HRP20010319A2 - Novel methods for therapeutic vaccination - Google Patents

Description

Područje izuma

Ovaj izum odnosi se na nove metode suzbijanja bolesti kao što su karcinomi, koji su karakterizirani prisutnosti stanica povezanih s produktima ekspresije gena koji su neimunogeni ili imaju malu imunogenost. Određenije, ovaj izum se odnosi na metode indukcije imunog odgovora vođenog citotoksičnim T-limfocitima (CTL), pri čemu su stanice koje nose epitope iz produkata ekspresije gena napadnute i ubijene s CTL. Izum se također odnosi na metode priprave imunogena, modificiranih polipeptidnih antigena koji se izvode iz slabih imunogenih antigena.

Izum se nadalje odnosi na seriju primjena od aplikanata AutoVac tehnologije (koji je predmet WO 95/05849) unutar polja vakcinacije u terapiji karcinoma.

Dosadašnje spoznaje

Ideja vakcinacije protiv karcinoma je prisutna više od sto godina i ponovo je aktivirana krajem stoljeća.

Međutim, tijekom zadnjih 10 godina razumijevanja fundamentalnih molekulskih mehanizama imunog odgovora su značajno poboljšana. Među najvažnijim postignutim dostignućima je otkriće još uvijek rastuće liste citokina i faktora rasta, razumijevanje mehanizama interakcije između T i B stanica kao i ustanovljavanje puta procesa staničnih antigena, uključujući ulogu i strukturu MHC klase I i II molekula i ispoljavanja antigena. Važna otkrića o imunologiji karcinoma - mada još ne potpuno razjašnjena - su također rasvijetlila mehanizme koji prikazuju indukciju imunološke tolerancije u domaćinu. U sve ovo istraživanje uložen je veliki napor, a da se razviju novi tretmani humanog karcinoma.

Ovisno o tome kakav je tumorski imunitet potreban za pacijenta, imunogeni režimi se mogu kategorizirati kao pasivni ili aktivni. U pasivnoj imunoterapijskom režimu pacijenti pasivno primaju imune komponente kao što su citokini, antitijela, citotoksične T-stanica ili limfocitima aktiviranim stanicama ubojicama (LAK). Nasuprot tome, protokoli aktivne specifične imunoterapije obuhvaćaju induciranje aktivne imunosti na tumore vakcinacijom sa stanicama tumora ili njegovim antigenskim komponentama. Taj kasniji oblik tretmana je preferiran jer je imunitet produljen.

Pasivne i aktivne vakcine protiv tumora su usmjerene na indukciju humoralnih ili staničnih imunih odgovora. Za aktivne vakcine je dobro poznato da je indukcija CD4 pozitivnih T pomoćnih stanica neophodna da bi se sekundarno inducirala antitijela ili citotoksične CD8 pozitivne stanice.

Pasivna vakcinacija s antitijelima

Od otkrića tehnologije monoklonalnih antitijela sredinom sedamdesetih, razvijen je veliki broj monoklonalnih antitijela koji su upućeni na specifične tumore ili antigene povezane s tumorima. Terapija monoklonalnim antitijelima, međutim, povećava nekoliko ozbiljnih problema:

- Injekcija tih tvari izaziva imuni odgovor u pacijentu prema injektiranim antitijelima, što može voditi manje specifičnom tretmanu kao i ozbiljnim alergijskim nuspojavama u pacijentima.

- Monoklonalna antitijela se obično moraju davati u velikim količinama. To je problem jer je cijena priprave monoklonalnih antitijela ogromna.

- Monoklonalna antitijela se moraju davati paranteralnim putem zbog relativno velike potrebne količine, pa se pacijenti često moraju hospitalizirati tijekom tretmana.

Injekcije monoklonalnih antitijela se moraju ponoviti u kratkim intervalima (tjedni), a da bi se održavao terapijski učinak.

- Monoklonalna antitijela obično nisu u mogućnosti aktivirati sekundarne sustav efektora imunog sustava kao što je komplement, NK-stanice ili tumorskih stanica koje uništavaju makrofage.

Kasniji nedostatak od posebne važnosti u terapiji karcinoma može biti važan razlog zašto terapija monoklonalnim antitijelima karcinoma u nekoliko slučajeva nije posebno uspješna. Takozvana humanizirana monoklonalna antitijela koja se sada koriste u mnogim kompanijama su manje sposobna aktivirati sekundarni sustav efektora. Nadalje, primijećeni su primjeri sekundarnog porasta tumora koji nemaju originalni antigen tumora, jer ta antitijela ne uključuju efekt "nevinog promatrača" na tumorskim stanicama koje nemaju tumorski antigen.

Slaba mogućnost efektorskih monoklonalnih antitijela vodi razvitku monoklonalnih antitijela koji su kemijski konjugirani s različitim toksinima i radioizotopima. Pharmacia Upjohn AB je npr. razvio konjugat između specifičnog antitijela monoklonalnog tumora i toksina A Staphiylococcus aureus, a sa svrhom aktiviranja T-stanica u tumoru. Meradex Inc. je razvio bispecifična monoklonalna antitijela koja sadrže specifični Fab fragment tumora kao i specifični fragment antitijela Fc-receptora sa svrhom aktivacije tumorskih stanica koje uništavaju. Obje strukture se efikasnije nego sama monoklonalna antitijela, ali su također skuplji i imunogenični. Antitijela konjugirana s radioizotopima su također skupa i imunogena, tešu opažene i druge opće toksične nuspojave.

Pojava tehnologije monoklonalnih antitijela je bila glavni korak naprijed koji je omogućio pripravu dobro definiranih molekula velikih afiniteta vezivanja. Međutim, zato što su monoklonalna, ta antitijela reagiraju samo s jednim tipom epitopa na antigenu tumora. To je glavni razlog zašto oni obično nisu u stanju aktivirati komplementarni sustav ili vezati se na FC-receptore ili makrofage NK-stanica. Ovi vrlo moćni sustavi efektora obično zahtijevaju istovremeno lokaliziranje višestrukih fragmenata Ec antitijela koji potječu od antigena.

Ostali istraživači su stoga pokušali koristiti dva monoklonalna antitijela u kombinaciji i to je vodilo poboljšanim efektima. Stoga izgleda vrlo razumno umjesto toga napasti tumorske stanica s visoko specifičnim polikonalnim antitijelima usmjerenim na specifične tumore, ili s tumorom (prekomjerno eksprimiranim) povezanim antigenima ili receptorima faktora rasta. Takva antitijela bi bila potpuno sposobna aktivirati gore spomenuti sekundarni sustav efektora. Nadalje, vjerojatno je da lokalna upalna reakcija inducirana tim sustavima efektora može voditi sekundarnim efektima na stanicama koje su "nevinih promatrači" ne eksprimirajući antigen tumora niti aktivirajući specifične TIL (inflitrirajući tumorski limfocit) u tkivu tumora. Takvi efekti su opaženi u Medarex Inc. korištenjem bispecifilnih konjugata monoklonalnih antitijela.

Od otkrića tehnologije monoklonalnih antitijela, mogućnost upotrebe poliklonalnih antitijela u terapiji karcinoma nije jako istražena (osim dolje opisani antigeni). Jedan glavni razlog je vrlo što su specifični tumorski antigeni ili antigeni vezani na površinu tumora karakterizirani samo zadnjih godina, ali - što je još važnije - mnogi od njih su vlastiti antigeni i stoga nisu imunogeni. Prema tome, ksenogena poliklonalna antitijela bi se neophodno koristila za istraživanja efekata. Međutim, takva antitijela induciraju snažni imuni odgovor prema injektiranim stranim poliklonalnom antitijelima koji brzo eliminiraju terapijski učinak.

Aktivna vakcinacija za indukciju antitijela

Nedavni pokušaji indukcije poliklonalnih antitijela za terapiju aktivnom vakcinacijom pacijenata s karcinomom su bili uspješni. Razvijene su vakcine na vlastite ugljikohidratne antigene vezane na membranu (kao što su 0-vezani aberantno eksprimirani Tn i sTn-antigeni i ganliozidni liposaharidi GM2 i GD3). Te male ugljikohidratne strukture su, međutim, vrlo loši antigeni, pa se moraju koristiti konjugati tih molekula s molekulama nosačima kao što je hemocijanin (KLH) ili ovčji micini (koji sadrže Tn-i sTn). Kod pacijenata sa melanomom indukcija anti-M2 antitijela je povezana s produljenim vremenskim intervalom bez bolesti i preživljavanjem nakon toga najmanje pedeset jedan tjedan. Također je randomizirano istraživanje faze II provedeno na pacijentima s karcinomom dojke koristeći konjugate sTn i KLH i DEROK-B adjuvantu (BIOMIRA Inc.) pokazujući da su pacijenti imuni na STn imali znatno dulje medijano vrijeme preživljavanja u usporedbi prema kontroli. Drugi primjer aktivne indukcije poliklonalnih antitijela u karcinomu je upotreba idiotipa specifične vakcine protiv limfoma B-stanica, koji - mada obećavajući - su ograničeni samo na taj tip stanica.

Konačno, US kompanija Aphton Inc. je razvila aktivne konjugate vakcina protiv hormona koji oslobađa gonadotropin (nRH) i astrin. Pokazano je da su te vakcine sposobne u kontroli biološke aktivnosti tih hormona, koji također mogu djelovati kao autokrini faktori rasta za neke stanice tumora. Uspješna faza II kliničkih ispitivanja je provedena na pacijentima s karcinomom gastrointestinalnog trakta, a faza II kliničkih istraživanja se upravo odvija.

Citototoksične T-stanice

Jasno je prikazano od nekoliko grupa da su na tumor specifične citotoksične T-stanice (CTL) prisutne u mnogim tumorima. Te CTL su tumorski infiltrirajući limfociti (TIL). Međutim, te stanice nisu odgovorne ili anergične zbog nekoliko različitih mogućih mehanizama uključujući izlučivanje imunosupresivnog citokina tumorskim stanicama, pomanjkanje ko-stimuirajućih signala, smanjivanje MHC klase I molekula itd.

Bilo je mnogo pokušaja da se izoliraju na tumor specifični peptidi koji se vezuju na HLA kasu I, a koji prepoznaju TIL, a u nekim slučajevima su također bili uspješni, (npr. peptidi od antigena povezanih s melanomom). Takvi peptidi su se koristili za indukciju na tumor specifičnog imunog odgovora u domaćina, ali je praktična primjena tumorsko specifičnih peptida u vakcinama ograničena na mali segment populacije zbog uske specifičnosti vezanja peptida HLA klase 1. Nadalje, obično je relativno teško izazvati Odgovor CTL in vivo korištenjem sintetskih peptida zbog malog biološkog poluživota tih tvari, kao i zbog poteškoća s egzogenom započinjanju sinteze molekulu MHC klase 1.

Provedeni su mnogi drugi pokušaji da bi se dobilo na tumore specifični odgovor CTL uključujući korištenje citokina (npr. IL-2, IFN-γ, IL-6, IL-4, IL-10 ili M-CSF) ili ko-stimulirajuće molekule (B7) u topljivom obliku ili eksprimirane od transfektiranih tumorskih stanica. Nadalje, imunizacije s halogenim ili autolognim cijelim stanicama ili tumorskim antigenima pripravljenim u specijaliziranim adjuvantima pripravljenim da ispoljavaju antigen putem ispoljevanja MHC klase I ili tumorskim antigenima eksprimiranim u npr. vakcinija vektorima itd. su korištene s promjenljivim uspjehom. Ipak je opće vjerovanje među tumorskim imunolozima da bi jedan od najboljih puteva da se eliminiraju tumori bi bila indukcija jako specifičnog tumorskog odgovora CTL.

Osim što su ovi tretmani obično vrlo skupi i teško se reproduciraju, također se ispostavilo da se teško dobije dobar imuni odgovor na tumore jer su mnogi od tumorom povezani antigeni pravi vlastiti proteini prema kojima je većina T stanica tolerantna. Stoga izgleda neophodno da se induciraju kontrolirani stanični autoimuni uvjeti u pacijentu.

Cilj izuma

Cilj ovog izuma je prikaz poboljšanih metoda i sredstava za indukciju imunog odgovora u organizmima domaćina na nepoželjne antigene, npr. antigene tumora. Daljnji cilj je prikaz metode priprave polipetidnih analoga takvih nepoželjnih antigena, analoga koji mogu inducirati učinkovit imuni odgovor na neželjen antigen.

Sažetak izuma

Ispoljavanje antigena je dogmatski učeno kao dva zasebna puta, egzogeni put klasa II i endogeni put klase I.

Ukratko, strani protein porijeklom izvan stanice ili sa stanične membrane se prihvaćen APCom kako endozomom koji se povezuje s intastaničnim dijelom koji sadrži proteolitičke enzime i MHC klasu II molekula. Neki od nastalih polipeptida se vezuje na klasu II koja je zatim premještena na staničnu membranu.

Endogeni put klase I je karakteriziran uglavnom ispoljavanjem citoksičnih proteina. Vjeruje se da se ovo događa proteasomom posredovanim cijepanjem, nakon čega slijedi premještanje peptida u endoplazmatski retikulum (ER) preka TAP molekula smještenih u membrani ER. U ER su peptidi vezani na klasu I molekula, nakon čega slijedi premještaj u membranu plazme.

Međutim, ta dva puta nisu sasvim odvojena. Primjerice, poznato je da su dendritične stanice i do neke mjere makrofagi sposobni za endocitozu (pinocitozu) ekstracelularnih proteina i zatim ispoljiti ih u kontekstu MHC klase I. Također je prije pokazano da korištenjem specijaliziranih načina davanja, npr. vezanjem na podlogu od željenog oksida, egzogeni antigeni mogu. ući u put klase I (Rock, 1996). Taj mehanizma izgleda centralni zbog važnosti istovremene ekspresije obaju klasa I i II na isti APC da bi izazvao nakupinu tipa triju stanica. Interakcija tog tip nakupine s tri stanice je preložena od Mitchisona (1987), a kasnije i od drugih autora. Oni su pokazali važnost istovremene prezentacije klase I i klase II epitopa na istom APC. Prema tome je nedavno opisan mehanizam aktivacije CTL (vidi Lanzavecchia, 1998, Natrue 393: 413, Matzinger, 199, Nature Med. 5: 616, Ridge et al., 1998, Nature 393:, 474, Bennett et al., 1998, Nature 393: 487, Schoenberger et al., 1998, Nature 393: 480, Ossenderop et al., 1998, J. Exp. Med. 187: 693, te Mackey et al. 1998, J. Immunol. 161: 2094), kojim je ispoljavanje antigena od profesionalnih APC na MHC klasu II prepoznato od T pomoćnih stanica. Ovi rezultati u APC (posredovano interakcijom CD40L na T pomoćne stanice i CD40 na APC) omogućuje da APC izravno stimulira CTL koji su time aktivirani. Vidi također Sl. 2.

Prethodno je pokazano da insercija, na MHC klasu II ograničenog stranog epitopa za T pomoćne stanice u vlastiti antigen, rezultira time da je antigen u stanju inducirati jake odgovore od međureaktivnih antitijela koji su upućeni na nemodificirani vlastiti antigen (vidi WO 95/05849 od aplikanata). Pokazano je da indukcija auto-antitijela uzrokovana specifičnom pomoći T stanica inducirana insercijom stranog epitopa.

Međutim, mi smo došli do zaključka da modificirani vlastiti antigeni - s pomoći odgovarajućeg adjuvansa - mogu biti sposobni također inducirati jake odgovore CTL na vlastite epitope ograničene na MHC klasu, a ta je tehnologija opisana u WO 95/05849 se može primijeniti također na pripravu vakcine na intracelulatne i ostale stanice povezane s antigenima koji imaju epitope ispoljene u kontekstu MHC klase 1.

Tehnologija autovakcine opisana u WO 95/05849 djeluje tako da postoji specifična pomoć od T stanica samoreaktivnim B stanicama, a kada je modificirani vlastiti antigen dan za prihvat u MHC klasu II (vidi Sliku 1, te Dalum I et al., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804 kao i Dalum I et al., 1999, Nature Biotechnol. 17: 666-669). Pokazano je da su potencijalno samoreagirajući B-limfociti koji prepoznaju vlastite proteine, fiziološki prisutni u normalnom pojedincu. Međutim, da bi se ovi B-limfociti inducirali da stvarno proizvode antitijela reaktivna s važnim vlastitim proteinima, pomoć je potrebna od citokina koji produciraju T pomoćne limfocite (TH-stanice ili Tg-limfociti). Ta pomoć normalno nije osigurana jer T limfociti općenito ne prepoznaju epitope za T stanice izvedene iz vlastitih proteina, a kada su ispoljeni stanicama koje ispoljavaju antigene (APC). Međutim, dovođenjem elementa "stranosti" u vlastiti protein (tj. uvođenjem imunološki značajne modifikacije), T stanice koje prepoznaju strani element su aktivirane prepoznavanjem stranog epitopa za APC (kao što je, početno, mononuklerna stanica). Poliklonalni B limfociti (koji ispoljavaju epitope za T stanice) mogu prepoznati vlastite epitope na modificiranim vlastitim proteinima također uvlače antigen i zatim ispoljavaju odgovarajući strani epitop(e) za T satnice, te aktiviraju T limfocite pa time omogućuju pomoć citokina tim samoreaktivnim poliklonalnim B-limfocitima. Kako su antitijela nastala tim poliklonalnim B-limfocitima reaktivna s različitim epitopima na modificiranom polipeptidu, uključujući one koji su također prisutni u prirodnom polipeptidu, međureaktivnost antitijela s nemodificiranim vlastitim proteinima je inducirana. U zaključku, T-limfociti mogu biti vođeni da djeluju kao da populacija poliklonalnih B-limfocita prepoznaje cijeli strani antigen, dok je u stvari samo insertirani epitop(i) stran domaćinu. Na taj način, induciraju se antitijela sposobna međureakciji s nemodificiranim vlastitim antigenima.

Kao što je gore spomenuto, CTL također zahtijevaju specifičnu pomoć T stanica, mada mehanizam toga još uvijek nije jasan. Mi smo zasnovali ovaj izum na našoj novoj teoriji da vlastiti proteini koji sadrže strane epitope MHC klase II, nakon egzogenog prihvaćanja, mogu imati pristup u put procesiranja MHC antigena klase I. Na taj način se može inducirati jaki odgovor CTL na subdominantne epitope u vlastitim proteinima. Alternativno, geni koji kodiraju modificirane tumorske antigene se mogu davati kao vakcine nukleinskih kiselina koji također vode MHC klasom II kao i MHC klasom I posredovanim imunim odgovorima.

Tumorske stanice vrlo loše ispoljavaju antigen zbog nepostojanja ekpresije MHC klase I, nedostatka kostimulirajućih. Konačno, produkt može, ovisno o odabranoj stanici domaćina ili korištenoj sintetskoj metodi biti podvrgnut umjetnoj post-tanslacijskoj modifikaciji. To može biti shema resturkutiranja poznata u struci, tretman s enzimima (da se dobije glikolizacija ili uklanjanje nepoželjnih partnera fuzije), te konjugacija, npr. s tradicionalnim molekulama nosačima.

Valja napomenuti da preferirane molekule iz izuma (i također važni analozi korišteni u metodi iz izuma) sadrže modifikacije koje kao rezultat u polipeptidu imaju sekvencijsku identičnost najmanje 70% s polipeptidnim antigenom ili njegovom podsekvencijom od najmanje 10 aminokiselina. Preferirane su veće identične sekvencije, npr. najmanje 75% ili najmanje 80% ili 85%. Identičnost sekvenvija proteina i nukleinskih kiselina se može računati kao

(Nref-Nraz) • 100/Nref,

pri čemu je Nraz ukupni broj neidentičnih ostataka u dvjema uspoređenim sekvencijama, a Nref je broj aminokiselinskih ostataka u jednoj od sekvencija. Tako će DNA sekvencija AGTCAGTC imati identičnost od 75% sekvenciji AATCAATC (Nraz=2 i Nref=8).

Specifični ciljevi za metodu iz izuma koji su primjeri

Kao što je gore diskutirano, preferirani slabi polipeptidni antigeni povezan sa stanicom su antigeni povezani s tumorom. Neograničavajuća lista tih je dana u sljedećoj tablici molekula, te izlučivanja imunosupresivnih citokina, itd. Korištenjem pripravljene autovakcine i gore spomenutog protokola vakcinacije, modificirani antigen tumora bi se mogao ispoljiti pomoću MHC klase I kao i MHC klase II molekula profesionalnih stanica koje ispoljuju antigen. Istovremeno ispoljavanje subdominantnih vlastitih epitopa na MHC klasi I i imunodominantnih stranih epitope MHC klase II molekula bi bili posredovani izravnom pomoći citokina od aktiviranih, na MHC klasu II ograničenih T-pomoćnih stanica na MHC klasu I ograničenih na CTL (slika 2). To će po našem mišljenju voditi razbijanju anutotolerancije T stanica prema tumorskim antigenima i to je upravo ono što je poželjno u imunoterapiji tumora.

U zaključku, vakcina konstruirana koristeći gore skiciranu tehnologiju će inducirati odgovor humoralnog antitijela sa sekundarnom aktivacijom komplementarne i o antitijelu ovisne stanične citotoksične aktivnosti (ADCC). Također se očekuje da će se inducirati odgovor citotoksičnih T stanica usmjerenog na npr. specifičan antigen tumorske membrane.

Stoga u najširem i najopćenitijem obujmu, ovaj izum se odnosi na metodu indukcije imunog odgovora na polipeptidni antigen u životinji, uključujući čovjeka, a rečeni polipeptidni antigen je slabo imunogen ili nije imunogen u životinji, a metoda uzrokuje istovremeno ispoljavanje stanica koje ispoljuju antigen (APC) iz imunog sustava životinje u imunogenski učinkovite količine:

1. najmanje jednog epitopa za CTL izvedenog iz polipeptidnog antigena i/ili najmanje jednog epitopa za B-stanice izvedenog iz polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, te

2. najmanje prvog epitopa za T pomoćne stanice (Tn epitop) koji je stran životinji.

U specifičnijom varijanti inventivne metode, izum se odnosi na metodu smanjivanja aktivnosti polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom u životinji, uključujući ljude, a rečeni je polipeptidni antigen slabo imunogen ili nije imunogen u životinji, a indukcijom odgovora specifičnih citotoksičnih T-limfocita (CTL) na stanice koje na površini nose polipeptidni antigen ili ukotvljeni polipeptidni antigen u unutarstaničnom dijelu, metoda sadrži uzrokovanje istovremenog ispoljavanja u životinji, a od pogodne stanice koja ispoljava antigen (APC) od

1. najmanje jednog epitopa za CTL izvedenog iz polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, te

2. najmanje prvog epitopa za T pomoćne stanice (TH) koji je stran životinji.

Također je nova strategija priprave imunogenog sredstva dio izuma. Ova nova strategija sadrži odabir i pripravu analoga slabih antigena povezanih sa stanicom, u kojima je sačuvan znatni dio frakcije poznate i previđenog epitopa za CTL i mišljeno je da se istovremeno uvodi najmanje jedan strani epitop za TH.

Nadalje, izum se odnosi na neke specifične imunogene konstrukte zasnovane na poznatim antigenima povezanih s tumorom, kao i na pripravke koji sadrže te strukture.

Konačno, izum se odnosi na fragmente nukleinske kiseline, vektore, transformirane stanice i ostale alate korisne u molekuarno-biološkim metodama za produkciju analoga antigena povezanih s tumorom.

Opis slika

Slika 1: Tradicionalni koncept autovakcije. A: Dominantni vlastiti epitopi koji se mogu tolerirati, ispoljeni na MHC klasu II na antigen ispoljavajućih stanica (APC) nisu uzeti u obzir zbog ispražnjenih mogućnosti T pomoćnih stanica (Th) (T pomoćne stanice prikazane su crtkanim linijama). Insertirani strani imunodominantni epitopi za T stanice ispoljeni na MHC klasi II aktiviraju T pomoćne stanice i B stanice (B) specifične za prirodne dijelove vlastitih proteina koji ispoljavaju strane imunodominantne epitope za T stanicu na MHC klasi II su aktivirani s pomoću citokina koju omogućuju T pomoćne stanice.

Slika 2: Koncept AutoVac za indukciju odgovora CTL. Insertirani strani imunodominantni epitopi za T stanice ispoljeni na MHC klasi II koji aktiviraju T pomoćne stanice i B stanice (B) specifične za prirodne dijelove vlastitih proteina koji ispoljavaju strane imunodominantne epitope za T stanice na MHC klasi II koji aktiviraju T pomoćne stanice. Podjedinice vlastitih epitopa koje prepoznaje vlastite proteine CTL ispoljeni na MHC klasi I su aktivirani susjednom aktiviranom T pomoćnom stanicom.

Slika 3: Shematski prikaz Her2 polipeptida s pokazanom epitopalnom regijom i N-glikolizacijskim mjestom. Četiri ekstraceluarne domene, transmembranska domena (TM) i dvije intracelularne domene su prikazane s naznačenim mjestima za različite stupnjeve homologije i mjestima koja sadrže prihvaćene/određene epitopeza CTL.

Slika 4: Shematski prikaz humanog PSM polipeptida s naznačenom regijom insecije P2 i P30 epitopa.

Slika 5: FGF geni i proteini. A: Ekson-intron struktura humanog i mišjeg FGF8 gena. Dolje je ilustrirano osam različitih ispletenih oblika (od Gemel 1996). B: Aminokiselinska sekvencija različitih FGF8 izoforma. Polipeptidni lanci jedinstveni od FGF8b, FGFSf i FGFSe su pokazani masnim slovima, kurzivom ili podvučeno. FGFSa je najkraća varijanta ne sadrži ni jednu od ovih istaknutih sekvencija. Očekuje se da će signalni peptid biti pocijepan C-terminalno do Ala22. Dva cisteinska ostatka nađena u odrasloj FGF8 (svi izoformi) su podvučeni debelom linijom. Dva potencijalne N-gliklzilacijska mjesta FGF8b su prikazana N. Brojanje je prema FGF8b.

Slika 6: Ilustracije četiriju različitih varijanata FGF8b dizajniranih za autovakcijnaciju. Gornji skup: Teorijski modeli mjesta insercije epitopa korištenjem FGF2 kristalne strukture kao templata. Donji skup: Aminokiselinska sekvencija divljeg tipa FGF8b (WT) i četiri varijante F30N, F2I, F30I, te F2C. Signalni peptid je dvostruko podvučen. N-terminalna sekvencija (MetAla) svih varijanata potječe od generacije Kozakove sekvencije (Kozak 1991) za bolju translaciju u eukariotskim sustavima.

Detaljan opis izuma

Definicije

U sljedećem dijelu bit će definirani i u detalje objašnjeni brojni termini korišteni u ovoj specifikaciji i zahtjevima, a da se raščiste otkrića i područja izuma.

Namjera je da "polipeptidni antigen povezan sa stanicom" u ovoj specifikaciji i zahtjevima označuje polipeptid koji je ograničen na stanicu koja je bio kako povezana s patološkim procesom. Nadalje, stanica sadrži epitope za CTL polipeptidnog antigena vezanih na MHC klasu I molekula na njenu površinu. Polipeptidni antigen povezani sa stanicom mogu stoga biti stvarni intracelularni antigeni (i zato nedostižni za humoralni imuni odgovor) ili antigeni vezani na površinu stanica. Antigen povezan sa stanicom može biti produkt ekspresije gena vlastite stanice, intracelularnog parazite ili virusa, ili druge stanice. U zadnjem slučaju, polipeptidni antigen je zatim povezan sa stanicom koja sadrži patološki proces.

Termin "T-limfocit" i TH stanica" će se koristiti alternativno za limfocite porijeklom iz timusa koji su odgovorni za različite stanice koje su posredovane imunim odgovorima kao i za aktivnost pomoćnih stanica u humoralnom imunom odgovoru. Slično, termin "B-limfocit" i B-stanica" će se koristiti limfocite koji produciraju antitijela.

"Stanica koja ispoljava antigen" (APC) je stanica koja sadrži epitope za T-stanice. Tipične stanice koje ispoljavaju antigen su makrofagi, dendritične stanice i ostale fagocitizirajuće i pinocitizirajuće stanice. Valja napomenuti da B-stanice također djeluju kao APC ispoljavanjem epitopa za TH vezanog na MHC klasu II molekula u TH stanicama, ali kad se općenito koristi termin APC u ovoj specifikaciji i zahtjevima, namjera je da se odnosi na gore spomenute fagocitizirajuće i pinocitizirajuće stanice.

"Pomoćni T-limfociti" ili "TH stanice" označuju CD4 pozitivne T-stanice koja pomažu B-stanicama i citotoksičnim T-stanicama putem prepoznavanja epitopa za TH vezanih na MHC klasu II molekula na stanice koja ispoljavaju antigen.

Termin "citotoksični T-limfociti" (CTL) će se koristiti za CD8 pozitivne T-stanice koje trebaju pomoć TH stanica da bi bile aktivirane.

"Specifični" imuni odgovor u ovom kontekstu označuje poliklonalni imuni odgovor usmjeren uglavnom na molekule ili skupine kvazi-identičnih molekula, ili altenativno na stanice koje ispoljuju epitopi za CTL molekula ili skupina kvazi-identičnih molekula.

"Polipeptdini antigen koji je slabo imunogen ili bez imunogenosti" ovdje označuje polipeptide koji imaju aminokiselinsku sekvenciju sa slabim proteinskim antigenom povezanim sa stanicom, koji je izveden od životinje (npr. čovjeka), ali su također terminom obuhvaćeni polipeptidi koji imaju aminokiselinsku sekvenciju identičnu analozima proteina izoliranih iz ostalih specija. Također su u granice termina uključeni polipeptidi koji imaju različite obrasce glikolizacije zbog njihove produkcije u heterolognim sustavima (npr. kvasac ili ostali eukariotski sustavi ekspresije koji ne potječu od sisavaca ili čak prokariotski sustavi). Valja, međutim, naznačiti da pri upotrebi termina, namjera je da polipeptid koji je u pitanju normalno nije imunogen ili je sam slabo imunogen u svojoj prirodnoj lokalizaciji u životinji koja se tretira.

Termin "polipeptid" u ovom kontekstu označuje kratke peptide od 2 do 10 aminokiselinskih ostataka, oliopeptide od 11 do 100 aminokiselinskih ostataka, te polipeptide od više od 100 aminokiselinskih ostataka. Nadalje, namjera je također da termin uključuje proteine, tj. funkcionalne biomolekule koje sadrže najmanje jedan polipeptid, a kad sadrže najmanje dva polipeptida oni mogu biti u obliku kompleksa, kovalentno vezani ili mogu biti nekovalentno vezani. Polipeptid(i) u proteinu može biti glikoliziran i/ili lipidiran i/ili može sadržavati prostetične skupine.

Termin "subsekvencija" označuje pružanje od najmanje 3 aminokiseline ili, kada je to važno, najmanje 3 nukleotida izravno izvedene od prirodne aminokiselinske sekvencije ili sekvencije nukleinske kiseline.

Termin "životinja" u ovom kontekstu općenito označuje životinjske vrste (preferirano sisavce) kao što su Homo sapiens, Canis domesticus, itd. a ne samo jednu životinju. Međutim, termin također označuje populaciju takvih životinjskih vrsta jer je važno da jedinke imunizirane prema metodi iz izuma sve sadrže uglavnom isti slabi polipeptidni antigen povezan sa stanicom koji dopušta da imunizaciju životinja s istim imunogenom (imunogenima). Ako primjerice genetske varijante polipeptida postoje u različitim humanim populacijama, može biti neophodno da se koriste različiti imunogeni u tim različitim populacijama, a da bi se mogla razbiti autotolerancija prema slabom polipeptidnom antigenu povezanom sa stanicom u svakoj populaciji.

Terminom "smanjivanje polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom" ovdje označuje smanjivanje količine i/ili aktivnosti antigena koji je u pitanju u živom organizmu. Smanjivanje se može dobiti putem nekoliko mehanizama" od koji je jednostavna interferencija s aktivnim mjestom u antigeni vezivanjem antitijela je najjednostavnije. Međutim, također je unutar obujma ovog izuma da vezivanje antitijela rezultira uklanjanju polipeptidna stanica čistača (kao što su makrofagi ili ostale fagocitizirajuće stanice), te još važnije, te stanice nose u ili na sebi antigen koji je ubijen CTL stanicama u životinji.

Termin "djelujući istovremenim ispoljavanjem uz pogodni APC" označuje da je životinjski imuni sustav podvrgnut imunogenom izazovu na kontrolirani način koji rezultira istovremenim ispoljavanjem epitopa koji su u pitanju uz APC.

Kao što će se ispostaviti iz donje diskusije, takav izazov imunog sustava može djelovati na brojne načine od kojih je najvažniji vakcinacija s polipeptidom koji sadrži "farmakocine" (tj. vakcine koje su dane za tretman ili poboljšanje postojeće bolesti) ili vakcinacija "farmakocinom" s nukleinskom kiselinom. Važan rezultat koji valja postići je da imuno kompetentna stanica u životinji suprotstavljena APC koji pokazuje važne epitope na imunološko učinkovit način.

Termin "imunogenski učinkovita količina" ima svoje uobičajeno značenje, tj. količina imunogena koja može inducirati inumi odgovor koji značajno zadržava patogena sredstva koja dijele imunološke karakteristike s imunogenom.

Kada se koristi izraz da je slabi polipeptidni antigen povezan sa stanicom "modificiran" ovdje označuje kemijsku modifikaciju polipeptida koji čini skelet tog polipeptida. Takva modifikacija može npr. biti izvedena (npr. alkiliranje) na nekim aminokiselinskim ostacima u sekvenciji, ali će prema ovom izumu preferirana modifikacija sadržavati promjene primarne strukture animokiselinske sekvencije.

Kada se diskutira "tolerancija" i "autotolerancija", s obzirom da su polipeptidi koji su ciljni u ovoj inventivnoj metodi vlastiti proteini u populaciji koja će biti vakcinirana ili proteini koji ne izazivaju učinkovit imuni odgovor, podrazumijeva se da normalni pojedinci u populaciji neće povećavati imuni odgovor prema polipeptidu. Ne može se isključiti da će ponekad pojedinci u životinjskoj populaciji moći tvoriti antitijela na prirodni poipeptidni antigen, npr. kao dio autoimunog poremećaja. Pri bilo kojoj brzini, životinja će normalno biti autotolerantna samo na svoj polipeptidni antigen, ali se ne može isključiti da će analozi izvedeni iz ostalih životinjskih vrsta iz populacije koja ima različit fenotip također biti tolerirani u rečenim životinjama.

"Strani epitop za T-stanice" je peptid koji je u stanju vezati se na molekulu MHC i koji stimulira T-stanice u životinjama. Preferirani strani epitop za T-stanice u ovom izumu su epitopi relaksirane specifičnosti, tj. epitopi koji se vežu na veliki udio klase II MHC molekula u životinjskim vrstama u populaciji. Poznat je samo vrlo mali broj takvih epitopa za T-stanice relaksirajuće specifičnosti, i ti će dolje biti detaljno prikazani. Valja napomenuti da bi imunogeni koji se koriste u ovom izumu bili učinkoviti u velikom dijelu životinjske populacije, za što može biti neophodno da se 1) insertira nekoliko stranih epitopa za T-stanice u istom analogu ili da se 2) pripravi nekoliko analoga u kojima svaki analog ima insertirani različiti epitop relaksirane specifičnosti. Valja naznačiti da je koncept stranih epitopa za T-stanica, tj. epitopi koji se izvode iz vlastitih proteina i koji pokazuju imunogeno ponašanje samo kad postoje u izoliranom obliku bez početnog dijela vlastitih proteina.

