JP2007528838A - 腫瘍特異的ワクチンとしての合成タンパク質 - Google Patents

Abstract

本発明は、ワクチン接種用組成物中で有利に使用できる、生物学的夾雑物を含まないタンパク質を化学的に合成する、ＧＭＰに適合した方法を提供する。この方法は、ペプチドの従来の合成を用い、それらを連結させて、好ましくは、ある抗原のすべてのＴ細胞エピトープを含む合成タンパク質を産生する。合成蛋白質にアジュバントを結合させて完全に合成のワクチンを産生することが好ましい。本発明は、主として、ＨＰＶタンパク質によって誘発された免疫をモデルとして用いることによって例示される。

Description

本発明は、概ね医学分野に関し、より詳細には、抗原に対するＴ細胞応答の誘発及び／又は促進に関し、これは、合成ペプチドを使用し、これらを連結させて、前記抗原のＴ細胞エピトープのすべてを含む合成タンパク質を産生させて行う。合成タンパク質にアジュバントを共有結合させて合成ワクチンを産生するのが好ましい。主として、ＨＰＶによって誘発された免疫をモデルとして用いることによって本発明を例示する。しかし、本発明は、ＨＰＶに限定されるものではなく、免疫に関連しているか、或いは関連している可能性のある広範な疾患に重要なものとして理解するべきである。

ＨＰＶ感染は、若く、性的に活発な男女の個体間で広く蔓延している。大規模な前向き研究において、男性パートナーからのＨＰＶの獲得が３年間の追跡期間中、対象の４０〜６０％で起こり、それが一般的であることが示された（Ｋｏｕｔｓｋｙら、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ １０２（５ａ）３、１９９７年、Ｈｏら、Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ３３８（７）、１９９８年、Ｍａｒｒａｚｚｏら、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １８３（３）、２０００年）。したがって、ＨＰＶは、おそらく最も一般的な性行為感染症である。高リスク型の乳頭腫ウイルス（例えば、ＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、及び−４５）は、子宮頚部癌の原因となっている（Ｂｏｓｃｈら、Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８７、１９９５年、Ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ、Ｂｉｏｃｈ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２８８，Ｆ５５、１９９６年）。基底上皮細胞の感染に続いて、即時型ＨＰＶ初期遺伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ６、及びＥ７が発現される。Ｅ６及びＥ７腫瘍性タンパク質の発現の長期化及び上昇は、ＨＰＶによって誘発された異形成及び子宮頚部癌への形質転換と緊密に関連している。

免疫抑制された腎臓移植患者及びＨＩＶに感染した患者における生殖器のＨＰＶ感染の発生頻度が、正常対照と比較して１７倍大きいという事実によって、ヒトにおけるＨＰＶ関連疾患、及びＨＰＶによって誘発された癌に対する防御での免疫系の防護的役割が示唆されている（Ｍａｔｏｒｒａｓら、Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １６４、４２、１９９１年、Ｈａｌｐｅｒｔら、Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ６８（２）、１９８６年）。免疫抑制された個体の、ＨＰＶ感染を自然治癒する能力の低下は、感染の初期における免疫系の防護的役割を間接的に指摘するものである。ＨＰＶ特異的なＴｈ免疫の積極的な役割が、ＣＤ４＋Ｔ細胞の優勢による陰部疣贅の退縮（Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１０２、１９９４年）によって、また、自然退縮しているＣＩＮ病変を有する対象の大多数で、ＨＰＶ１６ Ｅ７に対する遅延型過敏性応答が検出された（Ｈｏｐｆｌら、第１８回乳頭腫ウイルス国際会議、２０００年）ことによって示された。ヒトにおけるＨＰＶ１６に特異的なＴ細胞性免疫に関する試験によって、ＨＰＶ１６に特異的な防御免疫は、３つのＨＰＶ１６初期タンパク質Ｅ２、Ｅ６、及びＥ７に対して反応する、ＩＦＮ−γ及びインターロイキン５を伴った強いＴｈ１／Ｔｈ２型メモリーＴヘルパー細胞反応を特徴とする（ｄｅ Ｊｏｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２、４７２９頁、２００２年；Ｗｅｌｔｅｒｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３、６３６〜４１、２００３年）ことが示唆された。ＨＰＶ１６陽性の前悪性病変又は子宮頚部癌を有する患者の大多数がこのタイプのＴ細胞反応を誘導せず、このＴ細胞による補助の欠失によって、これらの患者におけるＨＰＶ１６特異的ＣＤ８＋細胞傷害Ｔリンパ球の一般的不在が説明されうる（Ｒｅｓｓｉｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６、１９９６年；Ｎｉｍａｋｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７、１９９７年）。重要なことに、ビーグル犬及びウサギで乳頭腫ウイルスに対して自然に誘導された防御免疫に関する研究は、ウイルスによって誘発された病変の退縮中にＥ２及びＥ６特異的なＴ細胞反応がピークに達したという点で、本発明者らの新知見を確証する（Ｍｏｏｒｅ ＲＡ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００３年）。さらに、早期抗原Ｅ２、Ｅ６、及びＥ７をコードするＤＮＡワクチンの使用は、これらの動物モデルにおける持続感染及びそれに伴う上皮異形成を予防した（Ｈａｎら、１９９９年、Ｓｅｌｖａｋｕｍａｒら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９（１）、１９９５年）。これらのデータは、Ｅ２、Ｅ６、及びＥ７に対する免疫が、パピローマウイルス感染の免疫予防として、また、ＨＰＶによって誘発された病変及び癌の治療に効果的でありうることを示す。

慢性のウイルス感染又はウイルスによって誘発された腫瘍に対する効果的な攻撃を導く分子イベント及び細胞イベントに関する新たな洞察が最近になって初めて得られた。溶解を行うエフェクター細胞の完全動員は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の微生物性リガンドなどの先天性免疫の誘発因子、及び／又は、活性ＣＤ４^＋Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞上のＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）などの適応免疫の誘発因子による、ＤＣの適切な活性化（成熟）に決定的に依存している（Ｍｅｌｉｅｆら、ｌｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １８８、２００２年）。ＨＰＶ１６による上皮の感染は、少なくとも早期には、この組織及び／又は強度の炎症誘発性刺激の著しい撹乱を伴わないため、効果的な免疫応答は、ＨＰＶ１６特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の補助に依存している可能性が高い。機能が分子的に特定されていない組換え体ベクター及びアジュバントなど、十分に特定されていない、免疫系の誘発因子に依存する替わりに、現在では、エフェクターＴ細胞の完全規模のバースト、及びＴ細胞記憶を誘導するのに適した抗原性シグナル及びアクセサリーシグナルを提供する、完全に合成されたワクチンを設計することが可能である。そのようなワクチンの特徴は、それらが、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋両方のＴ細胞を刺激する抗原を提供するのみでなく、樹状細胞（ＤＣ）活性化の、最も成功した天然の誘発因子を厳密に模擬した化合物も含有することである（Ｍｅｌｉｅｆら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８８、２００２年；Ｚｗａｖｅｌｉｎｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９、２００２年）。対象を、例えば（ミコ）バクテリア及び／又はウイルス、詳細にはＨＰＶに感染した細胞又は腫瘍細胞に対して免疫化する臨床的に適切なアプローチでは、特異的なＴヘルパー細胞及びＣＴＬの両方を誘導するのが好ましい。本発明者らは、最小ＣＴＬエピトープを用いた免疫処置の結果として、いくつかのモデルでは腫瘍に対する防御が得られ（Ｆｅｌｔｋａｍｐら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３、１９９３年、Ｋａｓｔら、ＰＮＡＳ、８８（６）、１９９１年）、一方、他のモデルでは、それによって、他の方法によって誘導した場合には防御的である、ウイルス−及び腫瘍−特異的なＣＴＬの寛容又は機能欠損を導く場合があることを既に示した（Ｔｏｅｓら、ＰＮＡＳ ９３（１５）、１９９６年、Ｔｏｅｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５６（１０）、１９９６年）。寛容又は機能欠損の存在は、ワクチン接種の効果をかなり低下させる。したがって、この作用に関与するエピトープは、免疫化の目的には適していなかった。ＭＨＣクラスＩ分子による提示に供する外因性抗原の、クロスプライミング及び他の機構によるプロセシングは、現在では、周知の内因性経路に次ぐ、ＭＨＣクラスＩによる提示のための第２のプロセシング経路として広く認識されている（Ｊｏｎｄａｌら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５（４）、１９９６年、Ｒｅｉｍａｎｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９（４）、１９９７年）。ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＡＰＣ活性化が起こらない限り、この経路を介した抗原プロセシングの正常な結果はＣＴＬ寛容である（Ｋｕｒｔｓら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８６（１２）、１９９７年）さらに、マウスのウイルス感染を用いたいくつかの研究では、ＣＴＬ前駆体の頻度と防御免疫との間に正の相関関係が検出された（Ｓｅｄｌｉｋら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７４（１３）、２０００年、Ｆｕら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６２（７）、１９９９年）。最適のＣＴＬ誘導を得るには、ＣＴＬエピトープの提示が樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面で行われることが好ましい（Ｍｅｌｌｍａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８、１９９８年、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９９９年）。一方、最小ＣＴＬエピトープは、プロフェッショナル抗原提示細胞によるプロセシングの必要がなく、いかなる体細胞もＴ細胞にそれらを提示することができるが、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩで、それぞれ、最適のＣＴＬエピトープ及びＴｈエピトープの提示が起こりうるには、プロフェッショナル抗原提示細胞によってタンパク質が取り込まれて、プロセシングされる必要がある（Ｍａｎｃａら、Ｊ Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ ７、１９９４年）。

