MOD₂) _s2 (PAG_e2) _n2........... (MOD_X) _sx (PAG_ex) _nx (I) kde PAG_ei-PAG_ex jsou x CTL a (nebo) B-buněčné epitopy obsahující sekvence důležitého polypeptidového antigenu, které zcela nezávisle mohou a nemusí být identické a obsahují nebo neobsahují cizí okrajové skupiny, přičemž x je celé číslo >3, nl-nx jsou x-tá celá čísla >0 (alespoň jedno (vakcinace-a.doc)

- 34 >1) , MODi-MOD_x jsou x-té modifikace vřazené mezi chráněné j edno je >1, jestliže se žádná okraj ová skupina nevřadí do sekvencí). Takže s určením funkčních omezení imunogenity systémů původní obměn.

předkládaný vynález sekvence připouští všechny typy obměn antigenové

Příslušné analogy se a všechny modifikace získají vynecháním těch těchto částí sekvence polypeptidového antigenu, které například vykazují nežádoucí účinky v živém organismu nebo vynechámím částí, které jsou normálně intracelulární, a tak mohou zvyšovat nežádoucí imunologické reakce (viz detailní diskusi dále).

Další zpracování výše uvedeného principu se týká použití CTL a B-buněčných epitopů ze dvou a více patologicky příbuzných antigenů. Například existuje několik antigenů vztahujících se k rakovině, které vykazují onkogenní efekt pouze v mutované formě - příkladem jsou mutované K-ras a P53, které oba patří k základním proteinům regulace normálního buněčného cyklu a vyskytují se v absolutně normálních buňkách. V některých případech se ukázalo, že CTL rozeznají mutované peptidy z těchto antigenů. Proto je důležité, že imunitní systém reaguje pouze na mutované peptidy a ne na nemutované části v případě indikace antigenspecifické imunoterapie.

Navrhli jsme strategii, kdy sekvence 8-25 aminokyselin proteinů souvisejících s onemocněním se použijí jako další epitopy ve složení autovakciny - nejlépe tak, že vložené epitopy současně umožňují vznik T_H epitopů v konečném složení, viz výše uvedená diskuse. Epitopy použité k tomuto účelu by měly obsahovat mutovanou oblast proteinu sovisejícího s onemocněním. Aby vyhovoval uvedenému postupu, měl by vytvářet CTL (a případně aplikovatelné protilátky) (vakcinace-a.doc) proti pouze mutované formě antigenů souvisejícího s onemocněním. V případech, kdy antigen související s onemocněním umožňuje tvorbu T_H epitopů, použití skutečně cizího T_H epitopů se zcela vynechá. Takovým případem je například vakcinace vakcinou nukleové kyseliny kódující analog polypeptidového antigenů (např. Her2 nebo PSM) , kdy se vřazuje alespoň jeden T_H epitop a alespoň jeden peptid y jiného antigenů souvisejícího s onemocněním (např. peptid z mutované části nějakého onkogenního proteinu). Je výhodné, když alespoň jeden T_H epitop se vřadí následně po vřazení peptidu.

Dále je výhodné, když varianta (modifikace) obsahuje aplikovatelnou duplikaci alespoň jednoho B-buněčného epitopů nebo alespoň jednoho CTL epitopů buněčného polypeptidového antigenů. Výsledkem této strategie je přítomnost mnoha kopií preferované epitopické oblasti v imunitním systému a s tím související maximalizace možností účinné imunitní odezvy. Tento vynález tedy využívá četného výskytu epitopů z polypeptidového antigenů (tj . vzorec I, kde se alespoň jeden B-buněčný epitop vyskytuje ve dvou polohách).

Tohoto efektu se dosáhne řadou postupů, například jednoduše přípravou fúzních polypeptidů obsahujících strukturu (PAG)_m, kde m je celé číslo > 2, a pak vřazením výše diskutovaných modifikací do alespoň jedné ze sekvencí polypeptidového antigenů.

Alternativním řešením tohoto vynálezu, jehož výsledkem je také zařazení více kopií důležitých epitopických oblastí antigenů (alespoň 2) do imunitního systému, je kovalentní připojení následných nebo různých antigenů k určitým molekulám. Mohou se použít například polymery, jako (vakcinace-a.doc) uhlovodíky, např. dextran (viz Lees A. et al.: Vaccine 12 (1994), 1160-1166; Lees A. et al.: J. Immunol. 145 (1990), 3594-3600), ale také manóza a manan jsou vhodnými alternativami. Úplné membránové proteiny např. z E. coli a jiných bakterii jsou také využitelné jako konjugačni partneři. Vhodnými konjugačnimi partnery jsou i tradiční nosné molekuly, jako klíšťový hemocyanin (KLH), tetanový toxin, záškrtový toxin a hovězí albuminové sérum (BSA).

Udržení prospěšných a podstatných frakcí B-buněčného epitopu nebo dokonce běžné terciární struktury proteinu vystaveného modifikaci, jak se popisuje výše, lze dosáhnout několika cestami. Jednou z možnosti je jednoduše připravit polyklonální antisérum proti polypeptidovému antigenu (např. antisérum připravené v králíkovi), a pak jej použít jako testovací látku (např. v konkurenční ELISA) proti modifikovaným proteinům, které se produkují. Modifikované verze (analogy), které reagují s antisérem ve. stejném rozsahu jako polypeptidový antigen, musí mít stejnou běžnou terciární strukturu jako zmíněný antigen, zatímco analogy vykazující omezenou reaktivitu s antisérem (ale ještě významnou a specifickou) obsahují pravděpodobně podstatnou frakci původních B-buněčných epitopů.

Nebo se testovací pole může připravit selekci monoklonálních protilátek reaktivních s rozdílnými epitopy na polypeptidovém antigenu. Tento postup má výhodu v tom, že umožňuje l)epitopické mapování příslušného polypeptidového antigenu a 2) mapování epitopů, které se udržují v připravených analogách.

Třetí možností je samozřejmě rozložit třídimenzionální strukturu polypeptidového antigenu nebo jeho biologicky (vakcinace-a.doc)

aktivní zkrácené modifikace (viz výše) a přirovnat ji k rozložené třídimenzionální struktuře připravených analogů. Třídimenzionální struktura se může rozložit RTG difrakcí a

NMR spektroskopií. Další informace týkající se třídimenzionální struktury se získají studiem kruhového dichroismu, které je výhodné tím, že potřebuje malé množství čistého polypeptidu (zatímco RTG difrakce vyžaduje vzorek krystalického polypeptidu a NMR vzorek jeho izotopu). RTG difrakční analýza a (nebo) NMR spektroskopie jsou však zcela nutné ke získání jednoznačných údajů, protože kruhový dichroismus pouze nepřímo zaznamená správnou třídimenzionální strukturu na základě informace sekundárních strukturních prvků, realizovatelné cesty imunitního systému:

V podstatě se zde uvádějí tři k uvedení důležitých epitopů do tradiční podjednotková vakcinace polypeptidovými antigeny, aplikace geneticky modifikované živé vakciny a vakcinace nukleové kyseliny. Tyto tři možnosti se diskutují jednotlivě v následujícím textu.

Polypeptidová vakcinace

Tento způsob znamená aplikovat do odpovídajícího živého organismu imunologicky účinné množství alespoň jednoho prvního analogu a pokud je to důležité, i imunologicky účinné množství alespoň jednoho druhého analogu. Je vhodné, když se alespoň jeden první a (nebo) druhý analog (analogy) formulují společně s farmaceuticky a imunologicky vhodným nosičem a (nebo) pojivém a libovolně s adjuvans.

Jestliže se efektivně aplikuje analog do živočišného imunitního systému, následná formulace polypeptidu probíhá podle obecně známých principů.

Příprava vakcin, které obsahují peptidové sekvence jako (vakcinace-a.doc)

ΦΦ ΦΦ φ φ « φ » ·* ·Φ·Φ

ΦΦ ·· • · · · aktivní složky, je v odborných kruzích velmi dobře známá, jak potvrzují US patenty 4 608 251; 6 601 903; 4 599 231;

599 230; 4 596 792 a 4 578 770, které se všechny citují v tomto vynálezu. Typicky se tyto vakciny připravují k injekční aplikaci buď jako roztoky nebo jako suspenze, případně jako pevná látka rozpustná do roztoku nebo suspenze. Může se připravit také emulze. Aktivní imunogenní složka se často mísí s farmaceuticky vhodným základem, který je kompatibilní s aktivní složkou. Vhodný základem jsou například voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol a kombinace těchto látek.' Jestliže se to vyžaduje, vakcina může navíc obsahovat malé množství pomocných látek, jako jsou zvlhčovadla a emulgátory, pH pufry nebo adjuvans podporující účinek vakciny (viz detailní diskuse o adjuvans dále).

Vakciny se komerčně aplikují parenterálně, injekčně (například subkutánně, intradermálně, subdermálně nebo intramuskulárně). Další vhodnou aplikační formou jsou čípky a v některých případech orální, bukální, podjazyková, intraperitoneální, intravaginální, anální a intralebeční formy. Tradiční pojivá a nosiče k výrobě čípků obsahují například polyalkalen glykoly nebo triglyceridy; čípky se pak připravují ze směsi obsahující 0,5 až 10 % aktivní složky, optimální je 1 - 2 %. Orální forma obsahuje normální farmaceutické látky, jako například farmaceutický manit, laktózu, škrob, stearat hořečnatý, sacharin sodný, celulózu, uhličitan hořečnatý a jiné. Tyto látky se používají ve formě roztoků, suspenzí, tablet, pilulek, kapslí, dlouho účinkujících látek a prášků a obsahují

10-95 % aktivní složky, optimální je 25-70 %. Pro tvorbu orální formy je zajímavým partnerem cholera toxin (a také možným konjugačním partnerem). Polypeptidy se formují do (vakcinace-a.doc)

0 ·		··		··	99
• 0	•	•	9 · ♦	9 ♦	9 9
•		··	* · ·	• ·	9
	•	• ·		• · ·	9
•	c	•	• · · ·	• ·	9
··«·		··	··	99	9999

vakciny v neutrální formě nebo jako sole. Farmaceuticky vhodné sole obsahují kyselou složku (tvořenou volnými aminoskupinami peptidů) a jsou tvořeny z anorganických kyselin, jako například chlorovodíkové nebo fosforečné, nebo organických kyselin, jako octové, šťavelové, vinné, mandlové a jiných. Sole obsahující volné karboxylové kyseliny se také odvozují od anorganických bází, například hydroxidu sodného, draselného, amonného, vápenatého nebo železitého, a také od organických bází, jako jsou isopropylamin, trimethylamin, 2-ethylamino ethanol, histidin, prokain a jiné.

Vakciny se aplikují způsobem, který odpovídá dávkování, a v terapeuticky a imunologicky účinném množství. Velikost aplikované dávky závisí na léčeném subjektu, včetně například schopnosti individuálního imunitního systému

proj evit	imunitní odezvu	nebo	včetně
ochrany.	Vhodné dávkování	se	pohybuj e
mikrogramů	aktivní složky	na	vakcinaci
rozsah okolo 0,1 až 2000	μς	(dokonce
množství,	1-10 mg), tedy	0,5	až 1000 μρ,

v r

se lépe 1 až 500 μς, až

100 preferovaný je stupně požadované rozsahu stovek zvažuje vyšší speciálně v rozmezí 10 aplikaci a nosné dávky při vstupní aplikaci a také μς. Vhodný různý, ale je následném očkování režim pro vstupní lze jej odhadnout nebo jiném způsobu aplikace.

Způsob aplikace může být různě široký a lze použít jakákoliv konvenční metoda aplikace vakciny. Patří sem orální aplikace na fyziologicky vhodné pevné bázi nebo v disperzi, parenterální injekční aplikace a jiné. Dávkování vakciny závisí na aplikační cestě a mění se s ohledem na stáří vakcinované osoby a tvorbu antigenů.

Některé polypeptidy vakciny jsou dostatečně imunogenní ve (vakcinace-a.doc)

	··	··	··	····
	• ·	• ·	• ·	•	• ·	• ·
40 -	• φ	·· · · • · · · ·	• •	• 9 • · ·	• •
	•	• ·	c ·	• ·	• ·	•
	····	·«	··	··	··	····

vakcině, ale u jiných se zvýší imunitní odezva, jestliže vakcina dále obsahuje pomocnou látku. Je výhodné použít takovou látku, která usnadňuje rozbití vlastní odolnosti ve prospěch autoprotilátek.

Jsou známé různé metody dosažení pomocného efektu ve vakcině. Obecné principy a metody se detailně popisují v „The Theory and Practical Application of Adjuvants, Duncan

E.S. Stewart-Tull (red.), Jon Wiley & Sons, Ltd., 1995, ISBN 0-471-95170-6, a také v „Vaccines: New Generation Immunological Adjuvats, Gregoriadis G. et al. (red.), Plenům Press, New York, 1995, ISBN 0-306-45283-9; obě tyto publikace se citují v předkládaném vynálezu.

Preferovaná adjuvans usnadňují příjem vakcinových molekul pomocí APC, jako jsou dendritické buňky, a jejich aktivaci. Ze skupiny imunogenních adjuvans lze vybrat neomezené množství příkladů; imunomodulační látky jako toxin, cytokin a mykobakteriální deriváty; olejovitá struktura; polymer; látka formující micely; saponin; matrix imunostimulačního komplexu (ISCOM matrix) ; částice; DDA; látky na bázi hliníku; DNA adjuvans; γ-inulin a zapouzdřovadla. Obecně je známo, že výše uvedená fakta týkající se sloučenin a činidel použitelných jako první, druhý a třetí podíl analogů také vypovídají o jejich vyžití jako adjuvans ve vakcinách tohoto vynálezu.

Aplikace adjuvans zahrnuje použiti alumosloučenin jako je hydroxid hlinitý a fosforečnan hlinitý (alum), běžně používané jako 0,05 až 0,1 procentní roztok v pufrujícím šalinu, směs se syntetickými polymery cukrů (např. Carbopol®) používanými v 0,25 procentním roztoku, agregaci proteinu ve vakcině zahříváním při teplotě 70 - 101 °C po (vakcinace-a.doc) dobu od 30 sekund do 2 minut, a také agregaci vzájemně spojených činidel. Také se může využít agregace reaktivací protilátkami upravujícími pepsin (Fab fragmenty) na albumin, směsi s bakteriálními buňkami jako jsou C. parvum nebo endoxiny, případně liposacharidové složky gramnegativních bakterií, emulze ve fyziologicky vhodném olejovitém nosiči, jako je manid monooleat (Aracel A) nebo emulze s 20% roztokem perfluorokarbonu (Fluosol-DA) používaným jako bloková náhražka. Také se preferují olejovité směsi na bázi skvalenu a IFA.

Podle tohoto vynálezu jsou zajímavými kandidáty na adjuvans DDA (dimethyldioktadecylamonium bromid), jako DDA a γ-inulin, ale také Freundovy úplné a neúplné adjuvans, stejně jako saponiny z druhu Quillaja, jako QuilA a QS21. Dalšími možnými jsou monofosforyl lipid A (MPL) a výše uvedené C3 a C3d.

Lipozómové struktury jsou známé tím, že zefektivňuji adjuvans, proto se lipozómové adjuvans v tomto vynálezu preferuj i.

Dalšími přednostně vybíranými adjuvans v tomto vynálezu jsou matrix imunostimulačních komplexů (ISCOM® matrix) především proto, že jsou schopné zvyšovat působení MHC typu II prostřednictvím APC. ISCOM® se skládá z libovolně dělených saponinů (triterpenoidů) z Quillaja saponaria, cholesterolu a fosfolipidu. Po smíchání s imunogenním proteinem vznikají částice známé jako ISCOM částice, kde saponin tvoří 60-70 % hmotnostních, cholesterol a fosfolipid 10-15 % hmotnostních a protein 10-15 % hmostnostních. Detaily týkající se složení a využití imunostimulačních komplexů lze nalézt (vakcinace-a.doc) • · • · · · • · · · · · t ···· ··· ··· ·· *

- 42 ···· ·· ·· ·· ·· ···· v již zmíněných publikacích týkajících se adjuvans, ale také v Morein B. et al.: Clin Immunother. 3 (1995), 461-475, nebo v Bar I.G. and Mitchell G.F.: Immunol. And Cell Biol. 74 (1996), 8-25 (obě publikace se citují v předkládaném vynálezu), kde jsou užitečné instrukce k přípravě úplných imunostimulačních komplexů.

Další velmi zajímavou (a tedy výhodnou) možností, jak dosáhnout účinného adjuvans, je použít techniku popsanou v Gosselin et al., 1992 (je citován v tomto vynálezu). Zkráceně, působení významného antigenů (jako je antigen tohoto vynálezu) se zvýší konjugací antigenů s protilátkou (nebo jejím fragmentem vázaným k antigenů) proti Fcy receptorům nebo monocyttům/makrofágům.Speciálně vazby mezi antigenem a anti- FcyRI jsou příkladem zvyšování imunogenicity za účelem vakcinace.

Další možností je použití cílených a imunitu formujících látek (tj . cytokinů), výše uváděných v souvislosti s kandidáty na první a druhé podíly modifikovaných analogů. Tady se mohou použít také syntetická indukovadla cytokinů, jako .póly I: C.

Vhodné mykobakteriální deriváty jsou ze skupiny muramyldipeptid, kompletní Freundovo adjuvans, RIBI a diester trihalózy, jako TDM a TDE.

Vhodnými k imunitě směrovanými adjuvans jsou látky ze skupiny tvořené CD40 ligandem a CD40 protilátkami nebo

specificky vázanými výše), manózou, Fab	fragmenty fragmentem	těchto látek a CTLA-4.	(srovnej	diskusi
Vhodná polymerni	adjuvans	jsou ze	skupiny	tvořené

(vakcinace-a.doc)

uhlovodíky, jako je dextran, PEG, škrob, manan a manóza, plastickým polymerem a latexem, jako jsou latexové kuličky.

Ještě jinou cestou modulace imunitní odezvy je začlenit imunogen (libovolně dohromady s adjuvans a farmaceuticky využitelnými nosiči a pojivý) do „virtuální lymfatické uzliny (VLN) (soukromý lékařský přístroj vyvinutý v ImmunoTherapy, lne., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (tenký tubulární přístroj) napodobuje strukturu a funkci lymfatické uzliny. Vložením VLN pod kůži se vytvoří lokální sterilní zánět s prudkým nárůstem cytokinů a chemokinů. T- a B-buňky , stejně jako APC rychle reagují na signalizované nebezpečí, přestěhují se do zánětlivého místa a akumulují v něm porézní matrix VLN. Ukázalo se, že nezbytná dávka antigenů potřebná ke zvýšení imunitní odezvy vůči antigenů se při použití VLN sníží a že imunitní ochrana prokázaná při vakcinaci převyšuje konvenční imunizaci s použitím RIBI jako adjuvans. Technologie se stručně popisuje v Gelber C. et al.: „Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Smáli Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node, ve sborníku abstraktů „From the Laboratory to the Clinic, 12.-15. října 1998, Seascape resort, Aptos, Kalifornie.

Poslední výzkumy ukázaly, že spolupodávání H2 agonistů zvyšuje životaschopnost přírodních smrtících buněk a CTL v nádoru. Proto se zvažuje přidávání H2 agonistů jako adjuvans v metodách tohoto vynálezu.

Předpokládá se, že se vakcina bude aplikovat alespoň jednou za rok, takže 1, 2, 3, 4, 5, 6krát a 12krát ročně. Přesněji, (vakcinace-a.doc)

Φ

4

Φ · 4 · · Φ 4 « · « Φ * · · ··· · Φ « φ · Φ

- 44 ΦΦΦΦ ΦΦ ·· φ» «4 ΦΦΦΦ předpokládá se aplikace 1 -12 krát za rok, takže 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 nebo 12krát podle individuální potřeby. Především se ukázalo, že imunitní paměť vyvolaná preferovanými autovakcinami podle tohoto vynálezu není stálá, a proto seimunitní systém musí periodicky pobízet analogy.

Díky genetické variabilitě může imunitní systém různých jedinců reagovat na různé druhy téhož polypeptidu různě. Proto vakcina podle tohoto vynálezu obsahuje několik rozdílných polypeptidů, aby se zvýšila imunitní odezva (srovnej také výše uvedenou diskusi týkající se volby vstupu cizího T-buněčného epitopu). Vakcina může obsahovat dva nebo více polypeptidů, z nichž všechny se již definovaly výše.

Vakciny mohou následně obsahovat 3-20 různých modifikovaných i nemodifikovaných polypeptidů, jako například 3-10 polypeptidů. Běžně je však snaha udržet počet peptidů na minimu, takže na 1 nebo 2 peptidech.

Živě vakciny

Druhou alternativou efektivního působení na imunitní systém je použití technologie živé vakciny. Při živé vakcinaci se účinek na imunitní systém vyvolá podáním nepatogenního organismu, který se transformuje fragmentem nukleové kyseliny kódujícím nezbytnou epitopickou oblast nebo kompletní první a (nebo) druhý analog, do živočišného organismu. Alternativně se mikroorganismus transformuje bacilonosičem včleněným jako fragment nukleové kyseliny. Nepatogenním organismem může být jakýkoliv vhodný oslabený bakteriální druh (oslabení ve smyslu vyčlenění určité části nebo odstranění patogenních produktů technologií využívající rekombinantni DNA), např. Mycobacterium hovíš BCG., (vakcinace-a.doc) nepatogenni Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella atd. Články zabývající se přípravou známých živých vakcin jsou například Saliou P. : Rev. Prát. 45 (1995), 1492-1496 a Walker P.D.: Vaccine 10 (1992), 977-990, přičemž oba se citují v předkládaném vynálezu. Detaily týkající se fragmentů nukleových kyselin a bacilonosičů používaných v tomto vynálezu se diskutují dále.

Pokud jde o polypeptidovou vakcinu, T_H epitop a (nebo) první a (nebo) druhý a (nebo) třetí podíl, pokud jsou přítomné, mají formu fúzních partnerů aminokyselinových sekvencí z buněčného polypeptidového antigenu. Alternativně k bakteriálním živým vakcinám, fragment nukleové kyseliny (diskutuje se dále) se vřadí do nezhoubného virového vakcinového bacilonosiče. Jednou z možností je neštovicový virus, jako např. virus kravských neštovic MVA (modifikovaný virus kravských neštovic) , neštovice kanárů, ptactva, kuřat atd. Jinak se může použít varianta viru oparu prostého.

Normálně se nepatogenni mikroorganismy nebo viry aplikuji živočichům pouze jednou, ale v některých případech je nezbytná více než jedna aplikace za život.

se také může

Mikroorganismus kyselinou (kyselinami) obsahující druhý a (nebo) třetí podíl, transformovat nukleovou oblasti kódující první, například ve formě imunomodulačních látek popsaných výše, např.

cytokinů (diskutovaných jako vhodná adjuvans). Nejlepší je, když kódovaná oblast pro analog a kódovaná oblast pro imunomodulátor mají rozdílný otevřený záznam nebo alespoň jsou řízené rozdílnými promotory. Tím je vyloučeno, aby se analog nebo epitopy produkovaly jako fúzní partneři do imunomodulátoru. Alternativně se jako transformační činidla (vakcinace-a.doc) mohou použit dva odlišné nukleotidové fragmenty.

Vakcinace nukleové kyseliny

Jako alternativa ke klasické aplikaci vakciny peptidu nabízí technologie vakcinace nukleové na bázi kyseliny (známá také jako „imunizace nukleovou kyselinou, „genetická imunizace, „genová imunizace a „DNA vakcinace) řadu atraktivních rysů.

Za prvé, na rozdíl od tradičního vakcinačního přístupu, vakcinace nukleovou kyselinou nevyžaduje zdroj spotřebovávající velké množství připravovaných imunogenních činidel (například ve formě průmyslově fermentovaných mikroorganismů produkujících analogy nezbytné k polypeptidové vakcinaci) . Navíc není potřeba přistroj na čištění a přeskládání struktur imunogenu. A nakonec, protože vakcinace nukleovou kyselinou závisí na biochemické výbavě vakcinovaného jedince, lze předpokládat optimální posttranslační působení produktu vložené nukleové kyseliny; to je především důležité v případě autovakcinace, protože, jak se uvádí výše, podstatná část původních B-buněčných epitopů se uchovává v analogách extracelulárních odkrytých polypeptidových sekvencí, a protože B-buněčné epitopy se skládají z částí libovolných (bio)molekul (např. uhlovodíků, lipidů, proteinů atd) . Proto jsou přírodní modely glykosylace a lipidace imunogenu velmi důležité pro celkovou imunogenicitu a jsou nej jistějším hostitelem produkujícím imunogen.

Takže důležitým bodem předkládané metody vzvólání účinku tím, že se do APC vloží „in vivo alespoň jeden fragment nukleové kyseliny, který kóduje a představuje alespoň jeden CTL epitop a (nebo) alespoň jeden B-buněčný epitop a alespoň (vakcinace-a.doc) jeden první cizí T_H epitop (altenativně se aplikují alespoň dva rozdílné fragmenty nukleové kyseliny, kde jeden kóduje alespoň jeden CTL epitop a druhý alespoň jeden cizí T_H epitop). Preferuje se použití fragmentu nukleové kyseliny, který kóduje a představuje výše diskutovaný první analog. Jestliže je první analog vybaven již detailně popsanými T_H epitopy a (nebo) prvním a (nebo) druhým a (nebo) třetím podílem, pak jsou přítomné ve formě fúzních partnerů aminokyselinové sekvence buněčného polypeptidového antigenu, přičemž fúzni skladba se kóduje fragmentem nukleové kyseliny.

Z hlediska tradičního přístupu vakcinace nukleovou kyselinou se kombinuje se vstupem alespoň jednoho fragmentu nukleové kyseliny kódujícího a představujícího druhý analog „in vivo do APC. Úvahy týkající se prvního, druhého a třetího podílu a T_H epitopů se vztahují i na tento případ.

V této souvislosti je preferovanou vřazenou nukleovou kyselinou DNA, která může být ve formě prosté DNA, DNA s nabitými nebo elektroneutrálními lipidy, DNA tvořené v liposomech, DNA . zahrnující virový bacilonosič, DNA s proteinem nebo polypeptidem usnadňujícím infikaci, DNA se směrovým proteinem nebo polypeptidem, DNA s činidly srážejícími vápník, DNA spojené s molekulou inertního nosiče a DNA s adjuvans. Ukázalo se, že prakticky všechny možnosti použití adjuvans pro tradiční složení vakciny jsou použitelné i pro DNA vakciny. Takže všechny závěry vedoucí k použití adjuvans ve vakcinách na bázi polypeptidu se uplatňují i na využití v technologii vakcinace nukleovou kyselinou. To samé platí pro jiné úvahy týkající se složení, formy a způsobu aplikace vakciny.

(vakcinace-a.doc)

- 48 Zvlášť vhodným typem složeni vakciny nukleové kyseliny jsou mikročástice obsahující DNA. Vhodné mikročástice se popisují v patentu WO 98/31398.

Navíc, nukleová kyselina (kyseliny) imunizační činidlo může obsahovat jako druhý a (nebo) třetí podíl, imunomodulačních oblasti kódující například ve první formě látek popsaných výše jako cytokiny (uvažované jako vhodná adjuvans).

Preferuj e se, jestliže pro analog a kóduj ící oblast pro kódující oblast imunomodulátor mají rozdílný otevřený záznam jsou řízené rozdílnými promotory. Tím je vyloučeno, aby se nebo alespoň analog nebo epitopy produkovaly jako fúzní partneři do imunomodulátoru. Alternativně se jako transformační činidla mohou použít dva odlišné nukleotidová fragmenty, ale tato varianta není příliš rozšířená vzhledem k výhodě obou kódujících oblastí obsažených v jedné a té samé molekule.

Za normálních okolností se nukleová kyselina vakciny vřazuje ve formě bacilonosiče řízeného virovým promotorem. Detailnější diskuse týkající se bacilonosičů používaných v tomto vynálezu se uvádí dále. Podrobnější závěry týkající se formy a použití vakcin nukleových kyselin jsou dostupné např. v Donnelly J.J. et al: Annu. Rev. Immunol. 15 (1997), 6187-648 a Donnelly J.J. et al: Life Sciences 60 (1997), 163-172. Oba tyto odkazy se citují v předkládaném vynálezu.

Důležitou část tohoto vynálezu představuje nová metoda třídění odpovídajících imunogenních analogů buněčného polypeptidového antigenů, který je slabě imunogenní nebo neimunogenní u živočichů, přičemž imunogenní analog je schopný v živočišném organismu indukovat odezvu CTL proti buňkám zobrazujícím MHC molekulu typu I vázanou na epitop (vakcinace-a.doc) • · buněčného polypeptidového antigenu. Tato metoda zahrnuje následující kroky:

a) identifikaci alespoň jedné subsekvence aminokyselinové sekvence buněčného polypeptidového antigenu, kde příslušná subsekvence neobsahuje známé nebo předpokládané CTL epitopy,

b) přípravu alespoň jednoho domnělého imunogenního analogu buněčného polypeptidového antigenu vložením do aminokyselinové sekvence buněčného polypeptidového antigenu alespoň jednoho T_H cizího epitopu v pploze alespoň jedné subsekvence určené v bodě a) a

c) výběr toho analogu (těch analogů) připraveného v bodě b) , u nějž se ověřila schopnost indukce CTL odezvy v živočišném organismu.

Alternativně výše vybrané metoda zahrnuje přípravu fragmentu nukleové kyseliny pro vakcinační účely. V takové situaci se požaduje, aby kódovaný peptid obsahoval alespoň jeden T_H epitop.

Jestliže je analog odvozený od antigenu nechráněnému vůči extracelulární oblasti, je lepší, když sekvence určená v kroku a) dále neobsahuje cysteinové zbytky, nebo případně, když T_H epitop vložený v kroku b) nemění podstatně charakter cysteinových zbytků. Tento přístup usnadňuje zachování prostoru B-buněčných epitopů ve výsledné struktuře, která je podobná B-buněčným epitopům ve slabém buněčném polypeptidovém antigenu.

Ze stejných důvodů se preferuje, když subsekvence určená v bodu a) dále neobsahuje známá nebo předpokládaná glykosylační místa, nebo případně, když T_H epitop vložený v kroku b) nemění podstatně glykosylační charakter.

(vakcinace-a.doc)

V oslabeni buněčné polypeptidové antigeny uplatňují nežádoucí patologické účinky. Očekává se, že se tyto účinky neobjeví ve vakcinační stavbě, a proto je lepší, když subsekvence z bodu a) přispívá podstatnou měrou k patofyziologickému účinku buněčného polypeptidového antigenu a když vstup T_H epitopu v bodu b) redukuje nebo eliminuje zmíněný patofyziologický efekt. Příkladem je odstranění aktivního místa v enzymu, hormonu nebo cytokinu a jeho záměna s cizím T_H epitopem.

Dalším důležitým bodem je otázka imunologické vzájemné reaktivity polypeptidového produktu vakciny s jinými vlastními proteiny, které nesouvisejí s patologií. Této vzájemné reaktivity je lepší se vyvarovat, proto je z hlediska tohoto vynálezu důležité, aby subsekvence určená v bodu a) byla homologická s aminokyselinovou sekvencí rozdílného proteinového živočišného antigenu a aby vstup T_H epitopu v bodu b) homologii v podstatě odstranil.

V souvislosti s tím se aminokyselinové sekvence, které 1) se normálně neodkrývají směrem k extracelulární fázi a 2) mohou tvořit B-buněčné epitopy slabého buněčného poplypeptidového antigenu, se neudržují v analogu. Toho se dosáhne záměnou příslušných aminokyselinových sekvencí T_H epitopy, které netvoří B-buněčné epitopy, za úplného nebo částečného odstranění těchto sekvencí.

Na druhé straně se preferuje, když jakékoliv „pravé Bbuněčné epitopy slabého buněčného polypeptidového antigenu se z velké části uchovají, proto je v selektivní metodě důležité, aby se po vstupu cizího T_H epitopu podle bodu b) uchovala podstatná část B-buněčných epitopů buněčného (vakcinace-a.doc) polypeptidového antigenu. Je zvlášť vhodné, když si analog uchová celkovou terciární strukturu buněčného polypeptidového antigenu.

Příprava v bodu b) se provádí metodami molekulární biologie nebo syntézou peptidů v pevné nebo kapalné fázi. Kratší peptidy se převážně připravují běžnými technologiemi syntézy v pevné nebo kapalné fázi. Výhodou této technologie je možnost připravit polypeptidy a proteiny plné délky, proto je úkolem tohoto vynálezu i příprava dlouhých struktur syntenticky.

Po určení vhodných analogů výše uvedenou metodou je nezbytné připravit analog ve větší míře. Polypeptidy se připravují známými metodami.

Způsob na základě molekulární biologie zahrnuj e v prvním kroku přípravu transformované buňky tak, že se do bacilonosiče vřadí sekvence nukleové kyseliny kóduj ící analog, který transformuje vhodnou hostitelskou buňku bacilonosiče.