"Strani epitop za T pomoćne limfocite" (strani etitop za TH) je strani epitop za T stanice koji se vezuje na MHC klasu II molekula i može biti prisutan na površini stanice koja ispoljava antigen (APC) vezanom na MHC klasu II molekulu.

"Funkcionalni dio" (bio)molekule u ovom kontekstu označuje dio molekule koja je odgovorna za najmanje jedan biokemijski ili fiziološki efekt pod utjecajem molekule. Dobro je poznato u struci da mnogi enzimi ili ostale molekule imaju aktivno mjesto koje je odgovorno za efekte koje se ispoljuju zbog tih molekula. Ostali dijelovi molekule mogu služiti u svrhu stabilizacije ili mogu povećavati topljivost i mogu stoga biti izostavljeni ako ove svrhe nisu važne u kontekstu nekih cjelina ovo izuma. Primjerice, moguće je da se koriste neki citokini kao modificirani ostaci u analogu (vidi detaljnu diskusiju dolje) i u takvom slučaju pitanje stabilnosti može biti nevažno jer je vezanje za analog dovodi do željene stabilnosti.

Termin "adjuvans" ima svoje uobičajeno značenje u tehnologiji vakcina, tj. tvar ili pripravak koji 1) za sebe nije u mogućnosti izazvati specifičan imuni odgovor vakcine, ali koji je 2) ipak u stanju povećati imuni odgovor na imunogen. Drugim riječima vakcinacija adjuvansom ne dovodi do imunog odgovora na imunogen, vakcinacija s imunogenom može ili ne mora povećavati imuni odgovor na imunogenu, ali kombinirana vakcinacija s imunogenom i adjuvansom izaziva imuni odgovor na imunogen koji je jači od onog induciraneg samim imunogenom.

"Usmjeravanje" molekule u kontekstu ovo izuma označuje situaciju u kojoj će nakon uvođenja molekule u životinju preferirati neko tkivo(a) ili će preferirano biti povezana s nekim tipom stanice ili stanicama. Efekt može biti dobiven na brojne načine, uključujući formulaciju molekule u pripravku koja olakšava usmjeravanje uvođenjem u molekulu skupina koje olakšavaju usmjeravanje. Ova tkiva će biti dolje detaljno diskutirana.

"Stimulacija imunog sustava" znači da tvar ili pripravak općenito pokazuje nespecifičan imunostimulirajući učinak. Brojni adjuvansi i oni za koje se pretpostavlja da su adjuvansi (kao neki citokini) dijele sposobnost stimulacije imunog sustava. Rezultat korištenja imunostimulacijskog sredstva je povećanje "pripravnosti" imunog sustava znači da istovremena ili kasnija imunizacija s imunogenom inducira značajno učinkovitiji imuni odgovor u usporedbi kad se koristi samo imunogen.

Preferirane cjeline

Da bi se izazvao odgovor CTL na stanice koje ispoljavaju epitope izvedene od polipeptidnih antigena na njihovoj površini, normalno je neophodno da je najmanje jedan epitop za CTL, kada je prisutan, povezan s MHC klasom I molekula na površini APC.

Preferirani APC koji ispoljavaju epitope su dendritične stanice i makrofagi, te bilo koji pino- ili fagocitizirajući APC koji je sposoban stimulirajuće ispoljiti 1) epitope za CTL vezane na MHC klasu I molekula, te 2) epitope za TH vezane na MHC klasu II molekula, a što je preferirano prema izumu.

Prema izumu, polipeptidni antigen povezan sa stanicom je preferirano odabran od antigena povezanih s tumorom i ostalih vlastitih proteina koji se odnose na patološke procese, ali također na virusne antigene i antigene izvedene od intracelularnih parazita ili bakterija. Dobro je poznato u struci da takvi antigeni koji su povezani s patogenošću su često slabo imunogeni (npr. antigeni iz mikobakterija kao Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium leprae, ali također iz protozoa kao što je Plasmodium spp.). Vjeruje se da je metoda iz izuma, osim što pokazuje moguću produkciju antitijela i odgovore CTL na stvarne vlastite proteinske antigene, moguće je povećati često nedovoljni imuni odgovor dobiven od organizama na intracelularne antigene.

Normalno, bit će dobro izložiti imuni sustav velikom dijelu aminokiselinske sekvencije polipeptidnog antigena koji je cilj vakcine. Zato, u preferiranoj cjelini, ispoljavanje epitopa za CTL i prvog stranog epitopa za TH od APC je uzrokovano ispoljavanjem imunog odgovora u životinji s najmanje prvim analogom polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, a rečeni prvi analog sadrži varijaciju aminokiselinske sekvencije u polipeptidnom antigenu povezanog sa stanicom, a rečena varijacija sadrži najmanje epitop za CTL i prvi strani epitop za TH. To je drugačije od DNA vakcinacijske strategije u kojoj su epitopi za CTL i TH eksprimirani od iste stanice ali kao dijelovi odvojenih polipeptida; takva DNA vakcinacijska strategija je također cjelina izuma, i vjeruje se da će zbog postojanja dvaju epitopa kao dio istog polipeptida normalno biti povećani imuni odgovor za bilo koji iznos, ali s tim da će samo jedan ekspresijski produkt biti neophodan.

Da bi se maksimizirala vjerojatnost dobivanja učinkovitog imunog odgovora, preferirano je da gore spomenuti prvi analog sadrži glavninu poznatog i predviđenog epitopa za CTL u polipeptidnom antigenu povezanom sa stanicom, tj. dio poznatog i predviđenog epitopa za CTL koji vezuje dio MHC klase I molekula u populaciji. Primjerice, preferirano je da je glavnina poznatog i predviđenog epitopa za CTL u aminokiselinskoj sekvenciji prepoznata od najmanje 50% MHC-I halotipova koji prepoznaju sve poznate i predviđene epitope za CTL u polipeptidnom antigenu povezanim sa stanicom, ali su preferirani viši postoci, kao što je najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, te najmanje 90%. Posebno je preferirano kad su gotovo svi predviđeni epitope za CTL u polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom prisutni u najmanje prvom analogu.

Metoda za predviđenja i ispoljavanje epitopa za CTL je dobro poznata u struci, vidi npr. Rothbard et al EMBO J. 7:93-100 (1988).

Bit će očito iz ove specifikacije i zahtjeva da se očekuje da će ovdje opisana inventivna metoda pokazati moguću učinkovitu indukciju odgovora CTL na polipeptidne antigene povezane sa stanicom.

U slučajevima u kojima je polipeptidni antigen povezan sa stanicom stvarno intracelularan, indukcija odgovora CTL na stanice koje ukotvijavaju antigen je jedini put da se postigne smanjivanje specifičnog imunološkog značenja. Međutim, u slučaju kad su antigeni povezani s membranom, dobro je inducirati odgovor antitijela i slabim polipeptdinim antigenom povezanim sa stanicom. Međutim, kada se povećava humoralni imuni odgovor na antigen povezan sa stanicom preferirano je znatno ograničiti odgovor antitijela na interakciju s dijelovima antigena koji su normalno izloženi mogućoj interakciji s antitijelom. Inače bi rezultat najvjerojatnije bio indukcija odgovora antitijela na dijelove antigena koji nisu normalno obuhvaćeni humoranim imunim sustavom, a to će povećati rizik indukcije ukrštene reaktivnosti s antigenima koji nisu povezani na bilo koji patološki oblik. Jedan elegantan način dobivanja te restrikcije je da se izvede vakcinacija nukleinskom kiselinom s analogom slabog antigena povezanog sa stanicom, u kojoj je vanstanični dio nepromijenjen ili uključuje epitop za TH koji ne mijenja značajno 3D strukturu ekstracelulatnog dijela antigena. Kao jedna moguća alternativa, imunizacija se može izvesti s CTL kao direktnim imunogenom i B-stanicama usmjerenim imunogenom u kojoj je utjecaj imunizacije na intracelularni dio ciljanog antigena (B-stanicom usmjerenom imumogenu može npr. nedostajati bilo koji ne vanstanični materijal iz antigena).

Indukcija odgovora antitijela stručnjak može postići na brojne načine. Primjerice, najmanje prvi analog može sadržavati dio koji se sastoji od modificirane strukture polipeptidnog antigena vezanog na stanicu, a rečena modifikacija kao rezultat ima imunizaciju životinja s prvim analogom inducira produkciju antitijela u životinji protiv polipeptidnog antigen vezanog sa stanicu - ta varijanta spomenuta gore je posebice pogodna za vakcinaciju nukleinskom kiselinom. Alternativno, metoda iz izuma može sadržavati efektivno ispoljavanje životinjskog imunog sustava imunogenski učinkovite količine najmanje drugog analoga polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom koji sadrži takvu modifikaciju. Pogodan način da se to postigne da modifikacija ima željeni efekt induciranja antitijela je da uključi najmanje jedan drugi strani epitop za TH u drugi analog, tj. ista strategija kao što je korištena za prvi analog.

U slučaju kada je poželjno izazvati također učinkovit humoralni imuni odgovor, pogodno je da je prva i/ili drugi analog (analozi) sadrži značajnu frakciju epitopa za B-stanicu polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, posebice kad se značajni dio takvih epitopa za B-stanice prirodno pojavljuju vanstanično od antigena i pogodnoj životinji.

Gore diskutirane varijacije modifikacija slabog polipeptidnog antigena vezanog sa stanicom mogu biti različiti oblici. Preferirano je da varijacije i/ili modifikacije uključuju aminokiselinsku supstituciju i/ili deleciju i/ili inserciju i/ili adiciju. Ove temeljne operacije odnose se na manipulaciju aminokiselinske sekvencije i trebaju sadržavati promjenu jedne aminokiseline kao i operacije koje obuhvaćaju aminokiselinske nizove (i.a. miješanje aminokiselinskih nizova unutar polipeptidnog antigena, to je posebno interesantno kada je antigen stvarni intracelularni antigen, jer je važno samo razmatranje koje se tiče sačuvanja epitopa za CTL). Razumjet će se da je uvođenje npr. jedne aminokiseline insercijom ili delecijom povećava pojavljivanje stranog epitopa za TH u sekvenciji analoga, tj. pojavljivanje vezujuće sekvencije MHC klase II molekule. Međutim, u većini situacija preferirano je (čak i neophodno) uvest poznati strani epitop za TH i takva operacija će zahtijevati supstituciju i/ili inserciju (ili ponekad adiciju) u obliku konjugacije na protein nosač ili uvjet fuzije polipeptida metodama molekularne biologije. Preferirano je da je broj aminokiselinskih insercija, delecija, supstitucija ili adicija najmanje 2, kao što je 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 i 25 insercija, adicija, supstitucija ili delecija. Nadalje je preferirano da je broj aminokiselinskih insercija, adicija, supstitucija ili delecija nije veći od 150, tako da je uglavnom 100, uglavnom 90, uglavnom 80 i uglavnom 70. Posebno je preferirano ako je broj aminokiselinskih insercija, adicija, supstitucija ili delecija ne prelazi 60, a određenije da ne prelazi 50 ili čak 40. Najpreferiraniji broj nije veći od 30.

Preferirane cjeline izuma uključuju modifikacije uvođenjem najmanje jednog stranog imunodominantog epitopa za T-stanice. Podrazumijevat će se da pitanje dominacije epitopa za T-stanice ovisi u vrsti životinje. Po tome kako se ovdje koristi, termin "imunodominacija" odnosi se na epitope koji u vakciniranom pojedincu/populaciji značajno povećavaju imuni odgovor, ali je dobro poznata činjenica da epitop za T-stanice koji je imunodominantan u pojedincu/populaciji nije sigurno dominantan u drugom pojedincu iste vrste, mada može biti sposoban vezati se na MHC-II molekule u potonjima. Stvarni imunodominantni epitopi za TH su oni koji, neovisno o polipeptidu u kojem oni tvore sekvenciju, povećavaju aktivaciju TH stanica - drugim riječima, neki epitopi za TH imaju unutarnju karakteristiku, karakteristika koja nikada nije bila dvojbena jer se gotovo uvijek procesiraju od APC i ispoljuju u kontekstu MHC II molekule na površini APC.

Sljedeći važni aspekt je pitanje restrikcije MHC epitopa T-stanice. Općenito prirodni epitopi T-stanica su ograničeni na MHC, tj. neki peptidi koji sadrže epitop za T-stanice će se vezati učinkovito na podskupinu MHC klase II molekula. To s druge strane ima učinak da će upotreba jednog specifičnog epitopa za T-stanice u komponenti vakcine rezultirati time da je ona učinkovita samo u dijelu populacije, a ovisno o veličini tog dijela, može biti neophodno da se uključi više epitopa za T-stanice u istu molekulu, ili da se alternativno pripravi višekomponentna vakcina u kojoj su komponente varijante antigena koje se mogu razlikovati jedna od druge uvođenjem prirodnog epitopa za T-stanice.

Ako je restrikcija korištenih T-stanica potpuno nepoznata (primjerice u situaciji u kojoj vakcinirana životinja ima slabo definirani sastav MHC), udio populacije koja je pokrivena specifičnim sastavom vakcine se može odrediti sljedećom formulom

[image]

- u kojoj pi jeste frekvencija onih koji daju odgovor u populaciji na i -tog epitopa T-stanice prisutnih u pripravku vakcine, a n je ukupni broj stranih epitopa T-stanice prisutnih u sastavu vakcine. Stoga, pripravak vakcine koji sadrži 3 strana epitopa T-stanice i ima frekvenciju odgovora u populaciji od 0.8, 0.7 i 0.6, dat će

1 - 0.2 x 0.3 x 0.4 = 0.976

tj. 97.6 posto populacije će statistički povećavati odgovor na vakcinu posredovan MHC-II.

Gornja formula se ne odnosi na situaciju u kojoj je poznat više ili manje precizni restrikcijski obrazac korištenih peptida. Ako se, primjerice, neki peptidi vežu samo na humane MHC-II molekule kodirane HLA-DR aleli DRI, DR2, DR3, DR5 i DR7, tada je korištenje tih peptida skupa s drugim peptidom koji se veže na preostale MHC-II molekule kodiran s HLA-DR alelom će upotpuniti 100% pokrivenosti populacije koja je u pitanju. Slično, ako se drugi peptid veže samo DR3 i DR5, dodatni peptid uopće neće povećati pokrivenost. Ako se račun zasniva na populacijskom odgovoru samo na MHC restrikciju epitopa T-stanica u vakcini, udio pokrivene populacije specifičnim pripravkom vakcine se može odrediti pomoću sljedeće formule:

[image] (III)

u kojoj φj je suma frekvencija u populaciji aleičnog haplotipa koji kodiraju MHC molekule koje vežu bilo koji epitop T-stanice u vakcini i koji pripadaju j-tom od 3 poznata mjesta HLA (DP, DR i DQ); u praksi je prvo određeno koje će MHC molekule prepoznavati svaki epitop T-stanice u vakcini koje su zatim navedene po tipu (DP, DR i DQ) - a zatim su pojedine frekvencije različitih navedenih aleičnih haplotipa zbrojene za svaki tip pri čemu su dobiveni φ1, φ2 i φ3.

Može se desiti da vrijednost pi u formuli II prelazi odgovarajući teorijsku vrijednost Πi:

[image] (IV)

- u kojoj je νj suma frekvencija u populaciji kojom alelični haplotip kodira MHC molekule koje se vežu na i-ti epitop T-

stanice u vakcini i koja pripada j-tom od 3 poznata mjesta HLA (DP, DR i DQ). To znači da je 1-Πi -tom dijelu populacije frekvencija odgovora fostatak_i " (pi--Πi )/(1-Πi ). Stoga se formula III može podesiti tako da se dobije formule V

[image] (V)

- u kojoj termin 1-fostatak_i je određen kao 0 ako je negativan. Valja napomenuti da formula V zahtjeva da svi epitopi imaju haplotip mapiran na identičan set haplotipa.

Zato, kada se biraju epitopi T-stanica koji će se uvesti u analog, važno je da se uključe sva znanja o epitopima koji su na raspolaganju: 1) frekvencija onih koji daju odgovor u populaciji na svaki epitop, 2) podaci o restrikciji MHC i 3) frekvencija relevantnih haplotipa u populaciji.

Postoje brojni prirodni epitopi T-stanice "relaksirane specifičnosti" koji su aktivni u velikom udjelu pojedinaca životinjskih vrsta ili životinjske populacije i oni se preferirano uvode u vakcinu, što smanjuje potrebu za vrlo velikim brojem različitih analoga u istoj vakcini.

Epitop relaksirane specifičnosti može prema ovom izumu biti prirodni etpitop za T-stanice kao što su epitopi iz toksoida tetanusa (npr. P2 i P30 epitopi), toksoida difterije, hemaglutinin virusa influence (HA), i antigen P. falciparun CS.

Tijekom godina su identificirani brojni epitopi za T-stanice relaksirane specifičnosti. Posebno peptidi sposobni da se vežu na veliki dio HLA-DR molekula kodiranih različitim HLA-DR alelima su identificirani i svi oni su potencijalni epitopi za T-stanice koji se mogu uvesti u analoge koji će se koristiti u ovom izumu. Vidi također su epitopi diskutirani u sljedećim referencijama koji su svi ovdje ugrađeni citatom jesu: WO 98/23635 (Frazer IH et al., iz University od Queensland); Southwood S et al. 1998, J. Immunol. IM: 3363-3373; Sinigaglia F et al. 1988, Nature 336: 778-780; Chicz RM et al. 1993, J. Exp. Med. 178: 27-47; Hammer J et al. 1993, Cell 74: 197-203; te Falk K et al. 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Zadnja referencija se također odnosi na HLA-DQ i -DP ligande. Svi prikazani epitopi za korištenjem u ovom izumu su epitopi koji dijele zajednički motiv s ovima.

Alternativno epitop može biti sintetski epitop za T-stanice koji se može vezati na veliki dio MHC klase II molekula. U tom kontekstu pan DR epitop peptida ("PARADE") opisan u WO 95/07707 i u odgovarajućem radu Alexander J et ai. 1994, Innunity 1: 751-671 (oba ovdje ugrađena citatom) su prema ovom izumu iteresantni kandidati za korištenje kao epitope. Valja napomenuti da najučinkovitiji PADRE peptidi opisani u ovim radovima nose D-aminokiseline na C- i N-terminalnom kraju., a da se poboljša stabilnost pri davanju. Međutim, ideja ovog izuma je prvenstveno u ugrađivanju važnih epitopa kao dijela modificiranog analoga koji treba zatim biti enzimatski pocijepan unutar lizosomalnog dijela APC, a da se dozvoli ispoljavanje u sadržaju MHC-II molekule, pa stoga nije pogodno da se ugradi D-aminokiselina u epitope korištenih u ovom izumu.

Jedan posebno preferirani PADRE peptid ima aminokiselinsku sekvenciju AKFVAAWTLKAA ili imunološki učinak kao njegovu posljedicu. Ti i ostali epitopi koji nemaju ograničenje MHC su preferirani epitopi za T-stanice koje treba biti prisutni u analozima korištenim u ovoj metodi. Takvi epitopi vrlo relaksirane specifičnosti će činiti najjednostavniju cjelinu izuma u kojem je samo jedan analog prisutan u vakciniranom životinjskom imunom sustavu.

Priroda gore diskutirane varijacije/modifikacije preferirano sadrži:

- da je uključen barem jedan prvi segment u prvi i/ili drugi analog (analoge), a rečeni prvi segment djeluje usmjeravanjem analoga na stanicu koja ispoljava antigen (APC), i/ili

- da je uključen barem jedan drugi segment u prvi i/ili drugi analog (analoge), a rečeni drugi segment djeluje stimulirajuće na imuni sustav, i/ili

- da je uključen barem jedan treći segment u prvi i/ili drugi analog (analoge), a rečeni treći segment djeluje optimizira ispoljevanje analoga na imuni sustav.

Funkcionalne karakteristike koje se odnose na prvi, drugi i treći segment će biti diskutirani u sljedećem:

Oni mogu biti ispoljeni u obliku bočnih skupina povezanih kovalentno ili nekovalentno na pogodnu kemijsku skupinu aminokiseline polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom ili na njegovu subsekvenciju. To znači da je lanac aminokiselina izveden iz polipeptidnog antigena preveden u derivate bez mijenjanja primarne aminokiselinske sekvencije, ili barem bez uvođenja promjena u peptidne veze između pojedinih aminokiselina u lancu.

Segment također može biti u obliku fuzijskih partnera aminokiselinske sekvencije izvedene iz polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom. S tim u vezi valja napomenuti da obje mogućnosti uključuju mogućnost konjugacije aminokiselinske sekvencije na nosač, vidi diskusiju toga dolje. Drugim riječima, u ovom kontekstu termin "fuzijski protein nije samo ograničen fuzioniranim konstruktom pripravljenim metodom ekspresije DNA fragmenta koji kodira strukturu, nego također konjugat između dvaju proteina koji su spojeni peptidnom vezom u sljedećoj kemijskoj reakciji.

Kao što je gore spomenuto, analog može također uključivati uvođenje prvog segmenta koji usmjeravaju analog u APC ili B-limfocit. Primjerice, prvi segment može biti specifično vezujući partner za specifični površinski antigen B-limfocita ili specifični površinski antigen APC. Poznati su mnogi takvi specifični površinski antigeni. Poznati su mnogi specifični površinski antigeni u struci. Primjerice, segment može biti ugljikohidrat za koji postoji receptor na B-limfocitu ili APC (npr. manan ili manoza). Alternativno, drugi segment može biti hapten. Također kao fragment antitijela koji specifično prepoznaju površinu molekule APC ili limfocitima se mogu koristiti kao prvi segment (površinska molekule može npr. biti FCγ receptor makrofaga ili monocita, kao što je FCγRI ili alternativno bilo koji druga specifična oznaka površine kao što je CD40 ili CTLA-4). Valja napomenuti da se svi ti primjeri usmjeravanja molekule mogu koristiti kao dio adjuvansa, vidi dolje. CD40 liand, antitijela na CD40 ili njihove varijante koji vezuju CD40 će usmjeriti analog na dendritične stanice. U isto vrijeme nedavni rezultati su pokazali da interakcija između CD40 molekula pokazuje TH stanice koje nisu esencijalne za dobivanje Odgovor CTLa. Zato je razmatrano da će opća upotreba CD40 vezujućih molekula kao prvo segmenta (ili adjuvansa, vidi dolje) znatno povećati Odgovor CTL; zapravo, korištenje takvih CD40 vezujućih molekula kao adjuvansa i "prvog segmenta" u značenju ovo izuma se vjeruje da je inventivan sam po sebi.

Kao alternativa ili suplement usmjeravanja analoga u neke tipove stanica da bi se postigao povećani imuni odgovor, moguće je povećanje razine odgovora imunog sustava uključivanjem gore spomenutog segmenta koji stimulira imuni sustav. Tipični primjeri takvih drugih segmenata su citokini i proteini podvrgnuti toplinskom šoku ili molekulski šaperoni kao i njihovi učinkoviti dijelovi.

Pogodni citokini koji se mogu koristiti u ovom izumu su oni koji će normalno djelovati kao adjuvansi u pripravku vakcine tj. primjerice interferon γ (IFN-γ), Flt3 liand (Flt3L), interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15), te stimulirajući faktor kolonije granulacitnog makrofaga (GM-CSF); alternativno funkcionalni dio molekule citokinona može biti pogodan kao drugi segment. S obzirom na upotrebu takvih citokina kao tvari koje su adjuvansi, vidi donju diskusiju.

Alternativno drugi segment može biti toksin kao što je listeiolicin (LLO), lipid A i termolabilan enterotoksin. Također su interesantne mogućnosti brojni mikrobakterijski derivati kao što je MDP (muramil dipeptid), CFA (kompletni Freudov adjuvans) i dister tetraloze TDM i TDE.

Prema izumu, pogodni proteini podvrgnuti topinskom šoku koji se koriste za drugi segment mogu biti HSP70, HSP90, HSC70, GPR94 i kalretikulin (CRT).

Također je važna cjelina uvođenje trećeg segmenta koji ubrzava ispoljavanje analoga na imuni sustav. U struci je poznato nekoliko primjera tog principa. Primjerice, poznato je da se sidren je lipidacije pamitoila u Borrelia burgrdorferi proteinu OspA može koristiti tako da se dobije polipeptidi koji je autoadjuvans (vidi npr. WO 96/40718). Izgleda da lipidirani proteini tvore strukture poput micela čija srž sadrži dijelove za sidrenje lipidacije polipeptida i ostali dijelovi molekule koje se pružaju od njih, rezultirajući višestrukom prezentacijom antigenske determinante. Zato, korištenje ovog i sličnih pristupa koristeći različita sidrišta lipidacije (npr. miristilna skupina farnezilna skupina, geranil-geraniolska skupina, GPI sidro i N-aciln digliceridna skupina) su preferirane cjeline iz izuma, posebice jer je ograničenje takve lipidacije u rekombinatno nastalom proteinu jednostavno i samo zahtjeva korištenje npr. prirodnih signalnih sekvencija kao partnere za anaog. Daljnja mogućnost je korištenje C3d fragmenta komplementarnog faktora C3 ili samo C3 (vidi Dempsey et al. 1996, Science 271, 348-350 i Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).

Važno je zabilježiti da kada je pokušana upotreba metode iz izuma na npr. polipeptidni antigen vezan na membranu koji je eksprimiran u vanstaničnom dijelu, najpreferiranije je da je prvi i/ili drugi analog (analozi) ima gotovo kompletnu tercijarnu strukturu polipeptidnog antigena vezanog na stanicu. U ovoj specifikaciji i zahtjevima namjera je da to označuje ukupnu tercijarnu strukturu dijela polipeptidnog antigena koji je izložen van stanice i sačuvan, jer kao što je gore spomenuto, tercijarna struktura obavezuje intracelularne polipeptide da ne obuhvate humoralni imuni sustav. Zapravo, kao dio strategije vakcinacije je često poželjno da se izbjegava izlaganje ekstraceularnom dijelu prihvaćenog epitopa za B-stanice izvedene od intraceularnog dijela polipeptidnih antigena; na taj način potencijalni nepovoljni efekti uzrokovani međureaktivnosti s ostalim antigenima će biti svedeni na minimum.

Za svrhe ovo izuma udovoljeno je, međutim, ako je varijacija/modifikacija (koja može biti insercija, adicija, delecija ili supstitucija) povećava strani epitop T-stanice i u isto vrijeme zadržava znatni broj epitopa CTL i polipeptidnom antigenu (i ponekas također znatan broj epitopa B-stanice).

Sljedeća formula opisuje građevne jedinice općenito pokrivene izumom:

(MOD1)s1 (PAGe1)n1 (MOD2)s2 (PAGe2n2....(MODx)sx (γAGex) (I)

- u kojoj PAGe1-PAGex jesu x epitopi za CTL i/ili B-stanice u koji sadrže podsekvencije relevantnog polipeptidnog antigena koje su neovisno identične ili nisu identične koje mogu sadržavati ili ne sadržavati druge bočne skupine, x je cijeli broj ≥3, n1-nx jesu x cijeli brojevi ≥0 (najmanje jedna je ≥1), MOD1-MODx su x modifikacija uvedenih između sačuvanih epitopa, te s1-sx jesu x cijeli brojevi ≥0 (najmanje jedna je ≥1 ako nije uvedena ni jedna bočna skupina u sekvencijama). Stoga prema općem funkcionalnom ograničenju na imunogenost građevnih dijelova, izum dozvoljava za sve vrste permutacija originalne sekvencije antigena i sve veste modifikacija u njoj. Stoga, u izum su uključeni analozi dobiveni ispuštanjem dijelova polipeptidnog antigena koji npr. pokazuje štetan učinak in vivo ili ispuštanjem dijelova koji su normalno unutar stanice i stoga povećavaju neželjene imunološke reakcije, vidi detaljnu diskusiju dolje.

Daljnje proširenje gornjeg principa uključuje korištenje epitopa za CTL i/ili B-stanice iz više od jednog antigena povezanog s pataloškim stanjem. Primjerice, postoji nekoliko antigena povezanih s karcinomom koji su pod utjecajem njihovog onkogenog efekta samo kada su u mutiranom obliku -primjeri su mutirani K-ras i P53 koji su oba suštinski proteini u normalnoj regulaciji staničnog ciklusa i oba su produkti ekspresije u većini normalnih stanica. U nekim slučajevima, CTL prepoznaje mutirane peptide od njihovog antigena, Zato je važno da imuni sustav odgovori samo na mutirane peptide a ne na nemutirane dijelove, a kao je imunoterpaija specifičnim antigenom započeta.

Mi smo razvili strategiju u kojoj skevencije od 8-25 aminokiselina takvih proteina povezanih s bolesti mogu biti korišteni kao daljnji epitopi u AutoVac strukturi - u preferiranoj cjelini, uvedeni epitopi bi u isto vrijeme osiguravali aktivnost epitopa za TH u finalnoj strukturi, vidi gornju diskusiju. Epitopi korišteni u tu svrhu će biti oni koji sadrže mutiranu regiju proteina povezanog s bolesti. Korištenjem takvog pristupa, bilo bi moguće generirati CTL (i antitijela gdje je moguće) samo na mutirani oblik antigena povezanog s bolesti. U slučajevima kada je antigen povezan s bolesti dovodi do aktivnosti epitopaza TH, korištenje stvarnih stranih epitopa za Tu se može u potpunosti izbjeći. Cjelina tog principa može, npr. biti vakcinacija s vakcinom nukleinske kiseline koja kodira analog polieptidnog antigena (npr. Her2 ili PSM) pri čemu je uveden najmanje jedan epitop za Tu i najmanje jedna peptid izveden iz drugog antigena povezanog s bolesti (npr. peptid iz mutiranog dijela onkogenog proteina). U preferiranoj cjelini je uveden najmanje jedan epitop za TH kao posljedica uvođenja peptida.

Nadalje je preferirano da je varijacija i/ili modifikacija uključuje duplikaciju kada je primjenljivo, najmanje jednog epitopa za B-stanice, ili najmanje jednog epitopa za CTL polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom. Ta strategija će dati rezultat koji multiplicira kopije preferiranih epitopnih područja je prikazana imunom sustavu i stoga maksimizira vjerojatnost učinkovitog imunog odgovora. Zato ova cjelina izuma koristi višestruko ispoljavanje epitopa izvedenih od polipeptidnog antigena (tj. formula I u kojoj je najmanje epitop za B-stanice prisutan u dvama položajima).

Taj efekt se može postići na različite načine, npr. jednostavnim pripravljanjem fuzioniranih polipeptida koji sadrže strukturu (PAG)m pri čemu je m cijeli broj veći od ≥2 a zatim uvođenje ovdje diskutirane modifikacije u najmanje jednoj polipeptidnoj sekvenciji antigena.

Alternativna cjelina izuma koja također rezultira preferiranim ispoljavanjem višestrukih (najmanje 2) kopija važnih regija eitopa antigena na imuni sustav u kovalentno povezanom antigenu, podsekvenciji ili njihovoj varijaciji nekih molekula. Primjerice, mogu se koristiti polimeri, npr. ugljikohidrati kao što je dekstran, vidi npr. Lees A et al., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A et al., 1990, J. Immunol. 145: 3594-3600, ali također i manoza i mana su korisni alternativi. Integralna membrana proteina iz npr. E. coli i ostalih bakterija su također korisni konjugacijski partneri. Tradicionalni nosač molekula kao što je hemocianin (KLH), toksoid tetanusa, toksoid difterije i goveđi serum albumin (BSA) su također preferirani i korisni partneri za konjugaciju.

Održavanje velikog dijela epitopa B-stanice, ili čak cijele tercijarne strukture proteina koji je podvrgnut modifikaciji kao što je opisano ovdje, može se postići na nekoliko načina. Jedan način je jednostavna priprava poliklonalnog antiseruma na polipeptidni antigen (npr. antiserum pripravljen u zecu) i zatim korištenje tog antiseruma kao reagensa (npr. u kompetitivnom ELISA) na modificirane proteine koji se proizvode. Modificirane verzije (analozi) koji reagiraju do iste mjere s antiserumom kao što čini polipeptidni antigen mora se smatrati da ima istu ukupnu tercijarnu strukturi kao polipeptidni antien, pri čemu analozi pokazuju ograničenu (ali još uvijek značajnu i specifičnu) reaktivnost s takvim antiserumom koji se smatra da ima održanu značajnu frakciju originalnih epitopa B-stanice.

Alternativno, odabir monoklonalnih antitijela koji su reaktivni s određenim epitopima polipeptidnog antigena mogu pripraviti i koristiti za testiranje. Ovaj pristup je povoljan jer dozvoljava: 1) mapiranje epitopa polipeptidnog antigena i 2) mapiranje epitopa koji se održava u pripravljenim analozima.

Naravno, treći pristup bi bio da se riješi trodimenzijska struktura polipeptidnog antigena ili biološki aktivnog fragmenta (vidi gore) i usporedba toga s riješenom trodimenzijskom strukturom pripravljenih analoga. Trodimenzijska struktura se može riješiti difrakcijom X-zraka i NMR spektroskopijom. Daljnje informacije koje se odnose na tercijarnu strukturu se do neke mjere mogu dobiti cirkularnim dikroizmom kojima je prednost da samo zahtijevaju polipeptid u čistom obliku (dok difrakcija X-zraka zahtjeva kristalizirani polipeptid a NMR zahtjeva izotopno obilježene polipeptide), a da se dobiju korisne informacije o tercijarnoj strukturi molekule. Međutim, na kraju su difrakcija X-zraka i/ili NMR neophodni da se dobiju konkluzivni podaci jer cirkularni dikroizam može samo dati indirektni dokaz o ispravnoj trodimenzijskoj strukturi, a informacijom o sekundarnoj strukturi elemenata.

U suštini postoje tri načina da se dobije ispoljavanje relevantnih epitopa na imuno sustav: tradicionalna vakcijnacija podjedinice s polipeptidnim antigenima, davanje genetski modificirane žive vakcine, i vakcinacija nukleinskom kiselinom. Te tri mogućnosti će biti diskutirane odvojeno u sljedećem:

Vakcinacija polipeptidnom

To sadrži davanje životinji imunološki učinkovite količine barem prvog analoga, te kad je važno, davanjem imunološki učinkovite količine barem drugog analoga. Preferirano, barem jedna prvi i/ili drugi analo(analozi) je formuliran skupa s farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačem i/ili vehikulom, a može i adjuvansom.

Utjecanje na ispoljavanje analoga na životinjski imuni sustav davanjem životinjama, formulaciju polipeptida je u skladu s općim znanjem struke.

Priprava vakcina koje sadrže peptidne sekvencije kao aktivne komponente je općenito dobro poznata, kao što je prikazano u U.S. Patentima 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; te 4,578,770, svi ovdje ugrađeni citatom. Tipično se takve vakcine pripravljaju kao tekuće otopine ili suspenzije koje se mogu injektirati; kruti oblici pogodni za otopine ili suspenzije, te tekućina koja se također može pripraviti prije injektiranja. Pripravak također može biti emulgiran. Aktivni imunogenčni sastojak se često miješa s ekcipijentom koji je farmaceutski prihvatljiv i kompatibilan s aktivnim sastojkom. Pogodni ekscipijensi su primjerice voda, fiziološka otopina, dektroza, glicerol, etanol ili slično te njihova kombinacija. Nadalje, po želji vakcina može sadržavati malu količinu dodatnih tvari kao što su klizna sredstva ili emugatori, sredstva za puferiranje pH, adjuvansi koji povećavaju učinkovitost vakcine; niže vidi detaljnu diskusiju o adjuvansima.