天然源のものであれ、宿主系で発現された組換体タンパク質であれ、生物源から得られたタンパク質を使用するならば、小型のタンパク質も、より大型のタンパク質も、精製された形態又は未精製の調製物としてワクチン接種を行う目的で使用することが可能となり、これらは、ワクチン接種に関する技術分野において日常的に投与されている。しかし、生物源から得られたタンパク質又は組換体タンパク質の使用は、徹底した精製と品質管理とを必要とする。生物源からのタンパク質又は組換体タンパク質の産生は、本質的に、生物学的変異、様々な夾雑物、及び誤りを免れないものである。生物源に固有の可変性及び予測不可能性と、使用される細胞系、細菌、ウイルス、及びベクターにおける高率の変異及び後成的変化と、ＤＮＡ、とりわけウイルスＤＮＡ又は組換え体ＤＮＡの混入の脅威のため、ＥＭＥＡ（欧州医薬品審査庁）、米国ＦＤＡ（食品医薬品局）、又は、日本国厚生労働省医薬局などの監督機関によって定められた安全性及び品質管理の要求事項は、広範且つ非常に厳密な臨床検証であり、医療当局によるワクチン接種用製剤の承認、並びにＧＭＰグレードの材料、設備、及び操作法の使用義務は、生物源からのタンパク質及び組換体タンパク質の使用を、極めて重労働で、危険性が高く、費用がかかり、概して魅力のないものとしている。

国際公開第０２／０７０００６号は、ＣＴＬエピトープとＴヘルパーエピトープとを併せ、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって取り込まれるのに十分な大きさの２２〜４５アミノ酸の中型の合成ペプチドの使用を例示する。小型又は中型の大きさの合成ペプチドの使用に伴う１つの問題は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるそれらの半減期が短く、血流から急速に除去されることであり、これによって、ワクチン接種用組成物又はワクチンの総合的な有効性が制限されている。さらに、アミノ酸のひとつづきが短いことは、合成ペプチド中に含有される利用可能なエピトープの数を制限する。それらよりかなり大きなタンパク質、場合によっては完全長のタンパク質であって、免疫処置される対象の全てのＨＬＡ分子に対する、所与のタンパク質の利用可能なエピトープの大部分又はすべてを含有するタンパク質の使用が非常に望ましいであろう。当技術分野の現状では、アミノ酸含量に応じて、約６０アミノ酸までの合成ペプチドの合成が可能である。理論的には、はるかに長いペプチドで合成できるが、ペプチドの大きさが増大するに従って、収率及び品質が漸次に低下する。

一方、詳細に特定され、且つ厳密に制御及びモニターされた化学過程を使用して、合成タンパク質を取得すれば、生物源由来のタンパク質の使用に付随した問題が回避されるであろう。しかし他方で、化学合成されたペプチドの長さの制限は、それらのワクチンとして免疫学的有効性を制限する。本発明の目的は、これらの短所を克服し、化学合成によって生成された、免疫学的に効果的なタンパク質性ワクチンを提供することである。

定義
本明細書では、合成又は人工のペプチドを、ペプチド結合によって連結された天然の２０種のアミノ酸の重合体の化学的合成によって産生された、化学的に産生されたアミノ酸の重合体すなわちポリペプチドとして定義する。合成タンパク質は、化学合成された、長さが２から８０アミノ酸までの範囲にある少なくとも２つ以上の合成ペプチドの融合産物として定義する。２つ以上の合成ペプチドの連結によって、合成タンパク質が産生され、この合成タンパク質は、天然のタンパク質の一部又は全長に対応する場合があり、また、その長さは、約８０アミノ酸から約１０００アミノ酸まで、好ましくは８５から４００アミノ酸まで、より好ましくは９０から２００アミノ酸までの範囲で変動しうる。対照的に、天然又は組換え体のタンパク質は、コードしているＲＮＡテンプレートの翻訳によってｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで酵素的に産生された、酵素的に産生されたタンパク質又はポリペプチドとして定義する。

ＧＭＰグレードペプチドは、適正製造基準プロトコルに従って生産されており、その際、操作の全ステップが標準化されており、完全に記録され、且つ、絶えずモニターされる。ドキュメンテーションシステムは、ＦＤＡ又はＥＭＥＡなどの当局による監査用に追跡が論理的且つ容易なバッチ記録をもたらし、これは、承認及び人工タンパク質の臨床使用に必要な品質管理及びモニタリングを容易にするであろう。

ＧＭＰグレードのタンパク質は、ワクチン中での臨床使用の前に、以下の非網羅的なリストに示す技法によって徹底的に試験されたものでありうる。すなわち、質量分析、アミノ酸分析（ＡＡＡ）、ペプチドシーケンシング、逆相−ＨＰＬＣ、残留有機揮発性物質、細菌内毒素評価、汚染微生物数評価、ＡＡＡによる正味ペプチド含有量、対イオン含有量（酢酸、トリフルオロ酢酸、ヒドロクロリドなど）、二次対イオン含有量、含水量、及び物質収支計算であり、また、追加の試験には、比旋光度（同一性）、キャピラリーゾーン電気泳動法（純度）、力価測定、並びに当業者に明らかな他の化学的及び生物学的分析技術が含まれることがある。

ワクチン接種用製剤中の合成タンパク質に対する免疫応答を強化及び刺激するために、組成物にアジュバントを添加してもよい。ワクチン接種用の様々なアジュバントの使用が当技術分野で知られている（例えば、Ｍｅｌｉｅｆ、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ １８８、２００２年；Ｚｗａｖｅｌｉｎｇ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９、２００２年）。本発明の合成タンパク質と共に使用される特に好ましいアジュバントは、細菌ＬＰＳ、ＣｐＧ ＤＮＡ、及び他のＴｏｌｌ様受容体活性化アジュバント、並びに樹状細胞を刺激するアジュバントである。本発明のより好ましい一実施形態では、プロフェッショナル抗原提示細胞表面に存在するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって認識されるアジュバントを使用する。ＴＬＲによって認識される様々なアジュバントは、当技術分野で知られており、それらには、例えば、リポペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、リポタンパク質（マイコプラズマ、ミコバクテリア、又はスピロヘータ由来）、二本鎖ＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）、非メチル化ＤＮＡ、リポアラビノマンナン、フラジェリン、ＣｐＧ含有ＤＮＡ、及びイミダゾキノリンが含まれる。アジュバントは、抗原と共に投与してもよく、或いは、当技術分野で知られている化学修飾、合成、結合、及び他の方法で抗原に物理的に結合させてもよい。

本発明の合成タンパク質は、天然のそれらの対応物とは何らかの配列の相違を示すものでありうる。「配列同一性」という用語は、比較のウィンドウ全体にわたって、２つのポリペプチド配列が同一である（すなわち、アミノ酸対アミノ酸ベースで）ことを意味する。「配列同一性の百分率」という用語は、最適に整列された２つの配列を比較のウィンドウ全体にわたって比較し、両方の配列で同一の残基が存在する位置の数を決定して、一致している位置の数を取得し、一致している位置の数を比較のウィンドウの中にある位置の総数（すなわちウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００に掛けて、配列同一性の百分率を取得することによって計算する。

本発明のペプチドに適用される場合、「実質的同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトパラメータを用いたＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどによって最適となるように整列された際に、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも９０パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも９５パーセント又はそれを超える配列同一性（例えば９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムを用いて、２つの配列を、それらの全長にわたって整列させるが、その際、一致している数が最大になり、ギャップの数が最小になるようにする。通常は、ＧＡＰデフォルトパラメータを使用し、ギャップ生成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、ギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）である。ヌクレオチド用に使用するデフォルトスコアリングマトリックスは、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質用のデフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年）。

同一でない残基の位置は、保存性のアミノ酸置換によって相違していることが好ましい。保存性のアミノ酸置換は、類似した側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の一群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の一群は、セリン及びトレオニンであり；アミドを含有する側鎖を有するアミノ酸の一群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の一群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の一群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；そして、硫黄を含有する側鎖を有するアミノ酸の一群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存アミノ酸置換のグループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。

比較的短いアミノ酸配列（約３０残基未満）のアライメント及び比較は通常、単純に行えるものである。比較ウィンドウを整列させる最適の配列アライメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ ２：４８２の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（ＵＳＡ）８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実施形態（ウィスコンシン遺伝学ソフトウェアパッケージバージョン１０．２中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ、遺伝学コンピュータグループ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ５３７１１，ＵＳＡ）によって、或いは、目視検査によって行うことができ、様々な方法によって作成されたものの中で最良のアライメント（すなわち比較ウィンドウ全体にわたって最も高い配列類似性の百分率をもたらす）を選択する。

したがって、第１の態様では、本発明は、合成タンパク質を生成する方法に関する。合成タンパク質は、病原体又は腫瘍の天然存在の抗原タンパク質における連続した少なくとも４６アミノ酸に少なくとも８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。本発明の方法は、（ａ）それぞれが上記アミノ酸配列における連続した２から８０アミノ酸から成る２つ以上の断片を化学合成し、それによって、上記２つ以上の断片が、上記アミノ酸配列中で隣接し、且つオーバーラップしていないステップと、（ｂ）一断片のＣ末端を、隣接した断片のＮ末端に化学的に連結させて、合成タンパク質又はその一部分を生成させるステップと、（ｃ）任意選択で、ステップＣを反復して、ステップＣ又はステップＢから得られたさらに別の隣接した断片を順次に連結させて、合成タンパク質を生成させるステップとを含む。

合成タンパク質は、病原体又は腫瘍の天然の抗原タンパク質における連続した少なくとも４６、４７、４８、５０、５５、６０、７０、又は８０アミノ酸に少なくとも８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。合成タンパク質は、病原体又は腫瘍の天然の抗原タンパク質の全（すなわち完全長）アミノ酸配列に少なくとも８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むことがより好ましい。好ましい天然の抗原タンパク質はＨＰＶタンパク質であり、より好ましくは、ＨＰＶ Ｅ２、Ｅ６、又はＥ７タンパク質であり、より好ましくは、天然のＨＰＶタンパク質がＨＰＶ１６、−１８、−３１、−３３、又は−４５タンパク質であり、これらの中でも、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８タンパク質が最も好ましい。したがって、対象の発明で利用される合成タンパク質は、病原体又は腫瘍の天然の抗原タンパク質に、実質的に同一であることはあっても、同一である必要はない。したがって、合成タンパク質は、挿入、欠失、及び置換など、保存性又は非保存性の様々な改変の対象となることがあり、その場合、そのような変化は、それらの使用における特定の利点を提供するかもしれない。同様に、本発明の、ＨＰＶ由来の合成タンパク質は、多くの方法で修飾することができ、その場合、そのタンパク質は、配列番号１〜６のうちの１つと少なくとも８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９、又は１００％の配列同一性を維持しながら、配列番号１〜６から選択されたＨＰＶ由来の抗原配列のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列に実質的に同一な（上記に定義した通り）配列を含むことが好ましい。