Dalším krokem je kultivace transformované buňky za podmínek umožňujících působení fragmentu nukleové kyseliny kódujícího analog buněčného antigenu a následné odebrání analogu y kultivační tekutiny nebo přímo z buněk (například ve formě lyzátu). Alternativně se analog může připravit rozsáhlou syntézou peptidů v pevné nebo kapalné fázi, viz výše.

Nakonec se produkt může podle zvolené hostitelské buňky nebo podle použité metody syntézy podrobit umělým posttranslačnim modifikacím. Těmi mohou být znovuposkládání známých schémat, zpracování pomocí enzymů (aby se dosáhlo glykosylace nebo odstranění nežádoucích fúzních partnerů), chemické (vakcinace-a.doc) • 4 ··· ♦ • · modifikace (opět je možná glykosylace) a konjugace, např. s tradičními nosiči.

Ukázalo se, že preferované analogy tohoto vynálezu (a také důležité analogy používané v příslušných metodách) zahrnují modifikace dávající polypeptidy sekvenčně identickými alespoň ze 70 % s polypeptidovým antigenem nebo s jeho subsekvencí délky alespoň 10 aminokyselin. Lepší je vyšší

sekvenční identita,

například alespoň 75 % nebo dokonce 80

nebo i 85 %. Sekvenční identita pro proteiny a nukleové kyseliny se spočítá jako (N_ref-N_dif) *100/N_ref, kde N_dif je celkový počet neidentických zbytků ve dvou uspořádaných sekvencích a N_ref je počet zbytků v jedné ze sekvencí. Proto DNA sekvence AGTCAGTC je ze 75 % sekvenčně identická se sekvencí AATCAATC (N_dif=2 a N_ref=8) .

Příklad specifických úkolů pro metodu předkládaného vynálezu

Jak již bylo

řečeno, nejvýznamnějšimi nádorovými

antigeny jsou slabé buněčné polypeptidové antigeny.V následující tabulce se uvádí seznam těchto látek, i když rozhodně není úplný.

Antigen	Odkazy
5-oí reduktáza	Délos, S., Carsol, J.L., Fina, F., Raynaud, J.P., Martin, P.M.: 5alphareductase and 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase expression in epithelial cells from hyperplastic and malignant human prostatě. Int. J. Cancer, Mar 16, 75:6 (1998), 840-846.

(vakcinace-a.doc)

	4« 4* 44 4444 44 44 4444 44 4 4»44 r ··♦······ · 4 4 4444 444 • •44 44 ♦· ·· »· 4444
a -fetoprotein	Esteban, C., Terrier, P., Frayssinet, C., Uriel, J. : Expression of the a fetoprotein gene in human breast cancer. Tumour. Biol., 17:5 (1996), 2999-305.
AM-1	Harada, Y. , Ohuchi, N., Masuko, T., Funaki, Y., Moři, S., Satomi, S., Hasimoto, Y.: Characterization of a new breast cancer-associated antigen and its relationship to MUC1 and TAG72 antigens. Tohoku J. Exp. Med., Nov 180:3 (1996), 273-288.
APC	Dihlmann, S., Amler, L.C., Schwab, M., Wenzel, A.: Variations in the expression of the adenomatous polyposis coli (APC) tumor suppressor gene in human cancer cell lineš of different tissue origin. Oncol. Res., 9:3 (1997), 119-127.
APRÍL	L.E., Sordat, B., Rimoldi, D., Tschopp, J. : APRÍL, a new ligand of the tumor necrosos factor family, stimulates tumor cell growth. J. Exp. Med., Sep 21, 188:6 (1998), 1185- 1190.
BAGE	Boel, P., Wildmann, C., Sensi, M.L., Brasseur, R., Renauld, J.C., Coulie, P.,. Boon, T and Van der Bruggen, P. : BAGE: a new gene encoding an antigen recognized on human melanomas by cytolytic lymphocytes. Immunity, 2 (1995), 167-175.

(vakcinace-a.doc)

Η ♦♦ 4444 44 ·« • 44444 · · · · · • 44 *44 4 4 4

44 4 4 4 4 444

4444 44 44 44 44 4444 β-katenin

Bcl2

Bcr-abl (b3a2)

CA-125

CASP-8/FLICE

Hugh, TJ., Dillon, S.A., 0'Dowd, G., Getty, B., Pignatelli, M.,Poston, G.J., Kinsela, A.R.: beta-catenin expression in primary and metastatic colorectal carcinoma. Int. J. Cancer, Aug 12, 82:4 (1999), 504-511.

Koty, P.P., Zhang, H., Levitt, M.L.: Antisense bcl-2 treatment increases programmed cell death in non-small cell lung cancer cell lineš. Lung Cancer, Feb 23:2 (1999), 115-127.

Verfaillie, C.M., Bhatia, R., Miller, W., Mortari, F., Roy, V., Burger, S., Mc Cullough, J. , Stieglbauer, K. , Dewald, G.,Heimfeld, S., Miller, J.S., Mc Glave, P.B.: BCR/ABL-negative promitive progenitors suitable for transplantation can be selected from the marrow of most early-chronic phase but not acceleratedphase chronic myelogenous leukemia patiens. Blood, Jun 1, 87:11 (1996), 4770-4779.

Bašt, R.C, Jr., Xu, F.J., Yu Y.H., Barnhill, S., Zhang, Z., Mills, G.B.: CA 125: the past and the future. Int. J. Biol. Markers, Oct-Dec 13:4 (1998), 179187 .

Mandruzzato, S., Brasseur, F., Andry, G., Boon, T., van der Bruggen, P.: A CASP-8 mutation recognized by cytolytic T lymphocytes on a human head and neck carcinoma. J. Exp. Med., Aug 29, 186:5 (1997), 785-793.

··«·

Katepsiny

CD19

Thomssen, C., Schmitt, M., Goretzki, L., Oppelt, P., Pache, L., Dettmar, P., Jánicke, F., Graeff, H. : Prognostic value of the cysteine proteases cathepsins B and cathepsin L in human breast cancer. Clin. Cancer Res., Jul 1:7 (1995), 741-746.

Scheuermann, R.H., Racila, E.: CD19 antigen in leukemia and lymphoma diagnosis and immunotherapy. Leuk.

CD20

Lymphoma, Aug	18:5-6	(1995), 385-397.
Knox, S . J.,	Goris,	M.L. , Trisler, K. ,
Negrin, R.,	Davis,	T., Liles, T.M.,
Grillo-López,	A., Chinn, P., Varns, C.,

CD21

CD23

Ning, S.C., Fowler, S., Deb, N., Becker, Μ. , Marquez, C., Levý, R. : Yttrium-90labeled anti-CD20 monoclonal antibody therapy of recurrent B-cell lymphoma.

Clin. Cancer res., Mar 2:3 (1996), 457470.

Shubinsky, G., Schlesinger, Μ. , Polliack, A. , Rabinowitz, R. : Pathways controlling the expression of surface CD21 (CR2) and CD23 (Fc (epsilon)IIR) proteins in human malignant B cells. Leuk. Lymphoma, May 25:5-6 (1997), 521530.

Shubinsky, G., Schlesinger, Μ., Polliack, A. , Rabinowitz, R. : Pathways controlling the expression of surface CD21 (CR2) and CD23 (Fc (epsilon) IIR) proteins in human malignant B cells.

*· ·φ ·· Φ··· φφ φφ • · ♦ · φ · » φφφφ • ·· φφφ · φ » • φ φ φ φ w φ*·φ φ • φφ φφφφ φφφ ···· ·· φφ φφ φ> φφφφ

CD22

Leuk. Lymphoma, May 25:5-6 (1997), 521530.

French, R.R., Penney, C.A., Browning,

A.C., Stirpe, F., George, A.J., Glennie,

CD33

M.J. : Delivery	of the	ribosome-
inactivating	protein,	gelonin,
tolymphoma cells	via CD22 and	CD38 using
bispecific antibodies. Br.	J. Cancer,
May 71:5 (1995),	986-994.
Nakase, K., Kita,	K., Shiku,	H., Tanaka,
I., Nasu, k. ,	Dohy, H. ,	Kyo, T. ,
Tsutani, H.,	Kamada, N.	: Myeloid

CD35

CD44

CD45 antigen, CD13,CD14, and/or CD33 expression is restricted to certain lymphoid neoplasms. Am. J. Clin. Pathol., Jun 105:6 (1996), 761-768.

Yamakawa, Μ., Yamada, K., Tsuge, T., Ohrui, H., Ogata, T., Dobashi, Μ., Imai, Y. : Protection of thyroid cancer cells by complement-regulatory factors. Cancer, Jun 1 73:11 (1994), 2808-2817. Naot, D., Sionov, R.V., Ish-Shalom, D. : CD44: structure, function, and association with the malignant process. Adv. Cancer Res., 71 (1997), 241-319. Buzzi, M., Lu, L., Lombardi, A.J. Jr., Posner, M.R., Brautigan, D.L., Fast,

L.D.,Frackelton,A.R.Jr.:Differentiationinduced changes in protein-tyrosin phosphatase activity and commensurate expression of CD45 in human leukemia cell lineš. Cancer Res., Jul 15, 52:14 (1992), 4027-4035.

9999 * * · * • ·« ·»

99

999999

9999

99

99

9 99

9 99

9999

99

9 9 9 *99

99

99

999999

CD46 Yamakawa, M., Yamada, K., Tsuge, Τ.,

Ohrui, Η., Ogata, Τ., Dobashi, Μ., Imai, Υ. : Protection of thyroid cancer cells by complement-regulatory factors.

	Cancer, Jun	1 73:11	(1994),	2808-2817.
CD5	Stein, R.,	Witz,	I.P. ,	Ovadia, J. ,
	Goldenberg,	D.M. , Yron, I. :	CD5+B cells

and naturally occurring autoantibodies in cancer patiens. Clin. Exp. Immunol., Sep 85:3 (1991), 418-423.

CD52 Ginaldi, L., De Martinis, Μ. , Matutes,

E., Farahat, N.,

Morilla, R., Dyer,

M.J., Catovsky, D. :

Levels of expression

CD55 (791Tgp72) of CD52 in normál cells:

and correlation therapeutic

Leuk. Res.,

Spendlove, responses

Feb 22:2 leukemic B and T with to (1998), in vivo

Campath-1H.

185-191.

L., Carmichael,

J.

and Durrant, L.G.:

Decay accelerating factor (CD55): A, target for cancer vaccine?

Cancer Res., 59 (1999), 22822286.

CD59

Jarvis,

G.A., Li, J., Hakulinen,

J.,

Brady, K.A., Nordling, S., Dahyia,

Meri, S.: Expression and function of the complement membrane attack complex inhibitor protectin (CD59) in human prostatě cancer. Int. J. Cancer, Jun 11, 71:6 (1997), 1049-1055.

Topalian, S.L., Rosenberg, S.A.: Cloning genes encoding MHC class II-restricted antigens: mutated CDC27 as a tumor

CDC27

Wang, R.F., Wang, X., Atwood, A.C.,

CDK4

CEA c-myc

Cox-2

DCC • ·

antigen. Science, May 21, 284:5418 (1999), 1351-1354.

Wolfel, T., Hauer, Μ. , Schneider, J., Serrano, Μ., Wolfel, C., Klehmann-Hieb, E., de Plaen, E.,Hankeln, T., Meyer zum Buschenfelde, K. , and Beach, D. : A pl6lNK4a-insensitive CDK4 mutant targeted by cytolytic T lymphocytes in a human melanoma. Science, Sep 1, 269:5228 (1995), 1281-1284.

Kass, E., Schlom, J., Thompson, J., Guadagni, F., Graziano, P., Greiner, J.W.: Induction of protective host immunity to carcinoembryonic antigen (CEA), a self-antigen in CEA transgenic mice, by immunizing with a recombinant vaccinia-CEA virus. Cancer Res., Feb 1, 59:3 (1999), 676-683.

Watson, P.H., Pon, R.T., Shiu, R.P.: Inhibition of c-myc expression by phpsphorothioate antisense oligonucleotide identifies a critical role for c-myc in the growth of human breast cancer. Cancer Res., Aug 1, 51:15, (1991), 3996-4000.

Tsujii, M. et al.: Cycloxygenase regulates antiogenesis induced by colon cancer cells. Cell, 93 (1998), 705-716.

Gotley, D.C., Reeder, J.A., Fawcett, J. , Walsh, M.D., Bates, P., Simmons, D.L., Antalis, T.M.: The deleted in colon cancer (DDC) gene is consistently expressed in colorectal cancers and metastases. Oncogene, Aug 15, 13:4 a· ·· ·· · ·· · ·<· ·♦ • · · · · · ♦ * · * ··· · · · · · * ·*···· · · · · · ····

DcR3

Pitti, R. et al.: Genomic amplification

Εβ / E7 of a decoy receptor for lung and colon cancer.

Steller,

M.A. ,

Baserga, papillomavirus

Fas ligand in

Nátuře,

396

Zou, Z., Schiller,

Transformation by

E6 and E7: role

J.T. , human of the insulin-like growth factor 1 receptor.

Cancer Res., Nov

1,

56:21 (1996),

5087-5091.

EGFR

Yang, X.D., Jia, X.C.,

Corvalan, J.R.,

Wang, P., Davis, C.G.,

Jakobovits, A. :

Eradication of established tumors by a fully human monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor without comcomitant chemotherapy. Cancer Res., (6), 1999, 1236-1243.

EMBP

Shiina,

H., Igawa, M., Ishibe, T.:

Ena78

Clinical study on estramustine binding protein

Prostatě,

Arenberg, (EMBP)

Sep 29:3 in human prostatě.

(1996), 169-176.

D.A. et al.: Epithelial neutrophil activating peptide (ENA-78) is an important angiogenic non-small cell lung cancer.

factor in

J. Clin.

Invest., 102 (1998), 465-472.

farsyl transferáza

Bjartell, A. , Neal,

D.E., Leung, H.Y.:

FGF8 over-expression in prostatě cancer

FGF8b a FGF8a

Dorkin, TJ., Robinson, M.C.,

Marsh, C., is associated with decreased patient • · • · · · « · • · ♦ « survival and persists in androgen • · · • ·· »·· · •o independent disease. Oncogene, Apr 29,

18:17 (1999), 2755-2761.

FLK-l/KDR

Fong, T. Annie, T. et	al.: SU5416 is a
potent and	selective	inhibitor	of the
vascular	endothelial	growth	factor
receptor	(Flk-1/KDR)	that	inhibits
tyrosine	kinase catalysis,	tumor
vacularizat	ion and growth of	multiple
tumor type.	Cancer Res	., 59 (1999), 99-

106.

Kys. listová

Dixon, K.H., Mulligan, T., Chung, K.N.,

Elwood, P.C., Cowan, K.H.: Effects of folate receptor expression following stable -transfection into wild type and methotrexatetransport deficient

ZRhuman breast cancer cells. J.

Biol.

Chem. , Nov25,267:33 (1992),24140-24147.

G250

Divgi, C.R., Bander, N.H.,

A.M. ,

0'Donoghue, J.A., Sgouros, G., Welt, S., Finn, R.D., Morrissey, F., Capitelli,

P., Williams, J.M., Deland, D., Nakhre, A., Oosterwijk, E., Gulec, S.,Graham, M.C., Larson, S.M., Old, L.J.: Phase

I/II radioimmunotherapy trial with iodine-131-labeled monoclonal antibody G250 in metastatic renal cell carcinoma.

Clin. Cancer Res., Nov 4:11 (1998),

2729-2739.

Skupina GAGE

De Backer, O., 10 others,Boon, T., van der Bruggen, P.: Characterization of the GAGE genes that are expressed in various human cancers and in normál testis.

· « ·

Cancer Res., Jul 1:59 (13) (1999), 31573165.

Gastrin 17

Watson, S.A., Michaeli, D., Grimes, S.,

Morris, T.M., Crosbee, D., Wilkinson,

M., Robinson, G., Robertson, J.F.,

Steele, R.J.,

Hardcastle, J.D.: Antigastrin antibodies raised by gastrimmune inhibit growth of the human colorectal tumour AP5. Int. J. Cancer, Apr 10, 61:2 (1995), 233-240.

Hormon uvolňující

Gastrin (Bombesin)

GD2 / GD3 / GM2

GnRH

GnTV

Wang, Q.J., Knezetic, J.A., Schally, A.V., Pour, P.M., Adrian, T.E.: Bombesin may stimulate proliferation of human pancreatic cancer cells through an autocrine pathway. Int. J. Cancer, Nov 15, 68:4 (1996), 528-534.

Wiesner, D.A., Sweeley, C.C.:

Circulating gangliosides of breastcancer patiens. Int. J. Cancer, Jan 27, 60:3 (1995), 294-299.

Bahk, J.Y., Hyun, J.S., Lee, H., Kim, M.O.,Cho, G.J., Lee, B.H., Choi, W.S.: Expression of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) and GnRH receptor mRNA in prostatě cancer cells and effect of GnRH on the proliferation of prostatě cancer cells. Urol. Res., 26:4 (998), 259-264. Hengstler, J.G., Arand, M., Herero, M.E.,Oesch, F.: Polymorphism of Nacetyltransferases, glutathione, Stransferases, microsomal epoxide hydrolase and sulfotransferases:

influence of cancer susceptibility.

* · • · ··· ·

GP1 gplOO / Pmel 17

Recent Results Cancer (1998),

47-85.

gWagner,

S.N. ,

Wagner,

C.,

Schulterwolter, T.,

Goos, M.:

Analysis of Pmel 17/gpl00 expression in primary human tissue specimens: implications for melanoma immunoand gene-therapy.

Cancer

Immunol.

Immunother., Jun (1997),

239-247.

gp-100-in4

Kirkin,

A.F.,

Dzhandzhugazyan,

K.,

Zeuthen,

Melanoma-associated antigens cytotoxic Tgpl5 lymphocytes. APMIS, Jul

106:7 (1998),

Maeurer.,

M. J.

New treatment options for patients with melanoma:

review of melanoma-derived

T-cell epitope-based peptide vaccines.

Melanoma

Res., Feb 6 (1), 1996, 11-24.

gp75 / TRP-1

Lewis, J.J., Houghton, A.N.: Definition of tumor antigens suitable for vaccine construction. Semin.

Cancer Biol., Dec

6:6 (1995) , 321-327.

hCG

Hoermann,

R. , Gerbes,

A.L., Spoettl, G. ,

Juungst,

D., Mann,

K. : Immunoreactive human chorionic gonadotropin and its free beta subunit in sérum and ascites of patiens with malignant

Res., Mar 15, 52:6 (1992), tumors. Cancer

1520-1524.

Heparanáza

Vlodavsky, I., Friedmann,

Y., Elkin, M.,

Aingorn, H., Atzmon, R. , Ishai-Michaeli,

R. , Bitan, Μ. , Pappo, O., Peretz, T.,

Her2 / neu

HMTV

Hsp7 O hTERT(telomeráza)

IGFR1 r ·

Michal, I., Spector,

Mammalian expression progression poznámky).

793-802 .

L.,

Pecker, I.:

heparanase:

gene cloning, and and function in tumor metastasis (viz

Nat.Med., Jul 5 : 7

Lewis, J.J., Houghton, A.N.: Definition of tumor antigens suitable cinstruction. Semin. Cancer

6:6 (1995), 321-327.

Kahl,

Wood, the for vaccine

Biol.,

Dec

J. , Read, N. G. :

putative human retrovirus associated

A.R. ,

Rhodes,

An evaluation of mammary tumour with peripheral blood monocytes. Br. J.

(1991), 534-540.

Jaatela, M. et al.:

itsanti-apoptotic function caspase-3-like proteases.

2, 17(21), 1998, 6124-6134.

Vonderheide, R.H.,

J.L. ,

Nadler, catalytic subunit tumor-associated

Hsp70 exerts downstream of

EMBO J., Nov

Hahn, W.C., Schultze,

L.M.:The telomerase is a widely expressed antigen recognized by cytotoxic T-lymphocytes. Immunity (1999), 673-679.

Ellis, M.J.

et al. : Insulin-like

June, growth factors in human breast cancer.

Breast

Cancer Res.

Treat., 52 (1998), 175-184.

Puri, R. K. :

Structure of

IL-13 receptor:

analysis of subunit composition in

IL-13R

Murata, T . ,

Obiri, N.I.

, Debinski, W. , cancer and immune cells.

Biochem.

Biophys. Res. Commun., Sep 8, 238:1 (1997), 90-94.

iNOS	Klotz, T.,	Bloch, W. ,	Volberg, C.,
	Engelmann,	U., Addicks,	K. : Selective
	expression	of inducible	nitric oxide
	synthase in	human prostatě carcinoma.
	Cancer, May	15, 82:10 (1998	), 1897-1903.
Ki 67	Gerdes, J.,	Schwab, U.,	Lemke, H. a
	Stein, H.:	Production	of a mouše

monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation. Int. J. Cancer, 31 (1983), 13-20.

KIAA0205

Gueguen, M., Patard, J.J., Gaugler, B.,

Brasseur, F., Renauld, J.C., Van Cangh,

P.J., Boon, T., Van den Eynde, B.J.: An antigen recognized by autologous CTLs on a human bladder carcinoma. J. Immunol.,

	Jun 15,	160:12 (1998),	6188-6194.
K-ras,H-ras,N-ras	Abrams,	S.I., Hand,	P.H., Tsang	K.Y. ,
	Schlom,	J. : Mutant	ras epitopes as
	targets	for cancer	vaccines.	Semin.
	Oncol.,	Feb 23:1 (1996	), 118-134.
KSA (CO17-1A)	Zhang,	S . , Zhang, H.	S . , Reuter,	V.E. ,
	Slovin,	S.F., Scher,	H.I., Livingston,
	P.O. :	Expression of	potential	target

antigens for immunotherapy on primary and matastatic prostatě cancers. Clin. Cancer Res., Feb 4:2 (1998), 295-302.

LDLR-FUT Caruso, M.G., Osella, A.R., Notarnicola,

Μ. , Berloco, P., Leo, S., Bonfiglio, C., Di Leo, A.: Prognostic value of low density lipoprotein receptor expression • · · · · • ·

Skupina MÁGE

Mammaglobin in colorectal carcinoma. Oncol. Rep.,

Jul-Aug 5:4 (1998), 927-930.

Marchand, M. et al.: Tumor regressions observed in patients with (MAGE1, MAGE3) metastatic melanoma treated with an antigenic peptide encoded by Gene MAGE-3 and presented by HLA-A1. Int. J. Cancer, Jan 18:80 (2), 1999, 219-230. Watson, M.A., Dintzis, S., Darrow, C.M., Voss, L.E., Di Persio, J., Jensen, R.,

Mapl7

Fleming,	T.P.: Mammaglobin	expression in
primary,	metastatic and	occult	breast
cancer.	Cancer Res., Jul 1,	59:13
(1999),	3028-3031.
Kocher,	0. , Cheresh, P.	, Lee,	S.W. :
Identification and		partial

Melan-A / MART-1

Mesothelin

MIC A/B characterization of a novel membraneassociated protein (MAP17) up-regulated in human carcinomas and modulating cell replication and tumor growth. Am. J. Pathol., Aug 149:2 (1996), 493-500.

Lewis, J.J., Houghton, A.N.: Definition of tumor antigens suitable for vaccine constru.ction . Semin. Cancer Biol., Dec 6: (1995), 321-327.

Chang, K. et al. : Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, Jan 9:93 (1), 1996, 136-140.

Groh, V., Steinle, A., Bauer, S. a Spies, T.: Recognition of stress-induced MHC molecules by intestinal epithelial *

MT-MMP,jako např.

MMP2, MMP3, MMP7 a MMP9

Moxl

Mucin jako např.

MUC-1, MUC-2,

MUC-3 a MUC-4

MUM1 gammadelta T cells. Science, 279 (1998), 1737-1740.

Sáto, H., Seiki, M. : Membrane-type matrix metalloproteinases in tumormetastasis (MT-MMPs). J. Biochem. (Tokyo), Feb 119 (2), 1996, 209-215.

Candia, A.F., Hu, J. , Crosby, J. , Lalley, P.A., Noden, D.,Nadeau, J.H.,

Wright, C.V.: Mox-1 and Mox-2 define a novel homeobox gene subfamily and are differentially expressed during early mesodermal patterning in mouše embryos.

Development, Dec 116:4 (1992), 11231136.

Lewis, J.J., Houghton, A.N.: Definition of tumor antigens suitable for vaccine construction. Semin. Cancer Biol., Dec 6:6 (1995), 321-327.

Kirkin,

A.F.,

Dzhandzhugazyan,

K.,

Zeuthen,

Melanomaassociated antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes. APMIS, Jul 106:7 (1998),

665-679.

NY-ESO-1

Jager, E. et al. : Simultaneous humoral

Osteonektin and cellular cancer-testis definition of leukocyte peptide (1998),

Graham,

J. S. , inunune response antigen human antigen epitopes. J.

265-270.

against histocompatibility (HLA)-A2-binding

J. D. , Balleine,

R. L. , Milliken,

Bilous, A.M.,

Ckarke,

C.L. :

ρ 15

Expression of osteonectin mRNA in human breast tumours is inversely correlated with oestrogen receptor content. Eur. J.

Cancer, Sep 33:10 (1997), 1654-1660.

Yoshida, S., Todoroki, T., Ichikawa, Y., Hanai, S., Suzuki, H., Hoři, M. , Fukao,

K., Miwa, M., Uchida, K. : Mutations of pl6Ink4/CDKN2 and pl5Ink4B/MTS2 genes in biliáry tract cancers. Cancer Res., Jul 1, 55:13 (1995), 2756-60.

Ρ170 / MDR1

Trock, B.J., Leonessa, F., Clarke, R. :

Multidrug resistance in breast cancer: a meta-analysis of MDRl/gpl70 expression and its possible functional significance.

J. Nati. Cancer Inst.,

Jul 2, 89:13 (1997), 917-931.

ρ53

Roth, J., Dittmer, D., Rea, D., Tartaglia, J., Paoletti, E., Levine, A.J.: p53 as a target for cancer vaccines: recombinant canarypox virus vector expressing p53 protéct mice against lethal tumor cell challenge. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, May 14, 93:10 (1996), 4781-4786.

ρ97 / melanotransferin

Furukawa, K.S., Furukawa, K. , Reál,

F.X., Old, L.J., Lloyd, K.O.: A unuque antigenic epitope of human melanoma is carried on the common melanoma glycoproteingp95/p97.

J. Exp. Med. , eb

ΡΑΙ-1

1, 169:2 (1989), 585-590.

Grondahl-Hansen, J. , Christensen, I.J.,

Rosenquist, C., Brunner, N., Mouridsen,

H.T., Dano, K., Blichert-Toft, M. : High • · ·♦ levels of urokinase-type plasminogen activator and its inhibitor PAI-1 in cytosolic extracts of breast carcinomas are associated with poor prognosis.

Cancer Res., Jun 1, 53:11 (1993), 25132521.

Vassbotn, F.S., Andersson, M., Westermark, B., Heldin, C. H., Ostman, A.: Reversion of autocrine

BDGF

Plasminogen transformation by a dominant negative platelet-derived growth factor mutant.

Mol. Cell Biol., Jul 13:7 (1993), 40664076.

(uPA) Naitoh, H., Eguchi, Y., Ueyama, H.,

Kodama, M., Hattori, T.: Localization of urokinase-type plasminogen activator

PRÁME

Probasin inhibitor-1, 2 plasminogen in colon cancer.

(1995),

Kirkin,

Zeuthen,

Jpn. J.

48-56.

A.F., antigens

Cancer Res. ,

Jan

86:1

Dzhandzhugazyan, recognized lymphocytes. APMIS,

665-679.

Matuo, Y., Nishi,

Yoshitake, Y.,

Localization of („probasin) in of

K.,

Melanoma-associated by

Jul

N.,

Kuřata, cytotoxic T

106:7 (1998),

Muguruma,

N., Wada,

Y·,

F. :

prostatic basic protein the rat prostates by use monoclonala antibody.

Biochem.

Biophys. Res. Commun., Jul

16, 130:1 (1985)

Progenipojetin PSA Sanda,

Hwang,

293-300.

M.G. ,

C.

Smith, D.C., Charles, L.G.,

Pienta, K.J., Schlom, J.,

	z.»-. z·.'··: f*:· : 69 z*:“:·: :♦ * ’ < *· ·' «««* ·* ♦· ·· *· ·**· Milenic,D., Panicali, D. , Montie, J.E.: Recombinant vaccinia - PSA (PROSTVAC) can induce a prostate-specific immune response in androgen-modulated human prostatě cancer. Urology, Feb 53:2 (1999), 260-266.
PSM	Kawakami, M., Nakayama, J.: Enhanced expression of prostate-specific membrane antigen gene in prostatě cancer as revealed by in šitu hybridization. Cancer Res., Jun 15, 57:12 (1997), 23212324 .
RAGE-1	Gaugler, B., 7 ostatních, Van den Eynde, B.J.: A new gene coding for an antigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on a human renal carcinoma. Immunogenetics, 44(5), 1996, 323-330.
Rb	Dosaka-Akita, H., Hu, S.X., Fujino, M. , Harada, M., Kinoshita, I., Xu, H.J., Kuzumaki, N., Kawakami, Y., Benedict, W.F.; Altered retinoblastoma protein expression in nonsmall cell lung cancer: its synergistic effects with altered ras and p53 protein status on prognosis. Cancer, Apr 1, 79:7(1997), 1329-1337.
RCAS1	Sonoda, K., Nakashima, M., Kaku, T., Kamura, T., Nakano, H., Watanabe, T.: A novel tumor-associated antigen expressed in human uterine and ovarian carcinomas. Cancer, Apr 15, 77(8), 1996, 1501-1509.
SART-1	Kikuchi M., Nakao, M., Inoue, Y., Matsunaga, K., Shichijo, S., Yamana, H., Itoh, K. : Identification of a SART-1-

• · derived peptide capable of inducing HLA-

A24-restricted and tumor-specific

cytotoxic T	lymphocytes. Int. (1999), 459-466.	J. Cancer,
May 5,	81:3
Skupina SSX genu Gure,	A.O.	, Ttiureci, 0. ,	Sahin,	u.,
Tsang,	S.,	Scanlan, M.J.,	Jáger,	E. ,
Knuth,	Ά. ,	Pfreundschuh, M.,	Old,	L. J. ,
Chen,	Y.T. :	SSX: a multigene	family	with

several members transcribed in normál testis and human cancer. Int. J. Cancer,

Sep 17, 72:6 (1997), 965-971.

STÁT 3

Bromberg, J. F.,

Wrzeszczynska,

M.H. ,

Devgan, G., Zhao, Y., Pestell,

R.G. ,

Albanese, C., Darnell, J.E. Jr. : Stat3 as an oncogene. Cell, Aug 6, 98(3),

1999, 295-303.

STn (skup, mucinu) Sandmaier, B.M., Oparin, D.V., Holmberg,

L.A., Reddish, M.A., macLean, G.D.,

TAG-72

Longenecker, B.M.: Evidence of a cellular immune response against sialylTn in breast and ovarian cancer patients after high-dose chemotherapy, stem cell rescue, and immunization with Theratope STn-KLH cancer vaccine. J. Immunother, Jan 22:1 (1999), 54-66.

Kuroki, M., Fernsten, P.D., Wunderlich,

D., Colcher, D. , Simpson, J.F., Poole,

D.J., Schlom, J.: Serological mapping of the TAG-72 tumor-associated antigen using 19 distinct monoclonal antibodies.

Cancer Res., Aug 15, 50:16 (1990), 48724879.

»·*· • ·

• 99

999

9·

TGF-α

TGF-β

Imanishi, K. , Yamaguchi, K., Suzuki, M., Honda, S., Yanaihara, N., Abe, K. : Production of transforming growth factor-alpha in human tumour cell lineš. Br. J. Cancer, May 59:5 (1989), 761-765. Picon, A., Gold, L.I., Wang, J. , Cohen, A., Frledman, E.: A subset of metastatic human colon cancers expresses elevated levels of transforming growth factor betal. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., Jun 7:6 (1998), 497-504.

Thymosin

Bao, L.,	Loda,	M.,	Janmey, P . A. ,
Stewart, R.	, Anand-Apte,	B., a Zetter,
B.R.: Thymosin	beta	15: a novel
regulátor	of	tumor	cell motility
upregulated	in	metastatic prostatě

cancer. Nátuře Medicine 2(12), 1996,

TNF- a

1322-1328.
Moradi, M.M.,	Carson, L.F.,	Weinberg,
B., Haney,	A. F. , Twiggs,	L.B. ,
Ramakrishnan,	S. : Sérum and	ascitic

TPA fluid levels of interleukin-1, interleukin-6 and tumor necrosos factoralpha in patiens with ovarian epithelial cancer. Cancer, Oct 15, 72:8 (1993), 2433-2440.

Maulard, C., Toubert, M.E., Chretien, Y., Delanian, S., Dufour, B., Housset,

M. : Sérum tisue polypeptide antigen (STPA) in bladder cancer as a tumor markér. A prospective study. Cancer, jan 15, 73:2 (1994), 394-398.

·*· ·

• · Φ* Φ ♦ · • ···

ΤΡΙ

Nishida, Y., Sumi, H.,

Mihara,

Athiol prothease inhibitor released f rom cultured human malignant melanoma cells.