Vakcine se uobičajeno daju parenteralnom injekcijom, primjerice subkutalno, intrakutalno, intradermalno, subdermalno ili intramuskularno. Nadalje, formulacije koje su pogodne za ostale načine davanja uključuju supozitorije, te u nekim slučajevima oralne, bukalne, sublingvalne, intraperitonalne, intravaginalne, analne, epiduralne, spinalne i intrakrainalne formulacije. Za supozitorije tradicionalna veziva i nosači mogu uključivati primjerice polialkalen, glikole ili trigliceride; takvi supozitoriji mogu se tvoriti od smjese koja sadrži aktivni sastojak i rasponu od 0.5% do 10%, preferirano 1-2%. Oralne formulacije uključuju normalno korištene ekcipijente kao što je primjerice manitol farmaceutskog stupnja čistoće, laktoza, škrob, magnezijev strearat, natrijev saharin, celuloza, magnezijev karbonat i slično. Ti pripravci mogu tvoriti otopine, suspenzije, tablete, pilule, kapsule, formulacije s odgođenim djelovanjem ili praške koji sadrže 10-95% aktivnog sastojka, preferirano 25-70%. Za oralne formulacije je toksin kolere interesantni formulacijski partner (a također i konjugacijski partner).

Polipeptidi se mogu formulirati u vakcine u neutralnom obliku ili obliku soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju soli nastale adicijom (nastale sa slobodnom aminoskupinom peptida) anorganskih kiselina kao što je primjerice klorovodična kiselina ili fosforna kiselina, ili s takvih organskih kiselina kao što je octena, oksalna, vinska, bademova i slične. Soli nastale sa slobodnim karboksilnom skupinama mogu također biti izvedene iz anorganskih baza kao što je primjerice natrij, kalij, amonij, kalcij ili željezo hidroksid, te iz takvih organskih baza kao što je izopropilamin, trimetilamin, 2-etilaminoetanol, histidin, prokain i slično.

Vakcine se daju na način koji je kompatibilan s formulacijom doze, i u takvoj količini koja će biti terapijski učinkovita i imunogena. Količina za davanje ovisi o osobi koja je pod tretmanom, uključujući npr. kapacitet imunog sustava pojedinca da podigne imuni odgovor i željenog stupanj zaštite. Pogodni rasponi doze kreću se do razlike nekoliko stotina mikrorama aktivnog sastojka po vakcini s preferiranim rasponom od oko 0.1 μg do 2000 μg (čak su razmatrane i veće količine u rasponu od 1-10 mg) kao što je raspon od oko 0.5 µg do 1000 μg, preferirano u rasponu od 1 μg do 500 μg, a posebno preferirano u rasponu od oko 10 μg do 100 μg. Pogodan režim za početak davanja i ponovljena imunizacija su također primjenljivi ali su tipizirani početnim davanjem koje slijedi inokulaciju ili druga davanja.

Način primjene može široko varirati. Primjenljiva je bilo koja konvencionalna metoda davanja vakcine. To uključuje oralnu primjenu na krutoj fiziološki prihvatljivoj osnovi ili fiziološki prihvatljivu disperziju, parenteralno davanje injekcijom ili slično. Doza vakcine će ovisiti o načinu davanja i prilagoditi će se starosti osobe koja će biti vakcinirani i vrsti formulacije antigena.

Neki polipeptidi iz vakcine su dovoljno imunogeni u vakcini, ali će za neke druge imune odgovore biti bolje ako vakcina daljnje sadrži adjuvanse. Posebno je preferirano da se koristi adjuvans koji može olakšavati razbijanje autotolerancije na autoantiena.

Poznate su različite metode postizanja učinka adjuvansa za vakcine. Opći principi i metode su opisane detaljno u "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (izd.), John Wiley & Sins Ltd, ISBN 0-471-95170-6, i također u "Vaccines: New Generation Immunologica Adjuvants", 1995, Greoriadis . et al. (izd.) Plenum Press, New York, ISBN 0-306-4583-9, a oba su ovdje ugrađeni citatom.

Preferirani adjuvansi olakšavaju prihvat molekula vakcine pomoću APC, kao što su dendritične stanice i aktiviraju ih. Neograničavajući primjeri pogodnih adjuvansa su odabrani iz skupine koja se sastoji od imunousmjeravajućih adjuvansa, imunomoduirajućih adjuvansa kao što je toksin, citokin i mikobakterijski derivati, formulacije ulja, polimera, adjuvansa koji tvore micele, saponina, matrice, imunostimulirajuće kompleksa (ISCOM matrica) čestica, DDa, aluminijskog adjuvansa, DNA adjuvansa, γ-inulina i adjuvansa koji se može kapsulirati. Općenito, bit će naznačeno da se gornji prikaz odnosi na sredstva korisna kao prvi, drugi i treći segment u analozima se također odnose mutatis mutandis na njihovo korištenje kao adjuvansa vakcine iz izuma.

Primjena adjuvansa uključuje upotrebu sredstva kao što je aluminijev hidroksid ili fosfat (alum), koji se obično koristi kao 0.05 do 01 postotna otopina u puferiranoj fiziološkoj otopini u smjesi sa sintetskim šećernim polimerima (npr. Carbopo®) korišten kao 0.25 postotna otopina, agregacija proteina u vakcini djelovanjem toplinom u rasponu temperature između 70°C do 101°C u periodu od 30 sekundi do 2 minute, a također je moguće postići agregaciju pomoću sredstva za umrežavanje. Mogu se također koristiti agregacija reaktiviranjem s antitijelima koji su tretirani pepsinom (Fab fragmenti) u albumin, smjesa bakterijskih stanica kao što je C. pravum ili endotoksini ili lipopolisaharidne komponente ili gram-negativnih bakterija, emulzija u fiziološki prihvatljivom uljnom vehikulu kao što je manidni monooleat (Aracel A) ili emulzija s 20 postotnom otopinom perfluorugljika (Fluosol-DA) korištena kao blok supstitut. Također je preferirano je miješanje s uljem kao što je skvalen i IFA.

Prema izumu DDA (dimetildioktadecilamonijev bromid) je interesantan kandidat da adjuvans kao i DNA i γ-inulin, ali također su Freudov kompletan i nekompletan adjuvans kao i quillaja saponons kao što su i QuilA i QS21 interesantni kao RIBI. Daljnje mogućnosti su monofosforilni lipidi A (MPL), te gore spomenuti C3, C3d.

Formulacije liposoma također prenose učinak adjuvansa, pa su stoga liposomski adjuvansi preferirana u ovom izumu.

Također je adjuvans tipa imunostimulirajuće matrice (ISCOM® matrica) preferiran izbor prema izumu, posebice jer je pokazano da takav tip adjuvansa može povećati ekspresiju MHC klase II pomoću APC. ISCOM® matrica se sastoji od (može biti frakcionirana) saponina (tritepenoidi) iz Quillaja saponaria, kolesterola i fosfolipida. Kada se miješa s imunogenim proteinom, nastale formulacija je ono što je poznato kao ISKOM šestica u kojoj saponin čini 60-70% w/w, kolesterol i fosfolipid 10-15% w/w, a protein 1-15% w/w. Detalji koji se odnose na sastav i korištenje imunostimulirajućih kompleksa mogu npr. biti nađeni u gore spomenutim udžbenicima koji prikazuju adjuvanse, ali također u i Morein B et al. 1995 Clin, Immunother. 3: 461-475 kao i Barr IG i Mitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (oba ovdje ugrađena citatom) prikazuju korisne upute za pripravu kompletnih imunostimulrajućih kompleksa.

Još jedna interesantne (pa stoga preferirana) mogućnost postizanja učinka adjuvansa je uporaba tehnike opisane od Gosselin et al., 1992 (koji je ovdje ugrađen citatom). Ukratko, ispoljavanje relevantnih antigena kao što je antigen u ovom izumu se može povećati konjugiranjem antigena s antitijelima (ili fragmentima antitijela koja vežu antigen) na Fcy receptore na monocitima/makro-fagima. Posebno su konjugati između antigena i anti-FcγRI pokazali da povećavaju imunogeničnost za svrhe vakciniranja.

Ostale mogućnosti korištenja usmjeravajućih i imunomodulirajućih tvari (i.a. citokini) koji su gore spomenuti kao kandidati za prvi i drugi segment u modificiranoj verziji analoga. S tim u vezi mogući su i citokini koji sintetski induciraju citokine kao što je poli I:C.

Pogodni bakterijski derivati su odabrani od skupine koja se sastoji od muramilnog dipeptida, kompleta Freudovog adjuvansa, RIBI i diestera trehaloze kao što je TDM i TDE.

Pogodni imunousmjeravajući adjuvansi su odabrani od skupine koja se sastoji od CD40 liganda i CD40 antitijela ili njihovih specifično vezanih fragmenata (vidi gornju diskusiju), manoze, Fab fragmenta i CTLA-4.

Pogodni polimerni adjuvansi su odabrani od skupine koja se sastoji od ugljikohidrata kao što je dekstran, PEG, škrob, manan i manoza; plastičnih polimera kao što je lateks u obliku lateksnih zrna.

Sljedeći interesantan macin moduliranja imunog odgovora je uključivanje imunogena (može zajedno s adjuvansom i farmaceutski prihvatljivim nosačima i vehikulima) u "virtualni limfni čvor" (VLN) (odgovarajuća medicinska naprava razvijena je od ImmunoTherapy, Inc. 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). VLN (tanka tubularna naprava) imitira strukturu i funkciju limfnog čvora. Umetanje VLN ispod kože stvara mjesto sterilne upale s porastom citokina i kemokina. T- i B- stanice kao i APC brzo odgovaraju na signal opasnosti koji je na mjestu upale i akumuliraju se unutar porozne matrice VLN. Pokazano je da je neophodna doza antigena potrebna za postizanje imunog odgovora na antigen smanjena kada se koristi VLN i da imuna zaštita pri vakcinaciji koja koristi VLN prelazi konvencionalnu imunizaciju koristeći Ribi kao adjuvans. Tehnologija je i.3. opisana ukratko u Gelber C et al. 1998 "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts od Inmmunegens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node" u "From the Laboratory to the Clinic, Book od Abstracts, October 12th - 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California".

Nedavna otkrića pokazuju da istovremeno davanje H2 agonista povećava preživljavanje u tumoru stanica prirodnih ubojica i CTL. Zato je također razmatrano da se uključe H2 agonisti kao adjuvani u metode iz ovog izuma.

Očekuje se da bi trebalo dati vakcinu najmanje jedanput godišnje, kao što je najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili 12 puta godišnje. Specifičnije očekuje se 1-12 puta godišnje kao što je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 puta godišnje osobi koja za tim ima potrebu. Prethodno je pokazano da pamćenje inducirane imunosti korištenjem preferiranih autovakcina prema izumu nije stalno, pa zato imuni sustav ima potrebu za periodičnim izazovom s analozima.

Zbog genetskih varijacija, različiti pojedinci mogu reagirati na isti polipeptid s imunim odgovorom različite jakosti. Zato vakcina prema ovom izumu može sadržavati nekoliko različitih polipeptida da bi se povećao imuni odgovor, vidi također gornju diskusiju koja se tiče izbora uvođenja stranog epitopa T-stanice. Vakcine mogu sadržavati dva ili više polipeptida, pri čemu su svi polipeptidi kao što su gore definirani.

Vakcine mogu sadržavati 3-20 različitih modificiranih ili nemodificiranih polipeptida, kao što je 3-10 različitih polipeptida. Međutim, bit će traženo da se normalan broj peptida drži na minimumu kao što je l ili 2 peptida.

Žive vakcine

Druga alternativa za učinkovitu ispoljavanje modificiranog na imuni sustav je korištenje tehnologije žive vakcine. Živom vakcinacijom djelovanje na imuni sustav je izvedeno davanjem životinji nepatogenih mikroorganizama koji su transformirani fragmentom nukleinske kiseline koja kodira neophodne epitopne regije ili kompletno prvo i/ili drugo analoga. Alternativno, mikroorganizam je transformiran vektorom koji sadrži takav fragment nukleinske kiseline. Pogodan nepatogeni mikroorganizam može biti bilo koja pogodna oslabljena bakterijska vrsta (oslabljena pasažom ili uklanjanjem patogenog produkta ekspresije tehnologijom rekombinantne DNA) npr. Nycobacteriujn bovis BCG., nepatogen .Stjreptococcus spp., F. coli, Samonella spp., Vibrio Cholerae, Shigea itd. Pregledni radovi koji obrađuju pripravu živih vakcina prema dosadašnjim spoznajama mogu biti nađeni u Saliou P, 11995 Rev. Prat. 45: 1492-1496 i Waker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990, ova ovdje ugrađena citatom. Za detalje o fragmentima nukleinskih kiselina i ovdje korištenih vektora u takvim živim vakcinama vidi donju diskusiju.

Kao za polipeptidnu vakcinu, epitop TH i/ili prvi i/ili drugi i/ili treći segment može, ako je prisutan biti u obliku fuzijskih partnera na aminokiselinsku sekvenciju izvedenu od polieptidno antigena povezano sa stanicom.

Kako alternativa živim bakterijskim vakcinama, fragmenti nukleinske kiseline mogu biti ugrađeni u neživu vakcinu s virusnim vektorom. Jedna mogućnost je pox viru kao što je vaccinia, MVA (modificiran Vaccinia virus), pasji pox, avipox, pileći pox itd. Alternativno se može koristiti virus herpes simplex.

Normalno se nepatogeni mikroorganizam ili virus daje samo jedanput životinji, ali u nekim slučajevima može biti neophodno da se mikroorganizam da više od jedno puta u životu.

Mikroorganizam se također može transformirati nukleinskom kiselinom (kiselinama) koja sadrži regiju koja kodira prvi, drugi i/ili treći segment, npr. u obliku imunomodulirajućih tvari koje su opisane gore, kao što je citokin koji je diskutiran kao koristan adjuvans. Preferirana verziji ove cjeline obuhvaća postojanje regije kodiranja za nalog i regiju kodiranja za imunomodulator u različitim otvorenim čitajućim okvirima ili barem da su kontrolirani različitim promotorima. Tako je izbjegnuto da se analog epitopa stvara kao partner za fuziju imunomodulatora. Alternativno se mogu koristiti dva različita nukleotidna fragmenta kao sredstva za transformiranja.

Vakcinacija nukleinskom kiselinom

Kao alternativa klasičnom davanju vakcine zasnovane na peptidu, tehnologija vakcinacije nukleinskom kiselinom (također poznata kao "imunizacija nukleinskom kiselinom", "genetska imunizacija" i "imunizacija genom") nudi brojne atraktivne karakteristike.

Prvo, nasuprot tradicionalnom pristupu vakcini, vakcinacija nukleinskom kiselinom ne zahtjeva produkciju konzumiranog resursa u velikim količinama imunogeničnog sredstva (npr. fermentacije mikroorganizama koji produciraju analog neophodan u polipeptidnoj vakcinaciji). Nadalje, nema potrebe za napravom za pročišćavanje i restrukturiranje shemi imunogena. Konačno, kako se vakcinacija nukleinske kiseline oslanja na biokemiju vakciniranog pojedinca, a da se producira produkt ekspresije uvedene nukleinske kiseline, očekuje se da dođe do optimuma post-translacijskog procesiranja produkta ekspresije; to je posebice važno u slučaju autovakcinacije jer, kao što je gore spomenuto, značajni dio originalnih epitopa B-stanice se mogu sačuvati u analozima izvedenim iz ekstracelularno izloženih polipeptidnih sekvencija, te jer se epitopi za B-stanice u načelu mogu sastojati od dijelova bilo koje (bio)molekule (npr. ugljikohidrat, lipid, protein itd.). Zato, prirodni način glikozilacije i lipidacije imunogena može biti vrlo značajan dio ukupne imunogenosti, a to se najbolje osigurava domaćinom koji proizvodi imunogen.

Zato važna cjelina metode iz izuma obuhvaća da se na ispoljavanje utječe in vivo uvođenjem u APC najmanje jednog fragmenta nukleinske kiseline koja kodira u eksprimira barem jedna epitop za CTL i/ili barem jedna epitop za B-stanice, te barem jedan prvi strani epitop za TH (alternativno sadrži davanje barem 2 različita fragmenta nukleinske kiseline, pri čemu jedna kodira barem jedan epitop za CTL i druga kodira barem jedan strani epitop za TH). Preferirano, to se izvodi korištenjem fragmenta nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira gore diskutirani prvi analog. Ako je prvi analog snabdjeven gore razmotrenim epitopima za TH i/ili prvim i/ili drugim i/ili trećim segmentom, tada su predstavljeni u obliku fuzijskih partnera aminokiselinskoj sekvenciji izvedenim od polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, a fuzijska struktura je kodirana fragmentom nukleinske kiseline.

Kao u tradicionalnom pristupu, vakcinacija nukleinskom kiselinom se može kombinirati in vivo uvođenjem u APC najmanje jednog fragmenta nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira drugi analog. Razmatranja koja se tiču prvog, drugog i trećeg segmenta epitopa za TH se također mogu ovdje primijeniti.

U ovoj cjelini, uvedena nukleinska kiselina je preferirano DNA koja može biti u obliku same DNA, DNA formulirane s nabijenim ili nenabijenim lipidima, DNA formulirane u liposomima, DNA uključene u virusni vektor, DNA formulirane s proteinom ili polipeptidom koji olakšava transfekciju, DNA formuliran s usmjeravajućim proteinom ili polipeptidom, DNA formuliran s sredstvima za taloženje kalcija, DNA vezan na internu molekulu koja je nosač, DNA kapsulirane u hitin ili hitosan, te DNA formulirane s adjuvansom. U ovom kontekstu primijećeno je da se gotovo sve tradicionalne formulacije vakcine koriste za formulaciju DNA vakcine. Zato sve prikazano ovdje koje se odnosi na korištenje adjuvansa u kontekstu vakcina baziranih na polipeptidima se primjenjuju mutatis mutandis na njihovu upotrebu u tehnologiji vakcijancije nukleinskom kiselinom. Vrijedi isto za druga razmatranja koja se odnose na formulacije, načine i puteve davanja pa se zato također ta razmatranja, gore diskutirana u vezi s tradicionalnom vakcinom, primjenjuju mutatis mutandis u tehnologiji vakcijacije nukleinskom kiselinom.

Jedan posebno preferirani tip formulacije vakcine nukleinske kiseline su mikročestice koje sadrže DNA. Pogodne mikročestice su npr. opisane u WO 98/3198.

Nadalje, nukleinska kiselina (kiseline) koja je korištena kao sredstvo imunizacije može sadržavati regije koje kodiraju prvi, drugi i/ili treći segment, npr. u obliku imunomodulirajućih tvari opisanih gore, kao što su citokini prikazani kao korisni adjuvansi. Preferirana verzija tih cjelina obuhvaća postojanje regije kodiranja za analoge i regiju kodiranja za imunomodulator u različitim čitajućim okvirima ili najmanje pod kontrolom različitih promotora. Zato je izbjegnuto da analog ili epitop nastane kao fuzijski partner imunomodulatoru. Alternativno se mogu koristiti dva različita nukleotidna fragmenta, ali je to manje preferirano jer je prednost osigurati istovremenu ekspresiju kad postoje obje kodirajuće regije uključene u istu molekulu.

Pod normalnim okolnostima, neukleinska kiselina iz vakcine je uvedena u obliku vektora pri čemu je ekspresija pod kontrolom virusnog promotora. Za detaljnu diskusiju vektora prema ovom izumu, vidi donju diskusiju. Također postoji detaljni prikaz koji se odnosi na formulacije i korištenje nukleinske kiseline za vakcine, vidi Donnelly JJ et al. 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 i Donnelly JJ et al. 1997, Life Sciences 60: 163-172. Oba su ovdje ugrađena citatom.

Važni dio izuma odnosi se na nove metode odabira pogodnog imunogenog analoga polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom koji je slabo imunogen ili nije imunogen u životinji, a rečeni imunogeni analog je sposoban inducirati odgovor CTL u životinji na stanice koji imaju MHC klasu II molekule vezane na epitop izveden od polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom. Ta metoda sadrži sljedeće korake:

a) identifikacija najmanje jedne podsekvencije amino-kiselinske sekvencije polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, pri čemu rečena podsekvencija ne sadrži poznati ili predviđeni epitop za CTL,

b) priprava najmanje jednog prihvaćenog imunogenog analoga polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom uvođenjem u aminokiselinsku sekvenciju polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom najmanje jednog epitopa za TH stranog životinji u položaj unutar najmanje jedne podsekvencije identificirane u koraku a), te

c) odabir tog (tih) analoga pripravljenog u koraku b) za koji se može dokazati da je sposoban inducirati odgovor CTL u životinji.

Alternativno, odabir gornje metode obuhvaća pripravu fragmenta nukleinske kiseline za svrhe vakcinacije. U toj situaciji zahtjeva se da je kodirani peptid uključen barem u epitop za TH.

Kada je analog izveden iz antigena koji je izložen ekstracelularnoj fazi, preferirano je da podsekvencija pokazana u koraku a) dalje ne sadrži ostatke cisteina ili, altrernatvno, da epitop za TH uveden u koraku b) nije značajno promijenio obrazac cisteinskih ostataka. Pristup omogućava sačuvanje oblika u prostoru epitopa za B-stanice u nastaloj strukturi koja je slična epitopima za B-stanice u slabom polipeptidnom antigenu povezanog sa stanicom.

Zbog istih razloga je preferirano da podsekvencija identificirana u koraku a) nadalje ne sadrži poznata ili previđena mjesta glikolizacije ili alternativno, kad je epitop za TH uveden u koraku b) nije značajno promijenio obrazac glikolizacije.

Neki slabi polipeptidni antigeni povezani sa stanicom pokazuju neželjene efekte koji imaju patofiziološku ulogu. Poželjno je da se ti efekti ne pojavljuju kod struktura za vakcinaciju, pa je stoga preferirano da ta podsekvencija pokazana u koraku a) pridonosi značajno patofiziološkom efektu koji potječe od polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, i da uvođenje u koraku b) stranog epitopa za TH smanjuje ili uklanja rečeni patofiziološki efekt. Primjer ovog pristupa je uklanjanje aktivnog mjesta enzima, hormona ili citokina i zamjena tih sa stranim epitopima TH.

Drugo važno razmatranje odnosi se na pitanje imunološke međureaktivnosti polipeptidnog produkta vakcine s drugim vlastitim proteinima koji se ne odnose na patologiju. Takve međureaktivnost treba preferirano biti izbjegnuta, pa je stoga važna cjelina ove metode iz izuma u kojoj je podsekvencija pokazana u koraku a) homolog aminokiselinske sekvencije različitog proteinskog antigena u životinji, a gdje je uvođenje epitopa za TH u koraku b) značajno izmijenilo homologiju.

Na ovo se odnosi cjelina u kojoj aminokiselinska sekvencija koja 1) je normalno izložena ekstracelularnoj fazi i 2) koja može činiti epitope za B-stanice u slabom polipeptidnom antigenu povezanog sa stanicom, nije sačuvana u analogu. To se može postići promjenom takve aminokiselinske sekvencije s epitopima za TH koji je čine epitope za T-stanice, a njihovim kompletnim ili djelomičnim uklanjanjem.

S druge strane, preferirano je da bilo koji "stvarni" epitopi B-stanice slabog polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom su sačuvani u visokom stupnju, i stoga važna cjelina odabrane metode iz izuma obuhvaća uvođenje u koraku b) stranog epitopa za TH nastalog u sačuvanju značajnog dijela epitopa za B-stanice polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom. Posebno je preferirano da analog sačuva ukupnu tercijarnu strukturu u polipeptidnom antigenu povezanog sa stanicom.

Priprava u koraku b) je preferirano završena metodom molekularne biologije ili metodom sinteze peptida u krutoj ili tekućoj fazi. Kraći peptidi se preferirano pripravljaju dobro poznatim tehnikama polipeptidne sinteze u čvrstoj ili tekućoj fazi. Međutim, nedavni razvitak u toj tehnologiji je omogućio pripravu polipeptida pune duljine i proteina tom metodom, pa je stoga također unutar obujma ovog izuma priprava dugih struktura sintezom.

Nakon prikazivanja korištenih analoga prema gore diskutiranoj metodi, neophodno je priprava analoga na većoj skali. Polipeptidi se pripravljaju prema metodama poznatim u struci.

To se može izvesti metodama molekulske biologije u kojoj je prvi korak priprava transformiranje stanica, uvođenjem u vektor sekvencije nukleinske kiseline koja kodira analog koji je odabran prema metodi transformiranja vektorom pogodne stanice domaćina. Sljedeći korak je kultiviranje transformirane stanice u uvjetima koji olakšavaju ekspresiju fragmenta nukleinske kiseline koja kodira analog antigena povezanog sa stanicom, a zatim izolaciju analoga iz kulture supernetanta ili izravno iz stanice, npr. u obliku lizata. Alternativno se analog može pripraviti na velikoj skali peptidnom sintezom na čvrstoj ili tekućoj fazi, vidi gore.

Konačno, produkt može, ovisno o odabranoj stanici domaćina ili korištenoj sintetskoj metodi biti podvrgnut umjetnoj post-tanslacijskoj modifikaciji. To može biti shema resturkutiranja poznata u struci, tretman s enzimima (da se dobije glikolizacija ili uklanjanje nepoželjnih partnera fuzije), te konjugacija, npr. s tradicionalnim molekulama nosačima.

Valja napomenuti da preferirane molekule iz izuma (i također važni analozi korišteni u metodi iz izuma) sadrže modifikacije koje kao rezultat u polipeptidu imaju sekvencijsku identičnost najmanje 70% s polipeptidnim antigenom ili njegovom podsekvencijom od najmanje 10 aminokiselina. Preferirane su veće identične sekvencije, npr. najmanje 75% ili najmanje 80% ili 85%. Identičnost sekvencija proteina i nukleinskih kiselina se može računati kao

(Nref-Nraz) • 100/Nref,

pri čemu je Nraz ukupni broj neidentičnih ostataka u dvjema uspoređenim sekvencijama, a Nref je broj aminokiselinskih ostataka u jednoj od sekvencija. Tako će DNA sekvencija AGTCAGTC imati identičnost od 75% sekvenciji AATCAATC (Nraz=2 i Nref=8).

Specifični ciljevi za metodu iz izuma koji su primjeri

Kao što je gore diskutirano, preferirani slabi polipeptidni antigeni povezan sa stanicom su antigeni povezani s tumorom. Neograničavajuća lista tih je dana u sljedećoj tablici

[image] [image] [image] [image] [image] [image] [image] [image] [image] [image]

U sljedećem će biti detaljno diskutirani brojni specifični antigeni povezani s tumorom.

Antigen iz membrane specifičan na prostatu, PMS

U USA karcinom prostate je drugi po redu uzrok smrti od karcinoma (ca. 40000 godišnje), s tim da je 200000 pacijenata godišnje dijagnosticirano (Boring 1993). Približno kod 1 od 11 muškaraca će se razviti karcinom prostate. Nadalje, približno kod 40-60% pacijenata s karcinomom prostate se razvije ekstraprostatsko proširenje bolesti (Babaian 1994). Glavna strategija u ovom izumu je upotreba vakcine u terapiji kao suplementarna terapija prostatektomiji, a da bi se eliminiralo zaostalo tumorsko tkivo i metastaze.

Nekoliko patoloških stanja povezano je sa žlijezdom prostate, uključujući benigni rast (BPH), infekciju (prostatitis) i neoplaziju (karcinom prostate). Biološka agresivnost karcinoma prostate je različita. Kod nekih pacijenata detektirani tumor ostaje latentan histološki tumor i nikada ne postane klinički značajan. Kod drugih pacijenata, tumor se razvija brzo, metastazira i ubija pacijenta u relativno kratkom vremenskom periodu (2-5 godina).

Sadašnji primarni tretman karcinoma prostate je prostatektomija. Međutim, zbog brzog širenja stanica karcinoma prostate, glavnina karcinoma prostate u pacijentima nije izliječena lokalnom operacijom. Pacijenti s nepotrvđenom bolesti konačno prime sustavnu androgenu ablacijsku terapiju, ali godišnja smrtnost uzrokovana karcinomom prostate nije opala u periodu od 50 godina, a od kada je androgena ablacija postala standardna terapija za metastatičnu bolest.

PSM je membranski protein koji je visoko specifičan za tkiva prostate, benignog kao i malignog, mada je ekspresija PSM također primijećena u ostalim tkivima kao što je bubrežno tkivo i bubrežni tumor, tkivima malog probanog trakta, mozga i tumorske neurovaskulature. Stoga bi se pacijentima s karcinomom kojima je izvedena prostatektomija, ako je operacija bila uspješna, teorijski PSM eksprimira na zaostalom malignom tkivu tumora prostate ili na tumorima koji potječu od metastataza. Indukcijom jakog odgovora CTL i/ili jakog odgovora poliklonalnog antitijela prema PSM, očekuje se da se zaostalo tumorsko tkivo može eliminirati.

Interesantno je da je zamijećeno povećanje ekspresije PSM nakon terapije uklanjanja androgena u pacijentima s karcinomom prostate (Wright 1996). To će učiniti na PSM usmjereni tretman vrlo pogodnim, a nakon tradicionalne terapije uklanjanja androgena.

PSM je prvo identificiran 1987. kao rezultat stvaranja monoklonalnog antitijela, 7E11-C5.3, uzgojen i izoliran protiv humane stanice prostate, LNCaP (Horoszewicz 1987). Antitijelo prepoznaje normalni i maligni epitel i korišten je 1993. za pročišćavanje i određivanje aminokiselinske sekvencije PSM proteina i konačno klonirati gen (Isaeli 1993).

PSM je tip II transmembranskog glikoproteina molekularne mase od 84 kD kao što je i predviđeno iz sekvencije nukleinske kiseline, pri čemu je kod glikoizirane verzije opažena molekulska masa od 100-120 kD. Sekvenciranje gena koji kodira PSM je pokazalo da je prihvaćena u regiju prolaska kroz membranu spojena s tri citosolna arginiska sidra. Vanstanični dio PSM sastoji se od 707 od ukupno 750 aminokiselina, pri čemu je predviđena duljina citoplazmatska domena 19 aminokiselina (Israeli 1993). PSM-specifična mRNA je detektirana u tkivu tumora prostate (Israeli 1994), pokazujući da tumorski antigen nije aberantno glikolizirani protein kao što je slučaj s npr. Tn- ili sTn-tumorskim antigenima.

PSM cDNA pune duljine je transficiran i eksprimiran u PSM negativu stanične linije humanog karcinoma prostate, PC-3 (Kahn 1994). Nadalje, puna dujina (2.65 kilobaze) cDNA je transkribirana i translatirana in vivo (Kahn 1994).

Nedavno je pokazano da PSM ima hidrolitičku aktivnost koja sliči na N-aciliranu oc-povezanu kiselu dipeptidazu (NAALADaza) - u stvari je pokazano da su dva proteina identična. NAALADaza je hidrolaza nervnog sustava vezana na membranu, koja katabolizira neuropeptid N-acetilaspartil glutamat (NAAG) da bi se djelovalo na glutamatergični proces prijenosa signala. Još uvijek nije poznato je li aktivnost PSM ima važnu biološku funkciju.

Važno je predvidjeti da li se očekuje da dođe do nepoželjne međureaktivnosti CTL s ostalim proteinima ili antitijelima koji su pristupačni za CTL, a nakon tretmana s autovakcinom induciraneg PSM specifičnog imunog odgovora. Pokazano je da dio kodirajuće regije PSM gena (aminokiselinski položaji 418-567) imaju 54% homologije s humanim transferinskim receptorom (Isreaei 1993). Također je nađena kompletna sekvencija identičnosti s enzimom NAALADasom, vidi gore. Nije identificirana funkcionalna važna sličnosti s ostalim poznatim peptidazama.

Homologija transferinskog receptora je vrlo mala i preferirano će biti razbijena u nekom inventivnim konstruktima. Za primijećenu identičnost sekvencije s humanom NAALADazom nije očekivano da je prepreka PSM vakcini, dijelom zbog male mogućnosti antitijela i CTL da prođu kroz krvno-moždanu barijeru. Zato ne očekuje čak ni većinom najsličnijih struktura PSM dođe do zabranjene među-reaktivnost s ostalim prroteinima u pacijentima.

Iz ranijih istraživanja je jasno da je PSM eksprimiran na većinu stanica karcinoma prostate i onih porijeklom od metastaze prostate. Nadalje, većina ostalih testiranih karcinoma, kao što su karcinomi, sarkom i melanomi različitih tkiva kao i velika skupina humanih staničnih linija koje nisu iz prostate su pokazali negativan test na PSM.

Uz ovo, za veliki broj ostalih tkiva je nađeno da pokazuju negativni test na PSM. To uključuje crijevo, dojku, pluća, ovarij, jetru, mokraćni mjehur, uterus, bronhij, slezenu, pankreas, jezik, ezofag, stomak, tiroideju, paratiroideju, adrenal, limfni čvor, aotrtu, vena cava, kožu, mliječnu žlijezdu, i placentu. Međutim, RT-PCR je pokazao postojanje PSM mRNA u nekom od ovih tkiva.

Mada je PSM predominantno nađen kao molekula vezana na membranu tkiva prostate, PSM se u malim količinama također može naći u serumima normalnih pojedinaca i pri povišenoj razini u pacijentima s karcinomom prostate (Rochon 1994, Murphy 1995). Razina cirkulirajućeh PSM u tim pacijentima stoga dozvoljava serološko promatranje učinkovitosti PSM vakcine.

U zaključku, zasnovano na ukupnoj količini podataka koji su do danas na raspolaganju, PSM je antigen s visokom specifičnosti na tkivo humane prostate i na tumore koji od njega potječu. To znači da je kod pacijenata koji su podvrgnuti prostatektomiji, PSM tumorski kvazi-specifičan antigen. Učinkovita PSM vakcina stoga treba biti usmjerena uglavnom na tkivo prostate ili na metastazirano tkivo porijeklom iz prostate.

Bit će jasno iz Primjera l da metoda iz izuma preferirano ima za posljedicu da je strani epitop za TH stanicu uveden u

dio aminokiselinske sekvencije PSM definirane SEQ ID NO: 2 položaji 16-52 i/ili 87-108 i/ili210-230 i/ili 269-289 i/ili 298-324 i/ili 442-465 i/ili 488-514 i/ili 598-630 i/ili 643-662 i/ili 672-699. Nadalje, modificirana PSM molekula koja ima strani TH epitop uveden u te položaje je također dio

izuma.

Prema ovom, izum se također odnosi na analog humanog PSM koji je imunogen u ljudima, a rečeni analog sadrži znatan dio svih poznatih predviđenih CTL i epitopa za B-stanice od PSM i sadrži barem jedan strani epitop za TH uveden insercijom u aminokiselinsku sekvenciju PSM ili supstitucijom dijela aminokiselinske sekvencije PSM ili kao rezultat delecije dijela aminokiselinske sekvencije PSM, a najpreferiraniji analozi su oni u kojima je strani epitop za TH stanice uveden u dio aminokiselinske sekvencije PSM definirane SEQ ID NO: 2 položaji 16-52 i/ili 87-108 i/ili210-230 i/ili 269-289 i/ili 298-324 i/ili 442-465 i/ili 488-514 i/ili 598-630 i/ili 643-662 i/ili 672-699.