本発明の方法では、この出願に開示した、合成ペプチドの逐次的な連結によって、より大きな合成タンパク質を合成することができる。この方法では、第１のステップで合成ペプチドを基質上に固定することが好ましい。これに続くステップで、第２の合成ペプチド、及び、任意選択でさらに多くの合成ペプチドを化学的方法によって、支持体上のペプチドに共有結合、すなわち融合させる。実施例では、同様のストラテジーに従って、免疫原性の高い他のＨＰＶタンパク質を化学合成する。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ６タンパク質は、４つの人工のペプチドから好都合に合成することができる（実施例番号２及び５）。さらに大きなタンパク質である、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のＥ２タンパク質用には、この方法の柔軟性を例示する非限定的な例として、２つの異なったストラテジーを本発明は提供する（実施例番号３及び６）。個々のペプチドの効率的な連結を確実にするために、適当な選択肢を選択して人工タンパク質を取得することによって、配列特異的な困難を回避することができる。

好ましい実施形態では、隣接して、且つオーバーラップしていない断片（すなわち、化学的連結によって合成タンパク質を合成するための建築ブロックとして使用される個々の合成ペプチド）が、Ｎ末端システイン残基又はグリシン残基を含むように選択される。合成される、個々の隣接し且つオーバーラップしていない断片は、中程度の長さ（２０〜８０アミノ酸、好ましくは最大約６５アミノ酸まで、より好ましくは最大５５アミノ酸までの長さ、より好ましくは最大４５アミノ酸までの長さ、最も好ましくは最大３５アミノ酸までの長さ）であることが好ましく、また、それらのチオエステルとして、通常の固相ペプチド合成によって、例えばＦｍｏｃベース又はＢｏｃベースの化学によって、適切なハンドル、例えば安全装置ハンドルを含有する通常の固形支持体上、例えばポリスチレンベース、又はポリスチレン／ポリエチレングリコール共重合体ベースの物質上で、許容される純度、例えば、好ましくは８０％超の純度に合成されることが好ましい。プロリンチオエステルとの結合は扱いにくいので、カルボキシ末端にプロリン（Ｐ）を有する建築ブロックを使用しないことが好ましい。合成されるタンパク質が、例えば配列中でシステイン同士が遠く離れているため、好ましい実施形態に適合した天然存在のシステインを含有しない場合、アミノ末端にグリシン（Ｇ）を有する１つ又は複数のブロックを使用する改変された連結ストラテジーを適用するのが好ましい。その場合、Ｎ末端のＧを、Ｎ−２，３，４−トリメトキシ−５−メルカプトフェニル基などの保護／活性化基で修飾することができ、Ｎ−２，３，４−トリメトキシ−５−メルカプトフェニル基は、グリシンに、システインのそれに匹敵する、チオエステルに対する反応性を与え、そしてなお、最終生成物中にグリシンを産生する（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４，４６４２（２００２年））。

本発明は、毒性の高いタンパク質又は不安定なタンパク質の産生にもよく適している。記載した方法は、それらの固有の毒性（例えばＨＰＶ１６ Ｅ２、野生型ｐ５３）、又は細菌／ウイルス／真核生物の発現系におけるｉｎ ｖｉｖｏでのそれらの不安定性のために現在のところ組換え技術によって生成させるのが困難であるタンパク質を生成させるための代替手段を提供しうる。

ｉｎ ｖｉｖｏ注入されたタンパク質は、細胞外マトリックス中に存在するエキソペプチダーゼによって迅速に分解されることが多い。本発明の好ましい一実施形態では、Ｎ及びＣ末端、並びにタンパク質配列中の戦略的な部位にＤ−アミノ酸を導入するなどのタンパク質修飾によって、そのような分解を克服することができる。さらに、配列中の特定の部位に非天然のアミノ酸を導入することによって、そのタンパク質を、酵素による分解に対してより安定にすることができる。例えば、非天然アミノ酸は、様々な形態の合成α−アミノ酸、合成β−アミノ酸、及び／又はＮ−メチル化合成アミノ酸である場合があり、タンパク質生産の従来のｉｎ ｖｉｖｏ法では容易に実現できない特徴を示す。

最短（９ＡＡ）又はそれより長い（３５ＡＡ）合成ペプチドと比較して、合成Ｅ７タンパク質の免疫原性活性が著しく増強されていることは、少なくとも部分的には、ｉｎ ｖｉｖｏでの合成タンパク質の安定性が増大したためである。これは、合成Ｅ７タンパク質とは対照的に、等モル用量の長いＥ７ペプチドを用いたワクチン接種が、ＣＤ８＋ＩＦＮγを産生するＨＰＶ１６ Ｅ７特異的なＴ細胞の誘導に効率的でなかったこと、そして、これが腫瘍の誘発に対する防御の欠如に反映されたという事実によって例証される。しかし、長いペプチドを約８倍高い用量で用いてワクチン接種を行ったところ、その結果、強いＥ７特異的なＴ細胞反応と、腫瘍に対する防御とが得られた。より大きな合成タンパク質若しくは完全長の合成タンパク質（あるタンパク質の天然に発現される対応物と比較して）の使用、又は、特定のドメインの使用、化学修飾、若しくは合成タンパク質からの分解用標的シグナルの除去が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける半減期の延長を示す合成タンパク質の設計を補助する技術的手段である。安定性が強化された合成タンパク質は、免疫原性反応の、より強力な誘発因子となる。強化された免疫原性活性、すなわち、マウスでの予防試験及び治療試験において、短い合成ペプチドと比較して、等モルベースの合成タンパク質ワクチンでより効果的な免疫原活性は、タンパク質が大きいほど、その分解が遅く、血流からの除去が低減又は遅延されることによって、少なくとも部分的に説明される。より大きな合成タンパク質の残留断片は、部分的な分解及び部分タンパク質分解の後でもなお、プロフェッショナル抗原提示細胞によって取り込まれ、活発な免疫応答を誘発するのに十分に大きなものでありうる。

化学的に連結されて本発明の合成タンパク質を形成する（ポリ）ペプチドの修飾を、様々な望ましい属性が得られるように、例えば、無改変ペプチドの実質的にすべての生物活性を増強又は少なくとも維持しながら、薬理学的特性の改善が得られるように行うことができる。例えば、ペプチドは、アジュバントの結合によって修飾することができ、それによって合成ペプチド融合過程における安定性又は補助が強化され、タンパク質のアミノ酸配列を改変、伸長、又は短縮することによって、免疫特性を強化する。異なったアミノ酸又はアミノ酸ミメティックで置換することもできる。

本発明の合成タンパク質に由来する免疫原性タンパク質の個々の残基は、ペプチド結合又は擬似ペプチド結合によって合成タンパク質に組み込むことができる。本発明の擬似ペプチド結合には、当業者に周知のペプチド骨格修飾が含まれる。そのような修飾には、アミド窒素、α−炭素、若しくはアミドカルボニルの修飾、アミド結合の完全な置換、伸長、欠失、又はバックボーン架橋が含まれる。全般的には、Ｓｐａｔｏｌａ、「アミノ酸、ペプチド、及びタンパク質の化学及び生化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」、Ｖｏｌ．ＶＩＩ、（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編集、１９８３年）を参照のこと。いくつかのペプチド骨格修飾が知られており、これらには、ψ［ＣＨ_２Ｓ］、ψ［ＣＨ_２ＮＨ］、ψ［ＣＳＮＨ_２］、ψ［ＮＨＣＯ］、ψ［ＣＯＣＨ_２］、及びψ［（Ｅ）又は（Ｚ）ＣＨ＝ＣＨ］が含まれる。上記で使用された用語体系は、上記のＳｐａｔｏｌａによって提案されたものである。この文脈では、ψはアミド結合の不在を示す。アミド基を置換する構造が括弧内に指定される。

アミノ酸ミメティックを合成タンパク質に組み込むことができる。本明細書で使用する場合、「アミノ酸ミメティック」は、本発明のペプチド中にあるアミノ酸の代替物として立体配置的に、且つ機能的に働く天然のアミノ酸以外の部分である。そのような部分は、例えばＨＰＶ由来のエピトープなど、関係するエピトープに対して免疫応答を誘発するペプチドの能力を妨害しない場合、アミノ酸残基の代替物として働く。アミノ酸ミメティックには、Ｌ−α−アミノ酸の多数の誘導体に加えて、β−、γ−、δ−アミノ酸、β−、γ−、δ−イミノ酸（ピペリジン−４−カルボン酸など）などの非タンパク質アミノ酸も含まれる。多くの適当なアミノ酸ミメティックが当業者に知られており、それらには、シクロヘキシルアラニン、３−シクロヘキシルプロピオン酸、Ｌ−アダマンチルアラニン、アダマンチル酢酸、及び同様のものが含まれる。本発明のペプチドに適したペプチドミメティックは、Ｍｏｒｇａｎ及びＧａｉｎｏｒ（１９８９年）、Ａｎｎ．Ｒｅｐｔｓ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ２４：２４３−２５２に論じられている。

本発明の方法の別の好ましい実施形態では、合成タンパク質がアジュバントに化学的に結合されている。好ましいアジュバントは、化学合成されたアジュバントである。抗原への（合成）アジュバントの結合は、当技術分野で知られている（Ｓｈｉｒｏｔａら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：５５７５、Ｃｈｏ，Ｈ．Ｊ．、Ｋ．ら、２０００年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５０９、Ｔｉｇｈｅ，Ｈ．、Ｋ．ら、２０００年、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １０６：１２４、Ｔｉｇｈｅ，Ｈ、Ｋ．ら、２０００年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１９３９）。