Cancer Res.,

TRP-2

Parkhurst,

M.R. ,

Fitzgeald

E.B. ,

Southwood,

S., Sette, A., Rosenberg

S.A., Kawakami, Y. : Identification of a shared

HLA-A*0201-restricted epitope from the melanoma antigen tyrosinase-related protein 2 (TRP2).

Cancer Res., Nov

1, , 48954901.

Tyrosináza

Kirkin,

A.F.,

Dzhandzhugazyan,

Zeuthen,

Melanoma-associated antigens recognized by cytotoxic T lymphocytes. APMIS,

Jul

665-679.

VEGF

Hyodo, I., Doi,

T.,

Endo,

H. , Hosokawa,

Y. , Nishikawa,

Y-,

Tanimizu, M., Jinno,

K., Kotani, Y.:

Clinical significance of plasma vascular endothelial growth factor in gastrointestinal cancer. Eur.

	J. Cancer, Dec 34:13 (1998),	2041-2045.
ZAG	Sanchez, L.M., Chirino,	A.J. , Bjorkman,
	P.J.: Crystal structure	of	human ZAG, a
	fat-depleting factor	related to MHC
	molecules. Science, 19,	283	(5409),1999,
	1914-1919.
P16INK4	Quelle, D.E., Ashmun,	R.	A. , Hannon,
	G.J., Rehberger, P.A	• f	Trono, D.,
	Richter, K.H., Walker,	C.,	Beach, D. ,
	Sherr, C.J., Serrano,	M. :	Cloning and
	characterization of murine	pl6INK4a and

pl5INK4b genes. Oncogene, Aug 17, 11(4), • ♦ φ • « φ φ φ φ «

1995, 635-645.

Glutathion

S-transferáza

Hengstler, J.G., Arand, Μ. , Herrero,

M.E., Oesch, F.:

Polymorphisms of N-acetyltransferases, glutathione S-transferases, microsomal epoxide hydrolase ainfluence on cancer susceptibility. Recent Results Cancer

Res., 154 (1998), 47-85.

V následující části se podrobně popisuje řada specifických nádorových antigenů.

Pro prostatu specifický membránový antigen, PSM

V USA je rakovina prostaty druhou nejrozšířenější příčinou úmrtí následkem rakoviny (přibližně 40 000 ročně), a 200 000 pacientů ročně je diagnostikováno (Boring 1993). Asi každý jedenáctý muž onemocní rakovinou prostaty. Navíc přibližně u 40 - 60 % nemocných rakovinou prostaty se nakonec onemocnění rozšíří mimo oblast prostaty (Babaian 1994). Hlavním cílem předkládaného vynálezu je využití teraupeutické vakcinace jako doplňkové léčby k prostatě, aby se eliminovaly residuální nádorová tkáň a metastázy.

Některé patologické stavy se lokalizují v prostatické žláze, včetně benigního nádoru (BPH), infekce (prostatitis) a neoplazie (rakovina prostaty).

Biologická podstata rakoviny prostaty je různá. U některých pacientů zůstává objevený nádor latentním histologickým tumorem a nikdy nebude klinicky významný. U jiných pacientů ·· *♦· · nádor roste progresivně, metastázuje a zahubí pacienta v relativně krátké době (2-5 let).

Běžnou primární léčbou rakoviny prostaty je prostatektomie.

Vzhledem k rozsáhlému šíření rakovinných buněk se však většina pacientů s rakovinou prostaty neléčí lokálním chirurgickým zákrokem. Pacienti s neomezeným rozsahem onemocnění se nakonec léčí systémovou ablací androgenu, ale roční úmrtnost v důsledku rakoviny prostaty vůbec neklesla v průběhu 50 let od té doby, co se ablace anrogenu stala standardní terapií metastázující choroby.

PSM je membránový protein vysoce specifický pro prostatickou tkáň, jak benigní tak maligní, přesto se objevuje i v jiných tkáních, jako v ledvinové tkáni a ledvinovývh tumorech, tenkém střevě, mozku a nádorových neovaskulaturách. I když byla operace úspěšná, u pacientů se může teoreticky projevit PSM v reziduální nádorové tkáni prostaty nebo v metastázách vzniklých z tohoto nádoru. Při vyvolání silné CTL reakce a (nebo) silné polyklonální reakce proti PSM se předpokládá eliminace reziduální nádorové tkáně.

Je zajímavé, že po ztrátě androgenu při léčbě rakoviny prostaty se u pacientů následně zvýší výskyt PSM (Wright 1996). Proto je po tradiční terapii odstraňující androgen vhodná léčba zaměřená právě na PSM.

PSM byl poprvé určen v roce 1987 jako výsledek generování monoklonální protilátky 7E11-C5.3, použité proti izolované lidské prostatické rakovinné buňce LNCaP (Horoszewicz

1987). Protilátka rozpoznala jak normální tak maligní prostatický epitel a použila se v roce 1993 k přečištění a ·· »♦·· • ·

stanoveni aminokyselinové sekvence PSM proteinu a případně klonování genu (Israeli 1993).

PSM je typem II transmembránového glykoproteinu molekulové hmotnosti 84 kD jak se předpokládá z nukleotidové sekvence, zatímco u glykosilované verze je molekulová hmotnost 100 120 kD.Sekvence genu kódujícího PSM odkrývá předpokládanou membránovou oblast vázanou se třema ukotvenými zbytky cytosolickéhoargininu. Extracelulární část PSM tvoří 707 z celkových 750 aminokyselin proteinu, zatímco u cytoplazmatické oblasti se předpokládá délka 19 aminokyselin (Israeli 1993). Pro PSM specifická mRNA zachycená v prostatické nádorové tkáni indikuje, že nádorový antigen není nenormálně glykosilovaný protein, který je v případě Tn- nebo sTn- nádorových antigenů.

Celá délka PSM cDNA se infikuje do PSM negativní lidské prostatické rakovinné buňky PC-3 (Kahn 1994). Dále se cDNA v plné délce (2,65 kilobází) přepisuje a přeskládá in vitro (Kahn 1994) .

Později se ukázalo, že PSM má hydrolytickou aktivitu podobnou (NAALADase)

N-acylované , vlastně identické.

NAALADase α-vázané kyselé dipeptidáze tedy, že tyto dva proteiny jsou vázaná hydroláza je membránově nervového kde katabolizuj e acetylaspartyl glutamatergický systému, glutamátu signální proces. Ještě není

PSM nějakou významnou biologickou neuropeptid N(NAAG), ovlivnil aby známo, jestli má tato aktivita funkci.

Také je poměrně důležité předpovědět, zda by nežádoucí křížová reaktivita s jinými proteiny dostupná pro CTL nebo protilátky indikovala následnou léčbu autovakcinou ν*Φ ·

vyvolávající imunitní reakci specifickou na PSM. Ukázalo se, že část kódované oblasti PSM genu (pozice aminokyselin 418-567) má 54% homologii s lidským receptorem transferinu (Israeli 1993) . Také se nalezla úplná sekvence identická s enzymem NAALADasy (viz výše). Žádná funkčně důležitá podobnost s jinými známými peptidázami se neidentifikovala.

Homologie s receptorem tranferinu je velmi nízká a pokud možno se vyruší v některé strktuře navrhované v tomto vynálezu. Očekává se, že pozorovaná sekvence identitická s lidskou NAALADasou nebude překážkou pro PSM vakcinu, částečně díky schopnosti protilátek a CTL proniknout skrz hematoencefalickou bariéru. Vesměs tedy platí, že ani při skladbě nejvíce odpovídající PSM nelze očekávat v praxi znemožnění křížové reakce s jinými proteiny u pacientů.

Z dřívějších studií je zřejmé, že PSM se vyskytuje na většině prostatických nádorových buněk a testovaných metestázách pocházejících z prostaty. Dále, řada jiných testovaných nádorů, jako jsou karcinomy, sarkomy a melanomy různých tkání, stejně jako široká oblast neprostatických lidských nádorových buněk, se prokázaly jako PSM negativní.

Navíc i velmi mnoho jiných tkání se ukázalo být PSM negativní. Do této skupiny patří tlusté střevo, prsy, plíce, vaječníky, játra, močový měchýř, děloha, průdušnice, slezina, slinivka, jazyk, jícen, žaludek, štítná žláza a příštitná těliska, nadledviny, lymfatické uzliny, aorta, dutá žíla, pokožka, mléčná žláza a placenta. Metodou RT-PCR se však objevila existence PSM mRNA i u některých z uvedených tkání.

Ačkoliv se PSM především vyskytuje jako membrána vázající molekulu na prostatickou tkáň, malé množství PSM se zachytí i v séru nornálních jedinců a vyšší hladina pak u pacientů s rakovinou prostaty (Rochon 1994, Murphy 1995). Hladina cirkulující PSM u těchto pacientů pak umožňuje serologický monitoring účinků PSM vakciny.

Závěrem, na základě veškerých dostupných údajů, PSM je antigen s vysokou specificitou pro lidskou prostatickou tkáň a z ní pocházejících nádorů. To znamená, že u pacientů, kteří podstoupili prostatektomii, je PSM něco jako nádorově specifický vlastní antigen. Účinná PSM vakcina proto nejlépe funguje na prostatickou nebo z prostaty pocházející metastázující tkáň.

Jak vyplývá z Příkladu 1, podle metody tohoto vynálezu se cizí T_H-buněčný epitop zavádí v části PSM aminokyselinové sekvence definované jako SEQ ID č.: 2, pozice 16-52 a (nebo) 87-108 a (nebo) 210-230 a (nebo)269-289 a (nebo) 298-324 a (nebo) 442-465 a (nebo) 488-514 a (nebo) 598-630 a (nebo) 643-662 a (nebo) 672-699. Dále je součástí předkládaného vynálezu modifikovaná molekula PSM, která má cizí T_H-epitop vložený v těchto pozicích.

V souladu s tím se předkládaný vynález týká také analogu lidského PSM, který je u lidí imunogenní, přičemž tento analog obsahuje podstatnou část všech známých a předpokládaných CTL a B-buněčných epitopů PSM a zahrnuje alespoň jeden cizí T_H epitop, jak se diskutuje dále. Preferovanými analogy PSM jsou ty, u kterých alespoň jeden cizí T_H epitop se zařadí do aminokyselinové sekvence PSM nebo je náhražkou části aminokyselinové sekvence PSM připadne důsledkem vymazání části této sekvence, přičemž ·* ··»« nejlepší jsou ty analogy, kde se cizí T_H-buněčný epitop vloží do části aminokyselinové sekvence PSM definované jako SEQ ID č.: 2, pozice 16-52 a (nebo) 87-108 a (nebo) 210-230 a (nebo)269-289 a (nebo) 298-324 a (nebo) 442-465 a (nebo) 488-514 a (nebo) 598-630 a (nebo) 643-662 a (nebo) 672-699.

Lidský chorionický gonadotropin (HCG)

Souvislost mezi embryonickými markéry a maligními fenotypy se diskutuje již po mnoho desetiletí. Z narůstajícího objemu dat lze předpokládat, že alespoň jeden takový markér, lidský chorionický gonadotropin beta (hCGp), se dá shodně identifikovat v rakovinných buňkách nejrůznějšího histologického původu, a že výskyt těchto proteinů často koreluje se vzrůstajícími metastatickými vlastnostmi. Humorální imunitní odezva zaměřená proti tomuto rozpustnému proteinu může redukovat šíření nádoru a (nebo) snížit recidivu nového primárního růstu v pooperačním období.

Lidský chorionický gonadotropin patří do skupiny glykoproteinových hormonů, včetně folikul stimulujícího hormonu (FSH) , štítnou žlázu stimulujícího hormonu (TSH) a hormonu žlutého tělíska (LH), z nichž všechny jsou důležitými regulátory reprodukčního procesu a přežití plodu. Členové této skupiny hormonů jsou heterodimery sdílející běžný a-řetězec. β-řetězec je unikátní pro každý hormon a vyjadřuje jeho, specifikum, β-řetězcem LH se projevují nejsilnějši sekvence homologické k ύϋΰβ (okolo 80 %). Měřitelná molekulová hmotnost celkového hCG je kD, přičemž jednu třetinu představují uhlovodíky. Posttranslační sacharidové modifikace obsahují uhlovodíky vázané jak přes N, tak přes O. Přítomnost četných zbytků sialové kyseliny dává proteinu silný záporný náboj . Byla

4* 4···

4444 • « · · •44 «44 4

4·

44444· • 4·

44

4 44

4 4·

4«4«

44 · 4 · *· •44

44 •4·<·· vyřešena krystalová struktura celkového hCG (Lapthorn et al., 1994).

Na základě krystalové struktury se ukázalo, že hCG vytváří homology ke skupině růstových faktorů včetně PDGF a TGF£ (Lapthorn et al., 1994). To předpokládá, že působení hCG může pomoci regulovat růst rakovinné buňky.

Lidský chorionický gonadotropin je glykoproteinový hormon produkovaný placentálními syncytiotrofoblasty brzy po oplodnění a je nezbytný pro zdárný průběh těhotenství u žen.

Patofyziologická úloha embryonálních markérů ve vývoji nebo udržení rakovinné hmoty není známa. Je však zajímavé, že trofoblasty (které tyto proteiny normálně produkují) mají jak angiogenický tak invazivní charakter, přičemž obě tyto vlastnosti jsou pro rakovinnou buňku nepostradatelné. Dále se předpokládá, že hCG (nebo jeho dílčí jednotky) inhibují imunitní reakci mateřských buněk na tkáň plodu. Například studie ukázaly, že hCG přímo potlačuje reakci T buněk (Jacoby et al., 1984) a je tedy pravděpodobné, že v důsledku toho, že lymfatické uzliny odčerpávající (v tomto případě) primární melanom jsou imunosupresivní, vzniká příznivější prostředí pro stabilizaci nádorových metastáz. V důsledku toho může působení hCGp napomoci šíření rakovinných buněk do sekundárních mízních orgánů. Konečně jak už bylo zmíněno, prokázala se strukturní homologie mezi hCG a řadou růstových faktorů. Jinou možností je to, že sekrece hCG rakovinnými buňkami podporuje růst nádoru.

	•4 • ·	44 • 4	44 • 4	4444 • 4	·· •	• 4 4 4
80	• t	44 4 4 4 · · · ·	• 4 4 4 4	4 4	4 4
•	• ·	4 ·	4 4 4	4	4
	4444	44	·«	44	44	4444

Působeni hCGp se ukázalo u mnoha různých typů rakoviny, například: a) Adenokarcinom prostaty: pozitivní působení hCGp na části tkání se pozorovalo u pacientů se špatnou prognózou, bez ohledu na histologický typ nádoru (Sheaff et al., 1996); b) různé druhy plicních nádorů: dlaždiové buňky (SQCC), adenokarcinom (AC) a velké buňky (LLC) vykazují vysoké procento reaktivity vůči hCGp (Boucher et al. ,

1995); c) adenokarcinom pankreatu (Syrigos et al.,

1998);

d) neuroblastomy, rakovina mozku, retinoblastomy (Acevedo

1997); e) maligní melanom (Doi et al.,

1996); f) rakovina močového měchýře (Lazar et al., 1995). Poslední článek popisuje přístup DNA, v němž se myši imunizovaly hCGp (Geissler et al. , 1997). U tohoto živého modelu inhibice růstu nádoru souvisela silně s aktivitou CTL, ale zaznamenala se i vysoká hladina protilátek neutralizujících biologický účinek intaktního hCG na jeho buněčné receptory.

Použití hCG jako imunogenu se popisuje v několika publikacích, se zaměřením na jeho využití jako antikoncepční vakciny (Talwar et al., 1976 a Talwar et al., 1994). Klinická zkouška zamezující plodnosti s využitím vakciny proti celkovému hCG se ukázala být vysoce účinná a spolehlivá (Talwar et al., 1994). Provedla se také první fáze klinických zkoušek s pacienty trpícími rakovinou, kteří používají vakcinu proti karboxyskupinou zakončenému peptidů hCGp v konjugaci s záškrtovým toxinem (Triozzi et al., 1994) a druhá fáze zkoušek je na cestě. Bez ohledu na to, že myšlenka využít hCGp jako cílené vakciny proti rakovině je již nějaký čas nablízku, nevyzkoumala se žádná souvislost s technologii autovakcinace.

• · · ·· · · 4 ·· • · · ·· · ···« • · · · · · « « »

Je známé, že buňky neembryonálni tkáně nebo benigních nádorů nevykazují hCGp. Proto by vakcinace neměla mít případné vedlejší účinky na tuto molekulu (vyjma vlivu na těhotenství). Protože se tato molekula projevuje v mnoha rozdílných druzích rakoviny, označuje se jako „definitivní rakovinný biomarker (Acevedo et al., 1995 a Regelson W., 1995) a jako taková je atraktivním cílem dalšího výzkumu.

Vhodné živočišné modely pro další studie efektivnosti vakciny na bázi hCG se nacházejí v Acevedo et al.: Cancer Det. and Prev. Supi. 1, (1987), 477-486 a v Kellen et al.: Cancer Immunol. Imun. Ther. 13 (1982), 2-4.

Her 2

Předpokládá se, že receptory tyrosin kinázy Her2 a EGFr hrají zásadní úlohu v maligní transformaci normálních buněk a v pokračujícím růstu rakovinných buněk. Přebujení většinou vede ke špatným prognózám. V průběhu několika minulých let se mnoho publikací zabývalo využitím protilátek proti těmto receptorům k léčbě rakoviny při přebujení jednoho nebo obou receptorů. Genentech lne. ukončil několik úspěšných klinických zkoušek u pacientů s rakovinou prsu s použitím monoklonální protilátky proti Her2 a nakonec získali oprávnění FDA k marketingu preparátu monoklonální protilátky proti Her2, Herceptinu®.

Technologie autovakcinace popsaná v tomto vynálezu při aplikaci na Her2 vyvolá protilátky, které reagují převážně s Her2. Od těchto protilátek se očekává, že napadnou a eliminují nádorové buňky, a také zabrání metastatickým buňkám přerůst do metastáz. Efektorový mechanismus tohoto ♦ · protinádorového působení se uskutečňuje přes komplement a na protilátce závislou buněčnou cytotoxicitu.

Podle volby složení vyvolané autoprotilátky mohou také inhibovat růst rakovinných buněk přes inhibici oligodimerizace závislé na růstovém faktoru a internalizaci receptorů. A co je nejdůležitější, předpokládá se, že analogy Her2 jsou schopné indukovat odezvu CTL proti známých a (nebo) předpokládaným Her2 epitopům zobrazeným nádorovými buňkami. Her 2 patří do skupiny receptorů epidermálních růstových faktorů (c-erbB), které se skládají ze čtyř rozdílných receptorů označovaných: c-erbB-Ι (EGFr), c-erbB-2 (Her2, c-Neu), c-erbB3 a c-erbB-4 (Salomon et al., 1995). C-erbB-3 a c-erbB-4 jsou charakterizovány méně dobře než EGFr a Her2. Her2 je integrální glykoprotein. Vyzrálý protein má molekulovou hmotnost 185 kD se strukturními rysy, které jsou velmi blízké EGFr receptor (Prigent et al., 1992). EGFrje také integrální membránový receptor sestávající z jedné jednotky. Mívá molekulovou hmotnost 170 kD a obsahuje doménu 621 aminokyselin vážící povrchové ligandy, jednoduchou hydrofobní transmembránovou doménu 23 aminokyselin a vysoce chráněnou cytoplazmatickou doménu tyrosin kinázy z 542 aminokyselin. Protein je Nglykosylovaný (Prigent et al., 1994).

Všechny proteiny této skupiny jsou tyrosin kinázy. Interakce s ligandem vedou k dimerizaci receptorů, čímž se zvýší katalytická aktivita tyrosinu kinázy (Bernard, 1995, Chantry, 1995). Proteiny této skupiny jsou schopné homo- a heterodimerizovať, což je důležité pro jejich aktivitu. EGFr podporují růst a stimulují absorpci glukózy a aminokyselin buňkami (Prigent et al., 1992). Her2 také nese signály podporující růst. Pouze EGFr váže EGF a TGF-α. Tyto • · φ · ligandy se nevážou na jiné receptory ze skupiny (Prigent et al., 1992). Ligandy pro Her2 nejsou zcela určené. Ukázalo se však, že heregulin indukuje fosforylaci aktivovaným Her2. Zjistilo se, že to není dáno jeho přímou vazbou na receptor, ale předpokládá se, že heregulin je ligandem pro erbB-3 a erbB-4, který pak aktivuje Her2 oligodimerizací (Solomon et al., 1995).

Homologie mezi proteiny skupiny EGF receptoru je nejvýraznější v doméně tyrosin kinázy na cytoplazmatické části molekuly (82% mezi EGFr a Her2) . Homologie je nižší v extracelulární oblasti - od 41 % do 46 % v různých domémách (Prigent et al., 1992).

Epidermální receptor růstového faktoru se v normální tkáni vyskytuje v malém množství, ale je přemnožený v mnoha typech nádorů. EGFr je přemnožený u rakoviny prsu (Earp et al., 1993, Eppenberger, 1994), gliomů (Schlegel et al., 1994), rakoviny žaludku (Tkunaga et al., 1995), nádoru svrchních kožních vrstev (Fujii 1995), rakoviny vaječníků (van Dam et al., 1994) a jiných. Her2 se také vskytuje na několika normálních lidských tkáních v malém množství, mnohem výrazněji na sekrečním epitelu. Přemnožení Her2 u asi 30 % rakovin prsu, žaludku, slinivky, močového měchýře a vaječníků.

Výskyt těchto receptorů se mění v závislosti na stupni diferenciace nádorů a typu bujení, tj. u rakoviny prsu se primárně v nádorech přemnoží oba receptory, zatímco u rakoviny žaludku se přemnožení objeví až v pozdějším stádiu v metastázách (Salomon et al., 1995). Počet přemnožených receptorů rakovinných buněk je vyšší než 10⁶/buňku pro některé rakoviny hlavy a krku, vulvy, prsu a vaječníků, jak se zjistilo izolací těchto buněk z tkáně pacientů (Dean et al., 1994).

Je několik důvodů, proč skupina EGFr receptorů představuje vhodný cíl imunoterapie. Za prvé, tyto receptory se přemnožují u mnoha typů rakoviny, což může směrovat imunitní odezvu proti nádoru. Za druhé, v nádorech se často vyskytují nebo až přemnožují ligandy pro tuto skupinu receptorů a některé z nich jsou velmi citlivé na bujení prostřdnictvím ligandů. Za třetí, u pacientů s nádory, které vykazují přemnožení receptorů růstového faktoru, je prognóza často velice špatná. Přemnožení je úzce spojené se špatnou prognózou především u rakoviny prsu, plic a močového měchýře (2) a souvisí patrně s invazivními metastatickými fenotypy, které jsou prakticky necitlivé na konvenční léčbu (Eccles et al., 1994).

Přemnožení Her2 je v některých případech výsledkem zesílení genu, jindy výsledkem zvýšení transkripce a translace. Přemnožení Her2 je spojené se špatnou prognózou u rakoviny prsu, vaječníků, žaludku, močového měchýře, případně i u rozsáhlejší rakoviny plic (Solomon et al., 1995).

Fáze I klinických zkoušek se prováděla s bispecifickou protilátkou u pacientů s pokročilou rakovinou prsu a vaječníků. Protilátka byla bispecifická proti Her2 a FcyRI (Weiner et al., 1995). Účinný rozpad Her2 v nádorových buňkách se pozoroval u bispecifické protilátky proti Her2 a CD3 (Zhu et al., 1995).

Léčba myší se štěpem lidského karcinomu žaludku monoklonální protilátkou proti Her2 prodloužila život myší (Ohniski et al., 1995). Protinádorové aktivity monoklonálních protilátek proti Her2, v živém organismu i ve zkumavce neprobíhají stejným mechanismem; částečně bojují proti ligandu, modifikují receptor Her2 přeměnou a fosforylaci nebo mohou působit dimerizací (Lupu et al., 1995).

Jednoduše se ukázalo, že protilátky na EGFr také interagují s růstovým faktorem (Baselga et al., 1994, Modjahedi et al., 1993a, Wu et al. , 1995, Modjahedi et al., 1993b, Tosi et al., 1995, Dean et al., 1994, Bier et al., 1995, Modjahedi et al·., 1996, Valone 1995).

Z tohoto důvodu je v metodách uvedených v předkládaném vynálezu důležité to, že se cizí T-buněčný epitop vloží do části aminokyselinové sekvence Her2 definované v SEQ ID č: 3, pozice 5-25 a (nebo) 59-73 a (nebo) 103-117 a (nebo) 149-163 a (nebo) 210-224 a (nebo) 250-264 a (nebo) 325-339 a (nebo) 369-383 a (nebo) 465-479 a (nebo) 579-593 a (nebo) 632-652 a (nebo) 653-667 a (nebo) 661-675 a (nebo) 695-709 a (nebo) 710-730, viz Příklady.

Kromě toho se vynález zabývá analogem lidského Her2, který je imunogenní u lidí, a který obsahuje podstatnou část všech známých a předpokládaných CTL a B-buněčných epitopů Her2 a obsahuje alespoň jeden cizí T_H epitop, jak se diskutuje dále. Preferuje se, když alespoň jeden cizí . T_H epitop je přítomný jako vřazení v aminokyselinové sekvenci Her2 nebo jako výsledek vymazání části této sekvence. Nej lepšími výše definovanými analogy jsou například ty, kde cizí T-buněčný epitop se vkládá do části aminokyselinové sekvence Her2 SEQ ID č. : 3 pozice 5-25 a (nebo) 59-73 a (nebo) 103-117 a (nebo) 149-163 a (nebo) 210-224 a (nebo) 250-264 a (nebo) 325-339 a (nebo) 369-383 a (nebo) 465-479 • · • * • · · ® a (nebo) 579-593 a (nebo) 632-652 a (nebo) 653-667 a (nebo) 661-675 a (nebo) 695-709 a (nebo) 710-730.

FGF8b

Několik vědců prokázalo, že FGF8b může vyvolat bujení, transformaci, diferenciaci a v některých případech silně zvýšit tvorbu nádorů z mateřských buněk a tkání (Tanaka 1992, Kouhara 1994, Lorenzi 195, MacArthur 1995a, Crossley 1996a, 1996b, Ghosh 1996, Ohuchi 1997a, Rudra-Ganguly 1998). Tyto efekty se primárně realizují prostřednictvím vazeb FGF8b k fibrioblastickým receptorům růstového faktoru FGFR2, FGFR3 a FGFR4 (MacArthur 1995b, Blunt 1997, Tanaka 1998).Ukázalo se tedy, že buňky nesoucí jeden z těchto receptorů a FGF8b tvoří autokrinní kaskádu signalizující růst, která vede k bujení. Biologický efekt FGF8b nejpravděpodobněji probíhá cestou JAK/STAT3, jak vyplynulo z pozorování, že adice FGF8b na růstové médium určitých buněk vyvolá fosforylaci STAT3, což podle očekávání poskytuje buňkám odolnost proti zániku (Catlett

Falcone

1999).

K výše uvedenému pozorováni ve zkumavce se nakonec ukázalo, že výskyt FGF8b je mnohem regulovatelnější u rakoviny prostaty a prsu (Marsh 1999, Dorkin 1999). Proto věříme, že autovakcina proti FGF8b bude velmi účinným prostředkem k léčbě řady nádorů obsahujících FGF8 nebo snad zvýší jejich citlivost na látky indukující jejich zánik.

Rakovina prostaty

Biologická agresivita prostatických karcinomů je různá. U některých pacientů zůstane objevený nádor latentním histologickým nádorem a nikdy se nestane klinicky významným. U jiných pacientů má nádor rychlou progresi, metastázuje a usmrtí pacienta v relativně krátkém čase (2-5 let) .

K diagnostickým účelům a následnému určení léčby rakoviny prostaty se primárně stanoví cirkulující hladina dvou proteinů: fosfatázy prostatické kyseliny (PAP) a prostatického specifického antigenu (PSA) (Nguyen 1990, Henntu 1989). Díky narušení normální stavby prostatické žlázy v důsledku vývoje karcinomu se tyto rozpustné proteiny dostanou do oběhu, kde mohou být stanoveny jako markéry, například pro šíření metastáz.

Běžným primárním krokem v léčbě rakoviny prostaty je prostatektomie. Vzhledem k rychlému šíření rakovinných buněk však pro většinu pacientů s rakovinou prostaty není lokální chirurgický zákrok vhodný. Pacienti s neomrzeným průběhem choroby podstoupí léčbu systémovou ablací androgenu, ale roční úmrtnost na rakovinu prostaty za posledních 50 let, kdy se ablace androgenu stala standardní léčebnou metodou metastatického stádia choroby, nepoklesla.

RT-PCR analýza ukázala, lidských prostatických LNCaP, PC-3, ALVA-31 nejvýznačnější izoformou LNCaP buněk citlivých na rekombinovaného FGF8b že FGF8 mRNA je produkován řadami epiteliálních nádorových buněk a DU145, přičemž FGF8b je (Tanaka 1995, Ghosh 1996) . Růst androgen se (Tanaka stimuluje přídavkem

1995), zatímco růst DU145 buněk se inhibuje přenosem

1998) .

viry nesoucími protisměrný

Tento poznatek společně diskutovanými dále ukazují na úlohu

FGF8b (Rudra-Ganguly s dosaženými výsledky

FGF8b při udržování karcenogenní stav těchto buněčných řad.

• ·· · 9 9

S použitím FGF8a cDNA k hybridizačním experimentrům in šitu Leung se spolupracovníky ukázali, že vysoký podíl (80 % (n=106) a 71 % (n=31)) prostatických karcinomů produkuje FGF8 mRNA a že FGF8 mRNA odpovídá závažnosti nádorů (P<0,0016, resp. P<0,05)(Leung 1996, Dorkinl999). Použití monoklonálni protilátky proti FGF8b ukázalo, že právě tato izoforma je odpovědná za přebujení FGF8b (Dorkin 1999). Navíc lidé s nádory vykazujícími vysokou hladinu FGF8 mají horší vyhlídky na přežití (P=0,034) a výskyt FGF8 přetrvává v prostatických nádorech nezávislých na androgenu (Dorkin 1999). Podle výsledků uváděných Dorkinem a kol., výskyt FGF8b v prostatickém karcinomu může předpovídat pacientův delší život.

Imunohistochemická analýza při použití monoklonálni protilátky proti FGF8 stanovila protein v 93 % (n=43) lidských prostatických karcinomů (Tanaka 1998). Normální prostatická tkáň nebo benigní prostatická hyperplazie produkuje nízkou hladinu FGF8 mRNA a neobsahuje detekovatelné množství proteinu FGF8 (Leung 1996, Yoshimura 1996, Ghosh 1996, Tanaka 1998, Dorkin 1999).

Z těchto výsledků vyplývá, že autovakcina proti FG.F8 (b) bude reaktivní proti prostatické nádorové tkáni a tedy nesmírně cenná pro léčbu rakoviny prostaty.

Rakovina prsu

Běžnou léčbou rakoviny prsuje chirurgický zákrok. Vzhledem k rychlosti šíření rakovinných buněk v prsu je však pro značnou část pacientů lokální operace nevhodná.

Pacienti s propuklou chorobou se nakonec léčí ablací androgenu, chemoterapií nebo ozařováním, připadne obojím. Úmrtnost při onemocnění rakovinou prsu je však ještě relativně vysoká.

FGF8 se původně izoloval z buněčné řady myšího prsního karcinomu (SC-3), přidáním androgenu do média (Nonomura 1990) . Bujení těchto i jiných prsních buněk vyvolává také protein. V poslední době se ukázalo, že FGF8b se vyskytuje v osmi (n=8) buněčných řadách lidkého karcinomu prsu (MDAMB-231, MDA-MB-415, ZR 75-1, T-47-D, SK-BR-III, PMC-42,

HBL-100 a MCF-7) (Tanaka 1995, Payson 1996, Wu 1997, Marsh 1998) .

U transgenetických myší Wnt-1 infikovaných virem myšího prsního nádoru (MMTV) rostly prsní nádory. Transkripce FGF8 se aktivovala v 50 % těchto nádorů (MacArthur 1995c, Kapoun 1997).

Transgenetické. myši nesoucí FGF8b cDNA na základě velmi specifického viru myšího prsního nádoru (MMTV) vykazují spontánní vývoj FGF8b představujícího prsní nádory (Coombes, osobní diskuse).

Nejnovější data ukazují, že výskyt FGF8(b) se u rakoviny prsu zvyšuje (Tanaka 1998, Marsh 1999). Tanaka a kol. použili k imunohistochemickým studiím novou monoklonální protilátku FGF8. Prokázali, že FGF8 se vyskytoval v 67 % (n=12) případů rakoviny prsu a že androgenové receptory se vyskytly v 89 % případech onemocnění prsu pozitivních na

FGF8 (hyperplazie, fibroadenom, intraduktální papilom a karcinomy), což umožnilo autokrinní růst vyvolávající progresi prsních karcinomů (Tanakaka 1998). Spožitím ·· ♦ ♦ ··♦ · semikvantitativni metody RT-PCR se ukázalo, že zvýšená hladina FGF8 mRNA v maligních a nemaligních prsních tkáních je srovnatelná. Výrazně více maligní tkáně vykazovaly FGF8 (p=0,019) ve výrazně vyšších hladinách (p=0,031) (68 prsních karcinomů a 24 nemaligních prsních tkání) (Marsh

1999).