Humani korionski gonadotropin (HCG)

Odnos između embrionskih markera i malignih fenotipa je predmet rasprave već desetljećima. Povećani broj podataka upućuje da je najmanje jedan od takvih markera, humani korionski gonadotropin beta (hCGp), konzistentno detektiran u stanicama karcinoma različitog histološko porijekla, te da ekspresija tog proteina često korelira s povećanim metastatskim svojstvima. Humoralni imuni odgovor upućen na taj topljivi protein može reducirati mogućnosti širenja tumora i/ili može inhibirati ponovo pojavljivanje novog primarnog rasta nakon operacije.

Humani korionski gonadotropin pripada obitelji glikoproteinskih hormona, uključujući hormon koji stimulira folikul (FSH), hormon koji stimulira tiroideju (TSH), te luteinizirajući hormon (LH), a koji su svi važni regulatori reproduktivne ekspresije i preživljavanje fetusa. Članovi ove obitelji hormona su heterodimeri koji dijeli zajednički α-lanac. β-Lanac je svojstven svakom hormonu i osigurava specifičnost, s β-lancem LH ima najveći stupanj homologije prema hCGβ (približno 80%). Molekulska masa hCG-holo je 37 kD, od koje jedna trećina potječe od ugljikohidrata. Post-translacijska modifikacija šećera uključuje N- i na O-vezane ugljikohidrate. Velika količina ostataka sialne kiseline prisutna je i daje proteinu negativni naboj. Kristalna struktura hCG-holo je razriješena (Lapthorn et al. 1994).

Na osnovi kristalne strukture je nađeno da hCG pokazuje homologiju s obitelji faktora rasta, uključujući PDFG i TGFß (Lapthorn et al., 1994). To pokazuje da ekspresija hCG može pomoći u regulaciji rasta stanice karcinoma. Humani korionski gonadotropin je glikoproteinski hormon nastao iz placentalnih sincitiotrofobasta odmah nakon začeća i neophodan je za uspješno nošenje trudnoće trudne žene.

Patofiziološka uloga embrionskih markera za razvitak i održavanje mase karcinoma je poznata. Međutim, od interesa je primijetiti da trofoblasti (u kojima se ti proteini normalno produciraju) imaju angiogensku i invazivnu karakteristiku, a ta svojstva su neophodna u stanici karcinoma. Nadalje, predloženo je da hCG (ili njegove podjedinice) može inhibirati stanični imuni odgovor na fetalne stanice. Primjerice, gornja istraživanja su pokazala da hCG izravno sprječava odgovore T-stanica (Jacoby et al., 1984) i predloženi razlog za to što limfni čvorovi slabe (u tom slučaju) primarni melanomski tumor, pa su imunosuprimirani, što je pogodnija okolina za tumore u metastazi. Kao posljedica, ekspresija hCß može pomoći širenju stanica tumora u sekundarne limfoidne organe. Konačno, kao što je gore spomenuto, nađena je strukturna homolija između hCG i brojnih faktora rasta. Sljedeća mogućnost je stoga da izučivanje hCG od stanica karcinoma može pogodovati rastu tumora.

Pokazana je ekspresija hCGβ u razliθitim tipovima karcinoma, primjerice: a) adenokarcinom prostate: pozitivnost za hCGβ na izlučivanje tikva je viđena u pacijentima s lošom prognozom, neovisno o histološkom stupnju tumora (Sheaff et al., 1996); različite vrste karcinoma pluća; skvamozne stanice (SQCC), adenokarcinoma (AC), te velike stanice (LLC), svi pokazuju veliki postotak reaktivnosti s hCHβ (Boucher wt al. 1995), c) adenokarcinom pankreasa (Sytios et al. 1998), d) neuroblastome, karcinom mozga, retinoblastomi (Acevedo et al., 1997), e) maligni melanom (Doi et al. 1996), f) karcinomi bubrega (Lazar et al.,1995). nedavni rad opisuje DNA pristup u kojem su miševi imunizirani s hCß ekspresijskim konstruktom (Geissler et al., 1997). U tom in vivo modelu imhibicija rasta tumora je snažno povezana s CTL aktivnosti, međutim veliki titar antitijela (koje neutralizira biološki efekt nedirnutih hCG na tom staničnom receptoru) su također nađeni.

Upotreba hCG kao imunogena je opisana u nekoliko radova, koji su fokusirani na njegovu upotrebu kao kontraceptivna vakcina (Talwer et al., 1976 i Talwar et al., 1994). Vrlo veliki stupanj efikasnosti i sigurnosti je primijećen u kliničkom istraživanju neplodnosti, korištenjem vakcine protiv hCG-holo (Talwar et al. 1994). Također je provedena faza I kliničkih istraživanja pacijenata s karcinomom, a vakcinom protiv sintetskog peptida s karboksilnom terminlanom skupinom konjigiranog na toksoid difterije (Triozzi et al., 1994), a faza II je u toku. Usprkos činjenici da je ideja upotrebe hCGß s ciljem priprave vakcina karcinoma već neko vrijeme prisutna, nije korištena AutoVac tehnologija.

Poznato je da stanice od tkiva koje nije embrionalni ili su benigne neoplazme, ne eksprimiraju hCGβ. Stoga ne treba postojati potencijalni nusefekt od vakcinacije protiv tih molekula (osim djelovanja na trudnoζu). Zato što je eksprimirana od tako različitih vrsta karcinoma, ta molekula je predložena da je "definitivan biostvaratelj karcinoma" (Acevedo et al. 1995 i Reelson W., 1995) i to bio atraktivna cilj.

Pogodni životinjski modeli za daljnja istraživanja učinkovitosti hCG zasnovani na vakcini su nađeni u Acevedo et al., Cancer Det. and Prev. Suppl, (1987) 1: 477-486 i u Kellen et al., Cancer Immunol. Immun. Ther. (1982) 13: 2-4.

Her2

Za receptore tirozin kinaze Her2 i EGFr se vjeruje da imaju odlučujuću ulogu u malignim transformacijama normalnih stanica i u rastu stanica karicnoma. Prekomjerna ekspreasija je obično povezana s vrlo lošom prognozom. Tijekom prošlih nekoliko godina bilo je mnogo podataka koja se tiču upotrebe antitijela na te receptore za terapiju karcinoma koji prekomjerno eksprimiraju jedan ili više receptora. Generech Inc. je završio nekoliko uspješnih kliničkih istraživanja na pacijentima s karcinomom dojke korištenjem monoklonlnih antitijela Her2 i nedavno je dobiveno odobrenje od FDA za stavljanje ne tržište anti-Her2 preparata monoklonalnih antitijela, Herceptin®.

Ako se ovdje prikazana tehnologija autovakcine primjeni na Her2 molekulu, uglavnom će izazvati reakciju poliklonalnih antitijela s Her2. Od takvih antitijela se očekuje da napadnu i eliminiraju tumorske stanice kao i da spriječe razvitak metastatskih stanica u metastaze. Efektorski mehanizam tih antitumorskih efekata će biti posredovan preko komplementarne stanične citotoksičnosti koja je ovisna o antitijelu.

Ovisno o izboru konstrukta, inducirana autoantitijela mogu također inihibirati rast karcinoma inhibicijom faktora rasta ovisnim o oligo-dimerizaciji i intrernalizaciji receptora. Još važnije, za Her2 analoge se očekuje da mogu inducirati odgovore CTL usmjerene na poznate i/ili predviđene epitope za Her2 prikazane iskazane tumorskim stanicama.

Her2 je član obiteji receptora epidermalnog faktora rasta (c-erbB) koji se sastoji od četiri različita receptora koji su: c-erbB-1 (EGFr), c-erbB-2(/hwe2, c-Neu), c-erbB-3 i c-erbB-4 (Salomon et al., 1995). c-erbB-3 i c-erbB-4 su slabije karakterizirani nego EGFr i Her2. Her2 je integralni dio gikoproteina. Zreli protein ima molekulsku masu od 185 kD sa strukturnim karakteristikama koji sliče na receptror EGFr (Prient et al., 1992). EGFr je također integralni membranski receptor koji se sastoji od jedne podjedinice. On ima molekulsku masu od 170 kD i sastoji se od površinske domene na koju se vezuje ligand koja ima 621 aminokiselina i jedne hidrofobne transmebranske domene od 23 aminokiselina, te od visoko sačuvane citoplazmatske domene za tirozin kinazu od 541 aminokiselina. Protein je N-glikoliziran (Prient et al. 1994).

Svi proteini u ovoj obitelji su tirozin kinaze. Interakcija između liganada vodi dimerizaciji receptora, što povećava katalitičko djelovanje tiozin kinaze (Bernard, 1995, Chantry 1995). Proteini unutar obitelji su sposobni homo- i heterodimeriziranju što je važno za njihovu aktivnost. EGFr vodi efekte pokretanja porasta i stimulira prihvat glukoze i aminokiselina od stanice (Prient et al. 1992). Her2 također vodi pokretanje signala rasta. Samo se EGFr vezuje na EGF i TGF-α. Ti ligandi se ne vezuju na ostale receptore obitelji (Prigent et al., 1992). Ligandi Her2 nisu potpuno određeni. Međutim, pokazano je da hereguin inducira fosforilaciju aktiviranjem Her2. Izgleda da to nije posljedica direktnog vezanja na receptor, nego se vjeruje da je heregulin ligand za erbB-3 i erbB-4, koji zatim aktivira Her2 oligodimerizacijom (Solomon et al., 1995).

Homoloija između proteina obitelji EFG receptora je najizraženija u domeni tirozin kinaze na citoplazmatskom dijelu molekula (82% između EGFr i Her2). Homologija je manja u vanstaničnom dijelu - od 41% do 46% u različitim domenama (Prigent et al. 1992).

Receptor epidermanlnog faktora rasta je eksprimiran na normalnim stanicama u malim količinama, ali je prekomjerno eksprimiran mnogim tipovima karcinoma. EGFr je prekomjerno eksprimiran u stanicama karcinomima dojke (Earp et al. 1993, Eppenberer 1994), glikomima (Schegel et al., 1994), karcinoma želuca (Fujii 1995), karcinoma jajnika (van Dam et al., 1994) i ostalima. Her2 je također ekprimiran u nekom normalnim ljudskim tkivima u maloj količini, najkarakterističnije na sekrecijskom epitelu. Prekomjerna ekspresija Her2 događa se u oko 30% karcinoma dojke, želuca, pankreasa, mjehura i jajnika.

Ekspresija ovih receptora se mijenja ovisno o stupnju diferencijacije tumora i tipu karcinoma, npr. u karcinomu dojke primarni tumori prekomjerno eksprimiraju oba receptora; dok se u karcinomu želuca prekomjerna ekspresija događa u kasnijem stupnju u tumoru u metastazi (Salomon et al., 1995). Broj prekomjerno eksprimiranih receptora na stanicama karcinoma je veća od 106/stanici za nekoliko karcinoma glave i vrata, karcinomskih linija vulve, dojke i ovarija izoliranih iz pacijenata (Dean et al. 1994).

Postoji nekoliko razloga zašto EGFr obitelj receptora čini pogodne ciljeve za tumorsku imunoterapiju. Prvo, ovi su prekomjerno ekprimirani u mnogim tipovima karcinoma, koji trebaju biti usmjereni na imuni odgovor prema tumoru. Drugo, tumori često eksprimiraju ili prekomjerno eksprimiraju ligande za tu obitelj receptora i neki su hipersenzitivni na proliferacijski efekt podredovan ligandima. Treće, pacijenti s tumorima koji prekomjerno eksprimiraju receptore faktora rasta često imaju lošu prognozu. Prekomjerna ekspresija je povezana s lošom prognozom posebice kod karcinoma dojke, karcinoma pluća i karcinoma mjehura (2) i povezana je s invazivnim/metastatskim fenotipom, koji je dosta neosjetljiv na uobičajene terapije (Eccles et al., 1994).

Prekomjerna ekspresija Her2 u nekim slučajevima rezultira pojačavanjem gena, a u drugim slučajevima povećanom transkripcijom i translacijom. Prekomjerna ekpresija Her2 je povezana s lošom prognozom u karcinomima dojke, ovarija, karcinomu želuca, karcinomu mjehura i moguće karcinomu nemalih stanica pluća (Solomon et al., 1995).

Provedena je faza I kliničkih istraživanja s bispecifičnim antitijelima kod pacijenata s uznapredavalim karcinomom dojke i ovarija. Antitijelo je bilo bispecifično na Her2 i FcRI (Weiner et al., 1995). Učinkovita razgradnja Her2 prekomjerno eksprimiranih tumorskih stanica je primijećena sa bispecifičnim antitijelim na Her2 i CD3 (Yhu et al. 1995).

Tretman "scid" miševa, ksenofragiranih s humanim karcinomom želuca, s anti-Her2 monoklonalnim antitijeima produžilo je preživljavanje miševa (Ohniski et al. 1995). Antitumorske aktivnosti monoklonalnih antitijela na Her2, in vivo i in vitro ne potječe od identičnih mehanizama; oni mogu djelovati kao parcijalni agonisti liganda, mijenjaju Her2 razgradnju/sintezu receptora i fosforilaciju ili mogu djelovati na dimerizaciju (Lupu et al. 1995).

Slično, pokazano je da antitijela EGFr mogu također interferirati s međudjelovanjem faktora rasta (Baselga et al., 1994, Modjahedi et al., 1993a, Wu et al., 1995, Modjahedi et al., 1993b, Tosi et al., 1995, Dean et al., 1994, Bier et al., 1995, Modjahedi et al., 1996, Valone 1995).

Zato je važna cjelina metoda iz izuma u kojoj je epitop za T-stanicu uveden u dio aminokiselinske skevencije od Her definirane aminokiselinskom numeracijom u SEQ ID NO: 3 položaja 5-25 i/ili 59-73 i/ili 103-117 i/ili 149-163 i/ili 210-224 i/ili 250-264 i/ili 325-339 i/ili 369-383 i/ili 465-479 i/ili 579-593 i/ili 632-652 i/ili 653-667 i/ili 661-675 i/ili 695-709 i/ili 710-730, vidi Primjere.

Prema tome, izum se također odnosi na analoge humanog Her2 koji je imunogen u ljudima, a rečeni analog sadrži značajan dio svi poznatih i predviđenih epitopa za CTL i B-stanice od Her2 i uključujući barem jedna strani epitop za TH kao što je ovdje diskutirano. Preferirano je da najmanje jedna prisutan strani epitop za TH uveden insercijom u amino-kiselinsku sekvenciju Her2 ili supstitucijom dijela aminokiselinske sekvencije Her2 ili kao rezultat delecije dijela aminokiselinske sekvencije Her2. Najpreferiraniji analozi su oni gore definirani, tj. oni u kojima je strani epitop za T-stanicu uveden u dio aminokiselinske sekvencije Her2 definirane SEQ ID NO: 3 položaja 5-25 i/ili 59-73 i/ili 103-117 i/ili 149-163 i/ili 210-224 i/ili 250-264 i/ili 325-339 i/ili 369-383 i/ili 465-479 i/ili 579-593 i/ili 632-652 i/ili 653-667 i/ili 661-675 i/ili 695-709 i/ili 710-730.

FGF8b

Nekoliko istraživača je pokazalo da FGF8b može inducirati proliferaciju, transformaciju, diferencijaciju i u nekim slučajevima značajno povećati tumorogenost stanica i tkiva sisavaca (Tanaka 1992, Kouhara 1994, Lorenzi 1995, MacArtur 1995a, Crossley 1996a, 1996b, Gosh 1996, Ohuchi 1997a, Rudra-Ganguly 1998). Ti efekti su primarno posredovani vezanjem FGF8b na članove receptora faktora rasta fibroblasta FGFR2, FGFR3, te FGFR4 (MacArtur 1995b, Blunt 1997, Tanaka 1998). Stoga je za stanice koje eksprimiraju jedan od ovih receptora i FGF8(b) pokazano da dovode do autokrinog prijenosa signala rasta koji vodi proliferaciji.

Biološki efekt FGF8b je najvjerojatnije posredovan preko JAK-STAT3 puta, jer smo mi i ostali primijetili da adicijom FGF8 u medij za rast, neke stanice pokreću fosforilaciju STAT3, karakteristika za koju se smatra da ukazuje na rezistenciju stanice na apotozu (Catlett-Falcone 1999).

Uz gore spomenuto in vitro opažanje, nedavno je pokazano da je FGF8(b) ekpresija značajno povećava u karcinomima prostate i dojke (Marsh 199, Dorkin 1999). Mi stoga vjerujema da autovakcina na FGF8(b) može biti vrlo učinkovit način tretmana brojnih tumora koji ekprimiraju FGF8, ili možda povećava njihovu osjetljivost prema sredstvima koji iduciraju apoptozu.

Karcinom prostate

Biološka agresivnost karcinoma prostate je različita. Kod nekih pacijenata detektirani tumor ostaje latentan histološki tumor i nikada ne postane klinički značajan. Kod drugih pacijenata, tumor se razvija brzo, metastazira i ubija pacijenta u relativno kratkom vremenskom periodu (2-5 godina).

Za svrhe dijagnoze, te za praćenje odgovora na terapiju karcinoma prostate, primarno je korišteno određivanje razine dvaju cirkulirajućih proteina: fosfataza prostatične kiseline (PAP) i specifični antigen prostate (PSA) (Ngguyen 1990, Hentt 1989). Zbog razbijanja normalne arhitekture žlijezde prostate zbog razvitka karcinoma, ti topljivi proteini se oslobađaju u krvotok u kojem se mogu detektirati kao markeri, npr. širenja metastaze.

Sadašnji primarni tretman karcinoma prostate je prostatektomija. Međutim, zbog brzog širenja stanica karcinoma prostate, glavnina karcinoma prostate u pacijentima nije izliječena lokalnom operacijom. Pacijenti s neograničenom bolesti konačno prime sustavnu androgenu ablacijsku terapiju, ali godišnja smrtnost uzrokovana karcinomom prostate nije opala u periodu od 50 godina, a od kada je androgena abacija postala standardna terapija za metastatičnu bolest.

RT-PCR analiza je pokazala da je FGF8 mRNA produciran od humanih prostatskih epitelnih staničnih linija LNCaP, PC-3, ALVA-31, te DU145 s EGE8b najistaknutija isoforma (Tanaka 1995, Ghosh 1996). Rast na androgen odgovarajućih LNCaP stanica je stimuliran adicijom rekombinantnog FGF8b (Tanaka 1995), dok DU145 stanice mogu inhibirati rast transfekcijom s virusima eksprimiranih FGF8b obrnute polarnosti (Rudraanuly 1998). Ovo, zajedno s dokazom iz dolje diskutiranih istraživanja razvitka pokazuje ulogu FGF8b u održavanju stanja karcinoma tih staničnih linija.

Korištenjem FGF8 mRNA za in situ hibridizacijski eksperiment, Leung i suradnici su pokazali da je veliki dio (80% (n=106), i 721% (n=31)) karcinoma prostate stvara FGF8 mRNA, te količina FGF8 mRNA korelira s ozbiljnosti tumora (P<0.0016, te P<0.05) (Leung 1996, Dorkin 1999). Korištenjem monoklonalnih antitijela anti-FGF8, ta izoforma se pokazala odgovornom za prekomjernu ekspresiju FGF8 (Dorkin 1999). Nadalje, ljudi s tumorima koji eksprimiraju visoke razine FGF8 su imali slabo preživljavanje (P=0,034), a ta FGF8 ekspresija ostaje u androgenu neovisno o karcinom prostate (Dorkin 1999). Prema podacima prikazanim od Dorkina i suradnika, prema ekspresiji FGF8b u karcinomu prostate se može predvidjeti preživljavanje pacijenta.

Imunohistokemijskom analizom korištenjem monoklonalnog antitijela na FGF8, je nađen protein u 93% (n=43) humanog karcinoma prostate (Tanaka 1989). Normalno tkivo prostate ili beningna hiperplazija prostate producira niske razine FGF8 mRNA, te ne sadrži količinu FGF8 proteina koja se može detektirati (Leung 1996, Yoshimura 1996, Gosh 1996, Tanaka 1998, Dorkin 1999).

Ovi rezultati pokazuju da bi autovakcina na FGF8(b) bila reaktivna s tumorskim tkivom prostate, pa stoga izuzetno vrijedna u tretmanu karcinoma prostate.

Karcinom dojke

Sadašnji tretman karcinoma dojke je operacija. Međutim, zbog izuzetnog širenja stanica karcinoma dojke, veliki dio pacijenata s karcinomom dojke nije liječen lokalnom operacijom. Pacijenti s neograničenom bolesti konačno prime sustavnu androgenu ablacijsku terapiju, kemoterapiju ili radijacijsku terapiju. Smrtnost godišnje od karcinoma dojke je, međutim još uvijek relativno velika.

FGF8 je originalno izoliran iz staničnih linija mišjeg karcinoma mliječne žlijezde (SC-3) u kojima se ekspresijom može inducirati dodatkom androgena u medij (Nonomura 1990). Poznato je da protein također inducira proliferaciju tih kao i ostalih stanica sisavaca. Nedavno je pokazano da je FGF8 mRNA prisutan u osam (n=8) staničnih linija humanog karcinoma dojke (MDA-MB-231, MDA-MB-415, ZR 75-1, T-47-D, SK-BR-III, PMC-42, HBL-100 i MCF-7) (Tanaka 1995, Payson 1996, Wu 1997, Marsh 1998).

Wnt-1 transgenični miš je inficiran virusom tumora mliječne žlijezde (MMTV) koji razvija tumore mliječne žlijezde. RGR8 transkripcija je aktivirana u 50% tih tumora (MacArthur 1995c, Kapoun 1997).

Pokazano je da transgenični miševi koji nose FGF8b cDNA pod kontrolom vrlo specifičnog virusa tumora mišje mliječne žlijezde (MMTV), spontano razvijaju FGF8b eksprimirajući tumor mliječne žlijezde (Coombes, osobno saopćenje).

Vrlo nedavni rezultati pokazuju da je ekspresija FGF8(b) povećana u karcinomu dojke (Tanaka 1998, Marsh 1999). Tanaka i suradnici su koristili novo monoklonalno FGF8 antitijelo u imunohistokemijskim istraživanjima. Pokazali su da je FGF8 prisutan u 67%(n=12) karcinoma dojke, te da su androgeni receptori prisutni u 89% FGF8 pozitivnog tumora dojke (hiperplazija, fibroadenom, intraduktalni papilom i karcinomi) što će dozvoliti napredovanje karcinoma dojke (Tanaka 1998). Korištenjem semikvantititivne RT-PCR metode, pokazano je da je povišena razine FGF8 mRNA nađena u malignim u odnosu na nemaligna tkiva dojke. Znatno više malignih tkiva je eksprimiralo FGF8 (p=0.029) i pri značajno većoj razini (p=0.031 (68 karcinoma dojke i 24 nemalignih tkiva dojke) (Marsh 1999).

Još nije potpuno ustanovljena funkcija FGF8(b) kao autokrinog faktora rasta. Međutim, činjenica da veliki broj tumora pretjerano eksprimira FGF8 potkrepljuje mogućnost da autovakcina može biti učinkovita na veliki postotak karcinoma dojke i prostate. Podaci pokazani od Marsh, Dorkin i Tanaka pokazuju da se autovakcina protiv FGF8(b) može koristiti za tretman karcinoma dojke i prostate, a podaci prikazani od Dorkin et al. donje podupiru mišljenje da je FGF8 obuhvaćen u proliferaciji humanih stanica karcinoma.

Opis FGF8b

FGF8b pripada obitelji fibroblastnog faktora rasta (FGF). ovi proteini koji reguliraju rast su mali proteini s -200 aminokiselinskih ostataka obuhvaćenih u indukciji proliferacije i diferencijacije širokog raspona stanica. Vidi nedavni revijalni članak i obuhvaćenosti fibroblastnih faktora rasta u razvitku udova vertebrata, Johnson 1997. Članovi FGF obitelji su povezani s evolucijom i dijele 20-50% identičnosti aminokiselinske sekvencije.

FGF8b je varijanta FGF8 dobivena izrezivanjem i spajanjem polipeptidnog lanca, koja originalno označuje androgenom induciran faktor rasta (AIGF). AIGF je prvo identificiran kao protein izlučen od stanične linije karcinoma mliječne žlijezde laboratorijskih glodavaca (SC-3) nakon stimulacije androgenom (Nonomura 1990). FGF8 gen laboratorijskog glodavca sadrži 6 eksona koji mogu kodirati osam različitih FGF8 izoforma (FGF8a-h) koji se razlikuju samo u N-terminalnom dijelu molekule (Crossley 1995, MacArtur 1995b). Humani FGF8 ima istu strukturu gena kao gen glodavca. Međutim, zbog "stop" kodona u eksonu 1B, humani FGF8 može pozitivno postojati u četiri različita izoforma FGFSa, FGF8b, FGF8e, te FGF8f (Gemel 1996). Strukture gena i aminokiselinske sekvencije četiriju humanih izoforma su ilustrirani na Slici 5.

Zreli FGF8b sadrži 193 aminokiselinska ostatka i ima izračunatu molekulsku masu od 22.5 kDa. Protein velike bazičnosti sadrži 21 arginskih i 14 lizinskih ostataka pa je izračunata izoelektrična točka 10.84, a izračunat pozitivan naboj je 19.8 kod pH 7.0. Sadrži dva cisteinska ostatka i ima dva potencijalna mjesta N-glikozilazije. Zbog prirode izvedenih istraživanja koja obuhvaćaju FGF8b, vrlo malo je poznato o proteinskom dijelu FGF8b. Međutim, on je eksprimiran heterogeno u bakteriji, pročišćen korištenjem C-terminalnog heksa-histidinske oznake, te in vitro restrukturiran u topljivo i biološki aktivno stanje (Mac Arthur 1995a, Blunt 1997).

Biološka aktivnost FGF8b

Kao što je gore spomenuto, FGF8(b) je prvo izoliran kao faktor koji je oslobađan iz o angorgenu ovisnih tumorskih stanica mišjeg tumora mliječne žlijezde, te je pokazano da taj protein može inducirati proliferaciju tih stanica. Morfološke promjene imitiraju one inducirane testosteronom, za koje je također poznato da induciraju sintezu FGF8(b) mRNA (Tanaka 1992). Proliferacija može biti inhibirana s FGF8(b) oligonukleotidima obrnute polarnosti (Nonomuta 1990, Tanaka 1992, te Yamanishi 1994). Doista, rast stanične linije humanog karcinoma prostate DU145 može biti inhibiran transfekcijom s mliječne žlijezde s virusima eksprimirajućih FGF8b obrnute polarnosti (Rudra-Ganguy 1998). Nedavni podaci pokazuju da FGF8b inducira fosforilaciju STAT3 - proteina za koji se sumnja da je rezistentan na apoptozu (Catlett-Falcone 1999, Johnston, C. L., neobjavljeni rezultati).

Od nekoliko istraživača je pokazano da FGF8b učinkovito inducira transformaciju NIH3T3 ili SC115 stanica (Miyashita 1994, Kouhara 1994, Lorenzo 1995, MacArthur 1995a). Korištenjem rekombinatno eksprimiranih proteina, također je pokazano da je ta indukcija morfoloških promjena znatno učinkovitija s FGF8b neko kad se koristi FGFSa ili FGFSc (MacArthur 1995a, Gosh 1996). Interesantno, za N-terminalnu polovicu FGF8b molekule je pokazano da je dovoljna za transformaciju NIH3T3 stanica, čak i mali FGF8b specifični peptidi (QVTVQSSPNFT) mogu omogućiti rast stanica 2-3 puta dulje nego normalni 0.1% serum (Rudra-Ganguly 1998). Nadalje, pokazano je da su NIH3T3 stanice koje su transficirane s ekspresijskim vektorom koji kodira FGF8b vrlo tumorigenične kada su injektirane intraokularno u bezdako miša (Kouhara 1994, Gosh 1996).

In vivo, FGF8b je poznat da eksprimira neke stupnjeve razvitak vertebara. Sažeta biološke uloge FGF8(b) prikazana je u Tablici 1. Za revijalni članak o obuhvaćenosti FGF8 u razvitku vertebrata vidi Goldfarb 1999, te Johnson 1997.

Tablica: Različita mjesta/tkiva poznata da produciraju FGF8, te preložena biološka uloga (uloge).

[image]

Vjeruje se da FGF(b) posreduje svoje djelovanje putem vezivanja na receptore fibroblastnog faktora rasta (FGFR). Specifično, poznato je da se FGF8b može aktivirati s FGFR2c, FGFR3c, FGFR4c, i do neke mjere s FGFR1c, ali ne s FGFR1b, -2b ili 3b (MacArthur 1995b, Blunt 1997). U slučaju indukcije rasta ektopičnih udova pileta FGF19, FGFR2 i FGF8 stupaju u interakciju što je dovoljno da rast (Kuwana 1997, Xu 1998). Ovi rezultati podupiru hipotezu da FGF8(b) može djelovati na autokrini i parakrini način, vodeći normalnom rastu i uzrokovanju nekoliko anatomskih struktura tijekom razvitka vertebara. Važno je da miševi potpuno osiromašeni FGF8 "totalno knock out" nisu preživjeli najvjerojatnije zbog složene obuhvaćenosti proteina u razvitku embrija.

Homologija s ostalim proteinima

Od velikog je značaja predvidjeti dolazi li do neželjene međusobne reaktivnost s ostalim proteinima koji su pristupačni antitijelima, a nakon tretmana s anutovakcinom koja uključuje FGF8b specifična antitijela. Zbog visokog stupnja identičnosti sekvencije između FGF8b i ostalih FGF8 molekula, za autovakcinu se očekuje da međusobno reagira s tim proteinima. Pretpostavlja se da će to, međutim, imati prednost jer ni za jedan od tih proteina nije pokazano da ekprimiraju tkiva ili stanične linije koje već ne eksprimiraju FGF8b.

Aminoliselinski ostaci od 55 do 175 u FGF8b pokazuju relativno mali ali značajan stupanj sekvencijske identičnosti s ostalim FGF. Opće je prihvaćeno (i nekoliko puta dokazano) da značajan stupanj identičnosti sekvencije između proteinskih domena također reflektira visoki stupanj sličnosti s tercijarnom strukturom. Stoga, je za članove FGF obitelji su općenito prihvaćeno da su strukturno slični. Trodimenzijska struktura FGF2 je razriješena iz kristala kao i otopine (Ago 1991, Zhang 1991, Zhu 1991, Erikson 1993, Blaber 1996, Moy 1996). FGF2 je sav sastavljen od beta-nabrane ploče koja sadrži tri puta ponovljenu četverolančastu antiparalelnu (3- ploču. Ta (3-burasta struktura je kompletno sačuvana između interleukina 1, FGF2 (ili osnovnog FGF), te FGF1 (ili kiselom FGF). Nuklearna magnetska rezonancijska analiza FGF2 u otopini je pokazala da N-terminalni dio molekule stvara relativno fleksibilnu strukturu. Zaostali dio FGF8b (aminoliselinski ostaci 1-54 i 176-215) samo pokazuju niski stupanj identičnosti sekvencije poznatim proteinima.

Na osnovu strukturnih podataka, općenito se pretpostavlja da trodimenzijska struktura ostalih fibroblastni faktora rasta sliči na FGF1 i FGF2 . Ta strukturna razmatranja su važni faktori u našem dizajnu autovaksinskih mutiranih FGF8b molekula.

Zbog relativno niskog stupnja identičnosti sekvencije između FGF8 i bilo kojeg ostalog člana FGF obitelji, važno je da površina FGF8 bude vrlo različita od one ostalih FGF, čime se minimizira međusobna reaktivnost s FGF8b autovakcinom generiranih antitijela s ostalim članovima FGF obitelji. Zbog znatno nižeg stupnja homologije s ostalim proteinima nego fibroblastnim faktorima rasta, ne očekujemo da autovakcina protiv FGF8b reagira s ostalim proteinima.

Valja naglasiti, međutim, da autovakcina protiv FGF8b bi mogla međusobno reagirati sa svim izoformama FGF8. To vjerojatno, međutim, neće biti problem jer se za niti jedan od izoforma ne očekuje da se eksprimiraju pri značajnoj razini kod odraslih. Čak je moguće da ta međusobna reaktivnost bude pogodna u tretmanu karcinoma jer je pokazano da barem neke stanične linije karcinoma eksprimiraju ostali izoforme uz FGF8b.

Distribucija FGF8 u tkivu

Idealno, inducirana antitijela, a zatim efektorski mehanizmi kao i očekivani odgovori CTL koji se povećavaju auto-vakcinacijom bi trebali biti usmjereni samo na tkiva koja trebaju biti eliminirana iz pacijenta. Stoga, raspodjela antigena u tkivu koji je ciljan autovakcinom je vrlo važno pitanje koje se tiče sigurnosti vakcine.

Tablica: Ekspresija FGF8b u različitim tkivima i stanicama

Ljudi

[image] [image]

Gornja tablica pokazuje široki odabir tkiva za distribuciju i podatke ekspresije FGF8b od staničnih linija. Kao što se vidi iz tablice, najveći dio podataka koji se tiču distribucije tkiva je dobiven korištenjem osjetljive RT-PCR metode. To je zato jer Northen analiza ne detektira FGF8b mRNA u bilo kojem normalnom tkivu osim u bubregu fetusa. Zbog tih nedovoljnih podataka, općenito se smatra da je ekspresija FGF8b mRNA kod odraslih vrlo ograničena i stoga autovakcina protiv FGF8b ne bi bila reaktivna s normalnim tkivom. Zbog činjenice da male količine FGF8b mogu stupiti u interakciju u nepoznatim sustavnima u odraslih, za distribuciju proteina je potrebna daljnja analiza. Po našem mišljenu, međutim, ne postoji indikacija da bi autovakcina protiv FGF8b rezultirala ozbiljnim neželjenim efektima kod pacijenata.

Efekt antitijela protiv FGF8b

Do sada se nije objavljen pokušaj tretman karcinoma prostate korištenjem monoklonalnih antitijela. Međutim, sada se odvijaju klinička istraživanja terapije karcinoma dojke s monoklonalnim antitijelima.

Antitijela protiv FGF8b će možda blokirati interakciju između FGF8b i njegovih receptora, što će inhibirati nabiranje stanične membrane i staničnu proliferaciju, što vrlo vjerojatno smanjuje pokretljivost i invazivnost stanica karcinoma.

Zato se izum također odnosi na ovdje opisane metode, pri čemu je strani epitop za T-stanice uveden u dio FGF8b aminokiseliske sekvencije definirane SEQ ID NO: 6 u položaje 1-54 i/ili 187-215 i/ili 55-58 i/ili 63-68 i/ili 72-76 i/ili 85-91 i/ili 95-102 i/ili 106-111 i/ili 115-120 i/ili 128-134 i/ili 138-144 i/ili 149-154 i/ili 158-162 i/ili 173-177. Valja napomenuti da je specijalno preferirano ne uvođenje varijanata ili modifikacija u položaje 26-45 te na C-terminlani kraj počevši od aminokiselina 186-215, jer ti dijelovi imaju najmanje homologije s nedavno otkrivenim proteinom FGF-18, koji izgleda da je eksprimiran u brojnim netumorskim tkivima.