例えば樹状細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞を、例えばＴＯＬＬ様受容体を介して特異的に活性化できるアジュバントに抗原を結合させたものは、両方の成分が共に混合されているワクチンと比較して、優れたワクチンであることも、上記の技術分野で知られている。一実施形態では、アジュバント、好ましくは合成アジュバントが本発明の合成タンパク質に結合され、その結果、純粋に合成されたものであり、そしてそれによって、化学的に完全に特定されているワクチン接種用の組成物が得られる。

生体分子を結合するのに適した技法の１つは、当技術分野で「クリックケミストリー」として知られている。この技法では、結合体を生成するために、１分子中のアジ化物部分が、別の分子中のアルキン基と反応し、両分子が１，２，３トリアゾール環を介して共有結合によって連結される。この反応は、通常、生体分子中に存在する実質的にすべての反応性基と直交し、銅（ｌ）イオンによって触媒され、水性媒体中で、比較的温和な反応条件で実施できる；Ｋｏｌｂ．Ｈ．Ｃ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０，２００４−２０２１（２００３年）、及びＷａｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５，３１９２−３１９３（２００３年）を参照。しかし、本発明のアジュバント及び抗原に適用できる、生体分子を結合する他の方法も、当技術分野で周知である。

本発明の抗原と併用及び／又は結合するための好ましいアジュバントは、樹状突起細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞を刺激するアジュバントである。そのようなアジュバントは、好ましくは、ＴＯＬＬ様受容体（ＴＬＲ）によって認識され、当技術分野で知られており、それらには、例えば、リポペプチド、リポ多糖、ペプチドグリカン、リポテイコ酸、リポタンパク質（マイコプラズマ、ミコバクテリア、又はスピロヘータ由来）、二本鎖ＲＮＡ（ポリＩ；Ｃ）、非メチル化ＤＮＡ、リポアラビノマンナン、フラジェリン、ＣｐＧ含有ＤＮＡ、及びイミダゾキノリンが含まれる。

本発明の好ましい一実施形態では、ＴＬＲ活性化アジュバントとしてＣｐＧ ＤＮＡを使用し、合成タンパク質のＮ及び／又はＣ末端、或いは特定のアミノ酸に共有結合によって結合させる。ＣｐＧ ＤＮＡ及びその類似体は、ＴＬＲ９の強力な活性化物質であることが知られている。ＣｐＧをタンパク質に結合する方法は、参考文献（Ｓｈｉｒｏｔａら、２０００年 Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１６４： ５５７５Ｃｈｏ，Ｈ．Ｊ．、Ｋ．ら、２０００年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５０９、Ｔｉｇｈｅ，Ｈ．、Ｋ．ら、２０００年、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６：１２４、Ｔｉｇｈｅ，Ｈ．、Ｋ．ら、２０００年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：１９３９）に詳細に記載されている。分子の１つにあるチオール基などの求核基は、もう一方の分子にあるハロアセチル基又はマレイミド基などの求電子基と反応しうる。別法では、分子の１つにあるアミン基が、もう一方の分子にある、ヒドロキシサクシニミドエステルのような活性カルボン酸基と反応しうる。分子の１つにあるアミン基は、もう一方の分子にあるアミン基とも、グルタルアルデヒドのような二機能性架橋剤との反応によって反応しうる（Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ及びＰ．Ｄ、Ｗｈｉｔｅ、第１０章におけるＤｒｉｊｆｈｏｕｔ，Ｊ．Ｗ．及びＨｏｏｇｅｒｈｏｕｔ，Ｐ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ社、２０００年）。

ポリＩＣはＴＬＲ３に作用するが、これも、本発明の合成タンパク質に共有結合させてもよい。ポリＩＣ（ポリイノシン：ポリシチジル酸）は、二本鎖ウイルスＲＮＡの「模倣体」であり、インターフェロンを誘導する。したがって、それをワクチン接種におけるアジュバントとして用いることができる（Ｍｏｎｓｈｏｕｗｅｒ Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２，１１９５−１２００（１９９６年）、及び、Ｍｏｒｉｙａｍａ Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９，５５３９−５５４４（２００２年））。ポリＩＣは、参考文献に記載されている方法を介して、合成タンパク質に共有結合させてもよい（Ｓｈｉｒｏｔａら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４：５５７５、Ｃｈｏ、Ｈ．Ｊ．、Ｋ．ら、２０００年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：５０９ 、Ｔｉｇｈｅ、Ｈ．、Ｋ．ら、２０００年、Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６：１２４。Ｔｉｇｈｅ、Ｈ．、Ｋ．ら、２０００年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０：１９３９）。

イミキモド及び類似体はＴＬＲ７及び８に作用し、Ｐａｍ３ ＣｙｓはＴＬＲ２に作用するが、これらも、単独で、或いは、他の合成アジュバントと併用して、本発明に記載の合成タンパク質への結合に有利に用いることができる。Ｐａｍ３Ｃｙｓは、３つのパルミチン酸ユニットがグリセロール分子を介してシステインに結合している化合物であり、強力なアジュバントである（Ｒａｂａｎａｌ，Ｆ．、ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１，９４５−９５２（１９９１年）、及び、Ｍｅｔｚｇｅｒ Ｊ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１１４９，２９−３９（１９９３年））。

さらに別の好ましい実施形態では、この方法は、上記合成タンパク質を、下記に特定する薬学的に許容される担体と混合することによって、上記タンパク質を医薬組成物に配合するステップを含む。したがって、一態様では、本発明は、本発明の合成タンパク質を含む医薬組成物を生成する方法にも関する。この方法は少なくとも、上述した方法で得られた本発明の合成タンパク質を、薬学的に許容される担体、並びに上記及び下記のアジュバントのようなさらに別の成分と混合するステップを含む。

さらに別の態様では、本発明は、上述した方法で得られた合成タンパク質を含む組成物に関する。合成タンパク質は上記に定義した通りのものが好ましい。本発明の方法の化学合成によって得られた合成タンパク質を含む組成物は、生物システムから得られた抗原タンパク質を含む従来の組成物にまさるいくつかの利点を有する。本質的に、生物システムでタンパク質を生産する過程は、生物学的変動を免れない。この変動に加えて、生物源から単離された成分には、それが組換え体宿主に由来するものであれ、非ＧＭＯ、又は無細胞系に由来するものでさえ、生物生産システムからの他の生体分子が混入するという固有の危険性があり、それらの一部は極めて有害なものでありうる。対照的に、本発明の組成物は、生物学的夾雑物を実質的に含んでいない。好ましくは、組成物が生物学的夾雑物を含んでおらず、その程度は、そのような夾雑物のレベルが、利用可能なアッセイの検出レベル未満となる程度である。本発明の組成物中に存在しない生物学的夾雑物には、生産生物又は生産システムに由来するいかなる生体分子も含まれる。したがって、そのような夾雑物には、例えば細菌内毒素など、タンパク質、炭水化物、ＤＮＡ及びＲＮＡを含めた核酸、脂質、並びにこれらの組合せが含まれ、ヒトを感染させることのできるウイルスさえも含まれる場合がある。組成物は、上記天然のタンパク質が得られた生物又はウイルス、すなわち、そのタンパク質がその中に天然の生物又はウイルス、或いは、組換えによる生産の場合には、そのタンパク質がその中で生産された生物又はウイルスからの夾雑物（生体分子）を実質的に含まないことが好ましい。重大な問題の１つは、核酸による、とりわけ、例えばウイルス及び／又は組換え体の核酸など、病原性及び／又は発癌性の核酸によるタンパク質性製剤の潜在的汚染である。したがって、本発明による合成タンパク質を含む組成物は、核酸による汚染が本質的に皆無であり、より詳細にはウイルス性及び／又は発癌性の核酸、その中でもとりわけＤＮＡを含んでいない。核酸による汚染、そして詳細にはウイルス性及び／又は発癌性の核酸による汚染、より詳細にはＨＰＶ核酸による汚染は、当技術分野で知られているＰＣＲ増幅技法によって実証することができる（Ａｕｓｕｂｅｌら、「カレントプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、１９８９年）。組成物は合成タンパク質を含み（例えば、病原体又は腫瘍の天然存在の抗原タンパク質における連続した少なくとも４６アミノ酸に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質）、それによって、合成タンパク質の上記アミノ酸配列をコードする核酸を組成物が含まないことが好ましい。本発明による合成タンパク質を含む組成物は、ウイルス性及び／又は発癌性の核酸の増幅に適したプライマーを用いたＰＣＲ増幅によってアッセイした場合に、好ましくは３０サイクル、より好ましくは４０サイクル、そして最も好ましくは５０サイクルのＰＣＲ増幅の後でも検出可能なＤＮＡ汚染を示さない。組成物は、適当なＨＰＶ特異的プライマーを用いた３０、４０、又は５０サイクルのＰＣＲ増幅によって検出可能なＨＰＶ核酸（ＤＮＡ）断片を含まないことがより好ましい。組成物は、配列番号１から６までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを実質的に含まないことが最も好ましい。

さらに別の好ましい組成物はアジュバントを含む。このアジュバントは、樹状細胞を活性化できるアジュバントであることが好ましい。このアジュバントは、上記に特定したものなど、ＴＬＲを活性化できるアジュバントであることがより好ましい。組成物は、合成タンパク質と混合されたアジュバントを含んでもよく、また、タンパク質に共有結合されたアジュバントを含有してもよく、また、これら両方を含有してもよい。加えて、複数のアジュバントが存在していてもよい。多数のアジュバントが当業者に周知となっている。適当なアジュバントには、不完全フロインドアジュバント、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリロキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、及びＲＩＢＩが含まれ、ＲＩＢＩは、細菌から抽出された３成分、すなわち、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコール酸、及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を、２％スクアレン／トウィーン８０エマルジョン中に含有する。アジュバントの有効性は、免疫原性ペプチドに対する抗体の量を測定することによって決定できる。特に有用なアジュバント及び免疫処置スケジュールが、Ｋｗａｋら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１２０９−１２１５（１９９２年）に記載されている。そこに記載されている免疫アジュバントは、５％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクアレン、２．５％プルロニックＬ１２１重合体、及び０．２％ポリソルベートをリン酸緩衝生理食塩水中に含む。本発明の好ましい一実施形態では、抗原提示細胞表面に存在するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって、アジュバントが認識され、したがって、アジュバントがＴＬＲリガンドである。ＴＬＲによって認識される様々なアジュバントは、上述されており、本発明の合成タンパク質との混合及び／又は結合にそれらを使用してよい。