Funkce FGF8(b) jako autokrinního růstového faktoru se ještě plně neprokázala. Avšak skutečnost, že u velkého množství nádorů se vyskytuje přebytek FGF8b, silně argumentuje pro to, že autovakcina proti FGF8b bude účinná na vysoké procento karcinomů prsu a prostaty. Data uváděná Marshem, Dorkinem a Tanakou nasvědčují tomu, že autovakcinu proti FGF8(b) bude možné použít pro oba uvedené typy rakoviny (prsu i prostaty) a poněkud méně přesná data uváděná Dorkinem a kol. ještě podporují názor, že FGF8 vyvolává bujení lidkých rakovinných buněk.

Popis FGF8b

FGF8 patří do skupiny fibroblastických růstových faktorů (FGFs) . Tyto růst regulující proteiny jsou proteiny malých aminokyselinových zbytků -200, které všechny se podílejí na vyvolání bujení a diferenciace široké oblasti buněk. Poslední zhodnocení podílu fibroplastických růstových faktorů va vývoji končetin obratlovců přinesl Johnson 1997. Členové skupiny FGF spolu vývojově souvisejí a podílejí se z 20 - 50 % na identitě aminokyselinové sekvence.

FGF8b je spletenou formou FGF8, původně nazývanou androgen, indukující růstový faktor (AIGF). AIGF se poprvé identifikoval jako protein vylučovaný buněčnou řadou (SC-3) prsního karcinomu v čeledi myšovitých při stimulaci androgenem (Nonomura 1990). FGF8 gen u myšovitých obsahuje 6 exonů potenciálně kódujících osm různých FGF8-izofořem (FGF8a-h), lišících se pouze v N-zakončeních molekul (Crossley 1995, MacArthur 1995b). Lidský FGF8 má stejnou genovou strukturu jako u čeledi myšovitých. Díky stop kodónu v exonu 1B může však lidský FGF8 existovat ve čtyřech různých izoformách nazývaných FGF8a, FGF8b, FGF8e a FGF8f (Gemel 1996). Genové struktury a aminokyselinové sekvence čtýř lidských izoforem znázorňuje obrázek 5.

Dospělý FGF8b obsahuje 193 aminokyselinových zbytků a vypočtenou molekulovou hmotnost 22,5 kDa. Vysoce zásaditý protein obsahuje 21 argininových a 14 lysinových zbytků, z nichž se vypočítá izoelektrický bod 10,84 a pozitivní náboj 19,8 při pH * 7,0. Obsahuje dva cysteinové zbytky a má dvě možné N-glykosilační polohy. Proto se výzkumy týkající se FGF8b zaměřují na jejich proteinovou část, o které se ví velice málo. Ta se získává heterologicky z baktérií, čištěných s použitím hexahistidinového značení s C-zakončením a pak „in vitro převevedených do rozpustného a biologicky aktivního stavu (MacArthur 1995a, Blunt 1997).

Biologická aktivita FGF8b

Jak již bylo řečeno, FGF8(b) se poprvé izoloval jako faktor uvolňovaný buněčnou řadou myšího prsního nádoru závislou na androgenu a ukázalo se, že tento protein vyvolává bujeni zmíněných buněk. Tento děj napodobují morfologické změny vyvolané testosteronem, který je také známý tím, že indukuje syntézu FGF8(b) mRNA (Tanaka 1992). Bujení se může inhibovat antisenzitivními oligo FGF8(b) (Nonomura 1990,

Φ· ·♦ *· ···· ·· ·· • * ♦ ♦ ♦· · · · « * f ·♦ «·· «φ 4 • · · ♦ · « · 4 4 ··

Φ ·· 4 · 4 · 4 44

4444 ·4 «4 4Φ *·4··4

Tanaka 1992 a Yamanishi 1994). Skutečně, růst buněčné řady lidského karcinomu prostaty DU145 se inhibuje kontaktem s virem nesoucím antisenztivní FGF8b (Rudra-Ganguly 1998) . Nejnovější data ukázala, že FGF8b vyvolává fosforylaci STAT3 - proteinu, u kterého se předpokládá, že brání odumření (Catlett-Falcone 1999, Johnston, C.L., nepublikované výsledky).

Podle několika výzkumníků je FGF8b velmi účinným impulsem k transformaci buněk NIH3T3 nebo SC115 (Miyashita 1994, Kouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArthur 1995a). Při použití rekombinovaných proteinů se také ukázalo, že indukce morfologických změn je daleko účinnější s FGF8b než s FGF8a nebo FGF8c (MacArthur 1995a, Ghosh 1996). Je zajímavé, že samotná N-zakončená část molekuly FGF8b je dostačující pro transformaci NIH3T3 buněk, a dokonce malý specifický peptid FGF8b (QVTVQSSPNFT) umožňuje 2-3krát pomalejší růst buněk než odpovídá normálu v 0,1% séru (Rudra-Ganguly 1998). Navíc NIH3T3 buňky stabilně kontaktované s bacilonosičem kódujícím FGF8b jsou v případě nitrooční injekční aplikace do myší silně nádorotvorné (Kouhara 1994, Ghosh 1996).

V živém organismu se FGF8b objevuje v určitých stupních vývoje obratlovců. Biologická úloha FGF8b je shrnuta v tabulce 1. Zapojení FGF8(b) ve vývoji obratlovců uvádějí Goldfarb 1999 a Johnson 1997.

Tabulka 1: Tkáňová místa produkující FGF8 a navrhovaná biologická úloha (úlohy)

Děj/mechanismus/výskyt (látky)_______________________________

Přítomnost v končetinách zárodků (myši)

Ohuchi výrůstky křídel zárodků (kuřata)

1997,

Indukce tvorby ektopických končetin z mezodermu (kuřata)

1996b

Indukce tvorby středního mozku z kaudálního mezimozku (kuřata)

1996a

Iniciace výrůstků křídel u bezkřídlého mutantu (kuřata)

1997a

Úloha při dorzoventrální modelaci gastruly (zebřička)

1997

Získané během gastrulačního, kardiálního, kraniofaciálního, Předomozkového, středomozkového a celeberálního vývoje (tkáň specificky drcených myší)

Úloha v morfogenezi zubů (myši)

1998

Odkazy Heikinheimo 1994,

1994

Kuwana

Xu 1998

Crossley

Crossley

Ohuchi

Furthauer

Meyers 1998

Kettunen

Předpokládá se, že FGF8b působí prostřednictvím vazeb na receptory fibroblastického růstového faktoru (RGFR). FGF8b zvlášť aktivuje FGFR2c, FGFR3c, FGFR4c a v určité míře také FGFRlc, ale nikoliv FGFRlb, -2b nebo -3b (MacArthur 1995b, Blunt 1997). V případě výrůstku ektopických kuřecích končetin je dostačující, že FGF10, FGFR2 a FGF8 interagují (Kuwana 1997, Xu 1998). Tyto výsledky podporují hypotézu, že FGF8(b) může působit v auto- a parakrinním režimu a vede k normálnímu vývoj a charakter některých anatomických struktur během vývoje obratlovců. Je důležité, že FGF8 „zcela uspaných myší nejspíš nepřežije díky důkladnému zapojení proteinu v embryonálním vývoji.

Homologie s jinými proteiny

Velmi důležité je předpovědět, zda nežádoucí reaktivita s jinými proteiny přístupnými pro protilátky bude předpokládat léčbu s použitím autovakciny vyvolávající specifické autoprotilátky naFGF8. Díky vysoké sekvenční ·· ♦·♦·

identitě mezi FGF8b a ostatními molekulami FGF8 lze očekávat, že autovakcina bude křížoě reagovat s těmito proteiny. To by bylo podle všeho výhodné, vzhledem k tomu, že žádný z těchto proteinů se nevyskytuje v tkáních nebo buněčných řadách, které neobsahují již FGF8b.

Aminokyselinové zbytky 55- 175 FGF8b ukazují relativně nízký, ale významný stupeň sekvenční identity k ostatním FGF. Běžně se předpokládá (a několikrát se prokázalo), že podstatný stupeň sekvenční identity mezi dvěma proteinovými doménami se také zobrazí ve velmi podobné terciární struktuře. Tudíž se předpokládá, že všechny členy FGF skupiny jsou si obecně strukturně blízké. Třídimenzionální struktura FGF2 se vyřešila z krystalické formy i v roztoku (Ago 1991, Zhang 1991, Zhu 1991, Eriksson 1993, Blaber 1996, Moy 1996). FGF2 je tvořen především beta-listovou strukturou obsahující opakující se třízáhybové a čtyřšroubové antiparalelní beta-meandry. Tato beta-barelová struktura je zcela uzavřena mezi interkleukinem 1, FGF2 (nebo bazickým FGF) a FGF1 (nebo kyselým FGF) . Nukleární magnetická rezonance FGF2 v roztoku ukázala, že N-zakončené části molekuly tvoří relativně flexibilní strukturu. Zbývající část FGF8b (aminokyselinové zbytky 1-54 a 176215) pouze ukazuje nízký stupeň sekvenční identity ke známým proteinům.

Na základě strukturních a jiných dostupných dat lze obecně shrnout, že třídimenzionální strukturní skelet ostatních fibroblastických růstových faktorů se velmi podobný struktuře FGF1 a FGF2. Tyto strukturní úvahy jsou důležitým faktorem našeho návrhu molekul mutantní autovakciny FGF8b.

•Φ ·· ·· ···· • · · · * · · • Φ· · · *

Φ · ΦΦΦ 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99

Důležité je, že díky relativně nízké sekvenční identitě mezi FGF8 a jakýmkoliv jiným členem skupiny FGF, povrch FGF8 je velmi rozdílný od ostatních, proto minimalizace křížových reakcí autovakciny FGF8b tvoří protilátky s jinými členy skupiny FGF. Vzhledem k velmi nízké homologii s jinými proteiny než jsou fibroblastické růstové faktory, nemůžeme předpokládat, že autovakcina proti FGF8b bude reagovat s jakýmikoliv jinými proteiny.

Je však třeba zdůraznit, že autovakcina proti FGF8b bude pravděpodobně křížově reagovat se všemi izoformami FGF8. To by· neměl být problém, protože žádná z izoforem FGF8 se u dospělých jedinců nevyskytuje ve významném množství. Je dokonce možné, že tyto křížové reakce budou prospěšné při léčbě rakoviny, protože se ukázalo, že alespoň některé rakovinné buněčné řady obsahují kromě FGF8b ještě jiné izoformy.

Rozdělení FGF8b v tkáni

Je optimální, když vyvolané autoprotilátky a následné efektorové mechanismy, stejně jako očekávaná odezva CTL zvýšená autovakcinací se zaměřují na eliminaci určité tkáně pacienta. Proto je tkáňové rozložení antigenu směrovaného autovakcinou velmi důležité z hlediska spolehlivosti vakciny.

Tabulka 2; Výskyt FGF8b v různých tkáních a buňkách

Člověk

Buněčné řady rakoviny prsu (MDA-MB-231, Payson

MDA-MB-415, ZR 75-1, T-47-D, SK-BR-III, 1999)

PMC-42, HBL-100 a MCF-7) ((RT-PCR) Tanaka 1995,

1996, Wu 1997, Marsh ♦♦ ♦♦

9 9* •· · • ·· · < 9· • ·9999

Nádory prsu

PCR)

Normální prsní tkáň rakovina prostaty (93 %) choroby prsu prostatické nádorové buňky (LNCaP,

PC-3, DU145 a ALVA 31)

Ledviny plodu

Prostata a varlata dospělých jedinců,

Plod, neurony

Teratokarcinomatické buňky (Tera-2)

Čeleď myšovitých

Buněčné řady rakoviny prsu (SC-115,

RENCA)

Hypotalamus, varlata

Nádory prsu (Wnt-1, transgenní)

Mozek embrya vaječníky, varlata vývoj tváře a končetin ((mAb) Tanaka 1998, (RTMarsh 1999) ((RT-PCR) Wu 1997, Marsh 1999, (mAb) Tanaka 1998) ((in šitu hyb.) Leung 1996, Dorkin 1999, (mAb) Tanaka 1998) ((mAb) Tanaka 1998) ((RT-PCR) Tanaka 1995, Ghosh

1996, Schmitt 1996) ((Northem blot) Ghosh 1996) ((RT-PCR) Ghosh 1996, Wu

1997, Dorkin 1999) ((RT-PCR) Wu 1997) ((RT-PCR) Yoshimura

1996) ((RT-PCR)

Yoshimura 1996) ((NB) MacArthur 1995c) ((in šitu hyb.) Crossley 1995, Heikinheimo 1994, Ohuchi 1994, Shimamura 1997, (RT-PCR) Blunt 1997) (NB) Valve 1997) ((pAb) MacArthur 1995b, (in

*· 99 • 9 9 9 • ·· • ·· ····99

999999 ··

99

99

9 99

9999 šitu hyb.) Heikinheimo

1994,

Ohuchi 1994, Cřossley

1995)

Gastrula ((in šitu hyb.) Cřossley

1995)

Kuřata

Mozek embrya ((in šitu hyb.) Cřossley

1996a)

Vývoj končetin ((in šitu hyb.) Ohuchi

1997a,b)

Krysa

Prostata a varlata ((RT-PCR) Schmitt 1996)

Tabulka ukazuje široký výběr tkáni a buněčných řad, kde se vyskytuje FGF8b. Také z ní vyplývá, že většina údajů týkajících se rozložení v tkáních se získala citlivou metodou RT-PCR. To proto, že NB analýza nezachytí FGF8b mRNA v žádné normální tkáni vyjma ledvin plodu. Z těchto ojedinělých údajů se došlo k závěru, že výskyt FGF8b mRNA u dospělých jedinců je velmi omezený, a tudíž autovakcina proti FGF8b by podle předpokladu neměla reagovat proti normální tkáni. Vzhledem k tomu, že malé množství FGF8b může interagovat s neznámými systémy u dospělých jedinců, je nutná další analýza tkáňového rozložení proteinu. Podle našeho názoru však nic nenasvědčuje tomu, že by autovakcina proti FGF8b měla vážné nežádoucí účinky u pacientů.

Účinky protilátky proti FGF8b

Až doposud nebyly publikovány žádné pokusy léčit rakovinu prostaty s použitím monoklonálních protilátek. V léčbě rakoviny prsu monoklonálními protilátkami však probíhají klinické zkoušky.

• ·

Protilátky proti FGF8b pravděpodobně blokuji interakce mezi FGF8b a jeho receptory, které inhibuji drážděni buněčných membrán a bujeni buněk a velmi pravděpodobně snižuji pohyblivost a invazivnost rakovinných buněk.

Předkládaný vynález se také zabývá výše popsanými metodami, kde cizí T-buněčný epitop se vloží do části aminokyselinové sekvence FGF8b definované jako SEQ ID č: 6, pozice 1-54 a (nebo) 178-215 a (nebo) 55-58 a (nebo) 6368 a (nebo) 72-76 a (nebo) 85-91 a (nebo) 95-102 a (nebo) 106-111 a (nebo) 115-120 a (nebo) 128-134 a (nebo) 138-144 a (nebo) 149-154 a (nebo) 158-162 a (nebo) 173-177. Ukázalo se, že zvláště není vhodné vřazovat varianty nebo modifikace v pozicích 26-45, a aminokyselinách 186-215 začínajících C-zakončením, protože tato rozložení vykazují přinejmenším homologii s nedávno objeveným proteinem FGF18, který se vyskytuje v řadě nenádorových tkání.

Vynález se také zabývá analogem lidského/myšího FGF8b, který je imunogenni v lidském organismu a který obsahuje podstatnou část všech známých a předpokládaných CTL a Bbuněčných epitopů FGF8b a také obsahuje alespoň jeden cizí T_H epitop, jak se diskutuje dále. Výhodné je, je-li alespoň jeden cizí T_H epitop vřazený do aminokyselinové sekvence FGF8b nebo je výsledkem vymazání části aminokyselinové sekvence FGF8b. Nejvýhodnějšími analogy v tomto případě jsou ty, kde se cizí T-buněčný epitop vřazuje do části aminokyselinové frekvence definované jako SEQ ID č: 6 pozice 1-54 a (nebo) 178-215 a (nebo) 55-58 a (nebo) 63-68 a (nebo) 72-76 a (nebo) 85-91 a (nebo) 95-102 a (nebo) 106111 a (nebo) 115-120 a (nebo) 128-134 a (nebo) 138-144 a (nebo) 149-154 a (nebo) 158-162 a (nebo) 173-177.

• ·

Muciny

Vynález se také týká metod využíváj icích speciálně modifikovaných verzí lidského mucinu (hlenu), především kteréhokoliv z MUC-1 až MUC-4, ale nejlépe MUC-1. Analogy obsahují následující strukturu kde TR jsou za sebou řazené opakující se přírodní muciny, P je cizí T_H-epitop, jak se diskituje dálr, S je inertní vmezeřený peptid, který má od 0 do 15 aminokyselinových zbytků, především mezi 0 a 10, n je celé číso od 1 do 30 a m je celé číslo od 1 do 10, nejlépe od 3 do 5.

Když se mucinový analog produkuje například v řadě lidských buněk nebo přečištěním z tkání, přímý výsledek normálně nemá požadovaný glykosylační charakter, tj . anomální glykosylační z nádoru. Je v např. E.

charakter nasvědčuje však možné připravit coli nebo synteticky mucinu pocházejícímu analog rekombinovaně a následně produkt glykosylovat enzymaticky tak, aby se dosáhlo Tn nebo S-Tn glykosylačního charakteru vyskytujícího se v nádorech.

specifického pro MUC-1

Jinak může být polypeptid připraven v savčí buněčné řadě t j . buňkách Drosophila, které nebo intracelulárním působením nebo buněčné řadě hmyzu, postrádají důležitý enzym, proteinu (při vyloučení sekrečního signálního peptidu), kde se nevyskytuje glykosylace.

Fragmenty nukleových kyselin a bacilonosiče předkládaného vynálezu

100

Z předcházejících závěrů vyplývá, že se analogy připravují technologií rekombinace genů, ale také chemickou syntézou nebo semisyntézou; druhé dva postupy jsou významné v případě, že modifikace vznikla připojením k proteinovým nosičům (jako KLH, záškrtový toxoid, tetanový toxoid a BSA) a neproteinovým molekulám, jako jsou uhlovodíkové polymery, a samozřejmě také v případě, že modifikace obsahuje adované postranní řetězce nebo skupiny na peptidový řetězec polypeptidu.

Pro účely rekombinační genové technologie asamozřejmě také imunizace nukleových kyselin jsou důležitými chemickými produkty fragmenty nukleových kyselin kódující nezbytné epitopické oblasti a analogy. Proto významná část tohoto vynálezu patřífragmentům nukleových kyselin kódujícím výše popsaných analogů důležitých nádorově specifických polypeptidů, především těch, do kterých se vřadil cizí T_Hbuněčný epitop vložením a (nebo) adicí, ale nejlépe substitucí a (nebo) odstraněním. V tomto vynálezu jsou odpovídajícími fragmenty buď fragmenty DNA nebo RNA.

V souladu s metodami tohoto vynálezu se fragmenty nukleových kyselin normálně vřazují do vhodných bacilinosičů za vzniku klonovaného nebo nového bacilonosiče nesoucího příslušné fragmenty nukleových kyselin; i tyto nové basilonosiče jsou předmětem předkládaného vynálezu. Detaily týkající se stavby těchto bacilonosičů se budou diskutovat dále v souvislosti s transformovanými buňkami a mikroorganismy. Podle účelu a typu aplikace bacilonosiče mohou být ve formě plasmidů, fágů, kosmidů, minichromozómů nebo virů, ale důležitým bacilonosičem je také forma prosté DNA, která se vyskytuje jen přechodně v určitých buňkách.

101 • · · ·

Preferované klonované i nově vzniklé bacilonosiče v tomto vynálezu jsou schopné autonomní replikace, a proto dávají velký počet kopií vyžitelných přímo nebo k následným replikacím klonů.

Obecný bacilonosič používaný v tomto vynálezu obsahuje následuje! charakteristické jevy ve směru 5'-+ 3'a v měnitelném spojení: promotor řídící působení fragmentu nukleové kyseliny, libovolně sekvenci nukleové kyseliny kódující vedoucí peptid umožňující sekreci nebo začlenění do membrámy polypeptidového fragmentu, fragment nukleové kyseliny v souladu s vynálezem a sekvenci nukleové kyseliny, kódující terminátor. Pro působení bacilonosičů při tvorbě buněčných řad nebo kmenech je vhodné, když se bacilonosič vřazený do hostitelské buňky integruje do genomu této buňky. Naopak, když se pracuje s bacilonosičem používaným ke zvýšení účinku přímo v organismu živočichů (tj. při použití bacilonosiče k vakcinaci DNA), je z bezpečnostních důvodů lepší, když se bacilonosič není schopen integrovat do genomu hostitelské buňky; typickým příkladem je použití prosté DNA nebo neintegrovatelných virových bacilonosičů, jejichž volba je velmi dobře známá v odborných kruzích.

Bacilonosiče se v tomto vynálezu používají k transformaci hostitelských buněk tak, aby produkovaly požadovaný analog. Transformované buňky, které jsou také předmětem tohoto vynálezu, jsou kultivované buňky nebo buněčné řady používané k šíření fragmentů nukleových kyselin a bacilonosičů, kterých se tento vynález týká, nebo se používají na rekombinovanou produkci analogů tohoto vynálezu. Jinak transformované buňky mohou být vhodnou živou vakcinou, kde fragment nukleové kyseliny (jedna

102

99 9

999 • · · · •* • · •«

9999 • · * '9

9 ·« jednoduchá nebo násobná kopie) se vloží ke za účelem sekrece nebo inegrace do bakteriální membrány nebo buněčné stěny analogu.

V souladu s vynálezem jsou preferovanými transformovanými buňkami mikroorganismy, jako je druh Escherichia (např. E. coli), Bacillus (např. Bacillus subtilis)_r Salmonella nebo Mycobacterium ('především nepatogenní, např. M. bovis BCG) , kvasinky (jako Saccharomyces cerevisiae) a prvoci. Jinak se transformované buňky odvozují od multicelulárních organismů, jako jsou houby, insekticidy, rostliny nebo savci. Preferované jsou lidské buňky, viz diskuse buněčných řad a bacilonosičů dále.

Pro klonování a (nebo) optimalizaci působení jsou nej lepší transformované buňky schopné replikace fragmentu nukleové kyseliny z tohoto vynálezu. Buňky představující fragment nukleové kyseliny jsou důležitým bodem tohoto vynálezu; mohou se použít pro malou nebo rozsáhlejší přípravu analogu, případně jde-li o nepatogenní bakterie, jako vakcinační složky živé vakciny.

Jestliže se analog v tomto vynálezu připravuje pomocí transformovaných buněk, je výhodné, i když ne nezbytné, když se výsledný produkt buď exportuje ven do kultivačního média nebo se nanese na povrch transformované buňky.

Na základě identifikikace účinné produkce buňky je vhodné určit stabilní buněčnou řadu, která nese bacilonosič podle tohoto vynálezu a představuje fragment nukleové kyseliny kódující analog. Tato stabilní buněčná řada především vylučuje nebo nese příslušný analog, a tím se usnadňuje jeho čištění.

103

Obecně, plasmidové bacilonosiče obsahující replikované a řízené sekvence látek kompatibilních s hostitelskou buňkou se používají v souvislosti s hostiteli. Bacilonosič běžně nese replikační místo, stejně jako označené sekvence schopné uskutečnit fenotypickou selekci transformovaných buněk. Například E. coli se typicky transformuje pomocí pBR322, plasmidem z druhu E. coli (viz např. Bolivar et al., 1977). Plasmid pBR 322 obsahuje geny pro resistenci ampicilnu a tetracyklinu, takže je jednoduchým prostředkem k identifikaci transformovaných buněk. Plasmid pBR nebo jiný mikrobiální plasmid nebo fág musí také obsahovat, nebo se modifikovat tak, aby obsahoval promotory působení prokaryotického mikroorganismu.

Nejběžněji používané promotory mají strukturu rekombinované DNA obsahující B-laktamázu (penicilinázu), systémy laktózového promotoru (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al. , 1979) a systém tryptofanového promotoru (trp) (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 036 776). Přestože uvedené promotory jsou nejčastěji používané, objevily se i další mikrobiální promotory, které se také využily a detaily týkající se jejich nukleotidových sekvencí se publikovaly, což umožnilo odborníkům je funkčně spojit s plasmidovými bacilonosiči (Siebwenlist et al., 1980). V E. coli se mohou vyskytnout určité prokaryotické geny ze sekvencí jejich vlastních promotorů, takže není nutné přidávat uměle jiný promotor.

Kromě prokaryotů se mohou použít také eukaryotické mikroby, jako kvasinkové kultury, kde promotor je schopný řídit ůsobení. Saccharomyces cerevisiase nebo běžné pekařské kvasinky j sou nej častěj i používané eukaryotické • *· ^; /' v * ⁰

104

mikroorganismy, ale může se použít i řada jiných druhů, jakonapřiklad Píchla pastoris. Pro působení v Saccharomyces se obvykle používá například plasmid Yrp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al.,1979; Tschemper et al., 1980). Tento plasmid již obsahuje gen trpí, který provádí selekci markéru mutantu kvasinek postrádajících schopnost růstu v tryptofanu, například ATCC č. 44076 nebo PEP4-1 (Jones, 1977). Přítomnost leze trpí charakteristická pro genom kvasinkové hostitelské buňky vytváří účinné prostředí pro zachycení transformačního růstu v nepřítomnosti tryptofanu.

Vhodné sekvence promotorů v kvasinkových bacilonosičích obsahují promotory 3-fosfoglycerat kinázy (Hitzman et al., 1980) nebo jiných glykolytických enzymů (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), jako jsou enoláza, glyceraldehyd -3fosfat dehydrogenáza, hexokináza, pyruvat dekarboxylázy, fosfofruktokináza, glukóza-6-fosfat izomeráza, 3fosfoglycerat mutáza, pyruvat kináza, trifosfat izomeráza, izomeráza fosfoglukózy a glukokináza. Ve vhodných plasmidových strukturách se terminační sekvence spojené s těmito geny také vážou do bacilonosiče 3' sekvence potřebné k provedení polyadenylace mRNA a terminace.

Jiné promotory, které mají ještě navíc výhodu transkripce regulované růstovými podmínkami, jsou oblastí promotorů alkohol dehydrogenázy 2, isocytochromu C, kyselé fosfatázy, odbourávajících enzymů metabolismu dusíku a dříve zmíněné glyceraldehyd-3-fosfat dehydogenázy, a také enzymů odpovědných za působení maltózy a galaktózy. Vhodný je jakýkoliv plasmidový bacilonosič obsahující kompatibilní kvasinkový promotor, základ replikačních a terminačních sekvencí.

« · · ·

105

Kromě mikroorganismů se jako hostitelé používají buněčné kultury mnohobuněčných organismů. V podstatě jsou funkční jakékoliv buněčné kultury obratlovců i bezobratlých. Největší zájem je však o buňky obratlovců a jejich rozmnožováni kultivací (v tkáňové kultuře) se stalo v posledních letech rutinním procesem (Tissue Culture, 1973) . Příklady využitelných hostitelských buněčných řad jsou buňky VĚRO a HeLa, buněčné řady z vaječníků čínských křečků (CHO) a buněčné řady W138, BHK, COS-7 293 a MDCK.

Bacilonosiče představující tyto buňky běžně obsahují (pokud je to nezbytné) základ replikace, promotor umístěný před genem, aby mohl působit společně s nějakým nezbytným místem vázajícím ribozóm, vazebná místa RNA, polyadenylační místa a sekvence transkripčního terminátoru.

Při využití savčích buněk často provádějí kontrolní funkce bacilonosičů viry. Například běžně používané promotory jsou z polyomu, Adenoviru 2 a nej častěji Simian Viru 4 0 (SV40). Prvotní i pozdější promotory viru SV40 se zvlášť využívají, protože se oba snadno získají jako virový fragment, který také obsahuje virový základ (SV40) replikace (Fiers et al., 1978). Mohou se také použít menší nebo větší fragmenty SV40, což představuje roztažení přibližně 250 bp sekvence z místa HindlII směrem k BglI umístěnému ve virovém základu replikace. Dále je také možné a často potřebné využit promotorické nebo kontrolní sekvence normálně připojené k požadované genové sekvenci, přičemž tyto kontrolní sekvence jsou kompatibilní se systémy hostitelské buňky.

Základ replikace se provádí buď sestavením a vřazením bacilonosiče jako exogenního základu, kterým může být SV40

106 nebo jiný virus (např. Polyom, Adeno, VSV, BPV) , nebo mechanismem chromozomálni replikace hostitelské buňky. Jestliže se bacilonosič vkládá do chromozómu hostitelské buňky, druhý způsob často stačí.

Složky předkládaného vynálezu

Vynález se zabývá také imunogenním složením, které obsahuje jako účinnou imunogenní látku alespoň jeden z výše popsaných analogů ve směsi s farmaceuticky a imunologicky využitelným nosičem, pojivém, rozpouštědlem, masťovým základem a libovolně adjuvans (viz také diskusi ve výše uvedeném popisu metod tohoto vynálezu).

Dále se vynález zabývá složkami vyvolávajícími produkci protilátek proti jakémukoliv z výše uvedených nádorových antigenů; složka obsahuje fragment nukleové kyseliny nebo bacilonosič v souladu s vynálezem a farmaceuticky a imunologicky využitelné rozpouštědlo a (nebo) pojivo a (nebo) nosič a (nebo) masťový základ a (nebo) adjuvans.

Formulace a jiné zvláštnosti týkající se těchto složek se diskutovaly již v příslušné kapitole zabývajícíse imunizací nukleové kyseliny.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález bude blíže vysvětlen prostřednictvím konkrétních příkladů provedení znázorněných na výkresech, na kterých představuje ··«··» 9 9 9 9 · 9 · 9 · · • * · · 9

107

A»·· 9 9 9 9 *9 9 9 ·«·!

Obr. 1: Tradiční postup autovakcinace.

A: Tolerodominantní vlastni epitopy představované na MHC typu II na buňce představující antigen (APC) jsou eliminovány díky degradaci souboru T-pomocných buněk (Th) (T-pomocné buňky jsou vyznačeny tečkovanými čarami). Vložené cizí imunodominantní T-buněčné epitopy na MHC typu II aktivují T-pomocné buňky a B-buňky

B: specifické části vlastní protein představujících cizích imunodominantních T buněčných epitopů na MHC typu II se aktivují pomocí cytokinú poskytovaného T pomocnou buňkou.

Obr. 2: Princip autovakcinace pro vyvolání reakce CTL.

Vložené cizí imunodominantní T buněčné epitopy prezentované na MHC typu II aktivují T-pomocné buňky. Subdominantni vlastní epitopy zaznamenané CTL, které se prezentují na MHC typu I, se aktivují přilehlými aktivovanými T-pomocnými buňkami.

Obr. 3: Schematické znázornění polypeptidu Her2 s indikacemi epitopických oblastí a N-glykosilačních míst.

extracelulární domény, transmembránovou doménu (TM) a 2 intracelulární domény představují místa s různými stupni homologizace a místa obsahující předpokládané CTL epitopy vzhledem k určeným.

Obr.4: Schematické znázornění lidského PSM polypeptidu s indikacemi oblastí pro vložení epitopů P2 a P30.

Obr. 5: FGF geny a proteiny.

A: Exon-intron struktura lidského a myšího FGF8 genu.

108 • φ φ ΦΦ φ*

ΦΦ « φ» •••Φ ·· • · φ

ΦΦ

Dole je znázorněno osm různě spojených forem (Gemel, 1996).

B: Aminokyselinová sekvence různých izoforem FGF8. Polypeptid dosahující do FGB8b, FGB8f a FGB8e je vyznačen tučně, kurzívou nebo podtržením písma. FGF8 je nej kratší variantou neobsahující žádnou z těchto zvýrazněných sekvencí. Signální peptid pravděpodobně odštěpí koncový atom uhlíku do Ala22. Dva cysteinové zbytky nacházející se ve vyvinuté FGF8 (všechny jsou izoformní) jsou vyznačeny silným podtržením. Dvě potenciální N-glykosilační místa FGF8b jsou označeny N. Číslování odpovídá FGF8b.

Obr. 6: Znázornění čtyř různých variant FGF8b navržených pro autovakcinaci.

Vrchní panel: Teoretické modely inzertních bodů epitopů používající jako vzor krystalovou strukturu FGF2.

Spodní panel:

Aminokyselinové sekvence přírodního typu FGF8b (WT) a peptid peptidy čtyři varianty F30N, F2I, je vyznačen jednoduchým jsou podtrženy dvakrát.

F30I a F2C.

podtržením.

N-koncová (MetAla) u všech variant je díky vzniku sekvence (Kozák 1991) pro lepší

Signální

Vložené sekvence

Kozákovy translaci v eukaryotických systémech.