Prema tome, izum se također tiče analoge FGF8b od ljudi/laboratorijskih glodavaca koji su imunogeni u ljudima, a rečeni analog sadrži znatni dio poznatih i predviđenih FGF8b epitopa za CTL i B-stanice uključujući najmanje jedan strani epitop za TH, kao što je ovdje diskutirano.

Preferirano je prisutan najmanje jedan strani epitop za TH uveden insercijom u aminokiselinsku sekvenciju ili supstitucijom dijela aminokiselinske sekvencije od FGF8b ili kao rezultat delecije dijela aminokiselinske sekvencije od FGF8b. Najpreferiraniji analozi cjeline su oni u kojima je strani epitop za TH stanice uveden u dio aminokiselinske sekvencije od FGF8b definirane SEQ ID NO: 6 u položaje 1-54 i/ili 187-215 i/ili 55-58 i/ili 63-68 i/ili 72-76 i/ili 85-91 i/ili 95-102 i/ili 106-111 i/ili 115-120 i/ili 128-134 i/ili 138-144 i/ili 149-154 i/ili 158-162 i/ili 173-177.

Mucini

Izum se također odnosi na metode iz izuma koje koriste specifično modificirane verzije humanih mucina, posebice bilo koji MUC-1 do MUC-4, preferirano MUC-1. Analozi sadrže sljedeću strukturu

TR(S-P-S-(TR)m)n

- gdje je TR ponovljen tandem izveden iz prirodnih mucina, P je strani epitop za TH kao što je ovdje diskutirano, S je inertni dio peptida koji ima O do 15 aminokiselinskih ostataka, preferirano između O i 10 aminokiseliskih ostataka, n je cijeli broj od 1 do 30, a m je cijeli broj od 1 do 10, prerefirano od 3 do 5.

Pri proizvodnji ovakvog analoga mucina, npr. u humanoj staničnoj liniji ili pročišćavanjem iz tkiva, izravni rezultat normalno neće imati željeni obrazac glikolizacije tj. aberantni obrazac glikolizacije koji sliči na mucin izveden iz tumora. Međutim, moguće je producirati analoge rekombiantno u npr. u E. coli ili sintezom, tako da se postigne Tn ili S-Tn glikolizacijski obrazac specifičan za MUC-1 eksprimiran na tumorima. Alternativno, polipeptid se može pripraviti u staničnoj liniji sisavca ili staničnoj liniji insekta, npr. u stanicama Drosophia, kojima nedostaje važan enzim ili eksprimiranjem proteina intracelularno (izbjegavajući izlučivanje signalnog peptida) pri čemu se glikolizacija ne događa.

Fragmenti nukleinske kiseline i vektori iz izuma

Bit će razumljivo iz gornjeg prikaza da se analozi mogu pripraviti tehnologijom rekombinantnog gena, ali također i kemijskom sintezom ili semisintezom; zadnje dvije mogućnosti su posebno važne kada se modifikacija sastoji od vezivanja na protein: nosača (kao što je KHL, toksoid difterije, toksoid tetanusa i BSA), neproteinske molekule kao što su polimeri ugljikovodika, te naravno bočnog lanca kada modifikacija sadrži adiciju bočnih lanaca ili bočnih skupina peptidnog lanaca deriviranog od polipeptida.

Za svrhe tehnologije rekombinantnog gena, i naravno također za svrhe imunizacije nukleinskom kiselinom, fragmenti nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptidni analog su važni kemijski produkti. Zato je važan dio izuma koji se odnosi na fragment nukleinske kiseline koji kodira analog bilo kojeg za tumor releventnog polipeptida, preferirano polipeptida u koji je uveden strani epitop za T-stanice načinom insercije i/ili adicije, preferirano metodom supstitucije i/ili delecije. Fragmenti nukleinskih kiselina iz izuma su DNA ili RNA fragmenti.

Fragmenti nukleinskih kiselina iz izuma će normalno biti insertirani u pogodne vektore, a za tvorbu vektora za kloniranje ili ekspresiju koji nose fragmente nukleinske kiseline iz izuma; takvi novi vektori su također dio izuma. Detalji koji se tiču konstrukcije tih vektora iz izuma će biti diskutirani dolje u kontekstu transformiranih stanica i mikroorganizmima. Vektor može, ovisno o svrsi i tipu aplikacije biti u obliku plazmida, faga, kosmida, mini-kromosoma ili virusa, ali je također sama DNA koja je samo eksprimirana privremeno u nekim stanicama važan vektor. Preferirano su vektori za kloniranje i ekspresiju iz izuma sposobni za autonomnu replikaciju, zato omogućuju veliki broj kopija za svrhe velike razine ekspresije ili velike razine replikacije za sljedeće kloniranje.

Općenito, vektor iz izuma ima sljedeće karakteristike u 5'-3' smjeru i djelatnom mjestu vezivanja: promotor ekspresije fragmenta nukleinske kiseline iz izuma, koji može biti sekvencija nukleinske kiseline koja kodira vodeći peptid omogućava izlučivanje (u ekstracelularnu fazu ili gdje je primjenjljivo u periplazmi) ili integraciju u membranu polipeptidnog fragmenta, u fragment nukleinske kiseline iz izuma, te može i u nukleinsku kiselinu koja može kodirati terminator. Kada se koriste ekspresijski vektori za produkciju vrsta ili staničnih linija, za svrhu genetske stabilnosti transformiranih stanica je preferirano da vektor pri uvođenju u stanicu domaćina integriran u genom stanice. Nasuprot tome, kada se radi s vektorima koji će se koristiti za djelovanje in vivo ekspresije u životinji (tj. kada se koristi vektor DNA vakcine), zbog razloga sigurnosti preferirano je da vektor ne može biti integriran u genom domaćina; tipično se koristi sama DNA ili neintegrirani virusni vektori, a izbor je dobro poznat stručnjacima.

Vektori iz izuma se koriste da transformiraju stanicu domaćina da producira analog iz izuma. Takve transformirane stanice, koje su također dio izuma, mogu biti kultivirane ili stanične linije korištene za propagaciju fragmenata nukleinskih kiselina i vektora iz izuma, ili se koriste za rekombinantnu produkciju analoga iz izuma. Alternativno, transformirane stanice mogu biti pogodne za žive vakcine u kojima je fragment nukleinske kiseline (jedna ili više kopija) insertirana tako da utječe na sekreciju ili interakciju u bakterijsku membranu ili stanični zid analoga.

Preferirane transformirane stanice iz izuma su mikroorganizmi kao što je bakterija (kao što su vrste Escherichia [npr. E. coli], Bacillus [npr. Bacius subtilis], Samonela ili Micobacterium [preferirano ne patogene npr. M bovis BGC]), gljivice (kao što je Saccharomyces cerevisiae) i protozonas. Alternativno, transformirane stanice se izvode iz multicelularnih organizama kao što je kvasac, stanice insekta, stanice biljke ili stanice sisavca. Najpreferiranije su stanice dobivene od ljudi, vidi donju diskusiju o staničnim linijama i vektorima.

Za svrhe kloniranja i/ili optimiziranja ekspresije preferirano je da su transformirane stanice sposobne za replikaciju fragmenta nukleinske kiseline iz izuma. Stanice koje eksprimiraju fragmente nukleinske kiseline su preferirana cjelina u ovom izumu i one mogu biti korištene za produkciju analoga na malo i veliko, ili u slučaju nepatogenih bakterije, kao sastavni dio žive vakcine.

Kada se pripravlja analog iz izuma transformiranjem stanica, pogodno je, mada nije suštinski, da je ekspresijski produkt eksportiran u medij kulture ili je nađen na površini transformirane stanice.

Kada je identificirana stanica koja je učinkovit proizvođač, preferirano je da se na toj osnovi utvrdi stanična linija koja nosi vektor iz izuma i koja eksprimira fragment nukleinske kiseline koja kodira modificirani polipeptidni analog. Preferirano, ta stabilna stanična linija izlučuje ili nosi analog iz izuma, pa stoga olakšava njegovo pročišćavanje.

Općenito, vektori plazmida koji sadrže replikon i kontrolnu sekvenciju koji se izvode iz vrsta kompatibilnim sa stanicama domaćina se koriste u vezi s domaćinima. Vektor obično sadrži mjesto replikacije kao i markajuću sekvenciju koja je sposobna omogućiti fenotipsku selekciju u transformiranim stanicama. Primjerice, E. coli je tipično transformirana korištenjem pBR322 plazmida izvedenog iz vrste E. coli (vidi npr. Bolivar et al. 1977). Plazmid pBR322 sadrži gene za rezistenciju na ampicilin i tetraciklin i stoga je moguće laka identifikacija transformiranih stanica. Plazmid pBR ili drugi plazmid ili fag mikroorganizma mora također sadržati ili biti modificiran da sadrži promotore koji se mogu koristiti prokariotski mikroorganizam! za ekspresiju.

Ti promortori se najuobičajenije koriste pri konstrukciji rekombinantne DNA koja sadrži B-laktamazu (penicilinaza) i promotorni sustav laktoze (Chang et al., 1978, Itakura et al. 1977; Goeddel et al 1979) i sustav promotora triptofana (trp) (Goeddel et al. 1979; EP-A-0 036 776). Dok se navedeni najviše koriste, pronađeni su i korišteni drugi promotori iz mikroorganizama, a detalji koji se tiču njihovih nukleotidnih sekvencija su publicirani, omogućujući stručnjacima da izvedu funkcionalnu ligaciju s plazmidnim vektorom (Siebwenlist et al. 1980). Neki geni prokariota se mogu eksprimirati učinkovito u E. coli iz njihove vlastite promotorske sekvencije, a time otklanjaju potrebu za dodatnim ili drugim promotorom dobivenim na umjetni način.

Uz prokariote se također mogu koristiti eukatiotski mikroorganizmi, kao što su kulture kvasca, a tamo promotor mora imati sposobnost izvođenja ekspresije. Sacchatomyces cerevisiase ili obični pekarski kvasac se najčešće koriste među eukariotskom mikroorganizmima, mada su na raspolaganju i brojne ostale vrste. Za ekspresiju Sacchato-myces se primjerice obično koristi plazmid YRp7 (Stinchcomb et al. 1979; Kingsman et al. 1979; Tschemper et al. 1980). Taj plazmid već sadrži trpi gen koji omogućuje odabir markera za mutantnu vrstu kvasca kojoj nedostaje mogućnost rasta triptofana primjerice ATCC br 44076 ili PEP4-1 (Jones, 1977). Prisutnost trpi lezije kao karakteristike stanice domaćina kvasnog genoma, omogućuje zatim učinkovit okoliš za detekciju transformacije pri rastu u nedostatku triptofana.

Pogodne sekvencije za promociju u vektorima kvasca uključuju promotore za 3-fosfoglicerat kinaze (Hitzman et al. 1980) ili ostale glikolitičke enzime (Hess et al. 1968; Holland et al. 1978) kao što je enolaza, gliceraldhid-2-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofrukto-kinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerrat mutaza, piruvat kinaza, triozafosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i gukokinaza. U konstrukciji pogodnih ekspresijskih plazmida, terminacijska sekvencija povezana s tim genima je također podvrgnuta ligaciji u ekspresijski vektor 3' sekvencije koja se želi eksprimirati, a da se dobije poliadenilacija mRNA i terminacija.

Ostali promotori koji imaju dodatnu prednost da su transkripcijski kontrolirani uvjetima rasta jesu regija koja pokreće alkohol dehidrogenazu 2, izocitokrom C kiselu fosfatazu, degradativne enzime povezane s metabolizmom dušika, te prije spomenutu gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu i enzime odgovorne za upotrebu maltoze i galaktoze. Pogodan je bilo koji plazmidni vektor koji sadrži promotor koji je kompatibilan s kvascem, a koji potječe od replikacijskih i terminacijskih sekvencija.

Uz mikroorganizme, kulture stanica izvedene od višestaničnih organizama mogu također biti domaćini. U načelu, bilo koja takva stanična kultura se može koristiti, bilo iz kultura vertebrata ili evertebrata. Međutim, najveći je interes pokazan prema stanicama vertabrata, a progagacija vertebrata u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinski postupak zadnjih godina (Tissue Culture 1973). Primjeri takvih korisnih staničnih linija domaćina su VERO i HeLa stanice, stanične linije ovarija kineskog zamorca (CHO), te W138, BHK, COS-7 293, i MDCK stanične linije.

Ekspresijski vektori za takve stanice obično uključuju (ako je potrebno) porijeklo replikacije, promotor smješten u prednjem dijelu gena koji će biti eksprimiran, skupa s bilo kojim neophodnim mjestom vezivanja ribosoma, RNA na mjestu izrezivanja introna, polidentilacijsko mjesto i sekvenciju transkripcijskog terminatora.

Za upotrebu u stanicama sisavaca, kontrolna funkcija ekspresijskih vektora često potječe od virusnog materijala. Primjerice, promotori koji se obično koriste se izvode od polinoma, Adenovirusa 2, a najčešće Simian Virusa 40 (SC40). Rani i kasni promotori SV40 virusa su izuzetno korisni jer se oba dobivaju lako iz virusa kao fragment koji također sadrži replikaciju SV40 virusnog porijekla (Fiers et al. 1978). Manji ili veći SV40 fragmenti se također mogu koristiti s tim da je uključeno približno 250 bp sekvencija koja se proteže od HindIII mjesta prema BglI mjestu smještenom u repikatoru virusnog porijekla. Nadalje, također je moguće, a često je poželjno, koristiti promotor ili kontrolnu sekvenciju koja je normalno povezana s željenom genonskom sekvencijom, s tim da je takva kontrolna sekvencija kompatibilina sa sustavima stanice domaćina.

Do replikacije može doći zbog konstrukcijskog vektora koji je egzogenog porijekla, a takav se može izvesti iz SV40 ili ostalih virusa (npr. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) ili može nastati replikacijskim mehanizmom kromosomske stanice. Ako je vektor ugrađen u kromosom stanice domaćina, potonji je često dovoljan.

Pripravci iz izuma

Izum se također odnosi na imungoenski pripravak koji sadrži učinkovito imungoeno sredstvo od barem jednog analoga opisanog ovdje u smjesi s farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačem, vehikukom, razrjeđivačem ili ekscipijentom, a može biti prisutan adjuvans, vidi također gornju diskusiju o ovim temama u opisu metode iz ovog izuma.

Nadalje, izum se također odnosi na pripravke za induciranje antitijela protiv bilo kojeg od gore diskutiranog tumorskog antigena, a pripravak sadrži

- fragment nukleinske kiseline ili vektor iz izuma, te

- farmaceutski i imunološki prihvatljivo otapalo i/ili vehikul i/ili nosač i/ili ekscipijent i/ili adjuvans.

Formulacija i ostale specifičnosti koje se tiču takvih pripravaka su diskutirane u važnim gornjim dijelovima koji se tiču imunizacije nukleinske kiseline

PRIMJER 1

U sljedećem dijelu će se opisati kako se može razviti humana vakcina protiv PSM, modifikacijom molekula insercijom jednog ili više stranog epitopa za T stanice relaksirane specifičnosti, a da se dobije skup imunogeniziranih PSM molekula.

Konstruktima će biti testirana mogućnost indukcije specifičnih odgovora CTL protiv tumorskih stanica koje nose PSM. Nadalje, konstruktima će biti testirana mogućnost indukcije antitijela koji su reaktivni s prirodnim dijelovima PSM molekule. Zatim, u nekoliko in vitro pokusa u in vivo životinjskih modela bit će procijenjena učinkovitost različitih konstrukata. Bit će testirana mogućnost induciranih antitijela da aktiviraju komplement preko klasičnog puta i da iniciraju ADCC preko Fc-receptora. Konačno, bit će testirane različite molekule u životinjskim modelima humanog karcinoma prostate.

Strategija u dizajnu autovakcine

Ukratko, plan priprave PSM vakcinacije sadrži sljedeće eksperimentalne zadatke.

Dizajn i pripravu skupa humanih PSM mutanata

- Kloniranje sekvencije PSM od ludi ili štakora/miša.

- Izvođenje mutacije da se generiraju imungenizirane hPSM molekule.

- Ekspresija imunogeniziranih hPSM molekuka divljeg tipa u E. coli i/ili Pichia pastoris i/ili u stanicama mliječne žlijezde i/ili stanicama insekta (kao što je stanična linija S2).

- Pročišćavanje, restrukturiranje i karakterizacija imunogeniziranih hPSM molekula.

DNA vakcinacija protiv PSM

- Generiranje hPSM DNA vakcinacijskih vektora koji kodiraju imunogenizirane hPSM molekule.

- Testiranje hPSM vakcinacijskih vektora in vitro i in vivo eksperimentima.

Odabir hPSM kandidata

- Imunizacija miševa/zečeva.

- ELISA.

- FACS analiza,

- U slučaju odgovora antitijela: Proliferativni test na tumorske stanice.

- Test T-stanica.

Testiranje hPSM mutant in vivo

Čvrsti model tumora/metastaze u miševima.

Konceptualno istraživanje; indukcija CTL autovakcinom

- Konstrukcija imunogeniziranih mišjeg/štakorskog PSM koji pripadaju odabranim hPSM kandidatima (npr. u obliku DNA vakcina).

- Testiranje imunog odgovora od povećane količine mišjeg/štakorskog PSM mutanata u in vitro testovima: imunokemijskom analizom, ELISA, FACS analizom, staničnim testovima, kompletnom lizom stanica koje nose PSM, ADCC testom, testom aktivnosti CTL, testom proliferacije tumorskih stanica, testovima ispoljavanje T stanice.

- Testiranje mPSM mutanata in vivo u čvrstim modelima tumora/metastaza u miševima.

Nomenkatura hPSM konstrukata

PSM je tip II membranskog proteina od 750 aminokiselina, vidi SEQ ID NO: 2 koji prikazuje sekvenciju divljeg tipa s izuzetkom da Gly supstituira Trp u položaju 2 zbog uvođenje NcoI mjesta i Kozak sekvnecije u SEQ ID NO: 1, gdje ggt

supstituira tgg u položajima 4-6. Međutim, prirodni PSM (tj. PSM koji ima Trp u položaju 2) je također korišten za neke humane na PSM zasnovana autovakcinska konstrukta.

U PSM vanstanični dio sastoji se od 707 C-terminalnih aminokiselina, pri čemu je predviđena duljina domena u citoplzmatskom 19 aminokiselina, a transmembranski dio proteina sastoji se od 24 aminokiseline (aa 20-43).

Kao polazna točka konstrukta je također korištena varijanta PSM' dobivena izrezivanjem i spajanjem polipeptidnog lanca. Naša verzija te varijante dobivena izrezivanjem i spajanjem ima aminokiselinsku sekvenciju koja odgovara ostacima 58-750 u SEQ ID NO:2. Za pojednostavljivanje nomenklature, regije PSM' su numerirane prema numeriranju u PSM (što znači npr. Da se regija 2 sastoji se od aminokiselina 87-108 u PSM i aminokiselina 30-51 u PSM') vidi također dolje diskusiju o regijama.

Svi genetski konstrukti humanog PSM su označeni hPSM_._ (ili hPSM'_._ ako je PSM' korišten kao polazna točka), u kojem je prva _ insercijska regija korištena za inserciju P2, a druga _ je insercijska regija korištena za P30. Ako P2 ili P30 nisu prisutni u proteinu, označeno je brojem 0 (nula). Divlji tip pune duljine hPSM je označen hPSM0.0, a divlji tip PSM kojem nedostaju citoplazmatski i transmembranski dijelovi je označen hPSM-f-0.0. 13 planiranih imunogeniziranih hPSM gena koji će sadržati jedan P2 epitop i jedna P30 epitop će biti nazvati hPSM1.1, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSM10.1, hPSM1.6, hPSM1.8, hPSM1.10, hPSM1.2, hPSM1.3, hPSM1.5, hPSM2.1, hPSM3.1, hPSM10.3, hPSM6.3, hPSM'10.1, hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM'8.3, te hPSM5.1, vidi detalje dolje.

U hPSM1.1 P2 i P30 epitopi su insertirani u tandemu u insercijsku regiju br. 1 (regija prolaska kroz membranu). Teoretski, taj mutant, hPSM1.1 se može smatrati vrlo atraktivnim kandidatom za vakcinu, a za indukciju produkcije antitijela, jer je cijela ektracelularna domena tih molekula nedirnuta. Za indukciju odgovora CTL korištenjem imunizacije nukleinskim kiselinom, smatraju se korisnim konstrukti kao što je hPSM10.3 i hPSM6.3.

Da bi se olakšalo kloniranje i postupak mutasgeneze, većina molekulskih konstrukcija je izvedena korištenjem N-terminalne (aminokiseline 1-436) ili C-terminalnog (aminoklseine 437-750) dijela hPSM gena kao polaznog materijala. Ta dva dijela hPSM gena su označena hPSMI_._ i hPSMII_._, gdje prvi _ je regija insercije korištena za inserciju P2, a drugi _ je regija insercije korištena za P30. Ponovo, ako P2 i P30 nisu prisutni u proteinu, označeno je brojem 0 (nula), a divlji tipovi su imenovani kao hPSMI0.0 odnosno hPSMII0.0. Specijana varijnta hPSMI0.0 bez citoplazmatskog dijela hPSM je označena hPSMI0.0.

Praktički, većina posla na mutagenezi je učinjena koristeći hPSMI0.0 i hPSMII0.0 kao polazni materijal.

Proteini eksprimiranog PSM mutanta će biti označeni PROS_._ gdje je prvi _ regija insercije korištena za inserciju P2, a drugi _ je regija insercije korištena za P30. Ako P2 i P30 nisu prisutni u proteinu, označeno je brojem 0 (nula). Divlji tipovi su imenovani kao PROS0.0. PROSII0.0 je hPSM proteinski produkt s aminokiselinama 437-750. His označeni proteini se nazivaju se HISPROS_._ gdje His oznaka korištena u SEQ ID NO: 21 za ekspresiju u kvascu i bakterijama, dok je SEQ ID NO: 23 korišten za ekspresiju stanica sisavaca.

Kloniranje humane PSM sekvencije

LNCap stanična linija koja potječe od metastatskih lezija humanog adenokarcinoma, kupljena je od American Type Culture Collection (ATCC). mRNA je izolirana iz stanice linije i reverzno transkribirana koristeći standardni kit da bi se dobila cDNA koja kodira humanu PSM sekvenciju. Koristeći različite setove specifičnih započinjača, PCR produkt i oni koji kodiraju PSM (437-750) je dobiven i daljnje kloniran u pUc19 (plazmid broj pMR300) i verificiran DNA sekvenciranjem. Taj C-terminalni dio divljeg tipa PSM je označen hPSM dio II (hPSMII0.0).

Slično, tip divljeg fPSM dio i (hPSMI0.0) je kloniran u pUc19 korištenjem primera za pojačavanje dijela sa (hPSMI0.0) ili bez (hPSMI-0.0) transmembrane+citoplazmatske domene. Klonovi su kontrolirano sekvencirani, a PSMI0.0 i PSMII0.0 su fuzionirani koristeći ligaciju na EcoRI mjestu. Nastali klonovi hPSM0.0 (SEQ ID NO: 2) i hPSMH-0.0 su sibklonirani u brojne pro- i eukarotske ekpresijske vektore i sekvencija je ponovo verificirana. Intercelularno eksprimiran oblik humanog PSM (označen hPSM'- aminokiseline 58-750 SEQ ID NO:2) je također konstruiran korištenjem cDNA kao polaznog materijala. Ta sekvencija je također bila subklonirana u ekspresijski vektor sisavca koji je korišten je kao polazni materijal za neke hPSM autovakcinske konstrukte, npr. hPSM'10.0 i hPSM'6.3.

Kloniranje štakorske i mišje PSM sekvnecije

Dva EST (eksprimirana sekvencijska oznaka) klona koji sadrže PSM cDNA sekvenciju laboratorijskog glodavca (od fetano bubrea glodavca, odnosno makrofaga glodavca) su kupljeni od American Type Culture Collection (ATCC). Zajedno, ti EST su pokrili mišju PSM cDNA sekvenciju i stoga su oba mišja PSM pune duljine (SEQ ID NO:7 i 8) kao i PSM' laboratorijskog glodavca (SEQ ID NO:9 i 10) subklonirani u bakterijske vektore i ekspresijske vektore sisavaca. PSM AutoVac konstrukti glodavca su također pripravljeni insercijom P30 u mišji PSM cDNA.

Ekspresija hPSM divljeg tipa u E. Coli

C-terminalni dio (aminokiseline 437-750) hPSM, hPSMIIO.O je kloniran u bakterijski ekspresijski vektor pET28b da bi se dobio produkt s N-terminanom polihistidinskom (HIS) oznakom koja olakšava pročišćavanje velike količine i identifikaciju s anti-poli-HIS antitijelima. Proteinski produkt poli-his označen hPSMIIO.O (proteinski produkt označen HIS-PROSIIO.0) je eksprimiran u E col i.

DNA koji kodira skraćeni divlji tip humanog PSM hPSM-cyt0.0 je također eksprimiran iz pET28b u E. coli vrsti BL21(DE3) gdje je ekpresijski produkt smješten u inkluzijsko tjelešce. SDS-PAGE analiza bakterijskog lizata je pokazala produkt s očekivanom migracijom i Western analiza sa zečjim anti-HIS-PROSII0.0 je također dala očekivanu vrpcu. Nadalje, N-terminalno sekvenciranje pet aminokiselina tako produkta dobivenog iz SDS-PAGE gela daju očekivanu aminokiselinsku sekvenciju.

Divlji tip hPSM konstrukta hPSMO.O, hPSM-0.0 (kao i dva hPSM mutanata, hPSM1.1 i hPSM6.1, vidi dolje) su klonirani u različite ekpresijske vektore E. coli da se omogući efikasnija ekspresija i neki stupanj nabiranja rekombinatnih proteina u E. coli. Odabrani ekspresijski sustavi su:

pMCT6 koji generira N-terminalnu s His obilježenu verziju eksprimiranih rekombinantnih proteina,

pGH433 koji eksprimira rekombinantne proteine spojene na 22 aminokiselinsku vodeću sekvneciju koje treba usmjeriti protein na periplazmatsko mjesto u bakteriji E. coli, te

pMal-p2 u kojem su rekombinantni proteini eksprimirani kao C-terminalni fuzijski protein vezan na maltozu (MBP) koji sadrži prirodnu periplazmatsku vodeću sekvenciju. Antitijela protiv MBP se mogu koristiti za detekciju fuzijskih proteina i ugljikohidratnu kolona se može koristit za afineitetno pročišćavanje produkta.

Međutim, ekspresijski eksperimenti s E. coli hPSM proteina divljeg tipa iz tih vektora su samo pokazali srednju razinu ekspresije iz pMCT6. Problemi dobivanja periplazmatske ekspresije hPSM proteina divljeg tipa još uvijek nisu riješeni do danas.

Ekspresija hPSM divljeg tupa u Pichia pastoris

Zbog relativno visoke molekulske mase proteina PSM i njegovog relativno visokog stupnja glikolizacije (oko 16% molekulske mase), a da bi se olakšalo pročišćavanje eliminacijom koraka restruktuiranja, odlučeno je da se primjeni alternativna tehnologija za ekspresiju eukariota rekombinantnih proteina. Nekoliko dobro karakteriziranih eukariotskih ekspresijskih sustava su procijenjeni i u početnom prosijavanju hPSM mutanata je izabran kvasac Pichia pastoris kao alternativa ekspresiji u E. coli.

Ekspresijksi sustav kvasac Pichia pastoris je primijenjen na PSM konstrukcijama. Očekuje se da obrazac glikolizacije rekombinantnih proteina eksprimiran u ovom organizmu više nalikuje obrascu glikolizacije sisavca nego npr. Saccharomyces cerevisiae, a zbog manje razgranate manolizacije rekombinantnog proteina. Pokazano je da receptorom manoze posredovano prihvaćanje antigena od dendritičnih stanica rezultira približno stostruko većom efikasnosti ispoljavanja u T stanice prema enzocitoznom prihvatu u tekućoj fazi. Stoga, manolizacija može mijenjati antigenost (a posebno za mogućnost induciranja odgovora CTL) hPSM mutanata i ostalih antigena protiv kojih je odgovor CTL poželjan.

Vrsta Pichia pastoris kao i dva ekspresijka vektora su kupljeni od Invitrogen. Vektor pPICZocA nosi metanolom indukabilni promotor uzvodno od poliklonalnog mjesta, pri čemu pPICZ?A vektor eksprimira proteine konstitutivno. Oba vektora kodiraju α-faktor sekrecijskog signala da bi izluθili rekombinantne proteine u medij. Odabrani sustav ovih vektora je otporan na zeocin. Sekvencije kodiraju hPSM0.0, hPSM-0.0 (kao i dva hPSM mutanata, hPSM1.1 i hPSM6.1, vidi dolje) su subklonirani u različite vektore (u okviru s C-terminalnim c-myc identifikacijskim epitopom, SEQ ID NO: 27).

Četiri vrste Pichia pastoris (X-33, SMD1168, GS115, te KM71) koje se razlikuju npr. u njihovim potrebama rasta, su transformirane s svakim od tih (lineariziranih) plazmida korištenjem elektroporacije. Postupak transformacije je ponovljen nekoliko puta s malim promjenana da bi se dobio veliki broj klonova otpornih na zeocin. Ekspresija divljeg tipa hPSM÷0.0 (kao i hPSMl.l, vidi dolje) je dobivena u sustavu Pichia pastoris. Eksprimirani produkti se mogu detektirati Western analizom lizata transformanata Pichia pastoris korištenjem anti-hPSM monoklonanoh antitijela i anti-c-myc monoklonalnog antitijela. Međutim, rekmbinantni produkti su detektriani intraceluarno.

Ekspresija hPSM divljeg tipa u stanicama sisavaca

Ekspresijski sustav koji koristi CHO (ovarij kineskog zamorca, engl. chinese hamster ovary) će također biti ugrađene u konačno testiranje i produkciju izabranih molekula.

Do sada, CHO stanice se bile tranficirane s hPSM divljeg tipa i hPSM1.1 sa ili bez okvira vodeće sekvencije ekspresijskog vektora pcDNA3.1 od sisavaca. Dobivene su na geneticin otporne stanice. U COS stanicama prolazno transficiranih s istim konstruktima, hPSM0.0 i hPSM1.1 su detektirani Western analizom staničnih limfocita korištenjem anti-hPSM monoklonalnih antitijela.

Distribucija hPSM u tkivu

Komercijalni kit je kupljen da bi se odredilo može li se detektirati ekspresija hPSM u različitim humanim tkivima uključujući tkivo prostate, krvi i mozga. Metoda je zasnovana na točkastoj analizi hibridizacije detekcijom poliA koja sadrži mRNA ekstrahiranu iz 50 različitih humanih tkiva. Preliminarni rezultati ne pokazuju hiperekspresiju hPSM u tkivima kao što je krv i mozak. Međutim, nakon prioritetnog datuma ove aplikacije, ostali su pokazali prisutnost PSM u ostalim tkivima, vidi gore.

Dizajn PSM mutanata

Pri planiranju mutacije u PSM, vrlo je važno da neke regije proteina sačuvaju modificirane konstrukte, primjerice potencijalni i identificirani epitopi za T stanice, epitopi za B stanice i disulfidni mostovi cisteinskih ostataka. Stoga, su bile identificirane takve "zabranjene" regije unutar PSM sekvencije ostavljajući na raspolaganju ograničen broj "otvorenih" regija od 20 ili više aminokiselina za izmjenu sa stranim epitopima P2 i/ili P30 za T pomoćne stanica. Po definiciji, transmembranska regija se također smatra "otvorenom" regijom jer su autoantitijela upućena na tu regiju nevažna i vjeruje se da eliminacija tih sekvencija ubrzava topjlivost mutiranih PSM proteina, ali ne može biti isključeno da ta regija sadrži važne epitope za CTL, pa zato treba sačuvati transmembranske regije u npr. hPSM10.3.

U skladu s našim očekivanjima da će autovakcina inducirati odgovor CTL, bilo bi važno identificirati i sačuvati potencijalne subdominantne epitope za CTL u konstruktima. Dva takva epitopa su već poznata iz literature: 1) peptid koji sadrži aminokiseline 4-12 od PSM (LLHETDSAV) se može ispoljiti na humanoj MHC klasi I molekule HLA-A2.l (Tjoa 1996), te 2) PSM (711-719 (ALFDIESKV) također vezuje HLA-A2.1 (ref. 25). Mi srna također tražili aminokiselinsku sekvenciju od PSM, da bi se identificirali primarni ostaci za sidrenje na HLA klase I vezujući motivi, kao što je opisano od Rammensee et al. (Rammensee, 1995) za najučestalije tipove HLA klase I (HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A23, HLA-A24 i HLA-A28), a koji zajedno čine 80% HLA-A tipove humane populacije. Slično, potencijalni epitopi za HLA-B i HLA-C su identificirani i označeni kao "zabranjene" regije.

Kako su za početni izum korišteni C57/crni x SJL F1 hidridni miševi, odlučeno je da se koriste transgenični miševi za testiranje PSM autovakcijskih konstrukata, neki potencijalni mišji H-2b i H-2S epitopi za T pomoćne stanice su identificirani i smatrani su "zabranjenim: regijama (Rammensee 1995).

Također je važno sačuvati poznata mjesta vezivanja antitijela u PSM molekuli, jer ona mogu biti važna u indukciji specifičnih anti-PSM antitijela. Već je opisano pet takvih regija: PSM (63-68), PSM (132-137), PSM (482-487) (W0 94/09820) PSM (716-723), te PSM (1-7) (Murphy, 1996). Korištenjem na kompjutoru zasnovane metode od Hopp i Woods za predviđanje antigeničnih determinanata, predviđeno je pet regija: PSM (63-68), PSM (183-191), PSM (404-414), PSM (716-723) (hopp 1983), neke od ovih se prekrivaju s eksperimentalno nađenim epitopima. Te regije će također biti sačuvane u molekulama koji su kandidati PSM vakcine.

PSM protein sadrži 4 cisteinska ostatka (aminokiseline u položajima 22, 196, 466 i 597) koji može biti sačuvan u imunogeniziranim konstruktima, a zbog njihove važnosti u tvorbi bisulfodnih mostova.

Na osnovu gore spomenutih "zabranjenih" i "otvorenih" regija u hPSM proteinu, identificirano je 10 regija pogodnih za inserciju stranog epitopa za T pomoćnu stanicu:

Regije insercije u hPSMI (iz početnog mjesta u EcoRI mjesto, aa 1-147):

Regija 1: aa 16-52 u PSM (4 aminokiseline koje prethode TM, TM (24 aminokiseline) i 9 aminokiseline nakon TM

= 37 aminokiselina)

Regija 2: aminokiseline 87-108 u PSM, aminokiseline 30-51 u PSM' (22 aminokiseline)

Regija 3: aminokiseline 201-230 u PSM, aminokiseline 153-173 u PSM' (21 aminokiselina)

Regija 4: aminokiseline 269-289 u PSM, aminokiseline 212-2323 u PSM' (21 aminokiseline)

Regija 5: aminokiseline 298-324 u PSM, aminokiseline 241-267 u PSM' (27 aminokiseline)

Regije insercije u hPSMII (iz EcoRI u mjesto terminacije, aminokiseline 437-750):

Regija 6: aminokiseline 442-465 u PSM, aminokiseline 385-408 u PSM' (24 aminokiseline)

Regija 7: aminokiseline 488-514 u PSM, aminokiseline 431-457 u PSM' (27 aminokiseline)

Regija 8: aminokiseline 598-630 u PSM, aminokiseline 541-573 u PSM' (33 aminokiseline)

Regija 9: aminokiseline 643-662 u PSM, aminokiseline 586-605 u PSM' (20 aminokiseline)

Regija 10: aminokiseline 298-324 u PSM, aminokiseline 615-642 u PSM' (28 aminokiseline)

Insecijske regije kao i "zabranjene" regije su prikazane grafički na Slici 4.