アジュバントは、生物源から精製されたものではなく、化学合成された合成アジュバントであることが最も好ましい。本発明の好ましい一実施形態では、ＴＬＲによって認識可能な合成アジュバント（１つ又は複数）に合成タンパク質を結合させ、それが、ワクチン接種用の完全に特定された合成の組成物の基礎を形成する。さらに別の好ましい組成物は抗ＣＤ４０抗体を含む。

本発明の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。これらの医薬組成物（ワクチン接種用）は、非経口投与、経口投与、経皮投与、又は経粘膜投与用であると意図されている。これらの医薬組成物は、非経口投与、例えば、皮下投与、皮内投与、又は筋肉内投与してよい。したがって、本発明は、経口投与用、又は好ましくは非経口投与用の組成物を提供し、それらは、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解又は懸濁された免疫原性の合成タンパク質又は合成ワクチンの溶液を含む。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸、及び同様のものが使用できる。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法で滅菌しても、或いは濾過滅菌してもよい。その結果得られる水溶液は、そのまま使用するように包装しても、凍結乾燥してもよく、凍結乾燥された製剤は投与前に無菌液と併せる。組成物を生理的条件に近づけるために、必要に応じて、これに、緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、及び同様のもの、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、及びオレイン酸トリエタノールアミンなど、薬学的に許容される補助剤を含有させてもよい。

固体組成物には、従来の非毒性固体担体を用いることができ、それらは、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、滑石、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム及び同様のものを含有する。経口投与用には、上記に列挙した担体など、通常利用される賦形剤のうち任意のものと、概ね１０〜９５％、より好ましくは２５％〜７５％の濃度の活性成分、すなわち本発明の１つ又は複数の合成タンパク質とを組み入れて、薬学的に許容される非毒性組成物を形成させる。上述のように、組成物は、合成タンパク質に対する免疫応答を誘導するように意図されている。したがって、免疫応答を最大にするのに適した組成物及び投与方法が好ましい。例えば、合成タンパク質は、担体に連結させて、或いは活性タンパク質ユニットのホモ重合体又はヘテロ重合体として、ヒトを含めた宿主に導入することができる。有用な担体は、当技術分野で周知であり、例えば、チログロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド、ポリ（リジン：グルタミン酸）などのポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス組換え体ワクチン、及び同様のものが含まれる。別法では、合成タンパク質の「カクテル」を用いることができ、これは、Ｅ７、Ｅ６、及びＥ２、又はそれらの部分、並びにそれらのアジュバント結合体など、選択された免疫原性ＨＰＶ合成タンパク質を含む。複数の合成タンパク質の混合物には、免疫学的反応が増強されるという利点がある。

本発明の免疫原性合成タンパク質の製剤中濃度は、広い範囲で変動しうるが、それは、重量比で約０．１％未満から、通常は約２％又は少なくとも２％、多くて２０％から５０％、又はそれを超える量までであり、選択された特定の投与方法に従って、主として、液量、粘度などによって選択されるであろう。

様々なタイプの投与に適した製剤に関するさらなる手引きは、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ社、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ、第１７版（１９８５年）に見出すことができる。薬物送達の方法に関する簡単な概説としては、Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０年）を参照のこと。例えば、経皮送達系には、貼付剤、ゲル、テープ、及びクリームが含まれ、それらは、溶解補助剤、透過性促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、及びアミノ酸）、親水性重合体（例えばポリカルボフィル及びポリビニルピリリジン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｉｌｌｉｄｉｎｅ））、並びに接着剤及び粘着付与剤（例えば、ポリイソブチレン、シリコーンベースの接着剤、アクリレート、及びポリブテン）などの賦形剤を含有する場合がある。経粘膜送達系には、貼付剤、錠剤、坐剤、腟坐剤、ゲル、及びクリームが含まれ、それらは、溶解補助剤及び促進剤（例えばプロピレングリコール、胆汁酸塩、及びアミノ酸）、並びに他の媒体（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステル及び誘導体、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒアルロン酸などの親水性重合体）などの賦形剤を含有する場合がある。注射用の送達系には、溶液、懸濁液、ゲル、微細球、及び重合体注射剤が含まれ、溶解性改変薬剤（例えばエタノール、プロピレングリコール、及びショ糖）、及び重合体（例えばポリカプリラクトン及びＰＬＧＡ）などの賦形剤を含有する場合がある。移植可能な系には、桿体及びディスクが含まれ、ＰＬＧＡ及びポリカプリラクトンなどの賦形剤を含有する場合がある。本発明の医薬組成物を投与するのに使用できる他の送達系には、噴霧剤及び粉末薬などの鼻腔内送達系、舌下送達系、及び吸入法による送達系が含まる。吸入による投与には、適当な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適当な気体を使用して、加圧されたパック又はネブライザーからエアゾール噴霧剤投与の形態で本発明の医薬組成物を送達するのが好都合である。気密エアゾールの場合には、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって、用量単位を決定できる。吸入器又はインサフレーターで使用するための、例えばゼラチンのカプセル剤及びカートリッジは、本発明のペプチドと、ラクトース又はデンプンなどの適当な粉末ベースとの粉末混合物を含有するように製剤できる。本発明の医薬組成物は、吸入法による投与用に、例えば米国特許第６，３５８，５３０号に記載の通りにさらに製剤することができる。本発明の好ましい組成物は、ワクチンとして使用するための組成物である。

さらに別の態様では、本発明は、腫瘍又は感染症を治療又は予防する方法に関し、この方法は、上記に特定した通りに生成された合成タンパク質、又は上記に特定した組成物を治療有効量で対象に投与することを含む。それによって、この合成タンパク質は、上記に定義した腫瘍又は感染性因子の天然の抗原タンパク質のアミノ酸配列を含む。好ましい方法は、ＨＰＶ感染、詳細には生殖器感染の予防又は治療、性器疣贅又は上皮異形成などのＨＰＶウイルス誘発病変の予防又は退縮、詳細にはＨＰＶによって誘発された異形成、及び癌、詳細には子宮頚部癌、肛門性器癌、又は頭部及び頚部癌、並びに他のＨＰＶ誘発癌への形質転換の予防及び治療を含めたＨＰＶ関連疾患の治療又は予防の方法である。

法律によって、治療の方法が特許可能でない管轄区では、本発明は、同様に、腫瘍又は上記に特定した感染症を治療又は予防する（方法で使用する）ための薬物を製造するための、上記に特定した通りに生成された合成タンパク質の使用、又は上記に特定した組成物の使用に関する。

したがって、本発明は、対象にワクチン接種する方法における、ワクチン接種用の合成タンパク質及び合成組成物の使用に関する。このワクチン接種の方法は、好ましくはＨＰＶに対するもの、より好ましくは発癌性タイプのＨＰＶ１６、１８、３１、３３、及び４５に対するものである。この方法は、上記に特定した合成タンパク質を含む医薬組成物を、対象に投与することを含む。好ましい方法では、この医薬組成物は、ＴＬＲを活性化するアジュバント、好ましくは合成アジュバント、より好ましくは本発明の合成タンパク質への合成アジュバントの結合体も含む。

別の態様では、本発明は、対象におけるＨＰＶ感染の予防及び／又は治療を目的とした、ワクチン接種用のワクチン又は組成物を製造するための、上記に特定したＨＰＶ由来の抗原性合成タンパク質の使用に関する。このワクチンは、経口投与、非経口投与、経皮投与、又は経粘膜投与に適した医薬組成物であることが好ましい。

本発明の合成タンパク質を少なくとも１つ含む医薬（ワクチン）組成物も、本発明の一実施形態である。本発明の合成タンパク質及び医薬組成物は、上記に示した疾患を治療及び／又は予防するための、哺乳動物、詳細にはヒトへの投与に有用である。適当な製剤は、例えば、「レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ社、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ、第１７版（１９８５年）中に記載されており、それらは当技術分野で周知であり、且つ、当業者ならば容易に適合させることができる。

本発明の免疫原性合成タンパク質は、予防的に投与するか、或いは既に疾患を患っている個体に投与する。これらの組成物は、効果的な免疫応答を誘発するのに有効な量で患者に投与する。これを実現するために適した量を、「治療上有効な用量」又は「免疫原性的に（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃａｌｌｙ）有効な用量」として定義する。この使用に有効な量は、例えば、ペプチドの組成、投与方法、治療される疾患の段階及び重篤度、患者の体重及び全般的健康状態、並びに処方を行う医師の判断に依存するであろうが、概ね、最初の免疫処置（すなわち治療用又は予防用の投与）には、患者の体重１キログラム（ｋｇ）あたり約０．１μｇから約５０μｇまで、より一般的には、体重１ｋｇあたり約１μｇから約２０μｇまでの範囲にある。追加免疫のための用量は、通常、体重１ｋｇあたり約１μｇから約２０μｇであり、患者の反応及び状態に応じて、何週間かの間から何カ月かの間にわたって追加免疫用の投与計画を用いる。適当なプロトコルとしては、３週間の間隔を置いて３〜４回の初回刺激注射を行い、それの最後に続いて、一定の間隔（例えば６カ月）を置いて追加免疫用の注射を行うものが含まれる。

以下の非限定的な実施例は、本発明のＨＰＶ由来の抗原性合成タンパク質の調製を記述するものである。

（実施例１）
ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドの化学合成とペプチドの連結
ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチド及びタンパク質の化学合成
均質な合成Ｅ７タンパク質を、Ｆｍｏｃ固相合成法で別々に組み立てられた２つのオリゴペプチドの化学的連結によって調製した。Ｅ７のＮ末端６０量体セグメントを、スルホンアミド安全つかみ樹脂で調製し、公表されている操作法に従ってチオエステル１［Ｅ７（１−６０）］に変換した（Ｉｎｇｅｎｉｔｏ，Ｒ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１，１１３６９−１１３７４（１９９９年））。Ｃ末端３８量体カルボキサミド［Ｅ７（６１−９８），２］は、標準的なのＦｍｏｃ固相プロトコルを介して生成させた。続いて、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製された断片１及び２を連結させて、完全長Ｅ７タンパク質（３）を得た。元の無改変の連結操作法（Ｈａｃｋｅｎｇ Ｔ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，１００６８−１００７３（１９９９年）、及びＤａｗｓｏｎ Ｐ．Ｅ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９，４３２５−４３２９（１９９７年））の１つに従って、添加物としてチオフェノール／ベンジルメルカプタンを用いて、連結反応を成功裏に実施することができた。しかし、本発明者らは、メルカプトエチルスルホン酸ナトリウム塩（Ｆｌａｖｅｌｌ Ｒ．Ｒ．ら、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．４、１６５〜１６８頁、２００２年）が、均質且つ無臭の反応混合物を与えるので、より好都合な添加物であることを見出した。