109

• 9	9~9		• ·	• · ·	•	99	4 9
« 9 9		4	• ·		•	9 ·	9 ·
9	99			•		9 9	4
» 9>		• 4	• ·		9	9 · »	9
• ·		*	• ·	9	9	9 9	*
	9 ·		♦ 9	• 9		• 4	9999

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Vakcinace proti PSM

V následujícím textu se popisuje, jak se může lidská autovakcina proti PSM vyvinout modifikací molekuly vložením jednoho nebo více smíšených cizích T buněčných epitopů k odkrytí pole imunogenizovaných PSM molekul.

Složky se testovaly z hlediska schopnosti vyvolat specifickou reakci CTL proti PSM nesoucím nádorové buňky. Dále se složky testovaly z hlediska schopnosti vyvolat protilátky, které jsou vzájemně reaktivní s přírodními částmi molekuly PSM. Následně se v několika vzorcích ve zkumavce a na živých modelech měřila

efektivita	různých složek. Vyvolané protilátky se testovaly
z hlediska	schopnosti aktivovat kompement klasickou cestou a
iniciovat	ADCC prostřednictvím Fc-receptorů. Nakonec se

rozdílné molekuly testovaly na žiočišných modelech lidského karcinomu prostaty.

Strategie projekce PSM atovakciny

Příprava PSM vakcinace se dělí do následujících experimentálních kroků:

Vzhled a produkce pole lidských PSM mutantů

Klonování PSM sekvencí lidských a krysích (myších).

Mutační práce pro generování imunogenizovaných hPSM molekul.

Působení původních a imunogenizovaných hPSM molekul v E. coli a (nebo) Pichia pastoris a (nebo) savčích • ·· · ♦ ♦ · *

11Λ *♦···· ♦ * · · ·····♦· ·· .

• «Ο ·· ♦· ·· ·* · buňkách a (nebo) insekticidnich buňkách (jako je S2 buněčná řada).

Čištěni, přeskupení a charakterizace imunogenizovaných hPSM molekul.

Vakcinace DNA proti PSM

Tvorba hPSM bacilonosičů DNA vakcinace kódujících imunogenizované hPSM molekuly.

Testování hPSM vakcinačních bacilonosičů „in vitro a „in vivo experimenty.

Selekce kandidátů hPSM

Imunizace myší (králíků).

- ELISA.

FACS analýza.

V případě reakce protilátky: Zkouška bujení nádorové buňky.

Zkoušky T-buňky.

Testováni hPSM mutantů „in vivo

Pevný model nádor/metastáza v myších.

Koncepční studie: indukce CTL autovakcinací

Stavba imunogenizovaných myších (krysích) PSM odpovídajících vybraným hPSM kandidátům (např. ve formě DNA vakcin).

Testování imunologické odezvy zvýšené myšími (krysími) PSM mutanty pokusy „in vitro: imunochemické zkoušky, ELISA, FACS analýza, buněčná analýza, komplementární rozklad nosných buněk PSM, zkouška ADCC, zkouška aktivity CTL, zkouška bujení nádorové buňky, zkoušky působení T-buněk.

· • ·

111

-	Testování mPSM	mutantů	„in vivo	v pevném modelu
	nádor/metastáza	u myší.
Názvosloví struktur	hPSM
PSM	je typem II membránového	proteinu ze	750 aminokyselin,
viz	SEQ ID č: 2,	která je	sestavena	ze čtyř původních

sekvenci s výjimkou Gly substituujícího Trp v poloze 2 díky vstupu Ncol polohy a Kozákovy sekvence do SEQ ID č: 1, kde ggt substituuje tgg v polohách 4-6. Pro skladbu lidské autovakciny na bázi PSM se však může použít i přírodní PSM (tj. PSM mající Trp v poloze 2).

Extracelulární část PSM obsahuje 707 C-koncových aminokyselin, přičemž cytoplasmatickou oblast tvoří pravděpodobně 19 aminokyselin dlouhý řetězec a transmembránová část proteinu obsahuje 24 aminokyselin (resp. 20 - 43).

Výchozím bodem pro skladbu může být také spojitá varianta PSM' . Naše verze takové struktury má aminokyselinové sekvence odpovídající zbytkům 58 - 750 v SEQ ID č. 2. Pro jednoduchost v názvosloví se oblasti PSM' číslují v souladu s PSM (to znamená, že např. oblast 2 obsahuje aminokyseliny 87-108 v PSM a 30-51 v PSM'), srovnej také diskusi týkající se sekvenčních oblastí dále.

Všechny genetické skladby lidského PSM se označují hPSM_._ (nebo hPSM', jestliže se jako výchozí bod použije PSM'), kde první _ je vstupní oblast použitá pro vstup P2 a druhá _ je vstupní oblast pro P30. Jestliže P2 a P30 nejsou v proteinu, označuje se jako 0 (nula). Plná délka původního hPSM se označuje hPSMO.O a původní hPSM postrádající • · · ·

112 cytopiazmatickou a transmembránovou část se označuje hPSM+0.0. 13 plánovaných imunogenizovaných genů hPSM, které všechny obsahují jeden P2 epitop a jeden P30 epitop se jmenuj i hPSMl.1, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSMlO.1, hPSMl.6, hPSMl.8, hPSMl.10, hPSMl.2, hPSMl.3, hPSMl.5, hPSM2.1, hPSM3.1, hPSM10.3, hPSM6.3, hPSM'10.3, hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM'8.3 a hPSM5.1, viz detaily níže.

V hPSMl.1 se oba epitopy P2 a P30 vřazují spolu v oblasti č. 1 (membránová oblast). Teoreticky je tento mutant, hPSMl.1, z hlediska vakciny velmi zajímavým kandidátem na vyvolání tvorby protilátky, protože celá extracelulární oblast této molekuly je intaktní. K vyvolání odezvy CTL s použitím imunizace nukleové kyseliny se hodí skladby jako hPSM10.3 a hPSM6.3.

Aby se usnadnily procesy klonování a mutageneze, funguje mnoho molekulových skladeb buď N-zakončením (aminokyseliny 1-436) nebo C-zakončením (aminokyseliny 437-750) hPSM genu jako výchozího materiálu. Tyto dvě části genu hPSM se označují hPSMl a hPSMII kde první _ je vstupní oblast použitá pro vstup P2 a druhá _ je vstupní oblast pro P30. Zase, jestliže P2 nebo P30 nejsou v proteinu, označuje se jako 0 (nula) a původní typy se označují hPSMIO.O a hPSMIIO.O. Speciální varianta hPSMIO.O bez cytoplazmatické části hPSM se označuje hPSMI+0.0.

Pro činnost většiny mutagenezí se tedy používá jako výchozí materiál hPSMIO.O a hPSMIIO.O.

Vznikající hPSM mutantní proteiny se označují PROS kde první _ je vstupní oblast použitá pro vstup P2 a druhá _ • ·

113 pro vstup P30. Jestliže P2 nebo P30 nejsou v proteinu, označuje se jako 0 (nula). Původní typy se označují PROS.0. PROSU. 0 je označení pro proteinový produkt hPSM aminokyselin 437-750. HIS značené proteiny se nazývají HISPROS Jako His konce se používájí SEQ ID č. 21 pro působení v kvasinkách a bakteriích, zatímco SEQ ID č. 23 pro působení v savčích buňkách.

Klonováni lidské sekvence PSM

LNCaP buněčná řada, která vzniká z metastázových lézí lidského prostatického adenokarcinomu se zakoupila od Američan Type Culture Collection (ATCC). mRNA se izolovala z této buněčné řady a vratně přepsala s použitím standardní sady tak, aby se získala cDNA kódující lidskou PSM sekvenci. S použitím rozdílných sad specifických primerů hPSM se získají PCR produkty kódující PSM (437-750) a dále se klonují do pUcl9 (plasmid č. pMR300) a ověřují se řazením DNA. Tato C-koncová část původního typu PSM se označuje hPSM částll (hPSMIIO.O).

Jednoduše, původní typ hPSM části (hPSMlO.O) se klonují do pUcl9 s použitím primeru k rozšíření části I s (hPSMlO.O) a bez (hPSMIIO.O) transmembránových a cytoplazmatických oblastí. Klony se kontrolně seřadily a hPSMlO.O a hPSMIIO.O se sloučily ligací v poloze EcoRI. Výsledné klony hPSMO.O (SEQ ID č. 2) a hPSM-^0.0 se subklonovaly do řady prokaryotických a eukaryotických bacilonosičů a zase se sekvence ověřily. Intracelulární formy lidského PSM (značené hPSM'aminokyseliny 58-750 ze sekvence SEQ ID č. 2) se také sestavují s použitím cDNA jako výchozího materiálu. Tato sekvence se také subklonuje do savčích bacilonosičů a

114 φ φ φ ♦ · ♦ • ·« φ ♦ · • ♦ φφφ · φ · · · · · ··*· φφ ·· ·· používá se jako výchozí materiál pro skladbu některých hPSM autovakcin, například hPSM'10.3 a hPSM'6.3.

Klonování krysích a myších PSM sekvencí

Dva EST klony (nesoucí sekvenci tag) obsahující cDNA sekvence myších PSM (z ledvin plodů myší a myších makrofágů) se zakoupily od Američan Type Culture

Collection (ATCC). Dohromady tyto EST klony pokrývají myší cDNA sekvenci PSM, a tak se jak plná délka myšího PSM (SEQ ID č. 7 a 8), tak myší PSM'(SEQ ID č. 9a 10) subklonuje do bakteriálních bacilonosičů a savčích bacilonosičů. _r Myší PSM autovakciny se mohou připravit také vřazením P30 do cDNA myšího PSM.

Původní typ hPSM v E. coli

C-koncová část hPSM, hPSMUO.O (aminokyseliny 437-750) se klonuje do bakteriálního bacilonosiče pET28b, aby se získal produkt s N-koncovou polyhistidinovou částí (HIS), která napomáhá jednoduše ve značné míře čištění a identifikaci protilátkou proti poly-HIS. Proteinový produkt poly-HIS značeného hPSMUO.O (proteinový produkt se pak značí HISPROSIIO.O) se vyskytl v E. coli.

DNA kódující zkrácený původní typ lidského PSM, hPSM-í-cytO. 0 se také projevuje v pET28b druhu E. coli BL21(DE3), kde se vznikající produkt lokalizuje v inkluzních tělískách. SDSPAGE analýza bakteriálního lyzátu ukáže produkt s předpokládanou migrací a Western blotting analýza s králičím anti HIS-PROSIIO.0 také dává předpokládaný pás. Dále N-koncové řazení pěti aminokyselin tohoto produktu eluovaného z gelu pro SDS-PAGE dává předpokládané aminokyselinové sevence.

115 ·· ·♦··

Skladby původního typu hPSM, hPSMO.O, hPSM-ř-0.0 (stejně jako dva hPSM mutanty, hPSMl.l a hPSM6.1, viz dále) se klonovaly do různých bacilonosičů E. coli, aby se zvýšila účinnost a některé stupně skládané struktury rekombinovaných proteinů v E. coli. Vybranými systémy jsou:

PMCT6, který generuje N-koncové His označující verze rekombinovaných proteinů,

PGH433, který představuje rekombinované proteiny v souvislosti s vedoucí sekvencí pelB aminokyseliny 22, která může směrovat proteiny do periplazmatického prostoru bakterií E. coli a

PMal-p2, v němž se rekombinované proteiny vyskytují jako Ckoncové fúze proteinu vázaného k maltóze (MBP), obsahující přírodní MBP periplazmatickou vedoucí sekvenci. Protilátky proti MBP se mohou použít k detekci fúze proteinů a oblast s uhlovodíky k afinitnímu čištění produktu.

Avšak experimenty zkoumající výskyt původního typu hPSM proteinů z těchto bacilonosičů v E.

coli ukázaly jasnou hladinu pMCT6.

původního typu hPSM

Problémy periplazmatického působení jsou nejsou dnes ještě vyřešené.

Původní typ hPSM v Pichia pas toris

Vzhledem k relativně vysoké molekulové hmotnosti proteinu PSM a relativně vysokému stupni jeho glykosylace (přibližně 16 % molekulové hmotnosti) a proto, aby se usnadnilo čištění za eliminaci stabilizačního kroku, rozhodlo se použít alternativní technologie pro eukaryotické působení

116 rekombinovaných proteinů. Některé dobře charakterizované eukaryotické systémy se vyhodnotily a pro vstupní třídění hPSM mutantů se zvolily kvasinky Pichia pastoris jako alternativa

E. coli.

Působení systému založeného na kvasinkách Pichia pastoris se aplikuje na PSM strukturách. Předpokládá se, že glykosylační charakter rekombinantních proteinů působících v tomto organismu se podobá savčímu glykosylačnímu charakteru více než např.

Saccharomyces cerevisiae díky méně rozvětvené manosylaci rekombinantního proteinu. Ukázalo se, že příjem antigenů dendritickými buňkami prostřednictvím receptoru manózy působí na T buňky přibližně s vyšším účinkem odpovídajícím 100 svinutím ve srovnání s endocytickou absorpcí do kapalné fáze. Proto manosylace může hrát roli v antigenicitě (a především ve schopnosti vyvolat CTL odezvu) u hPSM mutantů a jiných antigenů, proti nimž je CTL odezva žádoucí.

Druh Pichia pastoris, stejně jako dva různé bacilonosiče se zakoupily od Invitrogenu. Bacilonosič pPICZaA nese methanol produkující promotor proti polyklonálním místům, zatímco pGAPZaA produkuje proteiny nezávisle. Oba bacilonosiče kódují sekreční signál α-faktoru, aby se rekombinantní proteiny exportovaly do média. Systém výběru těchto bacilonosičů spočívá v rezistenci vůči zeocinu. Sekvence kódující hPSMO.O a hPSM+0.0 (stejně jako jeden mutant hPSM, hPSM.l, srovnej dále) se subklonovaly do těchto bacilonosičů (ve skladbě s Czakončeným c-myc identifikačním epitopem, SEQ ID č.: 27).

Čtyři druhy Pichia pastoris (X-33, SMD1168, GS115 a KM71) lišící se například podmínkami růstu se transformovaly s každým z těchto (linearizovaných) plasmidů s využitím • · · · • ·

117 • 4 • · 4 elektroporace. Transformační proces se několikrát opakoval s menšími obměnami, aby se získal velký počet klonů rezistentních k zeocinu. Ze systému Píchla pastoris se získaly přírodní typy hPSMeO.O (stejně jako hPSMl.1, viz dále). Produkty se zachytí ve Western blotting lyzátech transformantů Pichia pastoris jak s použitím monoklonální protilátky proti hPSM, tak monoklonální protilátky proti c-myc jako primární. Rekombinantni produkty se však stanovily intracelulárně.

Přírodní typy hPSM v savčích buňkách

Ke konečnému testováni a produkci jednotlivých molekul se také používá systém CHO buňky (z vaječníků čínských křečků).

Doposud se CHO buňky spojily s přírodním typem hPSM a hPSMl.1 a se stavebně vedoucími sekvencemi (případně bez nich) v savčím bacilonosiči pcDNA3.1. Získaly se buňky rezistentní vůči geneticinu. V buňkách COS přechodně spojovaných obdobným způsobem se stanovily jak hPSMO.O, tak hPSMl.1 ve Western blotting buněčných kuličkách s použitím monoklonální protilátky proti hPSM.

Tkáňové rozložení hPSM

K určení, zda hPSM působí v různých lidských orgánech včetně prostaty, krve a mozku, se zakoupil komerční materiál. Metoda se zakládá na bodové detekci polyA obsahujícího mRNA extrahované z 50 různých lidských tkání. Předběžné výsledky neukazují na zvýšený výskyt hPSM v tkáních, jako je krev nebo mozek. Ale s upřednostněním dat ze současné aplikace se ukazuje přítomnost PSM v jiných tkáních (srovnej výše).

Vzhled hPSM mutantů

Z hlediska mutační práce s PSM je velmi důležité uchránit modifikovanou strukturu od některých oblastí proteinu, •4 *414

118 například potencionálních a určených T buněčných epitopů, B buněčných epitopů a cysteinových zbytků s disulfidickými můstky. Proto se takové „zakázané oblasti identifikují s PSM sekvencí zanechávající omezený počet „otevřených oblastí 20 nebo více aminokyselin vhodných pro výměnu s cizími pomocnými epitopy P2 a (nebo)

P30.

Pro vymezení se za „otevřenou považuje i transmembránové oblast, protože vlastní protilátky zaměřené proti této oblasti nej sou podstatné a předpokládá se, že eliminace této sekvence zvýší rozpustnost mutovaných PSM proteinů, ale nelze vyloučit, že tato oblast obsahuje důležité CTL epitopy, proto se transmembránové oblast chrání např. v hPSM10.3.

V souladu s naším očekáváním, že autovakcina vyvolá odezvu CTL, je důležité identifikovat a ochránit potenciálně subdominantní CTL epitopy ve struktuře. Dva takové epitopy jsou známé z literatury: 1) peptidy obsahující PSM aminokyseliny 4-12 (LLHETDSAV) se vyskytují na lidské molekule MHC typu I HLA-A2.1 (Tjoa 1996) a 2) PSM(711-719) (ALFDIESKV) také váže HLA-A2.1 (ref. 25). Také jsme hledali PSM aminokyselinovou sekvenci ke stanovení primárně zachycených zbytků HLA typu I, jak popisuje Rammensee a kol. (Rammensee 1995) pro ne j rozšířeněj ší typy HLA typu I (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A23, HLA-A24 a HLA-A28) dohromady tvořící 80 %

HLA-A typů v lidské populaci. Rovněž potenciální HLA-B a HLA-C epitopy se identifikovaly a označily jako „zakázané oblasti.

Protože původní záměr byl použít C57/black x SJL F1 myší hybridy, rozhodlo se použít transgenetické myši k testování autovakcinových struktur PSM a určité množství myších H-2^b a H-2^S T pomocných epitopů se identifikovalo a označilo jako „zakázané oblasti (Rammensee 1995).

Rovněž je důležité chránit známé vazebné oblasti protilátek v molekule PSM, protože mohou být významné pro indukci specifických vlastních protilátek proti PSM. Bylo popsáno pět •Φ φφφφ

119 •Φ φφ • φ φ · ♦ · · φφφ · • φ φ •Φ φφφφ takových oblastí: PSM(63-68), PSM(132-137), PSM(482-487) , (WO

94/09820), PSM(716-723) a PSM(l-7) (Murphy 1996). S použitím počítačové metody Hoppa a Woodse k prognóze antigenních determinantů bylo předpovězeno pět oblastí: PSM(63-69),

PSM(183-191), PSM(404-414), PSM(479-486) a PSM(716-723) (Hopp 1983), z nichž některé kolidovaly s experimentálně nalezenými B buněčnými epitopy. Tyto oblasti se také ochraňují v molekulách kandidujících na PSM vakcinu.

PSM protein obsahuje 4 cysteinové zbytky (pozice aminokyselin 22, 196, 466 a 597), které se ochraňují v imunogenizovaných skladbách, protože mohou být důležité při tvorbě disulfidových můstků.

Na základě výše uvedených „zakázaných a „otevřených oblastí v hPSM proteinu se určilo 10 oblastí vhodných pro vstup cizích T pomocných epitopů:

Vstupní oblast v hPSMI (od počátečního místa do EcoRI, aminokyseliny 1-437):

Oblast 1: aminokys. 16-52 v PSM (4 aminokys. předcházející TM,

TM (24 aminokys.) a 9 aminokys. po TM = 37 aminokys).

Oblast 2: aminokys. 87-108 v PSM, 30-51 v PSM' (22 aminokys.)

Oblast	3:	aminokys.	210-230	v	PSM,	153-173	v	PSM'	(21
	aminokys.)
Oblast	4 :	aminokys.	269-289	v	PSM,	212-232	v	PSM'	(21
	aminokys.)
Oblast	5:	aminokys.	298-324	v	PSM,	241-267	v	PSM'	(27

aminokys.)

120

Vstupní oblasti v hPSMII (od EcoRI

1*·	Λ9	··	····	··	··
• ·			♦	•	•	•	•	•	• ·
•		··		•	•	•	•	•	•
•	•	• ·	«	•	•	• ·	•	•
•	•		•		•	• ·	•	•	•
····		··			··	··	··	• A··

do konečného místa, aminokys. 437-750):

Oblast	6: aminokys. aminokys.)	442-465	v	PSM,	385-408	v	PSM'	(24
Oblast	7: aminokys. aminokys.)	488-514	v	PSM,	431-457	v	PSM'	(27
Oblast	8: aminokys. aminokys.)	598-630	v	PSM,	541-573	v	PSM'	(33
Oblast	9: aminokys. aminokys.)	643-662	v	PSM,	586-605	v	PSM'	(20
Oblast	10: aminokys.	672-699	v	PSM,	615-642	v	PSM'	(28

aminokys.)

Vstupní oblasti stejně jako „zakázané oblasti znázorňuje obr. 4.

Řada různých imunogenizovaných PSM složení se připraví substitucí segmentu aminokyselin ze dvou z výše uvedených oblastí s P2 nebo P30. Každý mutantní protein tedy obsahuje jak P2 tak P30, ale takové složení je pouze ukázkové předmětem tohoto vynálezu jsou také jednotlivé mutanty. Experimentálně se mutanty připraví v klonech hPSMI, resp. HPSMII cDNA a dvě mutované části se následně spojí (v poloze EcoRI). Epitopy P2 a P30 se zpočátku vloží do vstupních oblastí 1, 2, 3, 5, 6, 8 a 10, aby se vytvořily mutanty.

P2 a P30 sekvence jsou:

P2: QZIKANSKFIGITEL (SEQ ID č. : 12, 15 aminokys.), v tomto případě kódované nukleotidovou sekvencí cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg (SEQ ID č. : 11, 45

121 nukleotidů), kde silně vyznačená sekvence je v poloze Sací.

Mohou se vyskytnout i jinak zvolené kodóny v závislosti na volbě klonovaného bacilonosiče a vybraného systému.

P30: FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID č.: 14, 21 aminokys.), v tomto případě kódovaných nukleotidovou sekvencí ttc aac aac ttc acc gta agc ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt aqc qCT AGC cac ctg gaa (SEQ ID č.: 13, 63 nukleotidů), kde silné vyznačení odpovídá pozici HindlII, jednoduché podtržení pozici Eco47lII, velká písmena pozici BstNI a dvojné podtržení pozici Nhel.

Následující tabulka shrnuje skladby lidského PSM. používané v tomto vynálezu:

Skladba pozice P2 v proteinu pozice

P30 v proteinu

hPSMO.O - 4-
hPSM-0.0	-Ť-	4-
hPSM'0.0	4-	4-
hPSMl.l	17-31	32-52
hPSMÓ.l	448-462	21-41
hPSM8.1	606-620	21-41
hPSMlO.l	674-688	21-41
hPSMl.6	24-38	443-463
hPSM1.8	24-38	607-627
hPSMl.10	24-38	673-693
hPSM1.2	24-38	87-107
hPSM1.3	24-38	210-230
hPSM1.5	24-38	301-321
hPSM2.1	91-105	21-41
hPSM3.1	213-227	21-41
hPSM5.1	305-319	21-41
hPSM8.0	606-620	4-
hPSMlO.O	674-688	-u

··· ··· · · 4 ···· «· <· l* ·· ·>··

hPSMO.l		21-41
hPSMl.0	24-38	-r-
hPSM6.3	448-462	210-230
hPSM8.3	606-620	210-230
hPSM10.3	674-688	210-230
hPSM'6.3	391-405	153-173
hPSM'8.3	549-563	153-173
hPSM'10.3	617-631	153-173

Molekulová stavba hPSM mutantů

Mutace k přepisu P2 a P30 kódovaných sekvencí se připraví s použitím hPSMlO.O a hPSMIIO.O jako výchozího materiálu.

Aby se generovala většina hPSM mutantů, P2 a P30 se zpočátku přepíší v hPSMlO.O na pozici 1. Výsledný materiál (hPSMIl.O, resp. HPSMIO.l) se následně použije jako výchozí materiál pro mutagenezi k přepsání P2 a P30 na pozice 2,3 a 5, a pro spojení s epitopem mutujícím hPSMII. HPSMIl.O se vytvoří s použitím SOE (spojení jednoduchým překrytím) PCR a následným ověřením sledu. hPSMIO.l se vytvoří technikou „Rychlé výměny a následným ověřením sledu.

P2 epitop se vloží do poloh 2, 3 a 5 hPSMl. s použitím SOE-PCR za vzniku hPSMI1.2, hPSMI1.3 a hPSMI1.5. Tato složení se kombinují s hPSMIIO.O za vzniku hPSMl.2, hPSMl.3 a hPSMl.5.

HPSMI2.1, hPSMI3.1 a hPSMI5.1 se sestavily SOE-PCR technikou s použitím hPSMIO.l jako výchozího materiálu. Tento materiál se spojil hPSMlO.O vazbou v pozici EcoRI, aby se vytvořily mutanty plné délky hPSM2.1, hPSM3.1 a hPSM5.1.

• · · · • ·

P2 epitopy se vkládají ve třech různých pozicích hPSMIIO.O, aby se vytvořily hPSMIIG.O, hPSMII8.0 a hPSMIHO.O technikou „Rychlé výměny a sled těchto klonů se následně ověřil.

Vřazení P30 epitopu v hPSMII se provádí současně, aby se vytvořily hPSMIl0.6, hPSMII0.8 a hPSMIIO.10 s použitím SOEPCR.

hPSM10.3, hPSM'10.3 a hPSM6.3 se sestavují s použitím SOE-PCR. Některé ostatní varianty hPSM s P2 a P30 vřazenými do extracelulární části hPSM se běžně sestavují (hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM'8.3).

Kromě původně uvažovaných mutantů, z nichž každý obsahuje jak P2 tak P30, se sestavily čtyři mutanty obsahující pouze jeden cizí epitop a jejich sled se ověřil: hPSMl.O, hPSM8.0, hPSMlO.O a hPSMO.l.

HPSM mutanty v E. coli

V malém počtu experimentů se objevilo sedm hPSM mutantů, hPSMl.l, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSMlO.l, hPSM2.1, hPSM3.1 a hPSM5.1 z pET28b v druhu E. coli BL21 (DE3) a IPTG produkované látky předpokládané velikosti se určily na Coomassie Blue napuštěném SDS-PAGE gely. Produkty hPSMl.1 se však nepodařilo zachytit. Hladina těchto mutantů byla ve srovnání s produkty přírodních typů hPSM-^0.0 velmi nízká. Z tohoto důvodu se odpovídající hladina hPSM mutantů s použitím pET systému v E. coli zdá nereálná, proto se musí použít jiné systémy E. coli a (nebo) jiný hostitelský organismus.

Jak se uvádí výše, hPSM6.1 a hPSMl.l se subklonují do rozdílných bacilonosičů E.coli, aby se generovaly • ·

124

N-zakončené His verze rekombinantnich proteinů používájících bacilonosič pMCT6, verze proteinů s pelB vedoucí sekvencí, která směruje protein do periplazmického prostoru bakterií E. coli s použitím bacilonosiče pGH433 a verze rekombinantnich proteinů vyskytujících se jako Czakončený fúzni protein k proteinu vázajícímu maltózu (MBP) s použitím bacilonosiče pMal-p2.

Doposud se nepodařilo získat odpovídající množství z žádné z těchto skladeb.

Protože hPSMO.O působí uspokojivě v E. coli, zatímco podobné působení hPSMO.O plné délky nebo HPSM mutantů se nepozorovalo, je možné, že přítomnost ' cytoplazmatických částí molekuly hPSM může nějakým způsobem „potlačovat výskyt plně dlouhých skladeb hPSM v E. coli. Abychom tuto hypotézu ověřili, připravili jsme dvě genetické stavby hPSMl.l a hPSM6.1 bez cytoplazmatických domén. Při experimentech v E. coli se však tyto -ι-cyt genové produkty vyskytovaly velmi slabě.

hPSM mutanty v Píchla pastoris

Aby se vyskytl hPSMl.l mutantní protein z kvasinek Pichia pastoris, hPSMl.l sekvence se subklonuje (v rámci Czakončeného c-myc identifikačního epitopu, SEQ ID č: 27) do dvou různých bacilonosičů pPICZaA a pGAPZcxA a sekvence se ověří. Výskyt hPSMl.l (stejně jako hPSM^O.O, viz výše) se určují intracelulárně v transformacích Pichia pastoris.

hPSM mutanty v savčích buňkách

Jak už bylo řečeno, hPSMl.l se subklonoval do savčích bacilonosičů pcDNA3.1(+) a pZeoSV2 a tyto (i jiné) struktury se použijí pro působení například v CHO buňkách. Přechodný • · • · · ·

125 výskyt hPSMl.l i hPSMO.O se objevil v OS buňkách, jak se potvrdilo metodou Western blotting.

DNA vakcinace

DNA vakcinace, pokud je efektivní, se velmi dobře hodí pro PSM autovakcinu - především protože se ukázalo, že tato forma podávání vakciny podporuje jak imunitní reakci zprostředkovanou CTL, tak tvorbu protilátek. Proto byl záměr předložit paralelní studii s cílem vyzkoumat účinnost DNA vakcinace myší s použitím odpovídajích bacilonosičů kódujících imunogenizovaný myší ubichitin a (nebo) myší TNFa. DNA vakcinace s hPSM (a (nebo) mutanty kódující čistou DNA se také prováděla.

Systematické studie používající imunogenizovaný ubichitin k DNA vakcinaci

Systematická studie sledující účinek DNA vakcinace s imunogenizovaným vlastním proteinem se provedla s použitím ubichitinu s vloženým T pomocným epitopem z vaječného albuminu (UbiOVA) jako modelovým proteinem. Sekvence kódující UbiOVA stejně jako původní typy ubichitinu se subklonovaly do savčího bacilonosiče pcDNA3.1(-).

Skupiny myší 5 BALB/c se imunizovaly 40 pg pcDNA-UbiOVA nebo pcDNA-ubichitin buď intramuskulárně do kvadricepsu nebo intradermálně. U kontrolní skupiny se podával přijatý UbiOVA protein v úplném Freundově adjuvans. Po třech a šesti týdnech se imunizace opakovala pouze s tím rozdílem, že UbiOVA protein se emulgoval v neúplném Freudově adjuvans.

Myším se pravidelně odebírala krev a stanovoval se titr protilátky proti ubichitinu. Ve skupině UbiOVA vakcinované DNA se našlo jen velmi malé množství protilátky proti ubichitinu. Následně byly všechny skupiny posíleny UbiOVA • · proteinem v neúplném Freundově adjuvans a odebíraly se vzorky krve, aby se zjistilo, jestli vakcinace UbiOVA a (a ne ubichitinem) zvyšuje odezvu protilátek proti UbiOVA proteinu. Výsledky tohoto experimentu ukázaly, že není podstatného rozdílu mezi UbiOVA skupinou a kontrolní skupinou, u všech myší se vyvíjely silně protilátky proti ubichitinu na základě jediné podpory UbiOVA/FIA.

DNA vakcinace s použitím struktur hPSM

Průběžně se provádějí různé experimenty s použitím hPSM struktur. Různé přírodní typy lidské PSM a AutoVac struktur (jako např. hPSMO.O, hPSM-?0.0. hPSM'0.0, hPSMl.l, hPSM10.3) se subklonovaly do DNA vakcinačních bacilonosičů (jako pcDNA3.1(+), pcDNA3.1(-), pVAX a pZeoSV2). Do některých struktur se vložily různé vedoucí sekvence (jako CDlla, tPA a IL5 vedoucí sekvence; SEQ ID č: 29, 25 a 31) přímo Nzakončením a do struktury, aby se mohly přítomné hPSM proteiny uvolnit „in vivo. Všechny struktury DNA vakcinačních bacilonosičů se ověřily řazením DNA a translací „in vitro.

Různé druhy myší (jako Balb/cA, Balb/cJ, DBA/2 a A/J) se injektovaly výše popsanou hPSM DNA vakcinoou buď intradermálně nebo intramuskulárně a vakcinace se několikrát podpořila stejnými strukturami. Vzorky séra se odebíraly během imunizační doby a skladovaly se při -20 °C. Tyto vzorky se pak analyzovaly na přítomnost protilátek reaktivních s původním typem hPSM.

Také se u těchto myší stanovila rakce na bujení CTL a T pomocných buněk.

Předběžné výsledky naznačují, že vyvolání reakce jak CTL tak protilátek proti PSM je hotové.

127 • · « · · · «·«·« ♦ · « · · * · 99

9 9 9 · 9 · · · ·9 • 9 9 9 9 9 9 9 99

999 9 99 99 99 9·99 99

Čištění a charakterizace HIS-značených hPSM (437-750) (HISPROSIIO. 0)

HIS-značené původní typy hPSMII (HIS-PROSIIO.0) se získaly z pET28b a rozpuštěná inkluzní tělíska se aplikovala do FPLC sloupce gelové filtrace a eludují se pufrem obsahujícím 8 M močovinu. Frakce obsahující převážně hPSM se podrobily různým skladebným podmínkám za účelem optimalizace procesu. U rozpuštěného produktu dialyzovaného proti Tris pufru se stanovila více než 90% čistota s použitím stříbrné SDS-PAGE.