Broj različitih imunogeniziranih PSM konstrukata će biti načinjen supstitucijom segmenta aminokiseline iz dva od gore nabrojanih insecijskih regija s P2 ili P30. Svaki mutantni protein će stoga sadržavati P2 i P30, mada su takve konstrukcije samo za primjere - jednostruki mutanti su također unutar obujma ovog izuma. Ekspreimantalno će mutacije biti izvedene u klonovima hPSMI i hPSMII, odnosno cDNA, te dva mutirana dijela će se zatim spojiti ligacijom (na EcoRi mjestu). P2 i P30 etipoti su početno bili insertirani u insercijska smjesa 1, 2, 3, 5, 6, 8 i 10, a da bi se kreirali mutanti.

Sekvencije P2 i P30 jesu:

P2: QYIKANSKFIGITEL (SEQ ID NO: 12, 15 aminokiseline), ovo je kodirano nukleotidnom sekvencijom cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggt atc acc gag ctg (SEQ ID NO: 11, 45 nukleotida), gdje je sekvencija naznačena masno mjesto SacI. Mogu se izabrati drugi kodoni, ovisno o izboru vektora za kloniranje i ekspresijskog sustava.

P30: FNNRTVSFWLRVPKVSASHLE (SEQ ID NO: 14, 21 amino-kiselina), ovo je kodirano nukleotidnom sekvencijom ttc aac ttc acc gta age ttc tgg ctg cgt gtt ccg aaa gtt age gCT AGC cac ctg ga a (SEQ ID NO: 13, 63 nukleotida), gdje je sekvencija naznačena masno označava mjesto HindIII, jednostruko podvučeno pokazuje mjesto Eco47III, velika slova pokazuju mjesto BstNI, a dvostruko podvučeno pokazuje smjesto Nhel.

Sljedeća tablica prikazuje ovdje korištene humane konsturkte:

[image] [image]

Molekulske konstrukcije hPSM mutanata

Mutacije za inseciju sekvencija koje kodiraju P2 i P30 su izvedene korištenjem hPSMI0.0 i hPSMII0.0 za polazni materijal.

Da bi se generirala glavnina hPSM mutanata, P2 i P30 su početno insertitani u hPSMI0.0 na položaju 1 za inserciju. Nastali materijal (hPSMI1.0, odnosno hPSMI0.1) je zatim korišten kao polazni materijal za mutanogenezu da bi se insertirali P2 i P30 u položaje 2,3 i 5, te za ligaciju s epitopom za mutirano hPSMII. hPSMI1.0 koji je konstruiran korištenjem SOE (ekstenzije jednostrukog preklapanja) PCR a zatim je sekvencija verificirana. hPSMI0.1 je konstruiran korištenjem tehnike "brze promjene" za zatim je sekvencija verificirana.

P2 epitop je insertiran u položaje 2,3 i 5 od hPSMI1.0 korištenjem SOE-PCR da se kreiraju hPSMI1.2, hPSMI1.3 i hPSMI1.5. Te konstrukcije su kombinirane s hPSMII0.0 da bi se kreirali hPSM1.2, hPSM1.3 i hPSM1.5.

hPSMI2.1, hPSMI3.1 i hPSMI5.1 su konstruirani pomoću SOE PCR korištenjem hPSM10.1 kao polazni materijal. Taj materijal je spojen s hSPMII0.0 ligacijom na EcoRi mjestu da bi se dobili mutanti hPSM2.1, hPSM3.1 i hPSM5.1 pune duljine.

P2 epitop je insertiran u tri različita položaja u hPSMII0.0, a da se kreira hPSMII6.0, hPSMII8.0 i hPSMII10.0 korištenjem tehnike "brze promjene", a ti klonovi su zatim verificirani.

Zatim je s hPSMI0.1 izvedena ligacija s hPSMII6.0, hPSMII8.0 i hPSMII10.0 da bi se dobio hPSM6.1, hPSM8.1 i klonovi su verificirani.

Insercija P30 epitopa u hPSMII je sada izvedena korištenjem SOC PCR, a da bi se generirali hPSMII0.6, hPSMII0.8 i hPSMII0.10.

hPSM1.1 je konstruiran korištenjem PCR mutacije u dva koraka koju slijedi ligacija i HindIII mjesto unutar sekvencije epitopa. Sekvencija konstrukta pune duljine je verificirana.

hPSM10.3, hPSM'10.3 i hPSM6.3 je konstruiran korištenjem SOE-PCR. Nekoliko hPSM varijanata s P2 i P30 insertiranim u eksltrecelularni dio hPSM se sada konstruiraju (hPSM'6.3, hPSM8.3, hPSM'8.3).

Uz početno planiranje da svaki mutant sadrži P2 i P30, konstruirana su četiri mutanata koji sadrže samo jedan strani epitop i sekvencije su verificirane: hPSM1.0, hPSM8.0, hPSM10.0. i hPSM0.1.

Ekspresija hPSM mutanata u E. coli

U eksperimentima s malim količinama je sedam hPSM mutanata, hPSM1.1, hPSM6.1, hPSM8.1, hPSM10.1, hPSM2.1, hPSM3.1 i hPSM5.1 eksprimirano iz pET28b u vrsti E. coli BL21(DE3), te IPT inducibilni produkti očekivanih veličina su identificirani Coomasive Blue bojenom na SDS-PAE gelu. Međutim, produkti hPSM1.1 nisu detektirani. Razina ekspresije tih hPSM mutanata je bila vrlo niska u usporedbi s produktom hPSM-0.0 konstrukta divljeg tipa. U tom stupnju dovoljna razina ekspresije hPSM mutanata korištenjem pET sustava u E. coli je izgledala nemogućom i upotreba ostalih E. coli ekspresijskih sustava i/ili ostalih organizama domaćina je stoga neophodna.

Kao što je gore spomenuto, hPSM6.1 i hPSM1.1 su subklonirani u različite E. coli ekspresijske vektore da se genenerira

- N-terminalna verzija s His oznakom ekspimiranog rekombianantnog proteina korištenjem pMCT6 vektora,

- verzije proteina eksprimiranih s pelB vodećom sekvencijom koja usmjerava protein u periplaznično mjesto bakterije E. coli korištenjem vektora pGH433, te

- verzije rekombinantnih proteina eksprimiranih kao C-terminalni fuzijski proteini na protein koji veže maltozu (MBP) korištenjem vektora pMal-p2.

Do sada je nije dobivena dovoljna razinu ekspresije iz bilo koje od ovih konstrukata.

Kako je hPSM0.0 dovoljno eksprimiran u E. coli, dok slična razina ekspresija hPSM0.0 pune duljine ili hPSM mutanata nije primijećena, moguće je da se u prisutnosti citoplazmatskog dijela PSM molekule može "inhibirati" ekspresija konstrukata hPSM pune duljine u E. coli. Da se testirala ova hipoteza, mi smo početno načinili dva genetska konstrukta od hPSM1.1 i hPSM6.1 bez citoplazmatske domene. Međutim, eksperiment u E. coli je pokazao samo slabu ekspresiju tih H-cyt gen produkata.

Ekspresija hPSM mutanata u Pichia pastoris

Da bi se eksprimirao hPSM1.1 mutant proteina iz kvasca Pischia pastoralis, hPSM1.1 sekvencija je subklonirana (u okviru s C-terminalnim c-my identifikacijskim epitopom, SEQ ID NO: 27) u dva različita ekspresijka vektora pPICZ?A i pAPZαA, te je sekvencija verificirana. Ekspresija hPSM1.1 (kao i hPSM-0.0, vidi gore) je detektirana intracelularno u transformantu Pichie pastoris.

Ekspresija hPSM mutanata u stanicama sisavaca

Kao što je gore spomenuto, hPSM1.1 je subkloniran u ekspresijski vektor sisavca pcDNA3.1(+) i pZeoSV2 i ti konstrukti (i ostali) bi mogli biti korišteni za ekspresiju u npr. CHO stanicama. Prolazna ekspresija hPSM1.1 kao i hPSM0.0 je dobiven u COS stanicama je verificiran Western analizom.

DNA vakcinacija

DNA vakcinacija bi, ako je učinkovita, bila vrlo dobra za autovakcine - posebice zbog tog jer je pokazano da takav oblik davanja povećava CTL posredovanu imunu reakciju i produkciju antitijela. Stoga je namjera da se izvede paralelno istraživanje s idejom istraživanja učinka DNA vakcinacije miševa s odgovarajućim vektorima koji kodiraju imunogenizirani mišji ubikvuitin i/ili mišji TNFa. DNA vakcinacija s hPSM (i/ili mutantima) koji kodiraju samu DNA će također biti izvedene.

Primjenjivost istraživanja korištenja imunogeniziranog ubiguitina za vakcinaciju s DNA.

Istraživanje primjenjivosti efekta DNA vakcinacije s imunogenziranim vlastitim proteinom izvedeno tako da se koristi ubikvitin s insertiranim epitopom za T pomoćnu stanicu iz ovalbumina (UbiOVA) kao modelni protein. Sekvencije koje kodiraju UbiOVa kao i ubikvitin divljeg tipa su subklonirani u ekspresijskom vektoru sisavca pcDNA3.1(-).

Grupe 5 BALB/c miševa su imunizirane s 40 µg pvDNA-UbbiOVA ili pcDNA-ubikvitinska konstrukta ili intramuskularnim davanjem u kvadriceps ili intradermalno. Kontrolna skupina je primila UbiOVA protein u kompletu s Freundovim adjuvansom. Tri i šest tjedana kasnije, imunizacija je ponovljena s jedinom razlikom da je UbiOVa protein emulgiran u nekompetnom Freundovom adjuvansu.

Miševima je uzimana krv regularno i određivan je titrar anti-ubikvitin antitijela. U DNA vakciniranoj UbiOVA grupi su dobiveni sam vrlo slabi titri anti-ubikvitin antitijela. Zatim su sve grupe stimulirante s UbiOVa proteinom u nekompletnom Freundovom adjuvansu i uzeta je krv da se odredi je li DNA vakcinacija s UbiOVA (a neubikvitinom) mogla povećati odgovor antitijela prema UbiOVA proteinu. Rezultati tog eksperimenta pokazuju da ne postoji značajna razlika između skupine kojoj je dan UbiOVA i kontrolnih skupina, i svi miševi su razvili jaki anti-ubikvitin antitijela nakon jedne UbiOVa/FIA stimulacije.

DNA vakcinaciniranje korištenjem hPSM konstrukata

Sada se odvijaju različiti eksperimenti DNA vakcinacije korištenjem hPSM konstukata. Različiti humani PSM divljeg tipa i AutoVac konstrukti (kao što je npr. hPSM0.0, hPSM-0.0, hPSM'0.0, hPSM1.1, hPSM10.3) su subklonirani u DNA vakcinacijske vektore (kao što je pcDNA3.1 (+), pcDNA3.1(-), pVAX i pZeoSV2). U nekim konstrukcijama uključene su različite vodeće sekvencije (kao u CD11a, tPA i IL-5 vodeće sekvencije, SEQ ID NO: 29, 25 i 31) izravno N-terminalno i u okvir, a da se dozvoli izlučivanje eksprimiranih hPSM proteina in vivo. Sve konstrukcije u DNA vakcinacijskim vektorima su verificirane DNA sekvenciranjem i in vitro translacijom.

Miševima različitih vrsta (kao što su Ba1b/cA, Ba1b/cJ, DBA/2 i A/J) su injektirane gore opisane hPSM DNA vakcine intradermalno ili intramuskularno i stimulirani su nekoliko puta korištenjem istog konstrukata.

Uzorci seruma su dobiveni tijekom imunizacijskog perioda su čuvani pri -20 °C. Ti uzorci će biti analizirani na prisustvo antitijela reaktivnih s hPSM divljeg tipa.

Također su testom utvrđeni odgovori CTL1 i T proliferativnih pomoćnih stanica u tim miševima.

Preliminarni rezultati pokazuju da indukcija CTL i odgovori antitijela na PSM.

Pročišćavanje/karakterizacija hPSM(437-750) s HIS oznakom (HIS-PROSII0.0)

hPSM(437-750 divljeg tipa s HIS oznakom (HIS-PROSII0.0) je eksprimiran iz pET28b, a topljiva inkuzijska tjelešca su nanesena na gel filtracijsku HPLC kolonu u puferu koji sadrži 8 M ureu. Frakcije koje uglavnom sadrže hPSMII su podvrgnute različitim uvjetima restuktuiranja da se optimizira postupak. Topljivi produkti koji su dializirani u Tris puferu su nađeni više od 90% čisti korištenjem bojenja srebrom SDS-PAGE. Zečevi su imunizirani s pročišćenim HIS PROSII0.0 da bi se nastali antiserum koristio za kasniju detekciju i moguće afinitetno pročišćavanje hPSM mutanata.

Pročišćavan je/karakterizacija topljivog hPSM (PROS-0.0)

Divlji tip hPSM kojem nedostaju citoplazmatski i transmembranski dijelovi, PROS-MKO, je eksprimiran u vrsti E. coli BL21(DE3) nakon uvođenja IPTG i detektirana su inkuzijska tjelešca. Nakon SDS-PAGE tog bakterijskog lizata slijedila je Western analiza sa zečjim anti HIS-RPSII0.0, koja je pokazala produkt s očekivanom migracijom. N-terminlano sekvenciranje prvih pet aminokiselina tog produkta dobiveno s SDS-PAGE gela ima očekivanu sekvenciju koja odgovara humanom PSM. Produkt je podvrgnut velikoj seriji eksperimenata slolubilizazije i restruktuiranja. Produkt koji ostaje u otopini se može dobiti u Tris puferu bez denaturiranja, ali SDS-PAGE analiza je pokazala da je materijal vjerojatno u obliku velikih agregata. Miševi i zečevi su imunizirani tim materijalom da bi se dobilo antitijelo protiv hPSM npr. za analitičke svrhe - antiserumi nisu reagirali s LNCap hPSM.

Skupina pranih E. coli inkluzijskih tjelešca od PROSI-0.0 je pripravljena za imunizaciju zečeva, da bi se generirao poliklonalni antiserum protiv PSM. Približno 50% sadržaja proteina u važnom istaloženom materijalu sadržavao je PROS-0.0. Antiserumi nisu reagirali s LNCap u Western analizi.

Priprava s KHL konjugiranih hPSM peptida za imunizaciju

Tri 15-mernih peptida je sintetizirano da bi se pripravili imunogeni konjugati poznatih epitopa za T stanice s imunološkom molekulom nosačem, a da se dobije poliklonalni antiserum koji je sposoban dreoranizirati hPSM. Ti peptidi sadrže PSM epitop za B stanice plus 5-6 bočnih PSM aminokiselina na svakom kraju.

Peptidi su pripravljeni automatskom sintezom, pročišćeni su HPLC i kontrolirano su sekvencirani koristeći Edmanovu degradaciju.

Kemijski vezani konjugati su pripravljeni unakrsnim vezivanjem epitopa za B stanice koji sadrži hPSM peptide KLH koristeći standardni postupak u jednom koraku s glutar-aldeihom kao sredstvo za umjetno vezivanje.

Sinteza P2 i P30 peptida s bočnim hPSM sekvencijama

Šest peptida su dizajnirani koji odgovaraju P2 i P30 epitopima s 5 bočnih hPSM aminokiselina na svakom kraju. Bočne aminokiseline odgovaraju mjestima insercije 6, 8 i 10 u epitopu. Peptidi će biti korišteni u npr. proliferacijskom testu T stanice, ali također za ostale svrhe kao što je ELISA ili ostali in vitro testovi. Sekvencije peptida jesu:

PSMpep007 P2 insertiran u PSM na mjesto insercije 6 QERGVOYIKANSKF1G1TELRVDCT (SEQ ID NO: 15)

PSMpep008 P2 insertiran u PSM na mjesto insercije 8 AVVLROYIKANSKF1GITELEMKTY (SEQ ID NO: 16)

PSMpep009 P2 insertiran u PSM na mjesto insercije 10 MFLERANSKFIGITELHVIYA (SEQ ID NO: 17)

PSMpep101 P30 insertiran u PSM na mjesto insercije 6 NSRLLFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEVDCTP (SEQ ID NO: 18)

PSMpep011 P30 insertiran u PSM na mjesto insercije 8 VVRKFNNFTVSFWLRVPKVSASHLESFESL (SEQ ID NO: 19)

PSMpep012 P30 insertiran u PSM na mjesto insercije 10 LMFLEFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEPSSHN (SEQ ID NO: 20)

P2 i P30 epitopi su podvučeni. Peptidi su pripravljeni automatskom sintezom, pročišćeni su HPLC i kontrolirano su skvencirani koristeći Edmanovu degradaciju.

Test imunogeničnosti

Različiti eksperimenti su započeti da bi se pripravili materijali i postavio test imunogeničnosti za buduća testiranja i odabira između mutiranih PSM konstrukata.

Generacija poliklonalnih zečjih anti-HIS-PROSII0.0 i anti-konjugiranih KLM-PSM-peptidnih antiseruma

Dva zeca su imunizirana s pročišćenim HIS-PROSII0.0, HIS označeni C-terminlani dio hPSM proteina (aminokiseline 437-750) je emulgiran 1:1 s kompletnim Freundovim adjuvansom i stimulirano je dva puta (28. i 55. dana) s istim emulgiranim antigenom u nekompletnom Freundovom adjuvansu.

Dva zeca je imunizirano s koktelom koji se sastoji od KLH-PSM peptidnog konjugata plus svaki od tri slobodna peptida. Svaki od ta tri peptida sadrži prethodno definirani hPSM epitop za B stanice. Koktel je emulgiran 1:1 s kompletnim Freundovim adjuvansom. Zečevi su stimulirani dva puta (28. i 55.dana) s istim emulgiranim antigenom u nekompletnom Freundovom adjuvansu.

Ukrštena reaktivnost između anti-HIS-PROSII0.0 i PSMpep005 i između anti-KLH-PSM peptidnog konjugata je pokazana u ELISA testovima. Anti-HIS-PROSII0.0 antitijelo ima sposobnost prepoznavanja prirodnog hPSM u lizatu LNCaP stanica u Western analizi.

Imunizacija miševa s retrovirusnom eksprimiranim hPSM0.0

U ovom stupnju PSM projekta, ozbiljna zapreka je nedostatak antitijela koji mogu prepoznati ispravno nabran prirodni hPSM. Stoga, je izveden eksperiment imunizacije korištenjem retrovirusom esprimiranog hPSM0.0.

Šest grupa Balb/c miševa je imunizirano s: 1) mitocinom C tretiranom BALB/c stanicama fibrosarkoma (79/24/H8) trans-duciranim s hPSMO.O cDNA (CMV-Koz-hPSM), 2) mitocinom C tretiranom BALB/c stanicama fibroskrkome (79/24/H8) tansduciranim s praznim vektorom (CMVBipep), 3) pakiranim stanicama (BOSC) transficiranih s hPSM0.0 cDNA (CMV-Koz-hPSM), 4) pakiranim stanicama (BOSC) transficiranih s praznim vektorom (CMVBipep), 5) retrovirusnim skupom koji eksprimira hPSM0.0 cDNA (CMV-Koz-hPSM), ili 6) uzorkom retrovirusa, pazni vektor (CMVBipep).

Nekoliko puta je miševima uzeta krv i dobiven serumi su testirani na reaktivnost u ELISA na reaktivnost na HIS-PROSII0.0. Nažalost, ni jedan od miševa nije razvio antitijela sposobna za specifično prepoznavanje HIS-PROSII0.0 preparacije.

Postavljanje anti-hPSM ELISA

Pročišćeni HIS-PROSII0.0 je korišten za presvlačenje polistirenskih mikrotitarskih pločica (Maxisorp) za svrhe postavljanja ELISA za testiranje npr. hibridoma super-natanta ili mišjih ili zečjih antiseruma. Serumi iz BALB-c miševa imuniziranih s istim pripravkom HIS-PROSII0.0 su reagirali s imobiliziranim HIS-PROSII0.0 pri 0.5 µg po jažici koristeći peroksidazom iz hrena obilježen zečji anti-mišju Ig kao sekundarno antitijelo.

Kao što je gore spomenuto, sposobnost antiseruma nastalog u zečevima, a protiv KLH-PSMpep004-PSMpep005-PSMpep006 konju-gata u smjesi sa slobodnim peptidima, da reagira s imobiliziranim HIS-PROSII0.0, je pokazana korištenjem ELISA testa.

Korištenjem AuguaBind® mikrotitaske pločice (vidi prikaz u WO 94/03530 koji opisuje i.a. mikrotitarske površine presvučene desktranom aktiviranim tresilom, koji su sada na tržištu pod registriranim tvorničkim nazivom AguaBind), određena je ELISA koja koristi imobilizirane PSM peptide PSMpep004, PSMpep005 i PSMpep006). AuguaBind® pločice presvučene s tim peptidima mogu detektirati zečji antiserum nastao protiv istog pripravka antigena. Kao što je gore spomenuto, zečji HIS-PROSII0.0 mogu biti detektiran! na AuguaBind® pločicama presvučenih s PSMpep005.

Postavljanje anti-hPSM Western analize koristeći LNCaP stanice i monoklonalna antitijela 7E11C5

7E11C5 stanica hibridoma koje izlučuju mišje IgG2a monoklonalno antitijelo protiv intracelularnih epitopa humanog PSM je kupljen od ATVV. Kultura supernatanta od približno 90% mrtvih stanica je sakupljena koristeći Western analizu za detekciju humanog PSM i membranom obogaćenog pripravaka LNCaP stanica i u LNCaP staničnih lizata. Ta

antitijela su pročišćena korištenjem proteinskih G kolona i njihova reaktivnost s LNCaP je verificirana Western analizom.

Postavljanje FACS metode za detekciju hPSM ili LNCaP stanica

Mi smo utvrdili višestruko neovisnu FACS metodu za detekciju hPSM ili LNCaP stanica. Nekoliko problema je dotaknuto: LNCaP stanice rastu vrlo sporo i u nepravilnim nakupinama, pa stoga metoda za pripravu suspenzije jedne stanice mora biti optimizirana. Drugo, epitop prepoznat od mAb7EHC5 je u literaturi definiran kao citoplazmatksa domena hPSM. Stoga, je razvijena metoda za fiksiranje i permeabilizaciju stanica. Za tu svrhu je na protein G pročišćeno 7E115 antitijelo konjugirano s FITC i može stoga biti korišten bez sekundarnih antitijela u FACS analizi.

Također, je ustanovljena FACS metoda koja koristi anti-hPSM monoklonalna antitijela J591 i koja prepoznaje epitop ekstrastaničnog dijela hPSM. Antitijelo je dobiveno od BZL Bioloicals i FITC konjugati su zatim korišteni za FACS analizu i sortiranje npr. LNCaP stanica i hPSM transficiranih stanica (vidi dolje).

Postavljanje testa citotoksičnosti

Korištena je metoda pročišćavanja dendritičnih stanica iz mišje koštane srži. Koristeći modelni protein, optimizirana je imunizacija pulsno tretiranih dendritičnih stanicama miševa s modelnim peptidima klase I i proteinima. Također su miševi imunizirani s modelnim proteinom (ß-alaktozidazom) koja je formuliran u obliku ISCOMS. T stanice pročišćene iz imuniziranih miševa su in vitro restimulirane s različitim oblicima odgovarajućih antigena. Zatim je mjerena sposobnost tih restimuliranih CTL da liziraju različite vrste ciljnih stanica (uključujući pulsno tretirane dendritičnih stanice kao i transfektante koji eksprimiranju retrovirusom eksprimirane citosolične peptide klase I). Utvrđena su dva različita in vitro testa koja mjere aktivnost CTL korištenjem oslobađanja kroma ili DNA framentaciju (JAM metoda) kao mjere citotoksičnosti. Vrlo dobri rezultati su dobiveni s modelnim proteinom ß-galaktozidazom kao i sa različitim kombinacijama na MHC klase I i klase II vezujućih modelnih peptida.

Utvrđivanje načina istraživanja razbijanja autotolerancije prema mišjem PSM u mišu

Namjera je da se istraži da li autotolerancija na mišji PSM može biti razbijena u mišu koji je imuniziran i/ili DNA vakcinacijom protiv PSM glodavaca korištenjem PSM AutoVac molekule glodavca.

Kao što je ore spomenuto, cDNA koja kodira PSM glodavca (mPSM) je dobivena sekvenciranjem DNA. Četiri mPSM molekulske varijante su generirane insercijom P30 na dobro definiranim mjestima u mPSM pune duljine ili u mPSM'. Konstrukti su sljedeći:

[image]

Početno, mPSM divjeg tipa i analogne molekule su subklonirani u DNA vakcinacijski vektor i korišteni za DNA vakcinaciju u miševima.

Namjera je da se analiziraju imuni odgovori i eliminacija tumora u miševima. Za to su tumorske stanične linije od glodavaca transficirane s divljim tipom PSM od glodavaca (fuzionirani u okvir s identidikacijskom oznakom, npr. c-myc epitop, SEQ ID NO: 21, a za svrhe detekcije).

I n vivo PSM modeli tumora

Proliferacijski test mišjih T stanica s P2 i P30

Serija eksperimenata proliferacije T stanica je provedena da bi se odredila imungogenost T stanice od P2 i P30 peptida u različitim mišjim vrstama (BAB/cA (H-2d), C3H/Hen (H-2k), DBA/1 (H-23), te C57BL/6 (H-2b)). Dobro je poznato da su ti epitopi relaksirane specifičnosti u ljudima, ali da je relaksirana specifičnost T stanica također potrebna da bi se potvrdili M&E eksperimentalni uvjeti korišteni u miševima. Stoga je pokazano da je P30 imunogen na T stanice u BAB/cA i DBA/l miševima. U DBA/1, T stanice se mogu razviti na P2.

Generiranje mišjih tumorskih stanica ekprimiranih od hPSM

Za upotrebu hPSM specifičnih tumorskog modela u miševima kao i za upotrebu u testu proliferacije tumorskih stanica, postavljen je skup od hPSM eksprimirajućih mišjih tumorskih stanica.

Jedan pristup je da se te stanične linije generiraju transdukcijom stanične linije tumora glodavaca s retrovisrusnim vektorom koji kodira divlji tip hPSM cDNA pune duljine.

Konstruirana su tri različita konstrukta koji kodiraju divlji tip cDNA pune duljine, a koja kodira hPSM insertiran u poliklonalno mjesto retrovirusnog vektora CMVBipep, a dva od njih sadrže kratku Kozak sekvenciju uzvodno od početnog kodona.

Ti konstrukti su transducirani u tri različite mišje tumorske stanične linije: P815 (mastocitoma, H-2d)r B16-F10 (melano-ma, H-2b), te 79.24.H8 (fibrosarkoma, H-2d) korištenjem BOSC pakiranja stanične linije. Klonovi reziztentni na geneticin su dobiveni za sve tri skupine stanica, i to je verificirano PCR analizom gemonong DNA templata koji je retrovirusni konstrukt integrirao u stanice domaćina. Još nije bilo moguće detektirati eksprimirane PSM produkte FACS analizom koristeći 7E11C5 monoklonalna antitijela.

Dvije stabilne mišje stanične linije koje obuhvaćaju divlji tip humanog PSM vezanog na membranu su odabrane za transfekciju. To je izvedeno korištenjem hPSMO.O cDNA subklonova u ekspresijskom vektoru sisavca pcDNA3.1(-f) pod kontrolom CMV promotora i koji uzvodno od početnog kodona sadrži Kozakovu sekvenciju.

Nastali plazmid je transficiran u dvije različite mišje stanične linije: 79.24.H8 (fibrosarkoma, izveden od Balb/c) i Sa1N (fibrosarkom, izveden iz A/J). Dobivene su kulture rezistentne na geneticin koje su podvrgnute Western analizi i FACS analizi korištenjem J591 i 7E11C5 anti-hPSM monoklonalnih antitijela. Koristeći J591 antitijelo, stanice su FACS sortirane nekoliko puta dok nije dobivena hPSM pozitivna populacija. hPSM ekspresija je ponovo verificirana intracelularnim FACS bojenjem korištenjem 7E11C5 antitijela. Također je FACS analizom provjereno je li ekspresijska razina MHC klase I ista kao što je razine roditeljskih staničnih linija.

Kulture 79.24.H8 i Sa1N koje eksprimiraju hPSM su klonirane ograničenim razrjeđivanjem. Nekoliko dobivenih klonova je testirano na različite hPSM ekspresijske razine FACS analizom korištenjem anti-hPSM monoklonalnih antitijela J591.

hPSM koji eksprimira 79.24.H8 stanice je transificiran s genom koji kodira B7 . l za upotrebu npr. u in vitro testu praćenja hPSM specifičnih odgovora CTL i/ili oslobađanjem interferona-gama. Stanice su sortirane prema FACS jedanput korištenjem anti-B7.1 antiseruma.

Postavljanje tumorskog modela u miševima koji je specifičan na hPSM

Odlučeno je da se postavi barem dva in vivo tumorska modela za imunu komponentu miša, da bi se odredio antitumorski učinak antitijela nastalog u miševima protiv imunogeniziranih molekula. To će biti izvedeno injektiranjem sinergičnih mišjih tumorskih stanica modificiranih da ekprimiraju divlji tip hPSM na površinu membrane. Bit će korištene stanice koje tvore čvrste tumore i/ili stanice za koje je poznato da metastaziraju. Kao model će biti korištene stanične linije koje se mogu ugraditi u sinergične miševe bez da budu odbijene, a zbog prisutnosti strane hPSM molekule. Sposobnost hPSM vakcine da eliminira takve tumorske stanice će se koristiti za odabir kandidata za hPSM vakcinu.

Da bi se procijenio rast Sa1N stanica transficiranih s humanom PSM pune duljine, različite doze (2 x 106 i 5 x 106) hPSM transficiranih Sa1N stanica (S-PSM, sortirane 5 puta) su skupini A/J miševa injektirane subkutano u niži desni dio slabine. Međutim, čvrsti tumori nisu utvrđeni. Zatim su tri klona S-PSM stanica s različitom ekspresijkom razinom hPSM inektirana subkutano u 3 skupine A/J miševa pri dozi od 107 stanica/mišu. Veličina utvrđenih tumora je određena mjerenjem dvaju različitih promjera koje su pomnoženi da bi se dobila veličina tumora u mm2. Te vrijednosti su uspoređene s trima skupinama. Unutar 3-6 dana, svim miševima je razvijena čvrsta tumorska struktura koja je opet nestala približno nakon 15 dana. To je vjerojatno zbog prisutnosti humanog PSM na površini tumora, mada to još nije verificirano. U Sa1N stanicama transficiranih samo s pcDNA3.1 vektorom čvrsti tumori su nastavili rast u miševima.

Slična slika je opažena i miševima u koje je injektirano 106, 5 x 106 ili 107 79.24.H8 stanica transficiranih s hPSM i sortiranih nekoliko puta prema hPSM ekspresiji. U tim stanicama (79-PSM) također nisu utvrđeni tumori u Balb/c niti u DBA/2 miševima. Međutim, kada je klon hPSM transficirao 9.24.H8 stanice, 79-PSM.3 je injektiran u Balb/c ili DBA/2 miševe, te su se u miševima razvile čvrste strukture poput tumora koje su nestale ponovo dana 10-20. Transificirani vektor 79.24.H8 je nastavio rast u Balb/c miševima.

Još ostaje da se odredi da li se ti "tumori" mogu tretirati ili se mora naći bolji tumorski model zasnovan na opisanim klonovima S-PSM i 79PSM staničnih linija.

Zaključci

U izvođenju molekulskih konstrukcija mi smo uspjeli klonirati humani PSM gen i dobiti mišju PSM cDNA. Postavljen je smjer pune sekvnecirane imunogenizirani autovacinskog kosnstrukta. hPSM mutanti kao i različiti divlji tipovi hPSM molekula su eksprimirani u E. coli i nađeno je, te je i verificirano da je razina ekspresije i E. coli vrlo niska. Poliklonalna antitijela protiv C-terminlane polovice hPSM su inducirana u zečevima. Učinjen je napor da bi se ugradile različite ekspresijske oznake (His oznaka i vezanje maltoze na fuzijski protein) kao i ekspresijski sustav alternativan E. coli inkluzijskim tjelešcima. Rekombinatni hPSM divljeg tipa i/ili autovakcina je detektiran u transficiranoj Pichia pastoris u stanicama sisavca. Razmatrana je promjenljivost tehnologije DNA vakcine. Eksperimenti DNA vakcinacije s hPSM molekulama autovakcine se sada odvijaju i pokazuju obećavajuće preliminarne rezultate. Postavljeni su različiti in vitro testovi korisni u testiranju i odabiru između mutiranih PSM konstrukta, uključujući imunokemijski test i FACS analizu. Mišje tumorske stanice su stabilno transficirane divljim tipom hPSM pune duljine i sortirane se pomoću FACS prema ekspresiji hPSM na površini. Dobiveni su klonovi tih staničnih linija. Procijenjeni su in vivo ksenogeni tumorski modeli u miševima koristeći te hPSM noseće sinergične mišje tumorske stanice. Test smjera proliferacije T stanice je izveden da bi se odabrala mišja vrsta za tumorske modele. CTL test je optimiziran i dobiveni su uvjerljivi rezultati s modelnim antigenima koristeći različite metode imunizacije i uvjete testa. Nadalje, oruđe je nađeno za istraživanje razbijanja tolerancije na mišji PSM, a imunizacijom na mišju PSM autovakcinu.

PRIMJER 2

Produkcija Her2 autovakcine

Humana autovakcina protiv Her2 se može razviti modifikacijom molekule insercijom jednog ili više strano epitopa T stanice relaksirane specifičnosti da nastane skup imunogeniziranih Her2 molekula. Bit će testirana mogućnost tih modificiranih proteina da induciraju antitijela koji su međureaktivna s prirodnim dijelovima Her2 molekula. Zatim, u nekoliko in vitro testova i in vivo životinjskih modela će biti procijenjena efikasnost pojedinih konstrukata (što bi mogao biti slučaj s DNA vakcinacijom) i bit će procijenjeni modificirani proteini. Analizirat će se indukcija specifičnih odgovora protiv tumorskih stanica koje nose Her2. Također će sposobnost aktiviranja koplementa putem klasičnog puta i za započinjanje ADCC putem Fc-receptora induciraneg antitijela biti testirana. Konačno, bit će testirane različite modificirane molekule u životinjskom modelu karcinom dojke, a da se istraži njihov učinak u tretmanu tumora.

Imunogenične štakorske i humane molekule će biti konstruirane s epitopima relaksirane specifičnosti za T stanice u različitim položajima molekule.