許容できるタンパク質収率を得るために、合成経路全体に次の通りの必要な改変を導入した。第１に、産物／反応中間体の完全且つ不可逆的な沈殿を防止するために、連結緩衝液に２０ｍＭ ＥＤＴＡを含有させる必要があることが明らかになった。本発明者らは、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いたＥ７タンパク質の準備精製は、このステップの収率が悪いため実施できないことも見出した。満足できる精製プロトコルは、強い変性条件（６Ｍ塩酸グアニジン）下におけるスーパーデックス７５カラムでの反応混合物のゲル濾過と、それに続く、標的タンパク質を含有するプールされた画分の、水に対する透析とを含む。非変性条件（リン酸緩衝液）又は弱い変性条件（７Ｍ尿素）で行ったゲル濾過ステップは、依然としてＥ７（６１−９８）が混入している産物を産生したことに留意しなければならない。これは、おそらく後者の断片と完全長Ｅ７との混合凝集によるものである。これらの結果は、周知（Ａｌｏｎｓｏ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１，１０５１０−１０５１８（２００２年）のＥ７の凝集能、及びＥ７のＣ末端部分がこのタンパク質のオリゴマー形成の原因となるという観測の報告（Ｃｌｅｍｅｎｓ，Ｋ．Ｅ．ら、Ｖｉｒｏｌ ２１４，２８９−２９３（１９９５年）と完全に一致している。

実験
ペプチド合成
断片Ｅ７（１−６０）チオエステル（１）及びＥ７（６１−９８）Ｃ末端カルボキサミド（２）は、ＰｙＢＯＰ活性化を伴ったＦｍｏｃ−ＳＰＰＳによってＡＢＩ４３３Ａ測定器を用いて０．２５ｍｍｏｌスケールで調製した。Ｃｙｓ残基のラセミ化を最小にするために、（Ｈａｎ，Ｙ．Ｘ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ ６２，４３０７−４３１２（１９９７年））で提案されたｉｎ ｓｉｔｕプロトコルを用いた。各合成サイクルは、ＮＭＰ中の２０％ピペリジンを用いたＦｍｏｃの除去、ＮＭＰ洗浄、２ｍｍｏｌ ＤＩＰＥＡの存在下におけるＰｙＢＯＰに補助された１ｍｍｏｌ Ｆｍｏｃアミノ酸との１ｈの連結ステップ、第２のＮＭＰ洗浄、Ａｃ_２Ｏ／ＤＩＰＥＡキャッピングステップ、及び、最後にＮＭＰ洗浄を含む。

ペプチドチオエステルＥ７（１〜６０）（１）
断片１の組み立ては、４−スルファミルブチリルＡＭ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社）から開始した。Ｎ末端メチオニン残基は、Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨとして導入した。チオエステルは、固定され、且つ保護されたオリゴペプチドから生成させた。簡潔には、樹脂をＴＭＳＣＨＮ_２でアルキル化し、ペプチドをＮａＳＰｈの存在下でエチル３−メルカプトプロピオン酸で切断し、９６／１．２／１．２／０．８／０．８のＴＦＡ／エチル３−メルカプトプロピオン酸／ＴＩＳ／ｍ−クレゾール／Ｈ_２Ｏで脱保護した。

ペプチドアミドＥ７（６１−９８）（２）
断片２は、ＲＡＭ Ｔｅｎｔａｇｅｌ樹脂（Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ社）上で組み立てた。ペプチド鎖組み立てが完了したときに、（Ｄｉｃｋ，Ｆ．、「分子生物学の方法、第３５巻：ペプチド合成プロトコル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３５：Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．及びＤｕｎｎ，Ｂ．Ｍ編集）中６３〜７２頁（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ社、Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、１９９４年））に記載の通り、切断混合物（９６／１．２／１．２／０．８／０．８のＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ／ｍ−クレゾール／Ｈ_２Ｏ）で２時間処理することによってペプチドを脱保護し、樹脂から切断した。

完全長Ｅ７タンパク質（３）を得るための連結
方法Ａ
ペプチドチオエステル１（２２ｍｇ、３．１μｍｏｌ）を、ペプチド２（１１．３ｍｇ、２．７μｍｏｌ）と混合し、３．０ｍＬの緩衝液（１００ｍＭリン酸、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍ Ｇｄｎ・ＨＣｌ、ｐＨ８）中に溶解させた。次に６０μＬチオフェノール及び６０μＬベンジルメルカプタンを添加し、混合物を２２℃で６５時間撹拌した。混合物を１００ｍｇ ＤＴＴで処理し、２５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７中で平衡化されたスーパーデックス７５ ＨＬ １６／６０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に添加した。３７ｍＬ（１ｍＬ／分）において溶出された産物を収集し、ＲＰ ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ−４ ２１４ＴＰ５１０カラム；２５０×１０ｍｍ、５ｍＬ／分；０．１％ＴＦＡ水溶液中のアセトニトリル勾配で溶出））によって再精製し、質量分光分析法、ＲＰ ＨＰＬＣ、及び定量的アミノ酸分析による測定で、０．６ｍｇ（収率２％）の均質なＥ７タンパク質を得た。ＰＥ Ｓｃｉｅｘ ＡＰＩ１６５シングル四重極質量分析計で電気スプレー電離ＭＳを行った。α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をマトリックスとして用いて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）ＭＳスペクトルを、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ ＰＲＯ測定器に記録した。

方法Ｂ
ペプチドチオエステル１（１０．５ｍｇ、１．４μｍｏｌ）をペプチド２（１６ｍｇ、２μｍｏｌ）と混合し、１．８ｍＬのライゲーション緩衝液（２００ｍＭリン酸、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、６Ｍ 塩酸グアニジン、７５ｍＭ ＭｅｓＮａ、ｐＨ８．５）中に溶解させ、混合物を２２℃で６５ｈ撹拌し、精製緩衝液（６Ｍ塩酸グアニジン、２５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７）中で平衡化されたスーパーデックス７５ ＨＬ １６／６０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に添加し、０．８ｍＬ／分で溶出した。５０ｍＬにおいて溶出された産物を収集し（５．５ｍＬ）、３ｋＤカットオフを有する透析チューブを用いて水中で透析し（２Ｌの水、４０ｈにわたって３回交換した）、６．７ｍｇ（収率４４％）のＥ７タンパク質を含有する７．５ｍＬの溶液を得た。この物質のクロマトグラフィー特性、分光器特性、及び免疫原性特性は、方法Ａで得られたタンパク質と区別できないものであった。

（実施例２）
ＨＰＶ１６ Ｅ６の化学合成
ＨＰＶ１６−Ｅ６タンパク質配列

完全長ＨＰＶ１６Ｅ６合成タンパク質を得るためのペプチド合成のために選択された４つの断片：

断片は、それらのチオエステル（−ＳＲ）として示されており、配列中、Ｘは、特定の断片が結合された後に除去される一時的な保護基（例えばＭＳＣ基）を表す。合成プロセスは以下の通りである。すなわち、断片０４を断片０３に結合し、それに続いて、構築物０３／０４からＸを除去し、断片０３／０４を断片０２に結合し、Ｘを構築物０２／０３／０４から除去し、断片０２／０３／０４を断片０１に結合する。

（実施例３）
ＨＰＶ１６−Ｅ２の化学合成
ＨＰＶ１６−Ｅ２タンパク質配列

完全長ＨＰＶ１６ Ｅ２合成タンパク質を得るためのペプチド合成のために選択された７つの断片：

断片は、それらのチオエステル（−ＳＲ）として示されており、配列中、Ｘは、特定の断片が結合された後に除去される一時的な保護基（例えばＭＳＣ基）を表す。合成ストラテジーは、ＨＰＶ１６ Ｅ６と同様である。

注意：構築物０６／０７と断片０５との間の連結は、この連結がＰへの連結であるため困難な場合がある。

ＨＰＶＩ６−Ｅ２、代替ストラテジー、このタンパク質のオーバーラップした２つ部分、グリシン連結。

通常、化学的連結は、長さ制限及び／又は好ましくない配列のために、ある断片のＣ末端チオエステルを別の断片のＮ末端Ｃに連結させることによって進行する。ＨＰＶ１６Ｅ２の場合には、代替ストラテジーを用いることができる：

断片は、それらのチオエステル（−ＳＲ）として示されており配列中、Ｘは、特定の断片が結合された後に除去される一時的な保護基（例えばＭＳＣ基）を表し、ＸＸは、Ｎ末端のＧに結合した、Ｓ保護されているＮ−（２，３，４−トリメトキシ−５−メルカプトフェニル）基を表す［Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４、４６４２（２００２年）］。

（実施例４）
ＨＰＶ１８ Ｅ７の化学合成
ＨＰＶ１８−Ｅ７タンパク質配列

完全長ＨＰＶ１８ Ｅ２合成タンパク質を得るためのペプチド合成のために選択された２つの断片、詳細は実施例１と同じ：

（実施例５）
ＨＰＶ１８ Ｅ６の化学合成
ＨＰＶ１８−Ｅ６タンパク質配列

完全長ＨＰＶ１８ Ｅ６合成タンパク質を得るためのペプチド合成のために選択された４つの断片：

断片は、それらのチオエステル（−ＳＲ）として示されており、配列中、Ｘは、特定の断片が結合された後に除去される一時的な保護基（例えばＭＳＣ基）を表す。

（実施例６）
ＨＰＶ１８ Ｅ２の化学合成
ＨＰＶ１８−Ｅ２タンパク質配列

完全長ＨＰＶ１８ Ｅ２合成タンパク質を得るためのペプチド合成のために選択された７つの断片：

断片は、それらのチオエステル（−ＳＲ）として示されており、配列中、Ｘは、特定の断片が結合された後に除去される一時的な保護基（例えばＭＳＣ基）を表す。

ＨＰＶ１８−Ｅ２、代替ストラテジー、このタンパク質のオーバーラップした２つ部分、グリシン連結。

化学的連結は、長さ制限及び／又は好ましくない配列のために、ある断片のＣ末端チオエステルを別の断片のＮ末端Ｃに連結させることによって進行することが好ましい。ＨＰＶ１６Ｅ２の場合には、代替ストラテジーを用いることができる：