Králíci se imunizovaly přečištěným HIS-PROSIIO.0, aby se výsledné antisérum použilo k pozdější detekci a případnému přečištění hPSM mutantů.

Čištění a charakterizace rozpustných hPSM (PROS-řO.O)

Původní typ hPSM postrádající cytoplazmatické a transmembránové části, PROSBO.0, se vyskytuje v druhu E. colí BL21 (DE3) na základě indukce s IPTG a zaznamenává se v inkluzních tělískách. SDS-PAGE tohoto bakteriálního lyzátu a následná Western blotting s králičím anti- HIS-PROSIIO.0 ukázaly očekávanou migraci produktu. N-koncové řazení prvních pěti aminokyselin tohoto produktu eluované z SDS-PAGE gelu ukázalo očekávanou sekvenci odpovídající lidskému PSM. Produkt se podrobil rozsáhlým sériím experimentů. Produkt, který v Tris pufru bez denaturantů solubilizačních a refoldačních zůstane v roztoku, se získá nebo reduktantů, ale SDS-PAGE analýza ukázala, že materiál pravděpodobně tvoří velké agregáty. Myši a králíci se imunizovaly tímto materiálem, aby se získala protilátka proti hPSM, například pro analytické účely - antiséra nereagují s LNCap hPSM.

Připravila se dávka promytých inkluzních tělísek E. coli k imunizaci králíků, aby se vytvořilo polyklonální antisérum proti PSM. Asi 50 % obsahu proteinu ve vlhkém peletizovaném « ♦ · 9 • · 4 · · · 9 · · V 9 ««* · · · · « *

128 ·*··’···· · · ·

X V ···· · 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 materiálu tvořil PROS+O.O. Antiséra nereaguji s LNCap hPSM ve

Western blotting.

Příprava KLH konjugováných peptidů hPSM pro imunizaci

Tři 15-mer peptidy se syntetizovaly, aby se vytvořily imunogenni konjugáty B buněčných epitopů známého hPSM s molekulou imunologického nosiče, a tak se získalo polyklonální antisérum schopné rozpoznat hPSM. Tyto peptidy obsahují na každém konci PSM B-buněčný epitop a 5-6 přilehlých PSM aminokyselin.

Peptidy se připravuji automatickou syntézou, HPLC čištěním a kontrolou řazeni Edmanovou degradaci.

Chemicky vázané konjugáty se připravují standardním jednokrokovým procesem, propojením B-buněčného epitopu obsahujícího hPSM peptidy KLH s glutaraldehydem jako pojidlem.

Syntéza P2 a P30 peptidů se sousedními hPSM sekvencemi

Bylo sestaveno šest peptidů odpovídajících P2 a P30 epitopům s 5 sousedními aminokyselinami na každém konci. Sousední aminokyseliny odpovídají vřazovacím místům 6,. 8 a 10. Peptidy se použijí například v testech bujení T-buněk, ale také pro jiné účely, jako ELISA a jiné ykoušky „in vitro. Peptidové sekvence jsou:

PSMpep007	P2 vřazený v pozici 6 QERGVQYIKANSKFIGITELRVDCT (SEQ ID č: 15)
PSMpep008	P2 vřazený v pozici 8 AWLRQYIKANSKFIGITELEMKTY (SEQ ID č: 16)
PSMpep009	P2 vřazený v pozici 10 MFLERQYIKANSKFIGITELHVIYA (SEQ ID č: 17)

Φ φ φ Φ · φ φφφφ

129

PSMpepOlO

Ρ30 vřazený v pozici β

PSMpepOll

PSMpepO12

Epitopy P2

ΦΦΦΦ ··

NSRLLFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEVDCTP

VVLRKFNNFTVSFWLRVPKVSASHLESFDSL

P30 vřazený v pozici 10

LMFLEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEPSSHN a P30 jsou podtržené. Peptidy (SEQ (SEQ (SEQ se

ID

ID

ID φφφφ

19)

20) připravily čištění, po automatickou syntézou a podrobily se procesu HPLC kterém následovala kontrola řazení Edmanovou degradací.

Testy imunogenity

Provedly se různé experimenty sloužící k přípravě materiálů a stanovení imunogenních testů pro budoucí testování a třídění mutovaných struktur PSM.

Tvorba polyklonálních králičích anti-HIS-PROSHO.0 a anti-KHLPSM-peptidových konjugovaných antisér

Dva králíci se imunizovali přečištěným HIS-PROSIIO.0, HIS značenou C-koncovou částí hPSM proteinu (aminokyseliny 437750) emulgovanou 1:1 s kompletním Freundovým adjuvans a dvakrát posílenou (ve 28. a 55. dni) stejným antigenem emulgovaným v neúplném Freundově adjuvans.

Dva králíci se imunizovali směsí obsahující konjugát KLH-PSM peptidů a každý ze tří volných peptidů. Každý' z těchto volných peptidů obsahoval předem definovaný B-buněčný epitop hPSM. Směs se emulgovala 1:1 s úplným Freundovým adjuvans. Králíci • ·« φφφ · φ · φ φ φφφ φ φφφ φ φ

130 φφφφ φφ φφ ·· φφφφ se přeočkovali dvakrát (ve 28. a 55. dni) stejným antigenem emulgovaným v neúplném Freundově adjuvans.

Vzájemná reaktivita mezi anti-HIS-PROSIIO.0 a PSMpep005 a vzájemná reaktivita mezi konjugátem anti-KLH-PSM peptidu a peptidy a HIS-PROSIIO.0 se demonstrovala testem ELISA. AntiHIS-PROSIIO . 0 protilátka má schopnost rozeznat přírodní hPSM v lyzátech buněk LNCaP (ve Western blotting).

Imunizace myši retrovirálně působícím hPSMO.0

V současném stavu PSM projektu je vážnou překážkou nedostatek protilátek, které jsou schopné rozpoznat správně skládané přírodní hPSM. Proto se provedl imunizační experiment s použitím retrovirálně působícího hPSMO.0.

Šest skupin Balb/c myší se imunizovalo buď: 1) mitomycinem C zpracovaným BALB/c buňkami fibrosarkomu (79.24.H8), přenášeným hPSMO.0 cDNA (CMV-Koz-hPSM), 2) mitomycinem C zpracovaným BALB/c buňkami fibrosarkomu (79.24.H8), přenášeným prázdným bacilonosičem (CMVBipep), 3) obalovými buňkami (BOSC) infikovanými hPSMO.0 cDNA (CMV-Koz-hPSM ), 4) obalovými buňkami (BOSC) infikovanými prázdným bacilonosičem (CMVBipep),

5) retrovirovým kmenem představujícím hPSMO.0 cDNA (CMV-KozhPSM ), nebo 6) retrovirovým kmenem představujícím prázdný bacilonosič (CMVBipep).

Několikrát se myším odebrala krev a získaná séra se testovala na reaktivitu proti HIS-PROIIO.O (ELISA). Bohužel, žádné z myší nevyvíjely protilátky schopné specificky rozpoznat preparát HIS-PROSIIO.0.

Stanovení anti-hPSM metodou ELISA

Přečištěný HIS-PROSIIO.0 se použil na potažení polystyrénových mikrotitračních destiček (Maxisorp) pro ELISA analýzu ♦ · « · • · testující např. kapaliny nad hybridomem nebo myší a králičí antiséra. Séra z BALB/c myší imunizovaných stejným preparátem HIS-PROSIIO.0 reagovala s imobilizovaným HIS-PROSIIO.0 při 0,5 pg na peroxidázu označující králičí anti-myší Ig jako sekundární protilátku.

Jak se píše výše, schopnost u králíků zvýšeného antiséra proti konjugátu KHL-PSMpep004-PSMpep005-PSMpep006 ve směsi s volnými peptidy reagovat s imobilizovaným HIS-PROSIIO.0 se prokázala ELISA analýzou.

Při použití AquaBind® mikrotitračních destiček (viz údaje v patentu WO 94/03530, kde se popisují mikrotitrační povrchy potažené dextranem aktivovaným tresylem, které se teď označují registrovanou ochrannou známkou AquaBind) , se stanovily imibilizované PSM peptidy (PSMpep004, PSMpepOOS a PSMpep006) ELISA analýzou. AquaBind® destičky potažené těmito peptidy detekují zvýšení králičího antiséra proti stejnému antigenovému preparátu. Jak se uvádí výše, králičí anti-HISPROSIIO.O se detekuje na AquaBind® destičkách potažených PSMpep005.

Stanovení anti- hPSM „Western blot metodou s použitím LNCaP buněk a monoklonální protilátky 7E11C5

7E11C5 B buněčné produkty lymfocytické fúze, které vylučují myší IgG2a monoklonální protilátku proti intracelulárnímu epitopů lidského PSM se odebrala z ATCC. Kultivační tekutina z asi 90 % mrtvých buněk se sebrala a použila ve Western blotting ke stanovení lidského PSM v membránově obohacených preparátech LNCaP buněk, a také v buněčných lyzátech LNCaP. Tato protilátka se čistila za použití proteinových G kolon a její reaktivita s LNCaP se ověřovala ve Western blotting.

132

Stanovení metody FACS k detekci hPSM na LNCaP buňkách

Sestavili jsme vzájemně nezávislé FACS metody ke stanovení hPSM na LNCaP buňkách. Objevily se některé problémy: LNCaP buňky rostou velmi pomalu a nepravidelně, proto by se měla optimalizovat metoda přípravy jednotlivých buněčných suspenzí. Za druhé, epitop rozpoznaný mAb 7E11C5 se v literatuře definuje jako součást cytoplazmatické domény hPSM. Proto se vyvíjí metoda fixace a permeabilizace buněk. Za tím účelem se protein G přečištěný protilátkou 7E11C5 konjugoval FITC, a tak se mohl použít v FACS analýze bez sekundární protilátky.

Také se sestavila metoda FACS využívající anti-hPSM monoklonální protilátku J591, která rozeznává epitop na extracelulární části hPSM. Protilátka se získala z biologických BZL a FITS konjugátů a následně se použila k FACS analýze a třídění například LNCaP buněk a hPSM.

Stanovení testů cytotoxicity

Realizovala se metoda čištění dendritických buněk z kostní dřeně myší. S použitím modelových proteinů se optimalizovala imunizace myší dendritickými buňkami impulzovánými modelovými peptidy typu I. Myši se také imunizovaly modelovým proteinem (β-galaktosidázou)tvořenou ve formě ISCOMS. Přečištěné T-buňky z imunizovaných myší se „in vitro restimulovaly různými formami odpovídajících antigenů. Následně se měřila schopnost těchto restimulovaných CTL rozkládat různé druhy cílových buněk (včetně impulzovaných dendritických buněk, stejně jako infikovadel představujících retrovirální cytosolický peptid typu I) . Stanovily se dva různé postupy měření CTL aktivity· „in vitro s použitím buď uvolňování chrómu nebo DNA fragmentace (metoda JAM) jako měřítka cytotoxicity. Velmi pěkné výsledky se získaly s modelovým proteinem βgalaktosidázy a s různými kombinacemi MHC typu I a typu II vázajícími modelové peptidy.

·· φφφφ

Φ· · · « φφ φ «φφ φ φ ·· · · φ φφ · φφφφφφ φφφφ φ

1QO Φ ΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦΦ

W φφφφ φφ ·φ ♦♦ ·♦ φ···

Určeni metody studia narušeni samotolerance vůči myšímu PSM u myší

Záměrně se sleduje, zda se samotolerance k myšímu PSM u myši může rozbít imunizací a (nebo) DNA vakcincí proti PSM myšovitých s použitím molekul PSM AutoVac.

Jak se uvádí výše, cDNA kódující PSM myšovitých (mPSM) se po získání rozdělí z hlediska DNA. Vřazením P30 na dobře definovaných pozicích do mPSM nebo mPSM' plné délky se generovaly čtyři varianty molekul mPSM. Jejich stavba je následující:

mPSM aminokyseliny délka molekuly substituované P30 (č. aminokyselin)

mPSMO.O	-ř-	752
mPSMO.O	-ř-	694
mPSMX	255-271 (SEQ ID č: 8)	756
mPSMY	689-700 (SEQ ID č: 8)	760
mPSM'X	197-213 (SEQ ID č: 10)	698
mPSM'Y	631-642 (SEQ ID č: 10)	702

Nejprve se původní typ mPSM a molekuly analogu subklonují do DNA vakcinačního bacilonosiče a použijí se k DNA vakcinaci myší.

Účelem je analyzovat imunitní odezvy jako odezvy CTL a eliminaci nádorů u myší. Proto se nádorové buněčné řady myšovitých infikují původním typem PSM myšovitých (připojeným v rámci identifikačního konce, např. c-myc epitopu, SEQ. ID č: 27, pro detekční účely).

• 4 ·44· • · • ·4 4 4 4 · ·· • · · · · 4 444 4 4

QJ 4 44 4444444

134 4444 ·· 44 44 44····

PSM nádorové modely „in vivo

Zkoušky T buněčného bujeni s P2 a P30 u myší

Série experimentů bujení T buněk se provedla pro stanoveni T buněčné imunogenity P2 a P30 peptidů v různých druzích myší(BALB/cA (H-2^d) , C3H/Hen (H-2^k) , DBA/1 (H-2^q) a C57BL/6 (H2^b) ) . Je dobře známo, že tyto epitopy jsou u lidí smíšené, ale nestejnorodost T buněk u myší bylo nutné experimentálně potvrdit. Ukázalo se, že P30 je imunogenni k T buňkám v druzích BALB/cA a C57BL/6, zatímco ani P2 ani P30 nejsou imunogenni proT buňky v C3H/Hen. V DBA/1 T buňky se zvyšují proti P2.

Generování nádorových buněk představujících hPSM u myší

K použití hPSM specifického nádorového modelu myšovitých, stejně jako pro zkoušky bujení nádorových buněk se stanovilo vzorový seznam myších nádorových buněk představujících hPSM.

Jedním úkolem je generovat tyto buněčné řady přenosem nádorových buněčných řad myšovitých retrovirálním bacilonosičem kódujícícm úplný původní typ hPSMO.0 cDNA.

Sestavily se tři různé struktury kódující úplný původní typ cDNA, která kóduje lidský PSM vřazený do polyklonálního místa retrovirálního bacilonosuče CMVBipep, z nichž dvě obsahovaly krátkou Kozákovu protisměrnou sekvenci startujícího kodónu.

Tyto struktury se přenesly do tří různých myších nádorových buněčných řad: P815 (mastocytom, H-2^d) , B16-F10 (melanom, H-2^b) a 79.24.H8 (fibrosarkom, H-2^d) s použitím BOSC balící buněčné řady. Ze všech tří typů se získaly klony rezistentní ke geneticinu a PCR analýzou na genomickém vzorku DNA se ověřilo, že retrovirální struktury se integrují v hostitelských buňkách. Dosud nebylo možné zachytit produkt představující PSM

135 gen Western blot nebo

FACS analýzou s použitím 7E11C5 monoklonální protilátky.

Dvě stabilní myší nádorové buněčné řady uchováváj ící membránově vázaný typ lidského

PSM se stanovily infikaci. Ta se provedla pomocí hPSMO.O cDNA subklonované do savčího bacilonosiče pcDNA3.1 { + ) , řízené CMV promotorem a obsahující

Kozákovu protisměrnou sekvenci startujícího kodónu.

Výsledným plasmidem se infikovaly dvě různé myší nádorové buněčné řady: 79.24.H8 (fibrosarkom z BALB/c) a SalN (fibrosarkom z A/J). Získaly se kultury rezistentní ke geneticinu a podrobily se Western blotting a FACS analýzám s použitím J591 a 7E11C5 anti-hPSM monoklonálních protilátek. Při použiti J591 při FACS se buňky rozdělily do několika skupin až do získáni hPSMpositivni populace. Výskyt hPSM se opět ověřil intracelulárním FACS barvením s použitím 7E11C5 protilátky. FACS analýzou se také zkontrolovalo, že hladina MHC typu I je stejná jako u mateřských buněčných řad.

Kultury 79.24.H8 a SalN buněčných řad představující hPSM se klonovaly při omezeném ředění. Některé získané klony se testovaly na různé hladiny hPSM FACS analýzou s použitím antihPSM monoklonální protilátky j591.

79.24.H8 buňky představující hPSM se infikovaly genem kódujícím B7.1 pro použití např. „in vitro k monitorování CTL odezvy specifické na hPSM a (nebo) uvolňování gamainterferonu. Buňky se jednou roztřídily pomocí FACS s použitím anti-B7.1 antiséra.

Stanovení hPSM specifických nádorových modelů u myší

Rozhodlo se stanovit alespoň dva „in vivo nádorové modely u imunologicky vyhovujících myší, aby se stanovil protinádorový efekt protilátek rostoucích v myších proti molekulám ·

136 ·*’ *·»· ·· »* <··»· • « · · · • « · · · 9 9

9 9 9 9 9

99 99 že se • ·· «· •♦ • * «» imunogenizovaného hPSM. Je naděje, injektovánim syngenetických myších nádorových buněčných to podaří řad modifikovaných na půvdni typ hPSM na povrch membrány. Použiji se buňky tvořící pevné nádory a (nebo) ty, které metastázují. V modelu se použily buněčné řady, které se implantuji do syngenetických myší aniž by se u nich potlačila přítomnost cizích hPSM molekul. Schopnost hPSM vakcin eliminovat tyto nádorové buňky se využila k výběru kandidátů na hPSM vakcinu.

Aby se vyhodnotil růst SalN buněk infikovaných úplným lidským PSM, různé dávky (2.10⁶ a 5.10⁶) hPSM infikujících SalN buňky (S-PSM, pětkrát tříděné) se injektovaly subkutánně do dolní části pravé slabiny skupiny myši A/J. pevné nádory se však nezjistily. Následně se inektovaly tři klony S-PSM buněk s různou hladinou hPSM subkutánně do tří skupin A/J myší v dávce 10⁷ buněk na lmyš. Velikost zjištěných nádorů se měřila dvojrozměrně, takže ve výsledku se získala velikost nádoru v mm². Tyto hodnoty se srovnaly pro tři sledované skupiny. V rozmezí 3-6 dní se u všech myší vyvinul pevný nádorový útvar, který přibližně do 15 dnů zase zmizel. To je zřejmě dáno přítomností lidského PSM na povrchu nádorových buněk, i když to dosud nebylo ověřeno. SalN buňky infikované pouze pcDNA3.1 bacilonosičem pokračují v růstu jako pevné nádory u myší.

Jednoduchý průběh se pozoroval u myši injektovaných ΙΟ⁶, 5.10⁶ nebo 10⁷ buněk 79.24.H8 infikovaných hPSM a několikrát tříděných z hlediska hPSM. Tyto buňky (nazývané 79-PSM) také netvoří nádor ani u Balb/c, ani u DBA/2. Jestliže se však klon hPSM infikující buňky 79.24.H8, 79-PSM.3, injektuje do Balb/c nebo DBA/2, vyvíjí se u myší pevný nádorovitý útvar, který zase zmizí za 10-20 dnů. Při infikaci 79.24.H8 bacilonosičem růst nádoru v myších Balb/c pokračuje.

·· φφ «φ Φ·Φ··» «φ φ · φ « Φ » · · · ·· • φφ ΦΦΦ ΦΦ*

ΦΦΦφΦΦ Φ · Φ ♦ Φ ι ο*7 φ φφ φφφφ φφφ

1J/ φφφφ φφ φφ ·· »···*·

Ještě zbývá zhodnotit, jestli jsou uvedené „nádory” léčitelné, nebo jestli se stanoví lepší nádorový model založený na popsaných S-PSM a 79-PSM buněčných řadách a klonech.

Závěry

Z hlediska molekulární struktury jsme uspěli v klonování lidského genu PSM a získání myšího PSM cDNA. Připravila se série plně sekventovaných imunogenizovaných hPSM autovakcin. Mutanty hPSM, stejně jako různé původní typy molekul hPSM se vyskytly v E. coli a zjistilo se (a také ověřilo), že jejich hladina v E. coli je velice nízká. Polyklonální protilátky proti C-zakončené polovině hPSM se indukovaly v králících. Značné úsilí se věnovalo realizaci různých zakončení vhodných pro výskyt (His zakončení, proteinová fúze vázající maltózu), a také alternativní systémy k E. coli. Rekombinantní původní typ a (nebo) autovakcina hPSM se zachytila v infikované Pichia pastoris a savčích buňkách. Uvažovalo se o užitečnosti technologie DNA vakcinace a provedly se předběžné realizační studie. Experimenty týkající se DNA vakcinace s molekulami hPSM autovakciny právě probíhají a ukazují slibné předběžné výsledky. Provádějí se různé zkoušky „in vitro” vhodné k testování a třídění mutantních PSM struktur, včetně imunochemických zkoušek a FACS analýz. Myší nádorové buňky se trvale infikovaly úplným původním typem hPSM a roztřídily se

FACS pro povrchové působení na hPSM. Získaly se klony těchto buněčných řad.

„In vivo” xenogenetické nádorvé modely u myší se hodnotily s použitím nádorových buněk u myší.

těchto nosných hPSM syngenetických

Provedla se série zkoušek bujení T buněk, aby se vybraly druhy myší vhodné pro nádorové modely. Optimalizovaly se zkoušky CTL a získaly se uspokojivé výsledky s modelovými antigeny při použití různých imunizačních metod a experimentálních podmínek. Dále se určily nástroje potřebné k rozbití odolnosti vůči myšímu PSM při imunizaci proti myším PSM autovakcinám.

·· · o ·· ···· ·· ·· • · · · · · · · · · · «·· · β · · * · • 0···* ···« · 138 ····*·· ·· ·· ·· ····

Příklad 2

Produkce Her2 autovakciny

Lidská autovakcina proti Her2 se vyvíjí modifikací molekuly vřazením jednoho nebo více smíšených cizích T buněčných epitopů, aby se odkryl úsek imunogenizovaných Her2 molekul. Tyto modifikované proteiny se testují, na schopnost indukovat protilátky, které jsou vzájemně reaktivní s přírodními částmi molekuly Her2. Následně se na několika „in vitro pokusech a „in vivo živočišných modelech hodnotí efektivnost různých struktur (to může být i případ s DNA vakcinací) a modifikovaných proteinů. Analyzovalo se vyvolání specifické CTL odezvy proti Her2 nosným nádorovým buňkám. Testovaly se také indukované protilátky, a to z hlediska jejich schopnosti aktivovat doplněk klasickou cestou a indikovat ADCC prostřednictvím Fc-receptorů. Nakonec se různé modifikované molekuly testovaly v živočišných modelech lidské rakoviny prsu, aby se vyzkoušela jejich účinnost při léčbě nádorů.

Imunogenní krysí a lidské molekuly se spojily se smíšenými Tbuněčnými epitopy v různých polohách v molekule.

Během vakcinace proti úplné extracelulární oblasti Her2 může dojít v určité míře ke vzájemné reakci protilátek s jinými EGFr receptory, protože některé, z těchto receptorů jsou v extracelulární oblasti homologické až ze 40-46 %. Proto se plánuje, že se uzavřené oblasti Her2 poruší vložením cizích T buněčných epitopů alespoň do některých modofikovaných proteinů (detaily viz dále).

Oblasti Her2, které mohou být potencionálními CTL nebo Bbuněčnými epitopy, se odstraní ze struktury (viz obr. 3) . Odůvodnění pro využití těchto poloh je následující:

• · • ·

139

Sekvence lidského Her2 se rozdělí do řady oblastí výhradně v závislosti na primární struktuře proteinu.

Extracelulární	(receptorová) část:
1-173:	Oblast I (N-oncová oblast vyzrálého polypeptidu).
174-323:	Oblast II (oblast bohatá na cystein, 24 cysteinových zbytků).
324-483:	Oblast III (ligand vázající oblast v homologickém EGF receptorů).
484-623:	Oblast IV (oblast bohatá na cystein, 20 cysteinových zbytků).
624-654:	Transmembránová oblast (TM zbytky 654-675) .
Intracelulární	(kinázová) část:
655-1010:	Oblast tyrosin kinázy (jádro TK pblasti 725992) .
1011-1235:	Oblast C-zakončení.
Výběr poloh	v aminokyselinové sekvenci Her2 zaplněných

P2 nebo P30 lidskými T pomocnými epitopy je dán následujícími parametry (volně priorizovatelnými):

1. Známé a předpokládané CTL eitpy

2. Homologie k odpovídajícím receptorům (EGFR částečně)

3. Ochrana cysteinových zbytků

4. Předpokládané struktury - cyklická, α-helix a βskládaného listu

5. Potenciální N-glykosylační místa

6. Prognóza odkrytých a skrytých aminokyselinovýc zbytků

7. Organizace oblastí

CTL epitopy se vyskytují jako klastry v oblasti I, III, TM, a ve dvou nebo třech „horkých bodech v oblasti TK. V souladu s předkládaným vynálezem se tyto oblasti z velké části zachovaly.

• · e ·

140

Oblasti s vysokým stupněm homologie s jinými receptory jsou pravděpodobně strukturně významné pro „celkovou terciární strukturu Her2, a tudíž pro rozpoznání protilátky, zatímco oblasti s nízkou homologií se mohou následně zaměnit pouze s lokálními strukturními modifikacemi.

Cysteinové zbytky se často zapojují do intramolekulárních disulfidových můstků, proto jsou významné pro terciární strukturu a není vhodné je měnit. Oblasti předpovídající vznik struktur α-helix a β-skládaného listu je lepší vynechat jako vstupní body cizích epitopů; tyto oblasti jsou pravděpodobně důležité pro skladbu proteinu.

Potenciální N-glykosylační místa je také vhodné zachovat, protože je velmi žádaná manosylace proteinu (například v kvasinkách), srovnej přítomnost receptorů manózy na APC.

Oblasti, u nichž se předpokládá, že jsou uvnitř molekuly, se pokud možno zachovávají a zapojují se do skladby. Na rozdíl od toho oblasti vystavené rozpouštědlu nabízejí polohy pro vstup modelových T_H epitopů P2 a P30.

A konečně se bere v úvahu také organizace proteinových domén, protože je důležitá pro strukturu a funkci proteinu.

Základním strategickým bodem je zachovat strukturu extracelulární části Her2 v co možná největší míře, protože se jedná o tu část proteinu, která je důležitým ukazatelem neutralizačních protilátek. Naproti tomu intracelulární část přírodní membrány vázající Her2 na povrchu rakovinných buněk je pro humorální imunitní systém nepřístupná.

Proto je důvodem k začlenění této části do vakciny pouze přítomnost CTL epitopů. Obvykle se tady umístí jeden jebo více epitopů. Ukazuje se, že se v E. coli nebo v kvasinkách nemůže

4* 4444

4 · ·

4 4

4

141 vyskytovat úplná molekula Her2, intracelulární část se zkrátí po prvním „horkém bodu CTL epitopu (okolo polohy 800). Dodatečné CTL epitopy se pak mohou přidat k C-zakončené části zkrácené molekuly.

Transmembránová oblast je pravděpodobně nezávislou skladebnou jednotkou a její substituce T_H epitopy, jako P2 nebo P30 neovlivní strukturu a skladbu Her2. Navíc TH oblast může způsobit velké problémy při působení v kvasinkách a coli a nesmí se v žádném případě substituovat. Epitop se tedy především umisťuje do této oblasti ve všech strukturách (snad vyjma 1 struktury, která obsahuje nějaké CTL epitopy a která se nějak zapojí do přenosu signálů ligandovou vazbou).

Extracelulární oblast se v principu může udržet intaktní umístěním P2 a P30 do intracelulárních a transmembránových oblastech, čímž se maximalizuje počet potenciálních Bbuněčných epitopů při co nejmenším narušení struktury. Vysoký stupeň homologie k EGFR, Her-3 a Her-4 však vytváří riziko vzájemné reaktivity těchto receptorů, která může (i když nemusí) být nežádoucí. Navíc se popsaly některé monoklonální protilátky, jejichž agonistická funkce vzhedem k receptorům (pravděpodobně stimulováním heterodimerizace neboligandové vazby) zvětšuje velikost nádoru „in vivo. Proto se vybírá taková pozice v extracelulární oblasti, aby se snížilo toto riziko.

Výběr zahrnuje všechny již uvedené parametry a zakládá se na dvou různých předpokladech:

(i) Vřazení v nechráněných oblastech (s ohledem na příslušné receptory) pomáhá udržet terciární strukturu a může snižovat nežádané aktivity protilátek.

(ii) Vřazení v dobře chráněných oblastech mění strukturu, ale současně může snižovat riziko vzájemné reaktivity za rozbití nejbližších sekvencí.

• · · · • 9 • · · * · · »9 9

9 9 9

9.9 9 9

142

Oba předpoklady jsou spekulativní a předpovědět efekt umístění epitopu proteinu; některé z těchto pozic •· a · •· •· • · je velmi těžké v některé jsou obsaženy ve • 9 strukturách.

Uvažovalo se o tom, že by bylo výhodné úplně odstranit dvě oblasti bohaté na cystein. Předpokládá se, že tvoří rozpustné cyklické struktury a může tvořit nezávislé skladebné jednotky zřejmě zasahující do dimerizace (jak ukazuje mnoho cysteinů, které slouží k přísnému dodržení struktury nezbytné k tvorbě dimerizační oblasti). Odstranění těchto struktur může proto eliminovat riziko aktivace protilátkami a snížit počet vzájemně reagujících protilátek, takže tyto domény jsou nejlépe chráněné z extracelulární části proteinu. Navíc, oblasti bohaté na cystein mohou být problematické při produkci v E. coli nebo kvasinkových buňkách.

Detaily struktur používají P2 a

P30 epitopy jako neomezené vzorky: P2 epitop se primárně umisťuje do extracelulární oblasti Her2 v kombinaci s P30 epitopem substituujícím část nebo všechny membránové oblasti.

základě výše uvedených kritérií, uvádějí v následujícím souhrnu:

P2 epitop se umisťuje na

Preferované struktury se

Název struktury	Poloha P2	Poloha P30	Délka
hHER2MA2-lA	59-73	632-652	795
hHER2MA2-2A	103-117	632-652	795
hHER2MA2-3A	149-163	632-652	795
hHER2MA2-4A	210-224	632-652	795
hHER2MA2-5A	250-264	632-652	795
hHER2MA2-6A	325-339	632-652	795
hHER2MA2-7A	369-383	632-652	795
hHER2MA2-8A	465-489	632-652	795
hHER2MA2-9A	579-593	632-652	795

• · e · · ·

143

hHER2MA2-lB	59-73	661-675	795
hHER2MA2-2B	103-117	661-675	795
hHER2MA2-3B	149-163	661-675	795
hHER2MA2-4B	210-224	661-675	795
hHER2MA2-5B	250-264	661-675	795
hHER2MA2-6B	325-339	661-675	795
hHER2MA2-7B	369-383	661-675	795
hHER2MA2-8B	465-479	661-675	795
hHER2MA2-9B	579-593	661-675	795
hHER2MA2-lY	59-73	710-730	795
hHER2MA2-2Y	103-117	710-730	795
hHER2MA2-3Y	149-163	710-730	795
hHER2MA2-4Y	210-224	710-730	795
hHER2MA2-5Y	250-264	710-730	795
hHER2MA2-6Y	325-339	710-730	795
hHER2MA2-7Y	369-383	710-730	795
hHER2MA2-8Y	465-479	710-730	795
hHER2MA2-9Y	579-593	710-730	795
hHER2MA2-Z	695-709	710-730	795
hHER2MA2-C	653-667	632-652	795
hHER2MA2-BX	695-709	661-675	795
hHER2MA2-AX	695-709	632-652	795
hHER2MA2-4E	210-224	5-25	795
hHER2MA2-6E	325-339	5-25	795
hHER2MA2-8E	465-479	5-25	795
hHER2MA5-4D	210-224	632-652*	666
hHER2MA5-6D	325-339	632-652*	666
hHER2MA5-8D	465-479	632-652*	666
hHER2MA6-C	653-667	632-652	702

Poloha epitopu indikuje první a poslední aminokyselinovou pozici epitopu vzhledem k výchozímu bodu zralého Her2. Délka znamená délku úplné struktury v aminokyselině. Ve všech uvedených strukturách kromě těch, které jsou označeny *, epitop nahrazuje úsek aminokyseliny o stejné délce. znamená, že « ♦ • · · ·

144 epitop je spíše vřazen do Her2 )nejde tedy o substituci).

Všechny výše uvedené struktury jsou zkrácené verze zralého Her2, kde vynechaná část je z C-zakončeni.

Většina struktur existuje v různých verzích, například v bacilonosiči pcDNA3.1+ ve fúzi s přírodní Her2 signální peptidovou sekvencí, v bacilonosiči pMT/BiP/V5-His-A jako fúze s BiP hlavním peptidem pro působení v buňkách Drosophila a bez hlavní sekvence v bacilonosiči pET28b pro působení v buňkách

E. coli.

Níže se popisují modely využitelné pro třídění a řazení modifikovaných Her2 proteinů.

1. Tvorba protilátek u transgenetíckých myší s krysím Her2 a u králíků vzhledem ke krysímu a lidskému Her2 se sledovala konvenční ELISA technologií po alespoň třech imunizacích. K přímé kontrole se použily komerčně dostupné protilátky vzhledem ke krysímu a lidskému Her2.