Tijekom vakcinacije protiv cijele ektracelularne domene Her2 postoji do neke mjere mogućnost reakcije antitijela s ostalim EGFr receptorima jer su neki od tih receptora homologni do 40-46% u eksptracelularnoj domeni. Stoga je planirano da se sačuvane regije Her2 razbiju insertiranjem stranih epitoma za T stanice najmanje u jednom modificiranom proteinu (vidi detalje dolje).

Regije Her2 koje mogu biti epitopi za CTL ili B-stanice su izbjegnuti u dizajnu konstrukata na Sići 3. Objašnjenje za korištenje ovih položaja je sljedeće:

Humana Her2 sekvencija se može podijeliti u brojne domene zasnovane samo na primarnoj strukturi proteina.

Ekstracelularni (receptorski) dio;

1-173: Domena I (N-terminalna domena zrelog polipeptida).

174-323: Domena II (Cisteinom bogata domena, 24 cisteinska ostatka).

324-483: Domena III (domena vezanja liganda u homolognom EGF receptoru).

484-623: Domena IV (Cisteinom bogata domena, 20 cisteinska ostatka).

624-654: Transmembranska domena (TM ostaci od 654-675).

Intraceluarni (kinaza) dio;

655-1010: Domena tirozin kinaze (srž TF domene od 725-992).

1011-1235: C-terminalna domena

Načinjen je odabir mjesta aminokiselinske sekvencije HER2 koju treba zamijeniti P2 ili P30 humanim epitopom T pomoćne stanice, a uzimajući u obzir sljedeće parametre (približno poredani po prioritetima):

1. Poznati i predviđenji CTL1 epitopi

2. Homologija prema odgovarajućim receptorima (EGFR)

3. Sačuvanje cisteinskih ostataka

4. Predviđena petlja, strukture α-heiksa i β-ploče

5. moguća mjesta N-glikolizacije

6. predviđanje izloženih i sakrivenih aminokiselinskih ostataka

7. Domena organizacije

CTL epitopi se pojavljuju u nakupinama u domeni I, domeni III, TM domeni i u dvije od tri "vruće točke" u TK domeni. Prema izumu, to treba biti uvelike sačuvano.

Regije s visokim stupnjem homologije s ostalim receptorima su vjerojatno strukturno važne za "ukupnu" tercijarnu strukturu Her2, i zatim za prepoznavanje od antitijela, dok kao posljedica, regije s malom homologijom mogu biti izmijenjene samo s lokalnom alternacijom strukture.

Cisteinski ostaci su često obuhvaćeni u stvaranju intramolekulskih disulfidnih mostova i stoga su najvažniji za tercijarnu strukturu i preferirano ne trebaju biti promijenjeni.

Preferirano je da regije za koje je predviđeno da tvore strukture α-heiksa ili β-ploče preferirano budu izbjegnute kao mjesta insercije stranih epitopa, jer su te regije vjerojatno važne za nabiranje proteina.

Potencijalna mjesta N-glikolizacije trebaju preferirano također biti konzervirana zbog toga što je manozilacija proteina (primjerice ekspresijom u kvascu) poželjna, vidi prisutnost receptora manoze u APC.

Regije predviđene (zbog njihovih hidrofobnih svojstava) da budu s unutarnje strane molekule preferirano trebaju biti sačuvane jer mogu biti obuhvaćene u nabiranju. Nasuprot tome, regije izložene otapalu mogu služiti kao kandidati za položaje insercije modela P2 i P30 epitopa za TH.

Konačno, domena organizacije proteina je također uzeta u razmatranje zbog njegove važnosti za strukturu u funkciju proteina.

Fokus strategije je da se sačuva struktura ekstracelularnog dijela Her2 što je više moguće, jer je taj dio proteina važan u cilju neutralizacije antitijela. Nasuprot tome, intracelularni dio prirodnog Her2 vezanog na membranu na površini stanice karcinoma je nepristupačan za humorlani imuni sustav.

Zato samo prisutnost epitopa za CTL daje razlog da se taj dio uključi u vakcinu. Stoga je očito da ovdje treba smjestiti jedan ili više epitopa. Ako ispadne da je nemoguće eksprimirati Her22 molekulu pune duljine u E. coli ili kvascu, intracelularni dio se može skratiti nakon prve "vruće točke" epitopa za CTL1 (oko položaja 800). Daljnji epitope za CTL se zatim mogu dodati na C-terminalni kraj skraćene molekule.

Transmembranska reagira je vjerojatni neovisna nabrana jedinica i supstitucija tog s epitopima za TH kao što je P2 ili P30 vjerojatno neće mijenjati HER2 strukturu i nabiranje.

Nadalje, TM domena može uzrokovati velike probleme za ekspresiju u kvascu i coli i u svakom slučaju mora biti supstiturana. Stoga, epitop preferirano treba biti smješten u tu domenu u svim konstruktima (možda ostavljajući netaknut 1 konstrukciji jer ta sadrži nekoliko epitopa za CTL, te jer je nekako obuhvaćena u transmisiji signala nakon vezanja liganda).

Ekstraceularna domena u principu može biti čuvana nedirnuta s miješanjem P2 i P30 u intracelularnu i transmembransku domenu, zatim maksimiziranjem broja potencijalnih epitopa za B-stanicu, a djelovanjem na strukturu što je manje moguće. Međutim, visoki stupanj homoloije s EGFR, te Her-3 i Her-4 doprinosi riziku od međureaktivnosti tih receptora koja može (i ne mora) biti poželjna. Nadalje, za neka monokolonalna antitijela je opisano da djeluju kao agonisti receptora (možda stimuliranjem heterodimerizacije ili vezanjem liganda) i povećanjem veličine tumora iv vivo.

Položaji u ekstracelularnoj domeni su stoga odabrani tako da se očekuje da smanje taj rizik.

Taj odabir obuhvaća sve od prethodno spomenutih parametara i zasnovan je na dvije različite pretpostavke: (i) Insercija u nesačuvanu (s obzirom na odgovarajuće receptore) regiju će pomoći održavanju tercijarne strukture i može smanjiti neželjenu aktivaciju antitijela, (ii) Insercija u dobro sačuvanu regiju može promijeniti strukturu, ali može u isto vrijeme smanjiti rizik od međusobne reaktivnosti uništavanjem najsličnije sekvencije. Obje pretpostavke su nagađanja, ali kako je vrlo teško predvidjeti efekt smještaja epitopa u bilo koji položaj proteina, neke od tih položaja su uključeni u konstrukcije.

Nagađano je da može biti korisno potpuno ukloniti cisteinom bogati domenu. Za njih je predviđeno da tvore strukture petlje izloženih otapalu i mogu tvoriti neovisnu jedinicu nabiranja obuhvaćenih u dimerizaciji (kao što je pokazano s mnogim cisteinima koji mogu služiti za održavanje čvrste strukture neophodne za tvorbu dimerizacijske domene). Delecijom tih struktura se stoga može eliminirati rizik od aktivacije antitijela kao i smanjiti broj međureaktivnih antitijela, jer su od eksptraceluarnog dijela proteina te domene najbolje sačuvane. Nadalje, produkcija takvih cisteinima bogatih dijelova u stanicama E. coli ili kvasca može biti problematična.

Slijedi detaljni prikaz konstrukata korištenjem P2 i P30 epitopa kao neograničavajućih primjera: P2 epitop će prvo biti smješten u ekstracelularnu domenu od Her2 u kombinaciji sa supstituirajućim dijelom P30 epitopa ili svim regijama prolaska kroz membranu. P2 epitop će biti smjšten u regije zasnovane na gore diskutiranom kriteriju. Preferirani konstrukti imaju sljedeće strukture:

[image] [image]

Položaj epitopa pokazuje položaj prve u zadnje aminokiseline epitopa relativno prema početnoj točki zrelog Her2. Duljina je duljina aminokislina kompletnog konstrukta. U svim konstrukti osim onima čiji je položaj označen s *, je epitop supstituirao aminokiselinski lanac iste duljine kao što je duljina epitopa. "*" pokazuje da je epitop insertitrana ne supstituiran u Her2. Svi gore nabrojani konstrukti su stoga kraći od zrelog Her2, pri čemu nedostaje dio koji je iz C-terminalnog kraja.

Većina konstrukcija postoji u različitim verzijama, npr. u pcDNA3.1+ vektoru fuzioniran s prirodnim HER2 signalnom peptidnom sekvencijom, u vektoru pMT/BiP/V5-His/A fuzioniran s BiP vodećim peptidom za ekspresiju stanica Drosophila i bez vodeće sekvencije u pET28b vektoru za ekspresiju u stanicama E. coli.

Dolje su opisani modeli za koje je namjera da služe za prosijavanje i odabir modificiranih Her2 proteina.

1. Indukcija antitijela u trangeničnim miševima koji sadrže štakorski Her2 i u zečevima koji sadrže štakorski I humani Her2 će biti istraživana uobičajenom ELISA tehnologijom nakon barem tri imunizacije. Komercijalno pristupačna antitijela na humani i štakorski Her2 će se koristiti za pozitivne kontrole.

2. Ta zečja antitijela će se koristiti za istraživanje moguće inhibicije rasta humanih i transgeničnih mišjih tumorskih stanica koje prekomjerno eksprimiranih Her2 u in vitro modelu.

3. Proliferacija T stanice PBL od tetanusom imuniziranih pacijenata prema odabranim humanim Her2 molekulama će se istraživati konvencijalnim metodama.

4. Sposobnost modifikacije štakorske Her2 molekule transgeničnih miševa da induciraju odgovore CTL u trangeničnima miševe koji sadrže štakorski Her2 će se istraživati upotrebom tumora kao ciljeve u tim miševa.

5. Namjera je da se sintetizira odabrani skup peptida u transmembranskoj regiji humanog Her2 koji sadrži P2 i P30 epitope. Ti peptidi će biti testirani u proliferaciji PBL od ljudi koji su prethodno imunizirani toksiodom tetanusa, a da se odredi da li P2 i P30 epitopi mogu efikasno nastati iz unutar Her2 sekvencije kao što je ispoljeno u T stanicama.

6. Potpuno je moguće da će odabrani humani modificirani Her2 proteini biti testirani na sposobnost neutralizacije antitijela u mišu koji su genetički konstruirani da eksprimiraju samo humane VDJ gene. Takvi miševi su dobiveni u suradnji od Abgenix, Fremon, CA, USA.

Opisana su četiri dobro karakterizirana trangenična mišja modela za karcinom dojke koji sadrži štakorski Her2 onkogen. Prva tri transgenična miša eksprimiraju aktivirani Her2 onkogen, dok četvrti model koristi neaktivirani Her2. Svi modeli koriste MMTV promotor da pokrenu ekspresiju mliječnih žlijezda.

Mi smo odlučili koristiti dva transgenična mišja modela: 1) agresivniji tumorski model opisan od Muller et al korištenjem aktiviranog Her2 onkogena (Muller et al, 1989) i manje agresivni tumorski model u kojem se koristi inaktivirani Her2 da stvori foklane tumore mliječne žljezde duge latentnosti (Guy et al, 1992). Oba transgenična miša su kupljena od Jackson i/ili Charles Rivers laboratories.

U početnim eksprimantima, ti miševi su ostavljeni da produciraju antitijela i odgovore CTL imunizacijom i stimulacijom s modificiranim štakorskim Her2 proteinima. Pojavljivanje tumora će zatim biti istraženo kao što je opisano od ostalih autora (Muller et al, 1989; Guy et al, 1992; Katsumata et al, 1995). Razina antitijela će biti mjerena ELISA testom. Aktivnost CTL bi se odredila generiranjem ciljnih stanica koje eksprimiraju štakorski Her2, kao što je gore spomenuto.

Alternativno se ksenograft karcinom bezdlakih mišjih modela može koristiti za eksperiment pasivne vakcinacije. U bezdlake miševe se mogu transplantirati humani tumori i inhibicija tumora se može pokušati s pasivnim prijenosom seruma iz normalnih ili humaniziranih miševa imuniziranih s modificiranim Her proteinima. Dok bi to bio korisno za istraživanje uloge antitijela u uništavanju tumora, CTL aktivnost se ne može direktno mjeriti u tom sustavu.

U drugom in vivo modelu, tumori u miševima bi također bili generirani transplantacijom staničnih linija iz tumora trangeničnih miševa kao što je gore definirano. Stanične linije generirane iz tih miševa bi bile prenesene u odgovarajuće mišje vrste i lokalizacija bi se utvrdila korištenjem standardnog protokola.

Prijenos mišjih stanica tumora putem ekspresije štakorskog Her2: U tom sustavnu će stanice biti transficirane štakorskim genima i prenesene u MHC kompatibilne miševe. Inhibicija rasta tumora bi se postigla generiranjem anti-Her2 odgovora.

U tim sustavima modificirani Her2 proteini bi se koristili kao vakcina u adjuvansima za generiranje antitijela i odgovora CTL.

DNA vakcinacija je uspješno korištena u nekoliko sustava kojim je dobiven učinkovit imuni odgovor. Mi sada istražujemo načine DNA isporuke korištenjem modificiranih vlastitih proteina. Naša je namjera da se koristi DNA vakcinacijski pristup da se odrede efekti modificiranih Her2 konstrukata u inhibiciji tumora u transgeničnim mišjim modelima karcijnom dojke. Sličan pristup se možda može primijeniti u ljudima za tretman tih bolesti.

PRIMJER 3

Produkcija anti-FGF8b vakcine

Kao sljedeće bit će opisano kako se humana autovakcina protiv FGF8b može razviti modifikacijom molekule insercijom jednog ili više stranog epitopa relaksirane specifičnosti za T stanice, a da se dobije skup imunogeniziranih "FGF8b" molekula. Mogućnost indukcije antitijela tih konstrukata će biti testirana međusobnom reaktivnosti s autentičnim dijelovima FGF8b molekula. Zatim, u nekoliko in vitro testova i in vivo životinjskih modela bit će procijenjena efikasnost pojedinih konstrukata. Bit će testirana sposobnost induciranih antitijela da aktiviraju koplement klasičnim putem i da započnu ADCC putem Fc-receptora. Konačno, bit će testirane različite molekule u životinjskom modelu humanog karcinom prostate i dojke.

Konstrukcija autovakcine protiv FGF8b

Zbog kompletne identičnosti FGF8b polipeptida čovjeka i glodavca, svi konstrukti se mogu koristiti u eksperimentima s ljudima i miševima.

Tetanus toksoidni epitopi P2 i P30 relaksirane specifičnosti za T pomoćne stanice koji je uspješno korišten u humanoj TNFα vakcini će biti insertiran u FGF8b polipeptid. Zbog male veličine FGF8b konstrukt će se pripraviti s jednim epitopom po molekuli. Ostali epitopi relaksirane specifičnosti za T pomoćne stanica kao što je epitop za hemaglutinin HA virusa influence (307-319) i ovdje diskutirani ostali epitope za T stanice se također mogu razmatrati (O'Sulivan 1991).

Četiri različita imunogenizirana FGF8b konstrukta su pripravljena s epitopima razdijeljenim u molekuli. Ta četiri konstrukta su načinjena na osnovu višestruke parne raspodjele FGF obitelji proteina. Parna raspodjela FGF2 i FGF8b je korištena kao osnova za an analizu pretpostavljene sekundarne strukture (tj. raspodjela beta-ploče) kroz FGF8b molekulu. Ostaci koji su sačuvani između FGF2 i FGF8b ne stvaraju nakupine bilo gdje u trodimenzijskoj strukturi, što pokazuje da nema određenog dijela molekule koji ne može biti zamijenjen bez efekta na mogućnost nabiranja. Aminokiselinski ostaci u FGF2 koji su okrenuti prema cisteinskom ostatku u FGF8b su smješteni vrlo blizu jedan drugom promatrano trodimenzijski, pokazujući da tvore disulfidne veze u FGF8b, i da je taj razmještaj ispravan. Feksibilnost N-terminlanog dijela FGF2 je također razmatrana.

Varijanta FGF8b s P30 epitopom u N-terminalnom dijelu (F20N) je dizajnirana na osnovi raspodjele aminokiselinskih ostataka bez razmaka u FGF8b proteinua i P30 epitopu (SEQ ID NO:14), te uzimanjem u obzir različitost položaja prema kemijskim svojstvima svakog aminokiselinskog ostataka. Razmatrana je samo je N-terminlalna regija predviđene beta-buraste strukture. U slučaju F30N, postoji 9 sličnih od 21 ostataka. Korištenjem pseudo-algoritma, očekivalo bi se da supstitucijom dođe do minimalnih strukturalnih promjena. Sekvencije od četiri različita konstrukta, kao i trodimenzijska reprezentacija smještenih aminokiselina je prikazana na Slici 6.

Varijanta FGF8b s P2 epitomom (SEQ ID NO: 12) u C-terminlanom (F2C) dijelu je označena kao F30N. Međutim, planiran je dobar Kd epitop u položajima 195-203. Stoga je P2 epitop insertiran samo u C-terminalni dio tog epitopa. Ponovo je razmatrana samo je C-terminalna regija za beta-buras tu strukturu.

Interne varijante FGF8b (F30I i F2I) su konstruirane zamjenom vanjske petlje u FF2 strukturi s epitopoima P2 i P30, pri čemu se očekuje da će snova beta-burasta struktura FGF strukture ostati nepromijenjena.

Imunogenizirane FGF8b molekule su ekspremirane u Eschericia coli što omogućava produkciju proteina u velikim količinama uz minimalnu cijenu. Mada FGF8b sadrže dva potencijalna mjesta N-glikolizacije (Asn31 i Asn177), u bakteriji eksprimirna rekombinantna FGF8b je pokazala biološku aktivnost (MacArtur 1995a, Blunt 1997). Da se olakša pročišćavanje i restrukturiranje, pripravljena je verizija FGF8b obilježena His, stoga je vezivanje na Ni-nabijenu kolonu moguće.

Pročišćavanje molekula je izvedeno korištenjem velikog pozitivnog nabija molekula proteina i His oznake, a restrukturiranje će biti izvedeno korištenjem standardnih postupaka uzimajući u obzir nastajanje disulfidnih mostova.

Četiri imunogenizirane molekule, zajedno s FGF8b cDNA divljeg tipa, su insertirane u DNA vakcinacijske vektore.

Prosijavanje I odabir modificiranih FGF8b molekula

Četiri imunogenizirane FGF8b molekule su eksprimirane u bakteriji a zatim pročišćeni iz inkluzijska tjelešca. Konstrukti će u paraleli biti korišteni kao DNA vakcine. Sposobnost različitih konstrukta za indukciju različitih efekata koji su poželjni u tretmani pacijenata s karcinomom prostate i dojke će zatim biti uspoređena. Takva istraživanja će se izvesti korištenjem nekoliko različitih in vitro i in vivo pokusa. Konačno, rezultati eksperimenata će tvoriti osnovu za konačni odabir jednog ili dva kandidata za FGF8b humanu vakcinu.

In vitro modeli

Analiza sustava laboratorijskih glodavaca

Miševi različitog halotipa kao i zečevi, bit će imunizirani s različitim FGF8b konstruktima u kompletnom Freundovom adjuvansu a zatim stimulirani najmanje dva puta s istim antigenima emulgiranim u nekompletnom Freundovom adjuvansu. Stoga se može usporediti sposobnost različitih konstrukata da razbiju toleranciju B-stanice. DNA vkacinacija će biti izvedena u drugim životinjama korištenjem pročišćene DNA u kompletnom Freundovom adjuvans/nekompletnom Freundovom adjuvansu injektirano intramuskularno u intervalu od 14 dana.

Uzorci seruma će se dobiti u nekoliko vremenskih perioda tijekom imunizacije, i sposobnost različitih konstrukata da

induciraju na FGF8b specifična antitijela će biti određena korištenjem konvencijalne ELISA metode (Rochom 1994). Komercijalni poliklonalni antiserum kao i komercijalno monoklonalno antitijelo nastalo protiv FGF8b (R&D) bi se koristili za pozitivne kontrole. FGF8b protein je komercijalno pristupačan (R&D) ali će također nastajati uz ostale FGF8b konstrukte a zatim će biti pročišćen i restrukturiran. Taj produkt može zatim biti korišten za presvlačenje pločica u izravnom ELISA za testiranje seruma iz miševa/zečeva imuniziranih s FGF8b varijanata proteina.

Vrijedno oruđe za istraživanje efekata vakcinacije protiv FGF8b će biti o FGF8b ovisna stanična linija karcinoma. Nekoliko FGF8b pozitivnih staničnih linija će biti identificirane korištenjem kvantitativne RT-PCR, eksperimenata proliferacije stanice, te STAT-3 testom fosforilacije.

Prisutnost FGF8b povezanih ligazom u FGF receptoru na staničnoj površini će biti detektirani s FGF8b specifičnim antitijelima u FACS ili ELISA analizi. antitijela usmjerena na nekoliko različitih FGF receptora su komercijalno pristupačna (R&D).

Bit će uspoređena sposobnost konstrukata da induciraju antitijela sposobna za aktiviranje komplementarno povezivanje ligazom FGF8b stanica koje produciraju/nose. To se može detektirani jednim od mišjih tumorskih staničnih linija koje eksprimiraju FGF8b, što je ranije opisano, ili alternativno se koristi osmotski napunjene FGF8b stanice. Serumi normalnih i transgeničnih miševa (vidi dolje) imuniziranih s humanim FGF8b konstruktima će biti inkubirani sa staničnim linijama i zatim inkubirani sa svježim komplementom od zamorca. Antitijelom posredovano komplementno cijepanje može biti detektirane standardnim postupcima.

Sposobnost induciranih antitijela da poredaju ADCC se može istraživati mjerenjem oslobođenog 51Cr iz obilježenih stanica koje eksprimiraju FGF8b. Efektorske stanice će biti PBMC iz sinergičnih miševa. Za postavljanje testa može biti pogodno korištenje mišje stanične linije sposobne za posredovanjem ADCC (pozitivni na Fc(-receptore) kao efektorske stanice s antitijelima protiv FGF8b).

Da bi se pokazalo da FGF8b kandidati vakcine ni na koji način ne promoviraju auto-antitijelom inducirani rast tumora, mi ćemo također izvesti test proliferacije tumora. Uzorci seruma iz izmuniziranih miševa će biti inkubirani s tumorskim stanicama koje eksprimiraju FGF8b. Proliferacija tumorskih stanica može zatim biti detektirana na osnovu njihove sposobnosti ugradnje 3H-timidina koji je zatim dodan stanici.

Kako je poznato da FGF8b inducira proliferaciju velikog raspona stanica sisavaca, također će biti neophodno da se istraži učinak promocije porasta varijanta proteina. To može biti izvedeno proliferacijskim testom kao što je onaj korišten od Marsh 1999.

Biološki efekt FGF8b na stanice sisavaca bi trebao biti neutraliziran auto-antitijelima. To se može pokazati korištenjem rekombinantnog FGF8b i npr. istraživanjem NIH3T3 u staničnoj proliferaciji (i morfološkim promjenama). Adicija auto-antitijela bi trebala eliminirati transformirajuću aktivnost FGF8b.

Protokol imunizacije

Broj životinja koje će ući u FGF8b AutoVac eksperiment imunizacije mora ovisiti o očekivanoj prisutnosti bolesti u modelu i o brojevima potrebnim za dobivanje statistički značajne informacije. Imunizacijski protokol se mora bazirati na našem iskustvu koje mamo iz TFNa AutoVac projekta. Različiti imunizacijski protokoli su korišteni za imunizaciju miševa s različitim TFNa analozima za specifične svrhe, ali većina eksperimenata je izvedena korištenjem sljedećeg protokola:

1. Miševi trebaju biti pojedinačno obilježeni oznakom na uhu ili transpoenderima, a 10 životinja u svakom kavezu. Mužjaci i ženke se moraju procjenjivati odvojeno, ali ni u jednom slučaju mi nećemo imati oba spola u istom kavezu. Životinje treba ostaviti da se odmaraju barem 3 dana nakon transporta i markiranja.

2. Antigen 1 mg/mL u PBS puferu je emulgiran s jednakim volumenom Freundovog kompletnog antigena (CFA) (Difco ili Sigma). Emulzija je provjerena smještajem kapi emulzije na površinu vode i praćeno je da li se kapljica drži zajedno ili dispergira. Miješanje je održavano dok kapljica ne dispergira.

3. Standardna imunizacijska doza je 100 jug antigena u 100 μg volumena -f 100 μL adjuvasna. Stoga je totalni imunizacijski volumen od 100 μL dan s.c. (subkutano) preko leđa životinje.

4. Stimuliranje je provedeno 2-3 puta tjedno nakon primarne imunizacije, a zatim u inervalima od 2-3 tjedna. Stimulirani/imunizirani materijal je pripravljen i dan isto kao imunizirani materijal, osim što je korišten Freundov nekompletni adjuvans. Vjerojatno će tri stimulacije inducirati maksimalni titar. Stoga će najviši titrovi biti dobiveni 6-9 tjedana nakon prve imunizacije.

5. Uzimanje 50-100 JUL krvi iz orbitalne regije je obično izvedeno prije prve imunizacije i jedan tjedan nakon svake stimulacije. Uzimanje krvi iz repa se također može koristiti, a 10-20 μL može biti dovoljno da određivanje titra.

Početna točka programa intimizacije će ovisiti o razvitku bolesti i o strategiji koju želimo koristiti. Mi predlažemo da se početno pokuša generirati maksimalna imunost što je prije moguće, ali je teško početi imunizaciju prije približno 5 tjedana starosti. Budući visoki titri bi se trebali održavati stimulacijom u intervalima od 6-8 tjedana, nakon tri početne stimulacije. Mogući problem postoji ako je FGF8b neophodan za normalni razvoj mladog miša, što ide u koristi početka imunizacije kasnije u odraslom mišu.

Analiza humanog sustava

U odabiru između različitih FGF8b konstrukata će biti istražena sposobnost humanih stanica za prezentaciju antigena da ispolje insertirane imunogene epitope za T stanicu u humane T stanice. To će biti izvedeno korištenjem istog in vitro testom na P2 i P30 prezentaciju koji su korišteni za TNFa vakcinu. Humane T stanične linije, koje su specifične na P2 i P30 će biti utvrđene iz donora vakciniranih protiv tetanusa. Stanice koje ispoljavaju antigen (PBMC) od istih donora će biti inkubirane s različitim konstruktima i bit će im dodane T stanične linije. Razina ispoljavanja insertiranih epitopa T stanica se zatim može usporediti mjerenjem stimulacije T staničnih linija.

In vivo životinjski modeli

Barem se mogu koristiti tri različita sustava za praćenje dolazi li do indukcije FGF8b antitijela koja su sposobna kontrolirati o FGF8b ovisne in vivo efekte.

Miševima će biti transplntiran s FGF8b glodavca koji eksprimira tumorske stanice, i inhibicija razvitka tumora će biti testirana autovakcinacijom koja koristi modificirane FGF8b proteine ili FGF8b DNA vakcine. Idealni sustav obuhvaća upotrebu stanica izoliranih iz tumora glodavca.

Alternativno ćemo koristiti ostale stanične linije glodavca (npr. Balb/3T3) stabilno transficiranih FGF8b cDNA u ekspresijski vektor.

Mišji model ksenograft karcinoma će se koristiti za eksperiment pasivne vakcinacije. Bezdlakim miševima će biti transplantirani humani tumori i inhibicija tumora će se pokušati prijenosom seruma iz normalnih i humaniziranih imuniziranih miševa s modificiranim FGF8b proteinima ili FGF8b DNA vakcinama. To bi bilo vrlo korisno za istraživanje sposobnosti nastalih antitijela da spriječe tumore.

Drugi pristup da se postigne dokaz koncepta će obuhvaćati korištenjem transgeničnih miševa za FGF8b. Za te miševe, koji nose FGF8b cDNA pod kontrolom vrlo specifičnog virusnog promotora mišjeg tumorskog virusa (MMTV), je pokazano da spontano razvijaju tumore mišje mliječne žlijezde koji eksprimiraju FGF8b (Coombes, osobno saopćenje). Autovakcinacija tih miševa s varijantom FGF8b proteina ili FGF8b cDNA vakcinama bi nam omogućila vidjeti da li će autovakcina biti sposobna da smanji ili spriječi tumore.

Mogući pristup da se dobije dokaz koncepcije bi bila upotreba Wnt-1 transeničnih miševa (MacArtur 1995c). Pokazano je da indukcija karcinoma dojke MMTV virusom aktivira ekspresiju FGF8b u više od polovice mišjih tumora u razvitku. Ovisnost FGF8b o tumorima bi se mogla potvrditi ako naša autovakcina(e) može smanjiti pojavljivanje ili brzinu rasta tumora.

Činjenica da trangenični miševi često pokazuju nefiziološke imunološki obrazac tolerancije neće najvjerojatnije djelovati na ovaj projekt jer su FGF8b polipetidi identični za čovjeka i miša.

Kada je povoljni efekt imunizacije FGF8b konačno pokazan u mišjem modelu i kad su odabrani pogodni kandidati za humanu vakcinu, bit će moguće izvesti ograničeni broj toksikoloških istraživanja. Potom, a da bi se dobio konačan dokaz koncepcije, izvedena su istraživanja vakcine na pacijentima s karcinomom dojke i prostate.

Ako u eksperimentima koji koriste in vivo modele ima pozitivnog rezultata, važno je da će biti konstruirano više mutanata na bazi podataka koji su na raspolaganju.

PRIMJER 4

Priprava MUC1 analoga

Pripravljena je samo jedna autovac s MUC-1. Ona sadrži ukupno devet mucinskih ponovljenih dijelova od kojih svaki ima sekvenciju prikazanu u SEQ ID NO:33. Konstrukcija počinje s tri takve sekvnecije, a zatim slijedi P2 epitop, nakon čega sijedi još tri mucinske sekvencije, a zatim P30-etiptop, i završava s tri mucinske sekvnecije.

Konstrukcija je izvedena sa i bez N-terminalnog UNI-his oznake (SEQ ID NO: 23). Obje varijante su eksprimirane u E. coli. Identičnost eksprimiranih proteina je potvrđena Wetstern analizom i sekvenciranjem N-terminalnog kraja. Protein je eksprimiran u topljivom obiku, ali kao dimer što je ponešto iznenađujuće.

MUC-1 molekule s HIS-oznakom su pročišćene metalnom afinitetnom kromatografijom. Količina čistog proteina i čistoća je za sada nepoznata.

PRIMJER 5

Razbijanje autotolerancije u sustavu modela glodavaca

CTL eksperimenti u kojima su miševi imunizirani s dendritičnim stanicama koje su pulsno tretirane s epitopima klase I i klase II, su prethodno pokazali da ubrzavaju CTL indukciju kada su imunizirani i ponovo stimulirani sa samo epitopom klase I. Ta situacija je usporediva s imunizacijom s autovakcinom u kojoj je strani epitop klase II insertiran u vlastiti protein. Prihvat i procesiranje tih molekula od profesionalnih antigen ispoljavajućih stanica, kao što su dendritične stanice, vode sačuvanju stranog epitopa klase II zajedno s vlastitim epitopima klase II. Poznato je da se može dobiti autoreaktivne CTL, ali je prisustvo stranog epitopa klase II za pomoćne stanice vrlo vjerojatno bilo povećano tom CTL indukcijom.

Potencijalna prednost ovog izuma za indukciju samoreaktivnih CTL je sada istraživana u ovalbumin transgeničnim miševima. Postoje četiri različite trangenične linije s različitom razinom ekspresije ovalbumina i stanju tolerancije, vidi Kurts C et al. 1997, J. Exp. Med. 186:239-245 koji prikazuje RIP-mOVA trangenični miš (koji essprimira ovalbumin u pankreasu, bubregu i timusu i ima visoki stupanj tolerancije) i Kurts C et al., 1988, J. Exp. Med. 188: 409-414 koji prikazuje RIP-OVAniska i RIP-OVAvisoka transgenične miševe koji imaju nisku i visoku ekspresiju ovalbumina. Zadnja linija, RIP-OVAsrednja koja eksprimira ovalbumin pri srednjoj razini, je dobivena od Dr. William R. Hearth, koautora gore spomenutih referencija.

U tijelu postoje različiti stupnjevi tolerancije na različite antigene. Jedan od najnižih stupnjeva tolerancije je nađen u cirkulirajućim antigenima u velikoj količini. Ti antigeni će uči u humani timus, gdje će samoreaktivne T-stanice biti uklonjene. Ti antigeni su pod "centralnom tolerancijom". Antigeni specifični na tkivo, s druge strane, ne ulaze izravno u timus i općenito su pod "perifernom tolerancijom" pod utjecajem npr. T-stanične energije.

Pripravljena su dva AutoVac konstrukta. Oba se odnose na sekvenciju pod brojem J00845 u EMBL gdje je sekvencija od P30 (SEQ ID NO: 14) insetirana na dva različita položaja.

U konstrukt "OVA 3.1", je P30 insertiran u položaj koji odgovara aminokiselina br. 272-292 u ovalbuminu. U konstrukt "OVA 3.2", je P30 insertiran u položaj koji odgovara aminokiselina br. 321-341 u ovalbuminu. Ti konstrukti su insertirani u vektor pVaxl i korišteni za DNA imunizaciju.

Miševi su imunizirani intradermalno jedanput s 100 ug svake DNA. Tri tjedna nakon imunizacije uklonjena je slezena i CTL test je postavljen koristeći ciljne stanice koje eksprimiraju dominantni ovalbuminski epitop SIINFEKL i različiti FILKSINE peptid kao kontrolu. Imunizacije dovode do jasne CTL indukcije u divljem tipu C57BL/6 miševa - kao što je očekivano, jer su albumin i P30 strani tim miševima.

Nama je sada namjera imunizirati 4 linije ovalbumin trangeničnih miševa s tim AutoVac konstruktima. RIP-OVAniska, RIP-OVAsrednja i RIP - OVAvisoka ekspresija povećavaju ovalbumina i imaju različite stupnjeve tolerancije i, kao što je gore spomenuto, također RIP-mOVA ima visoki stupanj tolerancije.

U te četiri linije transgeničnih miševa, samo je P30 strani. Ovalbumin je vlastiti antigen u tim miševima i ta situacija će stoga sadržavati stvarnu autovakcinaciju za CTL indukciju prema ovalbuminu.

Preliminarni rezultat dobiveni u RIP-OVAniska miševima koji imaju najnižu razinu "periferne tolerancije" na ovalbumin pokazuju da će ovalbumin s insercijom P30 i prirodne molekule ovalbumina biti sposobni inducirati odgovore CTL -očekuje se da trangenični miševi koji imaju veći stupanj tolerancije biti sposobni davati samo odgovore CTL na modificirane molekula ovalbumina, a ne na prirodne oblike.

LITERATURA

Ago H et al. (1991). J Biochem (Tokyo), 110, 360-3.

Abdel-Nabi H et al. (1992). Sem. Urol. 10, 45-54.

Acevedo et al. (1995), Cancer 76; 1467-1475.

Acevedo et al.(1997), Cancer Detect. Prev. 21; 295-303.

Adelstein S et al. (1991), Science 251: 1223-1225.

Babaian RJ et al. (1994), J. Urol 152, 1952-1955.

Barnard JA et al. (1995) Gastroenterol. 108(2):564-580.

Bier H et al. (1995), Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 252(7): 433-9.

Bouchard L et al. (1989), Celi 57(6): 931-36.

Blaber M et al. (1996), Biochemistry 35, 2086-94.

Blunt AG et al. (1997), J Biol Chem 272, 3733-8.

Boring CC et al. (1993), CA Cancer J. Clin. 43:7-26.

Boucher et al. (1995), Hum. Pathol. 26; 1201-1206.