断片は、それらのチオエステル（−ＳＲ）として示されており、配列中、Ｘは、特定の断片が結合された後に除去される一時的な保護基（例えばＭＳＣ基）を表し、ＸＸは、Ｎ末端のＧに結合した、Ｓ保護されているＮ−（２，３，４−トリメトキシ−５−メルカプトフェニル）基を表す［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４、４６４２（２００２年）］。

（実施例７）
合成ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質ワクチンの抗原性
方法
対照抗原及びアジュバント
Ｈ−２Ｄ^ｂ−拘束性ＣＴＬエピトープＨＰＶ１６−Ｅ７_{４９−５７}（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）と、Ｅ７_{４３−７７}の長さ３５残基ペプチドＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲとの２つのペプチドを生成させた。ペプチドの純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定し、日常的に、９０％超の純度となっていることが判明した。ペプチドを、０．５％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ中に溶解させ、即座に使用しない場合には、−２０℃で保存した。組換え体は、Ｐｅｔ−１９ｂ−ＨＰＶ１６−Ｅ７で形質転換された組換え体大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で産生させ、前述の通りに精製した（Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８、７２４〜３１頁、１９９９年）。配列ＴＴＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴのＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）１８２６は、Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社によって提供され、５０μｇ／マウスの作業濃度で使用した（Ｚｗａｖｅｌｉｎｇ Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９、３５０〜８頁、２００２年）。

マウス、免疫、細胞系、及びＴ細胞培養
Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６、Ｈ−２^ｂ）マウスは、ＩＦＦＡ Ｃｒｅｄｏ社（仏国、Ｐａｒｉｓ）から入手した。腫瘍細胞系１３．２は、アデノウイルス５型由来のＥ１タンパク質で形質転換されたＭＥＣ（Ｂ６）から派生しており、このタンパク質中では、Ｈ−２Ｄ^ｂ Ｅ１Ａエピトープが、ＨＰＶ１６−Ｅ７_{４９−５７}ＣＴＬエピトープで置換されている。ＴＣ−１は、ＨＰＶ−１６ Ｅ６及びＥ７並びにｃ−Ｈａ−ｒａｓ発癌遺伝子で同時形質転換されたＣ５７ＢＬ／６マウスの初代上皮細胞に由来し、ＩＭＤＭ＋１０％ＦＣＳ中で培養された（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ Ｓ．Ｈ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９，３６５２〜６０、２００１年）。Ｄ１細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから派生した長期の成長因子依存性の未成熟脾臓樹状細胞（ＤＣ）であり、記載されている通りに培養した（Ｗｉｎｚｌｅｒ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５、３１７〜２８頁、１９９７年）。ＰＢＳ中に溶解させたＥ７_{４９−５７}の短いペプチド（５．０μｇ）又はＥ７_{４３−７７}の長さ３５残基のペプチド（１８μｇ）のいずれか、組換え体ＨＰＶ１６−Ｅ７（５０μｇ）タンパク質又は合成ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質（５０μｇ）を等モルレベル（４．５ｎｍｏｌ）でＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射した。ＯＤＮ−ＣｐＧ１８２６（５０μｇ）はＰＢＳ中に溶解させて、皮下ワクチン接種の前にペプチドと混合した。陽性対照として、ＰＢＳ中に溶解され、ＯＤＮ−ＣｐＧ１８２６と混合された約８倍多い用量のペプチド（３７．７ｎｍｏ１、１５０μｇ）もマウスに注射した（Ｚｗａｖｅｌｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９、３５０〜８頁、２００２年）。注射された総容積は、２００μｌ／マウスであった。脾臓は１０日後に採取した。免疫処置されたマウスからの脾細胞を、完全培地中、５×１０^５のＥ７_{４９−５７}発現細胞（腫瘍細胞系１３．２）存在下で培養する（２４ウェルプレートのウェルあたり４×１０^６細胞）ことによってＴ細胞を得た。培養は、５％ＣＯ_２を含有する加湿された空気中で、３７℃で維持した。外因性のＩＬ−２は添加しなかった。６日目に、フィコール密度勾配中での遠心によって死んでいる細胞を培養から除去し、残った生存細胞を２４ウェルプレート中に１．５×１０^６細胞／ウェルで播種した。７日目に、四量体染色又は細胞内サイトカイン染色を行った。

ＨＰＶ１６−Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分析
以前に記載された（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９、３６５２〜６０頁、２００１年）通り、ＰＥ標識された、Ｅ７_{４９−５７}（ＩＶＴＦ）含有Ｈ−２Ｄ^ｂエピトープ四量体を構築し、ペプチド特異的ＣＴＬ免疫の分析に用いた。以前に記載された（Ｚｗａｖｅｌｉｎｇ Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９、３５０〜８頁、２００２年）通り、ＨＰＶ１６−Ｅ７特異的ＣＴＬの抗原特異的なＩＦＮγ産生の分析にＦＩＴＣ標識された抗ＣＤ８ｂ．２ Ａｂ（Ｌｙ−３．２）（クローン５３−５．８）と、ＰＥ標識された抗ＩＦＮγ Ａｂ（クローンＸＭＧ１．２）（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社、米国、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）とを使用した。

腫瘍曝露実験
予防ワクチン接種ストラテジー実験では、２８日目及び１４日目に、指示されたワクチンをマウスの左側の腹に皮下ワクチン接種した。０日目に、５００００のＴＣ−１腫瘍細胞をマウスに皮下注射し、腫瘍の成長を１００日間追跡した。治療用ワクチン接種の設定では、マウスを左側の腹で５００００のＴＣ−１腫瘍細胞に曝露した。腫瘍が触診可能であった９日目に、マウスの右側の腹に、指示されたワクチンを接種した。１４日後、これらのマウスに上記のワクチンを追加注射した。腫瘍の成長は、９５日間モニターした。

合成ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ抗原性
多数の研究によって、（１）ＨＰＶ１６−Ｅ７を発現する腫瘍に対するＣ５７ＢＬ／６マウスの防御が、主としてＥ７_{４９−５７}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に依存していること（Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎ Ｍ．Ｌ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８、７２４〜３１頁、１９９８年、Ｇｒｅｅｎｓｔｏｎｅ Ｈ．Ｌ．ら、ＰＮＡＳ ９５、１８００〜５頁、１９９８年、Ｌｉｎ Ｋ．Ｙ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６、２１〜６頁、１９９６年、Ｆｅｌｔｋａｍｐ Ｍ．Ｃ．ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３、２２４２〜９頁、１９９３年）、及び、（２）腫瘍の進行に対して防御するか、或いは確立された腫瘍を根絶するＨＰＶ１６−Ｅ７特異的Ｔ細胞の能力が、Ｅ７_{４９−５７}四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合と相関すること（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９，３６５２〜６０頁、２００１年）が示されているので、そのようなＨＰＶ１６−Ｅ７_{４９−５７}特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する能力によって、合成ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質の抗原性を評価した。最小ＣＴＬエピトープ（Ｅ７_{４９−５７}：ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）、Ｅ７_{４９−５７}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活発な反応を誘導することが知られていたより長いペプチド（Ｅ７_{４３−７７}）、組換え体のＨＰＶ１６−Ｅ７又は合成ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質を含めた、過去に成功裏に使用されてきたいくつかのワクチンを最小ＣＴＬエピトープと等モル濃度でＣｐＧと併用してＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した。ワクチン接種の１０日後に脾臓を採取し、Ｈ２−Ｄ^ｂ Ｅ７_{４９−５７}（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）四量体の染色によって細胞を直接分析し（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ Ｓ．Ｈ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ １９，３６５２〜６０頁、２００１年）（図３ａ）、Ｅ７_{４９−５７}（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）ペプチド特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を測定する前に、さらに、付加的なもう１ラウンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激も与えたところ、それは、ｉｎ ｖｉｖｏで誘発されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を拡大したが、それらのヒエラルキーは変化させなかった（図３ｂ）。予測された通り、より長いＥ７ペプチドは、抗原の用量が高くても、またより低い用量でも、ＨＰＶ１６−Ｅ７特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を強く誘導することができ、一方、最小ＣＴＬエピトープによって誘導された反応は有意に弱かった。重要なことに、合成Ｅ７タンパク質を１回注射することによって誘導されたＨＰＶ１６−Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の反応は、組換え体ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質の反応に匹敵するものであり、また、他のワクチンよりもいくらか強いものであった。合成Ｅ７タンパク質で１回ワクチン接種した後に、機能的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答が誘発されたことを確認するために、樹状細胞（ＤＣ）のみで刺激した際、又は、長いＥ７_{４３−７７}ペプチド又は組換え体Ｅ７タンパク質のいずれかでパルス刺激した際のＩＮＦ−γ産生ＣＤ８＋細胞の数を測定した。合成Ｅ７タンパク質でワクチン注射されたマウスの脾臓で多数のＩＮＦ−γ産生ＣＤ８^＋Ｔ細胞が検出され、Ｈ２−Ｄ^ｂ Ｅ７_{４９−５７}四量体によって検出されたＣＤ８＋Ｔ細胞が機能的に活性であったことが確認された（図４）。さらに、これらのマウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞は、組換え体Ｅ７タンパク質でパルス刺激されたＤＣに対して反応したが、これは、合成ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質がその最大限の抗原性潜在能を保持していることを示す。