2. Tyto králičí protilátky se použily ke studiu předpokládaného potlačení růstu lidských a myších nádorových buněk přeměňujících Her2 v „in vitro modelu.

3. T buněčné bujení PBL od pacientů imunizovaných tetanem směrem k vybraným lidským molekulám Her2 se sledovalo konvenčními metodami.

4. Schopnost modifikovaných krysích Her2 molekul vyvolat odezvu CTL u transgenetíckých myší s krysím Her2 se sledovala na nádorech z těchto myší, které sloužily jako srovnávací materiál.

5. Zamýšlí se syntentizovat vybranou sadu peptidů v transmembránové oblasti lidského Her2 ozahrnující P2 a P30 epitopy. Tyto peptidy se budou testovat z hlediska

145 bujení PBL od lidí předem imunizovaných tetanovým toxinem, aby se zjistilo, zda P2 a P30 epitopy se mohou účinně zpracovávat vně sekvencí s Her2 a působit na T buňky.

6. Je docela možné, že vybrané lidské modifikované Her2 proteiny se budou testovat na tvorbu neutralizačních protilátek v myši, která se geneticky vybaví tak, aby produkovala pouze lidské VDJ geny. Je k dispozici myš ze spolupracující firmy Abdenix ve Fremontu, CA, USA.

Byly popsány čtyři dobře definované transgenetické myši modely pro rakovinu prsu, které obsahují krysí Her2 onkogen. U prvních třech skupin transgenetických myší se vyskytuje aktivovaný Her2 onkogen, zatímco čtvrtý model využívá neaktivovaný Her2. Všechny modely používají MMTV promotor k řízení výskytu v prsních žlázách.

Rozhodli jsme se použít dva modely transgenetických myší: 1) model agresivnějšího nádoru popsaný Mullerem et al využívající aktivovaného Her2 onkogenu (Muller et al., 1989) a 2) model méně agresivního nádoru , ve kterém inaktivovaný Her2 tvoří ložisko nádorů prsní žlázy s dlouhou latencí (Guy et al., 1992). Obě skupiny transgenetických myší poskytly Jacksonova a (nebo) Charles Rivers laboratoře.

V počátečních experimentech se předpokládá, že myši produkují protilátky a CTL odezvy imunizací a posílením modifikovanými krysími Her2 proteiny. Výskyt nádorů se pak sleduje jinde posanými postupy (Muller et al., 1989; Guy et al., 1992; Katsumata et al., 1995). Hladina protilátek se měří ELISA analýzou. Aktivita CTL se stanoví generováním cílených buněk představujících výše uvedený krysí Her2.

Alternativně se pro pasivní vakcinaci může použít model štěpu cizího karcinomu u holých myší. Holým myším se transplantují

99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9.99 9 9 Φ · Φ « φφ ΦΦΦ · · ♦ 9 9 9

146

ΦΦΦΦ «φ ΦΦ ·» ΦΦ «Μ» lidské nádory a usiluje se o potlačení nádorů pasivním přenosem séra z normálních nebo humanisovaných myší úlohy protilátky imunizovaných modifikovanými Her2 proteiny. Tato metoda je použitelná ke sledování v potlačených nádorech, zatímco aktivitu

CTL nelze v tomto systému přímo měřit.

V druhém modelu „in vivo se nádory transplantací buněčných řad z nádorů také generuj i v myších transgenetických myší popsaných výše. Buněčné řady generované z těchtomyší se přenesou do odpovídajícího druhu myší a lokalizují se podle standardních zápisů.

Přenos myších nádorových buněk přes krysí Her2:

V tomto systému se buňky infikují krysími geny a přenesou se do MHC kompatibilních myší. Potlačení růstu nádoru se dosáhne generováním anti- Her2 odezvy.

V těchto systémech modifikované Her2 proteiny se použijí jako vakcina v adjuvans pro generování protilátek a CTL odezvy.

DNA vakcinace se může úspěšně použít v některých systémech ke zvýšení účinné imunitní odezvy. Průběžně jsme sledovali způsoby dodáváni DNA pomocí modifikovaných vlastních proteinů. Máme snahu využít DNA vakcinaci ke stanovení účinků modifikovaného Her2 inhibujícího nádory v transgenetických myších modelech rakoviny prsu. Jednoduchý postup by se případně mohl aplikovat na léčbu tohoto onemocnění u lidí.

Přiklad 3

Výroba vakciny proti FGF8b

Následující část popisuje, jak se vyvíjí lidská autovakcina proti FGF8b modifikací molekuly tak, že se vřadí jeden nebo více smíšených cizích T buněčných epitopů, aby se odkrylo pole imunogenizovaných „FGF8b molekul. Struktura se testuje

147 z hlediska schopnosti vyvolat protilátky, které jsou vzájemně reaktivní s autentickými částmi molekuly FGF8b. Následně se v několika „in vitro zkouškách a „in vivo živých modelech hodnotí účinnost různých struktur. Indukované protilátky se testují na schopnost aktivovat sadu klasickou cestou a iniciovat ADCC pomocí Fc-receptorů. Nakonec se různé molekuly testují v živých modelech lidské rakoviny prostaty a prsu.

Struktura, autovakciny proti FGF8b

Díky úplné identitě myších a lidských FGF8b polypeptidů se všechny struktury mohou použít k experimentům u lidí i myší.

Smíšený tetanový toxin T pomocných buněčných epitopů P2 a P30 s úspěchem používaný v lidské TNFa vakčině se vložil do FGF8b polypeptidu. Vzhledem k malé velikosti FGF8b se může přiřadit jeden epitop na molekulu. Jiné smíšené T pomocné buněčné epitopy, jako je chřipkový hemoglutininový epitop HA (307-319) a mohou se uvažovat i jiné zde uváděné T-buněčné epitopy (O' Sullivan, 1991).

Připravily se 4 různé imunogenizované FGF8b struktury s epitopy rozmístěnými po molekule. Tyto čtyři struktury se připraví na základě vícenásobného a párového uspořádání FGF skupiny proteinů. Párové uspořádáni FGF2 a FGF8b se použije jako základ pro analýzu předpokládané sekundární struktury v celé molekule FGF8b (tj. rozložení β-skládaného listu). Zbytky, které se zadrží mezi FGF2 a FGF8b, netvoří shluky nikde v třídimenzionální struktuře, což ukazuje, že v molekule nejsou žádné oblasti, které by se nemohly přemístit bez zhoubného účinku na konformační schopnosti. Aminokyselinové zbytky v FGF2 připojené k cysteinovým zbytkům v FGF8b jsou ve velmi těsném vzájemném třídimenzionálním uspořádání, což naznačuje, že tvoří v FGF8b disulfidovou vazbu, a že « ·

148 uspořádání je správné. Také se počítá s flexibilitou N-koncové části FGF2.

Varianta FGF8b s P30 epitopem v N-zakončení (F30N) se navrhla na základě těsného uspořádání aminokyselinových zbytků FGF8b proteinu a epitopu P30 (SEQ ID č: 14) a vyhodnocení různých pozic vzhledem k chemickým vlastnostem každého aminokyselinového zbytku. V úvahu připadají pouze N-koncové oblasti předpokládané β-válcovité struktury. V případě F30N je podobných 9 z 21 zbytku. S využitím tohoto pseudoalgoritmu lze očekávat, že substitucemi dojde k minimálním změnám celkové struktury. Sekvence čtyř různých struktur, stejně jako třídimenzionální představitele zaměněných aminokyselin znázorňuje obr. 6.

Varianta FGF8b s P2 epitopem (SEQ ID č: 12) v C-zakončení (F2C) se původně navrhla stejně jako F30N. Tady se však předpokládá dobrý Kd epitop v pozicích 195-203. proto se P2 epitop vkládá právě C-zakončením. Zase v úvahu připadají pouze C-koncové oblasti předpokládané β-válcovité struktury.

Vnitřní varianty FGF8b (F30I a F2I) se sestaví záměnou vnějších kliček ve struktuře FGF2 epitopy P2 a P30, přičemž βválcovitá strukturní podstata FGF zůstává pravděpodobně nezměněná.

Imunogenizované molekuly FGF8b se vyskytují v Eschericia coli, což poskytuje celou řadu proteinových produktů za minimální cenu. I když FGF8b obsahuje dvě potenciální glykosylační místa (Asn31 a Asnl77), bakteriálně působící rekombinantni FGF8b se ukázal jako biologicky aktivní (MacArthur, 1995a; Blunt, 1997). Aby se docílilo přečištění a přeskládání struktury, FGF8b varianty se připravují v His značené verzi pro možnost vazby k Ni-nabité koloně.

»

9 9 9 9 · · 9 · ♦·'· • 999 9« ·· «99 * · * « ·*

9 9 < · 9 · * 9 99

149 ···» ·· ·* ·♦ ·· ····

Čištění molekul se provádí s použitím vysokého kladného náboje proteinových molekul nebo His značení a přeskládání se provádí standardními metodami, které počítají s tvorbou disulfidových můstků.

Čtyři imunogenizované molekuly se mohou také společně s původním typem FGF8b vložit do DNA vakcinačního bacilonosiče.

Mapování a výběr modifikovaných molekul FGF8b

Čtyři imunogenizované molekuly FGF8b se vyskytly v baktériích a následně se čistily od inkluzních tělísek. Paralelně se struktury použily jako DNA vakciny. Rozdílné struktury se pak srovnávaly z hlediska jejich schopnosti vyvolat různé účinky, které se vyžadují při léčbě pacientů s rakovinou prostaty a prsu. Tento výzkum se prováděl s využtím několika rozdílných „in vitro a „in vivo zkoušek. Nakonec experimentální výsledky tvořily základ pro konečný výběr jednoho nebo dvou kandidátů pro FGF8b lidskou vakcinu.

Modely „in vitro

Analýzy v systému myšovitých

Myši různých haplotypů, stejně jako králíci různými strukturami se imunogenizuji

FGF8b v Kompletním Freundově následně se podpoří alespoň dvakrát emulzifikovaným v neúplném Freundově zvažuje schopnost různých struktur snášenlivost. DNA vakcinace stejným adjuvans.

rozbit s použitím přečištěné DNA neúplném Freundově adjuvans adjuvans a antigenem Tudíž se

B-buněčnou se provádí v Kompletním Freundově na jiných živočiších adjuvans/ injektováním intramuskulárně ve 14 denních intervalech.

φ · • ·· ·

150

Vzorky séra se získají v několika časových etapách během imunizačního rozvrhu a schopnost rozdílných struktur indukovat protilátky specifické pro FGF8b se stanoví konvenční ELISA metodou (Rochon, 1994). Komerční polyklonální antisérum, stejně jako komerční monoklonální protilátka proti FGF8b (R&D) se používá dostupné, pro pozitivní regulaci. FGF8b proteiny jsou omerčně ale mohou následným se pak použije na testování myšího/králičího variantami FGF8b proteinu.

struktur a se připravit také vedle přečištěním (přeskládáním). potažení jiných FGF8b

Tento desek

ELISA séra při přímé imunizovaného produkt metodě různými

Cenným nástrojem ke zjištění účinků vakcinace proti FGF8b je rakovinná buněčná řada závislá na FGF8b. Některé pozitivní FGF8b rakovinné buněčné řady, např. MCF-7 nebo SC-3 se popisují v literatuře. Takže na FGF8b závislá rakovinná buněčná řada myšovitých se určí pomocí kvantitativní RT-PCR, experimentálním buněčným bujením a STAT-3 fosforylací.

Přítomnost FGF8b vázaných na FGF receptor na buněčném povrchu se určují protilátkami specifickými na FGF8b v FACS nebo ELISA analýzách. Protilátky zaměřené proti některým z různých FGF receptorů jsou komerčně dostupné (R&D).

Struktury se srovnávají s ohledem na jejich schopnost vyvolat protilátky schopné aktivovat dodatečný rozpad buněk produkujících (nosných) FGF8b. To se stanoví s jednou myší nádorovou buněčnou řadou představující FGF8b popsanou dříve, nebo alternativně s použitím ~buněk osmoticky naplněných FGF8b. Séra z normálních nebo transgenetických myší (viz dále) imunogenizovaných lidskými strukturami FGF8b se vyvíjely s buněčnou řadou a následně s čerstvým komplementem quinejského vepře. Protilátky zprostředkující rozklad buněk se stanoví standardními metodami. Schopnost vyvolaných protilátek zprostředkovat ADCC se hodnotí na základě měření 51Cruvolněného z označených FGF8b představujících buněk.

• · 9 9 ·*·· 9 9 · · • 99 · 9 9 9 9 9 ·

99 9 9 9 9 9 *

9 9 9 9 9 9 9 9 <

• 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 99 9999

151

Efektorovými buňkami jsou PBMC ze syngenetických myši. Pro přípravu zkoušky může být vyhovující použít myší buněčnou řadu schopnou zprostředkovat ADCC (pozitiní pro Fc(-receptory) jako efektorovou buňku s protilátkou proti lidskému FGF8b.

Aby se ukázalo, že kandidáti na FGF8b vakciny nijak nepodporují autoprotilátku indukující růst jsme zkoušku z imunogenizovaných nádorovými buňkami.

podle jejich schopnosti přidal do buněk.

nádorového bujení.

myší zrály s FGF8b

Bujení nádorových buněk přijmout 3H-tymidin, nádoru, provedli séra

Vzorky představuj íčími se pak stanovilo který se následně

Protože FGF8b je známý tím, že vyvolává bujení u ředy sacích buněk, bylo také nutné vyzkoušet účinky různých proteintů na podporu růstu. To se uskutečnilo s použitím proliferačních zkoušek, které použil již Marsh, 1999.

Biologický účinek FGF8b na savčí buňky se neutralizují autoprotilátkami. To dokazují studie o použití rekombinantní FGF8b a např. NIH3T3 v buněčném bujení (a morfologické změny). Přídavek autoprotilátek může zrušit transformační aktivitu FGF8b.

Imunizačni protokol

Počet živočichů, kteří se zúčastní experimentu s FGF8b

AutoVac imunizací, musí záviset na očekávaném prorůstání choroby v modelu, tedy počet nezbytný ke získání staticticky zpracovatelné informace.

Imunizačni protokol se musí zakládat na zkušenostech, které máme z projektu TNFa AutoVac. Různé imunizačni protokoly se používaly k imunizaci myší s různými TNFa analogy a pro různé účely, ale nejvíce pokusů se provedlo s následujícím protokolem:

152

1.

Myši se individuálně

označily značkou nebo zprostředkovaně, 10 zvířat v každé kleci. Samci a samičky se pravděpodobně zkoumají odděleně, ale vžádném případě nesmí být obě pohlaví v jedné a té samé kleci. Zvířata se ponechají v klidu alespoň 3 dny po transportu a značkování.

2. Antigen o koncentraci 1 mg/ml v PBS pufru se emulzifikoval s odpovídajícím množstvím Freundova kompletního antigenu (CFA) (Difco nebo Sigma). Emulze se komtroluje umístěním kapky emulze na vodní hladinu a sledováním, zda kapka drží pohromadě nebo disperguje. Příprava směsi pokračuje s kapkami, které nedisperguji.

3. Standardní imunizační dávka je 100 pg antigenu v objemu 100 μΐ + 100 μΐ adjuvans. Takže celkový objem je 200 μΐ, podávaný subkutánně (s.c.). do zad zvířete.

4. Posilující dávky se aplikovaly ve 2 - 3 týdenních intervalech. Posilující/imunizační materiál se připravuje přesně stejně jako imunizační, ale použije se Freundovo neúplné adjuvans. Asi tři posilující dávky vyvolají maximální titr. Takže nejvyšší titry se získají po 6 - 9 týdnech od první imunizace.

5. Odběr krve se provádí pravidelně, 50 - 100 μΐ vždy před první imunizací a týden po každé posilující dávce. Zbytek vzorku se také použije, 10 - 20 μΐ je potřeba na stanovení titrů.

Úvodní bod imunizačního programu závisí na vývoji choroby a postupu, který chceme přijmout. V první řadě se musíme snažit vytvořit co nejdříve maximální imunitu, ale je obtížné nastartovat imunizaci dříve, než asi v 5 týdnech věku. Potom se vysoké titry drží při posílení v 6 - 8 týdenních intervalech, po třech počátečních posíleních. Může nastat • ·· · • ·

153 problém, jestliže FGF8b je nutný pro normální vývoj mladé myši, a to hovoří ve prospěch zahájení imunizace později, u dospělé myši.

Analýzy v lidském systému

Při výběru mezi různými FGF8b strukturami se zkoumá schopnost lidských anntigenových buněk prezentovat imunogenní T-buněčné eitopy vřazené do T buněk. K tomu se využije těch samých pokusů „in vitro pro P2 a P30, jako pro TNFa vakcinu. Lidské T buněčné řady, které jsou specifické pro P2 a P30, se stanoví z donorů vakcinovaných proti tetanu. Antigenové buňky (PBMC) z těch samých donorů zrají s různými přidanými strukturami a T buněčnými řadami. Hladina vložených T buněčných epitopů se pak porovná měřením stimulace T buněčných řad.

Živočišné modely „in vivo

Ke zjištění, zda indukované FGF8b protilátky jsou schopné řízení „in vivo účinků závislých na FGF8b, se používají alespoň tři různé systémy.

Myším se transplantují FGF8 nádorové buňky myšovitých a potlačení progrese nádoru se zkouší akutovakcinací s použitím modifikovanýchFGF8b proteinů nebo FGF8b DNA vakcin. Ideální systém zahrnuje použití buněk izolovaných z myšího nádoru. Alternativně jsme použili jiné buněčné řady myšovitých (např. Balb/3T3) trvale infikovaných FGF8b DNA v příslušném bacilonosiči.

K experimentům s pasivní vakcinací se použil model štěpu myšího karcinomu. Holým myším se transplantovaly lidské nádory a zkoušela se jejich inhibice přenosem séra z normálních nebo humanizovaných .myší imunogenizovaných modifikovanými FGF8b proteiny nebo FGF8b DNA vakcinami. To je velmi užitečné pro

154 ·· 4· ·« ·<·· ·· *· • · ♦ ♦ · · · 4 4 4 · ·· 4 4 4 · 4 4 »···<« · · 4 4 · •••4 ·· ·< ·· »4 ·♦♦· studium schopnosti rostoucích protilátek vůči potlačeným nádorům.

Jiná cesta ke získání osvědčené koncepce zahrnuje použití transgenetických myší pro FGF8b. Ukazuje se, že ty myši, které nesou FGF8b cDNA řízené velmi specifickým promotorem myšího prsního nádorového viru (MMTV), spontánně vyvíjejí FGF8b prsní nádory (Coombes, osobní diskuse). Autovakcinace těchto myší různými FGF8b proteiny nebo FGF8b DNA vakcinami umožní ukázat, jestli je autovakcina schopná potlačit nebo vyřadit nádory.

Možnou cestou ke získání osvědčeného postupu je použití Wnt-1 transgenetických myší (MacArthur, 1995c). Vyvolání rakoviny prsu virem MMTV aktivuje FGF8 více než poloviny myších vyvíjejících se nádorů. Závislost FGF8b na nádorech se prokáže, jestliže naše autovakcina (autovakciny) potlačí rozsah nebo rychlost růstu nádorů.

Skutečnost, že transgenetické myši často vykazují nefyziologickou imunologickou toleranci, neovlivní příliš tento projekt, protože FGF8b polypeptidy jsou u lidí a myší identické.

Když se nakonec ukázala prospěšnost FGF8b imunizace na myším modelu a vybrali se vhodní kandidáti pro lidskou vakcinu, bylo možné provést omezený počet toxikologických studií. Ke získání konečné podoby osvědčeného postupu se následně provedly vakcinační studie u pacientů s rakovinou prsu a prostaty.

Významné je to, že jestliže experimenty na modelech „in vivo mají pozitivní výstup, je možné na základě dosažitelných výsledku sestavit více mutantů.

Příklad 4

9

9 9

155

999 9

Příprava analogu MUC-1

Připravila se pouze jedna autovakcinační molekula MUC-1. Ta obsahuje celkem devět opakováni mucinu, z nichž každé má sekvenci SEQ ID č: 33. Struktura začíná třema těmito sekvencemi, následuje P2 epitop, tři další mucinové sekvence, P30 epitop a strukturu uzavírají tři mucinové sekvence.

Připravily se struktury s N-zakončeným UNI-his koncem (SEQ ID č: 23) a bez něj. Obě varianty působily v E. coli. Identita proteinů se potvrdila Western blotting a řazením N-koncovek. Protein se vyskytuje v rozpustné formě, ale jako dimer, což je překvapuj ící.

HIS zakončená MUC-1 molekula se přečistila chromatograficky (metodou kovové afinity). Množství čistého proteinu a jeho čistota nejsou průběžně známé.

Příklad 5

Narušeni autotolerance v modelovém systému myšovitých

CTL experimenty, kde se myši imunogenizuji dendritickými buňkami pulzujícími s epitopem typu I i typu II, předem vykazují zvýšenou CTL indukci, když se imunizují a restimulují „in vitro peptidem typu I i typu II ve srovnání s imunizací a restimulací pouze jedním typem epitopů. Tato situace je srovnatelná s imunizací autovakcinou, kde cizí epitop typu II se vloží do vlastního proteinu. Odnímání a zpracování těchto molekul buňkami předcházejícími profesionální antigen, jako dendritickými buňkami, vede k působení cizího epitopů typu II společně s některým vlastním epitopem typu I. Je známé, že lze vyvolat autoreaktivní CTL', ale přítomnost cizích pomocných epitopů typu II může tento jev ještě významně podpořit.

·· ···· φφ ·· • · · · φφ · φ φ φ ♦ φ ·« φφφ φφ φ φ · φφφ · φφφ · φ i rr · Φ· ΦΦΦΦ ΦΦΦ

1J0 ···· φ· ·· ·♦ ·· φφ·φ

Možná výhoda předkládaného vynálezu - vyvolání vlastních reaktivních CTL se průběžně zkoumá ve vaječném albuminu transgenetických myší. Existují čtyři různé transgenetické řady s rozdílnou hladinou vaječného albuminu a tolerance (viz Kurts C et al. : J. Exp. Med. 186 (1997), 239-245 popisující

RIP-mOVA transgenetické myši (výskyt vaječného albuminu v pankreatu, ledvině a brzlíku při vysokém stupni tolerance) a Kurts C et al. : J. Exp. Med. 188 (1998), 409-414 popisující RIP-OVA^nízký a RIP-OVA^vysoky transgenetických myší s nízkým a vysokým obsahem vaječného albuminu. Poslední řada, RIP-OVA^strední vykazující střední hladinu vaječného albuminu se získala od Dr.Williama R. Heatha, spoluautora dvou výše zmíněných odkazů.

V těle se vyskytují různé stupně tolerance vůči různým antigenům. Jeden z nejmenších stupňů tolerance se nalezl ve velkém množství na cirkulujících antigenech. Tyto antigeny všechny vstupují do brzlíku, kde se odstraní vlastni reaktivní T-buňky. Tyto antigeny jsou v „centrální tolranci. Naopak, tkáňově specifické antigeny nevstupují přímo do brzlíku a jsou obecně v „periferní toleranci”, projevující se například Tbuněčnou energií.

Vyrábějí se dvě autovakciny vaječného albuminu. Obě se vztahují k sekvenci s přístupem č: J00845 v EMBL, kde se sekvence od P30 (SEQ ID č: 14) vřazují do dvou různých pozic.

Ve struktuře „OVA3.1” se P30 vřazuje do pozice odpovídající aminokyselině č. 272-292 ve vaječném albuminu. Ve struktuře „OVA3.2 se P30 vřazuje do pozice odpovídající aminokyselině č. 321-341 ve vaječném albuminu. Tyto struktury se vřazují do bacilonosiče pVaxl a používají se k DNA imunizaci.

Myši se imunizují intradermálně jednou, 100pg každé DNA. Tři týdny po této imunizaci se odstraní slezina a provádějí se CTL zkoušky s použitím řídících buněk nesoucích dominantní epitop vaječného albuminu, SIINFEKL a smíšený peptid FILKSINE jako *|·

157 ·· *« φ φ φ • · · φφφ regulaci. Jak se očekávalo, imunizace, poskytují . čistou CTL indukci v původních typech C57BL/6 myší, protože jak vaječný albumin, tak P30 jsou v těchto myších cizí.

Nyní se snažíme imunizovat 4 řady vaječného albuminu transgenetických myší těmito autovakcinačňími. strukturami. RIP-OVA^nizký, RIP-OVA^středni a RIP-OVA^vysoký vykazují zvyšující se množství vaječného albuminu a různý stupeň tolerance, a jak už bylo řečeno, RIP-mOVA má vysoký stupeň tolerance.

V těchto čtyřech řadách transgenetických myší je cizí pouze P30. Vaječný albumin je v tomto případě vlastním antigenem, a proto se jedná o pravou autovakcinaci k vyvoláni CTL směrem k vaječnému albuminu.

Předběžné výsledky získané pro RIP-OVA^nízky mající nejnižší „periferní toleranci ukazují, že molekuly vaječného albuminu se vřazeným P30 i přírodně se vyskytujícího vaječného albuminu jsou schopné vyvolat CTL odezvy - očekává se, že transgenetické myši s vysokým stupněm tolerance budou schopné pouze zvýšit CTL odezvu, proti modifikovaným molekulám vaječného albuminu a ne proti přírodní formě.

SEZNAM PUBLIKACÍ .

Ago H et al. (1991). J Biochem (Tokyo), 110, 360-3.

Abdel-Nabi H et al. (1992). Sem. Urol, 10, 45-54.

Acevedo et al. (1995), Cancer 76; 1467-1475.

Acevedo et ař.(1997), Cancer Detecť. Prev. 21; 295-303.

Adelstein S et al. (1991), Science 251: 1223-1225.

Babaian RJ et al. (1994), J. Urol 152, 1952-1955.

Barnard JA et al. (1995) Gastroenterol. 108 (2):564-580.

Bier H et al. (1995), Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 252(7): 433-9.

Bouchard L et al. (1989), Cell 57 (6) : 931-36.

•9 ·«»·

158 ·· . ♦· • 9 9·

999

99 9

99

999999

Blaber M et al. (1996)

Biochemistry 35

2086-94.

Blunt AG et al. (.1997)

J Biol Chem 272, 3733-8.

Boring CC et al. (1993), CA Cancer J. Clin. 43:7-26.

Boucher et al. (1995), Hum. Pathol. 26; 1201-1206.

Callahan R (1996), Breast Cancer Res Treat, 39, 33-44.

Carter RE (1996), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 93, 749-753.

Chang et al., (1981), Fertil. Steril. 36; 659-663.

Chantry A, 1995, J.Biol. Chem. 270(7): 3068-73.

Crossley PH et al. (1996b), Gell, 84, 127-36.

Crossley PH et al. (1995), Development, 121, 439-51.

Crossley PH, Martinez, S. and Martin, G.R. (1996a) Midbrain development induced by FGF8 in the chick embryo. Nátuře, 380, 66-8. .

Dean C et al. (1994), Int. J. Cancer, suppl 8: 103-107.

Dillioglugil 0 et al. (1995), Eur. Urol. 28, 85-101.

Doi et al. (1996), Int. J. Cancer 65; 454-459.

Douglas TH et al. (1995), J. Surg. Oncol. 59(4), 246-250.

Earp HS et al. (1995), Breast Cancer Res. Treat. 35(1):115-32.

Eccles SA (1994),· Invasion Metastasis 14 (1-6):337-48.

Eppenberger U et al. (1994),. J. Neurooncol. 22(3):249-54.

Dorkin TJ et al. (1999), Oncogene 18: 2755-2761.

Eriksson AE et al.(1993), Protein. Sci. 2: 1274-84.

Fernandez-Teran M. et al. (1997), Dev. Biol. .189, 246-55. .

Fujii K et al. (1995), Exp. Cell.. .Res . 216(1): 261-72.

Furst J et ai. (1994), Urol. Res. 22,.107-113.

Furthauer M et al. (1997), Development 124: 4253-64.

159

··	99	99	9999	99	44
• 4	9	9	9	9	9	9 9	9 9
•	99	9	•	9	9 9	9
4»	4 4	9 9	•	9	9-9 9	9
. ·	•	9	9	9	9 ’·	9 ·	4
4444	4 4.	99		99	··	444 4

Geissler et al. (1997), Lab. Invest. 76: 859-871.

Gemel J et al. (1996), Genomics 35: 253-7.

Ghosh AK et al. (1996), Cell Growth Differ 7: 1425-34.

Goldfarb M et al. (1996), Cytokine Growth Factor Rev 7: 31125.

Goodnow CC et al.

(1988)

Nátuře 334: 676-682.

Goodnow CC et al.

(1991)

Nátuře 352: 532-536.

Greenberg NM et al. (1995), Proč. Nati. 3439-3443.

Acad. Sci. USA

92:

Guy CT et al. (1992) , 10578-10582..

Proč. Nati.Acad.

Sci, USA 89:

Heikinheimo M et al.

(1994),. Mech Dev,

48: 129-38.

Henttu Pand Vihko P 903-910.

(1989)., Bioch. Biophys. Res. Comm. 160

Hopp TP and

Woods KR (1983), Mol. Immunol. 20

483-9

Horoszewicz

JSH et al. (1983), Cancer Res. 43

1803-1818

Horoszewicz

JSH et al. (1987), Anticancer Res

Hoshikawa M 187-91.

Husmann I et al.' et al (1998), Biochem Biophys Res Commun 244 (1996), Cytokine Growth

Factor Rev 7: 249-58

Israeli RS et al (1994),

Cancer Res

1807-1811

Israeli RS .et al.

(1993),

Cancer Res

227-230

Israeli RS et al

Cancer Res.

6306-6310

Jacoby et al. (1984),· Adv. Immunol. 35: 157-208 ...

Johnson RL and Tabin CJ (1997), Cell 90: 979-90

Kahn D et al. (1994), J. Urol. 152: 1490-1495.

’.· Kapoun AM and Shackleford GM (1997) , Oncogene 14: 2985-9.

. Kettunen P and Thesleff I (1998), Dev Dyn 2.11: 256-68.

Koga M et al. (1995)., J Steroid Biochem Mol Biol 54: 1-6.

Kouhara H et al., (1994), Oncogene 9: 455-62.

44	44	44	«···	44	44
* 4	•		• 4 ·	•	4	•	4 4
•		··	• ·	4	4 4	4
•			• · 4 4	•	4 4	•	4
•	•		• 4 4	4 4	4 4	4
4444		• 4	44	44	44	4444

160

Kozák Μ (1991), J Cell Biol 115: 887-903.

Lapthorn et al. (1994), Nátuře 369: 455-461.

Lazar et al. (1995), Cancer Res. 55': 3735-373,8.

Leek J et al. (1995), British Journal of Cancer 72: 583-588.

Leung HY et al. (1996), Oncogene 12: 1833-5.

Lopes AD (1990), Cancer Res. 50: 6423-6429.

Loric S et al. (1995), Clin.Chem. 41 (12): 1698-1704 .

Lupu R et al. (1995), Semin.

Cancer. Biol. 6: 135-145.

MacArthur

CA et al.

(1995a)

Cell Growth

Differ 6: 817-25.

MacArthur

CA et.al.

(1995b)

Development

121:. 3 603-13.

MacArthur

CA et al (1995c)

J Virol 69:

2501-7 .

Manabe et al. (1985), Gastroenterology 89: 1319-1325.

Marsh SK et al.

(1999), Oncogene 18, 1053-1060

Martin Let al.

(1993), J. Immunol. 150(49): 1234-43

Mattei MG et al.	(1995),	Mamm Genome '6:	196-7.
McDonnell 42-45.	WM	and	Askari FD (1996), New	Engl.	J. Med 334:
Meyers	EN	et	al.	(1998),	Nat Genet.18:	136-41.
Mílích	DR	et	al.	(1994),	J. Immunol.. 153 (1) :	429-435.,
Milner .103.	PG	et	al..	(1989),	Biochem Biophys Res	Commun 165:
Miyashita	Y !	et al	. (1994)	, Jpn J Cancer	Res	85: 1117-23.

Modjtahédi

H et al .

1096(1993a), Br. J. Cancer 67(2): 254-261.

Modjtahédi

H et al (1993b).,. Cell., Bicphys. 22 (1-3) : 12 9-4 6

Modjtahédi

H et al.

(1996), .Br. J. Cancer,73(2) :.228-35.

• · · ·

Muller	WJ	et	al.	(1988)
Murphy	GP	et	al.	(1996)
Murphy	GP	et	al.	(1995)
Murphy	GP	et	al.	(1995)

t

I

Prostatě 26: 164-168 r

t

L et al.

(1990),

Prostatě 28: 266-271.

Anticancer Research 15(4): 1473-1379.

: Ng.uyen

Clin. Chem. 35: 1450-1455.

Nonomura N et al. (1990), Cancer Res 50: 2316-21.

0'Sullivan D et al. (1991),

J. Immunology 147: 2663-9.

(1995), Br. J. Cancer 71 (5): 96,9-73.

Ohnishi Y et al.

Ohuchi	H	et	al.	(1997a)
Ohuchi	H	et	al.	(1997b)
Ohuchi	H	et.	al.	(1994),

et al.