Callahan R (1996), Breast Cancer Res Treat, 39, 33-44.

Carter RE (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 749-753.

Chang et al., (1981), Fertil. Steril. 36; 659-663.

Chantry A, 1995, J.Biol. Chem. 270(7): 3068-73.

Crossley PH et al. (1996b), Celi, 84, 127-36.

Crossley PH et al. (1995), Development, 121, 439-51.

Crossley PH, Martinez, S. and Martin, G.R. (1996a) Midbrain development induced by FGF8 in the chick embryo. Nature, 380, 66-8.

Dean C et al. (1994), Int. J. Cancer, suppl 8: 103-107.

Dillioglugil O et al. (1995), Eur. Urol. 28, 85-101.

Doi et al. (1996), Int. J. Cancer 65; 454-459.

Douglas TH et al. (1995), J. Surg. Oncol. 59(4), 246-250.

Earp HS et al. (1995), Breast Cancer Res. Treat. 35 (1) : 115-32.

Eccles SA (1994), Invasion Metastasis 14 (1-6):337-48.

Eppenberger U et al. (1994),. J. Neurooncol. 22 ( 3) :249-54.

Dorkin TJ et al. (1999), Oncogene 18: 2755-2761.

Eriksson AE et al. (1993), Protein. Sci. 2: 1274-84.

Fernandez-Teran M. et al. (1997), Dev. Biol. 189, 246-55.

Fujii K et al. (1995), Exp. Celi. Res. 216(1): 261-72.

Furst J et al. (1994), Urol. Res. 22, 107-113.

Furthauer M et al. (1997), Development 124: 4253-64.

Geissler et al. (1997), Lab. Invest. 76: 859-871.

Gemel J et al. (1996), Genomics 35: 253-7.

Ghosh AK et al. (1996), Celi Growth Differ 7: 1425-34.

Goldfarb M et al. (1996), Cytokine Growth Factor Rev 7: 311-25.

Goodnow CC et al. (1988), Nature 334: 676-682.

Goodnow CC et al. (1991), Nature 352: 532-536.

Greenberg NM et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3439-3443.

Guy CT et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89: 10578-10582.

Heikinheimo M et al. (1994),. Mech Dev, 48: 129-38.

Henttu P and Vihko P (1989), Bioch. Biophys. Res. Comm. 160: 903-910.

Hopp TP and Woods KR (1983), Mol. Immunol. 20: 483-9.

Horoszewicz JSH et al. (1983), Cancer Res. 43: 1803-1818.

Horoszewicz JSH et al. (1987), Anticancer Res. 7: 927-936.

Hoshikawa M et al. (1998), Biochem Biophys Res Commun 244: 187-91.

Husmann I et al. (1996), Cytokine Growth Factor Rev 7: 249-58.

Israeli RS et al. (1994), Cancer Res. 54: 1807-1811.

Israeli RS et al. (1993), Cancer Res. 53: 227-230.

Israeli RS et al. (1994), Cancer Res. 54: 6306-6310.

Jacoby et al. (1984), Adv. Immunol. 35: 157-208.

Johnson RL and Tabin CJ (1997), Celi 90: 979-90.

Kahn D et al. (1994), J. Urol. 152: 1490-1495.

Kapoun AM and Shackleford GM (1997), Oncogene 14: 2985-9.

Kettunen P and Thesleff I (1998), Dev Dyn 211: 256-68.

Koga M et al. (1995), J Steroid Biochem Mol Biol 54: 1-6.

Kouhara H et al., (1994), Oncogene 9: 455-62.

Kozak M (1991), J Celi Biol 115: 887-903.

Lapthorn et al. (1994), Nature 369: 455-461.

Lazar et al. (1995), Cancer Res. 55: 3735-3738.

Leek J et al. (1995), British Journal of Cancer 72: 583-588.

Leung HY et al. (1996), Oncogene 12: 1833-5.

Lopes AD (1990), Cancer Res. 50: 6423-6429.

Loric S et al. (1995), Clin.Chem. 41(12): 1698-1704.

Lupu R et al. (1995), Semin. Cancer. Biol. 6: 135-145.

MacArthur ČA et al. (1995a), Celi Growth Differ 6: 817-25.

MacArthur ČA et al. (1995b), Development 121: 3603-13.

MacArthur ČA et al. (1995c), J Virol 69: 2501-7.

Manabe et al. (1985), Gastroenterology 89: 1319-1325.

Marsh SK et al. (1999), Oncogene 18, 1053-1060.

Martin L et al. (1993), J. Immunol. 150(49): 1234-43.

Mattei MG et al. (1995), Mamin Genome 6: 196-7.

McDonnell WM and Askari FD (1996), New Engl. J. Med 334: 42-45.

Meyers EN et al. (1998), Nat Genet 18: 136-41.

Milich DR et al. (1994), J. Immunol. 153(1): 429-435.

Milner PG et al. (1989), Biochem Biophys Res Commun 165: 1096-103.

Miyashita Y et al. (1994), Jpn J Cancer Res 85: 1117-23.

Modjtahedi H et al. (1993a), Br. J. Cancer 67(2): 254-261.

Modjtahedi H et al. (1993b), Celi. Biophys. 22(1-3): 129-46.

Modjtahedi H et al. (1996), Br. J. Cancer 73(2): 228-35.

Moy FJ et al. (1996), Biochemistry, 35: 13552-13561.

Muller WJ et al. (1988), Celi 54(1): 105-115.

Murphy GP et al. (1996), Prostate 28: 266-271.

Murphy GP et al. (1995), Prostate 26: 164-168.

Murphy GP et al. (1995), Anticancer Research 15(4): 1473-1379.

Nguyen L et al. (1990), Clin. Chem. 35: 1450-1455.

Nonomura N et al. (1990), Cancer Res 50: 2316-21.

O'Sullivan D et al. (1991), J. Immunology 147: 2663-9.

Ohnishi Y et al. (1995), Br. J. Cancer 71(5): 969-73.

Ohuchi H et al. (1997a), Development 124: 2235-44.

Ohuchi H et al. (1997b), Mech Dev 62: 3-13.

Ohuchi H et al. (1994), Biochem Biophys Res Commun 204: 882-8.

Payson RA et al. (1996), Oncogene 13: 47-53.

Pillai et al. (1996), FEBS Lett. 387: 23-26.

Pollard M and Luckert PH (1994), Anticancer Res. 14: 901-903.

Prigent SA and Lemoine NR (1992), Progress in Growth Factor Research 4: 1-24.

R&D focus, Drug News, (1996; 5, 21, 9.

Rammensee H-G. et al. (1995), Iirununogenetics 41: 178-228.

Regelson W (1995), Cancer 76: 1299-1301.

Ries LAG et al. (1996), SEER Cancer Statistics Review, 1973-1993:

Tables and Graphs, National Cancer Institute, Bethesda, MD.

Rinker-Schaeffer CW et al. (1995), Genomics, 30(1): 105-108.

Rochon YP et al. (1994), Prostate 25: 219-223.

Rock KL et al. (1996), Vaccine 14: 1560-1568.

Rock KL and Clark K (1996), J. Immunol. 156: 3721-3726,

Rudra-Ganguly N et al. (1998), Oncogene 16: 1487-92.

Salomon DS et al. (1995), Critical reviews in Onco-logy/Hematology 19: 183-232.

Sato B et al. (1993), J Steroid Biochem Mol Biol 47: 91-8. Schlegel J et al. (1994), J. Neurooncol. 22(3): 249-54.

Schmitt JF et al. (1996), J Steroid Biochem Mol Biol 57: 173-8.

Sheaff et al. (1996), J. Clin. Pathol. 49: 329-332. Sherman L et al. (1998), Genes Dev 12: 1058-71.

Shimamura K and Rubenstein JL (1997), Development 124: 2709-18.

Shirai A and Klinman DM (1993), AIDS Res. Hum. Retroviruses 9, 979-983.

Sokoloff M et al. (1996), Cancer 77(9): 1862-1872.

Steinhoff U et al. (1994), Eur. J. Immunol. 24(3): 773-76.

Stevens VC (1986), Ciba Found. Symp. 119: 200-225.

Su SL et al. (1995), Cancer Res. 55: 1441-1443.

Syrigos et al. (1998), Gut 42: 88-91.

Talwar et al. (1976), PNAS 73: 218-222.

Talwar et al. (1994), PNAS 91: 8532-8536.

Tanaka A et al. (1992), Proc Natl Acad Sci USA 89: 8928-32.

Tanaka A et al. (1998), Cancer Research 58: 2053-56.

Tanaka A et al. (1995), FEBS Lett 363: 226-30.

Thomas H et al. (1996), Br. J. Cancer, 73(1): 65-72.

Tjoa B et al. (1996), Prostate 28: 65-69.

Tjoa B et al. (1995), Prostate 27: 63-69.

Tokunaga A et al., (1995), Cancer 75(6 suppl.): 1418-25.

Tosi E et al. (1995), Int. J. Cancer 62 (5) :643-50.

Triozzi et al. (1994), Int. J. One. 5: 1447-1453.

Troyer JK et al. (1995), Int. J. Cancer 62: 552-558.

Valone FH et al. (1995), J. Clin. Oncol. 13(9): 2281-92.

Valve E et al. (1997), Biochem Biophys Res Commun 232: 173-7.

van Dam PA et al. J. Clin. Pathol. 1994 47(10): 914-19.

Weiner LM et al. (1995), Cancer Res. 55(20): 4586-4593.

Wright GL Jr et al. (1996), Urology 48: 326-334.

Wu J et al. (1997), J Steroid Biochem Mol Biol 62: 1-10.

Wu X et al. , Fan, Z., Masui, H., Rosen, N., Mendelsohn, J. Apoptosis induced by an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody in a human colorectal carcinoma ćeli line and its delay by insulin.

Wynant GE et al. (1991), Prostate 18: 229-241. Xu X et al. (1998), Development 125: 753-65.

Yamanishi H et al. (1995), J Steroid Biochem Mol Biol 52: 49-53.

Yogeeswaran and Salk (1981), Science 212: 1514-1516.

Yokoyama H et al. (1998), Dev Biol 196: 1-10.

Yoshimura K et al. (1996), Cancer Lett 103: 91-7.

Yoshiura K et al. (1997), Am J Med Genet 72: 354-62.

Young RA and Daviš RW (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 1194-1198.

Yule TD (1993), J. Immunol. 151(6): 3057-3069.

Zhang JD et al. (1991), [published erratum appears in Proc Natl Acad Sci USA 88 (12) :5477], Proc Natl Acad Sci USA 88, 3446-50.

Zhu Z et al. (1995), Int. J. Cancer 62(3): 319-324.

Zhu X et al. (1991), Science 251: 90-3.

Claims (83)

1. Metoda smanjivanja stanične ekspresije polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom u životinji uključujući ljude, naznačeno time da je rečeni polipeptidni antigen slabo imunogen ili nije imunogen u životinji, a induciranjem odgovora citotoksičnog T-limfocita (CTL) protiv stanica koje nose polipeptidni antigen povezan sa stanicom, na njihovoj površini ili smještanjem polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom u intracelularni dio, a metoda sadrži uzrokovanje pojave istovremenog ispoljavanje, a pomoću pogodne stanice koja ispoljava antigen (APC), 1) barem jednog epitopa CTL izvedenog iz polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, te 2) barem jednog prvog epitopa T-pomoćnih limfocita (th) koji je stran životinji.

2. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 1, naznačeno time da je životinja čovjek.

3. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 1 ili 2, naznačeno time da je rečeni barem jedan epitop za CTL, a kad je ispoljen, povezan s MHC klasom I molekula na površini APC i/ili kada je ispoljen rečeni barem prvi strani epitop za TH povezan s MHC klasom II molekula na površini APC.

4. Metoda u skladu s bilo kojim od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da APC jeste dendritična stanica ili makrofag.

5. Metoda u skladu s bilo kojim od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je polipeptidni antigen odabran od tumorom povezanih polipeptidnih antigena, vlastitog proteina, virusnog polipeptidnog antigena i polipeptidnog antigena izvedenog iz intracelularnog parazita ili bakterije.

6. Metoda u skladu s bilo kojim od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je prezentacija epitopa za CTL i prvog stranog epitop za TH pomoću APC uzrokovano prezentacijom životinjskog imunog sustava s najmanje prvim analogom polipeptidnog antigena, a rečeni prvi analog sadrži najmanje epitop za CTL i prvi strani epitop za TH.

7. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 6, naznačeno time da najmanje prvi analog sadrži veliki udio poznatih i predviđenih epitopa za CTL polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom.

8. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 7, naznačeno time da je veliki udio poznatih i predviđenih epitopa za CTL u aminokiselinskoj sekvenciji analoga prepoznat barem 90% od MHC-I halotipova koji prepoznaju sve poznate i predviđene epitope za CTL u polipeptidnom antigenu povezanog sa stanicom.

9. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 6-8, naznačeno time da su gotovo svi poznati epitopi za CTL polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom prisutni u analogu i/ili da su gotovo svi poznati epitopi za CTL polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom prisutni u najmanje prvom analogu.

10. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 6-9, naznačeno time da barem jedan prvi analog daljnje sadrži dio koji se sastoji od modifikacije strukture polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, a rečena modifikacija ima za rezultat da imunizacija životinje s prvim analogom inducira stvaranje antitijela u životinji protiv polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom.

11. Metoda u skladu s bilo kojim od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da sadrži učinkovitu prezentaciju na životinjski imuni sustav imunološki učinkovite količine najmanje jednog drugog analoga polipeptidnog antigena, a rečeni drugi analog sadrži modifikaciju strukture polipeptidnog antigena, a rečena modifikacija ima za rezultat imunizaciju životinje s drugim analogom induciranog stvaranja antitijela u životinji protiv polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom.

12. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 11, naznačeno time da modifikacija sadrži da je najmanje jedan drugi strani epitop za TH uključen u drugi analog.

13. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 6-12, naznačeno time da je prvi i/ili drugi analog (analozi) sadrži veliki dio epitopa za B-stanice polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom.

14. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 6-13, naznačeno time da varijacija i/ili modifikacija uključuje aminokiselinsku supstituciju i/ili deleciju i/ili inserciju i/ili adiciju.

15. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 6-14r naznačeno time da varijacija i/ili modifikacija sadrži da je uključen barem jedan prvi segment u prvi i/ili drugi analog (analoge), a rečeni prvi segment djeluje usmjeravanjem analoga na stanicu koja ispoljava antigen (APC), i/ili da je uključen barem jedan drugi segment u prvi i/ili drugi analog (analoge), a rečeni drugi segment djeluje stimulirajuće na imuni sustav, i/ili da je uključen barem jedan treći segment u prvi i/ili drugi analog (analoge), a rečeni treći segment optimizira ispoljavanje analoga na imuni sustav.

16. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 6-15, naznačeno time da varijacija i/ili modifikacija uključuje duplikaciju najmanje jednog epitopa za B-stanicu ili najmanje jednog epitopa za CTL polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom.

17. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 6-16, naznačeno time da varijacija i/ili modifikacija uključuje uvođenje haptena.

18. Metoda u skladu s bilo kojim od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je prvi i/ili drugi strani epitop (epitopi) TH za imunodominantan.

19. Metoda u skladu s bilo kojim od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je prvi i/ili drugi strani epitop (epitopi) za TH relaksirane specifičnosti.

20. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 12-19r naznačeno time da je prvi i/ili drugi strani epitop (epitopi) za TH odabran od prirodnog epitopa za TH i sintetske MHC-II vezujuće peptidne sekvencije.

21. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 20, naznačeno time da je prirodni epitop za TH odabran od epitopa toksoida tetanusa, kao što je P2 ili P30, epitopa toksoida difterije i epitopa hemaglutinina virusa infulence, te CS epitopa P. falciparum.

22. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 12-21, naznačeno time da je prvi i/ili drugi epitop za TH i/ili prvi i/ili drugi i/ili treći segmenti prisutan u obliku bočnih skupina spojenih kovalentno ili nekovalentno na pogodne kemijske skupine u aminokisleinskoj sekvenciji polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom ili u njegovoj subsekvenciji, i/ili fuzijskih partnera aminokiselinske sekvencije izvedene iz polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom.

23. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 22, naznačeno time da je prvi segment značajno specifičan partner vezivanja za APC specifični površinski antigena kao što je ugljikohidrat, za koji postoji receptor na APC, npr. manan ili manoza.

24. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 15-23, naznačeno time da je drugi segment citokin koji je odabran od: interferon γ (IFN-γ), Flt3L, interleukin 1 (IL-1), interleukin 2 (IL-2), interleukin 4 (IL-4), interleukin 6 (IL-6), interleukin 12 (IL-12), interleukin 13 (IL-13), interleukin 15 (IL-15), te stimulirajući faktor kolonije granulacitnog makrofaga (GM-CSF) ili njihovi učinkovit dijelovi; proteini podvrgnuti toplinskom šoku odabrani od: HSP70, HSP90, HSC70, GPR94 i kalretikulin (CRT) ili njihovi učinkovit dijelovi; ili hormon.

25. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 15-24, naznačeno time da je treći segment lipid kao što je palmitoilna skupina, miristilna skupina, farnezilna skupina, geranil-geraniolska skupina, GPI-sidro i N-acil-digliceridna skupina.

26. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 6-25, naznačeno time da prvi i/ili drugi analog (analozi) ima gotovo ukupnu tercijarnu strukturu polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom.

27. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 6-26, naznačeno time da je prezentacija pomoću APC uzrokovana davanjem životinji imunološki učinkovitu količine najmanje jednog prvog analoga.

28. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 27, naznačeno time da je također dana imunološki učinkovita količina najmanje jednog drugog analoga.

29. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 27 ili 28, naznačeno time da je rečeni barem jedan prvi i/ili drugi analog (analozi) formuliran skupa s farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačem i/ili vehikulom, a može biti i adjuvansom.

30. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 29, naznačeno time da adjuvans olakšava prihvaćanje najmanje prvog i/ili drugog analoga na APC, kao što su dendritične stanice.

31. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 30, naznačeno time da je adjuvans odabran od skupine koja se sastoji od imuno-usmjeravajućih adjuvansa; imuno modulirajućih adjuvansa kao što su: toksin, citokin i mikobakterijski derivati; formulacije ulja; polimeri; adjuvansa koji tvore micele; saponin; matrični imunostimulirajući kompleks (ISCOM matrica); čestice; DDA; aluminijski adjuvansi; DNA adjuvansi; γ-inulina i adjuvans koji se može kapsulirati.

32. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 31, naznačeno time da je citokin kao što je definiran u zahtjevu 24, ili njegov učinkoviti dio, pri čemu je toksin odabran iz skupine koja se sastoji od listeriolicina (LLO), lipida A (MPL, L180.5/RaILPS) i na temperaturu labilnog enterotoksina, pri čemu je mikrobakterijski derivat odabran is skupine koja se sastoji od muramilnog dipeptida, kompletnog Freundovog adjuvansa, RIBI i diestera trehaloze kao što je TDM i TDE, pri čemu je imuno-usmjeravanje adjuvasna odabrano od skupine koja se sastoji od CD40 liganda, CD40 antitijela ili njihovih specifično vezujućih fragmenata, manoze, Fab fragmenta i CTLA-4, pri čemu uljna formulacija sadrži skvalen ili nekompletni Freundov adjuvans, pri čemu je polimer odabran iz skupine koja se sastoji od ugjikohidrata kao što je dekstran, PEG, kukuruzni škrob, manan i manoza; plastični polimer kao što je lateks i zrna lateksa, pri čemu je saponin Quillaja saponaria saponin, Quil A i QS21, i pri čemu čestice sadrže lateks ili dekstran.

33. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 27-32, naznačeno time da uključuje davanje na način odabran od: oralnog puta i parenteralnog puta kao što je intradermalno, subdermalno, intrakutano, subkutano; peritonalno, bukalno, sublingvalno, epiduralno, spinalno, analno i intrakarnialno.

34. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 27-33, naznačeno time da uključuje barem jedno davanje godišnje, kao što je barem 2, 3, 4, 5, 6 i 12 davanja godišnje.

35. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1-5, naznačeno time da je ispoljavanje uzrokovano davanjem životinji nepatogenog mikroorganizma ili virusa koji nosi fragment nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira najmanje jedan epitop za CTL i najmanje jedan epitop za th-

36. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 6-14, naznačeno time da je ispoljavanje uzrokovano davanjem životinji nepatogenog mikroorganizma ili virusa koji nosi fragment nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira najmanje prvi analog.

37. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 15-26, naznačeno time da je epitop za th i/ili prvi i/ili drugi i/ili treći segment prisutan u obliku fuzijskog partnera aminokiselinskoj sekvenciji koja je izvedena od poli-peptidnog antigena povezanog sa stanicom, pri čemu je ispoljavanje uzrokovano davanjem životinji nepatogenog mikroorganizma ili virusa koji nosi fragment nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira najmanje prvi i/ili drugi analog.

38. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 11-14, naznačeno time da je ispoljavanje uzrokovano davanjem životinji nepatogenog mikroorganizma ili virusa koji nosi fragment nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira najmanje drugi analog.

39. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 38, naznačeno time da je nepatogeni mikroorganizam ili virus dan životinji jedanput.

40. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1-5, naznačeno time da je ispoljavanje uzrokovano in vivo uvođenjem u APC najmanje jednog fragmenta nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira najmanje jedna epitop za CTL i/ili najmanje jedna epitop za B-stanice i najmanje jedan prvi strani epitop za TH.

41. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 6-14 r naznačeno time da je ispoljavanje uzrokovano in vivo uvođenjem u APC najmanje jednog fragmenta nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira prvi analog.

42. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 15-26, naznačeno time da je epitop za TH i/ili prvi i/ili drugi i/ili treći segment prisutan u obliku fuzijskog partnera aminokiselinske sekvencije izvedene od polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, pri čemu je ispoljavanje uzrokovano in vivo uvođenjem u APC najmanje jednog fragmenta nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira prvi i/ili drugi analog.

43. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 11-14 i 41, naznačeno time da daljnje sadrži in vivo uvođenje u APC najmanje jednog fragmenta nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira drugi analog.

44. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 1-5, naznačeno time da je ispoljavanje uzrokovano in vivo istovremenim uvođenjem u APC najmanje jednog fragmenta nukleinske kiseline koja kodira i eksprimira najmanje jedan epitop za CTL a drugi kodira i eksprimira najmanje jedan prvi strani epitop za TH/ pri čemu je strani epitop za TH definiran u bilo kojem od zahtjeva 1,2 i 21-24.

45. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 40-44, naznačeno time da uvedeni fragment (fragmenti) nukleinske kiseline odabran od sljedećih: sama DNA, DNA formulirana s nabijenim ili nenabijenim lipidima, DNA formulirana u liposomima, DNA uvedena u virusnu vektor, DNA formulirana s proteinom ili polipeptidom koji olakšava transfekciju, DNA formulirana s usmjeravajućim proteinom ili polipeptidnom, DNA formulirana s usmjeravajućim uljikohidratom. DNA formulirana sa sredstvom koje taloži kalcij, DNA povezana s inertnom molekulom nosačem, te DNA formulirana s adjuvanstom.

46. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 45, naznačeno time da je adjuvans odabran iz skupine koja se sastoji od adjuvansa definiranih u zahtjevima 30-32.

47. Metoda u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 40-46, naznačeno time da je način davanja kao što je definirano u zahtjevima 33 ili 34.

48. Metoda odabira imunogenog analoga polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom koji je slabo imunogen ili nije imunogen u životinji, naznačeno time da je rečeni imunogeni analog sposoban inducirati odgovor CTL u životinji na stanice koji imaju MHC klasu II molekula vezanih na epitop izveden od polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, a metoda sadrži sljedeće: a) identifikacija najmanje jedne subsekvencije aminokiselinske sekvencije polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, pri čemu rečena subsekvencija ne sadrži poznate ili predviđene epitope za CTL, b) priprava najmanje jednog prihvaćenog imunogenog analoga polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, a uvođenjem u aminokiselinsku sekvenciju polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom najmanje jednog životinji stranog epitopa za TH u položaj unutar najmanje jedne podsekvencije identificirane u koraku a), te c) odabir tog (tih) analoga pripravljenog u koraku b) za koji se može dokazati da je sposoban inducirati odgovor CTL u životinji.

49. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 48, naznačeno time da 1) podsekvencija pokazana u koraku a) dalje ne sadrži ostatke cisteina ili, alternativno, da epitop za TH uveden u koraku b) nije značajno promijenio obrazac cisteinskih ostataka, i/ili 2) podsekvencija identificirana u koraku a) nadalje ne sadrži poznata ili previđena mjesta glikolizacije ili alternativno, da pri uvođenju epitop za TH u koraku b) nije značajno promijenjen njegov obrazac glikolizacije, i/ili 3) podsekvencija pokazana u koraku a) pridonosi značajno patofiziološkom efektu koji potječe od polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, pri čemu uvođenje stranog epitopa za TH u koraku b) smanjuje ili uklanja rečeni patofiziološki efekt, i/ili 4) podsekvencija pokazana u koraku a) je homologna aminokiselinskoj sekvenciji različitog proteinskog antigena u životinji, a gdje je uvođenje epitopa za TH u koraku b) značajno uklonilo homologiju, i/ili 5) uvođenje stranog epitopa za TH nastalog u koraku b) uzrokuje sačuvanje značajnog dijela epitopa za B-stanice polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom.

50. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 49, naznačeno time da kad je uključena varijanta 5, pri čemu analog ima istu ukupnu tercijarnu strukturu polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom.

51. Metoda priprave analoga nastalih iz stanice od polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, naznačeno time da metoda sadrži uvođenje u vektor sekvencije nukleinske kiseline koja kodira analog koji je odabran prema metodi iz bilo kojeg zahtjeva od 48-50 i transformacije vektorom pogodne stanice domaćina.

52. Metoda priprave analoga polipeptidnog antigena povezanog sa stanicom, naznačeno time da metoda sadrži kultiviranje stanice dobivene prema metodi iz zahtjeva 51 pod uvjetima koji olakšavaju ekspresiju sekvencije nukleinske kiseline koja kodira polipeptidni antigen povezan sa stanicom, te izolaciju analoga iz krutine supernatanta iz stanice.

53. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 52, naznačeno time da daljnje sadrži korak pročišćavanja izoliranog analoga, te moguće podvrgavanje pročišćenog produkta umjetnoj post-translacijskoj modifikaciji kao što je restruktuiranje, a djelovanjem enzimima, kemijskom modifikacijom i konjugacijom.

54. Metoda u skladu s bilo kojim od prethodnih patentnih zahtjeva, naznačeno time da je slabi antigen povezan s stanicom odabran od skupine koja se sastoji od: 5-alfa reduktaza, α-fetoprotein, AM-1, APC, APRIL, BAGE, β-katenin, Bc|2, bcr-abl (b3a2), CA-125, CASP-8, FLICE, katepsin, CD19, CD20, CD21, CD23, CD22, CD33, CD35, CD44, CD45, CD46, CD5, CD52, CD55 (791Tgp72), CD59, CDC27, CDK4,CEA, c-myc, Cox-2, DCC, DcR3, E6/E7, EGFR, EMBP, Ena78, farzil transferaza, FGFSa ili FGF8b, FLK-1/KDR, receptor folne kiseline, G250, GAGE obitelj, gastrin 17, hormon koji oslobađa gastrin (Bombesin), GD2/GD3/GM2, GnRH, GnTV, GP1, gp100/Pme117, gp-100-in4, gp15, gp75/TRP-1, hCG, heparanaza, Her2/neu, HMTV, Hsp70, hTERT (telomeraza), IGFR1, IL-13R, iNOS, Ki 67, KIAA0205, K-ras, H-ras, N-ras, KSA (CO17-1A), LDR-FUT, MAGE obitelj (MAHE-1, MAGE-2, MAGE-3, itd), mamaglobin, MAP17, Melan-A/MART-1, mezotelin, MIC A/B, MT-MMP', Mox1, mucin kao što je MUC-1, MUC-2, MUC-3 i MUC-4 koji su aberantno glikolizirani, MUM-1, NY-ESO-1, osteonektin, p15, P170/MDR1, p53, p97/meanotransferin, PAI-1, PDGF, plazminogen (uPA), PRAME, Probasin, Progenipoietin, PSA, PSM, RAGE-1, Rb, RCAS1, SART-1, obitelj SSX gena, Stat3, STn (povezan mucinom), TAG-72, TGF-α, TGF-β, timozin-β 15, TNF-α, TPA, TPI, TRP-2, tirozinaza, VEGF, ZAG, p16INK4, te gutation S-transferaza.

55. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 54, naznačeno time da je polipeptidni antigen povezan sa stanicom humani PSM.

56. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 55, naznačeno time da je strani epitop za TH stanicu uveden u dio aminokiselinske sekvencije PSM definirane SEQ ID NO: 2 u položaje 16-52 i/ili 87-108 i/ili 210-230 i/ili 269-289 i/ili 298-324 i/ili 442-465 i/ili 488-514 i/ili 598-630 i/ili 643-662 i/ili 672-699.

57. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 55 ili 56, naznačeno time da se koristi za tretmanu i poboljšanje karcinoma prostate.

58. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 54, naznačeno time da je polipeptidni antigen povezan sa stanicom fibroblastni faktor rasta 8b (FF8b).

59. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 58, naznačeno time da je strani epitop za TH stanicu uveden u aminokiselinske sekvencije FGF8b definirane SEQ ID NO: 6 u položaje 1-54 i/ili 187-215 i/ili 55-58 i/ili 63-68 i/ili 72-76 i/ili 85-91 i/ili 95-102 i/ili 106-111 i/ili 115-120 i/ili 128-134 i/ili 138-144 i/ili 149-154 i/ili 158-162 i/ili 173-177, pri čemu uvođenje ne obuhvaća aminokiseline 26-45 te aminokiseline 186-215.

60. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 58 ili 59, naznačeno time da se koristi za tretman i poboljšanje karcinoma kao što je karcinom prostate i karcinom dojke.

61. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 54, naznačeno time da je polipeptidni antigen povezan sa stanicom Her2.

62. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 61, naznačeno time da je strani epitop za TH stanicu uveden u aminokiselinske sekvencije Her2 definirane SEQ ID NO: 3 u položaje 5-25 i/ili 59-73 i/ili 103-117 i/ili 149-163 i/ili 210-224 i/ili 250-264 i/ili 325-339 i/ili 369-383 i/ili465-479 i/ili 579-593 i/ili632-652 i/ili 653-667 i/ili661-675 i/ili 695-709 i/ili 710-730.

63. Metoda u skladu s patentnim zahtjevom 61 ili 62, naznačeno time da se koristi za tretman i poboljšanje karcinoma dojke.

64. Analog humanog PSM koji je imunogen u ljudima, naznačeno time da rečeni analog sadrži gotovo cijeli dio poznatih ili predviđenih epitopa za CTL i B-stanice od PSM i uključuje barem jedan strani epitop za TH, kao što je definirano u bilo kojem od zahtjeva 18-21.

65. Analog u skladu s patentnim zahtjevom 64, naznačeno time da je prisutan barem jedan strani epitop za th uveden insercijom u aminokiselinsku sekvenciju PSM ili kao rezultat delecije dijela aminokiselinske sekvencije PSM.

66. Analog u skladu s patentnim zahtjevom 65, naznačeno time da je strani epitop za TH uveden u položaje koji su definirani u zahtjevu 56.

67. Analog humanog Her2 koji je imunogen u ljudima, naznačeno time da rečeni analog sadrži gotovo cijeli dio poznatih ili predviđenih epitopa za CTL i B-stanice od Her2 i uključuje barem jedan strani epitop za TH, kao što je definirano u bilo kojem od zahtjeva 18-21.

68. Analog u skladu s patentnim zahtjevom 67, naznačeno time da je prisutan barem jedan strani epitop za TH uveden insercijom u aminokiselinsku sekvenciju Her2 ili kao rezultat delecije dijela aminokiselinske sekvencije Her2.

69. Analog u skladu s patentnim zahtjevom 68, naznačeno time da je strani epitop za TH uveden u položaje definirane u zahtjevu 62.

70. Analog humanog FGF8b koji je imunogen u ljudima, naznačeno time da rečeni analog sadrži gotovo cijeli dio poznatih ili predviđenih epitopa za CTL i B-stanice od FGF8b i uključuje barem jedan strani epitop za TH, kao što je definirano u bilo kojem od zahtjeva 18-21.

71. Analog u skladu s patentnim zahtjevom 70, naznačeno time da je prisutan barem jedan strani epitop za TH uveden insercijom u aminokiselinsku sekvenciju FGF8b ili kao rezultat delecije dijela aminokiselinske sekvencije FGF8b.

72. Analog u skladu s patentnim zahtjevom 71, naznačeno time da je strani epitop za TH uveden u položaje definirane u zahtjevu 59.

73. Imunogeni pripravak, naznačeno time da kao učinkovito imunogeno sredstvo sadrži analog u skladu s bilo kojim zahtjevom od 64-72, u smjesi s farmaceutski i imunološki prihvatljivim nosačem i vehikulom, a može i s adjuvansom.

74. Fragment nukleinske kiseline, naznačeno time da kodira analog u skladu s bilo kojim zahtjevom od 64-72.

75. Vektor, naznačeno time da nosi fragment nukleinske kiseline u skladu sa zahtjevom 74.

76. Vektor u skladu s patentnim zahtjevom 75, naznačeno time da je sposoban za autonomnu replikaciju.

77. Vektor u skladu s patentnim zahtjevom 75 ili 76, naznačeno time da je odabran iz skupine koju čine: plazmid, fa, kosmid, mini kromosom i virus.

78. Vektor u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 75-77, naznačeno time da u 5'-3' smjeru na djelatnom mjestu vezivanja sadrži promotor ekspresije fragmenta nukleinske kiseline u skladu sa zahtjevom 74, a nukleinska kiselina može kodirati vodeći peptid omogućavajući izlučivanja ili integraciju u membranu polipeptidnog fragmenta, a fragment nukleinske kiseline je u skladu sa zahtjevom 74, a sekvencija nukleinske kiseline može kodirati terminator.

79. Vektor u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 75-78, naznačeno time da je pri uvođenju u stanicu domaćinima integriran u genom stanice domaćina ili nije sposoban za integraciju u genom stanice domaćina.

80. Tranformirana stanica, naznačeno time da nosi vektor iz bilo kojeg od zahtjeva 75-79.

81. Pripravak za indukciju produkcije antitijela protiv PSM, Her2 ili FGF8b, naznačeno time da pripravak sadrži 1) fragment nukleinske kiseline u skladu sa zahtjevom 74 ili vektor u skladu sa bilo kojim od zahtjeva 75-79, te 2) farmaceutski i imunološki prihvatljiv razrjeđivač i/ili vehikul i/ili adjuvans.

82. Stabilna stanična linija koja nosi vektor u skladu s bilo kojim od patentnih zahtjeva 75-79, naznačeno time da eksprimira fragment nukleinske kiseline u skladu sa zahtjevom 74, a koji može izlučivati ili nositi analog u skladu s bilo kojim od zahtjeva 64-72, a na svojoj površini.

83. Metoda za pripravu stanice prema patentnom zahtjevu 80, naznačeno time da sadrži transformaciju stanice domaćina s fragmentom nukleinske kiseline prema zahtjevu 74 ili s vektorom prema bilo kojem od zahtjeva 75-79.