合成Ｅ７タンパク質ワクチン接種はＴＣ−１腫瘍細胞の根絶をもたらす
５００００のＴＣ−１腫瘍細胞に曝露された後、未処置のマウスでは、１１日目からその先、触診可能な腫瘍の進行が開始し、すべてのマウスが、腫瘍接種の後４１日以内に死亡した。初回−追加接種プロトコルにおいて４．５ｎｍｏｌの合成Ｅ７タンパク質でワクチン接種されたマウスは、７０日目まで保護された。この日の後には、合成Ｅ７でワクチン接種された１０匹のマウスのうち１匹のみが腫瘍を発症し、一方、組換え体Ｅ７タンパク質でワクチン接種されたマウスのグループでは３匹のマウスが死亡した。等モル量の長いＥ７ペプチドでマウスにワクチン接種した場合、すべてのマウスが腫瘍を発症した（図５ａ）が、以前に防御的であることが確立されている約８倍多い用量の長いペプチド（１３）を注射されたマウスの中では、４匹のみが腫瘍を発症した。確立されている腫瘍をこのワクチンが根絶する能力を試験するために、最初にマウスをＴＣ−１腫瘍細胞に曝露し、腫瘍が触診可能であった９日目にワクチン接種した。１４日後にワクチンを追加接種した。未処置のマウスはすべて、腫瘍曝露後３９日以内に死亡した。低用量（合成タンパク質と等モル量）の長いペプチドを注射されたマウスのうち、＞４０％が４０日目にまだ生きていたが、最終的には、すべてのマウスが５６日目の前に死亡した。合成Ｅ７タンパク質でワクチン接種された８匹のマウスのうち、６匹のマウスは、５０日目と７０日目との間に死亡したが、最後２匹のマウスは、少なくとも９５日目まで生き残った。組換え体Ｅ７タンパク質でワクチン接種されたマウスはいくらか早めに死亡したが生存動態は、合成タンパク質でワクチン接種されたグループのものと同様であった（図５ｂ）。

上記の実験は、合成Ｅ７タンパク質が、予防用及び治療用の両方の設定でマウスを腫瘍に対して防御できる、ＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の強い免疫を誘導することを実証するものである。合成Ｅ７での治療用ワクチン接種は、すべてのマウスにおける腫瘍を根絶する結果とはならなかったが、これは、これらの実験で観測されたＴＣ−１腫瘍成長の病原力の強さに関係するかもしれない。ＴＣ−１細胞の注射の後、触診可能な腫瘍がかなり早期に現れただけではなく、すべてのマウスが７日以内に死亡した（図５ｂ）ので、それらの成長速度もさらに速いものでもあった。一方、本発明者らの以前の実験では、未処置のマウスが１４〜２１日以内に死亡した（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ Ｓ．Ｈ．、Ｖａｃｃｉｎｅ １９、３６５２〜６０、２００１年）。本発明者らの以前の研究（Ｚｗａｖｅｌｉｎｇ Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９、３５０〜８、２００２年）でマウスを極めて良好に保護した、高用量の長いペプチドを用いた場合でさえ、本発明者らの今回の研究では腫瘍の発症を完全に予防することができなかった。

組換え体Ｅ７タンパク質又は合成Ｅ７タンパク質と比較して、等モル用量の長いＥ７ペプチドによるワクチン接種は、ＣＤ８＋ＩＦＮγ産生ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的Ｔ細胞の誘導に効率的でなく、これが腫瘍曝露に対する防御の不足に反映された。約８倍高い用量の長いペプチドによるワクチン接種は、強いＥ７特異的なＴ細胞反応と腫瘍防御とをもたらしたし、ＣｐＧに媒介されたＤＣ活性化の部位における抗原提示の寿命が重要な役割を果たすので、これは、タンパク分解に対するペプチド及びタンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏの／ｖｉｖｏ感受性と、タンパク質及びペプチド、並びにアジュバントＣｐＧ、身体全体での拡散の相違とに関係する。等モル基礎では、合成タンパク質が、ワクチン接種の目的により好都合なプロフィールを有することを、本発明者らのデータは示す。

ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質を合成するための合成スキームを示す図である。 精製された合成ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質のＭａｌｄｉ−ｔｏｆ質量スペクトルを示す図である。 ４．５ｎｍｏｌの合成ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質の１回の注射によって、多数のＨＰＶ１６−Ｅ７_{４９−５７}特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導される結果となることを示す図である。最小ＣＴＬエピトープ（Ｅ７_{４９−５７}）と等モル濃度の、指示された抗原を、ＣｐＧと混合して、又は、陽性対照として使用する１５０μｇのＥ７_{４３−７７}（高用量）ペプチド＋ＣｐＧと混合してＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射したか、或いはワクチン接種しなかった（未処置）。ＰＥに結合したＨ−２Ｄ^ｂ−Ｅ７_{４９−５７}四量体（ＴＭ）で染色された脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、ｅｘ−ｖｉｖｏで直接示す（Ａ）か、或いは１ラウンドのｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激の後に示した（Ｂ）。棒グラフは、３匹のマウスの平均百分率及びＳＥＭを示す。 合成ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質によるワクチン接種が、機能的なｌＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することを示す図である。脾臓細胞培養を、樹状細胞系Ｄ１のみか、又はＥ７_{４３−７７}ペプチドでパルス刺激されたＤ１細胞、又は組換え体ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質でパルス刺激されたＤ１細胞で刺激し、細胞内サイトカイン染色によってフローサイトメーターで分析した。等モル濃度の組換え体ＨＰＶ１６−Ｅ７又は高用量のペプチドＥ７_{４３−７７}を注射されたマウス、及び非接種（未処置）マウスの代表例を組み合わせて、合成ＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク質を注射された３匹のマウスを示す図である。 ２８日目及び１４日目に、４．５ｎｍｏｌの合成Ｅ７タンパク質（ｎ＝１０）、及び等モル量の組換え体Ｅ７タンパク質（ｎ＝９）、又は５０μｇのＣｐＧと混合された長いペプチド（ペプチド低用量、ｎ＝１０）、又はＰＢＳのみ（未処置、ｎ＝７）でマウスのグループをワクチン接種した結果を示す図である。対照として、長いペプチドは、約８倍多い用量の（ｎ＝５）でも使用した。これは、８０％のマウスを防御することが以前に確立されている。０日目に、５００００のＴＣ−１腫瘍細胞を体の反対側にｓ．ｃ．で注入し、腫瘍の成長を２〜３日ごとに１００日間までモニターし、生存曲線をプロットした。 腫瘍が触診可能であった９日目に、ＴＣ−１腫瘍細胞に曝露されたマウスに、指示されたワクチンを体の反対側に接種し（１グループあたりｎ＝８）、２３日目（矢印）に追加接種した。腫瘍の成長を９５日目までモニターし、生存曲線をプロットした。

Claims (22)

1. 病原体又は腫瘍の天然の抗原タンパク質における連続した少なくとも４６アミノ酸に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む合成タンパク質を生成する方法であって、
   ａ）それぞれが、前記アミノ酸配列における連続した２から８０アミノ酸から成る２つ以上の断片を化学合成し、それによって、前記２つ以上の断片が、前記アミノ酸配列中で隣接して、且つオーバーラップしていないステップと、
   ｂ）一断片のＣ末端を、隣接した断片のＮ末端に化学的に連結させて、前記合成タンパク質又はその一部分を生成させるステップと、
   ｃ）任意選択で、ステップＢを反復して、ステップＢ又はステップＣから得られたさらに別の隣接した断片を順次に連結させて、前記合成タンパク質を生成させるステップと
   を含む方法。
2. 前記隣接し且つオーバーラップしていない断片が、Ｎ末端システイン残基又はグリシン残基を含むように選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記天然のタンパク質が、ＨＰＶタンパク質である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ＨＰＶタンパク質が、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３又はＨＰＶ４５からのＥ２、Ｅ６又はＥ７タンパク質である、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
5. ステップＢ又はＣから得られた前記合成タンパク質が、アジュバントに化学的に結合されている、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
6. 前記アジュバントが化学的に合成されている、請求項５に記載の方法。
7. 前記アジュバントが、樹状細胞を活性化できる、請求項５又は６に記載の方法。
8. 前記アジュバントが、ポリＩＣ、ＣｐＧ ＤＮＡ、イミキモド、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＬＰＳ、及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 前記合成タンパク質を薬学的に許容される担体と混合することによって、前記タンパク質を医薬組成物に配合するステップをさらに含む、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
10. 合成タンパク質を含む組成物であって、前記タンパク質が、病原体又は腫瘍の天然の抗原タンパク質における連続した少なくとも４６アミノ酸に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、それによって、前記組成物は、前記アミノ酸配列をコードする核酸を含まない組成物。
11. 前記タンパク質が、配列番号１から６までのうちの１つにおける連続した少なくとも４６アミノ酸に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、それによって、前記組成物は、配列番号１から６までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含まない、請求項１０に記載の組成物。
12. 前記組成物がアジュバントをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記アジュバントが、樹状細胞を活性化できる、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記ＴＬＲ−活性化アジュバントが、ポリＩＣ、ＣｐＧ ＤＮＡ、イミキモド、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＬＰＳ、及びこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
15. 前記アジュバントが共有結合によって前記タンパク質に結合されている、請求項１０から１４までのいずれか一項に記載の組成物。
16. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項９から１５までのいずれか一項に記載の組成物。
17. 抗ＣＤ４０抗体をさらに含む、請求項９から１６までのいずれか一項に記載の組成物。
18. ワクチンとして使用するための、請求項９から１７までのいずれか一項に記載の組成物。
19. ＨＰＶ関連疾患を治療又は予防する方法であって、請求項１から９までに記載の通りに生成された合成タンパク質、又は請求項１０から１８までに記載の組成物を治療有効量、対象に投与することを含む方法。
20. 前記ＨＰＶ関連疾患が、ＨＰＶによって誘発された癌である、請求項１９に記載の方法。
21. 請求項１から９までに記載の通りに生成された合成タンパク質、又は請求項１０から１８までに記載の組成物の、ＨＰＶ関連疾患を治療又は予防する薬物を製造するための使用。
22. 前記ＨＰＶ関連疾患が、ＨＰＶによって誘発された癌である、請求項２１に記載の使用。

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