Payson RA , Mech Dev 62: 3-13 , Development .124: 2235-44.,

Biochem Biophys Res Commun 204: 882-8.

(1996), Oncogene 13: 47-53.

Pillai et

Pollard M al. (1996), FEBS Lett. 387: 23-26.

and Luckert PH (1994), Anticancer Res. 14: 901-903.

Prigent SA and Lemoine NR (1992), Progress in Growth Factor Research 4: 1-24. .

R&D focus, Drug News, (1996) 5, 21, 9.

Rammensee H-G. et al. (1995), Immunogenetics 41: 178-228.

Regelson W (1995), Cancer 76: 1299-1301.

Ries LAG et al. (1996), SEER Cancer Statistics Review, 19731993: Tables and Graphs,.National, Cancer Institute, Bethesda, MD.

Rinker-Schaeffer CW et al. (1995), Genomics, 30(1): 105-108.

Rochon YP et al. (1994), Prostatě 25: 219-223.,

Rock KL et al. (1996) , Vaccine 14: ' 1560-1568.,

Rock KL and Clark K (1996), J., Immunol. 156: 3721-3726.

Rudra-Ganguly N, et al. (1998), Oncogene 16: 1487-92.

Salomon DS et al. (1995), Critical reviews in Oncology/Hematology 1.9: 183-232.

Sáto B et al. (1993), J Steroid Biochem Mol Biol 47: 91-8.

Schlegel J et al. (1994), J. Neurooncol. 22(3): 249-54.

Schmitt JF et. al. (1996), J Steroid Biochem Mol Biol. 57: 173-

8.

Sheaff et al. (1996), J. Clin. Pathol. 49: 329-332.

Sherman L et al. (1998), Genes Dev 12: 1058-71.

Shimamura K and Rubenstein JL (1997), Development 124: 2709-

18.

Shirai A and Klinman DM (1993), AIDS Res. Hum. Retroviruses 9, 979-983.

Sokoloff M et al. (1996), Cancer 77(9): 1862-1872.

Steinhoff U et al. (1994), Eur. J. Immunol. 24(3): 773-76.

Stevens VC (1986), Ciba Found. Symp. 119: 200-225.

Su SL et al. (1995), Cancer Res. 55: 1441-1443.

Syrigos et al.	(1998), Gut 42:	88-91.
Talwar et	al.	(1976) ,	PNAS	73:	218-222.
Talwar et	al.	(1994),	PNAS	91:	8532-8536.

Tanaka A et	al.	(1992),	Proč Nati Acad Sci USA 89: 8928-32
Tanaka	A	et	al.	(1998),	Cancer Researčh	58: 2053-56.
Tanaka	A	et	al.	(1995),	FEBS Lett 363:	226-30.
Thomas	H	et	al.	(1996),	Br. J. Cancer,	73(1): 65-72.

Tjoa B et al. (1996), Prostatě 28: 65-69.

Tjoa B et al. (1995), Prostatě 27: 63-69.

Tokunaga A et al., (1995), Cancer 75(6 suppl.):, 1418-25.

Tosi E et al. (1995), Int. J. Cancer 62(5):643-50.

Triozzi et' al. (1994),. Int. J. Onc. 5:. 1447-1453.

Troyer JK et al. (1995), Int. J. Cancer 62: 552-558.

163

Valone FH et al. (1995), J. Clin. Oncol.. 13 (9) : 2281-92.

Valve E et al. (1997), Biochem Biophys Res Commun 232: 173-7.

van Dam PA et al. J. Clin. Pathol. 1994 47(10): 914-19.

Weiner LM et al. (1995), Cancer Res. 55 (20) : 4586-4593.

Wright GL Jr et al. (1996), Urology 48: 326-334.

Wu J et al. (1997), J Steroid Biochem Mol Biol 62: 1-10.

Wu X etal. , Fan, Z., Masui, H., Rosen, N.,.Mendelsohn, J. Apoptosis induced by an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody in a human colorectal carcinoma cell line and its delay by insulin.

Wynant GE et al. (1991), Prostatě 18: 229-241.

Xu X et al. (1998), Development 125: 753-65.

Yamanishi H et al. (1995), J Steroid Biochem Mol Biol 52: 49-

53.

Yogeeswaran and Salk (1981), Science 212: 1514-1516.

Yokoyama H et al. (1998), Dev Biol 196: 1-10.

Yoshimura K et al. (1996), Cancer Lett 103: 91-7.

Yoshiura K. et al. (1997), Am, J Med Geriet 72: 354-62.

Young RA and Davis RW (1983), Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1194-1198.

Yule TD (1993), J. Immunol. 151(6): 3057-3069.

Zhang JD et al. (1991), [published erratum appears in Proč Nati Acad Sci USA 88 (12):5477], Proč Nátl Acad Sci USA 88, 3446-50.

Zhu Z et al. (1995), Int. J. Cancer 62(3): 319-324.

Zhu X et al. (1991), Science 251: 90-3

Claims (5)

1. Použití

1) alespoň jednoho CTL epitopů odvozeného od s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu, který je v živočichovi slabě imunogenní nebo neimunogenní a

2) * alespoň jednoho prvního T-pomocného lymfocytického (T_H) epitopů, který je pro živočicha cizí, nebo

1) alespoň jednoho fragmentu nukleové kyseliny kódujícího CTL epitop odvozený od s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu, který je v živočichovi slabě imunogenní nebo neimunogenní a

2) alespoň jednoho prvního fragmentu nukleové kyseliny kódujícího T-pomocný lymfocytický (T_H) epitop, který je pro živočicha cizí, nebo nepatogenního mikroorganismu nebo viru, který nese fragment nukleové kyseliny kódující nebo exprimující

1) alespoň jeden CTL epitop odvozený od s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu, který je v živočichovi slabě imunogenní nebo neimunogenní a

2) alespoň jeden první T-pomocný lymfocytický (T_H) epitop, který je {pro živočicha cizí, pro přípravu imunogenní kompozice pro negativní regulaci buněk exprimujících s buňkou asociovaný polypeptidový antigen tím, že se prostřednictvím vhodné antigenprezentující buňky (APC) v živočichovi vyvolá simultánní prezentace alespoň jednoho CTL epitopů a alespoň jednoho prvního T_H epitopů, a tím se indukuje specifická cytotoxická T-lymfocytová (CTL) odpověď v živočichovi proti buňkám nesoucím na svém povrchu s buňkou asociovaný polypeptidový antigen nebo obsahujícím s buňkou asociovaný antigen ve svém intracelulárním kompartmentu.

2. Použití podle nároku 1, kde živočich je člověk.

3. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde uvedený alespoň jeden CTL epitop, je-li prezentován, je spojen s molekulou MHC typu I na povrchu APC, a/nebo kde uvedený alespoň jeden první cizí T_H epitop, je-li prezentován, je spojen s molekulou MHC typu II na povrchu APC.

4. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde APC je dendritická buňka nebo makrofág.

5. Použití podle polypeptidový polypeptidového polypeptidového pocházejícího z kteréhokoliv z předcházejících j e vybraný vlastního proteinu, a polypeptidového nároků, kde nádorového virového antigenů antigen antigenů, antigenů nitrobuněčného parazitu nebo bakterie.

6. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde prezentace CTL epitopů a prvního cizího T_H epitopů prostřednictvím APC provádí tím, že se imunitnímu systému živočicha prezentuje alespoň jeden první analog polypeptidového antigenů, přičemž jmenovaný první analog obsahuje obměnu aminokyselinové sekvence polypeptidového antigenů, přičemž uvedená obměna obsahuje alespoň CTL epitop a první cizí T_H epitop.

7. Použití podle nároku 6, kde alespoň první analog obsahuje podstatnou část známých a předpokládaných CTL epitopů s buňkou asociovaného polypeptidového antigenů.

8. Použití podle nároku 7, kde podstatná část známých a předpokládaných CTL epitopů v aminokyselinové sekvenci alespoň jednoho prvního analogu je rozpoznávána alespoň 90 % haplotypů MHC-I, jež rozpoznávají všechny známé a předpokládané CTL epitopy v s buňkou asociovaném polypeptidovém antigenu.

9. 'Použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8, kde v podstatě všechny známé CTL epitopy s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu jsou přítomny v alespoň jednom prvním analogu a/nebo kde v podstatě všechny předpokládané CTL epitopy s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu jsou přítomné v alespoň jednom prvním analogu.

10. Použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 9, kde alespoň jeden první analog dále obsahuje část sestávající z modifikované struktury s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu, přičemž výsledkem této modifikace je, že imunizace živočicha prvním analogem vyvolá v těle živočicha produkci protilátek proti s buňkou asociovanému polypeptidovému antigenu.

11. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, které dáJÍe zahrnuje použití alespoň jednoho druhého analogu polypeptidového antigenu nebo fragmentu nukleové kyseliny kódujícího druhý analog polypeptidového antigenu nebo alespoň jednoho nepatogenního mikroorganismu nebo viru nesoucího fragment nukleové kyseliny kódující alespoň jeden druhý analog polypeptidového antigenu pro přípravu imunogenní kompozice pro zajištění prezentace imunogenicky účinného množství alespoň jednoho druhého analogu polypeptidového antigenu imunitnímu systému živočicha, přičemž tento druhý analog obsahuje modifikaci struktury polypeptidového antigenu a výsledkem této modifikace je, že imunizace živočicha druhým analogem vyvolá produkci protilátek proti s buňkou asociovanému polypeptidovému antigenu.

12. Použití podle nároku 11, kde se při modifikaci do druhého analogu včlení alespoň jeden druhý cizí T_H epitop.

13. Použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 12, kde první a/nebo druhý analog (analogy) obsahuje (obsahují) podstatnou část B-buněčného epitopu s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu.

14. Použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 13, kde variace a/nebo modifikace zahrnuje substituci a/nebo deleci a/nebo inzerci a/nebo adici aminokyseliny.

15. Použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 14, kde variace a/nebo modifikace zahrnuje

16.

začlenění alespoň jedné první části do prvního a/nebo druhého analogu (analogů), přičemž uvedená první část efektivně směruje analog k buňce prezentující antigen (APQj , a/nebo začlenění alespoň jedné druhé části do prvního a/nebo druhého analogu (analogů), přičemž uvedená druhá část stimuluje imunitní systém, a/nebo začlenění alespoň jedné třetí části do prvního a/nebo druhého analogu (analogů), přičemž zmíněná třetí část optimalizuje prezentaci analogu imunitnímu systému.

Použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 15, kde variace a/nebo modifikace zahrnuje duplikaci alespoň jednoho B-buněčného epitopu nebo alespoň jednoho CTL epitopu s buňkou asociovaného polypeptidového antigenů.

17. Použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 16, kde variace a/nebo modifikace zahrnuje zavedení haptenu.

18^-. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde první a/nebo druhý cizí T_H epitop (epitopy) je (jsou) imunodominantní.

19. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde první a/nebo druhý cizí T_H epitop (epitopy) je (jsou) promiskuitní.

20. Použití podle kteréhokoliv z nároků 12 až 19, kde první a/nebo druhý cizí T_H epitop (epitopy) se vybírá (vybírají) z přírodního T_H epitopu a umělé peptidové sekvence vázající MHC-II.

21. Použití podle nároku 20, kde přírodní T_H epitop se vybírá z epitopu tetanového toxoidu, jako je P2 nebo P30, epitopu záškrtového toxoidu, hemaglutininového epitopu chřipkového viru a CS epitopu P. falciparum.

22. Použití podle kteréhokoliv z nároků 12 až 21, kde první a/nebo druhý T_H epitop (epitopy) a/nebo první a/nebo druhá a/nebo třetí část je přítomna ve formě

- vedlejších skupin vázaných kovalentní nebo nekovalentní vazbou k vhodným chemickým skupinám v aminokyselinové sekvenci s buňkou asociovaného polypeptidového antigenů nebo její subsekvenci, a/nebo fúzních partnerů aminokyselinové sekvence odvozených z s buňkou asociovaného polypeptidového antigenů.

23. Použití podle nároku 22, kde první část je v podstatě specifickým vazebným partnerem pro APC specifický povrchový antigen, jako sacharid, pro který na APC existuje specifický receptor, například manan nebo manosa.

24. Použití podle kteréhokoliv z nároků 15 až 23, kde druhá část_ je cytokin vybraný z interferonu γ (IFN- γ) , Flt3L, interleukinu 1 (IL-1), interleukinu 2 (IL-2), interleukinu 4 (IL-4), interleukinu 6 (IL-6), interleukinu 12 (IL-12), interleukinu 13 (IL-13), interleukinu 15 (IL-15) a faktoru stimulujícího granulocyt-makrofágové kolonie (GM-CSF) nebo jeho účinná část; protein tepelného šoku vybraný z HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 a kalretikulinu (CRT) nebo jeho účinná část; nebo hormon.

25. Použití podle kteréhokoliv z nároků 15 až 24, kde třetí část je lipid, jako například palmitoylová skupina, myristylová skupina, farnesylová skupina, geranylgeranylová skupina, GPI-kotva a N-acyl diglyceridová skupina.

26. Použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 25, kde první a/nfebo druhý analog (analogy) má (mají) v podstatě výslednou celkovou terciární strukturu s buňkou asociovaného polypeptidového antigenů.

27. Použití podle kteréhokoliv z nároků 6 až 26, kde prezentace prostřednictvím APC se provádí podáním imunogenně účinného množství alespoň jednoho prvního

- • 9 9 9 9 ♦ • 9 · • · ·· • · ··♦· ·· 9« 9 · · · 9 9 9 9 9 9 9 · 9 · 9· · 9 9 9 9 9 ·· ♦ · 9 9 9 9· 9 9 t · ♦ 9 ♦ • · * · 99 99·9 analogu živočichovi. 28. Použití podle nároku 27, kde se také podává imunologicky účinné množství alespoň j ednoho druhého analogu. 29. Použití podle nároku 27 nebo 28, kde j menovaný alespoň

jeden první a/nebo druhý analog (analogy) je formulován 'společně s farmaceuticky a imunologicky vhodným nosičem a/nebo vehikulem a popřípadě adjuvantem.

30. Použití podle nároku 29, kde zmíněný adjuvant umožňuje příjem alespoň prvního a/nebo druhého analogu (analogů) APC buňkami, jakými jsou například dendritické buňky.

31. Použití podle nároku 30, kde zmíněný adjuvant je zvolen ze skupiny sestávající z adjuvantu zaměřeného na imunitu; adjuvantu modulujícího imunitu, jako je toxin, cytokin a mykobakteriální derivát; olejového preparátu; polymeru; adjuvantu formujícího micely; saponinu; imunostimulační komplexní matrix (ISCOM matrix); částice; DDA; aluminiových adjuvantů; DNA adjuvantů; γ-inulinu a zapouzdřujícího adjuvantu.

32. Použití podle nároku 31, kde cytokinem je cytokin definovaný.v nároku 24 nebo jeho účinná část, kde toxin je zvolen ze skupiny sestávající z listeriolycinu (LLO), Lipidu A (MPL, L180.5/RaILPS), a tepelně nestálého enterotoxinu a dále kde mykobakteriální derivát je zvolen ze skupiny sestávající z muramyl dipeptidu, úplného Freundova adjuvans, RIBI a diesteru trehalosy, jako TDM a TDE, a dále kde adjuvant zaměřený na imunitu je zvolen ze skupiny sestávající z ligandu CD40, protilátky CD40 nebo

X jejich specificky se vázajících fragmentů, manózy, Fab fragmentu a CTLA-4 a dále kde olejový preparát obsahuje skvalen nebo neúplné Freundovo adjuvans, a dále kde polymer je zvolen ze skupiny sestávající z sacharidu, jako dextranu, PEG, škrobu, mannanu a manózx; plastického polymeru, jako latexu, jako latexových kuliček, a dále kde saponin je z Quillaja saponaria, Quil A a QS21, a kde částice obsahují latex nebo dextran.

33. Použití podle kteréhokoliv z nároků 27 až 32 zahrnující podání léku formou vybranou z orální, parenterální, intradermální, subdermální, intrakutánní, subkutánní, peritoneální, bukální, sublinguální, epidurální, spinální, anální a intrakraniální formy.

34. Použití podle kteréhokoliv z nároků 27 až 33 zahrnující alespoň jedno podání ročně, jako alespoň 2, 3, 4, 5, 6 a 12 podání ročně.

35. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde se prezentace provádí podáním nepatogenního mikroorganismu nebo viru nesoucího fragment nukleové kyseliny kódující a exprimující alespoň jeden CTL epitop a alespoň jeden T_H epitop živočichovi.

36. Použití .podle kteréhokoliv z nároků 6 až 14, kde se prezentace provádí podáním nepatogenního mikroorganismu nebo viru nesoucího alespoň jeden fragment nukleové kyseliny kódující a exprimující alespoň první analog živočichovi.

37. Použití podle kteréhokoliv z nároků 15 až 26, kde T_H epitop a/nebo první a/nebo druhý a/nebo třetí část (části) jsou ve formě fúzních partnerů aminokyselinových sekvencí odvozených od s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu, a dále kde se prezentace provádí podáním nepatogenního mikroorganismu nebo viru nesoucího alespoň jeden fragment nukleové kyseliny kódující a exprimující první a/nebo druhý analog živočichovi.

38. Použití podle kteréhokoliv z nároků 11 až 14 nebo 36,

- kde se prezentace provádí podáním nepatogenního mikroorganismu nebo viru nesoucího alespoň jeden fragment nukleové kyseliny kódující a exprimující alespoň druhý analog živočichovi.

kde

39. Použití podle nároku 38, mikroorganismus nebo virus živočichovi podá nepatogenní j ednou.

40 .

Použití podle kteréhokoliv z nároků prezentace provádí in vivo zavedením jednoho fragmentu nukleové kyseliny.

kde do

APC alespoň

41. Použití podle kteréhokoliv prezentace provádí jednoho fragmentu exprimujícího první z nároků 6 az

14, kde se in vivo nukleové analog.

zavedením kyseliny do

APC alespoň kódujícího a

42. Použití podle kteréhokoliv z epitop a/nebo první a/nebo druhý a/nebo třetí část (části) jsou ve formě fúzních partnerů aminokyselinových sekvencí odvozených antigenu, zavedením nároků 15 až 26, kde T_H od s buňkou a dále kde se do APC alespoň asociovaného polypeptidového prezentace provádí in vivo jednoho fragmentu nukleové kódujícího a exprimujícího první a/nebo druhý kyseliny analog.

.442-

« 9 99 9 9 9 9 9 9 9 99 999· 9 9 9 9 9 9 99 • * ^w w : r : 9 999 _Λ 9 9 9 9 · 9 9 · • · · · • ♦ 9 9999 99 99 999 • 9 99 9 9 z nároků 11 až 14 a 41, alespoň j ednoho fragmentu

exprimujícího druhý analog

43. Použití podle kteréhokoliv které dále zahrnuje použití nukleové kyseliny kódujícího a pro výrobu farmaceutické kompozice pro in vivo zavedení do APC alespoň jednoho fragmentu nukleové kyseliny kódujícího a exprimujícího druhý analog.

441 Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde se prezentace provádí in vivo společným zavedením do APC alespoň dvou fragmentů nukleové kyseliny, z nichž jeden kóduje a exprimuje alespoň jeden CTL epitop a zbývající kóduje a exprimuje alespoň jeden první cizí T_H epitop, a dále kde první cizí T_H epitop je definován v kterémkoliv z nároků 1, 2 a 21 až 24.

45. Použití podle kteréhokoliv z nároků 40 až 44, kde zaváděný fragment (fragmenty) nukleové kyseliny se vybírá (vybírají) z čisté DNA, DNA formulované s nabitými nebo nenabitými lipidy, DNA formulované v liposomech, DNA obsažené ve virovém vektoru, DNA formulované s proteinem nebo polypeptidem umožňujícím trensfekci, DNA formulované se zaměřovacím proteinem nebo polypeptidem, DNA formulované se zaměřovacím sacharidem, DNA formulované se srážeďíem vápníku, DNA kopulované s molekulou inertního nosiče a DNA formulované s adjuvantem.

46. Použití podle nároku 45, kde adjuvant je zvolen ze skupiny sestávající z adjuvantů uvedených v kterémkoliv z nároků 30 až 32.

47. Použití podle kteréhokoliv z nároků 40 až 46, kde .způsob podávání je definován v nárocích 33 nebo 34.

• ΦΦΦ φ φ · · • φ · φ φφφ φ • · · ·

48. Způsob selekce imunogenního analogu s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu, který je u živočichů slabě imunogenní nebo neimunogenní, kde zmíněný imunogenní analog je schopný vyvolat u živočicha reakci CTL proti buňkám vykazujícím molekulu MHC typu I vázanou na epitop odvozený od s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu, vyznačující se tím, že 'zahrnuj e

a) identifikaci alespoň jedné subsekvence aminokyselinové sekvence s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu, který neobsahuje známé nebo předpokládané CTL epitopy,

b) přípravu alespoň jednoho předpokládaného imunogenního analogu s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu zavedením alespoň jednoho T_H epitopu cizího pro živočicha do aminokyselinové sekvence s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu v poloze ležící v alespoň jedné subsekvence identifikované v bodu a), a

c) selekci toho (těch) analogu (analogů) připravených v bodu b), který je (jsou) prokazatelně schopen vyvolat reakci CTL u živočichů.

49. Zpýsob podle nároku 48, vyznačující se tím, že

1) . - subsekvence identifikovaná v bodu a) dále neobsahuje cysteinové zbytky, nebo alternativně, T_H epitop zavedený v bodu b) v podstatě nemění uspořádání cysteinových zbytků a/nebo

2) subsekcence identifikovaná v bodu a) dále neobsahuje známá nebo předpokládaná glykosylační místa,

09 9 ♦ * ♦ · • · • · ··· »4 • « • · • 9 9 900· 9 999 9 90 9 9 • · 9 9 9 99 9 · « • • 9 9 9 • 9 • 9· 9 9 0 90 ··♦ 9

nebo alternativně, T_H epitop zavedený v bodu b) v podstatě nemění charakter glykosylace a/nebo

3) subsekvence identifikovaná v bodu a) se významně podílí na patofyziologickém efektu způsobeném s buňkou asociovaným polypeptidovým antigenem a zavedení cizího T_H epitopu v bodu b) redukuje nebo ruší zmíněný patofyziologický efekt a/nebo

4) subsekvence identifikovaná v bodu a) je homologická k aminokyselinové sekvenci rozdílného proteinového antigenu u živočicha a zavedení T_H epitopu v bodu b) v podstatě odstraní homologii a/nebo

5) zavedení cizího T_H epitopu v bodu b) má za následek zachování podstatné části B-buněčných epitopů s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu.

50. Způsob podle nároku 49, varianty 5, vyznačující se tím, že analog má celkovou terciární strukturu s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu.

51. Způsob přípravy buňky produkující analog s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení sekvence nukleové kyseliny kódující analog do. vektoru, přičemž analog se volí způsobem popsaným v kterémkoliv 48 až 50, a vhodná hostitelská buňka se transformuje tímto vektorem.

52. Způsob přípravy analogu s buňkou asociovaného polypeptidového antigenu, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buňky získané metodou podle nároku 51 za podmínek usnadňujících expresi sekvence nukleové kyseliny

• · 9 * * ♦ * • · • · 9 9 • • 9 999 ♦ · • -· 99 9 9 9 • • · · • 9 • 9 9 9 · 9 • 9 • • * 9 f· ·· • · · 99 99 99

kódující s buňkou asociovaný polypeptidový antigen, a získání analogu z kultivačního supernatentu nebo z buněk.

53. Způsob podle nároku 52 vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok čištění získaného analogu a popřípadě podrobení přečištěného produktu umělým posttranslačním modifikocím, jako je refolding, úprava enzymy, chemická modifikace a konjugace.

54. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 47 nebo způsob podle kteréhokoliv z nároků 48 až 53, kde slabý s buňkou asociovaný antigen se vybírá ze skupiny skládající se z 5-a-reduktázy, α-fetoproteinu, AM - 1, APC, APRÍL,

BAGE, β-kateninu, Bcl2, bcr-abl, (b3a2), CA-125, CASP8/FLICE, katepsinů, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33,

CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55 (791Tgp72), CD59, CDC27, CDK4, CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DcR3, E6/E7, EGFR,

EMBP, Ena78, farsyl transferázy, FGF8a nebo FGF8b, FLK1/KDR, receptorů kyseliny listové, G250, rodiny GAGE, gastrinu 17, hormonu uvolňujícího gastrin (Bombesinu), GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gplOO/Pmel 17, gplOO - in4, gpl5, gp75/TRP-l, hCG, heparanázy, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT (telomerázy), IGFR1, IL-13R, ÍNOS, Ki 67, KIAA0205,

K-ras, H-ras, N-ras, KSA (C017-1A), (MAGEyl, MAGE-2, MAGE-3 atd.),

LDLR-FUT, rodiny MÁGE mamaglobinu, MAP17,

MelanuA/MART-1, mesotelinu,

MIC A/B, MT-MPP, Moxl, mucinu, jako je MUC-1, MUC-2, MUC-3 a MUC-4, které jsou anomálně glykosylované, MUM-1, NY-ESO-1, osteonektinu, pl5, P170/MDR1, p53, p97/melanotransferinu, PAI-1, PDGF, plasminogenu (uPA), PRÁME, probasinu, progenipoietinu,

PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, genové rodiny SSX,

STAT3, STn (asociovaného s mucinem), TAG-72, TGF-α, TGFβ, thymosinu β 15, TNF-α, TPA, TPI, TRP-2, tyrosinázy,

99 ·· • · • · • • • • · • 9 • · · 9 · • 9 • 9 • 9999 « · ··

99 99 • 9 9 9 9 999 9 9 * 9 9 9 9 9 9 9 9 9 999 «4» ·«*·

VEGF, ZAG, p!6INK4 a glutathion-S-transferázy.

55. Použití nebo způsob podle nároku 54, kde s buňkou asociovaný polypeptidový antigen je lidský PSM.

56. Použití nebo způsob podle nároku 55, kde cizí T-buněčný epitop se zavádí v oblasti aminokyselinové sekvence PSM definované jako SEQ ID č. 2, pozice 16 - 52 a/nebo 87 - ' 108 a/nebo 210 - 230 a/nebo 269 - 289 a/nebo 298 - 324 a/nebo 442 - 465 a/nebo 488 - 514 a/nebo 598 - 630 a/nebo 643 - 662 a/nebo 672 - 699.

57. Použití podle nároku 55 nebo 56, kde se farmaceutické kompozice používá při léčení nebo zlepšování stavu rakoviny prostaty.

58. Použití nebo způsob podle nároku 54, kde s buňkou asociovaný polypeptidový antigen je fibroblastový růstový faktor 8b (FGF8b).

59. Použití nebo způsob podle nároku 58, kde cizí T-buněčný epitop se zavádí v oblasti aminokyselinové sekvence FGF8b definované jako SEQ ID č. 6, pozice 1-54 a/nebo 178 215 a/nebo 55 - 58 a/nebo 63 - 68 a/nebo 72 - 76 a/nebo 85 - 91 q/nebo 95 - 102 a/nebo 106 - 111 a/nebo 115 - 120 a/nebo 128 - 134 a/nebo 138 - 144 a/nebo 149 - 154 a/nebo 158' - 162 a/nebo 173 - 177, přičemž toto zavedení přednostně nepostihuje aminokyseliny 26 - 45 a aminokyseliny 186 - 215.

60. Použití podle nároku 58 nebo 59, kde se farmaceutické kompozice používá při léčení nebo zlepšování stavu rakoviny, jako je rakovina prostaty a rakovina prsu.

« • · · · · • * · ·« ··♦ ·

61. Použití nebo způsob podle nároku 54, kde s buňkou asociovaný polypeptidový antigen je Her2 .

62. Použití nebo způsob podle nároku 61, kde cizí T-buněčný epitop se zavádí v oblasti aminokyselinové sekvence Her2 definované jako SEQ ID č. 3, pozice 5-25 a/nebo 59 - 73 a/nebo 103 - 117 a/nebo 149 - 163 a/nebo 210 - 224 a/nebo 250 - 264 a/nebo 325 - 339 a/nebo 369 - 383 a/nebo 465 479 a/nebo 579 - 593 a/nebo 632 - 652 a/nebo 653 - 667 a/nebo 661 - 675 a/nebo 695 - 709 a/nebo 710 - 730.

63. Použití nebo způsob podle nároku 61 nebo 62, kde se farmaceutické kompozice používá při léčení nebo zlepšování stavu rakoviny prsu.

64. Analog lidského PSM, který je u lidí imunogenní, přičemž tento analog obsahuje podstatnou část všech známých a předpokládaných CTL a B-buněčných epitopů PSM a dále obsahuje alespoň jeden cizí T_H epitop definovaný v kterémkoliv z nároků 18 až 21.

65. Analog podle nároku 64, kde alespoň jeden cizí T_H epitop je přítomen jako insert do aminokyselinové sekvence PSM nebo gako substituce části aminokyselinové sekvence PSM nebo jako výsledek delece části aminokyselinové sekvence PSM.

66. Analog podle nároku 65, kde cizí T_H epitop je zaveden v pozicích definovaných v nároku 56.

67. Analog lidského Her2, který je u lidí imunogenní, přičemž tento analog obsahuje podstatnou část všech

X zxř známých a předpokládaných CTL a B-buněčných epitopů Her2 a dále obsahuje alespoň jeden cizí T_H epitop definovaný podle kteréhokoliv z nároků 18 až 21.

68. Analog podle nároku 67, kde alespoň jeden cizí T_H epitop je přítomen jako insert do aminokyselinové sekvence PSM nebo jako substituce části aminokyselinové sekvence PSM nebo jako výsledek delece části

- aminokyselinové sekvence PSM.

69. Analog podle nároku 68, kde cizí T_H epitop je zaveden v pozicích definovaných v nároku 62.

70. Analog lidského/myšího FGF8b, který je u lidí imunogenní, přičemž obsahuje podstatnou část všech známých a předpokládaných CTL a B-buněčných epitopů FGF8b a dále obsahuje alespoň jeden cizí T_H epitop definovaný v kterémkoliv z nároků 18 až 21.

71. Analog podle nároku 70 kde alespoň jeden cizí T_H epitop je přítomen jako insert v aminokyselinové sekvenci FGF8b nebo jako substituce části aminokyselinové sekvence FGF8b nebo jako výsledek delece části aminokyselinové sekvence FGF8b.

i

72. Analog podle nároku 71, kde cizí T_H epitop je zaveden v.pozicích definovaných v nároku 59.

73. Imunogenní kompozice, vyznačující se tím, že jako účinné imunogenní činidlo obsahuje analog podle kteréhokoliv z nároků 64 až 72 ve směsi s farmaceuticky a imunologicky vhodným nosičem nebo vehikulem a popřípadě adjuvantem.

• 0 • 9 • • 9 • · • · 0 0 » · • 04« • 0 * 0 • 9 ♦ · * 0 • • 0 ··«· 000 0 • ·« * 0 • · «0 0 • *0 · • · 0« • 0 ···♦

74. Fragment nukleové kyseliny kódující analog podle kteréhokoliv z nároků 64 až 72.

75. Vektor nesoucí fragment nukleové kyseliny podle nároku 74 .

76. Vektor podle nároku 75, který schopný autonomní replikace.

77. Vektor podle nároku 75 nebo 76 zvolený ze skupiny sestávající z plasmidu, fágu, kosmidu, minichromosómu a viru.

78. Vektor podle kteréhokoliv z nároků 75 až 77, který obsahuje ve směru 5'-* 3' a v operabilním spojení promotor pro pohánění exprese fragmentu nukleové kyseliny podle nároku 74, popřípadě sekvenci nukleové kyseliny kódující vedoucí peptid umožňující sekreci polypeptidového fragmentu nebo jeho integraci do membrány, fragment nukleové kyseliny podle nároku 74 a popřípadě sekvenci nukleové kyseliny kódující terminátor.

79. Vektor podle kteréhokoliv z nároků 75 až 78, který, zavedďn do hostitelské buňky, se integruje do genomu hostitelské buňky nebo není schopen integrace do genomu hostitelské buňky.

80. Transformovaná buňka nesoucí vektor podle kteréhokoliv z nároků 75 až 79.

81. Kompozice pro indukci produkce protilátek proti PSM, Her2 nebo FGF8b, vyznačující se tím, že obsahuje nebo

*· • · • ·· • ♦ • · v* 9 · • · • ·* • * * * • · • • ··« · • · • · • • ···· • ·· • · 4* • • · *4 ····

I) fragment nukleové kyseliny podle nároku vektor podle kteréhokoliv z nároků 75 až 79 a

2) farmaceuticky a' imunologicky vhodné ředidlo a/nebo vehikulum a/nebo adjuvans.

82. Stabilní buněčná linie nesoucí vektor podle kteréhokoliv z nároků 75 až 79, která exprimuje fragment nukleové - kyseliny podle nároku 74, a která popřípadě na svém povrchu vylučuje nebo nese analog podle kteréhokoliv z nároků 64 až 72.

83. Způsob přípravy buňky podle nároku 80, vyznačující se tím, že zahrnuje transformaci hostitelské buňky fragmentem nukleové kyseliny podle nároku 74 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 75 až 79.